ES2800983T3 - Materiales y métodos para conjugar un derivado de ácido graso soluble en agua con una proteína - Google Patents

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Abstract

Conjugado de un derivado de ácido graso soluble en agua y una proteína terapéutica, en el que el derivado de ácido graso soluble en agua comprende un ácido graso o éster de ácido graso unido a un ligador soluble en agua, y en el que el derivado de ácido graso soluble en agua se une de manera estable a la proteína terapéutica mediante una unión oxima formada entre un grupo aminooxilo en el ligador soluble en agua y un grupo aldehído de un hidrato de carbono oxidado en la proteína terapéutica.

Description

DESCRIPCIÓN
Materiales y métodos para conjugar un derivado de ácido graso soluble en agua con una proteína
Campo de la invención
La presente invención se refiere a materiales y métodos para conjugar un derivado de ácido graso soluble en agua con una proteína.
Antecedentes de la invención
Se han descrito una variedad moléculas y/o compuestos para conjugar con proteínas terapéuticas para aumentar la semivida de las proteínas terapéuticas conjugadas tras la administración a un paciente (Veronese FM y Mero A, BioDrugs 2008;22:315-29; Gregoriadis G et al., Int J Pharm 2005; 300:125-30; y Shechter Y et al.; International Journal of Peptide Research and Therapeutics 2007; vol. 13 :105-17).
Los ácidos grasos (FA, por sus siglas en inglés) pueden conjugarse con proteínas terapéuticas para formar derivados de acción más prolongada. Este principio para la prolongación de la semivida de proteínas o péptidos se basa en el hecho de que el FA puede unirse a albúmina sérica humana (HSA; también denominada sondas de unión a albúmina). La asociación de un FA con albúmina sérica humana en el torrente circulatorio puede conducir a una prolongación sustancial de la semivida de la proteína terapéutica ya que se reciclará junto con la albumina a través del receptor Fc neonatal. El FA y derivados del mismo (por ejemplo, ésteres metílicos correspondiente) ha mostrado propiedades de unión a albúmina similares (Spector AA, J Lipid Res 1975;16:165-79).
Un ejemplo destacado para este principio de acción prolongada es insulina detemir (Levemir®) de Novo Nordisk. En insulina detemir, el grupo carboxilo de un FA se acopla de manera covalente al grupo g-amino de un residuo de lisina de la proteína de insulina (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.866.538; US 6.011.007; y US 6.869.930). Otros grupos de investigación han descrito enfoques similares (Shechter Y et al., Bioconj Chem 2005;16:913-20; y Sasson K et al., J Control Release 2010;142:214-20). Por ejemplo, estos grupos describen un sistema FMOC liberable que contiene un éster de NHS activo para acoplar a grupos amino de proteínas. Sin embargo, la diferencia es que en este concepto el FA se une a la proteína a través de un grupo funcional en posición o convirtiéndose así en grupo carboxilo en intacto. Por tanto, pueden prepararse profármacos de acción prolongada que se unen a albúmina sérica humana, pero se disocian a lo largo del tiempo a medida que el sistema FMOC experimenta baja hidrólisis en condiciones fisiológicas (Sasson K et al., J Control Release 2010;142:214-20).
Además de los ácidos grasos, la preparación de conjugados formando una unión covalente entre el polímero soluble en agua y la proteína terapéutica puede llevarse a cabo por una variedad de métodos químicos. La pegilación de fármacos polipeptídicos los protege en la circulación y mejora sus perfiles farmacodinámicos y farmacocinéticos (Harris y Chess, Nat Rev Drug Discov. 2003;2:214-21). El procedimiento de pegilación une unidades de repetición de etilenglicol (polietilenglicol (PEG)) a un fármaco polipeptídico. Las moléculas de PEG tienen un gran volumen hidrodinámico (5-10 veces el tamaño de las proteínas globulares), son muy solubles en agua e hidratadas, no tóxicas, no inmunógenas y se someten a aclaramiento rápidamente del cuerpo. La pegilación de moléculas puede conducir a resistencia aumentada de los fármacos a la degradación enzimática, semivida aumentada in vivo, frecuencia de dosificación reducida, inmunogenicidad disminuida, estabilidad física y térmica aumentada, solubilidad aumentada, estabilidad en fase líquida aumentada y agregación reducida. Los primeros fármacos pegilados se aprobaron por la FDA a principios de la década de 1990. Desde entonces, la FDA ha aprobado varios fármacos pegilados para administración oral, inyectable y tópica.
El poli(ácido siálico) (PSA, por sus siglas en inglés), también denominado ácido colomínico (CA, por sus siglas en inglés), es un polisacárido que se produce de manera natural. Es un homopolímero del ácido N-acetilneuramínico con una unión cetosídica a (2 ^8 ) contiene grupos diol vecinos como su extremo no reductor. Está cargado negativamente y es un constituyente natural del cuerpo humano. Puede producirse fácilmente a partir de bacterias en grandes cantidades y con características físicas predeterminadas (patente estadounidense n.° 5.846.951). Ya que el PSA producido de manera bacteriana es química e inmunológicamente idéntico al PSA producido en el cuerpo humando, el PSA bacteriano no es inmunógeno, incluso cuando se acopla a proteínas. A diferencia de algunos polímeros, el ácido PSA es biodegradable. El acoplamiento covalente del ácido colomínico a la catalasa y asparaginasa ha demostrado aumentar la estabilidad enzimática en presencia de enzimas proteolíticas o plasma sanguíneo. Estudios comparativos in vivo con asparaginasa polisialilada y no modificada revelaron que la polisialilación aumentó la semivida de la enzima (Fernandes y Gregoriadis, Int J Pharm. 2001;217:215-24).
El acoplamiento de derivados de PEG a péptidos o proteínas fue revisado por Roberts et al. (Adv Drug Deliv Rev 2002; 54: 459-76). Un enfoque para acoplar polímeros solubles en agua a proteínas terapéuticas es la conjugación de los polímeros a través de los restos de hidratos de carbono de la proteína. Los grupos hidroxilo (OH) vecinos de hidratos de carbono en las proteínas pueden oxidarse fácilmente con peryodato de sodio (NaIO4 ) para formar grupos aldehído activos (Rothfus y Smith, J Biol Chem 1963; 238: 1402-10; van Lenten y Ashwell, J Biol Chem 1971; 246: 1889-94) Posteriormente, el polímero puede acoplarse a los grupos aldehído del hidrato de carbono mediante el uso de reactivos que contienen, por ejemplo, un grupo hidrazida activo (Wilchek M y Bayer EA, Methods Enzymol 1987; 138: 429-42). Una tecnología más reciente es el uso de reactivos que contienen grupos aminooxilo que reaccionan con aldehídos para formar uniones oxima (documentos WO 96/40662, WO2008/025856).
Ejemplos adicionales que describen la conjugación de un polímero soluble en agua con una proteína terapéutica se describen en el documento WO 06/071801 que enseña la oxidación de restos de hidratos de carbono en el factor de von Willebrand y el posterior acoplamiento al PEG usando química de hidrazida; la publicación de patente estadounidense n.° 2009/0076237 que enseña la oxidación de rFVIII y el posterior acoplamiento a PEG y otros polímeros solubles en agua (por ejemplo, PSA, HES, dextrano) usando química de hidrazida; el documento WO 2008/025856 que enseña la oxidación de diferentes factores de coagulación, por ejemplo, rFIX, FVIII y FVIIa y el acoplamiento posterior a, por ejemplo, PEG, usando química de aminooxilo formando una unión oxima; la patente estadounidense n.° 5.621.039 que enseña la oxidación de FIX y el posterior acoplamiento a PEG usando química de hidrazida.
El documento WO2005117984 A2 que se refiere a un compuesto de unión a albúmina que comprende un grupo espaciador, un grupo de unión en puente soluble en agua, una cadena de ácido graso y un grupo ácido, caracterizado porque el grupo ácido se une al extremo distal de la cadena de ácido graso; y el documento WO2006084319 A1 que se refiere a moléculas inmunógenas autoadyuvantes capaces de estimular una respuesta inmunitaria a los epítopos de un polipéptido independientemente del tipo de HLA de un sujeto.
A pesar de los materiales y métodos anteriores para la conjugación de proteínas, se desean nuevos materiales y métodos que, por ejemplo, permitan la manipulación y preparación de conjugados de proteínas estables. Aunque los ácidos grasos pueden proporcionar el beneficio de unirse a HSA, los ácidos grasos a menudo son difíciles de manipular en un entorno acuoso y pueden liberarse o eliminarse de su compañero de unión a proteínas a lo largo del tiempo.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona materiales y métodos para conjugar polímeros y derivados de ácido graso solubles en agua con proteínas lo que mejora las propiedades farmacodinámicas y/o farmacocinéticas de la proteína mientras que minimiza los costes asociados con los diversos reactivos y los riesgos para la salud a los pacientes receptores cuando la reacción de conjugación está catalizada por un catalizador nucleófilo. La presente invención proporciona materiales y métodos para conjugar derivados de ácido graso solubles en agua con proteínas en una disolución acuosa, produciendo así conjugados de proteínas estables en la que los derivados de ácidos grasos no se liberan a lo largo del tiempo.
En una realización de la presente invención, se proporciona un conjugado de un derivado de ácido graso soluble en agua y una proteína terapéutica, en la que el derivado de ácido graso soluble en agua comprende un ácido graso o éster de ácido graso unido a un ligador soluble en agua, y en la que el derivado de ácido graso se une de manera estable a la proteína terapéutica por una unión oxima formada entre un grupo aminooxilo en el ligador soluble en agua y un grupo aldehído de un hidrato de carbono oxidado en la proteína terapéutica. En otra realización, el conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica se une a albúmina sérica humana (HSA) in vitro o in vivo. En todavía otra realización, el conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica tiene una semivida aumentada en relación con una proteína terapéutica nativa. En aún otra realización, un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica mencionado anteriormente comprende un ácido graso saturado o ácido graso insaturado. En una realización relacionada, el ácido graso es un ácido graso saturado. En aún otra realización, el ácido graso es un ácido graso de cadena ramificada.
Se contemplan diversas longitudes de ácidos grasos en el conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica. En una realización, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica mencionado anteriormente en el que el ácido graso comprende una longitud de cadena entre C10 y C24, incluyendo ácidos grasos sintéticos con números impares de carbonos. En una realización, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica mencionado anteriormente en el que el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en: C10, C12, C14, C16, C18, C20, C20, C22 y C24. En otra realización, el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C14, C16 y C18. En todavía otra, el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C13, C15 y C17.
En todavía otra realización, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica mencionado anteriormente en el que el ácido graso se une al ligador soluble en agua en un grupo en el ácido graso seleccionado del grupo que consiste en: grupo carboxilo terminal y grupo o. En otra realización, el ácido graso se une al ligador soluble en agua en el grupo o En todavía otra realización, el grupo o se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, amino, tio y carboxilo.
En una realización de la presente invención, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica mencionado anteriormente en el que el ácido graso es ácido 16-hidroxihexadecanoico.
En otra realización, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica en el que el éster de ácido graso se selecciona del grupo que consiste en: éster metílico y éster etílico. En una realización, el éster de ácido graso es éster metílico del ácido 16-hidroxihexadecanoico.
Se contemplan diversos ligadores solubles en agua en la presente invención. En una realización, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica mencionado anteriormente en el que el ligador soluble en agua comprende un polímero soluble en agua y al menos un grupo funcional unido a la proteína terapéutica.
El grupo funcional es un grupo aminooxilo.
Se contemplan numerosos polímeros solubles en agua en la presente invención. En una realización, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica mencionado anteriormente en el que el polímero soluble en agua, que es parte integral del ligador, se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, poli(ácido siálico) (PSA), almidón de hidroxialquilo (HAS), almidón de hidroxietilo (HES), hidrato de carbono, polisacáridos, pululano, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, almidón, dextrano, carboximetildextrano, poli(óxido de alquileno) (PAO), polialquilenglicol (PAG), polipropilenglicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfaceno, polietileno-co-anhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido maleico y poli(1-hidroximetiletilenhidroximetilformal) (PHF). En todavía otra realización, el polímero soluble en agua es PEG. También se contemplan diversas longitudes de polímeros solubles en agua en el presente documento. En una realización, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica en el que el polímero soluble en agua comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en O3, O5, O7, O9, O11, O13 y O15.
En una realización, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica en el que el ligador soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en:
3-oxapentano-1,5-dioxiamina
Figure imgf000004_0001
3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina;
Figure imgf000004_0002
3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecano-1,17-dioxiamina;
Figure imgf000004_0003
3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosano-1,23-dioxiamina
Figure imgf000004_0004
Se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica en el que el derivado de ácido graso se une de manera estable a la proteína terapéutica por una unión oxima. La unión oxima se forma entre un grupo aminooxilo en el ligador soluble en agua y un grupo aldehído de un hidrato de carbono oxidado en la proteína terapéutica.
En una realización de la invención, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica en el que el derivado de ácido graso se selecciona del grupo que consiste en:
a) sal de sodio del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiimino)-hexadecanoico de la fórmula:
Figure imgf000004_0005
b) éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexadecanoico,
Figure imgf000005_0001
Se contemplan diversas proteínas terapéuticas en la presente invención. En una realización, se proporciona un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica mencionado anteriormente en el que la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en: factor IX (FIX), factor VIII (FVIII), factor VIIa (FVIIa), factor de von Willebrand (VWF), factor V (FV), factor X (FX), factor XI (FXI), factor XII (FXII), trombina (FII), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, tromboplastina tisular (TF), proteasa ADAMTS 13, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor estimulante de colonias 1 (c SF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), EPO, interferón alfa (IFN-alfa), interferón de consenso, IFN-beta, IFN-gamma, IFN-omega, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 alfa, IL-33, trombopoyetina (TPO), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, polipéptido similar a angiopoyetina 1 (ANGPTL1), polipéptido similar a angiopoyetina 2 (ANGPTL2), polipéptido similar a angiopoyetina 3 (ANGPTL3), polipéptido similar a angiopoyetina 4 (ANGPTL4), polipéptido similar a angiopoyetina 5 (ANGPTL5), polipéptido similar a angiopoyetina 6 (ANGPTL6), polipéptido similar a angiopoyetina 7 (ANGPTL7), vitronectina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiogenina, activina A, activina B, activina C, proteína morfogénica ósea 1, proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 3, proteína morfogénica ósea 4, proteína morfogénica ósea 5, proteína morfogénica ósea 6, proteína morfogénica ósea 7, proteína morfogénica ósea 8, proteína morfogénica ósea 9, proteína morfogénica ósea 10, proteína morfogénica ósea 11, proteína morfogénica ósea 12, proteína morfogénica ósea 13, proteína morfogénica ósea 14, proteína morfogénica ósea 15, receptor IA de proteínas morfogénicas óseas, receptor IB de proteínas morfogénicas óseas, receptor II de proteínas morfogénicas óseas, factor neurotrófico derivado del cerebro, cardiotrofina 1, factor neurotrófico ciliar, receptor del factor neurotrófico ciliar, cripto, críptico, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 1, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 2a, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 2p, factor de crecimiento de células endoteliales p, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, Epigen, epirregulina, factor quimiotáctico para neutrófilos derivado de células epiteliales, factor de crecimiento de fibroblastos 4, factor de crecimiento de fibroblastos 5, factor de crecimiento de fibroblastos 6, factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de crecimiento de fibroblastos 8, factor de crecimiento de fibroblastos 8b, factor de crecimiento de fibroblastos 8c, factor de crecimiento de fibroblastos 9, factor de crecimiento de fibroblastos 10, factor de crecimiento de fibroblastos 11, factor de crecimiento de fibroblastos 12, factor de crecimiento de fibroblastos 13, factor de crecimiento de fibroblastos 16, factor de crecimiento de fibroblastos 17, factor de crecimiento de fibroblastos 19, factor de crecimiento de fibroblastos 20, factor de crecimiento de fibroblastos 21, factor de crecimiento ácido de fibroblastos, factor de crecimiento básico de fibroblastos, receptor a1 del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, receptor a2 del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, proteína relacionada con el crecimiento, proteína relacionada con el crecimiento a, proteína relacionada con el crecimiento p, proteína relacionada con el crecimiento y, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado del hepatoma, factor de crecimiento similar a la insulina I, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento similar a la insulina II, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibidor de la leucemia, receptor a del factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento nervioso receptor del factor de crecimiento nervioso, neuropoyetina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, oncostatina M (OSM), factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento placentario 2, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA, factor de crecimiento derivado de plaquetas AB, cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, receptor a del factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor p del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante del crecimiento de células pre-B, factor de células madre (SCF), receptor del factor de células madre, TNF, TNF0, TNF1, TNF2, factor de crecimiento transformante a, factor de crecimiento transformante p, factor de crecimiento transformante p1, factor de crecimiento transformante p1.2, factor de crecimiento transformante p2, factor de crecimiento transformante p3, factor de crecimiento transformante p5, factor de crecimiento transformante latente p1, proteína I de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína II de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína III de unión al factor de crecimiento transformante p, linfopoyetina estromal tímica (TSLP), receptor de tipo I del factor de necrosis tumoral, receptor de tipo II del factor de necrosis tumoral, receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa, proteína de activación de fosfolipasas (PUP), insulina, lectina, ricina, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona foliculoestimulante, hormona estimulante del tiroides, activador tisular del plasminógeno, IgG, IgE, IgM, IgA e IgD, a-galactosidasa, p-galactosidasa, ADNasa, fetuína, hormona luteinizante, estrógeno, albúmina, lipoproteínas, fetoproteína, transferrina, trombopoyetina, urocinasa, integrina, trombina, leptina, Humira (adalimumab), Prolia (denosumab), Enbrel (etanercept), una proteína en la tabla 1, o un fragmento, derivado o variante biológicamente activo de la misma. En otra realización, la proteína terapéutica es FVIIa. En aún otra realización, la proteína terapéutica es FVIII. En todavía otra realización, la proteína terapéutica es FIX.
