ES2808906T3 - Sistema de expresión bacteriano cistrónico doble - Google Patents

Sistema de expresión bacteriano cistrónico doble Download PDF

Info

Publication number
ES2808906T3
ES2808906T3 ES15745247T ES15745247T ES2808906T3 ES 2808906 T3 ES2808906 T3 ES 2808906T3 ES 15745247 T ES15745247 T ES 15745247T ES 15745247 T ES15745247 T ES 15745247T ES 2808906 T3 ES2808906 T3 ES 2808906T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
expression
fragment
inclusion bodies
light chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15745247T
Other languages
English (en)
Inventor
Shardul Salunkhe
Brajesh Varshney
Sudheerbabu Soorapaneni
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lupin Ltd
Original Assignee
Lupin Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lupin Ltd filed Critical Lupin Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2808906T3 publication Critical patent/ES2808906T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/34—Cucurbitaceae, e.g. bitter melon, cucumber or watermelon 
    • A01H6/342—Citrullus lanatus [watermelon]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/27—Erwinia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24029—Aureolysin (3.4.24.29)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un procedimiento para la producción de un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende las etapas de: (i) transformar una célula hospedadora bacteriana con un único vector que consiste en un sistema de expresión cistrónico doble; (ii) cultivar las células bacterianas transformadas en medio adecuado para expresar el anticuerpo o un fragmento del mismo como cuerpos de inclusión; (iii) realizar la solubilización de dichos cuerpos de inclusión; (iv) realizar el replegamiento del anticuerpo o el fragmento del mismo; en donde el sistema de expresión cistrónico doble comprende: a) un primer cistrón que comprende un promotor de T7 unido operativamente con una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena pesada del anticuerpo o el fragmento de la misma; b) un segundo cistrón que comprende un promotor de arabinosa unido operativamente con una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de la misma; en donde el primer y segundo cistrones se sitúan en el vector único y expresan el anticuerpo o fragmento del mismo como cuerpos de inclusión; y en donde la expresión de la cadena pesada se induce mediante IPTG, al tiempo que la expresión de la cadena ligera se induce mediante arabinosa, de tal manera que la cadena pesada y la cadena ligera se expresan a niveles de expresión equimolares.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de expresión bacteriano cistrónico doble
Campo de la invención
En el presente documento se describe un sistema de expresión independiente de doble cistrón en un único vector para la producción de una proteína de interés que comprende fragmentos Fab de anticuerpos recombinantes u otros fragmentos de anticuerpos, péptidos y proteínas expresados como cuerpos de inclusión insolubles formados en la bacteria E. coli.
La presente invención proporciona un procedimiento para la expresión de un anticuerpo o un fragmento del mismo utilizando dicho vector bicistrónico.
Antecedentes de la invención
La tecnología de ADN recombinante (ADNr) ha revolucionado la forma en que se preparan los agentes terapéuticos. Las proteínas necesarias se fabrican ahora dentro de una célula extraña y se purifican.
Las proteínas que tienen modificaciones postraduccionales (las MPT) generalmente se expresan como moléculas recombinantes en sistemas de mamífero o de levadura. Los sistemas de expresión de levadura como Pichia y Saccharomyces están más cerca de los sistemas de mamífero en términos de las MPT, pero aún difieren en los tipos de glucosilaciones, como los glucanos con alto contenido en manosa en el caso de Pichia, lo que los hace inadecuados para la expresión de proteínas recombinantes para el uso humano.
Los anticuerpos monoclonales (los mAb), los anticuerpos, las proteínas de fusión, los fragmentos Fab de los mAb, se utilizan como agentes terapéuticos. La tecnología de ADNr utiliza vectores y sistemas de expresión especializados para la producción de proteínas terapéuticas. Los sistemas de expresión consisten principalmente en sistemas de expresión de bacterias, de levadura, de insecto o de mamífero. Inicialmente, la mayoría de las proteínas recombinantes se expresaban en el sistema de expresión bacteriana utilizando E. coli como hospedadora. Utilizar E. coli como hospedador de expresión presenta varias ventajas, tal como la facilidad de clonación, facilidad de expresión, plazos más cortos, períodos de incubación más cortos y rendimientos muy altos. Por lo tanto, las proteínas que no necesitan ninguna MPT pueden expresarse de forma segura en E. coli.
