ES2802623T3

ES2802623T3 - Agentes polipeptídicos técnicamente diseñados para la neutralización dirigida de amplio espectro de la gripe

Info

Publication number: ES2802623T3
Application number: ES11737670T
Authority: ES
Inventors: Ram Sasisekharan; Karthik Viswanathan; Venkataramanan Soundararajan; Sasi Raguram; Viswanathan Sasisekharan; Vidya Subramanian
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2010-01-27
Filing date: 2011-01-27
Publication date: 2021-01-20
Anticipated expiration: 2031-01-27
Also published as: US20110201547A1; US20140206603A1; US8637456B2; WO2011094445A1; EP2528615A1; JP6210685B2; JP2015166396A; JP2013518121A; US20160317612A1; CA2787940C; EP2528615B1; US9334309B2; US9572861B2; EP2528615A4; AU2011210840A1; CA2787940A1; JP2017125062A; AU2011210840B2

Abstract

Un agente de plegamiento interno que se une a un polipéptido hemaglutinina (HA) y comprende un polipéptido de menos de aproximadamente 1000 aminoácidos de longitud, cuya secuencia de aminoácidos consiste en el Plegamiento interno 1 de la SEQ ID NO: 1, Plegamiento interno 2 de la SEQ 5 ID NO: 2, Plegamiento interno 3 de la SEQ ID NO: 3, Plegamiento interno 4 de la SEQ ID NO: 4, Plegamiento interno de la SEQ ID NO: 5, Plegamiento interno 6 de la SEQ ID NO: 6, Plegamiento interno 7 de la SEQ ID NO: 7, Plegamiento interno 8 de la SEQ ID NO: 8, Plegamiento interno 9 de la SEQ ID NO: 9, Plegamiento interno 10 de la SEQ ID NO:10, Plegamiento interno 11 de la SEQ ID NO:11, Plegamiento interno 12 de la SEQ ID NO:12, Plegamiento interno 13 de la SEQ ID NO:13, Plegamiento interno 14 de la SEQ ID NO:14, Plegamiento interno 15 de la SEQ ID NO:15, Plegamiento interno 16 de la SEQ ID NO:16, Plegamiento interno 17 de la SEQ ID NO:17, Plegamiento interno 18 de la SEQ ID NO:18, Plegamiento interno 19 de la SEQ ID NO:19, Plegamiento interno 20 de la SEQ ID NO:20, Plegamiento interno 21 de la SEQ ID NO:21, Plegamiento interno 22 de la SEQ ID NO:22, Plegamiento interno 23 de la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 24 de la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 25 de la SEQ ID NO: 26 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 26 de la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 27 de la SEQ ID NO: 28 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 28 de la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 29 de la SEQ ID NO: 30 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 30 de la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 31 de la SEQ ID NO: 32 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 32 de la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 33 de la SEQ ID NO: 34 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 34 de la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 35 de la SEQ ID NO: 36 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 36 de la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 37 de la SEQ ID NO: 38 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 38 de la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 39 de la SEQ ID NO: 40 y la SEQ ID NO: 24, o Plegamiento interno 40 de la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 24.

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes polipeptídicos técnicamente diseñados para la neutralización dirigida de amplio espectro de la gripe

Antecedentes de la invención

El virus de la gripe es una amenaza para la salud mundial que es responsable de más de 300.000 muertes al año. El virus evade el reconocimiento inmunitario al participar en una combinación de variaciones antigénicas menores, reagrupamiento de dominios, recombinación genética y enmascaramiento basado en glucosilación de sus glucoproteínas de superficie acelerados. Esta capacidad de mutación rápida del virus se ve especialmente exacerbada en el contexto de la creciente amenaza de la actual pandemia de la 'gripe porcina' H1N1, así como la alarmante alarma mundial con infecciones recientes con cepas de 'gripe aviar' H5N1 aviar altamente patógenas. (Khanna et al., Journal of Biosciences,. 33(4):475, 2008, Soundararajan et al., Nature Biotechnology 27:510, 2009). Adicionalmente, dos de las principales pandemias de gripe del siglo pasado se originaron a partir de virus de gripe aviar que cambiaron su composición genética para permitir la infección en humanos.

Dado el alto grado de imprevisibilidad en la evolución de estos virus de la gripe, existe la necesidad de desarrollar opciones preventivas terapéuticas antigripales con efecto cruzado (universal o de amplio espectro) eficaz entre distintas cepas. Dichos agentes antigripales universales o de amplio espectro aumentarían las vacunas contra la gripe estacional que están diseñadas para tener como objetivo cepas víricas 'estacionales' específicas en circulación. (Ekiert et al., Science, 324(5924):246, 2009 y Sui et al., Nat Struct Mol Biol. 16(3):265, 2009; Throsby et al., Plos One, 3; 5942, 2008). El documento WO01/55315 describe proteínas y sus usos en medicina. El documento US2010/0004195 describe señuelos de glucanos con topología de paraguas para su uso en métodos para el tratamiento de la gripe. La importancia de tales agentes se pone de relieve por la resistencia a fármacos emergente para los antivíricos Tamiflu/Relenza (inhibidores de NA) y Amantadina/Rimantadina (inhibidores de MP-2) (Collins et al., Nature 453:1258, Stouffer et al., Nature, 451:596, 2008, Pielak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106:7379, 2009). Por ejemplo, más del 98 % y el 100 % de las cepas H1N1 son resistentes esta temporada al Tamiflu y a los derivados de adamantano (Amantadina/Rimantadina), respectivamente. Adicionalmente, las vacunas contra la gripe estacional se desarrollan basándose en predicciones de la cepa de gripe más virulenta. En algunos casos, estas predicciones son incorrectas, haciendo de este modo que las vacunas contra la gripe estacional sean menos eficaces. Por estas razones, existe la necesidad de desarrollar vacunas de amplio espectro y agentes terapéuticos que sean eficaces en el tratamiento o el retraso del inicio de la enfermedad provocada por los virus de la gripe, independientemente del subtipo o clado. Obviamente, también hay un valor significativo en los agentes que sean eficaces contra cualquier cepa gripales y, de hecho, puede haber un valor profundo en los agentes que son específicos para una o para un conjunto de cepas.

Sumario de la invención

La protección buscada para la presente invención es como se define en las reivindicaciones. La presente invención proporciona agentes para la inhibición de la infección gripal. La presente invención proporciona agentes que se unen a un virus de la gripe (por ejemplo, al polipéptido HA del virus) y/o que se unen al receptor de la HA. La presente invención proporciona agentes de amplio espectro para la neutralización de la gripe.

En particular, la presente invención proporciona agentes polipeptídicos, denominados "agentes de plegamiento interno ("infold agents", que se unen a regiones particulares en un polipéptido hemaglutinina (HA). Por ejemplo, la presente invención proporciona agentes de plegamiento interno que se unen a la región epitópica proximal de membrana (MPER, forma siglada de membrane proximal epitope región) del polipéptido HA. Los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER independientemente de la glucosilación de la HA. Los agentes de plegamiento interno interactúan con uno o más restos de aminoácido en el polipéptido HA y/o con uno o más glucanos unidos al polipéptido HA. Los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos unidos en N en el polipéptido HA. Los agentes de plegamiento interno se unen a N-glucanos proximales a la MPER en el polipéptido HA.

Los agentes de plegamiento interno se unen a receptores de HA. Los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos sialilados en los receptores de HA. Los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos sialilados que tienen topología de sombrilla. Los agentes de plegamiento interno se unen con alta afinidad y/o especificidad a glucanos con topología de paraguas (por ejemplo, en comparación con la unión a glucanos de otras topologías, tales como los glucanos con topología de cono).

Los agentes de plegamiento interno compiten con la hemaglutinina para unirse a un receptor de HA. Los agentes de plegamiento interno compiten con la HA para unirse a un glucano con topología de paraguas.

Los agentes de plegamiento interno se caracterizan por una estructura de cadena principal plegada seleccionada y dimensionada para encajar dentro de un espacio tridimensional predeterminado (por ejemplo, un bolsillo de unión) y para presentar "restos de interacción" seleccionados de modo que se posicionen en un espacio tridimensional dentro de una distancia designada de "restos diana" identificados en el polipéptido HA y/o el receptor de HA. Un agente de plegamiento interno se caracteriza por una primera estructura de cadena principal plegada seleccionada y dimensionada para encajar dentro de un sitio de unión del polipéptido HA, y una segunda estructura de cadena principal plegada seleccionada y dimensionada para encajar dentro de un sitio de unión al receptor de HA.

La presente divulgación proporciona diversos reactivos y métodos asociados con agentes de plegamiento interno que incluyen, por ejemplo, sistemas para identificarlos, estrategias para prepararlos, anticuerpos que se unen a ellos y diversos métodos de diagnóstico y terapéuticos relacionados con ellos. A continuación, se presenta una descripción adicional de determinadas realizaciones de estos aspectos, y otros, de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Presenta enfoques para lograr una neutralización dirigida y de espectro completo (amplio) de la gripe utilizando una molécula dirigida de amplio espectro (agente de plegamiento interno), (a) Agentes de plegamiento interno que se unen a la MPER de la HA (círculo rojo) y a receptores de HA (por ejemplo, a glucanos sialilados en los receptores de HA) (círculo verde); (b) Agente de plegamiento interno que se une a la MPER de la HA (círculo rojo), a un N-glucano proximal a MPER (círculo negro) y a glucanos sialilados en los receptores de HA (círculo verde); (c) Agente de plegamiento interno que se une a la MPER de la HA (círculo rojo); (d) Agente de plegamiento interno que se une a la MPER de la HA (círculo rojo) y a un N-glucano proximal a MPER (círculo negro).

Figura 2. Conservación de la región epitópica proximal de membrana (MPER) para las cepas del virus de la gripe ^{del grupo 1 y del grupo 2 (Stouffer et al., Nature, 451:596, 2008). Se muestran los principales restos de la}MPEr en HA-1 (dominio de la cabeza globular) y HA-2 (dominio de tallo) y los aminoácidos prominentes de cada cepa en estas posiciones se colorean de acuerdo con el grado de conservación del clado cruzado (naranja = más conservado posiciones).

Figura 3. Fundamento estructural de las limitaciones de los anticuerpos para el direccionamiento a la MPER de la HA del virus de la gripe N-glucosilado. El anticuerpo F10 (rosa) acoplado a HA H3 (beis/gris) N-glucosilada en Asn-38 (carbono verde) muestra que las cadenas beta C' y C" adicionales (negro) que constituyen dos de las nueve cadenas beta en todos los dominios VH de los anticuerpos, son responsables principalmente del impedimento estérico de la unión de los anticuerpos.

Figura 4. Fundamento estructural para la reducción del área de MPER disponible para el direccionamiento en la HA glucosilada. En los polipéptidos HA no glucosilados (parte superior), está disponible para el direccionamiento un área de MPER de 28* 11,5 ~ 325 A2, mientras que solo está disponible para la unión en los polipéptidos HA N-^{glucosilados (parte inferior) una reducida área de}MpER ^{de 0,5*(12,3*15,3 9,5*12,2) ~ 152 A2.}

Figura 5. Ilustra distintos conjuntos de posibles restos diana en un polipéptido HA y, específicamente, en y/o alrededor de la región MPER del polipéptido HA. El polipéptido HA particular representado es un polipéptido HA H3 de la entrada 1HGG de la ID del Protein Data Bank (ID de PDB).

Figura 6. (Parte superior) Unión del Plegamiento interno 3 (Infold-3) a la MPER de la HA no glucosilada. (Parte inferior) El Plegamiento interno 3 (rojo) se une a la MPER de la HA N-glucosilada (gris/beis). adaptándose al N-glucano (carbono verde) debido a su menor volumen y la falta de las dos cadenas adicionales con respecto a las de los anticuerpos, como se muestra en la Figura 3.

Figura 7. Presenta la unión de un agente de plegamiento interno ejemplar en comparación con la unión del ^{anticuerpo C179 a polipéptidos HA seleccionados, por ejemplo, H1, H3,}h5, ^{H7 y H9.}

Figura 8. Presenta un receptor de HA con glucano a2,6-sialilado (topología paraguas) (verde azulado), en este caso se muestra unido al polipéptido HA del H1N1 (gris) de la gripe de origen porcino del 2009 (comúnmente conocida como "gripe pandémica").

Figura 9. Presenta un ejemplo de un motivo de reconocimiento de glucano sialilado en a2,6, utilizado en el diseño de la unión del Plegamiento interno 9 y el Plegamiento interno 10 a los receptores de HA con glucano sialilado en a2,6 para la administración terapéutica dirigido contra la gripe.

Figura 10. Presenta un esbozo para comprender la especificidad del receptor con glucano. Los glucanos unidos en a2,3 y/o a2,6 pueden adoptar distintas topologías. Se cree que la capacidad de un polipéptido HA para unirse a determinadas topologías le confiere la capacidad de actuar como mediador en la infección de distintos hospedadores, por ejemplo en seres humanos. La presente divulgación se refiere a dos topologías de particular importancia, una topología de "cono" (panel izquierdo) y una topología de "paraguas" (panel derecho). La topología de cono puede ser adoptada por glucanos unidos en a2,3 y/o a2,6, y es típica de oligosacáridos cortos u oligosacáridos ramificados unidos a un núcleo (aunque esta topología puede ser adoptada por determinados oligosacáridos largos). La topología de paraguas solo puede ser adoptada por los glucanos unidos a a2,6 (presumiblemente debido a la mayor pluralidad conformacional proporcionada por el enlace C5-C6 adicional que está presente en el enlace a2,6), y es predominantemente adoptada por oligosacáridos largos o glucanos ramificados con ramas de oligosacáridos largas, que contiene particularmente el motivo Neu5Aca2,6Galp1-3/4GlcNAc.

Figura 11. Ilustra topologías de cono ejemplares. Esta Figura ilustra determinadas estructuras de glucanos ejemplares (pero no exhaustivas) que adoptan topologías de cono.

Figura 12. Ilustra topologías de paraguas ejemplares. (A) Determinadas estructuras de glucano unido en N y en O ejemplares (pero no exhaustivas) que pueden adoptar topologías de paraguas. (B) Determinadas estructuras de glucano unido en O ejemplares (pero no exhaustivas) que pueden adoptar topologías de paraguas.

Figura 13. Ilustra posibles conjuntos de restos de interacción y/o de unión del agente de plegamiento interno, seleccionados y diseñados para interactuar y/o unirse con los restos diana indicados en un polipéptido HA. Como se muestra, el polipéptido HA es un polipéptido HA H1.

Figura 14. Presenta imágenes de la estructura del ID de PDB 2V5Y (número de identificación del protein data bank) en los modelos representativos de cintas y de barras.

Figura 15. Ilustra que un agente de plegamiento interno ejemplar inhibe la infectividad del virus de la gripe PR8 (H1N1) in vitro. El panel izquierdo destaca que el agente de plegamiento interno ejemplar inhibe la producción de placas inducida por virus de una manera dependiente de la dosis para 6 dosis distintas.

Figura 16. Compara la actividad de un agente de plegamiento interno ejemplar con la de un control (BSA) y la del anticuerpo C179, utilizando un ensayo de placas con 4 dosis. Como se muestra en el ensayo de placas, el agente de plegamiento interno ejemplar inhibe la infectividad del virus de la gripe.

Figura 17. Presenta una exposición a H1N1 en ratones. En esta exposición, un agente de plegamiento interno ejemplar demuestra el inicio retardado de H1N1 en ratones, en comparación con el control de PBS. El agente de plegamiento interno ejemplar muestra un retraso del inicio similar al del fármaco antivírico, la Ribavirina, comenzando alrededor del día cinco.

Figura 18. Presenta ratones tratados con un agente de plegamiento interno ejemplar en una exposición a H1N1. En esta exposición, los ratones tratados con el agente de plegamiento interno ejemplar tienen el menor porcentaje de pérdida de peso posinfección en comparación con el control de PBS o el fármaco antivírico, la Ribavirina. Figura 19. Presenta las relaciones filogenéticas entre subtipos de HA, mostrando las divisiones de los subtipos del virus de la gripe en grupos, clados y clústeres.

Figura 20. Presenta una evaluación ejemplar de la actividad neutralizante de un agente de plegamiento interno particular (Plegamiento interno 28) descrito en el presente documento, utilizando cristal violeta.

Figura 21. Presenta una evaluación ejemplar de la actividad del agente de Plegamiento interno 28 en MDCK utilizando RT-PCR para cuantificar directamente las cantidades de genoma vírico. Los resultados muestran que el agente de plegamiento interno analizado (Plegamiento interno 28) es un inhibidor potente; la CI⁵⁰está afectada por la multiplicidad de infección (moi).

Figura 22. Presenta los efectos de la preincubación del agente de Plegamiento interno 28 con PR8 sobre la infectividad en células MDCK. Después de la infección, las células MDCK se cultivaron en medio sin virus con (a) o sin (b) agente de Plegamiento interno 28 durante 48 horas antes de cuantificar el título vírico mediante PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos para la proteína M del virus. = valor de CI⁵⁰calculado.

Definiciones

Afinidad: Como se conoce en la técnica, la "afinidad" es una medida del ajuste ceñido con que un ligando particular (por ejemplo, un polipéptido HA o agente de plegamiento interno) se une a su compañero (por ejemplo, y un receptor de HA). Las afinidades se pueden medir de distintas maneras.

Aminoácido: Como se usa en el presente documento, "aminoácido" se refiere a cualquier aminoácido natural o no natural (véanse las definiciones de "aminoácido natural" y "aminoácido no natural" a continuación).

Anticuerpo: Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" pretende incluir inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas que son específicamente reactivas con la proteína o péptido designado, o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos adecuados incluyen, pero sin limitación, anticuerpos humanos, anticuerpos primatizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos conjugados (es decir, anticuerpos conjugados o fusionados a otras proteínas, radiomarcadores, citotoxinas), productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños ("SMIPs™", forma siglada de Small Modular [mmunoPharmaceuticals), anticuerpos monocatenarios, anticuerpos cameloides y fragmentos de anticuerpos. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpos" también incluye anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, anticuerpos de dominio único de tiburón (por ejemplo, IgNAR o fragmentos de los mismos)), anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica desead. Los anticuerpos para su uso en el presente documento pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM).

Un anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo. Se apreciará que un fragmento de anticuerpo puede incluir una parte de un anticuerpo intacto, tal como, por ejemplo, la región de unión a antígeno o variable de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; triacuerpos; tetracuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo puede también incluir cualquier proteína sintética o modificada por ingeniería genética, que actúa como un anticuerpo al unirse a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden incluir fragmentos aislados, fragmentos "Fv", que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas polipeptídicas monocatenarias recombinantes en las cuales las regiones variables de las cadenas ligera y pesada están conectadas por un enlazador peptídico ("proteínas ScFv"), y unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los restos de aminoácido que imitan la región hipervariable.

Plegamiento en sándwich ¡5: Un "plegamiento en sándwich p" es un dominio polipeptídico que tiene entre 5-12 cadenas p cuando su estructura se determina de forma experimental o se predice informáticamente mediante cualquier método, con una RECM (raíz del error cuadrático medio) de Ca menor o igual a 6 angstroms tras la superposición sobre los restos 260-355 (cadena A) de la estructura con el IDDE PBD 2V5Y (véase la Figura 14). Además, dicha RECM tras la superposición de regiones estructurales secundarias (excluyendo los bucles) puede ser menor o igual a 5 Á. Los dominios de plegamiento interno constituyen los dominios de "reconocimiento de la diana" de los agentes de plegamiento interno.

