ES2807440T3 - Procedimiento de identificación de compuestos de almizcle - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de identificación de un compuesto que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o mejora la actividad de un receptor olfativo que es activado por uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un compuesto de almizcle policíclico y nitro almizcle, en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que el procedimiento comprende: a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo, reteniendo la capacidad de dicho polipéptido para ser activado por uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un compuesto de almizcle policíclico y nitro almizcle, o una célula que se modifica mediante recombinación para expresar dicho polipéptido, en el que la célula comprende 1) un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido; o 2) un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para dicho polipéptido y comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 con un compuesto en presencia de dicho uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un compuesto de almizcle policíclico y nitro almizcle; y b) detectar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de identificación de compuestos de almizcle
Campo
El campo técnico se dirige a los receptores y ensayos de olor y aroma que se pueden usar para identificar compuestos de aroma y/o olor y, más específicamente, potenciadores de compuestos de almizcle.
Antecedentes
El olfato es uno de los sistemas sensoriales humanos más complejos y poco conocidos. Desde la activación del receptor olfativo (OR) hasta la percepción, hay muchos pasos que aún requieren mayor investigación. Los compuestos de almizcle son parte de un grupo estructuralmente diverso de productos químicos que comprende almizcles macrocíclicos, almizcles policíclicos, almizcles alicíclicos y nitro almizcles. Estos compuestos de almizcle se usan en perfumería y forman las notas base en muchas formulaciones comerciales. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar nuevos compuestos de almizcle y compuestos que mejoren la percepción de almizcle en los perfumes.
Sumario
En la presente memoria se describe una célula huésped transformada para expresar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.
La presente invención se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un almizcle policíclico y un nitro almizcle, en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo, reteniendo la capacidad de dicho polipéptido para que se active por uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un compuesto de almizcle policíclico y nitro almizcle, o una célula que se modifica mediante recombinación para expresar dicho polipéptido, en el que la célula comprende
1) un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido; o
2) un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para dicho polipéptido y comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3
con un compuesto en presencia de dicho uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un compuesto de almizcle policíclico y nitro almizcle; y
b) detectar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
La presente invención se refiere además al uso de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 para identificar un compuesto de almizcle, en el que el polipéptido tiene la capacidad de ser activado por uno o más compuestos de almizcle.
La presente invención se refiere además a un procedimiento para identificar un compuesto de almizcle, que comprende utilizar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 y que tiene la capacidad de ser activada por uno o más compuestos de almizcle en un ensayo basado en receptor para identificar un compuesto de almizcle.
La presente invención se refiere además al uso de un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 para identificar un compuesto de almizcle.
Todavía más se proporciona una célula que se modifica mediante recombinación para expresar un polipéptido descrito anteriormente.
Descripción detallada de los dibujos
La Figura 1 muestra rastros de imágenes de neuronas sensoriales olfativas Ca2+ que respondieron a mezclas de compuestos de almizcle (Figura 1A) y la posterior identificación de los receptores de ratón Olfr96 y Olfr235 (Figura 1 B).
La Figura 2 muestra las curvas de respuesta a la dosis de almizcle de Olfr96 con compuestos de almizcle policíclicos vulcanolide y tonalide.
La Figura 3 muestra las curvas de respuesta a la dosis de almizcle de Olfr96 y OR11A1 con compuestos de almizcle policíclicos vulcanolide, tonalide y cashmeran, y el compuesto de nitro almizcle, almizcle X.
Descripción detallada
Para las descripciones en la presente memoria y las reivindicaciones adjuntas, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. De forma similar, "comprende", "comprenden", "que comprende", "incluye", "incluyen" y "que incluye" son intercambiables y no pretenden ser limitantes.
Debe entenderse además que cuando las descripciones de diversas realizaciones usan el término "que comprende", los expertos en la técnica entenderán que en algunos casos específicos, una realización se puede describir alternativamente usando el lenguaje "que consiste esencialmente en' o 'que consiste en'.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SeQ ID NO: 2.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la s Eq ID NO: 2.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2. En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 99 % idéntica a la SEQ iD NO: 2.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SeQ ID NO: 4.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la s Eq ID NO: 4.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar un polipéptido en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
En la presente memoria se describe una célula huésped que se transforma para expresar una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4; más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2; incluso más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 4.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SeQ ID NO: 2.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la s Eq ID NO: 2.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SeQ ID NO: 4.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la s Eq ID NO: 4.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
Además, en la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4; más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2; incluso más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la s Eq ID NO: 4.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica a al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SeQ ID NO: 1.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1. También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica a al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 3.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 3.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 3.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 3.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 3. También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 3.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 3.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 1.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que tiene un ácido nucleico en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 3.
También se describe en la presente memoria una célula que se modifica mediante recombinación para expresar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento para identificar un compuesto que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o mejora la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un almizcle policíclico y un nitro almizcle, en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo, reteniendo la capacidad de dicho polipéptido para que se active por uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un compuesto de almizcle policíclico y nitro almizcle, o una célula que se modifica mediante recombinación para expresar dicho polipéptido, en el que la célula comprende
1) un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido; o
2) un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para dicho polipéptido y comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o la SeQ iD NO: 3
con un compuesto en presencia de dicho uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un compuesto de almizcle policíclico y nitro almizcle; y
b) detectar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos
75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la s Eq ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID No : 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos
98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la s Eq ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID No : 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID nO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID nO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID No : 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID nO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 98 % y 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 4 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa por un nitro almizcle en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2 en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto;
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
Además, se proporciona uno cualquiera de una serie de compuestos de almizcle que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o mejora la actividad de un receptor olfativo y que se identifica por los procedimientos que se divulgan en la presente memoria.
Otra realización de la invención se refiere al uso de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 para identificar un compuesto de almizcle que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o mejora la actividad de un receptor olfativo, en el que el polipéptido tiene la capacidad de ser activado por uno o más compuestos de almizcle.
Todavía más se proporciona una célula que se modifica mediante recombinación para expresar un polipéptido descrito anteriormente.
