ES2799829T3

ES2799829T3 - Proteínas de fusión recombinantes para la prevención o el tratamiento de adherencias en tejidos u órganos

Info

Publication number: ES2799829T3
Application number: ES15753942T
Authority: ES
Inventors: Klaus Rübsamen; Stephan Witte
Original assignee: Akesion GmbH
Current assignee: Akesion GmbH
Priority date: 2014-08-26
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2020-12-21
Anticipated expiration: 2035-08-20
Also published as: EP3185891B1; PL3185891T3; JP7025928B2; CA2959198A1; US20170253864A1; US20210189368A1; US10837007B2; WO2016030278A1; DE102014112212A1; JP2017526746A; CN107109387A; EP3185891A1

Abstract

Proteína de fusión recombinante que incluye una enzima fibrinogenolítica con una secuencia de aminoácidos, que está unida en el extremo C y/o en el extremo N con la secuencia de aminoácidos de al menos un dominio de estabilización inerte de alto peso molecular con un peso molecular de > 50 kDa, para su uso en la prevención o el tratamiento de adherencias peritoneales después de intervenciones quirúrgicas en la cavidad peritoneal.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión recombinantes para la prevención o el tratamiento de adherencias en tejidos u órganos

Bajo condiciones de curación normales, el organismo de los mamíferos reacciona a una lesión con procesos de cicatrización que se desarrollan de forma específica. Éstos conducen a la formación de fibrina, una sustancia pegajosa responsable del cierre de las heridas. El fibrinógeno, el precursor de la fibrina, circula en la sangre y sale en el área de la lesión en forma de líquido de herida (exudado). El fibrinógeno se transforma en fibrina insoluble por la acción de trombina formada localmente, de modo que la herida se cierra en un plazo de unos minutos. La fibrina en exceso se descompone rápidamente mediante la acción de plasmina a través del sistema fibrinolítico endógeno que se activa simultáneamente.

Campo técnico:

Las adhesiones de tejido o adherencias son el resultado de un proceso de cicatrización mal dirigido, que se ha de atribuir a un desequilibrio del sistema fibrinolítico endógeno (Hellebrekers et al., 2005; Hellebrekers & Kooistra, 2011). En caso de lesiones en el abdomen provocadas por accidente o por cirugía, la descomposición de fibrina resulta perjudicada por la activación de inhibidores de plasmina, en particular por PAI-1, PAI-2 y a²-antiplasmina. La fibrina en exceso no descompuesta conduce en consecuencia a adherencias de tejidos y órganos adyacentes, que en unos días se transforman en adherencias permanentes mediante el crecimiento de fibroblastos y vasos sanguíneos (Arung et al., 2011). Estas adherencias se pueden producir tanto entre órganos independientes como entre órganos y el peritoneo. La limitación de la movilidad de los órganos provocada por ello se manifiesta en muchos casos en forma de dolores crónicos o, en caso de pacientes de sexo femenino, en esterilidad, y en casos graves, debido a la degradación de la peristalsis intestinal, puede conducir a una oclusión intestinal potencialmente mortal.

Estado de la técnica:

De acuerdo con un análisis retrospectivo de la Scottish National Health Service Medical Record Linkage Database, en mucho más de la mitad de todas las intervenciones quirúrgicas en el abdomen aparecen adherencias (Ellis et al.

1999). Aproximadamente en una tercera parte de los pacientes con adherencias, los síntomas clínicos fueron tan graves que tuvieron que ser operados de nuevo ya en el primer año después de la operación. La gran cantidad de operaciones múltiples muestra que el riesgo de más adherencias aumenta significativamente con la cantidad de operaciones (Parker et al, 2001,2005).

De acuerdo con un metaanálisis de 196 estudios con un total de 150.797 pacientes, después de un 9% de las operaciones abdominales se produjo una oclusión intestinal como complicación grave (Broek et al., 2013a), confirmándose en el intraoperatorio en cirugías de emergencia que la adherencia fue la causa de un 2% de las oclusiones. En un 6% de las operaciones posteriores para la eliminación de adherencias se ocasionaron daños consecuentes graves en órganos internos. En este contexto, las lesiones del intestino durante la eliminación quirúrgica de adherencias constituyen el factor de riesgo aislado más importante (Brummer et al. 2011). Los costes adicionales del gasto en tiempo y material a causa de las adherencias son considerables. En 138 hospitalizaciones debidas a obstrucciones intestinales posoperatorias (Kossi et al. 2003) se requirieron en total 1.118 días de tratamiento estacionario.

Sobre la base de los datos de la "2005 Healthcare Cost and Utilization Project’s Nationwide Inpatient Sample", Sikirica et al. (2011) calcularon unos costes totales de 2.300 millones de dólares estadounidenses para la eliminación de secuelas quirúrgicas producidas por adherencias. De ellos, 1.400 millones de dólares estadounidenses correspondieron a la adhesiolisis primaria y 926 millones de dólares estadounidenses a adhesiolisis secundarias. Las secuelas de operaciones abdominales producidas por adherencias ocasionaron un total de 57.005 días de hospitalización adicionales. De acuerdo con un análisis de los datos sobre enfermedades basados en la "National Hospital Discharge Database" de EE. UU., 1994, para la eliminación posterior de adherencias se requirieron en total 846.415 días de hospitalización adicionales, que ocasionaron unos gastos adicionales de 1.300 millones de dólares estadounidenses al año (Ray et al., 1998).

Estos datos farmacoeconómicos demuestran la necesidad y el beneficio potencial, tanto para el paciente individual como para el sistema sanitario, de una profilaxis de adherencias eficaz y segura. La única terapia posible de adherencias peritoneales consiste en la separación quirúrgica de las superficies unidas por crecimiento y los órganos. Debido al riesgo elevado de formación de nuevas adherencias a causa de la nueva intervención, los métodos profilácticos adecuados para reducir el riesgo de formación de adherencias tienen una especial importancia.

Como métodos profilácticos para evitar adhesiones y adherencias se puede optimizar la técnica quirúrgica o se pueden utilizar métodos mecánicos para la separación física de las superficies dañadas. Por último, existen estrategias farmacológicas para influir en los procesos fisiopatológicos subyacentes (resumidas en Arung et al., (2011); Schnüriger et al., (2011)).

Mediante el empleo de técnicas quirúrgicas mínimamente invasivas (laparoscopia), el riesgo de adhesiones y adherencias parece ser algo menor en comparación con la técnica quirúrgica convencional con el abdomen abierto (laparotomía) (Broek et al., 2013b; Schnüriger et al., 2011). La diferencia se debe presumiblemente al menor tamaño de la superficie de la herida en comparación con la laparotomía, la menor manipulación de los tejidos y órganos, y el menor riesgo de infección en general de esta técnica quirúrgica (SCAR Group, 2013). A pesar de las numerosas mejoras de la técnica quirúrgica, las adherencias como consecuencia de intervenciones quirúrgicas en el abdomen representan un riesgo inalterablemente alto de complicaciones, como por ejemplo dolores crónicos, esterilidad o incluso oclusión intestinal (Wallwiener et al., 2014).

