ES2823729T3 - Obtención de imágenes intraoperatoria - Google Patents
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Abstract
El agente de contraste DA364 de fórmula **(Ver fórmula)** para el uso como una sonda fluorescente para la detección y la demarcación de un margen de un tumor en la cirugía guiada de un paciente individual, en donde dicho tumor es un tumor que muestra una sobreexpresión reducida o variable de receptores de integrina αvβ3, siendo dicha expresión de 0,15 ng de integrina αvβ3/μg de proteínas o menos.
Description
DESCRIPCIÓN
Obtención de imágenes intraoperatoria
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la obtención de imágenes intraoperatoria in vivo. Más particularmente, la invención se refiere al uso de la sonda fluorescente del infrarrojo cercano (NIR) DA364 que comprende un péptido cíclico basado en azabicicloalcano marcado con un resto de colorante Cy5.5 en la cirugía guiada de tumores y regiones patológicas. La invención se refiere además a un método de obtención de imágenes óptica que comprende usar esta sonda fluorescente en la obtención de imágenes intraoperatoria, para la identificación y la demarcación de los márgenes de un tumor durante su resección quirúrgica.
Estado de la técnica
En las últimas décadas, se han dedicado esfuerzos considerables al desarrollo de modalidades terapéuticas mejoradas, tales como quimioterapia y radioterapia focalizadas, para el tratamiento de enfermedades agudas y cánceres. Sin embargo, la cirugía curativa todavía es el tratamiento de elección para la mayoría de los cánceres, especialmente para enfermedades malignas en fases tempranas, y la resección quirúrgica es actualmente la referencia para el tratamiento de la mayoría de los pacientes con cáncer (CA Cancer J. Clin. 2012; 62:220-241). Por ejemplo, el 93% de los pacientes con cáncer de mama en una fase temprana (I y II) y el 75% de los que están en una fase tardía (III y IV) se tratan quirúrgicamente; la cirugía para eliminar el cáncer y los nódulos linfáticos próximos es el tratamiento más común para el cáncer de colon (fase I y II) (94%) y rectal (74%) en fase temprana. Una colostomía se usa más comúnmente para el cáncer rectal (26%) que para el cáncer de colon (7%). La prostatectomía radical es el tratamiento de elección para el 57% de los pacientes con cáncer de próstata entre las edades de 18 y 64 años y el 33% de pacientes con edades de 65 a 74.
A pesar de los importantes avances en las técnicas de obtención de imágenes preoperatoria y tratamientos posoperatorios asociados, el pronóstico del paciente está esencialmente asociado con el éxito de la cirugía original, a saber, con la eliminación quirúrgica completa de los tejidos y las células cancerosos. Por lo tanto, es crítico para el éxito del tratamiento quirúrgico y la supervivencia del paciente la identificación y la demarcación claras de los márgenes del tumor que ayuden al cirujano a evitar eliminar o lesionar tejidos sanos y, especialmente, no dejar células tumorales residuales que conduzcan a la formación de recaídas locales, con efectos a menudo graves o letales (Ann Surg 2005; 241: 715-724).
En la actualidad, la mayoría de la cirugía oncológica se realiza bajo la única guía proporcionada por la inspección visual y la palpación directa del cirujano, donde la experiencia del cirujano y su capacidad para discriminar tejidos patológicos de tejido normal son las únicas guías disponibles en la elección de los tejidos que se van a resecar. Sin embargo, a menudo los tejidos cancerosos son difíciles de distinguir de un edema o una inflamación peritumoral por el ojo humano, o son demasiado pequeños para ser palpados con las manos. Entonces, surgen dificultades adicionales a partir de las diferencias marcadas existentes entre tipos de tumores y pacientes oncológicos, y la falta consiguiente de protocolos quirúrgicos.
Por lo tanto, existe un interés creciente en el desarrollo de tecnologías y sondas de obtención de imágenes concordantes con el incremento de la capacidad del cirujano para "ver" los márgenes del tumor y mejorar así los resultados quirúrgicos.
A lo largo de los últimos años, el uso de luz fluorescente y luz blanca estándar integradas ha entrado en el escenario quirúrgico, demostrando permitir la diferenciación entre tejidos sanos y patológicos, especialmente cuando se acoplan con fluoróforos del infrarrojo cercano (NIR) focalizados hacia la zona patológica. Ventajas de la luz fluorescente NIR, que actúa dentro del intervalo del NIR de 700 - 900 nm, incluyen una penetración en los tejidos de milímetros a centímetros, dispersión y autofluorescencia reducidas que maximizan el contraste de señal a fondo proporcionado por agentes de contraste del NIR exógenos. Por otra parte, la obtención de imágenes por fluorescencia NIR proporciona al cirujano ventajas tales como visualización en tiempo real, obtención de imágenes sin contacto, falta de radiación ionizante y vista inalterada del campo de visión quirúrgico. En este sentido, de hecho, solo la activación de un sistema de obtención de imágenes intraoperatoria específico permite al cirujano "ver" el agente de contraste que, de otro modo, sería invisible para el ojo humano, evitando de ese modo la contaminación de la imagen clínica observada por el cirujano (Mol Imaging. 2010; 9(5): 237-255).
Se ha dedicado un interés creciente a sondas de obtención de imágenes fluorescentes NIR que maximicen la relación de señal a fondo (SBR) registrada en el emplazamiento del tumor y permitan la identificación y la demarcación de la zona tumoral de interés.
Las integrinas, especialmente avp3 y avp5, son proteínas de la superficie celular transmembranarias expresadas por la mayoría de los tipos celulares que se sabe que son reguladas al alza sobre células endoteliales activadas durante la
neovascularización de varias enfermedades malignas, p. ej., incluyendo melanoma, glioblastoma, cáncer de ovario, mama, pulmón, hígado y colon, donde representan un papel importante en la fase temprana de angiogénesis tumoral, y en procesos que gobiernan el crecimiento y la metástasis tumorales (Mol. Cancer Ther. 2005;4:1670-1680). Como tales, constituyen una diana atractiva para sondas fluorescentes NIR focalizadas hacia tumores. En efecto, la mayoría de las sondas focalizadas hacia tumores actualmente bajo estudio incluyen en su estructura un resto focalizado hacia integrina basado en RGD destinado a acumular la sonda fluorescente en el emplazamiento tumoral elegido como diana.
Agentes diagnósticos focalizados hacia integrina para obtención de imágenes médica, incluyendo obtención de imágenes óptica, se divulgan, a modo de ejemplo, en el documento WO2006/095234.
La sonda fluorescente NIR que incluye un péptido cíclico basado en azabicicloalcano marcado con un colorante Cy5.5 que se identifica como DA364, y tiene la siguiente fórmula
y su uso para la detección de imágenes óptica de integrina av03 en xenoinjertos de glioblastoma y para el diagnóstico temprano del cáncer de mama se divulgan en Contrast Media & Molecular Imaging 2011; 6:449-458 y Contrast Media & Molecular Imaging 2013; 8, 350-360, respectivamente.
Fluoróforos NIR dipolares y sus derivados de RGD focalizados hacia integrinas se divulgan en Nature Biotechnology 2013; 31(2), 148-153 y en la bibliografía citada, y su uso en la obtención de imágenes por fluorescencia del infrarrojo cercano tanto de cáncer colorrectal como de los uréteres se han divulgado recientemente en Ann. Surg. Oncol. 11 de febrero de 2014 (publicado en línea, antes de la impresión). Estas sondas fluorescentes se han manipulado específicamente para proporcionar una relación de señal a fondo (sin tumor) (SBR) optimizada y, así, una visualización y demarcación óptimas de aquellos tumores peculiares que tienen una marcada sobreexpresión de integrina avP3.
También se ha divulgado un agente fluorescente NIR focalizado hacia el cáncer de próstata que comprende un fluoróforo NIR conjugado a un péptido o una molécula directora pequeña que acumula la sonda fluorescente en el emplazamiento tumoral elegido como diana a través de la interacción de unión con el antígeno membranario específico de la próstata (PSMA) (véase, a modo de ejemplo, Mol. Imaging 2005; 4(4), 448-462 y la bibliografía citada).
También se han obtenido agentes de contraste NIRF específicos para tumores mediante la conjugación de fluoróforos NIR con anticuerpos monoclonales o FABs aprobados por la FDA y clínicamente disponibles (p. ej. bevacizumab o cetuximab) o péptidos (véase, a modo de ejemplo, J. Nucl. Med. 2011; 52:1778-1785).
Agentes de obtención de imágenes óptica que comprenden conjugados de colorantes del infrarrojo cercano con polímeros de polietilenglicol (PEG) sintéticos se divulgan en el documento WO2010/106169 y la bibliografía citada.
Sin embargo, una posible limitación al uso de estas sondas macromoleculares en la obtención de imágenes intraoperatoria está representada por su gran dimensión, que típicamente incrementa significativamente su persistencia en la circulación antes de una depuración completa del sistema sanguíneo (Mol. Cancer Ther. 2009; 8:2861 -2871, y T rends in Pharmacological Sciences Vol. 29 N° 2).
Andamiajes de RAFT (plantilla funcionalizada focalizable regioselectivamente) funcionalizados (RAFT) injertados a motivos de focalización hacia integrina av03 sobre una de las caras y a marcadores de cianina sobre la otra cara y su uso en la detección intraoperatoria de márgenes tumorales se divulgan en el documento WO2010/076334.
Sin embargo, la principal limitación al desarrollo de la cirugía guiada por fluorescencia NIR reside en obstáculos probados encontrados al traducir los agentes NIR para obtención de imágenes óptica fluorescente a la aplicación clínica intraoperatoria y en la escasa disponibilidad de sondas fluorescentes NIR validadas.
En efecto, un procedimiento de obtención de imágenes diagnóstica requiere que, en un margen de tiempo compatible con la obtención de imágenes del paciente, el agente de contraste fluorescente se acumule preferentemente en un emplazamiento patológico y produzca localmente una señal significativamente superior a la observada en el tejido sano circundante (y que no esté atenuada o dispersada por el tejido vivo). A este fin, es bastante irrelevante si la señal es generada por un agente de contraste unido al resto tumoral elegido como diana o todavía circulante, al menos parcialmente, en la vascularización tumoral regulada al alza. Por lo tanto, la eliminación completa de la sonda no unida de la circulación no es una necesidad en la obtención de imágenes diagnóstica fluorescente NIR. Asimismo, con propósitos de diagnóstico, no es necesario que la SBR permanezca óptima durante tiempos prolongados, tales como los de la cirugía.
En el caso de la cirugía guiada, la acumulación preferente de la sonda fluorescente NIR en el emplazamiento tumoral de interés es una condición necesaria, pero no es suficiente.
Un agente de contraste NIRF para el uso en cirugía guiada debe presentar una diferencia de concentración de la sonda fluorescente entre tejido sano y patológico clara, precisa y persistente, a fin de asegurar una demarcación clara y exacta de los márgenes tumorales durante toda la extirpación tumoral quirúrgica. Al mismo tiempo, es absolutamente necesario que la sonda fluorescente circulante (no unida) esté completamente depurada del sistema sanguíneo antes de la cirugía, a fin de evitar que cualquier agente de contraste residual liberado con sangrado (producido durante la cirugía) pueda contaminar el escenario quirúrgico y confundir el campo visual del cirujano.
Para alcanzar estos resultados, un agente fluorescente NIR adecuado para el uso en cirugía guiada por imagen debe presentar:
- un tiempo de permanencia óptimo en el sistema sanguíneo, suficientemente prolongado para asegurar un tiempo de contacto suficiente del agente con la diana (y, de ahí, su acumulación efectiva en el emplazamiento elegido como diana) y, al mismo tiempo, la eliminación completa del agente no unido del sistema circulatorio;
- una acumulación selectiva en el emplazamiento tumoral elegido como diana, incluyendo tanto una absorción selectiva como una distribución homogénea del agente en la zona patológica, y una retención suficiente (en el emplazamiento tumoral) concordante con la demarcación clara de toda la región tumoral a lo largo de la cirugía;
- una cinética de liberación lenta y una extracción y difusión insignificantes (del agente fluorescente) desde la zona patológica hacia el tejido sano, a fin de evitar la contaminación de los márgenes del tumor o comprometer el reconocimiento de tejidos infiltrantes; además
- la sonda fluorescente debe proporcionar una señal que no esté reducida o comprometida debido a una exposición prolongada a la luz de excitación.
