ES2823162T3 - Células madre mesenquimatosas para mejorar la actividad antitumoral de la inmunoterapia - Google Patents

Abstract

Células madre mesenquimatosas (MSC) para usar en el tratamiento de un tumor, en donde dicho tratamiento comprende la administración combinada de dichas MSC con una inmunoterapia antitumoral, en donde dicha inmunoterapia comprende la administración de linfocitos T y/o linfocitos citolíticos naturales (NK), y en donde dichas MSC no están modificadas genéticamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre mesenquimatosas para mejorar la actividad antitumoral de la inmunoterapia

La invención se refiere a células madre mesenquimatosas (MSC) para usar en el tratamiento de un tumor, en donde dicho tratamiento comprende la administración combinada de dichas células madre mesenquimatosas con una inmunoterapia antitumoral, en donde dicha inmunoterapia comprende la administración de linfocitos T y/o linfocitos citolíticos naturales (NK), y en donde dichas MSC no están modificadas genéticamente.

En una realización preferida la invención se refiere al uso de dichas MSC en el tratamiento de un tumor y/o tumor maligno, en donde la inmunoterapia antitumoral para administración combinada comprende la administración de una inmunoterapia celular, preferentemente un receptor de antígeno quimérico (CAR) de linfocitos T, en donde dicho receptor de linfocitos T se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor, y las células madre mesenquimatosas no están modificadas genéticamente.

La invención abarca el uso de MSC en el tratamiento de un tumor y/o enfermedad maligna, por ejemplo, modulando el microambiente tumoral para atraer y/o estimular células inmunitarias que presentan un efecto antitumoral. Un aspecto de la invención se refiere al uso de dichas MSC en el tratamiento antitumoral que comprende la administración combinada de dichas células madre mesenquimatosas con células inmunitarias, por ejemplo linfocitos T, tales como linfocitos T con receptores de linfocitos T artificiales, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR-T), o células transducidas con un receptor de linfocitos T (TCR), linfocitos NK o macrófagos/monocitos. Adicionalmente, enfoques de inmunoterapia adicionales, por ejemplo inhibidores del punto de control, incluidos, por ejemplo, anticuerpos contra CTLA-4, PD-1, PD-L1 u otras moléculas coestimuladoras inmunitarias, o fármacos inmunoterapéuticos activos, por ejemplo, antígenos tumorales, material tumoral derivado del paciente y otros fármacos terapéuticos destinados a activar y/o dirigir la respuesta inmunitaria contra un tumor, pueden combinarse con la administración de las MSC.

Antecedentes de la invención

Las células madre mesenquimatosas (MSC) son células de origen no hematopoyético que residen en la médula ósea y otros tejidos. La correcta identificación y nomenclatura de las MSC ha sido aclarada por el Comité de Células Madre Mesenquimatosas y Tisulares de la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT), que ha propuesto un conjunto de criterios mínimos para definir las MSC: En primer lugar, las MSC crecen adhiriéndose al plástico cuando se mantienen en condiciones normales de cultivo celular. En segundo lugar, las células expresan un panel de los siguientes marcadores de superficie: expresión de CD105, CD73, y CD90 (>95 %). Por otro lado, deben estar ausentes un conjunto específico de marcadores: expresión de CD45, expresión de CD34, CD14 o CD11b, CD79alfa o CD19 y HLA-DR (<2 % positivo). Adicionalmente, las MSC deben poder diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condroblastos cuando se cultivan en condiciones de diferenciación in vitro normales (M. Dominici, et al., 2006, Cytotherapy, vol. 8, n.° 4, págs. 315-317).

El aislamiento, cultivo y administración de MSC se ha identificado como un enfoque prometedor para el tratamiento de los trastornos asociados a la inflamación. Esta conclusión se basó en la observación inicial de que las MSC pueden inhibir las reacciones mixtas de linfocitos (MLR) in vitro. Se demostró que las MSC nativas pueden suprimir la proliferación de linfocitos T tanto en MLR como en presencia de activadores policlonales (interleucina (IL) -2 o fitohemaglutinina (PHA)) (M. D. Nicola, et al., 2002, Blood, vol. 99, n.° 10, págs. 3838-3843).

La supresión de la activación de los linfocitos T por las MSC se puede observar en cultivos que contienen células mononucleares de sangre periférica o linfocitos T purificados. (Wang et al, 2014, Arthritis Rheumatol. Aug 66(8): 2234­ 45). La supresión de las respuestas de los linfocitos T por las MSC ha sido ampliamente estudiada y ha sido confirmada por muchos investigadores independientes, tales como Bartholomew et al (Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 2002, 30: 42-48), Aggarwal and Pittenger (Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood. 2005, 105: 1815-1822) y Krampera et al (Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 2003, 101: 3722-3729.).

Debido a la capacidad de las MSC para suprimir la activación de los linfocitos T, se ha propuesto que las MSC son beneficiosas para tratar enfermedades inflamatorias. Por lo tanto, las MSC se han estudiado ampliamente en ensayos clínicos con el objetivo de tratar la enfermedad de injerto contra hospedador (GvHD). La GvHD es un potencial efecto secundario del trasplante de células madre hematopoyéticas, en el cual los linfocitos T derivados del donante pueden atacar al hospedador. En relación con la GvHD, las MSC se han probado en ensayos clínicos con el objetivo de suprimir los linfocitos T alorreactivos del donante y, de este modo, aliviar los síntomas de la GvHD (Resnick et al. Treatment of severe steroid resistant acute GVHD with mesenchymal stromal cells (MSC); American Journal of Blood Research, 2013;3(3):225-238., y Herrmann et al, Adult human mesenchymal stromal cells and the treatment of graft versus host disease, Stem Cells and Cloning: Advances and Applications, 2014; 7: 45-52.).

Se sabe que las MSC muestran propiedades evasivas inmunitarias después de su administración a un paciente. Se ha demostrado que las MSC muestran un efecto inmunomodulador/supresor de linfocitos T en casos de trasplante de material de un donante alogénico (Le Blanc et al., Lancet 2004: 363, pág. 1439), reduciendo de este modo una alorreactividad potencialmente patógena y rechazo. El tratamiento con MSC también puede desempeñar una función terapéutica en la curación de heridas. La administración terapéutica de MSC puede realizarse mediante inyección sistémica, seguida de migración dirigida de MSC a e injerto en sitios de lesión (Kidd et al., Stem Cells 2009: 27, pág.

2614). Las MSC también se han descrito como vehículos para dirigir agentes anticancerosos a tumores, por ejemplo en el documento WO 2008/150368, que describe la expresión transgénica de HSV-TK de MSC en sitios tumorales y la administración sistémica combinada de ganciclovir.

Los receptores de linfocitos T artificiales (también conocidos como receptores de linfocitos T quiméricos, inmunorreceptores quiméricos, receptores antigénicos quiméricos (CAR)) son receptores modificados, que injertan una especificidad arbitraria en una célula inmunitaria. Normalmente, estos receptores se usan para injertar la especificidad de un anticuerpo monoclonal en un linfocito T y para activar ese linfocito T tras la interacción con el antígeno afín; con la transferencia de su secuencia de codificación facilitada por vectores retrovirales o lentivirales. Los receptores se denominan quiméricos porque están compuestos por partes de diferentes fuentes.

Los receptores de linfocitos T artificiales se están investigando como terapia para el cáncer, utilizando una técnica llamada transferencia celular adoptiva. Los linfocitos T se extraen de un paciente y se modifican ex vivo para que expresen receptores específicos para la forma particular de cáncer. Los linfocitos T, que luego pueden reconocer y destruir las células cancerosas, se administran al paciente con o sin preacondicionamiento del paciente. También se están investigando linfocitos T alogénicos modificados de la misma manera y obtenidos de donantes distintos del paciente.

A pesar del progreso en la inducción de la respuesta inmunitaria antitumoral usando inmunoterapias, tales como células CART, persisten las dificultades para lograr una inducción suficiente de la respuesta inmunitaria deseada para mostrar el efecto terapéutico deseado.

La técnica anterior divulga medios para mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales. El documento WO 2016/026854 divulga MSC modificadas genéticamente que expresan citocinas estimulantes de la respuesta inmunitaria para atraer y/o activar células inmunitarias en respuesta contra un tumor. De acuerdo con el documento WO 2016/026854, la expresión de una citocina inmunoestimulante a partir de un ácido nucleico exógeno es necesaria para la activación de la respuesta inmunitaria deseada. La administración de MSC, no modificadas genéticamente o sin ácidos nucleicos exógenos que codifiquen citocinas inmunoestimuladoras, ni se divulga ni se sugiere.

El documento WO 2014/087217 divulga la administración de una mezcla de células dendríticas alogénicas y MSC aisladas de sangre de cordón donada y activadas con antígenos de células tumorales autólogas para el tratamiento de tumores. El documento WO 2014/087217 enseña el uso de células dendríticas para presentar antígenos tumorales y estimular los linfocitos T endógenos para la respuesta inmunitaria deseada. No se hace mención a MSC que estimulen una respuesta inmunitaria antitumoral.

Hass et al (Cell Communication and Signaling, 2012, v. 10, n.° 1, 26) presenta un resumen de las funciones de las MSC en microambientes neoplásicos y divulga la capacidad inmunosupresora de las MSC, en particular la supresión de linfocitos T, células dendríticas y linfocitos citolíticos naturales por las MSC. Zhang et al (Stem Cell Research and Therapy, 2015, v. 6, n.° 1, 45) también divulga la supresión de la función de diversas células inmunitarias, incluyendo linfocitos T y B, por las MSC. Prigione et al (Stem Cells, 2009, v. 27, n.° 3, 693) describe el deterioro de la proliferación de linfocitos T mediado por MSC para subconjuntos de linfocitos T particulares que son relevantes en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

Ningxia Song et al (Int. J. Mol. Medicine, 2015, 36: 139-149) divulga que las MSC, cuando se administran en combinación con células de linfoma A20, conducen a una supervivencia mejorada en modelos de ratón, aunque dependen de un efecto antiproliferativo directo sobre las células de linfoma y los contactos célula-célula. Fritz et al (Current Stem Cell Research and Therapy, 2008, v. 3, n.° 1, 32-34) presentan una revisión de las MSC y sus usos en la terapia antitumoral, analizando los efectos inmunosupresores de las MSC y su uso como vehículos de administración de agentes anticancerosos. Loebinger et al (Cancer Research, 2009, v. 69, n.° 10, 4134) describe MSC modificadas genéticamente que expresan un ligando inductor de apoptosis TRAIL de un transgén exógeno y su uso en el tratamiento del cáncer. En estos documentos no se divulga ni la administración combinada de m Sc con terapias inmunitarias antitumorales ni el aumento asociado a las MSC de una respuesta inmunitaria antitumoral.

Aunque la terapia celular adoptiva es eficaz en el tratamiento de algunos cánceres, incluidos el melanoma y la leucemia/linfoma, la terapia aún falla en el tratamiento de la mayoría de las otras neoplasias malignas, en particular en la mayoría de los casos de cáncer sólido. Sigue existiendo una necesidad médica importante de mejorar la actividad anticancerosa de las inmunoterapias, en particular de las inmunoterapias celulares tales como las basadas en la administración de linfocitos T, por ejemplo, tanto para células inmunitarias genéticamente modificadas (CAR-T) como no modificadas.

Sumario de la invención

A la luz de la técnica anterior, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar medios mejorados o alternativos para la inmunoterapia de cánceres, o proporcionar medios para mejorar las inmunoterapias existentes para el tratamiento del cáncer. En particular, un problema subyacente a la invención es la provisión de medios adecuados para la estimulación, tal como la estimulación local, de una respuesta inmunitaria dirigida contra células cancerosas y/o tejido tumoral en el paciente. Otro problema subyacente a la invención es la provisión de medios adecuados para aumentar la actividad de las células inmunitarias, en particular CAR-T, contra células o tejidos cancerosos.

Este problema se resuelve por las características de las reivindicaciones independientes. Realizaciones preferidas de la presente invención se proporcionan por las reivindicaciones dependientes.

En el presente documento se divulgan células madre mesenquimatosas (MSC) para usar en el tratamiento de un tumor, en donde dicho tratamiento comprende la administración combinada de dichas células madre mesenquimatosas con una inmunoterapia antitumoral y en donde dichas MSC no comprenden ácidos nucleicos exógenos que codifican citocinas estimulantes de la respuesta inmunitaria.

La invención se refiere a células madre mesenquimatosas (MSC) para usar en el tratamiento de un tumor, en donde dicho tratamiento comprende la administración combinada de dichas células madre mesenquimatosas con una inmunoterapia antitumoral, en donde dicha inmunoterapia comprende la administración de linfocitos T y/o linfocitos citolíticos naturales (NK), y en donde dichas MSC no están modificadas genéticamente.

En el presente documento se divulgan también células madre mesenquimatosas (MSC) para usar en el tratamiento de un tumor, en donde dicho tratamiento comprende la administración combinada de dichas células madre mesenquimatosas con una inmunoterapia antitumoral y en donde dichas MSC están modificadas genéticamente, pero no comprenden ácidos nucleicos exógenos que codifican citocinas estimulantes de la respuesta inmunitaria.

En el presente documento se divulgan también células madre mesenquimatosas (MSC) para usar en el tratamiento de un tumor, en donde dicho tratamiento comprende la administración combinada de dichas células madre mesenquimatosas con una inmunoterapia antitumoral y en donde dichas MSC están modificadas genéticamente, pero no comprenden ácidos nucleicos exógenos que codifican moléculas inmunoestimuladoras que inducen una respuesta inmunitaria independiente de antígenos.

Por tanto, la invención abarca el uso médico de las MSC descritas en el presente documento, en particular para tratar el cáncer, además de los métodos para el tratamiento de un sujeto con un tumor, o los métodos de tratamiento de un tumor y/o enfermedad tumoral.

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que las MSC humanas que no están modificadas genéticamente, en particular las MSC sin transgenes que codifican citocinas inmunoestimuladoras u otros productos transgénicos que muestran propiedades inmunoestimuladoras independientes de antígeno, pueden mejorar la actividad de un inmunoterapia antitumoral. Este hallazgo es particularmente inesperado, ya que las MSC se han descrito previamente, y se acepta comúnmente, que presentan funciones inmunosupresoras. Tal como se ha descrito en detalle anteriormente, la técnica anterior divulga que las MSC se pueden emplear en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y de la GVHD, es decir, en enfermedades en las cuales la inmunosupresión es el resultado terapéutico deseado.