En una realización, se proporciona en la presente memoria una célula no humana transformada para expresar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4; más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2; incluso más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 4.
Además, se proporciona en la presente memoria un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4; más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2; incluso más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 4.
En una realización que se proporciona en la presente memoria, hay una célula que se modifica mediante recombinación para expresar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.
En una realización que se proporciona en la presente memoria, hay una célula que se modifica mediante recombinación para expresar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4; más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2; incluso más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 4.
Además, se proporciona en la presente memoria un procedimiento de acuerdo con la invención para identificar un compuesto que bloquea, inhibe, modula y/o aumenta la actividad de un receptor olfativo que se activa mediante un almizcle policíclico en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 2; incluso más particularmente una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 4. en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo con un compuesto; y
b) determinar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
En una realización, que se proporciona en la presente memoria hay una célula en la que la célula es una célula procariota. En otra realización, la célula que se proporciona en la presente memoria es una célula eucariota. En una realización particular, la célula que se proporciona en la presente memoria se selecciona de un grupo que consiste en una célula de levadura y una célula vegetal. En una realización más particular que se proporciona en la presente memoria, la célula se selecciona del grupo que consiste en HEK293, CHO, ovocitos de Xenopus, COS, levadura, bacterias y células derivadas de la placoda olfatoria.
Para identificar receptores específicos de almizcle desconocidos, se utilizan mezclas representativas de almizcles para detectar neuronas sensoriales olfativas disociadas (OSN). Los compuestos de almizcle individuales se pueden utilizar adicionalmente para experimentos de dosis-respuesta que se basan en células que se realizan en receptores de almizcle específicos para evaluar tanto la especificidad como la sensibilidad de los receptores.
Por ejemplo, los compuestos de almizcle son parte de un grupo estructuralmente diverso de productos químicos que comprende almizcles macrocíclicos, almizcles policíclicos, almizcles alicíclicos y nitro almizcles como se expone a continuación.
Figure imgf000011_0001
En un aspecto, se proporcionan en la presente memoria procedimientos para identificar receptores de olor de mamíferos para compuestos de perfume de almizcle y el uso del receptor para el cribado, particularmente para el cribado de alto rendimiento (HTS) de moduladores de almizcle (por ejemplo, potenciadores) y de nuevos compuestos de almizcle. En particular, en la presente memoria se proporcionan receptores de ratón, por ejemplo, Olfr96 (SEQ ID NO: 2) y su homólogo humano OR11A1 (SEQ ID nO: 4) como receptores para compuestos de almizcle que comprenden Vulcanolide, Cashmeran, Tonalide y Almizcle X.
Si bien no desea estar vinculado a ninguna teoría, el receptor de ratón Olfr235 es un parálogo del receptor Olfr1440 y un ortólogo del receptor humano OR5AN1. Estos receptores se identificaron previamente como receptores sensibles a muscona y muscenona (WO2015/020158; Shirasu y otros., Neuron (2013)).
En una realización adicional, los indicadores para controlar la actividad de los receptores olfativos se seleccionan de un colorante indicador fluorescente de calcio, una proteína indicadora de calcio, un indicador fluorescente AMPc, una proteína indicadora mediada por el elemento de respuesta AMPc (CRE), un ensayo bioquímico AMPc HTRF, un ensayo de beta-arrestina, o un registro electrofisiológico. En particular, se selecciona un colorante indicador de calcio que se puede usar para controlar la actividad de los receptores olfativos que se expresan en la membrana de las neuronas olfativas (por ejemplo, Fura-2 AM).
En una realización particular, los compuestos se seleccionan secuencialmente y los cambios dependientes del olor en la fluorescencia del colorante de calcio se miden usando un microscopio fluorescente o un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS).
En una realización adicional, se usa el modelado molecular del receptor 3D de los receptores olfativos para evaluar el potencial de unión in silico e identificar compuestos que pueden activar, imitar, bloquear, inhibir, modular y/o potenciar la actividad de un receptor olfativo.
Como ejemplo, las neuronas olfativas se aíslan mediante uno o más compuestos de almizcle utilizando un microelectrodo de vidrio que se conecta a un micromanipulador o una máquina FACS. Las neuronas sensoriales olfativas del ratón se examinan por imágenes de Ca2+ similares a los procedimientos descritos previamente (Malnic y otros, 1999; Areneda y otros, 2004; WO2014/210585). Particularmente, se usa una platina de microscopio móvil motorizada para aumentar el número de células que se pueden examinar de al menos 1.500 por experimento. Dado que hay aproximadamente 1.200 receptores olfativos diferentes en el ratón y cada neurona sensorial olfativa expresa solo 1 de 1.200 genes de receptores olfativos, esta capacidad de cribado cubrirá prácticamente todo el repertorio de receptores de olores del ratón. En otras palabras, la combinación de imágenes de calcio para el cribado de neuronas sensoriales olfativas de alto rendimiento conduce a la identificación de casi todos los receptores de olor que responden a un perfil particular de olores. En un aspecto particular, se pueden aislar los receptores de olor que responden a los compuestos de almizcle. Por ejemplo, al menos una neurona se aísla.
Para obtener imágenes de calcio de las neuronas olfativas, el epitelio olfativo principal se puede diseccionar de un ratón antes de la disociación neuronal. El epitelio olfativo diseccionado se puede luego transferir a un tampón de disociación para la disociación mecánica y enzimática. Las neuronas disociadas se pueden sembrar en un cubreobjetos que permite el cribado de miles de células mediante microscopía de fluorescencia y las células se pueden cargar con un colorante sensible al calcio (Fura-2 AM), por ejemplo, durante aproximadamente 30 minutos a 31 °C y se transfieren al microscopio listo para el cribado. Las células se estimulan perfundiendo soluciones de olor diluidas (en solución salina fisiológica) sobre las neuronas olfativas disociadas. Las células raras que responden al compuesto de mal olor se identifican, por ejemplo, estimulando los receptores con 50 pm de los compuestos de almizcle y luego monitoreando el flujo de Ca2+ intracelular que se indica por cambios en la fluorescencia de Fura-2. Después del análisis, las células que responden se pueden recuperar de un cubreobjetos de vidrio con una micropipeta de succión. Las células aisladas se agrupan en una muestra para la posterior identificación de los genes del receptor de olor que se expresan como ARNm en las células que responden.