Otro método utilizado actualmente para reducir el riesgo de adherencias posoperatorias consiste en la separación mecánica de las áreas de tejido dañadas mediante el uso de barreras de diferentes materiales biocompatibles o mediante la instilación de una cantidad mayor de líquido en el abdomen. La medida utilizada con mayor frecuencia consiste en la introducción de membranas finas de materiales biodegradables, que se introducen y se fijan entre las superficies dañadas. Mediante la separación mecánica de las superficies de los órganos, éstos se pueden curar de forma aislada, lo que ha de conducir a la prevención de adherencias. Sobre la superficie dañada se colocan como membrana, por ejemplo, composiciones como ácido hialurónico y carboximetil celulosa (Seprafilm). Además, se utilizó ácido hialurónico para evitar adherencias en caso de miomectomía, lo que condujo a una reducción de las adherencias (Fossum et al. 2011). Otras composiciones conocidas son polietilenglicoles formadores de gel, óxido de polietileno en combinación con carboximetil celulosa sódica o celulosa regenerada oxigenada. Otros ejemplos de barreras de adherencia de este tipo se describen en la publicación US 8629314A y, en forma de una nueva barrera de adherencia de múltiples capas, en el documento US 20080254091A.

Algunas estrategias experimentales abordan la utilización de sustancias químicas con el objetivo de intervenir en el proceso fisiopatológico de la formación de adherencias en una etapa temprana. Esta fase inicial de la adherencia, que solo dura unas horas, se caracteriza por una inflamación local persistente y una activación de la coagulación, seguida de una permeabilidad elevada de los vasos que conduce a la acumulación de un exudado rico en fibrina que cubre la superficie (Hellebrekers y Kooistra 2011). Estados como la hipoxia tisular (Saed y Diamond 2004) y la respuesta inmunitaria celular inducida por macrófagos, células T y citoquinas son factores que refuerzan la formación de adherencias (Binnebosel et al. 2011). El segundo día, la superficie de la herida ya está cubierta por macrófagos, fibroblastos y células mesoteliales, que se unen en poco tiempo formando una capa cerrada entremezclada con mastocitos, fibroblastos y células endoteliales recién formadas. Esta formación irreversible de una matriz sólida es la base del posterior crecimiento, caracterizado por fibrillas de colágeno en forma de banda y el crecimiento de vasos sanguíneos y fibras de tejido conjuntivo.

Por lo tanto, el suceso central en la formación de adherencias consiste en la formación de una capa de fibrina local a partir del precursor fibrinógeno. Bajo condiciones normales existe un equilibrio entre la formación de fibrina y la descomposición de fibrina mediante plasmina, cuya actividad enzimática es regulada a su vez por los inhibidores PAI-1, PAI-2 y a²-antiplasmina. Los datos experimentales muestran que los fibroblastos que aparecen en el área de adherencias presentan una concentración reducida de activador de plasminógeno con una formación elevada de inhibidor del activador de plasminógeno, lo que favorece la creación de una matriz de fibrina (Diamond et al. 2004). Esta observación se confirmó en un estudio prospectivo en pacientes con endometriosis (Hellebrekers et al. 2005).

Por lo tanto, la inhibición de la reacción inflamatoria, el aumento de la actividad fibrinolítica y la influencia en la coagulación parecían puntos de ataque terapéutico adecuados para impedir la formación de adherencias. Por ello, en numerosos experimentos se ha intentado compensar la falta de actividad fibrinolítica endógena mediante la administración de sustancias con actividad fibrinolítica. Los documentos EP 0318801B1, US 5578305A, EP 0297860B1 y EP 0227400B1 describen por ejemplo la utilización de rt-PA en hidrogel de hidroxietil celulosa y otras matrices como medio eficaz para evitar adherencias. También se han propuesto para esta aplicación modificaciones con r-tPA con afinidad de fibrina elevada (EP 0517756B1). La inhibición de la formación de fibrina mediante el uso de inhibidores de trombina descrita en el documento EP 0874634B1 representa otra estrategia para evitar la adherencia en una etapa temprana. El documento EP 0473689B1 describe el uso de activadores de plasminógeno como uroquinasa, estreptoquinasa y t-PA y se remite a la escasa vida media en la sangre. Como solución se propone el acoplamiento de activadores de plasminógeno con un fragmento de fibrina.

Mediante una administración intraperitoneal reiterada de rt-PA se pudo reducir la formación de adherencias en un modelo de ratón, en donde sin embargo el efecto no dependía de la dosis (Binda et al. 2009). En un modelo de adherencia en ratas se administró el activador de plasminógeno t-PA, uroquinasa o estreptoquinasa a lo largo de 4 días, bien con ayuda de una matriz de hidrogel biodegradable, bien mediante 4 inyecciones i.p. diarias. El t-PA liberado de una matriz redujo las adherencias de un 72 ± 15% (control) a un 4 ± 3%, mientras que las inyecciones intraperitoneales solo redujeron las adherencias a un 49 ± 8% (Hill-West et al. 1995). En resumen, los resultados obtenidos con sustancias fibrinolíticas son insatisfactorios.

A pesar de estos resultados experimentales negativos, el rt-PA se ensayó en un estudio prospectivo en 26 pacientes con miomectomía bajo condiciones clínicas (Hellebrekers et al. 2009). Entre los dos grupos no se observó ninguna diferencia significativa en la frecuencia de las adherencias. La frecuencia y la gravedad de las adherencias estaban en correlación con las concentraciones de PAI-1 medidas antes de la operación y, por consiguiente, apuntan a la importancia del sistema fibrinolítico para la formación de adherencias. Sin embargo, para tener éxito en la prevención se requieren concentraciones de t-PA relativamente altas, que no se alcanzaron en este estudio debido a la corta vida media biológica del rt-PA. Por lo tanto, estas sustancias tampoco son adecuadas para una utilización preventiva o terapéutica con el fin de evitar adherencias en compartimentos tisulares después de lesiones de la cavidad abdominal.

Por lo tanto, todos los métodos farmacológicos utilizados hasta ahora para reducir el riesgo de adherencias han demostrado en general ser poco eficaces en estudios clínicos. En particular fue decepcionante la eficacia de sustancias con acción fibrinolítica. Esto se ha de atribuir presumiblemente a que las altas concentraciones de inhibidor del activador de plasminógeno (PAI-1, PAI-2) inhiben la actividad fibrinolítica de sustancias fibrinolíticas aportadas de forma exógena. Para lograr una alta eficacia de las sustancias fibrinolíticas se requieren dosis muy altas, pero éstas conducen a efectos secundarios sistémicos, en particular hemorragias, debido a la reabsorción de estas sustancias a través de la membrana peritoneal. De este modo no se asegura la prevención libre de efectos secundarios o la disgregación temprana de los puentes de fibrina formados como causa de adherencias.

Por lo tanto, la eliminación del fibrinógeno, el precursor de la fibrina, para inhibir la formación de ésta ya en la etapa inicial, parece más prometedora. La idoneidad de enzimas fibrinogenolíticas para la profilaxis de adherencias posoperatorias se ha investigado en experimentos animales por ejemplo con la enzima ancrodo aislada del veneno de la víbora malaya, Calloselasma rhodostoma, (Ashby et al, 1969; Buckman et al., 1975; Chowdhury, & Hubbell, 1996). El ancrodo disocia específicamente el enlace de arginina-glicina de la cadena Aa del fibrinógeno. A diferencia de la trombina, el ancrodo no disocia la cadena Bp. Los monómeros de des-A-fibrina resultantes de ello se polimerizan después de la disociación de los fibrinopéptidos formando fibrina soluble de cadena corta, que no está reticulada y es eliminada rápidamente por plasmina y el sistema reticuloendotelial. Por lo tanto, mediante la administración intravenosa o intraperitoneal de ancrodo se puede reducir de forma controlada la concentración de fibrinógeno en la sangre. En las investigaciones mencionadas, esto condujo a una inhibición prácticamente completa, dependiente de la dosis, de la formación de adherencias. Debido al bajo peso molecular de < 40 kDa, el ancrodo puede pasar rápidamente de la cavidad abdominal al sistema circulatorio sanguíneo, donde conduce a la inhibición de la coagulación. En caso de una concentración correspondientemente alta en la sangre, esto puede conducir a hemorragias locales.

