ES2819152T3

ES2819152T3 - Control biológico de virus vegetales

Info

Publication number: ES2819152T3
Application number: ES16784990T
Authority: ES
Inventors: Adrianus Marinus Wilhelmus Vermunt
Original assignee: Looije Applications BV
Current assignee: Looije Applications BV
Priority date: 2015-10-05
Filing date: 2016-10-04
Publication date: 2021-04-15
Anticipated expiration: 2036-10-04
Also published as: PL3359672T3; MX2018004174A; EP3359672A1; CA3000945A1; WO2017061859A1; MA44271B1; US10920241B2; HUE051834T2; MX392243B; EP3359672B1; US20190048323A1; CA3000945C

Abstract

Un virus atenuado del mosaico del pepino que comprende una molécula de ácido nucleico al menos en un 80% idéntica a la SEQ ID NO:1 y en la que la secuencia de ácido nucleico codifica arginina en la posición 868 de SEQ ID NO:2, fenilalanina en la posición 956 de SEQ ID NO:2, fenilalanina en la posición correspondiente a 1052 de SEQ ID NO:2 y asparagina en la posición 1325 de SEQ ID NO:2.

Description

DESCRIPCIÓN

Control biológico de virus vegetales

Campo de la invención

La presente divulgación proporciona nuevos virus atenuados del mosaico del pepino que son útiles en el control de enfermedades de las plantas. También se proporcionan composiciones para el control biológico de enfermedades de las plantas, así como procedimientos para la inducción de protección cruzada y resistencia aumentada contra el virus del mosaico del pepino en plantas.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al campo del control biológico en agricultura y horticultura, en particular, al control de patógenos vegetales.

El tomate es susceptible a diversas enfermedades virales, y uno de los agentes causales, el virus del mosaico del pepino (PepMV), se ha convertido recientemente en un factor limitante importante con respecto a la producción de tomate. PepMV pertenece al género Potexvirus de la familia Alphaflexiviridae. PepMV se ha extendido rápidamente por los cultivos comerciales de tomate y actualmente se encuentra en Europa y América del Norte (Jorda et al., 2001; Cotillon et al., 2002; Verhoeven et al., 2003; Ling et al., 2008). El genoma de ARN de PepMV abarca aproximadamente 6,4 kb y contiene cinco marcos de lectura abiertos que codifican una polimerasa dependiente de ARN (RdRp), un bloque de triple gen (TGB), una proteína de cubierta (CP) y dos secuencias cortas sin traducir que flanquean las regiones codificantes. (Aguilar et al., 2002; Cotillon et al., 2002). Los aislados de PepMV se agrupan en cuatro cepas separadas (genotipos) basadas en la similitud de secuencia, a saber, la cepa peruana (LP) a la que pertenece la cepa original de PepMV, la cepa europea (UE) que se encontró en Europa en 1999 (Van der Vlugt et al, 2000), la cepa CH2 que se descubrió en semillas de tomate infectadas en Chile, y la cepa US1 que se descubrió en plantas de tomate enfermas en los Estados Unidos (Ling, 2007). La gravedad de los síntomas varía entre los diferentes aislados de PepMV (Van der Vlugt et al., 2000) y las diferencias en la gravedad no coinciden necesariamente con las diferencias en el genotipo (Hanssen et al, 2008).

PepMV induce una amplia gama de síntomas en el tomate (Van der Vlugt et al, 2000; Jorda et al, 2001), como mosaico, distorsión de las hojas, espigas en forma de ortiga, manchas amarillas únicas, clorosis interveinal y decoloración de la fruta. Las plantas de tomate muestran síntomas poco después de la infección por PepMV y, en general, se recuperan posteriormente (Van der Vlugt & Stijger, 2008). Sin embargo, los síntomas pueden regresar más tarde durante la temporada de crecimiento. La expresión de los síntomas también puede depender de las condiciones ambientales, como la temperatura y la intensidad de la luz (Jorda et al., 2001; Van der Vlugt & Stijger, 2008). A veces se sugiere que PepMV causa pérdidas de rendimiento en tomate, pero las mayores pérdidas económicas se atribuyen a síntomas que afectan el valor comercial de los frutos del tomate, como flameado, jaspeado (veteado), maduración con manchas y reducción del tamaño del fruto (Soler et al., 2000; Spence et al., 2006).

El PepMV se transmite eficazmente a través de manos, ropa o herramientas contaminadas (Van der Vlugt & Stijger, 2008). El contacto directo entre plantas sanas e infectadas durante la manipulación rutinaria del cultivo también es suficiente para propagar la infección por PepMV. La incidencia de PepMV en tomate es muy alta en algunas zonas de cultivo de tomate, donde el virus puede afectar hasta al 90% de los invernaderos (Soler-Aleixandre et al., 2005). Mantenerse libre de virus es un desafío en tales circunstancias.

Existe una necesidad en la técnica de proteger las plantas de la infección por PepMV y de prevenir o reducir las enfermedades de las plantas asociadas con la infección por PepMV.

Resumen de la invención

La presente invención corresponde al objeto que se define en las reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona un virus atenuado del mosaico del pepino que comprende una molécula de ácido nucleico al menos en un 80% idéntica a la SEQ ID NO:1 y en la que la secuencia de ácido nucleico codifica la arginina en la posición 868 de la SEQ ID NO:2, fenilalanina en la posición 956 de SEQ ID NO:2, fenilalanina en la posición correspondiente a 1052 de SEQ ID NO:2, y asparagina en la posición 1325 de SEQ ID NO:2 así como una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% identidad con SEQ ID NO:9 y donde el ácido nucleico codifica una arginina en la posición correspondiente a 886 de SEQ ID NO:9, una fenilalanina en la posición correspondiente a 1070 de SEQ ID NO: 9, una fenilalanina en la posición correspondiente a posición 974 de SEQ ID NO:9, y una asparagina en la posición correspondiente a la posición 1343 de SEQ ID NO:9.

En un aspecto, la divulgación proporciona un virus atenuado del mosaico del pepino que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico, en la que el nucleótido en la posición correspondiente a 2605 de Se Q ID NO:1 es G, el nucleótido en la posición correspondiente a 3156 de s Eq ID NO:1 es T, y/o el nucleótido en la posición correspondiente a 3422 de SEQ ID NO:1 es G. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es idéntica en al menos 80% a SEQ ID NO:1.

En un aspecto, la divulgación proporciona un virus atenuado del mosaico del pepino que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica arginina en la posición según 868 de SEQ ID NO:2 y/o codifica fenilalanina en la posición de acuerdo con 1052 de SEQ ID. NO:2. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es al menos un 80% idéntica a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7. Más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO:1.

En un aspecto, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 95% de identidad con una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica arginina en la posición según 868 de SEQ ID NO:2 y/o codifica fenilalanina en la posición según 1052 de SEQ ID NO:2. En realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas en la Figura 6, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica la arginina en la posición 887 de la Figura 6 y/o la secuencia de ácido nucleico codifica fenilalanina en la posición 1071 de la Figura 6.

