ES2828713T3 - Ensayos de detección de anticuerpos anti-VHC objeto usando péptidos de captura NS3 - Google Patents
Ensayos de detección de anticuerpos anti-VHC objeto usando péptidos de captura NS3 Download PDFInfo
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Abstract
Un método para detectar la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica inicial sospechosa de contener anticuerpos anti-VHC objeto con los péptidos de captura NS3h primero y segundo y los péptidos conjugados marcados de forma detectable primero y segundo para generar una muestra biológica mixta que comprende la muestra biológica inicial, el primer y segundo péptidos de captura NS3h y el primer y segundo péptidos conjugados, donde (i) el primer péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC y no tiene más de 350 aminoácidos de longitud, (ii) el segundo péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con una helicasa NS3 de VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3, y (iii) los anticuerpos anti-VHC objeto no están en forma purificada en la muestra biológica, b) incubar la muestra biológica mixta en condiciones tales que: (i) el primer péptido de captura NS3h se une específicamente al menos a uno de los anticuerpos objeto para formar un primer complejo de captura y el primer péptido conjugado se une al anticuerpo objeto en el primer complejo de captura para formar un primer complejo detectable, y (ii) el segundo péptido de captura NS3h se une específicamente al menos a uno de los anticuerpos objeto para formar un segundo complejo de captura y el segundo péptido conjugado se une al anticuerpo objeto en el segundo complejo de captura para formar un segundo complejo detectable; c) lavar la muestra biológica mixta para generar una muestra lavada; y d) detectar la presencia del primer y/o segundo complejo detectable, detectando así la infección por VHC en el sujeto, donde la presencia tanto del primero como del segundo péptidos de captura NS3h en la muestra biológica mixta amplía el intervalo dinámico para detectar cualitativamente los anticuerpos objeto en comparación con el uso de, únicamente, el primero o segundo péptido de captura NS3h.
Description
DESCRIPCIÓN
Ensayos de detección de anticuerpos anti-VHC objeto usando péptidos de captura NS3
Campo de la invención
La presente divulgación proporciona métodos, kits y composiciones para detectar anticuerpos anti-VHC objeto en una muestra usando péptidos de captura NS3. En determinados aspectos, al menos dos péptidos de captura de helicasa NS3 (NS3h) y al menos dos péptidos conjugados (por ejemplo, péptidos conjugados NS3h) se emplean juntos, lo que permite un amplio intervalo dinámico de detección de anticuerpos objeto en un ensayo tipo de una etapa. En otras realizaciones, se proporcionan métodos para detectar anticuerpos objeto específicos de NS3 sin el uso de un agente reductor. En algunos aspectos, los anticuerpos objeto específicos de NS3 se detectan con una "doble inyección" de péptido conjugado NS3 (por ejemplo, péptido conjugado añadido a una muestra antes y después del lavado).
Antecedentes
De acuerdo con las estadísticas de la OMS, hasta 170 millones de personas en todo el mundo están infectadas por el virus de la hepatitis C (VHC), una infección vírica del hígado. Del 75 al 85 % de las personas infectadas con el VHC progresan a una infección crónica, aproximadamente el 20 % de estos casos desarrollan complicaciones de hepatitis C crónica, incluyendo cirrosis hepática o carcinoma hepatocelular después de 20 años de infección. El tratamiento recomendado actualmente para las infecciones por VHC es una combinación de interferón y ribavirina, sin embargo, el tratamiento no es eficaz en todos los casos y el trasplante de hígado está indicado en la enfermedad hepática terminal relacionada con la hepatitis C. En la actualidad, no hay una vacuna disponible para prevenir la infección por el VHC, por lo tanto, se deben tomar todas las precauciones para evitar la infección. Por lo tanto, los ensayos de detección del VHC sensibles son importantes para la seguridad pública. El documento WO02096941 (A2) se refiere a un polipéptido que puede reaccionar específicamente con los anticuerpos de pacientes infectados con el VHC, al uso de dicho polipéptido para la detección y cuantificación de anticuerpos anti-VHC o de proteínas NS3, en una muestra biológica o a la obtención de anticuerpos.
Bian et al. "Significance of Monoclonal Antibodies against the Conserved Epitopes within Non-Structural Protein 3 Helicase of Hepatitis C Virus" PLOS ONE, (20130724), vol. 8, N.° 7 informan sobre un estudio en el que se caracterizaron anticuerpos monoclonales (mAb) contra la helicasa NS3 mediante mapeo de epítopos y prueba de función biológica.
F.-B. WU et al., "Double-antigen sandwich time-resolved immunofluorometric assay for the detection of anti-hepatitis C virus total antibodies with improved specificity and sensitivity", JOURNAL OF m Ed ICAL MICROBIOLOGY., Reino Unido, (20080801), vol. 57, n.° 8, informan sobre un estudio en el que se ha desarrollado un ensayo inmunofluorométrico de resolución en el tiempo de tipo sándwich de doble antígeno (DAS-TRIFMA) para detectar anticuerpos anti-VHC totales en base a la interacción biotina-estreptavidina. El documento US2014272933 (A1) desvela inmunoensayos combinados y otros reactivos y kits para la detección simultánea de antígenos del VHC y anticuerpos anti-VHC en una muestra de prueba.
