ES2809482T3 - Composición adecuada para proteger microorganismos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un material soporte formado por un polisacárido, al menos un antioxidante y una combinación de aminoácidos seleccionados entre cisteína y alanina; cisteína, lisina y alanina; lisina y arginina; cisteína y arginina; cisteína, lisina y arginina; lisina, alanina y arginina; y cisteína, arginina y alanina; de modo que los aminoácidos lisina, alanina y arginina se encuentran en una proporción del 8 al 20% en peso respecto al peso seco total de la composición y la proporción del contenido de cisteína está comprendida entre el 2 y el 10% en peso respecto al seco peso total de la composición.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición adecuada para proteger microorganismos

Ám bito de la presente invención

La presente invención se refiere a una composición que contiene al menos un vehículo constituido por un polisacárido, al menos un antioxidante y al menos un aminoácido seleccionado entre cisteína, lisina, alanina y arginina. También se refiere al uso de dicha composición para la protección de microorganismos durante el secado, el almacenamiento y/o la reconstitución, a un cultivo en polvo y a un proceso de elaboración del cultivo en polvo.

Antecedentes de la presente invención

Los cultivos en polvo beneficiosos y en particular los cultivos probióticos en polvo se añaden a una amplia gama de productos estables al almacenamiento. Para la mayoría de productos con baja proporción de humedad que contienen cultivos probióticos en polvo se declara una vida útil de al menos 18 meses. Durante este periodo debe garantizarse una cantidad mínima de microbios vivos en el producto. Por este motivo, la dosificación de cultivo en polvo al producto debe tener en cuenta la pérdida de viabilidad microbiana durante el almacenamiento. Por tanto es importante encontrar formas de proteger los microorganismos durante el procesamiento y el almacenamiento, con el fin de favorecer su supervivencia.

Las bacterias experimentan diversas sobrecargas durante el secado a temperaturas elevadas, como calor y tensión de cizallamiento en el secador, o estrés osmótico por deshidratación, por ejemplo durante el secado por pulverización. Estas tensiones pueden tener efectos perjudiciales o incluso letales sobre la bacteria. Mediante la adición de agentes protectores, las bacterias pueden estabilizarse en cierta medida contra dichas tensiones. Durante el almacenamiento las bacterias sufren de nuevo estrés. Además, al reconstituir el polvo con líquido las bacterias también se exponen al estrés osmótico.

Los agentes protectores son capaces de estabilizar los microorganismos durante el secado, el almacenamiento y/o la reconstitución. El efecto protector durante el secado va casi siempre acompañado de un efecto estabilizador durante el almacenamiento y la reconstitución, porque, si los microorganismos están mejor protegidos durante el secado, se dañan menos y en consecuencia son más resistentes durante el almacenamiento y la reconstitución.

En la literatura se han propuesto numerosos ingredientes como agentes protectores. Así, por ejemplo, en la patente JP3504365 se describe un agente protector para la liofilización de bacterias que comprende una mezcla de al menos tres ingredientes seleccionados entre ácido aspártico, arginina, ácido glutámico, prolina, lisina, leucina y metionina. Sin embargo los procesos de liofilización son de naturaleza muy diferente de los de secado con gas caliente, como el secado por pulverización, y exponen la biomasa a diferentes factores de estrés. Por lo tanto, los agentes protectores divulgados en los procesos de liofilización no sirven de ayuda para encontrar agentes protectores que sean adecuados para proteger microorganismos tales como las bacterias durante un proceso de secado con uso de gas caliente, como el secado por pulverización, y el subsiguiente almacenamiento y reconstitución.

Algunos documentos se refieren específicamente al secado de microorganismos por pulverización. Por ejemplo, en la patente EP1281752 B1 se describe un método de secado de células microbianas por pulverización. La atención se centra en el tamaño de las partículas de polvo obtenidas y en la baja temperatura empleada en el proceso de secado. En esta patente también se afirma que puede usarse un agente protector comúnmente conocido en el estado técnico. Aporta muchos ejemplos de posibles agentes protectores, en concreto vitaminas como el ácido ascórbico; aminoácidos tales como glutamina, ácido glutámico, cisteína, glicina, fenilalanina, serina o treonina; sacáridos o alcoholes de azúcar como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manita o maltitol; polisacáridos tales como oligosacáridos, ciclodextrina o dextrina; grasas tales como los ácidos grasos superiores obtenidos de la colza, soja, cacahuete, etc.; proteínas como las obtenidas de la leche de vaca, soja, etc. y proteínas degradadas como los péptidos; sales inorgánicas tales como el sulfato magnésico; y otros como el éster de ácido graso de sacarosa, ácido málico, ácidos nucleicos, extracto de levadura, leche descremada, peptona, gelatina, tanino, etc. Estos ingredientes pueden usarse solos o como cualquier combinación de los mismos. Esta patente no proporciona ninguna guía para seleccionar combinaciones particulares de ingredientes que tengan una actividad óptima.

Análogamente la patente US6010725 se refiere al secado de microorganismos por pulverización y a su supervivencia. Su aportación se centra en las condiciones que deben aplicarse durante el proceso de secado por pulverización. También afirma que se pueden usar diversos agentes protectores conocidos de la literatura y enumera como ejemplos ácido ascórbico, aminoácidos como lisina, cisteína y sus sales, glutamato sódico y glicina, proteínas o hidrolizados de proteicos, azúcares como lactosa, trehalosa, sacarosa, dextrina y maltodextrina, y grasas.

La patente EP1867713 A1 describe un método para mejorar la estabilidad al almacenamiento de microorganismos secos, tales como las bacterias de ácido láctico secadas, dejando que los microorganismos secos coexistan con una sal ácida del aminoácido L-arginina.

A pesar de las numerosas revelaciones de abundantes listas de ingredientes utilizables como agentes protectores, se necesita un mayor refinamiento de la búsqueda de combinaciones de ingredientes que tengan una actividad óptima para proteger los microorganismos durante los procesos de secado con gas caliente y el subsiguiente almacenamiento y reconstitución.

La presente invención resuelve ventajosamente los problemas mencionados anteriormente.

Resumen de la presente invención

En un primer aspecto la presente invención proporciona una composición formada por un material soporte que es un polisacárido, al menos un antioxidante y una combinación de aminoácidos seleccionada entre cisteína y alanina; cisteína, lisina y alanina;

lisina y arginina;

cisteína y arginina;

cisteína, lisina y arginina;

lisina, alanina y arginina; y

cisteína, arginina y alanina;

en la cual el contenido de cada uno de los aminoácidos lisina, alanina y arginina está comprendido en una proporción del 8 a 20% en peso respecto al peso seco total de la composición y el de cisteína en una proporción del 2 al 10% en peso respecto al peso seco total de la composición.

En un segundo aspecto, la presente invención ofrece el uso de una composición según la presente invención para la protección de microorganismos durante un proceso de secado con gas caliente y el subsiguiente almacenamiento y/o reconstitución.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un cultivo en polvo compuesto por microorganismos vivos y una matriz constituida por una composición según la presente invención, siendo la relación ponderal en seco matriz: microorganismo vivo de al menos 1.

En un cuarto aspecto, la presente invención ofrece un proceso para preparar un cultivo en polvo según la presente invención, que consiste en

a. producir una biomasa por fermentación con un microorganismo;

b. concentrar la biomasa obtenida en la etapa a);

c. acondicionar la biomasa concentrada con una solución acuosa de una composición de acuerdo con la presente invención; y

d. secar la biomasa acondicionada con gas caliente para formar un producto en polvo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: pérdida logarítmica de viabilidad de Bifidobacterium longum BL999 después del secado por pulverización y tras 2, 4, 6, 8 y 12 semanas de almacenamiento con Glucidex MD DE 47, lactosa, trehalosa, maltosa o sacarosa como agente protector, medida como en la prueba de preselección del ejemplo 1.