En un aspecto, la divulgación proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN en la que la polimerasa tiene una arginina en la posición de acuerdo con 868 de SEQ ID NO:2, una fenilalanina en la posición de acuerdo con 1052 de SEQ ID NO:2, una fenilalanina en la posición correspondiente a 956 de SEQ ID NO:2, y/o una asparagina en la posición correspondiente a 1325 de SEQ ID NO:2. Preferiblemente, dicha polimerasa tiene una arginina en la posición según 868 de SEQ ID NO:2 y una fenilalanina en la posición según 1052 de SEQ ID NO:2. Preferiblemente, dicha polimerasa tiene una fenilalanina en la posición correspondiente a 956 de SEQ ID NO:2 y una asparagina en la posición correspondiente a 1325 de s Eq ID NO:2. Preferiblemente, dicha polimerasa tiene una arginina en la posición según 868 de SEQ ID NO:2 y una fenilalanina en la posición correspondiente a 956 de SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, las ARN polimerasas dependientes de ARN tienen al menos 50%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas en la Figura 6. La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una polimerasa como se indica en este párrafo.

En un aspecto, la divulgación proporciona un virus atenuado del mosaico del pepino que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico, en la que el nucleótido en la posición correspondiente a 2675 de Se Q ID NO:8 es G, el nucleótido en la posición correspondiente a 3226 de s Eq ID NO:8 es T, y/o el nucleótido en la posición correspondiente a 3492 de SEQ ID NO:8 es G. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es al menos un 80% idéntica a SEQ ID NO:8.

En un aspecto, la divulgación proporciona un virus atenuado del mosaico del pepino que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica arginina en la posición de acuerdo con 886 de SEQ ID NO:9 y/o codifica fenilalanina en la posición según 1070 de SEQ ID. NO:9. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, o SEQ ID NO:7. Más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos el 95%, al menos el 99% o el 100% de identidad. SEQ ID NO:8.

En un aspecto, la divulgación proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que tiene al menos 50%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 99% o al menos 100% de identidad con SEQ ID NO:9, en donde la polimerasa tiene una arginina en la posición según 886 de SEQ ID NO:9 y/o una fenilalanina en la posición según 1070 de SEQ ID NO:9. Preferiblemente, dicha polimerasa tiene una arginina en la posición según 886 de SEQ ID NO:9 y una fenilalanina en la posición según 1070 de SEQ ID NO:9. Preferiblemente, dicha polimerasa tiene una fenilalanina en la posición correspondiente a 974 de SEQ ID NO:2 y una asparagina en la posición correspondiente a 1343 de SEQ ID NO:2. Preferiblemente, dicha polimerasa tiene una arginina en la posición según 886 de SEQ ID NO:2 y una fenilalanina en la posición correspondiente a 974 de SEQ ID NO:2. La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una polimerasa como se indica en este párrafo.

En un aspecto, la divulgación proporciona un vector, preferiblemente un vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento. En un aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido aislado codificado por una molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento. En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo específico para el polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico como se divulga en el presente documento.

En un aspecto, la divulgación proporciona una composición para el control biológico de enfermedades de las plantas que comprende un virus atenuado del mosaico del pepino como se divulga en este documento, una molécula de ácido nucleico como se divulga en este documento o un vector como se divulga en este documento; y un vehículo agrícolamente aceptable.

En un aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para identificar una planta resistente al virus del mosaico del pepino (PepMV), que comprende

a) exponer una planta o parte de una planta a un virus atenuado del mosaico del pepino como se divulga en este documento, una molécula de ácido nucleico como se divulga en este documento, un vector como se divulga en este documento, o las composiciones como se divulgan en este documento;

b) exponer la planta o parte de la planta a una dosis infecciosa de PepMV, y

c) identificar dicha planta como planta resistente a PepMV cuando, tras dicha exposición, los síntomas de enfermedad en dicha planta o parte de la planta se reducen o retrasan y/o la acumulación de PepMV en dicha planta o partes de la planta se reduce o retrasa en comparación con una planta de control infectada con PepMV.

En un aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para la detección de un virus del mosaico del pepino (PepMV) que comprende proporcionar una muestra sospechosa de contener PepMV y detectar un virus PepMV como se divulga en este documento, una molécula de ácido nucleico como se divulga en este documento o un vector como se divulga en este documento. El procedimiento es útil, entre otros, para determinar si una aplicación del virus atenuado a una planta ha tenido éxito. El procedimiento también es útil para determinar la extensión de la infección de una parcela particular de cultivo. Particularmente con un PepMV como se divulga en este documento. La muestra se prepara típicamente a partir de una planta o una parte de la misma que es susceptible a la infección de PepMV y/o replicación. Se sospecha que una muestra contiene PepMV cuando hay motivos para creer que PepMV está presente en la muestra. También se sospecha que una muestra contiene PepMV cuando la muestra es de una planta de la que es necesario verificar que contiene o no un PepMV de la invención. Tal muestra puede ser, por ejemplo, de una planta en un invernadero en la situación en la que en un invernadero cercano se ha informado de una infección por PepMV. También puede ser de una planta con uno o más síntomas que apuntan a una infección por PepMV y uno quiere confirmarlo. La invención también proporciona un procedimiento para la detección de PepMV como se divulga en el presente documento en el que el término "muestra sospechosa de contener PepMV" se reemplaza por el término "muestra de una planta susceptible a la infección por PepMV".

En un aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para producir una planta resistente al virus del mosaico del pepino (PepMV), que comprende exponer una planta o parte de una planta a un virus atenuado del mosaico del pepino como se divulga en este documento, una molécula de ácido nucleico como se divulga en este documento, un vector como se divulga en este documento, o las composiciones como se divulgan en este documento.

En un aspecto, la divulgación proporciona una planta resistente a PepMV que comprende un virus atenuado del mosaico del pepino como se divulga en este documento o una molécula de ácido nucleico como se divulga en este documento.

En un aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para controlar una infección o enfermedad en una planta que comprende aplicar a dicha planta una cantidad eficaz de un virus atenuado del mosaico del pepino como se divulga en este documento, una molécula de ácido nucleico como se divulga en este documento, un vector como se divulga en este documento o las composiciones como se divulgan aquí.

En un aspecto, la divulgación proporciona un virus atenuado del mosaico del pepino como se divulga en este documento, una molécula de ácido nucleico como se divulga en este documento, un vector como se divulga en este documento o las composiciones como se divulgan en este documento para su uso en el control de infecciones o enfermedades en una planta. En particular, el uso es para inducir resistencia a PepMV.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. La inoculación de plantas de tomate con CHD solo dio como resultado una fuerte necrosis de las hojas y los tallos, a partir de 3 semanas después de la inoculación de CHD (Fig. 1A). La inoculación de plantas de tomate con VCA, seguida de CHD, protegió a las plantas de la necrosis (Fig. 1B).

Figura 2. Treinta y nueve días después de la inoculación de plantas de tomate con VC1 (Fig 2 A) o VCA (Fig 2B).

Figura 3. Desarrollo de síntomas leves en plantas infectadas; sin tratamiento (Fig. 3A); Tratamiento con AVC (fig. 3B); Tratamiento con VC1 (Fig. 3C).

Figura 4. Comparación de síntomas en plantas cultivadas en condiciones óptimas (fila superior) versus condiciones subóptimas (fila inferior); sin tratamiento (Fig. 4A); Tratamiento con VC1 (Fig. 4B); Tratamiento con AVC (fig. 4C).

