ES2800925T3 - Utilización diagnóstica de un polipéptido de fusión que comprende una proteína vírica y un enzima MGMT - Google Patents

Abstract

Utilización in vitro de un polipéptido de fusión que comprende una proteína vírica y i) el enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT, EC 2.1.1.63) o un homólogo del mismo, cuya secuencia presenta una identidad de por lo menos 70% con SEC ID nº: 4, o ii) el mutante SNAP de SEC ID nº: 2 o un homólogo del mismo, cuya secuencia presenta una identidad de por lo menos 80% con SEC ID nº: 2, como un agente de diagnóstico para la detección de una infección vírica en un líquido biológico de un paciente.

Description

DESCRIPCIÓN

Utilización diagnóstica de un polipéptido de fusión que comprende una proteína vírica y un enzima MGMT

La presente invención se refiere al campo de la ingeniería genética y la biología molecular. En particular, la presente invención divulga un nuevo aumentador de la producción de proteínas en las células hospedadoras. Además, la presente invención divulga vectores que contienen la secuencia de ADN codificante de dicha proteína aumentadora y también la utilización de la misma para la expresión de proteínas recombinantes, tales como enzimas industriales o proteínas para la utilización farmacéutica, incluyendo proteínas eucarióticas (por ejemplo de mamífero, tal como humanas) y proteínas víricas.

Antecedentes de la invención

Los sistemas de producción de proteínas, en los que se producen polipéptidos o proteínas de interés en organismos o células recombinantes, son la columna vertebral de la biotecnología comercial.

A los primeros sistemas, basados en la expresión bacteriana en huéspedes tales como E. coli, les han seguido sistemas basados en huéspedes eucarióticos, en particular células de mamífero en cultivo, células de insecto tanto en cultivo como en forma de insectos completos, y mamíferos transgénicos tales como ovejas y cabras.

Los sistemas de cultivo de células procarióticas son fáciles de mantener y de explotación económica. Sin embargo, las células procarióticas no son capaces de modificar postraduccionalmente las proteínas eucarióticas. Además, muchas proteínas se pliegan incorrectamente, requiriendo procedimientos específicos para plegarlas nuevamente, lo que se añade al coste de producción.

Se han descrito sistemas de cultivo de células eucarióticas para varias aplicaciones. Por ejemplo, algunas células de mamífero son capaces de realizar modificaciones postraduccionales y generalmente producen proteínas que están correctamente plegadas y son solubles. Entre las desventajas principales de los sistemas de células de mamífero se incluyen la necesidad de instalaciones de cultivo especializadas y caras, el riesgo de infección, que puede llevar a la pérdida del cultivo completo y a un riesgo de contaminación del producto final con proteínas de mamífero potencialmente peligrosas. Las células de insecto se utilizan alternativamente para la expresión de polipéptidos. El sistema de expresión más extendido que se utiliza en células de insecto se basa en vectores baculovíricos. Se construye un vector de expresión baculovírico mediante la sustitución del gen polihedrina de baculovirus, que codifica una proteína estructural mayor del baculovirus, con un gen heterólogo, bajo el control del promotor de polihedrina nativo fuerte. Las células hospedadoras de insecto en cultivo resultan infectadas por el virus recombinante y la proteína producida de esta manera puede recuperarse a partir de las células mismas o partir del medio de cultivo en caso de que se utilicen señales de secreción adecuadas.

Sin embargo, ambos sistemas adolecen de problemas asociados a la reproducibilidad del nivel y calidad de expresión de las proteínas recombinantes, a la infección del cultivo y a que pueden requerir de instalaciones de cultivo especializadas. Además, las reservas de baculovirus, que para la producción de determinadas proteínas podrían requerir la preparación bajo condiciones GMP, no son estables durante el tiempo en todos los casos.

Las células de Drosophila, en particular las células de Drosophila melanogaster S2, para la expresión de proteínas se han dado a conocer en las patentes US n° 5.550.043, n° 5.681.713 y n° 5.705.359. En contraste con el sistema baculovírico de la técnica anterior, en el que la proteína de interés se proporciona únicamente tras la lisis de las células de insecto infectadas, el método basado en células S2 proporciona un sistema de expresión celular continua para las proteínas heterólogas y, por lo tanto, conduce a niveles de expresión más elevados.

Se han propuesto algunos otros medios para intensificar la expresión de proteínas heterólogas en células hospedadoras: por ejemplo, la patente US n° 5.919.682 describe un método de sobreproducción de ácido nítrico sintasa funcional en un procariota utilizando un vector pCW bajo el control del promotor tac y la coexpresión de la proteína con chaperones. Además, la patente US n° 4.758.512 se refiere a la producción de células hospedadoras que presentan mutaciones específicas dentro de las secuencias de ADN de las mismas que provocan que el organismo muestre una capacidad reducida de degradación de productos foráneos. Estos organismos huésped mutados pueden utilizarse para incrementar los rendimientos de proteínas foráneas manipuladas genéticamente.

Las células de vertebrado, en particular las células de mamífero, también han sido utilizadas ampliamente en la expresión de proteínas recombinantes. El nivel de producción de proteínas durante el tiempo de las células en cultivo depende de varios factores, tales como, por ejemplo, la densidad celular, la fase del ciclo celular, las tasas de biosíntesis celular de las proteínas, la condición del medio utilizado para la viabilidad y crecimiento celulares, y la longevidad de las células en cultivo (es decir, cuánto tiempo transcurre antes de que sucumban a la muerte celular programada, o apoptosis). Se han desarrollado diversos métodos para mejorar la viabilidad y el periodo de vida de las células en cultivo, conjuntamente con métodos de incremento de la productividad de una proteína deseada mediante, por ejemplo, el control de los nutrientes, la densidad celular, el contenido de oxígeno y dióxido de carbono, la lactato deshidrogenasa, el pH, la osmolaridad, los catabolitos, etc.

Pueden utilizarse otras células hospedadoras para producir proteínas recombinantes heterólogas, notablemente células vegetales y células de levadura.

Se han sintetizado en plantas muchas proteínas farmacéuticas de origen mamífero. Entre ellas se incluyen productos sanguíneos, tales como albúmina de suero humano, para la que existe una demanda anual superior a 500 toneladas, y citoquinas y otras moléculas de señalización que se necesitan en cantidades mucho menores. La mayoría de proteínas derivadas de plantas han sido producidas en plantas del tabaco transgénicas y se han extraído directamente de las hojas. En general estas proteínas se producen a niveles bajos, típicamente menos de 0. 1 . de la cantidad total de proteínas solubles. Este nivel bajo de producción probablemente refleja una combinación de factores, siendo los más importantes un plegamiento y estabilidad pobres de las proteínas. Más recientemente, se ha utilizado el sistema de cloroplastos del tabaco para expresar proteínas humanas a niveles mucho más elevados (MA JKC et al., 2004).

Los sistemas de levadura han resultado fundamentales para producir grandes cantidades proteínas para la utilización industrial y biofarmacéutica durante muchos años. Las levaduras pueden cultivarse hasta generar densidades de masa celular muy elevadas en un medio bien definido. Las proteínas recombinantes en levaduras pueden sobreexpresarse de manera que el producto se secrete de la célula y se encuentra disponible para la recuperación en la solución de fermentación. Las proteínas secretadas por las levaduras se encuentran fuertemente glucosiladas en sitios de glucosilación de consenso. De esta manera, la expresión de las proteínas recombinantes en los sistemas de levadura históricamente se ha restringido a proteínas en las que los patrones postraduccionales de glucosilación no afectan a la función de las proteínas. Se utilizan varios sistemas de expresión de levadura para la expresión de proteínas recombinantes, entre ellos Saccharomyces, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris y Hansanuela polymorpha. Recientemente ha aparecido un nuevo sistema con la capacidad de producir glucoproteínas recombinantes en levaduras que presenta secuencias de glucosilación similares a las de las glucoproteínas humanas secretadas que se producen en las células de mamífero. La ruta de glucosilación de Pichia pastoris se modificó mediante la eliminación de enzimas endógenos, que añaden cadenas ricas en manosa a intermediarios de N-glucosilación. Además, se transfirieron específicamente al interior de P. pastoris por lo menos cinco enzimas activos participantes en la síntesis de cadenas oligosacáridas humanizadas. La capacidad de producir grandes cantidades de glucoproteínas humanizadas en levaduras ofrece la ventaja de que las estructuras glucosiladas pueden ser muy uniformes y fáciles de purificar. Además, la contaminación cruzada por virus de mamífero y glucoproteínas de otros huéspedes mamíferos puede eliminarse mediante la utilización de una producción semicontinua en una levadura, con tiempos de fermentación más cortos que en las células de mamífero.

Sin embargo, mediante la utilización de dichos sistemas, se producen proteínas heterólogas a razón de aproximadamente 1 a 2 mg/l en el sobrenadante de las células en cultivo, que es un nivel bastante bajo para los objetivos de la producción industrial.

De esta manera, existe una necesidad urgente de proporcionar un sistema que permita alcanzar un nivel significativamente elevado de expresión de proteínas heterólogas.

La presente solicitud satisface dicha necesidad y proporciona métodos de expresión de proteínas que alcanzan un nivel de producción hasta 100 veces superior a los medios existentes de producción de proteínas (es decir, hasta 200 mg/l de proteínas en el sobrenadante).

Los presentes inventores en efecto han demostrado que la utilización de un vector de nucleótidos codificante de una proteína derivada de la proteína humana 6-metilguanina-ADN metiltransferasa (MGMT_h), estando unida dicha proteína derivada MGMT_h, directamente o no, a una proteína de interés incrementa la producción de dicha proteína de interés hasta un rendimiento de 40 mg/l a 200 mg/l de promedio.

Más específicamente, la invención se refiere a los puntos siguientes:

1. Utilización in vitro de un polipéptido de fusión que comprende una proteína vírica y

- el enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT, EC 2.1.1.63) o un homólogo del mismo, cuya secuencia presenta una identidad de por lo menos 70% con SEC ID n°: 4, o

- el mutante SNAP de SEC ID n°: 2 o un homólogo del mismo, cuya secuencia presenta una identidad de por lo menos 80% con SEC ID n°: 2,

como un agente de diagnóstico para la detección de una infección vírica en un líquido biológico de un paciente.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha proteína vírica es la proteína EDIII a partir de los virus de chikungunya, dengue, encefalitis japonesa (JE), encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), fiebre amarilla (YF), Usutu (USU) o del Nilo Occidental, o la nucleoproteína N a partir de los virus de la fiebre del valle del Rift o Toscana.

3. Utilización según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho líquido biológico es orina, sangre, suero o saliva.

4. Método de inmunoensayo de diagnóstico que utiliza el polipéptido de fusión como se define en las reivindicaciones 1 a 2 y un líquido biológico de un paciente.

5. Método de inmunoensayo de diagnóstico según la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido de fusión está acoplado a perlas.

6. Método de inmunoensayo de diagnóstico según la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido de fusión está acoplado a perlas que utilizan un sustrato de la proteína MGMT como un conector.

7. Método de inmunoensayo de diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para detectar rápida y simultáneamente anticuerpos en un líquido biológico.

8. Método de inmunoensayo de diagnóstico según la reivindicación 7, en el que dicho líquido biológico es orina, sangre, suero o saliva.

9. Kit de diagnóstico que contiene el polipéptido de fusión como se define en la reivindicación 1, en el que dicha proteína vírica es una proteína de los virus de chikungunya, dengue, encefalitis japonesa (JE), encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), fiebre amarilla (YF), Usutu (USU), del Nilo Occidental, de la fiebre del valle del Rift o Toscana.

10. Utilización del kit de diagnóstico según la reivindicación 9 para identificar una infección vírica en una muestra biológica de un paciente.

11. Utilización según la reivindicación 10, en la que dicha muestra biológica es orina, sangre, suero o saliva.

Leyendas de las figuras

la figura 1 da a conocer (A) una vista esquemática del ARNm codificante de una secuencia de proteína de fusión MGMT de la solicitud, que contiene, de 5' a 3', un péptido de señal, la secuencia de ARNm de MGMT, un espaciador, un sitio de corte de proteasa, un gen de proteína recombinante (gen foráneo), un espaciador y un marcaje de etiqueta (His6), y (B) las secuencias de ADN y de aminoácidos de la misma parte del vector, que comprende: i) el péptido de señal BiP monocatenario (BiPmc) de insecto (en cursiva), ii) la secuencia de intensificador codificante de SNAP (en gris), iii) una secuencia de espaciador de ADN, iv) la secuencia codificante de sitio de enterocinasa (en negrita), v) los sitios de clonación EcoRV/Xmal (subrayados) y vi) el ADN codificante del marcaje de etiqueta de His (cursiva y negrita) (ver también la SEC ID n° 5).

la figura 2 da a conocer (A) la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión SNAP (en gris) y la nucleoproteína N del virus de la fiebre del valle del Rift (FVR.N., en negrita) unida a un marcaje de etiqueta de His, separando ambas proteínas con un espaciador GGGS, (B) ensayo de inmunotransferencia en sobrenadante celular de células S2 transfectadas con el vector de ADN de SEC ID n° 19 (SNAP-FVR) estimuladas o no con cadmio durante 10 días, utilizando anticuerpos anti-Hisetiqueta, y (C) un ensayo de inmunotransferencia llevado a cabo con anticuerpos anti-His, en fracciones de proteína insolubles (INS) o solubles (SOL) de lisados de E. coli B21, portando dichas bacterias un plásmido pET302/FVR.N+proTEV+GST. (D) Un ensayo de inmunotransferencia que muestra la cantidad de s Na P-FVR.N en las muestras de fracción sucesivas, obtenidas tras una purificación en dos etapas de proteínas quimérica secretada SNAP-FVR.N a partir de células S2 estimuladas durante 10 días, utilizando columnas Talon y Superdex 75.

la figura 3 da a conocer (A) las secuencias de ADN y de aminoácidos de la proteína de fusión SNAP (en cursiva) y la forma soluble de la proteína de cubierta E del virus del Nilo Occidental (en gris), unido a un marcaje de etiqueta de His (en negrita), estando separadas las proteínas por un espaciador GGGS (SEC ID n° 20) y (B) ensayo de inmunotransferencia con anticuerpos anti-etiqueta His, que muestra la secreción de la forma soluble de la proteína de cubierta E del virus del Nilo Occidental en el sobrenadante de las células S2 transfectadas con el vector de ADN de la presente solicitud codificante de SNAP-WNsE (SEC ID n° 20) y estimuladas o no con cadmio durante 10 días.

la figura 4 da a conocer (A) un esquema del casete de ADN que contiene una señal de péptido BiP, una secuencia codificante de tipo MGMT (tipo SNAP), dos sitios de corte de pro-TEV (proteasa del virus del grabado del tabaco) en cada lado de la secuencia de IFNa (IFNAI_hu) y un marcaje de etiqueta His, (B) las secuencias de ADN y de aminoácidos de la proteína de fusión SNAP (en gris, precedidas por una señal de péptido de insecto, en cursiva) e IFNa (en negrita), seguido de un marcaje de etiqueta de His (en cursiva y negrita), estando separadas las proteínas SNAP e IFNa por el sitio de corte de enterocinasa (subrayado) y una secuencia espaciadora g Gg S. (C) Ensayo de inmunotransferencia con anticuerpos anti-etiqueta His, para detectar la expresión de IFNa en el sobrenadante de células S2 transfectadas con el vector de la presente solicitud codificante de IFNa (S2/SNAP-IFN) o un vector de control, estimulado o no con Cd2+. (D) Ensayo de inmunotransferencia con anticuerpos anti-SNAP en 10 |jl de sobrenadante de células S2/DeSNAPuniv-IFNa inducidas o no inducidas durante 10 días con cadmio, (E) actividad de luciferasa en células HeLa infectadas por virus Chikungunya expresantes de una luciferasa de Renilla, en donde se tratan dichas células con diferentes dosis de iFNa, de proveedor comercial (Intergen), o con la IFNa producida mediante el método de la presente solicitud. (F) Actividad de luciferasa en células HeLa infectadas por virus Chikungunya expresante de una luciferasa de Renilla, en donde se tratan dichas células con diferentes dosis de la proteína SNAP-IFNa obtenida mediante el procedimiento de producción descrito en la presente solicitud.

la figura 5 representa las diferentes etapas del procedimiento de producción de proteínas recombinantes descrito en la presente solicitud.

