ES2824104T3

ES2824104T3 - Lisados de plaquetas liofilizadas

Info

Publication number: ES2824104T3
Application number: ES13740649T
Authority: ES
Inventors: Amit Patel
Original assignee: JADI CELL LLC
Current assignee: JADI CELL LLC
Priority date: 2012-01-26
Filing date: 2013-01-28
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2033-01-28
Also published as: HRP20201564T1; US20130195959A1; US20170348354A1; US10993965B2; EP2806885A4; SI2806885T1; EP2806885B1; PT2806885T; PL2806885T3; US10980837B2; DK2806885T3; WO2013113024A1; EP2806885A1; US9682104B2; US20170348355A1

Abstract

Un procedimiento de preparación de lisados plaquetarios liofilizados, que comprende: concentrar las plaquetas de una fuente de plaquetas para formar una porción rica en plaquetas de la fuente de plaquetas; lisar las plaquetas de la porción rica en plaquetas mediante un ciclo de congelación-descongelación, en el que el ciclo de congelación-descongelación es repetido al menos una vez para formar al menos un 30% de lisados por el recuento de plaquetas de la porción rica en plaquetas; y liofilizar los lisados para formar lisados plaquetarios liofilizados en una composición que también incluye concentraciones liberadas de factores de crecimiento, citoquinas y quimioquinas disponibles.

Description

DESCRIPCIÓN

Lisados de plaquetas liofilizadas

Antecedentes

Han sido descritas diversas técnicas para la conservación y uso de plaquetas. DMSO y trehalosa son dos ejemplos de composiciones que han sido usadas para la conservación de las plaquetas, con o sin liofilización (o secado por congelación). También han sido usadas composiciones crioprotectoras junto con procesos de liofilización para obtener un resultado similar. Las desventajas de los enfoques que sólo utilizan conservantes y/o liofilización en plaquetas intactas se refieren al hecho de que estas plaquetas retienen sus proteínas, receptores, y similares en la superficie o dentro de las plaquetas. Por ejemplo, diversos receptores de la membrana plaquetaria permanecen intactos para unirse a los factores extracelulares en respuesta a la activación de las plaquetas, por ejemplo, para la adhesión, agregación, etc., de las plaquetas. De este modo, sería beneficioso preparar una preparación más universal de plaquetas que pueda ser usada eficazmente para numerosas aplicaciones, tal como la cicatrización de heridas, tratamiento de la piel, trastornos de los tejidos corporales (incluidos los órganos del cuerpo), tal como tejido pulmonar, o similares.

El documento US 2011/280952 desvela el uso de lisado de plaquetas para el tratamiento y/o prevención de la mucositis.

En un primer aspecto de la presente invención es proporcionado un procedimiento de preparación de lisados de plaquetas liofilizadas, que comprende:

concentrar las plaquetas de una fuente de plaquetas para formar una porción rica en plaquetas de la fuente de plaquetas;

lisar las plaquetas de la porción rica en plaquetas mediante un ciclo de congelación-descongelación, en el que el ciclo de congelación-descongelación es repetido al menos una vez para formar al menos un 30% de lisados por el recuento de plaquetas de la porción rica en plaquetas; y

liofilizar los lisados para formar lisados plaquetarios liofilizados en una composición que también incluye concentraciones liberadas de factores de crecimiento, citoquinas y quimioquinas disponibles.

También es proporcionada una composición de polvo de lisado plaquetario liofilizado, que comprende:

Una composición de polvo de lisado plaquetario liofilizado, que comprende:

al menos el 30% de plaquetas lisadas por recuento de plaquetas, en la que al menos el 30% de plaquetas lisadas son obtenidas por un ciclo de congelación-descongelación que es repetido al menos una vez; y factor de crecimiento, citoquinas y quimioquinas siendo congelados después de la liberación de las plaquetas lisadas,

en la que la composición de polvo lisado liofilizado de plaquetas es estable durante al menos un año cuando es almacenada a temperatura ambiente o al menos cinco años cuando es almacenada a -80 °C.

También es proporcionada la composición de polvo de lisado liofilizado de plaquetas de la presente invención para uso en un procedimiento de tratamiento de tejidos de mamíferos, comprendiendo el procedimiento la aplicación de la composición al área de tejido de mamíferos para su tratamiento.

En otro aspecto de la presente invención es proporcionado un procedimiento de cultivo de células o tejidos, que comprende la adición de una composición de medios que incluye la composición de polvo de lisado liofilizado de plaquetas de acuerdo con la presente invención con un cultivo de células o tejidos.

Breve descripción del d ibujo

La FIG. 1 establece una comparación de cultivos de células madre mesenquimales usando varios tipos de medios, uno de los cuales incluye lisados plaquetarios liofilizados preparados de acuerdo con los ejemplos de la presente divulgación.

