ES2821480T3 - Vacuna - Google Patents
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Abstract
Una partícula similar a virus (VLP) que comprende: a.) un polipéptido recombinante que consiste del dominio EDIII de cada uno de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 unido al extremo N del HBsAg en donde los dominios EDIII se fusionan secuencialmente, del extremo N al extremo C, en la secuencia DENV-1, DENV-3, DENV-4, DENV-2, en donde la secuencia de aminoácidos de los dominios EDIII de cada uno de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 es la SEQ ID NO 1, 2, 3 y 4 respectivamente; como se muestra en las Figuras 4a, b, c y d, respectivamente y b.) cuatro casetes de expresión del polipéptido HBsAg.
Description
DESCRIPCIÓN
Vacuna
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una vacuna de subunidad recombinante del dengue contra los cuatro serotipos del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4. La presente invención también se refiere a un candidato vacunal tetravalente contra el dengue basada en VLP recombinante que comprende una molécula EDIII-T tetravalente y un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg). La presente invención también se refiere a un proceso para la producción de un candidato vacunal tetravalente contra el dengue basada en VLP (partícula similar al virus) recombinante.
Antecedentes de la invención
La enfermedad del dengue causada por cuatro virus del dengue antigénicamente distintos (DENV) es un problema de salud grave en más de 150 países del mundo y especialmente en países altamente endémicos como India. Esta enfermedad ha ido en aumento desde la última década y se ha convertido en una amenaza para la salud pública mundial debido a la falta de vacunas o terapias antivirales efectivas. La enfermedad del dengue es un desafío global para los sistemas de salud, particularmente durante los brotes, y cada año se gastan millones de dólares en el control de vectores. Una vacuna efectiva, segura y rentable podría resolver la carga que impone el virus del dengue en los países afectados. A pesar de los intensos esfuerzos realizados durante las últimas tres décadas para desarrollar una vacuna profiláctica para limitar la propagación de la enfermedad, todavía no existe una vacuna autorizada en el mercado. Grupos de investigación/empresas de todo el mundo realizan esfuerzos para desarrollar una vacuna tetravalente efectiva contra todos los serotipos del virus del dengue. Anteriormente, la mayoría de las vacunas desarrolladas se basaban en virus quiméricos vivos atenuados y algunas de ellas se encuentran actualmente en ensayos clínicos. Sin embargo, debido a limitaciones como la interferencia viral, el enfoque de la investigación se ha desplazado hacia las vacunas de subunidades, particularmente mediante el uso del dominio III de la proteína de la envoltura (E) del virus del dengue. También se han informado numerosas patentes/publicaciones que abordan este dominio.
Aunque una vacuna contra el dengue basada en flavivirus vivos entró en ensayos clínicos de fase III, se informaron problemas debido a la interferencia viral. La interferencia viral surge presumiblemente debido a diferencias en el potencial de replicación y la inmunogenicidad de las cuatro cepas de virus vacunales.
Las vacunas de subunidades no replicativas tienen el potencial de superar el riesgo de interferencia viral asociada con las vacunas de virus vivos /Swaminathan, Khanna, N. (2009), Dengue: Recent advances in biology and current status of translational research, Current Mol. Med. 9: 152-173]. Se están explorando varios enfoques que utilizan vacunas de subunidades basadas en proteínas y ADN recombinante. La mayoría de estas vacunas de subunidades recombinantes se centran en la proteína principal de la envoltura (E). Varias evidencias demuestran además que muchas de las propiedades de la vacuna de la proteína E están asociadas con el dominio III (EDIII).
Se demostró que el dominio III de la envoltura de DENV (EDIII) es responsable del reconocimiento del receptor de la célula hospedero y la generación de anticuerpos neutralizantes /Swaminathan, Khanna, N. (2009). Dengue: Recent advances in biology and current status of translational research, Current Mol. Med. 9: 152-173; Guzman, MG Hermida, L., Bernardo, L., Ramirez, R., Guillen, G. (2010). Domain II of the envelope protein as a dengue vaccine target]. Además, se informó que EDIII tiene solamente un potencial intrínseco muy bajo para inducir anticuerpos con reactividad cruzada /Simmons, M., Nelson, W.M., Wu, S.J., Hayes, C.G. (1998). Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusion protein against dengue 2 virus infection in mice; Am. J. Trop. Med. Hyg. 58: 655-662; Simmons, M., Murphy, GS, Hayes, Cg (2001). Short report: anti-body responses of mice immunized with a tetravalent dengue recombinant protein subunit vaccine, Am. J. Trop. Med. Hyg. 65: 159-161]. Estos atributos hacen de EDIII un excelente candidato vacunal. Los inventores ya establecieron la eficacia de EDIII como posible antígeno de la vacuna contra el dengue en forma de proteína tetravalente /Etemad, B., Batra, G., Raut, R., Dahiya, S., Khanam, S., Swaminathan, S., Khanna, N. (2008)].