En particular, fue sorprendente que las MSC no modificadas genéticamente aumentasen la actividad antitumoral de dicha inmunoterapia combinada en un grado similar (pero algo reducido) que las MSC modificadas genéticamente que comprenden moléculas de ácido nucleico exógenas que codifican moléculas inmunoestimuladoras no específicas de antígeno, en particular citocinas inmunoestimuladoras, que son secretadas por estas células.

La presente invención se refiere a MSC que no están modificadas genéticamente. En el presente documento también se divulgan MSC que pueden exhibir una modificación genética, pero no presentan un transgén que codifique una o más moléculas inmunoestimuladoras tales como citocinas inmunoestimuladoras, que se considera que inducen una respuesta inmunitaria independiente de antígeno. La invención se refiere al hallazgo de que aunque se piensa que las MSC suprimen las respuestas inmunitarias in vivo, las MSC utilizadas en los ejemplos siguientes muestran propiedades de estimulación de una respuesta inmunitaria antitumoral de un linfocito CAR-T.

En el presente documento también se divulgan MSC que se modifican genéticamente para aumentar además el efecto de apoyo en la respuesta antitumoral, por ejemplo, mediante la expresión de transgenes citotóxicos. En una realización preferida, tales transgenes, por ejemplo los transgenes citotóxicos, no conducen a una estimulación inmunitaria no específica de antígeno.

Las MSC como se describen en el presente documento migran preferentemente al tejido tumoral debido a su capacidad natural o modificada para dirigirse a áreas de inflamación in vivo. La migración dirigida a y/o el injerto en el tejido tumoral (estroma tumoral) puede conducir a la expresión local de moléculas inmunoestimulantes tales como las citocinas de los ácidos nucleicos endógenos, permitiendo de este modo una mayor eficacia antitumoral de las células inmunitarias endógenas o administradas en el sitio de un tumor.

La invención proporciona medios adecuados para la estimulación local de una respuesta inmunitaria dirigida contra un tejido tumoral en un sujeto. Esto incluye, en particular, tratamientos inmunoterapéuticos destinados a dirigir la respuesta inmunitaria contra el tumor. Dicho apoyo o inducción de la respuesta inmunitaria puede ser beneficioso en diversos contextos clínicos para iniciar y mantener la respuesta inmunitaria y evadir la inmunosupresión mediada por tumores que a menudo bloquea esta activación.

Las células madre mesenquimatosas de la presente invención pueden usarse para mejorar las actividades y/o aumentar las cantidades de células inmunitarias endógenas que ya están presentes en el sujeto. Como alternativa, o adicionalmente, pueden administrarse células inmunitarias adicionales (autólogas o alogénicas) en combinación con las MSC (por ejemplo, de forma simultánea o secuencial) de la invención para mejorar la respuesta inmunitaria terapéutica deseada.

En una realización la invención se refiere por lo tanto a la inmunoterapia del cáncer y enfoques que implican la transferencia celular adoptiva, que abarca respuestas citotóxicas basadas en linfocitos T para atacar células cancerosas.

En una realización la invención se refiere por lo tanto a la inmunoterapia del cáncer y enfoques que implican la transferencia celular adoptiva, que abarca respuestas citotóxicas basadas en linfocitos NK para atacar células cancerosas.

La presente invención abarca el uso de las MSC como medicamento y/o el uso de las MSC como adyuvante para terapias inmunitarias antitumorales, preferentemente las descritas en el presente documento. Un "adyuvante" se refiere normalmente a un agente farmacológico o inmunitario que modifica el efecto de otros agentes. En la presente invención, el adyuvante (MSC) conduce preferentemente a un efecto mejorado de la terapia inmunitaria antitumoral, que se puede medir en comparación con cuando no se aplica adyuvante de MSC. Los ensayos adecuados se divulgan en los ejemplos siguientes.

En la presente invención, la inmunoterapia antitumoral para administración combinada comprende la administración de células inmunitarias. Dichas terapias implican la administración de células inmunitarias a un paciente con tumor que da como resultado una respuesta inmunitaria mejorada contra el tumor, ya sea debido a la actividad antitumoral directa de las células administradas o debido a su actividad inmunomoduladora que conduce a la activación de células inmunitarias endógenas. De acuerdo con la presente invención, la coadministración de MSC modificadas o no modificadas genéticamente aumenta esta actividad antitumoral de las células inmunitarias transferidas.

Una limitación crucial en el desarrollo exitoso y el uso clínico de las inmunoterapias, en particular de las terapias celulares, es la capacidad de los tumores para evadir y suprimir una respuesta inmunitaria contra las células tumorales mediante el establecimiento de un microambiente tumoral inmunosupresor. Este fenómeno se conoce como inmunosupresión mediada por tumores y está mediada en gran medida por la secreción de citocinas antiinflamatorias por células inmunitarias presentes en el tumor que muestran un fenotipo regulador (por ejemplo, linfocitos T reguladores, Treg; y células supresoras derivadas de monocitos, MDSC; y macrófagos asociados a tumores, TAM). Por lo tanto, la invención proporciona medios para modificar el microambiente tumoral, utilizando MSC como se describe en el presente documento para proporcionar un impulso de activación a las células inmunitarias, en particular los linfocitos CAR-T dirigidos contra el tejido tumoral.

En otra realización preferida de la presente invención, las células inmunitarias para la administración combinada son linfocitos T. Los linfocitos T desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células y pueden tener funciones citotóxicas así como inmunomoduladoras y mediante la formación de linfocitos T de memoria pueden conferir protección a largo plazo. Los linfocitos T desempeñan un papel fundamental en las respuestas inmunitarias antitumorales. De acuerdo con la presente invención, la administración combinada de MSC y linfocitos T conduce a una actividad antitumoral mejorada de los linfocitos T administrados.

En otras realizaciones, la célula inmunitaria es un linfocito T que comprende un receptor de linfocitos T artificial, tal como un receptor de antígeno quimérico (CAR-T), en donde dicho receptor de linfocitos T se une específicamente a un antígeno tumoral (Lee, DW et al., Clin Cancer Res; 2012; 18(10); 2780-90). En otra realización los linfocitos T son linfocitos T expandidos ex vivo o linfocitos T con TCR transgénico.

En otra realización preferida de la presente invención, las células inmunitarias para la administración combinada son linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T), en donde dicho receptor de linfocitos T se une específicamente a un antígeno asociado al tumor. La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que las MSC humanas pueden mejorar la actividad de los linfocitos CAR-T (Fig. 3-5), a pesar del hecho de que se considera que las MSC suprimen la proliferación de los linfocitos T nativos. Al contrario de lo que cabría esperar de lo publicado en bibliografía, las MSC humanas promueven la proliferación de CAR-T en cultivo, mejoran su supervivencia y aumentan la actividad antitumoral. La invención se refiere a la aplicación de MSC humanas para mejorar la actividad antitumoral de los linfocitos CAR-T con el objetivo de mejorar el tratamiento de tumores sólidos.

Fue completamente sorprendente que la administración combinada de tales linfocitos CAR-T junto con MSC genéticamente no modificadas mostrara un efecto terapéutico mejorado respecto al tratamiento con linfocitos CAR-T solo. Esto muestra que la presente invención permite la estimulación de CAR-T implicados en una respuesta inmunitaria antitumoral y de este modo en la activación local, la promoción y/o el fortalecimiento de una respuesta inmunitaria antitumoral. Adicionalmente, las propiedades únicas de las MSC conducen a una mejora mantenida de la respuesta inmunitaria con CAR-T para un efecto terapéutico mejorado y prolongado.

En una realización, las MSC como se describen en el presente documento se pueden administrar antes, después o al mismo tiempo que el tratamiento con linfocitos CAR-T para modificar y hacer que el microambiente tumoral sea favorable al tratamiento con CAR-T. Son posibles transferencias únicas o múltiples de MSC.

En otra realización de la presente invención, las células inmunitarias para la administración combinada son células dendríticas. Las células dendríticas son las células presentadoras de antígenos profesionales del sistema inmunitario innato que tienen el potencial de generar respuestas inmunitarias sólidas de los linfocitos T específicas de antígeno. Las estrategias inmunoterapéuticas han intentado monopolizar esta capacidad de las células dendríticas para administrar antígenos como medio de vacunación terapéutica en individuos con neoplasias malignas avanzadas, específicamente cáncer. La administración combinada de células dendríticas terapéuticas junto con MSC optimizará las vacunas de células dendríticas con el fin de mejorar las respuestas antitumorales en pacientes con cáncer.

En otra realización de la invención, las células inmunitarias para la administración combinada no son células dendríticas y/o no comprenden células dendríticas.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere a la administración de macrófagos y/o monocitos como inmunoterapia antitumoral en combinación con células madre mesenquimatosas. Los monocitos y macrófagos a menudo se encuentran muy próximos o dentro de masas tumorales y forman el principal infiltrado leucocítico dentro del estroma de muchos tipos de tumores. Están involucrados tanto en procesos pro-tumorales (por ejemplo, promoción del crecimiento y metástasis a través de la angiogénesis tumoral) como en procesos antitumorales (tumoricida y tumorostático) y dan forma de manera crítica al estado inmunológico del microambiente tumoral. La transferencia adoptiva de monocitos y/o macrófagos, que pueden pretratarse mediante estimulación externa o modificación genética para inducir una actividad antitumoral deseada, se ha sugerido como inmunoterapia antitumoral. En una realización preferida, los macrófagos administrados son macrófagos M1. La presente invención se refiere a la administración combinada de dichas células inmunitarias junto con las MSC para mejorar aún más la respuesta inmunitaria antitumoral.

En otra realización preferida de la presente invención, las células inmunitarias para la administración combinada son células linfoides innatas, preferentemente linfocitos NK. Las células linfoides innatas son un grupo de células inmunitarias innatas que pertenecen al linaje linfoide pero que no responden de una manera específica de antígeno e incluyen también los linfocitos NK naturales. Los linfocitos NK desempeñan un papel importante en la vigilancia de tumores y pueden usarse para tratar pacientes con tumores mediante transferencia adoptiva. Se cree que la administración combinada de MSC y células linfoides innatas, preferentemente, los linfocitos NK, conduce a una actividad antitumoral mejorada en comparación con el tratamiento con células linfoides innatas solas. Las células linfoides innatas pueden estar modificadas o no modificadas genéticamente y pueden experimentar estimulación externa antes de la transferencia para inducir un fenotipo favorable.

En otra realización preferida de la presente invención, las células inmunitarias para la administración combinada son granulocitos. Se sabe que los granulocitos, que incluyen neutrófilos, eosinófilos, basófilos y mastocitos, están implicados en la orquestación de una respuesta inmunitaria antitumoral. Se ha demostrado que la transferencia adoptiva de granulocitos, especialmente eosinófilos, mejora la respuesta inmunitaria contra los tumores al mejorar la actividad de los linfocitos T citotóxicos contra las células tumorales. Por tanto, la presente invención se refiere a la administración combinada de MSC y granulocitos que conduce a una actividad antitumoral mejorada de los granulocitos. Los granulocitos transferidos pueden estar modificados o no modificados genéticamente y pueden experimentar estimulación externa antes de la transferencia para inducir un fenotipo favorable.

En una realización de la presente invención, las células madre mesenquimatosas y/o las células inmunitarias para la administración combinada son autólogas del sujeto del tratamiento médico. La administración de células autólogas es ventajosa porque el rechazo de los linfocitos transferidos es muy raro debido a que el donante y el receptor son el mismo individuo y porque no puede desarrollarse la enfermedad injerto contra huésped.

En otra realización de la presente invención, las células madre mesenquimatosas y/o las células inmunitarias para la administración combinada son alogénicas del sujeto del tratamiento médico. El trasplante alogénico se ha establecido para la terapia celular y permite elegir, obtener y administrar preparaciones pre-preparadas o comerciales de células terapéuticas sin tener que obtener, cultivar y expandir células antes de la administración al paciente. El riesgo de rechazo del material alogénico administrado puede evaluarse utilizando técnicas comunes, por ejemplo, evaluando la compatibilidad HLA entre donante y receptor.

En otra realización preferida de la presente invención, la inmunoterapia antitumoral para administración combinada comprende el tratamiento con un anticuerpo, citocina, quimiocina u otro biofármaco. Una inmunoterapia exitosa de un tumor establecido se basa normalmente no solo en la generación de inmunidad sistémica sino también en la superación de la inmunosupresión en el sitio del tumor. Por ejemplo, el bloqueo de la vía B7-H1/PD-1 por anticuerpos monoclonales modula de forma selectiva y eficaz las respuestas inmunitarias en el sitio del tumor. Esta especificidad se debe en gran parte a la inducción y expresión selectivas de B7-H1 en el microambiente tumoral. Esta selectividad no solo permite un aumento más "dirigido" de la respuesta inmunitaria, sino que también evita las consecuencias de una toxicidad autoinmunitaria sistémica amplia. Este tipo de tratamiento con un biofármaco se puede combinar con la administración de MSC, que migran al tumor e inducen cambios en el microambiente tumoral, apoyando la inducción de una potente respuesta inmunitaria antitumoral por parte de las células inmunitarias endógenas e induciendo un efecto sinérgico.

En otra realización preferida de la presente invención, la inmunoterapia antitumoral para administración combinada comprende el tratamiento con una molécula pequeña, la cual tiene funciones inmunomoduladoras. La modulación del sistema inmunitario a través de un enfoque de molécula pequeña ofrece varias ventajas únicas que son complementarias y potencialmente sinérgicas con los enfoques biológicos o celulares. Se ha demostrado que tales moléculas inhiben directamente la señalización iniciada por los respectivos ligandos que se unen a sus receptores, para reclutar anticuerpos y otras moléculas inmunomoduladoras, o para promover o inhibir la proliferación de diferentes células inmunitarias para dirigirse a tipos específicos de células cancerosas. El tratamiento combinado de pacientes con tumores mediante la administración de tales moléculas junto con la transferencia de MSC podría producir efectos sorprendentes a través de la sinergia de estos dos agentes de tratamiento.

En otra realización preferida de la presente invención, la inmunoterapia antitumoral para administración combinada comprende la administración de linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde dicho receptor de linfocitos T se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor, y las células madre mesenquimatosas no están modificadas genéticamente.