Figura 2: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 después del secado por pulverización y tras 2, 4, 6 y 8 semanas de almacenamiento con xilitol, sorbita, manita, lactitol, mioinositol o glicerol como agente protector, medida como en la prueba de preselección del ejemplo 1.

Figura 3: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 después del secado por pulverización y tras 2, 4, 6 y 8 semanas de almacenamiento con glutamato sódico, glutamina, arginina, alanina, lisina o cisteína como agente protector, medida como en la prueba de preselección del ejemplo 1.

Figura 4: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 después del secado por pulverización y tras 2, 4, 6 y 8 semanas de almacenamiento con caseinato sódico, aislado de proteína de suero de leche, aislado de proteína de suero de leche desnaturalizada por calor o gelatina como agente protector, medida como en la prueba de preselección del ejemplo 1.

Figura 5: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 después del secado por pulverización y tras 2, 4, 6, 8 y 12 semanas de almacenamiento con goma de acacia, carragenano A, pectina, goma guar o alginato como agente protector, medida como en la prueba de preselección del ejemplo 1.

Figura 6: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 después del secado por pulverización y tras 2, 4, 6, 8 y 12 semanas de almacenamiento con almidón resistente, fibras de trigo, raftilosa o raftilina como agente protector, medida como en la prueba de preselección del ejemplo 1.

Figura 7: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 después del secado por pulverización y tras 2, 4, 6, 8 y 12 semanas de almacenamiento con betaína HCL, carnitina o prolina como agente protector, medida como en la prueba de preselección del ejemplo 1.

Figura 8: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 después del secado por pulverización y tras 2 y 3 semanas de almacenamiento con lecitina, una mezcla de lecitina y aceite de maíz, una mezcla de lecitina y aceite de girasol o una mezcla de lecitina y aceite de soja como agente protector, medida como en la prueba de preselección del ejemplo 1.

Figura 9: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 después del secado por pulverización y tras 2, 4, 6, 8 y 12 semanas de almacenamiento con las variantes A hasta D y la referencia como agente protector, medida como en la prueba con combinaciones de ingredientes del ejemplo 1.

Figura 10: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 después del secado por pulverización y tras 2, 4, 6, 8 y 12 semanas de almacenamiento con las variantes E hasta H y la referencia como agente protector, medida como en la prueba con combinaciones de ingredientes del ejemplo 1.

Figura 11: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 tras 8 semanas de almacenamiento después del secado por convección de aire en las muestras 1, 5, 6 y 7 (todas conteniendo L-lisina, sola o junto con otro aminoácido escogido entre L-cisteína, L-alanina y L-arginina), medida como en el ejemplo 2.

Figura 12: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 tras 8 semanas de almacenamiento después del secado por convección de aire en las muestras 2, 5, 8 y 9 (todas conteniendo L-arginina, sola o junto con otro aminoácido escogido entre L-cisteína, L-alanina y L-lisina), medida como en el ejemplo 2.

Figura 13: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 tras 8 semanas de almacenamiento después del secado por convección de aire en las muestras 3, 6, 8 y 10 (todas conteniendo L-cisteína, sola o junto con otro aminoácido escogido entre L-arginina, L-alanina y L-lisina), medida como en el ejemplo 2.

Figura 14: pérdida logarítmica de viabilidad de B. longum BL999 tras 8 semanas de almacenamiento después del secado por convección de aire en las muestras 4, 7, 9 y 10 (todas conteniendo L-alanina, sola o junto con otro aminoácido escogido entre L-cisteína, L-arginina y L-lisina), medida como en el ejemplo 2.

Figura 15: recuentos celulares de Streptococcus thermophilus ST496 tras 4, 8 y 12 semanas de almacenamiento en las variantes I y J y en la referencia, medidos como en el ejemplo 3.

Figura 16: recuentos celulares de Lactobacillus rhamnosus LPR tras 4, 8 y 12 semanas de almacenamiento en las variantes K y L y en la referencia, medidos como en el ejemplo 4.

Figura 17: recuentos celulares de Bifidobacterium lactis BL818 tras 15, 30, 60, 90 y 180 días de almacenamiento en la variante M y en la referencia, medidos como en el ejemplo 5.

Descripción detallada de la presente invención

Definiciones

“Agente protector”: para los fines de la presente invención debe entenderse como “agente protector” una composición que sea efectiva para mejorar la viabilidad de un microorganismo vivo durante el secado, el almacenamiento o la reconstitución.

“Secado” o “secado con gas caliente”: para el propósito de la presente invención, “secado” y “secado con gas caliente” se usan indistintamente y se refieren a cualquier proceso que produzca la deshidratación de un concentrado hasta la obtención de un producto en polvo por efecto de un gas que tenga una temperatura superior a la temperatura ambiente. El gas puede estar bajo presión o a presión atmosférica. Estos procesos son, por ejemplo, secado por pulverización, secado atmosférico, secado por convección de aire o secado en lecho fluido. En una forma de ejecución más preferida, secado se refiere al secado por pulverización.

“Reconstitución”: para el propósito de la presente invención, la reconstitución se refiere a la disolución o suspensión de un polvo en un líquido tal como agua, en un medio de reconstitución específico como el utilizado en microbiología analítica, o en una bebida como leche o un zumo, por ejemplo. El líquido utilizado para la reconstitución puede ser frío o tibio. Preferiblemente se refiere a la reconstitución con agua.

Composición

La composición de la presente invención está constituida por al menos un material soporte que es un polisacárido, al menos un antioxidante y al menos un aminoácido seleccionado entre cisteína, lisina, alanina y arginina.

Preferiblemente, la composición de la presente invención no es una composición nutricional, preferiblemente no es una composición nutricional completa, es decir, no es una bebida o un producto alimenticio que proporcione nutrientes equilibrados para satisfacer las necesidades nutricionales del ser humano o animal que lo consuma, preferiblemente no es una composición nutricional que constituya una comida completa para un individuo que la consuma.

En una forma de ejecución preferida de la presente invención, la composición es un agente protector. Con mayor preferencia es un agente protector de microorganismos vivos, con mayor preferencia de bacterias vivas, sobre todo de bacterias probióticas vivas. Aún con mayor preferencia es un agente protector para proteger microorganismos vivos, tales como bacterias, durante el secado, el almacenamiento y/o la reconstitución. Sobre todo, se trata de un agente protector para proteger microorganismos vivos durante un proceso de secado con un gas caliente, tal como el secado por pulverización, durante el almacenamiento y/o durante la reconstitución.

El soporte es un polisacárido. Por ejemplo, el soporte puede ser maltodextrina, dextrina, ciclodextrina, almidón, un oligosacárido o celulosa. Preferiblemente es maltodextrina. Por ejemplo, se puede utilizar una maltodextrina que tenga un ED de 5 a 12.

El soporte constituye la mayor parte de la composición. Es esencial llevar a cabo un proceso de secado estable de la composición, por ejemplo, cuando la composición se seca con un microorganismo para formar un cultivo en polvo. El soporte permite, por ejemplo, realizar el secado por pulverización a temperaturas más bajas y evitar la adherencia de polvo en la torre de secado por pulverización.

Preferiblemente, el soporte está contenido en una proporción del 20-60% en peso, con mayor preferencia del 30-56% en peso respecto al peso seco total de la composición. En una forma de ejecución, el soporte está formado por un polisacárido, tal como se ha definido arriba.

El antioxidante puede ser cualquier tipo de antioxidante, como por ejemplo vitamina C, vitamina E, glutatión, coenzima Q10, p-caroteno, licopeno, vitamina A o un derivado de los mismos. Preferiblemente es vitamina C o un derivado de la misma, con mayor preferencia ascorbato sódico. En una forma de ejecución, el antioxidante no es ninguno de los aminoácidos cisteína, lisina, alanina y arginina, incluso con mayor preferencia, no es un aminoácido. El antioxidante es un componente esencial de la composición de la presente invención. Cuando se añade a los microorganismos vivos contribuye a su protección durante el secado, el almacenamiento y/o la reconstitución. Un antioxidante tal como el ascorbato sódico está contenido preferiblemente en una proporción del 13-50% en peso, con mayor preferencia del 20-40% en peso, respecto al peso seco total de la composición.