la figura 6 da a conocer (A) las secuencias de ADN y de aminoácidos de la proteína de fusión SNAP (en gris, precedida de una señal peptídica de insecto) y el granzima M, seguido de un marcaje de etiqueta His, estando separadas las proteínas SNAP y granzima M por el sitio de corte de enterocinasa y una secuencia espaciadora GGGS. (B) Vista esquemática de la proteína de fusión quimérica SNAP-GrM, que subraya los tres sitios de corte potenciales de la GrM proteasa en SNAP. (C) Ensayo de inmunotransferencia con anticuerpos anti-SNAP y anti-etiqueta His para la detección de la expresión de SNAP-GrM en el sobrenadante de células S2 transfectadas con el vector de la presente solicitud codificante de GrM (S2/SNAP-GrM, SEC ID n° 55).

la figura 7 da a conocer (A) un esquema del casete universal de ADN que contiene una señal peptídica de tipo BiP, una secuencia codificante de MGMT, dos sitios de corte pro-TEV en cada lado de la secuencia de IFNa (IFNAI_hu) y un marcaje de etiqueta His, (B) las secuencias de ADN y de aminoácidos de la proteína de fusión SNAP (en gris, precedida de una señal peptídica de tipo BiP de insecto) e IFNal humana (aminoácidos en negrita), seguido de un marcaje de etiqueta de His, estando separadas las proteínas SNAP e IFNa por el sitio de corte de pro-TEV y una secuencia espaciadora GGGS. (C) Ensayo de inmunotransferencia con anticuerpos anti-SNAP para la detección de la expresión de SNAP-IFNa en el sobrenadante de células HeLa transfectadas con un vector codificante de SNAP solo sin señal peptídica (vector pSNAPf) o un vector codificante de SNAP solo, precedido de la señal peptídica del virus Dengue (pDV1ssprM-SNAP) o el vector de la presente solicitud codificante de IFNa, que comprende la secuencia de ADN tal como se define en (A) (pDeSNAP-4/SNAP-IFNA1, SEC ID n° 57).

la figura 8A da a conocer un casete universal de ADN que contiene una señal peptídica de tipo BiP, una secuencia codificante de SNAP, dos sitios de corte de pro-TEV, un marcaje de etiqueta de His, cuatro sitios de clonación únicos, BamHI, EcoRV, XmaI y ApaI para la clonación de un gen de interés y una secuencia espaciadora GGGS (DeSNAP Univ, SEC ID n° 59 y n° 60). Los sitios únicos Nh3I en el extremo 5' y Notl/HindIII en el extremo 3' resultan necesarios para la etapa de subclonación en los vectores de expresión de mamífero (por ejemplos el plásmido pcDNA3 o pCI-neo) y los sitios únicos Bgl II en el extremo 5' y Age I en el extremo 3' resultan necesarios para la etapa de subclonación en el sistema DES no de vertebrado. El esquema en (B) da a conocer el casete universal de ADN que contiene una señal peptídica de tipo BiP, una secuencia codificante de MGMT, dos sitios de corte de pro-TEV, un marcaje de etiqueta de His, cuatros sitios de clonación única: BamHI, EcoRV, Smal y ApaI para la clonación de un gen de interés y una secuencia espaciadora GGGS (DeMGMT univ, SEC ID n° 69 y n° 70).

la figura 9 da a conocer un medio para insertar un gen foráneo de interés en DeMGMT Univ.

la figura 10 da a conocer la estabilidad térmica de las proteínas de fusión de SNAP llamadas CHIK.sE2-SNAP, SNAP-WN.EDIII y SNAP-IFNaI incubadas durante 4 días a -80°C, a 4°C, a 25°C o a 37°C (A) o durante dos meses a -80°C, a 4°C, a 25°C o 37°C (B).

la figura 11 da a conocer la producción de las proteínas de fusión SNAP-SSX2 y SNAP-sFasL por los vectores de la presente solicitud introducidos en células S2, tras 10 días de inducción con cadmio (+) o sin cadmio (-) en sobrenadante completo (A) o en diferentes fracciones (B).

la figura 12 da a conocer (A) un esquema del casete universal de ADN que contiene una señal peptídica de tipo BiP, una secuencia codificante de MGMT (de tipo SNAP), dos sitios de corte de pro-TEV, en cada lado del antígeno de cáncer SSX2 y un marcaje de etiqueta His, (B) un esquema del casete universal de ADN que contiene una señal peptídica de tipo BiP, una secuencia codificante de MGMT, dos sitios de corte de pro-TEV en cada lados de la proteína NERMCSL y un marcaje de etiqueta His, (C) un ensayo de inmunotransferencia en células HeLa transitoriamente transfectadas durante dos días utilizando anticuerpos de ratón anti-SNAP, que mostraba producción extracelular o intracelular de IFNa, SSX2 y NERMCSL.

la figura 13 da a conocer (A) un esquema del casete universal de ADN que contenía una señal peptídica de tipo BiP, una secuencia codificante de MGMT (de tipo SNAP), dos sitios de corte de pro-TEV en cada lado del polipéptido SULF_h-2ñTMD, y un marcaje de etiqueta de His, (B) el ADN y las secuencias de aminoácidos de la proteína de fusión SNAP (en gris oscuro, precedido de una señal de péptido de tipo BiP de insecto) y hSULF2 ñTMD, seguido por un mareaje Histag, estando separadas las proteínas SNAP y SULF_h-2ñTMD por el sitio de corte de pro-TEV y una secuencia espadadora GGGS y (C) la actividad enzimática de DeSNAP-SULF_h-2ñTMD quimérico secretado por las células HEK 293 transfectadas transitoriamente durante dos días con pcDNA3/DeSNAPuniv-SULF_h-2ñTMD

la figura 14 da a conocer (A) un esquema del casete de ADN que contenía una señal peptídica BiP, una secuencia codificante de MGMT (de tipo SNAP), dos sitios de corte de pro-TEV en cada lado de la proteína NERMCSL y un marcaje de etiqueta de His, y (B) un ensayo de inmunotransferencia utilizando anticuerpos anti-SNAP, para la detección de la expresión de la proteína NERMCSL en el sobrenadante de células S2 transfectadas con el vector de la presente solicitud codificante de la proteína NERMCSL (S2/SNAP-NERMCSL) o con un vector codificante de la proteína soluble E2 del virus Chikungunya (CHIK.sE2-SNAP) estimulada o no con Cd2+.

Descripción detallada de la invención

En el contexto de la presente invención se aprecia que la coexpresión del enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT) conjuntamente con una proteína recombinante de interés mejoraba mucho la producción de dicha proteína recombinante en células de insecto, tales como células S2, así como en células de mamífero, tales como en células HeLa.

El enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT, también conocido como ATasa o AGT, y en lo sucesivo denominado "MGMT") presenta la referencia EC 2.1.1.63 en la nomenclatura de enzimas del IUBMB. Es un enzima de reparación del ADN 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa de 207 residuos aminoácidos la función del cual en las células es reparar el ADN alquilado. Más exactamente, MGMT actúa sobre la guanina O6-metilada en el ADN mediante la transferencia del grupo metilo en una reacción Sn2 a un residuo de cisteína reactiva (Cys 145). El mecanismo de reparación es inusual, ya que la proteína resulta inactivada irreversiblemente (Pegg A.E. et al., Mutat. Res. 462:82-100, 2000). Este enzima se utiliza actualmente en biología molecular para el marcaje de proteínas in vivo con moléculas informadoras, mediante una reacción de marcaje irreversible con derivados O6-bencilguanina (Juillerat A. et al., Chemistry & Biology 10:313-317, 2003 y documento n° WO 2005/085470).

Hasta el momento se han descrito diferentes enzimas derivados de MGMT (Lim A. et al., EMBO J. 15:4050-4060, 1996; Daniels D.S. et al., EMBO J. 19:1719-1730, 2000, Juillerat A. et al., Chemistry & Biology 10:313-317, 2003, documentos n° WO 2005/085470, n° WO 2004/031405). En particular, se ha obtenido una proteína mutante de 20 kDa que contiene las mutaciones Cys62Ala, Lys125Ala, Ala127Thr, Arg128Ala, Gly131Lys, Gly132Thr, Met134Leu, Arg135Ser, Cys150Ser, Asn157Gly, Ser159Glu truncada en el aminoácido 182 (el mutante denominado "AGT26" en el documento n° WO 2005/085470, también denominado "SNAP 26" en el documento n°WO 2006/114409). Se ha demostrado que el mutante particular "SNAP26" presenta actividad de marcaje incrementada. Sin embargo, nunca se ha demostrado o sugerido que pueda incrementar la expresión de las proteínas recombinantes a las que se acopla.

En la presente memoria los presentes inventores proponen por primera vez la utilización del enzima MGMT (EC 2.1.1.63), un mutante, un dominio catalítico del mismo o subfragmentos del mismo, para incrementar la producción de proteína en las células hospedadoras, en particular en células hospedadoras no de vertebrado y de vertebrado. El efecto de potenciación se observa al expresar las células hospedadoras un polipéptido de fusión que comprende por lo menos: i) una señal peptídica de secreción que es funcional en dichas células hospedadoras, ii) el enzima MGMT, mutante, dominio catalítico o subfragmentos del mismo, e iii) la proteína de interés. Para que se produzca el efecto de potenciación, el enzima MGMT debe unirse físicamente, de manera directa o indirecta (pueden introducirse espaciadores y otros aminoácidos), a la proteína de interés. Sin restringirse a ninguna teoría, se encuentra contemplado que el enzima MGMT pueda servir como proteína chaperona, por ejemplo favoreciendo la secreción a partir de la célula hospedadora y estabilizando el polipéptido de fusión sintetizado en el sobrenadante de las células hospedadoras, o evitando que resulte metabolizado durante y después de la síntesis y secreción del mismo a partir de las células hospedadoras.

Además, se ha observado que el MGMT presenta una estructura globular 3D que comprende una hélice a (Wibley J.E.A. et al., 2000) que es compatible con una función de andamiaje de MGMT.

En el contexto de la presente solicitud, las células "huésped" son cualesquiera células que pueden utilizarse para producir proteínas recombinantes, tales como células "no de vertebrado" (o de invertebrado), células de vertebrado, células vegetales, células de levadura o células procarióticas. Preferentemente son células no de vertebrado y de vertebrado.

Los no vertebrados (también conocidos como invertebrados) comprenden diferentes divisiones, siendo las más conocidas: Insectos, Arácnicos, Crustáceos, Moluscos, Anélidos, Cirrípedos, Radiados, Celenterados e Infusorios. En la actualidad se clasifican en más de 30 divisiones, desde organismos simples tales como esponjas de mar y platelmintos, hasta animales complejos tales como artrópodos y moluscos. En el contexto de la presente solicitud, las células no de vertebrado son preferentemente células de insecto, tales como células de Drosophila o de Mosquito, más preferentemente células de Drosophila S2.

Entre los ejemplos de células derivadas de organismos vertebrados que son útiles como líneas de células hospedadoras se incluyen células madre embrionarias no humanas o derivados de las mismas, por ejemplo células EBX aviares, la línea CVI de riñón de mono transformada por secuencias de SV40 (COS-7, ATCC n° CRL 1651), la línea renal embrionaria humana (293), las células renales de hámster neonato (BHK, ATCC n° CCL 10), células de ovario de hámster chino (CHO), células de Sertoli de ratón [TM4], células renales de mono (CVI, ATCC n° CCL 70), células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC n° CRL-1587), células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC n° CCL 2), células renales caninas (MDCK, ATCC n° c Cl 34), células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC n° CRL l442), células pulmonares humanas (W138, ATCC n° CCL 75), células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC n° CCL51), células de hepatoma de rata [HTC, Ml.5], y células YB2/O (ATCC n° CRL1662), NIH3T3, HEK y TRI. En el contexto de la presente solicitud, las células de vertebrado preferentemente son células EBX, CHO, YB2/O, COS, HEK, NIH3T3 o derivados de las mismas.

Las células vegetales que pueden utilizarse en el contexto de la presente solicitud son los cultivares del tabaco Bright Yellow 2 (BY2) y Nicotiana tabaccum 1 (NT-1).

Las células de levadura que pueden utilizarse en el contexto de la presente solicitud son: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Hansenula polymorpha, así como levaduras metilotróficas como Pichia pastoris y Pichia methanolica.

Las células procarióticas que pueden utilizarse en el contexto de la presente solicitud son típicamente bacterias de E. coli o bacterias Bacillus subtilis.

La presente solicitud divulga así un vector de expresión de nucleótidos codificantes de por lo menos a) una señal de secreción peptídica, que preferentemente es funcional en células no de vertebrado o en células de vertebrado, y b) un enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa, un mutante, un subfragmento o un dominio catalítico de la misma.

El término "vector" en la presente memoria se refiere al vehículo en el que puede introducirse una secuencia de ADN o ARN de un gen foráneo en una célula hospedadora de manera que se transforma y se promueve la expresión de la secuencia introducida. Entre los vectores pueden incluirse, por ejemplo, plásmidos, fagos y virus y se comentan en mayor detalle posteriormente. En efecto, puede utilizarse cualquier tipo de plásmido, cósmido, YAC o vector vírico para preparar un constructo de ácidos nucleicos recombinantes que pueden introducirse en una célula hospedadora en la que se desea la expresión de la proteína de interés. Alternativamente, en el caso de que se desee la expresión de la proteína de interés en un tipo particular de célula hospedadora, pueden utilizarse vectores víricos que infectan selectivamente el tipo celular o tipo tisular deseado. También resultan importante en el contexto de la presente solicitud los vectores para la utilización en la terapia génica (es decir, los que son capaces de transportar la molécula de ácidos nucleicos a un organismo huésped).

Por ejemplo, vectores víricos, tales como lentivirus, retrovirus, virus herpes, adenovirus, virus adenoasociados, virus Vaccinia, baculovirus y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. Los métodos para la construcción y la utilización de vectores víricos son conocidos de la técnica (ver Miller y Rosman, BioTechniques 7:980-990, 1992).

Los vectores víricos que actualmente resultan preferentes en la presente solicitud son aquellos que resultan idóneos para la utilización en células de vertebrado y de no vertebrado.

Para las células no de vertebrado, los vectores preferentes son los arbovirus, resultando particularmente preferido el virus del Nilo Occidental, los cuales son vectores artrópodos. Otros vectores que es conocido que son expresados eficientemente en las células no de vertebrado son los baculovirus.

Para las células de vertebrado resultan preferidos los vectores lentivíricos, VAA, baculovíricos y adenovíricos. Los vectores adecuados para la expresión en las células hospedadoras de mamífero también pueden ser de origen no vírico (por ejemplo ADN plasmídico). Entre los vectores plasmídicos adecuados se incluyen, aunque sin limitación, pREP4, pcEP4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 y pMT2PC, pVAX y pgWiz.

Para células procarióticas resultan preferidos los vectores plásmido, bacteriófago y cósmido. Entre los vectores adecuados para la utilización en sistemas procarióticos se incluyen, aunque sin limitación, los vectores pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pPoly, pTrc, pET 11d, pIN y pGEX.

Para las células vegetales, resultan preferentes los vectores de expresión plasmídicos, tales como los plásmidos Ti y los vectores de expresión víricos, tales como el virus del mosaico de la coliflor (CaMV, por sus siglas en inglés) y el virus del mosaico del tabaco TMV.

La expresión de proteínas recombinantes en las células de levadura puede llevarse a cabo utilizando tres tipos de vector: vectores de integración (YIp), plásmidos episómicos (YEp) y plásmidos centroméricos (YCp). Entre los vectores adecuados para la expresión en levaduras (por ejemplo S. cerevisiae) se incluyen, aunque sin limitación, pYepSec1, pMFa, pJRY88, pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y pTEF-MF (Dualsystems Biotech código de producto P03303).

Los vectores que pueden utilizarse para la terapia génica son bien conocidos de la técnica. Son, por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus, poxvirus, virus herpes, virus del sarampión, virus espumoso o virus adenoasociados (VAA). Los vectores víricos pueden ser competentes para la replicación o pueden discapacitarse genéticamente de manera que sean defectuosos para la replicación o de replicación deteriorada. Los vectores de terapia génica preferentes son los vectores de ADN solapado ("DNA flap"), tal como se indica en el documento n°WO 1999/055892, la patente US n° 6.682.507 y el documento n° WO 2001/27300.

Una secuencia "codificante" de un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, proteína o enzima, es una secuencia de nucleótidos que, al expresarse, resulta en la producción de dicho ARN, polipéptido, proteína o enzima; es decir, la secuencia de nucleótidos "codifica" dicho ARN o codifica la secuencia de aminoácidos para dicho polipéptido, proteína o enzima.