Descripción detallada de la invención

La principal respuesta del sistema inmunitario a los tumores es destruir las células anormales utilizando linfocitos T citolíticos, a veces con la ayuda de linfocitos T colaboradores. Sin embargo, la mayoría de los tumores liberan productos que inhiben la respuesta inmunitaria por diversos medios y crean un entorno que generalmente contrarresta la activación de los linfocitos T. La presente invención proporciona medios para apoyar una reacción inmunitaria antitumoral en dicho entorno mediante el uso de las MSC como se divulga en el presente documento.

La invención se caracteriza por el sorprendente hallazgo de que las MSC muestran propiedades adyuvantes estimulantes con respecto a una inmunoterapia antitumoral combinada. En particular, las MSC de la invención sin transgenes que expresen citocinas inmunoestimulantes u otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como las que inducen una respuesta inmunitaria independiente de antígeno, conducen a una eficacia mejorada de los linfocitos CAR-T dirigidos contra el material canceroso.

La respuesta a patógenos o tejido canceroso está orquestada por interacciones y actividades complejas de un gran número de diversos tipos de células implicadas en una respuesta inmunitaria. Las células inmunitarias, como se usan en el presente documento, pueden referirse a cualquiera de los siguientes tipos de células, como se describe en el contexto de los siguientes procesos: La respuesta inmunitaria innata es la primera línea de defensa y ocurre poco después de la exposición a patógenos o exposición a materia "extraña" o cancerosa. Lo llevan a cabo células fagocíticas tales como neutrófilos y macrófagos, linfocitos citolíticos naturales (NK) y granulocitos. La subsiguiente respuesta inmunitaria adaptativa incluye mecanismos de defensa específicos de antígeno y puede tardar días en desarrollarse. Los tipos de células con funciones críticas en la inmunidad adaptativa son las células presentadoras de antígenos, incluidos los macrófagos y las células dendríticas. La estimulación dependiente de antígeno de varios tipos de células, incluidos los subconjuntos de linfocitos T y linfocitos B, desempeña un papel fundamental en la defensa del hospedador.

Células inmunitarias:

Las células inmunitarias, como se describe en el presente documento, se refieren a células biológicas implicadas en la respuesta inmunitaria en un sujeto. Las células inmunitarias se seleccionan preferentemente de linfocitos T, linfocitos B, células dendríticas, granulocitos, linfocitos linfoides innatos (ILC), megacariocitos, monocitos/macrófagos, linfocitos citolíticos naturales (NK), plaquetas, eritrocitos (RBC) y/o timocitos.

Las células T o linfocitos T son un tipo de linfocitos (un subtipo de leucocitos) que juegan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como los linfocitos B y los linfocitos citolíticos naturales, por la presencia de un receptor de linfocitos T en la superficie celular. Los diferentes subconjuntos de los linfocitos T tienen cada uno de ellos una función diferente. Los subtipos de linfocitos T incluyen, sin limitación, linfocitos T colaboradores tipo 1 (Th1), linfocitos T colaboradores tipo 2 (Th2), linfocitos T colaboradores tipo 9 (Th9), linfocitos T colaboradores tipo 17 (Th17), linfocitos T colaboradores tipo 22 (Th22), linfocitos T colaboradores foliculares (Thf), linfocitos T reguladores (Treg), linfocitos T citolíticos naturales (NKT), linfocitos T gamma delta, linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL). Otras realizaciones no limitantes de linfocitos T incluyen timocitos, linfocitos T inmaduros, linfocitos T maduros, linfocitos T en reposo, linfocitos citolíticos inducidos por citocinas (linfocitos CIK) o linfocitos T activados. Los linfocitos citolíticos inducidos por citocinas (CIK) son normalmente linfocitos T similares a los linfocitos citolíticos naturales (NK) CD3 y CD56 positivo, no restringidos por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). El linfocito T puede ser un linfocito T CD4+, un linfocito T citotóxico (CTL; linfocito T CD8+), linfocito T CD4+CD8+, linfocito T CD4 CD8, o cualquier otro subconjunto de linfocitos T.

Receptores antigénicos quiméricos (CAR) y linfocitos CAR-T:

Un linfocito T puede modificarse con una especificidad definida mediante receptores de linfocitos T artificiales (también conocidos como receptores de linfocitos T quiméricos, inmunorreceptores quiméricos, receptores de antígenos quiméricos (CAR)) los cuales son moléculas compuestas y que tienen injertada una especificidad arbitraria de una célula efectora inmunitaria y que activan la célula modificada tras la interacción con la diana afín. Normalmente, estos receptores se usan para injertar la especificidad de un anticuerpo monoclonal en un linfocito T unido a un dominio de señalización intracelular para la activación.

Los linfocitos T genéticamente modificados se pueden crear infectando las células del paciente con un retro o lentivirus que codifica un receptor de linfocitos T (TCR) o un CAR que es específico para reconocer antígenos tumorales. Una vez que el linfocito T se une a su antígeno diana, las moléculas estimulantes proporcionan las señales necesarias para que el linfocito T se vuelva completamente activo. En este estado completamente activo, los linfocitos T pueden proliferar de manera más efectiva y pueden atacar a las células cancerosas.

Por ejemplo, cuando se reintroducen en pacientes después de un trasplante de células autólogas, los linfocitos T modificados con el CAR de la invención como se describe en el presente documento pueden reconocer y destruir células tumorales. los linfocitos CIK pueden tener una actividad citotóxica mejorada en comparación con otros linfocitos T y, por lo tanto, representan una realización preferida de una célula inmunitaria de la presente invención. Como entendería el experto, también se pueden usar otras células como células efectoras inmunitarias con los CAR como se describe en el presente documento. En particular, las células efectoras inmunitarias también incluyen linfocitos NK, linfocitos NKT, neutrófilos y macrófagos. Las células efectoras inmunitarias también incluyen las progenitoras de células efectoras en donde dichas células progenitoras pueden inducirse a diferenciarse en células efectoras inmunitarias in vivo o in vitro.

La administración combinada de las MSC, con o sin modificación genética, con células inmunitarias, preferentemente linfocitos T con o sin modificación genética, tales como los descritos en el presente documento, conduce a un efecto sinérgico con respecto a la actividad anticancerosa.

Los CAR se componen normalmente de un ectodominio extracelular derivado de un anticuerpo y un endodominio que comprende módulos de señalización derivados de proteínas de señalización de linfocitos T. En una realización preferida, el ectodominio comprende preferentemente regiones variables de las cadenas pesada y ligera de una inmunoglobulina configuradas como un fragmento variable monocatenario (scFv). El scFv se une preferentemente a una región de bisagra que proporciona flexibilidad y transduce señales a través de un resto transmembrana de anclaje a un dominio de señalización intracelular. Los dominios transmembrana se originan preferentemente a partir de CD8a o CD28. En la primera generación de CAR, el dominio de señalización consiste en la cadena zeta del complejo TCR. El término "generación" se refiere a la estructura de los dominios de señalización intracelular. Los CAR de segunda generación están equipados con un único dominio coestimulador procedentes de CD28 o 4-1BB. Los CAR de tercera generación ya incluyen dos dominios coestimuladores, p. ej., CD28, 4-1 BB, ICOS u OX40, CD3 zeta.

En diversas realizaciones, se proporcionan receptores modificados genéticamente que redirigen la citotoxicidad de las células efectoras inmunitarias hacia las células cancerosas. Estos receptores modificados genéticamente se denominan en este documento receptores de antígenos quiméricos (CAR). Los CAR son moléculas que combinan la especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, un antígeno asociado a un tumor) con un dominio intracelular que activa el receptor de linfocitos T para generar una proteína quimérica que presenta una actividad inmunitaria celular anti-BCMA específica. Como se utiliza en el presente documento, el término, "quimérico", describe su composición en partes de diferentes proteínas o ADN de diferentes orígenes.

Los CAR contemplados en el presente documento, comprenden un dominio extracelular (también denominado dominio de unión o dominio de unión a antígeno) que se une a un antígeno asociado a tumores, un dominio transmembrana y un dominio intracelular o dominio de señalización intracelular. La interacción del dominio de unión a antígeno anti-BCMA del CAR con el BCMA en la superficie de una célula diana da como resultado el agrupamiento del CAR y la liberación de un estímulo de activación a la célula que contiene CAR. La principal característica de los CAR es su capacidad para redirigir la especificidad de las células efectoras inmunitarias, desencadenando de este modo la proliferación, producción de citocinas, fagocitosis o producción de moléculas que pueden mediar en la muerte celular de la célula que expresa el antígeno diana de una manera independiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), explotando las capacidades de direccionamiento específicas de células de anticuerpos monoclonales, ligandos solubles o co-receptores específicos de células.

En diversas realizaciones, un CAR comprende un dominio de unión extracelular que comprende un dominio de unión específico de antígeno tumoral humanizado; un dominio transmembrana; uno o más dominios de señalización intracelular. En realizaciones particulares, un CAR comprende un dominio de unión extracelular que comprende un fragmento de unión a antígeno de un anti-antígeno tumoral humanizado del mismo; uno o más dominios espaciadores; un dominio transmembrana; uno o más dominios de señalización intracelular.

El "dominio de unión a antígeno extracelular" o "dominio de unión extracelular" proporciona un CAR con la capacidad de unirse específicamente al antígeno diana de interés. El dominio de unión puede proceder de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. Se prefieren los dominios scFV.

"Unión específica" es como entendería un experto en la materia, por lo que el experto en la materia sabe perfectamente que pueden usarse varios procedimientos experimentales para probar la unión y la especificidad de la unión. Los métodos para determinar las constantes de asociación en equilibrio o disociación en equilibrio se conocen en la técnica. En muchas interacciones proteína-proteína puede ser inevitable alguna reacción cruzada o unión inespecífica; esto no resta valor a la "especificidad" de la unión entre CAR y epítopo. "Unión específica" describe la unión de un anticuerpo anti-antígeno tumoral o un fragmento de unión a antígeno del mismo (o un CAR que lo comprende) a un antígeno tumoral con mayor afinidad de unión que la unión inespecífica. La expresión "dirigido contra" también es aplicable cuando se considera el término "especificidad" para comprender la interacción entre el anticuerpo y el epítopo.

Un "antígeno (Ag)" se refiere a un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de linfocitos T en un animal. En realizaciones particulares, el antígeno diana es un antígeno asociado a tumores, en otras palabras, un epítopo de un polipéptido expresado predominantemente en células tumorales. Un "epítopo" se refiere a la región de un antígeno a la que se une un agente de unión. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína.

Los fragmentos de anticuerpos "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica y en una orientación (p. ej., VL-VH o VH-VL). Generalmente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. En realizaciones preferidas, un CAR contemplado en el presente documento comprende un dominio de unión específico de antígeno que es un scFv y puede ser un scFv murino, humano o humanizado. Los anticuerpos de cadena sencilla pueden clonarse a partir de los genes de la región V de un hibridoma específico para una diana deseada. En realizaciones particulares, el dominio de unión específico de antígeno que es un scFv humanizado que se une a un polipéptido de antígeno tumoral humano.

Células inmunitarias: para terapia celular:

Las células dendríticas (CD) son células presentadoras de antígenos del sistema inmunológico de los mamíferos. Su función principal es procesar el material antigénico y presentarlo en la superficie celular a los linfocitos T del sistema inmunitario. Actúan como mensajeros entre los sistemas inmunitarios innato y adaptativo. Las células dendríticas están presentes en aquellos tejidos que están en contacto con el entorno externo, tal como la piel (donde hay un tipo de célula dendrítica especializada llamada célula de Langerhans) y el revestimiento interno de la nariz, pulmones, estómago e intestinos. También se pueden encontrar en estado inmaduro en la sangre. Una vez activadas, migran a los ganglios linfáticos donde interactúan con los linfocitos T y los linfocitos B para iniciar y dar forma a la respuesta inmunitaria adaptativa. Debido a sus propiedades, las células dendríticas se han convertido en los agentes naturales para la administración de antígenos y se han desarrollado estrategias de vacunación en las que intervienen las CD. El objetivo de la vacunación con CD es inducir linfocitos T efectores específicos del tumor que puedan reducir la masa tumoral específicamente y que puedan inducir la memoria inmunológica para controlar la recidiva del tumor. En este proceso, la primera etapa es proporcionar CD con antígenos específicos de tumores. Esto se puede lograr cultivando CD ex vivo que se han obtenido de pacientes con un adyuvante (que induce la maduración de las CD) y el antígeno específico del tumor, y a continuación inyectando estas células nuevamente en el paciente, o induciendo a las CD a incorporar el antígeno específico de tumores in vivo. Para mejorar el uso terapéutico de las estrategias de vacunación con Cd , se prevé la coadministración de CD junto con MSC de acuerdo con la presente invención.

Los monocitos son un tipo de glóbulos blancos (leucocitos). Son los más grandes de todos los leucocitos. Son parte del sistema inmunitario innato de los vertebrados, incluidos todos los mamíferos (incluidos los seres humanos). Los monocitos se producen en la médula ósea a partir de precursores denominados monoblastos, células bipotentes que se diferencian a partir de las células madre hematopoyéticas. Los monocitos circulan en el torrente sanguíneo durante aproximadamente uno a tres días y a continuación generalmente se mueven hacia los tejidos de todo el cuerpo. Constituyen entre el tres y el ocho por ciento de los leucocitos en la sangre. En los tejidos, los monocitos maduran en diferentes tipos de macrófagos en diferentes ubicaciones anatómicas.

Los macrófagos, denominados en ocasiones macrofagocitos, son células producidas por la diferenciación de monocitos en los tejidos. Los monocitos y los macrófagos son fagocitos. Los macrófagos funcionan tanto en la defensa no específica (inmunidad innata) como en la puesta en marcha de mecanismos de defensa específicos (inmunidad adaptativa) de los animales vertebrados. Los macrófagos que expresan predominantemente el fenotipo citolítico se denominan macrófagos M1, mientras que los que participan en la reparación de tejidos se denominan macrófagos M2. El papel de los macrófagos es fagocitar, o engullir y a continuación digerir, restos celulares y patógenos, ya sea como células estacionarias o móviles. También estimulan a los linfocitos y otras células inmunitarias para que respondan a los patógenos (Palucka K et al. Nat Rev Cancer. 2012 Mar 22;12(4): 265-77. doi: 10.1038/nrc3258). Son células fagocíticas especializadas que atacan sustancias extrañas, microbios infecciosos y células cancerosas mediante destrucción e ingestión.

