ES2823998T3 - Nuevos activadores de plasminógeno tisular mutados y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en: i) proteínas que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 25, que consisten preferentemente en la SEQ ID NO: 2 o en la asociación de la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26, en donde dicha secuencia comprende: una mutación A que consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e histidina o una doble mutación A y B que consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, histidina e histidina y el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina, ii) proteínas que comprenden una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con la SEQ ID NO: 2, comprendiendo dichas proteínas la mutación A o la doble mutación A y B o proteínas que comprenden una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con la SEQ ID NO: 25, comprendiendo dichas proteínas la mutación A o la doble mutación A y B; en donde dichas proteínas tienen actividad fibrinolítica, y iii) proteínas que consisten en un fragmento de la SEQ ID NO: 2, consistiendo dicho fragmento en el dominio Kringle 2 y el dominio catalítico, comprendiendo dichas proteínas la mutación A o la doble mutación A y B.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos activadores de plasminógeno tisular mutados y usos de los mismos

Sector de la técnica

La invención se refiere a activadores de plasminógeno tisular mutados (tPA) y a su uso para tratar enfermedades trombóticas y hemorrágicas, preferentemente, hemorragias intracerebrales y hemorragias oculares, más preferentemente, trastornos trombóticos neurológicos y oclusión de la arteria retiniana central, más preferentemente, ictus.

Estado de la técnica

El activador de plasminógeno de tipo tisular (tPA) es una serina proteasa secretada en la unidad neurovascular (NVU) por las células endoteliales (Angles-Cano et al., 1985), neuronas (Pecorino et al., 1991) y células gliales ((Siao y Tsirka, 2002); (Buisson et al., 1998)). A diferencia de otras serina proteasas, tPA es un zimógeno atípicamente activo, con actividad intrínseca completa y baja zimogenicidad (Loscalzo, 1988). En la vasculatura, tPA promueve la fibrinolisis mediante la conversión del zimógeno unido a fibrina abundante e inactivo, plasminógeno, en plasmina. En el parénquima cerebral, se ha informado que tPA muestra funciones críticas, tales como el control de la migración de neuronas, el aprendizaje y los procesos de memoria, destacablemente mediante el control de la señalización del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) ((Calabresi et al., 2000); (Nicole et al., 2001); (Su et al., 2008); (Seeds et al., 1999)).

Cuando tPA (administrado en el contexto clínico como Actilyse® o Alteplase®) fue aprobado por la Federal Food and Drug Administration para el tratamiento agudo del ictus isquémico, los datos experimentales se decantaban por la idea de que más allá de sus efectos vasculares beneficiosos, tPA puede tener propiedades dañinas en el parénquima cerebral, incluyendo transformaciones hemorrágicas y neurotoxicidad ((Fugate et al., 2010); (Yepes et al., 2009)). De hecho, más allá de su capacidad para promover la lisis de coágulos, en la actualidad está comprobado, a partir tanto de modelos experimentales como de datos clínicos, que tPA puede activar a metaloproteinasas, factores de crecimiento, media la activación de neutrófilos y de este modo promueve las transformaciones hemorrágicas ((Suzuki et al., 2009); (Fredriksson et al., 2004); (Rosell et al., 2008)). Curiosamente, el tPA intravenoso también es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica tanto intacta como lesionada ((Harada et al., 2005); (Benchenane et al., 2005); (Benchenane et al., 2005)) y por tanto tiene influencia en las disfunciones cerebrales, tales como neurotoxicidad ((Samson y Medcalf, 2006); (Benchenane et al., 2007); para una revisión, (Yepes et al., 2009)).

Por consiguiente, en la NVU y junto con el tPA parenquimatoso endógeno, el tPA derivado de la sangre interactúa con varios sustratos in vitro e in vivo. Entre sus mecanismos de acción, mediante la interacción con los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDAR) en las neuronas, se sabe que tPA activa los procesos de señalización dependientes de NMDAR, lo que causa una exacerbación de muerte neuronal en condiciones de privación de oxígeno y glucosa, excitotoxicidad o isquemia (Nicole et al., 2001) (Baron et al, 2010).

Por lo tanto, resulta de vital importancia la identificación de derivados de tPA que puedan mostrar una actividad fibrinolítica buena o mejorada, pero que no tenga las propiedades dañinas en el parénquima cerebral del tPA existente, incluyendo la exacerbación de la muerte neuronal.

También es crucial que dichos derivados de tPA tengan una actividad intrínseca razonable (que puede medirse gracias a su actividad amidolítica), de tal forma que se minimicen sus efectos adversos vasculares.

Los presentes inventores han identificado tPA mutados específicos, que son agentes eficientes agentes trombolíticos, que tienen una actividad intrínseca razonable y que no promueven la neurotoxicidad mediada por NMDAR.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a tPA mutados específicos, que tienen una actividad trombolítica y fibrinolítica y por tanto, son eficaces para tratar trastornos neurológicos trombóticos y la oclusión de la arteria retiniana central, más preferentemente, ictus, pero que no muestran eventos adversos neurotóxicos.

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones. La descripción de las realizaciones reivindicadas de la presente divulgación se proporciona en la siguiente descripción detallada.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Como se usan en el presente documento, los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una secuencia de aminoácidos que tiene más de 500 aminoácidos. Como se usa en el presente documento, el término "proteína" abarca secuencias de aminoácidos que tienen entre 500 y 1000 aminoácidos, preferentemente, entre 510 y 900 aminoácidos, preferentemente, entre 520 y 800 aminoácidos, preferentemente, entre 525 y 700 aminoácidos.

El término "homología" (u "homólogo"), como se usa en el presente documento, es sinónimo del término "identidad" y se refiere a la similitud de secuencia entre dos moléculas de polipéptido o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en ambas secuencias comparadas está ocupada por la misma base o el mismo resto de aminoácido, las moléculas respectivas son homólogas en dicha posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias corresponde al número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las dos secuencias dividido entre el número de posiciones comparadas y multiplicado por 100. En general, se hace una comparación cuando se alinean dos secuencias para proporcionar la máxima homología. Las secuencias de aminoácidos homólogas comparten secuencias de aminoácidos idénticas o similares. Los restos similares son sustituciones conservativas o "mutaciones puntuales permisibles" de, restos de aminoácidos correspondientes en una secuencia de referencia. Las "sustituciones conservativas" de un resto en una secuencia de referencia son sustituciones que son física o funcionalmente similares al resto de referencia correspondiente, por ejemplo, que tienen características similares de tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas, incluyendo la capacidad para formar enlaces covalentes o de hidrógeno o similares. Las sustituciones conservativas particularmente preferidas son aquellas que satisfacen los criterios definidos para una "mutación puntual aceptada" por Dayhoff et al. ("Atlas of Protein ^{Sequence and Structure", 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington,} Dc, ^{Supl. 3, 22:354-352).}

Las secuencias homólogas se identifican mediante alineamiento usando, por ejemplo, el programa PileUp de GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, versión 7, Madison, Wisconsin) o cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencias, tales como BLAST, FASTA, CLUSTALW, etc. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, una secuencia que tiene al menos un 80 % de homología con la SEQ ID NO: 2 es una secuencia para la que el número de posiciones coincidentes u homólogos compartidas por dicha secuencia y la ^{SEQ ID} nO: ^{2, dividido entre la longitud de la SEQ ID NO: 2 y multiplicado por 100, es al menos igual a 80.} La expresión "enfermedades trombóticas", como se usa en el presente documento, abarca trombosis venosa profunda (TVP), embolia pulmonar (EP), arteriopatía coronaria (AC) y síndrome coronario agudo (SCA), oclusión de la arteria retiniana central (OARC), degeneración macular asociada a la edad (DME) y trastornos neurológicos trombóticos, incluyendo ictus.

La expresión "trastorno neurológico trombótico", como se usa en el presente documento, se define como una enfermedad, trastorno o afección que afecta directa o indirectamente al normal funcionamiento o a la anatomía del sistema nervioso de un sujeto e incluye, pero sin limitación, insuficiencia cerebrovascular, isquemia cerebral o infarto cerebral, tal como ictus, isquemia retiniana (diabética o de otro tipo), glaucoma, degeneración retiniana, esclerosis múltiple, neuropatía óptica isquémica, reperfusión después de una isquemia cerebral aguda, lesión hipóxica-isquémica perinatal o hemorragia intracraneal de cualquier tipo (incluyendo, pero sin limitación, hemorragia epidural, subdural, subaracnoidea o intracerebral).

La expresión "actividad fibrinolítica" o "actividad trombolítica" se refiere a la capacidad para romper un coágulo de fibrina.

El término "tratar" un trastorno o una afección se refiere a revertir, aliviar o inhibir el proceso de uno o más síntomas de dicho trastorno o afección.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" indica un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino, un cerdo, un bóvido y un primate. Preferentemente, un sujeto de acuerdo con la invención es un ser humano.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, hace referencia a una cantidad mínima de agente activo que es necesaria para conferir beneficio terapéutico a un sujeto. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz del agente activo" para un sujeto es una cantidad del agente activo que induce, mejora o provoca una mejora en los síntomas de la patología, la progresión de la enfermedad o las afecciones físicas asociadas con la enfermedad que afecta al sujeto.

La divulgación de la presente solicitud

La presente solicitud divulga una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en:

i) proteínas que comprenden las secuencias de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:25, que consisten preferentemente en la SEQ ID NO: 2 o en la asociación de la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26, en donde dicha secuencia comprende:

una mutación A' que consiste en el reemplazo de cualquier aminoácido del sitio de unión a lisina de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e histidina, preferentemente, por arginina o una mutación B que consiste en el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina o

una doble mutación A' y B que consiste en el reemplazo de cualquier aminoácido del sitio de unión a lisina de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e histidina, preferentemente, por arginina y el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina,

ii) proteínas que comprenden una secuencia que tiene al menos un 80 % de homología con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25, comprendiendo dichas proteínas la mutación A', la mutación B o tanto la mutación A' como B y iii) proteínas que consisten en un fragmento de SEQ ID NO: 2, consistiendo dicho fragmento en el dominio Kringle 2 y el dominio catalítico, comprendiendo dichas proteínas la mutación A', la mutación B o la mutación A' y B.