Descripción detallada

Cabe señalar que, como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares de "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario.

El término "herida" se refiere a cualquier daño a cualquier tejido de un individuo, incluyendo el daño a la piel así como el daño a los tejidos más profundos, ya sea porque la herida sea causada accidental o intencionalmente, o alternativamente por el curso normal de una afección patológica, de enfermedad, o degenerativa. Por ejemplo, el daño puede ser resultado de una lesión o de una cirugía. Los ejemplos no limitativos de lesiones incluyen úlceras, quemaduras, huesos rotos, pinchazos, cortes y raspaduras, laceraciones, incisiones quirúrgicas, inflamación, infección, y similares.

Como se usa en la presente memoria, el término "fluido que contiene plaquetas" se refiere a cualquier fluido, ya sea biológico o artificial, que contiene plaquetas. Los ejemplos no limitativos de tales fluidos incluyen diversas formas de sangre entera, plasma sanguíneo, plasma rico en plaquetas, plaquetas concentradas en cualquier medio, o similares, derivados de fuentes humanas y no humanas.

Como se usa en la presente memoria, el término "concentrado" o "concentración" se refiere a la separación de las plaquetas del grueso del plasma, la sangre entera u otro fluido del que está presente. Por ejemplo, puede ser usada la centrifugación, la espectrometría, la filtración, la decantación, la sedimentación por gravedad u otros procedimientos para concentrar las plaquetas de los fluidos que contienen plaquetas. Cuando las plaquetas están concentradas, puede ser conveniente usar un anticoagulante (en particular para la centrifugación o la sedimentación por gravedad) junto con la fuente de plaquetas para evitar la coagulación durante la separación de las plaquetas de otros componentes de la sangre, el plasma u otro líquido.

El término "anticoagulante" se refiere a las composiciones que inhiben la coagulación al concentrar o recolectar plaquetas para su uso de acuerdo con los ejemplos de la presente divulgación. Los anticoagulantes suelen estar disponibles como inhibidores de la síntesis de factores de coagulación, inhibidores de la trombina o fármacos antiplaquetarios. Los inhibidores de la síntesis de factores de coagulación que inhiben la producción de ciertos factores de coagulación en el hígado, incluyen composiciones tal como la warfarina (Coumadin). Los inhibidores de la trombina interfieren con la coagulación de la sangre al bloquear la actividad de la trombina, e incluyen composiciones tal como heparina y lepirudina (Refludan). Los fármacos antiplaquetarios interactúan con las plaquetas propiamente dichas, e incluyen fármacos tal como aspirina, ticlopidina (Ticlid), clopidogrel (Plavix), tirofiban (Aggrastat), eptifibatida (Integrilin), etc.

Los términos "liofilización", "liofilizado" o similares se refieren a un proceso de liofilización o deshidratación usado a menudo para conservar las plaquetas, pero que es usado de manera algo diferente de acuerdo con la realización de la presente divulgación. Específicamente, la liofilización es usada principalmente no sólo como un proceso de conservación, sino más bien para lisar en forma adicional las plaquetas después de la congelación-descongelación inicial u otra técnica de lisis. En otras palabras, de acuerdo con los ejemplos de la presente divulgación, después de que los lisados son formados como es descrito en la presente memoria, la liofilización proporciona el beneficio añadido de conservar los factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas y otros contenidos inicialmente encerrados o unidos a la superficie de las plaquetas, pero que son liberados cuando las plaquetas son lisadas como es descrito en la presente memoria, por ejemplo, lisado por congelación-descongelación. El proceso funciona típicamente congelando el material y reduciendo la presión circundante para permitir que el agua congelada en el material sea sublimada directamente de la fase sólida a la fase gaseosa.

El término "tejido" incluye toda la gama de pequeños sitios desde tejidos a órganos completos.

De acuerdo con la presente divulgación, un "lisado" es la composición preparada en la que las plaquetas son destruidas por la alteración de su membrana celular. Esto puede hacerse químicamente, mecánicamente, por homogeneización de líquidos, o por sonicación, pero de acuerdo con las realizaciones de acuerdo con la invención, la citólisis es llevada a cabo por un procedimiento que comprende un ciclo de congelación-descongelación, en el que el ciclo de congelación-descongelación es repetido al menos una vez para formar al menos un 30% de lisados por recuento de plaquetas de la porción rica en plaquetas, y en menor grado, como parte del proceso de liofilización. Los lisados congelados-descongelados pueden ser formados por la congelación de una suspensión de plaquetas y luego la descongelación del material a una temperatura superior a la ambiente, por ejemplo, de 30 °C a 45 °C, aunque también son incluidos otros regímenes de congelación-descongelación en el ámbito de la presente divulgación, siempre que den lugar a una citólisis de las plaquetas. Con la técnica de congelación-descongelación, este procedimiento hace que las células se hinchen y se rompan a medida que son formados los cristales de hielo, seguido de una contracción al descongelarse. De este modo, la hinchazón y la contracción cíclica hacen finalmente que las plaquetas se abran. Son usados múltiples ciclos para una lisis más completa. Pueden producirse diversos grados de citólisis plaquetaria, por ejemplo, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, o hasta 100% de citólisis, por recuento de plaquetas.

