ES2793073B2

ES2793073B2 - Composicion fitosanitaria para su uso como bactericida

Info

Publication number: ES2793073B2
Application number: ES201930950A
Authority: ES
Inventors: Perez Jordi Ballesta; Llamas Antonio Miguel Lavado; Aragunde Hugo Cores
Original assignee: Lainco S A
Current assignee: Lainco S A
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2021-11-18
Anticipated expiration: 2039-10-29
Also published as: CL2022001068A1; CN114641206A; US20220378052A1; IL292626B1; KR20220088927A; BR112022007910A2; MX2022004417A; CN114641206B; WO2021084147A1; EP4052579A1; AU2020376321A1; EP4052579A4; ZA202205336B; IL292626B2; IL292626A; ES2793073A1

Description

DESCRIPCIÓN

Composición fitosanitaria para su uso como bactericida

Antecedentes

Numerosos estudios científicos en todo el mundo han abordado el problema de la agricultura en el siglo XXI como especialmente sensible al cambio climático, que ha provocado la propagación de las bacterias fitopatógenas. Por lo tanto, existe una necesidad clara y urgente de contener este tipo de riesgo en la producción agrícola.

El aceite de eucalipto se ha descrito como útil como repelente de insectos y animales varios (US20110171278A1).

E. R. Hendry et al. describen el efecto antimicrobiano sinérgico de la clorhexidina digluconato y el aceite de eucalipto (Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2009) 64, 1219 -1225 y Int J Mol Sci. 2012; 13(11): 14016-14025).

Hasta la fecha, aunque se haya descrito de manera general o combinada con otros principios activos la actividad antimicrobiana del aceite de eucalipto, no se ha descrito una composición estable, amigable con el medio ambiente y de fácil uso en protección de plantas basada en el aceite de eucalipto que sea eficaz contra numerosas infecciones bacterianas.

Por tanto, existe la necesidad de nuevas composiciones más amigables con el medio ambiente que al mismo tiempo sean altamente eficaces a la hora de prevenir infecciones bacterianas en los cultivos de plantas. Igualmente, es necesario que dichas composiciones sean estables a altas concentraciones y a temperatura ambiente, y que una vez diluidas para su uso en las plantas, consigan prevenir el crecimiento bacteriano sin ser tóxicas para las plantas tratadas.

Descripción de la invención

La presente invención supone una solución al problema descrito arriba, ya que describe composiciones fitosanitarias bactericidas altamente eficaces y amigables con el medio ambiente. Los inventores han encontrado que el uso del aceite de eucalipto derivado de Eucalyptus globulus en determinadas concentraciones es altamente efectivo contra numerosas infecciones bacterianas que afectan de manera importante a árboles frutales y a algunas hortícolas.

La presente invención se refiere a una composición líquida que comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda entre 5 y 80 % p/v de 1,8 cineol para su uso como bactericida en la protección de plantas, donde dicha composición se aplica a las plantas tras ser diluida en agua hasta entre 0,01 y 12 % en peso.

Las composiciones de la presente invención se pueden preparar más o menos concentradas para diluirse posteriormente para su uso, preferiblemente por aplicación sobre las plantas mediante pulverización. Dicha dilución se hace en agua y suele hacerse en el campo. Por tanto, para facilitar su manipulación, es ventajoso tener composiciones concentradas que se diluyen in situ antes de su aplicación. Las composiciones de la presente invención se han ensayado preferiblemente a concentraciones de aceite de eucalipto para aportar 20 % p/v de 1,8-cineol, que se han diluido posteriormente previamente a su uso en distintas proporciones, como se describe en los ejemplos.

En una realización preferida, dicha composición se aplica a las plantas tras ser diluida en agua hasta entre 0,1 y 5 % en peso. En una realización más preferida, dicha composición se aplica a las plantas tras ser diluida en agua hasta entre 0,2 y 1,0 % en peso.

En una realización preferida, la composición no comprende clorhexidina. Preferiblemente, no comprende clorhexidina digluconato. En una realización preferida de la presente invención, la composición no comprende aceite de árbol de nim o neem. En una realización preferida, la composición no comprende aceite de tomillo.

Tal y como se emplea aquí, el término “1,8-cineol” se refiere al eucaliptol o 1,3,3-Trimetil-2-oxabiciclo[2,2,2]octano, que es el principal compuesto del aceite de eucalipto. Tal y como se usa aquí, el término “aceite de eucalipto” se refiere al aceite obtenido por la destilación de ramitas y hojas de Eucalyptus globulus.

En una realización preferida del primer aspecto, la composición para uso como bactericida en la protección de plantas se usa contra infecciones de Xylella fastidiosa, Pseudomonas syringae, Xanthomonas fragariae, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas arborícola, Erwinia amylovora o cualquier combinación de las mismas. Preferiblemente, se usa contra infecciones de Xylella fastidiosa o Pseudomonas syringae.

Las composiciones de la presente invención han demostrado ser altamente eficaces contra las infecciones provocadas por las bacterias mencionadas arriba, destacando especialmente los magníficos resultados obtenidos contra las infecciones de Xylella fastidiosa.

En otra realización preferida, la composición del primer aspecto se aplica a árboles frutales y hortícolas, preferiblemente a vid, olivo, almendro, avellano, nogal, kiwi, tomate, fresa, patata, melocotonero, albaricoque, ciruelo, naranjo, limonero, mandarino, manzano, peral, membrillo, cafeto. Preferiblemente, la protección se aplica al peral, el almendro o el olivo.

En una realización preferida del primer aspecto, la composición para uso como bactericida en la protección de plantas comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda entre 15 y 25 % p/v de 1,8-cineol.

En una realización preferida del primer aspecto, la composición para uso como bactericida en la protección de plantas comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda 20 % p/v de 1,8-cineol.

En una realización preferida del primer aspecto, la composición para uso como bactericida en la protección de plantas comprende entre 40 y 70 % p/v de diluyente o diluyentes. Los diluyentes pueden seleccionarse de entre agua, un aceite vegetal o animal o mezclas de ácidos grasos y sus ésteres, al menos un aceite mineral de tipo parafínico, al menos un éster metílico C16-C18., al menos un alcohol C1-C5, ciclohexanona, acetofenona, xileno, nafta aromática o mezclas de los mismos. Preferiblemente, al menos un diluyente es agua. En una realización preferida, dicha composición comprende entre 40 y 70 % p/v de agua.

En una realización preferida del primer aspecto, la composición para uso como bactericida en la protección de plantas comprende entre 1,00 y 8,00 % p/v de tensioactivo o tensioactivos.

En una realización preferida del primer aspecto, la composición para uso como bactericida en la protección de plantas comprende 0,10 y 1,00% p/v de antioxidante o antioxidantes.

Cuando el diluyente principal es agua, la composición puede comprender hasta un 15 % p/v de un codiluyente seleccionado de entre un aceite vegetal o animal o mezclas de ácidos grasos y sus ésteres, al menos un aceite mineral de tipo parafínico, al menos un éster metílico C¹⁶-C¹⁸., al menos un alcohol C¹-C⁵, ciclohexanona, acetofenona o mezclas de los mismos, aunque preferiblemente el codiluyente es un aceite vegetal.

En una realización preferida del primer aspecto, la composición para uso como bactericida en la protección de plantas además comprende al menos un diluyente, al menos un tensioactivo, al menos un antioxidante y al menos un viscosizante en una cantidad suficiente como para que la viscosidad de la composición sea de entre 500 y 5000 cP, calculada según el método CIPAC MT 192 con un viscosímetro rotacional con aguja 2, 20 rpm y a 25 °C.

En una realización preferida del primer aspecto, la composición para uso como bactericida en la protección de plantas comprende entre 0,10 y 5,00% p/v de viscosizante o viscosizantes.

En una realización preferida del primer aspecto, la composición para uso como bactericida en la protección de plantas tiene una distribución volumétrica de tamaño de partícula con d10 entre 0,1 y 5 micras y d90 entre 0,8 y 50 micras, medida por difracción láser de acuerdo con el método CIPAC MT 187.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición líquida que comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda entre 10 y 30 % p/v de 1,8-cineol, al menos un diluyente, al menos un tensioactivo y al menos un antioxidante.

En una realización preferida del segundo aspecto, el aceite de eucalipto es el único ingrediente con efecto bactericida de la composición.