Unión: Se entenderá que el término "unión", como se usa en el presente documento, normalmente se refiere a una asociación no covalente entre o de agentes. La unión se puede abordar con respecto a polipéptidos HA particulares, glucanos particulares (por ejemplo, glucanos unidos en N, glucanos con topología de paraguas o glucanos con topología de cono) o receptores de HA particulares. Los expertos en la materia apreciarán que tal unión puede ^{evaluarse en cualquiera de una diversidad de contextos. La unión puede evaluarse con respecto al polipéptido}Ha. ^Launión puede evaluarse con respecto a glucanos unidos (por ejemplo, unidos covalentemente) a un vehículo. El vehículo puede ser un polipéptido. La unión puede evaluarse con respecto a glucanos unidos a un receptor de HA. Se puede hacer referencia a la unión del receptor o a la unión del glucano.

Sitio de unión: La expresión "sitio de unión", como se usa en el presente documento, se refiere a una región de un polipéptido diana, formado en un espacio tridimensional, que incluye los restos de interacción del polipéptido diana. Como entenderán los expertos en la materia, un sitio de unión puede incluir restos que son adyacentes entre sí en una cadena lineal, y/o están distales entre sí en una cadena lineal pero cerca uno del otro en un espacio tridimensional cuando el polipéptido diana está plegado. Un sitio de unión puede comprender restos de aminoácido y/o restos de sacárido.

Biológicamente activo: Como se usa en el presente documento, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico y en particular en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera que es biológicamente activo. Cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una parte de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se denomina normalmente parte "biológicamente activa".

Amplio espectro: Como se usa en el presente documento, la frase "amplio espectro" se refiere a agentes de plegamiento interno que se unen a una diversidad de polipéptidos HA de distintas cepas del virus de la gripe. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno de amplio espectro se unen a una pluralidad de polipéptidos HA distintos. Los ejemplos de tales polipéptidos HA incluyen, los polipéptidos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y/o H16, o combinaciones de los mismos. Los agentes de plegamiento interno proporcionados de la invención son de amplio espectro en el sentido de que se unen a polipéptidos HA de al menos dos clados o clústeres de virus distintos. Los agentes de plegamiento interno proporcionados de la invención son de amplio espectro en el sentido de que se unen a polipéptidos HA de todos los clados de virus conocidos. Los agentes de plegamiento interno proporcionados de la invención son de amplio espectro en el sentido de que se unen a polipéptidos HA de los virus de la gripe del grupo 1 y del grupo 2. Amplio espectro se refiere a polipéptidos HA que actúan como mediadores en la infección de hospedadores particulares, por ejemplo, de un ave, camello, cánido, gato, civeta, equino, ser humano, leopardo, visón, ratón, foca, garduña, cerdo, tigre, ballena, etc.

Sustrato candidato: Como se usa en el presente documento, la frase "sustrato candidato" se refiere a los sustratos de uno o más agentes de plegamiento interno. Los sustratos candidatos incluyen, pero sin limitación, polipéptidos y sacáridos. Los sustratos candidatos incluyen regiones de polipéptidos HA, la región MPER de polipéptidos HA, N-glucanos en polipéptidos HA, receptores de HA, receptores de HA sialilados, glucanos en receptores de HA sialilados y/o glucanos con topología de paraguas en receptores de HA sialilados.

Parte característica: Como se usa en el presente documento, la frase una "parte característica" de una proteína o polipéptido es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos, o una colección de tramos continuos de aminoácidos, que juntos son característicos de una proteína o polipéptido. Cada uno de tales tramos continuos generalmente contendrá al menos dos aminoácidos. Adicionalmente, los expertos en la materia apreciarán que normalmente se precisan al menos 5, 10, 15, 20 o más aminoácidos para ser característicos de una proteína. En general, una parte característica es una que, además de la identidad de secuencia especificada anteriormente, comparte al menos una característica funcional con la proteína intacta de interés.

Secuencia característica: Una "secuencia característica" es una secuencia que se encuentra en todos los miembros de una familia de polipéptidos o ácidos nucleicos y, por lo tanto, los expertos en la materia pueden utilizarla para definir miembros de la familia.

Terapia de combinación: La expresión "terapia de combinación", como se usa en el presente documento, se refiere a las situaciones en las que se administran dos o más agentes distintos en regímenes superpuestos para que el sujeto esté expuesto a ambos agentes de forma simultánea.

Topología de cono: La frase "topología de cono" se usa en el presente documento para referirse a una disposición tridimensional adoptada por determinados glucanos y, en particular, por glucanos en receptores de HA. Como se ilustra en la Figura 10, la topología de cono la pueden adoptar los glucanos sialilados en a2,3 o los glucanos sialilados en a2,6, y es típica de cadenas oligonucleotídicas cortas, aunque algunos oligonucleótidos largos también pueden adoptar esta conformación. La topología de cono se caracteriza por los ángulos de torsión glucosídicos del enlace Neu5Aca2,3 Gal que muestrea tres regiones de conformaciones de energía mínima proporcionadas por un valor 9 (C1-C2-O-C3/C6) de alrededor de -60, 60 o 180 y 9 (C2-O-C3/C6-H3/C5) muestrea de -60 a 60. La Figura 11 presenta determinados ejemplos representativos (aunque no exhaustivos) de glucanos que adoptan una topología de cono.

Aminoácidos de unión directa: Como se usa en el presente documento, la frase "aminoácidos de unión directa" se refiere a restos de aminoácido que interactúan directamente con un compañero de unión (por ejemplo, uno o más aminoácidos, glucanos, etc.). Normalmente, los restos de interacción son aminoácidos de unión directa.

Técnicamente diseñado: El término "técnicamente diseñado", como se usa en el presente documento, describe un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos ha sido seleccionada por el hombre. Por ejemplo, un agente de plegamiento interno técnicamente diseñado tiene una secuencia de aminoácidos que se seleccionó basándose en preferencias para los aminoácidos correspondientes en sitios particulares de las interacciones proteína-proteína. Una secuencia de plegamiento interno técnicamente diseñada tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos HA incluidos en la base de datos del NCBI.

Polipéptido hemaglutinina (HA): Como se usa en el presente documento, la expresión "polipéptido de hemaglutinina" (o "polipéptido HA") se refiere a un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye al menos una secuencia característica de HA. En la técnica se conoce una amplia diversidad de secuencias de HA de aislados gripales; de hecho, el National Center for Biotechnology Information (NCBI) mantiene una base de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html) que, a partir de la presentación de la presente solicitud incluyó 9796 secuencias de HA. Los expertos en la materia, haciendo referencia a esta base de datos, pueden identificar fácilmente secuencias que son características de los polipéptidos HA en general, y/o de polipéptidos HA particulares (por ejemplo, los polipéptidos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16; o de polipéptidos HA que actúan como mediadores en la infección de hospedadores particulares, por ejemplo, de un ave, camello, cánido, gato, civeta, del medio ambiente, equino, ser humano, leopardo, visón, ratón, foca, garduña, cerdo, tigre, ballena, etc. Por ejemplo, un polipéptido HA puede incluir uno o más elementos de secuencia característicos que se encuentran entre aproximadamente los restos 97 y 185, 324 y 340, 96 y 100, y/o 130-230 de una proteína HA encontrada en un aislado natural de un virus de la gripe. El polipéptido HA puede estar compuesto por los dominios HA-1 (tallo) y HA-2 (cabeza) de la HA. El polipéptido HA puede incluir el elemento de secuencia característico de la región epitópica proximal de membrana (MPER) de la HA. Una región del polipéptido HA puede estar glucosilada. Una región del polipéptido HA puede no estar glucosilada.

En combinación: La frase "en combinación", como se usa en el presente documento, se refiere a agentes que se administran de forma simultánea a un sujeto. Se apreciará que se considera que dos o más agentes se administran "en combinación" cuando un sujeto se expone simultáneamente a ambos (o más) agentes. Cada uno de los dos o más agentes puede administrarse de acuerdo con un programa distinto; no es necesario administrar dosis individuales de los distintos agentes al mismo tiempo o en la misma composición. Más bien, siempre que ambos (o más) agentes permanezcan en el cuerpo del sujeto, se consideran que se administran "en combinación".

Agente de plegamiento interno: En general, la expresión "agente de plegamiento interno" se usa en el presente documento para referirse a un agente que se une a un sitio de unión seleccionado, agente que comprende un polipéptido. Un agente de plegamiento interno puede tener una estructura caracterizada por una cadena principal "plegada" poblada por restos de interacción seleccionados y dispuestos de manera que, cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión, los restos de interacción individuales se colocan dentro de una distancia o volumen preseleccionado de restos diana afines. Un polipéptido de agente de plegamiento interno puede ser un polipéptido diseñado o técnicamente diseñado. Los agentes de plegamiento interno proporcionados en el presente documento se unen a un polipéptido hemaglutinina (HA). En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a un polipéptido HA en su región MPER. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a una región MPER de un polipéptido HA independientemente de su glucosilación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno están diseñados para tener el tamaño apropiado para que su unión a una región MPER no esté impedida por su glucosilación. Un agente de plegamiento interno puede unirse a una región MPER glucosilada con una afinidad de al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o más de su afinidad por una región MPER no glucosilada, por lo demás idéntica. Los agentes de plegamiento interno pueden tener tamaños volumétricos entre 6000-120.000 Á3. Los agentes de plegamiento interno proporcionados pueden tener un tamaño volumétrico que sea igual o menor que el tamaño volumétrico de un anticuerpo. Un agente de plegamiento interno puede tener un área de superficie de epítopo diana total de aproximadamente 20 x 30 = 600 Á2. El área de superficie de epítopo diana total ^{de un agente de plegamiento interno puede ser inferior a aproximadamente 10 Á2, 20}á2, ^{30 Á2, 40 Á2, 50 Á2, 60 Á2,}70 Á2, 80 Á2, 85 Á2, 90 Á2, 95 Á2, 100 Á2, 105 Á2, 110 Á2, 115 Á2, 120 Á2, 125 Á2, 130 Á2, 135 Á2, 140 Á2, 145 Á2, 150 Á2, 151 Á2, 152 Á2, 153 Á2, 154 Á2, 155 Á2, 160 Á2, 165 Á2, 170 Á2, 175 Á2, 180 Á2, 185 Á2, 190 Á2, 195 Á2, 200 Á2, 210 Á2, 220 Á2, 230 Á2, 240 Á2, 250 Á2, 260 Á2, 270 Á2, 280 Á2, 290 Á2, 300 Á2, 310 Á2, 315 Á2, 320 Á2, 325 Á2, 330 Á2 o mayor. El área de superficie de epítopo diana total puede ser inferior a aproximadamente 200 Á2, aproximadamente 175 Á2, aproximadamente 150 Á2, aproximadamente 125 Á2 o más pequeña. Los agentes de plegamiento interno como se reivindican tienen una longitud que es inferior a aproximadamente 1000 aminoácidos. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno tienen una longitud que es menor que una longitud máxima de aproximadamente 1000, 975, 950, 925, 900, 875, 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625, 600, 575, 550, 525, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25 o 20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno tienen una longitud que es mayor que una longitud mínima de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 o más aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno tienen una longitud entre una cualquiera de tales longitudes mínimas y una cualquiera de tales longitudes máximas, siempre que la longitud máxima sea mayor que la longitud mínima. En algunas realizaciones particulares, un agente de plegamiento interno tiene una longitud de entre aproximadamente 20 y 500, o de entre 30 y 400, o de entre 40 y 300, o de entre 80 y 250 aminoácidos. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno tiene una longitud de aproximadamente 84, 88, 93, 95, 98, 104, 106, 110, 111, 116, 119, 123, 124, 132, 212, 215, 244 o 245. Los agentes de plegamiento interno pueden estar compuestos por aminoácidos naturales. Los agentes de plegamiento interno pueden comprender uno o más aminoácidos no naturales. Los agentes de plegamiento interno pueden estar compuestos por combinaciones de aminoácidos naturales y no naturales. Un agente de plegamiento interno puede estar compuesto por una, dos o más cadenas polipeptídicas que estén covalentemente (por ejemplo, mediante un enlazador) o no covalentemente asociadas. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno puede estar unido a, o ser parte de, una cadena polipeptídica más larga (por ejemplo, un anticuerpo completo, albúmina sérica u otra proteína transportadora) siempre que el agente de plegamiento interno conserve su estructura tridimensional y su disposición para la interacción. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno pueden agregarse a los extremos N o C de otra secuencia polipeptídica que es o no es un plegamiento interno. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se incorporan en la secuencia de otro polipéptido que es o no es un plegamiento interno, separando de este modo la secuencia polipeptídica en dos o más segmentos. En algunas realizaciones, agregar el plegamiento a los extremos N o C o dentro de la secuencia de otro polipéptido que es o no un plegamiento puede permitir al menos uno o más de los siguientes: una disminución de la inmunogenicidad, un vida útil en la circulación aumentada, una degradación más lento in vivo, el estímulo de una respuesta inmunitaria local, la interacción con las moléculas del sistema inmunitario, un aumento en el volumen, un aumento en la afinidad por la diana (o dianas) de plegamiento interno, un aumento en la especificidad por la diana (o dianas) de plegamiento interno o el uso de otros protocolos de administración terapéutica/preventiva comúnmente utilizados. En algunas realizaciones, agregar un plegamiento a los extremos N o C o dentro de la secuencia de otro polipéptido que es o no un plegamiento no tiene un efecto directo sobre la unión de un agente de plegamiento a una diana (por ejemplo, un polipéptido HA, la región MPER de un polipéptido HA, N-^{glucanos en un polipéptido HA, receptores de}hA ^{o glucanos sialilados en los receptores de HA).}

Los agentes de plegamiento interno se unen a sus sitios de unión diana mediante la interacción con uno o más restos diana. Dichos restos diana son aminoácidos, sacáridos o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de plegamiento interno que se unen a un polipéptido HA, a glucanos unidos en N en un polipéptido HA, a un receptor de HA, a glucanos sialilados en un receptor de HA o diversas combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes polipeptídicos que comprenden un primer agente de plegamiento interno que se une a un polipéptido HA y un segundo agente de plegamiento interno que se une al receptor de HA. En algunas de tales realizaciones, el agente polipeptídico comprende una única cadena polipeptídica que comprende el primer y el segundo plegamiento interno, opcionalmente conectados entre sí por medio de uno o más aminoácidos enlazadores. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno que se une a un receptor de HA interactúa con uno o más glucanos en el receptor de HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos sialilados. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a los glucanos sialilados que tienen una topología de tipo paraguas. En determinadas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos con topología de paraguas con alta afinidad y/o especificidad. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno muestran una preferencia de unión para los glucanos con topología de paraguas en comparación con los glucanos con otras topologías (por ejemplo, glucanos con topología de cono). En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno compiten con la HA para unirse a receptores de HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno compiten con la HA por la unión de forma que la unión entre el polipéptido HA y el receptor de HA se reduce al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 11 veces, al menos 12 veces, al menos 13 veces, al menos 14 veces, al menos 15 veces, al menos 16 veces, al menos 17 veces, al menos 18 veces, al menos 19 veces o al menos 20 veces. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno compiten con la HA para unirse a glucanos en los receptores de HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno compiten con la HA para unirse a un glucano con topología de paraguas. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno proporcionado en el presente documento es un agente de bloqueo con topología de paraguas. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno proporcionado en el presente documento es un agente de bloqueo específico con topología de paraguas. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno tiene una estructura de cadena principal plegada poblada por una pluralidad de restos de aminoácido de unión directa (es decir, restos de aminoácido que hacen contactos directos con aminoácidos o glucanos de la HA), y/o con aminoácidos o glucanos del receptor de HA como se describe en el presente documento.

Restos de interacción: La expresión "restos de interacción", como se usa en el presente documento, se refiere a restos en un agente de plegamiento interno que están diseñados para interactuar con restos diana particulares en un polipéptido diana. En concreto, los restos de interacción se seleccionan y disponen dentro de la secuencia de un agente de plegamiento interno de forma que se presenten en un espacio tridimensional dentro de una distancia (o volumen) predeterminada de los restos diana identificados (por ejemplo, tras la unión, acoplamiento u otros ensayos de interacción). Los restos de interacción pueden ser restos de unión directa.

Aislado: el término "aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a un agente o entidad que (i) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociado cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza o en un contexto experimental); o (ii) se ha producido por la mano del hombre. Las agentes o entidades aisladas pueden separarse de al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de los otros componentes a los que estaban asociadas inicialmente. Los agentes aislados pueden estar más del 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % puros.

Oligosacárido largo: Para los fines de la presente divulgación, un oligosacárido se considera normalmente "largo" si incluye al menos una cadena lineal que tiene al menos cuatro restos de sacárido.

Aminoácido natural: Como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácido natural" se refiere a uno de los veinte aminoácidos de origen natural. Consúltese la Tabla 1 para obtener una lista de estos aminoácidos.

Polipéptido: Como se usa en el presente documento, un "polipéptido", en términos generales, es una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico. En algunas realizaciones, un polipéptido puede incluir al menos 3-5 aminoácidos, cada uno de los cuales está unido a los otros mediante de al menos un enlace peptídico. Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos a veces incluyen aminoácidos "no naturales" u otras entidades que, sin embargo, son capaces de integrarse, opcionalmente, en una cadena polipeptídica.

Puro: Como se usa en el presente documento, un agente o entidad es "puro" si está sustancialmente libre de otros componentes. Por ejemplo, una preparación que contiene más de aproximadamente el 90 % de un agente o entidad particular normalmente se considera una preparación pura. En algunas realizaciones, un agente o entidad está al menos el 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % pura.

Oligosacárido corto: Para los fines de la presente divulgación, un oligosacárido se considera normalmente "corto" si tiene menos de 4 o, ciertamente, menos de 3, restos en cualquier cadena lineal.

Especificidad: Como se conoce en la técnica, la "especificidad" es una medida de la capacidad de un ligando particular (por ejemplo, un agente de plegamiento interno) para distinguir a su compañero de unión (por ejemplo, un receptor de Ha ^{humana y en particular un receptor de HA humano de las vías respiratorias altas) de otros posibles socios de unión}(por ejemplo, un receptor de HA aviar).

Homología sustancial: La frase "homología sustancial" se usa en el presente documento para referirse a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico. Como apreciarán los expertos en la materia, generalmente se considera que dos secuencias son "sustancialmente homólogas" si contienen restos homólogos en las posiciones correspondientes. Los restos homólogos pueden ser restos idénticos. Como alternativa, los restos homólogos pueden ser restos no idénticos con características estructurales y/o funcionales apropiadamente similares. Por ejemplo, como saben los expertos en la materia, determinados aminoácidos se clasifican normalmente como aminoácidos "hidrófobos" o "hidrófilos", y/o como que tienen cadenas laterales "polares" o "no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo a menudo puede considerarse una sustitución "homóloga". Las clasificaciones de los aminoácidos típicas se resumen a continuación en la Tabla 1:

Tabla 1

Clasificaciones de aminoácidos

Aminoácido Abreviaturas Polaridad Carga

Alanina Ala A No polar neutro 1,8

Arginina Arg R Polar positivo -4,5

Asparagina Asn N Polar neutro -3,5

Ácido aspártico Asp D Polar negativa -3,5

Cisteína Cys C No polar neutro 2,5

Ácido glutámico Glu E Polar negativa -3,5

Glutamina Gln Q Polar neutro -3,5

Glicina Gly G No polar neutro -0,4

Histidina His H Polar positivo -3,2

Isoleucina Ile I No polar neutro 4,5

Leucina Leu L No polar neutro 3,8

Lisina Lys K Polar positivo -3,9

Metionina Met M No polar neutro 1,9

Fenilalanina Phe F No polar neutro 2,8

Prolina Pro P No polar neutro -1,6

Serina Ser S Polar neutro -0,8

Treonina Thr T Polar neutro -0,7

Triptófano Trp W No polar neutro -0,9

Tirosina Tyr Y Polar neutro -1,3

Valina Val V No polar neutro 4,2

Tabla 2

Aminoácidos ambiguos 3 letras 1 letras

Asparagina o ácido aspártico Asx B

Glutamina o ácido glutámico Glx Z

Leucina o isoleucina Xle J

Aminoácido no especificado o desconocido Xaa X

Como es bien conocido en la técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una diversidad de algoritmos, incluidos los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias nucleotídicas y BLASTP, gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias aminoacídicas. Se describen programas ejemplares de este tipo en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente en general proporcionan un indicio del grado de homología. Se considera que dos secuencias son sustancialmente homólogas si al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus restos correspondientes son homólogos en un tramo de restos de interés. El tramo de interés puede ser una secuencia completa. El tramo de interés es al menos de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más restos.