El término "liofilizado de plaquetas" o "LPL" es preparado como es descrito en la presente memoria. Sin embargo, cabe destacar que el término lisados de plaquetas liofilizadas también incluye "lisados de plasma rico en plaquetas liofilizadas" o "LPRRL" como un tipo específico de lisados de plaquetas liofilizadas. Por lo tanto, cualquier discusión sobre lisados de plaquetas liofilizadas (LPL) también incluye los lisados de plasma rico en plaquetas liofilizadas (LPRRL), entendiendo que una diferencia es que el plasma rico en plaquetas es usado o formado como parte del procedimiento o composición. Sin embargo, en cualquiera de las dos composiciones, ambas incluyen lisados plaquetarios liofilizados.

Como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente" es empleado para dar flexibilidad a un punto final de rango numérico, disponiendo que un valor dado puede estar "un poco por encima" o "un poco por debajo" del punto final. El grado de flexibilidad de este término puede ser dictado por la variable particular y su determinación está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica en base a la experiencia y la descripción asociada en la presente memoria.

Con estas definiciones en mente, ha sido reconocido que la preparación de lisados plaquetarios liofilizados (LPL) y lisados de plasma rico en plaquetas liofilizadas (LPRPL) puede ser altamente funcional tanto para la investigación como para las aplicaciones terapéuticas, ya sea antes o después de la reconstitución en un portador líquido. Cuando son preparados adecuadamente, estos lisados plaquetarios liofilizados pueden ser estables durante largos períodos de tiempo cuando son congelados, por ejemplo, a -80°C, o incluso a temperatura ambiente en ciertas realizaciones. Aunque estas composiciones pueden ser útiles tanto en un entorno de investigación como terapéutico sin la adición de otros ingredientes, cabe destacar que tanto el LPL como el LPRPL pueden incluir uno o más agentes activos o biológicos, tal como antifúngicos, antivirales, antibióticos, factores de crecimiento o productos químicos, dependiendo de la investigación o la aplicación terapéutica. Además, en ciertos ejemplos, el LPL o LPRPL puede ser preparado como parte de un producto encapsulado, por ejemplo, dentro de los liposomas. Los liposomas, por ejemplo, pueden ser preparados de manera tal que incluyan vesículas multilamelares o unilamelares. En estos ejemplos, l Pl o LPRPL pueden ser rehidratados a diferentes concentraciones que oscilan de 0,01% a 100%, en volumen, y mezclados con una solución de liposomas dentro de su membrana hidrófoba.

De acuerdo con esto, un procedimiento de preparación de una composición adecuada para uso terapéutico o como medio de cultivo comprende etapas de concentración de plaquetas de una fuente de plaquetas para formar una porción rica en plaquetas de la fuente de plaquetas; lisar las plaquetas de la porción rica en plaquetas mediante un ciclo de congelación-descongelación, en el que el ciclo de congelación-descongelación es repetido al menos una vez para formar al menos un 30% de lisados por recuento de plaquetas de la porción rica en plaquetas; y liofilizar los lisados para formar lisados plaquetarios liofilizados en una composición que también incluye concentraciones liberadas de factores de crecimiento, citoquinas y quimioquinas disponibles.

En otro ejemplo, una composición apta para uso terapéutico o como medio de cultivo comprende una composición de polvo de lisado plaquetario liofilizado, que comprende: al menos 30% de plaquetas lisadas por recuento de plaquetas, en el que al menos 30% de las plaquetas lisadas son obtenidas mediante un ciclo de congelación-descongelación que es repetido al menos una vez; y el factor de crecimiento, las citoquinas y las quimioquinas liofilizadas después de la liberación de las plaquetas lisadas, en el que la composición de polvo de lisado plaquetario liofilizado es viable y estable durante al menos un año cuando es almacenada a temperatura ambiente o al menos cinco años cuando es almacenada a -80 °C. Otras concentraciones de lisados plaquetarios liofilizados preparados a partir de las plaquetas fuente pueden ser de al menos 50%, 70%, 90% o incluso hasta 100% de lisados plaquetarios liofilizados.

