ES2800341T3 - Método para la preparación de 2,4-dihidroxibutirato - Google Patents

Abstract

Método para la preparación de 2,4-dihidroxibutirato a partir de homoserina, que comprende una ruta de dos etapas: - una primera etapa de conversión del grupo amino primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener 2-oxo-4-hidroxibutirato, catalizada por una enzima que presenta una actividad de homoserina transaminasa como se define por E.C.2.6.1.1 o E.C.2.6.1.42 o E.C.2.6.1.57, y - una segunda etapa de reducción del 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) obtenido a 2,4-dihidroxibutirato, catalizada por una enzima que presenta una actividad de OHB reductasa, la enzima que presenta una actividad de OHB reductasa es la lactato deshidrogenasa como se define por E.C.1.1.1.27 o E.C.1.1.1.28, o la malato deshidrogenasa como se define por E.C.1.1.1.37, E.C.1.1.1.82 o E.C.1.1.1.299 en el que la o las etapas primera y/o segunda están catalizadas por una enzima codificada por un gen endógeno o heterólogo.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la preparación de 2,4-dihidroxibutirato

La presente invención se refiere a un nuevo método para la preparación de 2,4-dihidroxibutirato (2,4-DHB) a partir de homoserina, que comprende una ruta de dos etapas:

- una primera etapa de conversión del grupo amino primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener 2-oxo-4-hidroxibutirato, y

- una segunda etapa de reducción del 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) obtenido para obtener 2,4-DHB.

Los ácidos carboxílicos citados en la presente solicitud se denominan igualmente bajo su sal (por ejemplo, 2,4-dihidroxiburarato) o formas ácidas (por ejemplo, ácido 2,4-dihidroxibutírico).

El ácido 2,4-dihidroxibutírico (igualmente 2,4-DHB o DHB) es un compuesto de considerable interés económico. El DHB se puede convertir fácilmente en a-hidroxi-Y-butirolactona en medios acuosos ajustando el pH apropiado. La a-hidroxi-Y-butirolactona es un precursor prominente para la producción del sustituto de metionina 2-hidroxi-4-(metiltio)-butirato (HMTB) (documento US 2009/318715) que presenta un gran mercado en nutrición animal. En la actualidad, la a-hidroxi-Y-butirolactona deriva de la Y-butirolactona mediante un procedimiento de múltiples etapas que implica la halogenación de la Y-butirolactona en la posición a, y la posterior sustitución del átomo de halógeno por un grupo hidroxilo en medio alcalino (documento US 2009/318715).

Del aumento de los precios del petróleo surge la necesidad de producir DHB a partir de recursos renovables. Los microorganismos son capaces de transformar materia prima derivada de biomasa, por ejemplo azúcares o ácidos orgánicos, en una gran variedad de compuestos químicos diferentes (Werpy y Petersen, 2004). Con el creciente cuerpo de información bioquímica y genómica, es posible modificar microorganismos de modo que sobreproduzcan productos intermedios metabólicos naturales con alto rendimiento y productividad (Bailey, 1991). La optimización de los microorganismos de producción a menudo requiere una ingeniería racional de las redes metabólicas que asegure, entre otros, la sobreexpresión de las enzimas requeridas para la biosíntesis del metabolito de interés, y el alivio de la inhibición de la retroalimentación del producto. Otra posibilidad es la implementación de nuevos sistemas enzimáticos que catalicen la producción de un metabolito de interés.

Los enfoques de ingeniería metabólica y las catálisis enzimáticas requieren un conocimiento detallado de la bioquímica y la regulación de la ruta metabólica que conduce al metabolito de interés. En el caso de la producción de DHB, esta información no está disponible. Solo unos pocos estudios informan de la aparición de DHB en pacientes con deficiencia de semialdehído succínico deshidrogenasa (Shinka et al. 2002) sin, sin embargo, identificar las reacciones enzimáticas implicadas en la producción de DHB. La producción cimótica o enzimática de DHB, por lo tanto, requiere (i) la identificación de una vía termodinámicamente factible que transforma un precursor accesible en DHB, (ii) la identificación o construcción de enzimas que son capaces de catalizar etapas de reacción individuales en la ruta, y (iii) la expresión funcional de las enzimas de la ruta en un organismo de producción apropiado. La presente invención tiene como objetivo satisfacer estas necesidades.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es un método de preparación de 2,4-DHB a partir de homoserina, que comprende una ruta de dos etapas (ver la figura 1):

- una primera etapa de conversión del grupo amino primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener OHB, y

- una segunda etapa de reducción del OHB obtenido a 2,4-DHB.

La(s) primera y/o segunda etapa(s) del método de la invención puede(n) ser catalizada(s) por una enzima codificada por un gen endógeno o heterólogo.

En la descripción, las actividades enzimáticas asimismo se designan por referencia a los genes que codifican las enzimas que tienen dicha actividad. El uso de la denominación de los genes no se limita a un organismo específico, sino que cubre todos los genes y proteínas correspondientes en otros organismos (por ejemplo, microorganismos, análogos funcionales, variantes funcionales, y fragmentos funcionales de los mismos, siempre que retengan la actividad enzimática).

Según la invención, la enzima que convierte el grupo amino primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener OHB es la homoserina transaminasa.

Dentro de un aspecto adicional de la invención, la enzima que presenta actividad de homoserina transaminasa se selecciona de entre enzimas que presentan una actividad de aspartato transaminasa (EC2.6.1.1), actividad de transaminasa de aminoácidos de cadena ramificada (EC2.6.1.42), o actividad de transaminasa de aminoácido aromático (EC2.6.1.57).

Dentro de un aspecto adicional de la invención, la homoserina transaminasa puede ser la transaminasa de aminoácido de cadena ramificada de Escherichia coli, Ec-IlvE, y de Lactococcus lactis, LI-BcaT, las transaminasas de aminoácido aromático de E. coli, Ec-TyrB, L. lactis, LI-AraT, y Saccharomyces cerevisiae, Sc-Aro8, o la aspartato transaminasa de E. coli, Ec-AspC.

La segunda etapa del método de la presente invención es catalizada por una enzima que presenta actividad de OHB reductasa. Dentro de un aspecto adicional de la invención, la enzima que presenta actividad de OHB reductasa se selecciona de entre enzimas que presentan una actividad de 2-hidroxiácido deshidrogenasa, en particular entre enzimas que presentan una actividad de lactato deshidrogenasa (Ldh) (EC1.1.1.27, EC 1.1.1.28) o malato deshidrogenasa (Mdh) (EC1.1.1.37, EC1.1.1.82, EC1.1.1.299). Más específicamente, la enzima que presenta actividad de homoserina transaminasa está codificada por genes ilvE, tyrB, aspC, araT, bcaT, o ARO8.

En un aspecto aún más específico, la enzima que presenta actividad de homoserina transaminasa está codificada por la secuencia expuesta en SEC ID N° 59, SEC ID N° 61, SEC ID N° 63, SEC ID N° 65, SEC ID N° 67 o SEC ID N° 69, o cualquier secuencia que comparta una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias o corresponda a SEC ID N° 60, SEC ID N° 62, SEC ID N° 64, SEC ID N° 66, SEC ID N° 68, SEC ID N° 70, o cualquier secuencia que comparta una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias.

Dentro de un aspecto adicional de la invención, la enzima OHB reductasa puede ser la (L)-lactato deshidrogenasa de Lactococcus lactis (Ll-LdhA), de Oryctalagus cuniculus (Oc-LldhA), de Geobacillus stearothermophilus (Gs-Lldh), o de Bacillus subtilis (Bs-Ldh), la (D)-lactato deshidrogenasa de Escherichia coli (Ec-LdhA), la (L)-malato deshidrogenasa de Escherichia coli (Ec-Mdh), o la (D)-2-hidroxiácido de cadena ramificada deshidrogenasa de Lactococcus lactis (LI-PanE).

En un aspecto aún más específico de la invención, la enzima OHB reductasa está representada por las secuencias de aminoácidos SEC ID N° 2, SEC ID N° 4, SEC ID N° 6, SEC ID N° 8, SEC ID N° 10, SEC ID N° 12, SEC ID N° 14, SEC ID N° 288, SEC ID N° 30, SEC ID N° 32, SEC ID N° 102, SEC ID N° 104, SEC ID N° 106, SEC ID N° 108, SEC ID N° 110, SEC ID N° 112, SEC ID N° 114, SEC ID N° 116 o SEC ID N° 118, o cualquier secuencia que comparta una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias, o sea codificada por las secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID N° 1, SEC ID N° 3, SEC ID N° 5, SEC ID N° 7, SEC ID N° 9, SEC ID N° 11, SEC ID N° 13, SEC ID N° 287, SEC ID N° 29, SEC ID N° 31, SEC ID N° 101, SEC ID N° 103, SEC ID N° 105, SEC ID N° 107, SEC ID N° 109, SEC ID N° 111, SEC ID N° 113, SEC ID N° 115 o SEC ID N° 117, o cualquier secuencia que comparta una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias.

En otro aspecto, la invención asimismo se refiere a la utilización de una enzima que reduce OHB a 2,4-DHB como se describió anteriormente.

Las proteínas que comparten homología con las enzimas anteriores asimismo son otro aspecto de la invención, tal como las variantes funcionales o los fragmentos funcionales.

La expresión “homología” cubre la homología con respecto a la identidad de secuencia.

Más generalmente, dentro del significado de la invención, la homología entre dos secuencias de proteínas puede determinarse por métodos bien conocidos por el experto en la materia. Generalmente se define como un porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia de referencia y la secuencia de una proteína de interés.

Como se usa en la presente memoria, el “porcentaje (%) de identidad de secuencia”, con respecto a las secuencias de aminoácidos o nucleotídicas identificadas en la presente memoria, se define como el porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia enzimática, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Los métodos para llevar a cabo el alineamiento de secuencias y determinar la identidad de la secuencia son conocidos por el experto en la materia, se pueden realizar sin experimentación excesiva, y los cálculos de los valores de identidad se pueden obtener con precisión. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York); y el programa ALIGN (Dayhoff (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.). Existen diversos algoritmos disponibles para alinear secuencias y determinar la identidad de secuencia, e incluyen, por ejemplo, el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443; el algoritmo de homología local de Smith, et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el método de búsqueda de similitud de Pearson, et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444; el algoritmo de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997); y los algoritmos BLASTP, BLASTN, y BLASTX (ver Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). Los programas computarizados que usan estos algoritmos asimismo están disponibles, e incluyen, pero no se limitan a: el software ALIGN o Megalign (ADNSTAR), o WU-BLAST-2 (Altschul, et al., Meth. Enzym., 266:460-480 (1996)); o GAP, BESTFIT, BLAST (Altschul, et al.), más arriba, FASTA, y TFASTA, disponibles en el paquete de Genetics Computing Group (GCG), Versión 8, Madison, Wis., USA; y CLUSTAL, en el programa PC/Gene de InteNigenetics, Mountain View, Calif. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr el alineamiento máximo a lo largo de la longitud de las secuencias que se comparan. Preferentemente, la identidad de secuencia se determina usando los parámetros predeterminados determinados por el programa. Específicamente, la identidad de secuencia se puede determinar mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997)) como se implementa en el programa MSPRCH (Oxford Molecular) usando una búsqueda de espacio afín con los siguientes parámetros de búsqueda: penalización por apertura de espacio de 12, y penalización por extensión de espacio de 1. Preferentemente, las comparaciones de aminoácidos emparejados se pueden llevar a cabo usando el programa GAP del paquete de software de análisis de secuencia de GCG de Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin, que emplea la matriz de sustitución de aminoácidos blosum62, con un peso de separación de 12 y un peso de longitud de 2. Con respecto al alineamiento óptimo de dos secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de aminoácidos variante puede tener restos de aminoácidos adicionales o restos de aminoácidos eliminados con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo usado para la comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia incluirá por lo menos 20 restos de aminoácidos contiguos, y puede ser 30, 40, 50 o más restos de aminoácidos. Las correcciones para el aumento de la identidad de secuencia asociada con la inclusión de espacios en la secuencia de aminoácidos del derivado se pueden hacer asignando penalizaciones por espacios.