Identidad sustancial: La frase "identidad sustancial" se usa en el presente documento para referirse a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico. Como apreciarán los expertos en la materia, generalmente se considera que dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si contienen restos idénticos en las posiciones correspondientes. Como es bien conocido en la técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una diversidad de algoritmos, incluidos los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias nucleotídicas y BLASTP, gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias aminoacídicas. Se describen programas ejemplares de este tipo en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente en general proporcionan un indicio del grado de identidad. Se considera que dos secuencias son sustancialmente idénticas si al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus restos correspondientes son idénticos en un tramo de restos de interés. El tramo de interés puede ser una secuencia completa. El tramo de interés puede ser al menos de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más restos.

Polipéptido diana: Un "polipéptido diana", como se usa el término en el presente documento, es un polipéptido con el que interactúa un agente de plegamiento interno. Un polipéptido diana puede ser un polipéptido HA. Un polipéptido diana puede ser un receptor de un polipéptido HA.

Resto diana: Un "resto diana", como se usa el término en el presente documento, es un resto dentro de un polipéptido diana con el cual un agente de plegamiento interno está diseñado para interactuar. En concreto, un agente de plegamiento interno se caracteriza normalmente por restos de interacción particulares seleccionados y dispuestos (en virtud de ser presentados en la cadena principal "plegada" seleccionada) para estar dentro de una determinada distancia (o volumen) predeterminada de un resto diana. Un resto diana puede ser o comprende un resto de aminoácido. Un resto diana puede ser o comprende un resto de sacárido.

Agente terapéutico: Como se usa en el presente documento, la frase "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que suscite un efecto biológico o farmacológico deseado.

Tratamiento: Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a cualquier método utilizado para aliviar, retrasar el inicio, reducir la gravedad o incidencia, o producir la profilaxis de uno o más síntomas o aspectos de una enfermedad, trastorno o afección. Para los fines de la presente invención, el tratamiento se puede administrar antes, durante y/o después del inicio de los síntomas.

Topología de paraguas: La frase "topología de paraguas" se usa en el presente documento para referirse a una disposición tridimensional adoptada por determinados glucanos y, en particular, por glucanos en receptores de HA. La presente divulgación abarca el reconocimiento de que la unión a glucanos con topología de paraguas es característica de los polipéptidos HA que actúan como mediadores en la infección de hospedadores humanos. Como se ilustra en las Figuras 10 y 12, la topología de paraguas normalmente la adoptan solo los glucanos sialilados en a2,6, y es típica de los oligosacáridos largos (por ejemplo, mayores que tetrasacárido). En algunas realizaciones, los glucanos con topología de paraguas son glucanos que presentan una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura presentada en la Figura 10 (panel derecho). En algunas realizaciones, los glucanos con topología de paraguas son glucanos que se ponen en contacto con polipéptidos HA a través de las interacciones con restos de aminoácido específicos. En algunas realizaciones, la topología estructural del glucano se clasifica basándose en el parámetro 0 definido como el ángulo entre el C2 de Sia, el C1 de Gal y el C1 de GlcNAc. Los valores de 0 < 100° representan una topología de tipo cono adoptada por los glucanos a2,3 y a2,6 cortos. Los valores de 0 > 110° representan una topología de tipo paraguas, tal como la topología adoptada por los glucanos a2,6 largos. Un ejemplo de topología de paraguas está dado por el ángulo 9 del enlace Neu5Aca2,6Gal de alrededor de -60. La Figura 12 presenta determinados ejemplos representativos (aunque no exhaustivos) de glucanos que pueden adoptar una topología de paraguas. Los motivos de a2,6 largos presentados en la Figura 12 incluyen Neu5Aca2,6 unidos en el extremo no reductor a una cadena larga (por ejemplo, al menos un trisacárido) encontrada como parte de los glucanos unidos en N, en glucanos unidos en O y en glucolípidos biológicos. El recuadro muestra ejemplos de fracciones de glucanos a2,6 largos con topología de paraguas que se encuentran como parte de los glucanos biológicos que se unen con alta afinidad a HA. En algunas realizaciones, los glucanos con topología de paraguas (por ejemplo, en un sitio) comprenden una mayor proporción de ramas de oligosacárido a2,6 largas (por ejemplo, múltiples unidades de lactosamina) que de ramas de a2,6 cortas (por ejemplo, una única lactosamina). Los glucanos con topología de paraguas (por ejemplo, en un sitio) pueden comprender aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 50 veces o mayor que aproximadamente 50 veces más ramas de oligosacáridos a2,6 largas que ramas a2,6 cortas (por ejemplo, lactosamina única). La característica singular de las interacciones de la HA con glucanos con topología de paraguas y/o señuelos de glucano es el contacto de la HA con un glucano que comprende ácido siálico (AS) y/o análogos de AS en el extremo no reductor. La longitud de la cadena del oligosacárido puede ser al menos de un trisacárido (excluyendo el SA o el análogo de SA). Los glucanos con topología de paraguas son oligosacáridos con la siguiente forma:

Neu5Aca2,6Sug1-Sug2-Sug3

en que:

(a) Neu5Ac a2,6 está normalmente (pero no esencialmente) en el extremo no reductor;

(b) Sugl:

(i) es una hexosa (frecuentemente Gal o Glc) o hexosamina (GlcNAc o GalNAc) en configuración a o p (frecuentemente p- para la extensión unida en N y O y a- en el caso de GalNAca- que está unida en O a la glicoproteína);

(ii) no hay azúcares distintos de Neu5Aca2,6 unidos a ninguna de las posiciones no reductoras de Sugl (excepto cuando Sugl es GalNAca-, que está unido en O a la glucoproteína); y/o

(Ni) las fracciones no azúcar tales como sulfato, fosfato, guanidinio, amina, N-acetilo, etc. pueden estar unidas a posiciones no reductoras (normalmente la posición 6) de Sugl (por ejemplo, para mejorar los contactos con la HA);

(c) Sug2 y/o Sug3 es/son:

(i) una hexosa (frecuentemente Gal o Glc) o hexosamina (GlcNAc o GalNAc) en configuración a o p (frecuentemente p); y/o

(ii) las fracciones de azúcares (tales como Fuc) o no azúcar tales como sulfato, fosfato, guanidinio, amina, N-acetilo, etc. pueden estar unidas a posiciones no reductoras de Sug2, Sug3 y/o Sug4;

(d) El enlace entre dos azúcares cualesquiera en el oligosacárido aparte del enlace Neu5Aca2,6 puede ser 1-2, 1 3, 1-4 y/o 1-6 (normalmente, 1-3 o 1-4); y/o

(e) La estructura en que Neu5Aca2,6 está unido GalNAca que está unido en O a la glucoproteína y los azúcares adicionales están unidos al extremo no reductor de GalNAca, por ejemplo

(i) Neu5Aca2,6(Neu5Aca2,3Galp1-3)GalNAca-(ii) Neu5Aca2,6(Galp1-3)GalNAca-

Aminoácido no natural: Como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácido no natural" se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado y/o análogo de aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos naturales. Consúltese la Patente de Estados Unidos N.° 7.045.337, la Patente de Estados Unidos N.° 7.385.028 y la Patente de Estados Unidos N.° 7.332.571. Como se usa en el presente documento, "aminoácido no natural" también abarca aminoácidos químicamente modificados, incluyendo, pero sin limitación, sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo los aminoácidos carboxi y/o amino terminales en péptidos, puede modificarse mediante pegilación, metilación, amidación, acetilación y/o sustitución con otros grupos químicos que no afecten negativamente la actividad del agente de plegamiento interno. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. El término "aminoácido" se usa indistintamente con "resto de aminoácido", y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un resto de aminoácido de un péptido. Será evidente a partir del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o a un resto de un péptido.

Agente antigripal universal: Como se usa en el presente documento, la expresión "agente antigripal universal" se refiere a un agente que tiene una neutralización de amplio espectro entre cepas, grupos, clados y clústeres del virus de la gripe (véanse las definiciones de "amplio espectro" más arriba y la Figura 19).

Vacunación: Como se usa en el presente documento, el término "vacunación" se refiere a la administración de una composición destinada a generar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, frente a un agente causante de una enfermedad. Para los fines de la presente invención, la vacunación se puede administrar antes, durante y/o después de la exposición a un agente causante de una enfermedad y en determinadas realizaciones, antes, durante y/o poco después de la exposición al agente. En algunas realizaciones, la vacunación incluye múltiples administraciones, espaciadas de forma apropiada en el tiempo, de una composición para vacunación.

Variante: Como se usa en el presente documento, el término "variante" es un término relativo que describe la relación entre un polipéptido particular (por ejemplo, un polipéptido HA) de interés y un polipéptido "parental" con el que se compara su secuencia. Se considera que un polipéptido de interés es una "variante" de un polipéptido parental si el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la del parental a excepción de un pequeño número de modificaciones de la secuencia en posiciones particulares. Normalmente, menos del 20 %, 15 %, 1o %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2% de los restos de la variante están sustituidos en comparación con el parental. En algunas realizaciones, una variante tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 resto sustituido en comparación con un parental. A menudo, una variante tiene un número muy pequeño (por ejemplo, menos de 5, 4, 3, 2 o 1) de restos funcionales sustituidos (es decir, restos que participan en una actividad biológica particular). Adicionalmente, una variante normalmente no tiene más de 5, 4, 3, 2 o 1 adición o deleción, y a menudo no tiene adiciones o deleciones, en comparación con el parental. Además, cualquier adición o deleción es normalmente menor de aproximadamente 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 10, 9, 8, 7, 6 y comúnmente es menor de aproximadamente 5, 4, 3 o 2 restos. En algunas realizaciones, el polipéptido original es uno que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido HA parental puede ser uno encontrado en un aislado natural (por ejemplo, de tipo silvestre) de un virus de la gripe (por ejemplo, un polipéptido HA de tipo silvestre).

Vector: Como se usa en el presente documento, "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se lo ha unido. Los vectores son capaces de replicación extracromosómica y/o de expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos en una célula hospedadora tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes unidos de operativamente se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

Tipo silvestre: Como se entiende en la técnica, la frase "tipo silvestre" generalmente se refiere a una forma normal de una proteína o ácido nucleico, como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, los polipéptidos HA de tipo silvestre se encuentran en aislados naturales del virus de la gripe. Se puede encontrar una diversidad de distintas secuencias de HA de tipo silvestre en la base de datos de secuencias de virus de la gripe del NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html.

Descripción detallada de determinadas realizaciones particulares de la invención

Polipéptido de hemaglutinina (HA)

Los virus de la gripe son virus de ARN que se caracterizan por una envoltura de membrana lipídica que contiene dos glucoproteínas, un polipéptido hemaglutinina (HA) y un polipéptido de neuraminidasa (NA), incluidos en la membrana del virus particular. Hay 16 subtipos de polipéptidos hA conocidos (H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16) y 9 subtipos de polipéptidos NA (N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 y N9), y las distintas cepas gripales se nombran basándose en el número de subtipos del polipéptido HA y el polipéptido NA de la cepa, en donde hay distintas combinaciones de un subtipo del polipéptido HA combinado con un subtipo del polipéptido NA (por ejemplo, H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, etc.).

Basándose en comparaciones de identidad de secuencia de aminoácidos y de las estructuras cristalinas, los subtipos de los polipéptidos HA se han dividido en dos grupos principales y cuatro clados más pequeños, que se dividen adicionalmente en cinco grupos (Figura 19). Los distintos subtipos del polipéptido HA no necesariamente comparten una fuerte identidad de secuencia de aminoácidos, pero las estructuras tridimensionales globales de los distintos subtipos del polipéptido HA son similares entre sí, con varias diferencias sutiles que pueden utilizarse a fines de clasificación. Por ejemplo, la orientación particular de los subdominios distales de membrana en relación con una hélice a central es una característica estructural comúnmente utilizada para determinar el subtipo del polipéptido HA (Russell et al., Virology, 325:287, 2004).

Los polipéptidos HA maduros están compuestos por dos dominios, (1) un dominio centra1HA-1 conocido como dominio de unión a ácido siálico y (2) el tallo transmembrana de la HA, conocido como dominio HA-2. HA-1 contiene el sitio de unión para glucanos y se cree que HA-1 es responsable de actuar como mediador en la unión de la HA al receptor de HA. HA-2 es responsable de presentar el dominio HA-1.

Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, el análisis de las secuencias de la HA de todos los subtipos gripales mostró un conjunto de aminoácidos en la interfaz de los dominios HA-1 (tallo) y HA-2 (cabeza) que están bien conservados y son accesibles a las posibles moléculas terapéuticas (Figura 13). Los estudios también han observado la excelente conservación de amplio espectro de la región epitópica proximal de membrana (MPER) de la interfaz HA-1/HA-2 que incluye la hélice a canónica y los restos en su vecindad (Ekiert et al., Science,. 324(5924):246, 2009; Sui et al., Nat Struct Mol Biol. 16(3):265, 2009) (Figura 2).

Se han desarrollado anticuerpos contra la región epitópica proximal de membrana (MPER) altamente conservada de la HA, que incluyen el FAb de CR6261 (Ekiert et al., Science,. 324 (5924): 246, 2009) y el scFv de F10 (Sui et al., Nat Struct Mol Biol. 16 (3): 265, 2009) (Figura 3). Si bien estos anticuerpos tienen éxito en la neutralización del clado del grupo 1 de las cepas del virus de la gripe A (HI, H2, H5, H9), son ineficaces contra las cepas del grupo 2 que están glucosiladas en N en la proximidad de su Mp Er (Ekiert et al., Science,. 324(5924):246, 2009; Sui et al., Nat Struct Mol Biol. 16(3):265, 2009). Estas cepas del grupo 2 incluyen H3 del virus de la gripe A, H7 y H10 que están glucosilados en Asn-38 del dominio N terminal de HA-1, así como todo el clado de virus de la gripe B que están glucosilados en Asn-238 del dominio C terminal de HA-1. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, los inventores proponen que las N-glucosilaciones impiden que las moléculas grandes basadas en anticuerpos, tales como las IgG, los mAb y los scFv accedan al epítopo subyacente, limitando de este modo su aplicación de amplio espectro (Figura 4).

Receptores de HA

Los polipéptidos HA interactúan con la superficie de las células al unirse a un receptor glucoproteína, conocido como el receptor de HA. La unión de un polipéptido HA a un receptor de HA está mediada predominantemente por glucanos unidos a N en los receptores de HA. En concreto, los polipéptidos HA en la superficie de las partículas del virus de la gripe reconocen los glucanos sialilados que están asociados con los receptores de HA en la superficie del hospedador celular. Después de reconocimiento y la unión, la célula hospedadora envuelve al viral y el virus puede replicarse y producir muchas más partículas de virus para distribuirse a las células vecinas.

Los polipéptidos HA existen en la membrana vírica como un homotrímero de uno de los 16 subtipos, denominado H1-H16. Solo tres de estos subtipos (HI, H2 y H3) se han adaptado hasta ahora para la infección humana. Una característica informada de los polipéptidos HA que se han adaptado para infectar a los seres humanos (por ejemplo, los polipéptidos HA de los subtipos pandémicos del virus de la gripe H1N1 (1918) y H3N2 (1967-68)) es su capacidad para unirse preferentemente a glucanos sialilados en a2,6 en comparación con sus progenitores aviares que se unen preferentemente a glucanos sialilados en a2,3 (Skehel y Wiley, Annu Rev Biochem, 69:531, 2000; Rogers, y Paulson, Virology, 127:361, 1983; Rogers et al., Nature, 304:76, 1983; Sauter et al., Biochemistry, 31:9609, 1992; Connor et al., Virology, 205:17, 1994; Tumpey et al., Science, 310:77, 2005). Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, se ha propuesto que la capacidad de infectar hospedadores humanos se correlaciona menos con la unión a los glucanos de un enlace particular y más con la unión a glucanos de una topología particular. Los inventores han demostrado en concreto que los polipéptidos HA que actúan como mediadores en la infección de seres humanos se unen a glucanos con topología de paraguas, a menudo mostrando preferencia por glucanos con topología de paraguas sobre los glucanos con topología de cono (aunque los glucanos con topología de cono pueden ser glucanos sialilados en a2,6) (Véanse, por ejemplo, los documentos USSN 12/348.266 presentado el 2 de enero de 2009, USSN 12/301.126, presentado 17 de noviembre de 2008, USSN 61/018.783, presentado jueves, 3 de enero de 2008, USSN 11/969.040, presentado jueves, 3 de enero de 2008, USSN 11/893.171, presentado martes, 14 de agosto de 2007, USSN 60/837.868, presentado el 14 de agosto de 2006, USSN 60/837.869, presentado el 14 de agosto y a la solicitud PCT PCT/US07/18160, presentada el 14 de agosto de 2007.

Están disponibles varias estructuras cristalinas de polipéptidos HA de H1 (humano y porcino), los subtipos H3 (aviar) y H5 (aviar) unidos a oligosacáridos sialilados (de enlaces a2,3 y a2,6), y proporcionan información molecular sobre los aminoácidos específicos que están implicados en distintas interacciones de los polipéptidos HA con estos glucanos (Eisen et al., Virology, 232:19, 1997; Ha et al., Proc Natl Acad Sci USA, 98:11181,2001; Ha et al., Virology, 309:209, 2003; Gamblin et al., Science, 303:1838, 2004; Stevens et al., Science, 303:1866, 2004; Russell et al., Glycoconj J 23:85, 2006; Stevens et al., Science, 312:404, 2006). Se han identificado y se presentan en la Tabla 3 algunas estructuras cristalinas de interacciones ejemplares HA-glucano:

Tabla 3. Estructuras cristalinas de complejos de HA-glucano

Abreviatura (ID de PDB) Cepa del virus Glucano (con coordenadas asignadas)

ASI30_H1_23 (1RV0) A/Swine/Iowa/30 (H1N1) Neu5Ac

ASI30_H1_26 (1RVT) A/Swine/Iowa/30 (H1N1) Neu5Aca 6Galp4GlcNAcp3Galp4Glc APR34_H1_23 (1RVX) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) Neu5Aca 3Galp4GlcNAc APR34_H1_26 (1RVZ) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) Neu5Aca 6Galp4GlcNAc ADU63_H3_23 (1MQM) A/Duck/Ukraine/1/63 (H3N8) Neu5Aca 3Gal

ADU63_H3_26 (1MQN) A/Duck/Ukraine/1/63 (H3N8) Neu5Aca6Gal

AAI68_H3_23 (1HGG) A/Aichi/2/68 (H3N2) Neu5Aca 3Galp4Glc

ADS97_H5_23 (1JSN) A/Duck/Singapore/3/97 (H5N3) Neu5Aca 3Galp3GlcNAc

ADS97 H5 26(1JSO) A/Duck/Singapore/3/97 (H5N3) Neu5Ac

Viet04_H5 (2FK0) A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)

Los complejos de HA - glucano sialilado en a 2,6 se generaron mediante la superposición del trazado de CA de la subunidad HA-1 de ADU63 H3 y ADS97 H5 y Viet04_H5 en ASI30_H1_26 y APR34_H1_26 (HI). Aunque se han publicado los complejos estructurales de A/Aichi/2/68 (H3N2) humano con glucanos sialilados en a 2,6 (Eisen et al., 1997, Virology, 232:19), sus coordenadas no estaban disponibles en el Protein Data Bank. Se utilizó el programa SARF2 (http://123d.ncifcrf.gov/sarf2.html) para obtener la alineación estructural de las distintas subunidades HA-1 para la superposición._______________________________________________________________________________

Por ejemplo, las estructuras cristalinas de H5 (A/pato/Singapur/3/97) solas o unidas a un oligosacárido sialilado en a2,3 o a2,6 identifican determinados aminoácidos que interactúan directamente con los glucanos unidos, y también aminoácidos que están a uno o más grado de separación (Stevens et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:11181, 2001). En algunos casos, la conformación de estos restos es distintas en los estados unido frente a no unido. Por ejemplo, Glu190, Lys193 y Gln226 participan en interacciones de unión directa y tienen conformaciones distintas en el estado unido frente al no unido. La conformación de Asn186, que es proximal a Glu190, también es significativamente distinta en el estado unido frente al no unido.

Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, se cree que los receptores de HA están modificados por los glucanos sialilados en a2,3 o a2,6 cerca del sitio de unión al polipéptido HA del receptor, y que el tipo de enlace del glucano unido al receptor puede afectar la conformación del sitio de unión al polipéptido Ha ^{del receptor, afectando}así la especificidad del receptor por distintos polipéptidos HA. Por ejemplo, el bolsillo de unión a glucano del receptor de HA aviar es estrecho. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, se ha propuesto que este bolsillo se une a la conformación trans de glucanos sialilados en a2,3 y/o a glucanos con topología de cono, ya sea unidos en a2,3 o a2,6 (Figuras 10-12).

Los receptores de HA en los tejidos aviares, y también en los tejidos del tracto gastrointestinal (GI) y de áreas distales del pulmón humanos se caracterizan por enlaces de glucano sialilado en a2,3, y además se caracterizan por glucanos, incluidos los glucanos sialilados en a2,3 y/o sialilados en a2,6, que predominantemente adoptan topologías de cono. Los receptores de HA que tienen tales glucanos con topología de cono pueden denominarse en el presente documento los CTHAr.

Por el contrario, los receptores de HA humanos en los bronquios y la tráquea de las vías respiratorias altas) están modificados por glucanos sialilados en a2,6. A diferencia del motivo a2,3, el motivo a2,6 tiene un grado adicional de libertad de conformacional debido al enlace C6-C5 (Russell et al., Glycoconj J23:85, 2006). Los polipéptidos HA que se unen a tales glucanos sialilados en a2,6 tienen un bolsillo de unión más abierto para adaptarse a la diversidad de estructuras que surgen de esta libertad conformacional. Además, de acuerdo con la presente invención, los polipéptidos Ha pueden necesitar unirse a los glucanos (por ejemplo, glucanos sialilados en a2,6) en una topología de paraguas, y particularmente puede necesitar unirse a tales glucanos con topología de paraguas con fuerte afinidad y/o especificidad, para actuar como mediadores de forma eficaz en la infección de los tejidos de las vías respiratorias altas humanas. Los receptores de HA que tienen glucanos con topología de paraguas pueden denominarse en el presente documento los UTHAr.

Como resultado de estos perfiles de glucosilación espacialmente restringidos, los seres humanos habitualmente no se infectan por virus que contienen muchos polipéptidos HA aviares de tipo silvestre (por ejemplo, H5 aviar). En concreto, debido a que las partes de las vías respiratorias humanas que tienen más probabilidades de encontrarse con virus (es decir, la tráquea y los bronquios) carecen de receptores con glucanos en cono (por ejemplo, los glucanos sialilados en a2,3 y/o los glucanos cortos) y los polipéptidos HA aviares de tipo silvestre normalmente se unen principalmente o exclusivamente a los receptores asociados con los glucanos cónicos (por ejemplo, glucanos sialilados en a2,3 y/o glucanos cortos), los seres humanos rara vez se infectan con virus aviares. Solo cuando están en contacto suficientemente cercano con virus que puede acceder a los receptores de áreas distales del pulmón y/o del tracto gastrointestinal que tienen glucanos de paraguas (por ejemplo, glucanos sialilados en a2,6 largos) es que los humanos se infectan.

Agentes de plegamiento interno

Estructura del agente de plegamiento interno

Como se describe en el presente documento, los agentes de plegamiento interno son, generalmente, agentes polipeptídicos que se unen a un sitio de unión seleccionado. Un agente de plegamiento interno tiene una estructura caracterizada por una cadena principal "plegada" poblada por restos de interacción seleccionados y dispuestos de manera que, cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión, los restos de interacción individuales se colocan dentro de una distancia o volumen preseleccionado de restos diana afines.

Se conoce en la técnica una diversidad de estructuras "plegadas" polipeptídicas, utilizadas apropiadamente como estructuras de cadena principal de agentes de plegamiento interno de acuerdo con la presente invención. Es decir, es bien sabido que las cadenas lineales de aminoácidos adoptan estructuras secundarias y terciarias discretas, de forma que los aminoácidos son proximales en el espacio, pero distales en secuencia. Por ejemplo, plegamientos secundarios comunes incluyen la hélice a, la lámina p, la hélice de poliprolina, hélice 3io y giros. Los plegamientos terciarios comunes incluyen los de tipo ferredoxina (4,45 %), barril TIM (3,94 %), bucle P que contiene nucleótido trifosfato hidrolasa (3,71 %), dominio catalítico de proteínas quinasas (PK) (3,14 %), dominios del plegamiento de Rossmann de unión a NAD(P) (2,80 %), haz de 3 hélices de unión a DNA:ARN (2,60 %), superhélice a-a (1,95 %), metiltransferasa dependiente de S-adenosil-L-metionina (1,92 %), propulsor beta de 7 hojas (1,85 %), a:p hidrolasas (1,84 %), transferasa dependiente de PLP (1,61 %), nucleótido adenina a-hidrolasa (1,59 %), de tipo flavodoxina (1,49 %), sándwich p de tipo inmunoglobulina (1,38 %) y de tipo receptor de glucocorticoides (0,97 %), en que los valores entre paréntesis son los porcentajes de las proteínas comentadas que adoptan los plegamientos respectivos (véase, por ejemplo, Zhang et al., Cellular and Molecular Life Sciences, 58:72, 2001).

Los agentes de plegamiento interno descritos en el presente documento pueden tener una estructura de cadena principal plegada basada en una proteína seleccionada del grupo que consiste en: la región extracelular del factor tisular humano, tenascina, neuroglian, molécula de adhesión celular neural 1 (NCAM), subunidad de beta-4 integrina, receptor de hormona de crecimiento, receptor de eritropoyetina (EPO), receptor de prolactina, cadena alfa del receptor de interleucina 4, cadena beta de receptores GM-CSF, cadena beta de receptores de IL-3, cadena beta de receptores de IL-5, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos (GC-SF), contactina 3 (KIAA1496), precursor de brother of c Do (BOC), cadena alfa del receptor del interferón gamma, dominios de unión a citocinas del receptor de citoquinas gp130, receptor 1 de interleucina 10 (IL-10R1), módulo de titina tipo 1, el dominio p40 de interleucina 12 (cadena beta de IL-12), cadena alfa del receptor de interleucina 6, cadena beta del receptor de interferón alfa/beta, proteína KIAA1568, proteína KIAA0343, proteína KIAA1355, receptor alfa del factor neurotrófico ciliar, factor de célula hospedadora 2 (HCF-2), proteína de dominios de repetición de anquirina 1 (FANK1), receptor 1 de efrina tipo B, receptor 8 de efrina tipo A, cadena gamma común del receptor de citocinas, proteína de unión a rim 2, cadena beta del receptor de interleucina 2, tenascina X, proteína-tirosina fosfatasa delta de tipo receptor (PTPRD), sidekick 2, neogenina, proteína similar a molécula de adhesión celular del síndrome de down 1 (DSCAML1), proteína de unión a miosina C (tipo rápido), proteína-tirosina fosfatasa F de tipo receptor (PTPRF), receptor hedgehog iHog, receptor 1 de efrina tipo A.

Los agentes de plegamiento interno descritos en el presente documento pueden tener una cadena principal plegada de anticuerpo. Varios agentes de plegamiento interno ejemplificados en el presente documento (véase, por ejemplo, la Tabla 9, por ejemplo, (Plegamiento interno 23 a Plegamiento interno 40) tienen una cadena principal plegada de anticuerpo. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno descritos en el presente documento tienen una cadena principal plegada de dominio de sándwich p.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno de la invención se caracterizan por la presencia de restos de interacción seleccionados y dispuestos para interactuar con restos diana particulares en un polipéptido HA y/o un receptor de HA. Por ejemplo, las tablas 4 y 5 presentan determinados conjuntos de restos diana representativos para polipéptidos HA (glucosilados o no glucosilados); Tabla 4) y para el receptor de HA (específicamente el receptor de hA que contiene glucanos sialilados; Tabla 5), también véanse las Figuras 5 y 9.

Tabla 4

Tabla 5

La presente invención proporciona agentes de plegamiento interno que contienen restos de interacción que se unen a estos conjuntos de dianas.

Por ejemplo, la Tabla 6 proporciona conjuntos de restos de interacción del plegamiento interno que se pueden utilizar en agentes de plegamiento interno de la invención diseñados para interactuar con polipéptidos HA y/o con receptores de HA de acuerdo con las reglas establecidas en la Tabla 7:

Tabla 6

Tabla 7

Como alternativa o adicionalmente, los agentes de plegamiento interno son polipéptidos caracterizados por una o más características estructurales expuestas en las Tablas 4-8 y/o en las Figuras 5, 13 y/o 14.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno proporcionados en el presente documento contienen uno o más de los elementos de secuencia de restos de interacción definidos en cada cuadro de la Tabla 8. Cada cuadro define un elemento de secuencia, en donde los aminoácidos enumerados en cada cuadro son restos de interacción que son adyacentes entre sí o están separados por uno o dos aminoácidos en la cadena polipeptídica del agente de plegamiento interno.

Tabla 8

Los agentes de plegamiento interno proporcionados tienen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a la de un agente de plegamiento interno expuesta en la Tabla 9. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno proporcionados tienen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la de un agente de plegamiento interno de la Tabla 9.

En la Tabla 9 se proporciona un listado de agentes de plegamiento interno particulares diseñados para unirse a la MPER de la HA (por ejemplo, de amplio espectro, glucosilada y no glucosilada). De acuerdo con la presente invención, los inventores descubrieron que menos del 10 % de los aminoácidos contribuyen a la unión de la HA. La presente invención proporciona agentes de plegamiento interno que tienen más del 50 % de identidad de secuencia por pares con cualquiera de las secuencias de agentes de plegamiento interno enumeradas a continuación en la Tabla 3. En particular, la presente invención proporciona tales agentes de plegamiento interno cuya estructura sigue adicionalmente las reglas o parámetros expuestos en una cualquiera de las Tablas 4-8 y las Figuras 5 y 13.

T l . n i min i l l mi n in rn i n ni n r ín l n .

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Los agentes de plegamiento interno como se reivindica se unen a la región MPER del polipéptido HA y se seleccionan del grupo que comprende el Plegamiento interno 1, Plegamiento interno 2, Plegamiento interno 3, Plegamiento interno 4, Plegamiento interno 5, Plegamiento interno 6, Plegamiento interno 7, Plegamiento interno 8, Plegamiento interno 9, Plegamiento interno 10, Plegamiento interno 11, Plegamiento interno 12, Plegamiento interno 13, Plegamiento interno 14, Plegamiento interno 15, Plegamiento interno 16, Plegamiento interno 17, Plegamiento interno 18, Plegamiento interno 19, Plegamiento interno 20, Plegamiento interno 21, Plegamiento interno 22, Plegamiento interno 23, Plegamiento interno 24, Plegamiento interno 25, Plegamiento interno 26, Plegamiento interno 27, Plegamiento interno 28, Plegamiento interno 29, Plegamiento interno 30, Plegamiento interno 31, Plegamiento interno 32, Plegamiento interno 33, Plegamiento interno 34, Plegamiento interno 35, Plegamiento interno 36, Plegamiento interno 37, Plegamiento interno 38, Plegamiento interno 39 o Plegamiento interno 40. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER del polipéptido HA y se seleccionan del grupo que comprende el Plegamiento interno 1, Plegamiento interno 2, Plegamiento interno 3, Plegamiento interno 4, Plegamiento interno 5, Plegamiento interno 6, Plegamiento interno 7, Plegamiento interno 8, Plegamiento interno 9, Plegamiento interno 10, Plegamiento interno 11, Plegamiento interno 12, Plegamiento interno 13, Plegamiento interno 14, Plegamiento interno 15, Plegamiento interno 16, Plegamiento interno 17, Plegamiento interno 18, Plegamiento interno 19, Plegamiento interno 20, Plegamiento interno 21 o Plegamiento interno 22. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER del polipéptido HA y se seleccionan del grupo que comprende el Plegamiento interno 23, Plegamiento interno 24, Plegamiento interno 25, Plegamiento interno 26, Plegamiento interno 27, Plegamiento interno 28, Plegamiento interno 29, Plegamiento interno 30, Plegamiento interno 31, Plegamiento interno 32, Plegamiento interno 33, Plegamiento interno 34, Plegamiento interno 35, Plegamiento interno 36, Plegamiento interno 37, Plegamiento interno 38, Plegamiento interno 39 o Plegamiento interno 40.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER del polipéptido HA y a glucanos, se seleccionan del grupo que comprende el Plegamiento interno 1, Plegamiento interno 3, Plegamiento interno 9, Plegamiento interno 10, Plegamiento interno 11, Plegamiento interno 12, Plegamiento interno 14, Plegamiento interno 15, Plegamiento interno 17, Plegamiento interno 18 o Plegamiento interno 19. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER del polipéptido HA y a glucanos, se seleccionan del grupo que comprende el Plegamiento interno 1, Plegamiento interno 3, Plegamiento interno 9, Plegamiento interno 10, Plegamiento interno 11, Plegamiento interno 12, Plegamiento interno 14, Plegamiento interno 15, Plegamiento interno 17, Plegamiento interno 18, Plegamiento interno 19 o Plegamiento interno 22.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER del polipéptido HA y a N-glucanos proximales a la MPER en el polipéptido HA, y se seleccionan del grupo que comprende el Plegamiento interno 11, Plegamiento interno 12, Plegamiento interno 14, Plegamiento interno 15, Plegamiento interno 18 o Plegamiento interno 19.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER del polipéptido HA y a glucanos sialilados en el receptor de HA, y se seleccionan del grupo que comprende el Plegamiento interno 1, Plegamiento interno 3, Plegamiento interno 9, Plegamiento interno 10, Plegamiento interno 17 o Plegamiento interno 19. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER del polipéptido HA y a glucanos sialilados en el receptor de HA, y se seleccionan del grupo que comprende el Plegamiento interno 1, Plegamiento interno 3, Plegamiento interno 9, Plegamiento interno 10, Plegamiento interno 17,1 Plegamiento interno 19 o Plegamiento interno 22.

En realizaciones adicionales, los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER del polipéptido HA, los N-glucanos proximales a la MPER en el polipéptido HA y los glucanos sialilados en el receptor de HA y es Plegamiento interno 19.

Los agentes de plegamiento interno para su uso en conformidad con la presente invención incluyen cualquiera de los presentados en la Tabla 9. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se seleccionan del grupo que comprende el Plegamiento interno 1, Plegamiento interno 3, Plegamiento interno 9, Plegamiento interno 10, Plegamiento interno 11, Plegamiento interno 12, Plegamiento interno 14, Plegamiento interno 15, Plegamiento interno 17, Plegamiento interno 18, Plegamiento interno 19, Plegamiento interno 22, Plegamiento interno 28 y Plegamiento interno 34. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se seleccionan del grupo que comprende el Plegamiento interno 1, Plegamiento interno 3, Plegamiento interno 9, Plegamiento interno 10, Plegamiento interno 17, Plegamiento interno 19 y Plegamiento interno 28.

La diana afín de los agentes de plegamiento interno en conformidad con la presente divulgación incluye al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA, en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 18, 19, 20, 21, 41, 45, 49, 52, 53 y 56, y combinaciones de los mismos. Los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto seleccionado del grupo que consiste en Trp21, Ile45, Asp19, Asn19, Ala19, His18, Gln18, Leu18, Ile18, Val18, Gly20, Thr41, Thr49, Asn49, Gln49, Val52, Leu52, Ile52, Asn53, Ile56 y Val56.

Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 18, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en His, Asp, Glu, Trp, Tyr, Asn, Lys, Arg, Gln, Met, Cys, Phe, Ile, Leu y Val, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 18 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 18, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en His, Asp, Glu, Trp, Tyr, Asn, Lys, Arg, Gln, Met, Cys, Phe, Ile, Leu, Val, Thr, Ser, Gly, Ala y Pro, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 18 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 18, el agente de plegamiento interno no contiene un resto que no sea distinto de His, Asp, Glu, Trp, Tyr, Asn, Lys, Arg, Gln, Met, Cys, Phe, Ile, Leu, Val, Thr, Ser, Gly, Ala o Pro, cuando se coloca dentro de un radio de 4-7 A cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 19, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys, His, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Val, Ala y Gly, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 19 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 19, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys, His, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Val, Ala, Gly, Tyr, Pro, Trp, Phe, Leu, Cys y Met, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 19 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 19, el agente de plegamiento interno no contiene un resto que no sea distinto de Arg, Lys, His, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Val, Ala, Gly, Tyr, Pro, Trp, Phe, Leu, Cys o Met, cuando se coloca dentro de un radio de 4-7 A cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 20, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Gly, Ala, Cys, Met, Ser y Pro, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 20 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 20, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Gly, Ala, Asn, Asp, Arg, Phe, Trp, His, Tyr, Gln y Lys, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 20 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 20, el agente de plegamiento interno no contiene un resto que no sea distinto de Gly, Ala, Cys, Met, Ser, Pro, Asn, Asp, Arg, Phe, Trp, His, Tyr, Gln o Lys, cuando se coloca dentro de un radio de 4-7 A cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 21, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Ile, Met, Phe, His, Cys y Pro, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 21 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 21, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Gly, Val, Arg, Ser, Thr, Trp, Leu y Ala, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 21 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 21, el agente de plegamiento interno no contiene un resto que no sea distinto de Tyr, Ile, Met, Phe, His, Cys, Pro, Gly, Val, Arg, Ser, Thr, Trp, Leu o Ala, cuando se coloca dentro de un radio de 4-7 A cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 41, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Ser, Thr, Asp, Asn. Glu y Gln, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 41 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 41, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Met, Ile, Val, Tyr, Ala, Gly, His, Arg, Lys y Pro, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 41 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 41, el agente de plegamiento interno no contiene un resto que no sea distinto de Ser, Thr, Asp, Asn. Glu, Gln, Met, Ile, Val, Tyr, Ala, Gly, His, Arg, Lys o Pro, cuando se coloca dentro de un radio de 4-7 A cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 45, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Ile, Met, Phe, Leu, Val, Trp y Cys, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 45 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 45, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Pro, Ala y Thr, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 45 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. En algunas realizaciones, cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 45, el agente de plegamiento interno no contiene un resto que no sea distinto de Ile, Met, Phe, Leu, Val, Trp, Cys, Tyr, Pro, Ala o Thr, cuando se coloca dentro de un radio de 4-7 A cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 49, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Ser, Thr, Asp, Asn, Glu, Gln, Lys y Arg, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 45 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 49, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Met, Ile, Val, Tyr, Ala, Gly, His, Arg, Lys, Pro, Trp, Ser y Thr, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 49 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. En algunas realizaciones, cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 49, el agente de plegamiento interno no contiene un resto que no sea distinto de Ser, Thr, Asp, Asn, Glu, Gln, Lys, Arg, Met, Ile, Val, Tyr, Ala, Gly, His, Pro o Trp, cuando se coloca dentro de un radio de 4-7 A cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 52, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Val, Leu, Ile, Phe, Met, Cys, Tyr y Trp, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 52 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 52, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Cys, Met, Trp, Tyr, Ala, Gly, Thr, Pro, His, Ser y Asp, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 52 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 52, el agente de plegamiento interno no contiene un resto que no sea distinto de

Val, Leu, Ile, Phe, Met, Cys, Tyr, Trp, Ala, Gly, The, Pro, His o Ser, cuando se coloca dentro de un radio de 4-7 A cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición

53, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Asn, Asp, Gln, Glu, Ser, Thr y Lys, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 53 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 53, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en His, Arg, Tyr, Gly, Ala, Trp y Pro, que se coloca con un radio de 4

7 A del resto diana correspondiente a la posición 53 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 53, el agente de plegamiento interno no contiene un resto que no sea distinto de Asn, Asp, Gln, Glu,

Ser, Thr, Lys, His, Arg, Tyr, Gly, Ala, Trp o Pro, cuando se coloca dentro de un radio de 4-7 A cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

56, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Ile, Met, Phe, Leu, Val, Trp y Cys, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 56 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la HA en la posición 56, el agente de plegamiento interno puede estar dispuesto y construido de forma que contenga un resto de interacción seleccionado del grupo que consiste en Tyr, Pro, Ala, Thr, Cys, Met, Trp y Gly, que se coloca con un radio de 4-7 A del resto diana correspondiente a la posición 56 de la HA cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión. Cuando los restos diana afines incluyen al menos uno que corresponde a un resto encontrado en la

HA en la posición 56, el agente de plegamiento interno no contiene un resto que no sea distinto de Ile, Met, Phe, Leu,

Val, Trp, Cys, Tyr, Pro, Ala, Thr, Trp o Gly, cuando se coloca dentro de un radio de 4-7 A cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión.

Como se analiza adicionalmente más adelante, un agente de plegamiento interno es un polipéptido que se une a un sitio de unión seleccionado. Como se describe en el presente documento, un agente de plegamiento interno tiene una estructura caracterizada por una cadena principal "plegada" poblada por restos de interacción seleccionados y dispuestos de manera que, cuando el agente de plegamiento interno está cerca del sitio de unión, los restos de interacción individuales se colocan dentro de una distancia o volumen preseleccionado de restos diana afines. Como se ha descrito, un agente de plegamiento interno es un polipéptido diseñado o técnicamente diseñado. Los agentes de plegamiento interno proporcionados en el presente documento se unen a un polipéptido de hemaglutinina (HA).

Los agentes de plegamiento interno descritos se unen a un polipéptido HA en su región MPER. Los agentes de plegamiento interno descritos se unen a una región MPER de un polipéptido HA independientemente de su glucosilación. Por ejemplo, los agentes de plegamiento interno están diseñados para tener el tamaño apropiado para que su unión a una región MPER no esté impedida por su glucosilación. Un agente de plegamiento interno se puede unir a una región MPER glucosilada con una afinidad de al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %,

45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o más de su afinidad por una región MPER no glucosilada, por lo demás idéntica. Los agentes de plegamiento interno pueden tener tamaños volumétricos entre

6000-1,20,000 A3. Los agentes de plegamiento interno proporcionados tienen un tamaño volumétrico que sea igual o menor que el tamaño volumétrico de un anticuerpo. Un agente de plegamiento interno puede tener un área de superficie de epítopo diana total de aproximadamente 20 x 30 = 600 A2. En algunas realizaciones, el área de superficie de epítopo diana total de un agente de plegamiento interno es inferior que aproximadamente 10 Á2, 20 Á2, 30 Á2, 40 Á2,

50 Á2, 60 Á2, 70 Á2, 80 Á2, 85 Á2, 90 Á2, 95 Á2, 100 Á2, 105 Á2, 110 Á2, 115 Á2, 120 Á2, 125 Á2, 130 Á2, 135 Á2, 140 Á2,

145 Á2, 150 Á2, 151 Á2, 152 Á2, 153 Á2, 154 Á2, 155 Á2, 160 Á2, 165 Á2, 170 Á2, 175 Á2, 180 Á2, 185 Á2, 190 Á2, 195 Á2, 200 Á2, 210 Á2, 220 Á2, 230 Á2, 240 Á2, 250 Á2, 260 Á2, 270 Á2, 280 Á2, 290 Á2, 300 Á2, 310 Á2, 315 Á2, 320 Á2, 325 Á2,

330 Á2 o más grande. El área de superficie de epítopo diana total puede ser inferior a aproximadamente 200 Á2, aproximadamente 175 Á2, aproximadamente 150 Á2, aproximadamente 125 Á2 o más pequeña.

Los agentes de plegamiento interno reivindican tienen una longitud que es inferior a aproximadamente 1000 aminoácidos. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno tienen una longitud que es menor que una longitud máxima de aproximadamente 1000, 975, 950, 925, 900, 875, 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650,

625, 600, 575, 550, 525, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180,

170, 160, 150, 140, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25 o 20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno tienen una longitud que es mayor que una longitud mínima de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 o más aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno tienen una longitud entre una cualquiera de tales longitudes mínimas y una cualquiera de tales longitudes máximas, siempre que la longitud máxima sea mayor que la longitud mínima. En algunas realizaciones particulares, un agente de plegamiento interno tiene una longitud de entre aproximadamente 20 y 500, o de entre 30 y 400, o de entre 40 y 300, o de entre 80 y 250 aminoácidos. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno tiene una longitud de aproximadamente 84, 88, 93, 95, 98, 104, 106, 110, 111, 116, 119, 123, 124, 132, 212, 215, 244 o 245. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno están compuestos por aminoácidos naturales. En otras realizaciones, los agentes de plegamiento interno están compuestos por aminoácidos no naturales. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno están compuestos por combinaciones de aminoácidos naturales y no naturales. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno está compuesto por una, dos o más cadenas polipeptídicas que estén covalentemente (por ejemplo, mediante un enlazador) o no covalentemente asociadas. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno puede estar unido a, o ser parte de, una cadena polipeptídica más larga (por ejemplo, un anticuerpo completo, albúmina sérica u otra proteína transportadora) siempre que el agente de plegamiento interno conserve su estructura tridimensional y su disposición para la interacción. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno pueden agregarse a los extremos N o C de otra secuencia polipeptídica que es o no es un plegamiento interno. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se incorporan en la secuencia de otro polipéptido que es o no es un plegamiento interno, separando de este modo la secuencia polipeptídica en dos o más segmentos. En algunas realizaciones, agregar el plegamiento a los extremos N o C o dentro de la secuencia de otro polipéptido que es o no un plegamiento puede permitir al menos uno o más de los siguientes: una disminución de la inmunogenicidad, un vida útil en la circulación aumentada, una degradación más lento in vivo, el estímulo de una respuesta inmunitaria local, la interacción con las moléculas del sistema inmunitario, un aumento en el volumen, un aumento en la afinidad por la diana (o dianas) de plegamiento interno, un aumento en la especificidad por la diana (o dianas) de plegamiento interno o el uso de otros protocolos de administración terapéutica/preventiva comúnmente utilizados. En algunas realizaciones, agregar un plegamiento a los extremos N o C o dentro de la secuencia de otro polipéptido que es o no un plegamiento no tiene un efecto directo sobre la unión de un agente de plegamiento a una diana (por ejemplo, un polipéptido HA, la región MPER de un polipéptido HA, N-glucanos en un polipéptido HA, receptores de HA o glucanos sialilados en los receptores de HA).

Los agentes de plegamiento interno pueden unirse a sus sitios de unión diana mediante la interacción con uno o más restos diana. En algunas realizaciones, tales restos diana son aminoácidos, sacáridos o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones la presente invención proporciona agentes de plegamiento interno que se unen a un polipéptido HA, a glucanos unidos en N en un polipéptido HA, a un receptor de HA, a glucanos sialilados en un receptor de Ha o diversas combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes polipeptídicos que comprenden un primer agente de plegamiento interno que se une a un polipéptido HA y un segundo agente de plegamiento interno que se une al receptor de HA. En algunas de tales realizaciones, el agente polipeptídico comprende una única cadena polipeptídica que comprende el primer y el segundo plegamiento interno, opcionalmente conectados entre sí por medio de uno o más aminoácidos enlazadores. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno que se une a un receptor de HA interactúa con uno o más glucanos en el receptor de HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos sialilados. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a los glucanos sialilados que tienen una topología de tipo paraguas. En determinadas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos con topología de paraguas con alta afinidad y/o especificidad. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno muestran una preferencia de unión para los glucanos con topología de paraguas en comparación con los glucanos con otras topologías (por ejemplo, glucanos con topología de cono). En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno compiten con la hA para unirse a receptores de HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno compiten con la HA para unirse a glucanos en los receptores de HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno compiten con la HA para unirse a un glucano con topología de paraguas. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno proporcionado en el presente documento es un agente de bloqueo con topología de paraguas. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno proporcionado en el presente documento es un agente de bloqueo específico con topología de paraguas. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno tiene una estructura de cadena principal plegada poblada por una pluralidad de restos de aminoácido de unión directa (es decir, restos de aminoácido que hacen contactos directos con aminoácidos o glucanos de la HA), y/o con aminoácidos o glucanos del receptor de HA como se describe en el presente documento.

Actividades del agente de plegamiento interno

Como se analiza en el presente documento, la presente invención proporciona agentes de plegamiento interno que se unen a polipéptidos HA y/o a receptores de HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno proporcionados se unen a polipéptidos HA independientemente del subtipo. En algunas realizaciones, se proporcionan agentes de plegamiento interno que logran la neutralización universal de la gripe a través de la unión al polipéptido HA.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a polipéptidos HA del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y/o H16. En concreto, en algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a polipéptidos HA que tienen elementos de secuencia característicos de uno o más de los polipéptidos HA H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno se une a uno o más de polipéptidos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16 con una afinidad de al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90% o más de su afinidad por uno o más de un polipéptido HA H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16 distinto. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno muestra afinidades de unión para distintos polipéptidos HA (por ejemplo, polipéptidos HA de distintos grupos, clados o clústeres, y/o de distintas cepas) que están dentro de 5 veces la afinidad de unión entre sí. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno muestra afinidades de unión para distintos polipéptidos HA que están dentro de 2 veces la de entre sí (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno muestra afinidades de unión para distintos polipéptidos HA (por ejemplo, polipéptidos HA de distintos grupos, clados o clústeres, y/o de distintas cepas) que están dentro de 150 veces (por ejemplo, dentro de 100 veces, dentro de 50 veces, dentro de 25 veces, dentro de 10 veces o dentro de 5 veces) la afinidad de unión entre sí.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno proporcionados se unen a al menos dos polipéptidos HA H1, H3, H5, H7 y/o H9. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno proporcionados se unen a al menos tres, cuatro o cinco de los polipéptidos HA H1, H3, H5, H7 y/o H9.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno proporcionados se unen a polipéptidos HA de al menos uno de los subtipos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y/o H16, y no se unen a al menos un polipéptido HA de los subtipos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y/o H16. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a polipéptidos HA del subtipo H1. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a polipéptidos HA del subtipo H1 con una afinidad de al menos el 100 %, al menos el 125 %, al menos el 150 %, al menos el 200% o más de la con que se unen a polipéptidos HA de al menos un subtipo de H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y/o H16. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a polipéptidos HA del subtipo H3. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a polipéptidos HA del subtipo H3 con una afinidad de al menos el 100 %, al menos el 125 %, al menos el 150 %, al menos el 200% o más de la con que se unen a polipéptidos HA de al menos un subtipo de H1, H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y/o H16.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a un sitio de unión que incluye regiones de los dominios HA-1 y HA-2 en un polipéptido HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a regiones de un dominio HA-1. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a regiones de un dominio HA-2. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a ambas regiones del dominio HA-1 y el dominio HA-2. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER de un polipéptido HA.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a una región MPER glucosilada. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a regiones MPER no glucosiladas. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a la región MPER del polipéptido HA, independiente de los niveles de glucosilación de la MPER. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a polipéptidos HA independientemente de los niveles de glucosilación con alta afinidad y/o especificidad. En algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno se une a una región MPER glucosilada con una afinidad de al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o más de su afinidad por una región MPER no glucosilada, por lo demás idéntica.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen al polipéptido HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos unidos en N en el polipéptido HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a N-glucanos proximales a la MPER en el polipéptido HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a los glucanos unidos a N en la región proximal a MPER de polipéptidos HA con alta afinidad y/o especificidad.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a receptores de HA. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a polipéptidos HA y a receptores de HA. En algunas de tales realizaciones, uno o más agentes de plegamiento interno proporcionados pueden unirse simultáneamente a polipéptidos HA y a receptores de HA. Entre otras cosas, la presente invención abarca el reconocimiento de que el uso de agentes de plegamiento interno que se unen tanto a los polipéptidos HA como a los receptores de HA puede permitir la inhibición eficaz de la infección por virus de la gripe con cantidades más bajas de agente terapéutico (es decir, agente de plegamiento interno) de lo que se precisaría para un agente que se une solo al polipéptido HA o al receptor de HA, pero no ambos. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, los inventores proponen que la capacidad de unir ambos lados de la interacción polipéptido HA-receptor de HA permite una concentración local aumentada de inhibidor (es decir, de agente de plegamiento interno) solo en los sitios que son de interés; el agente de plegamiento interno no se "desperdicia" en polipéptidos o receptores de HA que no participan en la infección.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a receptores de HA sialilados. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos sialilados en a2,6; en algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen preferentemente a glucanos sialilados en a2,6. En determinadas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a una pluralidad de glucanos sialilados en a2,6 distintos. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno no pueden unirse a los glucanos sialilados en a2,3 y en algunas realizaciones los agentes de plegamiento interno pueden unirse a glucanos sialilados en a2,3.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos sialilados que tienen una topología de tipo paraguas. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos con topología de paraguas (y/o a miméticos de glucanos con topología de paraguas) más fuertemente de lo que se unen a los glucanos con topología de cono. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno muestran una afinidad relativa por los glucanos de paraguas frente a los glucanos de cono que es aproximadamente de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a los glucanos con topología de paraguas (por ejemplo, glucanos sialilados en a2,6 largos tales como, por ejemplo, Neu5Aca2,6Galp1-4GlcNAcp1-3Galp1-4GlcNAc), con alta afinidad. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos con topología de paraguas con una afinidad comparable a la observada para un polipéptido HA de tipo silvestre que actúa como mediador en la infección de un ser humano (por ejemplo, polipéptido HA H1N1 o polipéptido HA H3N2). En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a los glucanos de paraguas con una afinidad que es al menos del 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de lo observado en condiciones comparables para un polipéptido HA de tipo silvestre que actúa como mediador en la infección de seres humanos. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos de paraguas con una afinidad que es mayor que la observada en condiciones comparables para un polipéptido HA de tipo silvestre que actúa como mediador en la infección de seres humanos.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a uno o más de los glucanos ilustrados en la Figura 12. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a múltiples glucanos ilustrados en la Figura 12. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen con alta afinidad y/o especificidad a los glucanos ilustrados en la Figura 12. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen preferentemente a los glucanos ilustrados en la Figura 12 en comparación con su unión a los glucanos ilustrados en la Figura 11. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a un oligosacárido de la siguiente forma:

Neu5Aca2,6Sug1-Sug2-Sug3

en que:

1. Neu5Ac a2,6 está siempre o casi siempre en el extremo no reductor;

2. Sugl:

a. es una hexosa (frecuentemente Gal o Glc) o hexosamina (GlcNAc o GalNAc) en configuración a o p (frecuentemente p- para la extensión unida en N y O y a- en el caso de GalNAca- que está unida en O a la glicoproteína);

b. no debería haber azúcares distintos de Neu5Aca2,6 unidos a ninguna de las posiciones no reductoras de Sugl (excepto cuando Sugl es GalNAca-, que está unido en O a la glucoproteína); y/o

c. las fracciones no azúcar tales como sulfato, fosfato, guanidinio, amina, N-acetilo, etc. pueden estar unidas a posiciones no reductoras (normalmente, la posición 6) de Sugl para mejorar los contactos con la HA;

3. Sug2 y/o Sug3:

a. una hexosa (frecuentemente Gal o Glc) o hexosamina (GlcNAc o GalNAc) en configuración a o p (frecuentemente p); y/o

b. las fracciones de azúcares (tales como Fuc) o no azúcar tales como sulfato, fosfato, guanidinio, amina, N-acetilo, etc. pueden estar unidas a posiciones no reductoras de Sug2, Sug3 y/o Sug4;

4. El enlace entre dos azúcares cualesquiera en el oligosacárido aparte del enlace Neu5Aca2,6 puede ser 1-2, 1 3, 1-4 y/o 1-6 (normalmente, 1-3 o 1-4); y/o

5. La estructura en que Neu5Aca2,6 está unido GalNAca que está unido en O a la glucoproteína y los azúcares adicionales están unidos al extremo no reductor de GalNAca, por ejemplo

i. Neu5Aca2,6(Neu5Aca2,3Galp1-3)GalNAcaii. Neu5Aca2,6(Galp1-3)GalNAca-

En determinadas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a glucanos con topología de paraguas con alta afinidad y/o especificidad. La presente invención abarca el reconocimiento de que adquirir la capacidad de unirse a glucanos con topología de paraguas (por ejemplo, glucanos sialilados en a2,6 largos), y particularmente una capacidad para unirse con alta afinidad, puede conferir a un agente de plegamiento interno la capacidad de proporcionar neutralización de amplio espectro dirigida contra el virus de la gripe. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, los inventores proponen que la unión a los glucanos con topología de paraguas puede ser primordial, y en particular que la pérdida de unión a otros tipos de glucanos puede no ser necesaria.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de plegamiento interno que se unen a glucanos con topología de paraguas que se encuentran en los receptores de HA de una especie diana particular. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes de plegamiento interno que se unen a glucanos con topología de paraguas que se encuentran en los receptores de HA humanos, por ejemplo, los receptores de HA encontrados en las células epiteliales humanas, y particularmente los agentes de plegamiento interno que se unen a los glucanos con topología de paraguas encontrados en los receptores de HA humanos en las vías respiratorias altas.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a los receptores que se encuentran en las células epiteliales de las vías respiratorias altas humanas. En determinadas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen a receptores de Ha en el bronquio y/o la tráquea. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno no pueden unirse a receptores en áreas distales del pulmón, y en algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno pueden unirse a receptores en áreas distales del pulmón.

En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno se unen al menos aproximadamente al 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % 95 % o más de los glucanos encontrados en los receptores de HA en los tejidos de las vías respiratorias altas humanas (por ejemplo, células epiteliales).