En otra realización, un procedimiento de tratamiento de tejidos de mamíferos puede comprender la aplicación de una composición de acuerdo con la reivindicación 8 a un sitio de tejidos de mamíferos para su tratamiento. Otras concentraciones de lisados plaquetarios liofilizados preparados a partir de las plaquetas fuente pueden ser de al menos el 50%, al menos el 70%, al menos el 90%, o incluso hasta el 100% de lisados plaquetarios liofilizados.

Un procedimiento de cultivo de células o tejidos puede comprender la mezcla de una composición de acuerdo con la reivindicación 8 con un cultivo de células o tejidos. Otras concentraciones de lisados plaquetarios liofilizados preparados a partir de las plaquetas de origen pueden ser de al menos el 50%, al menos el 70%, al menos el 90%, o incluso hasta el 100% de lisados plaquetarios liofilizados.

En más detalle, la presente divulgación proporciona un procedimiento de preparación de los lisados plaquetarios liofilizados (LPL), y en un ejemplo, los LPL pueden estar en forma de lisados de plasma rico en plaquetas liofilizadas (LPRPL). Las plaquetas pueden ser concentradas usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como centrifugación o dispositivos de purificación de plaquetas comercialmente disponibles. Después de la purificación o concentración de plaquetas o plasma rico en plaquetas, el material plaquetario concentrado resultante es congelado, tal como, por ejemplo, con nitrógeno líquido a -190 °C o al menos a -80 °C usando hielo seco, etanol u otro tipo de composición que ayude a la congelación, durante un período de horas, por ejemplo, 24 horas. Después de la congelación, el material plaquetario concentrado es descongelado rápidamente por encima de la temperatura ambiente, por ejemplo, de 30 °C a 45 °C, o en un ejemplo, a aproximadamente 37 °C. Este ciclo de congelacióndescongelación es repetido para aumentar la concentración de lisados plaquetarios. Generalmente, cuantos más ciclos sean realizados, más plaquetas serán lisadas.

Una vez formados los lisados de plaquetas mediante el procedimiento de ciclo de congelación-descongelación o algún otro proceso de lisado, los LPL (o LPRPL) son entonces * liofilizados usando un liofilizador comercialmente disponible, y luego almacenados durante largos períodos de tiempo a temperatura ambiente o incluso años a temperaturas inferiores a la de congelación, por ejemplo, de 0 °C a -100 °C, o más específicamente en una sola realización, a aproximadamente -80 °C, el producto puede ser almacenado durante aproximadamente 5 años o más.

En otro aspecto de la presente divulgación, LPL de acuerdo con la reivindicación 8 puede ser usado para aplicaciones de investigación tal como cultivos o tejidos celulares. Específicamente, el polvo o los gránulos de LPL pueden ser reconstituidos en un medio líquido (tal como DMEM, solución salina, plasma, DMSO, MEM alfa, RPMI, B-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio o glutamina, etc.) en concentraciones adecuadas para una aplicación determinada. Este tipo de medio, enriquecido con LPL puede ser usado para el cultivo de células de mamíferos, en particular de células humanas cuando son usadas plaquetas humanas, para aplicaciones de investigación o terapéuticas. Cabe señalar que el uso de LPL es útil para cultivar o derivar diversos tipos de células o tejidos, incluidas, entre otras, las células madre mesenquimales de diversos tejidos, las células madre embrionarias humanas, los queratinocitos, los cardiomiocitos y muchos otros tipos de células del cuerpo humano, dado que estos lisados plaquetarios liofilizados preparados de acuerdo con los ejemplos de la presente divulgación contienen factores de crecimiento y citoquinas que permiten el crecimiento de células y tejidos, así como el mantenimiento de los órganos y sus funciones, etc. El crecimiento de las células en el medio suplementado con LPL, por ejemplo, puede ser una mejora en muchos sistemas celulares en comparación con los suplementos del medio comercialmente disponibles, como el suero bovino fetal (FBS). Además, el aditivo de cultivo celular de LPL puede ser mantenido a temperatura ambiente por períodos más largos, lo que es una ventaja sobre el FBS, que caduca después de menos de una semana a temperatura ambiente.

En otro aspecto de la presente divulgación, el LPL puede ser usado para numerosas aplicaciones terapéuticas, tal como un suplemento en un medio que será usado para cultivar células para aplicaciones terapéuticas. Así, el LPL puede ser producido como es descrito en la presente memoria, pero bajo un sistema de cGMP, lo que resulta en LPL producido bajo procedimientos mínimamente manipulados y/o cGMP. Además, no es necesario el uso de productos animales para producir LPL de la presente divulgación, lo que hace que el material sea muy útil para su aplicación en seres humanos.