Las enzimas según la presente invención que tienen la misma actividad (ya sea OHB reductasa, o la enzima que convierte el grupo amino primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener OHB) comparten por lo menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 50%, 70% u 85%, preferentemente por lo menos 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferentemente por lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, incluso más preferentemente por lo menos 95% de identidad de secuencia de aminoácidos, y aún más preferentemente 98% de identidad de secuencia de aminoácidos. Preferentemente, cualquier sustitución de aminoácidos son “sustituciones de aminoácidos conservativas” que usan L-aminoácidos, en las que un aminoácido es reemplazado por otro aminoácido biológicamente similar. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son aquellas que conservan la carga general, la hidrofobia/hidrofilia y/o el volumen estérico del aminoácido que se sustituye. ejemplos de sustituciones conservativas son las que se encuentran entre los siguientes grupos: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Lys/Arg, Asn/Gln, Glu/Asp, Ser/Cys/Thr, y Phe/Trp/Tyr. Un derivado puede, por ejemplo, diferir en tan solo 1 a 10 restos de aminoácidos, tal como 6-10, tan solo 5, tan solo 4, 3, 2, o incluso 1 resto de aminoácido.

La expresión variante funcional comprende enzimas que pueden presentar modificaciones sustanciales de la secuencia en comparación con las secuencias específicamente descritas en la presente solicitud, pero que aún conservan la actividad enzimática original.

Asimismo significa que la secuencia de la enzima puede comprender menos aminoácidos que la original, pero dicha enzima truncada aún conserva la actividad enzimática original.

Según un aspecto de la invención, se potencia la actividad de la enzima que cataliza la primera y/o la segunda etapa del método de la presente invención. Esta mejora se puede medir mediante un ensayo enzimático como se describe en los ejemplos 1 o 4.

La mejora de dichas enzimas se puede obtener mediante por lo menos una mutación, dicha mutación o mutaciones (i) mejorando la actividad y/o la afinidad del sustrato de la enzima mutada por homoserina u OHB respectivamente, y/o (ii) disminuyendo la actividad y/o afinidad del sustrato de la enzima mutada por su sustrato natural.

En el contexto de la presente invención, la expresión “mejorar la actividad y/o la afinidad del sustrato” significa que la enzima, antes de la mutación, era

- incapaz de usar el sustrato, y/o

- sintetizar el producto de la reacción a una velocidad específica máxima por lo menos tres veces menor, y/o

- tenía una afinidad por la homoserina o el OHB que era por lo menos tres veces menor, y/o

- tenía una actividad específica máxima en el sustrato natural que era por lo menos tres veces mayor, y/o

- tenía una afinidad por el sustrato natural que era por lo menos tres veces mayor.

Se describen además las secuencias nucleotídicas que codifican las enzimas que catalizan la primera y la segunda etapa del método de la invención.

En un aspecto aún más específico de la invención, la enzima OHB reductasa está codificada por las secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID N° 1, SEC ID N° 3, SEC ID N° 5, SEC ID N° 7, SEC ID N° 9, SEC ID N° 11, SEC ID N° 13, SEC ID N° 287, SEC ID N° 29, SEC ID N° 31, SEC ID N° 101, SEC ID N° 103, SEC ID N° 105, SEC ID N° 107, SEC ID N° 109, SEC ID N° 111, SEC ID N° 113, SEC ID N° 115 o SEC ID N° 117 o cualquier secuencia que comparta una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias.

La OHB reductasa según la invención corresponde en un aspecto específico a (L)-lactato deshidrogenasa A que comprende por lo menos una mutación, cuando se compara con la enzima de tipo salvaje, en por lo menos una de las posiciones V17, Q85, E89, I226, o A222. Estas posiciones se conservan en la familia de la lactato deshidrogenasa, y se definen en este texto mediante referencia a la (L)-lactato deshidrogenasa A de Lactococcus lactis (SEC ID N° 6). El experto en la materia identificará entonces fácilmente los restos de aminoácidos correspondientes en otras lactato deshidrogenasas mediante un alineamiento de las secuencias de aminoácidos correspondientes. Por lo tanto, la invención asimismo proporciona cambios de estos aminoácidos en otras enzimas lactato deshidrogenasas.

La OHB reductasa según la invención corresponde en un aspecto específico a la (L)-malato deshidrogenasa que comprende por lo menos una mutación, cuando se compara con la enzima de tipo salvaje, en por lo menos una de las posiciones 112, R81, M85, D86, V93, G179, T211, o M227. Estas posiciones se conservan en la familia de la malato deshidrogenasa, y se definen en este texto mediante referencia a la secuencia de la (L)-malato deshidrogenasa de E. coli (SEC ID N° 2). El experto en la materia identificará fácilmente los restos de aminoácidos correspondientes en otras malato deshidrogenasas mediante un alineamiento de las secuencias de aminoácidos correspondientes. Por lo tanto, la invención asimismo proporciona cambios de estos aminoácidos en otras enzimas malato deshidrogenasas.

Según esta invención, una “secuencia de ácido nucleico” se refiere a una molécula de ADN o ARN en forma monocatenaria o bicatenaria, preferentemente una molécula de ADN. Un “ADN aislado”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un ADN que no se produce de forma natural o que ya no está en el entorno natural en el que estaba originalmente presente, por ejemplo una secuencia codificante de ADN asociada con otros elementos reguladores en un gen quimérico, un ADN transferido a otra célula hospedadora, o una secuencia de ADN artificial, sintéticamente obtenida, que presenta una secuencia nucleotídica diferente en comparación con cualquier secuencia de ADN natural.

La presente invención asimismo se refiere a un gen quimérico que comprende, funcionalmente unidos entre sí, por lo menos un promotor que es funcional en un organismo hospedador, un polinucleótido que codifica cualquiera de las enzimas que catalizan la primera y segunda etapas del método como se define según la invención, y un elemento terminador que es funcional en el mismo organismo hospedador. Los diversos elementos que puede contener un gen quimérico son, en primer lugar, elementos que regulan la transcripción, traducción y maduración de proteínas, tales como un promotor, una secuencia que codifica un péptido señal o un péptido de tránsito, o un elemento terminador que constituye una señal de poliadenilación, y, en segundo lugar, un polinucleótido que codifica una proteína. La expresión “funcionalmente unidos entre sí” significa que dichos elementos del gen quimérico están unidos entre sí de tal manera que la función de uno de estos elementos se ve afectada por la del otro. A título de ejemplo, un promotor está funcionalmente unido a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de dicha secuencia codificante. La construcción del gen quimérico según la invención y el ensamblaje de sus diversos elementos se pueden llevar a cabo usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. La elección de los elementos reguladores que constituyen el gen quimérico depende esencialmente del organismo hospedador en el que deben funcionar, y los expertos en la materia son capaces de seleccionar elementos reguladores que son funcionales en un organismo hospedador dado. El término “funcional” pretende significar capaz de funcionar en un organismo hospedador dado.

Los promotores que puede contener el gen quimérico según la invención son constitutivos o inducibles. A título de ejemplo, los promotores usados para la expresión en bacterias se pueden seleccionar de los promotores mencionados a continuación. Para la expresión en Escherichia coli se puede hacer mención de los promotores lac, trp, Ipp, phoA, recA, araBAD, prou, cst-I, tetA, cadA, nar, tac, trc, Ipp-lac, Psyn, cspA, PL, PL-9G-50, PR-PL, T7, [lambda]PL-PT7, T3-lac, T5-lac, T4 gen 32, nprM-lac, VHb y los promotores de la proteína A, o asimismo el promotor Ptrp (documento WO 99/64607) Para la expresión en bacterias grampositivas, tales como Corynebacteria o Streptomyces, se puede hacer mención de los promotores PtipA o PS1 y PS2 (documento FR91/09870), o aquellos descritos en la solicitud EP0629699A2. Para la expresión en levaduras y hongos, se pueden mencionar los promotores PLAC4 de K. lactis o el promotor Ppgk de K. lactis (solicitud de patente FR 91/05294), el promotor tef1 o cbh1 de Trichoderma reesei (documento WO 94/04673), el promotor his, csl o apf Penicillium funiculosum (documento WO 00/68401), y el promotor gla de Aspergillus niger.

Según la invención, el gen quimérico asimismo puede comprender otras secuencias reguladoras, que se encuentran entre el promotor y la secuencia codificante, tales como activadores de la transcripción (potenciadores).

Como tal, el gen quimérico de la invención comprende, en una forma de realización específica, por lo menos, en la dirección de transcripción, unida funcionalmente, una secuencia reguladora del promotor que es funcional en un organismo hospedador, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polinucleótido que codifica cualquiera de las enzimas que catalizan la primera y segunda etapa del método como se define según la invención, y una secuencia reguladora de terminación que es funcional en dicho organismo hospedador.

La presente invención asimismo se refiere a un vector de clonación y/o expresión que comprende un gen quimérico según la invención o una secuencia de ácido nucleico de la invención. El vector según la invención es útil para transformar un organismo hospedador y expresar en este organismo cualquiera de las enzimas que catalizan la o las etapas primera y/o segunda del método de la presente invención. Este vector puede ser un plásmido, un cósmido, un bacteriófago, o un virus. Preferentemente, el vector de transformación según la invención es un plásmido. En general, las principales cualidades de este vector deberían ser capaces de mantenerse y autorreplicarse en las células del organismo hospedador, en particular en virtud de la presencia de un origen de replicación, y expresar cualquiera de las enzimas que catalizan la o las etapas primera y/o segunda del método de la presente invención en el mismo. Para el fin de la transformación estable de un organismo hospedador, el vector asimismo puede integrarse en el genoma. La elección de dicho vector, y asimismo las técnicas de inserción del gen quimérico según la invención en este vector forman parte del conocimiento general de los expertos en la materia. Ventajosamente, el vector usado en la presente invención asimismo contiene, además del gen quimérico según la invención, un gen quimérico que codifica un marcador seleccionable. Este marcador seleccionable permite seleccionar los organismos hospedadores que se transforman efectivamente, es decir, aquellos que incorporaron el vector. Según una forma de realización particular de la invención, el organismo hospedador a transformar es una bacteria, una levadura, un hongo. Entre los marcadores seleccionables que se pueden usar, se pueden mencionar marcadores que contienen genes de resistencia a los antibióticos, tales como, por ejemplo, el gen de higromicinfosfotransferasa. Otros marcadores pueden ser genes para complementar una auxotrofia, tales como los genes pyrA, pyrB, pyrG, pyr4, arg4, argB y trpC, el gen de la molibdopterina sintasa o el de la acetamidasa. Asimismo se pueden mencionar genes que codifican enzimas fácilmente identificables tal como la enzima GUS, o genes que codifican pigmentos o enzimas que regulan la producción de pigmentos en las células transformadas. Tales genes marcadores seleccionables se describen en particular en las solicitudes de patente WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 y WO 97/04103.

La presente invención asimismo se refiere a microorganismos modificados.

Más específicamente, el microorganismo modificado de la invención permite la preparación de 2,4-DHB a partir de homoserina mediante una ruta de dos etapas que comprende:

- una primera etapa de conversión del grupo amino primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener 2-oxo-4-hidroxibutirato, y

- una segunda etapa de reducción del 2-oxo-4-hidroxibutirato obtenido para obtener 2,4-dihidroxibutirato.

Las enzimas involucradas en las dos etapas son las descritas anteriormente.

El término “microorganismo” pretende hacer referencia a cualquier organismo unicelular inferior en el que se puede introducir el o los genes quiméricos, el o los ácidos nucleicos o el o los vectores según la invención, para producir 2,4-DHB. Preferentemente, el organismo hospedador es un microorganismo, en particular un hongo, por ejemplo del género Penicillium, Aspergillus, y más particularmente Aspergillus flavus, Chrysosporium o Trichoderma, una levadura, en particular de las Saccharomycetaceae, Pichiaceae o Schizosaccharomycetaceae, más preferentemente Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, o Pichia jadinii, Pichia stipitis o Pichia pastoris, una bacteria, seleccionada preferentemente entre Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriacae, y Corynebacteriaceae, más preferentemente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorquens o Lactococcus lactis.

La presente invención asimismo se refiere a microorganismos modificados que contienen por lo menos un gen quimérico según la invención, integrados en su genoma o portados en un elemento genético extracromosómico, por ejemplo un plásmido. En un aspecto más específico de la invención, el organismo hospedador transformado comprende un ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido que convierte el grupo aminoácido primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener OHB, y/o un ácido nucleico que codifica un polipéptido que reduce OHB en 2,4-DHB, o un gen quimérico que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que convierte el grupo aminoácido primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener OHB, y/o una OHB reductasa o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que convierte el grupo aminoácido primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener OHB, o un polipéptido que presenta una actividad de OHB reductasa.