Por lo tanto, son de importancia crítica la velocidad de depuración y la ruta de depuración del agente NIR, puesto que controlan la semivida en sangre y, de ahí, el tiempo de contacto con la diana de interés, e influyen además en la señal de fondo en los órganos de excreción. Igualmente importante es la afinidad presentada por la sonda NIR para la diana, que tiene que ser casi absoluta, o totalmente compatible con cualquier absorción inespecífica existente.
Pueden surgir dificultades adicionales de la expresión, tanto en cuanto a la abundancia como a la uniformidad de la distribución de los receptores o epítopos elegidos como diana en el tumor de interés, ambas de las cuales dependen mucho del tipo de tumor, el paciente y el efecto promovido por cualesquiera pretratamientos terapéuticos opcionales, a modo de ejemplo llevados a cabo para reducir la masa tumoral antes de la cirugía.
De hecho, la sobreexpresión de algunos receptores tumorales típicos, a modo de ejemplo las integrinas, puede disminuir o ser modificada por el efecto, p. ej., de tratamientos quimioterapéuticos para comprometer la acumulación efectiva de sondas focalizadas específicamente hacia estos receptores en tumores o metástasis pretratados y, a su vez, su capacidad para proporcionar una demarcación fiable de los mismos.
Finalmente, los efectos engañosos provocados por las diferentes propiedades ópticas de los diferentes tejidos pueden impedir o reducir la capacidad de un agente de contraste para diferenciar entre zonas de tejidos sanos y tumorales especialmente para los agentes que funcionan fuera del margen óptico del tejido (NIR), tales como fluoresceína y 5-ALA. Esta limitación se empeora particularmente en los márgenes del tumor en los que la señal fluorescente puede ser baja.
La multiplicidad y complejidad de los factores anteriores es probablemente la razón detrás del hecho de que, aunque se haya desarrollado y probado en estudios clínicos una variedad de nuevos fluoróforos y agentes fluorescentes NIR específicos de tumores, bien explotando una especificidad para receptores tumorales o bien una especificidad para marcadores angiogenéticos tumorales, ninguno de ellos haya obtenido todavía una aprobación clínica.
En efecto, los únicos agentes de contraste fluorescentes NIR aprobados por la FDA son el azul de metileno (MB) y el verde de indocianina (ICG) que sigue siendo, este último, el producto de referencia en la práctica clínica actual. Ninguno de ellos se focaliza hacia tumores.
Por lo tanto, existe una necesidad de sondas fluorescentes NIR específicas para tumores y modalidades de obtención de imágenes intraoperatoria que permitan al cirujano una detección en tiempo real de los márgenes del tumor y faciliten la extirpación radical y precisa de las zonas patológicas.
Sumario de la invención
Según se menciona anteriormente, el uso del agente fluorescente NIR identificado como DA364, y que tiene la fórmula representada anteriormente, para la obtención de imágenes óptica de tumores que sobreexpresan intensivamente integrinas avp3, se conocía en el campo diagnóstico a partir de la bibliografía citada anteriormente.
Se ha encontrado ahora que este compuesto se puede usar eficazmente en la obtención de imágenes intraoperatoria para proporciona una detección y demarcación en tiempo real de los márgenes del tumor durante la cirugía curativa de tumores guiada por obtención de imágenes por fluorescencia NIR. Así, el uso de DA364 puede ayudar al cirujano a reducir el riesgo de dejar tejido tumoral residual o eliminar innecesariamente porciones grandes de tejidos sanos (con el riesgo asociado de lesionar posiblemente la inervación y la vascularización locales).
Por otra parte, se ha observado que este agente proporciona una acumulación y una retención óptimas en el emplazamiento tumoral, permitiendo así una clara identificación y demarcación de los márgenes del tumor, incluso de tumores que tengan una sobreexpresión reducida de integrina.
Según esto, en general, la presente invención se refiere a la sonda fluorescente DA364 para el uso según las reivindicaciones.
En la obtención de imágenes intraoperatoria, y, más particularmente, en la cirugía de tumores, DA364 proporciona al cirujano una detección y una demarcación en tiempo real de los márgenes del tumor, más particularmente en la cirugía curativa guiada por fluorescencia NIR de un tumor o una zona patológica en un paciente, para la detección y la demarcación intraoperatorias de los márgenes de la zona patológica o la región tumoral que se va a extirpar.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende el agente de contraste fluorescente NIR conocido como DA364 para el uso en la obtención de imágenes intraoperatoria, para la identificación y la demarcación en tiempo real de los márgenes del tumor, según la reivindicación 8.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método de obtención de imágenes intraoperatoria que comprende usar DA364 como un agente de contraste para identificar y demarcar los márgenes del tumor sometido a cirugía curativa.
En un aspecto adicional más, la divulgación se refiere a un protocolo de cirugía guiada para la cirugía curativa de una masa, zona o región tumoral en un paciente, que comprende usar DA364 y luz fluorescente para la delimitación y demarcación intraoperatorias o peroperatorias de los márgenes del tumor.
Descripción detallada de la invención
Para proporcionar un apoyo útil a un cirujano, un agente de contraste eficaz para el uso en cirugía guiada será capaz de acumularse selectivamente en el emplazamiento patológico de interés de un modo sustancialmente homogéneo, a fin de proporcionar una detección clara de toda la zona tumoral y una demarcación nítida y persistente de sus límites.
Ha resultado que el agente de contraste DA364 asegura una acumulación y una retención óptimas en el emplazamiento tumoral y a continuación proporciona localmente una señal fluorescente persistente que permite que el cirujano "vea" en tiempo real, durante la cirugía curativa, la zona patológica que se va a extirpar e identifique inequívocamente sus márgenes quirúrgicos. De forma interesante, de hecho, este compuesto muestra un perfil farmacocinético y propiedades farmacodinámicas que permiten que permanezca en el sistema circulatorio un tiempo suficientemente prolongado para garantizar su acumulación selectiva y sustancialmente homogénea en el emplazamiento de interés antes de su eliminación completa de la circulación.
Se ha observado adicionalmente que el compuesto DA364 proporciona inesperadamente una acumulación y una retención eficaces en emplazamientos tumorales para tumores que tienen una sobreexpresión reducida (p. ej. limitada o heterogénea) de integrina avp3.
Sin querer limitarse a ninguna teoría particular, se puede plantear como hipótesis que la acumulación en el emplazamiento tumoral (en particular con sobreexpresión reducida o heterogénea de integrina avp3) es el resultado
del efecto combinado tanto de una alta especificidad para receptores de integrina, especialmente avp3, como de una retención inespecífica, p. ej. mediada por interacciones de unión inespecíficas con componentes extracelulares, a modo de ejemplo incluyendo albúmina plasmática extravascular que se ha fugado desde vasculatura tumoral lesionada.
Esta capacidad inesperada para entrar y distribuirse eficazmente en el espacio extracelular (intersticial) de la región tumoral contribuye, por una parte, a amplificar y hacer más persistente la señal registrada en el emplazamiento tumoral, que de hecho se determina tanto por el agente NIR unido a los receptores de integrina avp3 expresados sobre células tumorales y endoteliales (unión específica) como por el agente retenido en los espacios intersticiales del tumor como resultado de interacciones inespecíficas (unión inespecífica).
Por otra parte, ventajosamente, la acumulación y la retención óptimas en el emplazamiento tumoral permiten que este agente proporcione una demarcación mejorada y persistente de los márgenes del tumor incluso en presencia de tejidos patológicos que tienen una expresión de integrina reducida o heterogénea, y venza las limitaciones que surgen de la variabilidad de la expresión de integrinas en los tumores individuales y en los pacientes individuales.
De hecho, ha resultado ventajosamente que la contribución a la señal detectada proporcionada por la sonda fluorescente retenida en el espacio extracelular del tumor compensa cualesquiera reducciones o heterogeneidad de la señal fluorescente, y cualquier demarcación imprecisa o ambigua posterior de los márgenes del tumor, posiblemente provocadas por una expresión reducida o heterogénea de los receptores de integrina focalizados específicamente.
Ventajosamente, por lo tanto, además de proporciona una demarcación fluorescente NIR mejorada en tiempo real de tumores y patologías que tienen una expresión marcada de receptores de integrina avp3, DA364 ha resultado proporcionar una demarcación fiable de los límites de tumores vascularizados y zonas patológicas que, bien debido a su naturaleza específica o bien debido al efecto promovido por tratamientos terapéuticos previos, presentan, o podrían presentar, una expresión limitada o heterogénea de receptores de integrina avp3.
Como resultado, el agente NIR de la invención se puede considerar ventajosamente de uso general, a saber, se puede proponer para el uso en la cirugía curativa guiada por fluorescencia NIR de un paciente, para proporcionar al cirujano una identificación y demarcación fiables en tiempo real de los márgenes de la región maligna que se va a resecar, independientemente de cualquier posible expresión reducida o heterogénea de receptores de integrina avp3 que pueda presentar.
Por lo tanto, una realización de la presente invención se refiere al agente de contraste DA364 para el uso en la obtención de imágenes intraoperatoria de un paciente, para la detección y demarcación en tiempo real de los márgenes del tumor, según se define en las reivindicaciones.
En un aspecto preferido, la obtención de imágenes intraoperatoria se registra directamente durante la cirugía curativa, en particular durante una cirugía curativa de un tumor, para proporcionar al cirujano una identificación en tiempo real de los márgenes de la zona tumoral o la región maligna que se va a extirpar.
Por lo tanto, una realización preferida de la divulgación se refiere al agente de contraste DA364 para el uso en cirugía y, preferiblemente, en la cirugía guiada de un tumor, para proporcionar una identificación y una demarcación en tiempo real de los márgenes de la zona patológica que se va a extirpar.
La cirugía curativa según la invención, que comprende usar DA364 como agente de contraste para detectar y demarcar la región tumoral de interés, se lleva a cabo adecuadamente bajo luz fluorescente, a modo de ejemplo obtenida al usar una luz de excitación filtrada adecuadamente en el intervalo de longitud de onda, p. ej., de aproximadamente 600 a aproximadamente 700 nm. Según un aspecto particularmente preferido, la divulgación se refiere al uso del agente de contraste DA364 en la cirugía de tumores guiada por fluorescencia NIR, para proporcionar la detección y la demarcación intraoperatorias en tiempo real de los límites de la zona o región patológica que se va a extirpar.
En la descripción y las reivindicaciones presentes, los términos "tumor", "zona patológica", "enfermedad maligna" o "zona o región maligna", según se usan en la presente intercambiablemente, se refieren a un tejido, órgano, zona o región del cuerpo del paciente individual que comprende células tumorales, independientemente de su cantidad y distribución, incluyendo así tumores, metástasis y regiones o tejidos corporales infiltrados, mientras que "zona, tejido o región sanos" es el tejido, la zona o la región del cuerpo del paciente individual que no incluye ninguna célula tumoral. Los términos "márgenes" o "límites" del tumor, según se usan en la presente, se refieren a la región del tumor u otra enfermedad maligna que demarca y separa la zona patológica de la sana.
Las expresiones "márgenes quirúrgicos" o "margen libre de tumor", según se usan en la presente, se refieren a los márgenes de corte seguidos por el cirujano en la resección quirúrgica del tumor que incluyen la región patológica hasta su límite visible (p. ej., mediante luz fluorescente NIR) y una región añadida no afectada (es decir, no fluorescente) adicional alrededor del límite detectable del tumor, típicamente de al menos 3 mm, y preferiblemente de al menos aproximadamente 5 mm hasta aproximadamente 1 cm y más de 1 cm.
Los términos "paciente" o "paciente individual", según se usan en la presente, comprenden un sujeto animado, preferiblemente un sujeto mamífero, y, más preferiblemente, un ser humano que sufra un tumor o una enfermedad maligna tratable mediante cirugía.
La expresión "tumor con expresión reducida de receptores de integrina avp3" se refiere a tumores que muestran una sobreexpresión de receptores de integrina avp3 que, aunque es superior que la expresión de receptores de integrina avp3 en tejido sano normal, generalmente es reducida con respecto a la expresión de receptores de integrina avp3 en tumores que se sabe que tienen una importante sobreexpresión de dichos receptores.
La sobreexpresión reducida se puede deber bien a una expresión efectiva inferior (limitada) de receptores de integrina avp3 por las células tumorales o bien a una distribución heterogénea de una expresión (por lo demás relativamente alta) de receptores de integrina avp3 en la masa tumoral, a modo de ejemplo cuando la integrina avp3 es expresada por células endoteliales asociadas con la neoangiogénesis, o bien a una combinación de ambas. En este último caso, la medida de la expresión de integrina avp3 con respecto a la masa total del tumor proporcionará así la expresión efectiva de integrina avp3 en la masa tumoral, independientemente de la expresión específica de integrina avp3 de células tumorales en la masa tumoral.