En una realización particular, el ARNm de las neuronas olfativas se purifica y amplifica de acuerdo con el procedimiento que se describe generalmente en Marko, NF, y otros, (2005) A robust method for the amplification of RNA in the sense orientation. BMC genomics, 6, 27; doi:10.1186/1471 -2164-6-27 (Procedimiento Eberwine). Al menos una parte del transcriptoma (hasta incluir todo el transcriptoma) se secuencia usando la secuenciación de próxima generación (NGS) o se hibrida con genes conocidos usando tecnologías de micromatrices. NGS se discute y describe generalmente en Metzker, ML (2010). Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics, 11 (1), 31-46; doi:10.1038/nrg262. En una realización particular, se agrupan un mínimo de 5 neuronas que presentan el mismo perfil de respuesta. El ARNm se libera por lisis celular inmediatamente después de la recolección; no se llevan a cabo etapas de DNAsa ni de purificación. El ARNm se amplifica por dos rondas consecutivas de transcripción in vitro (IVT). La amplificación se puede realizar de acuerdo con el kit de ARNa MesageAmplI (Ambion, AMA1751) con los siguientes parámetros: dos rondas de IVT consecutivas de 14 horas de duración.
En una realización adicional, la identidad de un grupo o familia de genes de receptores olfativos de almizcle se determina (por ejemplo, hasta el número de neuronas recogidas) comparando los resultados de las lecturas de NGS que se obtienen de las neuronas sensoriales olfativas activadas que se aíslan con una secuencia de genoma de referencia de la misma especie. En particular, los supuestos receptores de almizcle serán los ARNm más abundante en la muestra de NGS derivada de neuronas olfativas o estarán presentes en más de una réplica biológica independiente. Debido a la naturaleza combinatoria del código olfativo (un compuesto activa muchas OR y un OR se puede activar por muchos compuestos), la agrupación de varias neuronas que se activan por determinados compuestos permite la recuperación de prácticamente todos los receptores responsables de la percepción de estas moléculas en un solo experimento nGs . Agrupar neuronas funcionalmente similares mejora enormemente el rendimiento y la velocidad de desorfanización.
Las herramientas de bioinformática estándares se utilizan para identificar los receptores de olor humanos más estrechamente relacionados con otros supuestos receptores de almizcle de mamíferos (no humanos) bajo el supuesto de que los receptores de secuencias homólogas conservan una función similar. Adipietro y otros. (2012) Functional Evolution of Mammalian Odorant Receptors. PLoS Genet 8 (7): e1002821. doi: 10.1371/journal.pgen.1002821. Se pueden usar los parámetros predeterminados del algoritmo BLASTP y/o BLASTN.
Los receptores de almizcle de mamífero humano o no humano se pueden adaptar a un ensayo funcional que se puede usar para identificar compuestos que activan, imitan, bloquean, modulan y/o potencian la actividad de un compuesto de almizcle. En particular, el ensayo puede ser un ensayo que se basa en células o un ensayo de unión y el procedimiento para identificar compuestos puede ser un ensayo de cribado de alto rendimiento. Más particularmente, en la presente memoria se proporcionan ensayos que se basan en receptores adaptables para el cribado de receptores de alto rendimiento con librerías de compuestos para el descubrimiento de compuestos moduladores (por ejemplo, bloqueo, mejora y enmascaramiento).
En una realización particular, las secuencias de genes del receptor de almizcle se identifican a partir de células sensibles a compuestos de almizcle como sigue: Las neuronas agrupadas se calientan a 75 °C durante 10 minutos para romper la membrana celular y hacer que su ARNm esté disponible para la amplificación. Este paso de amplificación es importante cuando se aplican tecnologías NGS con una cantidad limitada de material de partida, típicamente entre 5 y 15 celdas. Una amplificación lineal de acuerdo con el procedimiento Eberwine (IVT) asegura el mantenimiento de los niveles relativos de transcripción de los genes que se expresan. Dos rondas consecutivas durante la noche (14h) de transcripción in vitro se usan para producir cantidades suficientes de ARNc; el ARNc amplificado se usa luego para generar una librería de ADNc en un Illumina HiSeq. Las secuencias cortas resultantes de típicamente 150 pares de bases (comúnmente conocidas como "lecturas") se alinean contra el genoma de referencia del ratón (como la versión UCSC mm9 o mm10) para construir el transcriptoma completo de estas células. El análisis cuantitativo de los datos del transcriptoma produce una lista de transcritos de genes de receptores de olores y sus respectivos niveles de expresión. Los genes receptores de olor que muestran los niveles más abundantes de ARNm ("lecturas" más abundantes) o están presentes en más de un experimento repetido, se consideran supuestos receptores de compuestos de almizcle.
Los genes OR de ratón pronosticados se utilizan para extraer las últimas versiones de las bases de datos del genoma humano y del ratón para identificar los receptores más estrechamente relacionados (es decir, la mayor similitud de secuencia) en el ratón (genes parálogos) y en el humano (genes ortólogos). Este procedimiento se puede realizar utilizando el algoritmo de búsqueda BLAST (disponible públicamente en el sitio web de NCBI), una herramienta de búsqueda de similitud de secuencia, donde cada secuencia de supuestos genes que se obtuvo previamente del análisis de transcriptoma inicial se usa como una secuencia de consulta. Los genes recientemente identificados a partir de este procedimiento de minería de datos también se consideran receptores potenciales de almizcle bajo el supuesto de que los genes parálogos y ortólogos tienen muchas probabilidades de poseer actividades similares. En una realización particular, la comparación por pares de homología de secuencia se lleva a cabo para identificar receptores estrechamente relacionados en ratones y humanos usando el siguiente esquema iterativo:
Secuencia de consulta de paso Resultado BLASTN/BLASTP
1. Candidato 1 de ratón ^ Parálogo 1 de ratón y ortólogo 1 de humano
2. Parálogo 1 de ratón ^ Ortólogo 2 humano
3. Ortólogo 1 de humano ^ Parálogo 2 de humano
4. Ortólogo 2 de humano ^ Parálogo 3 de humano
Parálogo = homólogo en la misma especie Ortólogo = homólogo en otras especies
Los genes parálogos se alinean usando una herramienta de alineamiento múltiple para generar un árbol filogenético. Los datos funcionales in vitro se pueden interpretar a la luz de tal relación filogenética entre receptores estrechamente relacionados pero distintos. Este paso es esencial en la identificación de familias completas de genes OR que responden, en diversos grados, a los compuestos de prueba, por ejemplo, vulcanolide.
