ES2817843T3 - Generador de gotitas y procedimiento de generación - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para generar gotitas a partir de una muestra líquida caracterizado por las etapas de: a) ubicar la muestra en una primera ubicación de electrohumectación y aplicar un voltaje de CA en la primera ubicación de electrohumectación para generar una fuerza de electrohumectación que hace que una región de la muestra se alargue en una dirección en la que se aplica la fuerza de electrohumectación, donde el voltaje de CA es proporcionado por un circuito de impulso; b) alterar temporalmente la fuerza de electrohumectación en la muestra causada por el voltaje de CA y aplicar un voltaje de CC constante o monótonamente creciente para acumular carga electrostática superficial en la muestra para contrarrestar las fuerzas de tensión superficial entre la mayor parte de la muestra y la región de muestra alargada por medio de repulsión de carga; c) restaurar posteriormente la fuerza de electrohumectación causada por el voltaje de CA; d) seguir alargando la región de muestra alargada cargada usando la fuerza de electrohumectación para separar una gotita de la región de muestra más alargada.

Description

DESCRIPCIÓN
Generador de gotitas y procedimiento de generación
Esta invención se refiere a un procedimiento para generar gotitas a partir de una muestra de líquido más grande y a un generador de gotitas que emplea dicho procedimiento.
Los dispositivos de microfluidos que se basan en la generación y manipulación de gotitas, especialmente microgotitas, se están convirtiendo cada vez más en un foco de aplicación tecnológica; especialmente en dispositivos biomédicos. Esto se debe en parte a que muchos miles de tales gotitas pueden dirigirse de forma confiable a través de los diversos componentes del dispositivo utilizando una multiplicidad de vías de electrohumectación. En una versión de tales dispositivos, las gotitas se pueden generar a partir de una muestra líquida que fluye a lo largo de una ruta de microfluidos que culmina en un cabezal de gotitas que las descarga en un medio portador inmiscible. Por este medio, las gotitas acuosas pueden descargarse, por ejemplo, en un vehículo tal como un fluorocarbono, hidrocarburo o aceite de silicona. A continuación, las gotitas se pueden alejar del cabezal utilizando una red de electrodos que aplican fuerzas propulsoras de electrohumectación. En tales dispositivos se requiere una constricción del fluido tal como un orificio conformado o un canal estrecho para separar la gotita del flujo masivo continuo mediante la aplicación de fuerzas de cizallamiento hidrodinámicas.
Cuando las gotitas se van a manipular usando fuerzas de electrohumectación, resulta atractivo reemplazar el cabezal de gotitas y generar las gotitas directamente desde el medio de muestra utilizando fuerzas de electrohumectación en lugar de las fuerzas de cizallamiento mencionadas anteriormente. Este enfoque tiene la ventaja adicional en determinadas circunstancias de poder obviar la necesidad de un vehículo líquido de modo que la gotita se pueda generar y manipular simplemente en aire o en un gas inerte como el nitrógeno. Langmuir 5 (1989) p376 y las publicaciones web DÜI:10.1002/anie.200503540 y DOI:10.1002/elps.201600276 describen técnicas de electrohumectación y electrostática aplicadas a gotitas.
El documento US2015174578 está dirigido a un activador de gotitas con una configuración de electrodo de formación de gotitas asociado con una superficie de operaciones de gotitas, donde la configuración de electrodo comprende uno o más electrodos configurados para controlar el volumen de una gotita durante la formación de una subgotita en la superficie de operaciones de gotitas. También se proporcionan procedimientos para fabricar y utilizar el activador de gotitas.