Se han informado numerosas patentes/publicaciones que abordan el dominio III de la proteína de la envoltura (E) del virus del dengue, por ejemplo,
Suzarte, E., Gil, L., Valdés, I., Marcos, E., Lazo, L., Izquierdo, A., ... Y Hermida, L. (2015), International immunology, dxv011 describe una nueva formulación tetravalente que combina las cuatro proteínas de la cápside de dominio III de los virus del dengue agregadas que induce una respuesta inmune funcional en ratones y monos. Esta referencia enseña una vacuna candidata contra el virus del dengue basada en dos regiones virales diferentes, el dominio III de la proteína de la envoltura y la proteína de la cápside, en donde se usó la formulación tetravalente de proteínas DIIIC. La nueva proteína quimérica del virus del dengue-2 (dominio III-cápside (DIIIC-2)), cuando se presenta como agregados que incorporan oligodesoxinucleótidos, induce anticuerpos antivirales y neutralizantes, respuesta inmune celular y confiere una protección significativa en ratones y monos. Las construcciones restantes ya se obtuvieron y caracterizaron adecuadamente. Con base en estas evidencias, el presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la respuesta inmune en ratones de las proteínas quiméricas DIIIC de cada serotipo, en formulaciones monovalentes y tetravalentes. Los presentes inventores demostraron la inmunogenicidad de cada proteína en términos de inmunidad humoral y mediada por células, sin competencia
antigénica en la mezcla que forma la formulación tetra DIIIC. En consecuencia, se proporcionó una protección significativa medida por la carga viral limitada en el modelo de encefalitis de ratón. También se realizó la evaluación de la formulación tetravalente en primates no humanos. En este modelo animal, se demostró que la formulación induce anticuerpos neutralizantes y una respuesta inmune mediada por células de memoria con capacidad secretora de IFN-y y citotóxica, independientemente de la vía de inmunización usada. La formulación tetravalente de las proteínas DIIIC constituye un candidato vacunal prometedor contra el virus del dengue.
Zuest, R., Valdés, I., Skibinski, D., Lin, Y., Toh, YX, Chan, K., ... Y Fink, K. (2015), Vaccine 33 (12), 1474-1482 describe la inmunogenicidad de una formulación tetravalente de una proteína de fusión recombinante que consiste del dominio III E y la proteína de la cápside de los serotipos del dengue 1-4 (TetraDIIIC) para conferir inmunidad contra el virus del dengue. El dominio III E es un epítopo para anticuerpos neutralizantes eficientes, mientras que la proteína de la cápside contiene epítopos de células T. Además de combinar epítopos de células B y T, Tetra DIIIC es altamente inmunogénico debido a su forma agregada y un adyuvante de dos componentes. Siguiendo estudios previos que evaluaron las formulaciones monovalentes de DIIIC, se abordaron la calidad y amplitud de la respuesta de células T y anticuerpos de Tetra DIIIC en ratones. Tetra DIIIC indujo una respuesta de tipo Th1 contra los cuatro serotipos de DENV y los anticuerpos específicos del dengue eran predominantemente IgG1 e IgG2a y neutralizantes, mientras que la inducción de anticuerpos neutralizantes depende de la señalización de IFN. Es importante destacar que el perfil de Th1 e IgG1/IgG2a del enfoque de la vacuna DIIIC es similar a una respuesta natural eficiente contra el dengue.
Izquierdo, A., García, A., Lazo, L., Gil, L., Marcos, E., Alvarez, M., & Guzman, MG (2014), Archives of Virology, 159 (10), 2597-2604 describe una vacuna tetravalente contra el dengue que contiene una mezcla del dominio III-P64k y del dominio III de las proteínas de la cápside que induce una respuesta protectora en ratones. Esta referencia enseña un candidato vacunal que contiene el dominio III de la proteína de la envoltura del virus del dengue (tipo 1, 3 y 4) fusionada a la proteína P64k de Neisseria meningitidis y se encontró que el dominio III del virus del dengue tipo 2 (D2) era inmunogénico. Las proteínas de fusión recombinantes que contienen el dominio III de la proteína de la envoltura del virus del dengue fusionada con la proteína P64k de Neisseria meningitidis y el dominio III del virus del dengue tipo 2 (D2) fusionado a la proteína de la cápside de este serotipo fueron inmunogénicos y se evaluó la protección conferida en ratones frente al desafío letal en ratones inmunizados con esta formulación tetravalente.