Según se observa por el solicitante, la cantidad de expresión de integrina avp3 en una masa tumoral se puede determinar según técnicas analíticas conocidas tales como, a modo de ejemplo, el análisis por transferencia Western que permite la cuantificación del contenido de una proteína específica en tejidos, según se describe con detalle en la parte experimental.
Según esta técnica, es posible determinar la cantidad de integrina avp3 (en ng) expresada por mg de masa tumoral o preferiblemente por gg del lisado proteínico total en la masa tumoral (para tener una mejor normalización en el número y el tipo de células). De este modo, no es importante si la reducción se debe a una menor expresión efectiva de integrina avp3 de las células tumorales o a una distribución heterogénea dentro de la masa tumoral de células que de otro modo expresan elevadamente integrina avp3; el valor medido proporciona de hecho una indicación de la expresión de integrina avp3 en la masa tumoral total.
En particular, se ha determinado que para tumores con alta sobreexpresión de integrina avp3 (p. ej. melanoma maligno tipo IV o tumor U-87 MG), la cantidad de integrina avp3 es superior a 0,20 ng/gg de proteínas totales (aproximadamente 0,241149 y 0,221000 ng de integrina avp3/gg de proteínas). Por otra parte, se ha observado que el agente de obtención de imágenes DA364 es sorprendentemente adecuado para la visualización (y así también para un método para la cirugía intra- o peroperatoria) de tumores con expresión reducida de receptores de integrina avp3. En particular, DA364 es adecuado para visualizar tumores que muestran una expresión de 0,15 ng de integrina avp3/gg de proteínas o menos, de 0,10 ng de integrina avp3/gg de proteínas o menos, o de 0,05 ng de integrina avp3/gg de proteínas o menos; y hasta, p. ej., 0,005 ng de integrina avp3/gg de proteínas, 0,01 ng de integrina avp3/gg de proteínas o 0,02 ng de integrina avp3/gg de proteínas. Alternativamente, definido como una relación de expresión, la DA364 es adecuada para visualizar tumores que muestran una expresión de integrina avp3 de 60% o menos con respecto a la expresión de integrina avp3 en un melanoma maligno tipo IV (CP565523 de OriGene), de 40% o menos o de 20% o menos; y hasta, p. ej., 2%, 4% u 8% de la expresión de integrina avp3 en un melanoma maligno tipo IV.
Como se sabe en la técnica, muchos tumores (o células en la masa tumoral) pueden mostrar una expresión variable de integrina avp3 durante sus diferentes fases de desarrollo, mostrando típicamente un incremente de expresión de integrina avp3 en la progresión desde los estadios tumorales más tempranas a finales.
Según se observó por el Solicitante, la propiedad ventajosa de visualizar tumores con expresiones relativamente bajas de integrina avp3 también permite usar el agente DA364 para la visualización (incluyendo la visualización intraoperatoria y peroperatoria) de los tumores que tienen una expresión variable de integrina avp3 durante sus fases de desarrollo o progresión respectivas.
En particular, los tumores en una fase de desarrollo relativamente temprana (que tienen una sobreexpresión relativamente reducida de integrina avp3 con respecto a una sobreexpresión superior en fases de desarrollo posteriores) se pueden visualizar ventajosamente, específicamente durante la cirugía.
Así, un aspecto adicional de la divulgación se refiere a un método para la visualización intra- o peroperatoria de tumores con una expresión variable de integrina avp3 en donde dicho tumor tiene una fase de desarrollo durante la cual la expresión de integrina avp3 es de 0,15 ng de integrina avp3/gg de proteínas o menos, de 0,10 ng de integrina avp3/gg de proteínas o menos, o de 0,05 ng de integrina avp3/gg de proteínas o menos; y hasta p. ej. 0,005 ng de integrina avp3/gg de proteínas, 0,01 ng de integrina avp3/gg de proteínas o 0,02 ng de integrina avp3/gg de proteínas.
Según un aspecto alternativo, la divulgación se refiere a un método para la visualización intra- o peroperatoria de tumores con expresión variable de integrina avp3, en donde dicho tumor tiene una fase de desarrollo durante la cual la expresión de integrina avp3 es de 60% o menos con respecto a la expresión de integrina avp3 en un melanoma maligno tipo IV (CP565523 de OriGene), de 40% o menos o de 20% o menos; y hasta, p. ej., 2%, 4% u 8% de la expresión de integrina avp3 en un melanoma maligno tipo IV .
En una realización de la invención, el tumor o la enfermedad maligna bajo cirugía curativa se selecciona del grupo que consiste en melanoma, glioma, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma, cáncer de ovario, mama, pulmón, hígado, colon, cabeza y cuello y próstata; preferiblemente, se selecciona de glioma, glioblastoma, cáncer de mama, ovario y próstata, prefiriéndose particularmente este último.
En una realización adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica de diagnóstico que comprende una cantidad eficaz de DA364 para el uso en la obtención de imágenes intraoperatoria y peroperatoria (o perioperatoria, según se usan en la presente intercambiablemente para indicar el período que describe la duración de un procedimiento quirúrgico del paciente), para la detección y la demarcación en tiempo real de los márgenes del tumor en un paciente en todo el período del procedimiento quirúrgico, según la reivindicación 8.
En este sentido, la obtención de imágenes intraoperatoria y peroperatoria (o perioperatoria, según se usan en la presente intercambiablemente para indicar el período que describe la duración de un procedimiento quirúrgico del paciente) según la invención pertenece a la obtención de imágenes óptica, que se lleva a cabo preferiblemente en el intervalo óptico fluorescente, más preferiblemente con una luz fluorescente NIR.
En una realización preferida, la invención se refiere a una composición farmacéutica de diagnóstico que comprende una cantidad eficaz de DA364 para el uso en la cirugía guiada y, preferiblemente, en la cirugía guiada fluorescente NIR de un tumor de un paciente individual, para la detección y la demarcación en tiempo real de los márgenes de la zona patológica que se va a resecar.
En este sentido, y a menos que se proporcione otra cosa, el término "cantidad eficaz" o "dosis eficaz", según se usa en la presente, se refiere a cualquier cantidad del agente NIR DA364 que sea suficiente para cumplir su propósito o propósitos de diagnóstico pretendidos: es decir, por ejemplo, para proporcionar en tiempo real, a saber durante la cirugía guiada por fluorescencia de un paciente individual, y a lo largo de toda la cirugía, una detección y demarcación clara de los límites de zonas, regiones o tejidos tumorales e infiltraciones malignas que se van a resecar. A modo de ejemplo, una dosis adecuada puede variar de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 250 nmol de sonda fluorescente por kg del paciente individual y, preferiblemente, es de 1 a 60 y, más preferiblemente, de 1,7 a 17 nmol/kg, correspondiente a una dosis de aproximadamente 0,05 a 20,0 mg y, preferiblemente, de 0,08-5,0 mg y, lo más preferiblemente, de 0,15 a 1,5 mg de sonda fluorescente por paciente.
Una composición farmacéutica adecuada según la invención se puede formular según procedimientos habituales como una composición farmacéutica apropiada para todas las vías de administración comúnmente usadas. Típicamente, la composición comprende una cantidad eficaz del agente de contraste NIRF y al menos un portador adecuado. Ejemplos no limitativos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen agua estéril, solución salina, agua salina tamponada, solución salina tamponada (que incluye tampones como fosfato o acetato), alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato magnésico, talco, ácido silícico, parafina, etc. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como, p. ej., lidocaína, para aliviar el dolor en el lugar de la inyección; y además puede incluir conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales, lubricantes, etc., con la condición de que no reaccionen perjudicialmente con los compuestos activos. De forma similar, la composición puede comprender excipientes convencionales, es decir, sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para aplicación parenteral, enteral o intranasal que no reaccionen perjudicialmente con los compuestos activos. Generalmente, los ingredientes se suministrarán bien separadamente o bien mezclados entre sí en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente cerrado herméticamente tal como, p. ej., un ampolla o una bolsita que indique la cantidad de agente activo en unidades de actividad. Cuando la composición se vaya a administrar mediante infusión, se puede distribuir con una botella de infusión que contiene “agua para inyección” o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se vaya a administrar mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua para inyección o solución salina estéril de modo que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
Cuando la composición esté destinada a la administración oral, se puede formular adecuadamente, por ejemplo, como un comprimido, una cápsula o una píldora, o como un líquido o una suspensión para uso oral.
En un aspecto preferido, las composiciones farmacéuticas de DA364 según la invención se formulan apropiadamente en soluciones acuosas estériles isotónicas, opcionalmente tamponadas, para administración parenteral, y lo más preferiblemente para administración intravenosa o intraarterial.
Preferiblemente, dicha composición de diagnóstico tiene una concentración del agente NIR DA364 de al menos 0,05 mg/ml, y más preferiblemente de 0,15 a 40 mg/ml, y se suministra, a modo de ejemplo, como una embolada, o como dos o más dosis separadas en el tiempo, o como una infusión de flujo constante o no lineal.
Por otra parte, la divulgación se refiere a un método para la obtención de imágenes óptica de los márgenes de una zona patológica y, especialmente de un tumor de un paciente individual, que comprende usar DA364 para generar la obtención de imágenes y la demarcación de los márgenes del tumor. Preferiblemente, la obtención de imágenes óptica
se basa en fluorescencia y, más preferiblemente, es una obtención de imágenes óptica basada en fluorescencia NIR e incluye detectar y demarcar los límites del tumor de interés bajo luz fluorescente.
En un aspecto, la obtención de imágenes óptica se lleva a cabo in vitro (ex vivo), sobre el tumor o las porciones del tumor resecados, p. ej. muestras tisulares obtenidas de una eliminación quirúrgica de un tumor de un paciente individual, y comprende examinar bajo luz fluorescente muestras extirpadas y detectar la señal fluorescente que proporcionan, a fin de identificar los márgenes del tumor eliminado y verificar la presencia de una zona no fluorescente alrededor de ellos. En este sentido, las muestras tumorales ex vivo examinadas se pueden obtener de un tumor resecado de un paciente individual adecuadamente pretratado con DA364. Alternativamente, la obtención de imágenes óptica se lleva a cabo in vitro (ex vivo), sobre un tumor o porciones del tumor resecadas de un paciente no tratado, en donde, en este caso, el agente de la invención se usa como un marcador histológico de los márgenes del tumor.
Más preferiblemente, la obtención de imágenes óptica de los márgenes del tumor se lleva a cabo in vivo, durante la inspección quirúrgica intraoperatoria de una zona corporal patológica de un paciente individual que incluye el tumor de interés.
Según esto, el agente de contraste DA364 se puede usa en un método para la detección in vivo de los márgenes de un supuesto tumor en un paciente al que previamente se ha administrado DA364, comprendiendo dicho método:
i) generar una imagente óptica intraoperatoria de una región de interés (ROI) que comprende dicho supuesto tumor, y
ii) detectar los márgenes del supuesto tumor bajo luz fluorescente.
El método anterior comprende además administrar una cantidad eficaz de la sonda fluorescente DA364 a un paciente y permitir que circule en el cuerpo del paciente durante un tiempo apropiado antes de la obtención de imágenes.
El método se lleva a cabo in vivo, y comprende generar la imagen intraoperatoria y determinar la demarcación de los márgenes del tumor en un paciente al que se ha administrado previamente una cantidad adecuada del agente de contraste fluorescente DA364, en un intervalo de tiempo apropiado que precede a la obtención de imágenes intraoperatoria.
La obtención de imágenes óptica intraoperatoria de la región tumoral y la detección de los márgenes del tumor se llevan a cabo al iluminar la ROI por medio de una fuente de luz de excitación, continua o discontinua, adecuadamente resuelta espectralmente (típicamente adecuadamente filtrada) capaz de excitar el agente DA364, y a continuación detectar la luz fluorescente emitida por el agente de contraste al usar un detector de fluorescencia apropiado, que permita filtrar y separar la señal fluorescente emitida. En este sentido, ejemplos no limitativos de equipos y dispositivos para poner en práctica las etapas anteriores se divulgan, p. ej., en Mol. Imaging octubre de 2010; 9(5): 237-255, y la bibliografía citada.
Se obtiene así una imagen fluorescente de la ROI bajo luz fluorescente, que refleja la acumulación selectiva de la sonda DA364 en el emplazamiento tumoral de interés, mientras que permite una demarcación clara e inequívoca de los límites del tumor.