Los aminoácidos del sitio de unión a lisina afectados por la mutación A' son fáciles de identificar: si se muta un aminoácido de dicho sitio de unión a lisina, el mutante correspondiente no induce un efecto significativo en la prueba de neurotoxicidad de NMDA, como se explica en el ejemplo 1 más adelante (véase el protocolo para "Muerte celular excitotóxica").

Los aminoácidos del sitio de unión a lisina que pueden mutarse de acuerdo con la mutación A' son, preferentemente, los aminoácidos cargados (positiva y negativamente) y los aminoácidos hidrófobos del sitio de unión a lisina. Preferentemente, dichos aminoácidos son los ácidos aspárticos en la posición 236 y 238 y el triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25.

Preferentemente, la mutación A' es la mutación A que consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e histidina.

Preferentemente, la doble mutación A' y B es la doble mutación A y B que consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, histidina e histidina y el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina.

Preferentemente, la proteína divulgada en el presente documento se selecciona entre el grupo que consiste en:

i) proteínas que comprenden las secuencias de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:25, que consisten preferentemente en la SEQ ID NO: 2 o en la asociación de la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26, en donde dicha secuencia comprende:

una mutación A que consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e histidina o

una mutación B que consiste en el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina o

una doble mutación A y B que consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, histidina e histidina y el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina,

ii) proteínas que comprenden una secuencia que tiene al menos un 80 % de homología con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25, comprendiendo dichas proteínas la mutación A, la mutación B o la mutación A y B y iii) proteínas que consisten en un fragmento de la SEQ ID NO: 2, consistiendo dicho fragmento en el dominio Kringle 2 y el dominio catalítico, comprendiendo dichas proteínas la mutación A, la mutación B o la mutación A y B.

Preferentemente, dicha mutación A consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por arginina. Preferentemente, dicha mutación A y B consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por arginina y en el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina.

Preferentemente, la proteína como se divulga en el presente documento comprende la mutación A' o la mutación A' y B, preferentemente, la mutación A o la mutación A y B.

Dicha proteína es un tPA mutado, que tiene una buena actividad fibrinolítica y que no promueve la neurotoxicidad mediada por receptores de N-metil-D-aspartato (NMDAR). Esto se muestra notablemente en el ejemplo más adelante.

El tPA está codificado por el gen PLAT y se refiere a la serina proteasa EC 3.4.21.68. El tPA humano se encuentra disponible comercialmente como alteplasa (Activase® o Actilyse®). El tPA está formado por 5 dominios: un dominio de dedo en el extremo N-terminal, después un dominio similar a EGF, los dominios Kringle 1 y Kringle 2 y finalmente, el dominio catalítico en el extremo C-terminal. El dominio Kringle 2 comprende un sitio de unión a lisina (LBS). La proteína tPA se encuentra bien conservada entre los mamíferos: tPA de humano, cerdo, bovino, ratón y rata comparten al menos un 80 % de homología. En particular, tPA de humano y rata comparten un 81 % de homología.

El tPA humano puede encontrarse en UniProtKB con el número de referencia P00750 y tPA de rata puede encontrarse en UniProtKB con el número de referencia P19637. El tPA humano está presente en 4 isoformas: la isoforma 1 es la secuencia canónica, mientras que las isoformas 2 a 4 difieren de esta secuencia canónica por eliminaciones y sustituciones.

La proteína se modifica durante el procesado: el tPA de mamífero se traduce en una forma de prepropéptido y después se procesa en la proteína madura. Finalmente, la proteína madura se escinde en dos cadenas, para dar una forma de dos cadenas, en donde ambas cadenas están unidas entre sí por medio de un enlace disulfuro.

Por ejemplo, el tPA humano se traduce en primer lugar en una forma de prepropéptido que comprende 562 aminoácidos y después se procesa en la proteína madura que comprende 527 aminoácidos (los 35 primeros aminoácidos se escinden durante el procesamiento). Por último, tras la escisión de la proteína madura, la forma humana de dos cadenas comprende una primera cadena de 275 aminoácidos y una segunda cadena de 252 aminoácidos.

El prepropéptido de tPA humano corresponde a la SEQ ID NO: 1 en la presente divulgación, mientras que su proteína madura corresponde a la SEQ ID NO: 2. Por último, la primera cadena de la forma humana de dos cadenas corresponde a la SEQ ID NO: 25 y la segunda cadena de la forma humana de dos cadenas corresponde a la SEQ ID NO: 26. La SEQ ID NO: 25 es idéntica a los primeros 275 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 26 es idéntica a los últimos 252 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Como otro ejemplo, el tPA de rata se traduce en primer lugar en una forma de prepropéptido que comprende 559 aminoácidos y después se procesa en la proteína madura que comprende 527 aminoácidos (los 32 primeros aminoácidos se escinden durante el procesamiento).

Sin desear quedar ligados a teoría alguna, los inventores han demostrado en el ejemplo que el tPA mutado específicamente en el sitio de unión a lisina en el dominio Kringle 2 (es decir, como la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 3) y en particular en un triptófano constitutivo del LBS, no induce neurotoxicidad. No obstante, dichas mutaciones no reducen la competencia trombolítica de dicho tPA mutado, ya que el dominio Kringle 2 tiene una función secundaria en la actividad fibrinolítica (Bakker et al., 1995; Bennett et al, 1991).

Además, los mutantes de tPA como se divulgan en el presente documento que comprenden al menos la mutación B son más estables que su versión de tipo silvestre.

Las proteínas divulgadas en el presente documento comprenden proteínas de tPA mutadas, en su forma madura original o escindida. Por lo tanto, las proteínas de acuerdo con la invención comprenden tPA monocatenario (sc-tPA) mutado con la mutación A, la mutación B o la mutación A y B. El sc-tPA tiene su significado general en la técnica y se refiere a la proteína madura de tPA.

Las proteínas divulgadas en el presente documento también comprenden tPA bicatenario (tc-tPA) mutado con la mutación A, la mutación B o la mutación A y B. El tc-tPA tiene su significado general en la técnica y se refiere a la forma escindida de tPA, obtenido después de la escisión de la proteína madura de sc-tPA mediante una escisión proteolítica en Arg-Ile, por ejemplo, en Arg275-Ile276 en ser humano. Ambas cadenas de tc-tPA están unidas entre sí mediante un enlace disulfuro.

Obsérvese que, a causa de la mutación B como se divulga en el presente documento, el mutante sc* no puede convertirse en la forma tc-tPA a partir de sus activadores habituales (por ejemplo, plasmina o calicreína), sino solo en la forma sc-tPA.

La proteína como se divulga en el presente documento puede seleccionarse entre el grupo i), es decir, proteínas que comprenden la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25, que consisten preferentemente en la SEQ ID NO: 2 o en la asociación de la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26, en donde dicha secuencia comprende: una mutación A que consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e histidina, preferentemente, arginina o

una mutación B que consiste en el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina o una doble mutación A y B que consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e histidina, preferentemente, arginina y el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina.

Dicho grupo i) corresponde a secuencias que comprenden la SEQ ID NO: 2, estando mutada específicamente dicha SEQ ID NO: 2 con la mutación A', la mutación B o la mutación A' y B (preferentemente, con la mutación A, la mutación B o la mutación A y B) y también a secuencias que comprenden la s Eq ID NO: 25, estando mutada específicamente dicha SEQ ID NO: 25 con la mutación A', la mutación B o la mutación A' y B (preferentemente, con la mutación A, la mutación B o la mutación A y B).

La mutación A es el siguiente reemplazo: el triptófano en la posición 253 se reemplaza por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e histidina, preferentemente, arginina. Por lo tanto, preferentemente, la mutación A es el siguiente reemplazo: W253R (en la presente solicitud, esta nomenclatura indica sucesivamente: el aminoácido que se reemplaza, su posición en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 y el aminoácido que se introduce). La mutación B es el siguiente reemplazo: R275S.

La mutación A y B como se divulga en el presente documento es la doble mutación W253 (el aminoácido hidrófilo se selecciona entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e histidina, preferentemente, arginina) y R275S.

Preferentemente, la mutación A y B es la doble mutación W253R y R275S.

Preferentemente, el grupo i) corresponde a secuencias que consiste en la SEQ ID NO: 2, estando mutada específicamente dicha SEQ ID NO: 2 con la mutación A, la mutación B o la mutación A y B y también a secuencias que consisten en la asociación de la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26, estando mutada específicamente dicha SEQ ID NO: 25 con la mutación A, la mutación B o la mutación A y B.

La expresión "asociación de la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26" significa que ambas secuencias están unidas entre sí por medio de un enlace disulfuro. Esta corresponde a la forma tc-tPA.

Preferentemente, las proteínas de acuerdo con el grupo i) son la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14.

La proteína como se divulga en el presente documento también puede seleccionarse entre el grupo ii), es decir, proteínas que comprenden una secuencia que tiene al menos un 80 % de homología con (la secuencia completa de) la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25, comprendiendo dichas proteínas la mutación A', la mutación B o la mutación A' y B (preferentemente, la mutación A, la mutación B o la mutación A y B). Las proteínas de acuerdo con el grupo ii) comprenden una secuencia que tiene al menos un 80 % de homología respecto de la SEQ ID NO: 2 a lo largo de su longitud completa y dichas proteínas comprenden la mutación A', la mutación B o la mutación A' y B (preferentemente, la mutación A, la mutación B o la mutación A y B). Las proteínas de acuerdo con el grupo ii) también comprenden una secuencia que tiene al menos un 80 % de homología respecto de la SEQ ID NO: 25 a lo largo de su longitud completa y dichas proteínas comprenden la mutación A', la mutación B o la mutación A' y B (preferentemente, la mutación A, la mutación B o la mutación A y B); en este caso, dicha proteína homóloga puede enlazarse a una proteína que consiste en la SEQ ID NO: 26 por medio de un enlace disulfuro.