Las células linfoides innatas (ILC) son un grupo de células inmunitarias innatas que pertenecen al linaje linfoide (linfocitos) pero que no responden de una manera específica de antígeno, ya que carecen de un receptor de linfocitos B o T. Este grupo de células descrito relativamente recientemente tiene diferentes funciones fisiológicas, algunas de ellas análogas a las de los linfocitos T colaboradores, aunque también incluyen los linfocitos NK citotóxicos. En consecuencia, tienen un papel importante en la inmunidad protectora y la regulación de la homeostasis y la inflamación. Los linfocitos citolíticos naturales (NK) son células efectoras innatas citotóxicas análogas a los linfocitos T citotóxicos del sistema inmunitario adaptativo. Se distribuyen por la sangre, los órganos y el tejido linfoide y constituyen alrededor del 15 % de los linfocitos de sangre periférica. Los linfocitos NK desempeñan un papel en la vigilancia de tumores y la rápida eliminación de células infectadas por virus. No requieren la señal "propia" del MHC Clase I que falta y pueden reconocer células estresadas en ausencia de anticuerpos, lo que les permite reaccionar mucho más rápidamente que el sistema inmunitario adaptativo. Los linfocitos citolíticos naturales (NK) desempeñan un papel fundamental en la inmunidad del hospedador contra el cáncer. En respuesta, los cánceres desarrollan mecanismos para escapar del ataque de los linfocitos NK o inducir linfocitos NK defectuosos (Cheng M et al. Cell Mol Immunol. 2013 May;10(3): 230­ 52. doi: 10.1038/cmi.2013.10. Epub 22 de abril de 2013). La inmunoterapia contra el cáncer actual basada en linfocitos NK tiene como objetivo superar la parálisis de los linfocitos NK utilizando varios enfoques y la administración combinada de MSC podría ayudar a que las terapias a base de linfocitos NK sean más efectivas.

Los granulocitos son una categoría de glóbulos blancos caracterizados por la presencia de gránulos en su citoplasma que abarcan neutrófilos, eosinófilos, basófilos y mastocitos.

Inmunoterapia

Como se utiliza en el presente documento, "inmunoterapia" comprende cualquier tipo de enfoque o tratamiento terapéutico dirigido contra un tumor que emplea medios del sistema inmunitario para anular o destruir el material tumoral. Esto incluye, sin limitación, moduladores de puntos de control inmunitario, terapias con células inmunitarias, transferencia adoptiva de células inmunitarias u otras células que modulan la respuesta inmunitaria, modulación de las células inmunitarias por moléculas pequeñas o biofármacos tales como anticuerpos monoclonales, citocinas, quimiocinas y vacunas para el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, debe entenderse que la inmunoterapia en el contexto de la presente invención abarca un agente terapéutico que usa el sistema inmunitario para tratar el cáncer.

La inmunoterapia abarca, sin limitación, la terapia celular, con biofármacos y con anticuerpos, así como el uso de moléculas pequeñas que inducen una modificación de la respuesta inmunitaria a los tumores.

Las terapias celulares implican normalmente la administración de células inmunitarias aisladas de la sangre o de un tumor del paciente. Las células inmunitarias dirigidas hacia el tumor a tratar se activan, cultivan y devuelven al paciente donde las células inmunitarias atacan el cáncer. Los tipos de células que se pueden usar de esta manera son, sin limitación, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos citolíticos activados por linfocina, linfocitos T citotóxicos, monocitos, macrófagos, granulocitos y células dendríticas. La terapia con células dendríticas provoca respuestas antitumorales al hacer que las células dendríticas presenten antígenos tumorales. Las células dendríticas presentan antígenos a los linfocitos, lo que los activa, induciéndoles a destruir a otras células que presentan el antígeno.

Un enfoque de estos intentos previos de inmunoterapia implica modificar células inmunitarias del propio paciente para que reconozcan y ataquen sus tumores. Y aunque este enfoque, denominado transferencia celular adoptiva (ACT), hasta la fecha se ha limitado a ensayos clínicos, los tratamientos que utilizan estas células inmunitarias modificadas han generado respuestas terapéuticas en pacientes con cáncer avanzado.

La presente invención abarca la transferencia celular adoptiva en combinación con la administración de las MSC descritas en el presente documento. Queda abarcado en la invención que la administración de MSC antes o simultáneamente con las células inmunitarias (por ejemplo, CAR-T) mejorará la actividad antitumoral de las los CAR-T, linfocitos T con TCR transgénicos, linfocitos T expandidos in vitro u otras células efectoras inmunitarias administradas durante la transferencia celular adoptiva. La presencia de las MSC mejorará la activación de los linfocitos T solo localmente, preferentemente dentro o cerca del tumor, y posteriormente conducirá a un fenotipo de célula efectora de memoria, prolongando de esta forma el efecto terapéutico del tratamiento.

La transferencia celular adoptiva usa respuestas citotóxicas basadas en linfocitos T para atacar a las células cancerosas. Los linfocitos T que tienen una reactividad natural o genéticamente modificada al cáncer de un paciente se generan in vitro y a continuación se transfieren de nuevo al paciente con cáncer. Los linfocitos infiltrantes de tumores autólogos se han utilizado como un tratamiento eficaz para pacientes con melanoma metastásico. Esto se puede lograr tomando linfocitos T que se encuentran con el tumor del paciente, que están entrenados para atacar las células malignas. Estos linfocitos T pueden denominarse linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Tales linfocitos T también pueden ser estimulados por la presencia de MSC in vivo.

La presente invención proporciona nuevos medios para la estimulación local y localizada en tejido de una respuesta inmunitaria antitumoral, mediada preferentemente por TIL, linfocitos T citotóxicos modificados o naturales y/o linfocitos NK.

Los biofármacos, también conocidos como productos farmacéuticos biológicos, productos biológicos o biológicos, son cualquier producto farmacéutico fabricado, extraído o semisintetizado de fuentes biológicas. Incluyen sin limitación vacunas, sangre o componentes de la sangre, y proteínas terapéuticas recombinantes tales como anticuerpos, citocinas, quimiocinas y proteínas de fusión. Los biofármacos pueden estar compuestos de azúcares, proteínas o ácidos nucleicos o combinaciones complejas de estas sustancias. Se aíslan de fuentes naturales, incluyendo seres humanos, animales o microorganismos.

Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmunitario que se unen a un antígeno diana en la superficie celular. Los que se unen a los antígenos del cáncer pueden usarse para tratar el cáncer. Las MSC de la presente invención son capaces de promover y/o mejorar las inmunoterapias basadas en células o anticuerpos gracias a sus propiedades únicas derivadas de las propiedades inherentes de las MSC.

La expresión "molécula pequeña" se refiere a un compuesto orgánico de bajo peso molecular (<900 daltons) que puede ayudar a regular un proceso biológico. La modulación del sistema inmunitario a través de un enfoque de molécula pequeña ofrece varias ventajas únicas que son complementarias y potencialmente sinérgicas con, otras inmunoterapias. Las moléculas pequeñas pueden actuar como antagonistas de los receptores de superficie ligados a enzimas y los receptores que interactúan con el microambiente tumoral, o incluso inhibir enzimas metabólicas. Se ha demostrado que tales moléculas inhiben directamente la señalización iniciada por los respectivos ligandos que se unen a sus receptores, para reclutar anticuerpos y otras moléculas inmunomoduladoras, o para promover o inhibir la proliferación de diferentes células inmunitarias para dirigirse a tipos específicos de células cancerosas.

Dichos modificadores de la respuesta inmunitaria incluyen, por ejemplo, imiquimod, moléculas de reclutamiento de anticuerpos dirigidas al cáncer de próstata, antagonistas del receptor de integrina, inhibidores de la indolamina-2,3-dioxigenasa, emodina, antagonistas de RORyt, antagonistas del receptor de efrina, inhibidores de la anhidrasa carbónica IX unida a membrana (CAIX), e inhibidores de proteína cinasa seleccionados como se describe por lyver VV (Anticancer Agents Med Chem. 2015;15(4):433-52.).

Tratamiento:

El sujeto o paciente, tal como el sujeto que necesita tratamiento o prevención, puede ser un animal, un animal vertebrado, un mamífero, un roedor (por ejemplo, una cobaya, un hámster, una rata, un ratón), un murino (por ejemplo, un ratón), un canino (por ejemplo, un perro), un felino (por ejemplo, un gato), un equino (por ejemplo, un caballo), un primate, un simio (por ejemplo, un mono o un homínido), un mono (por ejemplo, un tití, un babuino), un homínido (por ejemplo, gorila, chimpancé, orangután, gibón), o un ser humano. El significado de los términos "animal", "mamífero", etc. es bien conocido en la técnica y puede, por ejemplo, deducirse de Wehner und Gehring (1995; Thieme Verlag). En el contexto de la presente invención, se prevé particularmente que deban tratarse animales que sean económica, agronómica o científicamente importantes. Preferentemente, el sujeto/paciente es un mamífero. Más preferentemente, el sujeto/paciente es un ser humano.

El cáncer comprende un grupo de enfermedades que pueden afectar a cualquier parte del cuerpo y es causado por el crecimiento y la proliferación anormal de células. Estas células en proliferación tienen el potencial de invadir el tejido circundante y/o diseminarse a otras partes del cuerpo donde forman metástasis. A nivel mundial, se produjeron 14 millones de nuevos casos de cáncer y 8,2 millones de muertes relacionadas con el cáncer en 2012 (Informe mundial sobre el cáncer 2014). La mayoría de los cánceres son causados por señales ambientales que implican el consumo de tabaco, la obesidad y las infecciones, entre otros, mientras que alrededor del 5-10 % son casos genéticos. Los cánceres se pueden clasificar en subcategorías según la célula de origen. Las subcategorías más comunes son los carcinomas de células epiteliales, sarcomas de tejido conjuntivo y linfomas y leucemias de células hematopoyéticas. El cáncer se asocia con una gran variedad de síntomas locales y sistémicos y no se puede curar en muchos casos. A la luz del elevado número de nuevos pacientes con cáncer y de las muertes relacionadas con el cáncer, se requieren nuevas estrategias de tratamiento.

El cáncer de acuerdo con la presente invención se refiere a todos los tipos de cáncer o neoplasias o tumores malignos que se encuentran en mamíferos, incluyendo leucemias, sarcomas, melanomas y carcinomas. Se pueden tratar tumores sólidos y/o tumores líquidos (tales como leucemia o linfoma).

Las leucemias incluyen, pero sin limitación, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crónica, leucemia promielocítica aguda, leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto, leucemia aleucémica, leucemia leucocitémica, leucemia basófila, leucemia de citoblastos, leucemia bovina, leucemia mielocítica crónica, leucemia cutis, leucemia embrionaria, leucemia eosinófila, leucemia de Gross, leucemia de células pilosas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia blastocítica, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfógena, leucemia linfoide, leucemia de células de linfosarcoma, leucemia de mastocitos, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia mieloide granulocítica, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia de células plasmáticas, leucemia plasmacítica, leucemia promielocítica, leucemia de células de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia blastocítica, leucemia subleucémica, y leucemia de células no diferenciadas.

Los sarcomas incluyen, pero sin limitación, condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma alveolar de las partes blandas, sarcoma amelobástico, sarcoma botrioide, cloroma sarcoma, coriocarcinoma, sarcoma embrionario, sarcoma del tumor de Wilms, sarcoma endometrial, sarcoma estromal, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiple idiopático, sarcoma inmunoblástico de linfocitos B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de linfocitos T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma cerocístico, sarcoma sinovial y sarcoma telangiectásico.

Los melanomas incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanocítico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, léntigo, melanoma maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungeal, y melanoma de diseminación superficial.

Los carcinomas incluyen, pero sin limitación, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocístico, carcinoma adenoideo quístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de corteza adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloidal, comedocarcinoma, carcinoma endométrico, carcinoma cribiforme, carcinoma en coraza, carcinoma cutáneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma ductal, carcinoma duro, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma exofítico, carcinoma ulcerado, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocellulare, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma de matriz pilosa, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipernefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medullare, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparum, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucosum, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatodes, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células en avena, carcinoma osificante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de células espinosas, carcinoma pultáceo, carcinoma de células renales del riñón, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoides, carcinoma de Schnneider, carcinoma escirroso, carcinoma de escroto, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simple, carcinoma microcítico, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoideas, carcinoma de células en husillo, carcinoma de células fusiformes, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma ganglionar, carcinoma telangiectaticum, carcinoma telangiectodes, carcinoma de células transicionales, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrucoso, y carcinoma velloso.

Los cánceres adicionales incluyen, pero sin limitación, enfermedad de Hodgkin, Linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón microcíticos, tumores cerebrales primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulinoma pancreático maligno, carcinoma maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones cutáneas precancerosas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer de cuello del útero, cáncer de endometrio, cáncer adrenocortical, y cáncer de próstata.

En algunas realizaciones, "tumor" debe incluir, sin limitación, un tumor de próstata, un tumor pancreático, un carcinoma de células escamosas, un tumor de mama, un melanoma, un carcinoma basocelular, un carcinoma hepatocelular, un carcinoma colangiocelular, cáncer testicular, un neuroblastoma, un glioma o un tumor astrocítico maligno tal como glioblastoma multiforme, un tumor colorrectal, un carcinoma endometrial, un carcinoma de pulmón, un tumor de ovario, un tumor cervical, un osteosarcoma, un rabdo/leiomiosarcoma, un sarcoma sinovial, un angiosarcoma, un sarcoma de Ewing/PNET y un linfoma maligno. Estos incluyen tumores primarios, así como tumores metastásicos (tanto vascularizados como no vascularizados).

Células madre mesenguimatosas:

''Las células madre mesenquimatosas" divulgadas en el presente documento son preferentemente células de origen no hematopoyético que residen en la médula ósea y otros tejidos. La identificación y nomenclatura de las MSC ha sido aclarada por el Comité de Células Madre Mesenquimatosas y Tisulares de la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT), quienes han propuesto un conjunto de criterios mínimos para definir las MSC. Normalmente, las m Sc pueden dar origen al tejido conjuntivo, hueso, cartílago y células de los sistemas circulatorio y linfático. Las células madre mesenquimatosas se encuentran en el mesénquima, la parte del mesodermo embrionario que consiste en células no especializadas, fusiformes o estrelladas, poco empaquetadas. Como se utiliza en el presente documento, las células madre mesenquimatosas incluyen, sin limitación, células madre CD34-negativas.