Los Fab, que son la parte del fragmento de unión a antígeno de los mAb, no necesitan expresarse en sistemas de mamífero ya que no contienen los sitios de glucosilación presentes en la porción Fc del anticuerpo. Por tanto, los Fab habitualmente se expresan en un sistema de E. coli. Durante los años 80 y 90, varios investigadores intentaron la expresión de Fab en E. coli. PlückthunA et. al., 1990Behring Inst. Mitt. (87):48-55 son algunos de los primeros investigadores que informaron la secreción de anticuerpos Fab a partir de E. coli. Williamson R.A. et. al., 1991 Biochem J. 277 (Pt 2):561-3 informaron el uso de vectores del bacteriófago lambda para la expresión de moléculas Fab en un sistema de presentación en fagos en E. coli. para la producción de Fab, de anticuerpo bivalente o de fragmentos de anticuerpo quimérico en E. coli. Además, también se produjo el Fab en E. coli como cuerpos de inclusión mal plegados, y después se los replegó para obtener la molécula funcional y, de este modo, se obtuvo un aumento del 40 % en los rendimientos de anticuerpos.
La mayoría de los estudios mencionados anteriormente utilizaron un único promotor, es decir, phoA, para dirigir la expresión tanto de la cadena pesada como de la ligera. El sitio de unión al ribosoma (sur) presente entre las cadenas pesada y ligera dirige la transcripción y la traducción del segundo gen.
El documento US5648237 también utilizó una estrategia similar de promotor único (phoA) para expresar genes de Fab en E. coli, para obtener el producto secretado. El principal inconveniente de la estrategia anterior es que los niveles de expresión del segundo gen son habitualmente más bajos que los del primer gen, limitando así los rendimientos del Fab funcional.
La patente N.° WO03018771 divulga un procedimiento para la producción de un anticuerpo mediante dos unidades traduccionales distintas, que codifican respectivamente las cadenas ligera y pesada de dicho anticuerpo o fragmento, en donde ambas cadenas se expresan de manera secuencial, separando de este modo de forma específica la producción de las cadenas ligera y pesada, y permitiendo el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada.
La patente N.° EP1356052B1 divulga un método para producir anticuerpos completos en células procariotas. Hay una presencia de un primer promotor y un primer cistrón para producir la cadena ligera de inmunoglobulina y de un segundo promotor y un segundo cistrón para producir la cadena pesada de inmunoglobulina, en donde ambas cadenas se pliegan y ensamblan para formar una inmunoglobulina biológicamente activa.
El documento WO2003018771 divulga un procedimiento para la producción de un anticuerpo mediante dos unidades traduccionales distintas, que codifican respectivamente las cadenas ligera y pesada de dicho anticuerpo o fragmento, en donde ambas cadenas se expresan de manera secuencial, separando de este modo de forma específica la producción de las cadenas ligera y pesada, y permitiendo el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada.
Kim KJ et al. (Protein Science, 2004, 13:1698-1703) divulgan un sistema de vector bicistrónico de dos promotores para la producción de proteína en grandes cantidades y adecuado para un ensayo de cristalización extenso.
Sumario de la invención
La invención es como se define en las reivindicaciones.
En el presente documento se describe un sistema de expresión independiente de doble cistrón en un único vector para la producción de proteínas y péptidos recombinantes expresados como cuerpos de inclusión insolubles en células bacterianas.
Además, se describe un procedimiento de preparación de un sistema de expresión independiente de doble cistrón en un único vector que tiene dos promotores distintos para la producción de proteínas y péptidos recombinantes expresados como cuerpos de inclusión insolubles en células bacterianas.
Además, se describe un sistema de expresión independiente de doble cistrón en un único vector que tiene dos promotores distintos para la producción de fragmentos de anticuerpos expresados como cuerpos de inclusión insolubles en células bacterianas.
Además, se describe un sistema de expresión independiente de doble cistrón en un único vector que tiene dos promotores distintos para la producción de un fragmento de anticuerpos Fab recombinante, expresado como cuerpos de inclusión insolubles en células bacterianas.
Además, se describe un sistema de expresión independiente de doble cistrón en un único vector que tiene dos promotores distintos para la producción de péptidos recombinantes expresados como cuerpos de inclusión insolubles en células bacterianas.
El sistema de expresión cistrónico doble puede comprender:
a) un primer cistrón que comprende un promotor unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés;
b) un segundo cistrón que comprende un promotor unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés;
en donde el primer y segundo cistrones se sitúan en un único vector y expresan una secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés como cuerpos de inclusión en las células bacterianas. Además, se describe un vector cistrónico doble que comprende un promotor unido operativamente a un sitio de clonación múltiple que contiene un gen de interés, un sitio de unión al ribosoma y un terminador.
Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un anticuerpo o un fragmento utilizando un sistema de expresión cistrónico doble como se describe en las reivindicaciones.
Los detalles expuestos a continuación son solo de naturaleza ilustrativa y no pretenden limitar el ámbito de la invención. Otras características, objetos y ventajas de las invenciones serán evidentes a partir de la descripción.
