ES2811270T3 - Uso de peptidilarginina deiminasa para solubilizar proteínas, opcionalmente también para reducir su tendencia a la formación de espuma - Google Patents

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Abstract

Uso de peptidil arginina deiminasa (EC 3.5.3.15) para mejorar la solubilidad de una proteína vegetal a un pH de entre 5 y 8,5, en el que la proteína vegetal es guisante, soja o cereal.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de peptidilarginina deiminasa para solubilizar proteínas, opcionalmente también para reducir su tendencia a la formación de espuma
La presente invención se refiere al uso de una enzima para mejorar la solubilidad de proteínas.
Antecedentes
En un mundo con una población en crecimiento existe una demanda cada vez mayor de proteínas. Para responder a esta demanda creciente de proteínas es necesario observar aplicaciones más amplias de proteínas. Además, se desea buscar proteínas vegetales como una alternativa a las proteínas animales, ya que se considera que las plantas son una fuente de proteínas más sostenible que los animales. El uso de proteínas vegetales en los alimentos sigue siendo limitado porque la solubilidad es generalmente baja, lo que es indicativo de propiedades funcionales deficientes. La solubilidad de las proteínas puede mejorarse mediante proteólisis. No obstante, esto puede conducir a la destrucción de otras propiedades funcionales, tales como gelificación, emulsificación u otros atributos sensoriales. Yong et al., J. of Agric. Food Chem. 2006, 54, 6034-6040, divulgan el uso de la proteína glutaminasa para aumentar la solubilidad del gluten de trigo. La proteína glutaminasa desamida las proteínas y, por lo tanto, aumenta la carga de la proteína desamidada, lo que mejora la solubilidad de la proteína sin la proteólisis de la proteína.
Existe la necesidad de vías enzimáticas alternativas para mejorar la solubilidad de las proteínas.
Descripción detallada
La presente invención se refiere al uso de peptidil arginina deiminasa para mejorar la solubilidad de una proteína vegetal a un pH de entre 5 y 8,5, en el que la proteína vegetal es guisante, soja o cereal. Otras propiedades físicas de las proteínas incluyen propiedades gelificantes, espumantes o emulsionantes.
En una forma de realización, la presente divulgación se refiere al uso de peptidil arginina deiminasa para mejorar la solubilidad de una proteína vegetal a un pH de entre 5 y 8,5, en el que la proteína vegetal es guisante, soja o cereal.
La presente divulgación se refiere además a un proceso para mejorar la solubilidad de una proteína vegetal que comprende incubar la proteína vegetal con una peptidil arginina deiminasa a un pH de entre 4 y 9, en el que la proteína vegetal muestra una solubilidad mejorada a un pH de entre 5 y 8,5, siendo la proteína vegetal proteína de guisante, de soja o de cereal.
Mejorar una propiedad física de una proteína en un uso o un proceso tal como se divulgan en el presente documento incluye solubilizar la proteína y opcionalmente reducir la capacidad de formación de espuma de la proteína.
En una forma de realización, la presente invención se refiere al uso de peptidil arginina deiminasa para solubilizar proteínas vegetales seleccionadas de guisante, soja o cereal a un pH de entre 5 y 8,5. Solubilizar, tal como se utiliza en el presente documento, comprende incubar la proteína vegetal con una peptidil arginina deiminasa a un pH de entre 4 y 9, tal como un pH de entre 5 y 8, o un pH de entre 5,5 a 7,5, o un pH de entre 6 y 7, o un pH de entre 6,2 y 6,8, o un pH de 6,5, y solubilizar la proteína en una solución que tiene un pH de entre 5 y 8,5.
Las peptidil argininas deiminasas se conocen, por ejemplo, por el documento WO2008/000174. El documento WO2008/000174 divulga un proceso para tratar enzimáticamente una proteína con una proteína arginina deiminasa, en el que al menos el 30% de la arginina se transforma en citrulina. Sorprendentemente, hemos descubierto que cuando la proteína arginina deiminasa se incuba con proteínas seleccionadas a partir de guisante, soja o cereal, la solubilidad de las proteínas aumenta, por ejemplo la solubilidad de la proteína aumenta a un pH neutro, en comparación con una proteína que no se ha incubado con una proteína arginina deiminasa, sin influir en otras propiedades funcionales de la proteína, o sin la proteólisis de la proteína.