En el contexto de la presente solicitud, el "dominio catalítico" de un enzima se refiere al sitio activo del enzima o, en otras palabras, la parte de una molécula de enzima en la que se produce la catálisis del sustrato (en la presente memoria, la transferencia del grupo metilo en una reacción Sn2 a un residuo de cisteína reactivo). Por lo tanto, la expresión "un dominio catalítico del mismo" se refiere a cualquier fragmento o secuencia homóloga del polipéptido MGMT, preferentemente que presenta una actividad catalítica de por lo menos 80% la del enzima MGMT nativo. Estos fragmentos (también denominados "subfragmentos") pueden comprender entre 20 y 180, preferentemente entre 30 y 100 aminoácidos. La secuencia homóloga de dicho dominio catalítico puede presentar una o más mutaciones, resultando en la pérdida parcial o total de dicha actividad catalítica.

En el contexto de la invención, el enzima MGMT puede ser la MGMT humana (con la referencia NP_002403.2) de secuencia SEC ID n° 4, la MGMT de ratón identificada como NP_032624.1 (SEC ID n° 45), la MGMT de rata identificada como NP_036993.1 (SEC ID n° 46) o secuencia homóloga de la misma.

El término "homólogo" se refiere a secuencias que presentan similitud de secuencia. La expresión "similitud de secuencia", en todas las formas gramaticales de la misma, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos. En el contexto de la invención, dos secuencias de aminoácidos son "homólogas" en el caso de que por lo menos aproximadamente 80%, alternativamente por lo menos aproximadamente 81%, alternativamente por lo menos aproximadamente 82%, alternativamente por lo menos aproximadamente 83%, alternativamente por lo menos aproximadamente 84%, alternativamente por lo menos aproximadamente 85%, alternativamente por lo menos aproximadamente 86%, alternativamente por lo menos aproximadamente 87%, alternativamente por lo menos aproximadamente 88%, alternativamente por lo menos aproximadamente 89%, alternativamente por lo menos aproximadamente 90%, alternativamente por lo menos aproximadamente 91%, alternativamente por lo menos aproximadamente 92%, alternativamente por lo menos aproximadamente 93%, alternativamente por lo menos aproximadamente 94%, alternativamente por lo menos aproximadamente 95%, alternativamente por lo menos aproximadamente 96%, alternativamente por lo menos aproximadamente 97%, alternativamente por lo menos aproximadamente 98%, alternativamente por lo menos aproximadamente 99% de los aminoácidos son similares. Preferentemente, las secuencias polipeptídicas similares u homólogas se identifican mediante la utilización del algoritmo de Needleman y Wunsch.

Preferentemente, la secuencia homóloga respecto al enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa comparte una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 64%, preferentemente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 65%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 66%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 67%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 68%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 69%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 70%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 71%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 72%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 73%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 74%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 75%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 76%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 77%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 78%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 79%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 81%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 82%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 83%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 84%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 85%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 86%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 87%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 88%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 89%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 90%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 91%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 92%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 93%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 94%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 95%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 96%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 97%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 98%, alternativamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 99% respecto a SEC ID n° 4. En una forma de realización preferida, la secuencia homóloga de SEC ID n° 4 es por lo menos 64%, preferentemente 70%, y más preferentemente 80% idéntica a la SEC ID n° 4.

Una secuencia de MGMT homóloga más preferida contiene las mutaciones indicadas en el documento n°WO 2005/085470, las posiciones de las cuales pueden transponerse fácilmente en vista de la SEC ID n° 4, el residuo de metionina de partida de SNAP26 correspondiente al residuo de metionina en la posición 32 de la SEC ID n° 4 (por lo tanto, deberían añadirse 31 aminoácidos a las posiciones dadas a conocer en el documento n° WO 2005/085470 con el fin de obtener las correspondientes en la SEC ID n° 4).

Preferentemente, la secuencia homóloga de MGMT útil en la invención corresponde a la secuencia de MGMT de tipo salvaje de SEC ID n° 4, en la que se han eliminado entre 1 y 30, preferentemente entre 6 y 25, y en particular 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 aminoácidos son sustituidos por otros aminoácidos, y/o 1 a 40, preferentemente 1 a 20, en particular 10 a 20 aminoácidos, más preferentemente 15 aminoácidos en el extremo C-terminal.

En una forma de realización preferida, la secuencia homóloga de MGMT contiene las mutaciones siguientes respecto a la SEC ID n° 4:

(A) Lys31 sustituido por Arg, o Met32 sustituido por Ser, o Cys93 sustituido por Ala, o Lys156 sustituido por Ala, o Ala158 sustituido por Thr, o Arg159 sustituido por Ala, o Gly162 sustituido por Lys, o Gly163 sustituido por Thr, o Met165 sustituido por Leu, o Arg166 sustituido por Ser, o Cys181 sustituido por Ser, o Asn188 sustituido por Gly, o Ser190 sustituido por Glu, o Gly214 sustituido por Pro, o Ser215 sustituido por Ala, o Ser216 sustituido por Gly, o Gly217 sustituido por Ile, o Leu218 sustituido por Gly, o Gly220 sustituido por Pro, o Ala221 sustituido por Gly, o Trp222 sustituido por Ser, o

(B) Lys31-Met32 sustituido por Arg-Ser, o Ala158-Arg159 sustituido por Thr-Ala, r Gly162-Gly163 sustituido por Lys-Thr, o Met165-Arg166 sustituido por Leu-Ser, o Gly162-Gly163/Met165-Arg166 sustituido por Lys-Thr/Leu-Ser, o Asn188/Ser190 sustituido por Gly/Glu, o Gly214-Ser215-Ser216-Gly217-Leu218 sustituido por Pro-Ala-Gly-Ile-Gly, o Gly220-Ala221-Trp222 sustituido por Pro-Gly-Ser, preferentemente en combinación con cualesquiera otras sustituciones de aminoácidos citadas en (A), o

(C) Truncado después de Leu223 (los aminoácidos 224 a 238 han sido eliminados), preferentemente en combinación con cualquier otra sustitución de aminoácido citada en (A) o (B).

Las secuencias homólogas de MGMT preferidas son las truncadas después de Leu223.

Las secuencias homólogas de MGMT preferidas son aquellas con dos de las modificaciones de (B) y opcionalmente con truncado después de Leu223.

Las secuencias homólogas de MGMT preferidas son aquellas con tres de las modificaciones de (B) y opcionalmente con truncado después de Leu223.

Las secuencias homólogas de MGMT preferidas son aquellas con cuatro de las modificaciones de (B) y opcionalmente con truncado después de Leu223.

Las secuencias homólogas de MGMT preferidas son aquellas con cinco de las modificaciones de (B) y opcionalmente con truncado después de Leu223.

Las secuencias homólogas de MGMT preferidas son aquellas con seis de las modificaciones de (B) y opcionalmente con truncado después de Leu223.

Otras secuencias homólogas de MGMT preferentes son las que contienen una combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mutaciones seleccionadas de entre las modificaciones dadas a conocer en (A), y opcionalmente truncadas después de Leu223.

Resultan particularmente preferidas las secuencias homólogas que contienen las mutaciones Lys31Arg, Met32Ser, Cys93Ala, Lys156Ala, Ala158Thr, Arg159Ala, Gly162Lys, Gly163Thr, Met165Leu, Arg166Ser, Cys181Ser, Asn188Gly, Ser190Glu, Gly214Pro, Ser215Ala, Ser216Gly, Gly217Ile, Leu218Gly, Gly220Pro, Ala221Gly, Trp222Ser y truncado después de Leu223 (es decir, la secuencia SNAP de la SEC ID n° 2).

En una forma de realización todavía más preferente, el enzima MGMT es la proteína mutante SNAP de SEC ID n° 2 o un homólogo de la misma. El mutante SNAP de SEC ID n° 2 comparte una homología de 77% con la secuencia de aminoácidos de la 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa humana (NP_002403.2, SEC ID n° 4) y una homología de 70% respecto a la secuencia de aminoácidos de la 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa de ratón (NP_032624.1, SEC ID n° 45).

Preferentemente, dicha secuencia homóloga respecto a la proteína SNAP es por lo menos idéntica a más del 80%, preferentemente al 81%, más preferentemente al 82%, más preferentemente al 83%, más preferentemente al 84%, más preferentemente al 85%, más preferentemente al 86%, más preferentemente al 87%, más preferentemente al 88%, más preferentemente al 89%, más preferentemente al 90%, más preferentemente al 91%, más preferentemente al 92%, más preferentemente al 93%, más preferentemente al 94%, más preferentemente al 95%, más preferentemente al 96% y todavía más preferentemente al 97% respecto a la proteína SNAP de secuencia SEC ID n° 2.

Preferentemente, el vector de expresión de nucleótidos divulgado comprende además sitios de clonación que permiten la inserción dentro del marco de una secuencia de ADN heteróloga codificante de una proteína de interés.

La expresión "señal de secreción peptídica" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a una cadena peptídica corta (de 3 a 60 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte de una proteína.

Entre los ejemplos de señales de secreción apropiadas para los presentes vectores se incluyen, aunque sin limitación, las secuencias peptídicas de señal del factor de apareamiento (MF, por sus siglas en inglés) alfa (patente US n° 5.879.926), la invertasa (documento n° WO84/01153), PHO5 (patente DK n° 3614/83), YAP3 (documento n° WO95/02059) y BAR1 (documento n° WO87/02670).

En el contexto de la presente solicitud, esta señal de secreción peptídica es preferentemente funcional en células de no vertebrado o en células de vertebrado, o ambas.

Son ejemplos de señales de secreción peptídica que son funcionales en las células de insecto: BiPmc de insecto (SEC ID n° 48, que presenta por ejemplo la secuencia de ADN SEC ID n° 11), la señal peptídica de tipo BiP de SEC ID n° 51 (por ejemplo que presenta la secuencia de ADN SEC ID n° 50) y cualquier señal peptídica presente en un arbovirus, por ejemplo la proteína E de cubierta del virus del Nilo Occidental (SEC ID n° 15).

Resulta interesante que la señal peptídica de tipo BiP anteriormente indicada es funcional en células tanto de no vertebrado como de vertebrado. Esta señal de tipo BiP corresponde a la señal peptídica BiP de SEC ID n° 48 en la que el último aminoácido glicina ha sido sustituido por la secuencia de aminoácidos Pro Thr Ala Leu Ala (SEC ID n°61), que corresponde al sitio de corte de la proteína E del virus Dengue. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la señal de tipo BiP es cortada ventajosamente tras la traducción de la proteína y la secreción al sobrenadante de las células hospedadoras.

También se encuentra disponible una diversidad de señales de secreción para la expresión en células hospedadoras de levadura, por ejemplo en S. cerevisiae. Entre ellas se incluyen el factor alfa Prepro, HSp150, PHO1, SUC2, KILM1 (toxina asesina tipo 1) y GGP1.

Un sitio de clonación es una secuencia que facilita la clonación de un gen codificante de una proteína de interés en el sistema de expresión. Contiene sitios de restricción, o sitios de reconocimiento de restricción, es decir localizaciones en una molécula de ADN que contiene secuencias específicas de nucleótidos, los cuales son reconocidos por enzimas de restricción (ver, por ejemplo, en las figuras). Éstas son secuencias generalmente palindrómicas (debido a que los enzimas de restricción habitualmente se unen como homodímeros) y un enzima de restricción particular puede cortar la secuencia entre dos nucleótidos dentro de su sitio de reconocimiento, o en una localización próxima. Los sitios de clonación son bien conocidos por el experto en la materia.

Más preferentemente, el vector de expresión de nucleótidos comprende además una secuencia de ADN heterólogo codificante de una proteína de interés heteróloga o un polipéptido heterólogo insertado en dichos sitios de clonación.

El término "heterólogo" se refiere a una combinación de elementos no natural. Por ejemplo, la presente solicitud describe "secuencias de ADN heterólogas" codificantes de "proteínas/polipéptidos de interés", estando dichas secuencias de ADN no situadas naturalmente en o dentro de un sitio cromosómico de la célula hospedadora que se utiliza para la expresión de proteínas.

En el caso de que se inserte en el vector de nucleótidos divulgado una secuencia de ADN heteróloga codificante de una proteína o polipéptido heterólogo de interés, preferentemente codifica un polipéptido de fusión que comprende dicha señal peptídica, dicho enzima MGMT, mutante u homólogo del mismo, y dicha proteína/polipéptido heterólogo de interés.

En una forma de realización preferida, la secuencia de ADN codificante de dicho enzima MGMT se encuentra situada en el extremo 5' o 3' de la secuencia de ADN codificante de dicha proteína heteróloga de interés, preferentemente en el extremo 5'. Por lo tanto, el enzima MGMT se une directa o indirectamente a la proteína/polipéptido heterólogo de interés y preferentemente se localiza en el extremo N-terminal de la proteína/polipéptido heterólogo de interés.

Resulta particularmente preferido que la secuencia de ADN codificante de dicho enzima MGMT de la misma se encuentre situada en el extremo 5' de la secuencia de ADN codificante de dicha proteína/polipéptido heterólogo de interés, en el caso de que el dominio de actividad de la proteína/polipéptido heterólogo de interés se encuentre localizado en su parte C-terminal, tal como IFNa. De la misma manera, podría resultar particularmente preferido que la secuencia de ADN codificante de dicho enzima MGMT se encuentre situada en el extremo 3' de la secuencia de ADN codificante de dicha proteína/polipéptido heterólogo de interés, en el caso de que el dominio de actividad de la proteína/polipéptido heterólogo de interés se encuentre localizado en su parte N-terminal.

Más exactamente, la presente solicitud divulga un vector para la expresión de proteínas recombinantes en células hospedadoras, preferentemente en células hospedadoras no de vertebrado y/o de vertebrado, más preferentemente en células de insecto, que comprende una secuencia de nucleótidos codificante en un único marco de lectura abierto, de extremo 5' a 3':

a) una señal de secreción peptídica que es funcional en dicha célula hospedadora,

b) el enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT, EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico del mismo y

c) una proteína recombinante.

En el contexto de la presente solicitud, la expresión "proteína recombinante" o "proteína de interés" se refiere a productos génicos o polipéptidos que son foráneos respecto a la célula productora de proteína y que se seleccionan preferentemente de entre el grupo que consiste en una o más proteínas o polipéptidos diagnósticos y terapéuticos.

Más preferentemente, dicha proteína o proteínas o polipéptido o polipéptidos diagnósticos y terapéuticos se seleccionan de entre el grupo que consiste de:

- proteínas inmunogénicas bacterianas o víricas, más preferentemente proteínas víricas (infecciosas, patógenas), por ejemplo la proteína EDIII de los virus Dengue, de la encefalitis japonesa, de la encefalitis transmitida por garrapatas, de la fiebre amarilla, Usutu, Rocio, de la encefalitis de Murray, Wesselbron, Zika o del Nilo Occidental, o la nucleoproteína N del virus de la fiebre del valle del Rift o del virus Toscana, o la forma soluble de la proteína de cubierta E2 del virus Chikungunya, o la forma soluble de la proteína de cubierta E del virus del Nilo Occidental, y

- factores sanguíneos, anticoagulantes, factores de crecimiento, hormonas, vacunas, enzimas terapéuticos, anticuerpos monoclonales y citoquinas (tales como IFNa, granzima M y FasL),

- antígenos, por ejemplo antígenos del cáncer tal como el antígeno de cáncer de testículo SSX2 o la región N-terminal de ERc/mesotelina (NERCMSL),

- proteínas antitumorales, por ejemplo FasL, o las heparán-sulfato 6-O-endosulfatasas (hSULF),

- polipéptidos microbianos, víricos y/o parasitarios,

- cualesquiera otras proteínas útiles (por ejemplo contactinas).

La proteína FasL es una proteína proapoptótica que puede utilizarse como agente antitumoral. Se encuentra codificada, por ejemplo, por la SEC ID n° 88.

Las proteínas hSulf (o hSULF) son heparán-sulfato 6-O-endosulfatasas que regulan la estructura de la heparina sulfato y presentan un impacto drástico sobre el crecimiento y la progresión de las células malignas in vivo (Dai et al., 2005). En el contexto de la invención, preferentemente es la proteína hSulf2, y más preferentemente hSulf-2ñTMD, en las que el dominio transmembrana (TMD) ha sido eliminado para incrementar su solubilidad, presentando este mutante la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 95 y estando codificada, por ejemplo, en la SEC ID n° 94.

El vector divulgado también puede utilizarse para expresar y purificar péptidos y/o polipéptidos de interés. En el contexto de la presente invención, los términos "péptidos" y "polipéptidos" pretenden ser sinónimos, refiriéndose a polímeros cortos de monómeros aminoácidos (también denominados "residuos") unidos mediante enlaces peptídicos. Dichos polímeros preferentemente contienen menos de 100 residuos, más preferentemente menos de 50 residuos.

