ES2817897T3 - PTPRS y proteoglicanos en enfermedad autoinmune - Google Patents

Abstract

Una proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS, donde la proteína comprende tanto el dominio 1 (Ig1) de tipo inmunoglobulina como el dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig2) de PTPRS, para su uso en terapia.

Description

DESCRIPCIÓN

PTPRS y proteoglicanos en enfermedad autoinmune

Antecedentes de la invención

Aproximadamente del 5 al 8 % de las personas en los Estados Unidos padecen una enfermedad autoinmune. Los investigadores han identificado más de 80 enfermedades autoinmunes diferentes y sospechan que muchas más enfermedades pueden tener un componente autoinmune. La artritis reumatoide (AR) por sí sola afecta a aproximadamente 2,5 millones de personas en los Estados Unidos. La AR afecta a las articulaciones y los huesos, pero también puede afectar a diferentes órganos y sistemas biológicos.

Los sinoviocitos de tipo fibroblasto (FLS) son actores clave en la mediación de la inflamación y la destrucción articular en la artritis reumatoide (AR). Existe un mayor nivel de atención para este tipo de células como posible objetivo de una nueva generación de terapias anti-AR, que se utilizarían en combinación con inmunomoduladores para ayudar a controlar la enfermedad sin aumentar la inmunosupresión. El comportamiento de los FLS está controlado por múltiples vías de transducción de señales interconectadas. Varias de estas vías implican la fosforilación reversible de proteínas en residuos de tirosina, que es el resultado de la acción equilibrada de las proteínas tirosina cinasas (PTK) y fosfatasas (PTP). Las PTK son mediadoras del crecimiento y la invasividad de los FLS. Las PTP actúan eliminando los grupos fosfato de los residuos de tirosina fosforilados en las proteínas. Las proteínas de tipo receptor de tirosina fosfatasas (RPTP o PTPR) son PTP que generalmente tienen un dominio extracelular de longitud variable seguido de una región transmembrana y un dominio citoplásmico catalítico C-terminal. Sin embargo, se sabe poco sobre la conexión entre las PTP o las PTPR en relación con FLS. En el documento WO2012/148003 se proporcionan anticuerpos anti-PTPRS que pueden detectar, identificar o aislar células dendríticas plasmocitoides (pDC). Coles et al., Science (2011), vol. 332, 484-488 describen estudios cristalográficos para investigar la base estructural del reconocimiento de proteoglicanos en las RPTP y RPTP de tipo IIa en general. En el presente documento se proporcionan métodos y composiciones que abordan estas y otras necesidades en la técnica.

Breve sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones. La invención proporciona una proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS, donde la proteína comprende tanto el dominio 1 (Ig1) de tipo inmunoglobulina como el dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig2) de PTPRS, para su uso en terapia.

La invención también proporciona un agente de desagrupación de PTPRS para su uso en un método de tratamiento de artritis donde el agente de desagrupación de PTPRS se selecciona de: la proteína recombinante no enzimática como se define en el presente documento; un anticuerpo anti-PTPRS, o un fragmento del mismo; o un anticuerpo antiheparán sulfato, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de desagrupación de PTPRS, donde la administración trata la artritis en el sujeto.

En el presente documento se describen métodos para modular la matriz extracelular en un sujeto. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad eficaz de una proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS o una porción del mismo.

En el presente documento se describen métodos para identificar un agente de desagrupación de PTPRS candidato. Los métodos incluyen poner en contacto un agente de prueba con proteínas PTPRS agrupadas y detectar la desagrupación de las proteínas PTPRS, identificando así un agente de desagrupación de PTPR^s candidato. Como alternativa, los métodos incluyen poner en contacto un agente de prueba con PTPRS y heparán sulfato, y determinar si el agente de prueba inhibe la unión de las PTPRS al heparán sulfato, inhibición de la unión que indica que el agente de prueba es un agente de desagrupación de PTPRS.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B son gráficos que representan la expresión de PTPRS en sinoviocitos de tipo fibroblasto (FLS). La figura 1A muestra la expresión en ratones. La figura 1B muestra la expresión en seres humanos.

Las figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2E y 2F son imágenes y gráficos que representan una mayor gravedad de la erosión ósea en la artritis para ratones PTPRS -/- en comparación con ratones PTPRS /+. A los ratones se les inyectaron 100 pl de suero K/BxN por vía intraperitoneal a las 8-10 semanas de edad (PTPRS-/- recibieron proporcionalmente menos suero para reflejar su peso corporal disminuido). El grosor del tobillo se midió con calibradores digitales y los tobillos y las muñecas recibieron una puntuación de artritis clínica entre 0 (sin enrojecimiento ni hinchazón) y 4 (hinchazón máxima con los dedos afectados) cada dos días durante 14 días. Véanse las figuras 2A, 2B, y 2C. Después de 14 días, se sacrificó a los ratones y se fijaron los tobillos para determinar la puntuación histológica usando tinción con H&E (inflamación y erosión ósea) y safranina O (erosión del cartílago). Véanse las figuras 2D (inflamación), 2E (erosión del cartílago) y 2F (erosión ósea) para determinar las puntuaciones histológicas.

La figura 3 es un histograma que muestra que el tratamiento de FLS de ratón (mFLS) con sulfato de condroitina (CS) reduce su invasión a través de una matriz extracelular. Los PTPRS-/- mFLS exhiben una inhibición de la invasión mediada por CS reducida.

La figura 4 es un gráfico que muestra que la invasividad de PTPRS-/- mFLS no se ve afectada por CS a niveles aproximadamente 5 veces más altos que los de la articulación.

La figura 5 es un gráfico que muestra que el tratamiento de mFLS con CS reduce su migración. Los PTPRS-/-mFLS exhiben una inhibición de la migración mediada por CS reducida.

La figura 6 son imágenes de geles que muestran la inactivación de PTPRS mediada por morfolino vivo en FLS de ratón y humano. Panel izquierdo: MLS murino: panel derecho: FLS humano.

La figura 7 es un histograma que muestra que la inactivación de PTPRS aumenta la migración de RA FLS humano y anula la inhibición de la migración mediada por CS.

La figura 8 son gráficos que muestran que el análisis PTPome de ARNm de RA FLS muestra que al menos 5 PTP están altamente expresadas.

Las figuras 9A y 9B son gráficos que muestran la expresión de ARNm de PTPRS. La expresión en la figura 9A de FLS clasificada de ratones de control o ratones con artritis aguda o crónica inducida por suero K/BxN y macrófagos clasificados de ratón en la figura 9B y FLS con PTPRC incluido como control positivo para la expresión en macrófagos. La expresión de PTP en FLS y macrófagos de ratones combinados se midió mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Los valores son la media de la expresión de PTP con respecto al gen constitutivo GAPDH.

Las figuras 10A y 10B son gráficos que muestran la migración de FLS. En la figura 10A, se permitió la invasión de PTPRS WT o KO FLS a través de cámaras transwell recubiertas con Matrigel. Las células por campo se contaron después de la invasión durante 24 horas en respuesta a suero fetal bovino (FBS) al 5 % en presencia de CS. En la figura 10B, se permitió que PTPRS WT o KO FLS migraran a través de cámaras transwell no revestidas. Las células por campo se contaron después de la migración durante 4 h en respuesta a FBS al 5 % en presencia de CS con o sin tratamiento con condroitinasa ABC. Las barras indican la media /- error estándar del cambio múltiplo de migración con respecto la de las células no tratadas. Los datos incluyen tres experimentos independientes que utilizan tres conjuntos de líneas celulares de crías de la misma camada. (***P <0,001; significancia determinada mediante la prueba de Mann-Whitney sobre datos brutos).

Las figuras 11A y 11B son gráficos que muestran que la inhibición de la migración de RA FLS por sulfato de condroitina (CS) depende de la expresión de PTPR^s . La figura 11A es un gráfico de datos de RT-PCR que muestra la inactivación de PTPRS en RA FLS después de la incubación con oligo antisentido (ASO) durante 7 días. En la figura 11B, se permitió que PTPRS WT o KO FLS migraran a través de cámaras transwell no revestidas. Las células por campo se contaron después de la migración durante 4 h en respuesta a suero fetal bovino (FBS) al 5 % en presencia de CS con o sin tratamiento con condroitinasa ABC. Las barras indican la media /- error estándar del cambio múltiplo de migración con respecto la de las células no tratadas. Los datos incluyen tres experimentos independientes que utilizan tres conjuntos de líneas celulares de crías de la misma camada. (***P <0,001; significancia determinada mediante la prueba de Mann-Whitney sobre datos brutos). Las figuras 12A y 12B son gráficos que muestran que el desplazamiento de PTPRS de HS es suficiente para inhibir la migración y la invasión de FLS. Se permitió la invasión de PTPRS WT o KO FLS a través de cámaras transwell no recubiertas. Las células por campo se contaron después de la migración durante 4 h en respuesta a suero fetal bovino (FBS) al 5% en presencia de 20 nM de los dominios de Ig1 e Ig2 de PTPRS (Ig1+2) en solitario (figura 12A) o además de 100 pg/ml de CS (figura 12B). Las barras indican la media /error estándar del cambio múltiplo de la migración con respecto a la de las células no tratadas. Los datos incluyen tres experimentos independientes que utilizan tres conjuntos de líneas celulares de crías de la misma camada. (**P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001; significancia determinada mediante la prueba de Mann-Whitney sobre datos brutos).

Las figuras 13A y 13B son imágenes de micrografías de luz de explantes de cartílago bovino y un gráfico. La figura 13A muestra micrografías de luz teñidas con hematoxilina de Mayer con y sin tratamiento con Ig1+2. La figura 13B es un gráfico que muestra los recuentos celulares con y sin tratamiento con Ig1+2.

Las figuras 14A y 14B son gráficos que muestran la unión y desfosforilación de beta-catenina y cadherina. La figura 14A es una transferencia de Western de lisados de células totales o lisados incubados con sustrato de GST o GST-PTPRS D/A que atrapa el mutante de FLS no estimulado o estimulado por pervanadato. * representa GST-PTPRS D1 D/A y ** representa la etiqueta GST. Figura 14B Transferencia de Western que muestra una disminución de la fosforilación de tirosina de beta-catenina inmunopurificada en presencia de GST-PTPRS D1 en comparación con GST en solitario.

La figura 15 es un gráfico que muestra el efecto de Ig1 e Ig2 en la mejora de la artritis. Puntuación clínica de ratones BALB/c inducidos con artritis aguda mediante la administración de 100 j l de suero K/BxN el Día 0 y tratados con vehículo (control) o 500 jg de Ig1+2 al día desde los días 0 a 6. N = 3 por tratamiento. Análisis histopatológico de la articulación con (panel inferior) y sin (panel superior) tratamiento con Ig1+2 más puntuación de erosión y daño del cartílago.

La figura 16 es un gráfico que muestra el tratamiento de mFLS con Ig1+2 de PTPRS recombinante que reduce la migración.

La figura 17 es un gráfico que muestra que PTPRS-/- mFLS son insensibles a la migración reducida mediada por Ig1+2 de PTPRS recombinante.

La figura 18 es un esquema de la actividad propuesta de PTPRS, sulfato de condroitina y sulfato de heparina en sinoviocitos de tipo fibroblasto en la articulación.

Descripción detallada de la invención

La presente descripción se refiere a la PTP transmembrana comúnmente denominada proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, S o Sigma (PTPRS). El dominio extracelular de PTPRS incluye múltiples dominios de tipo fibronectina tipo III y dominios de tipo inmunoglobulina (Ig). Los dos dominios de Ig más externos (llamados Ig1 e Ig2) interactúan con afinidad nanomolar con PG (proteoglicano) que contiene HS (heparán sulfato) y CS (sulfato de condroitina). La interacción de PTPRS con HS (que se encuentra en capas en la superficie celular de la mayoría de los tipos de células) induce una topología agrupada de PTPRS, que inhibe la acción de la fosfatasa y promueve la señalización. Por el contrario, el CS (enriquecido en la MEC que rodea a las neuronas y otras células) induce una conformación desagrupada, que es activa y conduce a la inhibición de la señalización. Se puede encontrar más información sobre PTPRS, por ejemplo, en Shen et al., Science 23 octubre de 2009, 592-596; Coles et al., Science 22 abril de 2011, 484-488.

Como se demuestra en el presente documento, el dominio extracelular de PTPRS se une a proteoglicanos en la matriz extracelular. Esta unión a diferentes proteoglicanos da como resultado diferencias en las funciones intracelulares de la fosfatasa. Este mecanismo mediado por PTPRS de regulación de la señalización intracelular por la matriz extracelular se denomina en el presente documento "interruptor de proteoglicanos". Como se demuestra en el presente documento, el interruptor de proteoglicanos regula de una manera dependiente de PTPRS la adhesión y la invasividad de FLS. La interferencia con el interruptor de proteoglicanos in vivo conduce a una disminución de la gravedad de la artritis en un modelo de ratón. Por lo tanto, como se demuestra en el presente documento, PTPRS es un regulador clave del comportamiento destructivo de RA FLS.

Los términos "sujeto", "paciente", "individuo", etc. no pretenden ser limitantes y pueden intercambiarse generalmente. Es decir, un individuo descrito como un "paciente" no necesariamente tiene una enfermedad determinada, sino que simplemente busca asesoramiento médico.