En determinadas realizaciones, la afinidad de unión de los agentes de plegamiento interno se evalúa en un intervalo de concentraciones. Una estrategia de este tipo proporciona significativamente más información, en particular en ensayos de unión multivalentes, que los análisis de concentración única. En algunas realizaciones, por ejemplo, las afinidades de unión de los agentes de plegamiento interno se evalúan a través de concentraciones que varían al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces.

Producción de agentes de plegamiento interno

Los agentes de plegamiento interno y/o las partes características de los mismos, los o ácidos nucleicos que los codifican, pueden producirse mediante cualquier medio disponible.

Se pueden producir agentes de plegamiento interno (o partes características), por ejemplo, mediante la utilización de un sistema de células hospedadoras técnicamente diseñado para expresar un ácido nucleico codificante de polipéptido de la invención. Como alternativa o adicionalmente, los agentes de plegamiento interno pueden prepararse parcial o totalmente mediante síntesis química.

Cuando los agentes de plegamiento interno se expresan en células (por ejemplo, células técnicamente diseñadas), para producir los agentes de plegamiento interno (o porciones características de los mismos) puede utilizarse cualquier sistema de expresión. Por proporcionar unos pocos ejemplos, los sistemas de expresión conocidos incluyen, por ejemplo, huevo, baculovirus, células vegetales, levaduras, células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) o células Vero (de riñón de mono verde africano). Como alternativa o adicionalmente, los agentes de plegamiento interno (o partes características) pueden expresarse en células utilizando técnicas recombinantes, tal como a través del uso de un vector de expresión (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual", CSHL Press, 1989).

Como alternativa o adicionalmente, los agentes de plegamiento interno (o partes características de los mismos), puede producirse en el contexto de virus intactos, ya sea de tipo silvestre, atenuados, muertos, etc. Los agentes de plegamiento interno, o partes características de los mismos, también pueden producirse en el contexto de partículas similivíricas.

Además, los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos, y en particular los agentes de plegamiento interno, como se describe en el presente documento, pueden generarse, identificarse, aislarse y/o producirse mediante el cultivo de células u organismos que produzcan agentes de plegamiento interno (ya sea solos o como parte de un complejo, incluso como parte de una partícula de virus o virus), en condiciones que permitan el cribado y/o la selección de polipéptidos capaces de unirse a glucanos con topología de paraguas. Por proporcionar un solo ejemplo, en algunas realizaciones, puede ser útil producir y/o estudiar una colección de agentes de plegamiento interno en condiciones que revelen y/o favorezcan las variantes que se unan a polipéptidos HA o glucanos con topología de paraguas (por ejemplo, con especificidad y/o afinidad particulares). En algunas realizaciones, tal colección de agentes de plegamiento interno es el resultado de la evolución en la naturaleza. En algunas realizaciones, tal colección de agentes de plegamiento interno es el resultado del diseño técnico. En algunas realizaciones, tal colección de agentes de plegamiento interno es el resultado de una combinación de diseño técnico y evolución natural.

Ácidos nucleicos

La presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un agente de plegamiento interno o una parte característica o biológicamente activa de un agente de plegamiento interno. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos que son complementarios a ácidos nucleicos que codifican un agente de plegamiento interno o una parte característica o biológicamente activa de un agente de plegamiento interno.

La invención proporciona moléculas de ácido nucleico que hibridan con ácidos nucleicos que codifican un agente de plegamiento interno o una parte característica o biológicamente activa de un agente de plegamiento interno. Dichos ácidos nucleicos pueden utilizarse, por ejemplo, como cebadores o como sondas. Por proporcionar unos pocos ejemplos, tales ácidos nucleicos pueden utilizarse como cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como sondas para hibridación (incluyendo hibridación in situ) y/o como cebadores para transcripción inversa-PCR (RT-PCR).

Los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, y pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Los ácidos nucleicos pueden incluir uno o más nucleótidos no naturales; los ácidos nucleicos incluyen solo nucleótidos naturales.

Anticuerpos para agentes de plegamiento interno

La presente invención proporciona anticuerpos para agentes de plegamiento interno. Estos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden prepararse mediante cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la materia (por ejemplo, véase Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de cultivo celular, incluida la generación de anticuerpos monoclonales, o mediante la transfección de genes de anticuerpos en hospedadores celulares bacterianos o de mamífero adecuados, para permitir la producción de anticuerpos recombinantes.

Sistemas para identificar y/o caracterizar agentes de plegamiento interno

La presente invención proporciona una diversidad de sistemas para analizar, caracterizar y/o identificar agentes de plegamiento interno.

Los agentes de plegamiento interno pueden caracterizarse mediante tales sistemas y métodos que implican poner en contacto el agente de plegamiento interno con uno o más sustratos candidatos, tales como regiones de polipéptidos HA, la región MPER de polipéptidos HA, N-glucanos en polipéptidos HA, receptores de HA, receptores de HA sialilados, glucanos en receptores de HA sialilados y/o glucanos con topología de paraguas en receptores de HA sialilados.

Un agente de plegamiento interno y/o el sustrato candidato pueden estar en solución, fijados a un soporte y/o expresarse en y/o sobre la superficie de una célula. El sustrato candidato y/o el agente de plegamiento interno pueden estar marcados, permitiendo de este modo la detección de la unión. La especie marcada es o bien el agente de plegamiento interno o bien el sustrato candidato. Se pueden realizar formatos de unión competitiva en los que una de las sustancias está marcada, y se puede medir la cantidad de marcador libre frente al marcador unido para determinar el efecto sobre la unión.

Los ensayos de unión pueden implicar, por ejemplo, exponer un sustrato candidato a un agente de plegamiento interno y detectar la unión entre el sustrato candidato y el agente de plegamiento interno. Se puede realizar un ensayo de unión in vitro (por ejemplo, en un tubo candidato, que comprenda sustancialmente solo los componentes mencionados; en extractos sin células; y/o en componentes sustancialmente purificados). Como alternativa o adicionalmente, se pueden realizar ensayos de unión en células y/o in vivo (por ejemplo, dentro de una célula, tejido, órgano y/u organismo; descrito con más detalle a continuación).

Se pone en contacto al menos un agente de plegamiento interno con al menos un sustrato candidato y se detecta un efecto. Por ejemplo, un agente de plegamiento interno se pone en contacto con un sustrato candidato, y se controla la unión entre las dos entidades. Un ensayo puede implicar poner en contacto un sustrato candidato con una porta característica de un agente de plegamiento interno. Se detecta la unión del agente de plegamiento interno al sustrato candidato. Se apreciará que pueden emplearse fragmentos, partes, homólogos, variantes y/o derivados de agentes de plegamiento interno, siempre que comprendan la capacidad de unirse a uno o más sustratos candidatos.

La unión de un agente de plegamiento interno al sustrato candidato puede determinarse mediante una diversidad de métodos bien conocidos en la técnica. La presente invención proporciona ensayos que implican agentes de plegamiento interno unidos en fase sólida y la detección de sus interacciones con uno o más sustratos candidatos. Por lo tanto, un agente de plegamiento interno puede comprender un marcador detectable, tal como un marcador radiactivo, fluorescente y/o luminiscente. Adicionalmente, el sustrato candidato se puede acoplar a sustancias que permitan la detección indirecta (por ejemplo, mediante el empleo de una enzima que usa un sustrato cromogénico y/o mediante la unión de un anticuerpo detectable). Pueden detectarse cambios en la conformación de los agentes de plegamiento interno como resultado de una interacción con un sustrato candidato, por ejemplo, mediante el cambio en la emisión del marcador detectable. Como alternativa o adicionalmente, se pueden analizar mediante espectrometría de masas complejos de proteínas unidos a fase sólida.

El agente de plegamiento interno puede no estar inmovilizado. El componente no inmovilizado puede estar marcado (con, por ejemplo, un marcador radioactivo, una etiqueta epitópica, un conjugado de enzima-anticuerpo, etc.). Como alternativa o adicionalmente, la unión se puede determinar mediante técnicas de detección inmunológicas. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede someterse a transferencia de Western y la transferencia sondarse con un anticuerpo que detecte el componente no inmovilizado. Como alternativa o adicionalmente, para someter a ensayo la unión puede utilizarse el ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA, forma siglada de enzyme [inked [mmunosorbent assay).

Las células se pueden someter a ensayo directamente en cuanto a la unión entre los agentes de plegamiento interno y los sustratos candidatos. Las técnicas inmunohistoquímicas, las técnicas confocales y/u otras técnicas para evaluar la unión son bien conocidas por los expertos en la materia. Se pueden utilizar diversas líneas celulares para tales ensayos de cribado, que incluyen células técnicamente diseñadas de forma específica para este fin. Los ejemplos de células utilizadas en los ensayos de cribado incluyen células de mamífero, células fúngicas, células bacterianas o células víricas. Una célula puede ser una célula estimulada, tal como una célula estimulada con un factor de crecimiento. Un experto en la materia entenderá que la invención divulgada en el presente documento contempla una amplia diversidad de ensayos en células para medir la capacidad de los agentes de plegamiento interno para unirse a sustratos candidatos.

Dependiendo del ensayo, puede ser necesario un cultivo celular y/o tisular. Una célula puede examinarse utilizando cualquiera de varios ensayos fisiológicos distintos. Como alternativa o adicionalmente, se puede realizar un análisis molecular, incluyendo, pero sin limitación, transferencia de Western para controlar la expresión de proteínas y/o probar las interacciones proteína-proteína; espectrometría de masas para controlar otras modificaciones químicas; etc.

La presente invención proporciona métodos de identificación de agentes de plegamiento interno que se unen a sustratos candidatos y, por lo tanto, que puede estar implicados en la infección gripal. Un método en células de identificación de sustancias que se unen a sustratos candidatos es el ensayo del sistema de dos híbridos (Fields et al., 1994, Trends in Genetics, 10:286; y Colas et al., 1998, TIBTECH, 16:355). En este ensayo, las células de levadura expresan una primera proteína de fusión que comprende una sustancia de prueba en conformidad con la presente invención (por ejemplo, un agente de plegamiento interno, un gen que codifica un agente de plegamiento interno y/o partes características del mismo) y un dominio de unión a ADN de un factor de transcripción tal como Gal4 y/o LexA. Las células contienen adicionalmente un gen indicador cuyo promotor contiene sitios de unión para el dominio de unión a ADN correspondiente. Al transformar las células con un vector que expresa una segunda proteína de fusión que consiste en un sustrato candidato fusionado a un dominio de activación (por ejemplo, de Gal4 y/o del virus del herpes simple VP16), la expresión del gen indicador puede verse enormemente aumentada si el sustrato candidato interacciona con el agente de plegamiento interno. De esta manera, es posible identificar rápidamente nuevos agentes de plegamiento interno.

Cualquiera de los ensayos de unión descritos en el presente documento puede realizarse utilizando un intervalo de concentraciones de agentes de plegamiento interno y/o de sustratos candidatos. Los ensayos de unión descritos en el presente documento se utilizan para evaluar la capacidad de un sustrato candidato para unirse a un agente de plegamiento interno por encima de un intervalo de concentraciones del agente de plegamiento interno (por ejemplo, mayor que aproximadamente 100 pg/ml, aproximadamente 100 pg/ml, aproximadamente 50 pg/ml, aproximadamente 40 pg/ml, aproximadamente 30 pg/ml, aproximadamente 20 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 4 pg/ml, aproximadamente 3 pg/ml, aproximadamente 2 pg/ml, aproximadamente 1,75 pg/ml, aproximadamente 1,5 pg/ml, aproximadamente 1,25 pg/ml, aproximadamente 1,0 pg/ml, aproximadamente 0,9 pg/ml, aproximadamente 0,8 pg/ml, aproximadamente 0,7 pg/ml, aproximadamente 0,6 pg/ml, aproximadamente 0,5 pg/ml, aproximadamente 0,4 pg/ml, aproximadamente 0,3 pg/ml, aproximadamente 0,2 pg/ml, aproximadamente 0,1 pg/ml, aproximadamente 0,05 pg/ml, aproximadamente 0,01 pg/ml y/o menos de aproximadamente 0,01 pg/ml).

Cualquiera de los estudios de unión descritos en el presente documento puede ejecutarse en una manera de alto rendimiento. Utilizando ensayos de alto rendimiento, es posible cribar hasta varios miles de agentes de plegamiento interno en un solo día. En algunas realizaciones, se puede utilizar cada pocillo de una placa de microtitulación para ejecutar un ensayo separado contra un sustrato candidato seleccionado o, si se van a observar los efectos de la concentración y/o del tiempo de incubación, cada 5 a 10 pocillos pueden probar un solo sustrato candidato. Por lo tanto, una única placa de microtitulación convencional puede someter a ensayo hasta 96 interacciones de unión entre agentes de plegamiento interno y sustratos candidatos; si se utilizan placas de 1536 pocillos, entonces una única placa puede someter a ensayo hasta 1536 interacciones de unión entre agentes de plegamiento interno y sustratos candidatos; y así sucesivamente. Es posible someter a ensayo muchas placas por día. Por ejemplo, se pueden realizar hasta aproximadamente 6.000, aproximadamente 20.000, aproximadamente 50.000 o más de aproximadamente 100.000 cribados de ensayo sobre interacciones de unión entre agentes de plegamiento interno y sustratos candidatos, utilizando sistemas de alto rendimiento en conformidad con la presente invención.

Dichos métodos utilizan un hospedador animal. Como se usa en el presente documento, un "hospedador animal" incluye cualquier modelo animal adecuado para la investigación de la gripe. Por ejemplo, los hospedadores animales adecuados para la invención pueden ser hospedadores mamíferos, incluyendo primates, hurones, gatos, perros, vacas, caballos, roedores tales como ratones, hámsteres, conejos y ratas. En determinadas realizaciones, un hospedador animal utilizado para la invención es un hurón. En particular, en algunas realizaciones, un hospedador animal no se ha expuesto previamente a la exposición o infección vírica antes de la administración de un agente de plegamiento interno (opcionalmente en una composición de la invención). En algunas realizaciones, el hospedador animal se inocula con, se infecta con o se expone de otra manera al virus antes o de forma simultánea con la administración de un agente de plegamiento interno. Un hospedador animal utilizado en la práctica de la presente invención puede inocularse con, infectarse con o exponerse de otra manera al virus mediante cualquier método conocido en la técnica. Un hospedador animal puede inocularse con, infectarse con o exponerse al virus por vía intranasal.

Un hospedador animal adecuado puede tener una distribución de glucanos con topología de paraguas frente a los de topología de cono, y/o glucanos a2,6 frente a glucanos a 2,3, similar a la distribución encontrada en el tracto respiratorio humano. Por ejemplo, se contempla que un hurón como hospedador animal puede ser más representativo que un ratón cuando se utiliza como modelo de enfermedad provocada por virus de la gripe en humanos (Tumpey, et al. Science (2007) 315; 655-659). Sin desear quedar ligados a ninguna teoría, la presente invención abarca la idea de que los hurones pueden tener una distribución más similar de glucanos en el tracto respiratorio a los del tracto respiratorio humano que el ratón.

Los animales sin exposición previa y/o inoculados pueden utilizarse para cualquiera de una variedad de estudios. Por ejemplo, tales modelos animales pueden utilizarse para estudios de transmisión de virus como se conoce en la técnica. Se contempla que el uso de hurones en estudios de transmisión de virus puede servir como un factor pronóstico fiable para la transmisión de virus en seres humanos. Por ejemplo, la transmisión aérea de la gripe vírica de animales inoculados (por ejemplo, hurones) a animales sin exposición previa se conoce en la técnica (Tumpey, et al. Science (2007) 315; 655-659). Los estudios de transmisión de virus pueden utilizarse para probar agentes de plegamiento interno. Por ejemplo, los agentes de plegamiento interno pueden administrarse a un hospedador animal adecuado antes, durante o después de los estudios de transmisión del virus para determinar la eficacia de dicho agente de plegamiento interno en el bloqueo de la unión y/o la infectividad del virus en el hospedador animal. Utilizando la información recopilada de los estudios de transmisión de virus en un hospedador animal, se puede predecir la eficacia de un agente de plegamiento interno en el bloqueo de la unión y/o la infectividad del virus en un hospedador humano.

Composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen agentes de plegamiento interno y/o entidades relacionadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, están incluidos en las composiciones farmacéuticas agentes de plegamiento interno, ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, fragmentos característicos o biológicamente activos de tales polipéptidos o ácidos nucleicos, anticuerpos que se unen y/o compiten con tales polipéptidos o fragmentos, moléculas pequeñas que interactúan o compiten con tales polipéptidos o con glucanos que se unen a ellos, etc.

La invención abarca el tratamiento de la infección gripal mediante la administración de tales composiciones farmacéuticas. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una infección gripal. En algunas realizaciones, se considera que un sujeto padece una infección gripal en un sujeto que presenta uno o más síntomas comúnmente asociados con la infección gripal. En algunas realizaciones, se sabe o se cree que el sujeto estuvo expuesto al virus de la gripe. En algunas realizaciones, se considera que un sujeto es susceptible a una infección gripal si se sabe o se cree que el sujeto ha estado expuesto al virus de la gripe. En algunas realizaciones, se sabe o se cree que un sujeto ha estado expuesto al virus de la gripe si el sujeto ha estado en contacto con otros individuos que se sabe o se sospecha que se han infectado con el virus de la gripe y/o si el sujeto está o ha estado presente en un lugar en que se sabe o se cree que la infección gripal es prevalente.

En algunas realizaciones, los sujetos que padecen o son susceptibles a la infección gripal se analizan en cuanto a anticuerpos para agentes de plegamiento interno antes de, durante o después de la administración de composiciones farmacéuticas. En algunas realizaciones, a los sujetos que tienen tales anticuerpos no se les administran composiciones farmacéuticas que comprenden agentes de plegamiento interno. En algunas realizaciones, se selecciona una dosis apropiada de composición farmacéutica y/o de agente de plegamiento interno basándose en la detección (o falta de la misma) de tales anticuerpos.

En algunas realizaciones, se hace constar la selección de un sujeto particular para el tratamiento, un agente de plegamiento interno o una composición para la administración particular, y/o una dosis o régimen para la administración particular, por ejemplo, en una forma escrita, impresa o de almacenamiento electrónico.

Las composiciones de la invención se pueden administrar antes o después del desarrollo de uno o más síntomas de infección gripal.

La invención abarca el tratamiento de las infecciones gripales mediante la administración de agentes descritos en el presente documento.

La presente invención también proporciona otras composiciones terapéuticas útiles en el tratamiento de infecciones víricas. En algunas realizaciones, el tratamiento se realiza mediante la administración de un agente que interfiere con la expresión o la actividad de un polipéptido HA.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos u otros agentes relacionados con los agentes de plegamiento interno proporcionados. Por ejemplo, la invención proporciona composiciones que contienen anticuerpos que reconocen agentes de plegamiento interno, ácidos nucleicos (tales como secuencias de ácido nucleico complementarias a secuencias de agentes de plegamiento interno que puede utilizarse para ARNi) o combinación de los mismos. En algunas realizaciones, se utilizan colecciones de distintos agentes que tienen diversas estructuras. En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas comprenden uno o más agentes multivalentes. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende la administración urgente poco después de la exposición o sospecha de exposición al virus de la gripe.

En general, una composición farmacéutica incluirá un agente terapéutico además de uno o más agentes inactivos tales como un vehículo estéril biocompatible incluyendo, pero sin limitación, agua estéril, solución salina, solución salina tamponada o solución de dextrosa. Como alternativa o adicionalmente, la composición puede contener cualquiera de una diversidad de aditivos, tales como estabilizantes, tampones, excipientes (por ejemplo, azúcares, aminoácidos, etc.) o conservantes.