Dicho grupo ii) corresponde a secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80 % de homología con la SEQ ID ^{NO: 2 o la SEQ ID} nO: ^{25, estando mutada específicamente dicha SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 25 con la mutación} A', la mutación B o la mutación A' y B (preferentemente, con la mutación A, la mutación B o la mutación A y B). Preferentemente, las proteínas del grupo ii) tienen al menos un 81 %, preferentemente, al menos un 85 %, preferentemente, al menos un 90 %, preferentemente, al menos un 95 % y preferentemente, al menos un 99 % de homología con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25, comprendiendo dichas proteínas la mutación A', la mutación B o la mutación A' y B (preferentemente, la mutación A, la mutación B o la mutación A y B).

Siempre que comprendan la mutación A', la mutación B o la mutación A' y B, las proteínas del grupo ii) pueden comprender al menos una de las siguientes modificaciones:

- el reemplazo de prolina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por arginina,

- la eliminación del dominio de dedo en el extremo N-terminal y/o la eliminación del dominio similar a EGF, en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 y/o el reemplazo de asparagina en la posición 117 de la SEQ ID NO: 2 o al SEQ ID NO: 25 por glutamina,

- el reemplazo de treonina en la posición 103 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por asparagina y/o el reemplazo de asparagina en la posición 117 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por glutamina y/o el reemplazo de lisinahistidina-arginina-arginina (KHRR) en las posiciones 296 a 299 de la SEQ ID NO:2 por alanina-alanina-alaninaalanina (AAAA),

- el reemplazo de cisteína en la posición 84 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina,

- el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por ácido glutámico o glicina, comprendiendo dicha proteína únicamente la mutación A y/o la eliminación del dominio Kringle 1 en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25.

Siempre que comprenda la mutación A', la mutación B o la mutación A' y B, la proteína divulgada puede seleccionarse entre el grupo iii), es decir, proteínas que consisten en un fragmento de la SEQ ID NO: 2, consistiendo dicho fragmento en el dominio Kringle 2 y el dominio catalítico. Dicho fragmento de la SEQ ID NO: 2 que consiste en el dominio Kringle 2 y el dominio catalítico está por tanto desprovisto del dominio de dedo, el dominio similar a EGF y el dominio Kringle 1. Preferentemente, dicho fragmento de la SEQ ID NO: 2 consiste en los aminoácidos 180 a 526 de la SEQ ID NO: 2. Por lo tanto, dicho grupo iii) preferentemente corresponde a la secuencia de los aminoácidos 180 a 526 de la SEQ ID NO: 2, comprendiendo dicha secuencia la mutación A', la mutación B o la mutación A' y B (preferentemente, la mutación A, la mutación B o la mutación A y B).

Preferentemente, las proteínas del grupo ii) o III) proceden de ser humano, rata, ratón, cerdo o bovino.

Preferentemente, las proteínas de acuerdo con el grupo ii) son la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12.

Preferentemente, la proteína divulgada se selecciona entre el grupo que consiste en proteínas que comprenden al menos una de las secuencias de la SEQ ID NO: 3 a la SEQ ID NO: 14. Más preferentemente, la proteína se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias de la SEQ ID NO: 3 a la SEQ ID NO: 14; en otras palabras, dicha secuencia consiste en una de las secuencias de la SEQ ID NO: 3 a la SEQ ID NO: 14.

Otro objeto divulgado es un polinucleótido que codifica dicha proteína. En vista de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína, puede sintetizarse el polinucleótido correspondiente. Preferentemente, dicho polinucleótido procede de las secuencias de la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 16.

Las secuencias descritas en la presente solicitud de patente pueden resumirse como se indica a continuación:

(continuación)

Otro objeto divulgado es un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido que codifica dicha proteína. Los vectores de expresión adecuados para su uso pueden comprender al menos un elemento de control enlazado operativamente a la secuencia de ácido nucleico. Los elementos de control de la expresión se insertan en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Los ejemplos de elementos de control de la expresión incluyen, pero sin limitación, el sistema lac, las regiones operadoras y promotoras del fago lambda, promotores de levadura y promotores procedentes de polioma, adenovirus, citomegalovirus, retrovirus, lentivirus o SV40. Los elementos operativos adicionales preferidos o necesarios incluyen, pero sin limitación, secuencia líder, codones de terminación, señales de poliadenilación y cualquier otra secuencia necesaria o preferida para la transcripción adecuada y la posterior traducción de la secuencia de ácido nucleico en el sistema hospedador. Un experto en la materia entenderá que la combinación correcta de elementos de control de la expresión necesarios o preferidos dependerá del sistema hospedador elegido. Se entenderá además que el vector de expresión debe contener elementos adicionales necesarios para la transferencia y la posterior replicación del vector de expresión que contiene la secuencia de ácido nucleico en el sistema hospedador. Los ejemplos de dichos elementos incluyen, pero sin limitación, orígenes de replicación y marcadores de selección. Un experto en la materia entenderá además que dichos vectores se construyen fácilmente usando métodos convencionales o disponibles comercialmente.

Otro objeto divulgado es una célula hospedadora que comprende un vector de expresión como se ha descrito anteriormente o un polinucleótido como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos de células hospedadoras que pueden usarse son células eucariotas, tales como células animales, vegetales, de insecto y de levadura y células procariotas, tales como E. coli. Los medios mediante los que puede introducirse el vector que porta el gen en las células incluyen, pero sin limitación, microinyección, electroporación, transducción o transfección usando DEAE-dextrano, lipofección, fosfato de calcio u otros procedimientos conocidos por un experto en la materia.

En una realización preferida, se usan vectores de expresión en eucariotas que funcionan en células eucariotas. Los ejemplos de dichos vectores incluyen, pero sin limitación, vectores víricos, tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus vaccinia, poxvirus, poliovirus; lentivirus, vectores de expresión en bacterias, plásmidos, tales como pcDNA5 o los vectores de transferencia de baculovirus. Las líneas celulares eucariotas preferidas incluyen, pero sin limitación, células COS, células CHO, células HeLa, células NIH/3T3, células 293 (ATCC n.° CRL1573), células T2, células dendríticas o monocitos.

La proteína divulgada puede usarse como medicamento. Por lo tanto, la proteína de acuerdo con la invención puede introducirse en una composición farmacéutica.

En particular, la proteína puede usarse para el tratamiento de enfermedades trombóticas. Dichas enfermedades trombóticas incluyen isquemia, oclusiones arteriales o venosas (tales como oclusión de la arteria retiniana central), hemorragias intracerebrales y hemorragias oculares. Las hemorragias intracerebrales incluyen ictus, hemorragias intraparenquimatosas, hemorragias intraventriculares y hemorragias subaracnoideas. los hematomas intracerebrales (o intraparenquimatosos) son un tipo de ictus y se caracterizan por una erupción espontánea de sangre dentro del parénquima cerebral y la causa es no traumática.

Las hemorragias oculares incluyen hemorragias maculares, vinculadas con enfermedades oculares, tales como la degeneración macular asociada a la edad (DME) y hemorragias en el humor vítreo.

En particular, la proteína puede usarse para el tratamiento de enfermedades trombóticas, seleccionadas preferentemente entre trombosis venosa profunda (TVP), embolia pulmonar (EP), arteriopatía coronaria (AC), síndrome coronario agudo (SCA), oclusión retiniana, que puede ser central o no, arterial o venosa, preferentemente, oclusión de la arteria retiniana central (OARC), degeneración macular relacionada con la edad (DME), insuficiencia cerebrovascular, isquemia cerebral, infarto cerebral, tal como ictus, isquemia retiniana, glaucoma, degeneración retiniana, esclerosis múltiple, neuropatía óptica isquémica, reperfusión después de una isquemia cerebral aguda, lesión hipóxica-isquémica perinatal y hemorragia intracraneal de cualquier tipo. Preferentemente, la proteína de acuerdo con la invención se usa para tratar hemorragias intracerebrales o hemorragias oculares, más preferentemente para tratar el ictus o la oclusión de la arteria retiniana central.

La composición farmacéutica divulgada puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente, matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar una composición terapéutica.

En la composición farmacéutica para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intratecal, intraocular, intracerebral, transdérmica, local o rectal, el principio activo, solo o en combinación con otro principio activo, puede administrarse en una forma galénica unitaria, como una mezcla con soportes farmacéuticos convencionales, a animales y seres humanos. Preferentemente, la composición farmacéutica se administra por vía intraocular o intracerebral.

La vía intraocular incluye administración intravítrea (en forma de inyección) y la vía de administración por el suelo ocular.

Las formas galénicas unitarias adecuadas comprenden formas orales, tales como comprimidos, cápsulas de gel, polvos, gránulos y suspensiones o soluciones orales, formas galénicas para administración sublingual y bucal, formas galénicas en aerosol, implantes, subcutáneas, transdérmicas, tópicas, intraperitoneales, intramusculares, intravenosas, subdérmicas, transdérmicas, intratecales e intranasales, así como formas farmacéuticas rectales.

Preferentemente, la composición farmacéutica contiene vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede inyectarse. En particular, estas pueden ser soluciones salinas isotónicas estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales) o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o de suero salino fisiológico, permiten la constitución de las soluciones inyectables. Dichas soluciones pueden comprender al menos poliuretano.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las soluciones que comprenden compuestos en forma de base libre o de sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezcladas con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estos preparados contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

La composición farmacéutica puede formularse en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. También pueden obtenerse sales formadas con los grupos carboxilo libres procedentes de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

El portador también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas de los mismos y aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando las sustancias activas en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con varios de los demás ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de la solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la presentación farmacéutica y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas farmacéuticas, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también pueden emplearse cápsulas de liberación de fármaco y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse de manera adecuada en caso necesario y el diluyente líquido en primer lugar tiene que volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosis podría disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y se añade a 1000 ml de fluido de hipodermocilisis o se inyecta en el sitio de infusión propuesto. Se producirá necesariamente alguna variación en la dosis dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. La persona a cargo de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto individual.

La composición farmacéutica puede formularse en una mezcla terapéutica para que comprenda de aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos o de aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos o de aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis o similares. También pueden administrarse múltiples dosis.

Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; formulaciones liposomales; cápsulas de liberación controlada; y cualquier otra forma usada en la actualidad.