Además, también se conocen composiciones farmacéuticas de una proteína de fusión de ancrodo, que se utilizan para la disolución de coágulos de sangre. Así, el documento EP 0395375 A1 describe una proteína de fusión entre ancrodo y un polipéptido 5'-terminal, que puede incluir de 2 a 1.000 aminoácidos. Sin embargo, en dicho documento no se describe una utilización de esta proteína de fusión para el tratamiento de adherencias posoperatorias.

Del mismo modo actúa la batroxobina obtenida del veneno de la serpiente sudamericana Bothrops atrox, que también disocia selectivamente el fibrinógeno y de este modo reduce la concentración de fibrinógeno. Por ejemplo, en el documento WO 99/29838 A1 se describe una proteína de fusión entre batroxobina y una segunda cadena de polipéptido.

El ancrodo se ha utilizado durante muchos años para la profilaxis de la trombosis en pacientes con trombocitopenia inducida por heparina y para el tratamiento de los trastornos circulatorios arteriales periféricos, entre otras cosas, pero entre tanto ha sido sustituido por nuevos medicamentos. Sin embargo, a pesar de su buena eficacia en el modelo animal, esta enzima y otras comparables no son adecuadas para la profilaxis de adherencias peritoneales, ya que, debido a su estructura molecular, no permanecen durante un tiempo suficiente en la cavidad abdominal y llegan rápidamente al torrente sanguíneo e inhiben la coagulación. Este efecto secundario es prohibitivo para la indicación "profilaxis de adherencias posoperatorias", de modo que una utilización nativa de estas sustancias en pacientes no entra en consideración.

Además, existen otras proteínas de fusión fibrinogenolíticas, pero que no han sido desarrolladas con el planteamiento de un tratamiento de adherencias peritoneales. Estas construcciones se describen por ejemplo en el documento US 6,214,594 B1 o en Yang et al., Protein Expression and Purification, 66 (2009): 138-147.

Para lograr una liberación lenta de los principios activos y una mayor duración del efecto en la cavidad peritoneal, por ejemplo se han incorporado sustancias fibrinolíticas y desfibrinogenantes en un material de soporte (US 2004/224006 A1). El documento US 8,629,314 B2 describe la incorporación de diferentes sustancias activas en una matriz polimérica para evitar adherencias. En los documentos US 6,461,640 B1 y WO 1995/15747 A1 también se describen ensayos similares. En este contexto se utiliza una matriz polimérica biodegradable, de aplicación tópica, como soporte para plasminógeno, uroquinasa y estreptoquinasa, así como ancrodo. El éxito de estas medidas fue escaso, presumiblemente sobre todo por la liberación incontrolada de los principios activos incorporados.

Descripción de la Invención:

En este contexto, el objetivo de la presente invención consiste en reducir o evitar los efectos secundarios locales o sistémicos, en particular en forma de hemorragias o de una inhibición de la coagulación sanguínea, que aparecen en el caso de las sustancias fibrinolíticas o fibrinogenolíticas conocidas, y en proporcionar un medio farmacológicamente eficaz con el que se puedan evitar o reducir las adherencias posoperatorias.

Este objetivo se resuelve mediante una proteína de fusión recombinante con las características indicadas en la reivindicación 1. Las reivindicaciones subordinadas muestran formas de realización preferibles.

Los inventores han comprobado sorprendentemente que mediante el acoplamiento con un dominio de estabilización inerte de alto peso molecular se pueden reducir o evitar las propiedades no deseadas de enzimas fibrinogenolíticas conocidas para la profilaxis de adherencias posoperatorias, en particular en la cavidad peritoneal. Las proteínas de fusión recombinantes según la invención posibilitan un tratamiento preventivo de adherencias en tejidos u órganos, en particular adherencias peritoneales después de intervenciones quirúrgicas o lesiones. En la proteína de fusión, una enzima o fragmento de enzima fibrinogenolítica se acopla como dominio biológicamente activo a un dominio de estabilización inerte de alto peso molecular, con lo que se forma una proteína de fusión que constituye una fibrinogenasa de alto peso molecular con propiedades enzimáticas y farmacocinéticas novedosas. Mediante el acoplamiento de la enzima fibrinogenolítica con el dominio de estabilización inerte de alto peso molecular se aumenta significativamente el peso molecular y se logra una unión no específica a la superficie mesotelial que cubre la cavidad peritoneal. Sorprendentemente, de este modo se reduce el transporte a través de la membrana peritoneal y, por lo tanto, el paso al torrente sanguíneo. Además, se prolonga el tiempo de permanencia y en consecuencia el tiempo de acción de la fibrinogenasa como principio activo recombinante en la cavidad abdominal, con lo que se logra más rápidamente el éxito de la curación con la administración a pacientes afectados (por ejemplo, ser humano o animal). Gracias al mayor tiempo de permanencia y tiempo de acción es posible reducir drásticamente las dosis biológicamente activas necesarias para la descomposición del fibrinógeno, con lo que las desventajas descritas inicialmente de las sustancias con actividad fibrinolítica o fibrinogenolítica en relación con la aparición de hemorragias o la inhibición de la coagulación sanguínea se pueden eliminar por completo o al menos reducir considerablemente.

Preferiblemente, el dominio de estabilización inerte de alto peso molecular consiste en una proteína, polipéptido o péptido que presenta un peso molecular de más de 50 kDa, preferiblemente un peso molecular de más de 80 kDa. Los pesos moleculares preferibles del dominio de estabilización previsto para el acoplamiento con el dominio enzimático oscilan entre 50 y 150 kDa, preferiblemente entre 50 y 100 kDa. El peso molecular elevado deseado del dominio de estabilización también se puede generar mediante dimerización o mutimerización del dominio de estabilización, por ejemplo mediante dimerización de un fragmento IgG-Fc, por ejemplo del fragmento IgG1-Fc humano.

El acoplamiento del dominio de estabilización inerte de alto peso molecular con la enzima fibrinogenolítica tiene lugar en el extremo C y/o en el extremo N. En este contexto, para mantener la actividad enzimática se ha de tener en cuenta la estructura del dominio enzimático. En caso dado se han de insertar secuencias de enlace suficientemente largas entre las proteínas. Si se requiere un extremo N o C para la actividad enzimática, la actividad enzimática en caso dado solo se mantendrá en una de las variantes posibles. Esto puede ser determinado por los expertos sin un gran esfuerzo por medio de métodos conocidos, por ejemplo por medio de ensayos de actividad. En una variante preferible también se pueden acoplar varios dominios de estabilización al extremo C o al extremo N del dominio enzimático con el fin de lograr dicho aumento del peso molecular. También es posible una combinación de diferentes dominios de estabilización (por ejemplo producidos como productos de expresión recombinantes). Mediante el acoplamiento del dominio de estabilización con la enzima fibrinogenolítica, las propiedades fibrinogenolíticas de la enzima también se mantienen en el producto de fusión, de modo que la novedosa proteína de fusión recombinante resultante es farmacológicamente eficaz evitando al mismo tiempo las desventajas mencionadas.

