ES2823455T3

ES2823455T3 - Proceso para la preparación de un producto de fermentación de material que contiene lignocelulosa

Info

Publication number: ES2823455T3
Application number: ES10768708T
Authority: ES
Inventors: Johannes Petrus Smits; Van Gierveld; Van Der Hor
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2009-10-08
Filing date: 2010-10-05
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2030-10-05
Also published as: EP2486139A2; MX341469B; EA201200561A1; CA2774142A1; HRP20201649T1; AU2010305447A1; CA2774142C; BR112012010808A2; EA026127B1; PL2486139T3; WO2011042437A2; US20190093137A1; US20120183993A1; AU2010305447C1; BR122016004370B1; CN102549163A; DK2486139T3; US11421256B2; MX2012004072A; MX361395B

Abstract

Proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material lignocelulósico, que comprende las siguientes etapas: a) opcionalmente, pretratamiento; b) opcionalmente, lavado; c) hidrólisis enzimática; d) fermentación; y e) opcionalmente, recuperación de un producto de fermentación; en donde en la etapa (c) se usa una composición enzimática que tiene un óptimo de temperatura de 60 ºC o más, el tiempo de hidrólisis es 40 horas o más, la temperatura de hidrólisis es 60 ºC o más y en donde el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis (c) es 14 % p/peso de materia seca o más y en donde en la etapa (d) la fermentación se realiza con un microorganismo que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5.

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para la preparación de un producto de fermentación de material que contiene lignocelulosa

Campo de la invención

La invención se refiere a un proceso para la hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y la fermentación de azúcares.

Antecedentes de la invención

El material lignocelulósico de planta, también denominado en el presente documento materia prima, es una fuente de energía renovable en forma de azúcares que se puede convertir en productos valiosos, por ejemplo, biocombustible, tal como bioetanol. Durante este proceso, la (ligno o hemi)celulosa presente en la materia prima, tal como paja de trigo, tallos y hojas de maíz, cascarillas del arroz, etc., se convierte en azúcares reductores por enzimas (hemi)celulolíticas, que entonces se convierten en valiosos productos tales como el etanol por microorganismos como levadura, bacterias y hongos.

Puesto que la (hemi)celulosa es cristalina y está atrapada en una red de lignina, la conversión en azúcares reductores es en general lenta e incompleta. Normalmente, la hidrólisis enzimática de materia prima sin tratar da azúcares <20 % de la cantidad teórica. Aplicando un pretratamiento químico y termofísico, la (hemi)celulosa es más accesible para las enzimas (hemi)celulolíticas, y así las conversiones van más rápido y a rendimientos más altos.

Un rendimiento del etanol típico a partir de la glucosa, derivada de tallos y hojas pretratados de maíz, es 40 galones de etanol por 1000 kg de tallos y hojas secos de maíz [1], o 0,3 g de etanol por g de materia prima. El máximo rendimiento del etanol en una base de celulosa es aproximadamente 90 %.

Las enzimas celulolíticas - la mayoría de las cuales se producen por especies como Trichoderma, Humicola y Aspergillus - se usan comercialmente para convertir materia prima pretratada en una pasta que contiene (hemi)celulosa insoluble, azúcares reductores producidos a partir de la misma y lignina. Esta pasta se usa entonces en una fermentación durante la que los azúcares reductores se convierten en biomasa de levadura (células), dióxido de carbono y etanol. El etanol producido de esta forma se denomina bioetanol.

La producción común de azúcares a partir de materia prima lignocelulósica pretratada, la hidrólisis también se denomina licuefacción, presacarificación o sacarificación, tiene lugar normalmente durante un proceso que dura 6-168 horas [2][4] a temperaturas elevadas de 45-50 °C [2] y condiciones no estériles. Durante esta hidrólisis, la celulosa presente se convierte parcialmente (normalmente 30-95 %, dependiendo de la actividad enzimática y las condiciones de hidrólisis) en azúcares reductores. En caso de inhibición de las enzimas por compuestos presentes en la materia prima pretratada y por azúcares liberados, y para minimizar la inactivación térmica, este periodo de temperatura elevada se minimiza en la medida de lo posible.

La fermentación después de la hidrólisis tiene lugar en una etapa de proceso anaerobia separada, ya sea en el mismo recipiente o en uno diferente, en el que la temperatura se ajusta hasta 30-33 °C (proceso mesófilo) para acomodar el crecimiento y la producción de etanol por biomasa microbiana, comúnmente levaduras. Durante este proceso de fermentación, el material (hemi)celulósico restante se convierte en azúcares reductores por las enzimas ya presentes de la etapa de hidrólisis, mientras se producen la biomasa microbiana y el etanol. Por tanto, este tipo de fermentación se denomina frecuentemente sacarificación y fermentación simultánea, SSF. La fermentación termina una vez el material (hemi)celulósico se convierte en azúcares fermentables y todos los azúcares fermentables se convierten en etanol, dióxido de carbono y células microbianas. Esto puede durar hasta 6 días. El tiempo de hidrólisis y fermentación del proceso global puede así ascender a hasta 7 días.

La pasta fermentada así obtenida consiste en azúcares no fermentables, material (hemi)celulósico no hidrolizable, lignina, células microbianas (las más comunes las células de levadura), agua, etanol, dióxido de carbono disuelto. Durante las etapas sucesivas, el etanol se destila a partir de la masa y se purifica adicionalmente. La suspensión sólida restante se seca y se usa como, por ejemplo, combustible de combustión, fertilizantes o pienso para ganado vacuno.

Con cada lote de materia prima, se añaden enzimas para maximizar el rendimiento y la tasa de azúcares fermentables liberados de la materia prima lignocelulósica pretratada durante el tiempo de proceso dado. En general, los costes para la producción de enzimas, rendimiento de materia prima a etanol e inversiones son los principales factores de coste en los costes de producción globales [2]. Hasta ahora, el coste de la reducción del uso de enzimas se logra aplicando productos enzimáticos a partir de una fuente microbiana individual o de múltiples fuentes microbianas [7] con actividad hidrolítica más ancha y/o más alta (específica), uso que tiene como objetivo una necesidad de enzimas más baja, velocidades de conversión más rápidas y/o un rendimiento de conversión más alto, y así a costes de producción de bioetanol más bajos globales. Esto requiere grandes inversiones en la investigación y el desarrollo de estos productos enzimáticos. En caso de un producto enzimático compuesto de enzimas de múltiples fuentes microbianas, se necesitan grandes inversiones de capital para la producción de cada compuesto enzimático individual.

Por tanto, es conveniente mejorar el proceso anterior que implica la hidrólisis y la fermentación.

Se han usado enzimas celulolíticas termoestables derivadas de Talaromyces para degradar materia prima lignocelulósica y estas enzimas se conocen por su termoestabilidad en el documento de patente WO2007091231 [3]. El documento de patente WO2007091231 describe además el desarrollo de composiciones enzimáticas optimizadas, particularmente composiciones enzimáticas térmicamente estables, que pueden servir para reducir los costes asociados a estas enzimas. Desvela un proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material lignocelulósico que comprende las etapas de hidrólisis enzimática durante 40 horas o más, una temperatura de 60 °C o más y un contenido de materia seca de aproximadamente 5 %, y fermentación con un microorganismo que fermenta azúcares C6. Sin embargo, no se da divulgación sobre cómo optimizar el proceso de hidrólisis y fermentación.

Sumario de la invención

Es, por tanto, un objeto de la invención proporcionar un proceso en el que la etapa de hidrólisis y la etapa de fermentación se realizan en condiciones de temperatura óptima. Otro objeto de la invención es proporcionar un proceso que implica la hidrólisis y la fermentación que tienen un tiempo de proceso reducido. Un objeto adicional de la invención es proporcionar un proceso, en donde la dosis de enzima se puede reducir y al mismo tiempo se mantiene la salida de producto de fermentación útil al mismo nivel. Otro objeto es proporcionar un proceso, en donde se reduce el riesgo de contaminación por microorganismos contaminantes. Otro objeto es proporcionar un proceso en donde aumenta el contenido de materia seca. Otro objeto es proporcionar un proceso que implica la hidrólisis y la fermentación, en donde se optimizan las condiciones de proceso de la fermentación. Se obtienen uno o más de estos objetos según la invención. La presente invención proporciona un proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material lignocelulósico, que comprende las siguientes etapas:

a) opcionalmente, pretratamiento;

b) opcionalmente, lavado;

c) hidrólisis enzimática;

d) fermentación; y

e) opcionalmente, recuperación de un producto de fermentación;

en donde en la etapa (c) se usa una composición enzimática que tiene un óptimo de temperatura de 60 °C o más, el tiempo de hidrólisis es 40 horas o más, la temperatura de hidrólisis es 60 °C o más y en donde el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis (c) es 14 % p/peso de materia seca o más y en donde en la etapa (d) la fermentación se realiza con un microorganismo que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5.

Sorprendentemente, según la invención, por la provisión de una composición enzimática que es estable y tiene un óptimo de temperatura de 60 °C o más para la etapa de hidrólisis enzimática c), es posible obtener muchas ventajas de proceso, que incluyen condiciones de temperatura óptima, tiempo de proceso reducido, administración de enzima reducida, riesgo reducido de contaminación, mayores concentraciones de materia seca, reutilización de enzimas y otras optimizaciones de proceso, dando como resultado costes reducidos.

En una realización de este proceso, el tiempo de fermentación es 18-120 horas. En una realización, la composición enzimática estable usada retiene actividad durante 30 horas o más. Según una realización adicional, la hidrólisis se realiza a una temperatura de 60 °C o más. En una realización preferida, la composición enzimática deriva de un microorganismo del género Talaromyces. El proceso de la invención se ilustrará más abajo en más detalle.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: La liberación con el tiempo de la glucosa desde una suspensión al 10 % de materia seca de materia prima usando enzimas celulolíticas estables Talaromyces. La línea de puntos superior indica el máximo teórico de glucosa que se puede liberar, basado en la composición de celulosa de la materia prima. La línea de puntos inferior indica el nivel de conversión del 90 %. A indica el momento en el que se logra el nivel del 90 %.

Fig. 2: Liberación del azúcar reductor glucosa durante la hidrólisis de materia prima lignocelulósica pretratada en diferentes dosis de enzima Talaromyces (expresadas como disolución de enzima en volumen por cantidad de materia seca de materia prima). La línea de puntos indica el 90 % de la máxima cantidad teórica de glucosa que se puede producir a partir de la materia prima (90 % de conversión). A indica el momento en el que se logra el 90 % de hidrólisis con una dosis de 0,175 mL/g de disolución de enzima/g de materia seca de materia prima; B indica el momento al que se logra el 90 % de conversión con una dosis de 0,075 mL de disolución de enzima/g de materia seca de materia prima.

Fig. 3: Cantidad de azúcares que se libera durante 72 horas a 60 °C de hidrólisis de materia prima si se usan enzimas de Talaromyces recirculadas. El gráfico muestra 5 ciclos de recirculación de enzimas (experimento 2 6). En cada ciclo, la cantidad de enzima recuperada del ciclo previo se usa para hidrolizar un nuevo lote de materia prima pretratada. No se añaden enzimas nuevas. La recuperación se hace usando centrifugación y ultrafiltración. La cantidad de azúcares liberados por ciclo se compara con la cantidad liberada en el experimento 1 donde se usan enzimas Talaromyces que no se recirculan.

Fig. 4: Liberación del azúcar reductor glucosa durante la hidrólisis de materia prima lignocelulósica pretratada en diferentes dosis de enzima Talaromyces (expresada como el volumen de disolución de enzima por cantidad de materia seca de materia prima). Se muestran los resultados de 10 % p/p de materia seca de materia prima y 15 % p/p de materia seca de materia prima.