Sumario de la invención
La presente divulgación proporciona métodos, kits y composiciones para detectar anticuerpos anti-VHC objeto en una muestra usando péptidos de captura NS3. De acuerdo con la presente divulgación, al menos dos péptidos de captura de helicasa NS3 (NS3h) y al menos dos péptidos conjugados (por ejemplo, péptidos conjugados NS3h) se emplean juntos, lo que permite un amplio intervalo dinámico de detección de anticuerpos objeto en un ensayo tipo de una etapa. En otros aspectos de la presente divulgación, se proporcionan métodos para detectar anticuerpos objeto específicos de NS3 sin el uso de un agente reductor. En algunos aspectos de la presente divulgación, los anticuerpos objeto específicos de NS3 se detectan con una "doble inyección" de péptido conjugado NS3 (por ejemplo, péptido conjugado añadido a una muestra antes y después del lavado).
Más en particular, de acuerdo con la presente invención, en el presente documento se proporcionan métodos para detectar la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en un sujeto, que comprenden:
(a) poner en contacto una muestra biológica inicial sospechosa de contener anticuerpos objeto con el primer y segundo péptidos de captura NS3h y el primer y segundo péptidos conjugados marcados de forma detectable para generar una muestra biológica mixta que comprende la muestra biológica inicial, el primer y segundo péptidos de captura NS3h y el primer y segundo péptidos conjugados, donde
(i) el primer péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC y no tiene más de 350 aminoácidos de longitud,
(ii) el segundo péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con una helicasa NS3 de VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3, y (iii) los anticuerpos objeto no están en forma purificada en la muestra biológica,
b) incubar la muestra biológica mixta en condiciones tales que:
(i) el primer péptido de captura NS3h se une específicamente al menos a uno de los anticuerpos objeto para formar un primer complejo de captura y el primer péptido conjugado se une al anticuerpo objeto en el primer complejo de captura para formar un primer complejo detectable, y
(ii) el segundo péptido de captura NS3h se une específicamente al menos a uno de los anticuerpos objeto para formar un segundo complejo de captura y el segundo péptido conjugado se une al anticuerpo objeto en el segundo complejo de captura para formar un segundo complejo detectable;
c) lavar la muestra biológica mixta para generar una muestra lavada; y
d) detectar la presencia del primer y/o segundo complejo detectable, detectando así la infección por VHC en el sujeto,
donde la presencia tanto del primero como del segundo péptidos de captura NS3h en la muestra biológica mixta amplía el intervalo dinámico para detectar cualitativamente los anticuerpos objeto en comparación con el uso de, únicamente, el primero o segundo péptido de captura NS3h.
En determinadas realizaciones, La presente invención proporciona kits que comprenden:
(a) primero y segundo péptidos de captura NS3h que se unen al menos a un anticuerpo objeto en una muestra biológica, donde
(i) el primer péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC y no tiene más de 350 aminoácidos de longitud y
(ii) el segundo péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con una helicasa NS3 de VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3, (b) los primero y segundo péptidos conjugados, donde el primero y segundo péptidos conjugados pueden unirse al menos a un anticuerpo objeto en la muestra biológica, y
(c) instrucciones de uso.
En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona composiciones que comprenden:
(a) primero y segundo péptidos de captura NS3h que se unen al menos a un anticuerpo objeto en una muestra biológica, donde
(i) el primer péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC y no tiene más de 350 aminoácidos de longitud y
(ii) el segundo péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con una helicasa NS3 de VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3, y (b) los primero y segundo péptidos conjugados, donde el primero y segundo péptidos conjugados pueden unirse al menos a un anticuerpo objeto en la muestra biológica. En determinadas realizaciones, las composiciones de la presente invención comprenden además c) la muestra biológica que contiene los anticuerpos objeto, y donde los anticuerpos objeto no están en forma purificada en la muestra biológica. En otras realizaciones, las composiciones están libres, o libres de forma detectable, de detergentes.
En realizaciones particulares de la presente invención, en el presente documento se proporcionan métodos para detectar la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en un sujeto, que comprenden: a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener anticuerpos objeto con: i) un primer péptido de captura NS3h que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos un 90 % (por ejemplo, de al menos un 90 %... 95 %... 98 %... 99,5 %... o 100 % de identidad de secuencia) con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC, donde el primer péptido de captura NS3h no tiene más de 350 o 300 aminoácidos de longitud (por ejemplo, no más de 325... 300... 275... 250... 225... 200... o 180 aminoácidos de longitud); ii) un segundo péptido de captura NS3h que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % (por ejemplo, al menos un 97 %... 99 %...
99,5%... 99,9%... o 100%) de identidad de secuencia con una helicasa NS3 del VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3.
De acuerdo con la invención, la presencia del primer péptido de captura NS3h junto con el segundo péptido de captura NS3h en la muestra extiende el intervalo dinámico superior para detectar cualitativamente los anticuerpos objeto en comparación con el uso exclusivo del segundo péptido NS3h.
En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona sistemas de kits que comprenden: a) un primer
péptido de captura NS3h que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC, donde el primer péptido NS3h no tiene más de 350 o 300 o 225 aminoácidos de longitud; b) un segundo péptido de captura NS3h que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con una helicasa NS3 de VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3.