En otro aspecto de la presente divulgación, el LPL puede ser usado para tratar heridas, úlceras o quemaduras. Dado que el LPL de la presente divulgación puede ser producido bajo cGMP, la aplicación tópica al tejido humano dañado puede ser beneficiosa. Como ha sido mencionado, LPS puede ser aplicada en forma seca o rehidratada antes de la aplicación, o como un gel. Alternativamente, aunque la piel no esté dañada por una herida, úlcera o quemadura, puede ser usada para otros tipos de daños producidos como resultado del envejecimiento, fotodaño, enfermedad patológica o degenerativa, o similares. Por lo tanto, el LPL de la presente divulgación puede ser usado en diversas concentraciones y combinado con una crema base u otro portador para uso cosmético.

En otro aspecto, el LPL puede ser rehidratado y nebulizado en diversas concentraciones y usado para tratar desórdenes pulmonares. Polvos finos o gotitas finas rehidratadas pueden ser inhalados en los pulmones para el tratamiento de desórdenes pulmonares, por ejemplo. El LPL también puede ser reconstituido en gotas para los ojos, así como para el tratamiento de los ojos o el tejido circundante.

En otro aspecto de la presente divulgación, el LPL puede ser rehidratado en cualquier concentración terapéutica efectiva, o puede ser mantenido en forma de polvo, y puede ser usado para aplicaciones ortopédicas, por ejemplo, curación de huesos, fusión de huesos, etc.

En otro aspecto, el LPL puede ser combinado con una venda que puede ser aplicada directamente a la herida, o rehidratada y luego aplicada a la herida. De este modo, en parte debido a la vida útil relativamente larga a temperatura ambiente del LPL de la presente divulgación, una venda tal tiene mejores propiedades de curación de la herida y durará más tiempo que muchas otras composiciones, dándole una mejor oportunidad de permanecer activa y efectiva antes de su uso. También pueden ser usados otros procedimientos de aplicación, tal como rehidratación y aplicación con una jeringa, un atomizador u otro dispensador de solución en una de las concentraciones terapéuticamente eficaces cuando es aplicada al área de tratamiento. De este modo, la administración de las composiciones terapéuticas de la presente divulgación puede hacerse de cualquier manera aceptable conocida en la técnica médica y farmacéutica.

Los ejemplos específicos y no limitativos de procedimientos de administración incluyen el uso de fluidos, aerosoles, pulverizadores, nieblas, lociones, cremas, ungüentos, geles, gomas, pastillas, gotitas o polvos nebulizados, supositorios, gotas, lavados, frascos dispensadores, tubos flexibles, telas preempapadas, dispositivos automáticos de mezcla y/o dispensación, jeringas, vendas, parches o emplastos dérmicos, etc. En un ejemplo específico, el LPL puede estar contenido en un equipo que puede ser usado en el combate o en otras situaciones de emergencia para el tratamiento de heridas. El kit puede almacenar LPL en una forma más estable, y luego puede ser reconstituido para su uso inmediato cuando sea necesario.