La composición contiene además al menos un aminoácido seleccionado entre cisteína, lisina, alanina y arginina. La composición contiene una combinación de al menos dos aminoácidos entre cisteína, lisina, alanina y arginina, con mayor preferencia una combinación de al menos tres de estos aminoácidos. La combinación de aminoácidos incluye lisina y/o cisteína. Los aminoácidos están preferiblemente en su forma enantiomérica L (L-cisteína, L-lisina, L-alanina y L-arginina).

El contenido total de aminoácidos está comprendido preferiblemente en una proporción del 3,5 al 37% en peso, con mayor preferencia del 3,5 al 34% en peso, sobre todo del 8 al 34% en peso respecto al peso seco total de composición. La proporción de lisina, alanina y arginina es respectivamente del 8-20% en peso, referido al peso seco total de la composición. La proporción de cisteína es del 2-10% en peso, con mayor preferencia del 2-8% en peso, referido al peso seco total de la composición. El empleo de cisteína en concentraciones más bajas que otros aminoácidos es ventajoso porque produce un beneficio sensorial. En concreto, al limitar la concentración de cisteína a un máximo del 10% en peso, preferiblemente a un máximo del 8% en peso, respecto al peso seco total de la composición, mejora el sabor de la composición, haciéndola más aceptable por parte de los consumidores.

Las combinaciones de aminoácidos incluyen

- cisteína y alanina;

- cisteína, lisina y alanina;

- lisina y arginina;

- cisteína y arginina;

- cisteína, lisina y arginina;

- lisina, alanina y arginina; y

- cisteína, arginina y alanina.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que la cisteína, la lisina, la arginina y la alanina, usadas preferiblemente en las proporciones antedichas, tienen efectos protectores superiores cuando se usan en un cultivo en polvo, porque de esta forma reducen la pérdida de microorganismos vivos durante el secado, el almacenamiento y/o la reconstitución del polvo.

El ejemplo 1 demuestra en particular que la cisteína, la lisina, la alanina y la arginina tienen un mejor efecto protector en comparación con todos los demás ingredientes individuales probados, incluidos otros aminoácidos como prolina, glutamato sódico o glutamina, así como otros varios tipos de sustancias y mezclas tales como azúcares, alcoholes de azúcar, proteínas, gomas, fibras y emulsiones. En el ejemplo 1, los ensayos con combinaciones de ingredientes también demuestran que se obtienen los mejores resultados cuando se usan estos aminoácidos.

Se observa un efecto sinérgico cuando los aminoácidos están combinados en la composición, en particular cuando lleva cisteína y/o lisina. De hecho, como se demuestra en el ejemplo 2, las composiciones que llevan dos aminoácidos, incluida la lisina y/o la cisteína, protegen mejor los microorganismos vivos durante el secado, el almacenamiento y/o la reconstitución que las composiciones que llevan un solo aminoácido, a igual concentración total de aminoácidos. El material soporte, el antioxidante y como mínimo un aminoácido seleccionado entre lisina, cisteína, alanina y arginina son los componentes fundamentales de la composición. La composición puede contener ingredientes adicionales. No obstante, los presentes inventores han descubierto que se consigue un mejor efecto protector cuando ciertos tipos de ingredientes se usan en concentración limitada o incluso se evitan. Por consiguiente es preferible que la concentración de lactosa e inositol en la composición esté comprendida en el intervalo del 0-10% en peso respecto al peso seco total de la composición. Es con mayor preferencia que la composición esté libre de lactosa e inositol. Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que estas composiciones con bajo contenido de lactosa e inositol tienen un efecto protector superior para los microorganismos vivos durante el secado, el almacenamiento y/o la reconstitución. Para el propósito de la presente invención se entiende como “inositol” cualquiera de sus estereoisómeros (mioinositol, escilo-inositol, muco-inositol, D-quiro-inositol, neo-inositol, L-quiro- inositol, alo-inositol, epi-inositol y cis-inositol). La forma más común de inositol es el mioinositol y, por lo tanto, en una forma de ejecución el inositol se define como mioinositol.

En una forma de ejecución preferida la concentración total de todos los ingredientes esenciales (vehículo, antioxidante y uno o más de los aminoácidos lisina, cisteína, alanina y/o arginina) está comprendida entre el 80 y el 100% en peso y la concentración total de ingredientes adicionales está comprendida entre el 0 y el 20% en peso, porcentajes que se refieren al peso seco total de la composición.

En una forma de ejecución más preferida de la presente invención, la composición consta esencialmente de al menos un vehículo, al menos un antioxidante y al menos un aminoácido escogido entre lisina, cisteína, alanina y arginina, tal como se ha definido en cualquiera de las formas de ejecución anteriores, preferiblemente en dichas proporciones. Con mayor preferencia, la composición consta de al menos un vehículo, al menos un antioxidante y al menos un aminoácido escogido entre lisina, cisteína, alanina y arginina, tal como se ha definido en cualquiera de las formas de ejecución anteriores, preferiblemente en dichas proporciones. Sobre todo consta de maltodextrina, ascorbato sódico y al menos un aminoácido escogido entre lisina, cisteína, alanina y arginina, tal como se ha definido en cualquiera de las formas de ejecución anteriores, preferiblemente en dichas proporciones.

Uso de la composición

La composición según cualquiera de las formas de ejecución arriba descritas se puede emplear ventajosamente para proteger microorganismos vivos durante un proceso de secado, como el secado por pulverización, el almacenamiento y/o la reconstitución. Preferiblemente, el almacenamiento y/o la reconstitución son posteriores a un proceso de secado, preferiblemente a un proceso de secado por pulverización. Es preferible que el agente protector tenga la capacidad de limitar la pérdida de microorganismos vivos hasta un máximo de 1,5 log y con mayor preferencia menos de 1 log, durante un proceso de secado y el subsiguiente almacenamiento durante un período de 12 semanas a 37°C y lograr una vida útil de 12 meses a temperatura ambiente para un producto en forma de polvo.

La pérdida logarítmica de viabilidad absoluta puede variar dependiendo de la cepa microbiana, de la temperatura y del tiempo de almacenamiento y de la actividad acuosa del medio durante el almacenamiento, por ejemplo del producto al cual se incorpora el microorganismo. Independientemente de la pérdida logarítmica de viabilidad absoluta medida para una cepa particular, el efecto protector logrado por la presente invención supone una menor pérdida logarítmica de viabilidad de esta cepa microbiana respecto a la misma cepa microbiana secada, almacenada y/o reconstituida sin la composición de la presente invención, y preferiblemente también respecto a la misma cepa microbiana secada, almacenada y/o reconstituida con un agente protector constituido por el vehículo y el antioxidante solo (es decir, sin aminoácidos).

El microorganismo vivo puede ser cualquier tipo de microorganismo vivo. Preferiblemente, los microorganismos son bacterias, con mayor preferencia bacterias beneficiosas, por ejemplo bacterias probióticas. Las bacterias probióticas se definen como preparaciones de células bacterianas que tienen un efecto beneficioso sobre la salud o el bienestar del huésped (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. y otros “Probiotics: how should they be defined [Probióticos: cómo deberían definirse]’’ Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10).

Los microorganismos se consideran “vivos” cuando son capaces de multiplicarse en condiciones de cultivo controladas formando colonias o suspensiones o cuando se puede demostrar la actividad metabólica del microorganismo y/o la integridad de la membrana usando métodos conocidos por el especialista en la materia, como por ejemplo la citometría de flujo.

Los ejemplos aportados en la presente solicitud de patente demuestran que la composición de la presente invención protege diversas cepas microbianas durante el secado y el subsiguiente almacenamiento y reconstitución. Por lo tanto, el efecto no es específico de la cepa y se puede aplicar a una amplia gama de cepas microbianas.