Se entenderá que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente divulgación se decidirá por el médico responsable dentro del alcance del buen criterio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de diversos factores, incluyendo el trastorno que se esté tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el género y la dieta del paciente; el momento de administración, la vía de administración y la tasa de secreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o de manera coincidente con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Por ejemplo, se encuentra dentro de la capacidad del experto iniciar las dosis del compuesto a niveles inferiores que los necesarios para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. Sin embargo, la dosis diaria de los productos puede variarse a lo largo de un amplio intervalo de 0,01 a 1.000 mg por adulto al día. Preferentemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del principio activo para el ajuste sintomático de la dosis para el paciente que se vaya a tratar. Un medicamento contiene normalmente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del principio activo, preferentemente, de 1 mg a aproximadamente 100 mg del principio activo. Normalmente se administra una cantidad eficaz del fármaco a un nivel de dosis de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al día, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal al día.

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar diversas realizaciones de la divulgación.

Descripción de las figuras

Nota importante:

En las siguientes figuras que están relacionadas con el ejemplo, los aminoácidos se numeran desde la serina N-terminal de la secuencia madura de tPA de Rattus norvergicus (UniProtKB: PI9637).

Figura 1. Tabla de comparación de los tres activadores de plasminógeno. A) tPA humano, tPA de rata y activador de plasminógeno de Desmondus rotundus (DSPA) muestran una secuencia de dominios prácticamente similar que varía desde un dominio de dedo en el extremo aminoterminal hasta el dominio de proteasa en el extremo carboxilo terminal. El dominio kringle 2 de tPA está ausente en DSPA. Además, tPA de ser humano y de rata y DSPA comparten una fuerte homología (> 80 % entre tPA de rata y ser humano; > 65 % entre tPA humano y DSPA). B) Mapa del plásmido pcDNA5/FRT usado en los experimentos para la expresión de tPA de ts de rata.

Figura 2. Comparación de la estructura primaria de tPA de ser humano y de rata y DSPA. A) El análisis de secuencia del dominio kringle de DSPA revela sustituciones de aminoácidos de origen natural que dan lugar a un sitio de unión a lisina no funcional: los cambios aniónicos en la posición D237 y D239 (recuadro negro 1) y el aminoácido hidrófobo W254 (recuadro negro 2) están ausentes. B) DSPA es una proteasa específica en tanto que existe únicamente en una forma monocatenaria, mientras que las proteasas, tales como tPA de humano o de rata pueden procesarse en una forma bicatenaria.

Figura 3. Caracterización bioquímica de las muteínas relacionadas con tPA. A) Se sometieron cantidades iguales de (100 ng) de las muteínas tPA de ts, AK2-tPA, K2*-tPA y sc*-tPA a inmunotransferencia. (B-C) Actividad de las muteínas relacionadas con tPA medida o bien en un sustrato fluorogénico (B) o mediante ensayos de zimografía de plasminógeno-caseína (C).

Figura 4. Las muteínas relacionadas con K2 tienen propiedades fibrinolíticas mejoradas. A) AK2-ÍPA y K2*-tPA revelan una actividad fibrinolítica como ts-tPA cuando se someten a zimografía de fibrina-agarosa después de electroforesis por SDS-PAGE no reductora. B) Evaluación in vitro de la actividad fibrinolítica usando un coágulo de plasma con pocas plaquetas (PPP-coágulo). Las muteínas K2*-tPA y AK2-tPA expresan una eficacia fibrinolítica global mejorada en comparación con ts-tPA (26 % y 51 %, respectivamente). La actividad fibrinolítica se normalizó a la de ts-tPA de rata, usando la semivida para la lisis del coágulo. (** p<0,02; *** p<0,01).

Figura 5. La anulación del sitio de unión a lisina constitutivo del dominio kringle 2 de tPA suprime la neurotoxicidad mediada por tPA. (A-C) Se evaluó la muerte neuronal midiendo la liberación de LDH en el medio de baño 24 horas después de exposición durante 1 hora de las neuronas corticales primarias cultivadas (14 días ^{in vitro - DIV) a} NMdA ^{50 pM solo o suplementado con o bien (A) tPA humano o ts-tPA de rata (0,3 pM; n=12, 3} experimentos independientes) (B) ts-tPA, AK2-tPA o K2*-tPA (0,3 pM; n=12, 4 experimentos independientes) o (C) tPA humano en presencia o no de 0,1 mM del análogo de lisina s-ACA (ácido £-amino caproico) (n=19, 5 experimentos independientes). Los datos se presentan como el valor medio ± DT de la muerte celular en porcentaje en relación con el control.

(*** p<0,01; ns: no significativo).

Figura 6. La fibrina restaura parcialmente la función de activación del plasminógeno del sc*-tPA inactivo.

Aunque sc*-tPA no es capaz de promover por sí mismo la conversión del plasminógeno en plasmina, su cofactor de fibrina devuelve parcialmente su función de activación del plasminógeno, detectada (A) mediante zimografía de fibrina-agarosa después de electroforesis SDS-PAGE no reductora y (B) en un ensayo de lisis de un coágulo de plasma con pocas plaquetas (PPP-coágulo). Los coágulos de fibrina restauran la actividad de sc*-tPA a un mayor nivel que la mitad de la actividad fibrinolítica de ts-tPA (n=3). La actividad fibrinolítica se normalizó a la de ts-tPA de rata, usando la semivida para la lisis del coágulo. (*** p<0,01).

Figura 7. La restauración de la zimogenicidad de sc-tPA rescata a las neuronas de la potenciación por tPA de la neurotoxicidad mediada por NMDA. Se evaluó la muerte neuronal midiendo la liberación de LDH en el medio de baño 24 horas después de exposición durante 1 hora de las neuronas corticales primarias cultivadas (14 días in vitro - DIV) a NMDA 50 pM solo o suplementado con o bien de ts-tPA de rata o sc*-tPA de rata (0,3 pM; n=12, 4 experimentos independientes). Los datos se presentan como el valor medio ± DT de la muerte celular en porcentaje en relación con el control. (*** p<0,01; ns: no significativo).

Figura 8. Caracterización de las variantes de tPA humano. Se sometieron a inmunotransferencia cantidades iguales (200 ng) de las variantes de tPA humano y se compararon con las formas comercialmente disponibles de tPA (Actilyse) y reteplasa (rapilisina).

Figura 9. Caracterización bioquímica de las variantes de tPA. IZQUIERDA, se determinó la cantidad intrínseca de las variantes de tPA determinada midiendo el aumento en la absorbancia del cromóforo libre (AMC) generado, en comparación con el sustrato original, por unidad de tiempo a una A440 nm. El sustrato fluorigénico usado es Spectrofluor tPA (fórmula: CH3SO2-D-Phe-Gly-Arg-AMC.AcOH, American Diagnostica). Las mediciones se llevaron a cabo por duplicado usando 5 dosis diferentes, en tres experimentos independientes. CENTRO, actividad fibrinolítica de los dobles o triples mutantes de tPA normalizada al tPA disponible comercialmente (Actilyse) usando la semivida para la lisis del coágulo para coágulos derivados de euglobulina. DERECHA, actividad fibrinolítica de los dobles o triples mutantes de tPA normalizada al tPA disponible comercialmente (Actilyse) usando la semivida para la lisis del coágulo para coágulos derivados de plasma completo.

Figura 10. Prueba de concepto in vitro del efecto no neurotóxico de las variantes de tPA humanas. Se evaluó la muerte de células neuronales midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa en el medio de baño, como se describe en la sección de métodos. tPA humano (Actilyse), hutPAsc* u Opt-PA2 (0,3 pM; 4 experimentos independientes) (para las definiciones de hutPAsc* y Opt-PA2, véase la tabla de las secuencias anterior). Los datos se presentan como el valor medio ± DT de la muerte celular en porcentaje en relación con el control; ns: no significativo.

Figura 11. Prueba de concepto in vitro del efecto no neurotóxico de las variantes de tPA humanas. Se evaluó la muerte de células neuronales midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa en el medio de baño, como se describe en la sección de métodos. tPA humano (Actilyse), hutPAK2* u Opt-PA (0,3 pM; 4 experimentos independientes) (para las definiciones de hutPAK2* y Opt-PA, véase la tabla de las secuencias anterior). Los datos se presentan como el valor medio ± DT de la muerte celular en porcentaje en relación con el control; ns: no significativo.

Figura 12. Opt-PA no promueve neurotoxicidad inducida por NMDA in vivo. Las lesiones cerebrales excitotóxicas inducidas por NMDA se midieron mediante formación de imágenes por resonancia magnética (IRM) como se describe en la sección de métodos, 24 horas después de la inyección en intraestriatal de NMDA (12,5 mM) solo o en combinación con Actilyse (5 pM), Opt-PA (5 pM) o hutPA k2* ^{(5 pM) (para las definiciones de hutPAK2*} y Opt-PA, véase la tabla de las secuencias anterior). Los datos se presentan como los valores medios ± DT de los volúmenes de la lesión en mm3.

Tabla 1. Sumario de las muteínas relacionadas con tPA producidas en el estudio.

Tabla 2. Características bioquímicas de las variantes de tPA. (1): secuencia disponible en la base de datos UniProt, número de referencia P19637; (2): actividades fibrinolíticas obtenidas a partir del ensayo de tiempo de lisis del coágulo de euglobulina por referencia a la preparación internacional de referencia (IRP 98/714) usando el tiempo para obtener un 50 % de la lisis del coágulo; (3-4): Kd para fibrina (3) y Km y kcat para plasminógeno en presencia de fibrina (4) obtenida a partir de 3 experimentos independientes (12 dosis ensayadas).

EJEMPLO 1: Mutantes de tPA de rata

Nota importante:

En el siguiente estudio, los aminoácidos se numeran desde la serina N-terminal de la secuencia madura de tPA de Rattus norvergicus (UniProtKB: P19637).

Material y métodos

Productos químicos.