En lo que respecta específicamente al ciclo de lisado que se produce, y en el que se produce una mayor lisado durante la etapa de liofilización, como es describe en la presente memoria, pueden estar presentes en el material resultante mayores cantidades de factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas, etc. Los ejemplos de estos factores de crecimiento y otros materiales que pueden estar presentes en el material resultante incluyen, sin limitación, PDGF, PDAF, VEGF, PDEGF, PF-4, TGF-B, FGF-A, FGF-B, TGF-A, IGF-1, IGF-2, BTG, TSP, vWF, PAI-1, IgG, IgM, IgA, KGF, EGF, FGF, TNF, IL-1, KGF-2, fibropéptido A, fibrinógeno, albúmina, osteonectina, gro-alfa, vitronectina, fibrina D-dímero, factor V, antitrombina III, macroglobulina a2, angiogenina, Fg-D, y elastasa. En mayor detalle, los factores de crecimiento, citoquinas o similares que pueden estar presentes incluyen, sin limitación, LIF, factores de crecimiento anticancerígenos tal como IGFBP3, eicosanoides tal como PG o leucotrienos, IL-1 TNF alfa, INF, TNF-a, IL-6, IL-1 (a/b), metabolitos prostanoides, componentes de complemento, intermediarios de oxígeno reactivo, metabolitos de ácido araquidónico, factores de coagulación, nitratos y quimioquinas. Los factores de crecimiento derivados del ser humano, quimiocinas, citoquinas y hormonas pueden incluir alfa defensina, alfa sinucleína, beta sinucleana, 4-1BBL, 6Cquina, ácido FGF, activina A, activina R1b, angiopoietina 2, B-DNF, BAFF, BCA-1, BCA-1, BD-1, BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPRA1, BDNF, CNTF, CTGF, CTLA-4Fc, CXCL1, CXCL2, cardiotrofina-1, Cripto, Cistatina C, Dkk-1, EGF AOF, EGF, EMAP II, ENA-78, EPO, Eotaxina, FGF básico AOF, FGF-10, FGF-16, FGF 17, FGF 18, FGF19, FGF4, FGF6, FGF7, FGF8, FGF8b, FGF9, Flt3, G-CSF, GDNF, GMCSF, HGF, HGH, IFN alfa A, IFN alfa A/D, IFN alfa D, IFN alfa a2b, IFN, beta 1A, IFN-gamma, IGF1, IGFII, IGFBP-4, IGFBP6, IL1 alfa, IL-1Beta, IL10, IL11, IL12, IL13, IL15, IL17, IL17A, IL17F, IL18, IL19, IL2, IL20, IL21, IL23, IL28A, IL28B, IL29, IL3, IL31, IL33, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, ITAC, KGF2, Calicreína 11, Calicreína 4, Calicreína 7, LEFTY-A, LIF, Leptina, MCSF AOF, MCSF, MCP-1, MCP2, MCP3, MCP4, MDC, MIG, MIP1 alfa, MIP1 beta, MIP3 alfa, MIP3 beta, MIP4, MIP5, midkina, NAP2, NT3, NT4, Neurotactina, neurturina, Oncostatina, osteoprotegerina, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PTN, ligando Rank, receptor Rank, RANTES< SCF, SCFAOF, SDF-1 alfa, SDF-1Beta, CD4, CD40L, TNF-RI, TNFRII, TARC, TECK, TGF alfa, TGF1 Beta1, TGF Beta2, TGF Beta3, TNF beta/linfotoxina, TNF-alfa, TPO, TRAIL, TWEAK y VEGF. De este modo, las composiciones preparadas de acuerdo con los ejemplos de la presente divulgación pueden ser preparadas para eliminar o destruir la información celular comúnmente hallada en la membrana celular, y retener muchos de estos factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas, etc., para su uso beneficioso para producto de curación, aditivo de medio de cultivo celular, composición de tratamiento cosmético, etc.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones de la presente divulgación que actualmente son más conocidas. Sin embargo, debe entenderse que los siguientes son sólo ejemplos o ilustraciones de la aplicación de los principios de la presente divulgación. Pueden ser ideados por los expertos en la técnica numerosas modificaciones y composiciones, procedimientos y sistemas alternativos sin apartarse del espíritu y el alcance de la presente divulgación. Las reivindicaciones adjuntas tienen por objeto cubrir tales modificaciones y disposiciones. De este modo, mientras que la presente reivindicación ha sido descrita anteriormente con particularidad, los siguientes ejemplos proporcionan más detalles con relación a lo que actualmente es considerado como las realizaciones más prácticas.

Ejemplo 1 - Preparación de lisados de plaquetas liofilizadas (LPL)

Es recogida sangre periférica con una cantidad adecuada de anticoagulante para evitar la coagulación de la sangre durante el procesamiento. En este ejemplo, son recogidos 35 ml de sangre, que luego son centrifugados a 200 x g (1000 rpm) durante 10 minutos a 4 °C con el modo de freno desactivado. Después de la centrifugación, es retirada la porción rica en plaquetas y son colocados tubos de la porción rica en plaquetas en un rango de congelación de -190 °C a -80 °C durante un período de 24 horas. Después de 24 horas, las plaquetas son lisadas por descongelación rápida a 37 °C. Después de la descongelación, los tubos son colocados nuevamente en otro ciclo de congelación dentro del mismo rango de congelación durante un período de 24 horas. El ciclo de congelación-descongelación (un ciclo de congelación seguido de un ciclo de descongelación) es repetido al menos una vez, y más típicamente, es repetido al menos dos veces para un total de 3 ciclos, por ejemplo, de 3 a 6 ciclos de congelación-descongelación. Cabe destacar que la sonicación, filtración o similares, pueden ser usadas también para lisar o recoger plaquetas, ya sea alternativamente o adicionalmente con respecto al ciclo de congelación-descongelación descrito en la presente memoria. Después del último ciclo de descongelación, los tubos son nuevamente congelados a -80 °C y almacenados durante la noche. Al día siguiente, los tubos son liofilizados usando FreeZone 2.5 Plus (Labconco) bajo 0,8 Pa a -84 °C durante 48 horas. La liofilización puede también lisar plaquetas adicionales. Dependiendo del volumen total a ser liofilizado, el tiempo puede incrementarse más allá de las 48 horas. Asimismo, en algunas realizaciones, el tiempo puede disminuirse hasta cierto grado. El LPL, cuando es preparado de esta manera, puede ser almacenado a temperatura ambiente durante al menos un año, o si está a -80 °C, por ejemplo, puede ser posible un período de 5 años. Cabe destacar que las etapas de la lisado y liofilización pueden dar lugar a diversos grados de lisado de las plaquetas, por ejemplo, el 30%, 50%, 70%, 90%, o incluso hasta el 100% de las plaquetas pueden ser lisadas, dependiendo de la variación del número de ciclos de congelación-descongelación, los parámetros de los ciclos de congelación-descongelación, los parámetros de la liofilización, etc. La liofilización por sí sola no proporcionará el grado de lisado que puede ocurrir cuando son llevadas a cabo ambos etapas de lisado y liofilización de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación.