Sin embargo, la generación de gotitas usando la división por electrohumectación puede ser problemática. En primer lugar, existe un conjunto relativamente estrecho de limitaciones físicas determinadas por los materiales empleados y las dimensiones de microfluidos del generador de gotitas en el que tiene lugar la división. Por ejemplo, en ciertas configuraciones de EWOD de doble cara, se puede imponer una restricción a las condiciones para dividir una gotita usando fuerzas de electrohumectación porque es necesario que la gotita esté confinada entre dos placas paralelas para poder dividirla mediante una acción de estiramiento. Para una fuerza de electrohumectación dada, el volumen más pequeño de gotita que se puede dividir se contrae a medida que disminuye el espacio entre las placas de confinamiento. Existe una ventaja, por lo tanto, en minimizar la separación de las placas en el dispositivo de electrohumectación para permitir la división de pequeñas gotitas hijas con una fuerza de electrohumectación limitada. Sin embargo, en ciertos sistemas es ventajoso usar el sistema de electrohumectación para transportar micropartículas, células, organoides y otros objetos en el líquido que pueden no encajar físicamente en placas poco espaciadas. Es importante destacar que siempre existe un límite superior para la cantidad de fuerza de electrohumectación que se puede aplicar a la muestra con el fin de alargar una región. Este límite está impuesto por efectos físicos como la saturación del ángulo de contacto, el ensuciamiento de la superficie y la ruptura dieléctrica que existen en todos los sistemas prácticos de transporte de líquidos por electrohumectación. La naturaleza finita de la cantidad de fuerza de electrohumectación que se puede aplicar en un sistema es problemática porque, durante el alargamiento, la tensión superficial del medio de muestra actúa continuamente en oposición, por lo cual obliga a la necesidad de aplicar una fuerza de electrohumectación progresivamente creciente. Por lo tanto, contrarrestar este efecto de tensión superficial es fundamental si se va a generar de forma fiable una corriente de muchos miles de gotitas sin necesidad de utilizar placas espaciadas extremadamente estrechas que limitan la utilidad del dispositivo para manipular muestras que contienen partículas o células.
Hemos descubierto que este problema puede superarse mediante un procedimiento en el que se aplican ciclos de fuerzas de electrohumectación y carga electrostática a una región de la muestra hasta el momento en que la región haya experimentado un alargamiento suficiente para que una gotita se divida sin causar roturas simultáneas de la muestra. La carga electrostática acumulada en la superficie de la gotita actúa para contrarrestar la tensión superficial mediante la repulsión de tipo carga; esto permite más estiramiento y alargamiento de lo que se puede lograr de otra manera en una gotita sin carga.
La invención es como se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para generar gotitas de una muestra líquida caracterizado por las etapas de:
a) ubicar la muestra en una primera ubicación de electrohumectación y aplicar un voltaje de CA en la primera ubicación de electrohumectación para generar una fuerza de electrohumectación que hace que una región de la muestra se alargue en una dirección en la que se aplica la fuerza de electrohumectación, en donde la tensión de CA es proporcionada por un circuito de impulso;
b) reducir temporalmente la fuerza de electrohumectación en la muestra causada por el voltaje de CA y aplicar un voltaje de CC constante o monótonamente creciente para acumular carga superficial electrostática en la muestra para contrarrestar las fuerzas de tensión superficial entre la mayor parte de la muestra y la región de muestra alargada por medio de repulsión carga-carga;
c) restaurar posteriormente la fuerza de electrohumectación causada por el voltaje de CA;
d) alargar aún más la región de muestra alargada, cargada usando la fuerza de electrohumectación para dividir una gotita de la región de muestra más alargada.
El procedimiento de la invención tiene la ventaja de que aplicando uno o más ciclos de carga y alargamiento, las microgotitas que tienen dimensiones en el rango de menos de 1 milímetro, adecuadamente menos de 25 micrones, pueden extraerse fácil y progresivamente de la muestra. Además, el procedimiento también es especialmente útil en situaciones en las que las fuerzas de electrohumectación se generan ópticamente usando luz que incide en una capa semiconductora; véase, por ejemplo, las publicaciones US6958132 y US7727771.
En una forma de realización, las etapas (a) a (d) se repiten varias veces hasta que haya ocurrido un alargamiento suficiente de la región de muestra para que tenga lugar la etapa (e).
De manera adecuada, el procedimiento de la invención comprende además la etapa (f) de transportar la gotita dividida fuera de la primera ubicación a lo largo de un camino que comprende la primera ubicación y al menos una segunda ubicación de electrohumectación. En una forma de realización, las etapas (a) a (f) se repiten varias veces para fraccionar la muestra en una corriente de gotitas, cada una de igual volumen, que se puede transportar fuera de la muestra original y posteriormente rellenar con material como el analito en investigación y cualquier reactivo químico secundario y moléculas marcadoras requeridas; por ejemplo, sensores biológicos que generan una fluorescencia característica. Los analitos adecuados para la investigación en tales gotitas incluyen, pero no se limitan a, material biológico como estructuras organoides; células; biomoléculas tales como proteínas y polinucleótidos derivados de ADN o ARN de origen natural y micropartículas funcionalizadas tales como perlas de polímero a las que se pueden o se han unido biomoléculas y/o marcadores diana.