Los términos proteína arginina deiminasa y peptidil arginina deiminasa (PAD) se utilizan indistintamente en el presente documento. La proteína o peptidil arginina deiminasa pertenece a una familia de enzimas (EC 3.5.3.15) que convierten la arginina unida a péptidos o proteínas en citrulina unida a péptidos o proteínas. Este proceso se denomina desaminación o citrulinación. En la reacción de arginina para dar citrulina, uno de los átomos de nitrógeno terminales de la cadena lateral de la arginina se reemplaza por un oxígeno. La reacción utiliza una molécula de agua y proporciona amoniaco como subproducto (http://en.wikipedia.org/wiki/Citrullination). Mientras que la arginina se carga positivamente a un pH neutro, la citrulina no se carga. Sorprendentemente, se ha descubierto que una proteína en la que al menos parte de la arginina se ha convertido en citrulina y, por lo tanto, en una proteína con menos carga, mostraba una mayor solubilidad en una solución con un pH de entre 5 y 8,5, o un pH de entre 5,5 y 8.
La solubilidad de una proteína, tal como se utiliza en el presente documento, es la cantidad de nitrógeno en el sobrenadante después de la separación sólido-líquido de la proteína. La cantidad de nitrógeno se puede medir después de la incubación de la proteína con PAD y/o la incubación de la proteína sin PAD. La separación de la proteína se puede realizar por centrifugación o por filtración. El contenido de nitrógeno se puede medir según el procedimiento Kjeldahl. La solubilización de la proteína se mide como solubilización de nitrógeno.
En una forma de realización, la solubilidad de la proteína se aumenta mediante el uso de peptidil arginina deiminasa. El aumento en la solubilidad de la proteína es de al menos el 2%, 3%, 5%, 10%, por ejemplo de al menos el 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o al menos el 90% o el 95%. El aumento en la solubilidad de una proteína que se ha incubado con PAD se compara con una proteína que no se ha incubado con PAD en las mismas condiciones.
Sorprendentemente, también se ha descubierto que la capacidad de formación de espuma de una proteína, tal como se utiliza en el presente documento, que se había tratado con una peptidil arginina deiminasa se redujo; por ejemplo, la capacidad de espuma se redujo en al menos el 2%, 3%, 4%, 5% o el 6%. Una capacidad reducida de formación de espuma es ventajosa, en particular, en una bebida que comprende una proteína vegetal, por ejemplo, leche derivada de una fuente vegetal.
La capacidad de formación de espuma, tal como se utiliza en el presente documento, se determina dividiendo el volumen de espuma inmediatamente después de mezclar una bebida entre el volumen del líquido antes de mezclar multiplicado por 100.
Las proteínas vegetales seleccionadas a partir de guisante, soja o cereal pueden utilizarse en un uso o un proceso de la presente invención. Ventajosamente, una proteína comprende arginina unida a proteínas, tal como al menos el 1% en moles, el 2, 3, 4, 5 o al menos el 6% en moles. Ejemplos de proteína vegetal son proteína de cereal, proteína de patata, proteína de soja, proteína de colza, proteína de arroz, proteína de guisante, así como proteínas de otras plantas que se sabe que son ricas en arginina, tales como altramuces, sésamo, palmiste, etc. Según la invención, La proteína vegetal es proteína de guisante, de soja o de cereal. Ejemplos de proteína de cereal son trigo o maíz o fracciones de los mismos, por ejemplo, gluten tal como gluten de trigo.
En una forma de realización, el uso de peptidil arginina deiminasa para mejorar la solubilidad y opcionalmente para reducir la capacidad de formación de espuma comprende incubar una proteína vegetal elegida a partir de guisante, soja o cereal con una peptidil arginina deiminasa a una temperatura y un pH adecuados, por ejemplo incubar la proteína con una peptidil arginina deiminasa a un pH de entre 4 y 9, tal como un pH de entre 5 y 8,5, tal como un pH de entre 5,5 y 8, tal como un pH de entre 6 y 7, o un pH de entre 6,2 y 6,8, por ejemplo a un pH de aproximadamente 6,5. Una temperatura adecuada a la que se incuba la proteína con PAD puede encontrarse entre 20 y 60 grados Celsius, tal como entre 30 y 50, o entre 35 y 45 grados Celsius.