Ejemplo 2 - Preparación de lisados de plasma rico en plaquetas liofilizadas (LPRPL)

Es seguido el procedimiento del Ejemplo 1, excepto por LPRPL, después de que la sangre es recogida como ha sido descrito anteriormente, es procesada usando un dispositivo de preparación de PRP comercialmente disponible tal como el dispositivo Magellan PRP de Arteriocyte Medical Systems. Las etapas de lisado y liofilización del Ejemplo 1 pueden ser, por lo demás, iguales para el presente ejemplo.

Ejemplo 3 - Uso de LPL o LPRPL para el cultivo de células de mamíferos humanos

Tras la preparación del LPL del Ejemplo 1 o el LPRPL del Ejemplo 2, el material puede ser usado para complementar los medios de cultivo de tejidos para el cultivo de células humanas. Por ejemplo, una concentración de LPL o LPRPL puede oscilar entre el 0,5% y el 20% por volumen de LPL o LPRPL liofilizado total usado para el cultivo de células. En un ejemplo específico, pueden ser usados 10 ml de LPL o LPRPL para preparar 100 ml de medio.

En una realización específica, son aisladas células madre mesenquimales humanas cultivadas de la médula ósea y el tejido adiposo, y puede ser preparada una composición de medios de la siguiente manera:

10 ml de LPL o LPRPL liofilizado (aproximadamente 1 gramo)

1mL de NEAA (100X)

1 ml de Glutamax (100X)

1 ml de Penn/Strep (100X)

97 ml de DMEM LG - sin Fenol

En este ejemplo, las células son cultivadas hasta aproximadamente 80% de confluencia y son pasadas para generar el número de células deseado.

Ejemplo 4 - Uso de LPL o LPRPL para el tratamiento de heridas (procedimiento rehidratado )

Tras la preparación del LPL del Ejemplo 1 o el LPRPL del Ejemplo 2, el LPL o el LPRPL pueden ser rehidratados en una jeringa o en una botella de spray a una concentración terapéutica predeterminada deseada, tal como, por ejemplo 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, etc., por volumen). La concentración puede estar relacionada con un efecto deseado, estabilidad, necesidad de un tipo específico de herida a ser tratado, etc. En cualquier caso, el LPL o LPRPL rehidratado es aplicado directamente sobre el sitio a ser tratado, que es recubierto. La aplicación puede ser parte de un tratamiento único, o más típicamente, puede repetirse diariamente, o cada tres o cinco días según se desee.

Ejemplo 5 - Uso de LPL o LPRPL para el tratamiento de heridas (procedimiento no rehidratado o en polvo )

Tras la preparación del LPL del Ejemplo 1 o el LPRPL del Ejemplo 2, el LPL o el LPRPL son molidos hasta ser convertidos en un polvo fino y son aplicados directamente sobre una herida o sitio de tratamiento sin rehidratar primero la composición. La herida es recubierta para el tratamiento en la herida o el sitio de tratamiento. La aplicación puede ser parte de un tratamiento de una sola vez, o más típicamente, puede repetirse diariamente, o cada tres o cinco días según se desee.

Ejemplo 6 - Uso de LPL o LPRPL para tratar heridas con un vendaje

Tras la preparación del LPL del Ejemplo 1 o el LPRPL del Ejemplo 2, el LPL o el LPRPL son molidos en un polvo fino y colocados en una pequeña gasa porosa. La gasa es unida a un material adhesivo para formar una venda. En esta condición, la venda LPL o LPRPL está lista para ser aplicada en varios tipos de heridas directamente. Alternativamente, la venda LPL o LPRPL puede ser rehidratada con solución salina o agua y luego colocada en el sitio de la herida.

Ejemplo 7 - Uso de LPL o LPRPL para el tratamiento de trastornos pulmonares

Tras la preparación del LPL del Ejemplo 1 o el LPRPL del Ejemplo 2, el LPL o el LPRPL son molidos hasta obtener un polvo fino y luego pueden ser rehidratados a diversas concentraciones con un efecto terapéutico determinado para un régimen de tratamiento determinado. En este ejemplo es usada una concentración del 10% en volumen. Para el tratamiento directo a los pulmones, el LPL o LPRPL rehidratado es nebulizado e inhalado por el paciente durante un período de 10 minutos.