Un "control" o "control estándar" se refiere a una muestra, medición, o valor que sirve como referencia, normalmente una referencia conocida, para la comparación con una muestra de prueba, medición, o valor. Por ejemplo, se puede tomar una muestra de prueba de un paciente que se sospecha que tiene una enfermedad determinada (por ejemplo, una enfermedad inmune, enfermedad inmune inflamatoria, cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad inmune, u otra enfermedad) y compararla con un individuo normal conocido (no enfermo) (por ejemplo, un sujeto de control estándar). Un control estándar también puede representar una medición o valor promedio obtenido de una población de individuos similares (por ejemplo, sujetos de control estándar) que no tienen una enfermedad determinada (es decir, población de control estándar), por ejemplo, individuos sanos con antecedentes médicos similares, la misma edad, peso, etc. También se puede obtener un valor de control estándar del mismo individuo, por ejemplo, de una muestra obtenida anteriormente del paciente antes de la aparición de la enfermedad. Un experto reconocerá que se pueden diseñar controles estándar para la evaluación de cualquier número de parámetros (por ejemplo, niveles de ARN, niveles de proteínas, tipos de células específicas, fluidos corporales específicos, tejidos específicos, sinoviocitos, líquido sinovial, tejido sinovial, sinoviocitos de tipo fibroblasto, sinoviocitos de tipo macrófago, etc.). Un experto en la técnica comprenderá qué controles estándar son los más apropiados en una situación dada y podrá analizar los datos basándose en comparaciones con los valores de control estándar. Los controles estándar también son valiosos para determinar la significancia (por ejemplo, significancia estadística) de los datos. Por ejemplo, si los valores de un parámetro dado varían ampliamente en los controles estándar, la variación en las muestras de prueba no se considerará significativa.

Los términos "dosis" y "dosificación" se usan indistintamente en el presente documento. Una dosis se refiere a la cantidad de principio activo que se le da a un individuo en cada administración. La dosis variará dependiendo de varios factores, incluyendo el intervalo de dosis normales para una terapia determinada, la frecuencia de administración; tamaño y tolerancia del individuo; gravedad de la afección; riesgo de efectos secundarios; y la vía de administración. Un experto reconocerá que la dosis puede modificarse dependiendo de los factores anteriores o basándose en el progreso terapéutico. El término "forma de dosificación" se refiere al formato particular del producto farmacéutico o la composición farmacéutica, y depende de la vía de administración. Por ejemplo, una forma de dosificación puede estar en forma líquida para nebulización, por ejemplo, para inhalantes, en un comprimido o líquido, por ejemplo, para administración oral, o una solución salina, por ejemplo, para inyección.

Como se usan en el presente documento, los términos "tratar" y "prevenir" pueden referirse a cualquier retraso en el inicio, reducción en la frecuencia o gravedad de los síntomas, mejora de los síntomas, mejora en la comodidad o función del paciente (por ejemplo, función articular), disminución en la gravedad de la patología, etc. El efecto del tratamiento se puede comparar con un individuo o grupo de individuos que no reciben un tratamiento determinado, o con el mismo paciente antes o después del cese del tratamiento. El término "prevenir" generalmente se refiere a una disminución en la aparición de una enfermedad determinada (por ejemplo, una enfermedad autoinmune, autoinmune inflamatoria, cáncer, infecciosa, inmune u otra enfermedad) o síntomas de enfermedad en un paciente. Como se ha indicado anteriormente, la prevención puede ser completa (sin síntomas detectables) o parcial, de manera que se observen menos síntomas de los que probablemente aparecerían sin tratamiento.

Por "dosis o cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se entiende una dosis que produce los efectos para los que se administra (por ejemplo, tratar o prevenir una enfermedad). La dosis y la formulación exactas dependerán del propósito del tratamiento, y un experto en la técnica podrá determinarlas usando técnicas conocidas (véanse, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, Gennaro, Editor (2003), y Pickar, Dosage Calculations (1999)). Por ejemplo, para un determinado parámetro, una cantidad terapéuticamente eficaz mostrará un aumento o disminución de al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 %, o al menos el 100 %. La eficacia terapéutica también se puede expresar como aumento o disminución "del número de veces". Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede tener al menos un efecto de 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces o más sobre un control estándar. Una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz puede mejorar uno o más síntomas de una enfermedad. Una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz puede prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad o uno o más síntomas de una enfermedad cuando el efecto por el que se administra es tratar a una persona que corre el riesgo de desarrollar la enfermedad.

El término "diagnóstico" se refiere a una probabilidad relativa de que una enfermedad (por ejemplo, una enfermedad autoinmune, autoinmune inflamatoria, cáncer, infecciosa, inmune u otra), esté presente en el sujeto. De manera similar, el término "pronóstico" se refiere a una probabilidad relativa de que un determinado resultado futuro pueda tener lugar en el sujeto con respecto a una patología. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, el pronóstico puede referirse a la probabilidad de que un individuo desarrolle una enfermedad (por ejemplo, una enfermedad autoinmune, autoinmune inflamatoria, cáncer, infecciosa, inmune u otra), o la probable gravedad de la enfermedad (por ejemplo, duración de la enfermedad). Los términos no pretenden ser absolutos, como apreciará cualquier experto en el campo del diagnóstico médico.

"Ácido nucleico" u "oligonucleótido" o "polinucleótido" o equivalentes gramaticales usados en el presente documento significa al menos dos nucleótidos unidos covalentemente entre sí. El término "ácido nucleico" incluye ADN, ARN monocatenario, bicatenario o multicatenario y análogos (derivados) de los mismos. Los oligonucleótidos son típicamente de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50 o más nucleótidos de longitud, hasta aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos y polinucleótidos son polímeros de cualquier longitud, incluyendo longitudes más largas, por ejemplo, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10.000, etc. Los ácidos nucleicos en el presente documento pueden contener enlaces fosfodiéster. Los análogos de ácido nucleico pueden tener esqueletos alternativos, que comprenden, por ejemplo, enlaces fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato u O-metilfosforamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press); y esqueletos y enlaces peptídicos de ácidos nucleicos. Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con esqueletos positivos; esqueletos no iónicos, esqueletos no ribosa, incluyendo los descritos en las Patentes de EE.UU. N.° 5.235.033 y 5.034.506, y Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui y Cook, eds. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se incluyen dentro de una definición de ácidos nucleicos. Las modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato se pueden realizar por diversas razones, por ejemplo, para aumentar la estabilidad y la semivida de dichas moléculas en entornos fisiológicos o como sondas en un biochip. Pueden prepararse mezclas de ácidos nucleicos de origen natural y análogos; como alternativa, pueden prepararse mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos y mezclas de ácidos nucleicos de origen natural y análogos.

Una secuencia de ácido nucleico particular también incluye "variantes de corte y empalme". De manera similar, una proteína particular codificada por un ácido nucleico abarca cualquier proteína codificada por una variante de corte y empalme de ese ácido nucleico. Las "variantes de corte y empalme", como sugiere el nombre, son productos de corte y empalme alternativos de un gen. Después de la transcripción, puede cortarse y empalmarse un transcrito de ácido nucleico inicial de modo que diferentes productos de corte y empalme de ácido nucleico (alternativos) codifiquen diferentes polipéptidos. Los mecanismos para la producción de variantes de corte y empalme varían, pero incluyen corte y empalme alternativo de exones. Los polipéptidos alternativos derivados del mismo ácido nucleico por transcripción de lectura también están incluidos en esta definición. Cualquier producto de una reacción de corte y empalme, incluidas las formas recombinantes de los productos de corte y empalme, se incluye en esta definición. Un ejemplo de variantes de corte y empalme de canales de potasio se analiza en Leicher, et al., J. Biol. Chem.

273(52):35095-35101 (1998).

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si se posiciona de manera que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen están próximas entre sí y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra mediante ligadura en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.

El término "sonda" o "cebador'', como se usa en el presente documento, se define como uno o más fragmentos de ácido nucleico cuya hibridación específica con una muestra puede detectarse. Una sonda o cebador puede tener cualquier longitud dependiendo de la técnica particular para la que se utilizará. Por ejemplo, los cebadores de PCR tienen generalmente entre 10 y 40 nucleótidos de longitud, mientras que las sondas de ácido nucleico para, por ejemplo, una transferencia de Southern, pueden tener una longitud de más de cien nucleótidos. La sonda puede estar sin marcar o marcada como se describe a continuación para que se pueda detectar su unión a la diana o muestra. La sonda se puede producir a partir de una fuente de ácidos nucleicos a partir de una o más porciones particulares (preseleccionadas) de un cromosoma, por ejemplo, uno o más clones, un cromosoma completo aislado o un fragmento de cromosoma, o una colección de productos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La longitud y la complejidad del ácido nucleico fijado sobre el elemento diana no son importantes para la invención. Un experto en la técnica puede ajustar estos factores para proporcionar una hibridación y una producción de señales óptimas para un procedimiento de hibridación dado, y para proporcionar la resolución requerida entre diferentes genes o ubicaciones genómicas.

La sonda también pueden ser ácidos nucleicos aislados inmovilizados sobre una superficie sólida (por ejemplo, portaobjetos de nitrocelulosa, vidrio, cuarzo, sílice fundida), como en una matriz. La sonda puede ser miembro de una serie de ácidos nucleicos como se describe, por ejemplo, en el documento WO 96/17958. También se pueden usar técnicas capaces de producir matrices de alta densidad para este propósito (véanse, por ejemplo, Fodor (1991) Science 767-773; Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; Patente de EE.UU. N.° 5.143.854).

Una "sonda u oligonucleótido de ácido nucleico marcado" es uno que está unido, ya sea covalentemente, a través de un enlazador o un enlace químico, o no covalentemente, a través de enlaces iónicos, de van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a un marcador de manera que la presencia de la sonda pueda detectarse detectando la presencia del marcador unido a la sonda. Como alternativa, un método que usa interacciones de alta afinidad puede lograr los mismos resultados cuando uno de un par de compañeros de unión se une al otro, por ejemplo, biotina, estreptavidina.

Los términos "idéntica" o "identidad" de secuencia porcentual, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente un 60 % de identidad, preferiblemente un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o mayor identidad en una región específica, en comparación y en alineamiento para obtener la máxima correspondencia sobre una ventana de comparación o región designada) según se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias BLAST o b La ST 2.0 con los parámetros predeterminados descritos a continuación, o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, el sitio web de NCBI en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ o similares). Entonces se dice que dichas secuencias son "sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere, o puede aplicarse, al complemento de una secuencia de prueba. La definición también incluye secuencias que tienen deleciones y/o adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones. Los algoritmos empleados pueden tener en cuenta los huecos y similares.

Para las comparaciones de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, en caso necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Preferiblemente, se pueden usar parámetros de programa predeterminados, o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en de 20 a 600, usualmente, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más normalmente, de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas una vez alineadas las dos secuencias de manera óptima. Se conocen bien en la técnica métodos de alineamiento de secuencias para comparación. Se puede realizar un alineamiento óptimo de secuencias para la comparación, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 complemento)).

Un ejemplo preferido de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res.

25:3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente.

La expresión "hibrida selectivamente (o específicamente) con" se refiere a la unión, duplexación o hibridación de una molécula solo con una secuencia de nucleótidos particular con una afinidad más alta, por ejemplo, en condiciones más rigurosas, que con otras secuencias de nucleótidos (por ejemplo, ADN o ARN celular total o de biblioteca).

La expresión "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a las condiciones en las que un ácido nucleico se hibridará con su secuencia diana, típicamente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán distintas en circunstancias distintas. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Se encuentra una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones de hibridación rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5-10 °C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definido. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica definida, pH y concentración nucleica) a la que el 50 % de las sondas complementarias a la diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, el 50 % de las sondas están ocupadas en equilibrio). También se pueden lograr condiciones de hibridación rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces el fondo, preferiblemente 10 veces la hibridación del fondo. Las condiciones de hibridación rigurosas ejemplares pueden ser las siguientes: formamida al 50 %, 5x SSC, y SDS al 1 %, incubación a 42 °C, o 5x SSC, ^s D^s al 1 %, incubación a 65 °C, con lavado en 0,2x SSC, y SDS al 0,1 % a 65 °C. Las "condiciones de hibridación moderadamente rigurosas" ejemplares incluyen una hibridación en un tampón de formamida al 40 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C, y un lavado en IX SSC a 45 °C. Una hibridación positiva es al menos dos veces el fondo. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente que se pueden utilizar condiciones alternativas de hibridación y lavado para proporcionar condiciones de rigurosidad similar. Se proporcionan pautas adicionales para determinar los parámetros de hibridación en numerosas referencias, por ejemplo, y Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., John Wiley & Sons.

Los ácidos nucleicos pueden ser sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto sucede, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. En dichos casos, los ácidos nucleicos se hibridan típicamente en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas.