Dentro de un aspecto adicional de la invención, la ruta sintética para la conversión de homoserina en DHB se expresa en un microorganismo con una producción mejorada de homoserina. La producción mejorada de homoserina en microorganismos se puede lograr (i) sobreexpresando las enzimas aspartato cinasa, aspartato semialdehído deshidrogenasa, y homoserina deshidrogenasa, (ii) haciendo que la enzima aspartato cinasa sea insensible a la inhibición del producto que puede producir la lisina, la metionina, o la treonina, y (iii) por supresión de rutas metabólicas que se ramifican de la ruta de biosíntesis de homoserina. La sobreexpresión de aspartato cinasa, aspartato semialdehído deshidrogenasa, y homoserina deshidrogenasa se puede lograr al expresar las enzimas de un plásmido multicopia bajo el control de un promotor constitutivo o inducible apropiado. Alternativamente, la sobreexpresión de dichas enzimas se puede lograr mediante la eliminación de represores transcripcionales que limitan la transcripción de genes que codifican aspartato cinasa, aspartato semialdehído deshidrogenasa, y homoserina deshidrogenasa. Las aspartato cinasas pueden devenir insensibles a la inhibición por los aminoácidos derivados del aspartato mediante la introducción de mutaciones apropiadas en sus secuencias de aminoácidos. Los puntos de entrada a las rutas metabólicas que se ramifican de la ruta de biosíntesis de homoserina son catalizados por enzimas que presentan una actividad de O-succinil homoserina u O-acetil homoserina sintasa (entrada en la biosíntesis de metionina), actividad de homoserina cinasa (entrada en la biosíntesis de treonina), o actividad de diaminopimelato descarboxilasa (entrada en la biosíntesis de lisina). La eliminación de genes que codifican proteínas que tienen dichas actividades enzimáticas evita la formación de aminoácidos derivados de aspartato y, por lo tanto, ayuda a la formación de homoserina.

En consecuencia, la eliminación de los genes metA, thrB, y lysA en E. coli atenúa las rutas que se ramifican de la ruta biosintética de la homoserina. El aumento de las actividades enzimáticas de la ruta de la homoserina en E. coli puede lograrse, por ejemplo, mediante la sobreexpresión del mutante bifuncional de aspartato cinasahomoserina deshidrogenasa thrA S345F (insensible a la inhibición de la treonina) y asd (ambos genes de E. coli); o por la sobreexpresión del mutante monofuncional de aspartato cinasa lysC E250K (insensible a la lisina), asd (ambos genes de E. coli), y el gen de la homoserina deshidrogenasa HOM6 de S. cerevisiae.

El microorganismo de la invención asimismo puede tener capacidad atenuada para exportar homoserina, lo que aumenta la disponibilidad intracelular de este aminoácido. Para lograr una disminución de la exportación de homoserina desde las células, se pueden eliminar las permeasas capaces de exportar homoserina. Tales permeasas pueden identificarse sobreexpresando bibliotecas genómicas en el microorganismo y cultivando dicho microorganismo a concentraciones inhibidoras de homoserina o aminoácidos estructuralmente similares tales como treonina, leucina o aspartato (Zakataeva et al. 1999/FEBS Lett/452/228-232). Es probable que los genes cuya sobreexpresión confiere crecimiento a concentraciones elevadas de cualquiera de dichos aminoácidos participen en la exportación de homoserina.

En otro aspecto, el microorganismo de la invención, que es Escherichia coli, porta supresiones en los transportadores de eflujo de homoserina rhtA, rhtb, y/o rhtC.

La producción eficiente de DHB se puede garantizar optimizando el reparto del flujo de carbono en la red metabólica del organismo hospedador con respecto a la optimización del suministro de cofactores para la síntesis de DHB, y la atenuación de las vías competidoras que causan la formación de subproductos metabólicos distintos al DHB. Una herramienta importante para mejorar la cepa proporciona un análisis de balance de flujo basado en restricciones. Este método permite calcular el rendimiento teórico de una red metabólica dada dependiendo de las condiciones de cultivo, y facilita la identificación de dianas metabólicas para sobreexpresión o supresión. Se describen las técnicas experimentales usadas para la sobreexpresión y la supresión de la reacción metabólica diana (ejemplo 8).

Por lo tanto, el microorganismo de la invención asimismo puede exhibir actividades enzimáticas seleccionadas de entre fosfoenolpiruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxicinasa, isocitrato liasa, piruvato carboxilasa, y permeasa simportadora de hexosa que aumenta, y/o por lo menos una de las actividades enzimáticas seleccionadas de entre lactato deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, acetato cinasa, fosfato acetiltransferasa, piruvato oxidasa, isocitrato liasa, fumarasa, 2-oxoglutarato deshidrogenasa, piruvato cinasa, enzima málica, fosfoglucosa isomerasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxicinasa, piruvato-formiato liasa, semialdehído succínico deshidrogenasa, fosfotransferasa que transporta azúcar, cetohidroxiglutarato aldolasa, homoserina-O-succinil transferasa, homoserina cinasa, transportador de eflujo de homoserina, diaminopimelato descarboxilasa, y/o metilglioxal sintasa, que disminuye o disminuyen.

En otro aspecto, el microorganismo de la invención, que es Escherichia coli, sobreexpresa por lo menos uno de los genes seleccionados de entre ppc, pck, aceA, galP, asd, thrA, metL, lysC, todos ellos de E. coli; pycA de L. lactis, y/o tiene por lo menos uno de los genes eliminados seleccionados de entre ldhA, adhE, ackA, pta, poxB, focA, pflB, sad, gabABC, sfcA, maeB, ppc, pykA, pykF, mgsA, sucAB, ptsl, ptsG, pgi, fumABC, aldA, lldD, iclR, metA, thrB, lysA, eda, rhtA, rhtB, rhtC.

La presente invención asimismo comprende un método de producción de 2,4-DHB, que comprende las etapas de

- cultivar el microorganismo modificado de la invención en un medio de cultivo apropiado,

- recuperar 2,4-DHB del medio de cultivo.

Dicho 2,4-DHB puede purificarse adicionalmente.

La separación y la purificación del producto es un factor muy importante que afecta enormemente la eficiencia general del procedimiento y los costes del producto. Los métodos para la recuperación del producto comprenden comúnmente las etapas de separación celular, así como la purificación, concentración y secado del producto, respectivamente.

Separación celular

La ultrafiltración y la centrifugación se pueden usar para separar las células del medio de fermentación. La separación celular de los medios de fermentación a menudo se complica por la alta viscosidad del medio. Por lo tanto, podemos añadir aditivos tales como ácidos minerales o sales alcalinas, o calentar el caldo de cultivo para optimizar la separación celular.

Recuperación del producto

Se puede aplicar una variedad de métodos cromatográficos de intercambio iónico para la separación de DHB antes o después de la eliminación de biomasa. Incluyen el uso de resinas de intercambio catiónico primario que facilitan la separación de productos según su punto isoeléctrico. Típicamente, la resina se carga con la disolución, y el producto retenido se eluye por separado después del aumento del pH (por ejemplo, añadiendo hidróxido de amonio) en el eluyente. Otra posibilidad es el uso de cromatografía de intercambio iónico usando resinas de lecho fijo o móvil simulado. Es posible que se deban combinar diferentes etapas cromatográficas para lograr la pureza adecuada del producto. Esos métodos de purificación son más económicos en comparación con una etapa de cristalización costosa, que asimismo proporcionan ventajas adicionales y flexibilidad con respecto a la forma del producto final.

Concentración y secado del producto

El procedimiento de purificación asimismo puede comprender una etapa de secado que puede implicar cualquier medio de secado adecuado, tal como un granulador por pulverización, secador por pulverización, secador de tambor, secador rotatorio, y secador de túnel. Las disoluciones concentradas de DHB se pueden obtener calentando caldos de fermentación a presión reducida por vapor a 130°C usando un concentrador multipropósito o un evaporador de película delgada.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Método de preparación de 2,4-DHB a partir de homoserina que comprende una ruta de dos etapas que utiliza una primera etapa de conversión del grupo amino primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener o Hb , y una segunda etapa de reducción del OHB obtenido a 2,4-DHB.

Figura 2: Actividades específicas de lactato deshidrogenasa de L. lactis purificada, mutada en la posición Q85. (A) actividades específicas sobre OHB, (B) actividades específicas sobre piruvato, (C) especificidad de sustrato expresada como relación de valores de Vmax en OHB y piruvato. Los valores mayores que 1 en la gráfica C indican preferencia por OHB (no se obtuvo saturación de actividad enzimática en ninguno de los sustratos para enzimas mutadas entre 0 y 50 mM de OHB o piruvato). Las actividades se midieron a una concentración de sustrato de 20 mM.

Figura 3: Actividades específicas de malato deshidrogenasa de E. coli purificada, mutada en posición R81. (A) actividades específicas sobre OHB, (B) actividades específicas sobre oxaloacetato. Las actividades se midieron a una concentración de sustrato de OHB de 20 mM u oxaloacetato de 0,5 mM.

Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: demostración de la actividad de OHB reductasa

Construcción de plásmidos que contienen genes de tipo salvaje que codifican lactato deshidrogenasa o malato deshidrogenasa:

Los genes que codifican la (L)-malato deshidrogenasa en Escherichia coli, Ec-mdh (SEC ID N° 1), (D)-lactato deshidrogenasa en E. coli, Ec-ldhA (SEC ID N° 3), (L)-lactato deshidrogenasa de Lactococcus lactis, Ll-ldhA (SEC ID N° 5), (L)-lactato deshidrogenasa de Bacillus subtilis, Bs-ldh (SEC ID N° 7), (L)-lactato deshidrogenasa de Geobacillus stearothermophilus, Gs-ldh (SEC ID N° 9), las dos isoformas de la (L)-lactato deshidrogenasa de Oryctalagus cuniculus Oc-ldhA (SEC ID N° 11 y SEC ID N° 13), se amplificaron por PCR usando la polimerasa Phusion™ (Fermentas) de alta fidelidad y los cebadores enumerados en la tabla 1. Como molde, se usaron ADN genómicos de E. coli MG1655, L. Lactis IL1403, y la cepa 168 de B. subtilis. Los genes Oc-ldhA, y Gs-ldh se optimizaron en el uso de codones para la expresión en E. coli, y se sintetizaron por MWG Eurofins. Los cebadores introdujeron sitios de restricción (tabla 1) en dirección 5' del codón de inicio y en dirección 3' del codón de parada, respectivamente, facilitando la ligación de los productos de la PCR digeridos en los sitios correspondientes del vector de expresión pET28a+ (Novagen)) usando T4 ADN ligasa (Fermentas). Los productos de ligación se transformaron en células DH5a de E. coli (NEB). Los plásmidos pET28-Ec-mdh, pET28-Ec-ldhA, pET28-Ll-ldhA, pET28-Bs-ldh, pET28-Gs-ldh, y pET28-Oc-IdhA resultantes se aislaron y mostraron mediante secuenciación de ADN que contienen la secuencia de longitud completa correcta de los genes de E. coli mdh, E. coli IdhA, L. lactis IdhA, B. subtilis Idh, G. stearothermophilus Idh, y O. cuniculus ldhA, respectivamente. Las secuencias proteicas correspondientes están representadas por SEC ID N° 2, SEC ID N° 4, s Ec ID N° 6, SEC ID N° 8, SEC Id N° 10, SEC ID N° 12 y SEC ID N° 14, respectivamente.