La obtención de imágenes óptica intraoperatoria de la región tumoral y la detección de los márgenes del tumor se pueden llevar a cabo ventajosamente en tiempo real, durante la inspección quirúrgica y la resección curativa de una región o zona corporal patológica y, especialmente, de un tumor, para permitir que el cirujano "vea" el tumor de interés e identifique claramente los márgenes de la zona tumoral que se va a extirpar y para ayudarle en la resección del tumor de un paciente individual.
Por lo tanto, un aspecto adicional de la divulgación se refiere a un método para la cirugía guiada de un tumor de un paciente individual, que comprende, como principales etapas:
i) proporcionar al paciente individual una cantidad apropiada de la sonda fluorescente DA364;
ii) generar una imagen óptica intraoperatoria basada en fluorescencia de una región de interés que comprende el supuesto tumor bajo cirugía curativa;
iii) identificar los márgenes del tumor bajo luz fluorescente, y
iv) realizar la cirugía curativa del tumor.
Preferiblemente, el método quirúrgico según la divulgación está guiado por fluorescencia; más preferiblemente, es un método para la cirugía guiada por fluorescencia NIR de una ROI en un paciente, que comprende usar la sonda fluorescente DA364 para generar la detección intraoperatoria del tumor y una demarcación clara y precisa de los límites del tumor que permita su resección radical.
Según una ejecución preferida, las etapas ii) e iii) del método de cirugía guiada de la invención, que incluyen generar la imagen intraoperatoria de la ROI y la detección de los márgenes del tumor, se llevan a cabo convenientemente bajo luz fluorescente, a modo de ejemplo según se analiza anteriormente.
En la práctica, estas etapas se pueden llevar a cabo a modo de ejemplo mediante el uso de un aparato quirúrgico equipado con una lámpara de excitación y un conjunto adecuado de filtros que permitan visualizar la sonda fluorescente acumulada en el tumor e identificar sus márgenes. En este sentido, se usa a modo de ejemplo una luz de excitación adecuadamente filtrada en el intervalo de 600 a 700 nm y, preferiblemente, en el intervalo entre 630 y 694. Así, se obtiene una luz fluorescente emitida, que se filtra adecuadamente en el intervalo de 650 a 1000 nm y, preferiblemente, de 694 a 800 nm. Cuando, en cambio, no se requiere la señal fluorescente, el campo quirúrgico se puede iluminar apropiadamente con luz blanca, a modo de ejemplo mediante una fuente de luz fría. En este sentido, se puede usar convenientemente un aparato adecuado, p. ej. el sistema FLARE, que permite la detección de fluorescencia que abandona el campo quirúrgico con luz natural, que, por lo tanto, no requiere el encendido y el apagado de la luz de excitación fluorescente.
En una realización, el método quirúrgico guiado de la divulgación incluye una etapa i) que comprende administrar una cantidad eficaz de la sonda fluorescente DA364 al paciente individual y a continuación hacerla circular durante un tiempo apropiado.
En una realización preferida, la cirugía guiada según la divulgación se lleva a cabo convenientemente en un paciente individual pretratado con una dosis eficaz del agente fluorescente DA364; a este respecto, la administración apropiada del agente fluorescente al paciente individual se realiza convenientemente intravenosamente o intraarterialmente, a modo de ejemplo a menos de una semana de la cirugía curativa, preferiblemente a menos de 48 horas, y, más preferiblemente, en un margen de tiempo de aproximadamente 24 hasta 48 horas antes de la cirugía tumoral curativa guiada.
Así, se genera una imagen fluorescente de la zona tumoral bajo luz fluorescente según la etapa ii) del método de la invención, permitiendo una identificación clara e inequívoca de los límites de la zona patológica sometida a resección quirúrgica curativa y ayudando al cirujano a identificar los márgenes quirúrgicos de la región patológica que se va a resecar, incluyendo comúnmente toda la zona patológica hasta los márgenes tumorales altamente fluorescentes y una región añadida adicional, probablemente sana, (o margen negativo, según se usan en la presente intercambiablemente) alrededor del tumor, a modo de ejemplo de al menos 0,3 mm y, preferiblemente, de aproximadamente 0,5 mm hasta aproximadamente 1 cm y más de 1 cm, donde la señal fluorescente está ausente o coherente con la señal de fondo (autofluorescencia) generada por el tejido sano normal, que compensa cualquier determinación imprecisa opcional del límite del tumor.
A continuación, una cirugía guiada de la región tumoral es realizada por el cirujano según la etapa iv) del método de la invención, siguiendo los márgenes quirúrgicos identificados del tumor.
A continuación, el método de cirugía guiada fluorescente de la invención puede comprender opcionalmente una etapa v) adicional que incluye verificar la precisión y la eficacia de la resección curativa realizada bajo luz fluorescente y, opcionalmente, repetir la cirugía siguiendo márgenes mayores alrededor de la zona tumoral detectada, hasta alcanzar márgenes negativos, a saber márgenes alrededor del tumor extirpado que no tienen señal fluorescente.
En una realización particularmente preferida, la divulgación se refiere a un método para la cirugía guiada por fluorescencia NIR de un tumor de un paciente individual, en donde el tumor es un tumor prostático.
Según se analiza previamente, la sonda fluorescente identificada por la presente invención permite una demarcación mejorada y persistente de los márgenes de un tumor bajo luz fluorescente independientemente del tipo de tumor o la expresión de integrinas reducida o heterogénea que pueda presentar.
Como tal, encuentra un uso ventajoso en una detección intraoperatoria fluorescente NIR de los márgenes de un tumor y un protocolo de cirugía guiada que permite estandarizar la resección quirúrgica de un tumor en un paciente individual, que comprende usar el compuesto DA364 y luz fluorescente para la delimitación y la demarcación intraoperatorias o peroperatorias de los márgenes del tumor sometido a cirugía curativa.
Según esto, en un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un protocolo estandarizado para la obtención de imágenes intraoperatoria de márgenes de un tumor y la cirugía curativa guiada de un tumor en un paciente individual, que comprende:
a) administrar una cantidad eficaz de la sonda fluorescente DA364 al paciente individual, a modo de ejemplo a menos de una semana, preferiblemente al menos 24 horas y, más preferiblemente, en un margen de tiempo de 24 a 48 horas antes de la cirugía guiada por imagen;
b) exponer la región corporal del paciente individual que comprende el tumor de interés a la inspección visual del cirujano, p. ej. mediante incisión opcional (de la región corporal en cuestión) y retirada opcional de piel y tejido o tejidos interpuestos;
c) generar una imagente intraoperatoria de dicha región corporal del paciente individual, bajo luz fluorescente, y detectar los márgenes del tumor;
d) realizar la resección curativa del tumor siguiendo los márgenes detectados,
e) determinar el estado de los márgenes extirpados bajo luz fluorescente y verificar la existencia de márgenes negativos alrededor del tumor extirpado o, alternativamente,
f) repetir la extirpación siguiendo márgenes mayores alrededor del tumor, y
g) repetir las etapas e) y f) hasta alcanzar los márgenes negativos (no fluorescentes) alrededor del tumor extirpado;
lo que constituye una realización adicional de la invención.
Cada una de las de las etapas a) - e) del protocolo se lleva a cabo, por ejemplo, según se analiza previamente. En este sentido, después de realizar la retirada quirúrgica del tumor según la etapa d) del protocolo, la eficacia de la resección realizada se verifica bajo luz fluorescente, según la etapa e) del protocolo, a fin de determinar la presencia o la ausencia de márgenes negativos, a saber de una zona sana no fluorescente alrededor del tumor resecado. A continuación, si es necesario, a saber, si todavía se detectan regiones fluorescentes en la zona corporal del paciente que rodea el tumor extirpado o en ausencia de márgenes negativos alrededor del tumor extirpado, se repiten las etapas g) y h) del protocolo siguiendo márgenes mayores alrededor de la zona tumoral, hasta alcanzar márgenes tumorales negativos bajo luz fluorescente. A continuación, el tejido no fluorescente que rodea el tumor extirpado se recoge opcionalmente y se usa para un examen patológico adicional.
El potencial de la solución proporcionada por la presente invención, a saber la eficacia presentada por la DA364 en la detección y la demarcación intraoperatorias de los márgenes de un tumor en un paciente individual y, especialmente, en la resección radical de tumores, aunque tengan expresión de integrinas reducida o no uniforme, se ha determinado por medio de pruebas in vitro e in vivo.
En este sentido, las características fluorescentes de la sonda DA364 se determinaron en primer lugar y a continuación se midió la afinidad presentada por DA364 hacia integrinas (ejemplos 2-4).
También se determinó una constante de asociación (ka (M-1)) con HSA de 2,8670 104 ± 0,1140 104 para DA364 (Ejemplo 5) y la cinética plasmática (Ejemplo 6).,
La fiabilidad de las estimaciones visuales de los márgenes del tumor obtenidas bajo luz fluorescente con el agente NIR identificado por la presente invención durante la inspección intraoperatoria y la resección guiada de un tumor, y su eficacia quirúrgica, se ha verificado a continuación con pruebas in vivo llevadas a cabo en un modelo en ratas que tienen tumor de próstata Mat-Ly-Lu ortotópico.
En este sentido, el cáncer de próstata, que no pertenece a los tumores que tienen una alta expresión de avp3, se eligió a propósito para demostrar la capacidad inesperada mostrada por DA364 para proporcionar, además de propiedades de focalización y acumulación óptimas en tumores que tienen una alta expresión de integrinas avp3, una acumulación preferente también en tumores que tienen una expresión reducida o no uniforme de estos receptores, lo que es completamente adecuado para permitir un apoyo eficaz al cirujano en la inspección intraoperatoria de una región tumoral y la cirugía guiada del tumor. De hecho, se sabe en la técnica pertinente que tanto la especie de integrinas expresadas en cánceres prostáticos como su concentración son parámetros lejos de ser reconocidos con certeza. En efecto, la expresión de integrinas avp3 en cánceres prostáticos todavía es un valor bastante indefinido, que varía de fuerte a nulo y que se sabe que depende de los pacientes individuales (The Prostate 70:1189-1195 (2010), donde esta probabilidad es la razón por la que la focalización del cáncer de próstata y su detección se obtiene ahora comúnmente al explotar los centros activos del antígeno membranario específico de la próstata (PMSA), una glicoproteína unida a la membrana que es sobreexpresada casi exclusivamente por el epitelio prostático de células malignas de la próstata y sus metástasis (véanse, a modo de ejemplo, J. Med. Chem. 2009, 52(2) 544-550 y Trans. Androl. Urol. 2013; 2 (3):254-264 y la bibliografía citada).
En este contexto, se debe apuntar que la bibliografía pertinente sobre modelos tumorales en animales (véase, a modo de ejemplo, Ann Nucl Med 31 de diciembre de 2011 ;25(10):717-31) excluye de hecho los marcadores de focalización basados en RGD de los marcadores de focalización apropiados para tumor prostático MAT-Ly-Lu.
Según se ilustra con detalle en los ejemplos de trabajo, se ha determinado ahora sorprendentemente la eficacia de DA364 en el tratamiento quirúrgico del modelo de tumor prostático MAT-Ly-Lu ortotópico en ratas citado anteriormente que se puede clasificar como un tumor que tiene una expresión reducida de integrinas avp3. Además de demostrar la capacidad de DA364 de ser usado en la cirugía intraoperatoria guiada por fluorescencia para tumores con baja sobreexpresión de integrinas, este resultado apoya la elección del tumor prostático como un modelo apropiado representativo de un tumor que tiene una expresión reducida o heterogénea de receptores de integrina avp3.
Por otra parte, según se ilustra en los ejemplos de trabajo in vivo, la DA364 es adecuada para la visualización intra- o preoperatoria de una región de interés que comprende otros tumores con sobreexpresión reducida de receptores de integrina avp3. Representativos de estos tumores que expresan poca integrina avp3 (además del modelo de tumor prostático MAT-Ly-Lu ortotópico de rata citado anteriormente) es el modelo tumoral A431 (un modelo en ratón xenoinjertado de carcinoma epidermoide humano que se presenta que tiene baja expresión de integrinas), según se ilustra en los ejemplos de trabajo, así como adenocarcinoma ovárico o colorrectal humano.
Estos resultados son muy prometedores, especialmente debido a que en la prueba experimental del Ejemplo 7 la extirpación de la región tumoral se ha realizado estrictamente siguiendo los márgenes tumorales identificados bajo luz fluorescente y demarcados por una señal fluorescente de alta intensidad, sin incluir un volumen mayor alrededor de los márgenes tumorales detectados, a modo de ejemplo de aproximadamente 0,5 mm de tejido sano (poco fluorescente), según se recomienda para una estrategia quirúrgica más segura.