En particular, el vector divulgado puede utilizarse para expresar y purificar polipéptidos microbianos diagnósticos, tales como polipéptidos bacterianos, víricos o parasitarios. Son ejemplos de dichos polipéptidos los péptidos antigénicos, mucinas y/o toxinas secretadas o expresadas por bacterias, virus o parásitos. Preferentemente, dicho péptido antigénico es expresado por el virus Influenza, el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C, el virus de la hepatitis G, el virus VIH, el virus de la fiebre amarilla, el virus Dengue, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, los virus Usutu o del Nilo Occidental, el virus de la fiebre del valle del Rift o el virus Toscana, el virus Chikungunya, el virus sincitial respiratorio, el virus Rocio, el virus de la encefalitis de Murray, el virus Wesselbron, el virus Zika, el virus de la coreomeningitis linfocítica, un paravovirus humano, un papilomavirus humano, el citomegalovirus humano o cualquier virus identificado. Preferentemente, dicho péptido antigénico es expresado por protozoos parasitarios (tal como Entamoeba histolytica o Giardia lamblia), anélidos (tales como nemátodos, céstodos o tremátodos) o artrópodos (tales como crustáceos, insectos o arácnidos). Preferentemente dicho péptido antigénico es expresado por bacterias infecciosas, por ejemplo de los géneros Streptococcus o Staphylococcus y E. coli. Las toxinas infecciosas son bien conocidas de la técnica. Pueden citarse a título de ejemplos las neurotoxinas botulínicas, la toxina epsilón de Clostridium perfringens, la ricina, la saxitoxina, la shigatoxina, la tetrodotoxina, las enterotoxinas estafilocócicas, etc. Las mucinas también son bien conocidas de la técnica. Son ejemplos de las mismas MUC5AC, MUC5B y MUC2. Dichos ejemplos no son limitativos y puede expresarse cualquier péptido/polipéptido mediante el presente método.

Las contactinas son un subgrupo de moléculas pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas que se expresan exclusivamente en el sistema nervioso (ver la revisión de Shimoda y Watanabe, 2009). Participan en trastornos psiquiátricos, en particular en el autismo. Las contactinas preferentes que debe producir el presente sistema son las contactinas 2 y 4. La contactina 4 (CNTN4) está codificada por, por ejemplo, la SEC ID n° 91 (correspondiente a los aminoácidos 19 a 990 de la proteína completa NP_783200.1).

Es conocido que numerosos antígenos del cáncer resultan eficientes dianas de vacuna para el tratamiento del cáncer. La producción en cantidad elevada de dichos polipéptidos (ver las listas en Cheever et al., 2009) aparentemente resulta muy importante para obtener una vacuna del cáncer eficiente. Resulta interesante que los vectores divulgados permiten obtener un nivel elevado de antígenos recombinantes del cáncer que pueden utilizarse en inmunoterapia, o para producir anticuerpos o en métodos diagnósticos del cáncer.

SSX2 y NERCMSL son dos ejemplos de antígenos del cáncer. El antígeno de cáncer SSX2 está codificado por el ADN que presenta la SEC ID n° 76 (GenBank: NM_175698). La región N-terminal de ERC/mesotelina (NERCMSL) está codificada por la SEC ID n° 83. Este antígeno se utiliza comúnmente como antígeno de detección en pacientes que sufren de mesotelio maligno.

Mediante los presentes métodos puede producirse cualquier proteína.

Sin embargo, las proteínas preferentes son las proteínas terapéuticas, tales como la insulina, IFN, FasL, la mesotelina, hSULF o las contactinas.

Más generalmente, las proteínas preferentes son aquellas que ha resultado difícil producir en cantidades elevadas hasta el momento. Dichas proteínas son, por ejemplo, FasL, granzima M, hSULF, mesotelina y contactinas.

La secuencia de ADN codificante del polipéptido de fusión que comprende dicha señal peptídica, dicho enzima MGMT, mutante o dominio catalítico, y dicha proteína de interés recombinante, puede asociarse operativamente con un promotor inducible que resulta funcional en las mismas células hospedadoras en las que es funcional la señal peptídica.

Más preferentemente, en el vector divulgado, dicho marco de lectura abierto se encuentra asociado operativamente a un promotor inducible que es funcional en la misma célula hospedadora en la que es funcional la señal peptídica.

Una secuencia codificante se encuentra "operativamente asociada con" una secuencia de control de la expresión (es decir, secuencias de control transcripcional y traduccional) en una célula, en el caso de que la ARN polimerasa transcriba la secuencia codificante en ARN, que seguidamente es procesado en trans-ARN (en caso de contener intrones) y, en el caso de que la secuencia codifique una proteína, se traduce en dicha proteína.

Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos a partir de la que puede iniciarse la transcripción del ADN unido operablemente cadena abajo (es decir, en la dirección 3' en la cadena de sentido del ADN de doble cadena). Dentro de la secuencia del promotor se encuentra un sitio de inicio de la transcripción (que se encuentra convenientemente, por ejemplo, mediante el mapeado con nucleasa S1), así como dominios de unión de proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.

Los promotores que pueden utilizarse para controlar la expresión génica son por ejemplo los funcionales en las células no de vertebrado o en las células de vertebrado. Por ejemplo, para las células no de vertebrado, pueden utilizarse las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., Nature 296:39-42, 1982).

Preferentemente, el promotor inducible que se encuentra presente en el vector divulgado presenta una actividad de promotor en una célula de insecto, y más preferentemente en una célula de Drosophila. Es, por ejemplo, el promotor de metalotioneína de Drosophila (Lastowski-Perry et al., J. Biol. Chem. 260:1527, 1985) que dirige un nivel elevado de transcripción del gen en presencia de metales, por ejemplo CuSO4. Alternativamente, puede utilizarse el promotor del gen actina 5C de Drosophila, que es un promotor constitutivo y no requiere la adición de un metal (B.J. Bond et al., Mol. Cell. Biol. 6:2080, 1986). Entre los ejemplos de otros promotores de Drosophila conocidos se incluyen, por ejemplo, los promotores inducibles de choque térmico (Hsp70) y COPIA LTR. El promotor temprano del SV40 proporciona un nivel más bajo de expresión que el de metalotioneína de Drosophila.

Preferentemente, el promotor inducible que se encuentra presente en el vector divulgado presenta una actividad de promotor en una célula de Drosophila melanogaster, preferentemente en células S2 de Drosophila. Es, por ejemplo, el promotor de metalotioneína que se describe en detalle en Lastowski-Perry et al., J. Biol. Chem.

260:1527, 1985.

Entre los promotores adecuados para la expresión constitutiva en células de mamífero se incluyen, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), el promotor tardío mayor de adenovirus, el promotor fosfoglicerocinasa (PGK) y el promotor timidina cinasa (TK) del virus herpes simplex (VSH)-1. Entre los promotores eucarióticos inducibles regulados por compuestos suministrados exógenamente se incluyen, aunque sin limitación, el promotor de metalotionneína (Mt ) inducible con cinc, el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema del promotor de polimerasa de T7 (documento n° WO 98/10088), el promotor ecdisona de insecto, el promotor reprimible por tetraciclina, el promotor inducible por tetraciclina, el promotor inducible por RU486 y el promotor inducible por rapamicina.

Preferentemente, el promotor que se encuentra presente en el vector divulgado presenta una actividad de promotor en una célula de mamífero, preferentemente en células HeLa. Es, por ejemplo, el promotor del SV 40.

Se encuentra disponible un abanico de promotores de levadura para la expresión de proteínas en las células hospedadoras de levadura. Algunos, tales como ADH2 y SUC2, son inducible, mientras que otros, como GAPDH, presentan una expresión constitutiva. Entre otros promotores adecuados para la expresión en levaduras se incluyen los promotores TEF, PGK, MF alfa, Cy C-1, GAL-1, GAL4, GAL10, PHO5, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP o GAPDH) y alcohol deshidrogenasa (ADH).

Para la utilización en células vegetales, el promotor utilizado más comúnmente es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) o su versión potenciada, aunque puede utilizarse uno de entre varios promotores alternativos, tales como el promotor híbrido (ocs)3mas o el promotor ubiquitina del maíz y de A. Thaliana. En contraste con dichos promotores constitutivos, el promotor a-amilasa RAmy3D del arroz es inducido por la privación de azúcar (Hellwig S. et al., 2004).

Los promotores adecuados para la expresión en una célula hospedadora de E. coli incluyen, aunque sin limitación, el promotor pL del bacteriófago lambda, el promotor lac, y los promotores pTAC inducibles por t Rp e IPTG.

Resulta preferido que la señal de secreción peptídica y el promotor inducible son funcionales en la misma célula hospedadora.

Más preferentemente, la señal de secreción peptídica y el promotor inducible son funcionales tanto en células S2 de Drosophila como en células de vertebrado.

El término "inducible" tal como se aplica a un promotor es bien conocido por el experto en la materia. En esencia, la expresión bajo el control de un promotor inducible resulta "activado" o incrementado en respuesta a la aplicación de un estímulo. La naturaleza del estímulo varía entre promotores. Algunos promotores inducibles provocan niveles bajos o indetectables de expresión (o una expresión nula) en ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles causan una expresión constitutiva detectable en ausencia del estímulo. Sea cual sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo, la expresión a partir de cualquier promotor inducible se encuentra incrementada en presencia del estímulo correcto.

Tras construir un vector apropiado y transfectarlo en la célula hospedadora seleccionada, preferentemente una línea celular de Drosophila, se induce la expresión de una proteína heteróloga mediante la adición de un agente inductor apropiado para el promotor inducible. Por ejemplo, el cadmio o el cobre son agentes inductores para el promotor Hsp70. Para los promotores constitutivos, tales como el promotor actina 5C, no se requiere ningún agente inductor para la expresión.

El enzima MGMT humano de la invención preferentemente se encuentra codificado por la secuencia del gen de MGMT humano de referencia NM_002412.3, el gen ID 4255 (SEC ID n° 3) o por la secuencia optimizada SEC ID n° 68 (que comprende únicamente 50% de G/C). Sin embargo, puede utilizarse cualquier secuencia homóloga de la misma, con la condición de que codifique un enzima MGMT funcional, mutante o dominio catalítico del mismo, preferentemente la SEC ID n° 4 o la SEC ID n° 2. Las secuencias de ADN preferentes codificantes de dicho mutante de MGMT son las secuencias de ADN de SNAP SEC ID n° 1 o las secuencias de ADN SEC ID n° 47 o SEC ID n° 67 codificantes de la SEC ID n° 2 pero que presentan un contenido de G/C de 51%.

En otra realización, el vector de nucleótidos divulgado codifica por lo menos un fragmento del enzima MGMT (por ejemplo un fragmento de SEC ID n° 4) o un fragmento de un homólogo del mismo (por ejemplo un fragmento del mutante de MGMT de secuencia SEC ID n° 2) que conserva la actividad biológica de incremento de la expresión de la proteína de interés en un factor de por lo menos 0,5 veces el nivel obtenido con el enzima de longitud completa del que es un fragmento. A título de ejemplo, en el caso de que el nivel de producción sea de 100 mg/l con el enzima de longitud completa de SEC ID n° 4, se encuentran comprendidos cualesquiera fragmentos de SEC ID n° 4 que presenta un nivel de producción de por lo menos 50 mg/l (bajo las mismas condiciones experimentales que para el enzima de longitud completa de s Ec ID n° 4).

En otra realización, el vector de expresión de nucleótidos codifica por lo menos un sitio de corte peptídico que se encuentra situado preferentemente entre el enzima MGMT o su dominio catalítico y la proteína recombinante de interés.

Un sitio de corte peptídico (también denominado "sitio de corte del péptido") es una secuencia de aminoácidos que resulta reconocida por como mínimo un enzima proteasa (por ejemplo una serina proteasa o una cisteína proteasa, entre otros). Un ejemplo de un sitio de corte peptídico es el sitio de corte de enterocinasa de SEC ID n° 62 (AspAspAspAspLys/Asp), por ejemplo codificado por la secuencia de ADN SEC ID n° 12. La enterocinasa es un enzima serina proteasa (EC 3.4.21.9) que es conocido que convierte el tripsinógeno inactivo en tripsina activa mediante el corte en el extremo C-terminal de la secuencia: Val--(Asp)4--Lys--Ile--Val~ (tripsinógeno) ^ Val--(Asp)4--Lys (hexapéptido) Ile—Val~ (tripsina). La enterocinasa corta después de la lisina en el caso de que Lys se encuentre precedido por cuatro Asp y no seguido por un residuo de prolina.

Otro sitio de corte peptídico útil es el sitio de corte de la denominada "proteasa del TEV", que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 53 o SEC ID n° 65 (Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly o Ser), y que se encuentra, por ejemplo, codificado por la secuencia de ADN SEC ID n° 52 o SEC ID n° 66. La proteasa del TEV es el nombre común para el dominio catalítico de 27 kDa de la inclusión nuclear de una proteína codificada por el virus del grabado del tabaco. Se encuentra disponible comercialmente (Invitrogen).

El sitio de corte del precursor membranal prM del virus Dengue serotipo 1 (SEC ID n° 61) también puede utilizarse en el presente vector.

En otra realización, el vector de expresión de nucleótidos codifica además un marcaje, preferentemente situado en el extremo C-terminal de la proteína recombinante en el polipéptido de fusión de la invención (que comprende la señal peptídica, la proteína MGMT u homólogo de la misma, y la proteína recombinante).

En el contexto de la presente solicitud, un "marcaje" está destinado a facilitar la recuperación del polipéptido a partir del lisado en bruto de células hospedadoras y preferentemente se selecciona de entre el grupo que comprende: proteínas fluorescentes, etiquetas poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly), etiquetas HA de la gripe, etiqueta c-myc, etiquetas de glucoproteína D (gD) del virus del herpes simplex, péptidos Flag, epítopos de alfa-tubulina o etiquetas peptídicas de proteína de gen 10 de T7. Sin embargo, podría resultar de utilidad cualquier otro marcaje. En una forma de realización preferida, los vectores comprenden el ADN codificante de una etiqueta hexa-histidina que presenta la SEC ID n° 14.

En otra forma de realización, el vector de expresión de nucleótidos codifica además una o más secuencias espaciadoras, situadas preferentemente entre el enzima MGMT (o su dominio catalítico) y la proteína recombinante de interés y/o entre la proteína recombinante de interés y el marcaje.

Una secuencia espaciadora es una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos tres aminoácidos, destinada a separar espacialmente dos polipéptidos unidos (uniendo seguidamente estos polipéptidos de manera indirecta). Dicho espaciador puede ser, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos Glicina-Glicina-Glicina-Serina (GGGS, SEC ID n° 63) y la secuencia espadadora de ADN codificante de la misma puede ser SEC ID n° 13. En el contexto de la presente solicitud, dicha secuencia de ADN se denomina en lo sucesivo "secuencia espaciadora de ADN" y se encuentra situada entre el ADN codificante de MGMT o el dominio catalítico del mismo y la secuencia de ADN recombinante, preferentemente cadena arriba de la secuencia de ADN codificante del sitio de corte peptídico.

El vector de expresión de nucleótidos que se da a conocer en la presente solicitud puede presentar la secuencia SEC ID n° 9, la secuencia SEC ID n° 10 o la secuencia SEC ID n° 64 (correspondiente a vectores vacíos sin gen recombinante de interés insertado en los sitios de clonación). En una forma de realización particular, el vector divulgado puede codificar:

- una señal peptídica BiP de insecto (que preferentemente es funcional en las células S2 de Drosophila) o una señal de tipo BiP tal como se ha definido anteriormente,

- una proteína MGMT de SEC ID n° 4 o una proteína SNAP de SEC ID n° 2,

- una proteína recombinante de interés,

- un sitio de corte peptídico de enterocinasa o un sitio de corte de pro-TEV tal como se ha definido anteriormente,

- un marcaje poli-histidina, y

- dos secuencias espaciadoras que presentan la secuencia de aminoácidos Glicina-Glicina-Glicina-Serina (GGGS, SEC ID n° 63).

En una forma de realización más preferida, el vector de expresión divulgado codifica:

- una señal peptídica de BiP de insecto de SEC ID n° 48,

- una proteína MGMT de SEC ID n° 4 o una proteína SNAP de SEC ID n° 2,

- una proteína recombinante de interés,

- un sitio de corte peptídico de enterocinasa de SEC ID n° 62,

- un marcaje poli-histidina, y

- dos secuencias espaciadoras que presentan la secuencia de aminoácidos Glicina-Glicina-Glicina-Serina (GGGS).