Como ejemplos de bacterias que se pueden proteger con la composición de la presente invención cabe mencionar bifidobacterias, lactobacilos, lactococos, enterococos, estreptococos, Leuconostoc, Escherichia, propionibacterias o combinaciones de ellas, preferiblemente Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis, Lactobacillus helveticus, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Leuconostoc pseudomesenteroides, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus sakei, Streptococcus salivarius y/o sus mezclas, así como cualquiera de sus subespecies.

Como ejemplos de cepas bacterianas que pueden protegerse eficazmente cabe citar Bifidobacterium longum BL999 (ATCC BAA-999), Bifidobacterium longum (CNCM I-2618), Bifidobacterium breve (CNCM I-3865), Bifidobacterium lactis BL818 (CNCM I-3446), Lactobacillus johnsonii La1 (CNCM 1-1225), Lactobacillus paracasei (CNCM I-2116), Lactobacillus rhamnosus LPR (CGMCC 1.3724), Streptococcus thermophilus (CNCM 1-1422), Streptococcus thermophilus ST496 (CNCM 1-4l53), Lactobacillus casei (CNCM 1-1518), Lactobacillus casei (ACA-Dc 6002), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus (CNCM 1-1198), Lactococcus lactis (CNCM I-4154), o combinaciones de ellas.

En una forma de ejecución el microorganismo se selecciona entre Bifidobacterium longum BL999 (ATCC BAA-999), Streptococcus thermophilus ST496 (CNCM I-3915), Lactobacillus rhamnosus LPR (CGMCC 1.3724) y Bifidobacterium lactis BL818 (CNCM I-3446).

Cultivo en polvo

Los presentes inventores han desarrollado ahora un cultivo en polvo más estable durante el almacenamiento y/o la reconstitución. El cultivo en polvo consta de una matriz y microorganismos vivos, y la matriz está formada por una composición de la presente invención, tal como la descrita anteriormente bajo el título “Composición”. El cultivo en polvo consta sobre todo de una matriz y un microorganismo vivo, y la matriz está formada por una composición de la presente invención, tal como la descrita anteriormente bajo el título “Composición”.

Para asegurar una protección eficaz del microorganismo vivo, la relación ponderal matriz: microorganismo en el cultivo en polvo es de al menos 1. Es preferible que esté comprendida entre 1 y 1,2, para lograr un efecto protector adecuado y mantener a la vez una proporción económicamente efectiva de microorganismos

La matriz se encuentra preferentemente en un estado vitreo.

Los microorganismos vivos son como los definidos anteriormente bajo el título “Uso de la composición”.

La cantidad de microorganismos vivos en el cultivo en polvo de la presente invención puede describirse como unidades formadoras de colonias (UFC). La cantidad requerida de microorganismos vivos en el cultivo en polvo puede ser muy variable y depende de la cepa de microorganismos y del uso previsto del cultivo en polvo. Por ejemplo, en el caso de las bacterias probióticas el cultivo en polvo puede contener al menos 1010, con mayor preferencia al menos 3 x 1010 y sobre todo al menos 1011 UFC por gramo de cultivo en polvo.

En el cultivo en polvo de la presente invención los microorganismos pueden estar contenidos en forma de una biomasa seca formada por los microorganismos junto con un medio de fermentación sólido. Así, el polvo puede contener una fuente de nitrógeno tal como extracto de levadura, una fuente de carbono tal como azúcar y/o varias sales adecuadas para usar en un medio de fermentación destinado al crecimiento del microorganismo. También puede llevar derivados fermentados de la fuente de nitrógeno y carbono, así como ingredientes bioactivos producidos por los microorganismos durante la fermentación. Dichos ingredientes están comprendidos normalmente en una proporción del 0-60% en peso, preferiblemente del 0-50%, respecto al peso seco total del componente formado por los microorganismos (biomasa). También contiene proporciones particularmente bajas de estos ingredientes adicionales, como parte de la fracción de microorganismos, cuando la biomasa se lava antes de mezclarla con la matriz.

El cultivo en polvo puede llevar otros ingredientes además del microorganismo y la matriz. Tales ingredientes pueden ser normalmente vehículos adicionales, como, por ejemplo, polisacáridos, disacáridos o leche descremada en polvo., La matriz está preferiblemente en estado vítreo, mientras que los ingredientes adicionales no están en estado vítreo. Proceso para producir un cultivo en polvo.

La primera etapa del proceso de la presente invención es la producción de una biomasa por fermentación mediante microorganismos. Los métodos de fermentación en condiciones aeróbicas o anaeróbicas son comúnmente conocidos. El especialista en la materia puede identificar los componentes adecuados del medio de fermentación y ajustar las condiciones de fermentación en función de sus conocimientos generales, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar. El medio de fermentación consta normalmente de

- una fuente de nitrógeno como extracto de levadura,

- una fuente de carbono como azúcar

- varios factores de crecimiento (p.ej. minerales, vitaminas, etc.) requeridos por el microorganismo y

- agua.

La fermentación se lleva a cabo preferiblemente en dos etapas, realizándose una fermentación de iniciador antes de la etapa de fermentación principal. El medio de fermentación puede ser diferente o idéntico para el iniciador y para la fermentación principal.

La segunda etapa del proceso es la concentración de la biomasa, que también puede llevarse a cabo según métodos conocidos del especialista en la materia, como por ejemplo centrifugación o filtración. El contenido sólido total de la biomasa tras la concentración está comprendido preferiblemente entre 10 y 35% en peso, con mayor preferencia entre 14 y 35% en peso, respecto al peso seco total de la biomasa (es decir, de la cantidad total de medio de fermentación y del microorganismo producido).

Opcionalmente la concentración puede estar precedida o combinada con una etapa de lavado para eliminar los restos del medio de fermentación y/o los compuestos producidos durante la fermentación. Por ejemplo, el lavado se puede realizar concentrando biomasa, resuspendiendo la biomasa concentrada en un tampón, tal como un tampón de fosfato, o en una composición similar y volviendo a concentrar la biomasa.

La tercera etapa del proceso es el acondicionamiento del microorganismo vivo. En esta operación, una matriz formada por una composición de la presente invención se pone en contacto con el microorganismo vivo. La composición de la presente invención es tal como la definida en cualquiera de las formas de ejecución descritas anteriormente bajo el título “Composición”. Dicha matriz es preferiblemente un agente protector.

La etapa de acondicionamiento consta preferiblemente de las siguientes subetapas:

a) preparación de una disolución acuosa de la matriz, preferiblemente con un contenido total de sólidos (ST) del 40-65%, con mayor preferencia del 45-60%.

b) adición de la disolución acuosa preparada en la etapa a) a la biomasa, de manera que la concentración de matriz sea del 40-60% en peso, preferiblemente del 50-60% en peso, con mayor preferencia del 55%, respecto al peso seco total de la matriz y la biomasa (contenido sólido total);

c) mantenimiento de la biomasa y la matriz en contacto durante 20 hasta 150 minutos;

d) ajuste del pH entre 6,5 y 8,5, preferiblemente entre 6,8 y 7,2

En una forma alternativa del proceso, la etapa c) se lleva a cabo antes de la etapa d). En otra alternativa, la etapa d) se lleva a cabo antes de la etapa c).

El tiempo de contacto deseado entre la biomasa y los agentes protectores puede tener lugar por lotes o en un proceso continuo. Cuando se realiza por lotes, los agentes protectores y la biomasa se mezclan en un tanque de procesamiento por lotes y se mantienen en agitación durante todo el tiempo de acondicionamiento, opcionalmente con refrigeración, preferiblemente a T < 10°C, para evitar el crecimiento de microbios no deseados y la germinación de esporas. En un proceso continuo el tiempo de contacto deseado entre la biomasa y los agentes protectores se puede conseguir en un tanque de reacción agitado continuamente, con un tiempo medio de permanencia adecuado, o en un reactor de flujo de pistón con un tiempo de permanencia adecuado (similar a un tubo de retención).