Un "ácido nucleico inhibidor" es un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, polímero de análogos de nucleótidos) que es capaz de unirse a un ácido nucleico diana (por ejemplo, un ARNm traducible a PTPRS) y reducir la transcripción del ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm a partir de ADN), o reducir la traducción del ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm), o alterar el corte y empalme del transcrito (por ejemplo, oligo morfolino monocatenario). Un "oligo morfolino" puede denominarse alternativamente como un "ácido morfolino nucleico" y se refiere a ácidos nucleicos de ácido nucleico que contienen morfolina comúnmente conocidos en la técnica (por ejemplo, fosforamidato morfolinio oligo o un "PMO"). Véase Marcos, P., Biochemical and Biophysical Research Communications 358 (2007) 521-527. En algunas realizaciones, el "ácido nucleico inhibidor" es un ácido nucleico que es capaz de unirse (por ejemplo, hibridar) a un ácido nucleico diana (por ejemplo, un ARNm traducible a una RPTPS) y reducir la traducción del ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana es o incluye una o más secuencias de ácido nucleico diana a las que se une (por ejemplo, se hibrida) el ácido nucleico inhibidor. Por lo tanto, un ácido nucleico inhibidor es típicamente o incluye una secuencia (también denominada en el presente documento como una "secuencia de ácido nucleico antisentido") que es capaz de hibridar con al menos una porción de un ácido nucleico diana en una secuencia de ácido nucleico diana. Un ejemplo de un ácido nucleico inhibidor es un ácido nucleico antisentido. Otro ejemplo de un ácido nucleico inhibidor es siARN o ARNi (incluyendo sus derivados o precursores, tales como análogos de nucleótidos). Ejemplos adicionales incluyen shARN, miARN, shmiARN, o algunos de sus derivados o precursores. En algunas realizaciones, el ácido nucleico inhibidor es monocatenario. En otras realizaciones, el ácido nucleico inhibidor es bicatenario.

Un "ácido nucleico antisentido" es un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN o análogos de los mismos) que es al menos parcialmente complementario al menos a una porción de un ácido nucleico diana específico (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico diana), tal como una molécula de ARNm (por ejemplo, una molécula de ARNm diana) (véase, por ejemplo, Weintraub, Scientific American, 262:40 (1990)), por ejemplo, antisentido, siARN, shARN, shmiARN, miARN (microARN). Por lo tanto, los ácidos nucleicos antisentido son capaces de hibridar (por ejemplo, hibridar selectivamente) con un ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm diana). En algunas realizaciones, el ácido nucleico antisentido hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm) en condiciones rigurosas de hibridación. En algunas realizaciones, el ácido nucleico antisentido se hibrida con el ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm) en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas. Los ácidos nucleicos antisentido pueden comprender nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados tales como, por ejemplo, fosforotioato, fosfonato de metilo y azúcar anomérico-fosfato, nucleótidos modificados por el esqueleto. Un "ácido nucleico antisentido anti-PTPRS" es un ácido nucleico antisentido que es al menos parcialmente complementario con al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico diana, tal como una molécula de ARNm, que codifica al menos una porción de la PTPRS. Un ácido nucleico antisentido puede ser un oligo morfolino. Un oligo morfolino puede ser un ácido nucleico antisentido monocatenario, como se conoce en la técnica. Un oligo morfolino puede disminuir la expresión de proteínas de una diana, reducir la traducción del ARNm diana, reducir el inicio de la traducción del ARNm diana, o modificar el corte y empalme de la transcripción. El oligo morfolino puede conjugarse con un resto permeable a las células (por ejemplo, péptido). Los ácidos nucleicos antisentido pueden ser ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios.

En la célula, los ácidos nucleicos antisentido pueden hibridar con el ARNm diana, formando una molécula bicatenaria. Los ácidos nucleicos antisentido interfieren con la traducción del ARNm, ya que la célula no traducirá un ARNm que sea bicatenario. El uso de métodos antisentido para inhibir la traducción in vitro de genes se conoce bien en la técnica (Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, (1988)). Pueden usarse moléculas antisentido que se unen directamente al ADN.

Los ácidos nucleicos inhibidores pueden administrarse al sujeto usando cualquier medio apropiado conocido en la técnica, incluyendo por inyección, inhalación o ingestión oral. Otro sistema de administración adecuado es un sistema de dispersión coloidal tal como, por ejemplo, complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas a base de lípidos, incluidas emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un ejemplo de un sistema coloidal de esta invención es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. Los ácidos nucleicos, incluidos el ARN y el ADN dentro de los liposomas, se administran a las células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Los liposomas pueden dirigirse a tipos de células o tejidos específicos utilizando cualquier medio conocido en la técnica. Los ácidos nucleicos inhibidores (por ejemplo, ácidos nucleicos antisentido, oligos morfolino) pueden administrarse a una célula usando sistemas de administración permeables a las células (por ejemplo, péptidos permeables a las células). Los ácidos nucleicos inhibidores pueden administrarse a células o tejidos específicos usando vectores virales o virus.

Un "siARN" se refiere a un ácido nucleico que forma un ARN bicatenario, cuyo ARN bicatenario tiene la capacidad de reducir o inhibir la expresión de un gen o gen diana cuando el siARN está presente (por ejemplo, expresado) en la misma célula que el gen o gen diana. El siARN tiene típicamente de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, más típicamente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, más típicamente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, mucho más típicamente aproximadamente 20-30 nucleótidos de base, o aproximadamente 20-25 o aproximadamente 24-29 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. Las moléculas de siARN y los métodos para generarlas se describen en, por ejemplo, Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; los documentos WO 00/44895; WO 01/36646; WO 99/32619; WO 00/01846; WO 01/29058; WO 99/07409; y WO 00/44914. Una molécula de ADN que transcribe dsARN o siARN (por ejemplo, como un dúplex de horquilla) también proporciona ARNi. Las moléculas de ADN para transcribir dsARN se describen en la patente de EE.UU. N.° 6.573.099 y en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2002/0160393 y 2003/0027783, y Tuschl y Borkhardt, Molecular Interventions, 2:158 (2002).

El siARN se puede administrar directamente o se pueden usar vectores de expresión de siARN para inducir ARNi que tienen diferentes criterios de diseño. Un vector puede tener insertadas dos repeticiones invertidas separadas por una secuencia espaciadora corta y que termina con una cadena de T que sirven para terminar la transcripción.

La construcción de vectores adecuados que contienen las secuencias de ácido nucleico emplea técnicas estándar de ligadura y restricción, que se conocen bien en la técnica (véase Maniatis et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1982)). Los plásmidos aislados, las secuencias de ADN o los oligonucleótidos sintetizados se escinden, se adaptan y se vuelven a ligar en la forma deseada.

"Muestra biológica" o "muestra" se refieren a materiales obtenidos o derivados de un sujeto o paciente. Una muestra biológica incluye secciones de tejidos, tales como muestras de biopsia y autopsia, y secciones congeladas tomadas con fines histológicos. Dichas muestras incluyen fluidos corporales tales como sangre y fracciones o productos de sangre (por ejemplo, suero, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y similares), esputo, tejido, células cultivadas (por ejemplo, cultivos primarios, explantes y células transformadas), heces, orina, líquido sinovial, tejido articular, tejido sinovial, sinoviocitos, sinoviocitos de tipo fibroblasto, sinoviocitos de tipo macrófagos, células inmunes, células hematopoyéticas, fibroblastos, macrófagos, linfocitos T, etc. Una muestra biológica se obtiene típicamente de un organismo eucariota, tal como un mamífero, tal como un primate, por ejemplo, un chimpancé o un ser humano; vaca; perro; gato; un roedor, por ejemplo, cobaya, rata, ratón; conejo; o un ave; reptil; o pez.

Una "biopsia" se refiere al proceso de extraer una muestra de tejido para evaluación de diagnóstico o pronóstico, y al propio espécimen de tejido. Cualquier técnica de biopsia conocida en la técnica puede aplicarse a los métodos de diagnóstico y pronóstico descritos en el presente documento. La técnica de biopsia aplicada dependerá del tipo de tejido a evaluar (es decir, próstata, ganglios linfáticos, hígado, médula ósea, glóbulo rojo, tejido articular, tejido sinovial, sinoviocitos, sinoviocitos de tipo fibroblasto, sinoviocitos de tipo macrófagos, células inmunes, células hematopoyéticas, fibroblastos, macrófagos, linfocitos T, etc.), entre otros factores. Las técnicas de biopsia representativas incluyen biopsia por escisión, biopsia por incisión, biopsia con aguja, biopsia quirúrgica y biopsia de médula ósea. Las técnicas de biopsia se analizan, por ejemplo, en Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16a ed., 2005, Capítulo 70, y en toda la Parte V.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos sintéticos y de origen natural, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos modificados que están modificados posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una manera similar a un aminoácido de origen natural.

Se puede hacer referencia a los aminoácidos en el presente documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Asimismo, se puede hacer referencia a los nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

Las "variantes modificadas de forma conservativa" se aplican tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias particulares de ácido nucleico, variantes modificadas conservativamente modificadas se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, de secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina se especifica por un codón, el codón puede alterarse en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG que es normalmente el único codón para la metionina, y TGG, que es normalmente el único codón para el triptófano) puede modificarse para dar como resultado una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a las secuencias sonda reales.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones individuales, deleciones o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteínas que altera, añade o elimina un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una variante conservativamente modificada donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes conservativamente modificadas son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la invención.

Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Un "marcador" o un "resto detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos, u otros medios físicos. Por ejemplo, marcadores útiles incluyen 32P, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas u otras entidades que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando un radiomarcador en un péptido o anticuerpo específicamente reactivo con un péptido diana. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para conjugar un anticuerpo al marcador, por ejemplo, utilizando métodos descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.

El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico, proteína, o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector se ha modificado por o es el resultado de métodos de laboratorio. Por lo tanto, por ejemplo, las proteínas recombinantes incluyen proteínas producidas por métodos de laboratorio. Las proteínas recombinantes pueden incluir residuos de aminoácidos que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la proteína o pueden incluir residuos de aminoácidos que se han modificado, por ejemplo, marcados.

El término "heterólogo", cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, que tiene dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas para preparar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).

"Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región marco de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que se une a y reconoce específicamente un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como una miríada de genes de las regiones variables de inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Típicamente, la región de unión al antígeno de un anticuerpo será más crítica en la especificidad y afinidad de unión. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden derivarse de diferentes organismos, incluyendo seres humanos, ratones, ratas, hámsteres, camellos, etc. Los anticuerpos de la invención pueden incluir anticuerpos que se han modificado o mutado en una o más posiciones de aminoácidos para mejorar o modular una función deseada del anticuerpo (por ejemplo, glucosilación, expresión, reconocimiento de antígeno, funciones efectoras, unión de antígeno, especificidad, etc.).

Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente.

Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas, o en forma de numerosos fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Por lo tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'², un dímero de Fab que a su vez es una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'² se puede reducir en condiciones suaves para romper la unión disulfuro en la región bisagra, convirtiendo así el dímero F(ab')2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región bisagra (véase Fundamental Immunology (Paul ed., 3a ed. 1993). Aunque varios fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que dichos fragmentos pueden sintetizarse de novo ya sea químicamente o usando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación de anticuerpos completos, o aquellos sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv monocatenario) o los identificados usando bibliotecas de presentación de fagos (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).

Para la preparación de anticuerpos adecuados para su uso de acuerdo con la invención, por ejemplo, anticuerpos recombinantes, monoclonales o policlonales, se pueden usar muchas técnicas conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., págs. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); y Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2a ed. 1986)). Los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de interés pueden clonarse a partir de una célula, por ejemplo, los genes que codifican un anticuerpo monoclonal pueden clonarse a partir de un hibridoma y usarse para producir un anticuerpo monoclonal recombinante. También se pueden elaborar bibliotecas de genes que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas o células plasmáticas. Las combinaciones aleatorias de los productos génicos de cadena pesada y ligera generan un gran conjunto de anticuerpos con diferente especificidad antigénica (véase, por ejemplo, Kuby, Immunology (3a ed. 1997)). Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios o anticuerpos recombinantes (Patente de Estados Unidos 4.946.778, Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567) pueden adaptarse para producir anticuerpos contra polipéptidos de esta invención. Además, se pueden usar ratones transgénicos u otros organismos tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados o humanos (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)). Como alternativa, la tecnología de presentación en fagos puede usarse para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados (véanse, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)). Los anticuerpos también pueden hacerse biespecíficos, es decir, capaces de reconocer dos antígenos diferentes (véase, por ejemplo, el documento WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); y Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)). Los anticuerpos también pueden ser heteroconjugados, por ejemplo, dos anticuerpos unidos covalentemente, o inmunotoxinas (véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 4.676.980, los documentos WO 91/00360; WO 92/200373; y EP 03089).

Se conocen bien en la técnica métodos para humanizar o primatizar anticuerpos no humanos (por ejemplo, Patentes de EE.UU. N.° 4.816.567; 5.530.101; 5.859.205; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.777.085; 6.180.370; 6.210.671; y 6.329.511; WO 87/02671; solicitud de patente EP 0173494; Jones et al. (1986) Nature 321:522; y Verhoyen et al. (1988) Science 239:1534). Se describen adicionalmente anticuerpos humanizados en, por ejemplo, Winter y Milstein (1991) Nature 349:293. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan residuos importados, que típicamente se toman de un dominio variable de importación. La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (véanse, por ejemplo, Morrison et al., PNAS USA, 81:6851-6855 (1984), Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)), sustituyendo las CDR o secuencias de CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. N.° 4.816.567), donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Por ejemplo, los polinucleótidos que comprenden una primera secuencia que codifica las regiones marco de inmunoglobulina humanizada y un segundo conjunto de secuencias que codifica las regiones determinantes de complementariedad de inmunoglobulina deseadas, pueden producirse sintéticamente o combinando segmentos apropiados de ADNc y ADN genómico. Las secuencias de ADN de la región constante humana pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos de una diversidad de células humanas.