Julia Schmitz y otros, (2011), Vaccine, Vol 29, No. 42, 7276-7284 describe proteínas de fusión de DENV1-4.
Las vacunas vivas atenuadas (LAV), consideradas el enfoque más efectivo para el dengue, han desmentido esta expectativa. Los datos recientes de un ensayo de eficacia del candidato LAV más avanzado mostraron una eficacia general del 30 %, sin eficacia para DENV-2. Esto requiere una exploración seria de enfoques alternativos para desarrollar una vacuna contra el dengue. El candidato vacunal tetravalente contra el dengue basado en VLP, 'DSV4', es una VLP basada en HBsAg que presenta los cuatro EDIII correspondientes a los cuatro serotipos de DENV desarrollados.
Inicialmente, como se describe en la Patente de la India núm. 261749, una proteína tetravalente del dominio III (rTDIII), un único polipéptido quimérico que comprende el dominio III de los cuatro serotipos del virus del dengue, Dengue -1, 2, 3 y 4, unidos entre sí a través de conectores de pentaglicina, se optimizó por codones para la expresión en E. coli.
Otra solicitud de patente de la India núm. 1259/DEL/2007 describe una proteína tetravalente recombinante basada en el dominio III de la envoltura con y sin péptido señal de secreción que induce respuestas inmunes protectoras contra cada uno de los cuatro serotipos del virus del dengue, DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4, dicha proteína codificada por una secuencia de polinucleótidos optimizada por codones para la expresión en el sistema de expresión eucariota.
La capacidad del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) para servir como plataforma para la presentación y exhibición de epítopos extraños queda bien ilustrada por el éxito de la vacuna candidata contra la malaria RTS, S. El uso del HBsAg como plataforma para la presentación de DENV2 EDIII y el uso de construcciones de1HBsAg DENV2 EDIII como vacuna se describe en Niyati Khetarpal y otros, (2013) Journal of Nanobiotechnology, Biomed Central, GB, Vol 11, no. 1, 15).
Con el fin de aumentar la inmunogenicidad de EDIII-T, los inventores exploraron si e1HBsAg podría servir bien para su presentación. Por lo tanto, se clonó EDIII-T en fusión con HBsAg y en un fondo de cuatro casetes de expresión de1HBsAg en un vector para P. pastoris (Figura 1A). Este diseño de DSV4 es similar al de RTS, S (Familia de patentes: WO9310152 A1, MX9206574 A, EP0614465 A1, etcétera), que muestra el epítopo de la malaria en las VLP de1HBsAg.
La novedad de la presente invención radica en la construcción de EDIII-T con HBsAg y en un fondo de cuatro casetes de expresión del HBsAg en un vector. Por lo tanto, este diseño de EDIII-T y HBsAg (denominado "DSV4"), puede considerarse novedoso. La inventiva de la presente invención radica en la fusión de EDIII-T con HBsAg para aumentar la inmunogenicidad de la proteína expresada sirviendo como plataforma para la presentación y para que la proteína HBsAg coexpresada se ensamble en la v Lp . Un solo dominio tetravalente recombinante (EDIII-T) se clona en fusión con HBsAg y se coexpresa con HBsAg para formar Partículas similares a virus (VLP) DSV4. La vacuna de subunidad tetravalente DSV4 genera anticuerpos neutralizantes específicos de serotipo DENV y es efectiva contra cada uno de los 4 serotipos del Dengue.
La presente invención tiene/se espera que tenga las siguientes ventajas sobre las vacunas propuestas existentes.
Las vacunas vivas atenuadas Sanofi que se encuentran actualmente en el ensayo de fase 3 requieren tres inmunizaciones durante un programa de dosificación extendido (0, 6 y 12) de 12 meses para provocar respuestas equilibradas de anticuerpos neutralizantes a los 4 serotipos, mientras que Glaxo Smith Kline (en los ensayos de fase 1) propone como objetivo un esquema de dosificación de tipo - 2 dosis con 28 días de diferencia - y Takeda (ensayos de fase 2 completados) con dos dosis separadas por solo tres meses, régimen de inmunización. Por tanto, con los datos preliminares, el esquema de inmunización de la presente vacuna sería más corto que el de la vacuna en fase de ensayo de Sanofi. Además, la presente vacuna comprende EDIII-T de los 4 serotipos de DENV y HBsAg como una única proteína recombinante, mientras que todas las demás vacunas candidatas en ensayo, incluyendo las vacunas de virus vivos atenuados de Sanofi, son una mezcla de cuatro candidatas correspondientes a los cuatro serotipos.