Figura 5. Una alineación de la secuencia de VCA con secuencias estrechamente relacionadas identificadas a partir de BLAST (herramienta básica de búsqueda de alineación local) de NCBI. La secuencia con la identidad más alta en la búsqueda BLAST fue "1906", con un 99.6% de identidad. La nomenclatura enumerada en la Figura 5 corresponde a las anotaciones de NCBI de la siguiente manera: 1906: aislado de virus del mosaico del pepino 1906 replicasa, proteína de bloque de gen triple 1 (TGBpl), proteína de bloque de gen triple 2 (TGBp2), proteína de bloque de gen triple 3 (TGBp3), y genes de proteínas de la cubierta, cds completos.

DQ000985: aislado de virus del mosaico del pepino Ch2, genoma completo.

FJ212288: virus del mosaico del pepino, genoma completo.

Pa: aislado de virus del mosaico del pepino PepMV-Pa, genoma completo.

PK: aislado de virus del mosaico del pepino PepMV-PK, genoma completo.

220606A1: aislado del virus del mosaico del pepino 220606A1.

VFBC12-04: aislado de virus del mosaico del pepino VFBC12-04.

VFBC12-08: aislado del virus del mosaico del pepino VFBC12-08.

P5: aislado de virus del mosaico del pepino PepMV-P5, genoma completo.

PCH06/104: aislado de virus del mosaico del pepino PCH 06/104 replicasa, proteína de bloque de gen triple 1 (TGBpl), proteína de bloqueo de gen triple 2 (TGBp2), proteína de bloqueo de gen triple 3 (TGBp3) y genes de la proteína de la cubierta, cds completos

Figura 6. Una alineación de la secuencia de aminoácidos de la ARN polimerasa dependiente de ARN de VCA y otros virus PepMV.

LE-2002, AJ438767 y Sp-13 son aislados EU. LP-2001 es un aislado LP. US1 es un aislado US.

Figura 7. Listado de secuencias

Figura 8. Listado de secuencias

Descripción detallada de las formas de realización divulgadas

La protección cruzada es el fenómeno de proteger cultivos contra aislados virulentos de virus mediante el tratamiento previo con aislados atenuados del virus estrechamente relacionadas. En la década de 1970, se aplicó por primera vez con éxito contra la infección del tomate con el virus del mosaico del tabaco en varios países (Burgyán & Gáborjányi, 1984). Los aislados atenuados pueden seleccionarse entre las que se producen de forma natural o desarrollarse mediante la introducción de mutaciones en dichas aislados, por ejemplo, usando mutagénesis aleatoria. Una estrategia en la que se aplican aislados atenuados a las plantas se basa en la identificación de una aislado que tiene el menor impacto posible en el rendimiento total y la calidad de la fruta, y al mismo tiempo protege eficazmente contra los aislados más virulentas.

Si bien no se desea ceñirse a la teoría, la protección cruzada puede deberse a la actividad de silenciamiento del ARN inducida por el aislado protector (Ratcliff et al., 1999; Valkonen et al., 2002). El papel del silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) en la protección cruzada se demostró mediante la observación de que dos construcciones virales derivadas de diferentes virus, pero que comparten una secuencia común, podrían suprimirse entre sí cuando se co-inoculan en plantas (Ratcliff et al., 1999). PTGS es un mecanismo de defensa antiviral en plantas, que se dirige al ARN bicatenario (dsRNA) para su degradación de una manera específica de secuencia. En la protección cruzada, se cree que la cepa leve "prepara" el sistema de defensa de la planta para que opere contra la infección posterior por cepas graves.

En el estudio de Schenk et al. (2010), se probaron aislados atenuados de PepMV (EU-Attl y PE-Attl). Los aislados atenuados redujeron eficazmente los efectos de los aislados de PepMV con síntomas agresivos (a saber, EU-Chl1 y EU-Nec1). La acumulación total de virus, la gravedad de los síntomas y las pérdidas de rendimiento se redujeron significativamente en las plantas con protección cruzada en comparación con las infecciones individuales por los aislados agresivos. Los rendimientos de las plantas con protección cruzada estuvieron en un nivel similar al de las plantas no infectadas. Aunque las plantas protegidas de forma cruzada por los aislados atenuados redujeron los síntomas, la infección por los aislados atenuados solos también produjo síntomas (Tabla 2 de Schenk et al.) Los aislados atenuados causaron síntomas poco después de la inoculación, un patrón que también se ha observado en otros ensayos (Spence et al., 2006). En general, la gravedad de los síntomas se correlacionó con la acumulación de virus, pero la acumulación por sí sola no explicó todas las diferencias en la gravedad de los síntomas. A su vez, la gravedad de los síntomas se correlacionó negativamente con el rendimiento. Los dos síntomas que tuvieron el mayor efecto sobre el rendimiento, es decir, la deformación de las hojas y la necrosis de las hojas, afectaron el área foliar de las plantas, lo que explicaría las pérdidas de rendimiento observadas. Un aspecto de la presente invención es la provisión de un virus atenuado que protege de forma cruzada a las plantas de una mayor infección por PepMV mientras que provoca síntomas mínimos por la exposición al virus atenuado solo.

Por consiguiente, un aspecto de la divulgación proporciona virus del mosaico del pepino, en particular virus atenuados. Como es conocido por un experto en la materia, un virus atenuado es un virus que ha sido modificado a partir de un virus patógeno de tipo salvaje. Un virus atenuado tiene una patogenicidad reducida en comparación con el virus de tipo salvaje. Además, un virus atenuado divulgado en el presente documento se puede utilizar para proteger de forma cruzada las plantas contra la infección por aislados virulentos de PepMV. La divulgación identifica varias posiciones de nucleótidos en PepMV que desempeñan un papel en los síntomas inducidos por la infección por PepMV. Específicamente, la divulgación proporciona virus PepMV y moléculas de ácido nucleico, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica arginina en la posición correspondiente a 868 de SEQ ID NO:2 (correspondiente a la posición 886 de SEQ ID NO:9) y/o codifica fenilalanina en la posición correspondiente a 1052 de SEQ ID NO:2 (correspondiente a la posición 1070 de Se Q ID NO:9).

La divulgación proporciona que los nucleótidos en las posiciones 2605 y 3156 de SEQ ID NO:1 (correspondientes a las posiciones 2675 y 3226 de SEQ ID NO:8) y, en consecuencia, los aminoácidos codificados (en parte) por estos nucleótidos, desempeñan un papel en los síntomas patogénicos. Específicamente, un cambio de aminoácido de lisina a arginina en la posición 868 de SEQ ID NO:2 (correspondiente a la posición 886 de SEQ ID NO:9) y un cambio de aminoácido de leucina a fenilalanina en la posición 1052 de SEQ ID n O:2 (correspondiente a la posición 1070 de SEQ ID NO:9) da como resultado un virus atenuado PepMV. En los virus patógenos representados en la Figura 6, así como en el virus VC1 atenuado, los aminoácidos correspondientes a 868 y 1052 de SEQ ID NO:2 (y 886 y 1070 de SEQ ID NO:9) son lisina y leucina, respectivamente. Aunque no se desea ceñirse a ninguna teoría, se cree que estos cambios de aminoácidos proporcionan virus atenuados que muestran síntomas más leves que el virus VC1 (véanse los Ejemplos).