En una forma de realización, se mejora una propiedad física de la proteína cuando se mide la propiedad física de la proteína en una solución que tiene un pH entre 5 y 8,5, tal como un pH entre 5,5 y 8, tal como un pH entre 6 y 7, o un pH entre 6,2 y 6,8.
La peptidil arginina deiminasa (PAD) puede derivarse de cualquier origen adecuado, por ejemplo, de origen mamífero o microbiano. Las PAD que se utilizan en la presente invención se derivan ventajosamente de una fuente microbiana. Por ejemplo, las PAD pueden derivarse de un origen fúngico tal como Fusarium sp., tal como Fusarium graminearum, Chaetomium globosum, Phaesphaeria nodorum, o de origen bacteriano tal como de la bacteria Streptomyces, por ejemplo Streptomyces sarna, Streptomyces clavuligeres. Los términos "derivado" o "derivable", con respecto al origen de un polipéptido tal como se divulga en el presente documento, significan que cuando se lleva a cabo una búsqueda BLAST con un polipéptido tal como se divulga en el presente documento, el polipéptido puede derivarse de una fuente natural, tal como un célula microbiana, en la que un polipéptido endógeno muestra el porcentaje más elevado de homología o identidad con el polipéptido tal como se divulga en el presente documento.
Una peptidil arginina deiminasa puede ser una peptidil arginina deiminasa pura o purificada. Una peptidil arginina deiminasa purificada es una enzima que puede ser al menos el 50% pura, por ejemplo, al menos el 60% pura, al menos el 70% pura, al menos el 75% pura, al menos el 80% pura, al menos el 85% pura, al menos el 80% pura, al menos el 90% pura, o al menos el 95% pura, el 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% pura, por ejemplo según se determina por SDS-PAGE o cualquier otro procedimiento de análisis adecuado para este propósito y conocido por el experto en la técnica.
Ventajosamente, la peptidil arginina deiminasa es un polipéptido que tiene al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o el 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o con la secuencia de aminoácidos madura de la SEQ ID NO: 1, en las que el polipéptido tiene actividad de peptidil arginina deiminasa.
Para los fines de la presente invención, se establece en el presente documento que para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de aminoácidos las secuencias se alinean con fines de comparación óptimos. Para optimizar el alineamiento entre las dos secuencias, se pueden introducir huecos en cualquiera de las dos secuencias que se están comparando. Dicho alineamiento puede llevarse a cabo a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Alternativamente, el alineamiento puede llevarse a cabo a lo largo de una longitud más corta, por ejemplo, a lo largo de aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más aminoácidos. La identidad de secuencia es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias a lo largo de la región alineada de la que se informa. El porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Con el algoritmo pueden alinearse tanto las secuencias de aminoácidos como las secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE. Para los fines de la presente invención, se utilizó el programa n Ee DLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. y Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) p. 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para secuencias de proteínas, se utiliza EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por apertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5. El experto apreciará que todos estos parámetros diferentes producirán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad general de dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan algoritmos diferentes.
Un "polipéptido maduro" se define en el presente documento como un polipéptido en su forma final y se obtiene después de la traducción de un ARNm en un polipéptido y las modificaciones postraduccionales de dicho polipéptido. Las modificaciones postraduccionales incluyen procesamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilación, fosforilación y eliminación de secuencias líderes tales como péptidos, propéptidos y/o prepropéptidos señal por escisión.
Una secuencia de polipéptidos maduros de SEQ ID NO: 1 puede comprender o contener los aminoácidos 19, 20, 21, 22, 23, 24 a 640 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ventajosamente la secuencia de polipéptidos maduros de SEQ ID NO: 1 comprende o contiene los aminoácidos 22 a 640 de la SEQ ID NO: 1, en la que la metionina presente en la posición 1 en la SEQ ID NO: 1 se cuenta como el número 1.
El término "polipéptido" se refiere a una molécula que comprende residuos de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y que contiene más de cinco residuos de aminoácidos. El término "proteína", tal como se utiliza en el presente documento, es sinónimo del término "polipéptido" y también puede referirse a dos o más polipéptidos. Por lo tanto, los términos "proteína" y "polipéptido" se pueden utilizar indistintamente. Opcionalmente, los polipéptidos pueden modificarse (por ejemplo, glicosilarse, fosforilarse, acilarse, farnesilarse, prenilarse, sulfonarse y similares) para añadir funcionalidad. Los polipéptidos que muestran actividad en presencia de un sustrato específico en determinadas condiciones pueden denominarse enzimas.