En determinadas realizaciones de la presente invención, los kits comprenden además un primer envase, donde el primer y segundo péptidos de captura NS3h están dentro del primer envase. En otras realizaciones de la presente invención, el primer envase está libre o sustancialmente libre de detergente. En otras realizaciones de la presente invención, los kits comprenden además un soporte sólido (por ejemplo, micropartículas). En otras realizaciones de la presente invención, los kits comprenden además un segundo envase, donde el soporte sólido está dentro del segundo envase. En realizaciones adicionales de la presente invención, los kits comprenden además un primer péptido conjugado marcado de forma detectable (por ejemplo, que se unirá a un anticuerpo objeto capturado por el primer o segundo péptido de captura NS3h). En determinadas realizaciones de la presente invención, el primer péptido conjugado marcado de forma detectable: i) comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % o 90 % de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 de VHC, ii) no tiene más de 250 o 200 aminoácidos de longitud; y iii) comprende un marcador detectable. En realizaciones adicionales de la presente invención, los kits comprenden además un segundo péptido conjugado marcado de forma detectable (por ejemplo, que se unirá a un anticuerpo objeto capturado por el primer o segundo péptido de captura NS3h). En determinadas realizaciones de la presente invención, el segundo péptido conjugado marcado de forma detectable: i) comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % o 90 % de identidad de secuencia con una helicasa NS3 de VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3 de una helicasa NS3 de VHC, y ii) comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones de la presente invención, los kits comprenden además un segundo (o tercer) envase, donde el primero y el segundo péptidos conjugados NS3h están dentro del segundo (o tercer) envase. En realizaciones particulares de la presente invención, el segundo envase está libre o sustancialmente libre de detergente.
En determinadas realizaciones de la presente invención, los kits comprenden además un primer anticuerpo anti-VHC. En algunas realizaciones de la presente invención, el primer anticuerpo anti-VHC es un anticuerpo anti-núcleo del VHC o un anticuerpo anti-NS3 o NS4. En otras realizaciones de la presente invención, el primer anticuerpo anti-VHC comprende un resto de unión a soporte sólido. En realizaciones adicionales de la presente invención, los kits comprenden además un segundo anticuerpo anti-VHC. En determinadas realizaciones de la presente invención, el segundo anticuerpo anti-VHC es un anticuerpo anti-núcleo del VHC. En algunas realizaciones de la presente invención, los kits comprenden además un segundo envase, donde el segundo anticuerpo anti-VHC está dentro del segundo envase. En determinadas realizaciones de la presente invención, los kits comprenden además un péptido de captura del núcleo del VHC. En realizaciones adicionales de la presente invención, el péptido de captura del núcleo del VHC comprende un resto de unión a soporte sólido. En otras realizaciones de la presente invención, los kits comprenden además un péptido del núcleo del VHC conjugado marcado de forma detectable.
En determinadas realizaciones, La presente invención proporciona composiciones que comprenden: a) un primer péptido de captura NS3h que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % (por ejemplo, un 90 %... 95 %... 99 %... 99,5 %) de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC, donde el primer péptido NS3h no tiene más de 350 aminoácidos de longitud (por ejemplo, no más de 250... 300... o 350); y b) un segundo péptido de captura NS3h que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con una helicasa NS3 de VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3. En algunas realizaciones de la presente invención, las composiciones comprenden además al menos uno de los componentes siguientes: c) un soporte sólido; d) un primer péptido conjugado marcado de forma detectable; e) un segundo péptido conjugado marcado de forma detectable; f) un primer anticuerpo anti-VHC; g) un segundo anticuerpo anti-VHC que está marcado de forma detectable; h) un péptido de captura el núcleo del VHC; y i) un péptido conjugado del núcleo del VHC marcado de forma detectable. En realizaciones particulares de la presente invención, la composición tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o los siete componentes.
En determinadas realizaciones de la presente invención, en el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden al menos un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-16, o un péptido con al menos un 95% (por ejemplo, 95%... 98%... 99 %... o 99,5 %) de Identidad de secuencia con las SeQ ID NO: 1-16.
En algunas realizaciones de la presente invención, en el presente documento se proporcionan métodos como los anteriores para detectar la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en un sujeto, que comprenden adicionalmente: a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener anticuerpos objeto con los péptidos de captura NS3h como los anteriores y donde el contacto se lleva a cabo en condiciones tales que ningún agente reductor exógeno (es decir, un agente reductor que no esté presente de forma natural en la muestra) se añade ni está presente en la muestra, b) incubar la muestra en condiciones tales que los péptidos de captura NS3h como los anteriores se una específicamente al menos a uno de los anticuerpos objeto para formar un primer y segundo complejo de captura, donde la incubación se realiza en condiciones en las que no está presente ningún agente reductor exógeno en la muestra; y c) detectar la presencia del primer y/o segundo complejo de captura, detectando
de esta manera la presencia de infección por VHC pasada o presente en el sujeto, donde la detección se realiza en condiciones en las que no está presente ningún agente reductor exógeno.
En determinadas realizaciones de la presente invención, en el presente documento se proporcionan kits y composiciones como los anteriores y donde la composición está libre de agentes reductores exógenos.
En determinadas realizaciones de la presente invención, la secuencia de aminoácidos del segundo péptido de captura NS3h es al menos 1,5 o 2 veces más larga que la del primer péptido de captura NS3h (por ejemplo, al menos 1,5... 3,0... 4,0... 5,0 veces más larga o más). En realizaciones adicionales de la presente invención, el primer péptido de captura NS3h tiene al menos un 90 % (por ejemplo, 80 %... 87 %... 94 %... 98 %... 99 %, ... o 95,5 %) de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC y no tiene más de 250 aminoácidos de longitud. En realizaciones adicionales, el segundo péptido de captura NS3h tiene al menos un 95 % (por ejemplo, 96 %... o 99 %) de identidad de secuencia con una helicasa NS3 de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3. En determinadas realizaciones de la presente invención, el segundo péptido de captura NS3h comprende una secuencia de helicasa NS3 de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3. En realizaciones adicionales de la presente invención, la secuencia de aminoácidos del segundo péptido de captura NS3h tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la helicasa del VHC de longitud completa. En realizaciones adicionales de la presente invención, la secuencia de aminoácidos del segundo péptido de captura NS3h comprendía una secuencia de helicasa de NS3 de longitud completa que tiene los dominios 1, 2 y 3. En realizaciones adicionales de la presente invención, el segundo péptido de captura NS3h tiene una estructura nativa de helicasa NS3 (es decir, estructura no desnaturalizada).