En determinadas realizaciones, el agente terapéutico presente en una composición farmacéutica de la invención consistirá en uno o más agentes de plegamiento interno como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de la invención contiene un agente de plegamiento interno que se une a polipéptidos HA o a glucanos con topología de paraguas (y/o a miméticos de glucanos con topología de paraguas). En algunas de tales realizaciones, la composición de la invención está sustancialmente exenta de agentes relacionados (por ejemplo, de otros agentes de plegamiento interno, etc.) que no se unen a glucanos con topología de paraguas. En algunas de tales realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen no más de al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o más de un agente que se une a un polipéptido HA glucosilado o no glicosilado, y/o glucanos de receptores de HA distintos de glucanos con topología de paraguas.

En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica incluirá un agente terapéutico que está encapsulado, atrapado o unido dentro de una vesícula lipídica, una matriz biodisponible y/o biocompatible y/o biodegradable, u otra micropartícula.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada incluirá un agente de plegamiento interno que no está agregado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, menos del 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 % o 30 %, en peso seco o número, de agentes de plegamiento interno, está presente en un agregado.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada incluirá un agente de plegamiento interno que no está desnaturalizado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, menos del 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 % o 30 %, en peso seco o número, de los agentes de plegamiento interno administrados está desnaturalizado.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada incluirá un agente de plegamiento interno que no está inactivo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, menos del 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 % o 30 %, en peso seco o número, de los agentes de plegamiento interno administrados está inactivo.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se formulan para reducir la inmunogenicidad de los agentes de plegamiento interno proporcionados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un agente de plegamiento interno proporcionado está asociado con (por ejemplo, unido a) un agente, tal como polietilenglicol y/o carboximetilcelulosa, que enmascara su inmunogenicidad. En algunas realizaciones, un agente de unión proporcionado tiene glucosilación adicional que reduce la inmunogenicidad.

Terapia de combinación

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse solas o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos que incluyen, pero sin limitación, vacunas y/o anticuerpos. Por "en combinación con" no se pretende implicar que los agentes deban administrarse al mismo tiempo o formularse para la administración conjunta, aunque estos métodos de administración están dentro del alcance de la invención. En general, cada agente se administrará a una dosis y con un cronograma determinado para ese agente. Adicionalmente, la invención abarca la administración de las composiciones farmacéuticas en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir o modificar su metabolismo, inhibir su excreción o modificar su distribución dentro del organismo. Aunque las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento de cualquier sujeto (por ejemplo, cualquier animal) que lo necesite, se utilizan muy preferentemente en el tratamiento de seres humanos.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención y/o los agentes de plegamiento interno pueden administrarse en combinación con uno o más de otros agentes. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención y/o los agentes de plegamiento interno pueden administrarse en combinación con uno o más de otros agentes de plegamiento interno. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención y/o uno o más agentes de plegamiento interno pueden administrarse en combinación con uno o más de otros agentes de farmacéuticos (por ejemplo, vacuna contra la gripe, agente antivírico, analgésicos, antinflamatorios, antibióticos, agentes esteroideos, anticuerpos, sialidasa, etc.). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención y/o los agentes de plegamiento interno pueden administrarse en combinación con un adyuvante.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención y/o uno o más agentes de plegamiento interno se administran en combinación con uno o más anticuerpos. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a polipéptidos HA en el virus. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a la región MPER del polipéptido HA (por ejemplo, los polipéptidos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16). En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a una región MPER glucosilada del polipéptido HA. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen al receptor de HA. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a glucanos sialilados en el receptor de HA. En algunas realizaciones, los anticuerpos son C179, F10 y CR6261.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención y/o uno o más agentes de plegamiento interno se administran en combinación con uno o más agentes antivíricos. En algunas realizaciones, tales agentes antivíricos incluyen, pero sin limitación, aciclovir, ribavirina, amantadina, remantidina, zanamivir (Relenza), oseltamivir (Tamiflu), amantadina, rimantadina y/o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención y/o uno o más agentes de plegamiento interno se administran en combinación con una o más vacunas. En algunas realizaciones, la vacuna es una vacuna antivírica. En algunas realizaciones, la vacuna es una vacuna contra la gripe. En algunas realizaciones, la vacuna contra la gripe es para tratar la gripe estacional (por ejemplo, comúnmente denominada gripe). En algunas realizaciones, la vacuna contra la gripe es la vacuna antigripal y/o FluMist. En algunas realizaciones, la vacuna contra la gripe está dirigida a una combinación específica de uno o más polipéptidos HA (por ejemplo, los polipéptidos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16). En algunas realizaciones, la vacuna contra la gripe es específica para una o más combinaciones de virus of H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3 o H10N7. En algunas realizaciones, la vacuna contra la gripe es específica para virus H1N1. En algunas realizaciones, la vacuna contra la gripe es específica para virus H3N2. En algunas realizaciones, la vacuna contra la gripe es específica para virus H1N1 y H3N2.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y/o uno o más agentes de plegamiento interno pueden administrarse en combinación con uno o más de otros agentes farmacéuticos utilizados para tratar los síntomas asociados con la infección por el virus de la gripe A. En algunas realizaciones, los agentes farmacéuticos utilizados para tratar los síntomas asociados con la infección gripal son analgésicos, antinflamatorios, antibióticos y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los agentes farmacéuticos utilizados para tratar los síntomas asociados con la infección gripal son acetaminofeno, ibuprofeno, aspirina, naproxeno y/o combinaciones de los mismos.

Métodos de administración

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse mediante una diversidad de vías, incluyendo la oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial, subcutánea, intraventricular, transdérmica, intradérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas, cremas o gotas), mucosa, nasal, bucal, entérica, sublingual; mediante instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o inhalación; y/o como una pulverización oral, pulverización nasal y/o un aerosol. En general, la vía de administración más apropiada dependerá de una diversidad de factores que incluyen la naturaleza del agente (por ejemplo, su estabilidad en el entorno del tracto gastrointestinal), el estado del paciente (por ejemplo, si el paciente puede tolerar la administración oral), etc.

En la actualidad, la vía por pulverización o aerosol oral o nasal (por ejemplo, mediante inhalación) se utiliza muy comúnmente para suministrar agentes terapéuticos directamente a los pulmones y/o al sistema respiratorio. Sin embargo, la invención abarca la administración de la composición farmacéutica de la invención por cualquier vía apropiada teniendo en cuenta los posibles avances en las ciencias de la administración de fármacos.

En algunas realizaciones, las preparaciones para la administración por inhalación o en aerosol comprenden una pluralidad de partículas. En algunas realizaciones, tales preparaciones tienen un tamaño medio de partícula de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 micrómetros. En algunas realizaciones, las preparaciones para administración por inhalación o en aerosol se formulan como un polvo seco. En algunas realizaciones, las preparaciones para administración por inhalación o en aerosol se formulan como un polvo húmedo, por ejemplo a través de la inclusión de un agente humectante. En algunas realizaciones, el agente humectante se selecciona del grupo que consiste en agua, solución salina u otro líquido de pH fisiológico.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran como gotas en la cavidad nasal o bucal. En algunas realizaciones, una dosis puede comprender una pluralidad de gotas (por ejemplo, 1-100, 1-50, 1-20, 1-10, 1-5, etc.)

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran utilizando un dispositivo que administra una dosificación medida de la composición (por ejemplo, de agente de plegamiento interno).

Los dispositivos adecuados para su uso en la administración intradérmica de composiciones farmacéuticas descritos en el presente documento incluyen dispositivos de aguja corta tales como los descritos en las patentes de Estados Unidos N.° 4.886.499, patente de los Estados Unidos n.° 5.190.521, patente de los Estados Unidos n.° 5.328.483, patente de los Estados Unidos n.° 5.527.288, patente de los Estados Unidos n.° 4.270.537, patente de los Estados Unidos n.° 5.015.235, patente de los Estados Unidos n.° 5.141.496, patente de los Estados Unidos n.° 5.417.662. Las composiciones intradérmicas también pueden administrarse mediante dispositivos que limitan la longitud de penetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los descritos en el documento WO99/34850, y equivalentes funcionales de los mismos. Además, son adecuados los dispositivos de inyección de chorro que suministran composiciones líquidas a la dermis a través de un inyector de chorro líquido o a través de una aguja que perfora el estrato córneo y produce un chorro que alcanza la dermis. Los dispositivos de inyección de chorro se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 5.480.381, patente de los Estados Unidos n.° 5.599.302, patente de los Estados Unidos n.° 5.334.144, patente de los Estados Unidos n.° 5.993.412, patente de los Estados Unidos n.° 5.649.912, patente de los Estados Unidos n.° 5.569.189, patente de los Estados Unidos n.° 5.704.911, patente de los Estados Unidos n.° 5.383.851, patente de los Estados Unidos n.° 5.893.397, patente de los Estados Unidos n.° 5.466.220, patente de los Estados Unidos n.° 5.339.163, patente de los Estados Unidos n.° 5.312.335, patente de los Estados Unidos n.° 5.503.627, patente de los Estados Unidos n.° 5.064.413, patente de los Estados Unidos n.° 5.520.639, patente de los Estados Unidos n.° 4.596.556, patente de los Estados Unidos n.° 4.790.824, patente de los Estados Unidos n.° 4.941.880, patente de los Estados Unidos n.° 4.940.460, documentos WO 97/37705 y WO 97/13537. Además, son adecuados los dispositivos de suministro balístico de polvo/partículas que utilizan gas comprimido para acelerar las composiciones en forma de polvo a través de las capas externas de la piel hasta la dermis. Adicionalmente, pueden utilizarse jeringuillas convencionales en el método clásico de mantoux de administración intradérmica.

Formulaciones

Pueden encontrarse consideraciones generales en la formulación y fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en cualquier dosis apropiada para lograr un resultado deseado. En algunas realizaciones, el resultado deseado es la reducción de la intensidad, la gravedad y/o la frecuencia, y/o el retraso del inicio de uno o más síntomas de infección gripal.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas están formuladas para administrar una dosis de agente de plegamiento interno eficaz para competir con un polipéptido HA gripal para unirse a glucanos con topología de paraguas. En algunas realizaciones, tal unión por un polipéptido HA gripal se reduce después de la administración de una o más dosis de una composición de agente de plegamiento interno en comparación con su nivel en ausencia de tal administración. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas están formuladas para administrar una dosis de agente de plegamiento interno eficaz para saturar al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más sitios de unión al polipéptido HA (por ejemplo, sitios de unión al polipéptido HA que contienen glucanos con topología de paraguas) presentes en el sujeto (por ejemplo, en las vías respiratorias del sujeto) que recibe la composición.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se formulan para suministrar una dosis unitaria de agente de plegamiento interno dentro del intervalo de 0,0001 a 1000 nmg/kg.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran en múltiples dosis. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran en múltiples dosis/día. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran de acuerdo con una pauta posológica continua, de forma que el sujeto no experimente períodos de dosificación inferior a la terapéutica interpuestos entre períodos de dosificación terapéutica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran de acuerdo con una pauta posológica intermitente, de forma que el sujeto experimente al menos un período de dosificación inferior a la terapéutica interpuesto entre dos períodos de dosificación terapéutica.

Diagnóstico/kits

La presente divulgación proporciona kits para la detección de agentes de plegamiento interno como se describe en el presente documento, ya sea que tales polipéptidos sean agentes de plegamiento interno o no.

La presente divulgación proporciona kits para la detección de agentes de plegamiento interno y en particular para la detección de agentes de plegamiento interno con características particulares de unión a polipéptidos HA y/o glucanos (por ejemplo, unión a glucanos de paraguas, a glucanos sialilados en a2,6, a glucanos sialilados en a2,6 largos, etc.) en muestras patológicas, incluyendo, pero sin limitación, sangre, suero/plasma, células mononucleares de sangre periférica/linfocitos de sangre periférica (CMSP/LSP), esputo, orina, heces, frotis faríngeo, hisopado de lesiones dérmicas, líquido cefalorraquídeo, citología del cuello uterino, muestras de pus, matrices alimentarias y tejidos de diversas partes del organismo, tal como cerebro, bazo e hígado. La presente divulgación también proporciona kits para la detección de agentes de plegamiento interno de interés en muestras ambientales, incluyendo, pero sin limitación, suelo, agua y flora. Otras muestras que no se han enumerado también pueden ser aplicables.

Los métodos para la detección de agentes de plegamiento interno implican proporcionar una muestra patológica y/o ambiental, poner en contacto la muestra con un agente de plegamiento interno y determinar si el agente de plegamiento interno se une a la muestra con respecto a un agente de unión de control negativo. Dichos métodos implican una etapa de procesamiento de la muestra (por ejemplo, someter la muestra a una o más etapas de purificación) antes de la etapa de puesta en contacto. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno proporcionados están marcados con una fracción detectable (por ejemplo, marcadores fluorescentes, radioactivos, quimioluminiscentes, etc.). Los agentes de plegamiento interno pueden ser detectables mediante métodos inmunológicos (por ejemplo, transferencia de Western, ELISA, inmunofluorescencia, etc.). Los agentes de plegamiento interno pueden estar inmovilizados (por ejemplo, en una perla, a una placa de microtitulación, a una matriz, a una matriz de glucanos, etc.) antes de la etapa de puesta en contacto.

Los kits pueden incluir uno o más agentes que detectan específicamente agentes de plegamiento interno con características particulares de unión a polipéptido HA y/o a glucanos. Dichos agentes de detección pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos que reconocen específicamente determinados agentes de plegamiento interno (por ejemplo, agentes de plegamiento interno que se unen a glucanos con paraguas y/o a glucanos sialilados en a2,6 y/o a glucanos sialilados en a2,6 largos), que puede utilizarse para detectar específicamente tales agentes de plegamiento interno mediante ELISA, inmunofluorescencia y/o inmunotransferencia.

Los anticuerpos que se unen a los agentes de plegamiento interno también se pueden utilizar en pruebas de neutralización de virus, en las que una muestra se trata con un anticuerpo específico para el agente de plegamiento interno de interés, y se analiza su capacidad para infectar células cultivadas con respecto a una muestra no tratada. Si el virus en esa muestra contiene tales agentes de plegamiento interno, el anticuerpo neutralizará el virus e impedirá que infecte las células cultivadas. Como alternativa o adicionalmente, tales anticuerpos también pueden utilizarse en pruebas de inhibición de HA, en las cuales la proteína HA se aísla de una muestra dada, se trata con un anticuerpo específico para un agente de plegamiento interno o un conjunto de agentes de plegamiento interno particular, y se analiza su capacidad para aglutinar los eritrocitos con respecto a una muestra no tratada. Si el virus en la muestra contiene tales agentes de plegamiento interno, el anticuerpo neutralizará la actividad de los agentes de plegamiento interno e impedirá que aglutine los eritrocitos (Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual", CSHL Press, 1988; www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_NCS_2002_5/en/i ndex.html; www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index. html). Dichos agentes pueden incluir ácidos nucleicos que se unen específicamente a nucleótidos que codifican agentes de plegamiento interno particulares y que pueden utilizarse para detectar específicamente tales agentes de plegamiento interno mediante RT-PCR o hibridación in situ (www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_NCS_2002_5/en/index .html; www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index.html). Los ácidos nucleicos que se han aislado de una muestra se amplifican antes de la detección. Los reactivos de diagnóstico pueden marcarse de forma detectable.

La presente invención también proporciona kits que contienen reactivos de acuerdo con la invención para el tratamiento de la infección por el virus de la gripe. El contenido de los kits incluye, pero sin limitación, plásmidos de expresión que contienen nucleótidos de agentes de plegamiento interno (o partes características o biológicamente activas) que codifican agentes de plegamiento interno de interés (o partes características o biológicamente activas). Como alternativa o adicionalmente, los kits pueden contener plásmidos de expresión que expresan agentes de plegamiento interno de interés (o partes características o biológicamente activas). También pueden incluirse plásmidos de expresión que no contienen genes de virus, de modo que los usuarios puedan incorporar nucleótidos de agentes de plegamiento interno de cualquier virus de la gripe de interés. También se pueden incluir en los kits líneas celulares de mamífero, incluyendo, pero sin limitación, las líneas celulares Vero y MDCk . Los reactivos de diagnóstico pueden marcarse de forma detectable.

Los kits para su uso en conformidad con la presente invención pueden incluir, una muestra de referencia, instrucciones para procesar muestras, realizar la prueba, instrucciones para interpretar los resultados, tampones y/u otros reactivos necesarios para realizar la prueba. Un kit puede comprender un panel de anticuerpos.

La presente divulgación proporciona kits para la administración de composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, un kit que comprende al menos una dosis de un agente de plegamiento interno. Un kit que comprende una dosis unitaria inicial y una o más dosis unitarias posteriores de un agente de plegamiento interno. La dosis unitaria inicial puede ser mayor que las dosis unitarias posteriores o en donde todas las dosis son iguales.

Los kits (particularmente aquellos para la administración de composiciones farmacéuticas de agente de plegamiento interno) pueden comprender al menos un componente de un dispositivo de administración, por ejemplo, un inhalador. Un kit puede comprender al menos un componente de un dispositivo de administración, por ejemplo, un inhalador y una dosis de un agente de plegamiento interno.

Los kits proporcionados comprenden instrucciones de uso.

Ejemplos

Ejemplo 1. Diseño de agentes de plegamiento interno

El presente ejemplo ilustra el diseño de agentes de plegamiento interno para unirse a regiones específicas en un polipéptido HA.

Se diseñó una secuencia de plegamiento interno ejemplar contra la interfaz de unión de HA (Figura 6). Estas interacciones revelaron varios contactos potencialmente estabilizadores con los dominios de la cabeza (HA-1) y del tallo (HA-2) de la HA (Tabla 10). Se observa que una de las regiones de la proteína diseñada tiene los contactos hidrófobos estabilizadores y enlaces de hidrógeno deseados con los dominios HA-1 y HA-2, mientras que otra región destacada tiene interacciones hidrófobas estabilizadoras principalmente con HA-1, mientras que aún otra región tiene interacciones hidrófobas estabilizadoras principalmente con HA-2. Por lo tanto, se espera que la proteína de plegamiento interno diseñada en consideración se una a la interfaz tallo-cabeza de los dominios h A-1 y HA-2. Adicionalmente, como se esperaba, se observa que las proteínas diseñadas se adaptan a la N-glucosilación en la región MPER de la HA debido a su volumen significativamente menor que los anticuerpos (Figura 6). Por lo tanto, se sostiene que las proteínas diseñadas se unirán con buena afinidad tanto a las cepas de virus de la gripe con glucosiladas en MPER como a las no glucosiladas en MPER, sustentando la neutralización universal de la gripe.

Tabla 10

Se sabe que dirigirse al suministro de productos terapéuticos de forma local en lugar de a nivel global proporciona un tratamiento inmensamente menos tóxico con mayor potencia. Además de las propiedades de amplio espectro de neutralización de la gripe, la capacidad de unirse específicamente a glucanos sialilados en a2,6 en el receptor de HA se convierte en una propiedad importante de los nuevos productos terapéuticos para la gripe. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría, los inventores proponen las siguientes estrategias para la neutralización de amplio espectro dirigida de gripe, como se ilustra en la Figura 1. Incluyen la capacidad de unirse a la región epitópica proximal de membrana conservada glucosilada/no glicosilada de la HA (neutralización de amplio espectro) junto con la capacidad de unirse a los receptores con glucano sialilado en las vías respiratorias altas humanas (suministro dirigido).

Ejemplo 2. Los agentes de plegamiento interno se unen a polipéptidos HA

El presente ejemplo ilustra la unión de agentes de plegamiento interno al polipéptido HA en un ensayo de unión in vitro.