Tabla 1: Secuencias de cebadores y sitios de restricción usados para la amplificación y clonación de enzimas candidatas

Gen Secuencia de cebador directo e inverso Sitios de 5' - 3' restricción

Ec-mdh TATAATCATATGAAAGTCGCAGTCCTC (SEQ ID No 15). NdeI TATAATGGATCCTTACTTATTAACGAACTC (SEC ID N° 16) BamHI Ll-ldhA TATAATCATATGGCTGATAAACAACGTAAAAAA (SEC ID N° 17) Ndel

TATAATGGATCCTTAGTTTTTAACTGCAGAAGCAAA (SEC ID N° 18) SamHI

Bs_ldh TATAATGCTAGCATGATGAACAAACATGTAAATAAAGT (SEC ID N° 19) Ndel

TATAATGGATCCTTAGTTGACTTTTIGTTC (SEC ID N° 20) SamHI

Gs-ldh El gen fue suministrado por MWG Eurofins ™ en el vector pET28a NdeI SamHI Oc-ldhA TATAATGCTAGCATGGCGGCGTTGAAAGAC (SEC ID N° 21) NheI ATTATAGAATTCTTAAAATTGCAGTTCTTT (SEC ID N° 22) EcoRI Ll-panE TATAATCATATGAGAATTACAATTGCCGG (SEC ID N° 23) NdeI

TATAATGGATCCTTATTTTGCTTTTAATAACTCTTCTTTGC (SEC ID N° 24) SamHI

Ec-ldhA TATAATCATATGAAACTCGCCGTTTATAG (SEC ID N° 25) Ndel TATAATGGATCCTTAAACCAGTTCGTTCGG (SEC ID N° 26) SamHI

Expresión de enzimas; Las células de E. coli BL21 (DE3) se transformaron con los plásmidos apropiados usando protocolos genéticos estándares (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, 1989). Las enzimas con una etiqueta hexa-His N-terminal se expresaron en cultivos LB de 50 ml que se inocularon de un cultivo nocturno a OD600 de 0.1 y se hicieron crecer hasta OD600 de 0.6 antes de que se indujera la expresión de la proteína mediante la adición de 1 mM de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IpTG) al medio de cultivo. Después de 15 h de la expresión proteica, las células se cosecharon por centrifugación a 4000 g a 4°C durante 10 min, y se descartó el sobrenadante. Los sedimentos celulares se almacenaron a -20°C hasta su posterior análisis. El crecimiento y la expresión de proteínas se llevaron a cabo a 25°C. Los medios de cultivo contenían 50 pg/ml de kanamicina.

Purificación de enzimas: Los sedimentos celulares congelados de los cultivos de expresión se resuspendieron en 0.5 ml de amortiguador de rotura (Hepes 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7.5), y se abrieron en cuatro rondas sucesivas de sonicación (intervalo de sonicación: 20 s, potencia de salida: 30%, sonicador: Bioblock Scientific, VibraCell™ 72437). El desecho celular se eliminó centrifugando los extractos brutos durante 15 minutos a 4°C a 4000 g, y reteniendo el sobrenadante transparente. El ARN y el ADN se eliminaron de los extractos añadiendo 15 mg/ml de sulfato de estreptomicina (Sigma), centrifugando las muestras a 13000 g durante 10 minutos a 4°C, y reteniendo el sobrenadante. El extracto de proteína transparente se incubó durante 1 h a 4°C con 0.75 ml (volumen del lecho) de resina de afinidad de cobalto Talon™ (Clontech). La suspensión se centrifugó a 700 g en una centrífuga de mesa, y se eliminó el sobrenadante. La resina se lavó con 10 volúmenes de lecho de amortiguador de lavado (Hepes 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 15 mM, pH 7.5) antes de eluir las proteínas con 0.5 ml de amortiguador de elución (Hepes 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, pH 7.5). La pureza de las enzimas eluidas se verificó mediante análisis de SDS-PAGE. Las concentraciones de proteínas se estimaron con el método de Bradford (Bradford (1976, Anal. Biochem. 72: 248-54). Para estabilizar las enzimas lactato deshidrogenasas, el amortiguador de elución se intercambió sistemáticamente por amortiguador de fosfato 100 mM ajustado a pH 7. La muestra de proteína se transfirió a un filtro ultracentrífugo Amicon™ (corte de 10 kDa), y se centrifugó durante 8 minutos a 4000 g a 4°C para eliminar el amortiguador. La proteína se diluyó en amortiguador de fosfato, y el procedimiento se repitió 4 veces.

Ensayos enzimáticos: La mezcla de reacción contenía Hepes 60 mM (pH 7), cloruro potásico 50 mM, MgCh 5 mM, NADH 0.25 mM, (opcionalmente fructosa-1,6-bisfosfato 5 mM) (todos los productos de Sigma), y cantidades apropiadas de malato o lactato deshidrogenasa purificada o de extracto celular. Las reacciones se iniciaron añadiendo cantidades apropiadas de 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB), piruvato, u oxaloacetato (OAA). Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo a 37°C en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocilios en un volumen final de 250 pl. Las reacciones fueron seguidas por la absorción característica de NADH a 340 nm (enadh = 6.22 mM-1 cm-1) en un lector de microplacas (BioRad 680XR).

OHB se sintetizó incubando homoserina 125 mM con (L)-aminoácido oxidasa de veneno de serpiente (1.25 U/ml, Sigma) y catalasa (4400 U/ml, Sigma) en amortiguador Tris 100 mM a pH 7.8 durante 90 min a 37°C. Posteriormente, la mezcla de reacción se purificó en un filtro ultracentrífugo Amicon™ con un corte de 10 kDa, para eliminar las enzimas (método adaptado de Wellner y Lichtenberg, 1971).

El OHB se cuantificó mezclando 100 pl de la disolución ensayada con 1 ml de una disolución que contiene arseniato de sodio 1 M y ácido bórico 1 M a pH 6.5. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos, y la absorbancia a 325 nm se usó para cuantificar OHB. La relación entre la absorbancia y la concentración de la cetona se calibró usando disoluciones de piruvato de concentraciones conocidas (método adaptado de (Wellner y Lichtenberg, 1971)). El rendimiento típico de OHB del método fue 90%.

Resultados: Los parámetros cinéticos se enumeran en la tabla 2 para las enzimas analizadas en sus sustratos naturales y OHB. Se encontró actividad significativa de OHB reductasa para todas las lactato deshidrogenasas de diferente origen biológico. Malato deshidrogenasa, Mdh, de E. co lisolo tuvo muy poca actividad en OHB. La 2-oxoácido deshidrogenasa de cadena ramificada, PanE, de L. lactis asimismo tuvo una actividad significativa en OHB.

Tabla 2: Sumario de parámetros cinéticos de enzimas candidatas seleccionadas en su sustrato natural y OHB

Actividad específica máx. Afinidad del sustrato, Km [pmol/(mg min)] [mM]

Enzima Sustrato natural3 OHBb Sustrato naturala OHB Ec-Mdh 95.6 0.01 0.04 ns Ll-Ldh 184 18 2.7 ns Gs-Ldh 87.7 66.8 1.2 1.3 Bs-Ldh 170 15.7 nd ns Ll-PanE nd 2.58 nd ns Oc-LdhA 68.3 6.5 1.5 13 Ec-LdhA 265 0.56 1.8 4.8 (a) Los sustratos naturales para Mdh y Ldh son oxaloacetato y piruvato, respectivamente

(b) Cuando las enzimas no se pudieron saturar, la actividad específica máxima se refiere a la actividad estimada a una concentración de sustrato de 20 mM

ns - no saturado

nd - no determinado

Ejemplo 2: construcción de enzimas lactato deshidrogenasa con actividad de reductasa OHB mejorada

La mutagénesis dirigida al sitio del gen IdhA de L. lactis se llevó a cabo usando el plásmido pET28-Ll-ldhA como molde. Se introdujeron mutaciones puntuales para cambiar la secuencia de aminoácidos por PCR (Phusion 1U, amortiguador HF 20% (v/v), dNTPs 0.2 mM, cebadores directos e inversos 0.04 pM cada uno, plásmido molde 30­ 50 ng, agua) usando los pares de oligonucleótidos enumerados en la tabla 3. Los genes mutados por PCR contenían un nuevo sitio de restricción enumerado en la tabla 3 (introducido usando mutaciones silenciosas), además de la mutación funcional, para facilitar la identificación de clones mutados. Los productos de la PCR se digirieron por Dpnl a 37°C durante 1 h para eliminar el ADN molde, y se transformaron en células DH5a de E. coli (NEB) competentes. Los plásmidos mutados se identificaron mediante análisis de sitio de restricción, y se verificó que portaban las mutaciones deseadas mediante secuenciación de ADN.

Tabla 3: Oligonucleótidos usados para mutar lactato deshidrogenasa ldhA de L. lactis (nnk denota un codón degenerado, representando k timina o citosina)

Proteína Mutación Secuencias de cebadores 5’ - 3’ Sitio de restricción Ll-LdhA Q85nnk GT CTT G ACTT CTG GTGCTCCAN N KAAACCAGGTG Mlul

AAACGCGTCTT (SEQ ID NO.27)

AAGACGCGTTT CACCTGGTTTMN NT GGAGCACCA

GAAGTCAAGAC (SEQ ID NO.28)

Ll-LdhA I226V CGTGATGCTGCTTACTCGATCGTCGCTAAAAAAG pvu|

GTG (SEQ ID No.99)

CACCTTTTTT AG CG ACG AT CG AGT AAG CAGCAT C

ACG (SEQ ID No. 100)

Las enzimas mutantes se expresaron, purificaron y ensayaron para determinar la actividad de OHB y piruvato reductasa como se describe en el ejemplo 1. Las medidas de la actividad para ambos sustratos se resumen en la figura 2. Los resultados demuestran que el reemplazo de Gln85 por preferentemente alanina, cisteína, asparagina, o metionina produce un aumento de la especificidad de la enzima para OHB, y/o un aumento en la actividad específica máxima de reductasa de OHB.

La mutación Q85N en Ll-Ldh se combinó con la mutación 1226V. Se demostró que este intercambio tuvo un gran impacto positivo en la afinidad del sustrato para OHB.

Tabla 4: Sumario de parámetros cinéticos de mutantes de lactato deshidrogenasa A, LI-LdhA, de L. lactis, en piruvato y OHB

Actividad específica máx. Km [^mol/(mg min)] [mM] Enzima mutante Sec ID Piruvato OHB Piruvato OHB

Q85N SEC ID N° 30 184 63.9 22.1 29.2

Q85NI226V SEC ID N° 32 11.5 4.9 1.4 3.3

Ejemplo 3: construcción de enzimas malato deshidrogenasas con actividad mejorada de OHB reductasa La mutagénesis dirigida al sitio del gen mdh de E. coli se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 2 usando los cebadores enumerados en la tabla 5. El plásmido pET28-Ec-mdh se usó como molde.

Tabla 5 Oligonucleótidos usados para mutar malato deshidrogenasa mdh de E. coli (nnk denota un codón degenerado, representando k timina o citosina)

Proteína Mutación Secuencias de cebadores 5’ - 3’ Sitio de restr. Ec-Mdh R81nnk TTATCTCTGCAGGCGTAGCGNNKAAACCCGGGATGGATCGTTC (SEC Sma1

ID N° 33)

GAACGATCCATCCCGGGTTTMNNCGCTACGCCTGCAGAGATAA (SEC

ID N °34)

Ec-Mdh R81AM85E TTAT CT CTGCAGGCGTAGCGGCTAMCCGGGT GAGGAT CGTT CC no GA.CCTG CSEQ.ID NQ..3S, Sma1

CAGGTCGGAACG AT CCT CACCCGGTTTAGCCGCTACGCCTGCA

GAGATAA(SEQ ID NO. 36)

Ec-Mdh R81AM85Q TTATCTCTGCAGGCGTAGCGGCTAAACCGGGTCAGGATCGTTCC no GACCTG (SEQ ID NO.37) Sma1

CAGGTCGGAACG AT CCT GACCCGGTTTAGCCGCTACGCCTGCA

GAGATAA (SEQ ID NO.38)

Ec-Mdh I12V GTCGCAGTCCTCGGCGCCGCTGGCGGTGTCGGCCAGGCGCTTG Nar1 CAC (SEQ ID NO.39

GTGCAAGCGCCTGGCCGACACCGCCAGCGGCGCCGAGGACTG

CGAC (SEQ ID NO.40)

Ec-Mdh G179D CCG GTT ATT GGC GGC CAC TCT GAT GTT ACC ATT CTG CCG Eae1 CTG CTG (SEQ ID NO.41)

CAGCAGCGGCAGAATGGTAACATCAGAGTGGCCGCCAATAACC

GG (SEQ ID NO.42)

Ec-Mdh R81AD86S GGCGTAGCGGCTAAACCGGGTATGTCTCGTTCCGACCTG (SEC ID N° no 43) Sma1 CAGGTCGGAACGAGACATACCCGGTTTAGCCGCTACGCC (SEC ID N°

44)

Las enzimas mutantes se expresaron, purificaron y analizaron para determinar la actividad de OHB y oxaloacetato reductasa como se describe en el ejemplo 1. Las medidas de actividad en OHB y oxaloacetato se resumen en la figura 3. Los resultados demuestran que el reemplazo de Arg81 por alanina, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, asparagina, glutamina, serina, treonina, o valina confiere una actividad de OHB reductasa significativa y una disminución concomitante de la actividad de oxaloacetato reductasa.