Además, la fusión del EDIII-T recombinante con el HBsAg daría como resultado no solo la formación de VLP y la coexpresión de la proteína inmunogénica recombinante y el antígeno de superficie de la hepatitis B, sino que podría proporcionar protección/inmunización contra la hepatitis B junto con el dengue. Esto podría conducir al desarrollo de una vacuna dual que proporcione inmunización simultánea contra todos los serotipos del dengue, así como también la hepatitis B.
Objetivos de la invención
Un objetivo importante de la presente invención es proporcionar una vacuna de la subunidad del dengue contra los cuatro serotipos: DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un candidato vacunal tetravalente contra el dengue basada en VLP recombinante, DSV4.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un candidato vacunal tetravalente contra el dengue basado en VLP recombinante, DSV4 que genera anticuerpos neutralizantes específicos de serotipo DENV contra cada uno de los 4 serotipos del Dengue, DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV- 4.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un proceso para la producción del candidato vacunal tetravalente contra el dengue basado en VLP recombinante.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un enfoque de vacunación eficiente y seguro contra los cuatro serotipos del virus del Dengue.
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona una partícula similar a virus (VLP) que comprende: a.) un polipéptido recombinante que consiste del dominio EDIII de cada uno de los serotipos del virus del dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, unidos al extremo N del HBsAg en donde los dominios EDIII se fusionan secuencialmente, del extremo N al extremo C, en la secuencia DENV-1, DENV-3, DENV-4, DENV-2, en donde la secuencia de aminoácidos de los dominios EDIII de cada uno de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3, y DENV-4 es la SEQ ID NO 1,2, 3 y 4 respectivamente; y b.) cuatro casetes de expresión del polipéptido HBsAg.
La invención proporciona además la partícula similar a virus de la invención en donde el polipéptido recombinante tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 11.
En un aspecto adicional, la invención proporciona una vacuna que comprende la partícula similar a virus de la invención.
En un aspecto adicional, la invención proporciona la vacuna de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por el virus del dengue.
Breve descripción de los dibujos adjuntos
Figura 1:
(A) Diseño de DSV4: El EDIII-T que consiste de cuatro EDIII correspondientes a los cuatro DENV unidos a través de un conector hexagonal se fusionó genéticamente con HBsAg (S) para codificar EDIII-T-HBsAg, que se clonó en un vector que llevaba cuatro casetes de expresión del HBsAg. El plásmido recombinante se linealizó con Bgl II y se sometió a electroporación en células de P. pastoris para obtener un clon que coexpresa EDIII-T-HBsAg y HBsAg.
(B) Inducción con metanol: Se preparó biomasa no inducida (U) e inducida (I) del clon seleccionado mediante inducción con metanol y se analizó la expresión mediante tinción con plata y transferencia Western. El gel teñido con plata muestra la expresión de EDIII-T-HBsAg (~72 kDa) y HBsAg (~25 kDa) en la muestra inducida. La transferencia de Western con mAb específico de EDIII detecta EDIII-T-HBsAg, y con mAb específico del HBsAg detecta tanto EDIII-T-HBsAg como HBsAg.
(C) Purificación de DSV4: Tres preparaciones de DSV purificado4 de la biomasa inducida.
Figura 2:
(A) Cromatografía de filtración en gel de DSV4: DSV4 eluyó en el volumen vacío cuando se sometió a cromatografía de filtración en gel. El análisis de proteína en volumen vacío mediante tinción con plata indica la presencia tanto de EDIII-T-HBsAg como del HBsAg.
(B) Ultracentrifugación en CsCl: Co-migración de EDIII-T-HBsAg y HBsAg en ultracentrifugación en columna de CsCl. (C) Vista microscópica electrónica de DSV4 VLP: DSV de tamaño 25-35 nm4 VLP como se observa en la tinción negativa con un microscopio electrónico.
Figura 3:
(A) Fuente de la secuencia EDIII: Genotipo de cada serotipo DENV del que se derivó la correspondiente secuencia de aa de EDIII.