Se recubrieron los pocillos de placas Maxisorp de 96 pocillos con 0,2 |jg de un polipéptido HA de distintos subtipos (HI, H3, H5, H7 y H9) y se dejó toda la noche a 4 °C. Las placas recubiertas con polipéptido HA se lavaron tres veces con PBS y se bloquearon con BSA al 1 % en PBST. Se añadieron a los pocillos recubiertos con polipéptido HA distintas concentraciones de agentes de plegamiento interno junto con el anticuerpo C179 (control) y la placa se incubó a TA durante 2 horas. La placa se lavó tres veces con PBST y los pocillos que contenían agentes de plegamiento interno se incubaron con anticuerpo anti-6xHis de ratón (dilución 1:1000) durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron tres veces con PBST y todos los pocillos se incubaron con anticuerpo de cabra anti-ratón HRP durante 1 hora a TA. Después de la incubación, los pocillos se lavaron con PBST y la HRP unida se midió utilizando sustrato TMB. Se añadió sustrato TMB a los pocillos, se incubó durante 3 minutos, seguido de la adición de ácido sulfúrico 1 N. La absorbancia se midió a 450 nm.

Los resultados experimentales de los inventores muestran una buena concordancia con los cálculos teóricos predichos, con las proteínas diseñadas que presentan una alta afinidad hacia las cepas de virus de la gripe tanto glucosiladas en MPER como no glucosiladas en MPER. Los resultados de los inventores muestran que un agente de plegamiento interno ejemplar se une a diversos polipéptidos HA glucosilados y no glucosilados (HI, H3, H5, H7 y H9) con afinidades similares (Figura 7, panel izquierdo). Estos datos se comparan con el control de anticuerpos C179 (Figura 7, panel derecho), lo que muestra que el anticuerpo C179 no puede distinguir entre distintos clados del polipéptido HA.

Ejemplo 3. Afinidad de unión entre los agentes de plegamiento interno y las dianas de un agente de plegamiento interno

El presente ejemplo muestra un cálculo de afinidad de la unión, representada como una constante de disociación (Kd), entre un agente de plegamiento interno y la diana del agente de plegamiento interno. En este ejemplo, el agente de plegamiento interno es un agente de plegamiento interno ejemplar y la diana del agente de plegamiento interno es un polipéptido HA.

La afinidad de unión entre el agente de plegamiento interno ejemplar y un polipéptido HA es una función de las concentraciones tanto del agente de plegamiento interno como del polipéptido HA. En el presente ejemplo, la afinidad de unión se describe cuantitativamente utilizando constante de disociación (Kd). A continuación se describe un ejemplo de cómo medir la constante de disociación.

Se utilizaron placas recubiertas con polipéptido HA para realizar ensayos ELISA con un agente de plegamiento interno ejemplar como se describe anteriormente. Se utilizó la absorbancia medida a 450 nm para calcular la saturación fraccional del receptor. La saturación fraccional se representó en función de la concentración molar del agente de plegamiento interno. Los datos se ajustaron a la siguiente ecuación:

en que y es la saturación fraccional, I0 es la concentración del agente de plegamiento interno y Kd es la constante de disociación.

Utilizando el cálculo al que se hace referencia anteriormente y aplicando el análisis de regresión, los inventores han observado valores de Kd en el intervalo de 0,1 a 500 nM para la unión de agentes de plegamiento interno a polipéptidos HA. En algunas realizaciones, los inventores han observado valores de Kd en el intervalo de 10 a 100 nM para la unión de agentes de plegamiento interno a polipéptidos HA. En algunas realizaciones, los inventores han observado valores de Kd en el intervalo de 50 a 100 nM para la unión de agentes de plegamiento interno a polipéptidos HA.

Ejemplo 4. Los agentes de plegamiento interno inhiben la infectividad del virus in vitro

El presente ejemplo ilustra la capacidad de los agentes de plegamiento interno para prevenir la infectividad del virus en ensayos de unión in vitro.

Se evaluó in vitro la capacidad de un agente de plegamiento interno para la inhibición de la infección por virus de la gripe utilizando células MDCK (riñón canino Madin-Darby), una línea de células epiteliales comúnmente utilizada para la propagación y el análisis de cepas de virus de la gripe. Los efectos inhibidores del agente de plegamiento interno sobre la infectividad se determinaron midiendo tanto la producción vírica como la extensión de los efectos citopáticos (EC) inducidos por el virus de la gripe en las células hospedadoras. Se empleó un ensayo de placas (Figuras 15 y 16) y qRT-PCR para cuantificar la producción vírica, y se utilizó un ensayo de viabilidad celular para medir los niveles de EC. Los experimentos se configuraron para permitir que el agente de plegamiento interno se uniera primero a su diana vírica durante un período de preincubación de una hora antes de la introducción en las células hospedadoras. La infección se llevó a cabo en presencia de bajos niveles de tripsina (1 |jM). El ensayo de placas se realizó inoculando una monocapa de células confluente con diluciones en serie de muestras de prueba, y cubriendo con una suspensión viscosa del polímero Avicel (FMC Biopolymers). Las placas se dejaron desarrollar durante un período de 48 horas a 35 °C, se fijaron con formalina, se tiñeron con cristal violeta y visualizaron (Figuras 15 y 16). El recuento de las placas se utilizó para calcular los títulos de los virus infecciosos en las muestras de prueba. La producción total de virus también se determinó por RT-PCR cuantitativa, que midió los niveles de copias del genoma vírico en las muestras infectadas. Se diseñaron cebadores y una sonda marcada para amplificar y medir específicamente una región dentro del gen de la hemaglutinina vírica mediante el método TaqMan. Se utilizó el número relativo de células viables después de la infección como una medida del EC. Se expusieron cultivos celulares subconfluentes a una mezcla de compuesto/virus (moi = 1,0) durante un período de una hora a 35 °C. El virus y el fármaco no unidos se eliminaron y a continuación se reemplazaron por medio de crecimiento de virus. La viabilidad celular se determinó después de 48 horas de incubación utilizando reactivos CellTiter Blue de Promega (resazurina) como lectura del grado de conversión metabólica de resazurina no fluorescente a resorufina fluorescente (excitación/emisión de 555/585 nm; SpectraMax M2; Molecular Probes).

A partir de estos estudios, los inventores han descubierto que los agentes de plegamiento interno inhiben la producción de placas inducida por el virus. En algunas realizaciones, los agentes de plegamiento interno inhiben la producción de placas inducida por virus de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 5. Los agentes de plegamiento interno se unen a polipéptidos HA in vivo

El presente ejemplo ilustra la capacidad de los agentes de plegamiento interno para unirse a polipéptidos HA in vivo.

Se adquirieron ratones BALB/c (de 4-6 semanas de edad) de Charles River Labs. Los ratones se pesaron y se dividieron en cuatro grupos de 6 ratones cada uno para el experimento. A casa grupo se le administró una dosis de isoflurano con 0 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,6 mg/kg o 6 mg/kg de agente de plegamiento interno, y se dejó recuperar (< 2 min). Después, se les readministró isoflurano y se expusieron por vía intranasal a una dosis letal del virus H1N1 PR8. Los ratones se controlaron diariamente durante 14 días. Se registraron diariamente la pérdida de peso, la puntuación visual y la supervivencia (Figuras 17 y 18). Los signos clínicos de la infección gripal en ratones incluyen postura encorvada, pelaje erizado, respiración rápida, pérdida de apetito, pérdida de peso y muerte. Además, el día 3 se recogieron lavados nasales de tres animales cada uno del grupo no tratado y el grupo al que se le dosificaron 6 mg/kg, para demostrar una reducción de la replicación vírica en la nariz con títulos máximos esperados en el día 3. Se recogieron los pulmones de cada ratón antes del sacrificio.

Los resultados de estos estudios han demostrado que los agentes de plegamiento interno pueden retrasar satisfactoriamente el inicio de la infección por H1N1 en ratones, con resultados que fueron comparables o extremadamente mejores que un tratamiento antivírico alternativo, la Ribavirina.

Ejemplo 6. Agentes de plegamiento interno en el diagnóstico

El presente ejemplo ilustra la capacidad de los agentes de plegamiento interno para proporcionar una forma rápida de (a) identificar la presencia del virus de la gripe en una muestra biológica y (b) caracterizar el virus, basándose en el subtipo.

Se utiliza un ensayo de ELISA tipo sándwich (ensayo ELISA de tipificación de virus) para identificar la presencia del virus de la gripe y caracterizar el subtipo de virus. Para el ensayo de ELISA de tipificación de virus, se recubrirán placas de 96 pocillos con 2 |jg de agente de plegamiento interno y se incubarán durante una noche a 4 °C. Después, las placas se lavarían exhaustivamente con PBS y se bloquearían con BSA al 1 % en PBST durante 1 hora. Después del bloqueo, las placas se lavarán con PBST y se almacenarán a 4 °C hasta su uso posterior.

Las muestras biológicas sospechosas de contener virus de la gripe se diluirán en tampón de muestra (PBS) directamente o después del procesamiento. Las muestras diluidas se aplicarán a continuación a los pocillos recubiertos con agente de plegamiento interno y se incubarán durante 2 horas a temperatura ambiente (TA), seguido de un lavado exhaustivo. Por lo tanto, el virus de la muestra sería capturado por el agente de plegamiento interno y se prestaría para un análisis posterior. Se aplicará un anticuerpo específico de subtipo a los distintos pocillos durante 1 hora a TA. Después de lavados adicionales con PBST, se aplicarán a los pocillos anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Después de la incubación, los pocillos se lavarían y tratarían con sustrato t Mb y ácido sulfúrico 1 N. Se medirá la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro. Se incluirán controles negativos y positivos apropiados.

Los resultados del ensayo de ELISA de tipificación de virus proporcionarán información sobre la presencia del virus de la gripe en una muestra y el subtipo del virus.

Ejemplo 7. Agentes de plegamiento interno para la caracterización de glucanos del virus de la gripe

El presente ejemplo ilustra la capacidad de los agentes de plegamiento interno como medio para enriquecer y marcar virus de la gripe para la caracterización de glucanos, utilizando un ensayo de tipificación de glucanos.

En el ensayo de tipificación de glucanos, los agentes de plegamiento interno se conjugarían con Qdot 525 Carboxyl Quantum Dots utilizando química EDC según las instrucciones del fabricante. Se añadirá el complejo Qdotplegamiento interno a las muestras biológicas procesadas y se agitará bien durante 2 horas. A continuación se centrifugará la muestra y el complejo Qdot-plegamiento-Pleg.A se lavará tres veces con PBST. Después, este complejo se aplicaría en una matriz de glucanos (que contiene glucanos con topología de paraguas y de cono). Después de incubar durante 2 horas a TA, los pocillos se lavarían tres veces con PBST. La fluorescencia unida se mediría utilizando el espectrofotómetro SpectraMax M2e, utilizando el modo de lectura inferior.

Los resultados de este ensayo producirán información con respecto a la caracterización de los glucanos de los virus de la gripe.

Ejemplo 8. Evaluación de la CI50 del Plegamiento interno 28

Se ha cuantificado la CI50 de los agentes de plegamiento interno contra el virus de la gripe dirigidos a HA. Estos estudios utilizaron la cepa PR8 del virus de la gripe H1N1 (A/Puerto Rico/8/34). En resumen, se infectan células MDCK confluentes con PR8 [4E3 UFP/ml] preincubadas durante 40 minutos con concentraciones variables de agentes contra el virus de la gripe. Después de una hora de infección, los medios se retiraron y se reemplazaron por medios sin virus que contenían fármaco o medios sin virus sin fármacos, dependiendo del experimento. Después de 48 horas de incubación a 37 °C, en CO2 al 5 %, se recogieron los sobrenadantes. Se aisló el ARN vírico y se cuantificó el título vírico mediante PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos para la proteína M del virus.

La evaluación inicial de los valores de CI50 para el Plegamiento interno 28 se determinaron mediante un ensayo de microneutralización seguido de PCR cuantitativa (qPCR). Se preincubaron mezclas de virus (PR8) y de Plegamiento interno 28 a diversos títulos y concentraciones, respectivamente, durante 1 hora a 35 °C antes de su aplicación a cultivos de células MDCK en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos (~ 10.000 células/pocillo). Después de 48 horas adicionales de incubación, se recogió de cada pocillo el medio de cultivo para la determinación de la producción vírica mediante qPCR. Un indicio preliminar de la actividad neutralizante del Plegamiento interno 28 provino de la tinción con cristal violeta de células que sobrevivieron a la infección (Figura 20; las células teñidas están en negro), lo que mostraron una inhibición dependiente de la concentración del fármaco y del título vírico.

Se combinaron los medios de muestras por triplicado y a continuación se sometieron a la cuantificación directa de la producción vírica mediante qPCR. Los títulos víricos se calcularon a partir de los valores de Ct de la PCR con la ayuda de una curva patrón interna y se determinaron los valores de la CI50 representando los títulos calculados frente a las concentraciones de Plegamiento interno 28 (Figura 21). Los resultados mostraron una inhibición del 50 % (CI50) de 200 ufp/ml (moi = 0,04) de partículas de virus PR8 con 11 pg/ml de Plegamiento interno 28. Como se esperaba para un agente activo, este valor aumentó con el título vírico. Los resultados muestran que el Plegamiento interno 28 es un inhibidor potente; la CI50 está afectada por la multiplicidad de infección (moi).

Además, los inventores investigaron cómo el método de adición del Plegamiento interno 28 (es decir, en la cobertura, etc.) influyó en la inhibición. La C50 del Plegamiento interno 28 se midió como de ~ 1 pg/ml o ~ 6 nM cuando el fármaco se añade a la cobertura después de la infección, y ~ 8 pg/ml o ~ 50 nM cuando el fármaco no se añade a la cobertura después de la infección (Figura 22 ). Al menos otro agente de plegamiento interno analizado de la Tabla 9 mostró una CI50 comparable, mientras que se observó una actividad menos potente con al menos otro agente de este tipo. Los expertos en la materia apreciarán que la orientación proporcionada en el presente documento permite el ajuste y la optimización de los agentes de plegamiento interno basándose en los agentes representativos proporcionados en la Tabla 9, sin experimentación excesiva.

Ejemplo 9. Ensayo de actividad inhibidora mínima

Los inventores han utilizado un método para determinar la concentración inhibidora mínima (CIM) de los agentes antivíricos contra la gripe A. Para ser activo en este ensayo, el agente debe unirse al virus y neutralizar la capacidad del virus para formar placas. Brevemente, se diluye en serie un agente en incrementos de dos veces en PBS para formar un gradiente de concentración a través de múltiples pocillos. Se añade a cada pocillo un número conocido de unidades formadoras de placas víricas y, después de 1 hora de incubación, se añade la mezcla a una monocapa de MDCK para permitir la unión del virus. La cobertura de Avicel fomenta la formación de las placas y las placas se visualizan mediante inmunotinción. La concentración más baja de agente para impedir la formación de placas se informa como la CIM. Estos estudios utilizaron la cepa PR8 del H1N1 (A/Puerto Rico/8/34).

Los agentes de plegamiento interno representativos, incluyendo el Plegamiento interno 28, de la Tabla 9, mostraron actividad en el ensayo frente a H1N1, y mostraron específicamente un CIM <120, e incluso dentro de un intervalo de 15 a aproximadamente 100, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 60, o de aproximadamente 15-20 a aproximadamente 60-100. Los agentes de plegamiento interno analizados en este ensayo no mostraron actividad frente a un virus H3N2 en los estudios particulares realizados. Al menos en algunos casos en que no se observó actividad (ya sea frente a H1N1, H3N2, o ambos) puede haber habido problemas con la estabilidad del agente de plegamiento interno en el ensayo. Los expertos en la materia apreciarán que las mejoras en la estabilidad de tales agentes (por ejemplo, mediante la modificación de la secuencia de aminoácidos o de la cadena principal), la infusión constante o repetida del agente u otros ajustes experimentales en los agentes y/o las condiciones del ensayo, pueden revelar actividad no vista en la prueba particular realizada hasta ahora.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agente de plegamiento interno que se une a un polipéptido hemaglutinina (HA) y comprende un polipéptido de menos de aproximadamente 1000 aminoácidos de longitud, cuya secuencia de aminoácidos consiste en el Plegamiento interno 1 de la SEQ ID NO: 1, Plegamiento interno 2 de la SEQ ID NO: 2, Plegamiento interno 3 de la SEQ ID NO: 3, Plegamiento interno 4 de la SEQ ID NO: 4, Plegamiento interno 5 de la SEQ ID NO: 5, Plegamiento interno 6 de la SEQ ID NO: 6, Plegamiento interno 7 de la SEQ ID NO: 7, Plegamiento interno 8 de la SEQ ID NO: 8, Plegamiento interno 9 de la SEQ ID NO: 9, Plegamiento interno 10 de la SEQ ID NO:10, Plegamiento interno 11 de la SEQ ID NO:11, Plegamiento interno 12 de la SEQ ID NO:12, Plegamiento interno 13 de la SEQ ID NO:13, Plegamiento interno 14 de la SEQ ID NO:14, Plegamiento interno 15 de la SEQ ID NO:15, Plegamiento interno 16 de la SEQ ID NO:16, Plegamiento interno 17 de la SEQ ID NO:17, Plegamiento interno 18 de la SEQ ID NO:18, Plegamiento interno 19 de la SEQ ID NO:19, Plegamiento interno 20 de la SEQ ID NO:20, Plegamiento interno 21 de la SEQ ID NO:21, Plegamiento interno 22 de la SEQ ID NO:22, Plegamiento interno 23 de la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 24 de la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 25 de la SEQ ID NO: 26 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 26 de la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 27 de la SEQ ID NO: 28 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 28 de la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 29 de la SEQ ID NO: 30 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 30 de la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 31 de la SEQ ID NO: 32 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 32 de la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 33 de la SEQ ID NO: 34 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 34 de la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 35 de la SEQ ID NO: 36 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 36 de la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 37 de la SEQ ID NO: 38 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 38 de la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 24, Plegamiento interno 39 de la SEQ ID NO: 40 y la SEQ ID NO: 24, o Plegamiento interno 40 de la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 24.

2. El agente de plegamiento interno de la reivindicación 1, en donde el agente de plegamiento interno comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos consiste en el Plegamiento interno 3 (SEQ ID NO: 3).

3. El agente de plegamiento interno de la reivindicación 1, en donde el agente de plegamiento interno comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos consiste en el Plegamiento interno 28 (SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 24).

4. El agente de plegamiento interno de la reivindicación 1, en donde el agente de plegamiento interno comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos consiste en el Plegamiento interno 22 (SEQ ID NO: 22).

5. Una composición farmacéutica que comprende el agente de plegamiento interno como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 4, y un vehículo biocompatible.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente un agente farmacéutico.

7. Un agente de plegamiento interno como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 4 o una composición farmacéutica como se revindica en la reivindicación 5, para su uso en un método de tratamiento de la infección por gripe A en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el agente de plegamiento interno como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 4 o la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 5, en donde el sujeto ha estado expuesto a una fuente infectada seleccionada del grupo que consiste en un ave, un ser humano y un cerdo.

8. El agente de plegamiento interno o la composición farmacéutica para su uso como se reivindica en la reivindicación 7, en donde el método comprende administrar el agente de plegamiento interno o la composición farmacéutica en combinación con uno o más agentes farmacéuticos.

9. El agente de plegamiento interno para su uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en donde el tratamiento es para el virus de la gripe A subtipo H1N1.

10. El agente de plegamiento interno para su uso como se reivindica en la reivindicación 9, en donde el agente de plegamiento interno comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos consiste en el Plegamiento interno 28 (SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 24).