Este enfoque tiene varias ventajas importantes sobre los procedimientos de RT-PCR de una sola célula previamente establecidos. Primero, al agrupar múltiples neuronas que comparten propiedades de unión similares, un experimento único de secuenciación de ARNm (NGS) identifica prácticamente todos los receptores que se activan por los compuestos de almizcle diana. Por lo tanto, el rendimiento es más alto de lo que se logró anteriormente. En segundo lugar, debido a que se pueden agrupar varias células en una muestra, este enfoque permite la selección de genes mediante una comparación exhaustiva de muestras replicadas a través de experimentos. En tercer lugar, la NGS no requiere el uso de cebadores de PCR específicos para un OR. La NGS tampoco requiere el uso de cebadores degenerados específicos para OR, que son problemáticos y a menudo conducen a falsos positivos debido a la amplificación por PCR no lineal o no específica. En particular, dado que las secuencias de codificación OR se encuentran dentro de un solo exón, la contaminación de la muestra con ADN genómico puede conducir fácilmente a una amplificación específica de las secuencias del gen OR. Cuarto, el análisis de RT-PCR es difícil de realizar en muestras agrupadas debido a la tasa de falsos positivos inherente. Se han realizado experimentos de hibridación de ARNm de células individuales utilizando chips de micromatrices de ADN de alta densidad. Sin embargo, este enfoque generalmente es menos sensible que la NGS y se restringe aún más a los genes conocidos para los cuales se deben sintetizar las sondas de ADN correspondientes. Por lo tanto, el uso de NGS es significativamente ventajoso para identificar rápidamente OR y, en última instancia, da como resultado una selección más precisa de receptores candidatos en comparación con los enfoques estándares (por ejemplo, RT-PCR y micromatrices). Si bien se prefiere el enfoque NGS, se pueden usar otros enfoques como RT-PCR y enfoques de micromatrices.
En una realización adicional, para completar el procedimiento de desorfanización, los genes OR candidatos se expresan adicionalmente in vitro para confirmar la actividad contra los compuestos utilizados para aislar las neuronas sensoriales olfativas y otros compuestos de interés estructuralmente relacionados. Los receptores de ratón identificados a partir de neuronas olfativas aisladas que responden a ambos compuestos de almizcle se modifican en su N-terminal con secuencias cortas de polipéptidos (por ejemplo, secuencias Flag (SEQ ID NO: 6), Rho (SEQ ID NO: 8; 20 primeros aminoácidos del receptor de rodopsina bovina), o Lucy (SEQ ID NO: 10), que se expresan de forma transitoria en células HEK 293T, y se estimulan por separado con compuestos de almizcle para confirmar su identidad como receptores de compuestos de almizcle de buena fe. La coexpresión de la subunidad G alfa humana Gaolf en este ensayo que se basa en células, activa la vía de transducción de Gs que conduce a un aumento de AMPc interno al unirse al ligando apropiado. Alternativamente, la coexpresión de la subunidad G alfa humana Gai5 en el ensayo que se basa en células, activa la ruta de transducción de Gq que conduce a un aumento de Ca2+ interno al unirse al ligando apropiado. El procedimiento anterior y los resultados que se obtuvieron hasta ahora sirven para validar el procedimiento para la identificación rápida y confiable de los receptores de olores de mamíferos para los compuestos de almizcle.
Definiciones
Los siguientes términos tienen los significados atribuidos a éstos, a menos que se especifique lo contrario.
"OR" se refiere a uno o más miembros de una familia de receptores acoplados a proteínas G que se expresan en células olfativas. Las células receptoras olfativas también se pueden identificar en base a la morfología o mediante la expresión de proteínas que se expresan específicamente en células olfativas. Los miembros de la familia OR pueden tener la capacidad de actuar como receptores para la transducción olfativa.
Los ácidos nucleicos "OR" codifican una familia de GPCR con siete regiones transmembrana que tienen "actividad del receptor acoplado a proteínas G", por ejemplo, se pueden unir a proteínas G en respuesta a estímulos extracelulares y promover la producción de segundos mensajeros como IP3, AMPc, GMPc y Ca2+ a través de la estimulación de enzimas como la fosfolipasa C y la adenilato ciclasa.
La región del "dominio N terminal" comienza en el N-terminal y se extiende hasta una región cercana al comienzo de la primera región transmembrana. El "dominio transmembrana", que comprende las siete "regiones transmembrana", se refiere al dominio de polipéptidos OR que se encuentra dentro de la membrana plasmática, y también puede incluir los lazos citoplasmáticos (intracelulares) y extracelulares correspondientes. Las siete regiones transmembrana y los lazos extracelulares y citoplasmáticos se pueden identificar utilizando procedimientos estándares, como se describe en Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol., 157: 105-32 (1982) o en Stryer. La estructura secundaria y terciaria general de los dominios transmembrana, en particular los siete dominios transmembrana de los receptores acoplados a proteínas G, como los receptores olfativos, son conocidos en la técnica. Por lo tanto, la secuencia de estructura primaria se puede diseñar o predecir en base a secuencias de dominio transmembrana conocidas, como se describe en detalle a continuación. Estos dominios transmembrana son útiles para ensayos de unión a ligando in vitro, tanto en fase soluble como sólida.