Estos resultados también confirman el gran margen de tiempo de operación (de 4 a más de 24 horas) proporcionado por el compuesto identificado por la presente invención, ya que el agente de obtención de imágenes permite una demarcación clara del tumor prostático todavía después de 24 horas tras la inyección de una cantidad mínima del agente de contraste, mientras que el agente circulante es poco observable después de 4 horas desde la administración intravenosa.)
Por otra parte, las imágenes experimentales muestran que el agente administrado es detectable tanto dentro de las células tumorales como en el espacio intersticial circundante.
Todos estos resultados están de acuerdo con y confirman el potencial inesperadamente mostrado por la sonda fluorescente identificada por la presente invención para ofrecer una información fiable en tiempo real al cirujano, al promover una demarcación nítida y persistente de los márgenes de un tumor bajo luz fluorescente que permite realizar resecciones curativas de tumores con buena eficacia probada, incluso en presencia de tumores que tienen una expresión reducida o subóptima o no uniforme de integrinas avp3 que representan la diana natural de la sonda DA364.
Detalles adicionales relativos al agente fluorescente DA364 y su uso según la presente divulgación e invención se presentan en la siguiente sección experimental, con el único objetivo de ilustrar mejor la presente invención, sin representar ninguna limitación para ella.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Regresión lineal para la evaluación del coeficiente de extinción molar de la sonda fluorescente DA364.
La Figura 2 muestra los espectros de excitación y emisión de DA364 en PBS (gráfica izquierda; ex/em: 674/694; SS:20 nm) y en Seronorm (gráfica derecha; 694/704, SS:10 nm).
La Figura 3 muestra imágenes fluorescentes (Paneles A, B y C) adquiridas durante el procedimiento quirúrgico guiado usando DA364 y las correspondientes imágenes adquiridas bajo luz blanca (Paneles D, E y F). En particular: los Paneles A y D muestran una próstata intacta, en los Paneles B y E la próstata en la que se retiraba el lóbulo ventral derecho, y los Paneles C y F muestran el campo quirúrgico al final del procedimiento.
La Figura 4 presenta muestras tisulares extirpadas. En el Panel A, se obtienen imágenes de las muestras tisulares bajo luz blanca y el Panel B presenta las imágenes fluorescentes NIR correspondientes.
La Figura 5 muestra los resultados de la validación histológica de la clasificación visual basada en fluorescencia. En particular: el Panel A muestra un ejemplo de secciones teñidas con hematoxilina/eosina de cáncer de próstata que muestra zonas sanas (menor densidad y menor fluorescencia) y patológicas (alta densidad y fluorescencia superior); el Panel C muestra la tinción por fluorescencia con DAPI, y la zona no vacía detectada automáticamente en blanco se muestra en el panel D; el Panel B presenta la gráfica de la correspondencia entre resultados histológicos y visuales para el parámetro densidad tisular medido en secciones desde muestras bajas y fluorescentes (valor de p < 0,001, prueba de la U de Mann Whitney).
La Figure 6 muestra la curva del tiempo frente a la concentración en plasma de DA364 (concentración de agente libre en sangre circulante) registrada en la prueba experimental del Ejemplo 6. La eliminación rápida de la sonda DA364 circulante desde el compartimento del plasma se muestra claramente en la gráfica.
Figura 7 Imágenes en blanco y negro de células tumorales Mat-Ly/Lu en portaobjetos con tejidos obtenidos que solapan las señales procedentes de DA364 y la tinción de la membrana plasmática WGA.
Figura 8 Citometría de flujo de la expresión de integrina avp3 en células Mat-Ly-Lu de tumor prostático de rata y en células PC3 de tumor prostático humano, usadas como referencia interna. La expresión de integrina avp3 se muestra en los histogramas grises, y el fondo del control negativo de IgG de ratón se muestra mediante el marcador. Los números muestran el porcentaje de células positivas, calculado al sustraer el valor obtenido con Ig de control de igual isotipo del detectado con el mAb específico.
Parte Experimental
Ejemplo 1 Preparación del agente NIR DA364
La preparación del agente NIR DA364 se realizó sustancialmente según se describe en la referencia antes apuntada
1) Preparación del pentapéptido cíclico cRGD-NH2 focalizado hacia integrina
La preparación del resto peptidomimético focalizado hacia integrina cRGD-NH2 se llevó a cabo sustancialmente según se describe en el documento WO2006/095234 y, con mejor detalle, respectivamente, en Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 7111-7115, J. Org. Chem. 2005, 70, 4124-4132 y Chem Med. Chem. 2009, 4, 615-632 que describen, respectivamente, las preparaciones de los productos intermedios individuales y el andamiaje focalizado a integrina cRGD-NH2 cíclico según los siguientes esquemas:
a. Síntesis del producto intermedio 5
b. Síntesis del producto intermedio 10
c. Síntesis de cRGD-NH2
2) Preparación del agente NIR DA364
Una solución de éster de NHS de Cy5.5 (13 mg, 0,011 mmol) (adquirido de GE Healthcare, Código de Producto PA15602) en tampón de borato pH 9 (4 ml) se añadió con una solución de andamiaje de cRGD-NH2 cíclico (8,8 mg, 0,011 mmol) en tampón de borato pH 9 (3,5 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 24 h a temperatura ambiente y se protegió de la luz (dando como resultado un pH 8,1). Al final de la reacción (determinada mediante HPLC-MS), la reacción en bruto se diluye con una solución acuosa de CH3COOH al 5% (1,5 ml) y el disolvente de reacción residual se retiró a continuación mediante criosecado.
El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (eluyente A: H2O TFA al 0,1%, eluyente B: CH3CN TFA al 0,1%, flujo: 15 ml/min, fase estacionaria: Waters Atlantis Prep T3 OBD 5 pm, 19 x 100 mm, detección: UV, A1: 210 nm, A2 : 254 nm) para dar el producto deseado como un sólido azul oscuro (11,8 mg, 0,0082 mmol) después del criosecado. Rendimiento: 74,6%. Pureza por HPLC: 92,96% (como % de la superficie)
Caracterización analítica
La caracterización analítica del agente NIR obtenido se realizó mediante HPLC-MS y RMN 1H.
Resonancia magnética nuclear
Los espectros de RMN 1H se registraron a 298 K en DMSO-d6 o D2O, con un Bruker Avance-III (1H, 600,13 MHz) con deuterio como canal de cierre.
El RMN 1H registrado estaba de acuerdo con la estructura esperada.
Método preparativo de HPLC-UV-MS
Columna LC : Agilent Zorbax SB-PHENYL - 250 mm x 4,6 mm x 5 pm (P/N: 880975-312)
Parámetros de HPLC
Instrumento: Thermo Fisher LC Accela de triple cuadripolo equipado con bomba Accela, Automuestreador Accela, detector Accela PDA y TSQ Quantum Access.
Volumen de inyección: 5 pl (con una concentración de muestra de 200 pg/ml)
Horno de la columna: 40°C
Temperatura de la bandeja: 5°C
Programa de la aguja de lavado: el lavado de la aguja interna se produce para evitar efectos de memoria.
Solución de lavado: 40:50:10 - agua: metanol: i-propanol
intervalo de adquisición Uv-vis: 200 - 790 nm (lámpara de volframio necesaria: abs. máx. 776 nm) Intervalo de adquisición de MSD: 50 - 1500 a.m.u.
Modo MSD: ESI ambas polaridades (positiva y negativa, se prefiere la negativa)
El compuesto bajo análisis se diluyó con agua milli-Q.
Flujo de la bomba: 0,5 ml/min; Presión máx.: 400 bar
Disolvente A: Agua acetato amónico (1 g/l); Disolvente B: Acetonitrilo al 100%
Tiempo de parada: 42 min.
Gradiente:
Caracterización fluorimétrica de DA364
Ejemplo 2: Determinación del coeficiente de extinción
Material y métodos
Se usó un espectrofotómetro UV-VIS Perkin Elmer Lambda 40 UV-VIS de doble haz para determinar el coeficiente de extinción molar del agente NIR DA364.
Se prepararon dos soluciones madre estándar que contenían el agente NIR en PBS a 1000 pM (sol I: 1,27 mg, 0,884 ml) y 1250 pM (sol II: 7,03 mg, 3,915 ml). A continuación, se prepararon soluciones estándar diluidas según se presenta en la Tabla A al diluir las soluciones madre en un matraz volumétrico apropiado usando PBS. La absorbancia de cada solución diluida estándar se midió sin dilución adicional.
Tabla A: Tabla de dilución de soluciones estándar
Resultados
La absorbancia de cada solución estándar diluida se midió y el coeficiente de extinción molar de DA364 se calculó a partir de la pendiente de la regresión lineal presentada en la Figura 1. El coeficiente de extinción medido en esta condición era 208500 M-1-cm-1 (correspondiente a 83% del valor teórico presentado para el colorante Cy5.5: 250000 M-1-cm-1).
También se llevó a cabo un análisis estadístico (datos no presentados) para verificar la fiabilidad de la regresión lineal.
Ejemplo 3: Determinación del rendimiento cuántico de fluorescencia.
Material y métodos
Las medidas de los rendimientos cuánticos de fluorescencia (0%) se realizaron sobre FluoroLog-3 1IHR-320 (HORIBA-JobinYvon) con un accesorio esférico de integración.
Las medidas se llevaron a cabo usando una longitud de onda de excitación de 625 nm y usando una fuente de luz de xenón de 450 W. La detección se realizó en un detector TBX-04 de 645 a 850 nm (las ranuras de excitación y emisión tenían 1,8 nm).
El rendimiento cuántico de fluorescencia de una solución de DA364 se midió tanto en suero humano (Seronorm™ Human, NycomedPhama, lote 1109514) como en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
Las soluciones del agente NIR se prepararon en PBS y en suero humano con una absorbancia inferior a 0,1. Las medidas de fluorescencia (0%) se llevaron a cabo después de la incubación del agente NIR a temperatura ambiente (TA) durante 15 min.
Resultados
Los valores de 0% obtenidos, presentados en la Tabla B posterior, muestran que DA364 exhibe un rendimiento cuántico de 36,5% (± 2,37) en PBS y 57,5% (± 1,26) en Seronorm™.
Los espectros de excitación y emisión normalizados del agente NIR en PBS (ex/em: 674/694; desplazamiento de Stokes: 20 nm) y en Seronorm™ (694/704, desplazamiento de Stokes: 10 nm) se muestran en la Figura 2. Según se muestra en la figura, la interacción del agente de contraste DA364 con albúmina sérica promueve el desplazamiento del máximo de emisión de 694 nm a 704 nm (en PBS y en Seronorm™, respectivamente) y también la reducción de la unidad de Stokes.
Tabla B. 0% valores para DA364 en PBS y Seronorm™
PBS Seronorm™
o% 36,5 (SD 2,37) 57,5 (SD 1,26)
Caracterización biológica de DA364
Ejemplo 4: ensayo de unión competitiva in vitro hacia integrinas avp3, avp5 y avp1
La afinidad de DA364 para su diana específica (la integrina avp3) y su reactividad cruzada para otras integrinas (p. ej. avp1, avps) se determinó mediante pruebas de unión in vitro.
Material y métodos
Una placa de microvaloración de 96 pocillos (MediSorp, Nunc) se revistió durante la noche a 4°C, con integrinas probadas (0,5 pg/ml, diluidas en tampón de revestimiento/lavado (Tris HCl 20 mM pH 7.4; NaCl 150 mM; MnCl21 mM; MgCl20,5 mM; CaCl22 mM). Después del revestimiento, la placa se enjuaga con tampón de lavado y a continuación se incuba en tampón de bloqueo (BSA al 3% en tampón de revestimiento) durante 2 h a temperatura ambiente (TA) (24°C en un termomezclador, bajo remoción). A continuación, la placa se enjuaga en tampón de lavado y se incuba a TA durante 3 h con DA364 (intervalo de concentración de 5000 a 0,005 nM). Se prepararon soluciones de DA364 al diluir en serie una solución madre del agente NIR en BSA al 1% en tampón de revestimiento en presencia de vitronectina biotinilada (1 pg/ml, cod. HVN-U605, Molecular Innovations). A continuación, la placa se enjuaga de nuevo y se incuba con Streptavidin-HRP (cod.EG RPN 1051, GE Healthcare) (1:10000 en PBS) 1 h a t A, uniéndose a
vitronectina biotinilada. Después de lavados adicionales en PBS, la placa se incubó con solución de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) (cod. T-0440, Sigma-Aldrich) durante 5-10 min y a continuación la reacción colorimétrica se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico 2 N. La cuantificación de la IC50 para DA364 se realizó al medir el competidor (vitronectina biotinilada) al leer la absorbancia a 450 nm. Los valores de IC50 se determinaron mediante análisis de regresión no lineal minimocuadrático.