También se divulga un conjugado derivado de ácido graso-proteína terapéutica en el que el derivado de ácido graso se une de manera estable a la proteína terapéutica por un grupo maleimida en el ligador soluble en agua a un grupo sulfhidrilo libre en la proteína terapéutica. En todavía otra realización, el derivado de ácido graso se une de manera estable a la proteína terapéutica por un éster de N-hidroxisuccinimida en el ligador soluble en agua a un grupo amino libre en la proteína terapéutica.
También se contemplan métodos de preparación de derivados de ácidos grasos en la presente invención. En una realización, se proporciona un método de preparación de un derivado de ácido graso descrito en el presente documento que comprende: a) oxidar un grupo ro-hidroxilo en un ácido graso para generar un grupo aldehído en el ácido graso; y b) acoplar un ligador soluble en agua que comprende un grupo aminooxilo activo al grupo aldehído para formar una unión oxima estable, en el que el derivado de ácido graso es soluble en agua. En una realización, se proporciona el método mencionado anteriormente en el que el grupo ro-hidroxilo se oxida por un reactivo de oxidación seleccionado del grupo que consiste en: reactivo de peryodinano de Dess Martin, reactivo Tempo, oxidación Swern con cloruro de oxalilo/DMSO, perrutenato de tetrapropilamonio (TPAP), reactivos de cromo VI tales como reactivo de Collins, clorocromato de piridinio (PCC) y dicromato de piridinio. En todavía otra realización, el reactivo de oxidación es peryodinano de Dess Martin.
En otra realización, se proporciona un método mencionado anteriormente en el que el ácido graso es un ácido graso saturado o ácido graso insaturado. En todavía otra realización, el ácido graso es un ácido graso saturado.
En aún otra realización de la invención, se proporciona un método mencionado anteriormente en el que el ácido graso es un ácido graso de cadena ramificada.
Según otra realización, también se proporciona un método mencionado anteriormente en el que el ácido graso comprende una longitud de cadena entre C10 y C24, incluyendo ácidos grasos sintéticos con números impares de carbonos. En una realización, se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente en el que el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en: C10, C12, C14, C16, C18, C20, C20, C22 y C24. En otra realización, el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C14, C16 y C18. En todavía otra, el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C13, C15 yC17.
En todavía otra realización, se proporciona un método mencionado anteriormente en el que el ligador soluble en agua comprende un polímero soluble en agua y al menos un grupo aminooxilo.
Se contemplan numerosos polímeros solubles en agua en la presente invención para su uso en un método mencionado anteriormente. En una realización, se proporciona un método mencionado anteriormente en el que el polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, poli(ácido siálico) (PSA), almidón de hidroxialquilo (HAS), almidón de hidroxietilo (HES), hidrato de carbono, polisacáridos, pululano, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, almidón, dextrano, carboximetildextrano, poli(óxido de alquileno) (PAO), polialquilenglicol (PAG), polipropilenglicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfaceno, polietileno-co-anhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido maleico y poli(1-hidroximetiletilenhidroximetilformal) (PHF). En una realización, el polímero soluble en agua es PEG.
También se contemplan diversas longitudes de polímeros solubles en agua. En una realización, se proporciona un método mencionado anteriormente en el que el polímero soluble en agua comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en O5, O7, O9, O11, O13 y O15.
En todavía otra realización, se proporciona un método mencionado anteriormente en el que el ligador soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en:
a) 3-oxapentano-1,5-dioxiamina de fórmula:
Figure imgf000006_0001
b) 3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina de fórmula:
Figure imgf000006_0002
c) 3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecano-1,17-dioxiamina de fórmula:
Figure imgf000006_0003
d) 3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosano-1,23-dioxiamina de fórmula:
Figure imgf000007_0001
En aún otra realización, se proporciona un método mencionado anteriormente en el que el ligador soluble en agua es 3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina de fórmula:
Figure imgf000007_0002
En todavía otra realización, se proporciona un método mencionado anteriormente en el que el ligador soluble en agua es 3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecano-1,17-dioxiamina de fórmula:
Figure imgf000007_0003
Se contemplan todavía otros métodos para elaborar los derivados de ácidos grasos en el presente documento. En una realización, se proporciona un método de preparación de un derivado de ácido graso mencionado anteriormente que comprende: a) esterificar un grupo carboxilo en un ácido graso para generar un éster en el ácido graso; b) activar un grupo ro-hidroxilo en un ácido graso mediante la introducción de un grupo mesilo en el ácido graso de la etapa a); y c) acoplar un ligador soluble en agua que comprende un grupo aminooxilo activo sustituyendo el grupo mesilo de la etapa b) formándose así un enlace oxiamina-metileno estable; en el que el derivado de ácido graso es soluble en agua.
En una realización, se proporciona lo mencionado anteriormente en el que el grupo carboxilo se esterifica por un agente de esterificación seleccionado del grupo que consiste en: cloruro de acetilo, metanol en presencia de ácido, etanol en presencia de ácido, diazometano y yoduro de metilo. En otra realización, el agente de esterificación es cloruro de acetilo.
En todavía otra realización, se proporciona lo mencionado anteriormente en el que el grupo ro-hidroxilo se activa por un agente de activación seleccionado del grupo que consiste en: cloruro de mesilo, cloruro de tosilo y cloruro de nosilo. En una realización, el agente de activación es cloruro de mesilo.
Se contemplan diversos ácidos grasos para su uso en el método mencionado anteriormente. En una realización, se proporciona lo mencionado anteriormente en el que el ácido graso es un ácido graso saturado o ácido graso insaturado. En otra realización, el ácido graso es un ácido graso saturado. En aún otra realización, el ácido graso es un ácido graso de cadena ramificada.
En todavía otra realización, se proporciona el método mencionado anteriormente en el que el ácido graso comprende una longitud de cadena entre C10 y C24, incluyendo ácidos grasos sintéticos con números impares de carbonos. En una realización, se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente en el que el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en: C10, C12, C14, C16, C18, C20, C20, C22 y C24. En otra realización, el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C14, C16 y C18. En todavía otra, el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C13, C15 y C17.
También se contemplan diversos polímeros solubles en agua para su uso en el método mencionado anteriormente. En una realización, se proporciona el método mencionado anteriormente en el que el ligador soluble en agua comprende un polímero soluble en agua y al menos un grupo aminooxilo. En otra realización, el polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, poli(ácido siálico) (PSA), almidón de hidroxialquilo (HAS), almidón de hidroxietilo (HES), hidrato de carbono, polisacáridos, pululano quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, almidón, dextrano, carboximetildextrano, poli(óxido de alquileno) (PAO), polialquilenglicol (PAG), polipropilenglicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfaceno, polietileno-co-anhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido maleico, y poli(1-hidroximetiletilenhidroximetilformal) (PHF). En otra realización, el polímero soluble en agua es PEG.
En todavía otra realización de la invención, se proporciona un método mencionado anteriormente en el que el polímero soluble en agua comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en O3, O5, O7, O9, O11, O13 y O15. En otra realización, el ligador soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en:
También se contemplan métodos de preparación de proteínas conjugadas en la presente invención. En una realización, se proporciona un método de preparación de una proteína terapéutica conjugada que comprende poner en contacto un resto de hidrato de carbono oxidado en la proteína terapéutica con un derivado de ácido graso mencionado anteriormente (o un polímero soluble en agua tal como se describe en el presente documento) en condiciones que permitan la conjugación; el resto de hidrato de carbono oxidado por incubación con un tampón que comprende un agente oxidante seleccionado del grupo que consiste en peryodato de sodio (NaIO4), tetraacetato de plomo (Pb(OAc)4 ) y perrutenato de potasio (KRuO4 ); en el que se forma una unión oxima entre el resto de hidrato de carbono oxidado y el grupo aminooxilo activo en el derivado de ácido graso; y en el que la formación de unión oxima se cataliza por un catalizador nucleófilo seleccionado del grupo que consiste en ácido o-aminobenzoico, ácido m-aminobenzoico, ácido p-aminobenzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o-toluidina, m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, m-anisidina y p-anisidina.
En otra realización, se proporciona el método mencionado anteriormente en el que la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en: factor IX (FIX), factor VIII (FVIII), factor VIIa (FVIIa), factor de von Willebrand (VWF), factor V (FV), factor X (FX), factor XI (FXI), factor XII (FXII), trombina (FII), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, tromboplastina tisular(TF),proteasa ADAMTS 13, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor estimulante de colonias 1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), EPO, interferón alfa (IFN-alfa), interferón de consenso, IFN-beta, IFN-gamma, IFN-omega, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 alfa, IL-33, trombopoyetina (TPO), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, polipéptido similar a angiopoyetina 1 (ANGPTL1), polipéptido similar a angiopoyetina 2 (ANGPTL2), polipéptido similar a angiopoyetina 3 (ANGPTL3), polipéptido similar a angiopoyetina 4 (ANGPTL4), polipéptido similar a angiopoyetina 5 (ANGPTL5), polipéptido similar a angiopoyetina 6 (ANGPTL6), polipéptido similar a angiopoyetina 7 (ANGPTl7), vitronectina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiogenina, activina A, activina B, activina C, proteína morfogénica ósea 1, proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 3, proteína morfogénica ósea 4, proteína morfogénica ósea 5, proteína morfogénica ósea 6, proteína morfogénica ósea 7, proteína morfogénica ósea 8, proteína morfogénica ósea 9, proteína morfogénica ósea 10, proteína morfogénica ósea 11, proteína morfogénica ósea 12, proteína morfogénica ósea 13, proteína morfogénica ósea 14, proteína morfogénica ósea 15, receptor IA de proteínas morfogénicas óseas, receptor IB de proteínas morfogénicas óseas, receptor II de proteínas morfogénicas óseas, factor neurotrófico derivado del cerebro, cardiotrofina 1, factor neurotrófico ciliar, receptor del factor neurotrófico ciliar, cripto, críptico, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 1, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 2a, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 2p, factor de crecimiento de células endoteliales p, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, Epigen, epirregulina, factor quimiotáctico para neutrófilos derivado de células epiteliales, factor de crecimiento de fibroblastos 4, factor de crecimiento de fibroblastos 5, factor de crecimiento de fibroblastos 6, factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de crecimiento de fibroblastos 8, factor de crecimiento de fibroblastos 8b, factor de crecimiento de fibroblastos 8c, factor de crecimiento de fibroblastos 9, factor de crecimiento de fibroblastos 10, factor de crecimiento de fibroblastos 11, factor de crecimiento de fibroblastos 12, factor de crecimiento de fibroblastos 13, factor de crecimiento de fibroblastos 16, factor de crecimiento de fibroblastos 17, factor de crecimiento de fibroblastos 19, factor de crecimiento de fibroblastos 20, factor de crecimiento de fibroblastos 21, factor de crecimiento ácido de fibroblastos, factor de crecimiento básico de fibroblastos, receptor a1 del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, receptor a2 del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, proteína relacionada con el crecimiento, proteína relacionada con el crecimiento a, proteína relacionada con el crecimiento p, proteína relacionada con el crecimiento y, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado del hepatoma, factor de crecimiento similar a la insulina I, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento similar a la insulina II, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibidor de la leucemia, receptor a del factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento nervioso, neuropoyetina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, oncostatina M (OSM), factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento placentario 2, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas a A, factor de crecimiento derivado de plaquetas AB, cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, receptor a del factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor p del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante del crecimiento de células pre-B, factor de células madre (SCF), receptor del factor de células madre, TNF, TNF0, TNF1, TNF2, factor de crecimiento transformante a, factor de crecimiento transformante p, factor de crecimiento transformante p1, factor de crecimiento transformante p1.2, factor de crecimiento transformante p2, factor de crecimiento transformante p3, factor de crecimiento transformante p5, factor de crecimiento transformante latente p1, proteína I de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína II de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína III de unión al factor de crecimiento transformante p, linfopoyetina estromal tímica (TSLP), receptor de tipo I del factor de necrosis tumoral, receptor de tipo II del factor de necrosis tumoral, receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa, proteína de activación de fosfolipasas (PUP), insulina, lectina, ricina, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona foliculoestimulante, hormona estimulante del tiroides, activador tisular del plasminógeno, IgG, IgE, IgM, IgA e IgD, agalactosidasa, p-galactosidasa, ADNasa, fetuína, hormona luteinizante, estrógeno, albúmina, lipoproteínas, fetoproteína, transferrina, trombopoyetina, urocinasa, integrina, trombina, leptina, Humira (adalimumab), Prolia (denosumab), Enbrel (etanercept), una proteína en la tabla 1, o un fragmento, derivado o variante biológicamente activo de la misma.
En otra realización, se proporciona el método mencionado anteriormente en el que la proteína terapéutica es FVIIa. En todavía aún otra realización, se proporciona el método mencionado anteriormente en el que la proteína terapéutica es FVIII. En aún otra realización, se proporciona el método mencionado anteriormente en el que la proteína terapéutica es FIX.
En todavía otra realización, se proporciona el método mencionado anteriormente en el que el agente oxidante es peryodato de sodio (NaIO4). En otra realización, se proporciona el método mencionado anteriormente en el que el catalizador nucleófilo es m-toluidina.
En aún otra realización, se proporciona el método mencionado anteriormente que comprende además purificar la proteína terapéutica conjugada.
En todavía otra realización, se proporciona el método mencionado anteriormente en el que el derivado de ácido graso se prepara mediante un método tal como se describe en el presente documento.
Se contemplan todavía otros métodos de preparación de derivados de ácidos grasos en la presente divulgación. En una realización, se proporciona un método de preparación de un derivado de ácido graso mencionado anteriormente que comprende: a) esterificar un grupo carboxilo en un ácido graso para generar un éster en el ácido graso; y b) acoplar un ligador soluble en agua que comprende un grupo maleimida activo a un grupo sulfhidrilo (SH) libre, formándose así un enlace tioéter estable; en el que el derivado de ácido graso es soluble en agua.
En todavía otra realización de la presente divulgación, se proporciona un método de preparación de un derivado de ácido graso mencionado anteriormente que comprende: a) esterificar un grupo carboxilo en un ácido graso para generar éster de ácido graso; b) hacer reaccionar el ácido graso resultante de la etapa a) con un reactivo de azida produciendo así una azida de ácido graso correspondiente; c) hidrogenar la azida de ácido graso de la etapa b) para producir una amina de ácido graso correspondiente; y d) acoplar un ligador soluble en agua que comprende un grupo NHS activo a un grupo amina libre, formando así un enlace estable; en el que el derivado de ácido graso es soluble en agua.