En otra forma de realización preferida, el vector de expresión divulgado codifica:

- una señal peptídica de tipo BiP de SEC ID n° 51,

- una proteína MGMT de SEC ID n° 4 o una proteína SNAP de SEC ID n° 2,

- una proteína recombinante de interés,

- un sitio de corte peptídico de pro-TEV de SEC ID n° 53,

- un marcaje poli-histidina, y

- dos secuencias espaciadoras que presentan la secuencia de aminoácidos Glicina-Glicina-Glicina-Serina (GGGS).

Dichos vectores pueden comprender, por ejemplo, la secuencia SEC ID n° 19 (en el caso de que la proteína de interés sea la nucleoproteína N del virus la fiebre del valle del Rift (FVR), SEC ID n° 20 (en el caso de que la proteína de interés sea la nucleoproteína N del virus del Nilo Occidental), SEC ID n° 21 o n° 57 o n° 72 o n° 74 (en el caso de que la proteína de interés sea IFNa), SEC ID n° 77, n° 79 o n° 81 (en el caso de que la proteína de interés sea el antígeno del cáncer SSX2), SEC ID n° 55 (en el caso de que la proteína de interés sea granzima M), SEC ID n° 89 (en el caso de que la proteína de interés sea FasL), ^s E^c ID n° 84 o n° 86 (en el caso de que la proteína de interés sea el antígeno del cáncer NERCMSL) o SEC ID n° 92 (en el caso de que la proteína de interés sea la contactina CNTN4).

La presente solicitud da a conocer además un vector para la expresión de proteínas recombinantes en células hospedadoras, que comprende una secuencia de nucleótidos codificante en un único marco de lectura abierta, de 5' a 3':

a) una señal de secreción peptídica,

b) una proteína MGMT de SEC ID n° 4 o una proteína SNAP de SEC ID n° 2,

c) por lo menos un sitio de corte peptídico,

d) un marcaje poli-histidina, y

e) por lo menos una secuencia espaciadora.

En una forma de realización preferida, dicha señal de secreción peptídica es la señal peptídica de tipo BiP de SEC ID n° 50.

En una forma de realización más preferente, dicho vector comprende dos sitios de corte peptídico de pro-TEV de SEC ID n° 52 y/o dos secuencias espaciadoras que presentan la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 63.

En una forma de realización particularmente preferente, dicho vector comprende la secuencia SEC ID n° 59 o SEC ID n° 69, haciendo referencia a dichas secuencias en la presente solicitud como el casete DeSNAP universal "DeSNAP Univ" y el casete DeMGMT "DeMGMT Univ", respectivamente.

Estas secuencias "DeSNAP Univ" (SEC ID n° 59) y "DeMGMT Univ" (SEC ID n° 69) se consideran secuencias "universales" ya que pueden insertarse en cualquier tipo de vector destinado a la transfección de células hospedadoras con el fin de producir proteínas heterólogas, es decir vectores de vertebrado (tales como el vector pcDNA3 o el vector pCI-neo), así como vectores no de vertebrado (tales como pMT/BiP/V5-HisA, que resulta útil en el sistema DES; ver los ejemplos, posteriormente).

Son ejemplos de plásmido que comprende dichas secuencias universales, SEC ID n° 64 (pUC57 que comprende DeSNAP Univ) y SEC ID n° 71 (pUC57 con DeMGMT Univ).

Tras clonar en la presente memoria la secuencia heteróloga de una proteína de interés, dicho vector puede transfectarse ventajosamente en células hospedadoras de vertebrado o de no vertebrado, de manera que se produzca la proteína de interés en cantidades elevadas.

La presente solicitud divulga asimismo la célula recombinante, que resulta establemente transfectada por dicho vector DeSNAP Univ o DeMGMT Univ, es decir, por el vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos codificante en un único marco de lectura abierta, de 5' a 3':

a) una señal de secreción peptídica,

b) una proteína MGMT de SEC ID n° 4 o una proteína SNAP de SEC ID n° 2,

c) por lo menos un sitio de corte peptídico,

d) un marcaje poli-histidina, y

e) por lo menos una secuencia espaciadora,

siendo cada componente tal como se ha definido anteriormente.

Preferentemente comprende los plásmidos de SEC ID n° 64 (pUC57 que comprende DeSNAP Univ) o SEC ID n° 71 (pUC57 con DeMGMT Univ) o por lo menos la secuencia de nucleótidos SEC ID n° 59 (DeSNAP Univ) o SEC ID n° 69 (DeMGMT Univ).

Preferentemente, dicha célula recombinante es una célula de E. coli.

Dicha célula recombinante se utiliza con el fin de amplificar y purificar los vectores de expresión, preferentemente aquellos que comprenden DeSNAP Univ de SEC ID n° 59 (tal como SEC ID n° 64) o DeMGMT Univ de SEC ID n° 69 (tal como SEC ID n° 71).

Por lo tanto, la presente solicitud también divulga la utilización de dicha célula recombinante para la producción de cualquier vector de expresión definido anteriormente.

Los vectores de expresión de nucleótidos pueden comprender además un gen codificante de un marcador de selección y/o una secuencia de terminador.

Los genes marcadores de selección que pueden incluirse en el constructo típicamente son los que confieren fenotipos seleccionables, tales como resistencia a antibióticos (por ejemplo blasticidina, ampicilina, canamicina, higromicina, puromicina y cloranfenicol).

La presente solicitud divulga asimismo un polipéptido de fusión que comprende una señal de secreción peptídica que es funcional en células hospedadoras, preferentemente en células no de vertebrado o de vertebrado, más preferentemente en células de insecto y el enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT) (EC 2.1.1.63), mutante o dominio catalítico del mismo tal como se ha definido anteriormente.

En este polipéptido de fusión de la exposición, dicho enzima MGMT es preferentemente la proteína de SEC ID n° 4, la mutante de proteína SNAP de SEC ID n° 2, o un homólogo de la misma.

Este polipéptido de fusión comprende además una proteína recombinante de interés tal como se ha definido anteriormente, preferentemente situada en el extremo C-terminal del enzima MGMT o dominio catalítico del mismo, y/o un marcaje, tal como se ha definido anteriormente. Dicho marcaje preferentemente es un marcaje polihistidina y preferentemente se localiza en el extremo C-terminal de la proteína recombinante de interés.

Dicho polipéptido de fusión puede ser la secuencia de aminoácidos de SEC ID n° 33 a n° 43, SEC ID n° 56 o SEC ID n° 58 (en el caso de que la proteína recombinante de interés sea GrM), SEC ID n° 73 o n° 75 (en el caso de que la proteína recombinante de interés sea IFNa), SEC ID n° 78 o n° 80 o n° 82 (en el caso de que la proteína recombinante de interés sea el antígeno del cáncer SSX2), SEC ID n° 85 o n° 87 (en el caso de que la proteína recombinante de interés sea NERCMSL), SEC ID n° 90 (en el caso de que la proteína recombinante de interés sea FasL) o SEC ID n° 93 (en el caso de que la proteína recombinante de interés sea CNTN4).

De manera interesante, dichas proteínas de fusión pueden almacenarse a 4°C durante varios meses sin degradación. Este efecto de estabilización in vitro durante el almacenamiento podría ser el resultado de las propiedades de andamiaje de la proteína MGMT y/o de la elevada concentración que se obtiene gracias a la presencia de la proteína MGMT (típicamente de por lo menos 40 mg/ml).

Más importante, la asociación con MGMT estabiliza las proteínas recombinantes durante el procedimiento de purificación de las proteínas secretadas. De esta manera, podría utilizarse para estabilizar proteínas recombinantes in vivo tras la administración en un sujeto que lo necesita. El acoplamiento con MGMt sería un medio para incrementar el periodo de vida de dichas proteínas recombinantes in vivo. Este efecto de estabilización in vivo se está investigando en la actualidad.

La presente solicitud divulga asimismo una célula hospedadora recombinante de no vertebrado que comprende el vector de expresión descrito anteriormente.

Las células de no vertebrado pueden ser cualesquiera células de las divisiones Insectos, Arácnidos, Crustáceos, Moluscos, Anélidos, Cirripedios, Radiados, Celenterados e Infusorios. En el contexto de la presente solicitud, las células de no vertebrado son preferentemente células de insecto, tales como células de Drosophila o de Mosquito. Más preferentemente son células S2 de Drosophila.

Las células S2 de Drosophila han sido ampliamente descritas. Resultan especialmente adecuadas para la producción de alto rendimiento de proteínas debido a que pueden mantenerse en cultivos en suspensión a temperatura ambiente (24 ± 1°C). El medio de cultivo era M3 complementado con 5% a 10% (v/v) de suero de feto bovino (SFB) inactivado por calor. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo contiene SFB al 5%. Tras la inducción las células se cultivan en medio sin suero. En dicho medio, las células S2 pueden cultivarse en cultivos en suspensión, por ejemplo en matraces de agitación de 250 a 2.000 ml bajo agitación a 50-60 rpm. Las densidades celulares típicamente se mantienen entre 106 y 107 células por ml.

La presente solicitud divulga asimismo las células S2 recombinantes de Drosophila que comprenden los presentes vectores de expresión, comprendiendo dichos vectores de expresión preferentemente la secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que consiste de:

- la secuencia plasmídica SEC ID n° 64 (pUC57 con DeSNAP Univ) o la secuencia de nucleótidos clonada en la célula que ha sido depositada según el Tratado de Budapest en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 9 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4581,

- el vector que comprende la SEC ID n° 19 o la secuencia de nucleótidos clonada en la célula que ha sido depositada según el Tratado de Budapest en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 19 de agosto de 2010, con el número CNCM I-4357,

- un vector que comprende SEC ID n° 22 o la secuencia de nucleótidos clonada en la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, el 27 de octubre de 2010 con el número CNCM I-4381,

- un vector que comprende SEC ID n° 21 o la secuencia de nucleótidos clonada en la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismos (CNCM), Institut Pasteur, el 27 de octubre de 2010 con el número CNCM I-4382,

- el vector de SEC ID n° 9 o la secuencia de nucleótidos clonada en la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismos (CNCM), Institut Pasteur, el 29 de septiembre de 2010 con el número CNCM I-4368, y

- un vector que comprende la SEC ID n° 20 la secuencia de nucleótidos clonada en la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismos (CNCM), Institut Pasteur, el 29 de septiembre de 2010 con el número CNCM I-4369,

- el vector de la SEC ID n°71,

- un vector que comprende la SEC ID n° 57 o n° 72 o n° 74 (en el que la proteína de interés es IFNa), SEC ID n° 77, n° 79 o n° 81 (en el caso de que la proteína de interés sea el antígeno del cáncer SSX2), SEC ID n° 55 (en el caso de que la proteína de interés sea granzima M), SEC ID n° 89 (en el caso de que la proteína de interés sea FasL), SEC ID n° 84 o n° 86 (en el caso de que la proteína de interés sea el antígeno del cáncer NERCMSL) o SEC ID n° 92 (en el caso de que la proteína de interés sea la contactina CNTN4) o SEC ID n° 96 (en el caso de que la proteína de interés sea hSULF-2ñTMD).

Dichas células S2 transfectadas establemente también pueden seleccionarse de entre el grupo que consiste en:

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 19 de agosto de 2010, con el número CNCM I-4357,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 27 de octubre de 2010, con el número CNCM I-4381,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 27 de octubre de 2010, con el número CNCM I-4382,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 29 de septiembre de 2010, con el número CNCM I-4368,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 29 de septiembre de 2010, con el número CNCM I-4369,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 5 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4565,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 5 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4566,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 5 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4567,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 5 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4568,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 5 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4569,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 5 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4570,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 5 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4571,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 5 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4572,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 8 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4576,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 8 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4577,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 8 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4578,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 8 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4579,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 8 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4580,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 9 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4582,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 9 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4583,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 9 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4584,

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 9 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4585, y

- la célula que ha sido depositada en el Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, el 9 de diciembre de 2011, con el número CNCM I-4586.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4357 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende el vector plasmídico de SEC ID n° 19 (pMT/BiP/SNAP-FVR.N/His^etiqueta), en el que FVR.N es el antígeno N del virus de la fiebre del valle del Rift (FVR) (ver Brehin et al., Virology 371:185, 2008).

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4381 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiPN5-His^etiqueta en el que la SEC ID n° 22 (SNAP/WN.EDIII) ha sido insertado después de la secuencia de BiP, en la que NO.EDIII es el dominio III de la glucoproteína E del virus del Nilo Occidental.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4382 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende el vector plasmídico pMT/V5-His^etiqueta en el que ha sido insertada la SEC ID n° 21 (BiP/SNAP/IFNa1). IFNa1 es el interferón alfa 1 humano de SEC ID n° 32 (Mokkim et al., Protein expression purif.

63:140, 2009).

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4369 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiPN5-His^etiqueta en el que la SEC ID n° 20 (NO.sE/SNAP/His^etiqueta), en el que NO.sE es la forma soluble de la proteína de cubierta E del virus del Nilo Occidental.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4369 es la línea celular S2 estable de macrófagos que comprende un vector plasmídico pMT/BiPN5-His^etiqueta que contiene SEC ID n° 20 (NO.sE/SNAP/His^etiqueta), en el que NO.sE es la forma soluble de la proteína de cubierta E del virus del Nilo Occidental.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4565 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+DVI.EDIII/His^etiqueta en el que DV1.EDIII codifica la proteína EDIII del virus Dengue 1 y presenta la secuencia SEC ID n° 27.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4566 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+DV2.EDNI/His^etiqueta en el que DV2.EDIII codifica la proteína EDIII del virus Dengue 2 y presenta la secuencia SEC ID n° 28.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4567 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+DV3.EDIII/His^etiqueta en el que DV3.EDIII codifica la proteína EDIII del virus Dengue 3 y presenta la secuencia SEC ID n° 29.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4568 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+DV4.EDIII/His^etiqueta en el que DV4.EDIII codifica la proteína EDIII del virus Dengue 4 y presenta la secuencia SEC ID n° 30.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4569 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+YF.EDIII/His^etiqueta en el que YF.EDIII codifica la proteína EDIII del virus de la fiebre amarilla y presenta la secuencia SEC ID n° 31.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4570 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+JE.EDIII/His^etiqueta en el que JE.EDIII codifica la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa y presenta la secuencia SEC ID n° 25.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4571 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+USU.EDIII/His^etiqueta en el que USU.EDIII codifica la proteína EDIII del virus Usutu y presenta la secuencia SEC ID n° 24.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4572 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+TBE.EDIII/His^etiqueta en el que TBE.EDIII codifica la proteína EDIII del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y presenta la secuencia SEC ID n° 26. La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4576 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+MVE.EDIII/His^etiqueta en el que EVM.EDIII codifica la proteína EDIII del virus de la encefalitis del valle de Murray.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4577 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+Rocio.EDIII/His^etiqueta en el que Rocio.EDIII codifica la proteína EDIII del virus Rocio.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4578 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+SLE.EDIII/His^etiqueta en el que ESL.EDIII codifica la proteína EDIII del virus de la encefalitis de Saint Louis.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4579 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+WSL.EDIII/His^etiqueta en el que WSL.EDIII codifica la proteína EDIII del virus Wesselbron.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4580 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+Zika.EDIII/His^etiqueta en el que Zika.EDIII codifica la proteína EDIII del virus Zika.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4583 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+SSX2/His^etiqueta en el que SSX2 es de SEC ID n° 76.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4584 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+NERCMSL/His^etiqueta en el que NERCMSL es de SEC ID n° 83.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4585 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/SNAP+GrM/His^etiqueta en el que GrM es de SEC ID n° 54.

La célula recombinante depositada con el número CNCM I-4586 es la línea celular S2 estable de macrófagos de Drosophila que comprende un vector plasmídico pMT/BiP/ProTEV/His^etiqueta en el que proTEV es de SEC ID n° 52.

La presente solicitud divulga asimismo una célula hospedadora recombinante de vertebrado que se encuentra establemente transfectada con el presente vector de expresión.

Preferentemente, dicha célula recombinante de vertebrado es una célula de mamífero, preferentemente una célula CHO, YB2/O, COS, HEK, NIH3T3, HeLa o derivados de las mismas. Más preferentemente, en este caso, el vector de la expresión divulgado comprende la SEC ID n° 57 o n° 72 o n° 74 (en el caso de que la proteína de interés sea IFNa), SEC ID n° 77, n° 79 o n° 81 (en el caso de que la proteína de interés sea el antígeno del cáncer SSX2), SEC ID n° 55 (en el caso de que la proteína de interés sea granzima M), SEC ID n° 89 (en el caso de que la proteína de interés sea FasL), SEC ⁱD n° 84 o n° 86 (en el caso de que la proteína de interés sea el antígeno del cáncer NERCMSL) o SEC ID n° 92 (en el caso de que la proteína de interés sea la contactina CNTN4) o SEC ID n° 96 (en el caso de que la proteína de interés sea hSULF-2^ñTMD).