En algunas realizaciones de la presente invención, se sospecha además que la muestra contiene partículas de VHC o fragmentos de las mismas y donde el método comprende además poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo de captura anti-VHC de modo que se forma un tercer complejo, donde el tercer complejo comprendía el primer anticuerpo de captura anti-VHC unido a una partícula de VHC o fragmento de la misma. En otras realizaciones de la presente invención, el primer anticuerpo anti-VHC de captura es un anticuerpo anti-núcleo de VHC. En realizaciones adicionales de la presente invención, el primer anticuerpo anti-VHC comprende un resto de unión a soporte sólido. En realizaciones adicionales de la presente invención, los métodos comprenden además poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo anti-VHC (por ejemplo, anticuerpo conjugado) que se une a la partícula de VHC o fragmento de la misma en el tercer complejo, donde el segundo anticuerpo anti-VHC está marcado de forma detectable. En realizaciones adicionales de la presente invención, el el segundo anticuerpo anti-VHC es un anticuerpo anti-núcleo del VHC. En algunas realizaciones de la presente invención, los métodos comprenden además detectar el tercer complejo.
De acuerdo con el método proporcionado por la presente invención, antes de cualquier detección por péptido conjugado o anticuerpo conjugado, la muestra se lava (véase la etapa c) como anteriormente). En algunas realizaciones de la presente invención, los métodos comprenden además poner en contacto la muestra con un primer péptido del núcleo del VHC (por ejemplo, péptido de captura del núcleo), donde el primer péptido del núcleo se une específicamente al menos a uno de los anticuerpos objeto para formar un cuarto complejo. En realizaciones adicionales de la presente invención, el primer péptido del núcleo del VHC comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12 o una con un 95% o más de identidad con la SEQ ID NO: 12. En realizaciones adicionales de la presente invención, el primer péptido del núcleo del VHC comprende un resto de unión a soporte sólido.
En realizaciones adicionales de la presente invención, los métodos proporcionados comprenden además poner en contacto la muestra con un segundo péptido del núcleo del VHC (por ejemplo, péptido conjugado), donde el segundo péptido del núcleo del VHC está marcado de forma detectable y donde el segundo péptido del núcleo del VHC se une al anticuerpo objeto como parte del cuarto complejo. En determinadas realizaciones de la presente invención, los métodos comprenden además detectar la presencia del cuarto complejo. En realizaciones adicionales de la presente invención, los métodos comprenden además poner en contacto la muestra con un soporte sólido (por ejemplo, microperlas, etc.). En realizaciones adicionales de la presente invención, el soporte sólido se recubre con avidina u otra molécula de unión.
En realizaciones adicionales de la presente invención, los métodos comprenden además poner en contacto la muestra con un primer péptido conjugado marcado de forma detectable que se une al anticuerpo objeto como parte del primer complejo y donde la detección de la presencia del primer complejo comprende la detección del primer péptido conjugado marcado de forma detectable. En realizaciones adicionales de la presente invención, el primer péptido conjugado marcado de forma detectable: i) comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %... 90 %... o 99 % de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC, ii) no tiene más de 300... 200... o 180 aminoácidos de longitud; y iii) comprende un marcador detectable.
En determinadas realizaciones de la presente invención, los métodos comprenden además poner en contacto la muestra con un segundo péptido conjugado marcado de forma detectable que se une al anticuerpo objeto como parte del segundo complejo y donde la detección de la presencia del segundo complejo comprende la detección del segundo péptido conjugado marcado de forma detectable. En otras realizaciones de la presente invención, el
segundo péptido conjugado marcado de forma detectable comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %... 90 %... 99 % de identidad de secuencia la helicasa NS3 del VHC de longitud completa. En realizaciones adicionales de la presente invención, el primer péptido de captura NS3h no tiene más de 180 aminoácidos de longitud. En realizaciones adicionales, el primer péptido de captura NS3h comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3 o donde el primer péptido NS3 tiene un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3. En realizaciones adicionales de la presente invención, el primer péptido de captura NS3 comprende o consiste en al menos 100 aminoácidos contiguos (por ejemplo, al menos 100... 125... o 135) de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.
En realizaciones adicionales de la presente invención, el segundo péptido de captura NS3h tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la helicasa NS3 del VHC de longitud completa. En determinadas realizaciones de la presente invención, el segundo péptido de captura NS3h tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la helicasa NS3 del VHC de longitud completa. En otras realizaciones de la presente invención, el segundo péptido de captura NS3h comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7 o donde el segundo péptido de captura NS3h tiene un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7. En realizaciones adicionales de la presente invención, el segundo péptido de captura NS3h comprende o consiste en al menos 300... 350 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.
En realizaciones adicionales de la presente invención, el primer péptido conjugado tiene al menos un 90 %... o 95 % de identidad con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VCH. En otras realizaciones de la presente invención, el primer péptido conjugado no tiene más de 180 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones de la presente invención, el primer péptido conjugado comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID n O : 3 o donde el primer péptido conjugado tiene un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3. En realizaciones adicionales de la presente invención, el segundo péptido conjugado tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la helicasa NS3 del VHC de longitud completa. En otras realizaciones de la presente invención, el segundo péptido conjugado tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la helicasa NS3 del VHC de longitud completa. En determinadas realizaciones de la presente invención, el segundo péptido conjugado comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7 o donde el segundo péptido conjugado tiene un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones de la presente invención, el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC es del genotipo del VHC seleccionado del grupo que consiste en: 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 2d, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 5a y 6a. En realizaciones adicionales de la presente invención, la helicasa NS3 del VHC de longitud completa es de un genotipo del VHC seleccionado del grupo que consiste en: 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 2d, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 5a y 6a. En otras realizaciones de la presente invención, el sujeto es un ser humano. En realizaciones adicionales de la presente invención, el resto de unión del soporte sólido comprende biotina. En realizaciones adicionales de la presente invención, los métodos comprenden además añadir una solución de activación a la muestra, donde la solución de activación activa una señal del marcador detectable.