Se adquirió N-metil-D-aspartato (NMDA) de Tocris (Bristol, Reino Unido). Se adquirió Spectrofluor 444FL de American Diagnostica (Stamford, EE. UU.). El ácido 6-aminocaproico (s-ACA), el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), la poli-D-lisina, el p-D-arabinósido de citosina y la higromicina B fueron de Sigma-Aldrich (L'Isle d'Abeau, Francia). El kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange XL fue de Stratagene (La Jolla, California, EE. UU.). El plasminógeno se adquirió de Calbiochem (Nottingham, Reino Unido). la Lipofectamine 2000, Opti-MEM RSM, los sueros fetales bovinos y de caballo, y la laminina eran de Invitrogen (Cergy Pontoise, Francia). tPA (Actilyse®) se obtuvo de Boehringer-Ingleheim (Alemania).

Construcción de tPA de tipo silvestre y muteínas de AK2-tPA en el vector pcDNA5/FRT.

La secuencia codificante de tPA de rata de tipo silvestre de longitud completa se amplificó mediante la PCR usando un cebador directo 5' CCGGGATCCTCCTACAGAGCGACC 3' (SEQ ID NO: 17) y un cebador inverso 5' GGCAAGCTTTTGCTTCATGTTGTCTTGAATCCAGTT 3' (SEQ ID NO: 18). Se colocó un marcador 6xHis en la posición N-terminal de la proteína madura. Posteriormente, los productos de la PCR digeridos se insertaron en un vector pcDNA5/FRT (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia). Se llevó a cabo PCR de fusión para obtener AK2-tPA a partir de la secuencia codificante de ts-tPA usando el mismo protocolo con los siguientes cebadores de fusión: directo 5' CAGGCCGCACGTGGAGTCCTGAGTTGGTCCCTTAGG 3' (SEQ ID NO: 19) e inverso 5' TCCACCTGCGGCCTG 3' (SEQ ID NO: 20). Las construcciones finales se comprobaron usando un análisis de secuencia automatizado.

Mutagénesis dirigida al sitio.

La mutagénesis de tPA de ts de longitud completa (tPA W254R) se llevó a cabo usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® XL adquirido de Stratagene (Agilent Technologies, Massy, Francia) y los siguientes cebadores 5' GGACCGAAAGCT GACACGGGAATATT GCGACAT GTCC 3' (SEQ ID NO: 21) y 5' GGACATGTCGCAATATTCCCGTGGTCAGCTTTCGGTCC 3' (SEQ ID NO: 22). Se obtuvo tPA no escindido (tPA R276S) usando los cebadores 5' TACAAACAGCCTCTGTTTCGAATTAAAGGAGGA 3' (SEQ ID NO: 23) y 5' TCCTCCTTTAATTCGAAACAGAGGCTGTTTGTA 3' (SEQ ID NO: 24). Las mutaciones se confirmaron usando un análisis de secuencia automatizado.

Cultivos de células de riñón embrionario humano (HEK)-293 y transfección estable.

Se cultivaron células de riñón embrionario humano 293 previamente transfectadas de manera estable con el vector pFRT/lacZeo (HEK-Flpln, Invitrogen) en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 10 % y glutamina 2 mM. Las células a alta confluencia se transfectaron usando el reactivo Lipofectamine 2000 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen) con una mezcla que contiene los plásmidos relacionados con tPA y el plásmido auxiliar pOG44. Después 24 horas, se lavaron las células. 48 horas después de la transfección, se aislaron los clones positivos mediante selección con higromicina B. La calidad de la transfección se evaluó mediante qRT-PCR.

Medio condicionado que contiene las muteínas relacionadas con tPA.

Las células a alta confluencia transfectadas de manera estable con los diferentes plásmidos relacionados con tPA se incubaron durante 24 horas en medio mínimo compuesto por Opti-MEM RSM (Invitrogen) al que se le añadió glutamina 2 mM y que contenía 10 UI/ml de aprotinina y 200 pg/ml de higromicina B. Los sobrenadantes se recogieron en azida al 0,01 %, EDTA 2 mM, Tween 20 al 0,01 %, se centrifugaron 15 minutos a 10.000 g y finalmente se almacenaron a -20 °C.

Producción en biorreactor de las muteínas relacionadas con tPA.

Para producir un alto nivel de muteínas, las células HEK transfectadas de manera estable se cultivaron en un biorreactor a escala de laboratorio CELLine AD 1000. Dos semanas después de la inoculación con 1 x 106 células viables/ml, se recoge dos veces a la semana el compartimento celular durante cuatro meses. Cada sobrenadante recogido se controla en cuanto a su pH, turbidez, se centrifuga 15 minutos a 10.000 g y se almacena a -20 °C antes de la purificación mediante 6xhis.

Purificación mediante 6xhis de muteínas.

La purificación se procesó usando una matriz de cromatografía de afinidad de metal de níquel-ácido nitriloacético (Ni-NTA) (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, las muteínas se acondicionaron en un tampón de NH4HCO30,5 M, se cuantificaron y se almacenaron.

Inmunotransferencia de tPA.

Las inmunotransferencias se llevaron a cabo usando un anticuerpo monoclonal de ratón generado contra una secuencia de penta-histidina (1/1000eme), seguido de incubación con el anticuerpo secundario conjugado biotinilado adecuado. La señal se amplificó usando el conjugado de biotina-peroxidasa Extravidine (Sigma) (1/5000). Las inmunotransferencias se revelaron con un sistema de detección de inmunotransferencia ECL Plus de quimioluminiscencia potenciada (Perkin Elmer-NEN, París, Francia).

Zimografía de plasminógeno-caseína por SDS-PAGE.

Se llevó a cabo un ensayo de zimografía mediante la adición de plasminógeno (4,5 pg/ml) y caseína (1 %) en geles de SDS-poliacrilamida al 10 %. La electroforesis se llevó a cabo a 4 °C. Los geles se lavaron con Triton X-100 (2,5 %) y se incubaron durante 2 horas a 37 °C. Las bandas caseinolíticas se visualizaron después de la tinción de Coomassie.

Ensayo de actividad amidolítica.

Las muteínas relacionadas con tPA se incubaron en presencia de un sustrato fluorogénico (5 pM) (Spectrofluor® FL444). La reacción se llevó a cabo a 37 °C en Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 150 mM en un volumen total de 100 pl. La actividad amidolítica se midió como el cambio en la emisión de fluorescencia a 440 nm (excitación a 360 nm). Usando Spectrozyme®, un sustrato amidolítico (Spectrozyme tPA, SptPA)), se incubaron ts-tPA y sc*-tPA (0,3 nM) con concentraciones crecientes del SptPA (0-1 mM) en una placa de micropocillos (200 pl por pocillo) y se registró la DO405nm cada minuto usando un espectrofotómetro para placas de micropocillos (ELx 808, Biotek, EE: UU.). Posteriormente, se calculó la velocidad máxima (Vmáx) de la reacción y los datos se representaron como se indica a continuación:

1

_v f _J ( _v— _[Sp —_tPX] )_' = _V —_m • _X (— _{S p t} — _{P A /} ) _V —_m .

Zimografía en agarosa de fibrina.

Las proteínas (10 pg) y las proteínas de referencia (10 pl de tPA 0,06 Ul/ml, uPA 0,25 Ul/ml y plasmina 200 nM) se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8 % en condiciones no reductoras. Después, se intercambió el SDS con Triton X-100 al 2,5 %. Tras retirar por lavado el exceso de Triton X-100 con agua destilada, se superpuso cuidadosamente el gel sobre un gel de agarosa al 1 % que contenía 1 mg/ml de fibrinógeno bovino, paslminógeno 100 nM y 0,2 unidades NIH/ml de trombina bovina. Se dejaron revelar los zimogramas a 37 °C durante 12 h y se tomaron fotografías a intervalos regulares usando iluminación de fondo oscuro. Las proteínas activas en los lisados celulares se identificaron por referencia a la migración de marcadores conocidos (uPA, tPA, plasmina). Para verificar la identidad del activador, los zimogramas se prepararon en un gel de fibrina-agarosa que contenía un anticuerpo policlonal dirigido contra tPA o una IgG no inmunogénica.

Tiempo de lisis de coágulos.

Se recogió plasma humano y se separaron las fracciones de euglobulina, que contienen p- y Y-globulinas mediante dilución de un volumen de plasma enfriado en 20 volúmenes de ácido acético 2,9 mM enfriado. Después de la incubación a 4 °C durante 15 minutos y centrifugación a 3000 g durante 10 minutos, se precipitó la fracción de euglobulina, se desechó el sobrenadante y el precipitado se disolvió en tampón HEPES (HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM). La solución de euglobulina (100 pl) se suplementó con cloruro de calcio 15 mM y 5, 10, 15, 20, 25 o 30 U.l. de muteínas de tPA. Se registró el tiempo hasta la lisis del coágulo mediante la densidad óptica (absorbancia a 405 nm) a 37 °C. Las pruebas se llevaron a cabo por duplicado. Los resultados se expresan como el tiempo hasta el 50 % de la lisis del coágulo.

Cultivo ce células neuronales.

Los cultivos neuronales se prepararon a partir de ratones fetales (día embrionario 15-16) como se ha descrito previamente (Nicole et al., 2001). Brevemente, se extrajeron y disociaron las cortezas en DMEm y se emplacaron en placas de 24 pocillos previamente recubiertas con poli-D-lisina (0,1 mg/ml) y laminina (0,02 mg/ml). Las células se cultivaron en DMEM suplementado con suero fetal bovino al 5 %, suero de caballo al 5 % y glutamina 2 mM. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2. Se añadió p-D-arabinósido de citosina (10 pM) después de 3 días in vitro (DIV) para inhibir la proliferación glial. Se llevaron a cabo diversos tratamientos después de 14DIV.

Muerte celular excitotóxica.

Se indujo excitotoxicidad mediante exposición de neuronas corticales a NMDA (50 pM) en DMEM sin suero suplementado con glicina 10 pM, durante 1 hora. Se aplicaron las muteínas relacionadas con tPA humano y tPA de rata con NMDA en los momentos indicados. La muerte celular se cuantificó 24 horas después midiendo la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada por las células dañadas en el medio de baño usando un kit de detección de citotoxicidad (Roche Diagnostics; Mannheim, Alemania). Se determinó el nivel de LDH correspondiente a la máxima muerte neuronal en cultivos hermanos expuestos a NMDA 200 pM (LDHmáx). Los niveles basales de LDH se determinaron en cultivos hermanos sometidos a lavados de control (LD-Hmin). Los valores experimentales se midieron después de restar LDHmin y después se normalizaron a LDHmáx - LDHmin para expresar los resultados en porcentaje de muerte neuronal en relación con el control.