Se ha comprobado que un acoplamiento de ancrodo en el extremo N del dominio de estabilización resulta especialmente eficaz. En particular se ha podido registrar un tiempo de permanencia de la construcción en la cavidad peritoneal prolongado en comparación con la molécula de ancrodo nativa.

El dominio biológicamente activo de la proteína de fusión recombinante causa la descomposición enzimática de fibrinógeno y de este modo impide la formación de fibrina, el precursor de adherencias. Mediante el acoplamiento de la enzima con un dominio de estabilización basado en proteínas o péptidos se reduce la salida de los componentes enzimáticos biológicamente activos del abdomen al sistema circulatorio sanguíneo, con lo que se limita el efecto en la formación excesiva de fibrina local y se reduce o evita una inhibición no deseada de la coagulación sanguínea. De este modo se evitan hemorragias sin influir negativamente en la curación de la herida quirúrgica. Gracias al mayor tiempo de permanencia de la construcción según la invención se aumenta además el tiempo de permanencia de la sustancia activa, de modo que se evita la formación de adherencias a lo largo de la fase de curación crítica de 2 a 4 días.

Por estos motivos, las proteínas de fusión recombinantes según la invención son excelentes candidatos para un uso terapéutico, ya que, debido a la escasa disponibilidad sistémica, provocan muy pocos efectos secundarios o ninguno en comparación con las sustancias ensayadas hasta ahora. Además, gracias a su efecto de larga duración, las sustancias según la invención presentan una eficacia considerablemente mejor, de modo que en general son adecuadas para todas las aplicaciones terapéuticas que requieren un efecto de duración prolongada.

En una forma de realización preferible, el dominio que codifica la enzima fibrinogenolítica y el dominio de estabilización están unidos entre sí a través de su extremo C o N. El acoplamiento del dominio de estabilización con la secuencia de aminoácidos de la enzima fibrinogenolítica puede tener lugar por ejemplo mediante métodos tales como los descritos en los documentos US 2009/0175893A y US 2014/0017273A.

No obstante, la actividad biológica de la proteína de fusión recombinante creada mediante el acoplamiento de una enzima fibrinogenolítica con un dominio de estabilización se puede optimizar mediante un enlazador adicional dispuesto entre el dominio de estabilización y el dominio enzimático. Por ello, en una forma de realización preferible, el dominio de estabilización inerte se une a la enzima fibrinogenolítica a través de un enlazador variable. El acoplamiento del enlazador tiene lugar a través del extremo C o del extremo N del dominio de estabilización o del dominio enzimáticamente activo. Para la unión del enlazador se pueden utilizar procedimientos estándar conocidos en el estado actual de la técnica.

El enlazador consiste preferiblemente en un péptido o polipéptido, cuya secuencia de aminoácidos puede presentar diferentes longitudes o grados de ramificación. Un enlazador preferible incluye por ejemplo secuencias repetitivas de residuos de glicina, alanina y serina. Preferiblemente, el enlazador incluye una secuencia (GGGGGS)x o (GGGGA)xR, en donde A = alanina; G = glicina; S = serina; R = arginina; x = cantidad de repeticiones > 1. La cantidad de repeticiones x en la secuencia de enlace oscila preferiblemente entre 1 y 4. El enlazador aumenta la distancia esférica entre la enzima fibrinogenolítica y el dominio de estabilización inerte de la proteína de fusión recombinante según la invención.

Además de los enlazadores peptídicos arriba mencionados, para el acoplamiento de los dos dominios también se pueden utilizar en el sentido de la presente invención enlazadores químicos conocidos en sí, pudiendo modificarse su estructura y longitud en la orientación de los dos dominios en relación con una expresión y actividad enzimática optimizada de la proteína de fusión en el marco de la metodología habitual.

Después de su producción, las construcciones según la invención se examinan en cuanto a su actividad biológica en uno de los ensayos conocidos, en el que se determina la actividad enzimática fibrinogenolítica de las proteínas de fusión. La invención incluye en particular aquellas proteínas de fusión que presentan suficiente actividad fibrinogenolítica. Para la optimización de la actividad biológica puede ser necesario adaptar el tipo y la posición del acoplamiento, la estructura y la longitud del enlazador, así como el tipo y la estructura del dominio de estabilización. En particular, un impedimento estérico del dominio de estabilización puede influir negativamente en la actividad enzimática, pero esto puede ser comprobado fácilmente in vitro por un experto con ayuda de los medios disponibles. Por lo tanto, las proteínas de fusión recombinantes de alto peso molecular según la invención constituyen fibrinogenasas altamente eficaces, que se pueden clonar a través de métodos estándar y expresar en sistemas de expresión adecuados. Debido al peso molecular relativamente alto de las construcciones y su estructura compleja, que incluye puentes de disulfuro, son preferibles los sistemas de expresión eucariotas.

El concepto "enzima fibrinogenolítica" utilizado en la presente memoria incluye enzimas, fragmentos de enzima activos o sustancias con actividad enzimática, que presentan actividad de fibrinogenasa y producen o favorecen una descomposición de fibrinógeno. Preferiblemente, la enzima fibrinogenolítica del dominio de fibrinogenasa consiste en una serina proteasa, preferiblemente una serina proteasa similar a la trombina. Las enzimas fibrinogenolíticas preferibles son, por ejemplo, las enzimas ancrodo o batroxobina aisladas de venenos de serpiente. Estas enzimas han resultado ser muy adecuadas para el acoplamiento con el dominio de estabilización inerte de alto peso molecular, ya que obtienen su actividad, al menos en gran medida, en la proteína de fusión recombinante según la invención. Además, existen otros candidatos adecuados, por ejemplo, proteasas y versiones recombinantes de éstas similares a la trombina, aisladas de venenos de serpiente. Como dominio de fibrinogenasa de la proteína de fusión recombinante son particularmente adecuadas algunas formas recombinantes o variantes de la enzima ancrodo o batroxobina.

El dominio de estabilización inerte de alto peso molecular consiste preferiblemente en albúmina sérica, preferiblemente albúmina sérica animal o humana. En otra variante, el dominio de estabilización inerte de alto peso molecular incluye transferrina o variantes de transferrina inactivadas mediante modificaciones genéticas. En otra variante, el dominio de estabilización inerte de alto peso molecular incluye secuencias de aminoácidos artificiales, como por ejemplo PAS (Schlapschy et. al 2013) o XTEN (US 2013/0165389 A1). También es posible acoplar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos como dominios de estabilización con la enzima fibrinogenolítica. Para la administración profiláctica o terapéutica en humanos, como anticuerpos preferiblemente se utilizan anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpo de estos. Además, también se pueden utilizar variantes de los dominios de estabilización mencionados para el propósito según la invención. Otras formas de realización prevén además la utilización de dominios sintéticos u otros dominios proteínicos inertes, siempre que estén descritos en el estado actual de la técnica.

En una variante preferible, la proteína de fusión incluye una secuencia de aminoácidos, que incluye la enzima ancrodo y un dominio de estabilización (por ejemplo albúmina sérica o un fragmento de anticuerpo IgG-Fc). Preferiblemente, la proteína de fusión incluye una secuencia de aminoácidos tal como las reproducidas en la SEQ ID N° 2 o la SEQ ID N° 4 o partes de esta secuencia con actividad fibrinogenolítica. Las partes de esta secuencia con actividad fibrinogenolítica son secciones de secuencia que codifican el dominio enzimático y el dominio de estabilización y que tienen actividad enzimática en la descomposición de fibrinógeno. En los ejemplos concretos, a estas partes fibrinogenolíticas también se les añadieron, por ejemplo, una hexahistidina-Tag (His-Tag) para una purificación sencilla y un péptido de señalización. También es posible añadir aminoácidos adicionales o alternativos a las secuencias arriba mencionadas o retirar éstos de las mismas.