La expresión "efectos funcionales" en el contexto de ensayos para probar compuestos que modulan la transducción olfativa mediada por un miembro de la familia OR incluye la determinación de cualquier parámetro que esté indirectamente o directamente bajo la influencia del receptor, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Incluye la unión de ligandos, cambios en el flujo de iones, potencial de membrana, flujo de corriente, transcripción, unión de proteínas G, fosforilación o desfosforilación de GPCR, interacciones receptor-ligando de transducción de señales, concentraciones de segundo mensajero (por ejemplo, AMPc, GMPc IP3 o Ca 2+) intracelular, in vitro, in vivo, y ex vivo y también incluye otros efectos fisiológicos tales como aumentos o disminuciones de la liberación de neurotransmisores u hormonas.
Por "determinar el efecto funcional" o "confirmar la actividad" en el contexto de los ensayos se entiende ensayos para un compuesto que aumenta o disminuye un parámetro que está indirectamente o directamente bajo la influencia de un miembro de la familia OR, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Dichos efectos funcionales se pueden medir por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, cambios en las características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia, índice de refracción), propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, forma), cromatográficas o de solubilidad, fijación con parche, colorantes sensibles al voltaje, corrientes de células enteras, eflujo de radioisótopos, marcadores inducibles, expresión génica de OR de ovocitos; expresión de OR en células de cultivo de tejidos; activación transcripcional de genes OR; ensayos de unión a ligandos; voltaje, potencial de membrana y cambios de conductancia; ensayos de flujo de iones; cambios en los mensajeros secundarios intracelulares tales como AMPc, GMPc e inositol trifosfato (IP3); cambios en los niveles de calcio intracelular; liberación de neurotransmisores, y similares.
Los "inhibidores", "activadores", "contrarrestantes" y "moduladores" de genes o proteínas OR se usan indistintamente para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras identificadas usando ensayos in vivo, in vitro e in vivo para la transducción olfativa, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas, potenciadores y sus homólogos y miméticos. Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen, bloquean parcial o totalmente la estimulación, disminuyen, evitan, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan negativamente la transducción olfativa, por ejemplo, los antagonistas. Los activadores son compuestos que, por ejemplo, se unen a, estimulan, aumentan, abren activan, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan o regulan positivamente la transducción olfativa, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen compuestos que, por ejemplo, alteran la interacción de un receptor con: proteínas extracelulares que se unen a activadores o inhibidores (por ejemplo, proteínas de unión al olor, ebnerina y otros miembros de la familia de vehículos hidrófobos); proteínas G; quinasas (p. ej., homólogos de rodopsina quinasa y beta quinasas de receptores adrenérgicos que están involucradas en la desactivación y desensibilización de un receptor); y arrestinas, que también desactivan y desensibilizan los receptores. Los moduladores pueden incluir versiones genéticamente modificadas de miembros de la familia OR, por ejemplo, con actividad alterada, así como ligandos de origen natural o sintéticos, antagonistas, agonistas, moléculas químicas pequeñas y similares. Dichos ensayos para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, expresar miembros de la familia OR en células o membranas celulares, aplicar supuestos compuestos moduladores, en presencia o ausencia de moléculas de aroma o sabor, por ejemplo, almizcles, y luego determinar los efectos funcionales sobre la transducción olfativa, como se describió arriba. Las muestras o ensayos que comprenden miembros de la familia OR que se tratan con un posible activador, inhibidor o modulador se comparan con muestras de control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar el grado de modulación. A las muestras de control (no tratadas con moduladores) se les asigna un valor relativo de actividad OR del 100 %. La inhibición de un OR se logra cuando el valor de la actividad de OR en relación con el control es de aproximadamente 80 %, opcionalmente 50 % o 25-0 %. La activación de un OR se logra cuando el valor de la actividad de OR en relación con el control es 110 %, opcionalmente 150 %, opcionalmente 200-500 % o mayor que 1.000-3.000 %.
Los términos "purificado", "sustancialmente purificado" y "aislado", como se usan en la presente memoria, se refieren al estado de estar libre de otros compuestos diferentes con los que el compuesto de la invención se asocia normalmente en su estado natural, de modo que el sujeto "purificado", "sustancialmente purificado" y "aislado" comprende al menos 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 % o 20 %, y más preferentemente al menos 50 % o 75 % de la masa, en peso, de una muestra dada. En una realización preferida, estos términos se refieren al compuesto de la invención que comprende al menos el 95 % de la masa, en peso, de una muestra dada. Como se usa en la presente memoria, los términos "purificado", "sustancialmente purificado" y "aislado", cuando se refieren a un ácido nucleico o proteína, de ácidos nucleicos o proteínas, también se refieren a un estado de purificación o concentración diferente al que ocurre naturalmente en el cuerpo de los mamíferos, especialmente humano. Cualquier grado de purificación o concentración mayor que la que ocurre naturalmente en el cuerpo de los mamíferos, especialmente el humano, que incluye (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados o (2) la asociación con estructuras o compuestos a los que normalmente no está asociada en el cuerpo de los mamíferos, especialmente humanos, están dentro del significado de "aislado". El ácido nucleico o proteína o clases de ácidos nucleicos o proteínas, que se describen en la presente memoria, se pueden aislar o asociar de otra manera con estructuras o compuestos a los que normalmente no están asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de procedimientos y procesos conocidos por los expertos en la técnica.
Como se usa en la presente memoria, el término "aislado", cuando se refiere a un ácido nucleico o polipéptido, se refiere a un estado de purificación o concentración diferente al que ocurre naturalmente en el cuerpo de los mamíferos, especialmente humanos. Cualquier grado de purificación o concentración mayor que el que ocurre naturalmente en el cuerpo, que incluye (1) la purificación de otras estructuras o compuestos asociados de origen natural, o (2) la asociación con estructuras o compuestos a los que normalmente no está asociado en el cuerpo está dentro del significado de "aislado" como se usa en la presente memoria. Los ácidos nucleicos o polipéptidos descritos en la presente memoria se pueden aislar o asociar de otro modo con estructuras o compuestos a los que normalmente no están asociados en la naturaleza, de acuerdo con una variedad de procedimientos y procesos conocidos por los expertos en la técnica.