Ejemplo 8 - Rehidratación en dos partes de LPL o LPRPL

Tras la preparación del LPL del Ejemplo 1 o el LPRPL del Ejemplo 2, el LPL o el LPRPL son molidos en un polvo fino y colocados en un lado de un recipiente de varios compartimentos, y en el otro lado del recipiente es colocada una solución salina estéril para que los dos materiales no entren en contacto hasta que se rompa el sello. Una vez que roto el sello, la solución salina es mezclada con el LPL o LPRPL y es rehidratada. A continuación, un aplicador de aerosol es puesto en posición ON, y usando una bomba para presionar hacia arriba y hacia abajo, el LPL o LPRPL reconstituido es aplicado por pulverización directamente en un sitio a ser tratado. Este es un ejemplo de un dispositivo que puede ser usado de acuerdo con los ejemplos de la presente divulgación. También pueden ser usados otros dispositivos para la reconstitución y/o aplicación del LPL o LPRPL descrito en la presente memoria.

Ejemplo 9 - Uso de LPL o LPRPL con un agente activo o biológico

Tras la preparación del LPL del Ejemplo 1 o el LPRPL del Ejemplo 2, el LPL o el LPRPL son molidos en un polvo fino o pueden ser rehidratados a diversas concentraciones con un efecto terapéutico determinado para un régimen de tratamiento determinado. Luego, el LPL o LPRPL es mezclado con un agente activo o biológico, tal como un antimicótico, antiviral, antibiótico, factor de crecimiento o químico, dependiendo de la aplicación terapéutica o de investigación. La concentración del agente activo o biológico puede ser cualquier concentración que tenga un efecto terapéutico o que cumpla con un objetivo de investigación siendo considerado, sin limitación.

Ejemplo 10 - Comparación de cultivos de células madre mesenauimales usando diversos medios

Los lisados plaquetarios liofilizados preparados de forma similar a la descrita en el Ejemplo 1 son comparados con otros medios para el cultivo de células madre mesenquimales. La FIG. 1 muestra gráficamente los resultados del estudio. Específicamente, el Medio 1 incluye 10% de Suero Bovino Fetal (FBS), Célula Madre Embrionaria calificada (ESC); el Medio 2 incluye 10% de Plasma Rico en Plaquetas (PRP); el Medio 3 incluye 10% de Lisados Plaquetarios (PL); y el Medio 4 incluye 5% de Lisados Plaquetarios Liofilizados (LPL), cada porcentaje por volumen. Como puede observarse en la FIG. 1, las células cultivadas en los medios que incluyen los lisados de plaquetas liofilizados superaron significativamente a los cultivos de células que no incluían lisados de plaquetas liofilizados.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de preparación de lisados plaquetarios liofilizados, que comprende:

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de concentración es por centrifugación.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la fuente de las plaquetas es sangre entera o plasma.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de concentración es en presencia de un anticoagulante.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ciclo de congelación-descongelación de la porción rica en plaquetas comprende la congelación de la porción rica en plaquetas a una temperatura de -190 °C a -80 °C, seguida de una rápida descongelación de las plaquetas a una temperatura que oscila entre 30 °C y 45 °C.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el ciclo de congelación-descongelación es repetido hasta al menos el 50% de la citólisis de las plaquetas.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el ciclo de congelación-descongelación es repetido hasta al menos el 70% de la citólisis de las plaquetas.

8. Una composición de polvo de lisado plaquetario liofilizado, que comprende:

9. La composición de la reivindicación 8, en la que la composición de polvo de lisado plaquetario liofilizado es reconstituida en un medio líquido, o formulada para su aplicación en un sitio de tejido para uso terapéutico.

10. La composición de la reivindicación 8, que comprende al menos el 50% de plaquetas lisadas por recuento de plaquetas.

11. La composición de la reivindicación 8, que comprende además un agente terapéutico, un fármaco o un medio de cultivo adicional mezclado con la composición de polvo de lisado plaquetario liofilizado.

12. La composición de la reivindicación 8, en la que la composición de polvo de lisado plaquetario liofilizado es formulada en un medio para un cultivo celular.

13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 para uso en un procedimiento de tratamiento de tejidos de mamíferos, comprendiendo el procedimiento la aplicación de la composición al área de tejido de mamíferos para el tratamiento.

14. Un procedimiento de cultivo de células o tejidos, que comprende la mezcla de una composición de medios incluyendo la composición de polvo de lisado liofilizado de plaquetas de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 con un cultivo de células o tejidos.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la composición de medios comprende uno o más de DMEM, DMSO, MEM alfa, RPMI, B-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, o glutamina.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el cultivo de células o tejidos comprende células madre mesenquimales, células madre embrionarias humanas, queratinocitos, o cardiomiocitos.