Descripción de las figuras
Las figuras 1A y 1B muestran las secuencias de aminoácidos del péptido ejemplar denominado NS3-D1, que incluyen los aminoácidos 1192-1356 del VHC de acuerdo con la numeración estándar, que incluye todo el Dominio 1 de helicasa (1207-1356) y una pequeña porción de la proteasa NS3 (119201207). La figura 1A muestra específicamente las secuencias de aminoácidos del péptido de captura NS3-D1 (SEQ ID NO: 2) con una etiqueta de histidina en N-terminal (por ejemplo, para purificación de proteínas), mientras que la figura 1B muestra una versión biotinilada de NS3-D1 (SEQ ID NO: 3) (por ejemplo, de manera que este péptido puede unirse a microperlas recubiertas de avidina). Las figuras 1C-E muestran una secuencia ejemplar denominada "NS3-D1, DelN15", que son los aminoácidos 1205-1356. La figura 1C muestra específicamente la secuencia de aminoácidos del péptido ejemplar NS3-D1, delN15-Cbt (v2e), SEQ ID NO: 1, con una secuencia de biotina en el C-terminal. La figura 1D muestra específicamente la secuencia de aminoácidos del péptido ejemplar NS3-D1, delN15-XC9, SEQ ID NO: 13, que tiene la secuencia "XC9" en el extremo C-terminal, que está diseñado para unir BSA acridinilada con fines de marcaje. La figura 1E proporciona la secuencia de aminoácidos de NS3-D1, del N15 (SEQ ID NO: 14), con una etiqueta de histidina N-terminal.
La figura 2 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de los péptidos NS3h ejemplares NS3-(DeltaN15) (aminoácidos 1205-1658) que incluyen la helicasa NS3 del VHC de longitud completa con los tres dominios. La figura 2A muestra específicamente la secuencia de ácido nucleico de NS3h(deltaN15) (SEQ ID NO: 4). La Figura 2B muestra la secuencia de aminoácidos de NS3h(deltaN15) (SEQ ID NO: 5). La figura 2C muestra la secuencia de ácido nucleico de NS3h(deltaN15)-Cbt(v2e) (SEQ ID NO: 6), que codifica una etiqueta de biotina en C-terminal. La figura 2D muestra la secuencia de aminoácidos de NS3h(deltaN15)-Cbt(v2e) (SEQ ID NO: 7), que incluye una etiqueta de biotina en C-terminal. La figura 2E muestra la secuencia de ácido nucleico de NS3h(deltaN15)-XC9 (SEQ ID NO: 8), que codifica una secuencia de XC9 en C-terminal. La figura 2F muestra la secuencia de aminoácidos de NS3h(deltaN15)-XC9 (SEQ ID NO: 9), que codifica una secuencia de XC9 diseñada para unirse a BSA acridinilada con fines de marcaje.
La figura 3A muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 10) del péptido de fusión 9NB45H y la figura 3B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) del péptido de fusión 9NB45H, que es una fusión de
los aminoácidos 1192-1457 (región NS3), 1-150 (región del núcleo) y GSGSHHHHHH (etiqueta de histidina). Esta secuencia es útil, por ejemplo, como calibrador o secuencia de control.
La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de un péptido del núcleo ejemplar (SEQ ID NO: 12), que son los aminoácidos 15-68, con una deleción en las posiciones 34 y 48.
La figura 5 muestra una alineación de secuencia de las secuencias descritas en la figura 1-4 y el aislado P26664 en la región NS3 del VHC. Esta alineación muestra una porción de la proteasa, así como la ubicación de los dominios 1, 2 y 3 de la HS3 helicasa.
Definiciones:
El término "muestra" como se utiliza en el presente documento, se utiliza en su sentido más amplio. Una "muestra biológica", como se utiliza en el presente documento, incluye, pero sin limitación, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o un ser antes vivo. Tales seres vivos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, ratones, ratas, monos, perros, conejos y otros animales. Tales sustancias incluyen, pero sin limitación, sangre, (por ejemplo, sangre entera o componentes de la misma), plasma, suero, orina, saliva, líquido amniótico, líquido sinovial, células endoteliales, leucocitos, monocitos, otras células, órganos, tejidos, médula ósea, ganglios linfáticos y bazo.