Fig. 5: La cantidad total de actividad enzimática, expresada por unidades de sustrato, antes (muestras de referencia) y después de la hidrólisis, fermentación y destilación a vacío de una suspensión al 10 % de materia seca de materia prima a varias dosis de enzima. Una actividad enzimática unitaria de sustrato libera un mmol de azúcar reductor.

Fig. 6: Liberación de glucosa durante la hidrólisis con 0,20 (•) y 0,09 (■) g de composición enzimática por g de materia seca de materia prima (Ejemplo 2).

Fig. 7: La cantidad relativa de glucosa liberada de la materia prima en diferentes dosis de enzima en vinazas ligeras (Ejemplo 4).

La Figura 8 expone el rendimiento de la cepa BIE252 en fibra de maíz hidrolizada al 13,8 % de m.s. Se muestran la velocidad de producción de CO², la producción de etanol y la conversión de azúcar.

La Figura 9 expone el rendimiento de la cepa BIE252 en tallos y hojas hidrolizados de maíz al 10 % de m.s. Se muestran la velocidad de producción de CO², la producción de etanol y la conversión de azúcar.

La Figura 10 expone el rendimiento de la cepa BIE252 en paja de trigo hidrolizada al 10 % de m.s. Se muestran la velocidad de producción de CO², la producción de etanol y la conversión de azúcar.

Descripción detallada de la invención

La invención se describe ahora en todas sus realizaciones, con más detalle.

Composición de enzimas estable

Según la invención, en la etapa de hidrólisis, se usa una composición enzimática estable que tiene un óptimo de temperatura de 60 °C o más, o de 65 grados o más. El óptimo de temperatura se determina midiendo la actividad de la composición enzimática a diferentes temperaturas y representando la actividad frente a la temperatura, y luego determinando la temperatura óptima, es decir, la temperatura a la que se encuentra la actividad más alta.

Composición enzimática estable en el presente documento significa que la composición enzimática retiene la actividad después de 30 horas del tiempo de la reacción de hidrólisis, preferentemente al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de su actividad inicial después de 30 horas de tiempo de la reacción de hidrólisis. Preferentemente, la composición enzimática retiene la actividad después de 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas de tiempo de la reacción de hidrólisis.

La composición enzimática se puede obtener de un microorganismo. Una composición para su uso en un proceso de la invención comprenderá actividades enzimáticas normalmente obtenidas de un microorganismo fúngico saprófito de la clase Penicillium y del género Talaromyces, por ejemplo, Talaromyces emersonii. Talaromyces emersonii también se puede denominar Geosmitia emersonii o Penicillium emersonii. Talaromyces emersonii también se ha denominado Talaromyces duponti y Penicillium duponti.

La composición enzimática se puede preparar por fermentación de un sustrato adecuado con el microorganismo, por ejemplo, Talaromyces emersonii, en donde la composición enzimática se produce por el microorganismo. Opcionalmente, se usa un sustrato que induce la expresión de las enzimas en la composición enzimática.

La composición enzimática se usa para liberar azúcares de lignocelulosa, que comprende polisacáridos. Los principales polisacáridos son celulosa (glucanos), hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos). Además, alguna hemicelulosa puede estar presentes como glucomananos, por ejemplo, en materias primas derivadas de la madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, que incluye tanto monómeros como multímeros, por ejemplo, glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas ocurre bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto.

Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tales como los arabinanos puede constituir una proporción considerable de la masa seca de normalmente paredes celulares de tejidos de plantas no leñosas (aproximadamente de un cuarto a la mitad de la masa seca pueden ser pectinas).

La celulosa es un polisacárido lineal compuesto de restos de glucosa unidos por enlaces p-1,4. La naturaleza lineal de las fibras de celulosa, así como la estequiometría de la glucosa unida en p (con respecto a a) genera estructuras más propensas al enlace de hidrógeno intercatenario que las estructuras de almidón unidas en a altamente ramificadas. Así, los polímeros de celulosa, en general, son menos solubles, y forman fibras más fuertemente unidas que las fibras encontradas en el almidón.

Las enzimas que se pueden incluir en la composición enzimática estable usada en la invención se describen ahora con más detalle:

Las endoglucanasas (EG) y las exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de celulosa insoluble a celooligosacáridos (celobiosa como producto principal), mientras que las p-glucosidasas (BG) convierten los oligosacáridos, principalmente la celobiosa y celotriosa, en glucosa.

La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición varía frecuentemente ampliamente de organismo a organismo, y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente principal de la hemicelulosa es la xilosa unida en p-1,4, un azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa está frecuentemente ramificada en el átomo 0-3 y/o 0-2 de la xilosa, y se puede sustituir con enlaces dando arabinosa, galactosa, manosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico o por esterificación dando acético ácido (y esterificación de ácido ferúlico dando arabinosa). La hemicelulosa también puede contener glucano, que es un término general para los azúcares de seis carbonos unidos en p (tales como los p-(1,3)(1,4) glucanos y heteroglucanos mencionados previamente) y adicionalmente glucomananos (en los que tanto la glucosa como la manosa están presentes en el esqueleto lineal, unidos entre sí por enlaces p).

Las xilanasas junto con otras enzimas accesorias, por ejemplo, a-L-arabinofuranosidasas, feruloílo y acetilxilano esterasas, glucuronidasas y p-xilosidasas) catalizan la hidrólisis de hemicelulosas.

Las sustancias pécticas incluyen pectinas, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos. Las pectinas son los polisacáridos más complejos en la pared celular vegetal. Se forman alrededor de una cadena central de unidades de ácido D-galacturónico enlazadas en a(1,4) intercaladas hasta cierto grado con L-ramnosa. En una pared celular cualquiera, existen varias unidades estructurales que se ajustan a esta descripción y se ha considerado, en general, que en una única molécula péctica, las cadenas del núcleo de diferentes unidades estructurales son continuas entre sí.

Los principales tipos de unidad estructural son: galacturonano (homogalacturonano), que se pueden sustituir con metanol en el grupo carboxilo y acetato en O-2 y O-3; ramnogalacturonano I (RGI), en el que las unidades de ácido galacturónico se alternan con unidades de ramnosa que llevan cadenas laterales de galactano unido en (1,4) y de arabinano unido en (1,5). Las cadenas laterales de arabinano se pueden fijar directamente a ramnosa o indirectamente mediante las cadenas de galactano; xilogalacturonano, con unidades de xilosilo individuales en O-3 de ácido galacturónico (estrechamente asociado a RGI); y ramnogalacturonano II (RGII), una unidad secundaria particularmente compleja que contiene azúcares poco usuales, por ejemplo, apiosa. Una unidad de RGII puede contener dos restos de apiosilo que, en condiciones iónicas adecuadas, puede formar reversiblemente ésteres con borato.

Una composición para su uso en un proceso de la invención comprende al menos dos actividades, aunque normalmente una composición comprenderá más de dos actividades, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más. Normalmente, una composición puede comprender al menos un celulasa y al menos una hemicelulasa. Sin embargo, una composición puede comprender celulasas, pero no xilanasas. Además, una composición puede comprender actividad enzimática auxiliar, es decir, actividad adicional que, o directamente o indirectamente conduce a la degradación de la lignocelulosa. Los ejemplos de dichas actividades auxiliares se mencionan en el presente documento.

Así, una composición para su uso en la invención puede comprender actividad de endoglucanasa y/o actividad de celobiohidrolasa y/o actividad de p-glucosidasa. Una composición para su uso en la invención puede comprender más de una actividad enzimática en una o más de las clases. Por ejemplo, una composición para su uso en la invención puede comprender dos actividades de endoglucanasa, por ejemplo, actividad de endo-1,3(1,4)-p glucanasa y actividad de endo-p-1,4-glucanasa. Dicha composición también puede comprenden uno o más actividades de xilanasa. Dicha composición puede comprender una actividad enzimática auxiliar.

Una composición para su uso en la invención se puede obtener de Talaromyces emersonii. En la invención, se tiene previsto que un conjunto central de actividades enzimáticas (que degradan lignocelulosa) se puedan obtener de Talaromyces emersonii. Talaromyces emersonii puede proporcionar un conjunto altamente eficaz de actividades como se demuestra en el presente documento para la hidrólisis de biomasa lignocelulósica. Esa actividad puede entonces ser complementada con actividades enzimáticas adicionales de otras fuentes. Dichas actividades adicionales se pueden obtener de fuentes clásicas y/o producir por un organismo genéticamente modificado.

Las actividades en una composición para su uso en la invención son termoestables. En el presente documento, esto significa que la actividad tiene un óptimo de temperatura de 60 °C o más, por ejemplo, aproximadamente 70 °C o más, tal como aproximadamente 75 °C o más, por ejemplo, aproximadamente 80 °C o más tal como 85 °C o más. Las actividades en una composición para su uso en la invención normalmente no tendrán el mismo óptimo de temperatura, pero preferentemente serán, sin embargo, termoestables.

Además, las actividades enzimáticas en una composición para su uso en la invención pueden ser capaces de trabajar a bajo pH. Para los fines de la presente invención, bajo pH indica un pH de aproximadamente 5,5 o menos, aproximadamente 5 o menos, aproximadamente 4,9 o menos, aproximadamente 4,8 o menos, aproximadamente 4,7 o menos, aproximadamente 4,6 o menos, aproximadamente 4,5 o menos, aproximadamente 4,4 o menos, aproximadamente 4,3 o menos, aproximadamente 4,2 o menos, aproximadamente 4,1 o menos, aproximadamente 4,0 o menos, aproximadamente 3,9 o menos, o aproximadamente 3,8 o menos, aproximadamente 3,7 o menos, aproximadamente 3,6 o menos, o aproximadamente 3,5 o menos.

Actividades en una composición para su uso en la invención se puede definir por una combinación de cualquiera de los óptimos de temperatura y valores de pH anteriores.

La composición usada en un proceso de la invención puede comprender, además de las actividades obtenidas de Talaromyces, una celulasa (por ejemplo, una obtenida de una fuente distinta de Talaromyces) y/o una hemicelulasa (por ejemplo, una obtenida de una fuente distinta de Talaromyces) y/o una pectinasa.

Una composición para su uso en la invención puede comprender una, dos, tres, cuatro clases o más de celulasa, por ejemplo, una, dos tres o cuatro o todas de una endoglucanasa (EG), una o dos exo-celobiohidrolasas (CBH) y una pglucosidasa (BG). Una composición para su uso en la invención puede comprender dos o más de cualquiera de estas clases de celulasa.

Se conoce que la enzima p-glucosidasa nativa de Talaromyces es muy activa, el valor de Vmáx para la p-glucosidasa de Talaromyces Cel3a es 512 UI/mg que es considerablemente superior a los valores informados para las pglucosidasas de las otras fuentes fúngicas (P. Murray et al. / Protein Expression and Purification 38 (2004) 248-257). A pesar de la alta actividad de la p-glucosidasa en las composiciones según la invención, y los altos niveles de glucosa logrados, no ocurre la inhibición de glucosa. Esto es ventajoso, puesto que se pueden combinar las altas actividades y los altos niveles de glucosa usando las composiciones.

Una composición puede comprender una actividad que tiene un tipo diferente de actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa que la proporcionada por la composición para su uso en un método de la invención. Por ejemplo, una composición puede comprender un tipo de actividad de celulasa y/o de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa proporcionada por una composición como se describe en el presente documento y un segundo tipo de actividad de celulasa y/o de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa proporcionada por una celulosa/hemicelulasa/pectinasa adicional.

En el presente documento, una celulasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar la celulosa. Un polipéptido que es capaz de degradar la celulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de degradación de la celulosa en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo, en celodextrinas, o completamente en monómeros de glucosa. Una celulasa puede dar lugar a una población mixta de celodextrinas y monómeros de glucosa cuando se ponen en contacto con la celulasa. Dicha degradación tendrá normalmente lugar a modo de una reacción de hidrólisis.