La mutación R81A en Ec-Mdh se combinó con cambios adicionales en la secuencia proteica. Los resultados se enumeran en la tabla 6. Se demostró que la introducción de las mutaciones M85Q, M85E, 112V, D86S o G179D da como resultado una mayor actividad en OHB.

Tabla 6: Sumario de parámetros cinéticos de mutantes de malato deshidrogenasa de E. coli en oxaloacetato (OAA) y OHB

Actividad específica máx. Km [^mol/(mg min)] [mM] Enzima mutante SecID OAAa OHBb OAA OHB Actividad específica máx. Km [gmol/(mg min)] [mM] Tipo salvaje SEC ID N° 2 95 0.01 0.04 ns R81A SEC ID N° 102 1.16 1.8 ns ns R81A M85Q SEC ID N° 104 0.5 4.99 ns ns R81A M85E SEC ID N° 106 1 3 ns ns R81A M85Q I12V SEC ID N° 108 1.84 18.9 ns 15 R81A M85E I12V SEC ID N° 110 2.2 12.54 ns ns R81A G179D SEC ID N° 112 0.37 4.16 ns ns R81A D86S SEC ID N° 1114 0.67 14.6 ns ns R81A I12V SEC ID N° 115 0.5 4.9 ns ns R81A G179D D86S SEC ID N° 118 0.54 19 ns ns (a) - la actividad se midió a 0.5 mM de oxaloacetato

(b) - la actividad se midió a 20 mM de OHB

(ns) - no saturado a concentraciones de hasta 50 mM de OHB y 0.5 mM de oxaloacetato

Ejemplo 4: Demostración de la actividad de homoserina transaminasa para transaminasas seleccionadas

Los genes que codifican diferentes transaminasas en E. coli, S. cerevisiae, y L. lactis se amplificaron por PCR usando la polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y los cebadores enumerados en la tabla 7. Como moldes, se usó ADN genómico de E. coli MG1655, S. cerevisiae BY4741, y L. lactis IL1403. Los cebadores introdujeron sitios de restricción (tabla 7) en dirección 5’ del codón de inicio y en dirección 3’ del codón de parada, respectivamente, facilitando la ligación de los productos de la PCR digeridos en los sitios correspondientes del vector de expresión pET28a+ (Novagen) usando T4 ADN ligasa (Biolabs). Los productos de ligación se transformaron en células DH5a de E. coli. Los plásmidos resultantes se aislaron, y se mostró mediante secuenciación de ADN que contenían la secuencia correcta de longitud completa de los genes correspondientes. Las referencias a las secuencias de proteínas correspondientes se enumeran en la tabla 7.

Tabla 7: Secuencias de cebadores y sitios de restricción usados para la amplificación y clonación de enzimas candidatas (abreviaturas usadas para el organismo fuente: Ec - E. coli, Sc - S. cerevisiae, Ll - L. lactis). Todos los genes se clonaron en pET28a+ (Novagen), añadiendo una etiqueta Hexa-His N-terminal.

Gen Secuencias de cebador directo e inverso Secuencia del Secuencia Sitios de gen proteica restricción 5’ - 3’

Ec-ilvE ataatgctagcatgaccacgaagaaagctgattaca (SEC I SEC ID N° 59 SEC ID N° 60 NheI N° 47)

tataatggatccttattgattaacttgatctaacc (SEC ID N° BamHI 48)

Tataatggatccttacatcaccgcagcaaac (SEC ID N° BamHI 50)

SEC ID N° 63 SEC ID N° 64 NheI

Tataatggatccttacagcactgccacaatcg (SEC ID N° BamHI 52)

Ll-araT Tataatgctagcatggatttattaaaaaaatttaaccct SEC ID N° 65 SEC ID N° 66 NheI aa (SEQ ID No. 53)

Tataatggatcctcagccacgttttttagtcacataa (SEC ID BamHI

SEC ID N° 67 SEC ID N° 68 NheI

Tataatggatccttaatcaactttaactatcc (SEC ID N.° 56) BamHI

Tataatggatccctatttggaaataccaaattcttcg (SEC ID BamHI N° 58)

Las enzimas se expresaron y purificaron como se describe en el ejemplo 1, y se analizaron para determinar la actividad de homoserina transaminasa en las condiciones que se describen a continuación.

Ensayos enzimáticos: La actividad de transaminasa de varias aminotransferasas candidatas se cuantificó con 2-oxoglutarato como aceptor del grupo amino. Las reacciones de transaminasas se llevaron a cabo usando homoserina y el aminoácido preferido de las enzimas. Las reacciones se siguieron por la oxidación dependiente de aminoácidos de NADH en la reacción de deshidrogenasa acoplada.

Ensayos de transaminasas (esquema de reacción)

Transaminasa:

Aminoácido 2-oxoglutarato ^ 2-oxoácido glutamato

Deshidrogenasa:

2-oxoácido NADH ^ 2-hidroxiácido NAD+

La mezcla de reacción contenía Hepes 60 mM (pH 7), cloruro potásico 50 mM, MgCh 5 mM, 2-oxoglutarato 4 mM, piridoxal-5'-fosfato (PLP) 0.1 mM, NADH 0.25 mM, (opcionalmente fructosa-1,6-bisfosfato 5 mM) (todos los productos de Sigma), 4 unidades/ml de 2-hidroxiácido deshidrogenasa auxiliar, y cantidades apropiadas de aminotransferasa purificada o extracto celular. La enzima deshidrogenasa auxiliar se purificó: PanE de L. lactis en caso de los aminoácidos fenilalanina y leucina (Chambellon, Rijnen, Lorquet, Gitton, van HylckamaVlieg, Wouters, e Yvon, 2009), malato deshidrogenasa (Sigma) en caso de aspartato, y (L)-lactato deshidrogenasa de músculo de conejo (Sigma) cuando se usó homoserina como el sustrato de partida. Las reacciones se iniciaron añadiendo 50 mM del aminoácido.

Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo a 37°C en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos en un volumen final de 250 pl. Las reacciones se siguieron por la absorción característica de NAD(P)H a 340 nm (£^nadph = 6.22 mM'1 cirr1) en un lector de microplacas (BioRad 680XR).

Resultados: Los parámetros cinéticos de las diferentes aminotransferasas se enumeran en la tabla 8. Se encontró actividad significativa de la homoserina transaminasa para las enzimas transaminasas enumeradas.

Tabla 8: Actividades de transaminasas de enzimas candidatas ensayadas en homoserina y su sustrato de aminoácidos preferido (abreviaturas usadas para el organismo fuente: Ec - E. coli, Sc - S. cerevisiae, Ll - L.

lactis).

Enzima Actividad específica máx. en diferentes sustratos [pmol)(min mgprot)]

Homoserina* Aminoácido preferido

Ec-IlvE 0.077 10.6(L)

Ec-TyrB 0.057 9.03(P)

Ec-AspC 0.082 74.031(A)

Ll-AraT 0.109 11.72(P)

Ll-BcaT 0.028 30.39(L)

Sc-ARO8 0.076 20.5(P)

(*) actividad medida a 50 mM de homoserina

Ejemplo 5: construcción de plásmidos para la sobreexpresión de las enzimas de la ruta de la homoserina

Construcción de los plásmidos pTAC-op-HMS1 y pACT3-op-HMS1

El plásmido pET28-LYSCwt se construyó amplificando el gen lysC por PCR usando polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y los cebadores directo e inverso 5'CAc Ga GGTACATATg Tc TGAAATTGTTGTCTCC3' (SEC ID N° 71) y 5'CTTCCAGGGGATCCAGWTTACTCAAAC3' (SEC ID N° 72) que introdujeron sitios de restricción Ndel y BamHI en dirección 5' del codón de inicio y en dirección 3' del codón de parada, respectivamente. Como molde, se usó ADN genómico de E. coli MG1655. El producto de la PCR se digirió con Ndel y BamHI, se ligó en los sitios correspondientes del vector de expresión pET28a (Novagen) usando T4 ADN ligasa (Biolabs), y se transformó en células DH5a de E. coli. El plásmido pET28-LYSCwt resultante se aisló, y se demostró mediante secuenciación de ADN que contenía el gen lysC de longitud completa que presenta la secuencia correcta (SEC ID N° 73).

La mutagénesis dirigida al sitio de lysC para aliviar la inhibición por lisina se llevó a cabo usando el plásmido pET28-LYSCwt como molde. Se introdujo una mutación puntual para cambiar la secuencia de aminoácidos en la posición 250 de glutamato a lisina (E250K, SEC ID N° 36) por PCR (Phusion 1U, amortiguador HF 20% (v/v), dNTPs 0.2 mM, cebadores directo e inverso 0.04 pM cada uno, plásmido molde 50 ng, agua) usando los oligonucleótidos 5'GCGTTTGCCGAAGCGGCAAAGATGGCCACTTTTG3' (SEC ID N° 74) y 5'CAAAAGTGGCCATCTTTGCCGCTTCGGCAAACGC3' (SEC ID N° 75). El producto de la PCR (SEC ID N° 35) se digirió por Dpnl a 37°C durante 1 h para eliminar ADN molde, y se transformó en células DH5a de E. coli (NEB) competentes. El plásmido mutado pET28-LYSC* se identificó mediante análisis del sitio de restricción, y se verificó que portaba las mutaciones deseadas mediante secuenciación de ADN.

El plásmido pET28-ASDwt se construyó amplificando el gen asd de E. coli por PCR usando polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y los cebadores directo e inverso 5'TATAATGCTAGCATGAAAAATGTTGGTTTTATCGG3' (SEC ID N° 76) y 5'TATAATGGA-TCCTTACGCCAGTTGACGAAGC3' (SEC ID N° 77) que introdujeron un sitio de restricción Nhel y BamHI en dirección 5' del codón de inicio y en dirección 3' del codón de parada, respectivamente. Como molde, se usó ADN genómico de E. coli DH5a. El producto de la PCR se digirió con Nhel y BamHI, se ligó en los sitios correspondientes del vector de expresión pET28a (Novagen) usando T4 ADN ligasa (Biolabs), y se transformó en células DH5a de E. coli. El plásmido pET28-ASDwt resultante se aisló, y se demostró mediante secuenciación de ADN que contenía el gen asd de longitud completa que presenta la secuencia correcta (SEC ID N°98).

El plásmido pET28-HOM6wt se construyó amplificando el gen HOM6 de S. cerevisiae por PCR usando polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y los cebadores directo e inverso 5'TATAAT CATATGAGCACTAAAGTTGTTAATG3' (SEC ID N° 78) y 5'TATAATGGATC-CCTAAAGTCTTTGAGCAATC3' (SEC ID N° 79) que introdujeron un sitio de restricción NdeI y BamHI en dirección 5' del codón de inicio y en dirección 3' del codón de parada, respectivamente. Como molde, se usó ADN genómico de S. cerevisiae BY4741. El producto de la PCR se digirió con NdeI y BamHI, se ligó en los sitios correspondientes del vector de expresión pET28a (Novagen) usando T4 ligasa (Biolabs), y se transformó en células DH5a de E. coli. El plásmido pET28-HOM6wt resultante se aisló, y se demostró mediante secuenciación de ADN que contenía el gen HOM6 de longitud completa que presenta la secuencia correcta (SEC ID N° 97).

El plásmido pET28-LYSC* se usó como la columna vertebral para la construcción del plásmido pTAC-op-HMS que permitió la expresión de aspartato cinasa insensible a lisina, aspartato semialdehído deshidrogenasa, y homoserina deshidrogenasa a partir de un promotor tac inducible.

El gen asd se obtuvo por PCR a partir de pET28-asdwt. Toda la región codificante y parte de la región en dirección 5' que comprende el sitio de unión al ribosoma (rbs) de pET28 y la etiqueta de His N-terminal en el marco se amplificaron por PCR usando la polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y los cebadores directo e inversos 5'TATAAGGATCCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGG3' (SEC ID N° 80) y 5'TATAAGAATTCTTACGCCAGTTGACGAAG3' (SEC ID N° 81) que introdujeron un sitio de restricción BamHI y EcoRI en dirección 5' del rbs y en dirección 3' del codón de parada, respectivamente. El producto de la PCR se digirió con BamHI y EcoRI, se ligó en los sitios correspondientes de pET28-LYSC* usando T4 ADN ligasa (Biolabs), y se transformó en células DH5a de E. coli. El plásmido pET28-LYSC*-ASD resultante se aisló, y se demostró mediante secuenciación de ADN que presenta la secuencia correcta.