En una realización de la invención, las células madre mesenquimatosas son células adherentes al plástico, definidas en algunas realizaciones como células estromales mesenquimatosas multipotentes y también incluyen células CD34-negativas. Para evitar cualquier duda, la expresión célula madre mesenquimatosa abarca células estromales mesenquimatosas multipotentes que también incluyen una subpoblación de células mesenquimatosas, MSC y sus precursores, cuya subpoblación está compuesta de células de autorrenovación multipotentes o pluripotentes con capacidad de diferenciación en múltiples tipos celulares in vivo.

Como se utiliza en el presente documento, célula CD34 negativa indicará una célula que carece de CD34, o que expresa únicamente niveles insignificantes de CD34, en su superficie. Las células CD34 negativas y los métodos para aislar dichas células, se describen, por ejemplo, en Lange C. et al., "Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine". J. Cell Physiol. 2007, Apr. 25.

Las células madre mesenquimatosas pueden distinguirse de las células madre hematopoyéticas (HSC) por varios indicadores. Por ejemplo, se sabe que las HSC flotan en cultivo y no se adhieren a superficies plásticas. Por el contrario, las células madre mesenquimatosas se adhieren a superficies plásticas. Las células madre mesenquimatosas CD34 negativas de la presente invención son adherentes en cultivo.

Modificación genética

Las MSC o cualquier otra célula terapéutica, tales como las células inmunitarias descritas en el presente documento, pueden modificarse genéticamente para expresar un ácido nucleico exógeno, tal como un transgén, por ejemplo, un producto génico terapéutico de un ácido nucleico exógeno. Como se utiliza en el presente documento, "modificado genéticamente" significará cualquier tipo de célula u organismo que lleve material genético modificado, tal como ácidos nucleicos. Como se utiliza en el presente documento "ácido nucleico" significará cualquier molécula de ácido nucleico, incluyendo, sin limitación, ADN, ARN e híbridos o variantes modificadas de los mismos. Un "ácido nucleico exógeno" o "elemento genético exógeno" se refiere a cualquier ácido nucleico introducido en la célula, que no es un componente del genoma "original" o "natural" de las células. Los ácidos nucleicos exógenos pueden estar integrados o no integrados en el material genético de la célula madre mesenquimatosa diana, o puede referirse a ácidos nucleicos transducidos de forma estable.

El experto en la materia puede determinar la modificación genética de una célula de mamífero utilizando técnicas comúnmente disponibles. Por ejemplo, es posible la secuenciación del genoma o partes del mismo de una célula modificada, identificando de este modo si están presentes ácidos nucleicos exógenos. Como alternativa, se pueden aplicar otras técnicas de biología molecular, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para identificar/amplificar el material genético exógeno. Los ácidos nucleicos exógenos pueden detectarse mediante secuencias de vectores o partes de secuencias de vectores que permanecen en el sitio de modificación genética. En los casos en los que las secuencias de vectores (por ejemplo, las secuencias de vectores que flanquean un transgén terapéutico) pueden eliminarse del genoma, la adición de un transgen terapéutico aún puede detectarse intentando determinar la secuenciación mediante la detección de secuencias genómicas que incorporan un gen terapéutico en una posición "no natural" en el genoma.

Cualquier método de administración génica dado está abarcado por la invención y se refiere preferiblemente a vectores víricos o no víricos, así como métodos bioquímicos o químicos de transfección. Los métodos pueden producir expresión génica estable o transitoria en el sistema usado.

Los virus modificados genéticamente se han aplicado ampliamente para la administración de genes en células madre. En la modificación genética de la presente invención puede emplearse un vector vírico.

Los vectores víricos preferidos para modificación genética de las MSC descritas en el presente documento se refieren a vectores retrovíricos, en particular a vectores retrovíricos gamma. Los retrovirus gamma (a veces mencionados como retrovirus de tipo C de mamífero) es un género hermano al clado de lentivirus, y es un miembro de la subfamilia Orthoretrovirinae de la familia de los retrovirus. El virus de la leucemia murina (MLV o MuLV), el virus de la leucemia felina (FeLV), el virus relacionado con el virus de la leucemia murina xenotrópica (XMRV) y el virus de la leucemia del simio gibón (GALV) son miembros del género de retrovirus gamma. Un experto en la materia conoce las técnicas requeridas para la utilización de retrovirus gamma en la modificación genética de MSC. Por ejemplo, pueden emplearse los vectores descritos por Maetzig et al., (Gammaretroviral vectors: biology, technology and application, 2001, Viruses Jun;3(6):677-713) o vectores similares. Por ejemplo, el virus de la leucemia murina (MLV), un retrovirus gamma simple, puede convertirse en un vehículo eficaz de agentes terapéuticos genéticos en el contexto de la creación de MSC modificadas por retrovirus gamma y la expresión de un transgén terapéutico a partir de dichas MSC después de la administración a un sujeto.

Pueden aplicarse adenovirus, o virus de ARN tales como lentivirus, u otros retrovirus. Los adenovirus se han usado para generar una serie de vectores para ingeniería celular por transferencia génica. La generación inicial de vectores adenovíricos se produjo eliminando el gen EI (requerido para la replicación vírica) que genera un vector con una capacidad de clonación de 4 kb. Una eliminación adicional de E3 (responsable de la respuesta inmunitaria del hospedador) permitió una capacidad de clonación de 8 kb. Se han producido generaciones adicionales que abarcan eliminaciones de E2 y/o E4. Los lentivirus son miembros de la familia de virus Retroviridae (M. Scherr et al., Gene transfer into hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 2002 Feb; 2(1): 45-55). Los vectores lentivíricos se generan por eliminación de la secuencia vírica completa con la excepción de las LTR y las señales de empaquetado de acción en cis. Los vectores resultantes tienen una capacidad de clonación de aproximadamente 8 kb. Una característica distintiva de estos vectores respecto a los vectores retrovíricos es su capacidad de transducir células en división y células que no están en división, así como células diferenciadas de forma terminal.

También pueden emplearse métodos no víricos, tales como estrategias alternativas que incluyen transferencia convencional de plásmidos y la aplicación de integración génica dirigida mediante el uso de tecnologías de integrasa o transposasa. Estas representan estrategias para la transformación con vectores que tienen la ventaja de ser eficaces, y a menudo específicas de sitio en su integración. Los métodos físicos para introducir vectores en células son conocidos para los expertos en la materia. Un ejemplo se refiere a electroporación, que se basa en el uso de impulsos eléctricos breves, de alto voltaje que crean poros transitorios en la membrana superando su capacitancia. Una ventaja de este método es que puede utilizarse para expresión génica tanto estable como transitoria en la mayoría de tipos celulares. Métodos alternativos se refieren al uso de liposomas o dominios de transducción de proteínas. Los métodos apropiados son conocidos para los expertos en la materia y no se entienden como realizaciones limitantes de la presente invención.

La presente invención abarca la transferencia celular adoptiva en combinación con la administración de las MSC descritas en el presente documento. Queda abarcado en la invención que la administración de MSC antes o simultáneamente con las células inmunitarias (por ejemplo, CAR-T) mejorará la actividad antitumoral de las los CAR-T, linfocitos T con TCR transgénicos, linfocitos T expandidos in vitro u otras células efectoras inmunitarias administradas durante la transferencia celular adoptiva. La presencia de las MSC mejorará la activación de los linfocitos T sistémicamente y/o localmente, preferentemente dentro de o en proximidad al tumor, pero también puede conducir a la activación o estimulación de los linfocitos CAR-T antes de la administración en una mezcla de células terapéuticas.

Administración

La presente invención abarca el tratamiento de un paciente introduciendo un número terapéuticamente eficaz de células en el torrente sanguíneo de un sujeto. Como se utiliza en el presente documento, "introducir" células "en el torrente sanguíneo de un sujeto" incluirá, sin limitación, introducir dichas células en una de las venas o arterias del sujeto mediante inyección. Dicha administración también puede realizarse, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados. Se prefiere una única inyección, pero pueden ser necesarias inyecciones repetidas a lo largo del tiempo (por ejemplo, semanalmente, mensualmente, trimestralmente, semestralmente o anualmente) en algunos casos. Dicha administración también se realiza preferiblemente usando una mezcla de células CD34-negativas y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para los expertos en la materia e incluyen, aunque no de forma limitativa, 0,01-0,1 M y preferiblemente 0,05 M de tampón fosfato o solución salina al 0,8 %, así como medios de crioconservación patentados usados habitualmente.

La administración también puede producirse de forma local, por ejemplo, por inyección en una zona del organismo del sujeto en proximidad a un sitio tumoral. Las MSC han demostrado migrar hacia el tejido canceroso. Independientemente, la administración local de las células como se describe en este documento puede dar lugar a niveles elevados de las células en su sitio de acción.

Además, dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones, mucho más preferiblemente soluciones acuosas. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones y suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato y aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reforzadores de líquidos y nutrientes, reforzadores de electrolitos tales como solución de Ringer con dextrosa, los basados en solución de Ringer con dextrosa y similares. Los líquidos usados habitualmente para administración i.v. se encuentran, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a Ed., pág. 808, Lippincott Williams S-Wilkins (2000). También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.

En una realización, se administra un "número terapéuticamente eficaz de células". Esto puede referirse a las MSC de la invención o a una célula inmunitaria terapéutica como la terapia inmunitaria antitumoral combinada. Como se utiliza en el presente documento, un "número terapéuticamente eficaz de células" incluye, sin limitación, las siguientes cantidades e intervalos de cantidades: (i) de aproximadamente 1 x 102 a aproximadamente 1 x 108 células/kg de peso corporal; (ii) de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 107 células/kg de peso corporal; (iii) de aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 106 células/kg de peso corporal; (iv) de aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 105 células/kg de peso corporal; (v) de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 106 células/kg de peso corporal; (vi) de aproximadamente 5 x 104 a aproximadamente 0,5 x 105 células/kg de peso corporal; (vii) aproximadamente 1 x 103 células/kg de peso corporal; (viii) aproximadamente 1 x 104 células/kg de peso corporal; (ix) aproximadamente 5 x 104 células/kg de peso corporal; (x) aproximadamente 1 x 105 células/kg de peso corporal; (xi) aproximadamente 5 x 105 células/kg de peso corporal; (xii) aproximadamente 1 x 106 células/kg de peso corporal; y (xiii) aproximadamente 1 x 107 células/kg de peso corporal. Los pesos corporales humanos previstos incluyen, sin limitación, aproximadamente 5 kg, 10 kg, 15 kg, 30 kg, 50 kg, aproximadamente 60 kg; aproximadamente 70 kg; aproximadamente 80 kg, aproximadamente 90 kg; aproximadamente 100 kg, aproximadamente 120 kg y aproximadamente 150 kg. Estos números se basan en experimentos preclínicos en animales y en ensayos en seres humanos y protocolos convencionales del trasplante de células madre hematopoyéticas CD34+. Las células mononucleares (incluyendo células CD34+) habitualmente contienen entre 1:23000 a 1:300000 células CD34-negativas. Estos números de células pueden aplicarse a las MSC o a la inmunoterapia celular antitumoral.

Como se utiliza en el presente documento, "tratar" a un sujeto que padece un trastorno significará ralentizar, detener o revertir la progresión del trastorno. En la realización preferida, tratar a un sujeto afectado con un trastorno significa revertir la progresión del trastorno, idealmente hasta el punto de eliminar el propio trastorno. Como se utiliza en el presente documento, mejorar un trastorno y tratar un trastorno son equivalentes. El tratamiento de la presente invención puede referirse también, o como alternativa, a la administración profiláctica de dichas células. Dicha administración profiláctica puede referirse a la prevención de cualquier trastorno médico dado, o a la prevención del desarrollo de dicho trastorno, por lo que prevención o profilaxis no debe interpretarse en sentido estricto en todas las situaciones como prevención absoluta. La prevención o profilaxis también puede referirse a una reducción del riesgo de que un sujeto desarrolle cualquier afección médica dada, preferiblemente en un sujeto en riesgo de dicha afección.

El sujeto del que se obtienen las células madre mesenquimatosas y/o las células inmunitarias puede ser el mismo sujeto, al que se pretende administrar las células después del cultivo. Por lo tanto, dichas células pueden considerarse autólogas. Sin embargo, las células pueden obtenerse de un sujeto distinto del paciente previsto, y por lo tanto se consideran alogénicas. Como se utiliza en el presente documento, una célula es "alogénica" con respecto a un sujeto si esta o cualquiera de sus células precursoras son de otro sujeto de la misma especie. Como se utiliza en el presente documento, una célula es "autóloga" con respecto a un sujeto si esta o sus células precursoras son del mismo sujeto. En una realización preferida, las células inmunitarias son autólogas del sujeto de tratamiento médico.

La célula o células descritas en el presente documento pueden comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si tienen que administrarse en forma sólida, líquida o de aerosol, y si tienen que ser estériles para dichas vías de administración como inyección. La presente invención se puede administrar por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada que riega células diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas) o por otro método o cualquier combinación de los anteriores, como sabría un experto en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado en el presente documento por referencia).

Administración combinada:

"Administración combinada" puede referirse a la administración concurrente y/o secuencial de dichas células madre mesenquimatosas antes de, durante y/o después de dicha inmunoterapia (preferentemente tratamiento con linfocitos CAR-T). El tratamiento combinado también incluirá un régimen de tratamiento combinado que comprende múltiples administraciones de cualquiera de los componentes terapéuticos del tratamiento. Se proporcionan en el presente documento realizaciones adicionales de administración combinada.

La administración combinada abarca el tratamiento simultáneo, cotratamiento o tratamiento conjunto, e incluye la administración de formulaciones separadas de MSC con inmunoterapias, tales como inhibidores de puntos de control y/o células inmunitarias, de modo que el tratamiento puede administrarse en el plazo de minutos entre uno y otro, a la misma hora, el mismo día, en la misma semana o en el mismo mes. La administración secuencial de cualquier combinación dada de agentes combinados (por ejemplo, MSC, células inmunitarias y/o inhibidores de puntos de control) también está abarcada por el término "administración combinada". También puede usarse un medicamento de combinación, que comprende una o más de dichas MSC con otro inmunoterapéutico, tales como inhibidores de puntos de control y/o células inmunitarias, para coadministrar los diversos componentes en una sola administración o dosificación.