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, está alterada, reemplazada o intercambiada de tal manera que el sitio de unión a antígeno (región variable) se une a una región constante de una clase diferente o alterada, una función y/o una especie efectora, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, está alterada, reemplazada o intercambiada con una región variable que tiene una especificidad por el antígeno diferente o alterada. Los anticuerpos preferidos de, y para su uso de acuerdo con la invención, incluyen anticuerpos monoclonales humanizados y/o quiméricos.

Las técnicas para conjugar agentes terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas (véanse, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery"in Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)).

La expresión "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo o "inmunorreactivo específicamente (o selectivamente) con", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína, a menudo en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por lo tanto, en condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular al menos dos veces el fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces el fondo. La unión específica a un anticuerpo en dichas condiciones requiere un anticuerpo que se seleccione por su especificidad por una proteína particular. Por ejemplo, se pueden seleccionar anticuerpos policlonales para obtener solo aquellos anticuerpos policlonales que son específicamente inmunorreactivos con el antígeno seleccionado y no con otras proteínas. Esta selección puede lograrse quitando anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con otras moléculas. Se puede usar una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida se utilizan de forma rutinaria para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) para obtener una descripción de los formatos y las condiciones de los inmunoensayos que se pueden utilizar para determinar la inmunorreactividad específica).

Como se usa en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" se usa como sinónimo de "fisiológicamente aceptable" y "farmacológicamente aceptable". Una composición farmacéutica generalmente comprenderá agentes para tamponamiento y conservación en almacenamiento, y puede incluir tampones y vehículos para una administración apropiada, dependiendo de la vía de administración.

Ciertos compuestos usados en la presente invención pueden existir en formas no solvatadas así como en formas solvatadas, incluyendo formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y se pretende que estén incluidas dentro del alcance de la presente invención. Ciertos compuestos usados en la presente invención pueden existir en múltiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas físicas son equivalentes para los usos contemplados por la presente invención y se pretende que estén dentro del alcance de la presente invención.

"PTPRS" o "RPTP" o "rPTP" (todos los términos son equivalentes) se refieren a proteínas de tipo receptor de tirosina fosfatasas, que se encuentran en la naturaleza como proteínas tirosina fosfatasas.

"PTPRS" se refiere al receptor de proteína tirosina fosfatasa tipo S (o sigma), que es un miembro de la familia de proteína tirosina fosfatasa (PTP). La secuencia de aminoácidos de PTPRS se puede encontrar, por ejemplo, en UniProtKB/Swiss-Prot N.° de Acceso Q13332 y B0V2N1, y también la SEQ ID NO: 4. La secuencia de ácido nucleico de PTPRS se puede encontrar, por ejemplo, en GenBank N.° de Acceso NC_000019.9 y, PTPRS incluye un dominio intracelular, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 1304-1948 de SEQ ID NO: 8 o los residuos de aminoácidos 1279-1907 de SEQ iD NO: 4, un dominio transmembrana, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 1283-1303 de SEQ ID NO: 8 o los residuos de aminoácidos 1258-1278 de SEQ ID NO: 4, y un dominio extracelular, por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. El término dominio transmembrana se refiere a la porción de una proteína o polipéptido que está incrustada y, opcionalmente, se extiende por una membrana. El término dominio intracelular se refiere a la porción de una proteína o polipéptido que se extiende al citoplasma de una célula. El término dominio extracelular se refiere a la porción de una proteína o polipéptido que se extiende al ambiente extracelular. El dominio extracelular de PTPRS incluye el dominio 1 (Ig1) de tipo inmunoglobulina, el dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig2) y el dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig3). La secuencia de aminoácidos de Ig1 incluye los residuos de aminoácidos 30 a 127 de SEQ ID NO: 4 o los residuos de aminoácidos 30-127 de SEQ ID NO: 8, o la secuencia de aminoácidos EEPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGA VLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLRE (SEQ ID NO: 1) o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos de Ig2 incluye los residuos de aminoácidos 128 a 231 de SEQ ID NO: 4, o los residuos de aminoácidos 128-244 de SEQ ID NO: 8, o la secuencia de aminoácidos DQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSETFESTPIRGALQIESS EETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA (SEQ ID NO: 2) o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. La secuencia de aminoácidos de Ig3 incluye los residuos de aminoácidos 232 a 321 de SEQ ID NO: 4, o los residuos de aminoácidos 245-334 de SEQ ID NO: 8 o la secuencia de aminoácidos PRFSILPMSHEIMPGGNVNITCVAVGSPMPYVKWMQGAEDLTPEDDMPVGRNVLELTD VKDSANYTCVAMSSLGVIEAVAQITVKSLPKA (SEQ ID NO: 3) o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

Un "nivel de proteína de una RPTP" se refiere a una cantidad (relativa o absoluta) de RPTP en su forma de proteína (a diferencia de su forma de ARN precursora). Una proteína de una RPTP puede incluir una proteína de longitud completa (por ejemplo, la proteína traducida de la región codificante completa del gen, que también puede incluir modificaciones postraduccionales), fragmentos funcionales de la proteína de longitud completa (por ejemplo, subdominios de la proteína de longitud completa que poseen una actividad o función en un ensayo), o fragmentos de proteína de RPTP, que pueden ser cualquier péptido u oligopéptido de la proteína de longitud completa.

Un "nivel de ARN de una RPTP" se refiere a una cantidad (relativa o absoluta) de ARN presente que puede traducirse para formar una RPTP. El ARN de una RPTP puede ser un ARN de longitud completa suficiente para formar una RPTP de longitud completa. El ARN de una RPTP también puede ser un fragmento del ARN de longitud completa, formando así un fragmento de RPTP de longitud completa. El fragmento del ARN de longitud completa puede formar un fragmento funcional de RPTP. El ARN de ^r PTP puede incluir todas las variantes de corte y empalme de un gen RPTP.

Un "agente terapéutico autoinmune" es una molécula (por ejemplo, anticuerpo, ácido nucleico, ácido nucleico inhibidor, químico sintético, molécula química pequeña) que trata o previene una enfermedad autoinmune cuando se administra a un sujeto en una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz. Un agente terapéutico autoinmune puede ser un agente de unión a RPTP.

Un "agente de unión a RPTP" es una molécula que se une (por ejemplo, se une preferiblemente) a RPTP, ARN que se puede traducir a RPTP, o ADN que se puede transcribir a un ^a Rⁿ que se puede traducir a RPTP. Cuando la molécula se une preferiblemente, la unión es preferente en comparación con otras biomoléculas macromoleculares presentes en un organismo o célula. Un compuesto se une preferiblemente en comparación con otras biomoléculas macromoleculares presentes en un organismo o célula, por ejemplo, cuando la unión preferencial es 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, 2000 veces, 3000 veces, 4000 veces, 5000 veces, 6000 veces, 7000 veces, 8000 veces, 9000 veces, 10000 veces, 100.000 veces, 1.000.000 veces o más.

Un agente puede "dirigirse" a una RPTP, un ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) que codifica una RPTP, o una proteína de una RPTP, uniéndose (por ejemplo, preferiblemente, uniéndose) a la RPTP, ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) que codifica una RPTP, o proteína de una RPTP. Opcionalmente, la RPTP es PTPRS. Un agente se une preferiblemente a una molécula, por ejemplo, cuando la unión a la molécula diana es mayor que la unión a otras moléculas de una forma similar. La unión preferencial puede ser 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, 2000 veces, 3000 veces, 4000 veces, 5000 veces, 6000 veces, 7000 veces, 8000 veces, 9000 veces, 10000 veces, 100.000 veces, 1.000.000 veces o más. En algunos casos, un agente se dirige a una RPTP, un ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) de una RPTP, o una proteína de una RPTP cuando se realiza un ensayo o experimento de unión (por ejemplo, electroforesis en gel, cromatografía, inmunoensayo, marcaje radiactivo o no radiactivo, inmunoprecipitación, ensayo de actividad, etc.), revela solo una interacción o principalmente una interacción con una sola RPTPS, un ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) de una sola RPTp , o una proteína de una sola RPTP. Un agente también puede "dirigirse" a una RPTP, un ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) de una RPTP, o una proteína de una RPTPS al unirse a RPTP, ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) de una RPTP, o una proteína de una RPTP, disminuyendo o aumentando la cantidad de RPTP en una célula u organismo en relación con la ausencia del agente, o disminuyendo la interacción entre RPTP con un ligando fisiológico o natural. Un experto en la técnica, utilizando la orientación proporcionada en el presente documento, puede determinar fácilmente si un agente disminuye o aumenta la cantidad de RPTP en una célula u organismo.

Como se usa en el presente documento, "tratar" o "tratamiento de" una afección, enfermedad o trastorno, o síntomas asociados con una afección, enfermedad o trastorno, se refiere a un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluidos resultados clínicos. Los resultados beneficiosos o deseados pueden incluir, pero sin limitación, alivio o mejora de uno o más síntomas o afecciones, disminución del grado de la afección, trastorno o enfermedad, estabilización del estado de la afección, trastorno o enfermedad, prevención del desarrollo de la afección, trastorno o enfermedad, prevención de la propagación de la afección, trastorno o enfermedad, retraso o ralentización del avance de la afección, trastorno o enfermedad, retraso o ralentización del avance de la afección, trastorno o enfermedad, mejora o paliación del estado de la afección, trastorno o enfermedad, y remisión, ya sea parcial o total. "Tratar" también puede significar prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de tratamiento. "Tratar" también puede significar inhibir el avance de la afección, trastorno o enfermedad, ralentizar el avance de la afección, trastorno o enfermedad temporalmente, aunque, en algunos casos, implica detener la progresión de la afección, trastorno o enfermedad de forma permanente. Como se usan en el presente documento, los términos tratamiento, tratar o que trata, se refieren a un método para reducir los efectos de uno o más síntomas de una enfermedad o afección caracterizada por la expresión de la proteasa, o síntoma de la enfermedad o afección caracterizada por la expresión de la proteasa. Por lo tanto, en el método descrito, el tratamiento puede referirse a una reducción del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o del 100% de la gravedad de una enfermedad establecida, afección o síntoma de la enfermedad o afección. Por ejemplo, un método para tratar una enfermedad se considera un tratamiento si hay una reducción del 10 % en uno o más síntomas de la enfermedad en un sujeto en comparación con un control. Por lo tanto, la reducción puede ser de un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o cualquier reducción porcentual entre el 10% y el 100% en comparación con niveles nativos o de control. Se entiende que el tratamiento no se refiere necesariamente a una cura o ablación completa de la enfermedad, afección o síntomas de la enfermedad o afección. Además, como se usan en el presente documento, las referencias a disminuir, reducir o inhibir incluyen un cambio del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en comparación con un nivel de control, y dichos términos pueden incluir pero no necesariamente incluyen la eliminación completa.

En el presente documento se describen agentes de desagrupación de PTPRS. Como se usan en el presente documento, los términos "agente de desagrupación de PTPRS" y similares, se refieren a un agente (por ejemplo, moléculas pequeñas, proteínas que incluyen anticuerpos y similares) capaz de causar una reducción en el nivel de dimerización, oligomerización o agrupación de proteínas PTPRS. Sin pretender quedar ligado a teoría alguna, se cree que la agrupación de PTPRS puede dar lugar a una forma dimérica inactiva. Por consiguiente, la acción de un agente de desagrupación de PTPRS da como resultado PTPRS monomérica que recupera la actividad en relación con la forma agrupada (por ejemplo, dimerizada u oligomerizada) de PTPRS. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS es una proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS o una subsecuencia, porción, homólogo, variante o derivado del mismo, como se describe en el presente documento. Opcionalmente, la proteína recombinante no enzimática es el dominio extracelular de PTPRS. Sin pretender quedar limitado a teoría alguna, el dominio extracelular de PTPRS o porciones del mismo, desplaza PTPRS de HS. Esto puede activar la PTPRS y conducir a la desfosforilación de la beta-catenina y otros sustratos y la inhibición de las acciones invasivas y proinflamatorias de FLS aguas abajo. Esto está respaldado por los ejemplos y los datos proporcionados en el presente documento. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS es un anticuerpo anti-PRPRS o un fragmento del mismo. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS es un aptámero anti-PTPRS. Opcionalmente, el agente de desagrupación PTPRS se une al heparán sulfato. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS es un anticuerpo anti-heparán sulfato o un fragmento del mismo. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS es un aptámero anti-heparán sulfato. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS no es sulfato de condroitina. La PTPRS, opcionalmente, no es un mimético del sulfato de condroitina o un agente que tiene el mismo mecanismo de acción o similar que el sulfato de condroitina. En otras realizaciones, el agente de desagrupación de PTPRS es un mimético de sulfato de condroitina.