Las diversas ubicaciones empleadas en el procedimiento de la invención son ubicaciones de electrohumectación y, en una forma de realización, pueden estar compuestas por regiones en una superficie dieléctrica que se superponen a electrodos unidos a un circuito de impulso que proporciona un voltaje alterno y genera así la fuerza de electrohumectación. Alternativamente, estas ubicaciones de electrohumectación pueden comprender ubicaciones de electrodos virtuales generadas transitoriamente en una capa semiconductora ubicada debajo de una superficie dieléctrica transparente por medio de la incidencia de radiación electromagnética. En otra forma de realización más, las fuerzas de electrohumectación surgen de un voltaje de CA dirigido a un conjunto específico de ubicaciones de electrohumectación mediante la conmutación externa del voltaje alterno a un electrodo específico o dirigiendo el voltaje alterno por medio de una zona semiconductora activada por la incidencia de radiación electromagnética. Este último entonces actúa para dirigir una fuente de voltaje externo aplicado a través del dispositivo por medio de un electrodo plano continuo. En una forma de realización, se alargan progresivamente múltiples regiones a partir de una única muestra parental, de modo que se pueden crear múltiples gotitas hijas o un flujo de gotitas hijas mediante separación simultánea.
En la etapa (a) del procedimiento de la invención, la muestra de líquido de origen se ubica en la primera ubicación y se aplica una fuerza de electrohumectación a una región de la muestra para provocar el alargamiento en una dirección dada hacia fuera de la mayor parte de la muestra. Esta fuerza de electrohumectación se proporciona por medio de un circuito de impulso como se explicó anteriormente que incluye un electrodo en o adyacente a la primera ubicación a la que se aplica una tensión de impulso de CA sinusoidal que no tiene componente de CC. Como también se mencionó anteriormente, los electrodos utilizados para aplicar esta fuerza pueden ser reales o virtuales.
De manera adecuada, en la etapa (b) el voltaje de impulso en la primera ubicación se altera temporalmente de modo que se puede hacer que la muestra de líquido de origen acumule una carga superficial electrostática significativa. Esta alteración temporal puede comprender la eliminación completa del voltaje de impulso o una reducción significativa de su intensidad. Esta carga electrostática se logra aplicando o superponiendo a la muestra en este momento un voltaje de carga de CC constante o que aumenta monótonamente. La duración óptima de la interrupción de la fuerza de electrohumectación para permitir la carga de la interfaz líquida está determinada por parámetros físicos subyacentes. Estos incluyen la viscosidad del líquido que se convierte en gotitas, la viscosidad del medio circundante (líquido o gas), el coeficiente de fricción entre los fluidos y los sustratos de electrohumectación y las tensiones superficiales en el sistema que existen entre los dos fluidos inmiscibles y en el interfaz fluido-sustrato. Todos estos parámetros interactúan para producir un tiempo de relajación característico para el proceso de retroceso de la gotita hacia la muestra de líquido original impulsada por la fuerza de la tensión superficial. Si el tiempo empleado en cargar la gotita es sustancialmente menor que este tiempo de relajación característico, la interfaz se cargará completamente antes de que la gotita se haya relajado de nuevo en el depósito de líquido principal debido a la interrupción temporal de la fuerza de electrohumectación. En una forma de realización, la duración de la aplicación de voltaje de carga dura desde aproximadamente 10 a 100 milisegundos. En otra forma de realización, la muestra se carga electrostáticamente de modo progresivo hasta un grado que es menor que el límite de Rayleigh para el medio de muestra empleado. De esta manera, se asegura que la muestra permanezca intacta mientras se aplica la fuerza de electrohumectación. Sin embargo, en ciertas aplicaciones, donde la gotita contiene el analito en forma de células biológicas, puede ser conveniente cargar la gotita al principio más allá del límite de Rayleigh para lisar o romper de otro modo las membranas celulares permitiendo así que se libere su contenido.
En una forma de realización, la alteración temporal del voltaje de impulso y la aplicación del voltaje de carga es controlada por un microprocesador usando algoritmos predeterminados.
El procedimiento de la invención también puede manifestarse como hardware adecuado para generar gotitas para una variedad de usos que incluyen, pero no se limitan a, los descritos anteriormente. Por tanto, de acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un generador de gotitas caracterizado por comprender:
• una primera ubicación de electrohumectación adaptada para recibir una muestra de líquido;
al menos una segunda ubicación de electrohumectación dispuesta de manera que la primera y la segunda ubicaciones de electrohumectación definen un camino a lo largo del cual las gotitas divididas de la muestra pueden ser transportadas usando fuerzas direccionales de electrohumectación; un circuito de impulso de CA dispuesto en la primera ubicación de electrohumectación y compuesto por un electrodo y un circuito eléctrico de CA asociado o una zona semiconductora activada por la incidencia de luz electromagnética sobre el mismo, un circuito de carga de CC dispuesto en la primera ubicación de electrohumectación y adaptado para cargar electrostáticamente la superficie de la muestra y un microprocesador configurado para controlar un voltaje de impulso de CA producido por el circuito de impulso de CA y la aplicación del voltaje de carga de CC producido por el circuito de carga de CC utilizando algoritmos predeterminados, y de esta manera hacer que el generador de gotitas lleve a cabo el procedimiento de la presente invención.