(B) reactividad en ELISA del antisuero DSV4: Reactividad del antisuero DSV4 agrupado contra HBsAg, EDIII-1, EDIII-2, EDIII-3 y EDIII-4. La curva púrpura representa la reactividad del suero no inmunizado contra DSV4.
(C) DSV4 genera títulos de neutralización equilibrados: Títulos de neutralización basados en FACS del antisuero DSV4 contra genotipo (s) específico(s) de cada serotipo.
(D) Amplitud de neutralización de genotipo con sueros combinados Figura 4:
(a) secuencia de aminoácidos del dominio III de la envoltura de DENV-1 (SEQ ID NO: 1) y ácido nucleico codificante (SEQ ID NO: 5);
(b) secuencia de aminoácidos del dominio III de la envoltura de DENV-2 (SEQ ID NO: 2) y ácido nucleico codificante (SEQ ID NO: 6);
(c) secuencia de aminoácidos del dominio III de la envoltura de DENV-3 (SEQ ID NO: 3) y ácido nucleico codificante (SEQ ID NO: 7);
(d) secuencia de aminoácidos del dominio III de la envoltura de DENV-4 (SEQ ID NO: 4) y ácido nucleico codificante (SEQ ID NO: 8);
(e) secuencia de aminoácidos del extremo N del HBsAg (SEQ ID NO: 9) y ácido nucleico codificante (SEQ ID NO: 10); (f) secuencia de aminoácidos de un polipéptido recombinante de la invención que comprende EDIII de DENV-1, 2, 3 y 4 unidos al extremo N del HBsAg (SEQ ID NO: 11) y ácido nucleico codificante (SEQ ID NO: 12), en donde las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos en cursiva son conectores de hexaglicina y las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos subrayadas son el resultado de la traducción del sitio de restricción KpnI. Los EDIII se ordenan secuencialmente desde el terminal extremo N al extremo C de DNV-1, DNV-3, DNV-4 y DNV-2.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona una vacuna de la subunidad del dengue contra los cuatro serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4. La vacuna de subunidad comprende una proteína recombinante que comprende EDIII-T tetravalente y HBsAg. La presente invención también se refiere a una vacuna de subunidad que comprende una vacuna tetravalente basada en VLP para la prevención de la enfermedad del dengue contra los cuatro serotipos de DENV.
La descripción proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína recombinante que comprende el dominio EdIII del serotipo del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, unido en marco al extremo N del HBsAg. Las secuencias de nucleótidos que codifican cada uno de los dominios EDIII de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 pueden unirse con el extremo N del HBsAg en cualquier orden secuencial.
Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico codifica los dominios EDIII de cada uno de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4 respectivamente. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica cada uno de los dominios EDIII de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 es la SEQ ID NO: 5, 6, 7 y 8 respectivamente.
Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico codifica un HBsAg que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica el HBsAg es la SEQ ID NO: 10.
La secuencia de ácido nucleico puede comprender cada una de las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 5, 6, 7 y 8 unidos en marco con el extremo N de la sEq ID NO: 10. Las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, 6, 7 y 8 pueden unirse con el extremo N de la SEQ ID NO: 10 en cualquier orden secuencial.
Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico codifica un conector que une cada uno de los dominios EDIII del serotipo del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4. Preferentemente, el ácido nucleico codifica un conector flexible, con la máxima preferencia un conector de hexaglicina. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico codifica un conector que une los dominios EDIII del serotipo del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 al extremo N del HBsAg. Preferentemente, el ácido nucleico codifica un conector flexible, con la máxima preferencia un conector de hexaglicina.
Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido recombinante es la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 12.
En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico es optimizada por codones para la expresión en levadura, preferentemente para la expresión en P. pastoris. El ácido nucleico puede ser un vector de expresión.
La descripción se refiere a una célula hospedera transformada o transfectada con un ácido nucleico de la invención, en donde la célula hospedera expresa HBsAg. La célula hospedera puede transformarse o transfectarse con una secuencia de ácido nucleico que codifica HBsAg. Preferentemente, la célula hospedera se transforma o transfecta con 1, 2, 3, 4 o más secuencias de ácido nucleico que expresan HBsAg. La célula huésped puede ser una levadura. Con la máxima preferencia, la célula huésped es P. pastoris.