En el presente documento, una hemicelulasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar hemicelulosa. Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar o modificar uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que es capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de degradación de la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, ya sea parcialmente, por ejemplo, en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar, por ejemplo, monómeros de azúcar hexosa o pentosa. Una hemicelulasa puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se ponen en contacto con la hemicelulasa. Dicha degradación normalmente tendrá lugar a modo de una reacción de hidrólisis.

En el presente documento, una pectinasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar pectina. Un polipéptido que es capaz de degradar pectina es uno que es capaz de catalizar el proceso de degradación de la pectina en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo, en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la pectinasa. Dicha degradación tendrá lugar normalmente a modo de una reacción de hidrólisis.

Por consiguiente, una composición puede comprender cualquier celulasa, por ejemplo, una celobiohidrolasa, una endo-p-1,4-glucanasa, una p-glucosidasa o una p-(1,3)(1,4)-glucanasa.

En el presente documento, una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1,4-p-D-glucosídicos en celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos de las cadenas. Esta enzima también se puede denominar celulasa 1,4-p-celobiosidasa, 1,4-p-celobiohidrolasa, 1,4-p-D-glucano celobiohidrolasa, avicelasa, exo-1,4-p-D-glucanasa, exocelobiohidrolasa o exoglucanasa.

En el presente documento, una endo-p-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,4-p-D-glucosídicos en celulosa, liquenina o p-D-glucanos de cereal. Dicho polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar 1,4-enlaces en p-D-glucanos que también contienen enlaces 1,3. Esta enzima también se puede denominar celulasa, avicelasa, p-1,4-endoglucano hidrolasa, p-1,4-glucanasa, carboximetil celulasa, celudextrinasa, endo-1,4-p-D-glucanasa, endo-1,4-p-D-glucanohidrolasa, endo-1,4-p-glucanasa o endoglucanasa.

En el presente documento, una p-glucosidasa (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de restos de p-D-glucosa no reductores terminales con liberación de p -D-glucosa. Dicho polipéptido puede tener una amplia especificidad por p-D-glucósidos y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: un p-D-galactósido, un a-L-arabinósido, un p-D-xilósido o un p-D-fucósido. Esta enzima también se puede denominar amigdalasa, p -D-glucósido glucohidrolasa, celobiasa o gentobiasa.

En el presente documento, una p-(1,3)(1,4)-glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1,4-p-D-glucosídicos en p-D-glucanos que contienen enlaces 1,3 y 1,4. Dicho polipéptido puede actuar sobre liquenina y p-D-glucanos de cereal, pero no sobre p-D-glucanos que solo contienen enlaces 1,3 o 1,4. Esta enzima también se puede denominar liqueninasa, 1,3-1,4-p-D-glucano 4-glucanohidrolasa, p-glucanasa, endop-1 ,3-1,4 glucanasa, liquenasa o p-glucanasa de enlace mixto. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo-1,3(4)-beta-glucanasa. Este tipo de enzima hidroliza enlaces 1,3 o 1,4 en beta-D-glucanasa cuando el resto de glucosa cuyo grupo reductor participa en el enlace a hidrolizar se sustituye él mismo en C-3. Los nombres alternativos incluyen endo-1,3-beta-glucanasa, laminarinasa, 1,3-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolasa; sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de cereal.

Una composición puede comprender cualquier hemicelulasa, por ejemplo, una endoxilanasa, una p-xilosidasa, una a-L-arabionofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una a-galactosidasa, una p-galactosidasa, una p-mananasa o una p-manosidasa.

En el presente documento, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,4-p-D-xilosídicos en xilanos. Esta enzima también se puede denominar endo-1,4-pxilanasa o 1,4-p-D-xilano xilanohidrolasa. Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces 1,4-xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos.

En el presente documento, una p-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de 1,4-p-D-xilanos, para retirar los restos de D-xilosa sucesivos de los extremos no reductores. Dichas enzimas también pueden hidrolizar xilobiosa. Esta enzima también se puede denominar xilano 1,4-p-xilosidasa, 1,4-p-D-xilano xilohidrolasa, exo-1,4-p-xilosidasa o xilobiasa.

En el presente documento, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos, a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos. Esta enzima también se puede denominar a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa.

En el presente documento, una a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronósido H(2)O = un alcohol D-glucuronato. Esta enzima también se puede denominar alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa. Estas enzimas también pueden hidrolizar 4-O-metilated ácido glucurónico -metilado, que también puede estar presente como un sustituyente en xilanos. La alternativa es EC 3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glucuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de enlaces alfa-1,2-(4-O-metil)glucuronosilo.

En el presente documento, una acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la desacetilación de xilanos y xilo-oligosacáridos. Dicho polipéptido puede catalizar la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naftilo o acetato de p-nitrofenilo, pero, normalmente, no de triacilglicerol. Dicho polipéptido no actúa normalmente sobre manano acetilado o pectina.

En el presente documento, una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: feruloil-sacárido H(2)O = ferulato sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Normalmente puede catalizar la hidrólisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoílo (feruloílo) de un azúcar esterificado, que es normalmente arabinosa en sustratos 'naturales'. El acetato de p-nitrofenol y el ferulato de metilo son normalmente sustratos más pobres. Esta enzima también se puede denominar cinamoil éster hidrolasa, ácido ferúlico esterasa o hidroxicinamoil esterasa. También se puede denominar una enzima accesoria de hemicelulasa, puesto que puede ayudar a xilanasas y pectinasas a degradar hemicelulosa y pectina de la pared celular vegetal.

En el presente documento, una cumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: cumaroil-sacárido H(2)O = cumarato sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima también se puede denominar trans-4-cumaroil esterasa, trans-p-cumaroil esterasa, p-cumaroil esterasa o ácido p-cumárico esterasa. Esta enzima también se encuentra dentro de EC 3.1.1.73, por lo que también se puede denominar una feruloil esterasa.

En el presente documento, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de restos de a-D-galactosa no reductores terminales en a-D-galactósidos, que incluyen oligosacáridos de galactosa, galactomananos, galactanos y arabinogalactanos. Dicho polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-D-fucósidos. Esta enzima también se puede denominar melibiasa.

En el presente documento, una p-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de restos de p-D-galactosa no reductores terminales en p-D-galactósidos. Dicho polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-L-arabinósidos. Esta enzima también se puede denominar exo-(1->4)-p-D-galactanasa o lactasa.

En el presente documento, una p-mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis al azar de enlaces 1,4-p-D-manosídicos en mananos, galactomananos y glucomananos. Esta enzima también se puede denominar manano endo-1,4-p-manosidasa o endo-1,4-mananasa.

En el presente documento, una p-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de restos de p-D-manosa no reductores terminales en p-D-manósidos. Esta enzima también se puede denominar mananasa o manasa.

Una composición puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo, una endo-poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta-galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa-ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una exo-poligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa.

En el presente documento, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis al azar de enlaces 1,4-a-D-galactosidurónicos en pectato y otros galacturonanos. Esta enzima también se puede denominar poligalacturonasa pectina depolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli-a-1,4-galacturónido glucanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli(1,4-a-D-galacturónido) glucanohidrolasa.

En el presente documento, una pectin metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que es capaz de catalizar la reacción: pectina n H²O = n metanol pectato. La enzima también se puede conocer como pectinesterasa, pectina demetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa.

En el presente documento, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,4-p-D-galactosídicos en arabinogalactanos. La enzima también se puede conocer como arabinogalactano endo-1,4-p-galactosidasa, endo-1,4-p-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4-p-D-galactanohidrolasa.

En el presente documento, una pectina acetil esterasa se define en el presente documento como cualquier enzima que tiene una actividad de acetil esterasa que cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de los restos de GalUA de pectina

En el presente documento, una endo-pectina liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminativa de éster metílico de (1 ^4)-a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-0-metil-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también se puede conocer como pectina liasa, pectina frans-eliminasa; endo-pectina liasa, transeliminasa polimetilgalacturónica, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1 ^4)-6-0-metil-a-D-galacturonano liasa.

En el presente documento, una pectato liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminativa de (1 ^4)-a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también se puede conocer como transeliminasa poligalacturónica, ácido péptico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido péptico liasa, liasa péctica, ácido a-1,4-D-endopoligalacturónico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo-a-1,4-poligalacturónico liasa, ácido poligalacturónico liasa, pectina trans-eliminasa, ácido poligalacturónico trans eliminasa o (1 ^4)-a-D-galacturonano liasa.

En el presente documento, una alfa-ramnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de restos terminales de a-L-ramnosa no reductores en a-L-ramnósidos o alternativamente en ramnogalacturonano. Esta enzima también se puede conocer como a-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnósido ramnohidrolasa.

En el presente documento, la exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido capaz de hidrolizar el ácido péptico a partir del extremo no reductor, liberando digalacturonato. La enzima también se puede conocer como exopoli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa.

En el presente documento, la exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido capaz de catalizar: (1,4-a-D-galacturónido)ⁿ+ H²O = (1,4-a-D-galacturónido)^n-1+ D-galacturonato. La enzima también se puede conocer como galacturano 1,4-a-galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli(galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli(1,4-a-D-galacturónido) galacturonohidrolasa.

En el presente documento, la exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la escisión eliminativa de 4-(4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil)-D-galacturonato a partir del extremo reductor de pectato, es decir, pectina desesterificada. Esta enzima se puede conocer como pectato disacárido-liasa, pectato exo-liasa, ácido exopéptico transeliminasa, exopectato liasa, ácido exopoligalacturónico-frans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o disacárido-liasa del extremo reductor de (1 ^4)-a-D-galacturonano.

En el presente documento, la ramnogalacturonano hidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar el enlace entre ácido galactosilurónico y ramnopiranosilo en un modo endo en estructuras de ramnogalacturona estrictamente alternas, que consiste en el disacárido [ácido (1,2-alfa-L-ramnoil-(1,4)-alfa-galactosilurónico].

En el presente documento, la ramnogalacturonano liasa es cualquier polipéptido que es cualquier polipéptido que es capaz de escindir enlaces a-L-Rhap-(1 ^4)-a-D-G alp^ en un modo endo en ramnogalacturonano por eliminación beta.

En el presente documento, la ramnogalacturonano acetil esterasa es cualquier polipéptido que cataliza la desacetilación del esqueleto de restos alternos de ramnosa y ácido galacturónico en ramnogalacturonano.

En el presente documento, la ramnogalacturonano galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar ácido galacturónico del extremo no reductor de estructuras de ramnogalacturona estrictamente alternas en un modo exo.

En el presente documento, la xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúa sobre el xilogalacturonano escindiendo el esqueleto de ácido galacturónico sustituido por p-xilosa en un modo endo. Esta enzima también se puede conocer como xilogalacturonano hidrolasa.

En el presente documento, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre los a-L-arabinofuranósidos, a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos. Esta enzima también se puede denominar a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa.

En el presente documento, la endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,5-a-arabinofuranosídicos en 1,5-arabinanos. La enzima también se puede conocer como endo-arabinasa, arabinano endo-1,5-a-L-arabinosidasa, endo-1,5-a-L-arabinanasa, endo-a-1,5-arabanasa; endoarabanasa o 1,5-a-L-arabinano 1,5-a-L-arabinanohidrolasa.

Una composición normalmente comprenderá al menos una celulasa y/o al menos una hemicelulasa y/o al menos una pectinasa (una de las cuales es un polipéptido según la invención). Una composición puede comprender una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una p-glucosidasa. Dicha composición también puede comprender una o más hemicelulasas y/o una o más pectinasas.

Además, una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o todas) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa, una glucuronidasa o una expansina o una proteína inducida por celulosa o una proteína integrante de celulosa o proteína similar puede estar presente en una composición (esto se denomina actividades auxiliares anteriormente).