En una forma de realización, el generador de gotitas comprende además un circuito de control para conmutar entre los circuitos de impulso y carga que son adecuadamente circuitos de CA y CC respectivamente. En otra forma de realización, el generador de gotitas comprende además un analizador para analizar el contenido de cada gotita producida. Por ejemplo, esto puede comprender una zona a través de la cual cada gotita puede pasar sucesivamente y ser examinada por la luz de una fuente como un láser o un LED. Este analizador puede comprender además un detector para detectar, por ejemplo, la fluorescencia emitida por las gotitas o la absorbancia de radiación ultravioleta o infrarroja en una o más longitudes de onda elegidas. Esto permite utilizar el generador de gotitas, por ejemplo, para detectar moléculas biológicas que han sido etiquetadas, por ejemplo, con un marcador o tintura fluorescente. El generador de gotitas descrito en este documento es especialmente útil para llevar a cabo procedimientos de secuenciación de ácidos nucleicos basados en gotitas como los descritos en nuestras patentes anteriores o para análisis de alto rendimiento de muestras con el fin de detectar la presencia de infecciones bacterianas o virales, cánceres y otras enfermedades genéticas o anomalías en muestras médicas de mamíferos; biopsias de sangre, plasma, esputo, orina y tejidos. También es especialmente útil para formar gotitas que contienen células, organoides o micropartículas que se pueden manipular en la plataforma de electrohumectación con el fin de realizar ensayos de función celular, interacción celular con sustancias químicas como fármacos, estimulantes y sustratos metabólicos, interacciones entre células y lisis de células.
La invención se ilustra ahora con referencia a lo siguiente. Se empleó un sustrato de electrohumectación activado ópticamente del tipo descrito en nuestra solicitud de patente anterior (PCT/EP2018/066573). Constaba de placas de vidrio superior e inferior cada una de 500 pm de espesor y recubiertas con capas transparentes de óxido de indio y estaño conductor (ITO) con un espesor de 130 nm. Cada capa estaba conectada a un circuito de impulso de A/C y un circuito de carga de CC. Una de las placas se revistió con una capa intermedia de silicio amorfo que tenía un espesor de 800 nm. A continuación, ambas placas se revistieron con capas de 160 nm de espesor de alúmina de alta pureza que, a su vez, se revistieron con una capa de 80 nm de Teflón™ AF para hacer que las superficies finales en contacto con la muestra fueran hidrófugas. A continuación, las dos placas se separaron 20 pm utilizando espaciadores y se insertó una muestra de líquido.
En una ubicación determinada donde se ubicaría la muestra, la placa que contenía silicio se iluminó con un LED desde abajo con luz visible (longitud de onda 660 u 830 nm) a un nivel de 0.01 W/cm2 para activar la fuerza de electrohumectación deseada a través del circuito de impulso. La muestra empleada estaba compuesta por un cultivo acuoso de células inmortalizadas en un medio de crecimiento.
A continuación, se extrajeron progresivamente las gotitas hijas de la muestra interrumpiendo periódicamente la aplicación de la fuerza de electrohumectación y reemplazándola con una fuerza de carga aumentada, suministrada por el circuito de CC en una serie de pulsos alternos a una tasa de repetición predeterminada. En el proceso, la muestra se alargó progresivamente en la dirección de la fuerza de electrohumectación aplicada hasta el momento en que se rompió la gotita hija. Después de la rotura, la gotita hija se alejó de la vecindad de la muestra utilizando caminos de otra estructura de electrohumectación dispuestas alrededor del sitio que contiene la muestra cómo se explicó en nuestra solicitud de patente anterior.
Esta metodología se utilizó para investigar las características del proceso de separación de la gotita hija en términos de tamaño mínimo de gotita y distancia de ruptura. Los resultados se recopilan en la siguiente tabla que muestra que usando el procedimiento de la invención se puede obtener una reducción sustancial en el volumen mínimo de gotitas hijas mientras que al mismo tiempo se minimiza la distancia de alargamiento requerida para alcanzar el punto de ruptura.