Después se seca la biomasa acondicionada por cualquier método de secado conocido del estado técnico, usando gas caliente, como por ejemplo mediante secado por pulverización, secado en lecho fluido, secado por convección de aire o secado atmosférico, preferiblemente mediante secado por pulverización. Por ejemplo, las condiciones descritas en la patente EP0818529, la cual se incluye íntegramente como referencia, son aplicables al proceso de secado por pulverización.

Opcionalmente el cultivo en polvo secado puede mezclarse en seco con otros ingredientes. Tales ingredientes pueden ser, por ejemplo, vehículos adicionales tales como polisacáridos, tal como se ha descrito anteriormente, disacáridos o leche descremada en polvo.

Producto

En este documento se revela un producto que contiene el cultivo en polvo según cualquiera de las formas de ejecución descritas anteriormente. Puede ser cualquier tipo de producto al que se pueda incorporar el cultivo en polvo, como por ejemplo un producto alimenticio o una bebida, un producto de alimentación animal, un suplemento nutricional para humanos o animales, una composición farmacéutica o una composición cosmética. El producto puede ir destinado al consumidor final en forma sólida (por ejemplo en forma de polvo), semisólida (por ejemplo en forma de pasta) o, como alternativa, para ser reconstituido en un líquido antes del uso.

Como productos alimenticios y las bebidas se entienden todos los productos destinados a ser consumidos oralmente por seres humanos, con el propósito de proporcionar nutrición y/o placer. Pueden ser, por ejemplo, una composición nutricional como las destinadas a bebés y/o niños pequeños, a una mujer embarazada o lactante o a una mujer que desea quedar embarazada, a personas que necesitan una nutrición especial debido a un estado de salud adversa o a personas mayores. La composición nutricional se selecciona preferiblemente entre fórmulas infantiles, productos de cereales infantiles, fórmulas de seguimiento, leches de crecimiento y productos lácteos para mujeres embarazadas y lactantes o para mujeres que desean quedar embarazadas. Otros ejemplos de productos alimenticios y bebidas son productos lácteos como leches o yogures, sopas, salsas, aperitivos dulces y salados, bebidas en polvo y productos de cereales.

El producto también puede estar en forma de un producto alimenticio o un suplemento nutricional para animales. El animal es preferiblemente un mamífero. Los ejemplos de animales incluyen primates (p.ej. humanos), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, peces, pájaros y similares.

Los suplementos nutricionales se encuentran normalmente en forma de polvo, tabletas o cápsulas. Los suplementos en polvo incluyen típicamente aquellos que se disuelven en agua o se espolvorean sobre alimentos o bebidas. Dichos suplementos están ideados para proporcionar nutrientes adicionales y/o un beneficio para la salud del sujeto que lo consume, así como otros ingredientes saludables, tales como los microorganismos beneficiosos, por ejemplo bacterias probióticas. Se puede emplear un suplemento para proporcionar nutrientes y/o un beneficio para la salud de los seres humanos y también de los animales, como se ha definido anteriormente. Los suplementos nutricionales incluyen, por ejemplo, suplementos en polvo para agregar a la leche materna, por ejemplo para bebés prematuros o con poco peso al nacer. También incluyen suplementos para mujeres embarazadas o lactantes o para mujeres que desean quedar embarazadas.

Los productos farmacéuticos incluyen productos en polvo, tabletas o cápsulas, ideados para tratar o prevenir una afección médica adversa en un sujeto que lo necesite.

Las composiciones cosméticas están ideadas normalmente para producir un efecto estético en el cuerpo y pueden ser de uso tópico, o administrables por vía oral, en forma de polvos, tabletas o cápsulas.

El producto lleva preferiblemente microorganismos vivos, sobre todo bacterias beneficiosas tales como las bacterias probióticas, en una proporción de al menos 5 x 106 UFC por gramo de producto seco.

Los ingredientes de la matriz se pueden seleccionar entre los ingredientes descritos anteriormente, basándose en la naturaleza del producto, por ejemplo en función del sabor o de los requisitos reglamentarios.

La presente invención se describe seguidamente con mayor detalle mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1: agente protector de Bifidobacterium longum BL999 (ATCC BAA-999)

Preparación de muestras

Se inoculó un medio de fermentación adecuado para el crecimiento de Bifidobacterium longum BL999 con un 2% de bacterias congeladas-descongeladas. El iniciador se fermentó en las siguientes condiciones:

- 10 horas de tiempo de fermentación

- control del pH con NaOH a pH 6.

Para la fermentación principal, se aplicaron las siguientes condiciones:

- 16 horas de tiempo de fermentación,

- sin control de pH

- caldo de fermentación cubierto con CO2

- inoculación de iniciador: 2%

La biomasa se concentró luego por centrifugación hasta un contenido total de sólidos (ST) del 14% (2,5 x 1011 UFC/g). La biomasa centrifugada se acondicionó luego conforme al siguiente proceso. El agente protector de cada una de las muestras se disolvió en agua desmineralizada hasta un contenido total de sólidos del 55%. Después se introdujeron 300 g de biomasa centrifugada en un vaso de precipitados, el cual se colocó en un baño de agua con hielo. Se midió el contenido total de sólidos de la biomasa y se añadió la solución de agente protector según una relación de agentes protectores a biomasa de 55/45 (basada en peso seco). La mezcla se agitó suavemente en el baño de agua con hielo durante una hora. Luego se ajustó el pH a 7.

A continuación el concentrado acondicionado se secó por atomización en un secador por pulverización de laboratorio (Buechi, B-290, Flawil, Suiza). La temperatura del aire fue de 140°C y la temperatura de la torre se ajustó mediante el flujo de concentrado a T = 70°C. Durante el secado, el vaso de precipitados que contenía el concentrado se enfrió en un baño de agua con hielo.

Preselección

En una primera tanda de ensayos se seleccionaron 38 ingredientes como posibles agentes protectores. El efecto de estos ingredientes en la estabilidad de Bifidobacterium longum BL999 se ensayó secando la biomasa por pulverización con un agente protector que contenía maltodextrina DE12, ascorbato sódico y un único ingrediente adicional de la lista de 38 compuestos que debían analizarse a las siguientes concentraciones:

Tabla 2: composición del agente protector para la preselección

Se preparó un control basado en un agente protector compuesto por 13,6% en peso de ascorbato sódico y 86,4% en peso de maltodextrina DE12. Este control se empleó como referencia para evaluar el efecto de los agentes protectores sobre la estabilidad de Bifidobacterium longum BL999 durante el secado por pulverización, el almacenamiento y la reconstitución.

Los 38 cultivos en polvo y el control se prepararon del modo arriba descrito, acondicionándolos con cada uno de los 38 agentes protectores.

La concentración celular de B. longum en el polvo se detectó mediante métodos clásicos de cultivo en placa. Dichos métodos clásicos de cultivo en placa están resumidos en el libro de microbiología de James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology [Microbiología alimentaria moderna], 7a edición, Springer Science, Nueva York, N.Y. El recuento de las células se efectuó en el concentrado antes del secado, en el cultivo en polvo inmediatamente después del secado y tras 2, 3, 4, 6, 8 y/o 12 semanas de almacenamiento en una cámara climática a T = 37° C por encima de una solución saturada de acetato potásico (aw = 0,22). Los recuentos celulares tras el secado y el almacenamiento se determinaron después de reconstituir el polvo con un medio de reconstitución, tal como es sabido del especialista en la materia, que conoce bien los métodos de cultivo en placa antes mencionados.