Figuras
La figura 1 muestra la síntesis del ligador soluble en agua 3-oxapentano-1,5-dioxiamina.
Descripción detallada de la invención
Las propiedades farmacológicas e inmunológicas de las proteínas terapéuticas pueden mejorarse mediante modificación y conjugación química con compuestos poliméricos tales como ácidos grasos y derivados de ácidos grasos según la presente invención.
La adición de un derivado de ácido graso soluble en agua tal como se describe en el presente documento es un enfoque para mejorar las propiedades de proteínas terapéuticas tales como las proteínas de la coagulación sanguínea factor IX (FIX), factor VIII (FVIII), factor VIIa (FVIIa), factor de von Willebrand (VWF), factor V (FV), factor X (FX), factor XI (FXI), factor XII (FXII), trombina (FII), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, tromboplastina tisular (TF) o proteasa ADAMTS 13, así como otras proteínas conocidas o fragmentos biológicamente/terapéuticamente activos de las mismas.
Proteínas terapéuticas
En determinadas realizaciones de la invención, los polipéptidos y polinucleótidos mencionados anteriormente se ejemplifican por las siguientes proteínas terapéuticas: enzimas, antígenos, anticuerpos, receptores, proteínas de coagulación sanguínea, factores de crecimiento, hormonas y ligandos. En determinadas realizaciones, la proteína terapéutica es una proteína de coagulación sanguínea tal como factor IX (FIX), factor VIII (FVIII), factor VIIa (FVIIa), factor de von Willebrand (VWF), factor V (FV), factor X (FX), factor XI (FXI), factor XII (FXII), trombina (FII), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, tromboplastina tisular (TF) o proteasa ADAMTS 13.
En determinadas realizaciones, la proteína terapéutica es inmunoglobulinas, citocinas tales como IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor estimulante de colonias 1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), EPO, interferón alfa (IFN-alfa), interferón de consenso, IFN-beta, IFN-gamma, IFN-omega, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 alfa, IL-33, trombopoyetina (TPO), angiopoyetinas, por ejemplo Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, los polipéptidos similares a angiopoyetinas humanos ANGPTL1 a 7, vitronectina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiogenina, activina A, activina B, activina C, proteína morfogénica ósea 1, proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 3, proteína morfogénica ósea 4, proteína morfogénica ósea 5, proteína morfogénica ósea 6, proteína morfogénica ósea 7, proteína morfogénica ósea 8, proteína morfogénica ósea 9, proteína morfogénica ósea 10, proteína morfogénica ósea 11, proteína morfogénica ósea 12, proteína morfogénica ósea 13, proteína morfogénica ósea 14, proteína morfogénica ósea 15, receptor IA de proteínas morfogénicas óseas, receptor IB de proteínas morfogénicas óseas, receptor II de proteínas morfogénicas óseas, factor neurotrófico derivado del cerebro, cardiotrofina 1, factor neurotrófico ciliar, receptor del factor neurotrófico ciliar, cripto, críptico, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 1, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 2a, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 2p, factor de crecimiento de células endoteliales p, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, Epigen, epirregulina, factor quimiotáctico de neutrófilos derivado de células epiteliales, factor de crecimiento de fibroblastos 4, factor de crecimiento de fibroblastos 5, factor de crecimiento de fibroblastos 6, factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de crecimiento de fibroblastos 8, factor de crecimiento de fibroblastos 8b, factor de crecimiento de fibroblastos 8c, factor de crecimiento de fibroblastos 9, factor de crecimiento de fibroblastos 10, factor de crecimiento de fibroblastos 11, factor de crecimiento de fibroblastos 12, factor de crecimiento de fibroblastos 13, factor de crecimiento de fibroblastos 16, factor de crecimiento de fibroblastos 17, factor de crecimiento de fibroblastos 19, factor de crecimiento de fibroblastos 20, factor de crecimiento de fibroblastos 21, factor de crecimiento ácido de fibroblastos, factor de crecimiento básico de fibroblastos, receptor a1 del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, receptor a2 del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, proteína relacionada con el crecimiento, proteína relacionada con el crecimiento a, proteína relacionada con el crecimiento p, proteína relacionada con el crecimiento y, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado del hepatoma, factor de crecimiento similar a la insulina I, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento similar a insulina II, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibidor de la leucemia, receptor a del factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento nervioso, neuropoyetina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, oncostatina M (OSM), factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento placentario 2, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA, factor de crecimiento derivado de plaquetas AB, cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, receptor a del factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor p del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante del crecimiento de células pre-B, factor de células madre (SCF), receptor del factor de células madre, TNF, incluyendo TNF0, TNF1, TNF2, factor de crecimiento transformante a, factor de crecimiento transformante p, factor de crecimiento transformante p1, factor de crecimiento transformante p1.2, factor de crecimiento transformante p2, factor de crecimiento transformante p3, factor de crecimiento transformante p5, factor de crecimiento transformante latente p1, proteína I de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína II de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína III de unión al factor de crecimiento transformante p, linfopoyetina estromal tímica (TSLP), receptor de tipo I del factor de necrosis tumoral, receptor de tipo II del factor de necrosis tumoral, receptor del activador del plasminógeno de tipo urocinasa, factor de crecimiento endotelial vascular, y proteínas quiméricas y fragmentos biológica o inmunológicamente activos de las mismas.
En determinadas realizaciones, la proteína terapéutica es interferones alfa, beta y gamma, factores estimulantes de colonias incluyendo factores estimulante de colonias de granulocitos, factores de crecimiento de fibroblastos, factores de crecimiento derivados de plaquetas, proteína de activación de fosfolipasas (PUP), insulina, proteínas vegetales tales como lectinas y ricinas, factores de necrosis tumoral y alelos relacionados, formas solubles de receptores de los factores de necrosis tumoral, receptores de interleucinas y formas solubles de receptores de interleucinas, factores de crecimiento tales como factores de crecimiento tisular, tales como TGFa o TGFp y factores de crecimiento epidérmico, hormonas, somatomedinas, hormonas pigmentarias, factores de liberación hipotalámicos, hormonas antidiuréticas, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona foliculoestimulante, hormona estimulante del tiroides, activador tisular del plasminógeno e inmunoglobulinas tales como IgG, IgE, IgM, IgA e IgD, una galactosidasa, a-galactosidasa, pgalactosidasa, ADNasa, fetuína, hormona luteinizante, estrógeno, corticosteroides, albúmina, lipoproteínas, fetoproteína, transferrina, trombopoyetina, urocinasa, ADNasa, integrinas, trombina, factores de crecimiento hematopoyéticos, leptina, glicosidasas, Humira (adalimumab), Prolia (denosumab), Enbrel (etanercept), y fragmentos de los mismos, o cualquier proteína de fusión que comprende cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente o fragmentos de las mismas. Además de las proteínas mencionadas anteriormente, la siguiente tabla 1 proporciona proteínas terapéuticas contempladas por la presente invención:
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Las proteínas terapéuticas proporcionadas en el presente documento no deben considerarse exclusivas. Más bien, como es evidente a partir de la divulgación proporcionada en el presente documento, los métodos de la invención son aplicables a cualquier proteína en la que se desee la unión de un derivado de ácido graso soluble en agua según la invención. Por ejemplo, se describen proteínas terapéuticas en el documento US 2007/0026485.
Proteínas de la coagulación sanguínea
En un aspecto, el material de partida de la presente invención es una proteína de la coagulación sanguínea, que puede derivarse del plasma humano o producirse mediante técnicas de ingeniería recombinante, tal como se describe en las patentes: patente estadounidense n.° 4.757.006; patente estadounidense n.° 5.733.873; patente estadounidense n.° 5.198.349; patente estadounidense n.° 5.250.421; patente estadounidense n.° 5.919.766; y documento EP 306968.
Los polipéptidos terapéuticos tales como proteínas de la coagulación sanguínea incluyendo factor IX (FIX), factor VIII (FVIII), factor VIIa (FVIIa), factor de von Willebrand (VWF), factor V (FV), factor X (FX), factor XI (FXI), factor XII (FXII), trombina (FII), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, tromboplastina tisular (TF) y proteasa ADAMTS 13 se degradan rápidamente por enzimas proteolíticas y se neutralizan por anticuerpos. Esto reduce su semivida y tiempo de circulación, limitando así su eficacia terapéutica. Se necesitan dosis relativamente altas y una administración frecuente para alcanzar y mantener el efecto terapéutico o profiláctico deseado de estas proteínas de la coagulación. Como consecuencia, la regulación adecuada de la dosis es difícil de obtener y la necesidad de administraciones intravenosas frecuentes impone restricciones en la forma de vida del paciente.
Tal como se describe en el presente documento, las proteínas de la coagulación sanguínea incluyendo, pero sin limitarse a, factor IX (FIX), factor VIII (FVIII), factor VIIa (FVIIa), factor de von Willebrand (VWF), factor V (FV), factor X (FX), factor XI, factor XII (FXII), trombina (FII), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, tromboplastina tisular (TF) y proteasa ADAMTS 13 están contempladas por la invención. Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína de coagulación sanguínea” se refiere a cualquier factor IX (FIX), factor VIII (FVIII), factor VIIa (FVIIa), factor de von Willebrand (VWF), factor FV (FV), factor X (FX), factor XII (Fx II), trombina (FII), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, tromboplastina tisular (TF) y proteasa ADAMTS 13 que presenta actividad biológica asociada con esa proteína de la coagulación sanguínea nativa particular.
La cascada de la coagulación sanguínea se divide en tres segmentos distintos: las rutas intrínseca, extrínseca y común (Schenone et al., Curr Opin Hematol. 2004; 11: 272-7). La cascada implica una serie de enzimas serina proteasa (zimógenos) y cofactores de proteínas. Cuando se requiere, un precursor de zimógeno inactivo se convierte en la forma activa, que en consecuencia convierte la siguiente enzima en la cascada.
La ruta intrínseca requiere los factores de coagulación VIII, IX, X, XI y XII. El inicio de la ruta intrínseca se produce cuando la precalicreína, el quininógeno de alto peso molecular, el factor XI (FXI) y el factor XII (FXII) se exponen a una superficie cargada negativamente. También se requieren iones de calcio y fosfolípidos secretados por las plaquetas.
La ruta extrínseca se inicia cuando se daña la luz vascular de los vasos sanguíneos. La glicoproteína tromboplastina tisular de membrana se expone y luego se une al factor circulante VII (FVII) y a pequeñas cantidades preexistentes de su forma activada FVIIa. Esta unión facilita la conversión completa de FVII a FVIIa y, posteriormente, en presencia de calcio y fosfolípidos, la conversión del factor IX (FIX) a factor IXa (FIXa) y factor X (FX) a factor Xa (FXa). La asociación de FVIIa con tromboplastina tisular mejora la actividad proteolítica al acercar los sitios de unión de FVII para el sustrato (FIX y FX) e inducir un cambio conformacional, que mejora la actividad enzimática de FVIIa.
La activación de FX es el punto común de las dos rutas. Junto con el fosfolípido y el calcio, los factores Va (FVa) y Xa convierten la protrombina en trombina (complejo de protrombinasa), que luego escinde el fibrinógeno para formar monómeros de fibrina. Los monómeros se polimerizan para formar hebras de fibrina. El factor XIIIa (FXIIIa) une de manera covalente estos hilos entre sí para formar una malla rígida.
La conversión de FVII en FVIIa también está catalizada por una serie de proteasas, incluyendo trombina, FIXa, FXa, factor XIa (FXIa) y factor XIIa (FXIIa). Para la inhibición de la fase temprana de la cascada, el inhibidor de la ruta de la tromboplastina tisular selecciona como diana el complejo de productos FVIIa/tromboplastina tisular/FXa.
Factor VIIa
El FVII (también conocido como factor estable o proconvertina) es una glicoproteína de serina proteasa dependiente de vitamina K con un papel fundamental en la hemostasia y la coagulación (Figenbrot, Curr Protein Pept Sci. 2002; 3: 287-99).
El FVII se sintetiza en el hígado y se secreta como una glicoproteína monocatenaria de 48 kD. FVII comparte con todas las glicoproteínas de serina proteasa dependientes de vitamina K una estructura de dominio de proteína similar que consiste en un dominio de ácido gamma-carboxiglutámico (Gla) amino-terminal con 9-12 residuos responsables de la interacción de la proteína con las membranas lipídicas, un dominio carboxi-terminal de serina proteasa (dominio catalítico) y dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico que contienen un sitio de unión a iones de calcio que media la interacción con la tromboplastina tisular. La gamma-glutamil carboxilasa cataliza la carboxilación de residuos Gla en la porción amino-terminal de la molécula. La carboxilasa depende de una forma reducida de vitamina K para su acción, que se oxida a la forma de epóxido. La vitamina K epóxido reductasa es necesaria para convertir de nuevo la forma de epóxido de vitamina K en la forma reducida.
La mayor proporción de FVII circula en plasma en forma de zimógeno, y la activación de esta forma da como resultado la escisión del enlace peptídico entre la arginina 152 y la isoleucina 153. El FVIIa activado resultante consiste en una cadena ligera derivada de NH2 (20 kD) y una cadena pesada derivada de COOH terminal (30 kD) unida a través de un enlace disulfuro único (Cys 135 a Cys 262). La cadena ligera contiene el dominio Gla de unión a la membrana, mientras que la cadena pesada contiene el dominio catalítico.
La concentración plasmática de FVII determinada por factores genéticos y ambientales es de aproximadamente 0,5 mg/ml (Pinotti et al., Blood. 2000; 95: 3423-8). Los genotipos de FVII diferentes pueden dar lugar a diferencias de varias veces en los niveles medios de FVII. Los niveles plasmáticos de FVII son elevados durante el embarazo en mujeres sanas y también aumentan con la edad y son más altos en mujeres y en personas con hipertrigliceridemia. El FVII tiene la semivida más corta de todos los factores procoagulantes (3-6 h). La concentración plasmática media de FVIIa es de 3,6 ng/ml en individuos sanos y la semivida circulante de FVIIa es relativamente larga (2,5 h) en comparación con otros factores de coagulación.
La deficiencia hereditaria de FVII es un trastorno hemorrágico autosómico recesivo poco frecuente con una prevalencia estimada en 1 caso por 500.000 personas en la población general (Acharya et al., J Thromb Haemost. 2004; 2248­ 56). La deficiencia adquirida de FVII de los inhibidores también es muy rara. También se han notificado casos en los que la deficiencia se produce en asociación con fármacos tales como cefalosporinas, penicilinas y anticoagulantes orales. Además, se ha notificado que la deficiencia adquirida de FVII se produce espontáneamente o con otros estados, tales como mieloma, septicemia, anemia aplásica, con terapia con interleucina 2 y concentrado de inmunoglobulinas antitimocíticas.
Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de referencia incluyen, por ejemplo, los números de registro de GenBank J02933 para la secuencia genómica, M13232 para el ADNc (Hagen et al. p Na S 1986; 83: 2412-6) y P08709 para la secuencia de polipéptidos. Se ha descrito una variedad de polimorfismos de FVII, por ejemplo, véase, Sabater-Lleal et al. (Hum Genet.2006; 118: 741-51).
Factor IX
FIX es una proteína plasmática dependiente de la vitamina K que participa en la ruta intrínseca de la coagulación sanguínea al convertir FX a su forma activa en presencia de iones de calcio, fosfolípidos y FVIIIa. La capacidad catalítica predominante de FIX es como una serina proteasa con especificidad para un enlace arginina-isoleucina particular en FX. La activación de FIX se produce por FXIa que provoca la escisión del péptido de activación de FIX para producir una molécula FIX activada que comprende dos cadenas mantenidas por uno o más enlaces disulfuro. Los defectos en FIX son la causa de la hemofilia B recesiva ligada al cromosoma X.
La hemofilia A y B son enfermedades hereditarias caracterizadas por deficiencias en los polipéptidos FVIII y FIX, respectivamente. La causa subyacente de las deficiencias es con frecuencia el resultado de mutaciones en los genes FVIII y FIX, que se encuentran en el cromosoma X. La terapia tradicional para las hemofilias a menudo implica la administración intravenosa de mezcla de plasmas o proteínas de coagulación semipurificadas de individuos normales. Estas preparaciones pueden estar contaminadas por agentes patógenos o virus, como priones infecciosos, VIH, parvovirus, hepatitis A y hepatitis C. Por tanto, existe la necesidad urgente de agentes terapéuticos que no requieran el uso de suero humano.