Una inmunoterapia combinada puede preceder o seguir al tratamiento con MSC, las cuales preferentemente no están modificadas genéticamente, o tienen modificaciones genéticas pero sin ácidos nucleicos exógenos que comprenden regiones que codifican citocinas inmunoestimuladoras, en intervalos que varían de minutos a semanas. En realizaciones donde el otro agente inmunoterapéutico y las MSC se administran por separado en el sitio de interés, habría que asegurarse, en general, de que no pasara un período de tiempo significativo entre el momento de cada administración, de manera que el agente y las MSC aún pudieran ejercer un efecto combinado ventajoso en el sitio de tratamiento. En dichos casos, se contempla poner en contacto la célula con ambas modalidades en aproximadamente 12-24 horas entre sí y, más preferentemente, en aproximadamente 6-12 horas entre sí, prefiriéndose un tiempo de retraso de aproximadamente solo 12 horas. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el período de tiempo para el tratamiento de manera significativa, de forma que, transcurren varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las respectivas administraciones.

Moléculas inmunoestimuladoras y citocinas:

En una realización, la invención se refiere a células madre mesenquimatosas (MSC) para usar en el tratamiento de un tumor y/o como adyuvante para una inmunoterapia antitumoral, en donde dicho tratamiento comprende la administración combinada de dichas células madre mesenquimatosas con una inmunoterapia antitumoral y en donde dichas MSC están o no están modificadas genéticamente.

La expresión "molécula inmunoestimuladora" se refiere a cualquier molécula que induzca una activación o estimulación del sistema inmunitario o cualquier componente o parte del sistema inmunitario. Esta activación puede ser dependiente de antígeno o independiente de antígeno.

Como se utiliza en el presente documento, la activación del sistema inmunitario "dependiente de antígeno" o "específica de antígeno" se refiere a la activación de linfocitos T y B por reconocimiento de antígeno a través de los TCR y BCR, respectivamente, lo que conduce a la activación del sistema inmunitario adaptativo.

Como se utiliza en el presente documento, la activación "independiente del antígeno" del sistema inmunitario se refiere a cualquier tipo de estimulación del sistema inmunitario que no depende de la activación específica de antígeno de los linfocitos T y B. Esto se puede referir a, pero no se limita a, atraer células efectoras inmunitarias, promover la maduración de las células inmunitarias de memoria, inflamación u otra respuesta inmunitaria que no sea específica de antígeno como se menciona en el presente documento. Estas respuestas inmunitarias (o aspectos de las respuestas inmunitarias) se producen independientemente del antígeno particular contra el que la respuesta inmunitaria puede (posteriormente) reaccionar. Como tal, este tipo de activación del sistema inmunitario puede denominarse "independiente de antígeno". Las citocinas son ejemplos de estimuladores o moduladores del sistema inmunitario independientes de antígeno conocidos en el sentido de la presente invención.

En el caso de la estimulación inmunitaria independiente de antígeno, el sistema inmunitario puede llevar a cabo posteriormente o en combinación una o más reacciones dependientes (específicas) de antígeno contra antígenos particulares. Por ejemplo, una estimulación inmunitaria independiente de antígeno conduce a la activación del sistema inmunitario en general (por ejemplo, enriqueciendo las células efectoras), las cuales a continuación se activan para llevar a cabo cualquier respuesta inmunitaria específica de antígeno dada a través de linfocitos T y B activados (por ejemplo, una reacción inmunitaria específica de antígeno posterior o concordante por un linfocito T activado contra un antígeno específico de tumor). Las "moléculas estimulantes que inducen una respuesta inmunitaria independiente de antígeno" pueden, por lo tanto, entenderse como moléculas (tales como citocinas) que comprenden una función estimuladora para una respuesta inmunitaria independiente de antígeno, pero en algunas realizaciones pueden o no comprender también una función estimuladora para una respuesta inmunitaria dependiente de antígeno.

Las citocinas inmunoestimuladoras son una realización de moléculas que inducen una estimulación inmunitaria independiente de antígeno. En este contexto, las citocinas estimulantes de la respuesta inmunitaria pueden atraer células efectoras inmunitarias, tales como linfocitos T, y promover la maduración de las células inmunitarias de memoria. Como alternativa, la estimulación inmunitaria independiente de antígeno puede conducir a afecciones inflamatorias en el sitio de estimulación. Los ejemplos de estas citocinas, sin limitación, son IFN gamma, IL-2, IL-12, IL-23, IL-15 y IL-21.

En el presente documento se divulgan MSC que se administran en combinación con la inmunoterapia antitumoral y están modificadas genéticamente y comprenden un transgén que expresa una proteína citotóxica u otra proteína terapéutica. Puede producirse una respuesta inmunitaria dirigida contra dicho producto proteico citotóxico o terapéutico. Esta reacción inmunitaria se considera una reacción inmunitaria dependiente de antígeno.

En el presente documento se divulgan células madre mesenquimatosas (MSC) para usar en el tratamiento de un tumor, en donde dicho tratamiento comprende la administración combinada de dichas células madre mesenquimatosas con una inmunoterapia antitumoral y en donde dichas MSC están modificadas genéticamente, pero no comprenden ácidos nucleicos exógenos que codifican citocinas estimulantes de la respuesta inmunitaria.

En algunos ejemplos comparativos, las citocinas estimulantes de la respuesta inmunitaria son las moléculas descritas en el documento WO 2016/026854, el cual se incorpora en el presente documento como referencia (incluyendo cualquier contraparte estadounidense).

Tal como se conoce en la técnica, una citocina estimulante de la respuesta inmunitaria debe entenderse como cualquier citocina que conduzca o produzca directa o indirectamente la inducción, activación y/o mejora de una respuesta inmunitaria, preferentemente dirigida contra un antígeno, por ejemplo un antígeno tumoral. En particular, las citocinas estimulantes de la respuesta inmunitaria de la invención se consideran preferentemente citocinas que conducen a la inducción, activación y/o mejora de una respuesta inmunitaria beneficiosa para el tratamiento de una enfermedad tumoral.

La exención de responsabilidad divulgada en el presente documento con respecto a la ausencia de un ácido nucleico exógeno que codifique una citocina moduladora de la respuesta inmunitaria, una citocina asociada a la respuesta inmunitaria o una citocina estimulante de la respuesta inmunitaria puede aplicarse a una o más de las citocinas divulgadas en el presente documento. Los términos "estimulación" y "activación" del "sistema inmunitario" o de una "respuesta inmunitaria" pueden usarse indistintamente.

Citocinas:

Las citocinas son un grupo diverso de proteínas no anticuerpos que actúan como mediadores entre las células. Actualmente, las citocinas se utilizan clínicamente como modificadores de la respuesta biológica para el tratamiento de diversos trastornos. El término citocina es un término general usado para describir un gran grupo de proteínas. Los tipos particulares de citocinas pueden incluir monocinas, en concreto, citocinas producidas por células fagocíticas mononucleares, linfocinas, en concreto citocinas producidas por linfocitos activados, especialmente linfocitos Th, interleucinas, en concreto citocinas que actúan como mediadores entre leucocitos y quimiocinas, en concreto citocinas pequeñas principalmente responsables de la migración de leucocitos. La señalización de citocinas es flexible y puede inducir respuestas tanto protectoras como dañinas. Pueden producir cascadas o aumentar o suprimir la producción de otras citocinas. A pesar de las diversas funciones de las citocinas, un experto en la materia sabe qué citocinas pueden considerarse estimulantes de la respuesta inmunitaria y, por lo tanto, aplicarse en el tratamiento de una enfermedad tumoral como se describe en el presente documento.

Las siguientes citocinas pueden denominarse citocinas estimulantes de la respuesta inmunitaria o citocinas moduladoras de la respuesta inmunitaria. Dos grupos de citocinas comúnmente utilizadas en la terapia antitumoral son los interferones y las interleucinas.

Los interferones son citocinas producidas por el sistema inmunitario que suelen participar en una respuesta antivírica, pero que también muestran eficacia en el tratamiento del cáncer. Hay tres grupos de interferones (IFN): tipo I (IFN alfa e IFN beta), tipo 2 (IFN gamma) y el tipo III relativamente recientemente descubierto (IFN lambda). El iFn alfa se ha aplicado en el tratamiento de la leucemia de células pilosas, el sarcoma de Kaposi asociado a SIDA, el linfoma folicular, la leucemia mieloide crónica y el melanoma. Los IFN de tipo I y II se han investigado ampliamente y, aunque ambos tipos promueven los efectos antitumorales del sistema inmunitario, hasta ahora solo se ha demostrado que los IFN de tipo I son clínicamente eficaces en el tratamiento del cáncer. El IFN lambda ha sido probado para determinar sus efectos antitumorales en modelos animales y parece prometedor.

Como se desvela en el presente documento, las citocinas estimulantes de la respuesta inmunitaria o moduladoras de la respuesta inmunitaria (los términos pueden usarse indistintamente) son preferentemente aquellas implicadas en la regulación de los linfocitos T o con función efectora para los linfocitos T (citocinas reguladoras de los linfocitos T). Estas citocinas presentan propiedades deseadas con respecto a inducir un microambiente proinflamatorio y de este modo facilitan la activación del sistema inmunitario contra el tumor y/o mejoran la eficacia de los tratamientos inmunoterapéuticos antitumorales. Dichas citocinas pueden atraer células efectoras inmunitarias, tales como linfocitos T, y promover la maduración de las células inmunitarias de memoria. Ejemplos de estas citocinas son IFN gamma, IL-2, IL-12, IL-23, IL-15 y IL-21 (consultar Kelley's Textbook of Rheumatology; Firestein et al, 8a ed. (ISBN 978-1-4160­ 3285-4), pág. 367 "Citocinas").

La citocina estimulante de la respuesta inmunitaria puede ser una quimiocina inflamatoria. En un ejemplo comparativo, la citocina estimulante de la respuesta inmunitaria es una quimiocina con propiedades quimiotácticas para atraer linfocitos T, por ejemplo, CCL1, CCL2 y/o CCL17. Las quimiocinas se refieren a un subgrupo de citocinas (proteínas de señalización) secretadas por las células. Las citocinas tienen la capacidad de inducir quimiotaxis dirigida en células sensibles cercanas; son citocinas quimiotácticas. Las proteínas se clasifican como quimiocinas de acuerdo con las características estructurales compartidas, tal como el tamaño pequeño (normalmente, aproximadamente 8-10 kilodaltons de tamaño) y la presencia de cuatro restos de cisteína en ubicaciones conservadas que son clave para formar su forma tridimensional. Las citocinas pueden conocerse bajo definiciones alternativas, tales como la familia de citocinas SIS, la familia de citocinas SIG, la familia de citocinas SCY, La superfamilia del factor 4 plaquetario o intercrinas. Las quimiocinas se han clasificado en cuatro subfamilias principales: CXC, CC, CX3C y XC. Todas estas proteínas ejercen sus efectos biológicos al interactuar con receptores transmembrana ligados a la proteína G denominados receptores de quimiocinas, los cuales se encuentran selectivamente en las superficies de sus células diana. Los ejemplos de quimiocinas inflamatorias se refieren a CXCL-8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11 y CXCL10, CXCL1, CXCL2.

Otras definiciones:

La expresión "funciones inmunomoduladoras" se refiere a funciones o propiedades de moléculas o células que inducen cambios o modulación en la función, acción o estado de cualquier componente del sistema inmunitario.

El término "estroma", como se utiliza en el presente documento, se refiere al marco de soporte de un tejido o un órgano (o glándula, tejido u otra estructura), normalmente compuesto de matriz extracelular (MEC) y células estromales. El estroma es distinto del parénquima, que consiste en los elementos funcionales clave de ese órgano. Las células estromales (en la capa de la dermis) adyacentes a la epidermis (la capa superior de la piel) liberan factores de crecimiento que promueven la división celular. El estroma está formado por células del hospedador no malignas. El estroma proporciona una matriz extracelular sobre la cual los tumores pueden crecer o mantener su existencia o separarse del entorno inmunitario.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "microambiente tumoral" se refiere al ambiente celular en el cual existe cualquier tumor dado, incluyendo el estroma tumoral, vasos sanguíneos circundantes, células inmunitarias, fibroblastos, otras células, moléculas de señalización, y la ECM.

Como se utiliza en el presente documento, "migración celular" o "migración dirigida" pretende indicar el movimiento de una célula hacia una señal química o física particular. Las células a menudo migran en respuesta a señales externas específicas, incluyendo señales químicas y señales mecánicas. Las MSC como se describen en el presente documento son capaces de dirigirse al tejido tumoral u otras señales de inflamación.

La quimiotaxis es un ejemplo de migración celular respecto a la respuesta a un estímulo químico. Los ensayos de quimiotaxis in vitro tal como los ensayos en cámara de Boyden pueden usarse para determinar si se produce migración celular en cualquier célula dada.

Por ejemplo, las células de interés pueden purificarse y analizarse. Los ensayos de quimiotaxis (por ejemplo, de acuerdo con Falk et al., 1980 J. Immuno. Methods 33:239-247) pueden realizarse usando placas donde se ubica una señal química particular con respecto a las células de interés y después se recogen y analizan las células que han migrado. Por ejemplo, los ensayos de cámara de Boyden implican el uso de cámaras aisladas por filtros, usadas como herramientas para la determinación precisa del comportamiento quimiotáctico. El tipo pionero de estas cámaras se construyó por (Boyden (1962) "The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes". J Exp Med 115 (3): 453). Las células móviles se ubican en la cámara superior, mientras que se rellena un líquido que contiene la sustancia de ensayo en la inferior. El tamaño de las células móviles a investigar determina el tamaño de poro del filtro; es esencial elegir un diámetro que permita la migración activa. Para modelar las condiciones in vivo, varios protocolos prefieren la cobertura del filtro con moléculas de matriz extracelular (colágeno, elastina, etc.). La eficacia de las mediciones se puede aumentar mediante el desarrollo de cámaras multipocillo (por ejemplo, NeuroProbe), donde se evalúan 24, 96, 384 muestras en paralelo. La ventaja de esta variante es que se ensayan varios análogos en condiciones idénticas.

Como se utiliza en el presente documento, "injerto" se refiere al proceso de incorporación de tejido o células injertadas o trasplantadas en el organismo del hospedador. Injerto también puede referirse a la integración de células trasplantadas en tejido hospedador tras la administración y su supervivencia y en algunas condiciones la diferenciación en estados de células que no son células madre.