El término "anticuerpo" (Ab) y "anticuerpos" (Ab) se refiere a anticuerpos monoclonales (mAb (singular) o mAb (plural)), anticuerpos policlonales (pAb (plural)), anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados (total o parcialmente humanizados; un polipéptido que comprende una región variable modificada de un anticuerpo humano donde una parte de la región variable ha sido sustituida por la secuencia correspondiente de una secuencia no humana y donde la región variable modificada está unida al menos a parte de la región constante de un anticuerpo humano), anticuerpos animales (tales como, pero sin limitación, un ave (por ejemplo, un pato o un ganso), un tiburón, una ballena y un mamífero, incluyendo un no primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, una cobaya, un gato, un perro, una rata, un ratón, etc.) o un primate no humano (por ejemplo, un mono, un chimpancé, etc.), anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos (cAb; un polipéptido que comprende todas o una parte de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de una especie hospedadora unida al menos a parte de las regiones constantes del anticuerpo de otra especie hospedadora), anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de un solo dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla ("scFv"), fragmentos Fv unidos por disulfuro ("sdFv"), fragmentos de dAb, diacuerpos, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada y anticuerpos antiidiotípicos ("anti-Id"), anticuerpos bifuncionales o de dominio dual (por ejemplo, anticuerpos de dominio variable dual o DVD-IgG) y funcionalmente activos, fragmentos de unión a epítopo (o fragmentos antigénicamente reactivos) de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos (o antigénicamente reactivos) de moléculas de inmunoglobulina, concretamente, moléculas que contienen un sitio de unión del analito como se describe adicionalmente en (n) en el presente documento, y variantes como se describe adicionalmente en el presente documento. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. Un anticuerpo, cuya afinidad (es decir, KD, kd o ka) se ha aumentado o mejorado mediante el cribado de una biblioteca de anticuerpos combinatoria que se ha preparado utilizando bio-visualización, se denomina "anticuerpo madurado por afinidad". Por simplicidad, un anticuerpo contra un analito se cita frecuentemente en el presente documento como un "anticuerpo antianalito" o simplemente un "anticuerpo frente a analito" (por ejemplo, un anticuerpo anti-VHC o un anticuerpo frente a VHC).
En la presente descripción, el "componente", "componentes" del ensayo y "al menos un componente", hacen referencia a, por ejemplo, anticuerpos de captura, péptidos de captura (por ejemplo, primer y segundo anticuerpos de captura NS3h), un anticuerpo de detección o conjugado, un control, un calibrador, una serie de calibradores, un panel de sensibilidad, un envase, un tampón, un diluyente, una sal, una enzima, un cofactor para una enzima, un reactivo de detección, un reactivo/solución de pretratamiento, un sustrato (por ejemplo, en forma de una solución), una solución de parada y similares que pueden incluirse en un kit para el ensayo de una muestra de prueba, tal como una muestra de orina, suero o plasma de un paciente, de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento y otros métodos conocidos en la técnica. Por tanto, en el contexto de la presente divulgación, "al menos un componente", "componente", y "componentes" puede incluir un polipéptido como se describe en el presente documento, que opcionalmente se inmoviliza en un soporte sólido. Algunos componentes pueden encontrarse en solución o liofilizados para su reconstitución para usarse en un ensayo.
Al realizar los ensayos de la presente divulgación, puede resultar útil utilizar un control. "Control" se refiere a una composición que se sabe que no contiene anticuerpo anti-VHC ("control negativo") o que contiene anticuerpo anti-VHC ("control positivo"). Un control positivo puede comprender una concentración conocida de anticuerpo anti-VHC. "Control", "control positivo", y "calibrador" se pueden usar indistintamente en el presente documento para hacer referencia a una composición que comprende una concentración conocida de anticuerpo anti-VHC. Puede usarse un "control positivo" para establecer las características de rendimiento del ensayo y es un indicador útil de la integridad de los reactivos (por ejemplo, analitos).
"Epítopo" "epítopos" y "epítopos de interés" se refieren a uno o más sitios en cualquier molécula (por ejemplo, los
antígenos NS3 y NS3h descritos en el presente documento) que se reconoce y puede unirse a un sitio complementario en un compañero de unión específica, tal como un anticuerpo o fragmento antigénicamente reactivo del mismo. Un epítopo está compuesto por los restos de aminoácidos precisos de una región de un antígeno (o fragmento del mismo) que se sabe que se une al sitio complementario en el compañero de unión específica. Un fragmento antigénico puede contener más de un epítopo.
En los ensayos, kits y composiciones que se describen en el presente documento, uno u otro componente del ensayo puede comprender un marcador detectable. Los términos "marcador" y "marcador detectable" significan un resto unido a un compañero de unión específica, tal como un anticuerpo o un analito, para hacer que la reacción entre miembros de un par de unión específica, tal como un anticuerpo y un analito, sea detectable y el compañero de unión específica, por ejemplo, anticuerpo o analito, así marcado se denomina "marcado de forma detectable". Un marcador puede producir una señal que es detectable por medios visuales o instrumentales. Varios marcadores incluyen sustancias productoras de señales, tales como cromógenos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos radiactivos y similares. Los ejemplos representativos de marcadores incluyen restos que producen luz, por ejemplo, compuestos de acridinio y restos que producen fluorescencia, por ejemplo, fluoresceína. En el presente documento se describen otros marcadores. En este sentido, el resto en sí puede no estar marcado de forma detectable pero puede convertirse en detectable tras la reacción con otro resto más. El uso de "marcado de forma detectable" pretende abarcar el último tipo de marcaje detectable.
"Secuencia enlazadora" se refiere a una secuencia polipeptídica natural o artificial que está conectada a una o más secuencias polipeptídicas de interés (por ejemplo, de longitud completa, fragmentos, etc.). El término "conectado" se refiere a la unión de la secuencia enlazadora a la secuencia polipeptídica de interés. Dichas secuencias polipeptídicas están unidas preferentemente por uno o más enlaces peptídicos. Las secuencias enlazadoras pueden tener una longitud de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 aminoácidos. Preferentemente, la longitud de la secuencia enlazadora es de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 aminoácidos. Las secuencias enlazadoras naturales se pueden modificar mediante sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos para crear secuencias enlazadoras artificiales. Las secuencias enlazadoras ejemplares incluyen, pero sin limitación: (i) restos de histidina (etiquetas His), tal como una etiqueta de 6xHis, que contiene seis restos de histidina, son útiles como secuencias enlazadoras para facilitar el aislamiento y purificación de polipéptidos y anticuerpos de interés, (ii) sitios de escisión de enterocinasa, como marcadores His, se usan en el aislamiento y la purificación de proteínas y anticuerpos de interés. Con frecuencia, se usan sitios de escisión de enterocinasa junto con marcadores de His en el aislamiento y la purificación de proteínas y anticuerpos de interés. Se conocen en la materia diversos sitios de escisión de enterocinasa. (iii) pueden usarse secuencias diversas para enlazar o conectar las regiones variables de cadena ligera y/o pesada de fragmentos de región variable monocatenarios. Pueden encontrarse ejemplos de otras secuencias enlazadoras en Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85: 5879-5883 (1988); y McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). Las secuencias enlazadoras también pueden modificarse respecto de funciones adicionales, tales como el acoplamiento de fármacos o el acoplamiento a soportes sólidos. En el contexto de la presente divulgación, un mAb, por ejemplo, puede contener una secuencia enlazadora, tal como un marcador His, un sitio de escisión de enterocinasa o ambos.