Cinética de la activación de plasminógeno en presencia de fibrina.

La cinética de la activación de plasminógeno en una superficie de fibrina se determinó para cada uno de los mutantes de tPA como se ha descrito anteriormente por Angles-cano et al. Brevemente, se inmovilizó fibrinógeno (0,3 pM) sobre placas de PVC previamente activadas con glutaraldehído. Posteriormente, se añadió trombina (10 NIH U/ml) durante 2 h a 37 °C para convertir el fibrinógeno en fibrina. Después, se lavan las placas con PPACK 9 nM que contiene tampón de unión (PO4 50 mM a pH 6,8, NaCl 80 mM, BSA al 0,4%, Tween 20 al 0,01 %, azida al 0,01 % y EDTA 2 mM). Después, se incubaron las variantes de tPA sobre superficies de fibrina durante 1 h a 37 °C con 50 pl de tampón de unión. Las proteínas no unidas se eliminaron mediante lavado con un tampón (PO450 mM a pH 7,4, NaCl 80 mM, BSA al 0,2%, Tween 20 al 0,01 %, azida al 0,01 %) y se inició la reacción añadiendo 50 pl de tampón de ensayo (PO450 mM a pH 7,4, NaCl 80 mM, BSA al 0,2 %) que contenía cantidades crecientes de plasminógeno (0­ 500 nM) y una concentración fija (0,75 mM) del sustrato cromogénico selectivo para plasmina (CBS0065, Diagnostica STAGO, Asnieres, Francia). Se registró la absorbancia a 405 nm durante 18 h usando un espectrofotómetro (ELx 808, Biotek, EE. UU.) y los datos se representaron como se indica a continuación: ([Pn] = f(t)). La velocidad máxima (MPn.s-1) se midió para cada concentración de activador y se representó frente a las concentraciones de activador ( Vi = f([Pg]). Los parámetros cinéticos se determinaron ajustando los datos a la ecuación de Lineweaver-Burk:

La kcat se calculó usando la siguiente ecuación:

kca t = Vm

[tPA]

Análisis estadístico.

Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante la prueba bilateral de Kruskall-Wallis, seguida de comparaciones post-hoc, con la prueba bilateral de Mann-Whitney. Los datos se expresan como media ± DT en relación con el control. Se considera la significación estadística para p<0,05.

Resultados

Generación de nuevos agentes trombolíticos a procedentes de tPA. Las diferencias estructurales entre tPA humano (Uni-ProtKB: P00750), tPA de rata (UniProtKB: P19637) y DSPAal (denominado DSPA) (UniProtKB: P98119) se estudiaron usando múltiples alineamientos. tPA de rata comparte un 81 % de identidad de aminoácidos y un 89 % de sustituciones conservadas con tPA humano (figura 1A). DSPA comparte un 67 % de identidad de aminoácidos y un 79 % de sustituciones conservadas con tPA de rata. DSPA contiene un solo dominio kringle que tiene un alto grado de homología de secuencia de aminoácidos con el dominio kringle 1 de tPA (figura 2A), incluyendo la ausencia de un sitio de unión a lisina constitutivo (figura 2A - recuadros negros). Por otra parte, el dominio kringle 2 de tPA contiene un sitio de unión a lisina constitutivo formado por el par de ácido aspártico en la posición 237 y 239 y el triptófano en la posición 254. Un segundo punto de interés es que a diferencia de tPA, DSPA es una serina proteasa exclusivamente monocatenaria (Schleuning et al., 1992). De hecho, el análisis de la secuencia primaria de DSPA revela la ausencia del sitio de escisión presente en tPA, Arg276-Iso277 (figura 2B). Todas estas características de DSPA, cuando se comparan con tPA, se asocian interesantemente con una afinidad aumentada por la fibrina (Schleuning et al., 1992) y ausencia de neurotoxicidad (Liberatore et al., 2003).

Por lo tanto, basándose en estas observaciones, los inventores han diseñado y generado tres muteínas procedentes de tPA de rata (Rattus norvegicus) (tPA de rata de tipo silvestre, denominado ts-tPA): (i) un tPA de rata modificado por ingeniería genética con supresión completa de su dominio K2 (eliminación de los aminoácidos 181 a 262), denominado AK2-tPA; (ii) un tPA de rata que contiene una mutación de triptófano a arginina en la posición 254 (W254R), denominado K2*-tPA; (iii) un tPA exclusivamente monocatenario de rata obtenido mediante una mutación puntual de arginina a serina en la posición 276 (R276S), denominado sc*-tPA (tabla 1). Tras la eliminación/mutación adecuada inducida por la PCR como se ha descrito anteriormente, se insertaron los ADNc marcados con 6x histidina correspondientes en un vector de expresión de mamífero pcDNA5/FRT (FRT: diana de recombinación de Flp) (figura 1B) y transfección estable en células HEK-293 que expresan el sistema Flp-In (Invitrogen) para la producción estable de las proteínas recombinantes correspondientes, como se describe en la sección de métodos. Una vez purificados usando una cromatografía de afinidad de níquel, las muteínas se sometieron a electroforesis de SDS-PAGE e inmunotransferencia. Ts-tPA, sc*-tPA y K2*-tPA mostraron pesos moleculares similares, mientras que el tPA con eliminación de K2, AK2-tPA, mostró un peso molecular reducido de 15 kDa (figura 3A). Curiosamente, sc*-tPA está presente en su forma exclusivamente monocatenaria, mientras que ts-tPA, K2*-tPA y AK2-tPA presentan formas bicatenarias (de 35 kDa y 25 kDa para AK2-tPA). Por tanto, la mutación puntual r 276S (sc*-tPA) da lugar a la generación de una forma no escindible de tPA. Debido a que tPA se une a y escinde varios sustratos aparte del plasminógeno, tales como PDGF-C o la subunidad NR1 del NMDAR sin un regulador alostérico identificado, los inventores han evaluado en primer lugar la actividad proteolítica intrínseca de cada una de estas muteínas. Por lo tanto, los ensayos de zimografía que contienen plasminógeno (figura 3B) y los ensayos de actividad amidolítica hacia un sustrato fluorigénico (Spectrofluor) (figura 3C) se llevaron a cabo para las diferentes muteínas relacionadas con tPA citadas anteriormente. Los presentes datos revelan que aunque ts-tPA y los mutantes relacionados con kringle 2 (AK2-tPA y K2*-tPA) muestran actividad amidolítica comparable con la observada para ts-tPA, sc*-tPA no. En lo sucesivo, las concentraciones de muteínas se normalizan a su actividad proteolítica intrínseca.

Los inventores midieron la capacidad de cada uno de los mutantes de tPA para unirse a fibrina, con Kd de 0,26 nM, 1,2 nM, 0,5 nM y 0,82 nM para ts-tPA, sc*-tPA, K2*-tPA y AK2-tPA, respectivamente (tabla 2).

Se sabe que tPA se une a y escinde varios sustratos aparte de plasminógeno (tales como la subunidad GluN1) sin un regulador alostérico identificado. Por lo tanto, los inventores evaluaron la actividad proteolítica intrínseca de cada una de las variantes de tPA. De este modo, se llevaron a cabo ensayos de actividad amidolítica frente a un sustrato fluorigénico (Spectrofluor) y ensayos de zimografía que contienen plasminógeno para los diferentes mutantes relacionados con tPA citados anteriormente. Los datos revelan que, aunque ts-tPA y los mutantes relacionados con kringle 2 (AK2-tPA y K2*-tPA) muestran una actividad amidolítica comparable con la observada para ts-tPA, sc*-tPA no. Para investigar adicionalmente el comportamiento de la variante sc*-tPA en comparación con ts-tPA, Los inventores determinaron la Km de ambos activadores de plasminógeno usando Spectrozyme® amidolítico, como sustrato. Los datos demostraron que, la mutación puntual dentro del sitio de escisión de tPA da lugar a un aumento de factor 3 del valor de Km cuando se compara con ts-tPA (2,83E-04 y 9,12E-05 M, respectivamente). En lo sucesivo, las concentraciones de los mutantes de tPA se normalizan a su actividad amidolítica intrínseca, a menos que se mencione otra cosa.

Las muteínas relacionadas con kringle 2 (AK2-tPA y K2*-tPA) muestran una mayor actividad fibrinolítica y no lograron promover la neurotoxicidad mediada por receptores de NMDA. Las muteínas relacionadas con K2 se caracterizaron respecto de su capacidad para iniciar la fibrinolisis en placas de fibrina-agar, como se describe en la sección de métodos. AK2-tPA y K2*-tPA provocan la activación del plasminógeno en plasmina en presencia de fibrina del mismo modo que ts-tPA (figura 4A). El ensayo de lisis de coágulos in vitro, llevado a cabo en plasma humano con escasez de plaquetas (PPP-coágulo) como sustrato, reveló que K2*-tPA y AK2-tPA mostraron una actividad fibrinolítica potenciada en comparación con ts-tPA (+26 % y 51 %, respectivamente) (figura 4B). Para estimar su efecto en la neurotoxicidad mediada por el receptor de NMDA, se sometió a cultivos puros de neuronas corticales (14 días in vitro) a una exposición durante 1 hora a NMDA 50 |jM solo o en combinación con AK2-tPA o K2*-tPA purificado (equivalente 0,3 |jM de su actividad amidolítica respectiva) antes de medir la muerte neuronal 24 horas después. Aunque ts-tPA de rata provoca una potenciación del 39 % de la excitotoxicidad mediada por NMDAR (71 % de la muerte celular en comparación con un 51 % solo con NMDA), un efecto similar al que se observa para tPA humano contenido en Actilyse® (figura 5A; n=3, p<0,01), AK2-tPA y K2*-tPA (figura 5B; n=4, p<0,01) no tienen perfiles proneurotóxicos. Por lo tanto, el triptófano 254, un aminoácido constitutivo del LBS kringle 2 de tPA es crucial para mediar la proneurotoxicidad de tPA. Por consiguiente, se llevaron a cabo los mismos experimentos en presencia de ácido £-amino caproico (£-ACA), un análogo de lisina que se sabe que compite con el LBS de tPA, demostrando que el bloqueo de la función del LBS previno la potenciación inducida por tPA de la neurotoxicidad mediada por NMDAr (figura 5C; n=5, p<0,01).