La divulgación también proporciona que nucleótidos adicionales, y los aminoácidos que estos codifican, también desempeñan un papel en los síntomas patógenos. Por consiguiente, en algunas formas de realización, los virus y las moléculas de ácido nucleico divulgados en el presente documento contienen uno o más de los siguientes: una C en la posición del nucleótido correspondiente a 191 de SEQ ID NO:1 (posición 261 de SEQ ID NO:8); una C en la posición del nucleótido correspondiente a 2354 de SEQ ID NO: (posición 2424 de SEQ ID NO:8); una T en la posición del nucleótido correspondiente a 2768 de la SEQ ID NO:1 (posición 2838 de la SEQ ID NO:8); una T en la posición correspondiente a 2868 de SEQ ID NO:1 (posición 2938 de SEQ ID NO:8); una G en la posición del nucleótido correspondiente a 3422 de SEQ ID NO:1 (posición 3492 de SEQ ID NO:8); y/o tiene una A en la posición del nucleótido correspondiente a 3975 de SEQ ID NO:1 (posición 4045 de SEQ ID NO:8). En algunas formas de realización, los virus o las moléculas de ácido nucleico divulgados en el presente documento contienen al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o todos los 6 nucleótidos enumerados anteriormente.

Estos seis nucleótidos son exclusivos tanto del virus atenuado por VCA como del virus atenuado por VC1 en comparación con las cepas virulentas de CH2 representadas en la Figura 5. Preferiblemente, los virus y moléculas de ácido nucleico divulgados en este documento, además de codificar arginina en la posición correspondiente a 868 de SEQ ID NO:2 (y correspondiente a la posición 886 de SEQ ID NO:9) y/o fenilalanina en la posición correspondiente a 1052 de SEQ ID NO:2 (y correspondiente a la posición 1070 de SEQ ID NO:9), también codifican una fenilalanina en la posición correspondiente a 956 de SEQ ID NO:2 (y correspondiente a la posición 974 de SEQ ID NO:9) y/o una asparagina en la posición correspondiente a 1325 de SEQ ID NO:2 (y correspondiente a la posición 1343 de SEQ ID n O:9). Como se muestra en la Figura 6, los virus patógenos de tipo salvaje codifican una leucina y un ácido aspártico en estas posiciones. Si bien no se desea ceñirse a ninguna teoría, se cree que estos aminoácidos desempeñan un papel en la reducción de la virulencia de los virus.

La SEQ ID NO: 1 (denominada en este documento virus "VCA") se aisló como un virus atenuado de la cepa CH2. Los ejemplos demuestran la capacidad del virus VCA para proteger de forma cruzada contra cepas de PepMV de tipo salvaje y la reducción de los síntomas en comparación con otro virus VC1 atenuado. SEQ ID NO:1 representa una secuencia parcial de la ARN-polimerasa dependiente de ARN del virus VCA. SEQ ID NO:8 representa la secuencia de nucleótidos de la ARN-polimerasa dependiente de ARN del virus VCA, incluida la secuencia codificante completa.

Véanse las Figuras 7 y 8 para ver la lista de secuencias. Como es conocido por una persona experta, Y indica una C o T, R indica A o G; y S indica G o C. En algunas formas de realización, R es G. En algunas formas de realización, Y1 es C. En algunas formas de realización, Y2 es C. En algunas formas de realización, Y3 es T. En algunas formas de realización, Y4 es T. En algunas formas de realización, S es C. En algunas formas de realización, Y5 es T. En algunas formas de realización, Y6 es T. Los virus que tienen la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:8 incluyen un solo virus homogéneo (es decir, que tiene una secuencia; por ejemplo, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:8 en donde R es G; Y1 es C; Y2 es C; Y3 es T; Y4 es T; S es C; Y5 es T; Y6 es T) así como mezclas de virus que tienen cada uno de ellos SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:8.

Se encontró que el virus VCA tiene sustituciones de nucleótidos que dan como resultado cambios de aminoácidos en el gen de la ARN polimerasa dependiente de ARN del virus. SEQ ID NO:2 representa la secuencia de aminoácidos parcial de la ARN polimerasa dependiente de ARN de VCA. SEQ ID NO:9 representa la secuencia de aminoácidos completa de la ARN polimerasa dependiente de ARN de VCA

VCA (SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:8) es un virus atenuado ejemplar de la cepa CH2. La divulgación también proporciona virus atenuados de otras cepas de PepMV. Se encontró que cuatro aminoácidos en la SEQ ID NO:2 eran únicos en comparación con los aislados EU, LP, CH2 y US1 de tipo salvaje. La arginina en la posición 868 de SEQ ID NO:2 (886 de SEQ ID NO:9) corresponde a la posición 887 en la alineación mostrada en la figura 6. La fenilalanina en la posición 956 de SEQ ID NO:2 (974 de SEQ ID NO:9) corresponde a la posición 975 en la alineación mostrada en la figura 6. La fenilalanina en la posición 1052 de SEQ ID NO:2 (1070 de SEQ ID NO:9) corresponde a la posición 1071 en la alineación mostrada en la figura 6. La asparagina en la posición 1325 de SEQ ID NO:2 (1343 de SEQ ID NO:9) corresponde a la posición 1344 en la alineación mostrada en la figura 6. Para un experto en la materia, es evidente que se pueden preparar virus atenuados a partir de cualquier cepa de PepMV basándose en estos aminoácidos.

En algunas formas de realización, el virus es un virus atenuado de una cepa EU. Las secuencias virales EU de tipo salvaje ejemplares se representan en las SEQ ID Nos: 3-5. En algunas formas de realización, el virus es un virus atenuado de una cepa US1. En SEQ ID NO: 6 se representa una secuencia viral de US1 de tipo salvaje ejemplar. En algunas formas de realización, el virus es un virus atenuado de una cepa LP. En SEQ ID NO: 7 se representa una secuencia viral de LP de tipo salvaje ejemplar.

Los virus PepMV tienen, en promedio, alrededor del 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico. En consecuencia, en formas de realización preferidas, los virus PepMV tienen una secuencia de ácido nucleico al menos 80% idéntica a SEQ ID NO:1, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica arginina en la posición correspondiente a 868 de SEQ ID NO:2 y/o codifica fenilalanina en la posición correspondiente a 1052 de SEQ ID NO:2 (o más bien, codifica arginina en la posición 887 de la Figura 6 y/o la secuencia de ácido nucleico codifica fenilalanina en la posición 1071 de la Figura 6). En formas de realización preferidas, los virus PepMV tienen una secuencia de ácido nucleico al menos 80% idéntica a SEQ ID NO:8, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica arginina en la posición correspondiente a 886 de SEQ ID NO:9 y/o codifica fenilalanina en la posición correspondiente a 1070 de SEQ ID NO:9. En una forma de realización preferida, los virus atenuados divulgados en este documento tienen una secuencia de ácido nucleico al menos 80%, al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98% y lo más preferiblemente al menos 99% idéntica a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, SEQ iD NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7. Las secuencias proporcionadas en este documento se refieren a las bases A, T, C y G. Sin embargo, para un experto en la materia está claro que cuando se hace referencia a un virus PepMV (un virus de ARN), está presente uracilo en lugar de timina.

La divulgación también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 80%, al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98% y lo más preferiblemente al menos 99% idéntica a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica arginina en la posición correspondiente a 868 de SEQ ID NO:2 y/o codifica fenilalanina en la posición correspondiente a 1052 de s Eq ID NO:2 (o más bien, codifica arginina en la posición 887 de la Figura 6 y/o la secuencia de ácido nucleico codifica fenilalanina en la posición 1071 de Figura 6; o más bien codifica arginina en la posición 886 de SEQ ID NO:9 y/o la secuencia de ácido nucleico codifica fenilalanina en la posición 1070 de SEQ ID NO:9).