El nivel de la disminución en la actividad de FIX es directamente proporcional a la gravedad de la hemofilia B. El tratamiento actual de la hemofilia B consiste en el reemplazo de la proteína que falta por FIX recombinante o derivado del plasma (denominado tratamiento o terapia de sustitución o reemplazo de FIX).
Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de FIX pueden encontrarse, por ejemplo, en el n.° de registro de UniProtKB/Swiss-Prot P00740, y en la patente estadounidense n.° 6.531.298.
Factor VIII
El factor VIII de la coagulación (FVIII) circula en plasma a una concentración muy baja y se une de forma no covalente al factor de von Willebrand (VWF). Durante la hemostasia, el FVIII se separa del v W f y actúa como cofactor para la activación de FX mediada por el factor IX activado (FIXa) mejorando la velocidad de activación en presencia de calcio y fosfolípidos o membranas celulares.
El FVIII se sintetiza como un precursor de cadena sencilla de aproximadamente 270-330 kD con la estructura de dominio A1-A2-B-A3-C1-C2. Cuando se purifica a partir de plasma (por ejemplo, “derivado de plasma” o “plasmático”), el FVIII se compone de una cadena pesada (A1-A2-B) y una cadena ligera (A3-C1-C2). La masa molecular de la cadena ligera es de 80 kD, mientras que, debido a la proteólisis en el dominio B, la cadena pesada está en el intervalo de 90-220 kD.
El FVIII también se sintetiza como una proteína recombinante para uso terapéutico en trastornos hemorrágicos. Se han ideado diversos ensayos in vitro para determinar la eficacia potencial del FVIII recombinante (rFVIII) como medicamento terapéutico. Estos ensayos imitan los efectos in vivo del FVIII endógeno. El tratamiento con trombina in vitro del FVIII da como resultado un aumento rápido y la disminución posterior en su actividad procoagulante, tal como se mide mediante ensayos in vitro. Esta activación e inactivación coincide con proteólisis limitada específica tanto en las cadenas pesadas como en las ligeras, que alteran la disponibilidad de diferentes epítopos de unión en FVIII, por ejemplo, permitiendo que FVIII se disocie de VWF y se una a una superficie de fosfolípidos o alterando la capacidad de unión a determinados anticuerpos monoclonales.
La falta o disfunción del FVIII se asocia con el trastorno hemorrágico más frecuente, la hemofilia A. El tratamiento de elección para el tratamiento de la hemofilia A es la terapia de reemplazo con concentrados derivados de plasma o rFVIII. Los pacientes con hemofilia A grave con niveles de FVIII por debajo del 1%, reciben generalmente terapia profiláctica con el objetivo de mantener el FVIII por encima del 1% entre dosis. Teniendo en cuenta las semividas promedio de los diversos productos de FVIII en la circulación, este resultado puede lograrse habitualmente administrando FVIII de dos a tres veces por semana.
Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de referencia incluyen, por ejemplo, UniProtKB/Swiss-Prot P00451 (FA8_HUMAN); Gitschier J et al., Characterization ofthe human factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984); Vehar GH et al., Structure of human factor VIII, Nature, 312(5992):337-42 (1984); Thompson AR. Structure and Function ofthe factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29;11-29 (2002).
Factor de von Willebrand
El factor de von Willebrand (VWF) es una glicoproteína que circula en plasma como una serie de multímeros que oscilan en tamaño desde aproximadamente 500 hasta 20.000 kD. Las formas multiméricas de VWF se componen de subunidades de polipéptidos de 250 kD unidas entre sí por enlaces disulfuro. El VWF media la adhesión plaquetaria inicial al subendotelio de la pared del vaso dañado. Solo los multímeros más grandes presentan actividad hemostática. Se supone que las células endoteliales secretan grandes formas poliméricas de VWF y las formas de VWF que tienen un bajo peso molecular (VWF de bajo peso molecular) surgen de la escisión proteolítica. Los multímeros que tienen grandes masas moleculares se almacenan en los cuerpos de Weibel-Pallade de células endoteliales y se liberan tras la estimulación.
El VWF se sintetiza por las células endoteliales y los megacariocitos como prepro-VWF que consiste en gran medida en dominios repetidos. Tras la escisión del péptido señal, el pro-VWF se dimeriza a través de enlaces disulfuro en su región C-terminal. Los dímeros sirven como protómeros para la multimerización, que se rige por uniones disulfuro entre los extremos terminales libres. El ensamblaje en multímeros es seguido por la eliminación proteolítica de la secuencia de propéptido (Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261).
El producto de traducción primario predicho a partir del ADNc clonado de VWF es un polipéptido precursor de 2813 residuos (prepro-VWF). El prepro-VWF consiste en un péptido señal de 22 aminoácidos y un propéptido de 741 aminoácidos, con el VWF maduro que comprende 2050 aminoácidos (Ruggeri Z.A., y Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993).
Los defectos en el VWF son causales de la enfermedad de von Willebrand (VWD), que se caracteriza por un fenotipo hemorrágico más o menos pronunciado. La VWD tipo 3 es la forma más grave en la que falta completamente el VWF, y el VWD tipo 1 se refiere una pérdida cuantitativa de VWF y su fenotipo puede ser muy leve. La VWD tipo 2 se refiere a defectos cualitativos de VWF y puede ser tan grave como VWD tipo 3. La VWD tipo 2 tiene muchas subformas, algunas asociadas con la pérdida o la disminución de multímeros de alto peso molecular. La enfermedad de von Willebrand tipo 2a (VWD-2A) se caracteriza por una pérdida de multímeros intermedios y grandes. La VWD-2B se caracteriza por una pérdida de multímeros de mayor peso molecular. Otras enfermedades y trastornos relacionados con VWF son conocidos en la técnica.
Las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de prepro-VWF están disponibles en los n.os de registro de GenBank NM_000552 y NP_000543, respectivamente.
Otras proteínas de coagulación sanguínea según la presente invención se describen en la técnica, por ejemplo, Mann KG, Thromb Haemost, 1999;82:165-74.
A. Polipéptidos
En un aspecto, el material de partida de la presente invención es una proteína o polipéptido. Tal como se describe en el presente documento, el término proteína terapéutica se refiere a cualquier molécula de proteína terapéutica que presenta actividad biológica que está asociada con la proteína terapéutica. En una realización de la invención, la molécula de proteína terapéutica es una proteína de longitud completa.
Las moléculas de proteínas terapéuticas contempladas incluyen proteínas de longitud completa, precursores de proteínas de longitud completa, subunidades biológicamente activas o fragmentos de proteínas de longitud completa, así como derivados y variantes biológicamente activos de cualquiera de estas formas de proteínas terapéuticas. Por tanto, las proteínas terapéuticas incluyen aquellas que (1) tienen una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de más de aproximadamente el 60%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98% o aproximadamente el 99% o más, en una región de al menos aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, o más aminoácidos, a un polipéptido codificado por un ácido nucleico al que se hace referencia o una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento; y/o (2) se unen específicamente a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales, generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos a la que se hace referencia tal como se describe en el presente documento, un fragmento inmunogénico del mismo y/o una variante modificada de manera conservadora del mismo.
Según la presente invención, el término “proteína terapéutica recombinante” incluye cualquier proteína terapéutica obtenida mediante tecnología de ADN recombinante. En determinadas realizaciones, el término abarca proteínas tal como se describe en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, “proteína terapéutica endógena” incluye una proteína terapéutica que se origina del mamífero destinado a recibir tratamiento. El término también incluye proteína terapéutica transcrita desde un transgén o cualquier otro ADN foráneo presente en dicho mamífero. Tal como se usa en el presente documento, “proteína terapéutica exógena” incluye una proteína de la coagulación sanguínea que no se origina del mamífero destinado a recibir tratamiento.
Tal como se usa en el presente documento, “proteína de la coagulación sanguínea derivada de plasma” o “plasmático” incluye todas las formas de la proteína encontrada en la sangre obtenida de un mamífero que tiene la propiedad que participa en la ruta de coagulación.
Tal como se usa en el presente documento, “derivado biológicamente activo” o “variante biológicamente activa” incluye cualquier derivado o variante de una molécula que tenga sustancialmente las mismas propiedades funcionales y/o biológicas de dicha molécula, tales como propiedades de unión y/o la misma base estructural, tal como un esqueleto peptídico o una unidad polimérica básica.
Un “análogo”, “variante” o “derivado” es un compuesto sustancialmente similar en estructura y que tiene la misma actividad biológica, aunque en determinados casos en un grado diferente, con respecto a una molécula que se produce de manera natural. Por ejemplo, una variante de polipéptido se refiere a un polipéptido que comparte una estructura sustancialmente similar y que tiene la misma actividad biológica que un polipéptido de referencia. Las variantes o análogos difieren en la composición de sus secuencias de aminoácidos en comparación con el polipéptido natural del que se deriva el análogo, basándose en una o más mutaciones que implican (i) deleción de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más extremos terminales del polipéptido y/o una o más regiones internas de la secuencia de polipéptido natural (por ejemplo, fragmentos), (ii) inserción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más extremos terminales (normalmente una “adición” o “fusión” ) del polipéptido y/o una o más regiones internas (normalmente una “inserción”) de la secuencia de polipéptido que se produce de manera natural o (iii) sustitución de uno o más aminoácidos por otros aminoácidos en la secuencia de polipéptido que se produce de manera natural. A modo de ejemplo, un “derivado” se refiere a un polipéptido que comparte la misma estructura o sustancialmente similar a un polipéptido de referencia que se ha modificado, por ejemplo, químicamente.
En diversas realizaciones, los análogos, variantes o derivados están diseñados para permitir, por ejemplo, la conjugación de otra molécula con el análogo, variante o derivado de proteína, formando así una proteína conjugada según la presente invención.
Los polipéptidos de variantes o análogos incluyen variantes de inserción, en las que se añaden uno o más residuos de aminoácidos a una secuencia terapéutica de aminoácidos de la proteína de la invención. Las inserciones pueden ubicarse en cualquiera o ambos extremos terminales de la proteína, y/o pueden colocarse dentro de las regiones internas de la secuencia terapéutica de aminoácidos de la proteína. Las variantes de inserción, con residuos adicionales en cualquiera o ambos extremos terminales, incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión y proteínas que incluyen etiquetas de aminoácidos u otros marcadores de aminoácidos. En un aspecto, la molécula de proteína de la coagulación sanguínea contiene opcionalmente un Met N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa de manera recombinante en una célula bacteriana tal como E. coli.
En las variantes de deleción, se retiran uno o más residuos de aminoácidos en un polipéptido proteico terapéutico tal como se describe en el presente documento. Las deleciones pueden efectuarse en uno o ambos extremos terminales del polipéptido proteico terapéutico, y/o con la retirada de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica. Por tanto, las variantes de deleción incluyen fragmentos de una secuencia terapéutica de polipéptidos proteicos.
En las variantes de sustitución, uno o más residuos de aminoácidos de un polipéptido proteico terapéutico se retiran y se reemplazan con residuos alternativos. En un aspecto, las sustituciones son de naturaleza conservadora y las sustituciones conservadoras de este tipo se conocen bien en la técnica. Alternativamente, la invención abarca sustituciones que también son no conservadoras. Se describen sustituciones conservadoras a modo de ejemplo en Lehninger, [Biochemistry, 2a edición; Worth Publishers, Inc., Nueva York (1975), págs.71-77] y se exponen inmediatamente a continuación.
SUSTITUCIONES CONSERVADORAS
CARACTERÍSTICA DE LA AMINOÁCIDO
CADENA LATERAL
No polar (hidrófobo):
A. Alifático A L I V P
B. Aromático F W
C. Que contiene azufre M
D. Límite G
Polar sin carga:
A. Hidroxilo S T Y
B. Amidas N Q
C. Sulfhidrilo C
D. Límite G
Cargado positivamente (básico) K R H
Cargado negativamente (ácido) D E
Alternativamente, las sustituciones conservadoras ejemplares se exponen inmediatamente a continuación.
SUSTITUCIONES CONSERVADORAS II
RESIDUO ORIGINAL SUSTITUCION A MODO
DE EJEMPLO
Ala (A) Val, Leu, Ile
Arg (R) Lys, Gln, Asn
Asn(N) Gln, His, Lys, Arg
Asp(D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe,
Leu (L) Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K) Arg, Gln, Asn
Met (M) Leu, Phe, Ile
Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala
Pro (P) Gly
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala
B. Polinucleótidos
Los ácidos nucleicos que codifican para una proteína terapéutica de la invención incluyen, por ejemplo y sin limitación, genes, pre-ARNm, miARN, ADNc, variantes polimórficas, alelos, mutantes sintéticos y que se producen de manera natural.
Los polinucleótidos que codifican para una proteína terapéutica de la invención también incluyen, sin limitación, aquellos que (1) se hibridan específicamente en condiciones de hibridación estrictas con un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos a la que se hace referencia tal como se describe en el presente documento, y variantes modificadas de manera conservadora de la misma; (2) tienen una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de nucleótidos mayor de aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o más, en una región de al menos aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 o más nucleótidos (hasta la secuencia de longitud completa de 1218 nucleótidos de la proteína madura), con respecto a una secuencia de ácido nucleico a la que se hace referencia tal como se describe en el presente documento. Las condiciones a modo de ejemplo de “hibridación estricta” incluyen hibridación a 42°C en formamida al 50%, 5X SSC, Na^PO420 mM, pH 6,8; y lavado en 1X SSC a 55°C durante 30 minutos. Se entiende que la variación en estas condiciones a modo de ejemplo puede realizarse basándose en la longitud y el contenido de nucleótidos GC de las secuencias que van a hibridarse. Las fórmulas convencionales en la técnica son apropiadas para determinar las condiciones de hibridación apropiadas. Véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) §§ 9.47-9.51.
Una secuencia polinucleotídica o polipeptídica “que se produce de manera natural” es normalmente de un mamífero que incluye, pero no se limita a, primates, por ejemplo, humanos; roedor, por ejemplo, rata, ratón, hámster; vaca, cerdo, caballo, oveja o cualquier mamífero. Los ácidos nucleicos y las proteínas de la invención pueden ser moléculas recombinantes (por ejemplo, heterólogas y que codifican para la secuencia de tipo natural o una variante de la misma, o que no se produce de manera natural).
C. Producción de proteínas terapéuticas.
La producción de una proteína terapéutica incluye cualquier método conocido en la técnica para (i) la producción de ADN recombinante mediante ingeniería genética, (ii) la introducción de ADN recombinante en células procariotas o eucariotas, por ejemplo y sin limitación, transfección, electroporación o microinyección, (iii) el cultivo de dichas células transformadas, (iv) la expresión de la proteína terapéutica, por ejemplo, de manera constitutiva o tras la inducción y (v) el aislamiento de dicha proteína de la coagulación sanguínea, por ejemplo, del medio de cultivo o recogiendo las células transformadas, para obtener proteína terapéutica purificada.
En otros aspectos, la proteína terapéutica se produce por expresión en un sistema huésped procariota o eucariota adecuado caracterizado por producir una molécula de proteína de la coagulación sanguínea farmacológicamente aceptable. Ejemplos de células eucariotas son células de mamíferos tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep y HepG2.
Se usa una amplia variedad de vectores para la preparación de la proteína terapéutica y se seleccionan de vectores de expresión eucariotas y procariotas. Los ejemplos de vectores para la expresión procariota incluyen plásmidos tales como, y sin limitación, pRSET, pET y pBAD, en los que los promotores usados en los vectores de expresión procariota incluyen uno o más de, y sin limitación, lac, trc, trp, recA o araBAD. Los ejemplos de vectores para la expresión eucariota incluyen: (i) para la expresión en levadura, vectores tales como, y sin limitación, pAO, pPIC, pYES o pMET, usando promotores tales como, y sin limitación, AOX1, GAP, GAL1 o AUG1 ; (ii) para la expresión en células de insecto, vectores tales como y sin limitación, pMT, pAc5, pIB, pMIB o pBAC, usando promotores tales como y sin limitación PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 o polh, y (iii) para la expresión en células de mamíferos, vectores tales como y sin limitación pSVL, pCMV, pRc/RSv, pcDNA3 o pBPV, y vectores derivados de, en un aspecto, sistemas virales tales como y sin limitación virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes o retrovirus, usando promotores tales como y sin limitación CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV y p-actina.