La composición de la presente invención es estable a temperatura ambiente durante al menos 24 meses. Esto significa que mantiene sus características de viscosidad, tamaño de partícula, pH, etc. y, además y, sobre todo, mantiene su efectividad cuando se conserva a temperatura ambiente al menos durante 24 meses.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición no comprende aceite de árbol de nim o neem. En una realización preferida, la composición no comprende aceite de tomillo.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda entre 16 y 25 % p/v de 1,8-cineol. Preferiblemente, la composición comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda entre 18,00 y 22,00 % p/v de 1,8-cineol. En una realización más preferida, la composición comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente como para que la composición comprenda 20 % p/v de 1,8-cineol.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende entre 40 y 70 % p/v de diluyente o diluyentes. Preferiblemente, al menos un diluyente es agua.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende entre 40 y 70 % p/v de agua. Preferiblemente, el agua es agua osmotizada.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende entre 1,00 y 8,00 % p/v de tensioactivo o tensioactivos. En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende entre 0,10 y 1,00% p/v de antioxidante o antioxidantes.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición además comprende al menos un viscosizante en una cantidad suficiente como para que la viscosidad de la composición sea de entre 500 y 5000 cP , calculada según el método CIPAC MT 192 con un viscosímetro rotacional con aguja 2, 20 rpm y a 25 °C. En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende entre 0,10 y 5,00% p/v de viscosizante o viscosizantes. En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende una cantidad suficiente de viscosizante(s) como para que la viscosidad de la composición sea de entre 500 y 1500 cP, calculada según el método CIPAC MT 192 con un viscosímetro rotacional con aguja 2, 20 rpm y a 25 °C.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición tiene una distribución volumétrica de tamaño de partícula con d10 entre 0,1 y 5 micras y una d90 entre 0,5 y 50 micras, preferiblemente una d10 entre 0,1 y 2 micras y una d90 entre 0,5 y 8 micras, medida por difracción láser de acuerdo con el método CIPAC MT 187.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende además de agua otro codiluyente seleccionado de entre al menos un aceite vegetal o animal o mezclas de ácidos grasos y sus ésteres, al menos un aceite mineral de tipo parafínico, al menos un éster metílico C16-C18., al menos un alcohol C1-C5, ciclohexanona, acetofenona, xileno, nafta aromática o mezclas de los mismos.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende como diluyentes agua y al menos un aceite vegetal. Preferiblemente, la composición comprende como diluyentes agua y aceite de sésamo.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende como tensioactivo al menos uno seleccionado de entre aceite de ricino etoxilado, ésteres de sorbitán etoxilados (polisorbatos), derivados de alcoholes grasos polietoxilados, poliarilfenil éter fosfato, un tensioactivo polimérico de alto peso molecular y bajo equilibrio hidrofílico-lipofílico (HLB) y un tensioactivo polimérico de alto HLB formado por copolímeros de bloque de óxido de etileno/óxido de propileno.

En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende como tensioactivo al menos uno seleccionado de entre derivados de alcoholes grasos polietoxilados, poliarilfenil éter fosfato, un tensioactivo polimérico de alto peso molecular y bajo HLB y un tensioactivo polimérico de alto HLB formado por copolímeros de bloque de óxido de etileno/óxido de propileno.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a la composición del segundo aspecto para su uso como fitosanitario. Preferiblemente, para su uso como bactericida en la protección de plantas, preferiblemente para la protección de árboles frutales y hortícolas, más preferiblemente para la protección de vid, olivo, almendro, avellano, nogal, kiwi, tomate, fresa, patata, melocotonero, albaricoque, ciruelo, naranjo, limonero, mandarino, manzano, peral, membrillo, cafeto o cualquier combinación de las mismas.

En una realización preferida del tercer aspecto, la composición del segundo aspecto se usa como bactericida en la protección de plantas, preferiblemente para la protección de árboles frutales y hortícolas, más preferiblemente para la protección de vid, olivo, almendro, avellano, nogal, kiwi, tomate, fresa, patata, melocotonero, albaricoque, ciruelo, naranjo, limonero, mandarino, manzano, peral, membrillo, cafeto o cualquier combinación de las mismas, contra infecciones de Xylella fastidiosa, Pseudomonas syringae, Xanthomonas fragariae, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas arborícola, Erwinia amylovora o cualquier combinación de las mismas, preferiblemente contra la infección de Xylella fastidiosa o Pseudomonas syringae.

Descripción de las figuras

Figura 1. Supervivencia de E. amylovora en función del tratamiento aplicado después de 30 min (barra de la izquierda) y 2 h (barra de la derecha) de contacto con el producto. El eje de ordenadas muestra la supervivencia en Log UFC/ml y el eje de abscisas muestra la concentración del producto en pl/ml, la estreptomicina (100 mg/L) y el control (CNT). Las barras representan el promedio de los valores observados en las tres repeticiones realizadas para cada tratamiento y tiempo. Las barras de error muestran el intervalo de confianza teniendo en cuenta la desviación estándar. (---), límite de detección de la técnica.

Figura 2. Supervivencia de X. arboricola pv. pruni en función del tratamiento aplicado después de 30 min (barra de la izquierda) y 2 h (barra de la derecha) de contacto con el producto. El eje de ordenadas muestra la supervivencia en Log UFC/ml y el eje de abscisas muestra la concentración del producto en pl/ml, la estreptomicina (100 mg/L) y el control (CNT). Las barras representan el promedio de los valores observados en las tres repeticiones realizadas para cada tratamiento y tiempo. Las barras de error muestran el intervalo de confianza teniendo en cuenta la desviación estándar. (---), límite de detección de la técnica.

Figura 3. Supervivencia de X. axonopodis pv. vesicatoria en función del tratamiento aplicado después de 30 min (barra de la izquierda) y 2 h (barra de la derecha) de contacto con el producto. El eje de ordenadas muestra la supervivencia en Log UFC/ml y el eje de abscisas muestra la concentración del producto en pl/ml, la estreptomicina (100 mg/L) y el control (CNT). Las barras representan el promedio de los valores observados en las tres repeticiones realizadas para cada tratamiento y tiempo. Las barras de error muestran el intervalo de confianza teniendo en cuenta la desviación estándar. (---), límite de detección de la técnica.

Figura 4. Supervivencia de P. syringae pv. actinidiae en función del tratamiento aplicado después de 30 min (barra de la izquierda) y 2 h (barra de la derecha) de contacto con el producto. El eje de ordenadas muestra la supervivencia en Log UFC/ml y el eje de abscisas muestra la concentración del producto en pl/ml, la estreptomicina (100 mg/L) y el control (CNT). Las barras representan el promedio de los valores observados en las tres repeticiones realizadas para cada tratamiento y tiempo. Las barras de error muestran el intervalo de confianza teniendo en cuenta la desviación estándar. (---), límite de detección de la técnica.

Figura 5. Supervivencia de P. syríngae pv. tomato en función del tratamiento aplicado después de 30 min (barra de la izquierda) y 2 h (barra de la derecha) de contacto con el producto. El eje de ordenadas muestra la supervivencia en Log UFC/ml y el eje de abscisas muestra la concentración del producto en pl/ml, la estreptomicina (100 mg/L) y el control (CNT). Las barras representan el promedio de los valores observados en las tres repeticiones realizadas para cada tratamiento y tiempo. Las barras de error muestran el intervalo de confianza teniendo en cuenta la desviación estándar. (---), límite de detección de la técnica.

Figura 6. Supervivencia de X. fastidiosa subsp. pauca en función del tratamiento aplicado después de 30 min (barra de la izquierda) y 2 h (barra de la derecha) de contacto con el producto. El eje de ordenadas muestra la supervivencia en Log UFC/ml y el eje de abscisas muestra la concentración del producto en pl/ml, la estreptomicina (100 mg/L) y el control (CNT). Las barras representan el promedio de los valores observados en las tres repeticiones realizadas para cada tratamiento y tiempo.

Figura 7. Supervivencia de Xylella fastidiosa subsp. multiplex en función del tratamiento aplicado después de 30 min (barra de la izquierda) y 2 h (barra de la derecha) de contacto con el producto. El eje de ordenadas muestra la supervivencia en Log UFC/ml y el eje de abscisas muestra la concentración del producto en pl/ml, la ampicilina (100 mg/L) y el control (CNT). Las barras representan el promedio de los valores observados en las tres repeticiones realizadas para cada tratamiento y tiempo. Las barras de error muestran el intervalo de confianza teniendo en cuenta la desviación estándar.

Figura 8. Supervivencia de Xylella fastidiosa subsp. fastidiosa en función del tratamiento aplicado después de 30 min (barra de la izquierda) y 2 h (barra de la derecha) de contacto con el producto. El eje de ordenadas muestra la supervivencia en Log UFC/ml y el eje de abscisas muestra la concentración del producto en pl/ml, la estreptomicina (100 mg/L) y el control (CNT). Las barras representan el promedio de los valores observados en las tres repeticiones realizadas para cada tratamiento y tiempo. Las barras de error muestran el intervalo de confianza teniendo en cuenta la desviación estándar.