Resultados
Los ensayos de unión competitiva con vitronectina, el sustrato natural de av03, demostraban la alta afinidad de DA364 para su diana específica, a saber, la avP3, y una afinidad inferior para el análogo av05; por otra parte, se destaca una reactividad cruzada para av01.
Resultados de afinidad obtenidos para las integrinas av03, av05 y av01 se proporcionan en la Tabla C posteriormente. Tabla C. Afinidades de unión de DA364 a integrinas expresadas como IC50 de vitronectina
IC50 (nM) EE
avP3* 3,76 0,65
avP5 280,57 0,97
28,3 1,22
*Valor promedio de una prueba por triplicado
Ejemplo 5: Ensayo de unión in vitro hacia albúmina sérica humana (HSA)
La afinidad de DA364 para la HSA se determinó mediante las medidas espectroscópicas de la absorbancia, según el procedimiento divulgado en, a modo de ejemplo, Connors, K.A. (1987) Binding Constants. The Measurement of Molecular Complex Stability, John Wiley & Sons, Nueva York (véase, en particular, el capítulo 4).
Material y métodos
Se usó un espectrofotómetro UV-VIS Perkin Elmer Lambda 40 de doble haz para adquirir espectros de absorción de DA364 incubado con HSA. Se prepararon recientemente diariamente dos soluciones estándar que contenían HSA en PBS a 75 mM y 500 mM y se mantuvieron bajo agitación durante aproximadamente 30 min y 1 h, respectivamente. Una solución madre de DA364 (845±5 mM) se diluyó 1:20 y se mezcló con HSA (HSA Sigma Aldrich, lote 049K7535, artículo A1653) para dar una escala de concentraciones (0, 1, 10, 20, 40, 60, 30, 80, 100, 200, 400 mM). Las soluciones finales, que contenían 0,99 mM del agente NIR y una cantidad diferente de HSA, se incubaron 1 h a temperatura ambiente antes de las medidas. La absorbancia de cada solución se midió frente a una solución de referencia de HSA a la misma concentración. Los valores de absorbancia medidos a la longitud de onda de 689 nm (correspondiente a la absorción máxima de DA364 unido a HSA) se ajustaron usando la siguiente ecuación:
A
A _ As ■ ka \HSÁ\
C d a 364
b ~ ka [HSA]
+ 1
donde As es la diferencia de absortividades molares obtenidas a partir de DA364 libre y unida, AA es la diferencia en la absorbancia de DA364 y las soluciones de referencia, b es la longitud del camino óptico a través de las soluciones, [HSA] es la concentración de HSA, Cda364 es la concentración del fluoróforo y ka es la constante de asociación. Resultados
La constante de asociación con HSA (ka(M-1)) medida para DA364 era 2,8670.104 ± 0,1140-104 (R2=0,9949).
Este resultado demuestra la existencia de una afinidad hacia albúmina sérica exhibida por el agente NIR identificado por la presente invención, que está de acuerdo con el comportamiento híbrido in vivo que exhibe, permitiendo su acumulación y difusión hacia tumores como resultado tanto de una alta especificidad para receptores de integrinas como una retención inespecífica, p. ej. mediada por una unión inespecífica a componentes extracelulares, incluyendo albúmina extravascular (fugada).
Ejemplo 6: Determinación de la cinética plasmática de DA364
La cinética plasmática de la sonda NIRF DA364 se evaluó después de una sola administración intravenosa en ratones CD-1 (ICR)BR.
Protocolo
La sonda fluorescente se administra en una dosis de 0,4 pmol/kg, correspondiente a aproximadamente 10 veces la dosis eficaz usada en estudios de obtención de imágenes (1 nmol/ratón, considerando un peso corporal promedio del ratón de 25 g). Los animales fueron sacrificados en diferentes momentos hasta e incluyendo 14 días después del tratamiento y se recogieron muestras de sangre para la determinación del contenido de DA364, realizada al usar un método de HPLC acoplado con un detector fluorimétrico.
Preparación de la formulación
La DA364 se suministró como una solución azulada 655 pM. Algunos días antes de la administración al animal, después de descongelarse, la solución 655 pM de DA364 se diluyó hasta la concentración final de 0,04 pmol/ml. A este fin, se diluyeron 0,8 ml de la solución 655 pM de DA364 con 12,2 ml de solución salina fisiológica de NaCl al 0,9%. La formulación de 0,04 pmol/ml se almacenó a -80°C hasta la administración.
Animales
El experimento se realizó con ratones CD-1(ICR)BR (40 machos; peso a la llegada: 22-30 g; edad: 4-5 semanas), adquiridos de Charles River Laboratories Italia, Calco (LC), Italia. Todos los procedimientos que implicaban a los animales se han efectuado según las leyes y políticas nacionales e internacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio (L.D. 116/92; Autorización n° 19/2008-A publicado el 6 de marzo de 2008, por el ministerio de salud italiano; Directiva del Consejo EEC 86/609CEE y Directiva del Consejo EEC 2010/63/EU).
Diseño experimental
La cinética plasmática de DA364 se midió en un estudio farmacocinético. Se dejó un período de al menos 3 días entre la llegada del animal y el tratamiento. El día de la dosificación, los animales fueron asignados aleatoriamente a los momentos farmacocinéticos y al grupo de calibración. Los animales fueron identificados por marcas coloreadas realizadas en la cola. Cada etiqueta de jaula estaba numerada individualmente con el número del estudio, el compuesto, la vía de administración, la especie, la dosis, la fecha de tratamiento y el día de sacrificio y los números de animales.
El agente NIR DA364, precalentado a temperatura ambiente, se inyectó intravenosamente a una dosis de 0,4 pmol/kg, a través de la vena caudal, a una velocidad de inyección de 1 ml/min con una bomba de infusión Harvard. La dosis administrada corresponde a aproximadamente 10 veces la dosis eficaz usada en estudios de obtención de imágenes. La vía de administración intravenosa se eligió como posible vía de exposición para seres humanos.
Esquema experimental:
Los animales (tres para cada momento) fueron sacrificados antes y 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 60 min, 4 h, 24 h, 48 h, 7 días y 14 días después de la DA364.
Por otra parte, se usaron siete animales para recoger plasma en blanco para la curva de calibración.
El día del sacrificio, los animales fueron anestesiados con sevoflurano, a una concentración expiratoria de 3-4% en la inducción y 2-3% en el mantenimiento y a continuación se sacrificaron por decapitación. La sangre para las determinaciones por HPLC (al menos 0,5 ml) se recogió usando tubos heparinizados. El plasma obtenido después de la centrifugación (2100 g durante 10 min) se almacenó a -80°C hasta el día del análisis.
Evaluación de DA364 en plasma
La determinación de la cantidad de DA364 en muestras de plasma se llevó a cabo mediante un método de HPLC acoplado con un detector fluorimétrico previamente iniciado.
Preparación de la solución de DA364 tamponada con acetato
Se preparó una solución tamponadora de acetato al disolver 1 g de tampón de acetato en 1 l de agua Milli-Q. A continuación, la cantidad apropiada del agente NIR se añadió a la solución obtenida.
Preparación de muestras de "CAL" plasmáticas
Se prepararon estándares de calibración (CAL) al añadir 10 pl de solución tamponadora de acetato de DA364 (de 0,04 a 4 nmol/ml) y 100 pl de una solución de metanol y acetonitrilo (50:50) a 90 pl de plasma en blanco. Los tubos se agitaron y posteriormente se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos a 13000 g. Se inyectaron diez microlitros del sobrenadante transparente en el equipo de HPLC.
Preparación de muestras de "QC" plasmáticas
Se prepararon controles de calidad (QC) al añadir 10 pl de solución tamponadora de acetato de DA364 (de 0,06 a 3 nmol/ml) y 100 pl de una solución de metanol y acetonitrilo (50:50) a 90 pl de plasma. Los tubos se agitaron y posteriormente se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos a 13000 g. Se inyectaron diez microlitros del sobrenadante transparente en el equipo de HPLC.
Preparación de muestras "S" de plasma
Se prepararon muestras (S) de plasma al añadir 100 pl de tampón de acetato y 100 pl de una solución de metanol y acetonitrilo (50:50) a 100 pl de plasma. Los tubos se agitarán y posteriormente se centrifugarán a 4°C durante 10 minutos a 13000 g. Se inyectarán diez microlitros del sobrenadante transparente en el equipo de HPLC. La dilución apropiada se realizó en el caso de muestras de plasma demasiado concentradas.
Condiciones cromatográficas
Cromatógrafo: Waters Alliance 2695XC
Columna de HPLC: Zorbax SB-Phenyl, 5 pm, 250 x 4,6 mm
Fase móvil A: Disuélvase 1 g de tampón de acetato en 1 l de agua Milli-Q (0,013 M, pH-7,0)
Fase móvil B: Disuélvase 1 g de tampón de acetato en 1 l de metanol y acetonitrilo (50:50) Temperatura de la muestra: 10° C
Temperatura de la columna: 60° C
Volumen de inyección: 10 pl
Detector: Detector de FL Waters 2475; longitud de onda de excitación: 670 nm; longitud de onda de emisión: 700 nm
Tiempo de marcha: 23 min
Elución: gradiente
La determinación por HPLC se realizó al interpolar curvas de calibración de DA364 en plasma y órganos, preparadas al ensayar muestras estándar de calibración (CAL) (6 concentraciones, 3 réplicas para cada concentración) de agente fluorescente DA364.
Análisis de datos
Se recogió sangre para las determinaciones por HPLC (al menos 0,5 ml) en tubos heparinizados. La concentración plasmática de DA364 se midió mediante un método de HPLC acoplado con un detector fluorimétrico.
Para evaluar la exposición sistémica, se calcularon Cmáx y la curva de concentración de DA364 en plasma como una función del tiempo (AUC) mediante métodos no paramétricos usando el programa informático WIN-NONLIN 6.3 (WinNonlin 6.3 SCI Software, Lexington, KE, EE. UU. de A.). Para la dosis probada, se realizó un análisis no compartimental usando las concentraciones plasmáticas promedio procedentes de 3 animales para cada momento. Se presentaron los valores observados para Cmáx y el correspondiente tmáx,. La superficie bajo la curva de concentración en plasma-tiempo hasta la última concentración en plasma observable (AUC(0 a t)) se calculó a partir de datos observados usando el método trapezoidal logarítmico.
El contenido de DA364 en órganos se presentará como gg/ml (sangre) o gg/g de tejido. Los datos se transformarán en porcentaje de dosis inyectada (%ID) en cada órgano. A continuación, la desviación media y estándar se calculará para cada momento de muestreo.
Resultados
La concentración en plasma de DA364, medida mediante fluorescencia después de la separación por HPLC se incluyen en la Tabla D posteriormente y, gráficamente, en la Figura 6. Los resultados obtenidos confirman la rápida depuración del agente libre en circulación, alcanzando una concentración insignificante en la sangre 4 horas después de la administración a animales de prueba, que entonces se hace menor que los límites de detección instrumental (LOD = 0,0012 nmol/ml).
T l D
Se midió una Cmáx de 1,629 nmol/ml a los 5 minutos (tmáx) después de la inyección. El valor de semivida asociado con la fase de eliminación terminal era 64 min. El valor de AUC(ü a ~) era 77 min*nmol/ml. El valor de la depuración en plasma total era 5 ml/min/kg (0,15 ml/min). Los resultados del valor de depuración son muy inferiores que el flujo hepático y sanguíneo real de los ratones (1,8 y 1,3 ml/min), sugiriendo la acumulación en el cuerpo (u otro tejido). El valor de distribución volumétrica en estado estacionario (Vdss) era 329 ml/kg (10 ml), ligeramente inferior que el agua corporal total de los ratones (14,5 ml), sugiriendo la extravasación de DA364 desde el compartimento plasmático.
Ejemplo 7: Cirugía guiada por fluorescencia en un modelo de tumor de próstata de rata usando DA364 como sonda fluorescente NIR
Este ejemplo está dirigido a evaluar la sensibilidad de la sonda cíclica de RDG NIR DA364 en el reconocimiento de masas tumorales usando un modelo de tumor de próstata ortotópico de rata Mat Ly-Lu (un tumor con expresión reducida de integrinas avp3, según se ilustra posteriormente).