En diversas realizaciones de la invención, las proteínas terapéuticas se modifican conjugando derivados de ácidos grasos solubles en agua o ligadores solubles en agua con uno o más hidratos de carbono en la proteína terapéutica. Por tanto, en una realización, la proteína terapéutica es una glicoproteína y se purifica de una célula huésped que permite la glicosilación (es decir, la proteína se glicosila in vivo y posteriormente se purifica como una glicoproteína). En diversas realizaciones, la proteína terapéutica es o no es una glicoproteína y se glicosila in vitro después de la purificación de una célula huésped. Los métodos de glicosilación in vitro se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Meynial-Salles I y Combes D, Journal of Biotechnology 1996, 46: 1-14;/ Solá RJ y Griebenow K, BioDrugs 2010, 24: 9-21). Por supuesto, un experto en la técnica podría (1) purificar la proteína terapéutica; (2) modificar la proteína terapéutica para permitir la glicosilación in vitro, opcionalmente específica de sitio (por ejemplo, deleciones/inserción/sustituciones de aminoácidos); y (3) glicosilar la proteína modificada in vitro según los procedimientos conocidos en la técnica.
D. Administración
En una realización de la presente divulgación, una proteína terapéutica conjugada de la presente invención puede administrarse mediante inyección, tal como inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal.
Para administrar composiciones que comprenden una proteína terapéutica conjugada de la presente invención a humanos o animales de prueba, en un aspecto, las composiciones comprenden uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los términos “farmacéuticamente” o “farmacológicamente aceptables” se refieren a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhiben la degradación de proteínas tales como productos de agregación y escisión, y además no producen reacciones alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran usando vías bien conocidas en la técnica, tal como se describe a continuación. Los “portadores farmacéuticamente aceptables” incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción clínicamente útiles y similares, incluyendo los agentes divulgados anteriormente.
Tal como se usa en el presente documento, “cantidad eficaz” incluye una dosis adecuada para tratar una enfermedad o trastorno o mejorar un síntoma de una enfermedad o trastorno. En una realización, “cantidad eficaz” incluye una dosis adecuada para tratar un mamífero que tiene un trastorno hemorrágico tal como se describe en el presente documento.
Las composiciones pueden administrarse por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral, mediante aerosol por inhalación, por vía vaginal, rectal o por inyección intracraneal. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección intracisternal o técnicas de infusión. También se contempla la administración por inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar o implantación quirúrgica en un sitio particular. Generalmente, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como otras impurezas que podrían ser perjudiciales para el receptor.
Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones pueden llevarse a cabo con los niveles de dosis y el patrón seleccionados por el médico tratante. Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, tal como se describió anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el medicamento se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al fármaco, y la discreción del médico tratante.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una proteína terapéutica conjugada tal como se define en el presente documento. La composición farmacéutica puede comprender además un portador, diluyente, sal, tampón o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede usarse para tratar los trastornos hemorrágicos definidos anteriormente. La composición farmacéutica de la invención puede ser una disolución o un producto liofilizado. Las disoluciones de la composición farmacéutica pueden someterse a cualquier procedimiento de liofilización adecuado. Como aspecto adicional, la invención incluye kits que comprenden una composición de la invención envasada de una manera que facilita su uso para la administración a sujetos. En una realización, tal kit incluye un compuesto o composición descrita en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende una proteína terapéutica conjugada), envasada en un recipiente tal como una botella o recipiente sellado, con una etiqueta pegada al recipiente o incluida en el paquete que describe el uso del compuesto o composición en la práctica del método. En una realización, el kit contiene un primer recipiente que tiene una composición que comprende una proteína terapéutica conjugada y un segundo recipiente que tiene una disolución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición en el primer recipiente. En un aspecto, el compuesto o composición se envasa en una forma de dosificación unitaria. El kit puede incluir además un dispositivo adecuado para administrar la composición según una vía específica de administración. Preferiblemente, el kit contiene una etiqueta que describe el uso de la composición de proteína o de péptido terapéutica.
ÁCIDOS GRASOS, DERIVADOS DE ÁCIDOS GRASOS Y CONJUGADOS DERIVADOS PROTEÍNAS Y ÁCIDOS GRASOS
En un aspecto, una molécula derivada de proteína terapéutica (una proteína terapéutica conjugada) proporcionada en el presente documento está unida a un derivado de ácido graso soluble en agua. Tal como se usa en la presente divulgación, un “derivado de ácido graso soluble en agua” comprende un ácido graso (es decir, un ácido carboxílico) conjugado con un ligador soluble en agua (por ejemplo, un ligador aminooxilo) tal como se describe en el presente documento. El derivado de ácido graso soluble en agua según la presente invención comprende un ácido graso o un éster de ácido graso conjugado con un ligador aminooxilo. Tales derivados de ácidos grasos, según la invención, son estables (es decir, no se liberan de la proteína), solubles en agua y capaces de unirse a albúmina sérica humana.
Ácidos grasos
Los ácidos grasos (es decir, FA) incluyen, pero no se limitan a, ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, ácidos grasos de cadena ramificada (Mukheriji etal., Prog Lipid Res 2003; 42: 359-76) y derivados de los mismos que son capaces de unirse a albúmina sérica humana según la presente invención.
A modo de ejemplo, los ácidos grasos tienen la siguiente estructura general:
FA saturado: estructura general
Figure imgf000044_0001
Éster metílico de FA saturado: estructura general
Figure imgf000044_0002
ado: estructura general
Los ácidos grasos, según diversas realizaciones de la presente invención, también comprenden diversas estructuras alternativas (por ejemplo, ésteres metílicos o etílicos) u otras estructuras tales como las que contienen grupos terminales en posición o (por ejemplo, grupos hidroxilo, amino, tio y carboxilo).
En una realización, el ácido graso es un ácido graso que se produce de manera natural. En diversas realizaciones, el ácido graso es un ácido graso de cadena corta (por ejemplo, menos de seis carbonos), un ácido graso de cadena media (por ejemplo, 6-12 carbonos), ácidos grasos de cadena larga (por ejemplo, más de 12 carbonos), o un ácido graso de cadena muy larga (por ejemplo, más de 22 carbonos). En otra realización, el ácido graso tiene entre 4 y 28 carbonos. En una realización, el ácido graso está en la configuración cis. En todavía otra realización, el ácido graso está en la configuración trans.
En una realización, el ácido graso es un ácido graso saturado de 12 a 20 carbonos de longitud. Tales ácidos grasos se conocen en la técnica, por ejemplo, C12 (ácido dodecanoico, ácido láurico), C14 (ácido tetradecanoico, ácido mirístico), C16 (ácido hexadecanoico, ácido palmítico), C18 (ácido octadecanoico, ácido esteárico) y C20 (ácido eicosanoico, ácido araquídico). Ejemplos de ácidos grasos insaturados son ácido miristoleico (C14:1), ácido palmitoleico (C16:1), ácido oleico (C18:1), ácido linoleico (C18:2) y ácido araquidónico (C20:4). La mayoría de los ácidos grasos están disponibles comercialmente y pueden prepararse mediante diferentes métodos químicos (Recent Developments in the Synthesis of Fatty Acid Derivatives, editores: Knothe G y Derksen JTB, AOCS Press 1999, ISBN 1-893997-00-6.)
En diversas realizaciones de la presente invención, el ácido graso comprende 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ó 50 carbonos.
B. Derivados de ácidos grasos.
La presente invención proporciona la preparación de una nueva clase de derivados de ácidos grasos activados (derivados de FA) que pueden unirse a albúmina sérica humana. Los derivados de FA contienen un espaciador o ligador soluble en agua, que permite el manejo y la manipulación de derivados de FA en disolución acuosa (es decir, los derivados de ácidos grasos según la presente invención son solubles en agua, a diferencia de los ácidos grasos correspondientes de los que se derivan). Los derivados de FA contienen un grupo aminooxilo activo, que permite el acoplamiento del derivado de FA a un resto de hidrato de carbono oxidado (predominantemente N-glicanos) de proteínas terapéuticas para formar uniones oxima estables. Tal como se usa en el presente documento, una unión “estable” significa que se forma un enlace covalente que es “no liberable” o no hidrolizable.
La modificación química a través de hidratos de carbono podría ser la opción preferida para proteínas de la coagulación como FVIII, FIX y FVIIa para formar conjugados con alta actividad residual.
A modo de ejemplo, la siguiente estrategia representa una realización según la presente invención para preparar un derivado de FA soluble en agua que contiene un grupo aminooxilo activo.
Estrategia 1:
El grupo ro-hidroxilo de un derivado de FA (por ejemplo, ácido 16-hidroxihexadecanoico) se somete a oxidación con peryodinano de Dess Martin para generar un grupo aldehído. En la siguiente etapa, un ligador de diaminooxilo que contiene una cadena de PEG soluble en agua (por ejemplo, 3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina) se acopla a este grupo aldehído para formar una unión oxima estable. El siguiente esquema representa un ejemplo según la estrategia 1:
Etapa 1: se oxidó selectivamente ácido 16-hidroxiesteárico con reactivo de Dess-Martin para producir ácido 16-oxoestearico. El producto bruto se purificó por cromatografía usando gel de sílice como agente de separación.
Figure imgf000045_0002
Peryodinano de Dess Martin
Figure imgf000045_0001
DCM THF 0°C 16h
27042
acido 16-hidroxihexadecanoico acido 16-oxohexadecanoico
Etapa 2: se hizo reaccionar el resto 16-oxo de la sal de sodio del ácido 16-oxoestearico con 3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina. El producto bruto se purificó por cromatografía usando gel de sílice como agente de separación.
Figure imgf000045_0003
Alternativamente, otra realización, la siguiente estrategia se emplea para preparar derivados de FA solubles en agua que contienen un grupo aminooxilo activo.
Estrategia 2:
El grupo carboxilo de un ácido graso ra-hidroxilo (por ejemplo, ácido 16-hidroxihexadecanoico) se esterifica con cloruro de acetilo. El grupo o-hidroxilo de este derivado de éster metílico se activa con cloruro de mesilo para introducir un mejor grupo saliente. Luego, el grupo mesilo se hace reaccionar con un ligador de diaminooxilo que contiene una cadena de PEG soluble en agua (por ejemplo, 3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina) para formar un enlace aminooxilo-metileno estable. Opcionalmente, el éster metílico puede hidrolizarse en disolución alcalina para generar un grupo carboxilo libre. El siguiente esquema representa un ejemplo según la estrategia 2:
Etapa 1: el resto de ácido carboxílico del ácido 16-hidroxihexadecanoico se protegió formando el éster metílico usando cloruro de acetilo como reactivo de metilación.
Figure imgf000045_0004
Etapa 2: el resto 16-hidroxilo de éster metílico del ácido 16-hidroxihexadecanoico se activó sustituyendo el grupo hidroxilo con mesilo, que es el mejor grupo saliente.
Figure imgf000046_0001
Etapa 3: el resto 16-mesilo de éster metílico del ácido 16-metilsulfonilhexadecanoico se sustituyó por un resto aminooxilo de la 3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina bifuncional. El producto bruto se purifica por cromatografía usando gel de sílice como agente de separación.
Figure imgf000046_0002
Éster metílico del ácido Éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminoetoxi)-etoxi)-16-metilsulfonilhexadecanoico etoxi)-extoxiamino)-hexadecanoico
Se divulgan estrategias adicionales en el presente documento, pero no forman parte de la presente invención.
Tal como se describe en el presente documento, se divulga el uso de otras químicas que incluyen, pero no se limitan a, hidrazidas para acoplamiento a grupos aldehído, ésteres de NHS para acoplamiento a grupos amino y maleimidas para acoplamiento a grupos SH libres de proteínas terapéuticas.
A modo de ejemplo, un éster metílico de ácido graso preparado tal como se describió anteriormente se hace reaccionar con un MAL-PEG-COOH disponible comercialmente (mal-PEG(12)-COOH/IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Alemania) tal como se describe en el presente documento. A modo de otro ejemplo más, un éster de ácido graso con un grupo amino reactivo se hace reaccionar con un NHS-PEG-NHS disponible comercialmente (NHS-dPEG(4)-NHS/IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Alemania) tal como se describe en el presente documento.
Los ligadores solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua (por ejemplo, PEG). El ligador puede consistir en cualquier estructura química que contenga uno o más grupos funcionales, lo que aumenta su solubilidad en agua. Estos grupos funcionales podrían tener la capacidad de formar una carga negativa o positiva, haciendo que el ligador sea soluble en agua. En una realización, este grupo funcional incluye, pero no se limita a un grupo sulfo o carboxilo. Además, puede usarse cualquier grupo funcional polar, lo que hace que el ligador sea más soluble en agua. Ejemplos de esto son los grupos hidroxilo, amino, amido, maleimido, aminooxilo e hidrazida, así como los ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) y los ésteres de sulfo NHS.
En diversas realizaciones, el polímero soluble en agua incluye, pero no se limita a, polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, poli(ácido siálico) (PSA), almidón de hidroxialquilo (HAS), almidón de hidroxietilo (HES), hidrato de carbono, polisacáridos, pululano, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, almidón, dextrano, carboximetildextrano, poli(óxido de alquileno) (PAO), polialquilenglicol (PAG), polipropilenglicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfaceno, polietileno-co-anhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido maleico y poli(1-hidroximetiletilenhidroximetilformal) (PHF).
En una realización, el polímero soluble en agua es PEG. En diversas realizaciones de la invención, el polímero soluble en agua comprende una longitud de cadena de entre aproximadamente 3 y 25 oxígenos. Por ejemplo, el polímero soluble en agua comprende 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 ó 25 oxígenos, en diversas realizaciones según la presente invención.
C. Conjugados de derivados de proteínas y ácidos grasos
La presente invención contempla sistemas ligadores de aminooxilo (es decir, en los que un derivado de ácido graso soluble en agua comprende un ligador aminooxilo). Por ejemplo, en una realización de la invención, la reacción de hidroxilamina o derivados de hidroxilamina con aldehídos (en un resto de hidrato de carbono tras la oxidación) para formar un grupo oxima se aplica a la preparación de conjugados de proteínas. Por ejemplo, una glicoproteína (una proteína terapéutica según la presente invención) se oxida en primer lugar con un agente oxidante tal como peryodato de sodio (NaIO4 ) (Rothfus JA y Smith EL., J Biol Chem 1963, 238, 1402-10; y Van Lenten L y Ashwell G., J Biol Chem 1971,246, 1889-94). La oxidación de peryodato de glicoproteínas se basa en la reacción clásica de Malaprade descrita en 1928, la oxidación de dioles vecinales con peryodato para formar un grupo aldehído activo (Malaprade L., Analytical application, Bull Soc Chim France, 1928, 43, 683-96). Ejemplos adicionales para tal agente oxidante son el tetraacetato de plomo (Pb(OAc)4), acetato de manganeso (MnO(Ac)3), acetato de cobalto (Co(OAc)2), acetato de talio (TIOAc), sulfato de cerio (Ce(SO4)2 ) (documento US 4.367,309) o perrutenato de potasio (KRuO4) (Marko et al., J Am Chem Soc 1997,119, 12661-2). Por “agente oxidante” se entiende un compuesto oxidante suave que es capaz de oxidar dioles vecinales en hidratos de carbono, generando así grupos aldehídos activos en condiciones de reacción fisiológicas.
La segunda etapa es el acoplamiento del polímero (derivado de ácido graso) que contiene un grupo aminooxilo al resto de hidrato de carbono oxidado para formar una unión oxima. En una realización de la invención, esta etapa puede llevarse a cabo en presencia de cantidades catalíticas del catalizador nucleófilo anilina o derivados de anilina (Dirksen A y Dawson PE, Bioconjugate Chem. 2008; Zeng Y et al., Nature Methods 2009; 6: 207-9). La catálisis de anilina acelera drásticamente la ligación de oxima permitiendo el uso de concentraciones muy bajas de los reactivos. En otra realización de la invención, la unión oxima se estabiliza por reducción con NaCNBH3 para formar una unión alcoxiamina. A continuación, se describen catalizadores adicionales. En otra realización, esta etapa se lleva a cabo en presencia de m-toluidina.