Figura 9. Efecto del tratamiento con el producto en la severidad de las infecciones causadas por E. amylovora en plantas de peral de la variedad Conference, inoculadas con una suspensión de 5x107 ufc/ml de E. amylovora . Las barras corresponden a la media de las tres repeticiones para cada tratamiento. Las barras de error representan el intervalo de confianza teniendo en cuenta la desviación estándar. Letras diferentes indican la existencia de diferencias significativas respecto al testigo según el test de Waller-Duncan. Estos resultados corresponden al primer ensayo (A) y al segundo ensayo (B). EGL2 EC es un producto de la invención y comprende una cantidad de aceite de eucalipto necesaria para que el producto tenga 20 % p/v de 1,8-cineol, al menos un diluyente, al menos un tensioactivo, al menos un antioxidante y al menos un viscosizante.

Figura 10. Efecto del tratamiento con el producto en la severidad de las infecciones causadas por Xylella fastidiosa subsp. fastidiosa en plantas de almendro. Las barras corresponden a la media de las tres repeticiones para cada tratamiento. Las barras de error representan el intervalo de confianza teniendo en cuenta la desviación estándar. Letras diferentes indican la existencia de diferencias significativas respecto al testigo según el test de Waller-Duncan. EGL2 EC es un producto de la invención y comprende una cantidad de aceite de eucalipto necesaria para que el producto tenga 20 % p/v de 1,8-cineol, al menos un diluyente, al menos un tensioactivo, al menos un antioxidante y al menos un viscosizante.

Ejemplos

Esta invención se entenderá mejor por referencia a los ejemplos a continuación, pero aquellos expertos en la técnica apreciaran fácilmente que los ejemplos específicos detallados solamente son ilustrativos de la invención.

Ejemplo 1: composiciones

A continuación, se indican algunas composiciones de la invención donde las cantidades de cada componente están en % p/v.

* los % p/v se refieren a la cantidad en % p/v de 1,8-cineol, por lo que la composición comprende la cantidad de aceite de eucalipto derivado de Eucalyptus globulus necesaria para comprender el porcentaje p/v deseado de 1,8-cineol, que se cuantifica por HPLC.

1

Las composiciones han de diluirse previamente a su uso en la protección de plantas. Estas composiciones, una vez diluidas en agua al 1 % (p/v) presentaron un pH de entre 4,00 y 6,50 a temperatura ambiente (25 °C).

En las composiciones 9 a 15, el diluyente mayoritario fue el agua osmotizada. Además, como codiluyente se emplearon opcionalmente aceites vegetales y/o animales o mezclas de ácido grasos y sus ásteres, aceites minerales de tipo parafínico, ásteres metílicos de entre 16 y 18 carbonos, alcoholes de entre uno y cinco carbonos, u otros como ciclohexanona o acetofenona. Los tensioactivos empleados fueron al menos uno seleccionado de entre aceite de ricino etoxilado, ásteres de sorbitán etoxilados (polisorbatos), derivados de alcoholes grasos polietoxilados, como por ejemplo tristirilfenoles etoxilados, poliarilfenil éter fosfato (sal de amina), tensioactivo polimárico de alto peso molecular y bajo equilibrio hidrofílico-lipofílico (HLB), y tensioactivo polimárico de alto HLB formado por copolímeros de bloque de óxido de etileno/óxido de propileno.

El tamaño de partícula de las composiciones se analizó según el mátodo CIPAC MT 187 con un equipo Mastersizer 3000E (unidad óptica) y una unidad de dispersión Hydro SM. Todas las composiciones presentaron una dv10 entre 0,1 y 5 micras y una dv90 entre 0,5 y 50 micras.

La viscosidad de las composiciones se analizó según el mátodo CIPAC MT 192 con un viscosímetro rotacional con aguja 2, 20 rpm y a 25 °C (equipo de Brookfield modelo DV1MLVTJ0). Todas las composiciones presentaron una viscosidad entre 500 y 5000 cP, o entre 500 y 1500 cP.

Ejemplo 2: evaluación de la actividad antimicrobiana mediante test de incorporación en agar

El producto de la presente invención se ensayó contra bacterias fitopatógenas de cuarentena. El producto evaluado comprendía aceite de eucalipto en una cantidad para que la composición final tuviera 20 % p/v de 1,8-cineol, medida por HPLC, y se conservó a temperatura ambiente.

La eficacia del producto se evaluó frente 11 cepas fitopatógenas de la colección de patógenos de cuarentena del Centro de Innovación y Desarrollo en Sanidad Vegetal (CIDSAV), procedentes de focos de infección europeos o bien de colecciones tipo españolas (Tabla 1).

Tabla 1. Descripción de las cepas fitopatógenas utilizadas en los ensayos de actividad antimicrobiana.

Bacterias fitopatógenas Cepa utilizada Procedencia Erwinia amylovora EPS 101 Girona Xanthomonas arboricola pv. pruni CFBP 5563 Francia

Pseudomonas syringae pv. actinidiae IVIA 3700.1.1 Portugal Pseudomonas syringae pv. tomato DC 3000 Málaga Pseudomonas syringae pv. syringae EPS 94 Girona Xanthomonas fragariae 349-9A España Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria IVIA 2133.2 España Ralstonia solanacearum CECT 125 CECT

Xylella fastidiosa subsp. fastidiosa IVIA 5387.2 Baleares Xylella fastidiosa subsp. multiplex IVIA 5901.2 Valencia Xylella fastidiosa subsp. Pauca DD1 CODiRo Italia

Se obtuvieron los inóculos a partir del cultivo puro de las cepas en crecimiento activo tras la siembra en medio BCYE agar en el caso de las tres subespecies de Xylella fastidiosa, en medio B agar para Xanthomonas fragariae y en medio LB agar para el resto de bacterias fitopatógenas de cuarentena. Seguidamente se incubaron a 28 °C durante 48 horas. En el caso de X. fastidiosa el tiempo de incubación se incrementó entre 7-10 días. Cada suspensión bacteriana fue preparada a una concentración final de 1x108 UFC/ml.

Se evaluó la actividad antimicrobiana de 5 dosis del producto frente a 11 cepas de patógenos bacterianos. Concretamente se utilizaron las siguientes concentraciones: 120, 60, 30, 10 y 5 pl/ml del producto. Además, el efecto se comparó con el del antibiótico estreptomicina a una concentración de 100 mg/L. También se añadió un control no tratado, donde se sustituyó el producto por agua destilada estéril.

Para la realización de los ensayos, se prepararon placas de cultivo sólido donde se incorporó el producto a la dosis correspondiente. Para cada cepa se utilizó el medio de cultivo adecuado. A continuación, se depositó en cada placa una gota de 10 pl de la correspondiente suspensión bacteriana a 108 UFC/ml. Posteriormente las placas se dejaron secar y se incubaron a 28 °C durante 48 horas. En el caso de X. fastidiosa el tiempo de incubación se incrementó entre 7 10 días. Transcurrido este tiempo, se observó el crecimiento bacteriano en cada una de las dosis ensayadas, y se comparó con el control no tratado, que correspondía a la suspensión bacteriana del patógeno incubado en medio sin producto. Para cada uno de los tratamientos se realizaron 2 repeticiones.

Se determinó la actividad inhibitoria in vitro del producto mediante la determinación de la concentración mínima inhibitoria. Además, el efecto el producto se comparó con el del bactericida de referencia estreptomicina. Previamente, se confirmó la ausencia de microorganismos contaminantes en el producto, que podrían interferir en el ensayo.

En la tabla 2 se muestra un resumen de la actividad inhibitoria del producto frente a las 11 cepas de bacterias fitopatógenas ensayadas.

En términos generales, la actividad antimicrobiana observada dependió de la concentración de producto y del patógeno utilizado. Las tres subespecies de Xylella fastidiosa fueron las cepas más sensibles al tratamiento con el producto, ya que a la dosis más baja testada (5 pl/ml) éste inhibió el crecimiento de las bacterias.

Por lo contrario, E. amylovora fue el patógeno más resistente, observándose crecimiento a una concentración de 60 pl/ml del producto (MIC 60-120 pl/l).

El antibiótico estreptomicina (100 mg/L) inhibió el crecimiento de todos los patógenos ensayados.

Se pudo observar crecimiento de todas las cepas en las placas control sin producto, al cabo de 48 h tras su incubación.

Tabla 2. Actividad antibacteriana in vitro de las 5 dosis testadas del producto contra 11 bacterias fitopatógenas de cuarentena. Se muestran los resultados obtenidos para las dos repeticiones.

Strep: estreptomicina (100 mg/L) utilizada como control antibacteriano;

+: crecimiento bacteriano igual al observado en el control no tratado

+/-: crecimiento bacteriano inferior al observado en el control no tratado (CNT)

- : no se observa crecimiento bacteriano.

1

Dosis producto (p.i/ml)

120 60 30 10 S Strep CNT

La concentración mínima inhibitoria (CMI) se determinó como la concentración de producto más baja a la que no se producía crecimiento bacteriano al final del experimento. El valor (rango) de las CMI frente las distintas cepas se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) obtenidas para las 11 bacterias fitopatógenas de cuarentena.