Breve descripción de las figuras adjuntas
Figura 1; ilustra la fórmula del vector bicistrónico
Figura 2; ilustra el mapa vectorial del clon pET21a-HC-LC
Figura 3; ilustra el análisis por SDS PAGE de la fracción de sedimento insoluble del clon E. coli BL21A1 junto con controles y el producto de referencia
Figura 4; ilustra el análisis por RP-HPLC (forma siglada de reversed phase-high performance liquid chromatography, cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa) de muestras de CI solubilizados, observándose picos de la CP y la CL en el clon en comparación con la molécula de Fab reducida
Figura 5; ilustra las ejecuciones de HPLC para separar el pico de la cadena pesada de otras proteínas Figura 6; ilustra un aumento significativo de la expresión del clon SAK-Lira en la construcción cistrónica doble en comparación con el clon de cistrón único en la línea celular E. coliBL21 A1.
Figura 7; ilustra el mapa vectorial de pBAD24M-LC
Descripción detallada de la invención
Definiciones:
Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de interés" se refiere en el presente documento a cualquier polipéptido, incluyendo proteínas y péptidos usados en la industria bioterapéutica o con fines de diagnóstico o investigación.
Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia polinucleotídica que codifica una proteína de interés" como se usa en el presente documento incluye un ADN que codifica un gen, preferentemente un gen heterólogo que expresa el polipéptido.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "proteína y péptido recombinante" se refieren a una proteína o péptido que se produce mediante la expresión de ADN recombinante dentro de células vivas.
Como se usa en el presente documento, los términos "Fab" y "anticuerpo" se usan indistintamente debido a que el anticuerpo comprende dos partes, es decir, la región Fab y la Fc.
Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ADN utilizada como vehículo para portar artificialmente material genético extraño a una célula bacteriana, donde puede replicarse y expresarse. Como se usa en el presente documento, el término "cistrón" se refiere a una sección de ADN que contiene el código genético de un único polipéptido y funciona como una unidad hereditaria.
Como se usa en el presente documento, la expresión "expresión independiente de doble cistrón" se refiere a dos cistrones distintos que se utilizan para expresar dos proteínas iguales o distintas de forma independiente.
Como se usa en el presente documento, el término "igual" es intercambiable con idéntico o similar.
La expresión "sistema de expresión cistrónica doble" como se usa en el presente documento incluye una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido a expresar y secuencias que controlan su expresión, tal como un promotor y, opcionalmente, una secuencia potenciadora. El promotor está unido operativamente al gen a expresar, es decir, una unidad de transcripción, o está separado del mismo mediante ADN intercalado, tal como por ejemplo por la región 5' no traducida del gen heterólogo.
Preferentemente, el sistema de expresión está flanqueado por uno o más sitios de restricción adecuados, para permitir la inserción del casete de expresión en un vector y/o su escisión de un vector. Por lo tanto, el sistema de expresión divulgado puede utilizarse para la construcción de un vector de expresión, en particular de un vector de expresión bacteriana. Como se usa en el presente documento, el término "promotores" se refiere a una región reguladora de ADN que habitualmente se encuentra corriente arriba de un gen, proporcionando un punto de control para una transcripción génica regulada.
Como se usa en el presente documento, la expresión "unido operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ADN, en particular de secuencias genéticas a expresar y las secuencias que controlan su expresión.
Como se usa en el presente documento, la expresión "péptidos pequeños" o "péptidos" se refiere a péptidos que varían de 2 a 10 kDa, utilizados en la industria bioterapéutica y con fines de diagnóstico e investigación, como Liraglutida, exanetida, PTH, etc.
La invención se refiere a un procedimiento como se describe en las reivindicaciones.
En el presente documento se describe un sistema de expresión cistrónico doble para la producción de una diversidad de proteínas recombinantes de interés. En determinada realización, el sistema de expresión cistrónico doble comprende dos cistrones que tienen un promotor unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés y un terminador.
En determinada divulgación, el sistema de expresión cistrónico doble comprende dos cistrones que expresan la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés que se colocan en un solo vector.
En una divulgación, el sistema de expresión cistrónico doble comprende;
a) un primer cistrón que comprende un promotor unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés;
b) un segundo cistrón que comprende un promotor unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés;
en donde el primer y segundo cistrones se sitúan en un único vector y expresan una secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés como cuerpos de inclusión formados en la célula hospedadora.
En una divulgación, el promotor puede seleccionarse de promotor de T7, promotor de arabinosa phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, trp, trc, preferentemente el promotor de T7 y el promotor de arabinosa. En determinada realización, el sistema de expresión cistrónico doble comprende dos cistrones que expresan la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés bajo el control de dos promotores. En una realización, ambos promotores controlan la expresión de una secuencia polinucleotídica que codifica la misma proteína de interés. En otra realización, ambos promotores controlan la expresión de la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de interés, con una longitud de aminoácidos o propiedades fisicoquímicas distintas.
En determinada realización, la proteína de interés puede seleccionarse de péptidos y proteínas.