El gen HOM6 se obtuvo por PCR a partir de pET28-HOM6wt. Toda la región codificante y parte de la región en dirección 5' que comprende el sitio de unión al ribosoma de pET28 y la etiqueta de His N-terminal en el marco se amplificaron por p Cr usando polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes), el cebador directo 5'TATAAGCGGCCGCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATAT3' (SEC ID N° 82), y el cebador inverso 5'TATAAACTCGAGCCTAAAGTCTTTGAGCAAT3' (SEC ID N° 83), que introdujeron un sitio de restricción NotI y PspXI en dirección 5' del rbs y en dirección 3' del codón de parada, respectivamente. El producto de la PCR se digirió con NotI y PspXI, se ligó en los sitios correspondientes de pET28-LYSC*-ASD, usando T4 ADN ligasa (Biolabs), y se transformó en células DH5a de E. coli. El plásmido pET28-op-HMS1 resultante se aisló, y se mostró mediante secuenciación de ADN que presenta la secuencia correcta.

La región promotora en dirección 5' de 5' que regula simultáneamente la expresión de los tres genes (es decir, el promotor T7 en pET28a+) se puede reemplazar por cualquier otro promotor, inducible o constitutivo, digiriendo los plásmidos con SphI y XbaI y clonando otra región promotora con sitios de restricción adecuados.

En el presente ejemplo no exclusivo, el promotor T7 del esqueleto pET28a+ fue reemplazado por el promotor tac artificial inducible por IPTG (de Boer et al., 1983). El promotor tac se obtuvo del plásmido pEXT20 (Dykxhoorn et al., 1996) digiriendo este plásmido con SphI y XbaI. El fragmento de ADN que contiene el promotor se purificó y se clonó en pET28-op-HMS1 digerido con SphI y XbaI, obteniendo pTAC-op-HMS1. El plásmido pTAC-op-HMS resultante se aisló, y se demostró mediante secuenciación de ADN que presenta la secuencia correcta.

El operón que contiene las secuencias codificantes de lysC*, asd, y HOM6 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pTAC-op-HMS1 usando los cebadores 5'-TATAAAGATCTTAGAAATAATTTTGTTTA-3' (SEC ID N° 84) y 5'-TATAATCTAGACTAAAGTCTTTGAGCAAT-3' (SEC ID N° 85) que introdujeron un sitio de restricción BglII y XbaI en el extremo 5' y 3', respectivamente, del fragmento de PCR. El fragmento se purificó, se digirió con BglII y XbaI, y se clonó en los sitios correspondientes de pACT3 (Dykxhoorn et al., 1996) para obtener el vector pACT3-op-HMS1. El plásmido pACT3-op-HMS1 resultante se aisló, y se demostró mediante secuenciación de ADN que presenta la secuencia correcta.

Construcción de los plásmidos pEXT20-op-HMS2 y pACT3-op-HMS2

El plásmido pET28-thrAwt se construyó amplificando el gen thrA de E. coli que codifica la enzima bifuncional aspartato cinasa/homoserina deshidrogenasa I mediante PCR usando polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y los cebadores directo e inverso 5'-TATAATCATATGCGAGTGTTGAAGTTCG-3' (SEC ID N° 86) y 5'-TATAATGGATCCTCAGACTCCTAACTTCCA-3' (SEC ID N° 87) que introdujeron sitios de restricción Ndel y BamHI en dirección 5' del codón de inicio y en dirección 3' del codón de parada, respectivamente. Como molde, se usó ADN genómico de E. coli MG1655. El producto de la PCR se digirió con Ndel y BamHI, se ligó en los sitios correspondientes del vector de expresión pET28a+ (Novagen) usando T4 ADN ligasa (Biolabs), y se transformó en células de E. coli competentes NEB 5-alfa (NEB). El plásmido pET28-thrAwt resultante se aisló, y se demostró mediante secuenciación de ADN que contiene el gen de thrA longitud completa que presenta la secuencia correcta (SEC ID N° 88). La proteína correspondiente está representada por la SEC ID N° 89.

Se construyó una aspartato cinasa/homoserina deshidrogenasa con una sensibilidad fuertemente disminuida para la inhibición por treonina mediante mutagénesis dirigida al sitio, reemplazando la serina en la posición 345 por fenilalanina (S345F). La mutagénesis dirigida al sitio se llevó a cabo usando los cebadores directo e inverso 5'-TGTCTCGAGCCCGTATTTTCGTGGTGCTG-3’ (SEC ID N° 90) y 5'-CAGCACCACGAAAATACGGGCTCGAGACA-3’ (SEC ID N° 91) y el plásmido pET28-thrAwt como molde. Se introdujo una mutación de un solo punto para cambiar la secuencia de aminoácidos mediante PCR (Phusion 1U, amortiguador HF 20% (v/v), dNTPs 0.2 mM, cebadores directo e inverso 0.04 pM cada uno, plásmido molde 30­ 50 ng, agua). Los plásmidos creados por PCR contenían un nuevo sitio de restricción para XhoI (subrayado) introducido por mutación silenciosa, además de la mutación funcional, para facilitar la identificación de clones mutados. Los productos de la PCR se digirieron por DpnI a 37°C durante 1 hora para eliminar el ADN molde, y se transformaron en células DH5a de E. coli competentes (NEB). El plásmido mutado pET_Ec_thrA_S345F se identificó mediante análisis del sitio de restricción, y se verificó que portaba la mutación deseada mediante secuenciación de ADN.

La región codificante thrAS345F de la aspartato cinasa/homoserina deshidrogenasa bifuncional de E. coli se obtuvo por PCR usando el plásmido pET_Ec_thrA_S345F como molde (SEC ID N° 92). Toda la región codificante se amplificó por PCR usando polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y los cebadores directo e inverso 5'-TATAATGAGCTCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGCGAGTGTTGA AGTTCGGCG-3' (SEC ID N° 93) y 5'-TATAATCCCGGGTCAGACTCCTAACTTCCA-3' (SEC ID N° 94) que introdujeron un sitio de restricción SacI y XmaI (subrayado) en dirección 5' del codón de inicio y en dirección 3' del codón de parada, respectivamente. El cebador directo incluye la secuencia del sitio de unión al ribosoma (negrita) de pET28. El producto de la PCR se digirió con SacI y XmaI, se ligó en los sitios correspondientes de pEXT20 o pACT3 (Dykxhoorn, St Pierre, y Linn, 1996), usando T4 ADN ligasa (Biolabs), y se transformó en células DH5a de E. coli. Los plásmidos pEXT20-op-HMS2_step1 y pACT3-op-HMS2_step1 resultantes se aislaron, y se demostró mediante secuenciación de ADN que tienen la secuencia correcta.

La aspartato semialdehído deshidrogenasa asd de Escherichia coli se amplificó por PCR usando polimerasa de alta fidelidad PhusionTM (Finnzymes) y los cebadores directo e inverso 5'-TATAATCCCGGGGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAAAATGTTG GTTTTATCGGC-3' (SEC ID N° 95) y 5'-TATAATGGATCCTTACGCCAGTTGACGAAG-3' (SEC ID N° 96) que introdujeron un sitio de restricción XmaI y BamHI en dirección 5' del codón de inicio y en dirección 3' del codón de parada, respectivamente (SEC ID N° 98). El cebador directo incluye la secuencia del sitio de unión al ribosoma de pET28. Como molde, se usó ADN genómico de E. coli MG1655. El producto de la PCR se digirió con XmaI y BamHI, se ligó en los sitios correspondientes de pEXT20-op-HMS2_step1 y pACT3-op-HMS2_step1, directamente en dirección 3' del gen thrA de E. coli, usando t 4 ADN ligasa (Biolabs), y se transformó en células DH5a de E. coli. Los plásmidos pEXT20-op-HMS2 y pACT3-op-HMS2 resultantes se aislaron, y se demostró mediante secuenciación de ADN que tienen la secuencia correcta.

Ejemplo 6: construcción de plásmidos para la sobreexpresión de las enzimas fosfoenolpiruvato (PEP) carboxicinasa, PEP carboxilasa, piruvato cinasa, piruvato carboxilasa, isocitrato liasa, y la permeasa simportadora de galactosa:

El plásmido pACT3-pck que aloja el gen pck de E. coli codificante de PEP carboxicinasa se construyó amplificando la secuencia codificante de pck usando ADN genómico de E. coli MG1655 como molde y los cebadores directo e inverso, respectivamente, 5'TATAATCCCGGGATGCGCGTTAACAATGGTTTGACC3' (SEC ID N° 119) y 5'TATAATTCTAGATTACAGTTTCGGACCAGCCG3' (SEC ID N° 120). El fragmento de ADN se digirió con XmaI y XbaI, se ligó en los sitios correspondientes del vector de expresión pACT3 (Dykxhoorn et al., 1996) usando t 4 ADN ligasa (Biolabs), y se transformó en células DH5a de E. coli. Los transformantes se seleccionaron en medio LB sólido que contiene cloranfenicol (25 pg/ml). El plásmido resultante se aisló, y la inserción correcta del gen pck se verificó por secuenciación. Los plásmidos pACT3-aceA, pACT3-ppc, pACT3-galP, pACT3-pck y pACT3-pycA, que alojan, respectivamente, aceA, ppc, galP, o pck (todos de E. coli) o pycA de Lactococcus lactis, se construyeron de manera análoga usando los cebadores enumerados en la tabla 9.

Tabla 9: cebadores usados para la construcción de plásmidos para la sobreexpresión génica. Los sitios de restricción usados para la clonación en pACT3 están subrayados

Ejemplo 7: construcción del plásmido para la sobreexpresión de la homoserina transaminasa y la OHB reductasa

La secuencia codificante de la amino transferasa de cadena ramificada, IlvE, de E. coli se amplificó por PCR usando los cebadores directo e inverso 5'-ACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCGGTACCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACCACGA AGAAAGCTGATTAC-3' (SEC ID N° 131) y 5'-GGATAACTTTTTTACGTTGTTTATCAGCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACGGATCCTTATTGATTAACTT

G-3' (SEC ID N° 132), respectivamente, y el plásmido pET28-Ec-ilvE (Ejemplo 4) como molde. La secuencia codificante de lactato deshidrogenasa, LdhA, de L. lactis se amplificó por PCR usando los cebadores directo e inverso 5'-TAATATGGATCCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCTGATAAAC AACGTAAAAAAGTTATCC-3' (SEC ID N° 133) y 5'-CAATGCGGAATATTGTTCGTTCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTCTAGATTAGTTTTTAACTGCAGAAG CAAATTC-3' (SEC ID N° 134), respectivamente, y el plásmido pET28-Ll-ldhA (Ejemplo 1) como molde. Los fragmentos de PCR amplificados se fusionaron en una PCR de extensión solapada añadiendo 150 ng de cada fragmento a 50 pl de la mezcla de reacción y llevando a cabo una PCR usando los cebadores 5'-ACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCGGTACCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACCACGA AGAAAGCTGATTAC-3' (SEC ID N° 135) y 5'-CAATGCGGAATATTGTTCGTTCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTCTAGATTAGTTTTTAACTGCAGAAG CAAATTC-3' (SEC ID N° 136). El fragmento de la PCR resultante se purificó, se digirió con KpnI y XbaI, y se ligó en los sitios correspondientes de pEXT20 (Dykxhoorn, St Pierre, y Linn, 1996) usando T4 ADN ligasa (Fermentas). El producto de ligación se transformó en DH5a de E. coli. El plásmido resultante pEXT20-DHB se aisló, y se demostró mediante secuenciación de ADN que contiene las secuencias codificantes correctas de longitud completa de Ec-ilvE y Ll-ldhA. El plásmido se transformó luego en cepas mutantes derivadas de E. coli MG1655, y se ensayó con respecto a la producción de DHB.

Ejemplo 8: construcción de cepas optimizadas para la producción de DHB

Varios genes se alteraron en la cepa MG1655 de E. coli para optimizar el reparto del flujo de carbono y el suministro de cofactores para la producción de DHB. Las supresiones de genes se llevaron a cabo usando el método de transducción de fagos, o el método de recombinasa Red de lambda según Datsenko et al. (Datsenko y Wanner, 2000).