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos (peptidasas), así como enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otros restos, tales como azúcares (glucopeptidasas). Muchas proteasas se caracterizan en EC 3.4, y son adecuadas para su uso en la invención. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen cisteína proteasas que incluyen pepsina, papaína y serina proteasas que incluyen quimotripsinas, carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas.

"Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos y acilglicéridos, que incluyen fosfoglicéridos, lipoproteínas, diacilgliceroles y similares. En las plantas, los lípidos se usan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua y la infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como cutina y suberina.

"Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o degradar la estructura de los polímeros de lignina. Las enzimas que pueden degradar la lignina incluyen peroxidasas de lignina, peroxidasas de manganeso, lacasas y feruloil esterasas, y otras enzimas descritas en la técnica conocidas por despolimerizar o romper de otro modo los polímeros de lignina. También se incluyen enzimas capaces de hidrolizar enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (en particular arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen, pero no se limitan a, el siguiente grupo de enzimas: lignina peroxidasas (EC 1.11.1.14), manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73).

"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas que son capaces de catalizar una reacción de transferasa, pero que también pueden catalizar una reacción de hidrólisis, por ejemplo, de celulosa y/o productos de degradación de celulosa. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que se puede usar en la invención es una p-glucanosiltransferasa.

Dicha enzima puede ser capaz de catalizar la degradación de (1,3)(1,4)glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de celulosa.

"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucoronósido, por ejemplo, p-glucuronósido para dar un alcohol. Se han caracterizado muchas glucuronidasas y pueden ser adecuadas para su uso en la invención, por ejemplo, p-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirricinato p-glucuronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139).

Una composición para su uso en la invención puede comprender una expansina o proteína de tipo expansina, tal como una swollenina (véase Salheimo et al., Eur. J. Biochem. 269, 4202-4211,2002) o una proteína de tipo swollenina.

Las expansinas participan en el aflojamiento de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de las células vegetales. Se han propuesto expansinas que rompen el enlace de hidrógeno entre la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin tener actividad hidrolítica. De esta forma, se cree que permiten el deslizamiento de las fibras de celulosa y el aumento de la pared celular. La swollenina, una proteína de tipo expansina, contiene un dominio de la familia 1 del módulo de unión a hidratos de carbono del extremo N (CBD) y un dominio de tipo expansina del extremo C. Para los fines de la presente invención, una proteína de tipo expansina o proteína de tipo swollenina puede comprender uno o ambos de dichos dominios y/o puede romper la estructura de las paredes celulares (tal como romper la estructura de celulosa), opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores.

Una composición para su uso en la invención puede ser una proteína inducida por celulosa, por ejemplo, el producto del polipéptido del gen c ip l o cip2 o genes similares (véase Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003), una proteína integradora de celulosa/celulosoma, por ejemplo, el producto de polipéptido del gen cipA o cipC, o una escafoldina o una proteína de tipo escafoldina. Las escafoldinas y las proteínas integradoras de celulosa son subunidades integradoras multifuncionales que pueden organizar subunidades celulolíticas en un complejo multienzimático. Esto se lleva a cabo por la interacción de dos clases complementarias de dominio, es decir, un dominio de cohesión sobre el dominio de escafoldina y de dockerina en cada unidad enzimática. La subunidad de escafoldina también posee un módulo de unión a celulosa (CBM) que media en la fijación del celulosoma a su sustrato. Una proteína integradora de escafoldina o celulosa para los fines de la presente invención puede comprender uno o ambos de dichos dominios.

Una composición para su uso en un proceso de la invención puede estar compuesto de un miembro de cada una de las clases de enzimas mencionadas anteriormente, varios miembros de una clase de enzima, o cualquier combinación de estas clases de enzimas o proteínas auxiliares (es decir, las proteínas mencionadas en el presente documento que no tienen actividad enzimática por sí mismas, pero, sin embargo, ayudan en la degradación lignocelulósica).

Una composición para su uso en un proceso de la invención puede estar compuesto de enzimas de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan enzimas; (3) caldo complejo (tal como el resultante del crecimiento de una cepa microbiana en medio, en donde las cepas secretan proteínas y enzimas en los medios; (4) lisados celulares de cepas cultivadas como en (3); y/o (5) enzimas que expresan el material vegetal. Las diferentes enzimas en una composición de la invención se pueden obtener de diferentes fuentes.

Las enzimas se pueden producir exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego se aíslan y se añaden, por ejemplo, a materia prima lignocelulósica. Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se aíslan, y se puede añadir caldo de fermentación de masa de células en bruto, o material vegetal (tal como tallos y hojas de maíz o paja de trigo), y similares, a, por ejemplo, la materia prima. Alternativamente, se puede tratar la masa de células en bruto o el medio de producción de enzimas o material de planta para prevenir el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, calentando o añadiendo agentes antimicrobianos), luego se añade a, por ejemplo, una materia prima. Estas mezclas enzimáticas en bruto pueden incluir el organismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima se puede producir en una fermentación que usa materia prima (pretratada) (tal como tallos y hojas de maíz o paja de trigo) para proporcionar la alimentación a un organismo que produce una enzima(s). De este modo, las plantas que producen las enzimas pueden ellas mismas servir de materia prima lignocelulósica y añadirse en materia prima lignocelulósica.

En los usos y métodos descritos en el presente documento, los componentes de las composiciones descritas anteriormente se pueden proporcionar simultáneamente (es decir, como una única composición en sí misma) o por separado, o una detrás de otra.

Así, la invención se refiere a procesos en los que se usa la composición descrita anteriormente.

Material lignocelulósico

El material lignocelulósico en el presente documento incluye cualquier material lignocelulósico y/o hemicelulósico. El material lignocelulósico adecuado para su uso como materia prima en la invención incluye biomasa, por ejemplo, biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, extractos orgánicos comerciales, escombros de construcción y de demolición, residuos sólidos municipales, papel usado y desechos de jardín. Las formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos y pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, pasto varilla, miscanto, maíz, tallos y hojas de maíz, cascarillas de maíz, mazorcas de maíz, tallos de colza, tallos de soja, sorgo dulce, granos de maíz que incluyen fibra de los granos, productos y subproductos de la molienda de los granos tales como maíz, trigo y cebada (incluyendo molienda en húmedo y molienda en seco) denominados frecuentemente "salvado o fibra", así como residuo sólido municipal, residuos de papel y restos de jardín. La biomasa también puede ser, pero no se limita a, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos de silvicultura, residuos sólidos municipales, residuos de papel y pulpa y residuos de fábricas de papel. La "biomasa agrícola" incluye ramas, arbustos, cañas, maíz y cascarillas de maíz, cultivos de energía, bosques, frutos, flores, granos, céspedes, cultivos herbáceos, hojas, corteza, agujas, troncos, raíces, árboles jóvenes, cultivos leñosos de rotación corta, arbustos, pastos varilla, árboles, verduras, cáscaras de fruta, vides, pulpa de remolacha azucarera, harinillas de trigo, cáscaras de avena y maderas duras y blandas (que no incluyen maderas con materiales perjudiciales). Además, la biomasa agrícola incluye materiales residuales orgánicos generados a partir de procesos agrícolas que incluyen actividades de la agricultura y la silvicultura, específicamente que incluyen residuo de maderas de la silvicultura. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de la mezcla anteriormente mencionada singularmente o en cualquier combinación o mezcla de las mismas.

Pretratamiento

La materia prima se puede pretratar opcionalmente con calor, modificación mecánica y/o química, o cualquier combinación de dichos métodos para potenciar la accesibilidad del sustrato a la hidrólisis enzimática y/o hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o celulosa y/o lignina, de algún modo conocido en la técnica. En una realización, el pretratamiento se realiza tratando la lignocelulosa con explosión por vapor, tratamiento con agua caliente o tratamiento con ácido diluido o base diluida.

Etapa de lavado

Opcionalmente, el proceso según la invención comprende una etapa de lavado. La etapa de lavado opcional se puede usar para retirar compuestos solubles en agua que pueden actuar de inhibidores para la etapa de fermentación. La etapa de lavado se puede realizar en el modo conocido.

Hidrólisis enzimática

El proceso según la invención comprende una etapa de hidrólisis enzimática. La hidrólisis enzimática incluye, pero no se limita a, hidrólisis con el fin de licuefacción de la materia prima e hidrólisis con el fin de liberar el azúcar de la materia prima o ambos. En esta etapa, el material lignocelulósico opcionalmente pretratado y opcionalmente lavado se pone en contacto con la composición enzimática según la invención. Dependiendo del material lignocelulósico y el pretratamiento, el experto puede adaptar las diferentes condiciones de reacción, por ejemplo, la temperatura, la dosis de enzima, el tiempo de la reacción de hidrólisis y la concentración de materia seca, para lograr una conversión deseada de lignocelulosa en azúcar. Algunas indicaciones se dan después.

En un aspecto de la invención, la hidrólisis se realiza a una temperatura de 60 °C o más, 65 °C o más, o 70 °C o más. La alta temperatura durante la hidrólisis tiene muchas ventajas, que incluyen el trabajar a la temperatura óptima de la composición enzimática, la reducción del riesgo de contaminación (bacteriana), la viscosidad reducida, la cantidad más pequeña de agua de refrigeración requerida, el uso de agua de refrigeración con una temperatura más alta, la reutilización de las enzimas y más.

En un aspecto adicional de la invención, la cantidad de composición enzimática añadida (también denominada en el presente documento la dosis de enzima o carga de enzima) es baja. En una realización, la cantidad de enzima es 6 mg de proteína / g de peso de materia seca o menos, 5 mg de proteína / g de materia seca o menos, 4 mg de proteína / g de materia seca o menos, 3 mg de proteína / g de materia seca o menos, 2 mg de proteína / g de materia seca o menos, o 1 mg de proteína / g de materia seca o menos (expresada como proteína en mg de proteína / g de materia seca). En una realización, la cantidad de enzima es 0,5 mg de enzima / g de peso de materia seca o menos, 0,4 mg de composición enzimática / g de peso de materia seca o menos, 0,3 mg de enzima / g de peso de materia seca o menos, 0,25 mg de enzima / g de peso de materia seca o menos, 0,20 mg de enzima / g de peso de materia seca o menos, 0,18 mg de enzima / g de peso de materia seca o menos, 0,15 mg de enzima / g de peso de materia seca o menos o 0,10 mg de enzima / g de peso de materia seca o menos (expresada como el total de enzimas celulasa en mg de enzima / g de materia seca). Es posible la baja dosis de enzima, puesto que, debido a la actividad y la estabilidad de las enzimas, es posible aumentar el tiempo de la reacción de hidrólisis.

En un aspecto adicional de la invención, el tiempo de la reacción de hidrólisis es 40 horas o más, 50 horas o más, 60 horas o más, 70 horas o más, 80 horas o más, 90 horas o más, 100 horas o más, 120 horas o más, 130 h o más. En otro aspecto, el tiempo de la reacción de hidrólisis es 40-130 horas, 50-120 horas, 60-120 horas, 60-110 horas, 60 100 horas, 70-100 horas, 70-90 horas o 70-80 horas. Debido a la estabilidad de la composición enzimática, son posibles tiempos de reacción de la hidrólisis más largos con rendimientos de azúcar más altos correspondientes.

El experto puede elegir el pH durante la hidrólisis. En un aspecto adicional de la invención, el pH durante la hidrólisis puede ser 3,0 - 6,4. Las enzimas estables de la invención pueden tener un amplio intervalo de pH de hasta 2 unidades de pH, hasta 3 unidades de pH, hasta 5 unidades de pH. El pH óptimo se puede encontrar dentro de los límites de pH 2,0 a 8,0, 3,0-8,0, 3,5-7,0, 3,5-6,0 3,5-5,0, 3,5-4,5, 4,0-4,5 o es aproximadamente 4,2.