En algunas formas de realización, el nucleótido en la posición correspondiente a 2605 de SEQ ID NO:1 (2675 de SEQ ID NO:8) es G; el nucleótido en la posición correspondiente a 3156 de SEQ ID NO:1 (3226 de SEQ ID No :8) es T y/o el nucleótido en la posición correspondiente a 3422 de SEQ ID NO:1 (3492 de Se Q ID NO:8) es G. En formas de realización preferidas, el nucleótido en la posición correspondiente a 2605 de SEQ ID NO:1 (2675 de SEQ ID NO:8) es G y/o el nucleótido en la posición correspondiente a 3156 de SEQ ID NO:1 (3226 de SEQ iD NO:8) es T. En formas de realización preferidas, las moléculas de ácido nucleico comprenden uno o más de los siguientes: una C en la posición del nucleótido correspondiente a 191 de SEQ ID NO:1 (posición 261 de SEQ ID NO:8); una C en la posición del nucleótido correspondiente a 2354 de SEQ ID NO:1 (posición 2424 de SEQ ID NO:8); una T en la posición del nucleótido correspondiente a 2768 de SEQ ID NO:1 (posición 2838 de SEQ ID NO:8); una T en la posición correspondiente a 2868 de SEQ ID NO:1 (posición 2938 de SEQ ID NO: 8); y/o tienen una A en la posición del nucleótido correspondiente a 3975 de SEQ ID NO:1 (posición 4045 de SEQ ID NO:8). Tales moléculas de ácido nucleico son útiles, por ejemplo, para producir los virus divulgados en este documento.

Como se usa en este documento, el término "aislado" se refiere a una proteína, péptido o molécula de ácido nucleico que está sustancialmente separada de otros componentes (sub)celulares. El término incluye una molécula de ácido nucleico o proteína que se ha eliminado de su entorno natural, así como aislados de ADN recombinante o clonado y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente mediante sistemas heterólogos.

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona vectores y vectores de expresión que comprenden las moléculas de ácido nucleico y los virus divulgados en este documento. Los vectores de expresión útiles en la presente divulgación incluyen virus vaccinia, retrovirus y baculovirus. El vector de expresión puede comprender las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento o un fragmento de las mismas que está bajo el control o unido operativamente a un elemento regulador, tal como un promotor. El segmento de ADN denominado promotor es responsable de la regulación de la transcripción del ADN en ARNm. El vector de expresión puede comprender uno o más promotores adecuados para la expresión del gen en, por ejemplo, células vegetales, células fúngicas, células bacterianas, células de levadura, células de insectos u otras células eucariotas.

Los virus y las moléculas de ácido nucleico divulgados en este documento se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido por un experto en la técnica. Se han descrito procedimientos para generar clones de ADNc de longitud completa del genoma de ARN de PepMV; véase, por ejemplo, Hasiow-Jaroszewsk et al. Arch Virol (2009) 154:853-856. Además, la clonación de ambos clones PepMV de Eu y CH2 también se ha descrito en Duff-Farrier et al., Molecular Plant Pathology (2015) 16:308-315. Duff-Farrier et al. describen la construcción de ADNc a partir de aislados de PepMV EU y CH2 y así como la introducción de secuencias quiméricas en el ADNc. Se sintetizó in vitro ARN infeccioso, que se utilizó para infectar plantas. Pueden usarse procedimientos similares para generar virus y moléculas de ácido nucleico con las secuencias descritas en el presente documento.

Los virus y moléculas de ácido nucleico que se divulgan en este documento son útiles para producir plantas con mayor resistencia a PepMV, en particular a cepas de PepMV que causan enfermedades como la cepa peruana (LP), la cepa europea (EU), la cepa CH2, identificada por primera vez en Chile y la cepa US1, identificada en los Estados Unidos. Por consiguiente, la divulgación proporciona virus atenuados y moléculas de ácido nucleico para controlar la infección por PepMV y/o la enfermedad por PepMV en una planta. Como se usa en este documento, controlar la infección por PepMV incluye la reducción, la prevención o el retraso de la acumulación de PepMV en una planta. Como se usa en el presente documento, controlar la enfermedad de PepMV incluye la reducción, la prevención o el retraso de los síntomas de PepMV.

Las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento, los polipéptidos codificados por dichas moléculas de ácido nucleico, así como los anticuerpos que reconocen dichos polipéptidos son todos útiles para, por ejemplo, detectar la infección por el virus atenuado y detectar así plantas con mayor resistencia a PepMV.

Los virus y moléculas de ácido nucleico divulgados en este documento pueden proporcionarse en composiciones que comprenden un vehículo agrícolamente aceptable. Estas composiciones se pueden usar para el control biológico de enfermedades de las plantas. Preferiblemente, la composición comprende un antioxidante, un regulador de pH de fosfato y/o un sulfito (el sulfito puede ayudar a prevenir la pudrición). Preferiblemente, las composiciones tienen un rango de pH de 6-8.5, más preferiblemente un pH de 7.7 ± 0.5. Preferiblemente, las composiciones comprenden uno o más de los siguientes: fosfato de potasio mono-básico, fosfato de sodio di-básico dodecahidrato y/o sulfito de sodio. Más preferiblemente, las composiciones comprenden 0.4-1.6 g de fosfato de potasio mono-básico por litro, más preferiblemente alrededor de 0.8 g/L; 15-60 g de fosfato de sodio di-básico dodecahidratado por litro, más preferiblemente alrededor de 30 g/L; y 1-4 g de sulfito de sodio por litro, más preferiblemente alrededor de 2 g/L.

Los virus pueden propagarse en una planta huésped adecuada. El tejido de las plantas infectadas se muele y el homogeneizado (la savia) se puede utilizar para preparar las composiciones divulgadas en este documento. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento pueden clonarse en un vector para su replicación en otro huésped.

La variedad de huéspedes de PepMV se restringe principalmente a especies de plantas de la familia de las solanáceas. El tomate (Solanum lycopersicum) es uno de los huéspedes naturales más importantes económicamente de PepMV. La planta de pepino (S. muricatum) es huésped en Perú y China (Jones et al., 1980; Soler et al., 2002; Zhang et al., 2003). En estudios en Perú, se ha encontrado que PepMV está presente naturalmente en especies silvestres de Solanum (S. chilense, S. chmielewskii, S. parviflorum y S. peruvianum).

También se han observado infecciones, asintomáticas o con síntomas leves, en especies de malezas que pertenecen a las familias de Amaranthaceae, Asteraceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Convolvulaceae, Malvaceae, Plantaginaceae, Polygonaceae y Solanaceae. (Córdoba et al., 2004; Jordá et al., 2001; Kazinczi et al., 2005, Papayiannis et al., 2012; Salomone & Roggero 2002; Soler et al., 2002; Stobbs et al., 2009). La mayoría de estas infecciones se encontraron en las cercanías de invernaderos de tomates. También se ha detectado PepMV en algunos cultivares de papa (por ejemplo, Solanum tuberosum cv. 'Yungay').

Se ha encontrado que varias especies son experimentalmente susceptibles a la infección por PepMV después de la inoculación artificial, incluida la berenjena (Solanum melongena) que se encontró infectada por PepMV mediante inoculación mecánica (Salomone y Roggero, 2002; Verhoeven et al., 2003). Algunos cultivares de patata (S. tuberosum) también pueden infectarse experimentalmente con PepMV (Jones et al., 1980). PepMV puede infectar a Datura metel, D. stramonium, Nicotiana debneyi, N. benthamiana sistémicamente (Jones et al., 1980; Verhoeven et al., 2003). Algunos aislados de PepMV pueden infectar N. glutinosa y N. tabacum (LP y algunos aislados de EU; Verhoeven et al., 2003).