Las técnicas para evaluar el injerto y, de este modo, en algún grado tanto la migración como la biodistribución de las MSC, pueden abarcar métodos in vivo o ex vivo. Los ejemplos de métodos in vivo incluyen bioluminiscencia, por la que las células se transducen para expresar luciferasa y después pueden tomarse imágenes a través de su metabolito luciferina que produce emisión de luz; fluorescencia, por la que las células se cargan con un tinte fluorescente o se transducen para que expresen un indicador fluorescente del que después pueden tomarse imágenes; marcaje de radionúclidos, donde las células se cargan con radionúclidos y se localizan con centelleografía, tomografía de emisión de positrones (PET) o tomografía de emisión monofotónica (SPECT); e imágenes de resonancia magnética (MRI), en donde las células cargadas con compuestos paramagnéticos (por ejemplo, nanopartículas de óxido de hierro) se rastrean con un analizador de MRI. Los métodos ex vivo para evaluar la biodistribución incluyen PCR cuantitativa, citometría de flujo y métodos histológicos. Los métodos histológicos incluyen seguimiento de células marcadas de forma fluorescente; hibridación in situ, por ejemplo, para cromosomas Y y para secuencias ALU específicas humanas; y tinción histoquímica para proteínas específicas de especie o introducidas genéticamente tales como p-galactosidasa bacteriana. Estos métodos inmunohistoquímicos son útiles para discernir la ubicación del injerto, pero necesitan la escisión de tejido. Para una revisión adicional de estos métodos y su aplicación, véase Kean et al., MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation, Stem Cells International, volumen 2013 (2013).

Como se utiliza en el presente documento, en "proximidad con" un tejido incluye, por ejemplo, a 50 mm, 10 mm, 5 mm, 1 mm del tejido, a 0,5 mm del tejido y a 0,25 mm del tejido.

Las moléculas específicas mencionadas en el presente documento se refieren preferentemente a moléculas de mamífero, preferentemente moléculas de seres humanos. Por ejemplo, las citocinas y/o quimiocinas mencionadas en el presente documento se refieren preferentemente a las secuencias humanas, como las puede obtener un experto sin esfuerzo excesivo, por ejemplo, de una base de datos de secuencias tales como las mantenidas por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Las secuencias de proteínas o las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas pueden modificarse en comparación con las secuencias comúnmente conocidas, por ejemplo, haciendo sustituciones conservadoras de aminoácidos en una secuencia de proteína, o usando la degeneración del código genético para cambiar la secuencia codificante sin cambiar la secuencia de proteína codificada. Como sabe el experto en la materia, las secuencias de moléculas biológicas se pueden cambiar (mutar) mediante técnicas estándar, mejorando o manteniendo de este modo sus propiedades en comparación con la secuencia original conocida. Por tanto, cualquier secuencia de citocina modificada que mantenga las propiedades básicas de la secuencia conocida o que sea funcionalmente análoga a la secuencia conocida, está incluida en la presente invención.

Figuras

Las siguientes figuras se presentan para describir realizaciones particulares y ejemplos comparativos de la invención, demostrando una implementación práctica de la invención, sin limitarse al alcance de la invención o los conceptos descritos en el presente documento.

Breve descripción de las figuras:

Fig. 1: Expresión del CAR n.° 946 en linfocitos CAR-T humanos específicos de CEA mediante FACS de dos colores.

Fig. 2 : Las MSC de tipo natural mejoran la actividad antitumoral de los linfocitos CAR-T.

Fig. 3 : Las células madre mesenquimatosas no suprimen la activación de los linfocitos CAR-T.

Fig. 4 : Las MSC promueven la proliferación y supervivencia de linfocitos CAR-T de forma dependiente de la activación.

Fig. 5: Supervivencia de linfocitos CAR-T en presencia de MSC.

Fig. 6 : Las MSC nativas aumentan la destrucción de linfocitos NK dependiente de células tumorales.

Fig. 7 : Las MSC nativas promueven la proliferación y activación de linfocitos T CD4+ in vitro.

Fig. 8 : Las MSC modificadas genéticamente que expresan el transgén alfa-1 anti-tripsina activan la proliferación de linfocitos T de una manera comparable a las MSC nativas.

Descripción detallada de las figuras:

Fig. 1: Expresión del CAR n.° 946 en linfocitos CAR-T humanos específicos de CEA mediante FACS de dos colores.

Los linfocitos T periféricos humanos se aislaron de la sangre de un donante sano y se transdujeron mediante el vector n.° 946 que codifica la secuencia de un CAR que consiste en un dominio de unión Fv monocatenario al anti-antígeno carcinoembrionario (CEA), un dominio bisagra-espaciador CH2-CH3 derivado de IgG1 humana y un dominio CD28-CD3zeta transmembrana e intracelular quimérico para la señalización CD28-CD3zeta combinada con especificidad por el antígeno carcinoembrionario (CEA). Doce horas después del final de la transducción, las células se ensayaron para la expresión de CAR n.° 946 mediante FACS de dos colores usando un anticuerpo policlonal anti-Fc de IgG humana de cabra marcado con PE y el anticuerpo monoclonal humano anti-CD3 murino marcado con FITC UCHT1.

Fig. 2 : Las MSC de tipo natural mejoran la actividad antitumoral de los linfocitos CAR-T

CEA es altamente expresado en la superficie de la mayoría de adenocarcinomas pancreáticos. La expresión de CEA está elevada en casi el 90 % de los cánceres que surgen del tejido endodérmico, incluyendo el tracto gastrointestinal, tejidos pulmonares, y mama. Los linfocitos T injertados con anti-CEA-CAR y los linfocitos T no modificados sin CAR para el control (cada 2x10(4)/pocillo) se cultivaron conjuntamente durante 48 h con células tumorales CEA LS174T o CEA-Colo320 (de cada 2,5x10(4)/pocillo) y MSC naturales o que secretan IL7/IL21 (cada 3x10 (3)/pocillo) en placas de fondo redondo de 96 pocillos. La viabilidad de las células tumorales se determinó mediante un ensayo XTT basado en sal de tetrazolio. La citólisis [%] se determinó mediante la viabilidad 100 [%]. Los valores representan la media de triplicados /- desviación típica (d T).

Fig. 3 : Las células madre mesenquimatosas no suprimen la activación de los linfocitos CAR-T

Los linfocitos T injertados con anti-CEA-CAR y los linfocitos T no modificados sin CAR para el control (cada 2x10(4)/pocillo) se cultivaron conjuntamente durante 48 h con células tumorales CEA LS174T o CEA-Colo320 (de cada 2,5x10(4)/pocillo) y MSC naturales o que secretan IL7/IL21 (de cada 3x10(3)/pocillo) en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Se recogieron los sobrenadantes y se determinó el contenido de IFN-gamma mediante ELISA. Los valores representan la media de triplicados experimentales /- desviación típica.

Fig. 4: Las MSC promueven la proliferación y supervivencia de linfocitos CAR-T de forma dependiente de la activación.

Modulación de la proliferación de linfocitos CAR-T tras la estimulación con CAR mediante un anticuerpo antiidiotípico unido a fase sólida en presencia de MSC. Los linfocitos CAR-T anti-CEA (n° 946-CAR) se marcaron con CFSE y se cultivaron conjuntamente (5x10 (4)/pocillo) con MSC no modificadas o secretoras de IL7/IL21 (5000/pocillo), respectivamente, en placas de 96 pocillos que se recubrieron con mAb antiidiotípico BW2064 (4 pg/ml) unido a fase sólida o PBS para el control. Después de 5 días, se recuperaron las células, se tiñeron los linfocitos CAR T con un anticuerpo anti-IgG-PE humano y se analizaron mediante citometría de flujo. Tras la dilución en CFSE, se determinó el número de células en proliferación. Los valores representan la media de triplicados /- desviación típica (DT). Mediante la prueba T de Student se determinaron diferencias significativas.

Fig. 5: Supervivencia de linfocitos CAR-T en presencia de MSC.

Los linfocitos CAR-T anti-CEA (n° 946-CAR) se marcaron con CFSE y se cultivaron conjuntamente (5x10 (4)/pocillo) con MSC no modificadas o secretoras de IL7/IL21 (5000/pocillo), respectivamente, en placas de 96 pocillos que se recubrieron con mAb antiidiotípico BW2064 (4 pg/ml) unido a fase sólida o PBS para el control. Después de 6 días, se recuperaron las células, se tiñeron con un anticuerpo anti-IgG-PE humana para identificar los linfocitos CAR-T y 7-AAD para la discriminación de células vivas y muertas. Las células se analizaron mediante citometría de flujo. Se determinó el porcentaje de linfocitos T positivos para CAR vivos respecto a todos los linfocitos T. Los valores representan la media de triplicados /- desviación típica (DT).

Fig. 6 : Las MSC nativas aumentan la destrucción de linfocitos NK dependiente de células tumorales.

Se sembraron MSC nativas humanas en diferentes concentraciones (20.000/10.000/5.000/1.000/500 células por 12 pocillos) y se incubaron durante la noche en medio RPMI con suero de ternera fetal al 10 % y glutamina al 1 %. Se aislaron linfocitos NK humanos mediante clasificación MACS negativa de PBMC congeladas usando el "NK Cell isolation kit" (Miltenyi, 130-092-657) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza de los linfocitos NK se evalúa mediante medición FACS usando una tinción de anticuerpo específico de CD56 (Miltenyi, 130-100-683) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los linfocitos NK purificados (3x10A5 por muestra) se cultivan conjuntamente durante la noche con las MSC nativas sembradas o solos. Al día siguiente se realiza un ensayo de citotoxicidad de NK. La línea celular tumoral diana K562 (1x10A6 células) se tiñó con calceína 10 pM y se incubó durante 30 min a 37 °C (1 mM, C3099, lote 1687887, Life Technologies). Posteriormente, la línea de células diana se incubó con los linfocitos NK con un efector-diana (E:T).

5000 linfocitos NK y 5000 células diana se sembraron en una placa de 96 pocillos. La placa se incubó a 37 °C en CO2 al 5 % durante 4 h. Se recogió el sobrenadante y se midió la liberación de calceína como lectura de destrucción en un fluorómetro (filtro de excitación: 485 ± 9 nm; filtro de paso de banda: 530 ± 9 nm). La destrucción se normalizó en relación con K562 teñidas que se habían lisado con tritón X (Sigma Aldrich). La incubación de linfocitos NK con MSC aumenta su actividad destructora de una manera dependiente de la dosis.

Fig. 7 : Las MSC nativas promueven la proliferación y activación de linfocitos T CD4+ in vitro.

Se aislaron linfocitos CD4+ humanos a partir de PBMC congeladas usando el "CD4 T cell isolation kit" (Miltenyi, 130­ 096-533) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los linfocitos CD4 se sembraron en una placa de 24 pocillos (4x10A5 por pocillo en 600 pl) en medio RPMI1640 FCS al 10 % FCS 1 % Glutamax. Los linfocitos Cd 4 se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (Becton-Dickinson, 1 pg/ml aCd3 5 pg/ml aCd28). Se sembraron MSC en el pocillo en una proporción (MSC:PBMC) de 1:16 o 1:80. Los cultivos se incubaron durante 3 días a 37 °C. Los sobrenadantes se recogieron para detectar IFNg. La proliferación se detectó mediante análisis FACS. A) El porcentaje de linfocitos CD4 activados y en proliferación se incrementó en presencia de MSC como se observa en el análisis FACS FCS/SSC. Se muestran los duplicados. B) La liberación de IFNg como signo de activación de los linfocitos T CD4 aumentó por la presencia de MSC de una manera dependiente de la dosis.

Fig. 8 : Las MSC modificadas genéticamente que expresan el transgén alfa-1 anti-tripsina activan la proliferación de linfocitos T de una manera comparable a las MSC nativas.

4x10A5 PBMC por pocillo (teñidas con CFSE 5 mM, sondas moleculares, CellT race Cell Proliferation Kits, C34554, de acuerdo con las instrucciones del fabricante) se cultivaron conjuntamente con MSC en las proporciones indicadas en una placa de 24 pocilios (200 |jl de medio RPMI-1640 FCS al 10 % y Glutamax al 1 %). Las PMBC se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (Becton-Dickinson, 1 jg/m l aCd3 5 jg/m l aCd28). Las células se incubaron durante 3 días a 37 °C. La proliferación de linfocitos se analizó mediante FACs . La intensidad de la señal de calceína se utilizó para determinar el número de duplicaciones que se habían producido. El análisis indicó que el cocultivo de PBMC con (A) MSC nativas y (B) MSC genéticamente modificadas aumentó la proliferación de PBMc . En cada caso, una fracción mayor de los linfocitos había experimentado 1 o más duplicaciones en comparación con la muestra sin ninguna MSC. Adicionalmente, el porcentaje de PBMC que no se había duplicado se redujo en presencia de MSC.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se presentan para describir realizaciones particulares y en algunos casos preferidas de la invención, demostrando una implementación práctica de la invención, sin limitarse al alcance de la invención o los conceptos descritos en el presente documento. También se divulgan ejemplos comparativos no incluidos en la invención.

Preparación de linfocitos CAR-T humanos específicos de CEA

El receptor de antígeno quimérico n.° 946 consiste en un dominio de unión Fv monocatenario al antígeno anticarcinoembrionario (CEA), un dominio bisagra-espaciador CH2-CH3 derivado de IgG1 humana y un dominio CD28-CD3zeta transmembrana e intracelular quimérico para la señalización CD28-CD3zeta combinada. Además, se mutó el dominio de señalización de CD28 para anular la secreción de IL2. El vector gamma-retroviral que codifica el CAR n.° 946 se produjo de acuerdo con SOP-VectProd usando una envoltura Galv. En resumen, la producción de partículas de vector se realizó de forma transitoria en la línea celular de riñón embrionario humano 293T después de la transfección de ADN mediada por lipofectamina (R). Las partículas de vector se pseudotipificaron con Galv. No se determinó ningún título de vector. Los sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,45 jm y se cargaron en placas de cultivo revestidas con poli-D-lisina (PDL) mediante centrifugación durante 30 min a 1500xg.

Se llevó a cabo la consiguiente transducción de linfocitos de sangre humana. Los linfocitos T humanos se aislaron de la sangre de un donante sano y se separaron mediante centrifugación de densidad Ficoll.