En una realización de la invención, las etapas de reacción para conjugar un ligador soluble en agua (derivado de ácido graso) con una proteína se llevan a cabo por separado y secuencialmente (es decir, materiales de partida (proteína terapéutica, ligador soluble en agua, etc.), reactivos (agentes oxidantes, anilina, etc.) y productos de reacción (hidrato de carbono oxidado en una proteína terapéutica, ligador de aminooxilo activado soluble en agua, etc.) se separan entre las etapas de reacción individuales). En otra realización, los materiales de partida y los reactivos necesarios para completar una reacción de conjugación según la presente invención se llevan a cabo en un único recipiente. En una realización, la proteína nativa se mezcla con el reactivo de aminooxilo-polímero. Posteriormente, se añade el reactivo oxidante y se realiza la reacción de conjugación.
Puede encontrarse información adicional sobre la tecnología de aminooxilo en las siguientes referencias: documento EP 1681303A1 (eritropoyetina HASilada); documento WO 2005/014024 (conjugados de un polímero y una proteína ligada por un grupo de unión de oxima); documento WO96/40662 (compuestos ligadores que contienen aminooxilo y su aplicación en conjugados); documento WO 2008/025856 (proteínas modificadas); Peri F et al., Tetrahedron 1998, 54, 12269-78; Kubler-Kielb J y Pozsgay V., J Org Chem 2005, 70, 6887-90; Lees A et al., Vaccine 2006, 24 (6), 716­ 29; y Heredia KL et al., Macromolecules 2007, 40 (14), 4772-9.
En determinados aspectos de la presente divulgación, las proteínas terapéuticas se conjugan con derivados de ácidos grasos solubles en agua por cualquiera de una variedad de métodos químicos (Roberts JM et al., Advan Drug Delivery Rev 2002; 54: 459-76). Por ejemplo, en una realización de la divulgación, una proteína terapéutica se modifica mediante la conjugación de derivados de ácidos grasos con grupos amino libres de la proteína usando ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS). En otra realización, el derivado de ácido graso soluble en agua se acopla a grupos SH libres usando química de maleimida. En una realización de la invención, el derivado de ácido graso soluble en agua se acopla mediante el uso de química aminooxilo a los restos de hidrato de carbono de la proteína terapéutica después de la oxidación previa.
En una realización de la divulgación, una proteína terapéutica se modifica a través de residuos de lisina mediante el uso de derivados de ácidos grasos solubles en agua que contienen un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) activo. Este derivado reacciona con los residuos de lisina de la proteína terapéutica en condiciones suaves formando un enlace amida estable.
En otra realización de la divulgación, la unión a través de un enlace peptídico entre un grupo carboxilo en uno de los derivados de proteína o ácido graso y un grupo amina de la proteína o derivado de ácido graso, o una unión éster entre un grupo carboxilo de la proteína o se contempla un derivado de ácido graso y un grupo hidroxilo de la proteína terapéutica o derivado de ácido graso. Otra unión por la que la proteína terapéutica se une de manera covalente al derivado de ácido graso es a través de una base de Schiff, por ejemplo, entre un grupo amino libre en la proteína que reacciona con un grupo aldehído formado en un extremo terminal de un ácido graso. La base de Schiff generada se estabiliza en un aspecto mediante reducción específica con NaCNBH3 para formar una amina secundaria. Un enfoque alternativo es la generación de grupos amino libres terminales en el derivado de ácido graso por aminación reductora con NH4Cl después de la oxidación previa. Pueden usarse reactivos bifuncionales para ligar dos grupos amino o dos grupos hidroxilo. Por ejemplo, un derivado de ácido graso que contiene un grupo amino se acopla a grupos amino de la proteína con reactivos como BS3 (bis(sulfosuccinimidil)suberato/Pierce, Rockford, IL). Además, se usan reactivos de reticulación heterobifuncionales como sulfo-EMCS (éster de N-g-maleimidocaproiloxi)sulfosuccinimida/Pierce), por ejemplo, para ligar grupos amina y tiol.
En otro enfoque divulgado en el presente documento, se prepara un derivado de ácido graso con un grupo hidrazida activo y se acopla al resto de hidrato de carbono de la proteína después de la oxidación previa y la generación de funciones aldehído.
Tal como se describió anteriormente, un grupo amina libre de la proteína terapéutica reacciona con el grupo 1-carboxilo de un derivado de ácido graso para formar un enlace peptidilo o se forma una unión éster entre el grupo ácido 1-carboxílico y un hidroxilo u otro grupo activo adecuado en una proteína
En diversas realizaciones, la proteína terapéutica se liga a o se asocia con el derivado de ácido graso en cantidades estequiométricas (por ejemplo, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9 o 1:10, etc.). En diversas realizaciones, 1­
6, 7-12 o 13-20 derivados de ácidos grasos se ligan a la proteína. En todavía otras realizaciones, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más derivados de ácidos grasos se ligan a la proteína.
En diversas realizaciones, la proteína terapéutica se modifica para introducir sitios de glicosilación (es decir, sitios distintos de los sitios de glicosilación nativos). Tal modificación puede lograrse usando técnicas convencionales de biología molecular conocidas en la técnica. Además, la proteína terapéutica, antes de la conjugación con un ligador soluble en agua a través de uno o más restos de hidrato de carbono, puede glicosilarse in vivo o in vitro. Estos sitios glicosilados pueden servir como dianas para la conjugación de las proteínas con ligadores solubles en agua (solicitud de patente estadounidense n.° 20090028822, solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0093399, solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0081188, solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0254836, solicitud de patente estadounidense n.° 2006/0111279 y DeFrees S. et al., Glycobiology, 2006, 16, 9, 833-43).
En una realización, la proteína conjugada conserva la actividad funcional completa de los productos de proteínas terapéuticas nativas y proporciona una semivida prolongada in vivo, en comparación con los productos de proteínas
, el 42, el 43 , el 61, el 62 , el 80, el 81
Figure imgf000048_0001
, el 99, el 10 el 120, el 130, el 140 o el 150 por ciento (%) de actividad biológica en relación con la proteína nativa.
En un aspecto relacionado, las actividades biológicas de la proteína conjugada y la proteína de la coagulación sanguínea nativa se determinan por las razones de actividad cromogénica con respecto al valor de antígeno del factor de la coagulación sanguínea (factor de la coagulación sanguínea:Chr: factor de la coagulación sanguínea:Ag).
En todavía otra realización más de la invención, la semivida de la proteína conjugada se disminuye o aumenta 0,5,
0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces en relación con la semivida in vivo de la proteína terapéutica nativa.
CATALIZADORES NUCLEÓFILOS
Tal como se describe en el presente documento, la anilina puede catalizar la conjugación de derivados de ácidos grasos solubles en agua con proteínas terapéuticas. La anilina cataliza fuertemente las reacciones acuosas de aldehídos y cetonas con aminas para formar iminas estables tales como hidrazonas y oximas. El siguiente diagrama compara una reacción de ligación de oxima catalizada por anilina frente a no catalizada (adaptada de Kohler JJ, ChemBioChem 2009; 10: 2147-50).
Figure imgf000049_0001
Sin embargo, considerando los numerosos riesgos para la salud asociados con la anilina, son deseables catalizadores alternativos. La presente invención proporciona derivados de anilina como catalizadores alternativos de ligación de oxima. Tales derivados de anilina incluyen, pero no se limitan a, ácido o-aminobenzoico, ácido m-aminobenzoico, ácido p-aminobenzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o-toluidina, m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, manisidina y p-anisidina. El siguiente diagrama compara una reacción de ligación de oxima catalizada por m-toluidina frente a no catalizada (documento PCT/US2011/45873):
Figure imgf000050_0001
En una realización de la invención, se usa m-toluidina (también conocida como meta-toluidina, m-metilanilina, 3-metilanilina o 3-amino-1-metilbenceno) para catalizar las reacciones de conjugación descritas en el presente documento. La m-toluidina y anilina tienen propiedades físicas similares y esencialmente el mismo valor de pKa (mtoluidina: pKa 4,73, anilina: pKa 4,63).
Los catalizadores nucleófilos de la invención son útiles para la ligación de oxima (usando unión aminooxilo). En diversas realizaciones de la invención, el catalizador nucleófilo se proporciona en la reacción de conjugación a una concentración de 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 , 35, 40, 45 ó 50 mM. En una realización, el catalizador nucleófilo se proporciona entre 1 y 10 mM. En diversas realizaciones de la invención, el intervalo de pH de la reacción de conjugación está entre 4,0 y 7,0, entre 4,5 y 7,0, entre 5,0 y 6,5, entre 5,0 y 6,5. En diversas realizaciones, el pH de la reacción de conjugación es pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 y 7,5. En una realización, el pH está entre 5,5 y 6,5.
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS CONJUGADAS
En diversas realizaciones, se desea la purificación de una proteína que se ha incubado con un agente oxidante y/o una proteína terapéutica que se ha conjugado con un derivado de ácido graso soluble en agua según la invención. Se conocen numerosas técnicas de purificación en la técnica e incluyen, sin limitación, métodos cromatográficos, métodos de filtración y métodos de precipitación (véase, por ejemplo, Guide to Protein Purification, Meth. Enzymology vol 463 (editado por Burgess RR y Deutscher MP), 2a edición, Academic Press 2009).
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones específicas de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
Preparación del ligador homobifuncional NH2 ÍOCH2CH2 I2ONH2
El ligador homobifuncional NH2[OCH2CH2]2ONH2
Se sintetizó 3-oxapentano-1,5-dioxiamina que contenía dos grupos aminooxilo activos según Boturyn et al.
(Tetrahedron 1997; 53: 5485-92) en una reacción orgánica de dos etapas que emplea una síntesis de Gabriel modificada de aminas primarias (figura 1). En la primera etapa, se hizo reaccionar una molécula de 2,2-diclorodietil éter con dos moléculas de endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida en DMF. Se preparó el producto homobifuncional deseado a partir del producto intermedio resultante por hidrazinolisis en etanol.
Ejemplo 2
Preparación del ligador homobifuncional NH2ÍOCH2CH216ONH2
El ligador homobifuncional NH2 [OCH2 CH2]6ONH2
Figure imgf000051_0001
Se sintetizó 3,6,9,12,15-pentaoxa-heptadecano-1,17-dioxiamina que contenía dos grupos aminooxilo activos según Boturyn et al. (Tetrahedron 1997; 53: 5485-92) en una reacción orgánica de dos etapas que emplea una síntesis de Gabriel modificada de aminas primarias. En la primera etapa, se hizo reaccionar una molécula de dicloruro de hexaetilenglicol con dos moléculas de endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida en DMF. Se preparó el producto homobifuncional deseado a partir del producto intermedio resultante por hidrazinolisis en etanol.
Ejemplo 3
Preparación del ligador homobifuncional NHyfOCHyCHyUONH?
Figure imgf000051_0002
Se sintetizó el ligador homobifuncional NH2 [OCH2CH2]4ONH2 (3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina) que contenía dos grupos aminooxilo activos según Boturyn et al. (Tetrahedron 1997; 53: 5485-92) en una reacción orgánica de dos etapas que emplea una síntesis de Gabriel modificada de aminas primarias: En la primera etapa, se hizo reaccionar una molécula de bis-(2-(2-cloroetoxi)-etil)-éter con dos moléculas de endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida en DMF. Se preparó el producto homobifuncional final a partir del producto intermedio resultante por hidrazinolisis en etanol.
Ejemplo 4
Preparación de sal de sodio del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiimino)-hexadecanoico
Se sintetizó el ligador de ácido graso-aminooxilo sal de sodio del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiimino)-hexadecanoico según Halligan y Nair (Arkivoc 2006 (ii) 101-106) y Hubbs y Heathcock (J Am Chem Soc, 2003; 125: 12836-43) en una reacción de dos etapas.
Producto intermedio 1: sal de sodio del ácido 16-oxohexadecanoico
Figure imgf000051_0003
A una disolución enfriada (0°C) de ácido 16-hidroxihexadecanoico (800 mg, 2,9 mmol) en diclorometano (10 ml) y tetrahidrofurano (20 ml) se le añadió peryodinano de Dess-Martin (1636 mg, 3,7 mmol) a 0°C. Se agitó la mezcla durante 3,5 horas a 0°C y 2,5 horas a temperatura ambiente bajo una atmósfera de Ar. Se añadió luego una disolución al 15% de tiosulfato de sodio en disolución saturada de bicarbonato de sodio, se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Se extrajo el producto intermedio 1 con dietil éter, después de secar sobre sulfato de sodio, se evaporó la fase orgánica hasta sequedad y se purificó por cromatografía en columna usando gel de sílice como agente de separación y una mezcla de disolventes de tolueno/acetato de etilo. Rendimiento: 34% (sólido blanco). Producto: sal de sodio del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiimino)-hexadecanoico
o
A una disolución de 3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina (146 mg, 0,65 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (3 ml), se le añadió el producto intermedio 1 (19,1 mg, 0,07 mmol). Se agitó la mezcla durante 1,5 horas a temperatura ambiente bajo una atmósfera de Ar. Se evaporó luego la mezcla hasta sequedad y se purificó por cromatografía en columna usando gel de sílice como agente de separación y una mezcla de disolventes de diclorometano/metanol/base de Huenig. Rendimiento: 71% (sólido blanco).
Espectrometría de masas (ESI): m/z = 477,3529 para [M 2H]+
Ejemplo 5
Preparación de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexadecanoico Se sintetizó el ligador de éster metílico de ácidos grasos-aminooxilo éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexadecanoico según Hang et al. (J Am Chem Soc 2007; 129: 2744-5) en una reacción de tres etapas.
Producto intermedio 1: éster metílico del ácido 16-hidroxihexadecanoico
Figure imgf000052_0001
A una disolución enfriada (0°C) de ácido 16-hidroxihexadecanoico (3000 mg, 10,79 mmol) en metanol anhidro (27 ml), se le añadió cloruro de acetilo (3,837 ml, 53,96 mmol) gota a gota a 0°C en el plazo de 2 minutos, se agitó luego la mezcla a temperatura ambiente durante 3,5 horas bajo una atmósfera de Ar. Posteriormente, se evaporó la mezcla hasta sequedad, se disolvió el residuo en diclorometano (100 ml), se lavó con disolución saturada de bicarbonato de sodio (2x50 ml) y disolución de salmuera (1x50 ml). Después de secar sobre sulfato de sodio, se evaporó la fase orgánica recogida hasta sequedad y se secó a vacío a temperatura ambiente. Rendimiento: 92% (sólido blanco). Producto intermedio 2: éster metílico del ácido 16-metilsulfonilhexadecanoico
Figure imgf000052_0002
A una disolución enfriada (0°C) del producto intermedio 1 (2807 mg, 9,80 mmol) en diclorometano (40 ml) se le añadió trietilamina (1,502 ml, 10,78 mmol), luego se le añadió una disolución preenfriada (0°C) de cloruro de mesilo (0,834 ml, 10,78 mmol) en diclorometano (5 ml) gota a gota en el plazo de 10 minutos a 0°C. Se agitó la mezcla durante 30 minutos a 0°C y durante 2,75 horas a temperatura ambiente. Luego se diluyó la mezcla con diclorometano (150 ml), se lavó con agua (1x100 ml), disolución saturada de bicarbonato de sodio (2x100 ml) y disolución de salmuera (1x100 ml). Después de secar sobre sulfato de sodio, se evaporó la fase orgánica recogida hasta sequedad y se secó a vacío a temperatura ambiente. Rendimiento: 95% (sólido blanco amarillo pálido).
Producto: éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexadecanoico
Figure imgf000052_0003
A una disolución de 3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina (517 mg, 2,30 mmol) en N,N-dimetilformamida anhidra (22 ml) se le añadió una disolución de producto intermedio 2 (70 mg, 0,19 mmol) en N,N-dimetilformamida anhidra (7 ml) gota a gota durante 1 hora a temperatura ambiente bajo una atmósfera de Ar; se agitó la mezcla durante 2 días a diferentes temperaturas (temperatura ambiente, 50°C, 80°C) para completar la reacción. Se evaporó luego la mezcla hasta sequedad, se purificó el producto bruto por cromatografía en columna usando gel de sílice como agente de separación y una mezcla de disolventes de diclorometano/metanol. Rendimiento: 31% (aceite blanco incoloro parcialmente solidificado).