Para evaluar los datos se usaron las fórmulas siguientes:

Pérdida logarítmica = ^{í X '} logi —-V X t j

donde Xo es el número de microorganismos en el tiempo t = 0 y Xt el número de microorganismos en el tiempo t. Cuando se midieron los recuentos microbiológicos en k repeticiones,

x o es el número medio de microorganismos en el tiempo t = 0 y

y

t es el número medio de microorganismos en el tiempo t; la pérdida logarítmica media en el tiempo t viene dada por:

Perdida logarítmica = ^, log ^{( X 0 )}

V X t ,

Los ingredientes individuales ensayados se seleccionaron entre varios grupos de moléculas: azúcares, alcoholes de azúcar, aminoácidos y proteínas. Todos los ingredientes ensayados de un grupo se secaron por pulverización el mismo día y la referencia se secó nuevamente por pulverización con cada grupo, también el mismo día.

Los azúcares ensayados fueron sacarosa, maltosa, trehalosa, lactosa y Glucidex MD DE47. En comparación con la referencia, los azúcares no proporcionaron ninguna protección contra el estrés letal que sufrieron las bacterias durante el secador por pulverización. Aunque los azúcares influyeron poco en la supervivencia bacteriana durante el secado, se observó que producían efecto en la estabilidad al almacenamiento. Los disacáridos mostraron el mejor rendimiento como agentes protectores y entre ellos la sacarosa resultó el ingrediente más eficiente. Los resultados se representan en la figura 1. La sacarosa y la lactosa se seleccionaron para la segunda tanda de ensayos.

Los alcoholes de azúcar ensayados fueron sorbita, manita, lactitol, mioinositol, xilitol y glicerol. Resultó difícil secar por pulverización el concentrado con alcoholes de azúcar debido a la pegajosidad del polvo en la torre. Algunos alcoholes de azúcar, como glicerol, manita, xilitol y sorbita, tuvieron un ligero efecto protector durante el secado. En el ensayo de almacenamiento, las muestras de polvo que contenían glicerol fallaron al cabo de poco tiempo. La mayoría de las bacterias de esta variante ya había muerto tras dos semanas de almacenamiento y por lo tanto se paró el ensayo. La pérdida de viabilidad a las 8 semanas fue menor en el caso de las variantes que contenían sorbita, manita, mioinositol y lactitol. Los resultados están representados en la figura 2. Para la segunda tanda de ensayos se seleccionó sorbita, lactitol y mioinositol.

Los aminoácidos ensayados fueron L-cisteína, L-lisina, L-arginina, L-alanina, L-glutamina y L-glutamato sódico. Al contrario que los azúcares, algunos aminoácidos estabilizan las bacterias durante el secado. Así como la pérdida de viabilidad durante el secado fue de 1 log en la referencia, en la variante que contenía cisteína solo se perdió 0,2 log. Si bien ya es sabido que el ascorbato sódico y la cisteína tienen propiedades antioxidantes, es sorprendente que la cisteína sea capaz de proteger el microorganismo durante el secado y en cambio el ascorbato sódico no tenga un efecto significativo en la supervivencia bacteriana durante el proceso de secado. Las muestras que contenían cisteína, lisina, arginina o alanina tuvieron las pérdidas más bajas durante el almacenamiento y la reconstitución, entre los aminoácidos, pero también en comparación con todos los demás ingredientes ensayados en esta fase de preselección. Estos aminoácidos se eligieron para la segunda tanda de ensayos. Los resultados están resumidos en la figura 3.

Las proteínas ensayadas fueron gelatina, aislado proteico de suero de leche desnaturalizado por calor (a T = 80°C durante 30 minutos), aislado de proteína de suero de leche y caseinato sódico. Ninguna de estas proteínas mejoró la estabilidad durante el secado. El aislado de proteína de suero de leche desnaturalizado por calor tuvo un efecto positivo durante las primeras seis semanas de almacenamiento, pero después de 8 semanas la pérdida de viabilidad fue tan alta como la de la referencia. Debido a su bajo rendimiento, no se seleccionaron proteínas para la segunda tanda de ensayos. Los resultados están resumidos en la figura 4.

Todos los demás ingredientes ensayados tuvieron poca o ninguna actividad protectora y no fueron seleccionados para la siguiente tanda de ensayos:

- gomas (goma arábiga, carragenano A, pectina goma guar y alginato), véase figura 5;

- oligosacáridos (almidón resistente, fibras de trigo, raftilosa y raftilina), véase figura 6;

- otros ingredientes (betaína HCL, carnitina) y el aminoácido prolina, véase figura 7.

La preselección demuestra claramente que los ingredientes mencionados en el estado técnico anterior como posibles agentes protectores de los microorganismos durante el secado tienen una eficiencia muy variable en la protección de microorganismos vivos durante un proceso de secado con gas caliente, como el secado por pulverización, durante el almacenamiento y/o durante la reconstitución. El trabajo de los presentes inventores ha demostrado la mayor eficacia de los aminoácidos cisteína, lisina, alanina y arginina combinados con un vehículo y un antioxidante en la protección de las bacterias probióticas durante el secado por pulverización, más 12 semanas de almacenamiento y la subsiguiente reconstitución.

Ensayos con combinaciones de ingredientes

Después de haber escogido los ingredientes más prometedores en la etapa de preselección, se estableció un diseño experimental para encontrar las mejores mezclas de agentes protectores y los perfiles óptimos de concentración. En primer lugar se realizaron ensayos de viabilidad para definir las restricciones respecto al procesamiento.

La concentración total de aminoácidos tuvo que limitarse a un total de 36,5% en peso, respecto al peso seco total del agente protector. El secado por pulverización resultó casi imposible a concentraciones más elevadas de aminoácidos, debido a la pegajosidad del polvo.

Para lograr un proceso de secado por pulverización estable, hubo que incorporar a la mezcla de agentes protectores una cantidad mínima del 31% en peso de maltodextrina, respecto al peso seco total de agente protector.

El contenido de biomasa se fijó en un 45% en peso respecto al producto en polvo final y por lo tanto el agente protector subió hasta un 55% en peso, basado en el peso seco total de la biomasa más el agente protector.

El diseño experimental incluyó 32 variantes formadas por varias combinaciones de los ingredientes identificados como agentes protectores satisfactorios en el ensayo de preselección. Estas variantes se dividieron en grupos de 5 variantes y una referencia, atendiendo a la capacidad del secador por pulverización, y cada grupo se secó por pulverización el mismo día. Como referencia se empleó una mezcla de agentes protectores identificada previamente como poseedora de algún efecto protector débil sobre los microorganismos durante el secado por pulverización. En la siguiente tabla 3 se indica la composición de la referencia. Además de las 5 variantes, la referencia también se secó por pulverización cada día de ensayo. La referencia siempre se secó por pulverización en una posición distinta del orden de un día de ensayo, a fin de eliminar los efectos debidos a los diferentes tiempos de almacenamiento de la biomasa. La pérdida de viabilidad se midió cuando todas las muestras del grupo se habían secado por pulverización. Por lo tanto, el tiempo de almacenamiento anterior a la medición realizada tras el secado por pulverización varió de 0 hasta 6 horas, debido al tiempo necesario para secar las 5 variantes y la referencia por pulverización.

Tabla 3: composición de la referencia

Todas las variantes se prepararon del modo descrito en el ensayo de preselección, empleando la combinación de ingredientes en lugar del ingrediente único. Luego se secaron por pulverización, se almacenaron durante 12 semanas tras el secado y se analizaron después de 2, 4, 6, 8 y 12 semanas, tal como se describió anteriormente respecto a los ensayos de preselección. Se usaron las mismas fórmulas matemáticas para analizar los datos. Los resultados de los dos grupos, incluidas las variantes más prometedoras, están representados en las figuras 9 y 10. Las composiciones de las variantes incluidas en estos ensayos se indican en la siguiente tabla 4.