Tabla
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La Tabla de la Figura 1 es un par de microfotografías de una gotita que se desprende del tapón de entrada de líquido mientras está bajo carga intermitente.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para generar gotitas a partir de una muestra líquida caracterizado por las etapas de:
a) ubicar la muestra en una primera ubicación de electrohumectación y aplicar un voltaje de CA en la primera ubicación de electrohumectación para generar una fuerza de electrohumectación que hace que una región de la muestra se alargue en una dirección en la que se aplica la fuerza de electrohumectación, donde el voltaje de CA es proporcionado por un circuito de impulso;
b) alterar temporalmente la fuerza de electrohumectación en la muestra causada por el voltaje de CA y aplicar un voltaje de CC constante o monótonamente creciente para acumular carga electrostática superficial en la muestra para contrarrestar las fuerzas de tensión superficial entre la mayor parte de la muestra y la región de muestra alargada por medio de repulsión de carga;
c) restaurar posteriormente la fuerza de electrohumectación causada por el voltaje de CA;
d) seguir alargando la región de muestra alargada cargada usando la fuerza de electrohumectación para separar una gotita de la región de muestra más alargada.
2. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la etapa (e) de transportar la gotita separada fuera de la primera ubicación de electrohumectación a lo largo de un camino que comprende la primera ubicación de electrohumectación y al menos una segunda ubicación donde se aplican fuerzas de electrohumectación adicionales.
3. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el voltaje de carga de CC es un voltaje de CC constante.
4. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el voltaje de carga de CC es un voltaje que aumenta monótonamente.
5. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las fuerzas de electrohumectación surgen de un voltaje de impulso de CA que se dirige a la ubicación o las ubicaciones de electrohumectación por medio de un electrodo específico ubicado en cada ubicación, o por medio de un electrodo virtual en cada ubicación creado por medio de una capa semiconductora activada en ubicaciones correspondientes por incidencia de radiación electromagnética.
6. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las gotitas tienen menos de 1 milímetro de diámetro.
7. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque las etapas (a) a (e) se repiten varias veces para generar un flujo de gotitas.
8. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra se fracciona en múltiples gotitas de igual volumen.
9. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se aplican múltiples fuerzas de electrohumectación a una única muestra de líquido para hacer que se divida en múltiples gotitas simultáneamente.
10. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la gotita o al menos algunas de las gotitas contienen una o más moléculas biológicas, células o micropartículas funcionalizadas.
11. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la conmutación entre la aplicación de la fuerza de electrohumectación y la carga electrostática se logra usando un microprocesador que aplica algoritmos.
12. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la muestra se carga progresivamente hasta un grado que es menor que el límite de Rayleigh para el medio de muestra.
13. Un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1a 11, caracterizado porque la muestra contiene células y se carga inicialmente más allá del límite de Rayleigh para lisar o romper de otro modo las membranas de las células.
14. Un generador de gotitas, el generador de gotitas comprende:
• una primera ubicación de electrohumectación adaptada para recibir una muestra de líquido;
• al menos una segunda ubicación de electrohumectación dispuesta de modo que la primera y la segunda ubicaciones de electrohumectación definan una vía a lo largo de la cual las gotitas separadas de la muestra pueden ser transportadas usando fuerzas direccionales de electrohumectación;
• un circuito de impulso de CA dispuesto en la primera ubicación de electrohumectación y que comprende un electrodo y un circuito eléctrico de CA asociado o una zona semiconductora activada por la incidencia de luz electromagnética sobre la misma;
• un circuito de carga de CC dispuesto en la primera ubicación de electrohumectación y configurado para aplicar un voltaje de carga de CC en la primera ubicación de electrohumectación para cargar electrostáticamente la superficie de la muestra; y
• un microprocesador configurado para controlar un voltaje de impulso de CA producido por el circuito de impulso de CA y la aplicación del voltaje de carga de CC producido por el circuito de carga de CC utilizando algoritmos predeterminados, y de ese modo hacer que el generador de gotitas lleve a cabo un procedimiento de acuerdo con cualquier una de las reivindicaciones anteriores.
15. Generador de gotitas como se reivindica en la reivindicación 14, caracterizado porque comprende además un circuito de control para conmutar entre los circuitos de impulso y de carga de CA.
16. Generador de gotitas como se reivindica en la reivindicación 14 o la reivindicación 15, caracterizado porque comprende además un analizador para analizar el contenido de cada gotita producida.
17. Generador de gotitas como se reivindica en la reivindicación 16, caracterizado porque el analizador está dispuesto para detectar la fluorescencia emitida por las gotitas cuando se examina con radiación electromagnética.
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