Se realizó una obtención de imágenes intraoperatoria en un sistema Zeiss, un microscopio quirúrgico modificado que incluye filtros apropiados para la iluminación y la selección de señales emitidas desde la sonda. Se inocularon células prostáticas MatLyLu tumorales de rata en el lóbulo ventral derecho de la próstata. Tres-cuatro días después de la inoculación, a los animales se les inyectó intravenosamente una dosis que variaba de 5 a 20 nmol/rata de la sonda fluorescente NIR y se obtuvieron imágenes 24 horas más tarde. A continuación, lo tumores se han resecado a través de la guía de la señal fluorescente. Tejidos que rodean la zona fluorescente incluyendo tejidos procedentes del lóbulo prostático izquierdo se extirparon para comparación histológica. Todas las muestras se analizaron a través de procesamiento histológico habitual (tinción con hematoxilina y eosina) e inmunomarcaje adicional.
Células tumorales y su preparación
La línea celular Mat-Ly-Lu de tumor prostático, una sublínea del modelo de adenocarcinoma prostático de rata G-Dunning R-3327, fue suministrada por European Collection of Cell Culture (ECACC). Las células se desarrollaron en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), glutamina 2 mM, 100 IU/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y dexametasona (DXMT) 250 nM. La prueba de exclusión del azul de tripano se usó para evaluar la viabilidad celular antes de la inoculación de las células. La viabilidad se expresó en % (relación de células viables a células totales X 100). Los cultivos celulares con una viabilidad < 70% se descartaron. La línea celular PC-3 de adenocarcinoma prostático humano fue suministrada por American Type Culture Collection (ATCC). Las células se desarrollaron en medio F-12 de Ham complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, glutamina 2 mM, 100 IU/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina. La prueba de exclusión del azul de tripano se usó para evaluar la viabilidad celular antes de la inoculación de las células. La viabilidad se expresó en % (relación de células viables a células totales X 100). Los cultivos celulares con una viabilidad < 70% se descartaron. La línea celular WM-266 de melanoma humano fue suministrada por American Type Culture Collection (ATCC). Las células se desarrollaron en medio esencial mínimo de Eagle complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, glutamina 2 mM, 100 IU/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina
Expresión de avp3
La expresión de integrina avp3 en la línea celular MatLyLu se midió mediante transferencia Western mediante comparación con la línea celular de melanoma WM266, que se sabe que tiene una alta sobreexpresión de integrinas (Anticancer Research 33:871-880 (2013)). A fin de extraer proteínas totales, las pellas celulares se disolvieron en tampón de lisis (Tris-HCI pH 850 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaF 100 mM, glicerol 10%, MgCl21 mM, TritonX-100 1%, inhibidores de proteasa), se sometieron a 3 rondas de congelación y descongelación (-80°C/37°C) y se dejaron en hielo durante 20 min. A continuación, la solución obtenida se sometió a ultrasonidos durante 10 s y se centrifugó a 14000 g a 4°C durante 15 min. A continuación, el contenido de proteína del sobrenadante se cuantificó con el método BCA. En este sentido, el extracto total se cargó en un gel de poliacrilamida al 10% y se aplicó electroforesis para separar las proteínas basándose en su peso molecular en condiciones de desnaturalización (SDS al 20%). A continuación, las proteínas dentro del gel se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa y posteriormente se transfirieron con los anticuerpos anti-integrina p3. La señal específica se visualizó como una banda simple o múltiple mediante un método de detección quimioluminiscente. Las imágenes de nitrocelulosa marcada se adquirieron mediante el sistema de obtención de imágenes ChemiDoc MP y la superficie de la banda con relación al nivel de expresión de p3 se cuantificó con el software Image Lab v.4.1.
La expresión de avp3 en células MatLyLu también se midió mediante un método de citometría de flujo (FACS) y se comparó con la expresión de la línea celular PC3.
En este sentido, las células se recuperaron y se lavaron en PBS complementado con BSA al 0,2% y azida sódica al 0,01%. Los centros inespecíficos se bloquearon con IgG de conejo (Sigma-Aldrich). A continuación, las células se incubaron con el anticuerpo anti-integrina avp3 (dilución 1:100; clon LM609, Millipore) o un control negativo del mismo isotipo durante 30 min a 4°C, y posteriormente se incubaron con anti(Ig de ratón) de conejo conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (DakoCytomation). Las muestras se recogieron y se analizaron con un citómetro de flujo CyAn ADP y el software Summit 4.3 (DakoCytomation). Las células se reunieron según sus propiedades de dispersión de luz para excluir residuos celulares, y según su negatividad a yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) para excluir células muertas.
El análisis por transferencia Western daba como resultado una expresión insignificante de integrina avp3 por células MatLyLu en comparación con la expresión por células de melanoma WM266. En el experimento de FACS, las células PC3 confirmaban una expresión de avp3 relativamente alta (45% de células que muestran señal fluorescente), de acuerdo con los valores apuntados en la bibliografía citada, y una expresión insignificante (0,1%) de avp3 en células Mat-Ly-Lu (Figura 8).
Modelo tumoral
El experimento se realizó sobre 10 ratas de Copenhague (machos) de 11 semanas de edad, adquiridas de Harían Laboratories Srl, S.Pietro al Natisone (UD), Italia. El adenocarcinoma de próstata de rata se indujo en las ratas de Copenhague mediante inyección ortotópica de las células tumorales MatLylu bajo anestesia con isofluorano Aproximadamente 1 hora antes de la implantación del tumor, se administró un analgésico (Rymadil) subcutáneamente (5 mg/kg) a ratas. A continuación, el abdomen inferior se afeitó y se desinfectó (Betadine®). Se realizó una incisión de 12 mm de la pared abdominal a lo largo de la línea alba de 3 a 4 cm por encima del orificio urinario. La próstata se expuso después de haber retirado el tejido adiposo sobre cada lado del animal.
Una suspensión celular (30 gl) que contenía 0,5x106 células tumorales se inyectó con una aguja de 27G en el lóbulo ventral derecho de la próstata. El plano muscular y cutáneo se suturó con hilo no reabsorbible estéril (seda negra 3-0, Distrex S.p.a.). La herida se pintó con solución desinfectante Betadine®. El analgésico también se administró al menos una vez después de la cirugía (aproximadamente 24 h después). Todos los procedimientos que impliquen a los animales se han efectuado según las leyes y políticas nacionales e internacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Directiva del Consejo EEC 86/609CEE; L.D. 116/92 y Directiva del Consejo EEC 2010/63/EU; L.D.
26/2014; Autorización n° 149/2006-A publicada el 27 de octubre de 2006 por el ministerio de salud italiano).
Experimento quirúrgico guiado por fluorescencia
La retirada del tumor se realizó usando un microscopio quirúrgico especializado (Axio Zoom v16, Carl Zeiss Beteiligungs GmbH, Jena, Alemania). El microscopio estaba equipado con un objetivo PLANAPO Z 0,5X/0.125 FWD 114 MM. Durante la cirugía, se visualizaba una superficie de aproximadamente 2,5x2,5 cm2. El campo quirúrgico estaba iluminado con luz blanca mediante una fuente de luz fría (CL 9000 LED CAN (D)) cuando no se requería la señal de fluorescencia, y mediante luz filtrada durante la retirada del tumor (Iluminador: HXP 200C (D), grupo filtrante: 32 Cy 5.5 libre de desplazamiento (E)).
El día antes de la cirugía, correspondiente a 3-4 días después de la implantación del tumor, a los animales se les administró una dosis de agente de prueba DA364 que variaba de 5 a 20 nmol/rata. Veinticuatro horas después de la inyección de las sondas, los animales fueron anestesiados con isofluorano gaseoso al 0,5% (O2 al 99,5%), asegurados sobre la mesa quirúrgica en la posición supina y el tumor de próstata se expuso.
Después de la retirada de la cápsula prostática, el tumor prostático se expuso a luz filtrada y se adquirieron imágenes de fluorescencia para esbozar la masa tumoral primaria y los márgenes de la patología (véase la Figura 3, Paneles A y D). A continuación, se llevó a cabo la retirada de la masa tumoral iterativamente, al usar fluorescencia para guiar la extirpación hasta ausencia de la señal fluorescente en la superficie circundante a la región tumoral (véase la Figura 3, Paneles B, E y C, F). La mayoría de la señal fluorescente se confinó en la superficie de implantación, es decir el lóbulo ventral derecho de la próstata. Muestras tisulares extirpadas de la superficie que rodea la señal de fluorescencia y los lóbulos ventral izquierdo, dorsal y anterior se recogieron y se adquirió la fluorescencia ex vivo para investigar el patrón histológico subyacente a la acumulación del fluoróforo (Figura 4). A destacar que en esta prueba experimental las muestras de tejido se extirparon estrictamente siguiendo los márgenes del tumor identificados por una alta intensidad de la señal de fluorescencia, aunque para una estrategia quirúrgica más segura, se recomienda un volumen de extirpación mayor que incluya al menos un margen negativo no fluorescente mínimo. Todas las muestras de tejido recogidas se procesaron finalmente para el siguiente análisis histológico. Al final de los experimentos, los animales fueron sacrificados mediante sobredosis de anestesia.
Análisis histológico
Las muestras extirpadas se embebieron directamente en compuesto Killik (medio de imbibición criostático) y se congelaron inmediatamente en isopentano enfriado en nitrógeno líquido.
Los bloques de tejido extirpados se cortaron en grupos de tres rodajas de 10 gm consecutivas para el marcaje paralelo. A continuación, cada muestra tisular se trató con el procedimiento estándar para el análisis histopatológico. En particular, se realizó una tinción histológica de las muestras recogidas con hematoxilina y eosina a fin de detectar y caracterizar los márgenes anatómicos del tumor en muestras extirpadas y verificar la presencia de células tumorales opcionales en tejido prostático sano circundante, a fin de evaluar y confirmar la extirpación radical del tumor con cirugía.
La detección de la distribución del agente fluorescente DA364 en muestras tisulares extirpadas se realizó sobre las rodajas tisulares, después de descongelar a temperatura ambiente (TA) y lavar en PBS para retirar Killik. Los núcleos celulares se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, cod. BML-AP402, Enzo Life Sciences) (5 gg/ml en PBS, 5 min). La membrana plasmática se tiñó con 2 gg/ml de aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugada a FITC (cod. W11261 Life Technologies), a fin de identificar la fracción internalizada de DA364. En este sentido, los tejidos se visualizaron tanto con el escáner digital de Aperio ScanScope FL, para adquirir la sección teñida total, como con el microscopio de fluorescencia Leica DM2500, para detalles adicionales.
Internalización en células tumorales
A continuación, la internalización de DA364 en células tumorales se observó mediante microscopía de fluorescencia. En particular, se obtuvieron imágenes en blanco y negro de células tumorales Mat-Ly/Lu, mostradas a modo de ejemplo en la Figura 7, en la que la señal fluorescente generada por DA364 se superpone a la señal obtenida de rodajas de tejido tumoral Mat-Ly/Lu teñidas con 2 |ug/ml de aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugada a FITC, permitiendo una tinción de la membrana plasmática identificar las membranas celulares y los espacios intersticiales extracelulares.
Análisis de imágenes
Las imágenes de fluorescencia ex vivo adquiridas justo después de la cirugía (Figura 4) se usaron para clasificar visualmente las muestras tisulares extirpadas en dos clases de fluorescencia: fluorescente y no fluorescente. La clasificación entre las dos clases de fluorescencia se basaba solamente en la señal fluorescente sin considerar el origen anatómico de la muestra tisular. Las muestras tisulares se asignaron a la clase fluorescente cuando incluían al menos una región caracterizada por emisión fluorescente intensa y brillante (véanse, por ejemplo, las muestras 3, 4 y 5 de la Figura 4). Todas las muestras restantes, es decir las muestras que no exhiben fluorescencia (tales como la muestra 1 de la Figura 4) o una fluorescencia coherente con la autofluorescencia observada en un tejido sano alejado de la zona tumoral (tal como la muestra 2 de la Figura 4), se clasificaron en la clase no fluorescente. Para cada imagen, la señal fluorescente se cartografió en píxeles de intensidad usando todo el intervalo de píxeles de intensidad. Este procedimiento de clasificación estaba destinado a reproducir la selección visual basada en fluorescencia de tejidos 'sanos' (no fluorescentes) y 'patológicos' (fluorescentes) que se requiere que opere el cirujano durante la eliminación del tumor.
A continuación, los resultados de la clasificación visual (de muestras titulares recogidas durante la cirugía guiada) se validaron histológicamente, mediante tinción con H&E de 2 secciones histológicas procedentes de cada muestra tisular, permitiendo identificar secciones que contienen una región de tumor, independientemente de su dimensión (Panel A de la Figura 5). Las muestras tisulares que contenían tumor (a saber, muestras tisulares de las que al menos 1 de las secciones histológicas probadas contenía células tumorales) se clasificaron entonces como positivas, mientras que las muestras libres de tumor se clasificaron como negativas. A continuación, las clasificaciones histológica y visual se compararon usando una tabla de contingencia que proporciona una medida de la sensibilidad de la clasificación visual permitida por el compuesto identificado por la presente invención y su fiabilidad para identificar y separar tejidos libres de tumor y que contienen tumor.