Tabla 4: composición de las variantes A hasta H

Los resultados representados en la figura 9 demuestran que la variante B y la referencia, que no llevan ninguno de los aminoácidos lisina, cisteína, arginina y/o alanina requeridos en la presente invención, tienen un efecto protector mucho más débil, ya que la pérdida logarítmica de viabilidad en estas dos muestras es mucho mayor que en las variantes de la presente invención. La variante con mejor rendimiento en este diseño experimental es la variante D, que tiene tres aminoácidos y está libre de otros ingredientes (es decir, consta de ascorbato sódico, maltodextrina y los aminoácidos lisina, cisteína y alanina). En la figura 10 las variantes F y G según la presente invención también muestran un efecto protector mucho mejor que las variantes E y H (que no tienen aminoácidos).

Este ejemplo demuestra que el efecto protector es proporcionado por los agentes protectores que contienen diversas mezclas de los aminoácidos cisteína, lisina, alanina y arginina, en un amplio intervalo de concentraciones totales, que van del 3,8 al 36,5% en peso, respecto al peso seco total de agente protector.

Ejemplo 2: comparación de diversas proporciones de aminoácidos

Se prepararon muestras cultivo en polvo que contenían Bifidobacterium longum BL999 (ATCC BAA-999) y una matriz formada por maltodextrina, ascorbato sódico y los aminoácidos cisteína, lisina, alanina y arginina, solos o combinados por pares, tal como se indica en la siguiente tabla 5.

Tabla 5: composición de aminoácidos en la matriz de las muestras ensayadas

Todos los porcentajes están expresados en peso respecto al peso total de la matriz.

Las muestras se prepararon con 55% de matriz y 45% de Bifidobacterium longum BL999 (ATCC BAA-999), siendo el porcentaje en peso respecto al peso seco total del cultivo en polvo. La matriz constaba de 33% de maltodextrina DEX, 33% de ascorbato sódico y 34% de composición de aminoácidos como la indicada en la tabla 5, siendo los porcentajes en peso respecto al peso total de la matriz.

Las muestras se prepararon del modo siguiente. Se cultivó B. longum BL999 durante 16 h a 37°C en un fermentador de 7 l (newMBR, CH-Zürich) bajo atmósfera de CO2 en el espacio de cabeza, usando el mismo medio de fermentación que en el ejemplo 1. No se controló el pH de la fermentación. La suspensión celular recogida del fermentador se centrifugó a 4500 rpm durante 20 minutos a 5°C (Sorvall RC3C Plus). Tras desechar el sobrenadante, la biomasa se almacenó a 4°C antes de mezclarla con la matriz protectora. El pH del concentrado se ajustó a 7,0 añadiendo gota a gota NaOH al 30% antes de secarlo con un secador de convección analítico (ACD) de laboratorio (construido por IVV-Fraunhofer Institut, DE-Freising). Los parámetros relevantes de secado, como la humedad del aire, la temperatura del aire y el caudal del flujo de aire, se ajustaron de la siguiente manera:

- Flujo de aire: 40 m3/h.

- Temperatura del aire de secado: 60°C.

- Humedad relativa del aire de secado: 8%.

- Duración: 660 s

La pérdida logarítmica de cada muestra se analizó tal como se describe en el ejemplo 1, tras el secado y después de 8 semanas de almacenamiento por encima de una solución saturada de acetato sódico (aw = 0,22) en una cámara climática a T = 37°C. La concentración celular de B. longum BL999 se midió antes del secado y después de 8 semanas de almacenamiento, usando el método descrito en el ejemplo 1. La pérdida logarítmica también se calculó usando las ecuaciones descritas en el ejemplo 1.

Los resultados están representados en las figuras 11 a 14. Estas cifras demuestran que las muestras en las cuales se empleó un par de aminoácidos en el agente protector tuvieron una pérdida de viabilidad logarítmica menor que las muestras en las que solo se utilizó un aminoácido. La única excepción es la muestra preparada con una combinación de los dos aminoácidos alanina y arginina, que tuvo una pérdida mayor de viabilidad en comparación con la arginina o la alanina por separado. A pesar de que el efecto de la combinación de alanina y arginina resultó ser menor que el de los ingredientes individuales, los resultados revelaron un efecto protector significativo de la alanina y de la arginina como ingredientes únicos o combinados en un par.

Estos resultados revelan un efecto sinérgico entre los aminoácidos cuando se usan en pares, sobre todo cuando hay presencia de cisteína y/o lisina, en comparación con el uso de un solo aminoácido, porque a concentraciones iguales los pares de aminoácidos proporcionan una mejor estabilización que los aminoácidos individuales.

Ejemplo 3: agente protector de Streptococcus thermophilus ST496 (CNCM I-3915)

Se llevó a cabo un ensayo comparativo de evaluación del rendimiento de una composición según la presente invención para la protección del microorganismo Streptococcus thermophilus ST496 (CNCM I-3915) durante el almacenamiento y la reconstitución.

Se preparó una referencia y dos muestras (variantes I y J). Como referencia, se usó una mezcla de agentes protectores identificada previamente como poseedora de algún efecto protector débil sobre los microorganismos durante el secado por pulverización. La composición de la referencia se indica en la anterior tabla 3. La composición del agente protector utilizado en cada muestra de ensayo se indica en la siguiente tabla 6. En todas las muestras, la concentración de la matriz fue del 55% en peso y la concentración de microorganismos fue del 45% en peso respecto a los sólidos totales.

Tabla 6: composición de las muestras I y J

Todas las muestras de referencia y de ensayo se prepararon empleando el siguiente mismo método. Se produjo S. thermophilus en un biorreactor de 3000 l a 40°C durante 9 h a pH constante después de inocular un medio adecuado que contenía una fuente de nitrógeno, una fuente de carbono y oligoelementos al 2% con el cultivo iniciador. Al final de la fermentación la biomasa se concentró por centrifugación y se acondicionó con la matriz durante 1 h. Después del acondicionamiento y del ajuste del pH a 7, la biomasa y la matriz se secaron por pulverización a gran escala usando una torre de secado por pulverización de tamaño parecido a una torre de secado a escala industrial.

Después del secado por pulverización, las muestras de referencia y de ensayo se sometieron a una prueba acelerada de almacenamiento. El cultivo en polvo se mezcló con leche descremada en polvo en una proporción de 1 a 100, tras el secado por pulverización del cultivo en polvo. Después, esta mezcla se almacenó a 37°C y aw = 0,25 durante 12 semanas. Los recuentos celulares se midieron en la referencia y en las muestras de ensayo inmediatamente después del secado por pulverización y tras 4, 8 y 12 semanas de almacenamiento. Los recuentos celulares se midieron tal como se describe en el ejemplo 1.

Los resultados están representados en la figura 15. En el gráfico se puede ver que el recuento total de células de los microorganismos tras 12 semanas de almacenamiento y reconstitución es notablemente mayor en las variantes I y J (según la presente invención) que en la referencia, lo cual demuestra que la composición según la presente invención protege efectivamente el Streptococcus thermophilus ST456 vivo durante el almacenamiento y la reconstitución tras el secado por pulverización. Al cotejar esta observación con lo visto en los otros ejemplos se comprueba que el efecto protector de la composición de la presente invención no es específico de la cepa y sirve para una gran variedad de cepas de microorganismos. Además, el efecto se consigue con diferentes concentraciones de los ingredientes de la composición protectora. Este ejemplo también demuestra que el efecto protector se obtiene cuando el cultivo en polvo se produce a gran escala.

Ejemplo 4: agente protector del Lactobacillus rhamnosus LPR (depositado como CGMCC 1.3724)

Se llevó a cabo un ensayo comparativo de evaluación del rendimiento de una composición según la presente invención para la protección del microorganismo Lactobacillus rhamnosus LPR (depositado como CGMCC 1.3724) durante el secado por pulverización, el almacenamiento y la reconstitución.