En alguna realización, las proteínas pueden expresarse en un vector bicistrónico. La proteína comprende un anticuerpo o fragmento del mismo. El fragmento de anticuerpo puede expresarse en el sistema de expresión bicistrónico. El fragmento de anticuerpo puede seleccionarse de cadenas pesadas y ligeras de Fab de anticuerpos u otros fragmentos de anticuerpos, tales como scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, Bis-scFv, minicuerpos Fab2 (biespecíficos), Fab3 (triespecífico). En una realización preferente, el sistema de expresión bicistrónico expresa la secuencia polinucleotídica que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpo que forman un anticuerpo Fab. En tal realización, el anticuerpo Fab muestra afinidad para el receptor de VEGF y dicho anticuerpo Fab es Ranibizumab. En otra divulgación, la proteína puede seleccionarse de, pero sin limitación, G-CSF, IFN, eritropoyetina, insulina y sus variantes, PTH (aa 1-84), FSH, LH, GH y proteína disulfuro isomerasa (PDI).
En una divulgación, los péptidos pueden expresarse en vector bicistrónico. Los péptidos comprenden una secuencia de aminoácidos que se selecciona de al menos, de menos de 40 aminoácidos o preferentemente menos de 31 aminoácidos, o más preferentemente menos de 10 aminoácidos. En determinada realización, el peso molecular del péptido se selecciona de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 kDa. El péptido puede seleccionarse de, pero sin limitación, análogos de péptido GLP-1 tales como Liraglutida o péptido Exendina, o de péptido GLP-2 como teduglutida y PTH (aa 1-34) e insulina. En otra realización preferente, el sistema de expresión bicistrónico expresa una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido agonista de GLP-1. En tal realización, el péptido GLP-1 es Liraglutida.
En otra realización, ambos promotores controlan independientemente la expresión de una cadena pesada o una cadena ligera de anticuerpo que tienen distintas longitudes de aminoácidos y propiedades fisicoquímicas.
En una divulgación, el sistema de expresión cistrónico doble comprende:
a) el primer cistrón comprende el promotor de T7 unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica la cadena pesada de anticuerpo;
b) el segundo cistrón comprende el promotor de arabinosa unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica la cadena ligera de anticuerpo;
En donde el primer y segundo cistrones se colocan en un único vector y expresan la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo como cuerpos de inclusión formados en la célula hospedadora.
En tal realización, la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpo comprenden la secuencia de nucleótidos de la secuencia de n.° de ID I y la secuencia de n.° de ID 2, o la secuencia de aminoácidos de la secuencia de n.° de ID 3 y la secuencia de número de ID 4.En algunas realizaciones, la posición del primer y segundo cistrones es intercambiable, en donde el segundo cistrón puede clonarse en el vector en la posición del primer cistrón y el primer cistrón puede posicionarse en el segundo cistrón. La cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo se expresan independientemente como cuerpos de inclusión y pueden tratarse adicionalmente para obtener anticuerpo Fab que muestre afinidad para el receptor de VEGF y dicho anticuerpo Fab es Ranibizumab.
En determinada realización, la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpo se expresan, opcionalmente, en combinación con un péptido señal, preferentemente pelB. El péptido señal dirige la expresión de la proteína en el espacio periplásmico de la célula hospedadora.
En una realización, el sistema de expresión cistrónico doble en un único vector que tiene dos promotores distintos, los promotores de arabinosa y de T7 que regulan la producción de, respectivamente, las cadenas ligera y pesada de fragmentos Fab recombinantes, respectivamente, y que tienen ambos una etiqueta pelB, se producen como cuerpos de inclusión insolubles en el espacio periplásmico de E. coli.
En determinada realización, la cadena pesada o la cadena ligera de anticuerpo se expresan, opcionalmente, en combinación con un regulador, preferentemente el gen AraC, para aumentar adicionalmente la expresión de la proteína.
El sistema de expresión cistrónico doble proporciona la expresión equimolar de la proteína de interés. La expresión equimolar es muy conveniente para obtener la proteína de interés con una calidad y cantidad adecuadas. Depende de la relación de la cadena pesada y ligera o de la relación de la subunidad del polipéptido clonado en el vector. En determinada realización, la cadena pesada y la cadena ligera se clonan en una relación adecuada que comprende que la cadena pesada sea al menos igual o mayor que la cadena ligera, para obtener la expresión equimolar de la cadena pesada y la ligera. La cadena pesada y la cadena ligera se clonan en una relación seleccionada de 1:5:0,7 a 1:1, que incluye 1:3:0,8, 1:2:0,9, 1:2:1 1:1.
En una realización, el sistema de expresión cistrónico doble comprende la secuencia de nucleótidos como se expone en la secuencia de n.° de ID 19.