Espectrometría de masas (ESI): m/z = 493,3824 para [M H]+
Ejemplo 6
Acoplamiento de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexa-decanoico al resto de hidrato de carbono del factor VIII de la coagulación
Se prepara FA-rFVIII usando un procedimiento de dos etapas. En la primera etapa, se oxida rFVIII con NaIO4 y se purifica por cromatografía de intercambio aniónico (AEC). Posteriormente, el rFVIII oxidado se modifica con el reactivo FA-aminooxilo.
Se oxida rFVIII (material de partida de 45 mg) con NaIO4 (concentración final 200 |iM). Después de un tiempo de incubación de 30 minutos (22°C), se detiene la reacción de oxidación añadiendo una disolución acuosa de L-cisteína 1 M (concentración final: 10 mM). Se purifica el rFVIII oxidado por cromatografía de intercambio aniónico en EMD TMAE(M). Luego, se añaden 25 |il de una disolución al 10% (p/v) de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexadecanoico (preparado según el ejemplo 3) en DMSO al eluato (concentración de proteína 2 mg/ml) y se realiza la reacción de acoplamiento durante 18 horas a 4°C. Luego, se purifica el conjugado FA-rFVIII adicionalmente por HIC en Phenyl Sepharose 4 FF. Finalmente, se concentra el eluato por UF/DF usando una membrana de 30 kD (MILLIPORE).
Ejemplo 7
Acoplamiento de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-am¡noox¡etox¡)-etox¡)-etoxi)-etox¡am¡no)-hexa-decano¡co al resto de hidrato de carbono del factor IX de la coagulación
Se disuelven 10 mg de rFIX en tampón de reacción (L-histidina 20 mM, CaCl25 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0) para dar una concentración final de 2,5 mg/ml. A esta disolución, se le añadió una disolución acuosa de NaIO4 para obtener una concentración final de 100 |iM. Se incubó la mezcla de reacción durante 1 hora a 4°C con agitación suave en la oscuridad. Luego, se carga la mezcla en columnas de desalación PD-10 preequilibradas para retirar el exceso de NaIO4. A esta mezcla, se le añaden 8 |il de una disolución al 10% (p/v) de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexa-decanoico (preparado según el ejemplo 3) en DMSO y se lleva a cabo la reacción de acoplamiento a pH 6,0 durante 18 h a 4°C. Luego, se purifica adicionalmente el conjugado por IEX en Q-Sepharose FF. Finalmente, se concentra el eluato por UF/DF usando dispositivos Vivaspin.
Ejemplo 8
Acoplamiento de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-am¡noox¡etox¡)-etox¡)-etoxi)-etox¡am¡no)-hexa-decano¡co al resto de hidrato de carbono del factor VIIa de la coagulación
Se disuelven 10 mg de rFVIIa en tampón de reacción ((Hepes 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de calcio 5 mM, pH 6,0) para dar una concentración final de 2,0 mg/ml. A esta disolución se le añade una disolución acuosa de NaIO4 5 mM para obtener una concentración final de 50 |iM. Se incuba la mezcla de reacción durante 1 h a 4°C con agitación suave en la oscuridad. Luego, se carga la mezcla en columnas de desalación PD-10 preequilibradas para retirar el exceso de NaIO4. A esta mezcla, se le añaden 8 |il de una disolución al 10% (p/v) de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexa-decanoico (preparado según el ejemplo 3) en DMSO y se lleva a cabo la reacción de acoplamiento a pH 6,0 durante 18 h a 4°C. Luego, se purifica adicionalmente el conjugado por IEX en Q-Sepharose FF. Finalmente, se concentra el eluato por UF/DF usando dispositivos Vivaspin.
Ejemplo 9
Acoplamiento de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-am¡noox¡etox¡)-etox¡)-etoxi)-etox¡am¡no)-hexa-decano¡co al resto de hidrato de carbono del factor VIII de la coagulación
Se disuelven 10 mg de rFVIII en tampón Hepes (Hepes 50 mM, NaCl 150 mM, cloruro de calcio 5 mM, pH 6,0) para dar una concentración de proteína de 2 mg/ml. Luego, se añaden 10 |il de una disolución al 10% (p/v) de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexadecanoico (preparado según el ejemplo 3) en DMSO a la disolución de FVIII. Posteriormente, se prepara una disolución acuosa del catalizador nucleófilo m-toluidina (50 mM) y se añade a la mezcla en el plazo de 15 minutos para obtener una concentración final de 10 mM. Finalmente, se añade una disolución acuosa de peryodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 |iM. Se incuba la mezcla de reacción durante 120 minutos en la oscuridad a una temperatura de 22°C con agitación suave. Luego, se detiene la reacción mediante la adición de una disolución acuosa de L-cisteína (1 M) para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 minutos. Posteriormente, se carga la mezcla de reacción en una columna IEX cargada con Q-Sepharose FF (1,6 x 8 cm). Se lava la columna con 20 volúmenes de tampón de equilibrio de columna (Hepes 20 mM, CaCl2 5 mM, pH 7,4) y se eluye el conjugado FA-rFVIII con tampón B (Hepes 20 mM, CaCl2 5 mM), NaCl 0,5 M, pH 7,4). Finalmente, se somete el producto a UF/DF con dispositivos Vivaspin usando tampón Hepes, 7,4 (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl25 mM, pH 7,4) como tampón de diafiltración.
Ejemplo 10
Acoplamiento de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexa-decanoico al resto de hidrato de carbono del factor IX de la coagulación
Se disuelven 7 mg de rFIX en tampón His (His 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl25 mM, pH 6,0) para dar una concentración de proteína de 2 mg/ml. Luego se añaden 7 |il de una disolución al 10% (p/v) de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexa-decanoico (preparado según el ejemplo 3) en DMSO a la disolución de FIX. Luego se prepara una disolución acuosa del catalizador nucleófilo m-toluidina (50 mM) y se añade a la mezcla en el plazo de 15 minutos para obtener una concentración final de 10 mM. Finalmente, se añade una disolución acuosa de peryodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 250 |iM. Se incuba la mezcla de reacción durante 120 minutos en la oscuridad a una temperatura de 22°C con agitación suave. Posteriormente, se extingue la reacción mediante la adición de L-cisteína (concentración final: 5 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Se purifica el conjugado FA-rFIX por cromatografía de intercambio aniónico. Se diluye la mezcla de reacción con 10 ml de tampón A (Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 7,5) y se carga en una columna HiTrap Q FF de 5 ml (GE Healthcare, Fairfield, CT) equilibrada con el tampón A. Se lava la columna con 5 VC usando el mismo tampón. Luego, se eluye la columna con tampón B (Hepes 50 mM, NaCl 1 M, CaCl25 mM pH 7,5). Se concentran las fracciones que contienen conjugado por u F/DF usando una membrana de 10 kD compuesta por celulosa regenerada. Se realiza la etapa de diafiltración final contra tampón Hepes 20 mM, pH 7,2 que contenía NaCl 150 mM y CaCl25 mM.
Ejemplo 11
Acoplamiento de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-am¡noox¡etox¡)-etox¡)-etoxi)-etox¡am¡no)-hexa-decano¡co al resto de hidrato de carbono del factor VIIa de la coagulación
Se disuelven 10 mg de rFVIIa en tampón Hepes (Hepes 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de calcio 5 mM, pH 6,0). Luego, se añaden 10 |il de una disolución al 10% (p/v) de éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexa-decanoico (preparado según el ejemplo 3) en DMSO a la disolución de FVIIa. Posteriormente, se prepara una disolución acuosa del catalizador nucleófilo m-toluidina (50 mM) y se añade a la mezcla en el plazo de 15 minutos para obtener una concentración final de 10 mM. Finalmente, se añade una disolución acuosa de peryodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 250 |iM. Se incuba la mezcla de reacción durante 120 minutos en la oscuridad a una temperatura de 22°C con agitación suave. Posteriormente, se extingue la reacción mediante la adición de L-cisteína (concentración final: 5 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se purifica el conjugado FA-rFVIIa por cromatografía de intercambio aniónico. Se diluye la mezcla de reacción con 10 ml de tampón A (Hepes 50 mM, pH 7,4) y se carga en una columna HiTrap Q f F de 5 ml (GE Healthcare, Fairfield, CT) equilibrada con el tampón A. Se lava la columna con 5 VC usando mismo tampón. Luego, se eluye la columna con tampón B (Hepes 50 mM, NaCl 1 M, CaCl25 mM pH 7,4). Se concentran las fracciones que contienen conjugado por UF/DF usando una membrana de 10 kD compuesta por celulosa regenerada. Se realiza la etapa de diafiltración final contra tampón Hepes 20 mM, pH 7,2 que contenía NaCl 150 mM y CaCl25 mM.
Ejemplo 12
Acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxilo activo a un resto de hidrato de carbono oxidado en presencia de un catalizador nucleófilo
También se proporciona el acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxilo activo a una proteína terapéutica oxidada (tal como las proteínas expuestas en la tabla 1 en el presente documento).
Para el acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxilo, se oxidan en primer lugar los restos de hidrato de carbono (predominantemente N-glicanos) de una proteína terapéutica (por ejemplo, EPO, G-CSF o insulina; véase la tabla 1; concentración: 0,5-3 mg/ml) con NaIO4 (concentración: 200 |iM). Luego, se detiene la reacción mediante la adición de L-cisteína (concentración final: 5 mM) y se separan los reactivos por UF/DF. Después de la diafiltración, se añade el reactivo aminooxilo de FA (es decir, el derivado de FA) usando un exceso de 25 M y se realiza la reacción de acoplamiento a pH 6,0 durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave en presencia del catalizador nucleófilo m-toluidina (concentración: 10 mM). Posteriormente, se carga la mezcla de reacción en una columna de intercambio iónico (IEX). Se lava la columna con> 5 VC de tampón de lavado y se eluye el conjugado con un gradiente lineal de NaCl. Finalmente, se someten las fracciones que contienen conjugado a u F/DF.
Ejemplo 13
Acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxilo activo a un resto de hidrato de carbono oxidado en presencia de un catalizador nucleófilo
Para el acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxilo con el resto de hidrato de carbono de una proteína terapéutica, se incuba la proteína (por ejemplo, EPO, G-CSF o insulina; véase la tabla 1; concentración: 0,5-3 mg/ml) a pH 6,0 con NaIO4 (concentración: 300 |iM) durante 1 hora a temperatura ambiente en presencia del catalizador nucleófilo m-toluidina (concentración: 10 mM). Luego, se detiene la reacción mediante la adición de L-cisteína (concentración final: 5 mM) y se carga la mezcla de reacción en una columna de intercambio iónico (IEX). Se lava la columna con> 5 VC de tampón de lavado y se eluye el conjugado con un gradiente lineal de NaCl. Finalmente, se someten las fracciones que contienen conjugado a u F/DF.
Ejemplo 14
Acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxilo activo con una proteína de la coagulación sanguínea oxidada en presencia de un catalizador nucleófilo
Puede llevarse a cabo el acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxilo activo a una proteína de la coagulación sanguínea oxidada (tal como FIX, FVIII y FVIIa tal como se describe en los ejemplos anteriores) en presencia de un catalizador nucleófilo tal como m-toluidina en un intervalo de concentración de 2-20 mM.
Ejemplo 15
Preparación de un ligador de ácido graso de MAL soluble en agua
Se prepara un ligador de ácido graso que contiene una cadena de PEG soluble en agua en posición o y un grupo MAL activo en una síntesis de dos etapas:
Etapa 1: preparación de éster metílico del ácido 16-hidroxihexadecanoico:
O
- o ^ f4 r OH
Se esterifica ácido 16-hidroxihexadecanoico disponible comercialmente con cloruro de acetilo en metanol durante 5 h a temperatura ambiente según el ejemplo 3 para dar el éster metílico correspondiente (Hang et al., Chemical probes for the rapid detection of fatty-acylated proteins in mammalian cells, JACS 2007; 129: 2744-5).
Etapa 2: preparación del ligador de ácido graso de MAL:
Figure imgf000055_0001
Se hace reaccionar éster metílico del ácido 16-hidroxihexadecanoico con MAL-PEG-COOH disponible comercialmente (mal-Peg (12)-COOH/IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Alemania) empleando una reacción de Mitsunobu en THF a temperatura ambiente durante la noche (Toyokuni et al., Synthesis of a New Heterobifunctional Linker, N-[4-(Aminooxy)butyl]-maleimide, for Facile Access to a Thiol-Reactive 18F-Labeling Agent, Bioconjugate Chem 2003; 14: 1253-9).
Ejemplo 16
Preparación de un ligador de ácido graso de NHS soluble en agua
Se prepara un ligador de ácido graso que contiene una cadena de PEG soluble en agua en posición o y un éster de NHS activo terminal mediante el uso de una síntesis de cuatro etapas:
Etapa 1: preparación de éster metílico del ácido 16-bromohexadecanoico
Figure imgf000055_0002
Se esterifica ácido 16-bromohexadecanoico disponible comercialmente con metanol y una cantidad catalítica de ácido sulfúrico concentrado durante la noche a temperatura de reflujo para dar el éster metílico correspondiente (Zinic et al., Positionally Isomeric Organic gelators: Structure-Gelation Study, Racemic versus Enantiomeric Gelators, and Solvation Effects, Chem Eur J 2010; 16: 3066-82).
Etapa 2: preparación de éster metílico del ácido 16-azidohexadecanoico
Figure imgf000056_0001
Se hace reaccionar éster metílico del ácido 16-bromohexadecanoico con azida de sodio en acetonitrilo durante cuatro días a temperatura de reflujo para dar la azida correspondiente (Zinic et al., Positionally Isomeric Organic Gelators: Structure-Gelation Study, Racemic versus Enantiomeric Gelators, and Solvation Effects, Chem. EUR. J. 2010; 16: 3066-82).
Etapa 3: preparación de éster metílico del ácido 16-aminohexadecanoico
Figure imgf000056_0002
Se hidrogena catalíticamente éster metílico del ácido 16-azidohexadecanoico con paladio/carbón activado en metanol a 3 bares durante tres horas para dar la amina correspondiente (Zinic et al., Positionally Isomeric Organic Gelators: Structure-Gelation Study, Racemic versus Enantiomeric Gelators, and Solvation Effects, Chem. EUR. J. 2010; 16: 3066-82).
Etapa 4: preparación del ligador de ácido graso de NHS
Figure imgf000056_0003
Se hace reaccionar éster metílico del ácido 16-aminohexadecanoico de NHS-PEG-NHS disponible comercialmente (NHS-dPEG (4)-NHS/IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Alemania) en 1,4-dioxano a temperatura ambiente durante tres días para dar el ligador de ácido graso de NHS (Cline et al., The Aminolysis of N-Hydroxysuccinimide Esters. A Structure-Reactivity Study, JACS 1987; 109: 3087-91).
Ejemplo 17
Caracterización analítica de conjugados de proteínas FA
Las propiedades de unión a albúmina de las muestras de FA-rFVIII, rFIX o FVIIa preparadas según los ejemplos en el presente documento se verifican in vitro mediante el uso de sistemas de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Se recubre una placa de 96 pocillos con un anticuerpo policlonal dirigido contra la albúmina sérica humana (HSA). La siguiente etapa es el bloqueo de la placa de ELISA con un tampón de gelatina-PBS. Luego, se une HSA al anticuerpo seguido de la unión de la muestra de proteína FA, que se diluye a diferentes concentraciones. Finalmente, la muestra de proteína-HSA se detecta mediante un anticuerpo anti-VIII, anti-FIX o anti-FVIIa marcado con peroxidasa. La actividad peroxidasa se detecta usando tetrametilbencidina (TMB) como sustrato. La intensidad de color desarrollada se mide con un lector de ELISA a 450 nm. La unión de la muestra de proteína FA a HSA se evalúa trazando las diferentes concentraciones de muestra en el eje x y sus valores de absorbancia correspondientes en el eje y.
Ejemplo 18
Preparación de un ligador de ácido graso pegilado soluble en agua que contiene un grupo aminooxilo
Se prepara un ligador de ácido graso que contiene una cadena de PEG soluble en agua con un resto aminooxilo en posición ra conectada al grupo carboxilo de ácido graso en una síntesis de tres etapas usando 3-oxapentano-1,5-dioxiamina tal como se describe en el ejemplo 1.