Preferiblemente, el término "planta" se refiere a cualquier planta que sea capaz de infectarse con PepMV. En algunas formas de realización, la planta pertenece a la familia de las solanáceas, en particular al género Solanum o Lycopersicon. Como saben los expertos, la nomenclatura de las plantas de tomate ha cambiado recientemente. Por ejemplo, Solanum juglandifolium ahora se conoce como Lycopersicon juglandifolium. Una planta preferida es una planta de tomate.

Como se usa en este documento, el término "parte de la planta" incluye, por ejemplo, células individuales y tejidos de polen, óvulos, hojas, embriones, raíces, puntas de raíces, anteras, flores, frutos, brotes de tallos y semillas; así como polen, óvulos, hojas, embriones, raíces, puntas de raíces, anteras, flores, frutos, tallos, brotes, vástagos, rizomas, semillas, protoplastos, callos y similares.

PepMV induce una amplia gama de síntomas en el tomate, como mosaico amarillo, distorsión de las hojas, ampollas o burbujas de las hojas, espigas con forma de ortiga, manchas amarillas únicas, clorosis intervenal, mosaicos foliares severos, necrosis foliar o de tallo y decoloración de la fruta (Van der Vlugt et al., 2000; Jorda et al., 2001; Roggero et al., 2001; Spence et al., 2006; Hasiów et al., 2008; Hasiów-Jaroszewska et al., 2009a; Hanssen et al., 2009). Las plantas de tomate muestran síntomas poco después de la infección por PepMV y, en general, los síntomas remiten posteriormente (Van der Vlugt & Stijger, 2008). Sin embargo, los síntomas pueden reaparecer más tarde durante la temporada de crecimiento.

La expresión de los síntomas puede depender de las condiciones ambientales, como la temperatura y la intensidad de la luz. Las bajas temperaturas ambientales y la baja intensidad de la luz provocan daños más graves (Jorda et al., 2001; Van der Vlugt & Stijger, 2008). A veces se sugiere que PepMV causa pérdidas de rendimiento en tomate, pero las mayores pérdidas económicas se atribuyen a síntomas que afectan el valor comercial de los frutos del tomate, como flameado, veteado, maduración con manchas y reducción del tamaño del fruto (Soler et al., 2000; Spence et al., 2006; Hanssen y Thomma, 2010). Además, el llamado 'colapso del tomate', un marchitamiento repentino y progresivo del tomate que puede provocar la muerte de la planta, probablemente es causado por la acumulación de PepMV en el sistema vascular (Soler-Aleixandre et al., 2005). Se han informado diferencias notables en la gravedad de la sintomatología (Verhoeven et al., 2003; Hanssen et al., 2008) y no todos los aislados causan síntomas típicos de PepMV, como frutos veteados y flameados (Hanssen et al., 2009). Los síntomas en las plantas se pueden caracterizar cualitativa o cuantitativamente.

Los virus divulgados en el presente documento también son útiles para inducir resistencia en "plantas tolerantes", es decir, plantas que pueden infectarse con el virus y aumentar su propagación, pero permanecen asintomáticas o tendrán síntomas leves.

Se han desarrollado varios procedimientos para detectar PepMV. Un procedimiento robusto para detectar PepMV en plantas es DAS-ELISA (Van der Vlugt et al., 2002). Los anticuerpos policlonales disponibles comercialmente pueden adquirirse en Prime Diagnostics (Wageningen, Países Bajos). Se han divulgado diferentes ensayos de PCR para detectar PepMV: un procedimiento general de detección de potexvirus (Van der Vlugt & Berendsen, 2002), una RT-PCR de inmunocaptura en tiempo real (Mansilla et al., 2003; Matinez-Culebras et al., 2002; Ling, 2005; Ling et al., 2007) y ensayos sensibles de p Cr en tiempo real (Alfaro -Fernandez et al., 2009; Johnson & Walcott, 2012; Gutierrez-Aguirre et al., 2009). La detección simultánea de múltiples virus de plantas, incluido PepMV, se puede realizar mediante el uso de micromatrices (Boonham et al., 2007) y secuenciación profunda (Li et al., 2012). Preferiblemente, la acumulación de PepMV en una planta se determina usando un procedimiento de detección cuantitativo (por ejemplo, un procedimiento ELISA o una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa [RT-PCR]).

Otro aspecto de la divulgación proporciona polipéptidos aislados expresados por los virus. En algunas formas de realización, el polipéptido es una polimerasa dependiente de ARN (RdRp) o una proteína de cubierta (CP). Preferiblemente, el polipéptido es RdRp.

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona anticuerpos específicos para los polipéptidos divulgados en este documento, preferiblemente RdRp. En formas de realización preferidas, el anticuerpo reconoce un antígeno específico de VCA, pero no reconoce las cepas CH2, US-1, EU o LP. Preferiblemente, el antígeno comprende la arginina en la posición correspondiente a 868 de SEQ ID NO:2 y/o la fenilalanina en la posición correspondiente a 1052 de SEQ ID NO:2 (o más bien, la arginina en la posición correspondiente a 886 de s Eq ID NO:9 y/o la fenilalanina en la posición correspondiente a 1070 de SEQ ID NO:9).

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento para producir dichos anticuerpos que comprende inmunizar a un huésped (tal como un ratón) con el virus atenuado, o una proteína o fragmento peptídico del mismo; recolección de sangre (incluyendo suero) o esplenocitos de dichos anticuerpos del huésped contra dicho virus, proteína o fragmento de péptido. En una forma de realización preferida, el procedimiento comprende además seleccionar un esplenocito productor de anticuerpos, fusionar dicho esplenocito con una línea celular de hibridoma inmortalizada y permitir que dicha fusión de hibridoma produzca anticuerpos monoclonales. Preferiblemente, el antígeno está codificado en parte por una secuencia de ácido nucleico en la que el nucleótido en la posición correspondiente a 2605 de SEQ ID NO:1 (2675 de SEQ ID NO:8) es G; el nucleótido en la posición correspondiente a 3156 de SEQ ID NO:1 (3226 de SEQ ID NO:8) es T y/o el nucleótido en la posición correspondiente a 3422 SEQ ID NO:1 (3492 de SEQ ID NO:8) es G. Más preferiblemente, el antígeno está codificado en parte por una secuencia de ácido nucleico en la que el nucleótido en la posición correspondiente a 2605 de SEQ ID n O:1 (2675 de SEQ ID NO:8) es G y/o el nucleótido en la posición correspondiente a 3156 de SEQ ID NO:1 (3226 de SEQ ID NO:8) es T.

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento para detectar la presencia del virus atenuado en una muestra de planta que comprende hacer reaccionar dicha muestra con un anticuerpo según la divulgación. Los procedimientos adecuados para realizar inmunoensayos son bien conocidos por los expertos e incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), etiquetado con inmunogold, microscopía electrónica inmunoabsorbente (Is Em ), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), transferencia Western e inmunotransferencia.