En el presente documento se proporcionan proteínas recombinantes no enzimáticas que comprenden una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS, o una subsecuencia, porción, homólogo, variante o derivado del mismo. Como se usa en el presente documento, el término "proteína recombinante no enzimática" se refiere a una proteína recombinante que no tiene actividad enzimática (por ejemplo, la proteína no funciona como catalizador biológico). Por lo tanto, en algunas realizaciones, las proteínas recombinantes no enzimáticas que comprenden una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS proporcionadas en el presente documento incluyen solo porciones de dominio extracelular de PTPRS y no las porciones enzimáticas de PTPRS. En realizaciones, las proteínas recombinantes no enzimáticas que comprenden una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS proporcionadas en el presente documento incluyen solo porciones del dominio extracelular de PTPRS y no las porciones enzimáticas de PTPRS o las porciones transmembrana de PTPRS. En algunas realizaciones, las proteínas recombinantes no enzimáticas que comprenden una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS incluyen dos o más dominios extracelulares de PTPRS unidos entre sí (por ejemplo, unidos por un enlazador de aminoácidos tal como un enlazador de aminoácidos de al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 10, aproximadamente de 2 a 50 o 100 aminoácidos, aproximadamente de 3 a 50 o 100 aminoácidos, o aproximadamente 2, 3, 45, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos, donde la secuencia de aminoácidos está diseñada para no interferir con el dominio extracelular de la unión del ligando de PTPRS). El término "dominio extracelular de PTPRS" puede incluir subsecuencias, porciones, homólogos, variantes o derivados del dominio extracelular de PTPRS. Por lo tanto, la proteína recombinante no enzimática puede comprender una parte del dominio extracelular de PTPRS, por ejemplo, la proteína comprende uno o más dominios de tipo inmunoglobulina de PTPRS, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y/o SEQ ID NO: 7, o subsecuencias, porciones, homólogos, variantes o derivados de los mismos. El dominio extracelular de PTPRS típicamente es capaz de unirse (por ejemplo, unirse específicamente) a un ligando de PTPRS tal como heparán sulfato. El dominio extracelular de PTPRS comprende tanto el dominio 1 de tipo inmunoglobulina (Ig1) como el dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig2) de PTPRS. El dominio extracelular también puede comprender el dominio 3 de tipo inmunoglobulina (Ig3), o una subsecuencia, porción, homólogo, variante o derivado del mismo.

Opcionalmente, la proteína comprende los residuos de aminoácidos de Ig1 39 a 124 de SEQ ID NO: 4, o una subsecuencia, porción, homólogo, variante o derivado de la misma. Opcionalmente, la proteína comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como: EEPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGA VLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLRE(SEQ ID NO: 1) o expuesta en la SEQ ID NO: 5, o una subsecuencia, porción, homólogo, variante o derivado de la misma.

Opcionalmente, la proteína comprende los residuos de aminoácidos de Ig2 152 a 233 de SEQ ID NO: 4, o una subsecuencia, porción, homólogo, variante o derivado de la misma. Opcionalmente, la proteína comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como: DQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSETFESTPIRGALQIESS EETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA (SEQ ID NO: 2) o expuesta como SEQ ID NO: 6, o una subsecuencia, porción, homólogo, variante o derivado de la misma.

Opcionalmente, la proteína comprende los residuos de aminoácidos de Ig3 259-327 de SEQ ID NO: 4, o una subsecuencia, porción, homólogo, variante o derivado de la misma. Opcionalmente, la proteína comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como: PRFSILPMSHEIMPGGNVNITCVAVGSPMPYVKWMQGAEDLTPEDDMPVGRNVLELTD VKDSANYTCVAMSSLGVIEAVAQITVKSLPKA (SEQ ID NO: 3), o expuesta como la SEQ ID NO: 7, o una subsecuencia, porción, homólogo, variante o derivado de la misma.

En algunas realizaciones, la proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS o una porción del mismo, carece de un dominio transmembrana y/o carece de un dominio intracelular. En algunas realizaciones, la proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS o una porción del mismo, carece de un dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS o una porción del mismo, carece de un dominio intracelular.

Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS proporcionado se une (por ejemplo, se une específicamente) al heparán sulfato. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS evita la oligomerización o agrupación de proteínas PTPRS; por ejemplo, el agente de desagrupación de PTPRS impide la dimerización de las proteínas PTPRS. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS modula la actividad de PTPRS; por ejemplo, el agente de desagrupación de PTPRS aumenta la actividad fosfatasa de PTPRS.

En el presente documento se proporcionan composiciones que incluyen los agentes proporcionados en el presente documento. En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen un agente de desagrupación de PTPRS y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones proporcionadas pueden incluir un solo agente o más de un agente. Las composiciones proporcionadas son, opcionalmente, adecuadas para formulación y administración in vitro o in vivo. Opcionalmente, las composiciones comprenden uno o más de los agentes proporcionados y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, David B. Troy, ed., Lippicott Williams y Wilkins (2005). Por vehículo farmacéuticamente aceptable se entiende un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material se administra a un sujeto sin causar efectos biológicos no deseados o interactuar de manera perjudicial con los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. Si se administra a un sujeto, el vehículo se selecciona opcionalmente para minimizar la degradación del principio activo y minimizar los efectos secundarios adversos en el sujeto.

El término "sales farmacéuticamente aceptables" o "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir sales de los compuestos activos que se preparan con ácidos o bases relativamente no tóxicos, dependiendo de los sustituyentes particulares encontrados en los compuestos descritos en el presente documento. Cuando los compuestos de la presente solicitud contienen funcionalidades relativamente ácidas, se pueden obtener sales de adición de base poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, pura o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición de base farmacéuticamente aceptables incluyen sal de sodio, potasio, calcio, amonio, amino orgánico o magnesio o una sal similar. Cuando los compuestos de la presente solicitud contienen funcionalidades relativamente básicas, se pueden obtener sales de adición de ácido poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, puro o en un disolvente inerte adecuado. Ejemplos de sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos como ácidos clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrogenocarbónico, fosfórico, monohidrogenofosfórico, dihidrogenofosfórico, sulfúrico, monohidrogenosulfúrico, yodhídrico o fosforoso, y similares, así como las sales procedentes de ácidos orgánicos relativamente no tóxicos como acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, bencenosulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metanosulfónico, y similares. También se incluyen sales de aminoácidos tales como arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos como ácidos glucorónico o galacturónico y similares (véase, por ejemplo, Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19 (1977)). Otros vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos por los expertos en la técnica son adecuados para las composiciones descritas en el presente documento.

Las composiciones para administración comprenderán comúnmente un agente como se describe en el presente documento disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Puede usarse una diversidad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada, y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente no contienen materia no deseada. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas tales como agentes reguladores y tamponadores del pH, agentes reguladores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro potásico, cloruro de calcio, lactato sódico y similares. La concentración de agente activo en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del sujeto.

Las soluciones de los compuestos activos como la base libre o la sal farmacológicamente aceptable se pueden preparar en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante soluciones o pulverizaciones intranasales o inhalables, aerosoles o inhalantes. Las soluciones nasales pueden ser soluciones acuosas diseñadas para administrarse a los conductos nasales en gotas o aerosoles. Las soluciones nasales se pueden preparar para que sean similares en muchos aspectos a las secreciones nasales. Por lo tanto, las soluciones nasales acuosas suelen ser isotónicas y ligeramente tamponadas para mantener un pH de 5,5 a 6,5. Además, se pueden incluir en la formulación conservantes antimicrobianos, similares a los utilizados en preparaciones oftálmicas y estabilizadores farmacológicos apropiados, si es necesario. Se conocen diversas preparaciones nasales comerciales y pueden incluir, por ejemplo, antibióticos y antihistamínicos.

Las formulaciones orales pueden incluir excipientes como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas orales comprenderán un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable, o pueden estar encerradas en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, los compuestos activos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Dichas composiciones y preparaciones deben contener al menos un 0,1 % de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, puede variarse y puede ser convenientemente entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 75 % del peso de la unidad, o preferiblemente entre el 25-60 %. La cantidad de compuestos activos en dichas composiciones es tal que se puede obtener una dosis adecuada.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente y el diluyente líquido primero debe hacerse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Las soluciones acuosas, en particular, los medios acuosos estériles, son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Por ejemplo, una dosis podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto.

Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando los compuestos activos o construcciones en la cantidad requerida en el disolvente apropiado seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico. Las técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado, pueden usarse para preparar polvos estériles para la reconstitución de soluciones inyectables estériles. También se contempla la preparación de soluciones más concentradas, o altamente concentradas, para inyección directa. Se puede utilizar DMSO como disolvente para una penetración extremadamente rápida, proporcionando altas concentraciones de los agentes activos a un área pequeña.

Las formulaciones de compuestos se pueden presentar en envases sellados de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas y viales. Por lo tanto, la composición puede estar en forma de dosis unitaria. En tal forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. Por lo tanto, las composiciones se pueden administrar en una diversidad de formas de dosificación unitarias dependiendo del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración oral incluyen, pero sin limitación, polvo, comprimidos, píldoras, cápsulas y grageas.

Las composiciones se pueden formular para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada después de la administración empleando procedimientos conocidos en la técnica. Ciertos vehículos pueden ser más preferibles dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y la concentración de la composición que se administra. Se pueden encontrar formulaciones adecuadas para su uso en las composiciones proporcionadas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, David B. Troy, ed., Lippicott Williams y Wilkins (2005).

En el presente documento se proporcionan kits que comprenden una o más de las composiciones proporcionadas e instrucciones de uso. Opcionalmente, el kit comprende una o más dosis de una cantidad eficaz de una composición que comprende un agente de desagrupación de PTPRS. Opcionalmente, el kit comprende una proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS o una subsecuencia, porción, homólogo, variante o derivado de la misma. Opcionalmente, el kit comprende una o más porciones del dominio extracelular de PTPRS. Opcionalmente, la composición o proteína está presente en un recipiente (por ejemplo, un vial o paquete). Opcionalmente, el kit comprende uno o más agentes adicionales para tratar o prevenir uno o más síntomas de una enfermedad inflamatoria y/o autoinmune. Opcionalmente, el kit comprende un medio para administrar la composición, tal como, por ejemplo, una jeringa, aguja, tubos, catéter, parche y similares. El kit también puede comprender formulaciones y/o materiales que requieran esterilización y/o dilución antes de su uso.

Las composiciones y agentes que se describen en el presente documento son útiles tanto para el tratamiento profiláctico como terapéutico. Para uso profiláctico, se administra a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de los agentes descritos en el presente documento antes o durante el inicio temprano (por ejemplo, tras los signos y síntomas iniciales de una enfermedad autoinmune). El tratamiento terapéutico implica la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de los agentes descritos en el presente documento después del diagnóstico o desarrollo de la enfermedad.

Las proteínas, agentes y composiciones proporcionados son para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmune, incluyendo, por ejemplo, artritis tal como artritis reumatoide u osteoartritis. Opcionalmente, las proteínas, agentes y composiciones son para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad de la matriz extracelular y/o una enfermedad mediada por fibroblastos. Como se usa en el presente documento, el término "enfermedad de la matriz extracelular" se refiere a una afección, trastorno o enfermedad, asociada con la matriz extracelular (MEC) o uno o más componentes de la matriz extracelular. La matriz extracelular proporciona soporte estructural a las células además de estar involucrada en otras funciones biológicas que incluyen, pero sin limitación, la comunicación intracelular. Los componentes de la matriz extracelular incluyen, pero sin limitación, proteoglicanos (por ejemplo, heparán sulfato, sulfato de condroitina y sulfato de queratina), polisacáridos no proteoglicanos (por ejemplo, ácido hialurónico), fibras, colágeno, elastina, fibronectina y laminina. La matriz extracelular también sirve como depósito para señalizar moléculas tales como factores de crecimiento y citocinas. Las enfermedades de la matriz extracelular incluyen enfermedades asociadas con la desregulación de una o más funciones de la MEC (por ejemplo, comunicación intracelular y/o movimiento desregulados) o desregulación de uno o más componentes de la MEC (por ejemplo, actividad aumentada o disminuida y/o producción de uno o más componentes de la MEC). Las enfermedades de la matriz extracelular también incluyen enfermedades asociadas con la degradación y remodelación alteradas de la MEC y enfermedades asociadas con la acumulación alterada (por ejemplo, aumentada o disminuida) de agentes, por ejemplo, inmunocomplejos y otros productos inmunitarios, en la MEC. Las enfermedades de la matriz extracelular incluyen, pero sin limitación, aterosclerosis, cáncer, enfermedades amiloides, enfermedades glomerulares, enfermedades mesangiales, afecciones inflamatorias y trastornos del desarrollo. Como se usa en el presente documento, el término "enfermedad mediada por fibroblastos" se refiere a una afección, trastorno o enfermedad, asociada con la actividad o el movimiento de las células de fibroblastos. Los fibroblastos son un tipo de célula involucrada en la síntesis de la MEC y el colágeno y son el tipo de célula principal del tejido conectivo. Los tipos de fibroblastos incluyen, pero sin limitación, fibroblastos sinoviales, fibroblastos dérmicos y fibroblastos intersticiales. La función principal de los fibroblastos es mantener la integridad del tejido conectivo secretando continuamente componentes de la MEC. Las enfermedades mediadas por fibroblastos incluyen enfermedades asociadas con la actividad y/o movimiento alterados de fibroblastos. Por lo tanto, por ejemplo, una enfermedad mediada por fibroblastos incluye enfermedades asociadas con la migración de fibroblastos alterada o la actividad de fibroblastos alterada. Las actividades de los fibroblastos incluyen, pero sin limitación, producción de colágeno, producción de glucosaminoglicanos, producción de fibras reticulares y elásticas, producción de citocinas y producción de glucoproteínas. Por lo tanto, las enfermedades mediadas por fibroblastos incluyen enfermedades asociadas con la producción alterada por fibroblastos de uno o más de colágeno, glucosaminoglicanos, fibras reticulares y elásticas, citocinas y glucoproteínas.