En otra divulgación, el sistema de expresión cistrónico doble que comprende:
a) el primer cistrón comprende el promotor de T7 unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica el péptido;
b) el segundo cistrón comprende el promotor de arabinosa unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica el péptido;
en donde el primer y segundo cistrones se sitúan en un único vector y expresan el péptido como cuerpos de inclusión formados en la célula hospedadora.
En tal divulgación, el péptido es un análogo de GLP-1 que comprende la secuencia de nucleótidos como se expone en la secuencia de n.° de ID 6 que codifica el péptido agonista de GLP-1, que es Liraglutida que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia de n.° de ID 7.
En determinada realización, el péptido puede expresarse, opcionalmente, con un péptido señal o regulador/potenciador conocido por el experto.
En determinada divulgación, el péptido puede expresarse, opcionalmente, con un compañero de fusión o una etiqueta de fusión para evitar la degradación del péptido. El compañero de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de 30 aminoácidos a 300 aminoácidos. El compañero de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de aproximadamente de 50 aminoácidos, 100 aminoácidos, aproximadamente 136 aminoácidos, aproximadamente 175 aminoácidos, aproximadamente 250 aminoácidos, 300 aminoácidos, preferentemente, aproximadamente 136 aminoácidos. La etiqueta de fusión puede seleccionarse de, pero sin limitación, etiqueta de histidina, glutatión-s-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa, NusA, tiorredoxina (TRX), polihistidina (HIS), pequeño modificador similar a ubiquitina (SUMO, forma siglada de small ubiquitin-like modifier) y el gen de la ubiquitina (Ub) y la estafiloquinasa (SAK). En una realización preferente, la etiqueta de fusión es el gen de la SAK. El uso detallado del gen de la SAK como etiqueta de fusión con una proteína de interés se divulga en el documento US8853380.
En alguna realización, el sistema de expresión bicistrónico comprende adicionalmente un marcador de selección que se selecciona de ampicilina, kanamicina, preferentemente ampicilina.
En otra divulgación, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de una proteína de interés que comprende las etapas de:
(i) transformar la célula hospedadora con un único vector que consiste esencialmente en un sistema de expresión cistrónico doble;
(ii) cultivar la célula transformada en un medio adecuado para expresar la proteína de interés, en donde el primer y el segundo cistrón expresan la proteína de interés en cuerpos de inclusión;
(iii) realizar la solubilización de los cuerpos de inclusión;
(iv) realizar el replegamiento de la proteína de interés.
En una divulgación, el sistema de expresión bicistrónico se transfecta en la célula hospedadora bacteriana adecuada para expresar la proteína de interés. La célula hospedadora bacteriana adecuada es E. coli, en la que la proteína de interés se expresa en forma de cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión son la sustancia insoluble formada en el periplasma o citoplasma de E. coli. Los cuerpos de inclusión pueden aislarse, solubilizarse y las proteínas de interés pueden recuperarse en forma activa mediante las técnicas bien conocidas en la técnica.
En una realización, las cadenas pesadas y ligeras de los Fab de los anticuerpos u otros fragmentos de anticuerpos tales como scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, Bis-scFv, minicuerpos Fab2 (biespecíficos), Fab3 (triespecífico), se expresaron como cuerpos de inclusión insolubles en el espacio periplásmico de E. coli mediante la construcción de dos cistrones independientes en un único vector que tiene dos promotores distintos, los promotores de arabinosa y de T7. Los dos promotores distintos, es decir, el promotor de T7 y el promotor de arabinosa, ayudaron en la expresión de las cadenas pesada y ligera de la molécula del Fab, respectivamente. Las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se produjeron como cuerpos de inclusión no funcionales en la célula bacteriana, es decir, E. coli, las que posteriormente se extraen, repliegan y purifican.
En una realización de la invención, el cistrón comprende como tal que cada gen (cadena pesada y ligera) tenga sus propio promotor y terminador en un único vector. La cadena pesada se clonó bajo el control del promotor de T7 mientras que la cadena ligera se clonó bajo el control del promotor de arabinosa. Ambas cadenas estaban precedidas por la etiqueta pelB de secuencia señal, para obtener el producto en el espacio periplásmico de la membrana bacteriana.
La ventaja del sistema de expresión bicistrónico es que tanto el de arabinosa como el de T7 son fuertes promotores, se obtiene una elevada expresión de las cadenas ligera y pesada a partir de un solo procedimiento de fermentación en lugar de fermentaciones separadas con clones de la cadena ligera y la pesada. El sistema de expresión de doble cistrón simplifica la caracterización y el mantenimiento de un banco de células único en lugar de bancos de células separados para los clones de la cadena ligera y la pesada. Además, los cuerpos de inclusión así obtenidos son relativamente puros cuando se extraen del espacio periplásmico de las células bacterianas. El alto nivel de expresión y las formas mucho más puras de las cadenas ligera y pesada obtenidas como cuerpos de inclusión son relativamente más fáciles de plegar en Fab funcionales ex vivo, aumentando significativamente, de este modo, el rendimiento del producto.