En un aspecto adicional de la invención, la etapa de hidrólisis c) se realiza hasta que se libera 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 92 % o más, 95 % o más del azúcar disponible en el material lignocelulósico.

Significativamente, se puede llevar a cabo un proceso de la invención usando altos niveles de materia seca (del material lignocelulósico) en la reacción de hidrólisis. Así, la invención se puede llevar a cabo con un contenido de materia seca de 14 % o más alto, aproximadamente 15 % o más alto, aproximadamente 20 % o más alto, aproximadamente 25 % o más alto, aproximadamente 30 % o más alto, aproximadamente 35 % o más alto o aproximadamente 40 % o más alto. En una realización adicional, el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis c) es 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 % (p/ pms) o más o 14-33 %. La abreviatura pms en el presente documento significa "peso de materia seca", los pesos se expresan en g (gramo).

Fermentación

El proceso según la invención comprende una etapa de fermentación d). Así, en un aspecto adicional, la invención incluye en la etapa d) procesos de fermentación en los que un microorganismo se usa para la fermentación de una fuente de carbono que comprende azúcar(es), por ejemplo, glucosa, L-arabinosa y/o xilosa. La fuente de carbono puede incluir cualquier oligo- o polímero de hidrato de carbono que comprende unidades de L-arabinosa, xilosa o glucosa, tales como, por ejemplo, lignocelulosa, xilanos, celulosa, almidón, arabinano y similares. Para la liberación de unidades de xilosa o glucosa a partir de dichos hidratos de carbono, se pueden añadir carbohidrasas apropiadas (tales como xilanasas, glucanasas, amilasas y similares) al medio de fermentación o se pueden producir por la célula hospedadora modificada. En el último caso, la célula hospedadora modificada puede ser genéticamente manipulada para producir y eliminar dichas carbohidrasas. Una ventaja adicional del uso de las fuentes oligo- o poliméricas de glucosa es que permite mantener una concentración (más) baja de glucosa libre durante la fermentación, por ejemplo, usando cantidades limitantes de la velocidad de las carbohidrasas. Esto, a su vez, prevendrá la represión de sistemas requeridos para el metabolismo y el transporte de azúcares no de glucosa tales como xilosa. En un proceso preferido, la célula hospedadora modificada fermenta tanto la L-arabinosa (opcionalmente xilosa) como la glucosa, preferentemente simultáneamente, en cuyo caso se usa preferentemente una célula hospedadora modificada que es insensible a la represión de la glucosa para prevenir el crecimiento diaúxico. Además de una fuente de L-arabinosa, opcionalmente xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá además el componente apropiado requerido para el crecimiento de la célula hospedadora modificada. Se conocen bien en la técnica las composiciones de los medios de fermentación para el crecimiento de microorganismos tales como levaduras u hongos filamentosos.

El tiempo de fermentación puede ser más corto que en la fermentación convencional en las mismas condiciones, en donde parte de la hidrólisis enzimática todavía tiene que participar durante la fermentación. En una realización, el tiempo de fermentación es 100 horas o menos, 90 horas o menos, 80 horas o menos, 70 horas o menos, o 60 horas o menos, para una composición de azúcar de 50 g/L de glucosa y otros azúcares correspondientes de la materia prima lignocelulósica (por ejemplo, 50 g/L de xilosa, 35 g/L de L-arabinosa y 10 g/L de galactosa. Para composiciones de azúcar más diluidas, el tiempo de fermentación se puede reducir correspondientemente.

El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aerobia o anaerobia. Un proceso de fermentación anaerobia se define en el presente documento como un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferentemente menos de 5, 2,5 o 1 mmol/L/h, más preferentemente se consumen 0 mmol/L/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable), y en donde las moléculas orgánicas sirven de tanto donante de electrones como aceptores de electrones. En ausencia de oxígeno, la NADH producida en la glucólisis y la formación de biomasa no se puede oxidar por fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones y de hidrógeno, regenerando así NAD+. Así, en un proceso de fermentación anaerobia preferido se usa piruvato como electrón (y aceptor de hidrógeno) y se reduce a productos de fermentación tales como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, un antibiótico p-lactámico y una cefalosporina. En una realización preferida, el proceso de fermentación es anaerobio. Es ventajoso un proceso anaerobio puesto que es más barato que los procesos aerobios: se necesita menos equipo especial. Además, se espera que los procesos anaerobios den un rendimiento de producto más alto que los procesos aerobios. En condiciones aerobias, normalmente el rendimiento de biomasa es superior a en condiciones anaerobias. Como consecuencia, normalmente en condiciones aerobias, el rendimiento de producto esperado es inferior a en condiciones anaerobias.

En otra realización, el proceso de fermentación es en condiciones limitadas de oxígeno. Más preferentemente, el proceso de fermentación es aerobio y en condiciones limitadas de oxígeno. Un proceso de fermentación limitada de oxígeno es un proceso en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación del oxígeno se determina por la cantidad y la composición de flujo de gas entrante, así como las propiedades reales de mezcla/transferencia de masa del equipo de fermentación usado. Preferentemente, en un proceso en condiciones limitadas de oxígeno, la tasa de consumo de oxígeno es al menos 5,5, más preferentemente al menos 6 e incluso más preferentemente al menos 7 mmol/L/h.

El proceso de fermentación se realiza preferentemente a una temperatura que es óptima para la célula modificada. Así, para la mayoría de las levaduras o células fúngicas, el proceso de fermentación se realiza a una temperatura que es inferior a 42 °C, preferentemente inferior a 38 °C. Para levadura o células hospedadoras fúngicas filamentosas, el proceso de fermentación se realiza preferentemente a una temperatura que es inferior a 35, 33, 30 o 28 °C y a una temperatura que es superior a 20, 22 o 25 °C.

En la invención, en la etapa d), la fermentación se realiza con un microorganismo que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5. En una realización, el proceso es un proceso para la producción de etanol por el cual el proceso comprende la etapa d) que comprende fermentar un medio que contiene azúcar(es) con un microorganismo que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5, por el cual la célula hospedadora es capaz de fermentar glucosa, L-arabinosa y xilosa en etanol. En una realización de la misma, el microorganismo que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5 es una levadura. En una realización, la levadura pertenece al género Sacaromyces, preferentemente de la especie Sacaromyces cerevisiae, en la que se han hecho las siguientes modificaciones genéticas:

a) un grupo que consiste en los genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1, bajo el control de promotores fuertes,

b) un grupo que consiste en un gen xylA y el gen XKS1, ambos bajo el control de promotores constitutivos,

c) un grupo que consiste en los genes araA, araB y araD y/o un grupo de gen xylA y el gen XKS1;

d) deleción de un gen aldosa reductasa;

y evolución adaptativa del microorganismo modificado resultante. Dicho microorganismo y su preparación se describen con más detalle en el documento de patente WO 2008/041840 y en la solicitud de patente europea EP10160622.6, presentada el 21 de abril de 2010. En una realización, el proceso de fermentación para la producción de etanol es anaerobio. Anaerobio ya se ha definido anteriormente en el presente documento. En otra realización preferida, el proceso de fermentación para la producción de etanol es aerobio. En otra realización preferida, el proceso de fermentación para la producción de etanol es en condiciones limitadas de oxígeno, más preferentemente aerobio y en condiciones limitadas de oxígeno. Las condiciones limitadas de oxígeno ya se han definido anteriormente en el presente documento.

En dicho proceso, la productividad volumétrica del etanol es preferentemente al menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 o 10,0 g de etanol por litro por hora. El rendimiento de etanol en L-arabinosa y opcionalmente xilosa y/o glucosa en el proceso es preferentemente al menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98 %. El rendimiento de etanol se define en el presente documento como un porcentaje del rendimiento máximo teórico que, para glucosa y L-arabinosa y opcionalmente xilosa, es 0,51 g de etanol por g de glucosa o xilosa.

En un aspecto, el proceso de fermentación que conduce a la producción de etanol tiene varias ventajas por comparación con procesos de fermentación del etanol conocidos:

- son posibles los procesos anaerobios;

- también son posibles condiciones limitadas de oxígeno;

- se pueden obtener rendimientos más altos de etanol y tasas de producción de etanol;

- la cepa usada puede ser capaz de usar L-arabinosa y opcionalmente xilosa.

Alternativamente, para los procesos de fermentación descritos anteriormente, se pueden usar al menos dos células distintas, esto significa que este proceso es un proceso de cofermentación. Todas las realizaciones preferidas de los procesos de fermentación como se ha descrito anteriormente también son realizaciones preferidas de este proceso de cofermentación: identidad del producto de fermentación, identidad de la fuente de L-arabinosa y fuente de xilosa, condiciones de fermentación (condiciones aerobias o anaerobias, condiciones limitadas de oxígeno, temperatura a la que se está llevando a cabo el proceso, productividad del etanol, rendimiento de etanol).

El proceso de fermentación se puede llevar a cabo sin ningún requisito para ajustar el pH durante el proceso. Es decir, el proceso es uno que se puede llevar a cabo sin la adición de ácido(s) o base(s). Sin embargo, esto excluye la etapa de pretratamiento, donde se puede añadir ácido. La cuestión es que la composición de la invención es capaz de actuar a bajo pH y, por tanto, no existe necesidad de ajustar el pH del ácido de una materia prima pretratada con ácido con el fin de que pueda tener lugar la sacarificación. Por consiguiente, un método de la invención puede ser un método de residuos cero usando solo productos orgánicos sin requisito de salida de productos químicos inorgánicos.

Tiempo de reacción global

Según la invención, se puede reducir el tiempo de reacción global (es decir, el tiempo de reacción de la etapa de hidrólisis c) y la etapa de fermentación d) juntos). En una realización, el tiempo de reacción global es 150 horas o menos, 140 horas o menos, 130 o menos, 120 horas o menos, 110 horas o menos, 100 horas de menos, 90 horas o menos, 80 horas o menos, 75 horas o menos, o aproximadamente 72 horas con 90 % de rendimiento de glucosa. Se pueden alcanzar tiempos globales correspondientemente más bajos con rendimiento de glucosa más bajo. Esto es independiente del modo en el que se realizan los procesos en modo SHF o SSF.

Productos de fermentación

Los productos de fermentación que se pueden producir según la invención incluyen aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para piensos para animales, productos químicos de especialidad, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, que incluyen etanol combustible (entendiéndose que el término ''etanol'' incluye alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua).

Los productos de valor añadido específicos que se pueden producir por los procesos de la invención incluyen, pero no se limitan a, biocombustibles (incluyendo etanol y butanol); ácido láctico; ácido 3-hidroxipropiónico; ácido acrílico; ácido acético; 1,3-propanodiol; etileno; glicerol; un plástico; un producto químico de especialidad; un ácido orgánico, que incluye ácido cítrico, ácido succínico y ácido maleico; un disolvente; un suplemento para piensos para animales; un producto farmacéutico tal como un antibiótico p-lactámico o una cefalosporina; una vitamina; un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico; una enzima, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa; una materia prima química; o un suplemento para piensos para animales.

Separación del producto de fermentación

El proceso según la invención comprende opcionalmente la recuperación del producto de fermentación. Un producto de fermentación se puede separar del caldo de fermentación de cualquier modo conocido. Para cada producto de fermentación, el experto será así capaz de seleccionar una técnica de separación apropiada. Por ejemplo, se puede separar etanol de un caldo de fermentación de levadura mediante destilación, por ejemplo, destilación con vapor de agua / destilación a vacío en la forma convencional.

Uso de enzimas termoestables en condiciones de temperatura óptima

En una realización, la invención se refiere al uso de enzimas termoestables tales como enzimas celulolíticas de Talaromyces en procesos de hidrólisis y fermentación por separado (SHF) y SSF para la producción de azúcares reductores a partir de materia prima lignocelulósica pretratada en, pero no se limita a, la producción del etanol. Las enzimas celulolíticas de Talaromyces aplicadas en materia prima lignocelulósica pretratada mostraron velocidades de conversión máximas a temperatura dentro del intervalo de 50-70 °C. La enzima sigue siendo activa en estas circunstancias durante 14 días y más sin el cese completo de la actividad.