Protocolo para la introducción de supresiones de genes usando el método de transducción de fagos:

Las cepas que portan las supresiones individuales deseadas se obtuvieron de la colección Keio (Baba et al. 2006). Los lisados de fagos de mutantes de una sola supresión se prepararon inoculando 10 ml de medio LB que contiene kanamicina 50 pg/ml, glucosa 2 g/l, y CaCh 5 mM con 100 pl de precultivos nocturnos. Después de una incubación de 1 h a 37°C, se añadieron 200 pl de lisado de fago preparado a partir de la cepa MG1655 de tipo salvaje, y los cultivos se incubaron durante otras 2-3 h hasta que se completó la lisis celular. Después de la adición de 200 pl de cloroformo, las preparaciones celulares se sometieron primero a una fuerte agitación vorticial y después se centrifugaron durante 10 minutos a 4500 x g. El lisado transparente se recuperó y se almacenó a 4°C.

La cepa del receptor se preparó para la transducción de fagos mediante un cultivo nocturno a 37°C en medio LB. Se centrifugó un volumen de 1,5 ml del precultivo a 1500 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se desechó, y el sedimento celular se resuspendió en 600 pl de una disolución que contiene MgSO4 10 mM y CaCh 5 mM. La transducción se llevó a cabo mezclando 100 pl de la disolución que contiene la cepa del receptor con 100 pl de lisado, e incubando esta mezcla a 30°C durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron 100 pl de una disolución de citrato de sodio 1M seguido de agitación vigorosa. Después de la adición de 1 ml de medio LB, la suspensión celular se incubó a 37°C durante 1 h antes de extender las células en placas de agar LB que contienen 50 pg/ml de kanamicina. Mediante PCR de colonia se confirmó que los clones capaces de crecer en presencia del antibiótico contenían la supresión deseada, usando los cebadores enumerados en la tabla 11. Después de la introducción de cada supresión génica, el marcador antibiótico se eliminó como se describió anteriormente siguiendo el método de (Cherepanov y Wackernagel, 1995). Las supresiones AldhA, AadhE, AmetA, AthrB, ArhtB, y AlldD se introdujeron sucesivamente mediante el método descrito.

Protocolo para la introducción de supresiones de genes usando el método de la recombinasa Red de lambda:

Los casetes de supresión se prepararon mediante PCR usando polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y el gen de resistencia a la kanamicina flanqueado por FRT (kan) del plásmido pKD4 como molde (Datsenko y Wanner, 2000). Los cebadores de sentido contenían secuencias correspondientes al extremo 5' de cada gen seleccionado como diana (subrayado), seguido de 20 pb correspondientes al casete FRT-kan-FRT de pKD4. Los cebadores antisentido contenían secuencias correspondientes a la región del extremo 3' de cada gen seleccionado como diana (subrayado), seguido de 20 pb correspondientes al casete. Los cebadores se describen en la tabla 10. Los productos de la PCR se digirieron con Dpnl, y se purificaron antes de la transformación.

La cepa MG1655 de E. coli resultó electrocompetente haciendo crecer las células hasta una OD600 de 0.6 en medio líquido LB a 37°C, concentrando las células 100 veces, y lavándolas dos veces con glicerol al 10% enfriado con hielo. Las células se transformaron con el plásmido pKD46 (Datsenko y Wanner, 2000) por electroporación (2.5 kV, 200 O, 25 |jF, en cubetas de 2 mm). Los transformantes se seleccionaron a 30°C (100 jg/m l) en medio sólido LB con ampicilina.

Los casetes de interrupción se transformaron en cepas de E. coli electrocompetentes que alojan el plásmido pKD46 que expresa recombinasa Red de lambda. Las células se cultivaron a 30°C en medio líquido s Ob que contiene ampicilina (100 jg/ml). El sistema de recombinasa Red de lambda se indujo mediante la adición de arabinosa 10 mM cuando OD600 de los cultivos alcanzó 0.1. Las células se hicieron crecer hasta una OD600 de 0.6 antes de que se cosecharan por centrifugación, se lavaron dos veces con glicerol al 10% enfriado con hielo, y se transformaron con el casete de interrupción por electroporación. Después de una expresión fenotípica durante la noche a 30°C en medio líquido LB, las células se sembraron en placas en medio LB sólido que contiene kanamicina 25 jg/ml. Los transformantes se seleccionaron después del cultivo a 30°C.

El reemplazo del gen se verificó por PCR de colonia usando Crimson Taq polimerasa (NEB). Se llevó a cabo una primera reacción con los cebadores específicos del locus flanqueantes (ver la tabla 11), para verificar la pérdida simultánea del fragmento parental y la ganancia del nuevo fragmento específico mutante. Se realizaron dos reacciones adicionales usando un cebador específico del locus junto con uno de los cebadores correspondientes k1rev o k2for (ver la tabla 11) que se alinean dentro del casete de resistencia de FRT-kanamicina (cebador del locus sentido/k1rev y k2for/cebador del locus inverso).

El gen de resistencia (FRT-kan-FRT) se cortó a continuación del cromosoma usando el plásmido pCP20 que aloja la FLP recombinasa (Cherepanov y Wackernagel, 1995), dejando una región SCAR que contiene un sitio FRT pCP20 es un plásmido de ampicilina y CmR que muestra la replicación sensible a la temperatura y la inducción térmica de la síntesis de FLP recombinasa. Los mutantes resistentes a la kanamicina se transformaron con pCP20, y los transformantes resistentes a la ampicilina se seleccionaron a 30°C. Después, los transformantes se hicieron crecer en medio LB sólido a 37°C, y se analizó la pérdida de todas las resistencias a antibióticos. La escisión del casete de FRT-kanamicina se analizó por PCR de colonia usando crimson taq polimerasa y los cebadores específicos de locus flanqueantes (Tabla 11). Se obtuvieron supresiones múltiples repitiendo las etapas descritas anteriormente.

Tabla 10: cebadores usados para alteraciones genéticas. Las secuencias homólogas a los genes diana están subrayadas

Gen Cebador Secuencia

IdhA A_ldhA_for gaaggttgcgcctacactaagcatagttgttgatgagtgtaggctggagctgcttc (SEC ID N° 137) A IdhA rev ttaaaccagttcgttcgggcaggtttcgcctttttcatgggaattagccatggtcc SEC ID N° 138) adhE A_adhE_for atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID N°

139)

A adhE rev ttaagcggattttttcgcttttttctcagctttagccggagcagccatatgaatatcctccttag (SEC ID N° 140) ackA A_ackA_for atgtcgagtaagttagtactggttctgaactgcggtagttcttcagtgtaggctggagctgcttc (SEC ID N° 141 A_ackA_rev tcaggcagtcaggcggctcgcgtcttgcgcgataaccagttcttccatatgaatatcctccttag (SEC ID N°

142)

focA- A focA- ttactccgtatttgcataaaaaccatgcgagttacgggcctataagtgtaggctggagctgcttc (SEC ID N° pflB pfIB_for 143)

A_focA- atagattgagtgaaggtacgagtaataacgtcctgctgctgttctcatatgaatatcctccttag (SEC ID N° pfIB_rev 144)

Gen Cebador Secuencia

pta A_pta_for atateccatattattatactaatccctaccaaaaccaacatcaatatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

145)

A_pta_rev ttactactactatacaaactaaatcacaatcaacacaataatatacatataaatatcctccttaa (SEC ID N°

146)

poxB A_poxB_for ataaaacaaacaattacaacttatatcaccaaaacactcaaatcaatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

147)

A poxB rev ttaccttaaccaatttattttcaccaattcaatcacttcatcacccatataaatatcctccttaa (SEC ID N° 148) sad A_sad_for ataaccattactccaacaactcatacaatttcaataaatcctaccatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

149)

A_sad_rev tcaaatccaatctttccacaccatctaaatattacaaaattcatacatataaatatcctccttaa (SEC ID N°

150)

gabD A_gabD_for ataaaacttaacaacaataacttattccaccaacaaacattaattatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

1^1 ^

A gabD rev ttaaaaccaatacacatatatttaatttctaaataatcttcaatcatataaatatcctccttaa (SEC ID N° 152) gadA A_gadA_for ataaaccaaaaactattaacaaatttccactcaaaactactcaatatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

153)

A gadA rev tcaaatatatttaaaactattctactaacaataccctacaatttcatataaatatcctccttaa (SEC ID N° 154) gadB A_gadB_for ataaataaaaaacaaataacaaatttaaaatcaaaactactcaatatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

155)

A_gadB_rev tcaaatatatttaaaactattctattaaacaataccctacaatttcatataaatatcctccttaa (SEC ID N° 156) gadC A_gadC_for ataactacatcaatacaaacaaataaaactaaacaactcacattaatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

157)

A_gadC_rev ttaatatttcttatcattcatcacaatataatataataaacataccatataaatatcctccttaa (SEC ID N° 158) sfcA A_sfcA_for ataaaaccaaaaacaaaaaaacaacattcactttatatcccttacatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

159)

A_sfcA_rev ttaaataaaaatacaacaataatcacaatattcaacttaccaaaacatataaatatcctccttaa (SEC ID N°

160)

maeB A_maeB_for ataaataaccaattaaaacaaaatacacttaatttccataaatttatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

1R1 ^

A_maeB_rev ttacaacaattaaatttacacttctaccacaaccaacaccaccatcatataaatatcctccttaa (SEC ID N°

162)

ppc A_ppc_for ataaacaaacaatattccacattacataataatatcaatatactcatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

163)

A_ppc_rev ttaaccaatattacacatacctaccacaatcccaacaataataaccatataaatatcctccttaa (SEC ID N°

164)

pykA A_pykA_for atatccaaaaaacttcacaaaacaaaaatcattaccacattaaacatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

165)

A_pykA_rev ttactctaccattaaaatacacataatattaataaaacccacaatcatataaatatcctccttaa (SEC ID N°

166)

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170)

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172)

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A_icd_rev ttacatattttcaataatcacatcaccaaactctaaacatttcaacatataaatatcctccttaa (SEC ID N° 174) sucA A_sucA_for atacaaaacaacactttaaaaacctaattaaactcttcttacctcatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

175)

A sucA rev ttattcaacattcaacacatcattaaccaaatcttattactqtttcatataaatatcctccttaa (SEC ID N° 176) sucB A_sucB_for ataaataacataaatattctaatccctaacctacctaaatccataatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

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178)

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179)

A_frdA_rev tcaaccattcaccttctccttcttattaactqcttccaccttatccatataaatatcctccttaa (SEC ID N° 180) Gen Cebador Secuencia

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181)

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182)

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183)

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186)

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A_ptsG_rev ttaataattacaaatatactcatccatctcaattttcaaattatccatataaatatcctccttaa (SEC ID N° 190) lacI A_lacl_for ataaaaccaataacattatacaatatcacaaaatataccaatatcatataaactaaaactacttc (SEC ID N°

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202)

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A_eda_rev ctcaatcaaacattttaacttttacaacttaacaccttctacaaccatataaatatcctccttaa (SEC ID N° 204) recA A_recA_for ataactatcaacaaaaacaaacaaaaaacattaacaacaacactaatataaactaaaactacttc (SEC ID N° 205)

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207)

A asd rev ttacaccaattaacaaaacatccaacacaacaactccacaacccccatataaatatcctccttaa (SEC ID N°

208)

Tabla 11: pares de cebadores usados para la verificación de alteraciones de genes

El plásmido que coexpresa aspartato cinasa, aspartato semialdehído deshidrogenasa, y homoserina deshidrogenasa (pACT3-op-HMS1) se transformó junto con el plásmido que expresa la homoserina transaminasa y la OHB reductasa (pEXT20-DHB) en las cepas hospedadoras optimizadas. Los transformantes se seleccionaron en medio LB sólido que contiene cloranfenicol (25 pg/ml) y ampicilina (100 pg/ml). En la tabla 12 se enumeran ejemplos no limitativos de cepas construidas.