"Paciente" y "sujeto" pueden usarse indistintamente en el presente documento para hacer referencia a un animal, tal como un ave (por ejemplo, un pato o un ganso), un tiburón, una ballena y un mamífero, incluyendo un no primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, una cobaya, un gato, un perro, una rata y un ratón) y un primate (por ejemplo, un mono, un chimpancé y un ser humano). Preferentemente, el paciente o sujeto es un ser humano, tal como un ser humano en riesgo de sufrir infección por VHC o un ser humano infectado por VHC.
En el análisis de los resultados de los inmunoensayos descritos en el presente documento, puede ser útil incluir ciertos niveles de detección como niveles de corte. "Valor de corte predeterminado" y "nivel predeterminado" se refieren, generalmente, a un valor de corte del ensayo que se usa para evaluar resultados de eficacia diagnóstica/pronóstica/terapéutica comparando los resultados del ensayo frente al valor de corte/nivel predeterminado, donde el valor de corte/nivel predeterminado ya se ha vinculado o asociado con diversos parámetros clínicos (por ejemplo, gravedad de la enfermedad, progresión/no progresión/mejora, etc.). Si bien la presente divulgación puede proporcionar niveles predeterminados ejemplares, es de sobra conocido que los valores de corte pueden variar dependiendo de la naturaleza del inmunoensayo (por ejemplo, anticuerpos empleados, etc.). Además, se encuentra dentro de las capacidades de la técnica la adaptación de la divulgación del presente documento para otros inmunoensayos a fin de obtener valores de corte específicos de inmunoensayo para estos otros inmunoensayos basándose en la presente divulgación. Aunque el valor preciso del límite de corte/nivel predeterminado puede variar entre ensayos, han de ser aplicables generalmente las correlaciones como se describen en el presente documento.
Como se describe a continuación, puede ser deseable, en algunas realizaciones, proporcionar un pretratamiento de la muestra de prueba. "Reactivo de pretratamiento", por ejemplo, reactivo de lisis, precipitación y/o solubilización, como se usa en un ensayo diagnóstico como se describe en el presente documento, es uno que lisa cualquier célula y/o solubiliza cualquier analito que esté presente en una muestra de prueba. No es necesario el pretratamiento para todas las muestras, como se describe adicionalmente en el presente documento. Entre otras cosas, solubilizar el
analito (es decir, anticuerpo anti-VHC) implica la liberación del analito de cualquier proteína de unión endógena presente en la muestra. Un reactivo de pretratamiento puede ser homogéneo (sin requerir una etapa de separación) o heterogéneo (requiriendo una etapa de separación). Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo, se elimina cualquier proteína de unión a analito precipitada de la muestra de prueba antes de pasar a la siguiente etapa del ensayo. El reactivo de pretratamiento puede comprender opcionalmente: (a) uno o más disolventes y sal, (b) uno o más disolventes, sal y detergente, (c) detergente, (d) detergente y sal o (e) cualquier reactivo o combinación de reactivos adecuada para la lisis celular y/o la solubilización del analito.
Los ensayos también pueden estar sujetos a un riguroso control de calidad. "Reactivos de control de calidad", en el contexto de los inmunoensayos y kits descritos en el presente documento, incluyen, pero sin limitación, calibradores, controles y paneles de sensibilidad. Un "calibrador" o "patrón" se usa típicamente (por ejemplo, uno o más, tal como una pluralidad) a fin de establecer curvas de calibración (patrón) para la interpretación de la concentración de un analito, tal como un anticuerpo o un analito. Como alternativa, se puede usar un solo calibrador, que está cerca de un valor de corte predeterminado positivo/negativo. Pueden usarse múltiples calibradores (es decir, más de un calibrador o una cantidad variable de calibradores) de manera conjunta para que comprenda un "panel de sensibilidad".
Los términos "muestra", "muestra de prueba" y "muestra de paciente" pueden usarse indistintamente en el presente documento. La muestra, tal como una muestra de orina, suero, plasma, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, células o tejido placentario, células endoteliales, leucocitos o monocitos, puede utilizarse directamente como se obtiene de un paciente o puede pretratarse, tal como mediante filtración, destilación, extracción, concentración, centrifugación, inactivación de componentes interferentes, adición de reactivos y similares, para modificar de algún modo el carácter de la muestra como se analiza en el presente documento o de otro modo como se conoce en la técnica. Preferentemente, la muestra es orina, suero o plasma.
En algunos ensayos, puede ser deseable proporcionar la calibración del ensayo. "Serie de composiciones de calibración" se refiere a una pluralidad de composiciones que comprenden una concentración conocida de anticuerpo anti-VHC, donde cada una de las composiciones difiere de las otras composiciones en la serie por la concentración de anticuerpo anti-VHC.