Usando condiciones de temperatura óptimas, se puede liberar la máxima cantidad de azúcares reductores de la materia prima (hidrólisis total) en el tiempo de hidrólisis más corto posible. De esta forma, se logra el 100 % de conversión de celulosa en glucosa en menos de 5 días (120 h, véase la Figura 1) en un proceso SHF con una dosis de enzima de 0,175 mL (6 mg de proteína) / g de materia seca de materia prima. En condiciones de SSF a 33 °C, la conversión total de la celulosa en materia prima lignocelulósica durará aproximadamente 168 h [2] y por la presente estas condiciones mesófilas determinan el tiempo de proceso requerido para la máxima producción de etanol a partir de materia prima.

En caso de que se usen enzimas celulolíticas termoestables, tales como de Talaromyces, en un proceso SSF con microorganismos termófilos productores de etanol, los tiempos de fermentación serán más cortos ya que las enzimas celulolíticas de Talaromyces liberan los azúcares reductores más rápido a temperaturas más altas que a temperaturas mesófilas.

En la operación SSF, la concentración de producto (g/L) depende de la cantidad de glucosa producida, pero esto no es visible puesto que los azúcares se convierten en producto en la SSF, y las concentraciones de producto se pueden relacionar con concentración de glucosa subyacente por multiplicación con el rendimiento máximo teórico (Yps máx en g de producto por gramo de glucosa)

El rendimiento máximo teórico (Yps máx en g de producto por gramo de glucosa) de un producto de fermentación se puede obtener de la bioquímica de los libros de texto. Para etanol, 1 mol de glucosa (180 g) da según la vía de fermentación por glucólisis normal en levadura 2 moles de etanol (=2x46 = 92 g de etanol. El rendimiento máximo teórico de etanol en glucosa es, por tanto, 92/180 = 0,511 g de etanol/g de glucosa.

Para butanol (MW 74 g/mol) o iso-butanol, el rendimiento máximo teórico es 1 mol de butanol por mol de glucosa. Así, Yps máx para (iso-)butanol = 74/180 = 0,411 g de (iso-)butanol/g de glucosa.

Para ácido láctico, el rendimiento de la fermentación para la fermentación homoláctica es 2 moles de ácido láctico (MW = 90 g/mol) por mol de glucosa. Según esta estequiometria, el Yps máx = 1 g de ácido láctico/g de glucosa.

Para otros productos de fermentación se puede hacer un cálculo similar.

La reducción de coste lograda con la aplicación de las enzimas celulolíticas de Talaromyces será el resultado de una reducción del tiempo de proceso global.

Reducción del tiempo de proceso con enzimas termoestables

Puesto que las enzimas estables permiten un tiempo de hidrólisis prolongado sin pérdidas significativas en la actividad, se pueden aplicar tiempos de hidrólisis de, por ejemplo, 72 horas, dando como resultado conversiones de aproximadamente 90 % del máximo teórico de azúcares reductores obtenidos con solo 0,175 mL de enzima/g de materia seca de materia prima (véase la Figura 1, punto A). La pasta así obtenida se puede usar como sustrato en una etapa de fermentación sucesiva para, por ejemplo, pero no se limita a, la producción de etanol. Aproximadamente el 10 % restante de la celulosa, que todavía no se ha convertido en azúcares reductores, se convertirá en azúcares reductores y directamente en etanol durante la fermentación (SSF). Puesto que dicha fermentación empieza con 90 % de la cantidad máxima de azúcares disponibles al principio de la fermentación, la tasa de liberación de azúcares reductores no determinará la tasa de crecimiento del microorganismo productor de etanol, como lo hace durante la SSF convencional. De esta forma, la producción de etanol puede tener lugar a velocidades de producción más altas, que permiten completar la producción de etanol en menos de 48 h, menos de 45 h, menos de 40 h, menos de 35 h, menos de 30 h, menos de 25 h, por ejemplo 24 h. Así, el tiempo de proceso global se puede reducir desde 7 días hasta menos de 5 días, hasta menos de 4 días, hasta menos de 3 días, hasta menos de 2 días (48 horas). Debido a los tiempos de fermentación más cortos, se usa menos sustrato para el mantenimiento de los microorganismos productores de etanol. El rendimiento global de este enfoque de prolongar el tiempo de hidrólisis y acortar el tiempo de fermentación puede producir un rendimiento de 5-15 % más alto de etanol en sustrato en comparación con la presacarificación y SSF convencionales.

La reducción de coste lograda con la aplicación de enzimas celulolíticas estables, como las de Talaromyces, de esta forma resultará de la reducción de tiempo del proceso global.

Compensación de la dosis de enzima más baja con tiempo de hidrólisis prolongado usando enzimas de Talaromyces

Debido a la alta estabilidad de las enzimas estables, las actividades no cesan con el tiempo, aunque se liberan menos azúcares reductores en el transcurso de la hidrólisis. Es posible reducir la dosis de enzimas y prolongar el uso de la enzima prolongando los tiempos de hidrólisis para obtener niveles similares de azúcares reductores liberados. Por ejemplo, 0,175 mL de enzima/g de materia seca de materia prima produjeron la liberación de aproximadamente 90 % del máximo teórico de azúcares reductores de materia prima pretratada en 72 h (punto A en la Fig. 2). Cuando se usan 0,075 mL de enzima/g de materia seca de materia prima, se logra aproximadamente 90 % de conversión del máximo teórico en 120 h (punto B en la Fig. 2). Los resultados muestran que, debido a la estabilidad de la actividad enzimática, el reducir la dosis de enzima se puede compensar prolongando el tiempo de hidrólisis para obtener la misma cantidad de azúcares reductores. Lo mismo ocurre para la hidrólisis de materia prima pretratada a contenidos de materia seca superiores al 10 %, que muestra el efecto de compensación del tiempo de hidrólisis prolongado al 15 % de materia prima en materia seca.

La reducción de coste lograda usando enzimas celulolíticas estables, tales como de Talaromyces, resulta de requerir menos dosis de enzima, dando como resultado rendimientos de conversión de la hidrólisis similares.

Optimización del proceso de fermentación con enzimas estables

Si la hidrólisis da como resultado niveles reductores de azúcar en o cerca del máximo teórico de azúcares reductores a partir de la materia prima tratada, se puede ajustar y procesar la disolución de azúcares reductores con el objetivo de obtener la composición de disolución de sustrato óptima para la etapa de fermentación. Este ajuste y el procesamiento incluyen, pero no se limitan a, concentración, purificación, ajuste del pH, suplementación de nutrientes adicionales, etc. La fermentación puede empezar por transferencia de la disolución de los azúcares reductores al recipiente de fermentación, o añadiendo el nutriente e inóculo necesario al recipiente que contiene la disolución de azúcares reductores.

Además, se puede optimizar el modo de adición de la disolución de azúcares reductores al recipiente de fermentación para la máxima eficiencia de fermentación, tal como adición en condiciones limitantes de carbono, en modo discontinuo, por lotes alimentados y continuo.

Debido a la estabilidad de las enzimas, la actividad seguirá estando presente durante la fermentación y continuará para convertir la celulosa restante y la celulosa parcialmente hidrolizada en azúcares reductores. De esta forma, las enzimas estables permiten la optimización de la etapa de fermentación sin pérdidas en los rendimientos de conversión global.

La reducción de coste lograda con la aplicación de enzimas celulolíticas estables, tales como de Talaromyces, de esta forma resultará de la maximización de la eficiencia del proceso.

Reducción del riesgo de contaminación con enzimas estables

En un proceso común para convertir material lignocelulósico en etanol, las etapas de proceso se hacen preferentemente en condiciones sépticas para reducir los costes de operación. La contaminación y el crecimiento de microorganismos contaminantes puede, por tanto, ocurrir y dar como resultado efectos secundarios no deseables, tales como la producción de ácido láctico, ácido fórmico y ácido acético, pérdidas de rendimiento de etanol en el sustrato, producción de toxinas y polisacáridos extracelulares, que pueden afectar los costes de producción significativamente. Una alta temperatura del proceso y/o un corto tiempo del proceso limitarán el riesgo de contaminación durante la hidrólisis y la fermentación. Las enzimas termoestables, como las de Talaromyces, son capaces de hidrolizar materia prima lignocelulósica a temperaturas superiores a 60 °C. A estas temperaturas, el riesgo de que un microorganismo contaminante provoque efectos secundarios no deseados será de poco a casi cero.

Durante la etapa de fermentación, en la que se produce etanol, las temperaturas son normalmente entre 30-37 °C y preferentemente no aumentarán debido a las pérdidas de producción. Aplicando tiempos del proceso de fermentación tan cortos como sea posible, se reducirán los riesgos y los efectos de contaminación y/o crecimiento de contaminantes en la medida de lo posible. Con enzimas estables, como las de Talaromyces, se pueden aplicar tiempos de fermentación tan cortos como sea posible (véase la descripción anterior), y así se reducirán en la medida de lo posible los riesgos de contaminación y/o de crecimiento de contaminantes. La reducción de costes lograda con la aplicación de enzimas celulolíticas termoestables de Talaromyces de esta forma resultará del menor riesgo de fallos de proceso debido a la contaminación.

Las enzimas estables reducen los costes de enfriamiento y aumentan la productividad de las plantas de etanol

La primera etapa después del pretratamiento térmico será enfriar la materia prima pretratada hasta temperaturas donde las enzimas sean óptimamente activas. A gran escala, esto se hace normalmente añadiendo agua (enfriada) que, además de disminuir la temperatura, reducirá el contenido de materia seca. Usando enzimas termoestables, como las de Talaromyces, se puede lograr una reducción de costes por el hecho de que (i) se requiere menos enfriamiento de la materia prima pretratada puesto que se permiten temperaturas más altas durante la hidrólisis, y (ii) se añadirá menos agua, que aumentará el contenido de materia seca durante la hidrólisis y la fermentación y así aumentará la capacidad de producción de etanol (cantidad producida por unidad de tiempo por volumen) de una planta de etanol. Por tanto, usando enzimas termoestables según la invención, como las de Talaromyces, también se puede lograr la reducción de costes usando agua de refrigeración que tiene temperatura más alta que el agua que se usa en un proceso con enzima no termoestable.

Recirculación de enzimas después de la hidrólisis con enzimas estables

Al final de la hidrólisis, parece que las actividades enzimáticas son bajas puesto que se liberan pocos azúcares reductores una vez se convierte casi toda la celulosa. Sin embargo, la cantidad de actividad enzimática presente solo se ha reducido un poco, supuestamente principalmente debido a la absorción de las enzimas al sustrato. Aplicando separación sólido-líquido después de la hidrólisis, tal como centrifugación, filtración, sedicantación, etcétera, 60 % o más por ejemplo 70 % de la actividad enzimática en disolución se pueden recuperar y reutilizar para la hidrólisis de una nueva materia prima lignocelulósica pretratada durante la siguiente hidrólisis (véase la Fig. 3).

Además, después de la separación sólido-líquido, la enzima en disolución se puede separar de la disolución que contiene azúcares reductores y otros productos de hidrólisis de las acciones enzimáticas. Esta separación se puede hacer, pero no se limita a, por (ultra y micro)filtración, centrifugación, sedicantación, sedimentación, con o sin primera adsorción de la enzima a un soporte de cualquier tipo.