En un aspecto, la invención proporciona una partícula similar a virus que comprende un polipéptido recombinante que comprende el dominio EDIII de cada uno de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 unidos al extremo N del HBsAg. Los dominios EDIII de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 se fusionan secuencialmente, del extremo N al extremo C, en la secuencia DENV-1, DENV-3, DENV-4 y DENV-2
La secuencia de aminoácidos de los dominios EDIII de cada uno de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 es la SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4 respectivamente. Preferentemente, el extremo N de1HBsAg tiene la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 9. Preferentemente, el polipéptido recombinante comprende cada una de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4 unidos al extremo N de la SEQ ID NO: 9. El polipéptido recombinante comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4 secuencialmente, del extremo N al extremo C, en la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 2.
Preferentemente, los dominios EDIII de cada uno de los serotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 del virus del Dengue están unidos por un conector, preferentemente un conector flexible, con la máxima preferencia un conector de hexaglicina. Preferentemente, los dominios EDIII están unidos al extremo N de1 HBsAg mediante un conector, preferentemente un conector flexible, con la máxima preferencia un conector de hexaglicina.
En un aspecto de la invención, el polipéptido recombinante tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.
Las células huésped transformadas o transfectadas sintetizan tanto HBsAg como el polipéptido recombinante de la invención. Los inventores demostraron que estos dos polipéptidos se coensamblan espontáneamente en bionanopartículas. La descripción incluye bionanopartículas que comprenden HBsAg y el polipéptido recombinante de la invención.
La descripción proporciona un método para preparar una proteína recombinante o bionanopartícula que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones apropiadas y recuperar la proteína recombinante o bionanopartícula expresada.
En un aspecto, la invención se refiere a una vacuna que comprende las partículas similares a virus de la invención. Preferentemente, la vacuna comprende las partículas similares a virus de la invención en un portador o diluyente adecuado farmacéuticamente aceptable.
La descripción proporciona un método para tratar o prevenir el virus del dengue, que comprende administrar a un sujeto una proteína recombinante, una bionanopartícula o una vacuna de la invención, el virus del dengue es el serotipo DENV-1, DENV-2, DENV-3 o DENV-4.
Se desarrolló la molécula tetravalente basada en EDIII, EDIII-T, que se diseñó para contener los cuatro EDIII unidos entre sí a través de conectores de glicilo flexibles como se representa en la Figura 1A. EDIII-T se expresó en Pichia pastoris, se purificó y se encontró que era inmunogénico en ratones. La construcción de la molécula EDIII-T se proporciona en la patente De la India núm. 261749.
La capacidad del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) para servir como plataforma para la presentación y exhibición de epítopos extraños queda bien ilustrada por el éxito del candidato vacunal contra la malaria RTS,S en la Solicitud de Patente núm.WO 93/10152.
La presente invención explora las posibilidades de que el HBsAg pueda servir para aumentar la inmunogenicidad de EDIII-T. Por lo tanto, se clonó EDIII-T en fusión con HBsAg y en un fondo de cuatro casetes de expresión de1HBsAg en P. pastoris vector como se representa en la Figura 1A. Este diseño de EDIII-T y HBsAg se denomina "DSV4" y es similar a la de RTS,S en la solicitud de patente núm. WO9310152 que muestra el epítopo de la malaria en las VLP de1HBsAg.
El plásmido recombinante se electroporó en P. pastoris y las colonias se seleccionaron para la coexpresión de proteínas EDIII-T-HBsAg y HBsAg por inducción de clones con metanol. Uno de los clones positivos que coexpresan las dos proteínas como se muestra en la Figura 1B, se seleccionó para un estudio adicional. La biomasa inducida se lisó y las proteínas asociadas a la membrana se extrajeron y se sometieron a diafiltración a través de una membrana de 300 kDa. Esta etapa se diseñó para permitir el enriquecimiento de proteínas de gran tamaño considerando que las dos proteínas
coexpresadas se ensamblan en VLP DSV4. El retenido se purificó a través de resina fenil 600 M con alta pureza como se representa en la Figura 1C.
La capacidad de las proteínas coexpresadas para ensamblarse en VLP se evaluó mediante filtración en gel como se muestra en la Figura 2a, ultracentrifugación en CsCl como se muestra en la Figura 2B y microscopía electrónica como se muestra en la Figura 2C. Se observó que ambos componentes proteicos de DSV4 eluyeron juntos en el volumen vacío durante la filtración en gel como se muestra en la Figura 2A y comigraron durante la ultracentrifugación en CsCl como se muestra en la Figura 2B. En la visualización con microscopio electrónico, se observó que se ensamblaban en VLP de 25 35 nm como se muestra en la Figura 2C.
La integridad conformacional de EDIII de los cuatro DENV en las VLP DSV4 se evaluó mediante el reconocimiento de epítopos críticos de EDIII mediante mAb bien caracterizados en formato ELISA sándwich.