Patógeno CMI (pl/ml)

E. amylovora 60-120

X. arboricola pv . pruni 10-30

P. syringae pv. Actinidiae 10-30

P. syringae pv. syringae 30-60

P. syringae pv. tomato 30-60

X. fragariae < 5

X. axonopodis pv. vesicatoria 10-30

Ralstonia solanacearum 30-60

Xylella fastidiosa subsp. fastidiosa < 5

Xylella fastidiosa subsp. multiplex < 5

Xylella fastidiosa subsp. pauca < 5

Se observa que la CMI de E. amylovora se encontraría entre las dosis 120 y 60 ql/ml. P. syringae pv. syringae, P. syringae pv. tomato y R. solanacearum, presentarían valores de CMI entre 30 y 60 ql/ml. Para X. arboricola pv. pruni, P. syringae pv. actinidiae y X. axonopodris pv. vesicatoria, la CMI estaría entre 10 y 30 ql/ml. X. fragariae (en una de las réplicas) y las tres subespecies de Xylella fastidiosa presentaron una CMI inferior a 5 ql/ml.

Resumiendo, el producto presenta una CMI en el rango de 5-60 ql/ml (5-60 ppm) frente las 11 cepas fitopatógenas estudiadas. Si extrapolamos la CMI obtenida in vitro para su utilización a campo (aproximadamente 10 x CMI), la dosis requerida estaría dentro del rango habitual de aplicación de fitosanitarios (50-100 ppm).

En conclusión, el producto presenta actividad antimicrobiana frente las 11 bacterias fitopatógenas ensayadas.

Ejemplo 3: evaluación de la actividad bactericida mediante test de contacto

La eficacia del producto se evaluó frente a las siguientes 5 cepas fitopatógenas de la colección de patógenos de cuarentena del CIDSAV, procedentes de focos de infección europeos o bien de colecciones tipo españolas. El producto evaluado comprendía aceite de eucalipto en cantidad suficiente como para tener 20 % p/v de 1,8-cineol (medido por HPLC) y se conservó a temperatura ambiente.

Bacterias fitopatógenas Cepa utilizada Procedencia

Erwinia amylovora EPS 101 Girona

Xanthomonas arboricola pv. pruni CFBP 5563 Francia

Pseudomonas syringae pv. actinidiae IVIA 3700.1.1 Portugal Pseudomonas syringae pv. tomato DC 3000 Málaga

Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria IVIA 2133.2 España

Se obtuvieron los inóculos a partir del cultivo puro de las cepas en crecimiento activo tras la siembra en medio LB agar y incubación a 28 °C durante 24 horas. Cada suspensión bacteriana fue preparada a una concentración final de 1x108 UFC/ml.

Se evaluó la actividad bactericida de 5 dosis del producto. Para cada fitopatógeno se ensayaron concentraciones distintas dependiendo de los resultados obtenidos previamente en la evaluación de la actividad antimicrobiana (ejemplo 2).

Tabla 4. Concentraciones utilizadas en el ensayo de actividad bactericida mediante test de contacto, seleccionadas a partir del test de actividad antibacteriana (CMI).

1

Además, el efecto del producto se comparó con el del antibiótico estreptomicina a una concentración de 100 mg/L. También se añadió un control no tratado, donde se substituyó el producto por agua destilada estéril.

La determinación de la actividad bactericida de las distintas concentraciones frente a las distintas bacterias fitopatógenas se realizó mediante un test de contacto con una suspensión de la bacteria en medio líquido. El test de contacto consistió en mezclar 100 pL de cada tratamiento con 100 pL de la suspensión bacteriana a una concentración de 108 UFC/ml obteniéndose un volumen final de 200 pL en cada pocillo de la placa (suspensión bacteriana a una concentración final 5x108 UFC/ml). Tanto las distintas dosis del producto como la estreptomicina se habían preparado dos veces concentradas (2x) para obtener la concentración final deseada en cada pocillo.

Las placas multipocillo se incubaron a 28 °C en agitación constante (150 rpm). A los 30 minutos (min) y a las 2 horas (h) de exposición de la bacteria con los productos, se analizó su supervivencia mediante recuento de viables en placa. Las unidades formadoras de colonias (UFC) se contabilizaron a las 48 h después de su incubación a 28 °C determinando la supervivencia (UFC/ml) de cada bacteria fitopatógena para cada tratamiento, y se compararon con los obtenidos en el control no tratado. Se analizaron tres repeticiones para cada tratamiento.

A partir de la supervivencia (UFC/ml) obtenida en cada tratamiento, se determinaron la concentración mínima bactericida (CMB) y la dosis que resulta letal para la mitad de una población bacteriana (DL50). La CMB se determinó como la concentración de producto más baja a la que no se observa crecimiento bacteriano al final del experimento tras la incubación con el producto. Para el cálculo de la DL50, los datos de supervivencia en función de la concentración se transformaron mediante la función probit, se ajustaron a una recta y se

1

realizó la interpolación para obtener la concentración en la que sólo se observa el crecimiento de la mitad de la población bacteriana inicial.

La actividad bactericida de las distintas concentraciones del producto frente a E. amylovora, X. arborícola pv. pruni, X. axonopodis pv. vesicatoria, P. syringae pv. actinidiae y P. syríngae pv. tomato se evaluó mediante un test de contacto, donde una suspensión de cada bacteria se incubó con cada concentración del producto y se tomaron muestras al cabo de 30 y 120 min. A partir de la preparación de diluciones seriadas de cada suspensión y posterior siembra en placas LB agar incubadas a 28 °C durante 48 h, se procedió al recuento de viables cultivables (colonias supervivientes).

En términos generales, la actividad bactericida observada dependió de la concentración de producto, del tiempo de exposición y del patógeno utilizado. La actividad bactericida del producto se incrementó al aumentar la concentración y el tiempo de contacto con el patógeno.

A continuación, se detalla el efecto bactericida de las diferentes dosis del producto frente a los fitopatógenos ensayados:

Erwinia amylovora

En la figura 1 se muestra la supervivencia de E. amylovora frente a las concentraciones del producto y del tiempo de contacto. No se observó crecimiento de Ea después del contacto con el producto EGL2 EC a las cinco dosis evaluadas, en ninguno de los dos tiempos ensayados (30 min y 2 h). La supervivencia en el control no tratado fue del 100 %.

Se observó una reducción significativa de la supervivencia de E. amylovora despúes de 30 min y 2 h de contacto con el antibiótico de referencia a una concentración de 100 mg/L.

A los 30 min de exposición, la concentración más baja testada del producto (10 pl/ml, mortalidad 100 %), presentó mayor actividad bactericida que el antibiótico de referencia estreptomicina.

Xanthomonas arboricola pv. pruni

En la figura 2 se muestra el gráfico de la supervivencia de X. arboricola pv. pruni en función del tratamiento aplicado y del tiempo de contacto estudiado. A los 30 min de contacto con el producto, no se observa supervivencia de X. arboricola pv. pruni a la dosis de 15 pl/ml. No obstante, a los 30 minutos de contacto con las dosis de 30 o 40 pl/ml se observa una supervivencia bacteriana media del 7,8 y 20,01 %, aunque estos resultados presentan una elevada variabilidad entre replicas (Fig. 2). A las 2 horas de contacto con el producto a las concentraciones de 40, 30 y 15 pl/ml no se observó crecimiento de X. arboricola pv pruni.

En las concentraciones de 7,5 y 3,75 |jl/ml no se observaron diferencias significativas en la supervivencia de X. arboricola pv. pruni en función del tiempo de contacto. En ambos casos se observó una reducción significativa de la supervivencia de la bacteria respecto el control no tratado (supervivencias de 13,06 % para la dosis de 3,75 jl/m l; 0,99 % para la dosis de 7,5 jl/m l; 100 % en el control no tratado).

A los 30 minutos de exposición a estreptomicina, se cuantificó una supervivencia media del 0,01 %, observándose una alta variabilidad entre las tres réplicas. Sin embargo, a las 2 horas de exposición no se observó supervivencia de X. arboricola pv. pruni en ninguna de las réplicas.

Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria

En la figura 3 se muestra la supervivencia de X. axonopodis pv. vesicatoria en función del tratamiento y del tiempo de contacto estudiado. A los 30 min y 2 horas del contacto con el producto, no se observó crecimiento bacteriano a las concentraciones de 15, 30 ni 40 jl/m l, presentando mayor actividad bactericida que el antibiótico estreptomicina. En las concentraciones de 7,5 y 3,75 jl/m l no se observaron diferencias significativas entre los dos tiempos ensayados y solo se observó una reducción de la supervivencia de la bacteria respecto el control no tratado en la concentración de 7,5 jl/m l. Concretamente, a 7,5 jl/m l se observaron valores de supervivencia similares a los obtenidos con el antibiótico estreptomicina (supervivencias a las 2 h de 8,2 % de producto 7,5 jl/m l; supervivencia de 3,06 % para 100 mg/L estreptomicina).