Se realizó además un análisis adicional de muestras tisulares recogidas, basado en la fluorescencia del colorante nuclear 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). En general, este análisis confía en las diferencias existentes en la morfología de los tejidos sanos y tumorales, donde la morfología prostática normal se altera por la invasión tumoral, que se puede distinguir fácilmente con un procedimiento de análisis de imágenes basado liminarmente automático (Figura 5. Paneles C, D). De hecho, el tejido prostático sano está constituido principalmente por glándulas y conductos inmersos en un estroma fibroso; las regiones vacías del tejido representan la amplia luz de las glándulas prostáticas, mientras que las células glandulares y el estroma representan el parénquima de la próstata. En cambio, el tejido tumoral está constituido más típicamente por células empaquetadas homogéneamente. Este procedimiento automático consistía en calcular la densidad tisular definida como la relación de la superficie de la muestra ocupada por tejido (superficie no vacía) frente a la superficie de la sección. Los tejidos sanos se caracterizan por una densidad tisular inferior que los tejidos patológicos.
Resultados
Validación histológica de la eficacia quirúrgica.
Los resultados de las clasificaciones histológica y visual se compararon al usar tablas de contingencia. Los resultados de la comparación, incluidos a modo de ejemplo en la Tabla E de contingencia posterior, indican que existe una correlación significativa entre la intensidad de la fluorescencia detectada y el estado patológico histológicamente verificado en las muestras tisulares probadas. En particular, los resultados obtenidos indican que la sonda fluorescente NIR DA634 permitía una clasificación visual de los tejidos tumorales con una sensibilidad de 87% y una especificidad de 83% (Tabla E).
Las muestras fluorescentes también se caracterizaron por una alteración sustancial de la morfología del tejido normal, mostrando una densidad tisular estadísticamente superior, esencialmente debido a la ausencia de glándulas y conductos prostáticos verificados en tejidos patológicos (prueba de la U de Mann Whitney, valor de p < 0,05, Figura 5, panel B).
Tabla E. Tabla de contingencia de las correspondencias entre la clasificación visual e histológica de muestras tisulares.
Cirugía Histología
Positiva Negativa
FLUORESCENTE 20 3
NO FLUORESCENTE 3 15
_Nota: dos de los tres falsos negativos registrados en la prueba (no fluorescente pero positiva) eran muestras tisulares procedentes de la cápsula prostática parcialmente infiltrada por células tumorales, aunque presentaban una baja fluorescencia al microscopio quirúrgico, probablemente debido al arrollamiento elástico sobre sí misma provocado por la incisión de la cápsula, que hace a esta región prostática particular menos visible y con imágenes menos apropiadas bajo luz fluorescente. El restante falso negativo era un trozo muy pequeño de tejido retirado de un tumor grande que, cuando se evaluaba solo por su fluorescencia, mostraba baja intensidad luminosa.
Ejemplo 8
Determinación de la expresión de integrina avp3 con respecto a la masa tumoral
La expresión de integrina avp3 se ha medido mediante transferencia Western, para tres tipos diferentes de tumores procedentes de modelos animales:
• Se presentaba que U-87 MG, un modelo en ratones xenoinjertados de glioblastoma humano, tenía una alta expresión relativa de integrina avp3
• Se presentaba que MatLyLu, un modelo en rata ortotópico de cáncer de próstata de rata, tenía una expresión media-baja de integrina avp3
• Se presentaba que A431, un modelo de ratón xenoinjertado de carcinoma epidermoide humano, tenía una expresión relativamente baja de integrina avp3
Métodos
Se cortaron tejidos tumorales congelados en pequeños trozos usando un bisturí y a continuación se pulverizaron, usando un mortero y un brazo, en presencia de nitrógeno líquido. El polvo se pesó y a continuación se disolvió en un volumen adecuado de tampón de lisis (Tris-HCI pH 850 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaF 100 mM, glicerol 10%, MgCl21 mM, TritonX-100 1%, inhibidores de proteasa), se sometió a turbulencia durante 1 min, y se puso sobre hielo durante 45 min. Posteriormente, la solución se sometió a ultrasonidos 15 s y se centrifugó 15 min a 4°C a 14000 rpm.
El contenido de proteína del sobrenadante se cuantificó mediante el método BCA. Los extractos totales se cargaron en un gel de poliacrilamida al 10% y se realizó electroforesis para separar las proteínas por su peso molecular en condiciones de desnaturalización (SDS al 20%). A continuación, las proteínas dentro del gel se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa y posteriormente se transfirieron con el anticuerpo anti-integrina p3. Se visualizó una señal específica como una banda simple o múltiple mediante un método de detección quimioluminiscente. Las imágenes de la nitrocelulosa marcada se adquirieron mediante el sistema de obtención de imágenes ChemiDoc MP y la superficie de la banda con relación al nivel de expresión de p3 se cuantificó con el software Image Lab v.4.1.
Resultados
La cantidad de integrina p3 se normalizó mediante la masa tumoral (mg de tumor). Los experimentos se realizaron con al menos dos muestras por tipo de tumor. Los resultados (valor medio de expresión de integrina) se muestran en Errore. L'origine riferimento non e stata trovata.
TABLA F
Ejemplo 9
Determinación de la expresión de integrina avp3 con respecto a la cantidad total de proteína en la masa tumoral
La expresión de integrina avp3 se ha medido mediante transferencia Western, para los tres modelos en animales previamente detallados en el Ejemplo 8 y para tumores humanos adicionales adquiridos como extractos proteínicos.
Los extractos proteínicos procedentes de modelos tumorales se obtuvieron partiendo de tejidos con el método de extracción descrito anteriormente, mientas que los extractos de proteínas humanas (según se detalla posteriormente en la tabla G) fueron adquiridos por OriGene
Los datos presentados en la tabla H posterior confirman adicionalmente la respectiva sobreexpresión reducida de integrina avp3 en tumor de tipo Matlylu y tumor A431, también muestran otro tumor humano con expresión reducida de integrina avp3 que se puede beneficiar de la presente invención.
TABLAH
Ejemplo 10
Visualización in vivo de tumores con expresión reducida de integrina avp3 (A431)
Este ejemplo muestra la absorción de DA364 en los modelos en ratón A431 y U87-MG de tumores humanos, caracterizados respectivamente por sobreexpresión de avp3 baja y alta.
Modelo tumoral
Se recogieron células A431 y se lavaron dos veces con PBS. Se resuspendieron cinco millones de células en 0,1 ml de medio con alto contenido de glucosa DMEM y se inyectaron subcutáneamente en el costado derecho de todos los ratones. Once días después de la inoculación de A431, las células U-87MG se recogieron y se lavaron dos veces con PBS. Se resuspendieron dos millones de células en 0,1 ml de medio EMEM y se inyectaron subcutáneamente en el costado izquierdo de los mismos animales previamente inyectados con células A431.
El desarrollo de los tumores se siguió después de la inoculación mediante palpación y medida del calibre una vez a la semana. El volumen del tumor se ha calculado mediante la fórmula: (L x W2)/2, donde L y W son la longitud y la anchura máximas del tumor. Los animales fueron sacrificados mediante sobredosis de anestesia al final de la fase experimental o en caso de que la suma de ambos tumores alcance un volumen de aproximadamente 2000 mm3.
Experimentos de obtención de imágenes fluorescentes
Tres semanas después de la implantación del tumor A431, se les administró a cinco ratones 1 nmol de DA364 para un volumen de administración total de 0,2 ml (velocidad de inyección 1 ml/min). Las adquisiciones de imágenes ópticas in vivo se han llevado a cabo 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 24 h y 48 horas después de la administración
intravenosa de la sonda fluorescente usando el sistema de obtención de imágenes óptica IVIS Spectrum (Perkin Elmer). Durante los experimentos de obtención de imágenes óptica, los animales se mantuvieron bajo anestesia de sevofluorano gaseoso al 3-4% (O297,0-96,0%). Durante la anestesia, la temperatura corporal de loa animales se ha estabilizado a aproximadamente 37°C usando un lecho calentado.
Siguiendo los experimentos de obtención de imágenes óptica in vivo, 48 horas después de la inyección de las sondas, los animales fueron sacrificados. Los tumores, el hígado, los riñones, el corazón y el bazo se extirparon para la medida de la señal fluorescente ex vivo sobre todo el tumor u órgano extirpado.
Resultados
La intensidad de fluorescencia procedente de tumores U-87 MG y A431 se midió in vivo junto con la señal que llegaba de los tejidos sanos normales (fondo).
En el margen de tiempo de 3 horas a 24 horas después de la inyección, los tumores U-87 MG y A431 mostraban una relación de señales estable, con respecto al fondo. La Figura 9 ilustra la obtención de imágenes de fluorescencia de ratones, que muestra que DA364 permite una visualización clara del tumor A431 con baja expresión de integrina bajo la piel.
La señal fluorescente (expresada como eficacia radiante (RE): p/s/(gW/cm2), donde p es el recuento de fotones), se midió a continuación sobre las muestras ex vivo extirpadas usando el sistema de obtención de imágenes óptica IVIS Spectrum (Perkin Elmer).
Según se ilustra en la tabla I posterior, la señal de fluorescencia de DA364 en el tumor U-87MG era aproximadamente dos veces la intensidad de la señal medida en el tumor A431. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia medida en tumores A431 era comparable con la medida en el hígado y el riñón (órganos de excreción en los que se acumula la DA364) mientras que era aproximadamente 10 veces superior con respecto a la señal medida en el corazón y el bazo (representativos de tejidos sanos, fondo).
Estos resultados muestran que DA364 es un agente de obtención de imágenes para tumores que tienen una expresión de integrina reducida, particularmente para su visualización intraoperatoria.
Claims (11)
1. El agente de contraste DA364 de fórmula
para el uso como una sonda fluorescente para la detección y la demarcación de un margen de un tumor en la cirugía guiada de un paciente individual, en donde dicho tumor es un tumor que muestra una sobreexpresión reducida o variable de receptores de integrina av|33, siendo dicha expresión de 0,15 ng de integrina av|33/pg de proteínas o menos.
2. El agente de contraste para el uso según la reivindicación 1, para la identificación en tiempo real de los límites quirúrgicos de la zona patológica bajo cirugía curativa.
3. El agente de contraste para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la detección y la demarcación de los márgenes del tumor se llevan a cabo bajo luz fluorescente.
4. El agente de contraste para el uso según la reivindicación 3, en donde la longitud de onda de la luz varía de 630 a 690 nm.
5. El agente de contraste para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la detección y la demarcación comprenden:
i) iluminar, con una fuente de luz capaz de excitar el agente DA364, una región de interés que comprende un supuesto tumor en un paciente al que se ha administrado previamente de forma adecuada una cantidad eficaz de DA364; y ii) identificar los márgenes de la zona o región patológica bajo luz fluorescente.
6. El agente de contraste para el uso según la reivindicación 5, en donde al paciente individual se le administra previamente una cantidad del agente de contraste DA364 de 0,05 a 20 mg.
7. El agente de contraste o el uso según la reivindicación 5 o 6, en donde la administración del agente de contraste se lleva a cabo a menos de 48 horas de la cirugía guiada.
8. Una composición farmacéutica de diagnóstico que comprende DA364 para el uso en la obtención de imágenes óptica intraoperatoria o peroperatoria, para proporcionar la detección y la demarcación en tiempo real de los márgenes de un tumor, donde el tumor muestra una sobreexpresión reducida o variable de receptores de integrina avp3, siendo dicha expresión de 0,15 ng de integrina avp3/pg de proteínas o menos.
9. Una composición farmacéutica de diagnóstico para el uso según la reivindicación 8, en donde la obtención de imágenes óptica se lleva a cabo en la cirugía guiada de un tumor de un paciente individual, para proporcionar una detección y una demarcación en tiempo real de los márgenes de la superficie del tumor que está sometida a resección curativa.
10. El agente de contraste DA364 para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en donde el uso es para la detección y la demarcación de un tumor seleccionado del grupo que consiste en melanoma, glioma, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma, cáncer de ovario, mama, pulmón, hígado, colon, cabeza y cuello y próstata.
11. El agente de contraste DA364 para el uso según la reivindicación 10, en donde el tumor es un cáncer prostático.
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