En el presente documento se proporcionan métodos para modular la actividad de PTPRS en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente de desagrupación de PTPRS, donde la administración modula la actividad de PTPRS en el sujeto. También se proporcionan métodos para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad o trastorno autoinmune en un sujeto que lo necesite. Específicamente, se proporciona un método para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de desagrupación de PTPRS, donde la administración trata la enfermedad autoinmune en el sujeto. También se proporciona un método para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que aumenta la actividad fosfatasa de PTPRS, donde la administración trata la enfermedad autoinmune en el sujeto. Las enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero sin limitación, enfermedades autoinmunes inflamatorias. Opcionalmente, la enfermedad autoinmune es artritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil, esclerodermia, esclerodermia sistémica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico (LES), miastenia grave, diabetes de inicio juvenil, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Guillain-Barre, encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, espondilitis anquilosante, psoriasis, síndrome de Sjogren, vasculitis, glomerulonefritis, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, penfigoide bulloso, sarcoidosis, psoriasis, ictiosis, oftalmopatía de Graves, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Addison, vitíligo, asma o asma alérgica. Opcionalmente, la enfermedad autoinmune es artritis, enfermedad de Crohn, esclerodermia o artritis reumatoide. Opcionalmente, el compuesto es un agente de desagrupación de PTPRS. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS no es sulfato de condroitina. Opcionalmente, el agente de desagrupación no es sulfato de condroitina, un mimético del sulfato de condroitina o un agente que tenga el mismo mecanismo de acción o similar que el sulfato de condroitina. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS es un anticuerpo anti-PTPRS o un fragmento del mismo, un anticuerpo anti-heparán sulfato o un mimético de sulfato de condroitina. Opcionalmente, como se describe en todo momento, el agente de desagrupación de PTPRS puede ser una proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS o una subsecuencia, porción, variante homóloga, o derivado de la misma.

Los métodos incluyen administrar una cantidad eficaz de los agentes y composiciones proporcionados, donde la administración de la cantidad eficaz de la composición trata o previene la enfermedad autoinmune en el sujeto. La administración de una composición descrita en el presente documento puede ser una administración sistémica o localizada. Por ejemplo, el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno autoinmune inflamatorio puede incluir la administración de una forma oral o inyectable de la composición farmacéutica diariamente o en una programación regular. Opcionalmente, los agentes y la composición se formulan para su administración, se pueden formular para su administración al líquido sinovial, y/o para su administración a sinoviocitos de tipo fibroblasto. En algunos casos, el tratamiento es solo según sea necesario, por ejemplo, tras la aparición de síntomas de enfermedad autoinmune inflamatoria.

También se proporcionan métodos para disminuir la actividad de los fibroblastos en un sujeto. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de desagrupación de PTPRS, donde la administración disminuye la actividad de los fibroblastos en el sujeto. Opcionalmente, el agente de desagrupación no es sulfato de condroitina, un mimético del sulfato de condroitina o un agente que tenga el mismo mecanismo de acción o similar que el sulfato de condroitina. En algunos casos, el agente de desagrupación es un mimético de sulfato de condroitina. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS es una proteína recombinante no enzimática como se proporciona en el presente documento. Opcionalmente, el agente de desagrupación PTPRS se une al heparán sulfato. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS es un anticuerpo anti-PTPRS, o un fragmento del mismo, o un anticuerpo anti-heparán sulfato, o un fragmento del mismo. Opcionalmente, la actividad de los fibroblastos comprende la migración de los fibroblastos. Opcionalmente, la actividad de los fibroblastos comprende producción de colágeno, producción de glucosaminoglicanos, producción de fibras reticulares y elásticas, producción de citocinas, producción de quimiocinas, producción de glucoproteínas o combinaciones de las mismas. Opcionalmente, la actividad de los fibroblastos comprende la producción de matriz extracelular. Los fibroblastos incluyen, pero sin limitación, fibroblastos sinoviales, fibroblastos dérmicos y fibroblastos intersticiales. Opcionalmente, los fibroblastos son fibroblastos sinoviales.

Opcionalmente, el sujeto tiene una enfermedad mediada por fibroblastos. Por lo tanto, se proporcionan métodos para tratar una enfermedad mediada por fibroblastos en un sujeto. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de desagrupación de PTPRS, donde la administración trata la enfermedad mediada por fibroblastos en el sujeto. Opcionalmente, el agente de desagrupación no es sulfato de condroitina, un mimético del sulfato de condroitina o un agente que tenga el mismo mecanismo de acción o similar que el sulfato de condroitina. En algunos casos, el agente de desagrupación es un mimético de condroitina. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS es una proteína recombinante no enzimática como se proporciona en el presente documento. Opcionalmente, el agente de desagrupación PTPRS se une al heparán sulfato. Opcionalmente, el agente de desagrupación de PTPRS es un anticuerpo anti-PTPRS, o un fragmento del mismo, o un anticuerpo anti-heparán sulfato, o un fragmento del mismo. Las enfermedades mediadas por fibroblastos incluyen, pero sin limitación, fibrosis y enfermedades autoinumnes mediadas por fibroblastos. La fibrosis puede ser, por ejemplo, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis hepática, fibrosis endomiocárdica, fibrosis auricular, fibrosis mediastínica, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis sistémica nefrogénica, fibrosis cutánea o artrofibrosis. La enfermedad autoinmune mediada por fibroblastos puede ser, por ejemplo, enfermedad de Crohn, artritis, artritis reumatoide y esclerodermia.

En el presente documento se proporcionan métodos para modular la matriz extracelular en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de la proteína recombinante no enzimática proporcionada en el presente documento, donde la administración modula la matriz extracelular en el sujeto. Opcionalmente, el método no incluye la administración de sulfato de condroitina, un mimético del sulfato de condroitina o un agente que tenga el mismo mecanismo de acción o similar que el sulfato de condroitina. La modulación de la matriz extracelular incluye, por ejemplo, la modulación de uno o más componentes de la matriz extracelular. Opcionalmente, el componente de la matriz extracelular se selecciona del grupo que consiste en un proteoglicano, polisacárido o fibra. Opcionalmente, el componente de la matriz extracelular es un proteoglicano, por ejemplo, heparán sulfato o sulfato de condroitina. Opcionalmente, el componente de la matriz extracelular es heparán sulfato. Opcionalmente, el sujeto tiene una enfermedad de la matriz extracelular. Las enfermedades de la matriz extracelular son conocidas e incluyen, pero sin limitación, aterosclerosis, cáncer, una enfermedad amiloide, una afección inflamatoria, y un trastorno del desarrollo. Opcionalmente, la enfermedad amiloide es la enfermedad de Alzheimer o amiloidosis ^a A relacionada con la inflamación. Opcionalmente, la afección inflamatoria es osteoartritis, esclerodermia sistémica o lupus.

Los métodos proporcionados en el presente documento que incluyen el tratamiento de sujetos con una afección inflamatoria, una enfermedad autoinmune, una enfermedad mediada por fibroblastos, o una enfermedad de la matriz extracelular pueden incluir la administración de uno o más agentes adicionales que tratan o previenen la afección inflamatoria o la enfermedad autoinmune. Por ejemplo, los métodos proporcionados pueden incluir además la administración de una cantidad eficaz de uno o más agentes antiinflamatorios. Los agentes adicionales adecuados para su uso en los métodos proporcionados incluyen, pero sin limitación, analgésicos, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad, corticosteroides y análogos de vitamina D. Los fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad ejemplares para tratar o prevenir la artritis reumatoide incluyen, pero sin limitación, azatioprina, ciclosporina A, D-penicilamina, sales de oro, hidroxicloroquina, leflunomida, metotrexato (MTX), minociclina, sulfasalazina (SSZ), y ciclofosfamida.

Las combinaciones de agentes o composiciones se pueden administrar de forma concomitante (por ejemplo, como una mezcla), por separado pero simultáneamente (por ejemplo, a través de líneas intravenosas separadas) o secuencialmente (por ejemplo, se administra primero un agente seguido de la administración del segundo agente). Por lo tanto, el término combinación se utiliza para referirse a la administración concomitante, simultánea o secuencial de dos o más agentes o composiciones. El curso del tratamiento se determina mejor de forma individual dependiendo de las características particulares del sujeto y del tipo de tratamiento seleccionado. El tratamiento, tal como los descritos en el presente documento, se puede administrar al sujeto de forma diaria, dos veces al día, quincenal, mensual, o cualquier base aplicable que sea terapéuticamente eficaz. El tratamiento se puede administrar en solitario o en combinación con cualquier otro tratamiento descrito en el presente documento o conocido en la técnica. El tratamiento adicional se puede administrar simultáneamente con el primer tratamiento, en un momento diferente, o en un programa terapéutico completamente diferente (por ejemplo, el primer tratamiento puede ser diario, mientras que el tratamiento adicional es semanal).

De acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento, al sujeto se le administra una cantidad eficaz de uno o más de los agentes proporcionados en el presente documento. Los términos cantidad eficaz y dosis eficaz se utilizan indistintamente. El término cantidad eficaz se define como cualquier cantidad necesaria para producir una respuesta fisiológica deseada (por ejemplo, reducción de la inflamación). Un experto en la técnica puede determinar empíricamente las cantidades y los programas eficaces para administrar el agente. Los intervalos de dosificación para la administración son los suficientemente grandes para producir el efecto deseado en el que se ven afectados (por ejemplo, reducidos o retardados) uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno. La dosis no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos sustanciales, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas, y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad, condición, sexo, tipo de enfermedad, la extensión de la enfermedad o trastorno, vía de administración, o si se incluyen otros fármacos en el régimen, y puede determinarse por un experto en la técnica. La dosis puede ser ajustada por el médico individual en caso de contraindicaciones. Las dosis pueden variar y pueden administrarse en una o más dosis diarias, durante uno o varios días. En la bibliografía se pueden encontrar orientaciones sobre las dosis adecuadas para determinadas clases de productos farmacéuticos. Por ejemplo, para un determinado parámetro, una cantidad eficaz mostrará un aumento o disminución de al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 %, o al menos el 100 %. La eficacia también se puede expresar como un aumento o una disminución del "número de veces". Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede tener al menos un efecto de 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces o más de efecto en comparación con un control. La dosis y la formulación exactas dependerán del propósito del tratamiento, y un experto en la técnica podrá determinarlas usando técnicas conocidas (véanse, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, Gennaro, Editor (2003), y Pickar, Dosage Calculations (1999)).

Opcionalmente, los métodos de tratamiento proporcionados o el método para modular la actividad o función de PTPRS en un sujeto incluyen además obtener una muestra biológica del sujeto y determinar si el sujeto tiene un nivel de ARN alterado o un nivel de proteína alterado de una PTPRS en comparación con un control, un nivel de ARN alterado, o un nivel de proteína alterado que indica que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una afección inflamatoria, una enfermedad autoinmune, enfermedad mediada por fibroblastos o enfermedad de la matriz extracelular. Opcionalmente, el nivel alterado es un nivel elevado en comparación con un control. Una muestra o valor de control se refiere a una muestra que sirve como referencia, normalmente una referencia conocida, para compararla con una muestra de prueba. Por ejemplo, se puede tomar una muestra de prueba de un paciente sospechoso de tener una enfermedad autoinmune y compararla con muestras de un sujeto que se sabe que tiene una enfermedad autoinmune o un sujeto normal conocido (no enfermo). Un control también puede representar un valor promedio obtenido de una población de individuos similares, por ejemplo, pacientes con enfermedades autoinmunes o individuos sanos con antecedentes médicos similares, la misma edad, peso, etc. También se puede obtener un valor de control del mismo individuo, por ejemplo, de una muestra obtenida anteriormente, antes de la enfermedad, o antes del tratamiento.

Por lo tanto, también se proporcionan métodos para determinar si un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una afección inflamatoria, enfermedad autoinmune, enfermedad mediada por fibroblastos o enfermedad de la matriz extracelular, que comprenden obtener una muestra biológica del sujeto y determinar si el sujeto tiene un nivel de ARN elevado o un nivel de proteína elevado de una PTPRS, un nivel de ARN elevado o un nivel de proteína elevado que indica que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria, enfermedad mediada por fibroblastos o enfermedad de la matriz extracelular. Opcionalmente, los métodos proporcionados comprenden además seleccionar un sujeto con una enfermedad autoinmune. Opcionalmente, la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune inflamatoria, por ejemplo, artritis o artritis reumatoide. Como se usa en el presente documento, las muestras biológicas incluyen, pero sin limitación, células, tejidos y fluidos corporales. Los fluidos corporales que se utilizan para evaluar la presencia, ausencia o nivel de ARN de PTPRS o proteína incluyen, sin limitación, sangre completa, plasma, orina, suero, lágrimas, linfa, bilis, líquido cefalorraquídeo, líquido intersticial, humor acuoso o vítreo, calostro, esputo, líquido amniótico, saliva, muestra de lavado bronquioaviolar, transpiración, trasudado, exudado y líquido sinovial. Opcionalmente, la muestra biológica se deriva de un tejido articular o fluido corporal. Opcionalmente, los métodos proporcionados comprenden además aislar células del tejido articular o del fluido corporal formando así una muestra de células aisladas. Dichas muestras de células aisladas pueden comprender sinoviocitos, fibroblastos, células hematopoyéticas, macrófagos, leucocitos, linfocitos T, o una combinación de los mismos. Opcionalmente, los sinoviocitos son sinoviocitos de tipo fibroblasto o sinoviocitos de tipo macrófago. Opcionalmente, la muestra de células aisladas comprende sinoviocitos de tipo fibroblasto.