La presente solicitud divulga un método de incremento de la expresión de la proteína o proteínas recombinantes que comprende coexpresar dicha proteína o proteínas con una señal de secreción peptídica, conjuntamente con el enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico del mismo. Dicha coexpresión se lleva a cabo preferentemente en células de no vertebrado y, más preferentemente, células de insecto.

Más preferentemente, en dicho método, el enzima MGMT es la proteína de SEC ID n° 4 o un homólogo de la misma, por ejemplo la proteína SNAP de SEC ID n° 2 o un homólogo de la misma.

En el contexto de la presente solicitud, la expresión "que potencia la expresión" de una proteína heteróloga se refiere a que la expresión de dicha proteína en el sobrenadante de las células recombinantes o dentro de las células mismas mejora en un factor de por lo menos 2 veces, preferentemente de 5 veces, más preferentemente de 10 veces, y todavía más preferentemente de 20 veces, en comparación con la expresión y/o la secreción de dicha proteína obtenida con un vector recombinante de la técnica anterior, es decir, que no coexpresa la proteína con una proteína MGMT o una proteína SNAP. En una forma de realización preferida, la expresión "que potencia la expresión" se refiere a que resulta posible recuperar del sobrenadante de las células hospedadoras que han sido transfectadas con un vector por lo menos 40 mg/l, preferentemente por lo menos 50 mg/l, más preferentemente por lo menos 60 mg/l de una proteína de interés.

El término "coexpresantes" se refiere a que las secuencias de ADN codificantes de i) la proteína recombinante, ii) el enzima MGMT, o mutante o dominio catalítico del mismo, e iii) la señal de secreción peptídica, se encuentran operablemente ligadas y reguladas por la misma secuencia de control de la expresión (es decir, secuencias de control transcripcional y traduccional). La traducción de las secuencias de ADN codificantes de la señal de secreción peptídica, la proteína heteróloga de interés y el enzima MGMT conduce por lo tanto a la formación de un polipéptido de fusión, en el que las proteínas pueden separarse con una secuencia espaciadora y/o un sitio de corte de enzima tal como se ha definido anteriormente.

La "señal de secreción peptídica" de dicho polipéptido de fusión es una señal de secreción que preferentemente es funcional en células no de vertebrado o en células de vertebrado, o ambas, y más preferentemente en células de insecto, todavía más preferentemente en células S2 de Drosophila.

Son ejemplos de señales de secreción peptídica que son funcionales en las células de insecto: ssBiP de insecto de SEC iD n° 48, la señal de tipo BiP de SEC ID n° 51 y cualquier señal peptídica presente en un arbovirus, por ejemplo la proteína E de cubierta del virus del Nilo Occidental (SEC ID n° 15).

Un ejemplo de una señal de secreción peptídica que es funcional en células tanto de vertebrado como de no vertebrado es la señal de tipo BiP de SEC ID n° 51.

La presente solicitud divulga un método para mejorar la producción de una proteína recombinante de interés o para producir las proteínas recombinantes en cultivo celular, comprendiendo la utilización del vector tal como se ha indicado anteriormente, o las células hospedadoras recombinantes tal como se ha indicado anteriormente.

Más exactamente, dicho método para mejorar la producción de una proteína recombinante de interés o para producir proteínas recombinantes en cultivo celular comprende las etapas de:

a) proporcionar un vector de expresión de nucleótidos, codificante de dicha proteína de interés, b) introducir dicho vector de expresión en células hospedadoras, preferentemente células de no vertebrado o de vertebrado,

c) proporcionar la expresión del nucleótido introducido en dichas células hospedadoras para producir dicha proteína recombinante de interés.

Preferentemente, dichas células hospedadoras de no vertebrado son células de insecto, por ejemplo células S2 de Drosophila.

Preferentemente, dichas células hospedadoras de vertebrado son células de mamífero, por ejemplo células CHO, YB2/O, COS, HEK, NIH3T3, HeLa o derivados de las mismas.

Mediante la utilización de dicho método se expresa la proteína recombinante de interés a razón de por lo menos 40 mg/ml del sobrenadante de cultivo celular recuperado o superior.

La utilización de la línea celular S2 de Drosophila que secreta el producto génico directamente al medio es una forma de realización preferida (la secreción directa al medio permite la utilización de un sistema de purificación eficiente en una etapa).

La presente solicitud divulga la utilización del enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT) (EC 2.1.1.63), mutante o dominio catalítico del mismo, para potenciar el nivel de producción de una o más proteínas recombinantes, preferentemente en células hospedadoras de no vertebrado y/o de vertebrado, más preferentemente en células de insecto o células de mamífero, infectadas con vectores replicativos o defectuosos. El enzima MGMT puede ser la MGMT humano (de referencia NP_8002403.2) de secuencia SEC ID n° 4, la MGMT de ratón identificada como NP_032624.1 (SEC ID n° 45), la MGMT de rata identificada como NP_036993.1 (SEC ID n° 46), una secuencia homóloga de la misma, o subfragmentos de la misma.

Preferentemente, el enzima MGMT mutante es la proteína SNAP de SEC ID n° 2 o es homóloga de la misma, es decir, es por lo menos idéntica a un nivel superior al 80%, preferentemente 85%, más preferentemente 90% respecto a la proteína SNAP de secuencia SEC ID n° 2.

Dichas células hospedadoras de no vertebrado preferentemente son células de insecto, por ejemplo células S2 de Drosophila.

Preferentemente, la presente solicitud divulga la utilización del enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT) (EC 2.1.1.63), mutante o dominio catalítico del mismo, para potenciar el nivel de producción de una o más proteínas recombinantes en células de vertebrado, por ejemplo en células de mamífero, infectadas con vectores replicativos o defectuosos.

Dichas células de vertebrado preferentemente son células EBX, CHO, YB2/0, COS, HEK, NIH3T3 o derivados de las mismas.

Además, la presente solicitud divulga la utilización de una secuencia de ADN codificante de un enzima MGMT, mutante o dominio catalítico del mismo, para mejorar el nivel de producción de una o más proteínas de interés en células recombinantes.

La presente solicitud divulga la utilización de una secuencia de ADN codificante de un enzima MGMT, mutante o dominio catalítico del mismo, para i) estabilizar una o más proteínas recombinantes de interés in vitro e in vivo, y, de esta manera, ii) potenciar el periodo de vida in vitro e in vivo.

Dicha secuencia de ADN es, por ejemplo, la secuencia del gen de MGMT humano NM_002412.3, gen ID 4255 (SEC ID n° 3) o cualquier secuencia homóloga de la misma codificante de un enzima MGMT funcional, un mutante o un dominio catalítico del mismo (preferentemente SEC ID n° 1, SEC ID n° 47, SEC ID n° 67 o SEC ID n° 68). En particular, la presente solicitud divulga la utilización del enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT, EC 2.1.1.63), mutantes o dominio catalítico del mismo como polipéptido protector fusionado o unido a proteínas recombinantes para mejorar la semivida de la proteína recombinante en medio de almacenamiento, en plasma o en tampón, para mejorar la semivida de la proteína recombinante utilizada como medicamento o vacuna. Este enzima puede ser utilizado particularmente para mejorar la semivida de la proteína recombinante utilizada en kits diagnósticos.

En el contexto de la presente solicitud, la expresión "mejorar el nivel de producción" o "potenciar el nivel de producción" de una proteína heteróloga se refiere a que la expresión de dicha proteína en el sobrenadante de dichas células o dentro de las células mejora en un factor de por lo menos 2 veces, preferentemente de 5 veces, más preferentemente de 10 veces, y todavía más preferentemente de 20 veces, en comparación con la expresión y/o la secreción de dicha proteína obtenida con un vector recombinante de la técnica anterior, es decir, que no comprende el presente vector. En una forma de realización preferida, la expresión "que mejora la producción" se refiere a que resulta posible recuperar del sobrenadante de las células hospedadoras que han sido transfectadas con el presente vector por lo menos 40 mg/l, preferentemente por lo menos 50 mg/l, más preferentemente por lo menos 60 mg/l de una proteína de interés.

En una forma de realización preferida, dicha proteína recombinante se selecciona de entre: insulina, IFN, SSX2, granzima M, FasL, mesotelina (NERMCSL), endosulfatasa (hSUFL) o contactinas.

En una forma de realización particular, la presente solicitud divulga un método para la producción de una proteína recombinante de interés, comprendiendo el método las etapas de:

(a) obtener una secuencia de ADN heterólogo codificante de una proteína recombinante de interés,

(b) insertar dicha secuencia de ADN heterólogo en un vector de expresión de nucleótidos, presentando dicho vector, por ejemplo, la secuencia de ADN SEC ID n° 9, SEC ID n° 10, SEC ID n° 64 o s Ec ID n° 71,

(c) transfectar una célula hospedadora (preferentemente una célula de insecto o una célula de mamífero) con el polinucleótido obtenido en la etapa (b),

(d) proporcionar la expresión de dicho polinucleótido obtenido en la etapa (c) para producir la proteína de interés,

(e) opcionalmente, cortar el polipéptido MGMT,

(f) recuperar la proteína de interés,

(g) opcionalmente, recuperar la proteína de interés.

Para llevar a cabo las diferentes etapas de dicho método pueden utilizarse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y de ADN recombinante comprendidas dentro de conocimiento del experto en la materia. Dichas técnicas se explican en detalle en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fitsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (en la presente memoria, "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. E. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 1984; F. M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., 1994.

El término "transfección" se refiere a la introducción de un ácido nucleico foráneo en una célula hospedadora eucariótica de manera que la célula hospedadora exprese el gen o secuencia introducido para producir una sustancia deseada, en la presente memoria una proteína codificada por el gen o secuencia introducido. Una célula hospedadora que recibe y expresa el ADN o ARN introducido ha sido "transfectada" y es un "transfectante" o un "clon". El ADN o ARN introducido en una célula hospedadora puede proceder de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula o células hospedadoras de un género o especie diferente.

La transfección de las células hospedadoras con los polinucleótidos puede llevarse a cabo mediante un método clásico de la técnica, por ejemplo mediante transfección, infección o electroporación. En otra forma de realización, el vector puede introducirse in vivo mediante lipofección (en forma de ADN desnudo) o con otros agentes facilitadores de la transfección (péptidos, polímeros, etc.). Los lípidos catiónicos sintéticos pueden utilizarse para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen codificante de un marcador (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417, 1987). Los compuestos y composiciones lipídicos útiles para la transferencia de ácidos nucleicos se describen en los documentos n° WO 95/18863 y n° W o 96/17823 y en la patente US n° 5.459.127. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas con el propósito de la administración dirigida (ver Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031, 1988). Los péptidos dirigidos, tales como hormonas o neurotransmisores, y proteínas tales como anticuerpos o las moléculas no peptídicas pueden acoplarse químicamente a liposomas. Otras moléculas también resultan útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como los oligopéptidos catiónicos (ver el documento n° WO 95/21931), péptidos derivados de proteínas de unión a ADN (ver el documento n° WO 96/25508) o polímeros catiónicos (ver el documento n° WO 95/21931). También resulta posible introducir el vector in vivo en forma de un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN desnudo para la terapia génica pueden introducirse en las células hospedadoras deseadas mediante métodos conocidos de la técnica, tales como la electroporación, la microinyección, la fusión celular, DEAE-dextrano, la precipitación con fosfato de calcio, la utilización de una pistola génica o la utilización de un transportador de vector de ADN (ver Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; Wu y Wu, J. Biol. Chem.

263:14621-14624, 1988; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:2726-2730, 1991).

La expresión "que proporciona la expresión" de un polinucleótido en la presente memoria se refiere a que el estímulo de las secuencias reguladoras presentes en el vector (por ejemplo el estímulo que activa el promotor inducible) y todos los componentes necesarios se encuentran presentes en cantidad suficiente para que se produzca la traducción del polinucleótido.

En caso necesario, el corte del polipéptido MGMT/SNAP de la proteína de fusión producido se obtiene mediante la adición de una proteasa que presenta un sitio de corte definido en el sobrenadante o en el interior de las células recombinantes. Por ejemplo, el corte del sitio de corte de enterocinasa DDDK/D se obtiene mediante la adición de un enzima enterocinasa al sobrenadante de las células recombinantes. Alternativamente, el polipéptido MGMT/SNAP puede mantenerse de manera que se incremente el periodo de vida de las proteínas recombinantes.

Además, el experto en la materia apreciará que puede detectarse una proteína o polipéptido expresado o secretado al medio de cultivo utilizado para mantener o cultivar las células hospedadoras presentes. El medio de cultivo puede separarse de las células hospedadoras mediante procedimientos conocidos, tales como la centrifugación o la filtración. A continuación, la proteína o polipéptido puede detectarse en el medio de cultivo sin células aprovechando las propiedades conocidas características de la proteína o polipéptido. Entre dichas propiedades pueden incluirse las propiedades inmunológicas, enzimáticas o físicas diferenciadas de la proteína o polipéptido. Por ejemplo, en el caso de que la proteína o polipéptido presente una actividad enzimática única, puede llevarse a cabo un ensayo para dicha actividad en el medio de cultivo utilizado por las células hospedadoras. Además, en el caso de que se encuentren disponibles anticuerpos reactivos con una proteína o polipéptido dado, dichos anticuerpos pueden ser utilizados para detectar la proteína o polipéptido en cualquier ensayo inmunológico conocido (por ejemplo tal como en Harlowe et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).

La recuperación de la proteína de interés está mediada por medios bien conocidos de la técnica, entre ellos, aunque sin limitación, la electroforesis preparativa de disco en gel, el enfoque isoeléctrico, la HPLC, la HPLC de fase inversa, la filtración en gel, el intercambio iónico y la cromatografía de repartición, la precipitación y la cromatografía de precipitación en concentración salina, la extracción y la distribución contracorriente, y similares. Debido a que resulta preferible producir la proteína de interés en un sistema recombinante unida a un marcaje, dicho marcaje facilita la recuperación del polipéptido a partir del lisado en bruto de la célula hospedadora mediante cromatografía en una matriz de fase sólida apropiada. Alternativamente, pueden utilizarse como reactivos de recuperación anticuerpos producidos contra la proteína o contra péptidos derivados de la misma.

Puede llevarse a cabo una etapa adicional (g) de purificación aunque resulta interesante que no resulta necesaria.

Un material purificado puede contener menos de aproximadamente 50%, preferentemente menos de aproximadamente 75% y todavía más preferentemente menos de aproximadamente 90% de los componentes celulares con los que se encontraba originalmente asociado. La expresión "sustancialmente puro" indica el grado más alto de pureza que puede conseguirse utilizando técnicas de purificación convencionales conocidas de la técnica.

En una forma de realización, los presentes métodos permiten obtener por lo menos 40 mg/l, preferentemente por lo menos 50 mg/l, más preferentemente por lo menos 60 mg/l de la proteína sustancialmente pura de interés en el sobrenadante de cultivo celular recuperado.

Las proteínas recombinantes de interés y las proteínas de fusión de la invención (es decir, las proteínas recombinantes acopladas con el polipéptido MGMT/SNAP, que son más estables que las proteínas recombinantes solas) pueden resultar útiles en una diversidad de productos. Por ejemplo, dichas proteínas recombinantes y/o de fusión pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas, por ejemplo para el tratamiento de infecciones víricas.

En una forma de realización preferida, dicha proteína recombinante se selecciona de entre: insulina, IFN, FasL, granzima M, SSX2, mesotelina (NERMCSL), endosulfatasa (hSUFL) o contactinas.

En otra forma de realización, la presente solicitud divulga unas partículas víricas infecciosas que comprenden los vectores de ácidos nucleicos anteriormente indicados: Típicamente, dichas partículas víricas se producen mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(a) introducir el presente vector vírico en una línea celular adecuada,

(b) cultivar dicha línea celular bajo condiciones adecuadas de manera que se permita la producción de dicha partícula vírica infecciosa,

(c) recuperar la partícula vírica infecciosa producida a partir del cultivo de dicha línea celular, y

(d) opcionalmente purificar dicha partícula vírica infecciosa recuperada.