Pseudomonas syringae pv. actinidiae

En la figura 4 se muestra la supervivencia de P. syringae pv. actinidiae en función del tratamiento y del tiempo de contacto estudiado.

En las concentraciones de 40, 30, 15 y 7,5 jl/m l del producto y estreptomicina no se observó crecimiento de la bacteria en ninguno de los dos tiempos ensayados. Aunque en la concentración de 3,75 jl/m l se observó supervivencia del P. syringae pv. actinidiae a los 30 min y a las 2 horas (supervivencia del 0,1 %), se observó una reducción significativa del crecimiento respeto al control no tratado (supervivencia del 100 %).

Pseudomonas syringae pv. tomato

En la figura 5 se muestra la supervivencia de P. syringae pv. tomato en función del tratamiento y del tiempo de contacto estudiado.

1

En las concentraciones de 60, 40, 30, 15 |jl/ml del producto y estreptomicina no se observó crecimiento de la bacteria en ninguno de los dos tiempos ensayados A los 30 min, solo se observó una supervivencia del 0,0002 % del fitopatógeno en la concentración del producto más baja testada (7,5 jl/m l), y únicamente en una de las tres réplicas, respeto al control no tratado. A las 2 horas, no se observó crecimiento en ninguna de las concentraciones testadas ni en el antibiótico estreptomicina, respecto al control no tratado.

El producto presentó distinta actividad bactericida frente a las cinco bacterias fitopatógenas testadas: E. amylovora presentó unos valores de CMB por debajo de 10 jl/m l, la concentración más baja testada para este patógeno, tanto a los 30 min como a las 2 h. La CMB de P. syríngae pv. actinidiae se encontraría entre las dosis 3,75-7,5 jl/m l en los dos tiempos estudiados. Las dosis mas bajas testadas mostraron una rápida actividad bactericida del producto (a los 30 minutos se observó una mortalidad próxima al 100 %). Para P. syríngae pv. tomato la CMB estaría entre 7,5 y 15 jl/m l a los 30 minutos de contacto con el producto, disminuyendo a valores inferiores a 7,5 jl/m l después de 2 h de contacto. X. arborícola pv. pruni y X. axonopodís pv. vesicatoria presentaron una CMB superior a 40 jl/m l a los 30 min, mientras que a las 2 h la CMB se encontraba entre 3,75 y 7,5 jl/m l.

Estos resultados indican que en el caso de P. syríngae pv. tomato, X. arborícola pv. pruni y X. axonopodís pv. vesicatoria era necesario más tiempo de contacto de la suspensión bacteriana con el producto a las concentraciones mas bajas testadas para observar una mortalidad próxima al 100 %.

Los valores de CMB obtenidos se encuentran por debajo de la concentración de 15 jl/m l a las 2 horas de contacto con el producto en las distintas bacterias fitopatógenas utilizadas.

Tabla 5. DL50 y CMB del producto frente a los distintos fitopatógenos testados, expresado en jl/m l de producto.

nd: no se pudo determinar la DL50 debido a que en ninguna de las diluciones probadas se obtuvo crecimiento de la bacteria.

1

La dosis mediana efectiva (DL50) del producto frente a X. arboricola pv. pruni fue similar en los dos tiempos estudiados, 2,73 pl/ml a los 30 min y 2,78 pl/ml a las 2 h. Mientras que en P. syringae pv. actinidiae y X. axonopodis pv. vesicatoria variaron ligeramente entre los 2 tiempos estudiados. La DL50 para P. syringae pv. actinidiae fue de 0,55 pl/ml a los 30 min y de 0,93 pl/ml a las 2 h. Y para X. axonopodis pv. vesicatoria fueron de 4,5 pl/ml y 5,48 pl/ml. Esta variación se puede atribuir al ligero incremento de CFU/ml en el CNT después de 2 horas de incubación, y por consiguiente en el resto de tratamientos.

Para E. amylovora y para P. syringae pv. tomato a los 30 minutos y a las 2 horas no se ha podido calcular la DL50 ya que no se observó crecimiento en ninguna de las concentraciones del producto testadas. Para ello sería necesario evaluar el efecto bactericida de dosis inferiores a las testadas en este estudio.

Analizando los valores de CMB y de DL50, se puede confirmar que el producto presenta una clara y rápida actividad bactericida frente a E. amylovora, P. syringae pv. actinidiae, P. syringae pv. tomato, X. arboricola pv. pruni y X. axonopodis pv. vesicatoria.

P. syringae pv. actinidiae y P. syringae pv. tomato resultaron ser más sensibles al producto que X. arboricola pv. pruni y X. axonopodis pv. vesicatoria. No se puede descartar que E. amylovora sea más sensible que P. syringae pv. actinidiae o P. syringae pv. tomato debido a que la dosis más baja testada fue de 10 pl/ml.

Para poder determinar exactamente la CMI y DL50 del producto frente a las bacterias fitopatógenas sería necesario ensayar más concentraciones del producto dentro del intervalo de CMI observado.

Ejemplo 4: evaluación de la actividad bactericida contra tres subespecies de Xylella fastidiosa.

El producto de la presente invención se ensayó contra tres subespecies de Xylella fastidiosa. El producto evaluado comprendía aceite de eucalipto en cantidad suficiente como para comprender 20 % p/v de 1,8-cineol (medido por HPLC) y se conservó a temperatura ambiente hasta el momento de su uso, cuando se tomó una cantidad de muestra que se utilizó para realizar los análisis microbiológicos, y poder confirmar la ausencia de microrganismos contaminantes.

La eficacia del producto se evaluó frente tres subespecies de X. fastidiosa: sbsp. pauca cepa CoDiRO (DD1), que afecta a olivo en Italia, subsp. fastidiosa y subsp. multiplex ambas procedentes de focos de infección españoles (Baleares y Alicante, respectivamente) y aisladas de almendro, depositadas en la colección de patógenos de cuarentena del CIDSAV.

2

Se obtuvieron los inóculos a partir del cultivo puro de las cepas en crecimiento activo tras la siembra en medio BCYE agar e incubación a 28 °C durante 7-10 días. Cada suspensión bacteriana fue preparada a una concentración final de 1x108 UFC/ml.

Todas las manipulaciones se realizaron en el laboratorio de bioseguridad que está autorizado para investigación con X. fastidiosa en condiciones in vitro, por el DARP de la Generalitat de Catalunya.

Las cepas utilizadas en el ensayo de actividad bactericida fueron las siguientes:

Bacterias fitopatógenas Cepa utilizada Procedencia

Xylella fastidiosa subsp. fastidiosaIVIA 5387.2 Baleares

Xylella fastidiosa subsp. Multiplex IVIA 5901.2 Valencia

Xylella fastidiosa subsp. Pauca DD1 CoDiRO Italia

Se evaluó la actividad bactericida de 5 dosis del producto frente a 3 subespecies de X. fastidiosa. Teniendo en cuenta los resultados del ejemplo 2, se ensayaron las concentraciones de 0,75, 1,25, 2,5, 5 y 10 pl/ml del producto. Además, el efecto del producto se comparó con el de los antibióticos estreptomicina y ampicilina a una concentración de 100 mg/L. También se incluyó un control no tratado, donde se sustituyó el producto por agua destilada estéril.

La determinación de la actividad bactericida de las distintas concentraciones de producto frente a las bacterias fitopatógenas se realizó mediante un test de contacto con una suspensión de la bacteria en medio líquido.

El test de contacto consistió en mezclar 100 pL de cada producto/concentración con 100 pL de la suspensión bacteriana a una concentración de 108 UFC/ml, obteniéndose un volumen final de 200 pL en cada pocillo de la placa (suspensión bacteriana a una concentración final aproximadamente de 5x107 UFC/ml). Tanto las distintas dosis del producto como de los antibióticos se habían preparado dos veces concentradas (2x) para obtener la concentración final deseada en cada pocillo.

Las placas multipocillo se incubaron a 28 °C en agitación constante (150 rpm). A los 30 minutos (min) y a las 2 horas (h) de exposición de la bacteria con los productos, se tomaron muestras y se analizó su supervivencia mediante recuento de viables en placa. Las unidades formadoras de colonias (UFC) se contabilizaron a los 7-10 días después de su incubación a 28 °C determinando la supervivencia (UFC/ml), y se compararon con los obtenidos en el control no tratado. Se analizaron tres repeticiones para cada tratamiento.

A partir de la supervivencia (UFC/ml) obtenida en cada tratamiento, se determinaron la concentración mínima bactericida (CMB) y la dosis letal mediana (DL50). La CMB se determinó como la concentración de producto más baja a la que no se observa crecimiento bacteriano al final del experimento tras la incubación con el producto. Para el cálculo de la DL50, los datos de supervivencia en función de la concentración se transformaron mediante la función probit, se ajustaron a una recta y se realizó la interpolación para obtener la concentración en la que sólo se observa el crecimiento de la mitad de la población bacteriana inicial.