Un tPA zimogénico (sc*-tPA) muestra un perfil no proneurotóxico. Los inventores han evaluado tanto la actividad fibrinolítica como la proneurotoxicidad de la forma no escindible de tPA de rata, sc*-tPA, generado y purificado como se ha descrito anteriormente. En contraste con su ausencia de actividad amidolítica intrínseca (figura 3B-C), sc*-tPA sigue siendo fibrinolítico en presencia de fibrina (figura 6A) a pesar de una menor actividad que la de ts-tPA (- 39 %) (figura 6B). Posteriormente, se evaluó la capacidad de esta muteína para influenciar la neurotoxicidad mediada por NMDAR en cultivos primarios de neuronas corticales. Curiosamente, sc*-tPA no logra potenciar la excitotoxicidad dependiente de los receptores de NMDA en comparación con ts-tPA (n=3, p<0,01) (figura 7).

En conjunto, los inventores han generado y caracterizado un conjunto original de agentes fibrinolíticos procedentes de tPA: un K2*-tPA (SEQ ID NO: 4) caracterizado por una mayor actividad fibrinolítica y ausencia de proneurotoxicidad y un sc*-tPA (SEQ ID NO: 8) caracterizado tanto por la ausencia de actividad amidolítica como por proneurotoxicidad a pesar de su actividad fibrinolítica conservada. Estos datos in vitro proporcionan la base para estudios adicionales para evaluar la eficacia de esta nueva generación de agentes fibrinolíticos en modelos experimentales de trombosis, antes de su posible transferencia a aplicaciones clínicas.

Ejemplo 2: mutantes de tPA humano

Material y métodos

Productos químicos

Se adquirió N-metil-D-aspartato (NMDA) de Tocris (Bristol, Reino Unido); Spectrofluor 444FL de American Diagnostica (ADF Biomedical, Neuville-sur-oise, Francia); El ácido 6-aminocaproico (s-ACA), el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), la poli-D-lisina, el p-D-arabinósido de citosina y la higromicina B de Sigma-Aldrich (L'Isle d'Abeau, Francia). la Lipofectamine 2000, los sueros fetales bovinos y de caballo, la laminina y el sistema de mutagénesis dirigida al sitio GeneArt® fueron de Invitrogen (Cergy Pontoise, Francia). El tPA (Alteplase®) fue de Boehringer-Ingleheim (París, Francia). Reteplasa (rapilisina) fue de Actavis (París, Francia).

Construcción de tPA de tipo silvestre en el vector pcDNA5/FRT.

Se amplificó tPA humano mediante PCR usando los cebadores:

5' GGCGCTAGCATGGATGCAATGAAGAGAGGGC 3' (SEQ ID NO: 32) y

5' CCGGGCAAGCTTTTGCTTCATGTTGTCTTGAATCCAGTT 3' (SEQ ID NO: 33) (con un marcador 6xHis en la posición N-terminal de la proteína madura). Los productos de la PCR se insertaron en un vector pcDNA5/FRT (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia). La construcción final se secuenció automáticamente.

Mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis de hutPAts se llevó a cabo usando el sistema de mutagénesis dirigida al sitio GeneArt® y los siguientes cebadores:

tPA K2* (W253R) de SEQ ID NO: 28: 5' GCCAAGCCCCGGTGCCACGTGC 3' (SEQ ID NO: 34) y 5' GCACGTGGCACCGGGGCTTGGC 3' (SEQ ID NO: 35).

tPA sc* (R275S) de SEQ ID NO: 29: 5' GTACAGCCAGCCTCAGTTTAGCATCAAAGGAGGGC 3' (SEQ ID NO: 36) y 5' AAACTGAGGCTGGCTGTACTGTCTCAGGCCGC 3' (SEQ ID NO: 37).

Mutación puntual P125R de tPA de SEQ ID NO: 31: 5' GCAGCGCGTTGGCCCAGAAGCGCTACAGCGGGC 3' (SEQ ID NO: 38) y 5' CTTCTGGGCCAACGCGCTGCTGTTCCAGTTGG 3' (SEQ ID NO: 39).

Las mutaciones se confirmaron mediante análisis de secuencia.

Cultivos de células de riñón embrionario humano (HEK)-293 y transfección estable

Se cultivaron células de riñón embrionario humano 293 transfectadas de manera estable con el vector pFRT/lacZeo (HEK-Flpln, Invitrogen) en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 10 % y glutamina 2 mM. Las células se transfectaron usando Lipofectamine 2000. Los clones positivos se aislaron mediante selección con higromicina B. La calidad de la transfección se evaluó mediante qRT-PCR.

Producción en biorreactor de los mutantes relacionados con tPA

Para producir altos rendimientos de genes mutantes, las células HEK transfectadas de manera estable se cultivaron en un biorreactor a escala de laboratorio CELLine AD 1000 (Dominique Dutscher SAS, Brumath, Francia).

Purificación de mutantes de 6xhis

La purificación se procesó usando una matriz de cromatografía de afinidad de metal de níquel-ácido nitriloacético (Ni-NTA) (Qiagen, Courtaboeuf, Francia). Posteriormente, se acondicionaron los mutantes de tPA en un tampón de NH4HCO30,5 M y se almacenaron.

Inmunotransferencia de tPA

Las inmunotransferencias se llevaron a cabo usando un antisuero policlonal de oveja generado contra tPA humano (1:5000) preparado en el Instituto Nacional de Investigación Agronómica (INRA, Clermont-Theix, Francia) y un antisuero policlonal de conejo generado contra tPA murino (125 ng/pl), seguido de incubación con el anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa adecuado. Las inmunotransferencias se revelaron con un sistema de detección de inmunotransferencia ECL Plus de quimioluminiscencia potenciada (Perkin Elmer-NEN, París, Francia).

Ensayo de actividad amidolítica

Las variantes de tPA se incubaron en presencia de un sustrato fluorogénico (5 pM) (Spectrofluor® FL444). La reacción se llevó a cabo a 37 °C en Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 150 mM en un volumen total de 100 pl. La actividad amidolítica se midió como el cambio en la emisión de fluorescencia a 440 nm (excitación a 360 nm).

Tiempo de lisis de coágulos

Se obtuvo plasma humano de sangre citrada. El plasma se suplementó con cloruro de calcio 15 mM y cada uno de los mutantes de tPA a 400, 420, 440, 460, 480 y 500 U.I. La fracción de euglobulina se recuperó como se ha descrito anteriormente, suplementada con cloruro de calcio 15 mM y 15, 20, 25, 30, 35 o 40 U.I. de las muteínas de tPA. El tiempo hasta la lisis del coágulo se registró mediante mediciones de la densidad óptica (A405nm) a 37 °C por referencia a la forma comercial de tPA (Actilyse). Las pruebas se llevaron a cabo por duplicado (a partir de 3 experimentos independientes). Los resultados se expresan como el tiempo hasta obtener un 50 % de la lisis del coágulo.

Cultivo ce células neuronales

Los cultivos neuronales se prepararon a partir de ratones fetales (día embrionario 15-16). Se extrajeron y disociaron las cortezas en DMEM y se emplacaron en placas de 24 pocillos previamente recubiertas con poli-D-lisina (0,1 mg/ml) y laminina (0,02 mg/ml). Las células se cultivaron en DMEM suplementado con suero fetal bovino al 5 %, suero de caballo al 5 % y glutamina 2 mM. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2. Se añadió p-D-arabinósido de citosina (10 pM) después de 3 días in vitro (DIV) para inhibir la proliferación glial. Se llevaron a cabo diversos tratamientos después de 14DIV.

Muerte celular excitotóxica

Se indujo excitotoxicidad mediante exposición de neuronas corticales a NMDA (50 pM) en DMEM sin suero suplementado con glicina 10 pM, durante 1 hora. Las diferentes variantes de tPA se aplicaron con NMDA en los tiempos indicados. La muerte celular se cuantificó 24 horas después midiendo la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada por las células dañadas en el medio de baño usando un kit de detección de citotoxicidad (Roche Diagnostics; Mannheim, Alemania). Se determinó el nivel de LDH correspondiente a la máxima muerte neuronal en cultivos hermanos expuestos a NMDA 200 pM (LDHmáx). Los niveles basales de LDH se determinaron en cultivos hermanos sometidos a lavados de control (LD-Hmin). Los valores experimentales se midieron después de restar LDHmin y después se normalizaron a LDHmáx - LDHmin para expresar los resultados en porcentaje de muerte neuronal en relación con el control.

Lesión excitotóxica

Las lesiones excitotóxicas se efectuaron bajo anestesia inducida por isoflurano en ratones Swiss macho (25-30 g; CURB, Caen, Francia). Las inyecciones estriatales (coordenadas: 0,5 mm posterior, 2,0 mm lateral, - 3,0 mm ventral desde el bregma; Paxinos y Watson, 1995) de 12,5 nmol de NMDA frente a NMDA/Actilyse, NMDA/Opt-PA o NMDA/hutPA K2* (NMDA 12,5 mM y actividad amidolítica de tPA equivalente a 5 pM; volumen total de 1 pl) se llevaron a cabo después de colocar a los animales en un soporte estereotáctico. Las inyecciones se efectuaron usando agujas adaptadas (calibradas a 15 mm/pl; referencia de asistente 555/5; Hoecht, Sodheim-Rhoen, Alemania) y se retiraron 5 minutos después. Después 24 horas, los cerebros se analizaron por IRM.

Formación de imágenes por resonancia magnética (IRM)

Los experimentos se llevaron a cabo 24 horas después de las lesiones excitotóxicas en un dispositivo Pharmascan 7T (Bruker, Alemania). Las imágenes potenciadas en T2 se tomaron usando un dispositivo Multi-Slice Multi-Echo (MSME): TE/TR 51,3 ms/1700 ms con resolución espacial de 70 x 70 x 350 pm3. Los tamaños de las lesiones se cuantificaron en estas imágenes usando el programa informático ImageJ (v1.45r).