Como se usa en la presente memoria, los términos "amplificar" y "amplificación" se refieren al uso de cualquier metodología de amplificación adecuada para generar o detectar un ácido nucleico que se expresa de manera natural o recombinante, como se describe en detalles a continuación. Por ejemplo, la invención proporciona procedimientos y reactivos (por ejemplo, pares de cebadores oligonucleotídicos degenerados específicos) para amplificar (por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa, PCR) ácidos nucleicos expresados de manera natural (por ejemplo, ADN genómico o ARNm) o recombinantes (por ejemplo, ADNc) de la invención in vivo o in vitro.
El término "receptor 7-transmembrana" significa un polipéptido que pertenece a una superfamilia de proteínas transmembrana que tiene siete dominios que abarcan la membrana plasmática siete veces (por lo tanto, los siete dominios se denominan dominios "transmembrana" o "TM" TM I a TM VII). Las familias de receptores olfativos y de ciertos gustos pertenecen a esta superfamilia. Los polipéptidos del receptor 7-transmembrana tienen características y estructuras primarias, secundarias y terciarias similares, como se analiza con más detalle a continuación.
La expresión "ácido nucleico" o "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a un oligonucleótido de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria. El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término abarca, además, estructuras similares a ácidos nucleicos con cadenas principales sintéticas. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácidos nucleicos particular implícitamente abarca las variantes de estos modificadas de forma muy conservadora (por ejemplo, las sustituciones de codones degenerados) y las secuencias complementarias, así como la secuencia que se indica explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr mediante la generación de, por ejemplo, secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados se sustituye con residuos con base mezclada y/o desoxiinosina.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en el que uno o más residuos de aminoácido es un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como de polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a las porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la naturaleza en igual relación entre sí. Por ejemplo, el ácido nucleico típicamente se produce por vía recombinante, con dos o más secuencias a partir de genes no relacionados dispuestos para preparar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor a partir de una fuente y una región de codificación a partir de otra fuente. Del mismo modo, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la naturaleza en igual relación entre sí (por ejemplo, una proteína de fusión).
Un "promotor" se define como un arreglo de secuencias de ácidos nucleicos que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Como se usa en la presente memoria, un promotor incluye las secuencias de ácidos nucleicos necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción, tal como, en el caso de un promotor de polimerasa tipo II, un elemento TATA. Un promotor además incluye opcionalmente los elementos potenciadores o represores distales, que se pueden localizar hasta diversos miles de pares de bases a partir del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que se activa bajo la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que se activa bajo la regulación ambiental o de desarrollo. El término "enlazado operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de ácidos nucleicos control para la expresión (tales como, un promotor, o un arreglo de sitios de unión del factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácidos nucleicos, en el que la secuencia control para la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente con la segunda secuencia.
Como se usa en la presente memoria "recombinante" se refiere a un polinucleótido que se sintetiza o manipula de cualquier otra manera in vitro (por ejemplo, "polinucleótido recombinante"), para procedimientos que usan polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos en células u otros sistemas biológicos, o para un polipéptido ("proteína recombinante") que codifica para un polinucleótido recombinante. "Recombinante" significa también la unión de ácidos nucleicos que tienen diversas regiones o dominios o secuencias promotoras codificadoras de diferentes fuentes en un casete o vector de expresión para la expresión de, por ejemplo, expresión inducible o constitutiva de una proteína de fusión que comprende un dominio de translocación de la invención y una secuencia de ácidos nucleicos que se amplifica usando un cebador de la invención. "Recombinante" significa también modificaciones que se obtienen por técnicas de edición del genoma, como CRISPR/Cas9, de una célula que conduce a la expresión estable o transitoria de genes endógenos como el gen receptor al que se hace referencia en la presente memoria.
El término "vector de expresión" se refiere a cualquier sistema de expresión recombinante con el propósito de expresar una secuencia de ácidos nucleicos de la invención in vitro o in vivo, de manera constitutiva o inducible, en cualquier célula, que incluye células procariotas, de levaduras, fúngicas, vegetales, de insectos o de mamíferos. El término incluye sistemas de expresión lineales o circulares. El término incluye sistemas de expresión que permanecen episomales o se integran en el genoma de la célula huésped. Los sistemas de expresión pueden tener la capacidad de autorreplicarse o no, es decir, conducir solo la expresión transitoria en una célula. El término incluye casetes de expresión recombinante que contienen solo los elementos mínimos necesarios para la transcripción del ácido nucleico recombinante.
Por "célula huésped" se entiende una célula que contiene un vector de expresión y soporta la replicación o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas como E. coli, o células eucariotas como levaduras, insectos, anfibios o células de mamíferos como CHO, HeLa, HEK-293 y similares, por ejemplo, cultivos celulares, explantes y células in vivo.