No se observó crecimiento de ninguna de las tres subespecies de Xylella fastidiosa después del contacto con el producto a las cinco dosis evaluadas, en ninguno de los dos tiempos ensayados (30 min y 2 h). La supervivencia en el control no tratado fue de aproximadamente el 100 %. La supervivencia de X. fastidiosa después del contacto con los antibióticos de referencia dependió de la subespecie estudiada, así como del antibiótico ensayado.

X. fastidiosa subsp. pauca cepa CoDiRO

El recuento de viables se realizó después de 8 días de la incubación a 28 °C en medio de cultivo PD2 agar. En la figura 6 se muestran los resultados frente a las concentraciones del producto y en función del tiempo de contacto.

No se observó crecimiento de X. fastidiosa subsp. pauca después del contacto con el producto a las cinco dosis evaluadas, en ninguno de los dos tiempos ensayados (30 min y 2 h). La supervivencia en el control no tratado fue del 100 %.

Se observó una supervivencia del 89,8 % y del 61,7% después de 30 y 120 minutos, respectivamente, del contacto con el antibiótico estreptomicina a una concentración de 100 mg/L. No se evaluó el efecto bactericida de la ampicilina.

A los 30 min de exposición, la concentración más baja testada del producto (0,75 pl/ml, mortalidad 100%), presentó mayor actividad bactericida que el antibiótico de referencia estreptomicina.

Xylella fastidiosa subsp. multiplex

El recuento de viables se realizó después de 8 días de la incubación a 28 °C en medio de cultivo BCYE agar. En la figura 7 se muestra el gráfico de la supervivencia de Xylella fastidiosa subsp. multiplex en función del tratamiento aplicado y del tiempo de contacto estudiado.

No se observó crecimiento de X. fastidiosa subsp. multiplex después del contacto con el producto a las cinco dosis evaluadas, en ninguno de los dos tiempos ensayados (30 min y 2 h). La supervivencia en el control no tratado fue del 100 %.

A los 30 y 120 minutos de exposición a ampicilina, se cuantificó una supervivencia media del 2 y 4,4 %, respectivamente. Después del contacto con el antibiótico estreptomicina, no se observaron diferencias significativas en la supervivencia de Xylella fastidiosa respecto del control no tratado.

A los 30 min de exposición, la concentración más baja testada del producto (0,75 pl/ml, mortalidad 100%), presentó mayor actividad bactericida que el antibiótico de referencia, ampicilina.

Xylella fastidiosa subsp. fastidiosa

El recuento de viables se realizó después de 8 días de la incubación a 28 °C en medio de cultivo PD2 agar. En la figura 8 se muestra la supervivencia de Xylella fastidiosa subsp. fastidiosa en función del tratamiento y del tiempo de contacto estudiado. A los 30 min y 2 horas del contacto con el producto, no se observó crecimiento bacteriano a ninguna de las dosis del producto testadas. La supervivencia en el control no tratado fue del 100 %. A los 30 y 120 minutos de exposición a estreptomicina, se cuantificó una supervivencia media del 4,4 y 20 %, respectivamente. A los 30 y 120 minutos de exposición al antibiótico ampicilina, no se observó supervivencia de X. fastidiosa subsp. fastidiosa en la suspensión directa ni a la dilución -1 (dilución 1/10 de la suspensión original). No obstante, al realizar las diluciones seriadas -2 (1/100) y -3 (1/1000) se obtuvo una supervivencia similar a la observada en el control no tratado, a la misma dilución. Este crecimiento bacteriano se relaciona con el hecho de que al diluir la suspensión bacteriana en contacto con ampicilina y posterior siembra en placas de medio agar en ausencia del antibiótico, también se diluye el antibiótico 1/100 y 1/1000 de modo que deja de presentar efecto. En este caso, la ampicilina presentaría un efecto bacteriostático sobre la subespecie fastidiosa. A diferencia del test del ejemplo 1, dónde se evaluaba la actividad antibacteriana mediante el Test de incorporación en agar (Agar Incorporation Test, el antibiótico está en contacto continuo con la suspensión bacteriana), en un test de contacto únicamente el antibiótico permanece en contacto directo con la suspensión bacteriana durante el tiempo de exposición seleccionado.

A los 30 min de exposición, la concentración más baja testada del producto (0,75 pl/ml, mortalidad 100%), presentó mayor actividad bactericida que los antibióticos de referencia ampicilina y estreptomicina.

2

El producto presentó una rápida actividad bactericida frente a las tres subespecies de Xylella fastidiosa testadas (a los 30 minutos se observó una mortalidad próxima al 100 %, Tabla 5). Los valores de CMB obtenidos se encuentran por debajo de la concentración de 0,75 pl/ml a los 30 y 120 minutos de contacto con el producto.

Tabla 6. DL50 y CMB del producto frente a los distintos fitopatógenos testados, expresado en pl/ml de producto.

nd: no se pudo determinar la DL50 con exactitud debido a que en ninguna de las diluciones probadas se obtuvo crecimiento de la bacteria.

Analizando los valores de CMB, se puede confirmar que el producto presenta una intensa y rápida actividad bactericida frente a Xylella fastidiosa. Para poder determinar exactamente la CMI y cuantificar la DL50 del producto frente a las tres subespecies de X. fastidiosa seria necesario ensayar más concentraciones del producto inferiores a 0.75 pl/ml.

Ejemplo 5: evaluación de la eficacia en el control de Erwinia amylovora en peral.

Las composiciones de la presente invención se ensayaron en el control de Erwinia amylovora en peral. El producto evaluado comprendía aceite de ecucalipto en cantidad suficiente como para que la composición tuviera 20 % p/v de 1,8-cineol y se conservó a temperatura ambiente.

Se utilizó la cepa EPS101 de E. amylovora, aislada de un brote infectado de peral Conference de Lleida, y conservada ultracongelada. Se obtuvo el inóculo a partir del cultivo puro de la cepa en crecimiento activo tras la siembra en medio LB agar e incubación a 28 °C durante 24 horas. La suspensión bacteriana fue preparada a una concentración final de 5x107 UFC/ml.

Para este ensayo se utilizaron plantas de peral de la variedad Conference procedentes de plantas autoenraizadas de 3 años de edad. Las plantas se fertilizaron una vez por semana con una solución de 200 ppm de NPK (20:10:20) y se utilizaron cuando los brotes contenían de 5 a 6 hojas jóvenes por brote. Durante el proceso se realizaron tratamientos estándar con insecticidas y acaricidas. No se aplicaron fungicidas ni bactericidas para evitar interferencias en el ensayo.

Se evaluó la eficacia de 2 dosis de las composiciones de la invención en el control de Erwinia amylovora en peral. Las dosis ensayadas fueron 40 y 20 pl/ml. Además, el efecto del producto se comparó con el del antibiótico estreptomicina a una concentración de 100 mg/L. También se incluyó un control no tratado, donde se substituyó el producto por agua destilada estéril.

El diseño experimental consistió en 3 repeticiones de 3 plantas por tratamiento, con un mínimo de dos brotes tiernos por planta (la mayoría presentaba más de 3 brotes tiernos). El ensayo se realizó dos veces de manera independiente.

Los ensayos se realizaron en un invernadero de seguridad biológica bajo las medidas de contención adecuadas según los protocolos establecidos por la Organización Europea y Mediterránea para la Protección de las Plantas (EPPO) para fitopatógenos de cuarentena. Las condiciones del invernadero de temperatura, humedad relativa y ciclos de luz fueron completamente controladas.

Antes de tratar las plantas y con la finalidad de facilitar la entrada del patógeno, se realizaron 2 cortes paralelos de 2 mm de longitud separados 1 mm de distancia y perpendiculares al nervio central, en las 3 hojas más jóvenes de cada brote, ya que éstas son las más susceptibles a la infección.

Los tratamientos se realizaron mediante pulverización foliar aplicando un mínimo de 10 ml por planta, asegurando la impregnación de toda la superficie foliar.

Después de los tratamientos se procedió a la inoculación de la cepa EPS101 de E. amylovora que se realizó mediante la aplicación de 10 pl de una suspensión bacteriana a 5x107 UFC/ml sobre cada una de las heridas previamente realizadas. Una vez inoculadas se embolsaron para mantener una alta humedad relativa, necesaria para el desarrollo de la enfermedad y se incubaron durante 8 días a 25 ± 2 °C y 16 horas de luz y a 20 ± 2 °C y 8 horas de oscuridad. Los niveles de enfermedad se determinaron a los 8 días después de la inoculación del patógeno mediante la asignación de un índice de intensidad de la infección con valores de 0 a 4, en función de la progresión de los síntomas: 0, sin necrosis; 1, necrosis localizada alrededor de la herida; 2, necrosis total del nervio central; 3, progresión de la necrosis a través del pecíolo; y 4, progresión de la necrosis al brote.