Se preparó una referencia y dos muestras (variantes K y L). Como referencia se empleó una mezcla de agentes protectores identificada previamente como poseedora de algún efecto protector débil sobre los microorganismos durante el secado por pulverización. La composición de referencia se indica en la anterior tabla 3. La composición del agente protector utilizado en cada muestra de prueba está indicada en la siguiente tabla 7. En todas las muestras, la concentración de la matriz fue del 55% en peso y la concentración de microorganismos fue del 45% en peso respecto a los sólidos totales.

Tabla 7: composición de las muestras K y L

Todas las muestras de referencia y de ensayo se prepararon empleando el siguiente mismo método.

Se produjo L. rhamnosus en un biorreactor de 3000 l a 37°C durante 16 h a pH constante después de inocular un medio adecuado que contenía una fuente de nitrógeno, una fuente de carbono y oligoelementos para obtener un alto rendimiento al 4% con el cultivo iniciador. Al final de la fermentación la biomasa se concentró por centrifugación y se acondicionó con la matriz durante 1 h. Después del acondicionamiento y del ajuste del pH a 7, la biomasa y la matriz se secaron por pulverización a gran escala utilizando una torre de secado por pulverización de tamaño parecido a una torre de secado a escala industrial.

Después del secado por pulverización, las muestras de referencia y de ensayo se sometieron a una prueba acelerada de almacenamiento. El cultivo en polvo se mezcló con leche descremada en polvo en una proporción de 1 a 100, tras el secado por pulverización del cultivo en polvo. Después esta mezcla se almacenó a 37°C y aw = 0,24 durante 12 semanas. Los recuentos celulares se midieron en la referencia y en las muestras de ensayo inmediatamente después del secado por pulverización y tras 4, 8 y 12 semanas de almacenamiento. Los recuentos celulares se midieron del modo descrito en el ejemplo 1.

Los resultados están representados en la figura 16. En el gráfico se puede ver que el recuento total de células de microorganismos es notablemente mayor tras 12 semanas de almacenamiento y reconstitución en las variantes K y L (según la presente invención), que en la referencia, lo cual demuestra que la composición de la presente invención protege eficazmente el Lactobacillus rhamnosus LPR vivo durante el almacenamiento y la reconstitución tras el secado por pulverización. Al cotejar esta observación con lo visto en los otros ejemplos se comprueba que el efecto protector de la composición de la presente invención no es específico de la cepa y sirve para una gran variedad de cepas de microorganismos. Además, el efecto se consigue con diferentes concentraciones de los ingredientes de la composición protectora. Este ejemplo también demuestra que el efecto protector se obtiene cuando el cultivo en polvo se produce a gran escala.

Ejemplo 5: agente protector del Bifidobacterium lactis BL818 (depositado como CNCM I-3446)

Se llevó a cabo un ensayo comparativo de evaluación del rendimiento de una composición según la presente invención para la protección del microorganismo Bifidobacterium lactis BL818 (depositado como CNCM I-3446) durante el secado por pulverización, el almacenamiento y la reconstitución.

Se preparó una muestra de referencia y una de ensayo (variante M). Como referencia se usó una mezcla de agentes protectores identificada con anterioridad como poseedora de algún efecto protector débil sobre los microorganismos durante el secado por pulverización. La composición de la referencia se indica en la anterior tabla 3. La composición del agente protector utilizado en la muestra de ensayo se indica en la siguiente tabla 8. En todas las muestras, la concentración de la matriz fue del 55% en peso y la concentración de microorganismos fue del 45% en peso respecto a los sólidos totales.

Tabla 8: composición de la muestra M

La referencia y la muestra de ensayo se prepararon usando el mismo método.

Después del secado por pulverización, la referencia y la muestra de prueba se sometieron a una prueba acelerada de almacenamiento a 37°C y aw = 0,17 durante 180 días. Los recuentos celulares se midieron en la referencia y en la muestra de prueba inmediatamente después del secado por pulverización y después de 15, 30, 60, 90 y 180 días de almacenamiento. Los recuentos celulares se midieron tal como se describe en el ejemplo 1.

Los resultados están representados en la figura 17. En el gráfico se puede ver que el recuento total de células de los microorganismos es notablemente mayor después de 180 días de almacenamiento y reconstitución en la variante M (según la presente invención), que en la referencia, lo cual demuestra que la composición de la presente invención protege efectivamente el Bifidobacterium lactis BL818 vivo durante el almacenamiento y la reconstitución después del secado por pulverización. La pérdida logarítmica de viabilidad (calculada tal como se describe en el ejemplo 1) en la muestra de la presente invención es solo de 0,24 después de 180 días; por tanto el efecto protector es muy eficiente. Al cotejar esta observación con lo visto en los otros ejemplos se comprueba que el efecto protector de la composición de la presente invención no es específico de la cepa y sirve para una gran variedad de cepas de microorganismos. Además, el efecto se consigue con diferentes concentraciones de los ingredientes de la composición protectora. Este ejemplo también demuestra que el efecto protector se obtiene cuando el cultivo en polvo se produce a gran escala.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un material soporte formado por un polisacárido, al menos un antioxidante y una combinación de aminoácidos seleccionados entre

cisteína y alanina;

cisteína, lisina y alanina;

lisina y arginina;

cisteína y arginina;

cisteína, lisina y arginina;

lisina, alanina y arginina; y

cisteína, arginina y alanina;

de modo que los aminoácidos lisina, alanina y arginina se encuentran en una proporción del 8 al 20% en peso respecto al peso seco total de la composición y la proporción del contenido de cisteína está comprendida entre el 2 y el 10% en peso respecto al seco peso total de la composición.

2. Una composición según la reivindicación 1, caracterizada porque el material soporte está seleccionado entre maltodextrina, dextrina, ciclodextrina, almidón, un oligosacárido o celulosa, preferiblemente maltodextrina.

3. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el antioxidante es vitamina C, vitamina E, glutatión, coenzima Q10, B-caroteno, licopeno o vitamina A o un derivado de los mismos, preferiblemente ascorbato sódico.

4. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la concentración total de aminoácidos está comprendida en el intervalo del 3,5 hasta el 36,5% en peso respecto al peso seco total de la composición.

5. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la concentración del soporte está comprendida en el intervalo del 20-60%, preferiblemente del 30-56% en peso, respecto al peso seco total de la composición.

6. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la concentración de antioxidantes está comprendida en el intervalo del 13-50%, preferiblemente del 20-40% en peso, respecto al peso seco total de la composición.

7. Un cultivo en polvo que contiene microorganismos vivos y una matriz constituida por una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, siendo la relación peso en seco matriz: microorganismo vivo de al menos 1.

8. Un cultivo en polvo según la reivindicación 7, caracterizado porque el microorganismo vivo son bacterias.

9. Un cultivo en polvo según la reivindicación 8, caracterizado porque las bacterias se eligen entre bifidobacterias, lactobacilos, lactococos, enterococos, estreptococos, Leuconostoc, Escherichia, propionibacterias o combinaciones de las mismas.

10. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para proteger microorganismos vivos durante un proceso de secado con gas caliente, durante el almacenamiento y/o durante la reconstitución.

11. Un proceso para preparar un cultivo en polvo según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que costa de las siguientes etapas

a. producir una biomasa por fermentación con un microorganismo;

b. concentrar la biomasa obtenida en la etapa a);

c. acondicionar la biomasa concentrada con una disolución acuosa de una composición según las reivindicaciones 1 a 6; y

d. secar la biomasa acondicionada para formar un producto en polvo.

12. El proceso según la reivindicación 11, caracterizado porque la etapa c) consta de las siguientes subetapas: (1) preparar una solución acuosa de una matriz formada por la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

(2) agregar la solución acuosa preparada en la etapa (1) a la biomasa para llegar a una concentración de matriz del 40-60% en peso respecto al peso seco total de la matriz más la biomasa;

(3) mantener la biomasa y la matriz en contacto durante 20 hasta 150 minutos; y

(4) ajustar el pH entre 6,5 y 8,5, preferiblemente entre 6,8 y 7,2; de modo que la etapa (4) puede tener lugar antes o después de la etapa (3).