Las proteínas de fusión según la invención tienen una alta eficacia fibrinogenolítica y conducen a una descomposición específica de fibrinógeno. Además, como efecto secundario en la administración en el organismo también se puede observar un efecto fibrinolítico, ya que los productos de descomposición de la enzima, desA-profibrina y monómeros de desAA-fibrina, forman complejos de fibrina solubles, que a su vez conducen a una activación de plasminógeno a través de la estimulación del t-PA endógeno. Este efecto se puede medir como un aumento de la concentración de plasmina después de la administración de la enzima in vivo. Este efecto ofrece una ventaja adicional, ya que unas altas concentraciones del inhibidor del activador de plasminógeno (PAI-1) en caso de lesiones conducen a una deficiencia de la descomposición natural de la fibrina y a adherencias.

Mediante el acoplamiento C-terminal de ancrodo u otra proteína con actividad fibrinogenolítica con un dominio de estabilización, por ejemplo con una albúmina sérica o un fragmento de anticuerpo IgG-Fc, el tiempo de permanencia de la construcción en la cavidad peritoneal se prolonga notablemente en comparación con la enzima con actividad fibrinogenolítica nativa. De este modo, la construcción puede desencadenar una duración de acción mucho más larga que en el caso de una molécula de ancrodo nativa. Mediante la retención de la construcción en la cavidad peritoneal también se redujo claramente el paso de la sustancia activa al torrente sanguíneo.

La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión recombinante tal como se describe más arriba. La composición farmacéutica incluye un soporte farmacéuticamente aceptable y se puede administrar como solución directamente en el espacio de la herida, por ejemplo el abdomen. De este modo, el principio activo evita la aparición de adherencias en todo el compartimento, en particular allí donde se han podido producir potencialmente lesiones. Debido al alto peso molecular, la proteína de fusión recombinante permanece como sustancia activa en la cavidad peritoneal durante un período de tiempo más largo en comparación con sustancias naturales no modificadas y no pasa o solo pasa en pequeña medida al sistema circulatorio sanguíneo. De este modo se evitan o reducen por ejemplo efectos sistémicos y efectos secundarios de la sustancia natural (por ejemplo de ancrodo o batroxobina). La sustancia activa se puede administrar una o más veces en la cavidad peritoneal durante la operación o después de la misma. Es preferible una sola administración, de modo que no son forzosamente necesarias otras inyecciones o infusiones. Esta ventaja se debe al mayor tiempo de permanencia de la construcción recombinante en la cavidad abdominal en comparación con las sustancias naturales.

En una variante preferible, la proteína de fusión recombinante según la invención se puede utilizar en combinación con otros métodos de tratamiento o productos. Por ejemplo es concebible una combinación de la proteína de fusión con métodos de barrera físicos formados por membranas sólidas o líquidas, geles o aerosoles. Preferiblemente, éstos son biodegradables.

Mediante la utilización de dominios específicos de la especie como dominios de estabilización (por ejemplo albúmina sérica humana (HSA) o un fragmento de anticuerpo IgG-Fc humano), la proteína de fusión recombinante según la invención presenta una baja inmunogenicidad y ningún efecto farmacodinámico propio. Debido al alto peso molecular, preferiblemente de > 50 kDa, se asegura además una larga durabilidad biológica.

Para desplegar una eficacia profiláctica óptima de la composición farmacéutica según la invención, el efecto fibrinogenolítico ha de estar presente durante todo el tiempo de la cicatrización. Por ello, la proteína de fusión recombinante preferiblemente está presente en el lugar de acción en una concentración eficaz. El período de tiempo necesario para una cicatrización completa es de 1 a 8 días, para el tratamiento profiláctico es preferible un período de 2 a 4 días.

La actividad enzimática necesaria para la eficacia preventiva o terapéutica de la solución farmacéuticamente activa administrada en la cavidad abdominal oscila entre 0,01 y 10 unidades/ml a lo largo de todo el período de tiempo de la cicatrización. Preferiblemente se utilizan concentraciones de la proteína de fusión entre 0,1 y 5 unidades/ml (units/ml). Preferiblemente, la proteína de fusión recombinante se aplica en un medio con actividad osmótica (por ejemplo solución de icodextrina).

La presente invención se refiere además a una utilización combinada de la proteína de fusión con otros productos para la prevención de adhesiones de tejido (adherencias), en particular después de intervenciones quirúrgicas. Para ello se pueden utilizar por ejemplo membranas consistentes en celulosa regenerada oxidada, politetrafluoroetileno, ácido hialurónico-carboximetil celulosa o polietilenglicol. También se pueden utilizar barreras de adherencia que separan los órganos y tejidos mediante hidroflotación. Preferiblemente, en este contexto se utilizan ácido hialurónico, ácido hialurónico reticulado o icodextrina.

Preferiblemente, la proteína de fusión recombinante según la invención está incorporada en una matriz biodegradable y biocompatible, que libera la proteína de fusión de forma continua durante la fase de cicatrización inicial, preferiblemente a lo largo de un período de tiempo de 2 a 4 días.

Modos de realización de la Invención:

La invención se explica en los siguientes ejemplos.

Ejemplos:

Ejemplo 1:

Preparación de proteína de fusión N-ancrodo-Fc

Para la preparación de la composición según la invención se preparó una proteína de fusión consistente en ancrodo y la región constante de un anticuerpo IgG1 humano. Entre el dominio de ancrodo biológicamente activo y el dominio de estabilización formado por el fragmento de anticuerpo IgG1-Fc está insertado un enlazador de glicina-alanina. Para mejorar la secreción en el medio de cultivo celular y para una purificación más sencilla se añadió el péptido de señalización de la albúmina sérica humana en el extremo N.

Para la preparación, la secuencia de la proteína de ancrodo (número de acceso: ABN13428.1) se fusionó por el extremo C con el extremo C de la región constante de una IgG1 humana (número de acceso Uniprot P01857-1, aminoácidos 104 - 330) a través de un enlazador de glicina-alanina. A continuación se añadió el péptido de señalización-HSA (aminoácidos 1 a 18) previsto para la purificación. Para la síntesis del ADNc que codifica la proteína de fusión, los codones de ADN se optimizaron para la expresión en células humanas. En el extremo 5' del ADNc se añadieron los sitios de clivaje de restricción para Notl y Xbal y en el extremo 3' para BstXI y HindIII, que permiten la clonación del ADN en los vectores correspondientes para una expresión transitoria o los vectores correspondientes para la producción de líneas celulares estables. La construcción de ADNc resultante se preparó sintéticamente.

Este ADNc se clonó, amplificó y reclonó en un vector de expresión para la transfección transitoria. La inserción correcta del ADNc se comprobó a través de una digestión de restricción. A continuación, con el plásmido resultante se transformaron bacterias E. coli (DH5a) y la cepa se cultivó en 0,8 litros de medio LB. A partir de ello se aisló el ADN-plásmido libre de endotoxinas y la solución se filtró de forma estéril.

Para la expresión transitoria de la proteína se cargaron células HEK-F en cultivo en suspensión libre de suero en un volumen de 500 ml en el matraz de agitación (aproximadamente 2,5 x 106 células/ml). La transfección de las células tuvo lugar a través de un copolímero de PEG-aminoéster ramificado con una carga de transfección de aproximadamente 10 gg ADN/1 x 107 células - ADN/coPEG33 - 1/6 (p/p). Después de añadir ácido valproico, el cultivo celular se cultivó durante otros 7 días. A continuación, se cosechó el sobrenadante del cultivo celular mediante centrifugación. La cromatografía tuvo lugar en tampón MES 50 mM, pH 5,5.