Se puede producir una peptidil arginina deiminasa, o un polipéptido que tiene actividad de peptidil arginina deiminasa, en cualquier organismo huésped adecuado mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo en hongos Aspergilli, por ejemplo Aspergillus niger o Aspergillus oryzae, Trichoderma, o las levaduras Saccharomyces yKluyveromuces o las bacterias del género Streptomyces o Bacilii. Un procedimiento adecuado para expresar un polipéptido que tiene actividad de peptidil arginina deiminasa en Aspergillus niger se divulga, por ejemplo, en los ejemplos 3 y 4 del documento WO2008/000714.
En una forma de realización, el uso de peptidil arginina deiminasa según la reivindicación 1 para mejorar la propiedad física de una proteína comprende además el uso de una proteína glutaminasa.
En una forma de realización, un proceso para mejorar una propiedad física según la reivindicación 3 comprende incubar adicionalmente la proteína con una proteína glutaminasa.
Sorprendentemente, se ha descubierto que cuando un uso según la reivindicación 1 comprende además el uso de una proteína glutaminasa o un proceso según la reivindicación 3 para mejorar una solubilidad comprende además incubar proteína con una proteína glutaminasa, se solubiliza una cantidad más elevada de proteína que cuando la proteína se ha incubado o solubilizado con peptidil arginina deiminasa o con proteína glutaminasa sola.
Una proteína glutaminasa es una enzima que hidroliza grupos amida de glutamina y/o asparagina en una proteína para dar ácido glutámico y/o ácido asparagínico y amoniaco. Una proteína glutaminasa pertenece a la clasificación enzimática EC 3.5.1.44.
Una proteína glutaminasa puede derivarse de cualquier microorganismo adecuado, por ejemplo, bacterias del género Chryseobacterium, Flavobacterium, Empedobacter, Sphingobacterium, Bacillus, Aureobacterium o Myroides, por ejemplo Chryseobacterium gleum, C. indologenes, C. meningosepticum C. proteolyticum, Flavobacterium aquatile, Empedobacter brevis, Sphingobacterium spiritivorum, S. heparinum, Bacillus circulans Aureobacterium esteroaromaticum o Myroides odoratus. Una proteína glutaminasa puede derivarse de C. proteolyticum. Por ejemplo, una proteína glutaminasa es un polipéptido que tiene al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o el 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o con la secuencia de aminoácidos madura de SEQ ID NO: 2, teniendo el polipéptido actividad de proteína glutaminasa.
Una secuencia de polipéptidos maduros de SEQ ID NO: 2 puede comprender o contener los aminoácidos 136 a 320 de la SEQ ID NO: 2, en la que la metionina presente en la posición 1 en la SEQ ID NO: 2 se cuenta como el número i.
Se puede producir una proteína glutaminasa en cualquier organismo adecuado mediante procedimientos conocidos por un experto en la técnica. Se puede producir una proteína glutaminasa en bacterias, por ejemplo, del género Pseudomonas, Bacillus o Escherichia, por ejemplo Pseudomonas putida, Bacillus subtilis o Escherichia coli.
Una proteína glutaminasa puede ser una proteína glutaminasa pura o purificada. Una proteína pura de glutaminasa purificada es una enzima que puede ser al menos el 50% pura, por ejemplo, al menos el 60% pura, al menos el 70% pura, al menos el 75% pura, al menos el 80% pura, al menos el 85% pura, al menos el 80% pura, al menos el 90% pura, o al menos el 95% pura, el 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% pura, por ejemplo, según se determina por SDS-PAGE o cualquier otro procedimiento analítico adecuado para este propósito y conocido por el experto en la técnica.
En una forma de realización, la presente divulgación se refiere a un proceso según la reivindicación 3 para mejorar la solubilidad de una proteína vegetal elegida a partir de guisante, soja o cereal y opcionalmente para reducir la capacidad de formación de espuma de dicha proteína vegetal que comprende incubar la proteína con una peptidil arginina deiminasa, en la que la proteína se solubiliza y, opcionalmente, se reduce su capacidad de formación de espuma. La solubilidad de la proteína aumenta y, opcionalmente, la capacidad de formación espuma de la proteína se reduce en comparación con una proteína que no se ha incubado con una proteína arginina deiminasa en un proceso tal como se divulga en el presente documento.