Los ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos que se identifican y/o utilizan en la presente memoria se enumeran a continuación:
Olfr96 de ratón (SEQ ID NO: ADN 1; SEQ ID NO: Proteína 2)
SEQ ID NO: 1
atgggaatcctttccacaggaaatcaaactgtcactgagtttgtacttcttggtttccatgaagtccctgggctg cacctcctgtttttttctgtgttcaccatcctctatgcctccatcatcacagggaacatgctcattgcagtggtg gtggtgagctcccagaggcttcacacacccatgtatttctttctggtgaatctgtccttcatagagattgtctat acctccacagtggtgcccaaaatgctggaaggcttcttacaggaggccaccatatctgtggctggctgcttgctc cagttctttgtttttggctctctggccacagatgagtgttttctgctggctgtgatggcatatgatcgatatete gcaatttgtcaccctctacgatacccacacctcatggggcctcaatggtgcctggggttggtgctcacagtctgg ctgtctggcttcatggtagatggactagttgttgctctgatggcccagttgagattctgtggccccaacttagtt gatcacttttactgtgatttttcacctttgatggtcctggcttgctcagatacccaagtggcccaggtgactaca tttgttctctctgtggtcttcctgactgtcccctttgggctggttctgatctcctatgctcagattgtagtgact gtgctgagagttccttctgggaccagaagaaccaaggccttctccacatgctcctctcacctggctgtggtgtcc acgttctatggaacactcatggtattgtacattgtgccctctgctgttcattctcagctcctctccaaggtcatt gccctgctctacacagtggtcactcccatcttcaaccctgtcatctacaccttgaggaaccaggaggtgcagcag gcactaagaaggcttctctactgcaaaccaactgaaatgtga
S E Q I D N O : 2
mgilstgnqtvtefvllgfhevpglhllffsvftilyasiitgnmliavvvvssqrlhtpmyfflvnlsfieivy tstvvpkmlegflqeatisvagcllqffvfgslatdecfllavmaydrylaichplryphlmgpqwclglvltvw lsgfmvdglvvalmaqlrfcgpnlvdhfyedfsplmvlacsdtqvaqvttfvlsvvfltvpfglvlisyaqivvt vlrvpsgtrrtkafstcsshlavvstfygtlmvlyivpsavhsqllskviallytvvtpifnpviytlrnqevqq alrrllyckptem
OR11A1 humano (SEQ ID NO: ADN 3; SEQ ID NO: Proteína 4)
SEQ ID NO: 3
atggaaattgtctccacaggaaacgaaactattactgaatttgtcctccttggcttctatgacatccctgaactg catttcttgttttttattgtattcactgctgtctatgtcttcatcatcatagggaatatgctgattattgtagca gtggttagctcccagaggctccacaaacccatgtatattttcttggcgaatctgtccttcctggatattctctac acctccgcagtgatgccaaaaatgctggagggcttcctgcaagaagcaactatctctgtggctggttgcttgctc cagttctttatcttcggctctctagccacagctgaatgcttactgctggctgtcatggcatatgaccgctacctg gcaatttgctacccactccactacccactcctgatggggcccagacggtacatggggctggtggtcacaacctgg ctctctggatttgtggtagatggactggttgtggccctggtggcccagctgaggttctgtggccccaaccacatt gaccagttttactgtgactttatgcttttcgtgggcctggcttgctcggatcccagagtggctcaggtgacaact ctcattctgtctgtgttctgcctcactattccttttggactgattctgacatcttatgccagaattgtggtggca gtgctgagagttcctgctggggcaagcaggagaagggctttctccacatgctcctcccacctagctgtagtgacc acattctatggaacgctcatgatcttttatgttgcaccctctgctgtccattcccagctcctctccaaggtcttc tccctgctctacactgtggtcacccctctcttcaatcctgtgatctataccatgaggaacaaggaggtgcatcag gcacttcggaagattctctgtatcaaacaaactgaaacacttgattga
SEQ ID NO: 4
meivstgnetitefvllgfydipelhflffivftavyvfiiignmliivavvssqrlhkpmyiflanlsfldily
tsavmpkmlegflqeatisvagcllqffifgslataeclllavmaydrylaicyplhypllmgprrymglvvttw
lsgfvvdglvvalvaqlrfcgpnhidqfycdfmlfvglacsdprvaqvttlilsvfcltipfgliltsyarivva
vlrvpagasrrrafstcsshlavvttfygtlmifyvapsavhsqllskvfsllytvvtplfnpviytmrnkevhq
alrkilcikqtetld
Secuencia Flag (SEQ ID NO: ADN 5; SEQ ID NO: Proteína 6)
SEQ ID NO: 5
gattacaaggacgacgacgataag
SEQ ID NO: 6 dykddddk
Secuencia Rho (SEQ ID NO: ADN 7; SEQ ID NO: Proteína 8)
SEQ ID NO: 7
atgaacgggaccgagggcccaaacttctacgtgcctttctccaacaagacgggcgtggtg
SEQ ID NO: 8
mngtegpnfyvpfsnktgvv
Secuencia Lucy (SEQ ID NO: ADN 9; SEQ ID NO: Proteína 10)
SEQ ID NO: 9
atgagaccccagatcctgctgctcctggccctgctgaccctaggcctggct
SEQ ID NO: 10
mrpqillllalltlgla
Los siguientes ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden limitar el ámbito de la invención como se establece en el Sumario, Descripción o en las Reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1
Identificación de receptores de almizcle policíclicos de ratón Olfr96 y OR11A1 humano
Las células sensibles al almizcle se aislaron y se procesaron adicionalmente para el análisis del transcriptoma en base a secuenciación de próxima generación (NGS). Se preparó una mezcla de cashmeran, tonalide y galaxolide (mezcla A). También se preparó una mezcla de muscona, muscenona y habanolide (mezcla B). Cada almizcle individual se mezcló a una concentración final de 50 |jM. Se registraron trazas de imágenes de Ca2+ para distintas neuronas sensoriales olfativas (OSN) que se activaron mediante la mezcla A y/o la mezcla B. El eje Y de la Figura 1A muestra la intensidad promedio de la unidad fluorescente relativa como resultado de una grabación de imágenes de radiometría a 340/380 nm de Ca2+. El eje X de la Figura 1A muestra los marcos de tiempo (8s/marco). Las células que respondieron se agruparon para la extracción de ARN y posterior experimento de secuenciación de próxima generación (es decir, ARNseq). Todos los niveles de expresión se normalizaron además para la proteína marcadora olfativa (OMP). El análisis del transcriptoma resultante reveló los receptores de olor más altamente expresados (es decir, los recuentos de lectura más abundantes, normalizados por FPKM): Olfr235 y Olfr96 (Figura 1B). Corresponden a los siguientes genes ortólogos humanos: OR5AN1 y OR11A1, respectivamente.