La purificación de la proteína de fusión tuvo lugar mediante cromatografía de intercambio iónico. Como material de columna se utilizó HiTrap SP FF Affinity Resin (GE Healthcare Europe GmbH, Friburgo, Alemania). La elución de la proteína de fusión tuvo lugar mediante un gradiente de cloruro de sodio. El análisis de las fracciones de eluato tuvo lugar mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE) y las fracciones proteínicas adecuadas se reunieron y se dializaron contra solución salina tamponada (PBS), se dividieron en partes alícuotas y se guardaron a -20 °C hasta su posterior utilización.

La secuencia de ADNc de la construcción se muestra en la SEQ ID N° 1:

Los sitios de clivaje de restricción insertados están subrayados. La secuencia que codifica la proteína de fusión se muestra en negrita.

gcggccgccaccatgaaatgggtcacctttatctcccttctgttcctctttagtagcgccta ttctgtcatcggtggtgacgagtgcaatatcaacgagcatcgatttctggtggcagtgtatg aaggaaccaactggacctttatctgcggcggggtccttattcacccagagtgggtcattacc gccgaacactgtgctcggcgtcgaatgaatcttgtgttcgggatgcacaggaaatcagagaa gtttgatgacgaacaggaacggtatcccaagaagcggtacttcattcgatgcaacaaaaccc ggactagctgggatgaggacatcatgctgattcggctgaacaagcccgtgaataacagcgag catattgctcctttgtcactgccttccaatccgcctattgtgggtagtgactgccgtgtgat gggctggggtagcattaacagaaggatccacgtgcttagcgatgaacccagatgtgccaaca tcaatctccacaacttcaccatgtgtcatgggttgttccgcaagatgcctaagaagggacgc gtactctgtgctggcgatctgcgcggtagacgggactcttgcaattcagatagtggaggacc ccttatctgcaacgaagagctgcatggcattgtggccagaggccccaatccatgtgcacagc ccaacaaaccagctctgtatactagcgtgtacgactacagggattgggtgaacaacgttatc gccggcaatgcaacctgtagtccaggcggcggcggagccggtggaggcggggcaggaggagg aggagctagagacaaaacacacacttgtccaccctgtcctgctcccgaactgcttggtggac ccagcgtgtttctgtttccgcctaagcccaaagacaccctcatgatctcacggactcccgaa gttacgtgtgtcgtagtagacgtgtcacacgaagatcccgaggtcaagttcaactggtatgt ggacggagttgaggttcacaacgccaaaaccaaaccgagagaggagcagtacaactccacat atagggtggtaagcgtgttgaccgtgctgcatcaggattggctgaatggcaaagagtacaag tgcaaggtgtccaataaggctcttccagcacccattgagaaaacgatctccaaggcgaaagg ccaacctcgtgaacctcaggtgtatactctccctccaagtcgcgatgagctcaccaagaacc aggtgtctttgacatgcctcgtcaaagggttctacccatcagacatagccgtcgaatgggag tctaatggccaaccagagaataactacaagaccactcctccggttctggatagtgatgggag cttctttctgtacagcaagctgacagtcgacaagtcccgatggcagcagggtaatgtgttca gttgctctgtgatgcatgaagccctgcataaccactatacccagaaaagcctgtctctgagc c c a g g a a a g ta a ta g a a g c tt

La secuencia de aminoácidos resultante de ello se muestra en la SEQ ID N° 2:

MKWVTFISLL FLFSSAYSVI GGDECNINEH RFLVAVYEGT NWTFICGGVL 50 1HPEWVITAE HCARRRMNLV FGMHRKSEKF DDEQERYPKK RYFIRCNKTR 100 TSWDEDIMLI RLNKPVNNSE HIAPLSLPSN PPIVGSDCRV MGWGSINRRI 150 HVLSDEPRCA NINLHNFTMC HGLFRKMPKK GRVLCAGDLR GRRDSCNSDS 200 GGPLICNEEL HGIVARGPNP CAQPNKPALY TSVYDYRDWV NNVIAGNATC 250 SPGGGGAGGG GAGGGGARDK THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM 300 ISRTPEVTCV WDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV 350 VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP 400 PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG 450 SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK 495

La secuencia de aminoácidos comienza con el péptido de señalización de la albúmina sérica humana MKWVTFISLLFLFSSAYS (representado subrayado), que se disocia de la célula durante la secreción de la proteína. El enlazador GGGGAGGGGAGGGGAR, dispuesto entre la albúmina sérica humana y el dominio de ancrodo, está unido con el extremo C del ancrodo (representado en negrita).

Ejemplo 2:

Preparación de proteína de fusión N-ancrodo-HSA-C con His-Tag

En este ejemplo se muestra otra variante de una proteína de fusión basada en ancrodo, que consiste en ancrodo, albúmina sérica humana (HSA), un péptido de señalización de la albúmina sérica humana y a continuación un His-Tag. Entre el dominio de ancrodo biológicamente activo y el dominio de estabilización formado por la albúmina sérica humana está insertado un enlazador de glicina/serina.

Para la preparación, la secuencia de la proteína de ancrodo (número de acceso: ABN13428.1) se fusionó por el extremo C con el extremo N de la albúmina sérica humana (HSA) (número de acceso: P02768, aminoácidos 25 609). A continuación, se añadió el péptido de señalización-HSA (aminoácidos 1 a 18). El ADNc se procesó tal como se describe más arriba, y se expresó la proteína.

La secuencia de ADNc de la construcción se muestra en la SEQ ID N° 3:

gcggccgctctagagccaccatgaaatgggttaccttcattagcct.cctgttcctgttttcctccgccta ttctgttatcggtggtgacgagtgtaacatcaacgagcataggttcctggtcgcagtgtatgagggcaca aactggaccttcatttgtggcggggtgctgattcacccagagtgggtaataacagcggagcattgtgccc gcagacgcatgaatctcgtgtttggaatgcatcgcaaaagcgagaaattcgatgatgaacaagaaaggta ccctaagaagcggtacttcattcggtgcaacaagacaagaacttcatgggacgaggacatcatgctgatc cgtcttaacaagccggtaaataacagcgagcatatcgcaccactctcattgcccagcaaccctcccatcg tgggaagcgattgcagagtgatggggtggggctccatcaatagaaggattcacgtgctctctgatgaacc gcggtgtgccaacattaatctgcataattttactatgtgccatggtctgtttcgcaaaatgcccaagaaa ggaagagttctgtgtgcaggcgatctgagaggaaggagagactcttgcaactccgatagtggcgggccac tgatatgcaacgaagagcttcacggaatcgtggccagaggtcctaatccatgtgctcagcctaacaagcc cgctctgtacaccagcgtttatgactaccgggattgggtcaacaatgtcattgccggaaatgccacctgt tcccctggcggcggcgggtcaggaggaggagggtctggtggcggcgggtctgacgcacataaaagcgaag tggctcaccggtttaaagatctcggcgaagagaacttcaaagctcttgtattgattgccttcgctcagta cttgcaacagtgccctttcgaggaccacgtgaaactggtgaatgaagtcacagaattcgctaagacgtgt gtggcggatgagagtgctgagaactgtgacaagagtctgcacaccctgtttggggataaactgtgcactg tcgctactctgcgagaaacttatggcgaaatggccgactgctgcgccaagcaggaacccgagagaaatga atgctttctgcagcacaaagacgacaaccctaatctgccacgattggttcggcccgaggtggacgtaatg tgcacggctttccacgacaatgaggaaaccttcctgaagaagtatctctacgaaatagctcgacggcatc cctacttttatgcacccgagctgctgttctttgcgaagcgctataaggccgctttcacagaatgctgtca agctgccgacaaggctgcctgtctcctcccaaaactggacgagctccgcgatgaggggaaggcaagcagt gccaaacagcgcctgaaatgcgcatcacttcagaaattcggagagcgcgcattcaaagcatgggcagtgg ctcgattgtcccagcgatttcctaaggctgaatttgccgaagtgtcaaagctggtgacagaccttaccaa agtccacacagaatgctgccatggtgacttgctggagtgcgccgatgacagagccgatctggccaagtac atctgtgaaaatcaggattccatctcctccaaactgaaagaatgctgcgagaaacccctgctggagaaga gccattgtattgctgaggtggaaaacgatgagatgccagcggacctcccatcactggcagccgacttcgt cgagagtaaggacgtgtgtaagaactacgccgaagcgaaggatgtgtttctcgggatgtttctgtacgaa tatgcgcgtcgtcatcccgattatagcgtggttctgctgcttaggcttgccaagacttacgaaaccaccc tcgagaagtgttgtgccgccgctgacccgcatgagtgctacgccaaagtatttgacgagtttaagcctct ggtcgaggagcctcagaacctgatcaaacagaactgcgagcttttcgagcagttgggtgaatacaaattt cagaatgccctgctcgtcaggtatactaagaaggtgccccaagtgtctacacctaccttggttgaggtca gccggaatctcggcaaggtcggcagcaaatgctgtaagcacccagaggcaaagcgtatgccatgtgcaga ggattatctgagtgtcgtcctcaaccagctgtgcgtacttcacgaaaagacaccagtgtccgatagggtc actaaatgttgcaccgaatctctggtgaatcggaggccctgtttctcagctctggaagttgatgaaacct

acgttccgaaggagttcaatgcagaaacgtttacctttcacgctgacatctgcacgctctctgagaagga gaggcagataaagaagcaaacagccctggtagagctggttaaacacaagcccaaagcaacaaaggagcag ctgaaagcggtgatggatgacttcgccgcgtttgtggagaagtgctgtaaggccgacgataaagaaactt gcttcgccgaagagggaaagaagcttgtggcagctagccaagcagcccttgggttgcaccaccatcacca ccactaatagccactgtgctqgttcgaa

Los sitios de clivaje de restricción insertados están subrayados (5': Notl, Xbal; 3': BstXI, HindIII). La secuencia que codifica la proteína de fusión se muestra en negrita.

La secuencia de aminoácidos resultante de ello se muestra en la SEQ ID N° 4:

MKWVTFISLL flfssaysvi GGDECNINEH RFLVAVYEGT NWTFICGGVL IHPEWVITAE 60

HCARRRMNLV FGMHRKSEKF DDEQERYPKK RYFIRCNKTR TSWDEDIMLI RLNKPVNNSE 120

HIAPLSLPSN PPIVGSDCRV MGWGSINRRI HVLSDEPRCA HINLHNFTMC HGLFRKMPKK 180

GRVLCAGDLR GRRDSCNSDS GGPLICNEEL HGIVARGPNP CAQPNKPALY TSVYDYRDWV 240

NNVIAGNATC SPGGGGSGGG GSGGGGSDAH KSEVAHRFKD LGEENFKALV LIAFAQYLQQ 300

CPFEDHVKLV NEVTEFAKTC VADESAENCD KSLHXLFGDK LCTVATLRET YGEMADCCAK 360

QEPERNECFL QHKDDNPNLF RLVRPEVDVM CTAFHDNEET FLKKYLYEIA RRHPYFYAPE 420

LLFFAKRYKA AFTECCQAAD KAACLLPKLD ELRDEGKASS AKQRLKCASL QKFGERAFKA 480

WAVARLSQRF PKAEFAEVSK LVTDLTKVHT ECCHGDLLEC ADDRADLAKY ICENQDSISS 540

KLKECCEKPL LEKSHCIAEV ENDEMPADLP SLAADFVESK DVCKNYAEAK DVFLGMFLYE 600

YARRHPDYSV VLLLRLAKTY ETTLEKCCAA ADPHECYAKV FDEFKPLVEE PQNLIKQNCE 660

LFEQLGEYKF QNALLVRYTK KVPQVSTPTL VEVSRNLGKV GSKCCKHPEA KRMPCAEDYL 720

SWLNQLCVL HEKTPVSDRV TKCCTESLVN RRPCFSALEV DETYVPKEFN AETFTFHADI 780

CTLSEKERQI KKQTALVELV KHKPKATKEQ LKAVMDDFAA FVEKCCKADD KETCFAEEGK 840

KLVAASQAAL C-LHHHHHH 858

La secuencia de aminoácidos comienza con el péptido de señalización de la albúmina sérica humana MKWVTFISLLFLFSSAYS, que se disocia de la célula durante la secreción de la proteína. El enlazador GGGGSGGGGSGGGGS, dispuesto entre la albúmina sérica humana y el dominio de ancrodo, está unido con el extremo N de la albúmina sérica (representado en negrita).

Ejemplo 3:

Determinación de la actividad enzimática fibrinogenolítica de las proteínas de fusión preparadas

La determinación de la actividad de las proteínas de fusión tuvo lugar con fibrinógeno como substrato (1 mg/ml) disuelto en Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4. En cada caso 500 pl de la solución de fibrinógeno se introdujeron con pipeta en una cubeta. Dos minutos después se añadieron 100 pl de muestra o de un control positivo (batroxobina). Después se determinó fotométricamente la medición del aumento de la turbidez a 340 nm a lo largo de un período de una hora y se determinó la pendiente máxima de la curva. La pendiente máxima de la curva es proporcional a la actividad enzimática, que se convierte en unidades/ml por medio de una curva de calibración.

Ejemplo 4:

Tratamiento de adherencias peritoneales en mamíferos

Para la administración preventiva o terapéutica a un mamífero (por ejemplo, un humano o un animal de experimentación), después de la intervención quirúrgica que provoca las adherencias, la proteína de fusión recombinante según la invención aislada y purificada después de la expresión, o un placebo correspondiente, se administra directamente en la cavidad abdominal del animal de experimentación. Para un efecto óptimo se procura alcanzar una actividad enzimática entre 0,01 y 10 U/ml. La solución farmacéutica incluye la proteína de fusión con una actividad entre 0,1 y 5 U/ml.

Después de la administración de la proteína de fusión, durante varios días se podrá constatar una actividad enzimática fibrinolítica sostenida de varios días de duración de la proteína de fusión, manteniéndose al mismo tiempo la cicatrización. En comparación con los animales de experimentación tratados con placebo, la proporción y la gravedad de las adherencias producidas en el marco del proceso de cicatrización se habrán reducido drásticamente.

Ejemplo 5:

Propiedades farmacológicas y farmacocinéticas de proteínas de fusión N-ancrodo-HSA-C

Para la preparación de la proteína de fusión, la secuencia de la proteína de ancrodo (número de acceso: ABN13428.1) se fusionó por el extremo C con el extremo N de la albúmina sérica humana (HSA) (número de acceso: P02768, aminoácidos 25-609). La actividad enzimática de la proteína de fusión es de 24 U/ml.