La severidad de las infecciones en cada uno de los tratamientos se calculó según la fórmula siguiente:

2

donde S es la severidad de la infección por repetición, I es el índice de severidad por infección, n es el número de hojas inoculadas.

Una vez obtenida la severidad en cada réplica para cada tratamiento, se determinó la existencia de diferencias significativas mediante ANOVA y se realizó la separación de medias con el test de Waller-Duncan utilizando el paquete estadístico SPSS (IBM SPSS Statistics v25).

En la figura 9 se muestran los resultados correspondientes a la severidad de las infecciones observadas en los dos ensayos de eficacia del producto en el control de E. amylovora en las plantas de peral.

En el primer ensayo se observó que las dos dosis del producto y la estreptomicina redujeron significativamente la severidad de las infecciones respeto al control no tratado. No se observaron diferencias significativas entre las dos dosis estudiadas. La estreptomicina a una dosis de 100 mg/L fue el tratamiento más efectivo.

En el segundo ensayo, los niveles de severidad de las infecciones causadas por E. amylovora fueron superiores a los observados en el primer ensayo. Las dos dosis del producto y la estreptomicina también redujeron significativamente la severidad de las infecciones respeto al control no tratado. A diferencia del primer ensayo, no se observaron diferencias significativas entre las dosis de 20 y 40 pl/ml del producto y la estreptomicina.

El producto presentó una eficacia del 30 al 62 % en el control de E. amylovora en plantas de peral, dependiendo de la dosis y del ensayo. Concretamente, la dosis de 20 pl/ml presentó una eficacia del 37 % en el primer ensayo y del 36 % en el segundo. Y la dosis de 40 pl/ml presentó un 62% y un 30%, respectivamente.

Ejemplo 6: evaluación in planta de la eficacia del producto en el control de Xylella fastidiosa.

La eficacia del producto se evaluó frente Xylella fastidosafastidiosa subsp. fastidiosa procedente de focos de infección españoles (Baleares) y aislada de almendro, depositada en la colección de patógenos de cuarentena del CIDSAV. El producto evaluado comprendía aceite de eucalipto en cantidad suficiente como para tener 20 % p/v de 1,8-cineol (cauntificado por HPLC) y se conservó a temperatura ambiente.

2

Se obtuvo el inóculo a partir del cultivo puro de la cepa en crecimiento activo tras la siembra en medio BCYE agar e incubación a 28 °C durante 7-10 días. La suspensión bacteriana fue preparada a una concentración final de 1x108 UFC/ml. El producto se conservó a temperatura ambiente hasta el momento de su uso.

El patógeno se inoculó mediante microinyección aplicada al tronco. 27 días después de la inoculación las plantas se trataron con el producto mediante microinyección aplicada al tronco, en estrategia curativa (después de la inoculación del patógeno), y una sola aplicación. Se ensayaron dos dosis del producto, y se utilizó como producto de referencia el antibiótico ampicilina. Además, se incluyó un control no tratado (agua en lugar de producto).

Se cuantificaron los niveles poblacionales totales mediante qPCR convencional y las células viables mediante viable-qPCR (PMAxx-qPCR)

Se utilizaron plantas de almendro de la variedad Avijor, y se mantuvieron en maceta en el invernadero, mediante condiciones de cultivo estándar. Se inocularon 40 plantas (10 por tratamiento) con una suspensión bacteriana de la cepa 5387.2 (tres puntos de inoculación en un tramo de 4-5 cm). Durante los días posteriores, se testó la presencia de Xylella fastidiosa en los vasos conductores, y si ésta estaba viva y si ascendía por el tejido vascular (mediante qPCR de viables). Se analizó por qPCR la zona de inoculación y la zona apical (alejada del punto de inoculación) a los 7, 15 y 27 dpi (qPCR viables). A los 27 días se confirmó la presencia de Xylella fastidiosa viva en el tejido vascular. Ese mismo día se aplican los diferentes tratamientos (dosis de 20 pl/ml y 40 pl/ml, Ampicilina 100 mg/L, Agua). Durante la aplicación del producto (tres puntos de inoculación en un tramo de 4-5 cm. 10 pl por punto) se observa que éste se absorbe con dificultad, debido seguramente a su composición. Por ello, después de su aplicación, las plantas se mantienen en posición horizontal durante 18 h, con la finalidad de aumentar la absorción del producto por parte de la planta.

31 días después de la aplicación de los distintos tratamientos (dpt) se observaron síntomas en las hojas que se podían atribuir a los síntomas típicos asociados a enfermedades causadas por Xylella fastidiosa en almendro. La intensidad de los síntomas incrementó a lo largo del tiempo, observándose una mayor severidad de la enfermedad en las plantas control. Los niveles de enfermedad se determinaron a los 31 días después de la aplicación del producto (en estrategia curativa) mediante la asignación de un índice de intensidad de la infección con valores de 0 a 5, en función de la progresión de los síntomas: 0, sin necrosis; 1, una o dos hojas mostrando necrosis marginal; 2, dos o tres hojas mostrando necrosis marginal; 3, la mitad o más de las hojas muestran necrosis; 4, todas las hojas muestran necrosis y 5, todas las hojas y el tallo muestran necrosis.

En la figura 10 se muestran los resultados correspondientes a la severidad de las infecciones observadas en el ensayo de eficacia del producto en el control de Xylella fastidiosa subsp. fastidiosa en las plantas de almendro. Se observó que las dos dosis testadas del producto y la ampicilina redujeron significativamente la severidad de las infecciones respeto al control no tratado. No se observaron diferencias significativas entre las dos dosis estudiadas ni el tratamiento con ampicilina (100 mg/L).

18 horas después de la aplicación de los distintos tratamientos se realiza una extracción de savia de la zona cercana al punto de inoculación y de la zona apical de la planta (8 cm de cada zona). En algunas plantas control no se obtuvo savia, muy probablemente debido a la necrosis producida por la obstrucción de savia consecuencia de la formación del biofilm de Xylella fastidiosa. Cuando existe necrosis del tejido, las bacterias no suelen detectarse por PCR o qPCR. Además, la mayoría de las células que forman parte del biofilm están muertas (lo que conlleva la degradación del ADN). Esto sumado al hecho que las células en biofilm son difíciles de extraer, no permite obtener resultados reales de la cuantificación/detección de Xylella fastidiosa mediante qPCR/viable-qPCR (generalmente se obtiene el resultado ND, no detectado).

Después de la aplicación del producto a 40 pl/ml, se observó disminución de bacterias viables en el tejido vascular de la zona apical, en el 75 % de las plantas analizadas (el número de células totales, es decir viables, y muertas, fue superior al número de células viables detectadas por viable-qPCR). Es decir, se puede asociar a una actividad bactericida del producto 18 h después de su aplicación. Con el resto de tratamientos se observa una disminución de la viabilidad de Xylella fastidiosa en únicamente 1 de las 4 plantas analizadas (25 %).

El análisis de la savia 18 horas dpt con un muestreo de 4 plantas por tratamiento reveló que el tratamiento con la dosis de 20 pl/ml provocó la disminución de viables en la zona apical del 25 % de las plantas (analizada por viable-qPCR), mientras que el tratamiento con la dosis de 40 pl/ml provocó la disminución de viables en la zona apical del 75 % de las plantas. El tratamiento con ampicilina (100 mg/L) provocó la disminución de viables en el punto de inoculación del 25 % de las plantas y los controles no tratados mostraron una disminución de viables en la zona apical del 25 % de las plantas.

14 días después de la aplicación del producto se analizan hojas apicales pero cercanas al punto de inoculación y hojas de la zona apical (en este caso no analizamos xilema, porque se trata de un método destructivo, y reduciríamos el número de plantas que nos quedarían para analizar al final del experimento). Mediante qPCR observamos una menor progresión de Xylella fastidiosa por el sistema vascular (movimiento desde el punto de inoculación hasta la

2

zona apical de la planta) de plantas tratadas curativamente con 40 pl/ml de producto, comparada con el control no tratado. No se observa este efecto después del tratamiento con 20 pl/ml de producto o con el antibiótico de referencia ampicilina (100 mg/L).

Con la finalidad de estudiar la progresión de Xylella fastidiosa por los vasos conductores, 31 días después de la aplicación de los distintos tratamientos se realizó una extracción de savia de tres zonas distintas de la planta (8 cm de cada zona). Se analizan las muestras mediante qPCR convencional (células totales).

Zona apical 1 (A1): Zona por encima del punto de aplicación del producto.

Zona apical 2 (A2): Zona mas cercana al meristemo apical del tallo.

Zona basal (B): Zona que se localiza entre el punto de inoculación y el inicio del sistema radicular.

Del mismo modo que ocurría con el análisis 1 dpt, se observa cómo el volumen de savia extraída de las plantas control después de 31 días de tratamiento (y algunas de las plantas tratadas con ampicilina) es muy inferior al resto de tratamientos. Además, se puede relacionar con la mayor necrosis observada en los tallos de las plantas control, relacionado con la mayor severidad de la enfermedad observada (a los 31 dpt), respecto el resto de tratamientos.