Por ejemplo, después de la hidrólisis de materia prima pretratada con 0,175 mL/g de carga de enzima de materia seca de materia prima durante 20 h, se libera el 50 % de la cantidad teórica máxima de azúcares reductores y después de la misma hidrólisis durante 72 h, se libera el 90 % de la cantidad teórica máxima de azúcares reductores. Por centrifugación y ultrafiltración, se recuperó el 60-70 % de la actividad enzimática en el concentrado, mientras que el filtrado contuvo más de 80 % de los azúcares reductores liberados. Reutilizando el concentrado, ya sea tal cual o después de más purificación y/o concentración, se puede reducir el 60-70 % de la dosis de enzima durante la siguiente etapa de hidrólisis. La reducción de costes lograda usando enzimas celulolíticas estables, tales como de Talaromyces, de esta forma resulta de requerir menos dosis de enzima.

Recirculación de enzimas después de la hidrólisis en combinación con producción de enzimas y recirculación de células de levadura con enzimas estables

Se puede combinar el proceso que incluye la recirculación de enzimas después de la hidrólisis, como se ha descrito anteriormente, con la recirculación del microorganismo productor de etanol después de la fermentación y con el uso del filtrado que contiene los azúcares reductores como sustrato (purificado y/o concentrado o diluido) en la fermentación para la producción de enzimas y como sustrato para el cultivo del microorganismo productor de etanol.

Recirculación de enzimas después de la destilación a vacío con enzimas estables

La termoestabilidad de las enzimas, como las de Talaromyces, provoca actividad celulolítica residual después de la hidrólisis, la fermentación y la destilación a vacío en las vinazas ligeras. Se reduce la actividad total de la enzima durante las tres etapas de proceso sucesivas con 10-15 unidades de sustrato por g de materia prima en materia seca, independientemente de la dosis de enzima inicial (véase la Fig. 5). Las vinazas ligeras obtenidas después de la destilación a vacío se pueden así reutilizar como una fuente de enzima para un ciclo del proceso de hidrólisisfermentación-destilación recién empezado de la conversión de paja de trigo pretratada en etanol. Las vinazas ligeras se pueden usar o en forma concentrada o (no) diluida y/o purificada y con o sin suplementación de enzimas adicional.

La reutilización de vinazas ligeras para la hidrólisis de material celulósico, polenta y lactosa se describe para un reactor SSF multietapa [2], que tiene como objetivo la producción y la separación continua de productos de fermentación volátiles. En este sistema, se usa una columna que se pone en contacto con gas-líquido para la separación continua del etanol de la pasta. El sistema complejo, sin embargo, requiere enormes cantidades de enzimas para lograr la liberación suficientemente rápida de azúcares reductores de la materia prima lignocelulósica puesto que las condiciones de proceso son inferiores a las óptimas para la enzima usada. La reducción de costes lograda usando enzimas celulolíticas termoestables, como las de Talaromyces, de esta forma resulta de la capacidad de reutilizar la actividad enzimática.

Recirculación de enzimas en combinación con suplementación de enzimas después de la destilación a vacío con enzimas termoestables

En un proceso óptimo, se complementa una cantidad de enzima en la vinaza ligera, antes de su reutilización en un nuevo ciclo de proceso, igual a la cantidad de actividad perdida durante las tres etapas de proceso sucesivas del ciclo de proceso previo. De esta forma se evita la sobredosis de enzima y así se obtiene el uso más eficiente de la enzima.

Además, proporcionando alta dosis de enzima en el primer ciclo de proceso, y suplementando enzima igual a la cantidad de actividad perdida durante las tres etapas de proceso sucesivas en los siguientes ciclos de proceso, se pueden obtener las tasas de hidrólisis más altas posibles en cada ciclo de proceso dando como resultado tiempos de hidrólisis cortos de menos de 48 h en combinación con el uso más eficiente de las enzimas.

Uso de enzimas estables en sistemas mixtos

Aplicando la mezcla durante la hidrólisis, las enzimas se ponen más frecuentemente en contacto con los sustratos, que da como resultado un uso más eficiente de la actividad catalítica. Esto dará como resultado una menor dosis de enzima y así menores costes, a menos que la mezcla tenga un efecto negativo sobre las enzimas. Las enzimas estables, al igual que las enzimas termoestables de Talaromyces, son robustas y pueden resistir a las circunstancias de cizallamiento y temperaturas (locamente) altas, que es el caso durante la intensa mezcla de suspensiones. El uso de ella en sistemas mixtos es, por tanto, beneficioso y conducirá a la reducción de la dosis y así de los costes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Reducción del tiempo de proceso usando composición enzimática que retiene la actividad durante más de 30 horas a temperaturas elevadas

Se hace una comparación entre un proceso en el que la hidrólisis se prolonga hasta 72 horas y un proceso en el que el tiempo para la hidrólisis se limita a 20 horas para demostrar el beneficio de uso de la actividad retenida de la composición enzimática en una hidrólisis prolongada.

Materiales y métodos

El método de hidrólisis y fermentación se describe en la solicitud de patente WO2010018105 (PCT/EP2009/060098). Se usó paja de trigo pretratada como materia prima y se lavó en agua de grifo de 70 °C hasta que el pH fue superior a 3, preferentemente entre 6,0 y 6,5. Se preparó una suspensión de 10 % p/p de la materia prima pretratada lavada y se preincubó a 56 °C. Se añadió la composición enzimática a una concentración de 0,20 g de composición enzimática por g de materia seca de materia prima. La mezcla se dividió en dos porciones A y B iguales y se incubó a 56 °C en una estufa de incubación mientras se agitaba suavemente. Durante esta hidrólisis, se tomaron diariamente muestras para determinar la cantidad de glucosa liberada de la celulosa presente en la suspensión. La porción A representa el proceso en el que se usa un tiempo de hidrólisis de 20 horas; la porción B representa el proceso en el que se usa la actividad retenida en una hidrólisis prolongada de 72 horas.

Después de 20 horas, se sacó la porción A de la estufa de incubación y se enfrió hasta 33 °C. Se realizó la fermentación, según el documento de patente WO2010018105 (PCT/EP2009/060098), mediante la adición de células de levadura y sales e incubando a 33 °C durante 6 días más. El tiempo de proceso de la porción A asciende a aproximadamente 7 días (20 horas de hidrólisis y 6 días de fermentación).

Después de 72 horas, se sacó la porción B de la estufa de incubación y se enfrió hasta 33 °C. Se realizó la fermentación a 33 °C de la misma forma que la porción A, pero se detuvo después de 48 horas. El tiempo de proceso de la porción B asciende a 5 días (3 días de hidrólisis y 2 días de fermentación).

Resultados y discusión

Durante la fermentación, se convierten los azúcares liberados en células de levadura, CO²y etanol. Una vez se detiene la producción de células de levadura, la cantidad de etanol producida es proporcional a la cantidad de dióxido de carbono producida. Puesto que el dióxido de carbono se puede medir en línea, su producción refleja la cantidad de etanol producida. La Tabla 1 da la cantidad de glucosa liberada, la cantidad de dióxido de carbono producida y el rendimiento de etanol final en las porciones A y B.

Tabla 1: Resultados del análisis de glucosa, dióxido de carbono y etanol de la porción A y B.

Los resultados muestran que un periodo de hidrólisis de 20 horas, seguido por un periodo de fermentación de 6 días, da la misma cantidad de etanol que un periodo de hidrólisis de 72 horas seguido por una fermentación de 48 horas. Así, con un tiempo de proceso de 5 días, se logra un nivel de producción de etanol similar a con un tiempo de proceso de 7 días.

Los motivos para esto es que durante la hidrólisis de 20 horas en la porción A se libera menos de 60 % de la cantidad máxima teórica de azúcares. La cantidad restante se libera durante la fermentación, aunque en condiciones menos óptimas debido a la menor temperatura.

En la porción B, la composición enzimática retuvo la actividad durante el periodo de hidrólisis de 72 horas en condiciones más óptimas. Durante esta hidrólisis, se libera el 95 % de la cantidad teórica máxima de glucosa, mientras que la cantidad restante del 5 % se libera durante el periodo de fermentación de 48 horas. Por la presente, se demuestra que la actividad de retención de la composición enzimática se puede usar para acortar el tiempo de proceso y así reducir los costes operacionales.

Ejemplo 2

Reducción de la dosis de enzima aumentando el tiempo de proceso con la composición enzimática que retiene el activo durante más de 30 horas a temperaturas elevadas

En otro experimento, se usó la propiedad de retención de la actividad de la composición enzimática para compensar la baja dosis de enzima por la hidrólisis prolongada.

Materiales y métodos

Se usó el método de hidrólisis y fermentación como se hace referencia en el Ejemplo 1.

Se preparó una suspensión de 10 % p/p de la materia prima pretratada lavada y se preincubó a 56 °C. La suspensión se dividió en dos porciones A y B iguales. Se añadió la composición enzimática a una concentración de 0,20 g de composición enzimática por g de materia seca de materia prima a la porción A y a una concentración de 0,09 g de composición enzimática por g de materia seca de materia prima a la porción B. Las porciones A y B se incubaron a 56 °C en una estufa de incubación mientras se agitaron suavemente durante 220 horas. Durante esta hidrólisis, se tomaron diariamente muestras para determinar la cantidad de glucosa liberada de la celulosa presente en la suspensión. La glucosa medida se representa frente al tiempo de hidrólisis (véase la Fig. 5).

En un experimento separado, se incubaron a 56 °C las porciones A, con 0,20 g de composición enzimática por g de materia seca de materia prima, y la porción B, con 0,09 g de composición enzimática por g de materia seca de materia prima. Después de 72 horas (porción A) y 120 horas (porción B), las porciones se sacaron de la estufa de incubación y se enfriaron hasta 33 °C. Se realizó la fermentación, según el documento de patente WO2010018105 (PCT/EP2009/060098), mediante la adición de células de levadura y sales e incubando a 33 °C durante 48 horas adicionales.

Resultados y discusión

La Fig. 6 muestra la liberación de glucosa de celulosa en una suspensión al 10 % p/p de materia seca de materia prima pretratada con ácido a una dosis de 0,20 y 0,09 g de composición enzimática por g de peso de materia seca de materia prima. Muestra que, aunque se reducen las dosis de enzima, se pueden lograr niveles similares de glucosa si se prolongan los tiempos de hidrólisis. Sorprendentemente, aunque la cantidad de enzima es superior a la mitad, se requirió una prolongación del 60 % del tiempo de hidrólisis para compensar la menor dosis de enzima. Se logra el nivel de 52 g/L en 72 horas cuando se usa una dosis de 0,20 g de composición enzimática por g de peso de materia seca de materia prima, mientras que se logra el mismo nivel en 120 horas cuando se usan 0,09 g de composición enzimática por g de peso de materia seca de materia prima.

En el experimento separado, ambas porciones fermentaron después de 72 (porción A) y 120 horas (porción B, véase la Tabla 2). Aunque el tiempo de hidrólisis fue 60 % más largo para la porción B, se obtuvieron niveles de etanol similares después de la fermentación. De esta forma se demuestra que se puede usar la actividad restante de la composición enzimática para reducir la dosis de enzima, y así para reducir los costes operacionales proporcionalmente.

Tabla 2: Resultados de la hidrólisis y fermentación, comparación de las porciones A y B.

Ejemplo 3

El uso de composición enzimática con actividad de retención permite la reutilización de la actividad después de la hidrólisis

Se realiza un experimento para demostrar el uso de la fracción líquida de la suspensión de materia prima-enzima después de la hidrólisis, como fuente de actividad para la hidrólisis en un próximo ciclo de proceso.

Materiales y métodos

Se usa el método de hidrólisis como se denomina en el Ejemplo 1.