Las células mononucleares sembraron con una densidad de 5x106 células/ml en RPMI 1640 FCS al 10 % (v/v) y se activaron con 100 ng/ml de mAb anti-CD3 OKT3 y 400 U/ml de IL2. Después de 96 días, se cosecharon las células, se resuspendieron en medio Xvivo15 200 U/ml de IL2 con una densidad de 5 x106 células/ml y se transdujeron en placas cargadas con virus por centrifugación durante 90 min a 1500 x g en sobrenadante fresco de células 293T transfectadas. Las células se incubaron durante 12 h. Las células se recuperaron y se ensayaron para determinar la expresión del inmunorreceptor n° 946 (Fig. 1).

Preparación de células madre mesenquimatosas humanas

Las MSC se prepararon de acuerdo con el proceso de Apceth, por ejemplo, como se describe usando el medio de cultivo celular divulgado en el documento US8557578 B2, que se incorpora en el presente documento en su totalidad como referencia. Las células se aislaron de médula ósea de donantes humanos sanos mediante adherencia al plástico y se cultivaron en medio de crecimiento.

Se aíslan MSC humanas de médula ósea por adherencia a plástico y se cultivan en medio de crecimiento, por ejemplo, DMEM que contiene FBS como se describe por Pittinger, M.F. (2008) Mesenchymal stem cells from adult bone marrow, En D.J. Prockop, D.G. Phinney, B.A. Bunnell, Methods in Molecular Biology 449, Mesenchymal stem cells, Totowa: Humana Press), o en el medio de cultivo como se describe en el documento US8557578 B2.

Generación de vectores para la expresión de citocinas y quimiocinas:

Los casetes de expresión transgénicos que consisten en un promotor y un gen (por ejemplo, ADNc) para un factor inmunoestimulador o la respuesta inmunitaria de apoyo del factor se construyen usando técnicas de clonación estándar como se describe en Julia Lodge, Peter Lund, Steve Minchin (2007) Gene Cloning, Nueva York: Tylor and Francis Group. Los promotores pueden ser promotores constitutivos como el promotor CMV o el promotor PGK o promotores inducibles como Tie2, RANTES o el promotor de HSP70.

Ejemplos de genes que codifican factores inmunoestimuladores o factores que promueven las respuestas inmunitarias son IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, IL-12, IFN gamma, IFN beta, SDF-1, CCL23, CCL19, CCL1, CCL2, CCL17, CCL22 y/o CCL4 (Strengell et al., M, The Journal of Immunology,2003, 170: 5464 -5469; Borish et al., J Allergy Clin Immunol.

2003 Feb;111(2 Suppl): S460-7). El gen puede fusionarse o no con secuencias de etiqueta (por ejemplo, proteínas/péptidos marcadores tales como la etiqueta de hemaglutinina o la etiqueta HIS) para permitir una fácil detección de la expresión posterior en el mismo (Hinrik Garoff, 1985, Annual Review of Cell Biology, Vol. 1: 403-445).

A continuación, el transgén se inserta en un sistema de vector adecuado (por ejemplo, vector lentivírico o gammaretrovírico) mediante técnicas de clonación estándar. Un vector adecuado se describe por ejemplo por Baum (EP 1757703 A2). El vector puede incluir o no un segundo casete transgénico que consiste en un promotor y un gen marcador seleccionable (marcador de superficie celular o gen de resistencia, por ejemplo, el gen pac para conferir resistencia a puromicina) para permitir el enriquecimiento de células modificadas genéticamente posteriormente en el proceso (David P. Clark, Nanette J. Pazdernik, 2009, Biotechnology: Applying the Genetic Revolution, Londres: Elsevier).

Modificación genética de células madre mesenquimatosas:

La transducción se realiza con modificaciones como se describe por Murray et al., 1999 Human Gene Therapy. 10(11): 1743-1752 y Davis et al., 2004 Biophysical Journal Volumen 861234-1242. En detalle:

se recubren placas de cultivo celular de 6 pocillos (por ejemplo, Corning) con poli-L-lisina (PLL) (por ejemplo, Sigma-Aldrich, P4707-50ML): La solución de PLL (0,01 %) se diluye hasta una concentración final de entre 0,0001 % y 0,001 % con PBS. Se usan 2 ml de PLL diluida para cada pocillo. La placa se incuba durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavan cuidadosamente con PBS.

Se añade sobrenadante de vector vírico en un volumen final de 2 ml a cada pocillo revestido con PLL. El número de partículas debe estar entre 2x10e3 y 1x10e6 por pocillo, lo que dará como resultado una multiplicidad de infección de 0,25 y 10. La placa cargada se centrifuga durante 2000x g, 30 min, 4 °C. Posteriormente se descarta el sobrenadante y se siembran 1 x10e5 células madre mesenquimatosas por pocillo. Las placas se incuban a 37 °C con CO2 al 5 % para su posterior uso.

El tratamiento combinatorio de un modelo de tumor de ratón con MSC y linfocitos CAR-T específicos de antígeno demuestra un efecto sinérgico

Ratones inmunocompetentes que expresan el transgén CEA (CEAtg) en los tractos intestinal y pulmonar (Chmielewski et al.; Gastroenterology. Octubre de 2012; 143(4): 1095-107.e2. doi: 10.1053/j.gastro.2012.06.037. Epub 2012 Jun 27.) reciben inyecciones intrapancreáticas de células Panc02 CEA(+) (expresan CEA y luciferasa de escarabajo clic) y los tumores se cultivan durante 10 días. A continuación a los ratones se les administran inyecciones intravenosas únicas de linfocitos T modificados para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) con especificidad para CEA, ya sea solo o junto con MSC naturales (no modificadas genéticamente), o con MSC que sobreexpresan y secretan IL7 e IL21. Las MSC de tipo natural o las MSC que expresan IL7 e IL21 también se inyectan solas sin co-inyección de linfocitos T CAR. La inyección de linfocitos CAR-T anti-CEA solos reduce ligeramente el tamaño de los tumores pancreáticos, mientras que la inyección de MSC de tipo natural solas no tiene ningún efecto sobre el tumor. Las MSC que expresan IL7 e IL21 tienen solo efectos antitumorales leves. Sin embargo, la inyección combinatoria de linfocitos CAR-T anti-CEA con MSC (MSC de tipo natural o que expresan IL7/IL21) reduce el tamaño del tumor por debajo del límite de detección en todos los ratones y produce la erradicación del tumor a largo plazo.

Los ejemplos se complementan con las figuras, en las cuales se demuestra el efecto sorprendente de las MSC descrito en el presente documento sin modificación genética con respecto a la mejora del efecto antitumoral de los CAR-T.

El tratamiento combinatorio de un modelo de tumor de ratón con MSC y linfocitos NK demuestra un efecto sinérgico

Los ratones inmunodeficientes se someten a una inyección intracraneal de la línea celular de glioblastoma U87 que expresa luciferasa y los tumores se hacen crecer durante 3 días. A continuación, los ratones se someten a inyecciones intravenosas únicas de linfocitos NK humanos aislados. Además, los ratones reciben inyecciones intracraneales con MSC de tipo natural (no modificadas genéticamente) o con MSC que sobreexpresan y secretan IL7 e IL21. Las MSC de tipo natural o las MSC que expresan IL7 e IL21 también se inyectan solas, sin co-inyección de linfocitos NK. La inyección de linfocitos NK solos reduce ligeramente el tamaño de los tumores pancreáticos, mientras que la inyección de MSC de tipo natural solas no tiene ningún efecto sobre el tumor. Las MSC que expresan IL7 e iL21 tienen solo efectos antitumorales leves. Sin embargo, la inyección combinatoria de linfocitos NK con MSC (MSC de tipo natural o que expresan IL7/IL21) reduce el tamaño del tumor por debajo del límite de detección en todos los ratones y produce la erradicación del tumor a largo plazo (Fig. 6).

El tratamiento combinatorio de un modelo de tumor de ratón con MSC y transferencia adoptiva de linfocitos T demuestra un efecto sinérgico

Los ratones inmunodeficientes se someten a inyecciones intrahepáticas de células de carcinoma de hígado HUH7 que expresan luciferasa y los tumores se hacen crecer durante 14 días. A continuación, los ratones se someten a inyecciones intravenosas únicas de linfocitos T humanos aislados o junto con MSC de tipo natural (no modificadas genéticamente), o con MSC que sobreexpresan y secretan IL7 e IL21. Las MSC de tipo natural o las MSC que expresan IL7 e IL21 también se inyectan solas sin co-inyección de linfocitos T. La inyección de linfocitos T solos reduce ligeramente el tamaño de los tumores pancreáticos, mientras que la inyección de MSC de tipo natural solas no tiene ningún efecto sobre el tumor. Las MSC que expresan IL7 e IL21 tienen solo efectos antitumorales leves. Sin embargo, la inyección combinatoria de linfocitos NK con MSC (MSC de tipo natural o que expresan IL7/IL21) reduce el tamaño del tumor por debajo del límite de detección en todos los ratones y produce la erradicación del tumor a largo plazo.

El tratamiento combinatorio de un modelo de tumor de ratón con MSC y la terapia con el inhibidor del punto de control (anticuerpo anti-PD-LI) demuestra un efecto sinérgico

El experimento se puede realizar como se describe por Deng et al. (Deng et al. (2014) Irradiation and anti-PD-LI treatment synergistically promote antitumor immunity in mice, J Clin Invest. 2014;124(2):687-695) con modificaciones: Se adquirieron ratones BALB/c de seis a 8 semanas de edad de Harlan. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. La línea celular MC38 es una línea celular de adenocarcinoma de colon. Se inyectan células tumorales MC38 (1 x 106) s.c. en los flancos de los ratones. Se deja crecer MC38 durante aproximadamente 8 días. Para el experimento de bloqueo de PD-L1, se administran i.p. 100 mg de anticuerpo anti-PD-L1 (clon 10F.9G2; Bio-XCell) a ratones cada 3 días durante un total de cuatro veces. Además, los ratones reciben tratamiento con MSC solo (hasta 3 inyecciones con dosis entre 1x10A3 - 1x10A6 MSC por ratón) o en combinación con anti-PD-L1. El tratamiento con anti-PD-L1 conduce a una disminución del volumen tumoral. La combinación de anti-PD-L1 y MSC conduce esencialmente a la erradicación del tumor, mientras que el tratamiento con MSC solo conduce a una ligera disminución del volumen tumoral.

El tratamiento combinatorio de un modelo de tumor de ratón con MSC y terapia con un inhibidor de IDO demuestra un efecto sinérgico

El experimento se puede realizar como se describe por Nakamura et al.(Nakamura et al.(2015) Effects of in- doleamine 2,3-dioxygenase inhibitor in non-Hodgkin lymphoma model mice.lnt J Hematol. 102(3): 327 -34) con modificaciones: Se obtienen ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas de Charles River. A20, una línea celular de linfoma de linfocitos B BALB/c derivada originalmente de una neoplasia espontánea de células del retículo puede obtenerse de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). La línea celular se cultiva en medio RPMI 1640 completo con FBS al 10 %, 1-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 U/ml y 2-ME 50 pM a 37 °C en una incubadora humidificada de CO2 al 5 %.

Para establecer tumores, se resuspenden 1 x 10e6 células A20 en 200 pl de PBS y se inyectan s.c. en la parte inferior del lomo de ratones BALB/c singénicos no sometidos previamente a experimentos. Siete días después se inicia el tratamiento. El inhibidor de la IDO 1-metil-d-triptófano (d-1MT) (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, USA) se disuelve en agua estéril (5 mg/ml) y se ajusta a pH 9,9 con NaOH. Los ratones fueron alimentados con agua suplementada con d-1MT. Además, los ratones recibieron inyecciones de MSC solas (hasta 3 inyecciones con dosis entre 1x10A3 - 1x10A6 MSC por ratón) o en combinación con agua suplementada con d-1MT. El crecimiento tumoral se controla dos veces por semana mediante medición con calibre. Se calculan los volúmenes tumorales. Los ratones se sacrifican por dislocación cervical el día 28. En comparación con los ratones de control no tratados, el tratamiento con d-1MT da como resultado un crecimiento tumoral reducido. El tratamiento con MSC solo conduce a una ligera disminución del volumen tumoral. La combinación del inhibidor de IDO con MSC conduce esencialmente a una erradicación del tumor en los ratones.

Las MSC nativas promueven la proliferación y activación de linfocitos T CD4+ in vitro

Como se muestra en la Figura 7, el porcentaje de linfocitos CD4 activados y en proliferación se incrementó en presencia de MSC como se observa tras el cultivo conjunto in vitro, como se puede observar en el análisis FACS FCS/SSC. Adicionalmente, la liberación de IFNg como signo de activación de los linfocitos CD4-T aumentó por la presencia de MSC de una manera dependiente de la dosis, lo que indica la capacidad de las MSC para activar linfocitos T CD4.

Las MSC modificadas genéticamente que expresan el transgén alfa-1 anti-tripsina (que no expresan citocinas inmunoestimulantes a partir de ácido nucleico exógeno) activan la proliferación de linfocitos T de una manera comparable a las MSC nativas

Como se muestra en la Figura 8, el cultivo conjunto de PBMC con MSC (A) nativas o (B) modificadas genéticamente conduce a un aumento en la proliferación de PBMC. En cada caso, una fracción mayor de los linfocitos había experimentado 1 o más duplicaciones en comparación con la muestra sin ninguna MSC. Esto respalda que las MSC modificadas genéticamente, sin citocinas inmunoestimuladoras exógenas, también son capaces de estimular respuestas de células inmunitarias. Adicionalmente, el porcentaje de PBMC que no se había duplicado se redujo en presencia de MSC.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Células madre mesenquimatosas (MSC) para usar en el tratamiento de un tumor, en donde dicho tratamiento comprende la administración combinada de dichas MSC con una inmunoterapia antitumoral, en donde dicha inmunoterapia comprende la administración de linfocitos T y/o linfocitos citolíticos naturales (NK), y en donde dichas MSC no están modificadas genéticamente.

2. Las células madre mesenquimatosas para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha inmunoterapia comprende la administración de linfocitos T que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde dicho CAR se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor.

3. Las células madre mesenquimatosas para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células madre mesenquimatosas, los linfocitos T y/o los linfocitos NK para la administración combinada son autólogas del sujeto de tratamiento médico.

4. Las células madre mesenquimatosas para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células madre mesenquimatosas, los linfocitos T y/o los linfocitos NK para la administración combinada son alogénicas del sujeto de tratamiento médico.

5. Las células madre mesenquimatosas para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la inmunoterapia antitumoral para administración combinada comprende la administración de linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde dicho CAR se une específicamente a un antígeno asociado a un tumor, y en donde las células madre mesenquimatosas no están modificadas genéticamente.