En el caso de que el vector vírico sea defectuoso, las partículas infecciosas habitualmente se producen en una línea celular complementaria o mediante la utilización de un virus ayudante, que suministra in trans los genes víricos no funcionales. Por ejemplo, entre las líneas celulares adecuadas para complementar los vectores adenovíricos con deleción de E1 se incluyen las células 293, así como las células PER-C6. Las partículas víricas infecciosas pueden recuperarse a partir del sobrenadante de cultivo o de las células después de la lisis. Pueden purificarse adicionalmente según técnicas estándares (cromatografía, ultracentrifugación en un gradiente de cloruro de cesio tal como se indica en, por ejemplo, los documentos n° WO96/27677, n° WO98/00524, n° WO98/22588, n° WO98/26048, n° WO00/40702, n° EP 1016700 y n° WO00/50573).

De esta manera, la presente solicitud divulga asimismo composiciones farmacéuticas que comprenden el vector de expresión, las proteínas recombinantes, las proteínas de fusión, las células hospedadoras o las partículas víricas que se describen anteriormente, o cualquier combinación de los mismos. Dichas composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéutica del vector, partículas, células o proteínas obtenidas mediante el presente método mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable.

La composición puede administrarse sistemáticamente por vía parenteral, intravenosa o subcutánea. En el caso de que se administre sistemáticamente, la composición terapéutica se encuentra en forma de una solución de proteína libre de pirógenos parenteralmente aceptable. La preparación de dicha solución de proteína parenteralmente aceptable, considerando debidamente el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, se encuentra dentro de los conocimientos del experto en la materia.

El régimen de administración será determinado por el médico responsable a partir de la consideración de diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la condición, peso corporal y dieta del paciente, la gravedad de la infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. El portador farmacéutico y otros componentes de una composición farmacéutica son seleccionados por el experto en la materia.

Adicionalmente, las proteínas de fusión y recombinantes divulgadas pueden utilizarse como componentes de vacunas para la inoculación de sujetos humanos contra la infección vírica, por ejemplo. Estas proteínas pueden utilizarse solas o con otras proteínas recombinantes o agentes vacunales terapéuticos. Los componentes de dicha vacuna serán determinados por un experto en la materia.

La presente solicitud divulga además la utilización de las proteínas de fusión, los vectores de expresión, las partículas víricas infecciosas, las células hospedadoras o las composiciones farmacéuticas que se describen anteriormente para la preparación de un medicamento, en particular una vacuna.

La presente solicitud divulga un método para el tratamiento o la prevención de un organismo humano o animal, que comprende administrar en dicho organismo una cantidad terapéuticamente eficaz de las proteínas de fusión, los vectores de fusión, las partículas víricas infecciosas, las células hospedadoras o las composiciones que se describen anteriormente.

Finalmente, las proteínas, y especialmente la fusión de SNAP-proteína de interés, pueden resultar útiles como agentes diagnósticos para la detección de la presencia de cáncer, infección vírica o anticuerpos contra proteínas víricas en líquidos biológicos, tales como sangre, suero, saliva y similares. Estas proteínas también pueden utilizarse en métodos para identificar y/o aislar proteínas víricas en líquidos y tejidos biológicos. De esta manera, las proteínas pueden ser componentes en kits para llevar a cabo dichos métodos.

De esta manera, en un primer aspecto, la presente invención se refiere además a la utilización de proteínas recombinantes o proteínas recombinantes etiquetadas con MGMT o SNAP de microorganismos patógenos o no patógenos obtenidos mediante cualquier método descrito anteriormente para la identificación de la presencia de dichos microorganismos patógenos o no patógenos en una muestra biológica. En este aspecto, dicho microorganismo patógeno es un virus, y la proteína etiquetada con MGMT o SNAP es una proteína vírica, tal como EDIII de los virus Chikungunya, Dengue, de la encefalitis japonesa (EJ), de la encefalitis transmitida por garrapatas (ETG), de la fiebre amarilla (FA), Usutu (USU) o del Nilo Occidental, o la nucleoproteína N de los virus de la fiebre del valle del Rift o del virus Toscana.

En el contexto de la invención, dicha muestra biológica se refiere a una muestra de sangre, una muestra de orina o cualquier muestra biológica que posiblemente se encuentre infectada por virus.

En este aspecto, la proteína MGMT es el enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT, EC 2.1.1.63) o un homólogo del mismo, cuya secuencia presenta una identidad de por lo menos 70% con SEC ID n°: 4, o el mutante SNAP de SEC ID n°: 2 o un homólogo del mismo, cuya secuencia presenta una identidad de por lo menos 80% con SEC ID n°: 2.

En este aspecto, se utiliza un polipéptido de fusión que comprende una proteína vírica y dicha proteína MGMT como un agente de diagnóstico para la detección de una infección vírica en un líquido biológico de un paciente. Preferentemente, dicha proteína vírica es la proteína de EDIII a partir de los virus de chikungunya, dengue, encefalitis japonesa (JE), encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), fiebre amarilla (YF), Usutu (USU) o del Nilo Occidental, o la nucleoproteína N a partir de los virus de la fiebre del valle del Rift o Toscana.

Preferentemente, dicho líquido biológico es orina, sangre, suero o saliva.

La presente invención se refiere a un método de inmunoensayo de diagnóstico que utiliza dicho polipéptido de fusión y un líquido biológico de un paciente.

Preferentemente, en dicho método de inmunoensayo de diagnóstico, dicho polipéptido de fusión está acoplado a perlas.

Más preferentemente, en dicho método de inmunoensayo de diagnóstico, dicho polipéptido de fusión está acoplado a perlas que utilizan un sustrato de la proteína MGMT como un conector.

Este método de inmunoensayo de diagnóstico puede utilizarse de manera ventajosa para detectar rápida y simultáneamente anticuerpos en un líquido biológico, preferentemente orina, sangre, suero o saliva.

La presente solicitud se refiere asimismo a un kit de diagnóstico que contiene el polipéptido de fusión definido anteriormente, en el que dicha proteína vírica es una proteína de los virus de chikungunya, dengue, encefalitis japonesa (JE), encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), fiebre amarilla (YF), Usutu (USU), del Nilo Occidental, de la fiebre del valle del Rift o Toscana.

Este kit de diagnóstico puede utilizarse, para identificar una infección vírica en una muestra biológica de un paciente, tal como orina, sangre, suero o saliva.

Ejemplos

1. Construcción de uno o más plásmidos

1.1. Se utilizó el plásmido pMT/BiP/V5-His A. Contiene 3.642 nucleótidos y los elementos siguientes:

- promotor metalotioneína: bases 412 a 778

- Inicio de transcripción: base 778

- sitio de cebador directo MT: bases 814 a 831

- Secuencia de señal de BiP: bases 851 a 904 (SEC ID n° 11).

- Sitio de clonación múltiple: bases 906 a 999

- etiqueta epítopo V5: bases 1.003 a 1.044

- región polihistidina: bases 1.054 a 1.074

- sitio de cebador inverso BGH: bases 1.094 a 1.111

- señal de poliadenilación tardía del SV40: bases 1.267 a 1.272

- origen de pUC: bases 1.765 a 2.438 (cadena complementaria)

- promotor bla: bases 3.444 a 3.542 (cadena complementaria)

- ORF de gen de resistencia a la ampicilina (bla) bases 2.583 a 3.443 (cadena complementaria)

El vector pUC57 Amp también puede utilizarse para los fines de la presente solicitud. Dicho vector comprende: - el sitio de clonación única EcoRI

- el promotor metalotioneína,

- la región no codificante 5' del ARN genómico del virus del Nilo Occidental cepa IS-98-ST1,

- un codón de inicio de traducción (ATG),

- el péptido de señal de la proteína E de cubierta del virus del Nilo Occidental cepa IS-98-ST1 (SEC ID n° 15),

- La región no codificante 3' del ARN genómico del virus del Nilo Occidental cepa IS-98-ST1 en el que han sido eliminadas dos secuencias repetidas y el tallo-bucle del extremo 3',

- el motivo de señal poliA de SV40,

- un único sitio de clonación ApaI.

1.2. Clonación de SNAP

La amplificación del ADN codificante de la secuencia SEC ID n° 2 de la proteína SNAP se llevó a cabo en el molde pMT/BiP/CHIK.sE2+etiqueta SNAP mediante PCR utilizando el par de cebadores 5'-SNAP y 3'-MCS tal como se indica posteriormente.

Cebador 5'-SNAP: 5'-aaaaaagatctgacaaagactgcgaaatg-3' (SEC ID n° 7)

Cebador 3'-MCS: 5'-gaggagagggttagggataggcttacc-3' (SEC ID n° 8)

A continuación, se digirió el producto de PCR con BglII y NotI y se insertó entre los sitios únicos BglII (en el extremo 5' de MCS) y NotI (en el extremo 3' de MCS) del plásmido linearizado p/MT/BiP/V5-A en el sistema DES.

El plásmido resultante es el vector pMT/BiP/SNAP-Hisetiqueta de SEC ID n° 9, que comprende:

- la secuencia de BiPmc de insecto de SEC ID n° 11,

- la secuencia de ADN de SNAP de SEC ID n° 1,

- el sitio de corte de enterocinasa de SEC ID n° 12,

- un sitio de restricción EcoRV-Smal,

- el ADN codificante de una etiqueta His6 (SEC ID n° 14) situada cadena abajo del sitio de restricción, y - dos secuencias espaciadoras de ADN de SEC ID n° 13 situadas i) entre la secuencia de intensificador y el sitio de restricción EcoRV-Smal, e ii) entre el sitio de restricción EcoRV-Smal y el ADN codificante de una etiqueta His6.

También puede obtenerse un vector pMT/BiP/SNAP-Hisetiqueta a partir de un esqueleto de pUC57 y se obtiene un vector que presenta la secuencia SEC ID n° 10. Dicho vector comprende:

- el sitio de clonación única EcoRl

- promotor metalotioneína

- la región no codificante 5' del ARN genómico del virus del Nilo Occidental cepa IS-98-ST1,

- un codón de inicio de traducción,

- el péptido de señal de la proteína E de cubierta del virus del Nilo Occidental cepa IS-98-ST1 de SEC ID n° 15

- la secuencia de ADN de SNAP de SEC ID n° 47,

- sitios de clonación únicos EcoRVy Smal/Xmal para la inserción dentro del marco de la secuencia foránea, - el sitio de corte de enterocinasa de SEC ID n° 12, situado entre el ADN intensificador de SNAP y los sitios de clonación,

- un ADN codificante de una secuencia de etiqueta hexa-histidina (SEC ID n° 14),

- dos secuencias espaciadoras de ADN de SEC ID n° 13 situadas i) entre la secuencia de intensificador y el sitio de restricción EcoRV-SmaI, e ii) entre el sitio de restricción EcoRV-Smal y el ADN codificante de una etiqueta His6.

- dos codones de parada de traducción,

- La región no codificante 3' del ARN genómico del virus del Nilo Occidental cepa IS-98-ST1 en el que han sido delecionadas dos secuencias repetidas y el tallo-bucle del extremo 3',

- motivos de señal poliA de S40 y

- un único sitio de clonación Apal.

También puede obtenerse un vector pMT/tipo BiP/SNAP-Hisetiqueta a partir de un esqueleto de pUC57 en el que se ha insertado la SEC ID n° 59 (ver también la figura 8) entre los sitios únicos EcoRVe HindIII. Dicho vector presenta la secuencia SEC ID n° 64. Comprende:

- el sitio de clonación única EcoRI

- promotor metalotioneína

- la región no codificante 5' del ARN genómico del virus del Nilo Occidental cepa IS-98-ST1,

- un codón de inicio de traducción,

- El péptido de señal de la proteína E de cubierta del virus del Nilo Occidental cepa IS-98-ST1 de SEC ID n° 15,

- la secuencia de ADN de SNAP de SEC ID n° 47,

- sitios de clonación únicos BamHI, EcoRV, Apal y Xmal para la inserción en el marco de la secuencia foránea,

- dos sitios de corte de pro-TEV de SEC ID n° 52, situados entre el ADN intensificador de SNAP y la etiqueta de His,

- un ADN codificante de una secuencia de etiqueta hexa-histidina (SEC ID n° 14),

- dos secuencias espaciadoras de ADN de SEC ID n° 13 situadas i) entre la secuencia de intensificador y el sitio de restricción EcoRV-Smal, e ii) entre el sitio de restricción Apal y el ADN codificante de una etiqueta Hisa.

- dos codones de parada de traducción,

- La región no codificante 3' del ARN genómico del virus del Nilo Occidental cepa IS-98-ST1 en el que han sido eliminadas dos secuencias repetidas y el tallo-bucle del extremo 3',

- motivos de señal poliA de S40 y

- Sitio de clonación único ApaI.

1.3. Clonación de un gen de interés

1.3.1. Nucleoproteína N del virus de la fiebre del valle del Rift (FVR-N)

Se llevó a cabo la mutagénesis dirigida en un ADNc codificante de la secuencia proteica de FVR-N mediante PCR utilizando el par de cebadores 5'-N y 3'-N tal como se lista posteriormente.

Cebador 5'-N:

5'- aaaaaggcgcgccagggggtggcggatctgacaactatcaagagcttcgagtccagtttgctgctc- 3' (SEC ID n° 17)

Cebador 3'-N:

5'- aaaaaaccggtcaatgatgatgatgatgatgacttccaccgccggctgctgtcttgtaagcctgagcgg- 3' (SEC ID n° 18)

1.3.2. Proteína no vírica, por ejemplo IFNa1 o granzima M

También puede utilizarse la secuencia de la proteína IFNa1 humana de SEC ID n° 32.

También puede utilizarse la secuencia de la proteína granzima M humana de SEC ID n° 54. La granzima M es una serina proteasa de tipo quimiotripsina que corta preferentemente sus sustratos después de Met o Leu. Se expresa constitutivamente en células asesinas naturales efectoras innatas activadas. Esta proteasa también presenta propiedades antivíricas y antitumorales (van Domselaar R. et al, The Journal of Immunology, 2010; Hu D. et al., The Journal of Biological Chemistry, 2010).

1.4. Inserción de un gen codificante de proteína en el vector pMT/BiP/SNAP-Hisetiqueta o pMT/tipo BiP/SNAP-Hisetiqueta, de manera que se obtiene el vector pMT/BiP/PROTEÍNA SNAP-Hisetiqueta o el vector pMT/tipo BiP/PROTEÍNA SNAP-Hisetiqueta

1.4.1. FVR.N

Los productos de PCR obtenidos en el punto 1.3.1 se digirieron con BssHIl y AGel y se insertaron entre los sitios únicos BssHII (en el extremo 3' del gen SNAP) y Agel (en el extremo 3' del MCS del vector lanzadera) del plásmido linearizado pMT/BiP/SNAP-Hisetiqueta obtenido en el punto 1.2.

El plásmido resultante es, por ejemplo, pMT/BiP/SNAP-FVR.N/Hisetiqueta (SEC ID n° 19).

1.4.2. Proteínas ED INI de diferentes flavivirus

Para potenciar la especificidad de los ensayos ELISA o de inmunotransferencia basados en antígenos flavivíricos recombinantes, el dominio antigénico III de la proteína E (ED III) aparentemente es un enfoque prometedor (Ludolfs et al., 2007). La producción de EDIII recombinante de los virus del Nilo Occidental (NO), Usutu (USU), de la encefalitis japonesa (EJ), de la encefalitis transmitida por garrapatas (ETG), dengue serotipos 1 a 4 (DEN-1, -2, -3 y -4) y de la fiebre amarilla (FA) han sido sometida a ensayo con el método divulgado.

Los virus NO, USU y EJ pertenecen al serocomplejo EJ. El sistema de expresión inducible de S2 de Drosophila (DES, Invitrogen) se ha seleccionado para la producción en masa de EDIII individual de flavivirus en células no de vertebrado. Los genes sintéticos codificantes del dominio III de longitud completa de las proteína E de los flavivirus NO, USU, EJ, ETG, DEN-1 a DEN-4 y FA se listan en SEC ID n° 23 a SEC ID n° 31. Las secuencias de ED III se fusionaron dentro del marco con el extremo C-terminal de la proteína SNAP en el plásmido pMT/BiP/SNAP-Hisetiqueta obtenido en 1.2 para generar las proteínas de fusión SNAP-EDIII.

1.4.3. IFNa

Se obtuvieron los plásmidos pMT/BiP/SNAP-IFN-Hisetiqueta (ver la figura 4) y pMT/tipo BiP/SNAP-IFN-Hisetiqueta (ver datos en la figura 8).

1.4.4. Granzima M

Se obtuvo el plásmido pMT/BiP/SNAP-GrM-Hisetiqueta (ver datos en la figura 6).

2. Transfección en células hospedadoras

2.1. Transfección en células S2

Los plásmidos resultantes pMT/BiP/PROTEÍNA SNAP-Hisetiqueta que permiten la producción de proteínas etiquetadas con SNAP como proteínas de fusión secretadas terminadas en Hisetiqueta se cotransfectaron con el marcador de selección pCo-Blast en células S2 para generar la línea celular estable S2/sPROTEÍNA-SNAP-Hisetiqueta que mostraba resistencia a la ampicilina.