La capacidad de estas VLP para montar una fuerte respuesta inmune contra los cuatro serotipos de DENV se evaluó mediante inmunización en ratones BALB/c como se muestra en la Figura 3. Las VLP DSV4 purificadas se inmunizaron (20pg/500pg Al como alhidrogel/100pl en PBS) en un grupo de seis ratones BALB/c por vía intraperitoneal los días 0, 30 y 90. El sangrado terminal se tomó el día 100 y se analizó la respuesta contra DSV4 por ELISA. Los sueros de los respondedores positivos se combinaron y caracterizaron por la presencia de anticuerpos contra los cinco componentes, específicamente, EDIII-1, EDIII-2, EDIII-3, EDIII-4 y HBsAg (Figura 3B). Se observó que se generó una fuerte respuesta inmune contra todos ellos. Era fundamental determinar si la respuesta antidengue era capaz de neutralizar los cuatro DENV. Por lo tanto, se evaluó la capacidad de neutralización del suero combinado mediante un ensayo basado en FACS y se observó que el antisuero DSV4 era de hecho capaz de neutralizar los cuatro DENV (Figura 3C). La figura 3A ilustra el diseño de DSV4 y la cepa de la que se adquirieron las correspondientes secuencias de aa de EDIII. La Figura 3C ilustra el título de neutralización del antisuero DSV4 contra los cuatro DENV (de la cepa especificada) y cepas de dos genotipos adicionales de DENV-3. Es evidente que los genotipos DENV-2, -3 y -4 utilizados en el ensayo de neutralización variaron con respecto a los genotipos a partir de los cuales se adquirió la secuencia de EDIII, y no afectó negativamente la capacidad de neutralización del antisuero DSV4, lo cual indica una alta intensidad de la respuesta inmune generada. Además, la respuesta general contra los diversos genotipos también pareció equilibrada, destacando la candidatura de DSV4 como una posible vacuna contra el dengue, como se representa en la Figura 3D. DSV4 pareció ser eficaz en un grado comparable con varios adyuvantes evaluados (Figura 3D)
La presente invención se describe con referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente para ilustrar y demostrar la invención. Estos ejemplos específicos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención de ninguna manera.
Ejemplo 1: Construcción de un candidato vacunal tetravalente recombinante basada en VLPcontra el dengue
EDIII-T se clonó en fusión con HBsAg y en un fondo de cuatro casetes de expresión de1HBsAg en un vector de P. pastoris como se representa en la Figura 1A. Este diseño de EDIII-T y HBsAg se denomina "DSV4 El plásmido recombinante se electroporó en P. pastoris y las colonias se seleccionaron para la coexpresión de proteínas EDIII-T-HBsAg y HBsAg por inducción de clones con metanol.
Ejemplo 2: Caracterización del candidato vacunal tetravalente DSV4 contra el dengue.
Uno de los clones positivos que coexpresan las dos proteínas como se muestra en la Figura 1B, se seleccionó para un estudio adicional. La biomasa inducida se lisó y las proteínas asociadas a la membrana se extrajeron y se sometieron a diafiltración a través de una membrana de 300 kDa. Esta etapa se diseñó para permitir el enriquecimiento de proteínas de gran tamaño considerando que las dos proteínas coexpresadas se ensamblan en VLP DSV4. El retenido se purificó a través de resina fenil 600 M con alta pureza como se representa en la Figura 1C.
Ejemplo 3: Identificación y caracterización de VLP
La capacidad de las proteínas coexpresadas para ensamblarse en VLP se evaluó mediante filtración en gel como se muestra en la Figura 2a, ultracentrifugación en CsCl como se muestra en la Figura 2B y microscopía electrónica como se muestra en la Figura 2C. Se observó que ambos componentes proteicos de DSV4 eluyeron juntos en el volumen vacío durante la filtración en gel como se muestra en la Figura 2A y comigraron durante la ultracentrifugación en CsCl como se muestra en la Figura 2B. En la visualización con microscopio electrónico, se observó que se ensamblaban en VLP de 25 35 nm como se muestra en la Figura 2C.