Ejemplo 2
Caracterización funcional de receptores de almizcle de ratón Olfr96 y humanos OR11A1
Se realizaron experimentos de dosis-respuesta funcional para evaluar el nivel de actividad funcional de la línea celular modificada. Utilizando un ensayo en base a células, el Olfr96 de ratón se probó en una línea celular HEK293T en la que el gen endógeno RTP1 se activó y se expresó la chaperona del receptor de olor. Los genes del receptor marcado con la secuencia Rho se cotransfectaron con la proteína G canónica olfativa, gen Golf y se expusieron a concentraciones crecientes de los olores de almizcle Tonalide, Vulcanolide y Muscona. La actividad inducida por el olor se detectó midiendo el aumento de AMPc en el citosol usando un kit basado en HTRF (CisBio, kit cAMP dynamic 2, 62AM4PEJ). Se observa un aumento dependiente de la dosis de la actividad del receptor Olfr96 para los 2 almizcles policíclicos (Tonalide y Vulcanolide), pero no para el almizcle macrocíclico, Muscona (Figura 2). En un experimento de repetición adicional que usa las mismas condiciones, Olfr96 de ratón y el correspondiente

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de identificación de un compuesto que activa, imita, bloquea, inhibe, modula y/o mejora la actividad de un receptor olfativo que es activado por uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un compuesto de almizcle policíclico y nitro almizcle, en el que el receptor es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en el que el procedimiento comprende:
a) poner en contacto el receptor, o una quimera o fragmento del mismo, reteniendo la capacidad de dicho polipéptido para ser activado por uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un compuesto de almizcle policíclico y nitro almizcle, o una célula que se modifica mediante recombinación para expresar dicho polipéptido, en el que la célula comprende
1) un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido; o
2) un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para dicho polipéptido y comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o la SeQ iD NO: 3 con un compuesto en presencia de dicho uno o más compuestos de almizcle seleccionados de un compuesto de almizcle policíclico y nitro almizcle; y
b) detectar si el compuesto tiene un efecto sobre la actividad del receptor.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto policíclico se selecciona del grupo que consiste en un tonalide, vulcanolide y cashmeran.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2 en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o a la SEQ ID NO: 4.
4. El procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula es una célula eucariota.
5. El procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula es una célula procariota.
6. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en HEK293, CHO, ovocitos de Xenopus, COS, levadura y células derivadas de la placoda olfatoria.
7. Uso de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 para identificar un compuesto de almizcle, en el que el polipéptido tiene la capacidad de ser activado por uno o más compuestos de almizcle.
8. Un procedimiento de identificación de un compuesto de almizcle, que comprende utilizar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 y que tiene la capacidad de ser activado por uno o más compuestos de almizcle en un ensayo basado en receptor para identificar un compuesto de almizcle.
9. Uso de un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 para identificar un compuesto de almizcle.
10. Uso de una célula que se modifica mediante recombinación para que exprese un polipéptido, en el que la célula comprende el vector de expresión de la reivindicación 9 para la identificación de un compuesto de almizcle.
11. El uso según la reivindicación 10 en el que la célula es una célula eucariota.
12. El uso según la reivindicación 10 en el que la célula es una célula procariota.
13. El uso según la reivindicación 11, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en HEK293, CHO, ovocitos de Xenopus, COS, levadura y células derivadas de la placoda olfatoria.
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6261500B2 (ja) 2011-07-22 2018-01-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US20150166985A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting von willebrand factor point mutations
CA2956224A1 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
IL294014B2 (en) 2015-10-23 2024-07-01 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
WO2018162638A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Firmenich Sa Method of identifying malodor modulating compounds
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
CN110662556A (zh) 2017-03-09 2020-01-07 哈佛大学的校长及成员们 癌症疫苗
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
IL269458B2 (en) 2017-03-23 2024-02-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
AU2018352592C1 (en) 2017-10-16 2025-09-25 Beam Therapeutics, Inc. Uses of adenosine base editors
AU2018379263B2 (en) 2017-12-05 2022-02-24 Chemosensoryx Biosciences Sa Olfactory receptor involved in the perception of musk fragrance and the use thereof
EP3724214A4 (en) 2017-12-15 2021-09-01 The Broad Institute Inc. SYSTEMS AND PROCEDURES FOR PREDICTING REPAIR RESULTS IN GENE ENGINEERING
SG11202001226PA (en) 2017-12-21 2020-03-30 Firmenich & Cie Method for identifying positive allosteric modulators for odorant receptors
EP3797160A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 The Broad Institute Inc. Base editors and uses thereof
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
US11951197B2 (en) 2018-12-19 2024-04-09 Firmenich Sa Use of volatile compounds to modulate the perception of floral muguet
WO2020154500A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
GB2601618B (en) 2019-03-19 2024-11-06 Broad Inst Inc Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
EP3997705A1 (en) 2019-10-04 2022-05-18 Firmenich SA Fragrance composition tonality determination method, fragrance composition determination method and corresponding systems
WO2021072328A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing rna
JP2023525304A (ja) 2020-05-08 2023-06-15 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物
CN113049695B (zh) * 2021-03-08 2022-10-11 漳州片仔癀药业股份有限公司 天然麝香中特征多肽的检测方法及其应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4825983A (en) 1987-03-14 1989-05-02 Motoyasu Nakanishi Inertia damper
AU2903701A (en) 1999-10-08 2001-04-23 Digiscents Olfactory receptor sequences
AU2001244591A1 (en) * 2000-04-04 2001-10-15 Lion Corporation Liquid finishing agent composition for textile product
AU2001290603A1 (en) * 2000-08-31 2002-03-13 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the or11a1 gene
JP2009543555A (ja) * 2006-07-11 2009-12-10 リープ・バイオサイエンシーズ・コーポレーション タンパク質を選択的に濃縮する方法及び関連する応用
US20100248390A1 (en) * 2009-03-02 2010-09-30 Duke University Compositions and methods for identifying ligands of odorant receptors
CN102283891A (zh) * 2011-05-06 2011-12-21 安徽丰乐香料有限责任公司 一种经鼻通过嗅觉通路加快麻醉后醒脑复苏、改善大脑认知功能的药物
JP6104058B2 (ja) * 2013-06-03 2017-03-29 花王株式会社 カビ臭抑制剤の探索方法
WO2014210585A2 (en) 2013-06-29 2014-12-31 Firmenich Sa Methods of identifying, isolating and using odorant and aroma receptors
EP2832347B1 (en) * 2013-08-02 2018-01-31 Takasago International Corporation Method for identifying patchouli odorant materials
WO2015020158A1 (ja) 2013-08-09 2015-02-12 国立大学法人東京大学 ムスク系香料のスクリーニング方法

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