Los métodos para detectar e identificar ácidos nucleicos y proteínas y las interacciones entre dichas moléculas implican técnicas de biología molecular convencional, microbiología y de ADN recombinante dentro del conocimiento de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía (véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1986).

Los métodos para detectar ARN son en gran parte acumulativos con los ensayos de detección de ácido nucleico e incluyen, por ejemplo, transferencias de Northern, RT-PCR, matrices que incluyen micromatrices, y secuenciación que incluye métodos de secuenciación de alto rendimiento. En algunas realizaciones, se realiza una reacción de transcriptasa inversa y a continuación la secuencia diana se amplifica usando PCR estándar. La PCR cuantitativa (qPCR) o la PCR en tiempo real (RT-PCR) es útil para determinar los niveles de expresión relativa, en comparación con un control. Las técnicas y plataformas de ^pC^r cuantitativa son conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, el sitio web del qPCR Symposium, disponible en qpersymposium.com). Las matrices de ácidos nucleicos también son útiles para detectar la expresión de ácidos nucleicos. Las matrices personalizables están disponibles, por ejemplo, en Affymatrix. Opcionalmente, los métodos para detectar ARN incluyen métodos de secuenciación. La secuenciación de ARN es conocida y puede realizarse con una diversidad de plataformas que incluyen, pero sin limitación, plataformas proporcionadas por Illumina, Inc., (La Jolla, CA) o Life Technologies (Carlsbad, cA). Véanse, por ejemplo, Wang, et al., Nat Rev Genet. 10(1):57-63 (2009); y Martin, Nat Rev Genet. 12(10):671-82 (2011).

Los niveles o la concentración de proteínas se pueden determinar mediante métodos estándar en la técnica para cuantificar proteínas, tales como transferencia de Western, ELISA, ELISPOT, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia (por ejemplo, FACS), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, etc., así como cualquier otro método ahora conocido o desarrollado posteriormente para cuantificar proteínas en o producidas por una célula.

También se proporcionan métodos para identificar un agente de desagrupación de PTPRS candidato, comprendiendo el método poner en contacto un agente de prueba con péptidos de PTPRS agrupados y detectar la desagrupación de los péptidos de PTPRS, identificando así un agente de desagrupación de PTPRS candidato. Opcionalmente, el método para identificar un agente de desagrupación de PTPRS candidato incluye poner en contacto un agente de prueba con PTPRS y heparán sulfato y determinar si el agente de prueba inhibe o reduce la unión de PTPRS al heparán sulfato, la inhibición o reducción de la unión que indica que el agente de prueba es un agente de desagrupación de PTPRS. Opcionalmente, el agente de prueba es un ácido nucleico, péptido, anticuerpo o molécula pequeña. Opcionalmente, el PTPRS agrupado forma parte de una membrana celular o célula. Los métodos de identificación de agentes de desagrupación de PTPRS se pueden realizar in vitro, in situ o in vivo. Un agente de prueba puede identificarse como un agente de desagrupación de PTPRS usando los métodos descritos en el ejemplo siguiente y otros conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001). Por lo tanto, la desagrupación de PTPRS agrupada se puede realizar usando cualquier método apropiado conocido en la técnica. Hay diversos métodos disponibles para evaluar si un agente es eficaz para desagrupar la PTPRS. Por ejemplo, se puede usar un ensayo de lectura basado en células para la función de PTPRS. La desagrupación de PTPRS se puede observar detectando una disminución en la fosforilación de tirosina de sustratos de PTPRS o intermedios de señalización aguas abajo. La desagrupación también se puede observar detectando una disminución en la migración o invasión de fibroblastos (por ejemplo, FLS). Otros ensayos incluyen, pero sin limitación, ensayos basados en FRET, y filtración en gel. Por ejemplo, en dichos ensayos, las células pueden tratarse con HS para inducir la agrupación de PTPRS y a continuación tratarse con los agentes de prueba para probar la desagrupación de PTPRS. De manera similar, la unión por inhibición de PTPRS al heparán sulfato puede detectarse usando cualquier método apropiado conocido en la técnica. Por ejemplo, un agente puede identificarse como un agente que inhibe o reduce la unión de PTPRS al heparán sulfato mediante la realización de un ensayo en el que se puede detectar la unión de PTPRS a heparán sulfato (por ejemplo, un inmunoensayo). El agente inhibe o reduce la unión de PTPRS al heparán sulfato si se puede detectar la unión de PTPRS a heparán sulfato en ausencia del agente, pero ya no se detecta o la unión se reduce en presencia del agente. Opcionalmente, la unión puede detectarse determinando si el agente a ensayar inhibe competitivamente el heparán sulfato de la unión a PTPRS. Opcionalmente, un agente puede identificarse como un agente que inhibe o reduce la unión de PTPRS al heparán sulfato realizando un ensayo que mide la función o actividad de PTPRS.

A modo de ejemplo, un agente de prueba puede identificarse como un agente de desagrupación de PTPRS determinando si el agente reduce la gravedad de uno o más síntomas de la enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria. Por lo tanto, a modo de ejemplo, en los métodos de cribado proporcionados, la etapa de contacto comprende administrar el agente a un sujeto con una enfermedad autoinmune o inflamatoria, y la etapa de determinación comprende determinar si el agente previene o reduce uno o más síntomas de la enfermedad en un sujeto. Opcionalmente, la enfermedad es artritis o artritis reumatoide. Dichos métodos de cribado se pueden realizar usando, por ejemplo, modelos animales de enfermedad inflamatoria y autoinmune, que se pueden obtener de laboratorios comerciales (por ejemplo, Jackson Laboratory, 600 Main Street, Bar Harbor, Maine 04609 EE.UU.). Dichos métodos de cribado también se pueden realizar utilizando los modelos de ratón y métodos descritos en el ejemplo siguiente.

Se describen materiales, composiciones y componentes que se pueden usar, se pueden usar junto con, se pueden usar en la preparación para, o son productos de los métodos y composiciones que se describen. Estos y otros materiales se describen en el presente documento, y se entiende que cuando se describen combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, si bien la referencia específica de cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estos compuestos no se puede describir explícitamente, cada uno se contempla y se describe específicamente en el presente documento. Por ejemplo, si se describe y se analiza un método y se analizan una serie de modificaciones que se pueden realizar en varias moléculas, incluido el método, se contemplan específicamente todas y cada una de las combinaciones y permutaciones del método, y las modificaciones que son posibles, a menos que específicamente se indique lo contrario. Asimismo, cualquier subconjunto o combinación de estos también se contempla y se describe específicamente. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta descripción, incluidas, pero sin limitación, las etapas en los métodos que utilizan las composiciones descritas. Por lo tanto, si hay una diversidad de etapas adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada una de estas etapas adicionales se puede realizar con cualquier etapa específica del método o combinación de etapas del método de los métodos descritos, y que cada una de dichas combinaciones o subconjuntos de combinaciones se contemplan específicamente y deben considerarse descritas.

Ejemplo

Ejemplo 1. Interacciones funcionales entre PTPRS y proteoglicanos en sinoviocitos de tipo fibroblasto.

La proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, S o Sigma (PTPRS) tiene un dominio extracelular que incluye múltiples dominios de tipo fibronectina tipo III y dominios de tipo inmunoglobulina (Ig). Los dos dominios de Ig más externos (llamados Ig1 e Ig2) interactúan con afinidad nanomolar con PG (proteoglicano) que contiene HS (heparán sulfato) y CS (sulfato de condroitina). La interacción de PTPRS con HS-PG (proteoglicanos) (que se encuentran en capas en la superficie celular de la mayoría de los tipos de células) induce una topología agrupada de PTPRS, que inhibe la acción de la fosfatasa y promueve la señalización. Por el contrario, CS-Pg (enriquecido en la MEC que rodea a las neuronas y otras células) compite eficazmente con HS-PG induciendo una conformación desagrupada, que es activa y conduce a la inhibición de la señalización. En ciertos experimentos, se utilizaron ratones desactivados para PTPRS. Estos ratones mostraron un fenotipo de disminución del peso corporal y del tamaño del cerebro, déficits en la memoria de aprendizaje, funciones nerviosas, aumento de la regeneración de la médula espinal después de hemisección y lesiones por contusión y aumento de la formación de axones a través de barreras inhibitorias (CSPG).

Los ratones que expresan el transgén del receptor de linfocitos T (TCR) KRN y la molécula A(g7) del MHC de clase II (ratones K/BxN) desarrollan artritis inflamatoria grave. El suero de estos ratones causa artritis en otras cepas de ratones. Para determinar si PTPRS está implicado en la artritis, se evaluó la expresión de PTPRS en ratones que recibieron suero K/BxN. Las figuras 1A y 1B son gráficos que representan la expresión de PTPRS en sinoviocitos de tipo fibroblasto (FLS). La figura 1A muestra la expresión en ratones. Se aislaron CD90+CD11b-CD3-CD45- mFLS primarios del tejido articular 7 días después de la transferencia aguda de suero K/BxN (administración única de 150 |jl de suero), 21 días después de la transferencia crónica de suero K/BxN (administración única de 150 j l de suero seguida de 2 dosis de refuerzo semanales de 50 j l de suero), o de ratones de control no inyectados. La figura 1A muestra los niveles de expresión de PTPRS y Cadherina-11 (CAD11) medidos por qPCR. Para determinar si la expresión de PTPRS está elevada en seres humanos, se evaluaron los niveles de expresión de PTPRS por qPCR de fibroblastos dérmicos humanos normales y el FLS cultivado aislado de una articulación reumatoide. Los resultados se muestran en la figura 1B. La PTPRS también está elevada en FLS aislado de una articulación reumatoide en un ser humano.

Se observó una mayor gravedad de la erosión ósea en la artritis para ratones PTPRS -/- en comparación con ratones PTPRS /+. Los resultados se muestran en las figuras 2A-2F. A los ratones se les inyectaron 100 j l de suero K/BxN por vía intraperitoneal a las 8-10 semanas de edad (PTPRS-/- recibieron proporcionalmente menos suero para reflejar su peso corporal disminuido). El grosor del tobillo se midió con calibradores digitales y los tobillos y las muñecas recibieron una puntuación de artritis clínica entre 0 (sin enrojecimiento ni hinchazón) y 4 (hinchazón máxima con los dedos afectados) cada dos días durante 14 días. Véanse las figuras 2A, 2B, y 2C. Después de 14 días, se sacrificó a los ratones y se fijaron los tobillos para determinar la puntuación histológica usando tinción con H&E (inflamación y erosión ósea) y safranina O (erosión del cartílago). Véanse las figuras 2D (inflamación), 2E (erosión del cartílago) y 2F (erosión ósea).

Con el fin de investigar más a fondo el papel de PTPRS, se aislaron y evaluaron FLS de ratón primarios. Las articulaciones de la rodilla, tobillo y codo se combinaron de ratones individuales y se trituraron en medio RPMI caliente en condiciones estériles. Se incubaron porciones picadas de cada ratón en 40 ml de medio RPMI caliente que contenía 0,5 mg/ml de colagenasa tipo IX durante 2 horas a temperatura ambiente en una plataforma basculante. Las células y trozos de articulación se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en medio FLS (DMEM que contenía ^fB^s al 10 %, 100 Ul/ml de penicilina/l0o pg/ml de estreptomicina, 10 pg/ml de gentamicina, glutamina 2 mM) y se colocaron en placas en matraces T75 durante 3 días antes de cambiar de medio. Una vez que las células alcanzaron una confluencia del -90 %, los trozos de articulación se lavaron y las células se subcultivaron. Las células se expandieron y se congelaron en el pase 2 y se usaron para experimentos entre los pases 4 y 8.

Se hicieron crecer mFLS de ratones PTPRS -/- hasta una confluencia de -90 % y se privaron de alimento durante una noche. Se recubrieron insertos transwell (0,8 pm de tamaño de poro) con 100 pl de matrigel diluido 1:25 en medio frío sin suero que no contenía o contenía 100 pg/ml de sulfato de condroitina (CS) y se incubaron a 37 °C durante 2 horas antes de colocarlos en 600 pl de medio FLS que contenía FBS al 5 %. Se sembraron en placas 2,5 x 104 células en cada cámara transwell en 100 pl de medio FLS que contenía BSA al 0,5 %. Se dejó que las células invadieran durante tres días a 37 °C, después de lo cual se aclararon los insertos transwell con PBS y se eliminaron las células de la membrana superior con un hisopo de algodón. Las células que estaban en la superficie de la membrana inferior se fijaron con metanol durante 10 minutos y se tiñeron con violeta cristal durante 30 minutos. Las células se visualizaron utilizando un microscopio óptico Nikon 80i y se utilizaron cinco campos de 100x por membrana para el recuento. Los resultados se muestran en la figura 3. El gráfico es representativo de tres experimentos independientes; tres pocillos por tratamiento; líneas celulares de crías de la misma camada hembra. La figura 3 muestra que PTPRS -/- FLS exhibe una inhibición de la invasión mediada por CS reducida.