Otra ventaja del sistema es que una proteína de interés puede clonarse y expresarse bajo los promotores de arabinosa y de T7, y el nivel de expresión de la proteína puede aumentarse significativamente.
Los ejemplos divulgados a continuación son solo con fines ilustrativos de la invención y no pretenden ser limitantes. Ejemplo 1: Clonación de la cadena pesada en el vector pET21a
La secuencia de ADN utilizada para la clonación de la cadena pesada y la ligera de fragmentos Fab se proporciona en las secuencias de n.° de ID 1 y 2, respectivamente. El inserto de la cadena pesada se amplificó a partir de ADN sintético utilizando cebadores específicos de genes. Los cebadores se diseñan de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Después, el producto de PCR de la cadena pesada se digirió con las enzimas Ndel-Hindlll y se ligó al vector pET21a digerido con las mismas enzimas. Los clones se exploraron mediante PCR de colonias y se confirmaron mediante análisis de restricción. El clon resultante se designó pET21a-HC. El vector recombinante se introdujo en la línea celular BL21A1 y se verificó la expresión de la cadena pesada.
Ejemplo 2: Clonación de la cadena ligera en el vector pBAD24M
El inserto de la cadena ligera se amplificó a partir de ADN sintético utilizando cebadores específicos del gen. Los cebadores están diseñados de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. La cadena ligera amplificada se digirió con las enzimas Ndel-Hindlll y se ligó al vector pBAD24M digerido (disponible en el laboratorio) en los mismos sitios. Los clones se exploraron mediante PCR de colonias y se confirmaron mediante análisis de restricción. El clon resultante se designó pBAD24M-LC. El vector recombinante se introdujo en la línea celular BL21A1 y se verificó la expresión de la cadena ligera.
Ejemplo 3: Construcción de dos cistrones independientes en el mismo vector
Los cebadores se diseñaron para amplificar la cadena ligera junto con el promotor de arabinosa, un terminador y el gen araC. Los cebadores están diseñados de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Los cebadores añadieron un enlazador de Bglll al producto amplificado. El vector pET21a tenía un único sitio Bglll corriente arriba del promotor de T7. El casete de expresión de la cadena ligera se amplificó a partir del pBAD24M como molde con los cebadores específicos para el vector, y se clonó en el clon pET21a-HC en el sitio Bglll. El clon se confirmó mediante digestión de restricción y secuenciación. El clon final se designó pET21a-HC-LC y el clon adecuado se seleccionó basándose en la expresión. El mapa de clon de pET21a-HC-LC se presenta en la Figura 2.
El clon así generado contiene todos los segmentos necesarios para la regulación independiente y la expresión de las cadenas pesada y ligera.
Ejemplo 4: Análisis de expresión
La línea celular E. coliBL21 A1 se utilizó como hospedador de expresión. Aparte de BL21 A1, se utiliza BL21 DE3 o cualquier otra línea celular que contenga el promotor de T7 en el genoma. Las células BL21 A1 se transformaron utilizando el clon seleccionado anteriormente junto con pET21a-HC y pBAD24M-LC como controles. La cadena pesada se indujo mediante IPTG al tiempo que la cadena ligera se indujo mediante arabinosa. La concentración del inductor fue de arabinosa 13 mM e IPTG 1 mM, y la inducción se realizó cuando la DO600 del cultivo fue de ~ 1. Las células se recogieron 4 horas posinducción. El estudio se realizó en matraces de agitación. El material recogido obtenido se lisó con perlas y se centrifugó para separar las fracciones soluble e insoluble. Las muestras se cargaron en geles de SDS PAGE al 12 % para verificar la expresión. El análisis por gel SDS PAGE se muestra en la Figura 3. Se cargó ranibizumab reducido en el Carril 5 de la Figura 3 para confirmar la expresión de las cadenas ligeras y pesadas reducidas.
El análisis por SDS PAGE demostró la expresión de ambas cadenas en la fracción de sedimento insoluble y la misma se confirmó mediante análisis por RP-HPLC, en donde los tiempos de retención de las cadenas ligera y pesada del producto de referencia correspondieron a los tiempos de retención del producto propio. Los controles utilizados fueron la molécula Fab reducida (producto de referencia) y los productos del clon pET21a-HC y el clon pBAD24M. Por lo

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para la producción de un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende las etapas de: (i) transformar una célula hospedadora bacteriana con un único vector que consiste en un sistema de expresión cistrónico doble;
(ii) cultivar las células bacterianas transformadas en medio adecuado para expresar el anticuerpo o un fragmento del mismo como cuerpos de inclusión;
(iii) realizar la solubilización de dichos cuerpos de inclusión;
(iv) realizar el replegamiento del anticuerpo o el fragmento del mismo;
en donde el sistema de expresión cistrónico doble comprende:
a) un primer cistrón que comprende un promotor de T7 unido operativamente con una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena pesada del anticuerpo o el fragmento de la misma;
b) un segundo cistrón que comprende un promotor de arabinosa unido operativamente con una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena ligera del anticuerpo o el fragmento de la misma;
en donde el primer y segundo cistrones se sitúan en el vector único y expresan el anticuerpo o fragmento del mismo como cuerpos de inclusión; y
en donde la expresión de la cadena pesada se induce mediante IPTG, al tiempo que la expresión de la cadena ligera se induce mediante arabinosa, de tal manera que la cadena pesada y la cadena ligera se expresan a niveles de expresión equimolares.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula hospedadora bacteriana es E. coli.