La proteína se puede incubar con peptidil arginina deiminasa y opcionalmente proteína glutaminasa a cualquier pH y temperatura adecuados. Preferentemente, la proteína se incuba con peptidil arginina deiminasa y opcionalmente proteína glutaminasa a un pH de entre 5 y 8,5, tal como un pH de entre 5,5 y 8, tal como un pH de entre 6 y 7, o un pH de entre 6,2 y 6,8. Una temperatura adecuada a la que se incuba la proteína con peptidil arginina deiminasa y opcionalmente proteína glutaminasa puede encontrarse entre 20 y 60 grados Celsius, tal como entre 30 y 50, o entre 35 y 45 grados Celsius.
La proteína vegetal tal como se utiliza en el presente documento puede ser una solución que comprende proteína vegetal seleccionada a partir de proteína de guisante, de soja o de cereal. Una solución que comprende proteína vegetal puede ser una bebida que comprende proteína vegetal, por ejemplo una bebida puede ser leche derivada de fuentes vegetales. Las fuentes vegetales de leche incluyen, pero sin limitación, leche extraída de soja, guisante, cacahuete, cebada, arroz, avena, quinoa, almendras, anacardos, coco, avellanas, cáñamo, semillas de sésamo y semillas de girasol.
Figuras
Figura 1. Análisis por SDS PAGE de diversas proteínas incubadas con y sin PAD. Carril 1: marcador MW; Carril 2: proteína de guisante; Carril 3: proteína de guisante PAD; Carril 4: gluten de trigo; Carril 5: gluten de trigo PAD; Carril 6: proteína de soja; Carril 7: proteína de soja PAD; Carril 8: colágeno óseo; Carril 9: colágeno óseo PAD. Figura 2. La solubilidad de la proteína de guisante a diferentes valores de pH incubada con PAD a pH de 6,5 y a 40 °C.
Figura 3. Capacidad de formación de espuma de la proteína de guisante tratada con PAD y PAD y PG a pH de 6,5 y a 40 °C en comparación con la capacidad de formación de espuma de la proteína de guisante y clara de huevo sin tratar.
Ejemplos
Materiales
Técnicas de biología molecular
Las técnicas de biología molecular conocidas por el experto se realizan tal como se establece en Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., C S h L Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).
Clonación y expresión de peptidil arginina deiminasa en Aspergillus niger
La clonación y la expresión del polipéptido que tiene actividad de peptidil arginina desmininasa según la SEQ ID NO: 1 se realizó tal como se divulga en los ejemplos 3 y 4 del documento W02008/000714.
Actividad de peptidil arginina deiminasa
La actividad de la peptidilaginina deiminasa se determinó midiendo la formación de residuos de citrulina en el éster etílico de a-N-benzoil-L-arginina (BAEE). La mezcla de incubación contenía tampón tris-HCI 100 mM (pH 7,5), CaCl2 5 mM, DTT 10 mM, BAEE 10 mM en un volumen final de 700 gl. La incubación se realizó a 55 °C durante 30 min, y la reacción se detuvo mediante la adición de 100 gl de HCIO4 8 N. La citrulina se determinó por colorimetría según el procedimiento de Guthohrlein y Knappe, (1968) Anal. Biochem. 26, 188.
Una unidad de peptidil arginina deiminasa se expresa como 1 gmol de citrulina formada/min/mg de proteína.
Clonación y expresión de proteína glutaminasa (PrgA) de Chryseobacterium proteolyticum en Bacillus subitilis
El vector lanzadera de E. coli B. subtilis pGBB09 que se describe en el documento US 8426182 B1 se utilizó para la expresión de proteína-glutaminasa (PrgA) (SEQ ID NO: 2) a partir de la cepa 9670 de Chryseobacterium proteolyticum (S. Yamaguchi, David J. Jeenes y David B. Archer (2001) Eur. J. Biochem. 268, 1410-1421). El gen prgA se sintetizó con un sitio de restricción PacI y un sitio de unión a ribosoma en el extremo 5' y un doble codón de detención y sitio de restricción Pmel en el extremo 3' y este fragmento de ADN se cataloga como SEQ ID NO: 3. El fragmento se clonó en el vector pGBB09 utilizando los sitios de restricción PacI y PmeI, dando esto como resultado el vector de expresión de PrgA pBHA12-PGU-1. La secuencia del plásmido se confirmó por secuenciación de ADN.