Las líneas celulares S2 estables cultivadas en matraz de agitación (1.000 ml) se estimularon durante 10 días con metal pesado cadmio (Cd2+) y las proteínas del medio extracelular se concentraron y se purificaron.

Se observó la acumulación de proteína etiquetada con SNAP secretada en los sobrenadantes de células S2/sPROTEÍNA-SNAP-Hisetiqueta tras 10 días de inducción con metal pesado cadmio.

Los ensayos de inmunotransferencia permitieron detectar las proteínas etiquetadas con SNAP extracelulares utilizando anticuerpo sérico de cabra anti-Hisetiqueta (ver las figuras 2B, 3B, 4B y 6C).

2.2. Transfección en células HeLa

Se transfectó el plásmido pMT/tipo BiP/SNAP-IFN-Hisetiqueta en células HeLa.

Los ensayos de inmunotransferencia permiten detectar IFN extracelular etiquetado con SNAP utilizando anticuerpos anti-SNAP (ver la figura 7B).

3. Purificación de proteínas recombinantes

Se purificaron proteínas etiquetadas con His extracelular y etiquetadas con SNAP utilizando resina quelante de metales y el método de HPLC.

3.1. FVR-N y TOS-N

FVR-N

En colaboración con Plate-Forme 5 Production de Protéines recombinantes et d'Anticorps (Institut Pasteur), se han obtenido hasta 97 mg de proteína FVR-N etiquetada con SNAP altamente purificada a partir de 2 litros de sobrenadantes de células S2/sSNAP-FVRV.N-Hisetiqueta 10 días después de la estimulación con Cd2+.

TOS-N

En colaboración con Plate-Forme 5 Production de Protéines recombinantes et d'Anticorps (Institut Pasteur), se han obtenido hasta 41 mg de proteína FVR.N etiquetada con SNAP altamente purificada a partir de 2 litros de sobrenadantes de células S2/sSNAP-TOS.N-Hisetiqueta 10 días después de la estimulación con Cd2+.

Resumen de los niveles de producción:

3.2. IFNa1 soluble

Las proteínas IFNa1 solubles se liberaron de la etiqueta SNAP mediante el corte con el enzima enterocinasa (kit de Novagen).

3.3. Antígenos de diferentes flavivirus

Reservas de proteínas etiquetadas con SNAP secretadas utilizando el sistema de expresión de Drosophila

• EDIII : dominio antigénico III de proteínas E de flavivirus (Dengue [DEN], Nilo Occidental [NO], encefalitis japonesa [EJ], Usutu [USU], encefalitis transmitida por garrapatas [ETG], fiebre amarilla [FA], encefalitis del valle de Murray [EVM], Wesselbron [WSL], Rocio, Zika)

• ectoM : ectodominio de la proteína M del virus Dengue de tipo 1

• Gen N de FVR: nucleoproteína N del virus de la fiebre del valle del Rift (antígeno vírico mayor)

• Gen N de TOS: nucleoproteína N del virus Toscana (antígeno vírico mayor)

• sE de WN : forma soluble de la proteína E de cubierta del virus del Nilo Occidental

• sE2 de CHIK: forma soluble de la proteína E2 de cubierta del virus Chikungunya

• SNAP-IFNAI: interferón-alfa 1 en fusión con SNAP.

3.4. Producción de granzima M

Se recuperaron 10 mg de proteína SNAP-GrM por cada litro de sobrenadante de cultivo en 7 días.

Tras las etapas de purificación, se detectaron tres formas de SNAP-GrM (ver la figura 6C), que correspondían al corte de la proteína SNAP por el enzima GrM acoplado.

Lo anterior significa claramente que la proteasa humana se encuentra activa tras su producción mediante el método divulgado (ver posteriormente).

4. Control de las proteínas etiquetadas con SNAP

Los ensayos de inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos (que reconocían la proteína de interés y/o el marcaje de etiqueta histidina) detectaron una producción sustancial de proteínas extracelulares etiquetadas con SNAP:

el ensayo de inmunotransferencia detectó proteína extracelular FVR.N etiquetada con SNAP utilizando anticuerpo sérico de cabra anti-Hisetiqueta (figura 2B). Los sueros inmunológicos humano y de ratón contra FVR.N reconocen específicamente proteína FVR.N recombinante etiquetada con SNAP.

Los ensayos de inmunotransferencia no mostraron reactividad cruzada entre ED III de NO y USU recombinantes utilizando sueros policlonales de ratón específicos a pesar del elevado nivel de similitud de las secuencias. De esta manera, la proteína SNAP-EDIII soluble secretada de los virus NO, EJ y USU resultan adecuados como antígenos víricos recombinantes para el diagnóstico específico de miembros del serocomplejo EJ ya que el virus USU y, en menor medida, los virus EJ han sido identificados recientemente como arbovirus potencialmente emergentes en Europa.

5. Actividad de las proteínas recombinantes etiquetadas con SNAP

• La proteína SNAP-IFNal recombinante soluble secretada a partir de células S2/SNAP-IFNaI inducidas muestra un potente efecto antivírico contra CHIKV.

Se recolectaron sobrenadantes (5 ml) de células S2/SNAP-IFNaI (5x106 células/ml) estimuladas con Cd2+ diez días después de la inducción. Se observó acumulación de la proteína SNAP-IFNal soluble en el sobrenadante celular mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpo anti-Hisetiqueta (ver posteriormente). Se evaluó la actividad antivírica de SNAP-IFNaI en células HeLa infectadas por virus Chikungunya que expresaba el gen luciferasa (Luc). Se determinó la actividad de Luc 6 h después de la infección. Se utilizó IFN alfaconl (Infergen) como un ensayo interno al conocer su potente efecto antivírico contra CHIKV en células HeLa. El sobrenadante de células S2/SNAP-Tos.N (la proteína N del virus Toscana) estimuladas con Cd2+ sirvió de control negativo. El gráfico ilustrado en la figura 4C demuestra que 1 j l de SNAP-IFNaI secretado o 0,1 |jg de Infergen podrían suprimir la replicación del CHIKV en el interior de las células hospedadoras infectadas. En el gráfico se muestra un efecto dependiente de la dosis de SNAP-IFNa. Todavía se observó un veinte por ciento de actividad de Luc con 0,1 j l de SNAP-IFNaI soluble o 0,01 jg de Infergen. No se observó ningún efecto antivírico utilizando SNAP-TOS-N a la dosis más alta sometida a ensayo.

• El granzima M es activo tras ser producido en el sobrenadante de las células S2

Tal como se ha indicado anteriormente, se han detectado tres formas de SNAP-GrM en el sobrenadante de las células S2 transfectadas con el vector pMT/BiP/SNAP-GrM-Hisetiqueta (ver la figura 6C).

Dichas tres formas corresponden al corte de la proteína SNAP por el enzima GrM acoplado. SNAP en efecto contiene tres sitios potenciales de corte de GrM (ver la figura 6B). Los inmunoensayos con anticuerpos anti-His o anti-SNAP han revelado que dichas tres formas en efecto son fragmentos de la proteína de fusión secretada SNAP-GrM.

La forma más pequeña (35 kDa) corresponde a GrM, que ha sido delecionada con la mayor parte de SNAP durante el procedimiento de purificación.

Estos resultados demuestran claramente que la proteasa GrM que ha sido producida por el sistema divulgado se encuentra activo, aunque acoplado con la proteína SNAP.

Lo anterior resulta realmente interesante debido a que es conocido que las proteasas humanas activas resultan muy difíciles de producir recombinantemente.

• hSULF-2ñTMD se encuentra activa tras ser producida en el sobrenadante de las células HEK 293. hSULF-2ñTMD fue expresado y purificado a partir de células HEK-293 transfectadas con un plásmido recombinante pcDNA3/De SNAPuniv-hSULF-2ñTMD (ver la figura 13A).

La actividad enzimática del polipéptido hSULF-2ñTMD obtenido en el sobrenadante se evaluó de la manera siguiente:

se transfectaron transitoriamente células HEK 293 con pcDNA3/DeSNAP-hSULF2ATMDs. Tras dos días, se incubó una alícuota del sobrenadante celular con el pseudosustrato no fluorescente 4-metil-umbeliferona (4-MUS) a una concentración de 20 mM en Tris 50 mM, pH 7,5, con MgC1220 mM, y se incubó (1:1, v/v) con el enzima (en medio condicionado) durante 2 a 4 horas a 37°C en una placa de 96 pocillos. Se detuvo la reacción enzimática mediante la adición (1:1 v/v) de NaHCO3/Na2CO3 1,5 M, pH 10,5 y se monitorizó la generación del producto fluorescente 4-metil-umbeliferona mediante fluorimetría (excitación: 360 nm). Se midieron los valores de la actividad de SULF en el sobrenadante celular a partir de la densidad óptica (DO) a 460 nm.

Resulta interesante que la proteína secretada (acoplada a SNAP?) se encuentra activa, tal como se muestra en la figura 13B.

6. Estabilidad de las proteínas recombinantes etiquetadas con SNAP

Inesperadamente se ha observado que las proteínas de fusión que comprenden el péptido SNAP son mucho más estables in vitro que en su ausencia.

Se incubaron las proteínas CHIK.sE2-SNAP, SNAP-WN.EDIII y SNAP-IFNAI altamente purificadas a las concentraciones no saturantes de 0,1 mg/ml (vol.: 0,1 ml) en PBS estéril durante 4 días a -80°C, a 4°C, a 25°C o a 37°C, o durante dos meses a la misma temperatura.

Se separaron muestras de proteína (1 |jg) en SDS-PAGE al 4-12% y se visualizaron con pigmento azul brillante de Coomassie G-250 utilizando la solución de tinción de proteínas PageBlue (Fermentas).

Las figuras 10A y B dan a conocer los resultados obtenidos mediante la comparación de la estabilidad de tres proteínas de fusión diferentes in vitro.

Resulta importante que todas las proteínas de fusión aparentemente se encontraban intactas tras dos meses a 4°C y también tras cuatro días de incubación a temperatura ambiente (25°C) o a 37°C.

En particular, IFN no resulta afectado tras 4 días a la temperatura corporal (37°C) y todavía se observa tras dos meses a 37°C, de manera que la estabilidad in vivo es probable que resulte altamente incrementada mediante su acoplamiento con SNAP.

7. Detección in vitro de SNAP-FVR.N producido por células S2

Se utilizaron proteínas de fusión SNAP-FVR.N que habían sido producidas siguiendo los protocolos anteriormente indicados como herramienta diagnóstica para la detección de anticuerpos anti-FVR.N en el suero de ovinos infectados.

Dichas proteínas de fusión se sometieron a ensayo y se compararon con kits comerciales de detección (kit de detección de IgG de FVR de BDSL y FVR multiespecie de IdVet).

Los ensayos se llevaron a cabo con 46 sueros de oveja, estando las ovejas inmunizadas con vacunas de FVR. Se utilizaron las proteínas de fusión SNAP-FVR.N para recubrir directamente el fondo de los pocillos o se biotinilaron y se añadieron a pocillos con recubrimiento de estreptavidina.

Se detectaron anticuerpos anti-FVR mediante el método de ELISA indirecto utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos directamente recubiertos con 0,2 |jg de antígeno SNAP-FVR.N recombinante altamente purificado en BS (concentración: 2 |jg de proteína/ml) durante la noche a 4°C. Tras la saturación, los sueros diluidos se incubaron con SNAP-FVR.N. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo de cabra anti-IgG conjugado con peroxidasa. Se llevó a cabo el ELISA con el sistema de sustrato de peroxidasa y se midió la densidad óptica (DO) a 450 nm. Los sueros de muestra se consideraron positivos en el caso de que la OD fuese el doble de la DO de los sueros no inmunológicos.

Resulta interesante que los resultados demuestran que las proteínas de fusión SNAP-FVR.N proporcionan la misma sensibilidad y especificidad que las proteínas comerciales al utilizarse para recubrir directamente los pocillos (no mostrado). Los resultados son menos reproducibles en el caso de que las proteínas se encuentren biotiniladas. Se obtuvieron los mismos resultados con sueros obtenidos de bovinos inmunizados naturalmente (datos no mostrados).

Estos resultados demuestran que las proteínas de fusión de la invención pueden ser utilizadas como herramientas diagnósticas para la identificación de infecciones víricas o bacterianas en muestras biológicas.

8. Inmunoensayo basado en perlas multiplex

En el contexto de la invención, se desarrolló un inmunoensayo basado en perlas multiplex para la detección rápida y simultánea de anticuerpos contra arbovirus en líquidos biológicos.

El sistema se basa en la tecnología xMAP (Luminex Corporation) y utiliza una mezcla de microesferas recubiertas con antígenos como reactivos de captura para inmunoglobulinas humanas específicas. Se acoplaron grupos diferentes de microesferas (Magplex, Luminex Corporation) con proteínas de fusión de MGMT purificadas, es decir, las proteínas recombinantes víricas etiquetadas con SNAP indicadas en la sección 3.3: sSNAP-DVI.EDIII, sSNAP-DV2.EDIII, sSNAP-DV3.EDIII, sSNAP-DV4.EDIII, sSNAP-WN.EDIII, sSNAP-EJ.EDIII, sSNAP-USU.EDIII, sSNAP-ETG.EDIII, sSNAP-FA.EDIII, sSNAP-EVM.EDIII, sSNAP-Rocio.EDIII, sSNAP-WSL.EDIII, sSNAP-ZIKA.EDIII, SNAP-DVlectoM, sSNAP-N.FVR, sSNAP-N.TOS y CHIK.sE2-SNAP. Los antígenos recombinantes se acoplaron covalentemente con la superficie carboxilo de las microesferas utilizando un sustrato de la proteína MGMT como conector (BG-PEG-NH2, New England Biolabs), incrementando de esta manera la eficiencia de captura de los anticuerpos en comparación con los procedimientos estándares de acoplamiento de amina.

La validación técnica utilizando anticuerpos anti-etiqueta SNAP y anticuerpos monoclonales de ratón específicos confirmó la eficiencia de acoplamiento y demostró la estabilidad a largo plazo de los antígenos (hasta seis meses). La presente solicitud no se limitada a antígenos víricos, ya que puede utilizarse cualquier péptido o polipéptido para el recubrimiento de perlas y la posterior captura de anticuerpos.

Referencias bibliográficas

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Utilización in vitro de un polipéptido de fusión que comprende una proteína vírica y

i) el enzima 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT, EC 2.1.1.63) o un homólogo del mismo, cuya secuencia presenta una identidad de por lo menos 70% con SEC ID n°: 4, o

ii) el mutante SNAP de SEC ID n°: 2 o un homólogo del mismo, cuya secuencia presenta una identidad de por lo menos 80% con SEC ID n°: 2, como un agente de diagnóstico para la detección de una infección vírica en un líquido biológico de un paciente.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha proteína vírica es la proteína EDIII a partir de los virus de chikungunya, dengue, encefalitis japonesa (JE), encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), fiebre amarilla (YF), Usutu (USU) o del Nilo Occidental, o la nucleoproteína N a partir de los virus de la fiebre del valle del Rift o Toscana.

3. Utilización según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho líquido biológico es orina, sangre, suero o saliva.

4. Método de inmunoensayo de diagnóstico que utiliza el polipéptido de fusión como se define en las reivindicaciones 1 a 2 y un líquido biológico de un paciente.

5. Método de inmunoensayo de diagnóstico según la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido de fusión está acoplado a perlas.

6. Método de inmunoensayo de diagnóstico según la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido de fusión está acoplado a perlas que utilizan un sustrato de la proteína MGMT como un conector.

7. Método de inmunoensayo de diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para detectar rápida y simultáneamente anticuerpos en un líquido biológico.

8. Método de inmunoensayo de diagnóstico según la reivindicación 7, en el que dicho líquido biológico es orina, sangre, suero o saliva.

9. Kit de diagnóstico que contiene el polipéptido de fusión como se define en la reivindicación 1, en el que dicha proteína vírica es la proteína EDIII a partir de los virus de chikungunya, dengue, encefalitis japonesa (JE), encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), fiebre amarilla (YF), Usutu (USU) o del Nilo Occidental, o la nucleoproteína N a partir de los virus de la fiebre del valle del Rift o Toscana.

10. Utilización del kit de diagnóstico según la reivindicación 9, para identificar una infección vírica en una muestra biológica de un paciente.

11. Utilización según la reivindicación 10, en la que dicha muestra biológica es orina, sangre, suero o saliva.