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento para identificar una planta resistente al virus del mosaico del pepino (PepMV), que comprende

a) exponer una planta o parte de una planta a una dosis infecciosa de los virus atenuados o moléculas de ácido nucleico divulgados en este documento,

b) exponer la planta o parte de la planta a una dosis infecciosa de PepMV, y

c) identificar dicha planta como planta resistente a PepMV cuando, tras la exposición a PepMV, los síntomas de la enfermedad en dicha planta o parte de la planta se reducen o retrasan y/o la acumulación de PepMV en dicha planta o partes de la planta se reduce en comparación con una planta control.

Para un experto en la materia está claro que el paso a) incluye un período de incubación de duración suficiente para permitir el establecimiento del virus atenuado. Preferiblemente, dicho período de incubación es de al menos una semana, más preferiblemente de al menos 5 semanas. En algunas formas de realización, la presencia de virus en la planta puede confirmarse mediante uno de los procedimientos divulgados en este documento. También está claro para un experto que el paso b) incluye un período de incubación de duración suficiente para permitir el establecimiento del virus PepMV y síntomas detectables en plantas de control. Preferiblemente, dicho período de incubación es de al menos una semana, más preferiblemente de al menos 5 semanas.

Como se usa en este documento, "resistente" se refiere a una reducción en la multiplicación de PepMV, una reducción del movimiento/propagación del virus a otras células y/o una reducción o retraso en el desarrollo de síntomas de enfermedad después de la infección con PepMV. La resistencia se puede determinar comparando una planta infectada con PepMV con una planta expuesta a VCA y PepMV. Preferiblemente, el PepMV mencionado anteriormente es una cepa CH2, US-1, EU o LP; sin embargo, también incluye otras cepas de PepMV que causan enfermedades.

Preferiblemente, la acumulación de PepMV en una planta se determina usando un procedimiento de detección cuantitativo (por ejemplo, un procedimiento ELISA o PCR, tal como una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa [RT-PCR]).

Como se usa en este documento, una "dosis infecciosa" se refiere a la dosis de partículas virales o molécula de ácido nucleico viral capaz de infectar una planta. Como es evidente para los expertos, la dosis puede variar entre las especies de plantas.

Los procedimientos para exponer una planta o una parte de la planta a virus son bien conocidos en la técnica e incluyen espolvorear, recubrir, inyectar, frotar, enrollar, sumergir, rociar o cepillar. Los procedimientos ejemplares incluyen la inoculación mecánica (por ejemplo, frotar plantas o partes de plantas con material vegetal infectado) y rociar plantas con una solución que contiene partículas de virus o ácido nucleico viral (véase el Ejemplo 1). El virus atenuado puede aislarse de plantas infectadas u otras fuentes mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica.

Como es conocido por un experto en la materia, la protección cruzada puede no conducir a la resistencia en el 100% de las plantas de la misma especie. Normalmente, la protección cruzada protege más del 50% de las plantas, preferiblemente más del 80% de las plantas.

Otro aspecto de la divulgación proporciona un procedimiento para producir una planta resistente al virus del mosaico del pepino (PepMV) que utiliza los virus atenuados o las moléculas de ácido nucleico divulgados en este documento para protección cruzada. También se proporcionan procedimientos para controlar o prevenir enfermedades de las plantas, en particular PepMV que causan enfermedades. También se proporcionan procedimientos para controlar o prevenir la infección por PepMV. Los procedimientos comprenden exponer una planta o parte de una planta a una dosis infecciosa del virus atenuado, a las moléculas de ácido nucleico divulgadas en este documento o a las composiciones divulgadas en este documento. En algunas formas de realización, los procedimientos comprenden además detectar el virus atenuado en dichas plantas o partes de plantas, tal como mediante un procedimiento divulgado en el presente documento.

La divulgación también proporciona plantas resistentes a PepMV que comprenden el virus atenuado o las secuencias de ácido nucleico divulgadas en el presente documento. Tales plantas pueden haber sido infectadas por el virus atenuado o son la progenie de una planta infectada por el virus. Las plantas también pueden haber sido transformadas por las moléculas de ácido nucleico divulgadas en este documento o un vector que comprende la molécula de ácido nucleico. La progenie de dichas plantas también está incluida en la invención. Tales plantas se pueden obtener mediante los procedimientos descritos en este documento.

PepMV es un virus de ARN. Como tal, se prefiere que la molécula de ácido nucleico que está comprendida en el virión sea ARN. Las secuencias indicadas en este documento contienen una T y, como tales, se refieren a ADN. Cuando en el presente documento se hace referencia a un virus que comprende una molécula de ácido nucleico con una determinada secuencia de ácido nucleico y se hace referencia a una secuencia de ADN en el contexto de un virus, está claro para el experto en la técnica que se quiere decir la secuencia correspondiente de ARN. En otras palabras, la referencia es a la SEC ID en la que la T se reemplaza por una U. Los vectores y otras composiciones que no se refieren a un virus o partícula de virus pueden tener el ADN referenciado, un ARN con la misma secuencia o una combinación de los mismos.

Definiciones

Como se usa en este documento, "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para dar a entender que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos no mencionados específicamente no están excluidos. Además, el verbo "consistir" puede ser reemplazado por "consistir esencialmente en", lo cual da a entender que un compuesto o compuesto adjunto, tal como se define en este documento, puede comprender un componente o unos componentes adicionales a los identificados específicamente; dicho componente o dichos componentes adicionales no alteran la característica única de la invención.

Los artículos "un" y "una" se utilizan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. La expresión "aproximadamente" o "alrededor de" cuando se usa en asociación con un valor numérico (aproximadamente 10, alrededor de 10) significa preferiblemente que el valor puede ser el valor dado de 10 más o menos 1% del valor.

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Zhang YL, Shen ZJ, Zhong J, Lu XL, Chjeng G y Li RD (2003) Caracterización preliminar de aislado de Shanghai del virus del mosaico del pepino (PepMV-Sh) y su detección por ELISA. Acta Agriculturae Shanghai 19: 90-92.

La invención se explica con más detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que simplemente sirven para aclarar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Experimentos de protección cruzada con nuevos aislados suaves de la cepa CH2 de PepMV VC1 es un aislado suave de la cepa CH2 del virus del mosaico del pepino (PepMV). Durante el invierno, la infección por VC1 puede producir síntomas no deseados en las plantas inoculadas, a saber, espigas de ortiga y retraso del crecimiento. Se produjeron nuevas variantes de la cepa CH2 para identificar virus que ofrecerían protección cruzada, pero con síntomas no deseados reducidos. En este ensayo, el nuevo aislado leve VCA se compara con el VC1 para los síntomas y su efectividad de protección cruzada. Se secuenció la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) de VCA y se encontró que comprendía una mezcla de virus estrechamente relacionados que tienen la secuencia de SEQ ID NO:1. Se realizó una secuenciación adicional para determinar la secuencia de codificación completa de RdRp que se representa en SEQ ID NO:8. Las secuencias superpuestas de SEQ ID NO:1 y 8 son idénticas con la excepción de la posición 6290 de SEQ ID NO:8. Una "C" está presente en esta posición en la SEQ ID NO:8 en lugar de una "T" en la SEQ ID NO:1. Esto puede reflejar una mutación, pero no conduce a un cambio de aminoácidos.

En la Figura 5 se representa un alineamiento de secuencia de VCA con virus PepMV conocidos. Tres de los nucleótidos en SEQ iD NO:1 (correspondientes a las posiciones 2605, 3156 y 3422 de SEQ ID NO:1) son exclusivos de VCA en comparación no solo con los virus PepMV conocidos, sino también con la cepa atenuada VC1. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, se cree que estos dos cambios de nucleótidos alteran la secuencia de aminoácidos, lo que a su vez da como resultado síntomas más leves.