Dado que el ancrodo nativo es inadecuado para un uso terapéutico para el tratamiento de adherencias peritoneales, la proteína de fusión así obtenida se ensayó en cuanto a su actividad y permanencia (tiempo de retención) en la cavidad abdominal. En la figura 1 se muestra la actividad enzimática en el líquido de la cavidad abdominal después de una única administración intraperitoneal de ancrodo nativo y una proteína de fusión de ancrodo (AK03) según la invención. Se puede ver claramente que el ancrodo nativo es inadecuado para un uso terapéutico, ya que el ancrodo administrado por vía intraperitoneal abandona muy rápidamente la cavidad abdominal y, por lo tanto, solo se alcanzan concentraciones bajas, que además caen a valores cercanos al límite de detección en un plazo de 6 horas. En cambio, después de la administración de una dosis comparable de la proteína de fusión de ancrodo (AK03) se alcanzan actividades considerablemente más altas en la cavidad abdominal, que además después de 6 horas todavía se encuentran dentro del intervalo terapéuticamente eficaz.

En la figura 2 se muestra el efecto del ancrodo y de la proteína de fusión de ancrodo (AK03) según la invención en la concentración de fibrinógeno en el plasma sanguíneo. El paso rápido del ancrodo al sistema vascular conduce aquí a un descenso del nivel de fibrinógeno en la sangre de más de un 50%. Debido a la estructura molecular modificada, la AK03 solo pasa muy lentamente al torrente sanguíneo y, por lo tanto, solo conduce a un pequeño descenso del nivel de fibrinógeno de un 14%. Estas pequeñas variaciones de la concentración de fibrinógeno están dentro del intervalo fisiológico y no tienen ninguna repercusión en la coagulación sanguínea.

Por consiguiente, la proteína de fusión de ancrodo AK03 provista del dominio de estabilización muestra un comportamiento farmacocinético mucho más favorable que la molécula de ancrodo nativa.

Estos resultados muestran que la proteína de fusión de ancrodo presenta propiedades enzimáticas similares a las del ancrodo, pero se diferencia claramente de éste en cuanto a la farmacocinética. En particular, esto conduce a un tiempo de permanencia más largo de la proteína de fusión en la cavidad peritoneal y a un menor paso de la sustancia al torrente sanguíneo. Gracias a estas propiedades, la proteína de fusión según la invención es especialmente adecuada para la administración intraperitoneal para el tratamiento/prevención de adherencias peritoneales.

Materiales y métodos

Farmacocinética en perros

Tres perros beagle se proveyeron de catéteres venosos e intraperitoneales permanentes. Una semana después de la implantación de los catéteres, los animales recibieron una única inyección intraperitoneal de la sustancia de ensayo. Se tomaron muestras de 0,5 ml del líquido peritoneal 0, 0,5; 1,2, 4, 6 y 8 horas después de la administración de la sustancia, y muestras de sangre venosa para obtener plasma de citrato en los tiempos de 0, 0,5; 1, 2, 4, 6, 8, 16 y 24 horas. La concentración de fibrinógeno en las muestras de plasma se midió fotométricamente con el método de Clauss. Después de centrifugar las muestras, la actividad enzimática en el líquido peritoneal se midió por turbidimetría con ayuda de un método cinético tras añadir finbrinógeno humano. Farmacocinética en ratas

Unas ratas Sprague Dawley recibieron inyecciones intraperitoneales de la sustancia de ensayo bajo una breve anestesia por inhalación. Al mismo tiempo se tomó una muestra de sangre venosa. A continuación, los animales se llevaron de vuelta a la jaula, donde se despertaron poco después. Seis horas después de la administración de la sustancia, los animales fueron anestesiados de nuevo y se tomaron el líquido peritoneal y otra muestra de sangre para obtener plasma de citrato. Las dos muestras se centrifugaron inmediatamente después de la toma, se ultracongelaron a -80 °C y, en un momento posterior, se analizaron con los métodos arriba descritos.

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Schnüriger, B.; Barmparas, G.; Branco, B. C.; Lustenberger, T.; Inaba, K.; Demetriades, D. (2011): Prevention of postoperative peritoneal adhesions: a review of the literature. In: The American Journal of Surgery 201 (1), S.

111-121.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proteína de fusión recombinante que incluye una enzima fibrinogenolítica con una secuencia de aminoácidos, que está unida en el extremo C y/o en el extremo N con la secuencia de aminoácidos de al menos un dominio de estabilización inerte de alto peso molecular con un peso molecular de > 50 kDa, para su uso en la prevención o el tratamiento de adherencias peritoneales después de intervenciones quirúrgicas en la cavidad peritoneal.

2. Proteína de fusión recombinante para el uso según la reivindicación 1, caracterizada por que el dominio de estabilización inerte está unido con la enzima fibrinogenolítica a través de un enlazador.

3. Proteína de fusión recombinante para el uso según la reivindicación 2, caracterizada por que el enlazador consiste en un enlazador de glicina-serina con la secuencia (GGGGGS)x o un enlazador de glicina-alanina con la secuencia (GGGGA)xR, en donde A = alanina; G = glicina; S = serina; R = arginina; x = cantidad de repeticiones > 1.

4. Proteína de fusión recombinante para el uso según la reivindicación 1, caracterizada por que en el extremo C de la enzima fibrinogenolítica están acoplados varios dominios de estabilización inertes.

5. Proteína de fusión recombinante para el uso según la reivindicación 1, caracterizada por que en el extremo N de la enzima fibrinogenolítica están acoplados varios dominios de estabilización inertes.

6. Proteína de fusión recombinante para el uso según la reivindicación 1, caracterizada por que el dominio de estabilización presenta un peso molecular entre 50 y 150 kDa.

7. Proteína de fusión recombinante para el uso según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que la enzima fibrinogenolítica consiste en una serina proteasa similar a la trombina.

8. Proteína de fusión recombinante para el uso según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que la enzima fibrinogenolítica consiste en ancrodo o batroxobina, o en una variante recombinante de ancrodo o batroxobina.

9. Proteína de fusión recombinante para el uso según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que el dominio de estabilización inerte de alto peso molecular consiste en un dominio de proteína o péptido, albúmina sérica, transferrina, un anticuerpo monoclonal o humanizado o un fragmento de anticuerpo, o en un dominio artificial, por ejemplo PAS o XTEN.

10. Proteína de fusión recombinante para el uso según la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de aminoácidos de albúmina sérica humana, o una parte de esta secuencia con un peso molecular > 50 kDa, está acoplada como dominio de estabilización inerte en el extremo C o en el extremo N de ancrodo o batroxobina como enzima fibrinogenolítica.

11. Proteína de fusión recombinante para el uso según la reivindicación 10, caracterizada por que la proteína de fusión incluye una secuencia de aminoácidos tal como las reproducidas en la SEQ ID N° 2 (fusión en el extremo N) o la SEQ ID N° 4 (fusión en el extremo C), o partes de esta secuencia con actividad fibrinogenolítica.

12. Proteína de fusión recombinante para el uso según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que la proteína de fusión está incorporada en una matriz biodegradable para una liberación intraperitoneal continua.

13. Composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en la prevención o el tratamiento de adherencias peritoneales después de intervenciones quirúrgicas en la cavidad peritoneal.

14. Composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 13, caracterizada por que la composición incluye un medio con actividad osmótica, estando presente la proteína de fusión recombinante en el medio con actividad osmótica, preferiblemente solución de icodextrina.