Con la dosis de 20 pl/ml no se observa movimiento descendente de Xylella fastidiosa desde las zonas apicales a la zona basal en ninguna de las plantas analizadas. Tampoco se detecta Xylella fastidiosa en A1 en el 25 % de las plantas. Tampoco se detecta Xylella fastidiosa en A2 en el 25 % de las plantas No se detecta Xylella fastidiosa en B en el 100 % de las plantas.

Con la dosis de 40 pl/ml no se observa movimiento ascendente de Xylella fastidiosa desde la zona apical 1 a la zona apical 2 en ninguna de las plantas analizadas. Únicamente se observa progresión de Xylella fastidiosa hacia la zona basal en el 25 % de las plantas. No se detecta Xylella fastidiosa en A1 en el 25 % de las plantas. No se detecta Xylella fastidiosa en A2 en el 100 % de las plantas No se detecta Xylella fastidiosa en B en el 75 % de las plantas.

Con el tratamiento con ampicilina se observa movimiento ascendente (zonas apicales) y descendiente (zona basal) de Xylella fastidiosa en el 75 % de las plantas analizadas No se detecta Xylella fastidiosa en A1 en el 25 % de las plantas No se detecta Xylella fastidiosa en A2 en el 25 % de las plantas No se detecta Xylella fastidiosa en B en el 25 % de las plantas.

En los controles no tratados, en el tallo se observa necrosis y/o biofilm, sobre todo en el tallo correspondiente a las zonas apicales.

2

Después del tratamiento con la dosis de 40 pl/ml, en el 75 % de las plantas se detecta Xylella fastidiosa en la zona apical 1. No obstante, en el 100 % de las plantas analizadas, no se observa Xylella fastidiosa en la zona apical 2. Además, no se detecta Xylella fastidiosa en la zona basal del 75 % de las plantas analizadas. Este hecho implica que no hay movimiento de Xylella fastidiosa desde la zona Apical 1 al resto de zonas de la planta (Apical 2 y basal). Después del tratamiento con la dosis de 20 pl/ml no se observa movimiento de Xylella fastidiosa desde las zonas apicales a la zona basal de las plantas. Por el contrario, después del tratamiento con el antibiótico de referencia ampicilina a una dosis de 100 mg/L, se observa movimiento ascendente y descendiente de Xylella fastidiosa a lo largo del sistema vascular en el 75 % de las plantas analizadas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una composición líquida que comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda entre 5 y 80 % p/v de 1,8-cineol como bactericida en la protección de plantas, donde dicha composición se aplica a las plantas tras ser diluida en agua hasta entre 0,01 y 12 % en peso, donde dicha protección es contra infecciones de Xylella fastidiosa, Pseudomonas syringae, Xanthomonas fragariae, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas arborícola, Erwinia amylovora o cualquier combinación de las mismas.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación anterior, donde dicha protección es contra infecciones de Xylella fastidiosa o Pseudomonas syringae.

3. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la protección se aplica a árboles frutales y hortícolas, preferiblemente a vid, olivo, almendro, avellano, nogal, kiwi, tomate, fresa, patata, melocotonero, albaricoque, ciruelo, naranjo, limonero, mandarino, manzano, peral, membrillo, cafeto.

4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la protección se aplica al peral, el almendro o el olivo.

5. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda entre 15 y 25 % p/v de 1,8-cineol.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda 20 % p/v de 1,8-cineol.

7. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición además comprende al menos un diluyente, al menos un tensioactivo y al menos un antioxidante.

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende entre 40 y 70 % p/v de diluyente o diluyentes.

9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende entre 1,00 y 8,00 % p/v de tensioactivo o tensioactivos.

10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende 0,10 y 1,00% p/v de antioxidante o antioxidantes.

11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos un diluyente es agua.

12. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende entre 40 y 70 % p/v de agua.

13. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición además comprende al menos un viscosizante en una cantidad suficiente como para que la viscosidad de la composición sea de entre 500 y 5000 cP, calculada según el método CIPAC MT 192 con un viscosímetro rotacional con aguja 2, 20 rpm y a 25 °C.

14. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende entre 0,10 y 5,00% p/v de viscosizante o viscosizantes.

15. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición tiene una distribución volumétrica de tamaño de partícula con d10 entre 0,1 y 5 micras y d90 entre 0,8 y 50 micras, medida por difracción láser de acuerdo con el método CIPAC MT 187.

16. Una composición líquida que comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda entre 10 y 30 % p/v de 1,8-cineol, al menos un diluyente, al menos un tensioactivo y al menos un antioxidante, donde al menos un diluyente es agua, donde dicha composición además comprende al menos un viscosizante en una cantidad suficiente como para que la viscosidad de la composición sea de entre 500 y 5000 cP, calculada según el método CIPAC MT 192 con un viscosímetro rotacional con aguja 2, 20 rpm y a 25 °C.

17. La composición de acuerdo con la reivindicación anterior, donde dicha composición comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda entre 16 y 25 % p/v de 1,8-cineol.

18. La composición de acuerdo con cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende aceite de eucalipto en una cantidad suficiente para que la composición comprenda entre 18,00 y 22,00 % p/v de 1,8-cineol.

19. La composición de acuerdo con cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende entre 40 y 70 % p/v de diluyente o diluyentes.

20. La composición de acuerdo con cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende entre 1,00 y 8,00 % p/v de tensioactivo o tensioactivos.

21. La composición de acuerdo con cualquiera de las cinco reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende entre 0,10 y 1,00% p/v de antioxidante o antioxidantes.

22. La composición de acuerdo con cualquiera de las seis reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende entre 40 y 70 % p/v de agua.

23. La composición de acuerdo con cualquiera de las siete reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende entre 0,10 y 5,00% p/v de viscosizante o viscosizantes.

24. La composición de acuerdo con cualquiera de las ocho reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende una cantidad suficiente de viscosizante(s) como para que la viscosidad de la composición sea de entre 500 y 1500 cP, calculada según el método CIPAC MT 192 con un viscosímetro rotacional con aguja 2, 20 rpm y a 25 °C.

25. La composición de acuerdo con cualquiera de las nueve reivindicaciones anteriores, donde dicha composición tiene una distribución volumétrica de tamaño de partícula con d10 entre 0,1 y 5 micras y una d90 entre 0,5 y 50 micras, preferiblemente una d10 entre 0,1 y 2 micras y una d90 entre 0,5 y 8 micras, medida por difracción láser de acuerdo con el método CIPAC MT 187.

26. La composición de acuerdo con cualquiera de las diez reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende además de agua otro codiluyente seleccionado de entre al menos un aceite vegetal o animal o mezclas de ácidos grasos y sus ésteres, al menos un aceite mineral de tipo parafínico, al menos un éster metílico C¹⁶-C¹⁸., al menos un alcohol C¹-C⁵, ciclohexanona, acetofenona, xileno, nafta aromática o mezclas de los mismos.

27. La composición de acuerdo con cualquiera de once reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende como diluyentes agua y al menos un aceite vegetal.

28. La composición de acuerdo con cualquiera de las doce reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende como diluyentes agua y aceite de sésamo.

29. La composición de acuerdo con cualquiera de las trece reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende como tensioactivo al menos uno seleccionado de entre aceite de ricino etoxilado, ésteres de sorbitán etoxilados (polisorbatos), derivados de alcoholes grasos polietoxilados, poliarilfenil éter fosfato, un tensioactivo polimérico de alto peso molecular y bajo equilibrio hidrofílico-lipofílico (HLB) y un tensioactivo polimérico de alto HLB formado por copolímeros de bloque de óxido de etileno/óxido de propileno.

30. La composición de acuerdo con cualquiera de las catorce reivindicaciones anteriores, donde dicha composición comprende como tensioactivo al menos uno seleccionado de entre derivados de alcoholes grasos polietoxilados, poliarilfenil éter fosfato, un tensioactivo polimérico de alto peso molecular y bajo HLB y un tensioactivo polimérico de alto HLB formado por copolímeros de bloque de óxido de etileno/óxido de propileno.

31. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 30, como fitosanitario.

32. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 30, como bactericida en la protección de plantas, preferiblemente para la protección de árboles frutales y hortícolas, más preferiblemente para la protección de vid, olivo, almendro, avellano, nogal, kiwi, tomate, fresa, patata, melocotonero, albaricoque, ciruelo, naranjo, limonero, mandarino, manzano, peral, membrillo, cafeto o cualquier combinación de las mismas.

33. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 30, para su uso como bactericida de acuerdo con la reivindicación anterior, contra infecciones de Xylella fastidiosa, Pseudomonas syringae, Xanthomonas fragariae, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas arborícola, Erwinia amylovora o cualquier combinación de las mismas, preferiblemente contra la infección de Xylella fastidiosa o Pseudomonas syringae.