Se hicieron crecer mFLS de ratones PTPRS /+ y PTPRS -/- hasta una confluencia de -90 % y se privaron de alimento durante una noche. Se humedecieron previamente insertos transwell (0,8 pm de tamaño de poro) con medio FLS sin suero a 37°C durante 30 minutos antes de colocarlos en 600 pl de medio FLS que contenía FBS al 5 %. Se sembraron en placas 2,5 x 104 células en cada cámara transwell en 100 pl de medio FLS que contenía BSA al 0,5 % y concentraciones crecientes de sulfato de condroitina (CS). Se dejó que las células migraran durante 4 horas a 37 °C, después de lo cual se aclararon los insertos transwell con PBS y se eliminaron las células de la membrana superior con un hisopo de algodón. Las células que migraron a la superficie de la membrana inferior se fijaron con metanol durante 10 minutos y se tiñeron con violeta cristal durante 30 minutos. Las células se visualizaron utilizando un microscopio óptico Nikon 80i y se utilizaron cinco campos de 100x por membrana para el recuento. Los resultados se muestran en la figura 4. El asterisco significa una diferencia estadísticamente significativa entre las dos muestras. La figura 4 muestra que los PTPRS -/- mFLS son insensibles a CS a niveles aproximadamente 5 veces más altos que los de la articulación.

Se hicieron crecer mFLS de ratones PTPRS /+ y PTPRS -/- hasta una confluencia de -90 % y se privaron de alimento durante una noche. Se humedecieron previamente insertos transwell (0,8 pm de tamaño de poro) con medio FLS sin suero a 37°C durante 30 minutos antes de colocarlos en 600 pl de medio FLS que contenía FBS al 5 %. Se sembraron en placas 2,5 x 104 células en cada cámara transwell en 100 pl de medio FLS que contenía BSA al 0,5 % con o sin 100 pg/ml de sulfato de condroitina (CS). Se dejó que las células migraran durante 4 horas a 37 °C, después de lo cual se aclararon los insertos transwell con ^p B^s y se eliminaron las células de la membrana superior con un hisopo de algodón. Las células que migraron a la superficie de la membrana inferior se fijaron con metanol durante 10 minutos y se tiñeron con violeta cristal durante 30 minutos. Las células se visualizaron utilizando un microscopio óptico Nikon 80i y se utilizaron cinco campos de 100x por membrana para el recuento. Los resultados se muestran en la figura 5, que son representativos de tres experimentos independientes; tres pocillos por tratamiento; líneas celulares de crías de la misma camada hembra; confirmados en el segundo par independiente de líneas celulares macho. La figura 5 muestra que PTPRS -/- mFLS exhibe una inhibición de la migración mediada por CS reducida.

Se obtuvieron oligos antisentido morfolino permeables a las células de GeneTools (Philomath, OR) y se diseñaron para unir uniones intrón-exón y provocar el corte y empalme de un exón seleccionado dando como resultado un desplazamiento de marco. Esto finalmente provoca un producto de ARNm truncado y no funcional después de 7 días. Los resultados se muestran en la figura 6. Los morfolinos mediaron la inactivación de PTPRS en FLS primario de ratón y humano.

Para determinar el efecto de la inactivación de PTPRS en la artritis reumatoide (AR) humana, se sembraron hRA FLS en placas de 6 pocillos y se dejaron adherir durante una noche. Se reemplazó el medio que contenía oligo morfolino 2,5 pM (control o dirigido contra PTPRS) y se logró la inactivación después de 7 días (cambiando el medio y el oligo el día 3). A continuación, las células se privaron de alimento durante una noche antes del ensayo de migración. Se humedecieron previamente insertos transwell (0,8 pm de tamaño de poro) con medio FLS sin suero a 37°C durante 30 minutos antes de colocarlos en 600 pl de medio FLS que contenía FBS al 5 %. Se sembraron en placas 5 x 104 células en cada cámara transwell en 100 pl de medio FLS que contenía BSA al 0,5 % con o sin 100 pg/ml de sulfato de condroitina (CS). Se dejó que las células migraran durante 24 horas a 37 °C, después de lo cual se aclararon los insertos transwell con PBS y se eliminaron las células de la membrana superior con un hisopo de algodón. Las células que migraron a la superficie de la membrana inferior se fijaron con metanol durante 10 minutos y se tiñeron con violeta cristal durante 30 minutos. Las células se visualizaron utilizando un microscopio óptico Nikon 80i y se utilizaron cinco campos de 100x por membrana para el recuento. Los resultados se muestran en la figura 7, que son representativos de cinco experimentos independientes en tres líneas celulares de pacientes; tres pocillos por tratamiento. La figura 7 muestra que la inactivación de PTPRS aumenta la migración de RA FLS humano y anula la inhibición de la migración mediada por CS.

Para investigar más el papel de las PTP en las enfermedades autoinmunes, se analizó el PTPome de ARNm de RA FLS. Los resultados se muestran en la figura 8. Al menos 5 PTP se expresaron altamente en RA FLS, una de los cuales fue PTPRS.

Para estudiar más a fondo la expresión de PTPRS, se midió la expresión en FLS y macrófagos de ratones combinados mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Los resultados se muestran en las figuras 9A y 9B. Los valores son la media de la expresión de PTP con respecto al gen constitutivo GAPDH. La figura 9A muestra que FLS se clasificaron de ratones de control o ratones con artritis aguda o crónica inducida por suero K/BxN, y la figura 9B muestra macrófagos clasificados de ratón y FLS con PTPRC incluida como control positivo para la expresión en macrófagos.

Para estudiar más a fondo los efectos de PTPRS sobre la migración de FLS, se permitió la invasión de PTPRS WT o KO FLS a través de cámaras transwell recubiertas con Matrigel. Las células por campo se contaron después de la invasión durante 24 horas en respuesta a suero fetal bovino (FBS) al 5 % en presencia de sulfato de condroitina (CS). Los resultados se muestran en la figura 10A. En la figura 10B, se permitió que PTPRS WT o KO FLS migraran a través de cámaras transwell no revestidas. Las células por campo se contaron después de la migración durante 4 horas en respuesta a FBS al 5 % en presencia de CS con o sin tratamiento con condroitinasa ABC. Las barras indican la media /- error estándar del cambio múltiplo de migración con respecto la de las células no tratadas. Los datos incluyen tres experimentos independientes que utilizan tres conjuntos de líneas celulares de crías de la misma camada. (***P <0,001; significancia determinada mediante la prueba de Mann-Whitney sobre datos brutos). Las figuras 10A y 10B muestran que los ratones PTPRS KO FLS no migraron en respuesta a CS.

Como se muestra en las figuras 11A y 11B, la inhibición de la migración de RA FLS por sulfato de condroitina (CS) depende de la expresión de PTPRS. La figura 11A es un gráfico de datos de RT-PCR que muestra la inactivación de PTPRS en RA FLS después de la incubación con oligo antisentido (ASO) durante 7 días. En la figura 11B, se permitió que PTPRS WT o KO FLS migraran a través de cámaras transwell no revestidas. Las células por campo se contaron después de la migración durante 4 h en respuesta a suero fetal bovino (FBS) al 5 % en presencia de CS con o sin tratamiento con condroitinasa ABC. Las barras indican la media /- error estándar del cambio múltiplo de migración con respecto la de las células no tratadas. Los datos incluyen tres experimentos independientes que utilizan tres conjuntos de líneas celulares de crías de la misma camada. (***P <0,001; significancia determinada mediante la prueba de Mann-Whitney sobre datos brutos).

Como se muestra en las figuras 12A y 12B, el desplazamiento de PTPRS del sulfato de heparina (HS) es suficiente para inhibir la migración y la invasión de FLS. Se permitió la invasión de PTPRS WT o KO FLS a través de cámaras transwell no recubiertas. Las células por campo se contaron después de la migración durante 4 h en respuesta a suero fetal bovino (FBS) al 5 % en presencia de 20 nM de Ig1+2 en solitario (figura 12A) o además de 100 pg/ml de CS (figura 12B). Las barras indican la media /- error estándar del cambio múltiplo de migración con respecto la de las células no tratadas. Los datos incluyen tres experimentos independientes que utilizan tres conjuntos de líneas celulares de crías de la misma camada. (**P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001; significancia determinada mediante la prueba de Mann-Whitney sobre datos brutos).

Para estudiar los efectos de Ig1 y 2 sobre el cartílago bovino, se tomaron micrografías de luz de explantes de cartílago bovino en presencia y ausencia de tratamiento con Ig1+2. La figura 13A muestra micrografías de luz teñidas con hematoxilina de Mayer con y sin tratamientos con Ig1+2. La figura 13B es un gráfico que muestra los recuentos celulares con y sin tratamientos con Ig1+2.

Las figuras 14A y 14B son gráficos que muestran la unión y desfosforilación de beta-catenina y cadherina. La figura 14A es una transferencia de Western de lisados de células totales o lisados incubados con sustrato de GST o GST-PTPRS D/A que atrapa el mutante de FLS no estimulado o estimulado por pervanadato. * representa GST-PTPRS D1 D/A y ** representa la etiqueta GST. Figura 14B Transferencia de Western que muestra una disminución de la fosforilación de tirosina de beta-catenina inmunopurificada en presencia de GST-PTPRS D1 en comparación con GST en solitario.

La figura 15 es un gráfico que muestra el efecto de Ig1 e Ig2 en la mejora de la artritis. Puntuación clínica de ratones BALB/c inducidos con artritis aguda mediante la administración de 100 pl de suero K/BxN el Día 0 y tratados con vehículo (control) o 500 pg de Ig1+2 al día desde los días 0 a 6. N = 3 por tratamiento. Análisis histopatológico de la articulación con y sin tratamiento con Ig1+2 más puntuación de erosión y daño del cartílago.

Como se muestra en la figura 16, el tratamiento de mFLS con Ig1+2 de PTPRS recombinante reduce la migración. Se hicieron crecer mFLS hasta una confluencia de -90 % y se privaron de alimento durante una noche. Se humedecieron previamente insertos transwell (0,8 pm de tamaño de poro) con medio FLS sin suero a 37°C durante

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína recombinante no enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de PTPRS, donde la proteína comprende tanto el dominio 1 (Ig1) de tipo inmunoglobulina como el dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig2) de PTPRS, para su uso en terapia.

2. La proteína recombinante no enzimática para su uso según la reivindicación 1, donde el dominio extracelular de PTPRS comprende el dominio 1 (Ig1) de tipo inmunoglobulina, el dominio 2 de tipo inmunoglobulina (Ig2) y el dominio 3 de tipo inmunoglobulina (Ig3) de PTPRS.

3. La proteína recombinante no enzimática para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde la proteína comprende los residuos de aminoácidos de Ig1 30 a 127 de SEQ ID NO: 4 o los residuos de aminoácidos 30-127 de SEQ ID NO: 8.

4. La proteína recombinante no enzimática para su uso según la reivindicación 3, donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como:

EEPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESA GAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLRE (SEQ ID NO: 1) o como se expone en la SEQ ID NO: 5.

5. La proteína recombinante no enzimática para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde la proteína comprende los residuos de aminoácidos de Ig2128 a 231 de SEQ ID NO: 4 o los residuos de aminoácidos 128-244 de SEQ ID NO: 8.

6. La proteína recombinante no enzimática para su uso según la reivindicación 5, donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como:

DQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRI KQLRSETFESTPIRGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA (SEQ ID NO: 2) o como se expone en la SEQ ID NO: 6.

7. La proteína recombinante no enzimática para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde la proteína comprende los residuos de aminoácidos de Ig3232-321 de SEQ ID NO: 4 o los residuos de aminoácidos 245-334 de SEQ ID NO: 8.

8. La proteína recombinante no enzimática para su uso según la reivindicación 7, donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como:

PRFSILPMSHEIMPGGNVNITCVAVGSPMPYVKWMQGAEDLTPEDDMPVGRNVLEL TDVKDSANYTCVAMSSLGVIEAVAQITVKSLPKA (SEQ ID NO: 3) o como se expone en la SEQ ID NO: 7.

9. La proteína recombinante no enzimática para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la proteína se une al heparán sulfato.

10. La proteína recombinante no enzimática para su uso como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene artritis.

11. La proteína recombinante no enzimática para su uso según la reivindicación 10, donde la artritis es artritis reumatoide.

12. Un agente de desagrupación de PTPRS para su uso en un método de tratamiento de artritis donde el agente de desagrupación de PTPRS se selecciona de: la proteína recombinante no enzimática como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; un anticuerpo anti-PTPRS, o un fragmento del mismo; o un anticuerpo antiheparán sulfato, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de desagrupación de PTPRS, donde la administración trata la artritis en el sujeto.

13. El agente de desagrupación de PTPRS para su uso según la reivindicación 12, donde la artritis es artritis reumatoide.