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sistema de expresión cistrónico doble comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 19.
4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el procedimiento es para la producción de Ranibizumab y comprende las etapas de:
(i) transformar E. coli con un único vector que consiste en el sistema de expresión cistrónico doble;
(ii) cultivar la célula transformada en un medio adecuado, en donde el primer y el segundo cistrón expresan las cadenas pesada y ligera de Ranibizumab como cuerpos de inclusión;
(iii) realizar la solubilización de dichos cuerpos de inclusión;
(iv) realizar el replegamiento de dichos cuerpos de inclusión en condiciones adecuadas para obtener un Ranibizumab funcional;
en donde el primer cistrón comprende un promotor de T7 unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica la cadena pesada de ranibizumab, y el segundo cistrón comprende un promotor de arabinosa unido operativamente con la secuencia polinucleotídica que codifica la cadena ligera de ranibizumab; y
en donde se utiliza IPTG I mM para inducir la expresión de la cadena pesada de Ranibizumab al tiempo que se utiliza Arabinosa 13 mM para inducir la expresión de la cadena ligera de Ranibizumab, de tal manera que la cadena pesada y la cadena ligera se expresan a niveles de expresión equimolares.
ES15745247T 2014-07-09 2015-07-09 Sistema de expresión bacteriano cistrónico doble Active ES2808906T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN2245MU2014 2014-07-09
PCT/IB2015/055189 WO2016005931A1 (en) 2014-07-09 2015-07-09 Dual cistronic bacterial expression system

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2808906T3 true ES2808906T3 (es) 2021-03-02

Family

ID=53773474

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15745247T Active ES2808906T3 (es) 2014-07-09 2015-07-09 Sistema de expresión bacteriano cistrónico doble

Country Status (20)

Country Link
US (2) US10329571B2 (es)
EP (1) EP3167065B1 (es)
JP (1) JP6748061B2 (es)
CN (1) CN106661588B (es)
AU (1) AU2015287296A1 (es)
BR (1) BR112017000389A2 (es)
CA (1) CA2954594A1 (es)
CY (1) CY1123303T1 (es)
DK (1) DK3167065T3 (es)
ES (1) ES2808906T3 (es)
HR (1) HRP20200996T1 (es)
HU (1) HUE050300T2 (es)
LT (1) LT3167065T (es)
MX (1) MX378585B (es)
PH (1) PH12017500047A1 (es)
PL (1) PL3167065T3 (es)
PT (1) PT3167065T (es)
RU (1) RU2732148C2 (es)
SI (1) SI3167065T1 (es)
WO (1) WO2016005931A1 (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6435770B2 (ja) * 2014-01-21 2018-12-12 東ソー株式会社 シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれを用いたタンパク質の製造方法
WO2017021819A1 (en) * 2015-07-31 2017-02-09 Dr. Reddy’S Laboratories Limited Process for preparation of protein or peptide
JP7282689B2 (ja) * 2017-05-19 2023-05-29 カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ リフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブの製造方法
WO2019038338A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 Sandoz Ag PROTEIN EXPRESSION SYSTEM WITH MULTIPLE GENIC COPIES
DK3818073T3 (da) * 2018-07-06 2026-02-23 Wacker Chemie Ag Bakteriestamme til frigivelse af rekombinant protein i en gæringsproces
JP7762935B2 (ja) * 2019-01-31 2025-10-31 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 組換え細胞、発現構築物、及び組換えタンパク質の製造方法
US12371482B2 (en) * 2019-04-02 2025-07-29 Council Of Scientific & Industrial Research Cloning and expression of in vivo refolded antibody fragment
CN114774453B (zh) * 2022-03-14 2023-04-21 湖北大学 一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用
CN116334118A (zh) * 2023-02-23 2023-06-27 四川大学 一种原核体系中单启动子控制多个颗粒蛋白亚基组装同源等同体在胞内恒定比例表达并共自组装的方法
CN118995554B (zh) * 2024-09-09 2025-07-04 江南大学 一种大肠杆菌整合表达体系及其在酶高效表达中的应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
WO2002061090A2 (en) * 2000-12-14 2002-08-08 Genentech, Inc. Prokaryotically produced antibodies and uses thereof
CN100513414C (zh) * 2001-08-27 2009-07-15 杰南技术公司 进行抗体表达和装配的系统