Se prepara una suspensión de 10 % p/p de la materia prima pretratada y se preincuba a 60 °C. Se añade la composición enzimática a una concentración de 0,20 g de composición enzimática por g de materia seca de materia prima y se incuba a 56 °C en una estufa de incubación mientras se agita suavemente durante 120 horas. Entonces se saca la suspensión de la estufa de incubación y se centrifuga a 4500 g. Se lava una vez el sedimento, se centrifuga y el sobrenadante del lavado se combina con el sobrenadante de la primera separación sólido-líquido. Se filtra el sobrenadante combinado, usando un filtro Z200 (un filtro de papel de aproximadamente 0,2 um de espesor de Pall) y se concentra usando una unidad de ultrafiltración enrollada en espiral de 10 kD de PES a 10 °C. El concentrado así obtenido se usa como fuente de enzimas en una segunda hidrólisis con materia prima pretratada nueva en las condiciones que se han descrito anteriormente. Todas las corrientes de proceso se analizan para actividad de glucosa y enzimática.

Resultados y discusión

El análisis de las corrientes demuestra que la glucosa se puede separar de la enzima usando separación sólido-líquido, seguido por filtración y ultrafiltración. La actividad enzimática del concentrado de UF permanece a un nivel de 70 % de la actividad original después de la hidrólisis, como se muestra en la Fig 4. Esto significa que, usando la composición enzimática con actividad de retención y usando las etapas de recuperación descritas aquí, la enzima se puede reutilizar para la hidrólisis de materia prima en un ciclo de proceso sucesivo. Se recupera aproximadamente el 86 % de la glucosa, y se puede usar como una corriente clara del proceso en la fermentación.

Por la recuperación de actividad enzimática después de la hidrólisis se hace posible reutilizar esta actividad enzimática y así reducir gastos en enzimas. Además, la corriente clara de proceso que contiene la glucosa dará como resultado menos mantenimiento y costes de energía como resultado de la ausencia de sólidos durante la fermentación y la destilación.

Ejemplo 4

El uso de composición enzimática con actividad de retención permite la reutilización de actividad después de la destilación

Se realiza un experimento para demostrar el uso de vinazas ligeras, obtenidas después de la hidrólisis con composición enzimática con actividad de retención, fermentación y destilación, como fuente de actividad para la hidrólisis.

Materiales y métodos

Se usa el método de hidrólisis y fermentación como se denomina en el Ejemplo 1.

Se prepara una suspensión de 10 % p/p de la materia prima pretratada lavada y se preincuba a 56 °C. La composición enzimática se añade a una concentración de 0,20 g de composición enzimática por g de materia seca de materia prima y se incuba a 56 °C en una estufa de incubación mientras se agita suavemente durante 20 horas. Se saca la suspensión de la estufa de incubación y se enfría hasta 33 °C. La fermentación se realizó, según el documento de patente PCT/EP2009/060098, mediante la adición de células de levadura y sales e incubando a 33 °C durante 148 horas.

Se destila la suspensión, usando destilación a vacío durante 20 minutos a 100 mbares y 60 ± 1 °C hasta que se retira todo el etanol. Se centrifuga la suspensión, que contiene residuos insolubles, células de levadura y enzimas, para retirar los residuos insolubles y las células de levadura; y se recoge el sobrenadante. El sobrenadante se denomina más adelante vinaza ligera.

Se añade materia prima pretratada a la vinaza ligera a una concentración de 10 % en peso de materia seca. La suspensión así obtenida se divide en varias porciones iguales a cada una de las cuales se añade una cantidad de enzima en el intervalo de 0 a 0,58 g de enzima por g de materia seca de materia prima. La suspensión se incuba entonces a 56 °C durante 20 horas y se libera la cantidad de glucosa.

Resultados y discusión

Para distinguir entre actividades enzimáticas altas y bajas, la hidrólisis no debe durar hasta que se hidroliza toda la celulosa. Por tanto, aquí se usa un tiempo de hidrólisis de 20 horas. La cantidad de glucosa liberada dentro de estas 20 horas depende de la cantidad de enzima presente durante la hidrólisis. La máxima cantidad de glucosa es el nivel indicado en la Fig. 6, y aquí se establece al 100 %.

Como se puede apreciar en la Fig. 7, la vinaza ligera sin enzima añadida contiene actividad hidrolítica que resulta del uso de la composición enzimática con actividad de retención en el ciclo de proceso anterior. Por tanto, el usar composición enzimática suspensa en vinaza ligera potencia la liberación de glucosa en comparación con la composición enzimática suspensa en agua. Esta mejora es más significativa a dosis de enzima más bajas, que se pueden explicar por el hecho de que, aumentando las actividades enzimáticas, disminuyen antes en el tiempo las tasas de liberación de glucosa como también se muestra en la Fig. 7. La curva de la alta dosis de enzima se flexiona antes que la curva de la baja dosis de enzima.

Reutilizando las vinazas ligeras en la hidrólisis, se puede reducir la dosis de enzimas y así se puede obtener una reducción en el coste.

Ejemplo 5

Hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y fermentación con levadura conversora de C5.

Hidrólisis

Se hidrolizaron enzimáticamente muestras de tallos y hojas de maíz y paja de trigo pretratadas con ácido diluido usando una preparación de celulasa de amplio espectro experimental a 60 °C durante 3 días (72 horas). El pH al comienzo de la hidrólisis fue 5,0. El contenido de materia seca al comienzo de la hidrólisis fue 10 % p/p.

Las condiciones para la hidrólisis de muestras de fibra de maíz pretratadas fueron esencialmente las mismas, excepto que la temperatura de la hidrólisis fue 50 °C y el contenido de materia seca al comienzo de la hidrólisis fue 13,8 %.

Después de la hidrólisis (72 h), se dejó que las muestras se enfriaran hasta temperatura ambiente. El pH se ajustó a 5,5 usando 10 % de NaOH. Posteriormente, se añadió 1 mililitro de 200 gramos por litro de (NH4)2SO4 y 1 mililitro de 100 gramos por litro de KH2PO4.

Fermentación

Entonces, se añadieron muestras de levadura correspondientes a un contenido de materia seca de levadura de 1 gramo de levadura por kilogramo de hidrolizado. Se siguió el desprendimiento de CO2 en el tiempo usando el AFM (monitor de fermentación de alcohol; HaloteC Instruments BV, Veenendaal, Países Bajos). Los experimentos se realizaron al menos por triplicado, durante 72 horas a 33 °C. Uno de estos se muestrea a intervalos regulares para que sean capaces de analizar la formación de etanol y las concentraciones de azúcar residual. Estos datos se pueden usar para calcular los rendimientos de fermentación. No se muestrea el caldo de los otros dos experimentos, al final de la fermentación el caldo se destila usando una unidad de destilación de Buchi K-355 al 45 % de vapor durante 15 minutos. El alcohol producido se determina usando un medidor de densidad Anton Paar DMA 5000 (Anton Paar Benelux BVBA, Dongen, Países Bajos).

La cepa usada para la fermentación es BIE252, cuya preparación se describe en la solicitud de patente europea EP10160622.6, presentada el 21 de abril de 2010. Esta cepa es una cepa de Saccharomyces cerevisiae que se ha adaptado genéticamente para permitir que metabolice azúcares C5, es decir, xilosa y arabinosa.

Se cultivó BIE252 durante la noche en matraces con agitación que contenían medio YEP complementado con 2 % de glucosa. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron a una concentración de 50 gramos de materia seca por litro.

Las materias primas que se probaron consistieron en lotes de fibra de maíz, tallos y hojas de maíz y paja de trigo. La hidrólisis y la fermentación se realizaron como se describe en la sección de materiales y métodos.

Los resultados se presentan en las Figuras 17 (fibra de maíz), 18 (tallos y hojas de maíz) y 19 (paja de trigo). En el caso de tallos y hojas de maíz y paja de trigo, las materias primas con una cantidad relativamente baja de galactosa y arabinosa, pero que consisten principalmente en glucosa y xilosa, todos los azúcares se convirtieron en 72 horas en CO2 y etanol. En el caso de fibra de maíz (Figura 17), queda una baja cantidad residual de arabinosa, galactosa y xilosa.

En las tablas a continuación, se calculó el rendimiento de la fermentación, basado en los azúcares liberados al final de la hidrólisis y la cantidad de etanol que se produjo al final de la fermentación.

Tabla 3: Azúcar total liberado (g/L), etanol producido (g/L) y rendimiento de etanol (g^etanol/g^azúcar) de la fermentación de BIE252, para diferente materia prima lignocelulósica

Basado en la cantidad de etanol producido al final de la fermentación, como se ha determinado por la medición con el medidor de densidad de Anton Paar DMA 5000, y la cantidad de materia prima pretratada que se usó, se calcularon los rendimientos de la hidrólisis y de la fermentación global, por duplicado. Estas cifras se exponen en la Tabla 4.

Tabla 4: Rendimiento de la hidrólisis y de la fermentación global (galones de etanol por tonelada de materia seca) de fermentación de BIE252, para diferente materia prima lignocelulósica

Bibliografía

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[3] WO 2007/091231

[4] Murray, P., et al., Enzyme Microbial Technol 29 (2001) 90-98;

[5] Dow, N., and McMillian, J. Technical Report NREL/TP-510-42630, enero de 2008;

[6] US 5141861;

[7] WO 2008/008793.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material lignocelulósico, que comprende las siguientes etapas:

a) opcionalmente, pretratamiento;

b) opcionalmente, lavado;

c) hidrólisis enzimática;

d) fermentación; y

e) opcionalmente, recuperación de un producto de fermentación;

2. Proceso según la reivindicación 1, en donde el tiempo de reacción en las etapas (c) y (d) junto es 150 horas o menos al 90 % de liberación de glucosa o un tiempo correspondientemente más corto a menor porcentaje de liberación de glucosa.

3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, en donde el tiempo de fermentación es 18-120 horas.

4. Proceso según la reivindicación cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición enzimática usada retiene la actividad durante 30 horas o más.

5. Proceso según la reivindicación cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la hidrólisis se realiza a una temperatura de 65 °C o más, o 70 °C o más.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición enzimática se obtiene de un microorganismo del género Talaromyces.

7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la composición enzimática usada retiene actividad en el periodo de tiempo de 30-500 horas.

8. Proceso según la reivindicación cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la etapa (c) se realiza hasta que se libere 70 % o más del azúcar disponible en el material lignocelulósico.

9. Proceso según la reivindicación 8, en donde la etapa (c) se realiza hasta que se libera 90 % o más del azúcar disponible en el material lignocelulósico.

10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la dosis de composición enzimática es 6 mg de proteína / g de peso de materia seca o menos.

11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis (c) es 20 % p/peso de materia seca o más.

12. Proceso según la reivindicación 11, en donde el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis (c) es 25 % p/peso de materia seca o más.

13. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde en la etapa (e) después de recuperación del producto de fermentación, la suspensión resultante que contiene enzima se recircula a la etapa (c).

14. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el producto de la etapa de hidrólisis (c) se somete a separación sólido-líquido y parte de la fracción líquida se alimenta a la etapa de fermentación (d).

15. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el producto de la etapa de hidrólisis (c) se somete a separación sólido-líquido y parte de la fracción líquida se recircula a la etapa (c).

16. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el producto de la etapa de hidrólisis (c) se somete a separación sólido-líquido y la fracción líquida se alimenta a una unidad de ultrafiltración, en donde el filtrado se alimenta a la etapa de fermentación (d) y el concentrado se recircula a la etapa (c).

17. Proceso según la reivindicación 16, en donde parte del filtrado se usa para alimentar los fermentadores de producción para la producción de los microorganismos usados en el proceso.

18. Proceso según la reivindicación 16 o 17, en donde parte del filtrado se usa para alimentar los termentadores de producción para la producción de enzima.

19. Proceso según la reivindicación 17 o 18, en donde parte del filtrado se usa para alimentar los termentadores de producción para la producción de producto de fermentación.

20. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que el filtrado se usa para alimentar los termentadores de producción en modo de cultivo discontinuo, de lotes alimentados y/o continuo.