El vector pBHA12-PGU-1 se transformó en la cepa BS154 de B. subtilis (CBS 363.94) (AaprE, AnprE, amyE, spo~) tal como se describe por Quax y Broekhuizen, 1994 Appl Microbiol Biotechnol. 41: 425-431. La cepa BS154 de B. subtilis que contiene el vector de expresión PrgA se denominó BSU154 PGU-1. Se cultivó BSU154 PGU-1 de B. subtilis en un matraz con agitación. Estos matraces con agitación contenían 20 ml de medio 2xTY compuesto por el 1,6% (p/v) de Bacto-triptona, el 1% (p/v) de extracto de levadura y el 0,5% (p/v) de NaCl. Los cultivos se agitaron vigorosamente a 37 °C y 250 rpm durante 16 horas y se utilizaron 0,2 ml de medio de cultivo para inocular 20 ml de medio SMM.
El premedio SMM contenía el 1,25% (p/p) de extracto de levadura, el 0,05% (p/p) de CaCl2 , el 0,075% (p/p) de MgCl2.6H2O, 15 gg/l de MnSO4.4H2O, 10 gg/l de CoCl2.6H2O, el 0,05% (p/p) de ácido cítrico, el 0,025% (p/p) de antiespumante 86/013 (Basildon Chemicals, Abingdon, Reino Unido). Para completar el medio SMM, se añadieron 20 ml de maltosa al 5% (p/v) y 20 ml de una solución madre de tampón de fosfato de Na 200 mM (pH 6,8), preparados y esterilizados por separado, a 60 ml de premedio SMM.
Los cultivos se incubaron a 37 °C y 250 rpm durante 48 horas. Los sobrenadantes se cosecharon por centrifugación a 13000 rpm durante 5 minutos, después de lo cual se almacenaron a -20 °C hasta su uso posterior.
Actividad de proteína glutaminasa (PG)
La actividad de PG se midió utilizando un procedimiento modificado descrito por Yamaguchi S. et al. en Appl. Reinar. Microbiol (2000), Vol 66, N° 8, p. 3337-3343. El sustrato Z-Gln-Gly 10 mM (Sigma) se preparó en tampón de fosfato de sodio 65 mM a pH 6,5 y se incubó con la enzima a 40 °C. La reacción se detuvo con 255 de ácido tricloroacético, operación seguida de centrifugación a 20000 g durante 5 minutos. El amoniaco liberado se midió por medio del procedimiento de Berthelot. La actividad enzimática se expresó como la cantidad de amoniaco (en mmol) liberada a 40 °C en 30 min.
Ejemplo 1. La peptidil arginina deiminasa (PAD) es activa en varios sustratos proteicos
La peptidil arginina deiminasa (PAD) convierte la arginina en citrulina, por lo que se libera amoniaco. Por lo tanto, la liberación de amoniaco es una medida de la actividad enzimática en los sustratos proteicos elegidos.
Se pesaron 40 mg de sustratos proteicos de aislado de proteína de soja (Wilmar International Ltd), aislado de proteína de guisante (Pisane F9, Cosucra), gluten de trigo (Sigma) y colágeno insoluble (Sigma) en vasos Eppendorf de 2 ml y se añadió 1 ml de fosfato de sodio 50 mM a pH de 6,5. Las incubaciones se iniciaron añadiendo enzima PAD a una dosis de 0,1% v/p sobre materia seca. Después de 16 horas de incubación a 40 °C, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 14.000 rpm a 25-40 °C. Las muestras se diluyeron una vez, excepto el colágeno, que se diluyó dos veces, y las muestras se centrifugaron nuevamente sobre el filtro 10K PES. Los sustratos proteicos sin adición de PAD se incubaron en las mismas condiciones para que sirvieran como blanco. El sobrenadante de las muestras se almacenó a 4 °C.
El análisis de amoniaco se realizó con el kit de ensayo de amoniaco (Sigma-Aldrich)
El kit está diseñado para la determinación cuantitativa y enzimática de amoniaco en alimentos y muestras biológicas. El amoniaco reacciona con ácido a-cetoglutárico y reduce el NADPH en presencia de L-glutamato deshidrogenasa para formar L-glutamato y NADP+ . La disminución de la absorbancia a 340 nm (NADPH ^ NADP+) es proporcional a la concentración de amoniaco.