ES2820837T3 (es) * 2006-07-10 2021-04-22 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos scFv que pasan las capas epitelial y/o endotelial
RU2413769C1 (ru) * 2009-12-24 2011-03-10 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET-32a, КОДИРУЮЩАЯ ГЕН ЛИГАНД-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА РЕЦЕПТОРА II ТИПА ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА-β ЧЕЛОВЕКА (TβRII), ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ СЛИТНОГО БЕЛКА ТИОРЕДОКСИН/TβRII И СПОСОБ РЕНАТУРАЦИИ И ОЧИСТКИ ЦЕЛЕВОГО БЕЛКА TβRII
GB201002730D0 (en) * 2010-02-18 2010-04-07 Uni I Oslo Product
WO2011151714A1 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Lupin Limited Modified sak gene for the production of recombinant proteins
AU2014225272B2 (en) * 2013-03-08 2015-10-22 Neuclone Biologics Pty Ltd A cell expression system
EP2992021B1 (en) * 2013-04-30 2020-07-22 Intas Pharmaceuticals Limited Novel cloning, expression & purification method for the preparation of ranibizumab
TW201534726A (zh) * 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CY1123303T1 (el) 2021-12-31
PT3167065T (pt) 2020-07-01
BR112017000389A2 (pt) 2018-01-23
AU2015287296A1 (en) 2017-02-02
MX2017000332A (es) 2017-07-28
EP3167065A1 (en) 2017-05-17
US10329571B2 (en) 2019-06-25
JP2017520261A (ja) 2017-07-27
HUE050300T2 (hu) 2020-11-30
WO2016005931A1 (en) 2016-01-14
CN106661588A (zh) 2017-05-10
PH12017500047A1 (en) 2017-05-22
US20170159060A1 (en) 2017-06-08
CA2954594A1 (en) 2016-01-14
PL3167065T3 (pl) 2020-11-16
JP6748061B2 (ja) 2020-08-26
RU2732148C2 (ru) 2020-09-11
MX378585B (es) 2025-03-10
LT3167065T (lt) 2020-07-27
DK3167065T3 (da) 2020-07-06
US20190309313A1 (en) 2019-10-10
US11365418B2 (en) 2022-06-21
HRP20200996T1 (hr) 2021-01-08
SI3167065T1 (sl) 2020-09-30
EP3167065B1 (en) 2020-03-25
CN106661588B (zh) 2020-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2808906T3 (es) Sistema de expresión bacteriano cistrónico doble
ES2732907T3 (es) Procedimiento de expresión
CN101445559B (zh) 三聚体可溶抗体与其产生及使用的方法
US9914770B2 (en) Cloning, expression and purification method for the preparation of ranibizumab
JP2015531751A (ja) 選択的対である軽鎖および重鎖を含む免疫グロブリン構築物
CN111936514A (zh) 多价抗体
US10113193B2 (en) Method for optimizing the assembly and production of hetero-multimeric protein complexes
CN113614113A (zh) 含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途
WO2015015518A2 (en) Process for production of insulin and insulin analogues
ES2331573T3 (es) Vector de expresion para la secrecion de un fragmento de anticuerpo usando una secuencia señal de e. coli y procedimiento para la produccion en serie del fragmento de anticuerpo.
Pasupuleti et al. Genetic code expansion in E. coli enables production of a functional ‘ready-to-click’T cell receptor-specific scFv
Zhang et al. Production of soluble and functional engineered antibodies in Escherichia coli improved by FkpA
US20160186190A1 (en) Expression vector for production of recombinant proteins in prokaryotic host cells
Ye et al. High-level expression and characterization of an anti-VEGF165 single-chain variable fragment (scFv) by small ubiquitin-related modifier fusion in Escherichia coli
Kuravsky et al. Modular design of bi-and multi-specific knob domain fusions
ES2792350T3 (es) Secuencia señal secretora de organismos eucariotas para la expresión recombinante en organismos procariotas
KR102603693B1 (ko) 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 vlrb 단백질에 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도
HK1246822A1 (zh) 双顺反子细菌表达系统
RU2115729C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая препроинсулин человека
US10465220B2 (en) Expression process
HK1246822B (zh) 双顺反子细菌表达系统
CN106661117A (zh) IgG杂合型抗TNFα和IL‑17A双特异性抗体
US20250312452A1 (en) Antibody targeting claudin18.2 and its applications
CN105198999A (zh) 一种融合蛋白、其制备方法及其应用
KR20250115936A (ko) 수용체 이량체화를 유도하는 작용제 항체를 스크리닝 하는 방법