Resultados

Generación de nuevos agentes trombolíticos a procedentes de tPA. Los inventores han diseñado y generado seis mutantes de tPA procedentes de tPA humano: (i) un tPA de tipo silvestre humano denominado hutPA ts (SEQ ID NO: 27); (ii) un tPA humano modificado por ingeniería genética con supresión completa de su dominio K2 (eliminación de los aminoácidos 180 a 261), denominado hutPA AK2; (iii) un tPA humano que contiene una mutación puntual de ^{triptófano a arginina en la posición 253 (W253R, SEQ ID} nO: ^{28), denominado hutPA K2*; (iv) un tPA exclusivamente} monocatenario humano obtenido mediante una mutación puntual de arginina a serina en la posición 275 (R275S, SEQ ID NO: 29), denominado hutPA sc*; (v) un tPA humano que contiene la doble mutación W253R R275S, denominado Opt-PA (SEQ ID NO: 30); (vi) un tPA humano que contiene la triple mutación P125R W253R R275S (SEQ ID NO: 31), denominado Opt-PA2. Tras la eliminación/mutación adecuada inducida por la PCR como se ha descrito anteriormente, los correspondientes ADNc marcados con 6x histidina se insertaron en un vector de expresión en mamífero pcDNA5/FRT y se transfectaron de manera estable en células HEK-293 que expresaban el sistema Flp-In (Invitrogen) para la producción estable de las proteínas recombinantes correspondientes, como se describe en la sección de métodos. Una vez purificados usando una cromatografía de afinidad de níquel, se sometió a los mutantes de tPA a electroforesis de SDS-PAGE e inmunotransferencia. Como patrones se usaron reteplasa y activasa (figura 8). Curiosamente, los mutantes de tPA que portaban la mutación puntual R275S están presentes en su forma exclusivamente monocatenaria.

Caracterización bioquímica de los mutantes de tPA de origen humano. Los inventores evaluaron en primer lugar la actividad proteolítica intrínseca de cada uno de estos mutantes. Por tanto, se llevó a cabo un ensayo de actividad amidolítica frente a un sustrato fluorogénico (Spectrofluor) (figura 9-IZQUIERDA). Los presentes datos revelan que sc*-tPA, Opt-PA y Opt-PA 2 muestran una actividad amidolítica reducida en 10, 2,5 y 2, respectivamente. Se caracterizó la capacidad de los mutantes para iniciar la fibrinolisis en modelos de ensayos de coágulos in vitro llevados a cabo en un coágulo de plasma humano pobre en plaquetas (PPP-coágulo) como sustrato. Estos ensayos revelan que tanto Opt-PA como Opt-PA muestran una potencialidad similar para desencadenar la fibrinolisis (figura 9 -CENTRO), incluso en presencia de los inhibidores de TPA (las diferencias son no mayores de un orden de magnitud, figura 9 - DERECHA).

La mutación puntual R275S no es suficiente para suprimir la neurotoxicidad mediada por receptores de NMDA relacionada con tPA. Para estimar el efecto de los mutantes de tPA hutPA sc* y Opt-PA 2 en la neurotoxicidad mediada por el receptor de NMDA, se sometió a cultivos puros de neuronas corticales (14 días in vitro) a una exposición durante 1 hora a NMDA 50 pM solo o en combinación con los mutantes purificados (0,3 pM) antes de medir la muerte neuronal 24 horas después. Aunque Actilyse provoca una potenciación del 61 % de la excitotoxicidad mediada por NMDAR (59 % de la muerte celular en comparación con un 37 % solo con NMDA), se observa un efecto similar para hutPA sc* (62 % de muerte celular neurona, figura 10; n=4, p<0,05). Por tanto, la mutación puntual R275S no es suficiente por sí misma para suprimir la neurotoxicidad mediada por receptores de NMDA relacionada con tPA. Los inventores también evaluaron el triple mutante Opt-PA en la configuración experimental anterior. Observaron una tendencia notable (pero no significativa) para suprimir la neurotoxicidad mediada por el receptor de NMDA relacionada con tPA (51 % de muerte de células neuronales, n=4, p=0,08).

Los mutantes de tPA humano relacionados con kringle 2 muestran un perfil no neurotóxico. Se usaron hutPA K2* y Opt-PA en lugar de hutPA sc* y Opt-PA2 en el ensayo de muerte neuronal excitotóxica (figura 11). En este caso, aunque Actilyse provoca una potenciación del 41 % de la excitotoxicidad mediada por NMDAR (75 % de la muerte celular en comparación con un 53 % solo con NMDA), hutPA K2* y Opt-PA no promovieron neurotoxicidad mediada por NMDAR (64 % y 62 % de muerte de células neuronales, respectivamente, figura 11; n=4, p<0,05). Por lo tanto, el tri ptófano 253, un aminoácido constitutivo del LBS kringle 2 de tPA es crucial para mediar la proneurotoxicidad de tPA. Los dos mutantes de tPA, hutPA K2* y Opt-PA tienen un perfil no neurotóxico interesante.

Opt-PA no aumenta la neurotoxicidad en un modelo in vivo de lesión estriatal. Los inventores han evaluado la neurotoxicidad tanto de hutPA K2* como de Opt-PA en un modelo de lesión estriatal in vivo. Como se describe en la sección de métodos, se inyectan 12,5 mM de NMDA y 5 pM de las variantes de tPA en el estriado de ratones Swiss.

24 horas después de la inyección, se mide el volumen de la lesión usando formación de imágenes por IRM no invasiva (figura 12). Aunque Actilyse provoca una potenciación del 48 % de la excitotoxicidad mediada por NMDA (5,36 mm3 de volumen de lesión % en comparación con 3,62 mm3 solo con NMDA), hutPA K2* tiene un efecto neurotóxico heterogéneo (5,15 mm3 de volumen de lesión) y Opt-PA no promueve la neurotoxicidad mediada por NMDA (4,00 mm3 de volumen de lesión, figura 12; n=11, p<0,05)

En conjunto, los inventores han generado y caracterizado un conjunto original de agentes fibrinolíticos procedentes de tPA humano. De entre este conjunto de mutantes, se caracterizó Opt-PA (SEQ ID NO: 30) por una actividad fibrinolítica similar a la de Actilyse y ausencia de proneurotoxicidad in vitro e in vivo. Estos datos proporcionan la base para estudios adicionales para evaluar la eficacia de este nuevo agente fibrinolítico en modelos experimentales de trombosis, antes de su posible transferencia a aplicaciones clínicas.

Referencias

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Angles-Cano, E., Balaton, A., Le Bonniec, B., Genot, E., Elion, J. et al. (1985). Production of monoclonal antibodies to the high fibrin-affinity, tissue-type plasminogen activator of human plasma. Demonstration of its endothelial origin by immunolocalization. Blood 66, págs. 913-920.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en:

i) proteínas que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 25, que consisten preferentemente en la SEQ ID n O: 2 o en la asociación de la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26, en donde dicha secuencia comprende:

una mutación A que consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e histidina o

una doble mutación A y B que consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por un aminoácido hidrófilo seleccionado entre arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, histidina e histidina y el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina,

ii) proteínas que comprenden una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con la SEQ ID NO: 2, comprendiendo dichas proteínas la mutación A o la doble mutación A y B o

proteínas que comprenden una secuencia que tiene al menos un 90 % de homología con la SEQ ID NO: 25, comprendiendo dichas proteínas la mutación A o la doble mutación A y B;

en donde dichas proteínas tienen actividad fibrinolítica,

y

iii) proteínas que consisten en un fragmento de la SEQ ID NO: 2, consistiendo dicho fragmento en el dominio Kringle 2 y el dominio catalítico, comprendiendo dichas proteínas la mutación A o la doble mutación A y B.

2. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde esta consiste en la SEQ ID NO: 2 o en la asociación de la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 26.

3. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que dicha mutación A consiste en el reemplazo de triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por arginina o dicha doble mutación A y B consiste en el reemplazo del triptófano en la posición 253 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por arginina y el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina.

4. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que las proteínas ii) tienen al menos un 95 % y preferentemente al menos un 99 % de homología respecto de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25, comprendiendo dichas proteínas la mutación A o la doble mutación A y B.

5. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que las proteínas ii) comprenden al menos una de las siguientes modificaciones:

- el reemplazo de prolina en la posición 125 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por arginina,

- la eliminación del dominio de dedo en el extremo N-terminal y/o la eliminación del dominio similar a EGF, en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 y/o el reemplazo de asparagina en la posición 117 de la SEQ ID NO: 2 o al SEQ ID NO: 25 por glutamina,

- el reemplazo de treonina en la posición 103 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por asparagina y/o el reemplazo de asparagina en la posición 117 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por glutamina y/o el reemplazo de lisina-histidina-arginina-arginina en las posiciones 296 a 299 de la SEQ ID NO:2 por alanina-alanina-alaninaalanina,

- el reemplazo de cisteína en la posición 84 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por serina,

- el reemplazo de arginina en la posición 275 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25 por ácido glutámico o glicina, comprendiendo dicha proteína únicamente la mutación A y/o la eliminación del dominio Kringle 1 en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 25.

6. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que las proteínas ii) provienen de rata, ratón, cerdo o bovino.

7. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que se selecciona entre el grupo que consiste en proteínas que comprenden al menos una de las secuencias de la SEQ ID NO: 3 a la SEQ ID NO: 14.

8. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que se selecciona entre el grupo que consiste en las secuencias de la SEQ ID NO: 3 a la SEQ ID NO: 14.

9. Un polinucleótido que codifica una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10 o un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9.

12. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso como medicamento.

13. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso para el tratamiento de enfermedades trombóticas.

14. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso para tratar una enfermedad seleccionada entre isquemia, oclusiones arteriales o venosas, hemorragias intracerebrales y hemorragias oculares, preferentemente, entre oclusión de la arteria retiniana central, ictus, hemorragias intraparenquimatosas, hemorragias intraventriculares, hemorragias subaracnoideas, degeneración macular asociada a la edad y hemorragias vítreas.

15. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso para el tratamiento de una enfermedad de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha enfermedad es ictus u oclusión de la arteria retiniana central.