Tabla 12: ejemplos de cepas construidas para la producción de DHB

Cepa Genotipo relevante

MG1655 Tipo salvaje

ECE73 AldhA AadhE AmetA AthrB

ECE74 AldhA AadhE AmetA AthrB

pACT3-op-HMS1

ECE75 AldhA AadhE AmetA AthrB

pEXT20-DHB

ECE76 AldhA AadhE AmetA AthrB

pACT3-op-HMS1 pEXT20-DHB

ECE77 AldhA AadhE AmetA AthrB AlldD

pACT3-op-HMS1 pEXT20-DHB

ECE78 AldhA AadhE AmetA AthrB ArhtB

pACT3-op-HMS1 pEXT20-DHB

Se entiende que la eliminación del gen lacI de la cadena principal de los plásmidos descritos anteriormente, junto con la supresión genómica de lacI en la cepa hospedadora, puede hacer que la expresión de proteínas de los plásmidos descritos anteriormente sea constitutiva.

Ejemplo 9: demostración de la producción zimótica de DHB a través de la ruta de homoserina-OHB

Cepas y condiciones de cultivo: Los experimentos se llevaron a cabo con las cepas enumeradas en la tabla 12. Todos los cultivos se llevaron a cabo a 37°C en un agitador rotatorio Infors que funciona a 170 rpm. Se inocularon cultivos durante la noche (3 ml de medio en tubo de ensayo) a partir de lotes de glicerol, y se usaron para ajustar una OD600 inicial de 0.05 en cultivos de crecimiento de 100 ml cultivados en matraces de agitación de 500 ml. Se añadió IPTG a una concentración de 1 mmol/l cuando la OD600 en los cultivos de crecimiento alcanzó 0.8. El medio de cultivo de un litro contenía 20 g de glucosa, 18 g de Na2HPO4 * 12 H2O, 3 g de KH2PO4, 0.5 g de NaCl, 2 g de NH4Cl, 0.5 g de MgSO4 * 7 H2O, 0.015 CaCh * 2 H2O, 1 ml de disolución madre de FeCh 0.06 mol/l preparada en HCl concentrado diluido 100 veces, 2 ml de disolución madre de tiamina HCl 10 mM, 20 g de MOPS y 1 ml de disolución de oligoelementos (que contiene por litro: 0.04 g de Na2EDTA * 2H2O, 0.18 g de CoCh * 6 H2O, ZnSO4 * 7 H2O, 0.04 g de Na2MoO4 * 2 H2O, 0.01 g de H3BO3, 0.12 g de MnSO4 * H2O, 0.12 g de CuCh * H2O). El pH del medio se ajustó a 7, y el medio se esterilizó por filtración. Los antibióticos sulfato de kanamicina, ampicilina y cloranfenicol se añadieron a concentraciones de 50 mg/l, 100 mg/l y 25 mg/l, respectivamente, cuando fue necesario.

Estimación de la concentración de DHB por análisis de LC-MS: La cromatografía de intercambio aniónico de líquidos se realizó en un sistema ICS-3000 de Dionex (Sunnyvale, USA) equipado con un sistema generador de eluyente automático (KOH) (RFIC, Dionex), y un automuestreador (AS50, Dionex) que mantiene las muestras a 4°C. Los analitos se separaron en una columna lonPac AS11 HC (250 x 2 mm, Dionex) protegida mediante una precolumna AG11 HC (50 x 2 mm, Dionex). La temperatura de la columna se mantuvo a 25°C, el caudal se fijó a 0.25 ml/min, y los analitos se eluyeron aplicando el gradiente de KOH descrito anteriormente (Groussac E, Ortiz M y Francois J (2000): Improved protocols for quantitative determination of metabolites from biological samples using high performance ionic-exchange chromatography with conductimetric and pulsed amperometric detection. Enzyme. Microb. Technol. 26, 715-723). El volumen de muestra inyectado fue 15 pl. Para la reducción del fondo, se usó un supresor de aniones ASRS ultra II (2 mm, modo de agua externo, 75 mA). Los analitos se cuantificaron usando un detector sensible a la masa (MSQ Plus, Thermo) que funcionaba en modo ESI (la división era 1/3, la presión de nitrógeno era 90 psi, el voltaje capilar era 3.5 kV, la temperatura de la sonda era 450°C).

Resultados:

Después de 24 h de cultivo, la concentración de DHB en el sobrenadante de diferentes cepas se cuantificó mediante análisis de LC-MS. Las cepas ECE73, ECE74, ECE75, y ECE76 produjeron 0 mg/l, 3.7 mg/l, 0.67 mg/l y 11.9 mg/l de DHB, respectivamente.

Referencias

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Wellner, D. y Lichtenberg, L. A. (1971). Assay of amino acid oxidase. Methods in Enzymology17, Part B, 593­ 596.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Método para la preparación de 2,4-dihidroxibutirato a partir de homoserina, que comprende una ruta de dos etapas:

- una primera etapa de conversión del grupo amino primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener 2-oxo-4-hidroxibutirato, catalizada por una enzima que presenta una actividad de homoserina transaminasa como se define por E.C.2.6.1.1 o E.C.2.6.1.42 o E.C.2.6.1.57, y

- una segunda etapa de reducción del 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) obtenido a 2,4-dihidroxibutirato, catalizada por una enzima que presenta una actividad de OHB reductasa, la enzima que presenta una actividad de OHB reductasa es la lactato deshidrogenasa como se define por E.C.1.1.1.27 o E.C.1.1.1.28, o la malato deshidrogenasa como se define por E.C.1.1.1.37, E.C.1.1.1.82 o E.C.1.1.1.299

en el que la o las etapas primera y/o segunda están catalizadas por una enzima codificada por un gen endógeno o heterólogo.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la primera etapa está catalizada por una enzima que presenta una actividad de homoserina transaminasa codificada por el gen ilvE, tyrB, aspC, araT, bcaT, ARO8, incluso más preferentemente la enzima que presenta una actividad de homoserina transaminasa está codificada por la secuencia expuesta en SEC ID N° 59, SEC ID N° 61, SEC ID N° 63, SEC ID N° 65, SEC ID N° 67 o SEC ID N° 69 o cualquier secuencia que codifique una enzima que presente una actividad de homoserina transaminasa y que comparta una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias o que presente una secuencia como se establece en SEC ID N° 60, SEC ID N° 62, SEC ID N° 64, SEC ID N° 66, SEC ID N° 68, SEC ID N° 70 o cualquier secuencia que comparta una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias, presentando la enzima codificada una actividad de homoserina transaminasa.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la OHB reductasa es (D)-lactato deshidrogenasa de Escherichia coli, (L)-lactato deshidrogenasa de Lactococcus lactis, de Oryctalagus cuniculus, de Geobacillus stearothermophilus, o de Bacillus subtilis, (L)-malato deshidrogenasa de Escherichia coli, u homólogos de las mismas, y más preferentemente la OHB reductasa es

- una lactato deshidrogenasa que comprende por lo menos una mutación en la posición V17, Q85, E89, I226 o A222, definiéndose dichas posiciones por la referencia a L-Lactis LdhA (SEC ID N° 6)

- una malato deshidrogenasa que comprende por lo menos una mutación en la posición I12, R81, M85, D86, V93, G179, T211 o M227, definiéndose dichas posiciones por la referencia a E. coli Mdh (SEC ID N° 2),

incluso más preferentemente, la OHB reductasa está

- representada por SEC ID N°2, SEC ID N°4, SEC ID N°6, SEC ID N° 8, SEC ID N° 10, SEC ID N° 12, SEC

ID N° 14, SEC ID N° 288, SEC ID N° 30, SEC ID N° 32, SEC ID N° 102, SEC ID N° 104, SEC ID N° 106,

SEC ID N° 108, SEC ID N° 110, SEC ID N° 112, SEC ID N° 114, SEC ID N° 116 o SEC ID N° 118 o cualquier secuencia que comparta una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias y que presente una actividad de OHB reductasa,

- codificada por una secuencia de ácido nucleico representada por SEC ID N° 1, SEC ID N° 3, SEC ID N° 5,

SEC ID N° 7, SEC ID N° 9, SEC ID N° 11, SEC ID N° 13, SEC ID N° 287, SEC ID N° 29, SEC ID N°31, SEC

ID N° 101, SEC ID N° 103, SEC ID N° 105, SEC ID N° 107, SEC ID N° 109, SEC ID N° 111, SEC ID N° 113,

SEC ID N° 115 o SEC ID N° 117 o cualquier secuencia que comparta una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias y que codifique una enzima que presente una actividad de OHB reductasa.

4. Microorganismo modificado para la preparación de 2,4-DHB a partir de homoserina que comprende una ruta de dos etapas que comprende:

- una primera etapa de conversión del grupo amino primario de homoserina en un grupo carbonilo para obtener 2-oxo-4-hidroxibutirato, catalizada por una enzima que presenta una actividad de homoserina transaminasa como se define por E.C.2.6.1.1 o E.C.2.6.1.42 o E.C.2.6.1.57, y

- una segunda etapa de reducción del 2-oxo-4-hidroxibutirato obtenido para obtener 2,4-dihidroxibutirato, catalizada por una enzima que presenta una actividad de OHB reductasa, la enzima que presenta una actividad de OHB reductasa es la lactato deshidrogenasa como se define por E.C.1.1.1.27 o E.C.1.1.1.28, o la malato deshidrogenasa como se define por E.C.1.1.1.37, E.C.1.1.1.82 o E.C.1.1.1.299.

5. Microorganismo modificado según la reivindicación 4, en el que las enzimas que catalizan las primera y segunda etapas son las descritas en las reivindicaciones 2-3.

6. Organismo modificado según la reivindicación 4 o 5, en el que la producción de homoserina se potencia en comparación con el mismo microorganismo no transformado.

7. Organismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que se potencian las actividades de la aspartato cinasa, la aspartato semialdehído deshidrogenasa, y/o la homoserina deshidrogenasa.

8. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que la producción de 2,4-DHB se potencia en comparación con el mismo microorganismo no transformado.

9. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 que es una bacteria, seleccionada preferentemente de entre Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriacae, y Corynebacteriaceae, todavía más preferentemente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorquens, o Lactococcus lactis, una levadura, seleccionada preferentemente de entre Saccharomycetaceae, Pichiaceae, y Schizosaccharomycetaceae, todavía más preferentemente Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia jadinii, Pichia stipitis, o Pichia pastoris, o un hongo seleccionado preferentemente de entre Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium o Trichoderma.

10. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que se incrementa la expresión de por lo menos una de las actividades enzimáticas seleccionadas de entre fosfoenolpiruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxicinasa, isocitrato liasa, piruvato carboxilasa, y permeasa simportadora de hexosa, y/o se disminuye por lo menos una de las actividades enzimáticas seleccionadas de entre lactato deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, acetato cinasa, fosfato acetiltransferasa, piruvato oxidasa, isocitrato liasa, fumarasa, 2-oxoglutarato deshidrogenasa, piruvato cinasa, enzima málica, fosfoglucosa isomerasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxicinasa, piruvato-formiato liasa, semialdehído succínico deshidrogenasa, fosfotransferasa transportadora de azúcar, cetohidroxiglutarato aldolasa, homoserina-O-succinil transferasa, homoserina cinasa, transportador de eflujo de homoserina, diaminopimelato descarboxilasa, y/o metilglioxal sintasa.

11. Microorganismo según la reivindicación 9, que es Escherichia coli que sobreexpresa por lo menos uno de los genes seleccionados de entre ppc, pck, aceA, galP, asd, thrA, metL, lysC, todos E. coli; pycA de L lactis, y/o que presenta por lo menos uno de los genes eliminados seleccionados de entre IdhA, adhE, ackA, pta, poxB, focA, pflB, sad, gabABC, sfcA, maeB, ppc, pykA, pykF, mgsA, sucAB, ptsl, ptsG, pgi, fumABC, aldA, lldD, iclR, metA, thrB, lysA, eda, rthA, rthB, rthC.

12. Método de producción de 2,4-DHB que comprende las etapas de

- cultivar el microorganismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11 en un medio de cultivo apropiado,

- recuperar 2,4-DHB del medio de cultivo,

- opcionalmente, el 2,4-DHB se purifica adicionalmente.

13. Utilización de cualquiera de las enzimas que presentan una actividad de homoserina transaminasa como se define por E.C.2.6.1.1 o E.C.2.6.1.42 o E.C.2.6.1.57, para transformar la homoserina en OHB.

14. Utilización de cualquiera de las enzimas que presentan una actividad de OHB reductasa, la enzima que presenta una actividad de OHB reductasa es lactato deshidrogenasa como se define por E.C.1.1.1.27 o E.C.1.1.1.28, o malato deshidrogenasa como se define por E.C.1.1.1.37, E.C.1.1.1.82 o E.C.1.1.1.299, para transformar OHB en 2,4-DHB.