Ejemplo 4: Evaluación de la integridad conformacional de los cuatro DENV en las VLP DSV4 por mAb
La integridad conformacional de EDIII de los cuatro DENV en las VLP DSV4 se evaluó mediante el reconocimiento de epítopos críticos de EDIII mediante mAb bien caracterizados en formato ELISA sándwich. Se recubrieron mAb específicos contra el dengue en pocillos de microtitulación y se añadieron las VLP DSV4. Las VLP unidas se revelaron mediante anti-HBsAg Hepnostika marcado con peroxidasa. La mayoría de estos mAb son contra la cadena A y la región de la cresta lateral de EDIII, que se cree que son esenciales para generar una fuerte respuesta inmune neutralizante. La reactividad
ELISA de DSV4 por 21 mAb para dengue (mAb específicos y no específicos de EDIII) se ilustra en la Tabla 1 y los resultados indican que los epítopos de EDIII de los cuatro DENV están intactos en las VLP DSV4.
Tabla 1: Lista de mAb específicos para EDIII, regiones que reconocen y sus reactividades con VLP 'DSV4' (en té rm inos de DO de ELISA)
mA ni EDIII N r liz f r m n R i n ifi i D ELI A
Ejemplo 5: Inmunización de ratones por VLP DSV4 purificadas.
La capacidad de estas VLP para montar una fuerte respuesta inmune contra los cuatro serotipos de DENV se evaluó mediante inmunización en ratones BALB/c como se muestra en la Figura 3. Las VLP DSV4 purificadas se inmunizaron (20pg/500pg Al como alhidrogel/100pl en PBS) en un grupo de seis ratones BALB/c por vía intraperitoneal los días 0, 30 y 90. El sangrado terminal se tomó el día 100 y se analizó la respuesta contra DSV4 por ELISA. Los sueros de los respondedores positivos se combinaron y caracterizaron por la presencia de anticuerpos contra los cinco componentes, específicamente, EDIII-1, EDIII-2, EDIII-3, EDIII-4 y HBsAg como se representa en la Figura 3B y se determinó una mayor amplitud de neutralización del genotipo de los antisueros DSV4 generados con varios adyuvantes como se representa en la Figura 3D
Respuesta inmunitaria:
Se observó que se generó una fuerte respuesta inmune contra los cinco componentes, específicamente, EDIII-1, EDIII-2, EDIII-3, EDIII-4 y HBsAg. Era fundamental determinar si la respuesta antidengue era capaz de neutralizar los cuatro DENV. Por lo tanto, se evaluó la capacidad de neutralización del suero combinado mediante un ensayo basado en FACS y se observó que el antisuero DSV4 es capaz de neutralizar los cuatro DENV como se muestra en la Figura 3C que ilustra el título de neutralización del antisuero DSV4 contra las cuatro cepas de DENV de referencia de la OMS y cepas de dos genotipos adicionales de DENV-3. Es evidente que los genotipos DENV-2, -3 y -4 utilizados en el ensayo de neutralización variaron con respecto a los genotipos a partir de los cuales se adquirió la secuencia de EDIII y no afectó negativamente la capacidad de neutralización del antisuero DSV4, lo cual indica la alta intensidad de la respuesta inmune generada. Además, la respuesta general contra los diversos serotipos también pareció equilibrada, destacando la candidatura de DSV4 como posible vacuna contra el dengue. La Tabla 2 más abajo ilustra el agotamiento posterior de FNT en EDIII-3-MBP que provoca Ab neutralizantes específicos de serotipo.
Tabla 2: Agotamiento posterior de FNT en EDIII-3-MBP que provoca Ab neutralizantes específicos de serotipo
Suero 2 MBP nd 775 1022 nd
Agotam iento de
Ab DENV-2 EDIII-2-MBP nd 78 975 nd
Resumen
La invención proporciona un polipéptido recombinante que comprende el dominio EDIII de cada uno de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, unido al extremo N del HBsAg.
Claims (1)
- REIVINDICACIONESUna partícula similar a virus (VLP) que comprende:a. ) un polipéptido recombinante que consiste del dominio EDIII de cada uno de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 unido al extremo N del HBsAg en donde los dominios EDIII se fusionan secuencialmente, del extremo N al extremo C, en la secuencia DENV-1, DENV-3, DENV-4, DENV-2, en donde la secuencia de aminoácidos de los dominios EDIII de cada uno de los serotipos del virus del Dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 es la SEQ ID NO 1, 2, 3 y 4 respectivamente; como se muestra en las Figuras 4a, b, c y d, respectivamente yb. ) cuatro casetes de expresión del polipéptido HBsAg.La partícula similar a virus (VLP) de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido recombinante tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 11 como se muestra en la Figura 4f.Una vacuna que comprende la partícula similar a virus de acuerdo con la reivindicación 1.La vacuna de acuerdo con la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por el virus del dengue.
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