Se añadieron 100 gl del sobrenadante de las incubaciones de proteínas a 1 ml de reactivo de ensayo de amoniaco. Después de mezclar, la solución se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente y se determinó la absorbancia a 340 nm. Posteriormente se añadieron 10 gl de la deshidrogenasa. La absorbancia se midió nuevamente después de 5 minutos de incubación. La cantidad de amoniaco se calculó utilizando el coeficiente de extinción molar de NADPH.
Se utilizó una solución estándar de amoniaco como control.
La tabla 1 muestra la cantidad de amoniaco liberado después de incubar el sustrato proteico con PAD a 40 °C durante 16 h, menos la cantidad de amoniaco medido en el sustrato incubado sin PAD.
Tabla 1. Amoniaco liberado a partir de varios sustratos proteicos después de incubación con PAD a 40 °C durante 16 h.
Figure imgf000007_0001
Ejemplo 2. Cambios en la solubilización de proteínas después de incubación con peptidil arginina deiminasa Se incubaron sustratos proteicos de aislado de proteína de soja (Wilmar International Ltd), guisante (Pisane C9, Cosucra), gluten de trigo (Sigma) y colágeno insoluble (Sigma) con peptidil arginina deiminasa (PAD) y se midió la cantidad de proteína solubilizada.
Se mezclaron 200 mg de sustrato con 4,8 ml de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 6,5, en tubos Greiner que contenían un agitador magnético y se dispusieron en un baño de agua con un dispositivo para agitación magnética de 40 °C. Se añadió proteína enzimática PAD al 0,1% sobre materia seca. Las muestras se incubaron durante la noche y se centrifugaron durante 25 minutos a 3220 * g. Los sobrenadantes se centrifugaron de nuevo durante 20 minutos a 14.000 rpm.
Las muestras se utilizaron para medir la solubilización de proteínas midiendo el contenido de nitrógeno (N) en el sobrenadante después de centrifugación utilizando el análisis de Kjeldahl. Los resultados del análisis de proteínas se presentan en la tabla 2.
Tabla 2. Solubilización de proteínas después de incubación con PAD a 40 °C durante 16 h, medida como nitrógeno (Kjeldahl)
Figure imgf000007_0002
Análisis por SDS-PAGE
Los sustratos proteicos incubados con peptidil arginina deiminasa se analizaron mediante SDS-PAGE.
Se mezclaron 65 gl de los sobrenadantes con 25 gl de tampón de muestra LiDS y 10 gl de agente reductor de muestra. La mezcla se calentó durante 15 minutos a 70 °C. Posteriormente, se aplicaron 10 gl de cada muestra al gel Bis-Tris al 10% y las proteínas se separaron utilizando tampón MES como sistema de ejecución durante 39 minutos a 200 V. El gel se tiñó con Instant Blue.
El gel de SDS-PAGE que se muestra en la figura 1 muestra que no se observó proteólisis en las incubaciones de los diferentes sustratos proteicos con peptidil arginina deiminasa.
Ejemplo 3. Solubilidad de proteínas vegetales tratadas con peptidil arginina deiminasa o una combinación de peptidil arginina desminasa y proteína glutaminasa
Se preparó una dispersión de 100 mg/ml de proteínas vegetales a partir de proteína de guisante (Pisane C9, Cosucra), aislado de proteína de soja (Wilmar Int. Ltd.) y aislado de proteína de arroz en agua a pH 6,5. A estas dispersiones, se añadieron el 0,1% en peso/peso de PAD o el 0,1% en peso de PAD y el 0,1% en peso de proteína enzimática PG a materia seca y se incubaron en un mezclador termostático durante 4 horas a 40 °C. Después de 4 h, el material se

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Uso de peptidil arginina deiminasa (EC 3.5.3.15) para mejorar la solubilidad de una proteína vegetal a un pH de entre 5 y 8,5, en el que la proteína vegetal es guisante, soja o cereal.
2. Uso según la reivindicación 1, que comprende además el uso de una proteína glutaminasa (EC 3.5.1.44).
3. Un proceso para mejorar la solubilidad de una proteína vegetal que comprende incubar la proteína vegetal con una peptidil arginina deiminasa a un pH de entre 4 y 9, en el que la proteína vegetal muestra una solubilidad mejorada a un pH de entre 5 y 8,5, siendo la proteína vegetal proteína de guisante, de soja o de cereal.