Etapa 1: preparación de N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-3-oxapentano-1,5-dioxiamina
Figure imgf000057_0001
Se hizo reaccionar 3-oxapentano-1,5-dioxiamina con cloroformiato de 9-fluorenilmetilo en 1,4-dioxano a temperatura ambiental durante 1 hora. Se evaporó la disolución a presión reducida y se purificó el producto bruto empleando cromatografía en gel de sílice con diclorometano/metanol 20/1 (v/v) como la mezcla de disolventes para dar dioxiamina pura protegida con mono-FMOC (Boturyn et al., Synthesis of Fluorescent Probes for the Detection of Abasic Sites in DNA, Tetrahedron 1997; vol. 53, n.° 15, 5485-92).
Etapa 2: preparación de (2-(2-(N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)aminooxi)etoxi)etoxi)amida de ácido hexadecanoico
Figure imgf000057_0002
Se hace reaccionar N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-3-oxapentano-1,5-dioxiamina con éster de N-hidroxisuccinimida de ácido palmítico disponible comercialmente en THF a temperatura ambiente durante la noche para dar el conjugado de ácido graso-aminooxilo protegido con mono-FMOC (Jong et al., Synthesis of ceramides using N-hydroxysuccinimide esters, Journal of Lipid Research 1972; Vol. 13, 819-22).
Etapa 3: preparación de (2-(2-aminooxietoxi)etoxi)amida de ácido hexadecanoico
Figure imgf000057_0003
Se hace reaccionar conjugado de ácido graso-aminooxilo protegido con mono-FMOC con piperidina en diclorometano a temperatura ambiental para dar el ligador de ácido graso-aminooxilo desprotegido como producto final (Boturyn et al., Synthesis of Fluorescent Probes for the Detection of Abasic Sites in DNA, Tetrahedron 1997; vol. 53, n.° 15, 5485­ 92).
Ejemplo 19 (ejemplo de referencia)
Acoplamiento de un ligador de ácido graso de MAL con A1PI
Se prepara un ligador de ácido graso que contenía un grupo MAL tal como se describe en el ejemplo 15 por reacción de éster metílico del ácido 16-hidroxihexadecanoico con Ma L-PEG-COOH disponible comercialmente (mal-Peg (12)-COOH/IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Alemania) empleando una reacción de Mitsunobu. Se acopla este ligador al grupo SH libre de A1PI.
Se disuelven 10 mg de A1PI purificado (concentración: 1 mg/ml) en tampón de reacción (fosfato 20 mM, EDTA 5 mM, pH 7,0) y se añaden 10 | l de una disolución al 5% (p/v) del ligador de ácido graso de MAL en DMSO a la disolución de A1PI. Se realiza la reacción de modificación durante 2 horas a temperatura ambiente seguido de una etapa de enfriamiento usando L-cisteína (concentración final: 10 mM). Después de la adición de L-cisteína, se incuba la mezcla de reacción con agitación suave durante una hora adicional a la misma temperatura. Se diluye el A1PI modificado con tampón de equilibrio (fosfato 25 mM, pH 6,5) para corregir la conductividad de las disoluciones a <4,5 mS/cm y se carga en una columna HiTrap Q FF (GE-Healthcare) precargada con un volumen de columna (VC) de 5 ml. Luego se equilibra la columna con 10 VC de tampón de equilibrio (velocidad de flujo: 2 ml/min). Finalmente, se eluye el PEG-A1PI con un gradiente lineal con tampón de elución (Na2HPO425 mM, NaCl 1 M, pH 6,5).
Ejemplo 20 (ejemplo de referencia)
Acoplamiento de un ligador de ácido graso del NHS con factor de la coagulación VIII
Se prepara un ligador de ácido graso que contenía un grupo NHS tal como se describe en el ejemplo 16 por reacción de éster metílico del ácido 16-hidroxihexadecanoico de NHS-PEG-NHS disponible comercialmente (NHS-dPEG (4)-NHS (IRIS Biotech GmbH, Marktredwitz, Alemania). Se acopla este ligador a los grupos amino libres de residuos de lisina del factor VIII de la coagulación.
Se disuelven 10 mg de rFVIII en tampón Hepes (Hepes 50 mM, NaCl 150 mM, cloruro de calcio 5 mM, pH 6,0) para dar una concentración de proteína de 2 mg/ml. Luego se añaden 10 |il de una disolución al 10% (p/v) de ligador de ácido graso de NHS en d Ms O a la disolución de FVIII. Se incuba la mezcla de reacción durante 120 minutos en la oscuridad a una temperatura de 22°C con agitación suave. Luego, se detiene la reacción mediante la adición de una disolución acuosa de glicina (1 M) para dar una concentración final de 20 mM en la mezcla de reacción. Se incuba la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación suave y posteriormente se carga en una columna IEX cargada con Q-Sepharose f F (1,6 x 8 cm). Se lava la columna con 20 volúmenes de tampón de equilibrio de columna (Hepes 20 mM, CaCh 5 mM, pH 7,4) y se eluye el conjugado FA-rFVIII con tampón B (Hepes 20 mM, CaCh 5 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,4). Finalmente, se somete el producto a UF/DF con dispositivos Vivaspin usando tampón Hepes, 7,4 (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl25 mM, pH 7,4) como tampón de diafiltración.

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Conjugado de un derivado de ácido graso soluble en agua y una proteína terapéutica, en el que el derivado de ácido graso soluble en agua comprende un ácido graso o éster de ácido graso unido a un ligador soluble en agua, y en el que el derivado de ácido graso soluble en agua se une de manera estable a la proteína terapéutica mediante una unión oxima formada entre un grupo aminooxilo en el ligador soluble en agua y un grupo aldehído de un hidrato de carbono oxidado en la proteína terapéutica.
  2. 2. Conjugado según la reivindicación 1, que une albúmina sérica humana (HSA) in vitro o in vivo, tiene semivida aumentada en relación con una proteína terapéutica nativa, y en el que el ácido graso es un ácido graso saturado o ácido graso insaturado.
  3. 3. Conjugado según la reivindicación 2, en el que el ácido graso es un ácido graso de cadena ramificada.
  4. 4. Conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C10, C12, C14, C16, C18, C20, C22 y C24.
  5. 5. Conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el ácido graso se une al ligador soluble en agua a un grupo en el ácido graso seleccionado del grupo que consiste en: grupo carboxilo terminal y grupo o, en el que el grupo o se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, amino, tio y carboxilo.
  6. 6. Conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el ácido graso es ácido 16-hidroxihexadecanoico o el éster de ácido graso es éster metílico del ácido 16-hidroxihexadecanoico.
  7. 7. Conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el éster de ácido graso es éster metílico o éster etílico.
  8. 8. Conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el ligador soluble en agua comprende un polímero soluble en agua y al menos un grupo aminooxilo unido a la proteína terapéutica.
  9. 9. Conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el derivado de ácido graso soluble en agua es
    a) sal de sodio del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiimino)-hexadecanoico de fórmula:
    Figure imgf000059_0001
    ' o
    b) éster metílico del ácido 16-(2-(2-(2-(2-aminooxietoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxiamino)-hexadecanoico,
    Figure imgf000059_0002
  10. 10. Método de preparación de una proteína terapéutica conjugada que comprende poner en contacto un resto de hidrato de carbono oxidado en la proteína terapéutica con el derivado de ácido graso soluble en agua según la reivindicación 1, en condiciones que permitan la conjugación;
    dicho resto de hidrato de carbono oxidado mediante incubación con un tampón que comprende un agente oxidante seleccionado del grupo que consiste en peryodato de sodio (NaIO4), tetraacetato de plomo (Pb(OAc)4 ) y perrutenato de potasio (KRuO4 );
    en el que una unión oxima se forma entre el resto de hidrato de carbono oxidado y un grupo aminooxilo activo en el derivado de ácido graso;
    y en el que dicha formación de unión oxima se cataliza por un catalizador nucleófilo seleccionado del grupo que consiste en anilina, ácido o-aminobenzoico, ácido m-aminobenzoico, ácido p-aminobenzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o-toluidina, m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, m-anisidina y p-anisidina.
  11. 11. Método de preparación de una proteína terapéutica conjugada según la reivindicación 10, que comprende además un método de preparación del derivado de ácido graso soluble en agua según la reivindicación 1, que comprende:
    a) oxidar un grupo o-hidroxilo en un ácido graso para generar un grupo aldehído en el ácido graso; y b) acoplar un ligador soluble en agua que comprende un grupo aminooxilo activo al grupo aldehido para formar una unión oxima estable;
    en el que dicho derivado de ácido graso es soluble en agua; en el que el grupo o-hidroxilo se oxida por un reactivo de oxidación seleccionado del grupo que consiste en: reactivo de peryodinano de Dess Martin, reactivo Tempo, cloruro de oxalilo/DMSO, perrutenato de tetrapropilamonio (TPAP) y reactivos de cromo VI (reactivo de Collins, clorocromato de piridinio (PCC) y dicromato de piridinio); en el que el ácido graso es un ácido graso saturado o ácido graso insaturado.
  12. 12. Método de preparación de una proteína terapéutica conjugada según la reivindicación 10, que comprende además un método de preparación del derivado de ácido graso soluble en agua según la reivindicación 1, que comprende:
    a) esterificar un grupo carboxilo en un ácido graso para generar un éster en el ácido graso;
    b) activar un grupo o-hidroxilo en un ácido graso para generar un grupo mesilo en el ácido graso de la etapa a); y
    c) acoplar un ligador soluble en agua que comprende un grupo aminooxilo activo sustituyendo el grupo mesilo de la etapa b) formando así un enlace de oxiimina-metileno estable;
    en el que dicho derivado de ácido graso es soluble en agua; en el que el grupo carboxilo se esterifica por un agente de esterificación seleccionado del grupo que consiste en: cloruro de acetilo, metanol en presencia de ácido, etanol en presencia de ácido, diazometano y yoduro de metilo;
    en el que el grupo o-hidroxilo se activa por un agente de activación seleccionado del grupo que consiste en: cloruro de mesilo, cloruro de tosilo y cloruro de nosilo; y en el que el ácido graso es un ácido graso saturado o ácido graso insaturado.
  13. 13. Método según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que el ácido graso es un ácido graso de cadena ramificada.
  14. 14. Método según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C10, C12, C14, C16, C18, C20, C22 y C24, en el que opcionalmente el ácido graso es ácido 16-hidroxihexadecanoico.
  15. 15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que el ligador soluble en agua comprende un polímero soluble en agua y al menos un grupo aminooxilo.
  16. 16. Conjugado según la reivindicación 8 o método según la reivindicación 15, en el que el polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, poli(ácido siálico) (PSA), almidón de hidroxialquilo (HAS), almidón de hidroxietilo (HES), hidrato de carbono, polisacáridos, pululano, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, almidón, dextrano, carboximetildextrano, poli(óxido de alquileno) (PAO), polialquilenglicol (PAG), polipropilenglicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfaceno, polietileno-co-anhídrido de ácido maleico, poliestireno-co-anhídrido de ácido maleico, y poli(1-hidroximetiletilenhidroximetilformal) (PHF).
  17. 17. Conjugado o método según la reivindicación 16, en el que el polímero soluble en agua es PEG y comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en O3, O5, O7, O9, O11, O13 y O15.
  18. 18. Conjugado o método según la reivindicación 17, en el que el ligador soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en:
    a) 3-oxapentano-1,5-dioxiamina de fórmula:
    Figure imgf000060_0001
    b) 3,6,9-triaoxaundecano-1,11-dioxiamina de fórmula:
    c) 3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecano-1,17-dioxiamina de fórmula:
    Figure imgf000061_0001
    d) 3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosano-1,23-dioxiamina de fórmula:
    Figure imgf000061_0002
    Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 16-18 o método según cualquiera de las reivindicaciones 10 y 16-18, en el que la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en: factor IX (FIX), factor VIII (FVIII), factor VIIa (FVIIa), factor de von Willebrand (VWF), factor V (FV), factor X (FX), factor XI (FXI), factor XII (FXII), trombina (FII), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, tromboplastina tisular(TF), proteasa AdAm TS 13, IL-1 alfa, IL-1 beta, iL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor estimulante de colonias 1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), EPO, interferón alfa (IFN-alfa), interferón de consenso, IFN-beta, IFN-gamma, IFN-omega, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 alfa, IL-33, trombopoyetina (TPO), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, polipéptido similar a angiopoyetina 1 (ANGPTL1), polipéptido similar a angiopoyetina 2 (ANGPTL2), polipéptido similar a angiopoyetina 3 (ANGPTL3), polipéptido similar a angiopoyetina 4 (ANGPTL4), polipéptido similar a angiopoyetina 5 (ANGPTL5), polipéptido similar a angiopoyetina 6 (ANGPTL6), polipéptido similar a angiopoyetina 7 (ANGPTL7), vitronectina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiogenina, activina A, activina B, activina C, proteína morfogénica ósea 1, proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 3, proteína morfogénica ósea 4, proteína morfogénica ósea 5, proteína morfogénica ósea 6, proteína morfogénica ósea 7, proteína morfogénica ósea 8, proteína morfogénica ósea 9, proteína morfogénica ósea 10, proteína morfogénica ósea 11, proteína morfogénica ósea 12, proteína morfogénica ósea 13, proteína morfogénica ósea 14, proteína morfogénica ósea 15, receptor IA de proteínas morfogénicas óseas, receptor IB de proteínas morfogénicas óseas, receptor II de proteínas morfogénicas óseas, factor neurotrófico derivado del cerebro, cardiotrofina 1, factor neurotrófico ciliar, receptor del factor neurotrófico ciliar, cripto, críptico, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 1, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 2a, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas 2p, factor de crecimiento de células endoteliales p, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, Epigen, epirregulina, factor quimiotáctico para neutrófilos derivado de células epiteliales, factor de crecimiento de fibroblastos 4, factor de crecimiento de fibroblastos 5, factor de crecimiento de fibroblastos 6, factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de crecimiento de fibroblastos 8, factor de crecimiento de fibroblastos 8b, factor de crecimiento de fibroblastos 8c, factor de crecimiento de fibroblastos 9, factor de crecimiento de fibroblastos 10, factor de crecimiento de fibroblastos 11, factor de crecimiento de fibroblastos 12, factor de crecimiento de fibroblastos 13, factor de crecimiento de fibroblastos 16, factor de crecimiento de fibroblastos 17, factor de crecimiento de fibroblastos 19, factor de crecimiento de fibroblastos 20, factor de crecimiento de fibroblastos 21, factor de crecimiento ácido de fibroblastos, factor de crecimiento básico de fibroblastos, receptor a1 del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, receptor a2 del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, proteína relacionada con el crecimiento, proteína relacionada con el crecimiento a, proteína relacionada con el crecimiento p, proteína relacionada con el crecimiento y, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado del hepatoma, factor de crecimiento similar a la insulina I, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento similar a la insulina II, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibidor de la leucemia, receptor a del factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento nervioso, neuropoyetina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, oncostatina M (OSM), factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento placentario 2, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA, factor de crecimiento derivado de plaquetas AB, cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, receptor a del factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor p del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante del crecimiento de células pre-B, factor de células madre (SCF), receptor del factor de células madre, TNF, TNF0, TNF1, TNF2, factor de crecimiento transformante a, factor de crecimiento transformante p, factor de crecimiento transformante p1, factor de crecimiento transformante p1.2, factor de crecimiento transformante p2, factor de crecimiento transformante p3, factor de crecimiento transformante p5, factor de crecimiento transformante latente p1, proteína I de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína II de unión al factor de crecimiento transformante p, proteína III de unión al factor de crecimiento transformante p, linfopoyetina estromal tímica (TSLP), receptor de tipo I del factor de necrosis tumoral, receptor de tipo II del factor de necrosis tumoral, receptor activador del plasminógeno de tipo urocinasa, proteína de activación de fosfolipasas (PUP), insulina, lectina, ricina, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona foliculoestimulante, hormona estimulante del tiroides, activador tisular del plasminógeno, IgG, IgE, IgM, IgA e IgD, agalactosidasa, p-galactosidasa, ADNasa, fetuína, hormona luteinizante, estrógeno, albúmina, lipoproteínas, fetoproteína, transferrina, trombopoyetina, urocinasa, integrina, trombina, leptina, Humira (adalimumab), Prolia (denosumab), Enbrel (etanercept), una proteína en la tabla 1, o un fragmento, derivado o variante biológicamente activo de la misma.
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