Montaje:

Se utilizaron plantas de tomate del cultivar Merlice (en rizoma). Cada fila de 12 plantas fue un tratamiento diferente. Las plantas se cultivaron en dos compartimentos de invernadero. Las temperaturas establecidas fueron 20°C durante el día y 18°C durante la noche. La prueba duró 3 meses. Las inoculaciones se llevaron a cabo mediante el protocolo de frotamiento (véase más abajo).

Las plantas se inocularon primero con aislados suaves (VC1 o VCA) y se analizaron con ELISA para determinar la infección. Los resultados del ELISA se muestran a continuación.

Aproximadamente seis semanas (39 días) después de la primera inoculación, las plantas se inocularon con el aislado virulento (CHD).

Resultados

La infección con los aislados leves VCA y VC1 resultó en síntomas muy leves, a saber, un ligero burbujeo en las hojas jóvenes y las espigas de ortiga menores (Fig. 2). La infección con el aislado virulento CHD de CH2 solo mostró una fuerte necrosis de las hojas y los tallos, desde 3 semanas después de la inoculación de CHD (Fig. 1A). El tratamiento con VCA o VC1 protegió a las plantas de la necrosis (véase, por ejemplo, Fig 1B)

Conclusiones

• VCA es tan leve como VC1 y tal vez incluso más suave.

• Tanto VCA como VC1 evitaron los síntomas del aislado virulento CHD de CH2.

Ejemplo 2: Síntomas observados del tratamiento con variantes de PepMV

La infección por VC1 puede producir síntomas no deseados en plantas inoculadas, a saber, espigas de ortiga y retraso del crecimiento. En este ensayo, el nuevo VCA aislado leve se compara con VC1 para la inducción de síntomas en plantas tratadas.

Se utilizaron plantas de tomate del cultivar Komeett. Las inoculaciones se llevaron a cabo mediante el protocolo de frotamiento (véase más adelante). Las plantas se inocularon con aislados suaves (VC1 o VCA) y se analizaron dos semanas después con ELISA para determinar la infección. Se encontró que en promedio el 95% de las plantas inoculadas con virus habían sido infectadas. Las plantas libres de virus permanecieron libres hasta el final de la prueba. El tratamiento con VCA o VC1 dio como resultado el desarrollo de síntomas leves, como malformaciones de las hojas. Sin embargo, las plantas tratadas con VCA (Fig. 3B) tuvieron más volumen foliar y crecieron mejor que las tratadas con VC1 (Fig. 3C).

Ejemplo 3: Comparación de síntomas en plantas cultivadas en condiciones óptimas frente a condiciones subóptimas La Figura 4 representa plantas cultivadas en condiciones óptimas frente a condiciones subóptimas. En condiciones óptimas de crecimiento, las plantas tratadas con VC1 y VCA muestran un nivel comparable de síntomas muy leves. Sin embargo, en condiciones de crecimiento subóptimas, las plantas tratadas con VC1 muestran síntomas mucho más graves que las plantas tratadas con VCA. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, se cree que las diferencias de nucleótidos en la posición 2605 y 3156 de SEQ ID NO:1 dan como resultado una alteración de aminoácidos en comparación con VC1 y que una o ambas de estas alteraciones de aminoácidos es responsable de los síntomas más leves.

Material y procedimientos:

Protocolo de frotamiento:

Amasar material vegetal infectado fresco o congelado.

Tomar 7.5-10 ml de savia vegetal extraída o 7.5-10 ml de suspensión de virus del producto viral.

Poner los 7.5-10 ml en una bandeja de plástico

Diluir la suspensión viral 10 veces con PBS

Agregar 1-2% (p/v) de carborundo

Mezclar bien la suspensión.

Ponerse guantes desechables en las manos.

Revolver con los dedos y el pulgar en la suspensión.

Inocular dos hojas de cada planta en la mitad superior de un folíolo frotando el folíolo 5 veces entre el pulgar y el dedo índice. Las hojas deben dañarse un poco. (ligera decoloración, sin agujeros).

Sumergir el dedo para cada planta e inocular la planta

Después de la inoculación, recogertodo el material residual y colocaren un cubo de basura o contenedor de desechos. El material residual debe desinfectarse con hipoclorito de 100-200 ppm y luego puede tratarse como desecho normal. Analizar después de 14 (± 2) días el porcentaje de plantas infectadas.

Esto puede determinarse mediante el procedimiento ELISA.

Protocolo de aspersión a alta presión:

Uso de líquido de aspersión: 0.5 L/m.

Medir la cantidad necesaria de agua fría del grifo y colocarla en el tanque del carro de rociado.

Preparar solución de virus

Agregar 800 gramos/100 L de carborundo al líquido de aspersión.

Mezclar bien el carborundo en el carro aspersor, con la mano, cubrir el antebrazo con un cubrebotas desechable, hacer circular el contenido del tanque

Presión en las boquillas en el brazo de aspersión: 12-15 bares

Ancho de aspersión: 1.20 m, 6 boquillas

Altura de aspersión: 10-15 cm por encima de las plantas.

Revisar las boquillas para ver si hay obstrucciones y la uniformidad del rociado.

Después de la inoculación, recoger todo el material residual y colocarlo en un cubo de basura o contenedor de desechos. El material residual debe desinfectarse con hipoclorito de 100-200 ppm y luego puede tratarse como desecho normal.

Analizar después de 14 (±2) días el porcentaje de plantas infectadas.

Esto se puede determinar mediante el procedimiento ELISA.

ELISA para medir PepMV en muestra

Los reactivos para realizar DAS-ELISA se obtuvieron en PRIME Diagnostics, Wageningen, Países Bajos. Los ELISA se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un virus atenuado del mosaico del pepino que comprende una molécula de ácido nucleico al menos en un 80% idéntica a la SEQ ID NO:1 y en la que la secuencia de ácido nucleico codifica arginina en la posición 868 de SEQ ID NO:2, fenilalanina en la posición 956 de SEQ ID NO:2, fenilalanina en la posición correspondiente a 1052 de SEQ ID NO:2 y asparagina en la posición 1325 de SEQ ID NO:2.

2. Virus según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico es al menos un 80% idéntica a SEQ ID NO:8.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99% de identidad con la SEQ ID NO:9 y en la que el ácido nucleico codifica una arginina en la posición correspondiente a 886 de la SEQ ID NO:9, una fenilalanina en la posición correspondiente a 1070 de SEQ ID NO:9, una fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 974 de SEQ ID n O:9, y una asparagina en la posición correspondiente a la posición 1343 de SEQ ID NO:9.

4. Un vector, preferiblemente un vector de expresión, que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3 o el virus según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

5. Un polipéptido aislado codificado por una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.

6. Una composición para el control biológico de enfermedades de plantas que comprende el virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 o el vector de la reivindicación 4; y un vehículo agrícolamente aceptable.

7. Un procedimiento para la detección del virus atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende proporcionar una muestra sospechosa de contener PepMV y detectar en dicha muestra el virus de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3, o el vector de la reivindicación 4.

8. Un procedimiento para producir una planta resistente al virus del mosaico del pepino (PepMV), que comprende exponer una planta o parte de la planta al virus de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3, al vector de la reivindicación 4, o a la composición de la reivindicación 6.

9. Una planta resistente a PepMV que comprende un virus según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.