4. Un proceso según la reivindicación 3, en el que la proteína vegetal se incuba adicionalmente con una proteína glutaminasa (EC 3.5.1.44).
5. Uso según la reivindicación 1 o 2 o proceso según la reivindicación 3 o 4, comprendiendo también el uso o el proceso reducir la capacidad de formación de espuma de la proteína.
6. Uso según las reivindicaciones 1,2 o 5 o un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en los que que la solubilidad de la proteína se aumenta en al menos un 2%.
7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 o 6 o un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en los que la proteína de cereal es gluten.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 o 6 o 7 o un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en los que la proteína vegetal es una solución que comprende proteína vegetal.
9. Uso o proceso según la reivindicación 8, en los que la solución es una bebida.
10. Uso o proceso según la reivindicación 9, en los que la bebida es leche derivada de una fuente vegetal.
11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 a 10 o un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en los que la peptidil arginina deiminasa tiene al menos el 80% de identidad con la SEQ ID NO: 1, o con la secuencia de aminoácidos madura de la SEQ ID NO: 1.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020521658A (ja) * 2017-07-28 2020-07-27 ヒューレット−パッカード デベロップメント カンパニー エル．ピー．Ｈｅｗｌｅｔｔ‐Ｐａｃｋａｒｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｌ．Ｐ． 特性値シフトを補正するための特性データの変換
CN107568410B (zh) * 2017-10-12 2020-12-01 江南大学 一种制备高可溶性共架结构的大米蛋白的方法
EP3775146B1 (en) 2018-03-29 2026-03-04 DSM IP Assets B.V. Process for the preparation of a stable beverage
PL3801068T3 (pl) 2018-06-07 2025-12-08 Dsm Ip Assets B.V. Izolat modyfikowanego białka rzepakowego
WO2019233923A1 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Dsm Ip Assets B.V. Use of peptidylarginine deiminase to obtain improved sweet protein
EP3802817A1 (en) 2018-06-07 2021-04-14 DSM IP Assets B.V. Use of peptidylarginine deiminase to obtain improved food
EP3911177A4 (en) * 2019-01-18 2022-09-28 Ripple Foods, PBC NON-DAIRY ANALOGUES AND BEVERAGES WITH DEAMIDATED PLANT PROTEINS AND METHODS OF MAKING SUCH PRODUCTS
BR112021016611A2 (pt) * 2019-02-21 2021-11-03 Amano Enzyme Europe Ltd Prevenção de agregação em leite de oleaginosas
CA3130907A1 (en) * 2019-02-21 2020-08-27 Amano Enzyme Inc. Prevention of aggregation in plant milk
EP3930478B1 (en) * 2019-02-26 2025-01-29 Amano Enzyme USA Co., Ltd. Stable protein formulations
EP3995000A4 (en) 2019-07-03 2023-07-05 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING A MODIFIED PEA PROTEIN
WO2021236749A1 (en) * 2020-05-20 2021-11-25 Corn Products Development, Inc. Composition, methods, and uses for pea protein isolates having improved dissolution characteristics
US20210401022A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Puris Proteins, LLC Non-soy, legume, protein material and method of making such
JPWO2022045152A1 (es) * 2020-08-24 2022-03-03
CN114304276A (zh) * 2020-09-30 2022-04-12 天野酶制品株式会社 加工植物性奶的制造方法
CN114521593A (zh) * 2020-11-05 2022-05-24 天野酶制品株式会社 提高分散稳定性和/或溶解性的加工植物性奶的制造方法
CA3250261A1 (en) * 2022-02-02 2023-08-10 Corn Products Development, Inc. Edible compositions comprising de-amided vegetable protein isolates
CN121794375A (zh) 2023-07-11 2026-04-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 蛋白质精氨酸脱亚胺酶
WO2025073989A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Dsm Ip Assets B.V. Acid stable soy or almond protein
WO2026060197A1 (en) * 2024-09-13 2026-03-19 International N&H Denmark Aps Novel protein glutaminase for plant based beverages

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3678310B2 (ja) * 1994-04-22 2005-08-03 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 植物性タンパク質の溶解度を改善する方法
US20090297689A1 (en) * 2006-06-26 2009-12-03 Luppo Edens Peptidylarginine deiminase and uses thereof in the production of citrullinated proteins and peptides
US20160186188A1 (en) * 2010-02-09 2016-06-30 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for altering polypeptide expression and solubility

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