A lo largo de toda la presente memoria descriptiva, se observa que los antígenos NS3h y/u otros reactivos pueden estar unidos a un soporte sólido o fase sólida, ambos términos se utilizan indistintamente. La expresión "fase sólida" se refiere a cualquier material que es insoluble o que puede hacerse insoluble mediante una reacción posterior. La fase sólida puede seleccionarse por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar un agente de captura. Como alternativa, la fase sólida puede tener unida sobre la misma un agente de unión que tiene la capacidad de atraer e inmovilizar el agente de captura. El agente enlazador puede, por ejemplo, incluir una sustancia cargada que tiene una carga opuesta con respecto al agente de captura en sí o con respeto a una sustancia cargada conjugada al agente de captura. En general, el agente enlazador puede ser cualquier compañero de unión (preferentemente específico) que se inmoviliza sobre (une a) la fase sólida y que tiene la capacidad de inmovilizar el agente de captura a través de una reacción de unión. El agente enlazador permite la unión indirecta del agente de captura a un material de fase sólida antes de llevar a cabo el ensayo o durante la ejecución del ensayo (por ejemplo; captura en los ensayos de tipo vuelo). La fase sólida puede, por ejemplo, ser de plástico, plástico derivatizado, metal magnético o no magnético, vidrio o silicio, incluyendo, por ejemplo, un tubo de ensayo, pocillo de microtitulación, lámina, perlas, micropartículas, microplaca y otras configuraciones conocidas por los expertos habituales en la técnica.
En ciertas descripciones de los ensayos, kits y composiciones descritas en el presente documento, puede ser útil hacer referencia a NS3, NS4 o antígeno del núcleo o el anticuerpo frente al VHC como compañero de unión específica. "Compañero de unión específica" es un miembro de un par de unión específica. Un par de unión específica comprende dos moléculas diferentes, que se unen específicamente entre sí por medios químicos o físicos. Por lo tanto, además de los pares de unión específica de antígeno y anticuerpo de los inmunoensayos comunes, otros pares de unión específica pueden incluir biotina y avidina (o estreptavidina), carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, inhibidores enzimáticos y enzimas, y similares. Adicionalmente, los pares de unión específica pueden incluir miembros que son análogos de los miembros de unión específica originales, por ejemplo, un analito-análogo. Los miembros de unión específica inmunorreactivos incluyen antígenos, fragmentos de antígeno y anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales, así como complejos, fragmentos y variantes (incluidos fragmentos de variantes) de los mismos, ya se encuentren aislados o se produzcan de manera recombinante. El término "específico" y "especificidad" en el contexto de una interacción entre miembros de un par de unión específica (por ejemplo, un antígeno (o fragmento del mismo) y un anticuerpo (o fragmento antigénicamente reactivo del mismo)) se refieren a la reactividad selectiva de la interacción. La frase "se une específicamente a" y frases análogas se refieren a la capacidad de los anticuerpos (o fragmentos antigénicamente reactivos de los mismos) para unirse específicamente a un antígeno dado (o un fragmento del mismo) y no unirse específicamente a otras entidades.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona métodos, kits y composiciones para detectar anticuerpos anti-VHC objeto en
una muestra usando péptidos de captura NS3. De acuerdo con la presente invención tal como se ha expuesta anteriormente, al menos dos péptidos de captura de helicasa NS3 (NS3h) y al menos dos péptidos conjugados (por ejemplo, péptidos conjugados NS3h) se emplean juntos, lo que permite un amplio intervalo dinámico de detección de anticuerpos objeto en un ensayo tipo de una etapa. En otras realizaciones de la presente invención, se proporcionan métodos para detectar anticuerpos objeto específicos de NS3 sin el uso de un agente reductor. En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos objeto específicos de NS3 se detectan con una "doble inyección" de péptido conjugado NS3 (por ejemplo, péptido conjugado añadido a una muestra antes y después del lavado).
De acuerdo con la presente invención, el primer péptido de captura NS3h está compuesto sustancialmente sólo por el Dominio 1 de una proteína helicasa NS3 de Hepicavirus (por ejemplo, VHC) (por ejemplo, los aminoácidos 1192 1356 o 1205-1356), mientras que el segundo péptido de captura NS3h está compuesto sustancialmente por los tres dominios de la proteína helicasa NS3 (por ejemplo, aminoácidos 1207-1654). Estos dos tipos de proteínas se pueden añadir a niveles apropiados en un formato de inmunoensayo de 1 etapa (tanto los péptidos de captura como los conjugados se añaden a una muestra al mismo tiempo, o aproximadamente al mismo tiempo, antes de cualquier lavado) de modo que las muestras que contienen anticuerpos anti-NS3 del VHC de título alto son detectadas por el dominio 1 de la proteína de captura de NS3 y las muestras de Ab de título bajo son detectadas por el péptido helicasa NS3 de longitud completa. En algunas realizaciones de la presente invención, los péptidos de captura NS3h primero y segundo contienen biotina en el extremo C-terminal (por ejemplo, para unirse a perlas recubiertas de avidina) y se usa un segundo conjunto de proteínas similares o idénticas como proteínas conjugadas para detectar los anticuerpos capturados. Dichos péptidos conjugados pueden conjugarse con BSA acridinilada. En determinadas realizaciones de la presente invención, estos cuatro péptidos (dos de captura y dos conjugados) se utilizan en un inmunoensayo de una solo etapa para la detección de anticuerpos contra la proteína NS3 del VHC.
Como se muestra en el ejemplo 1 más adelante. el uso de dos tipos de péptidos de captura NS3h permite extender el intervalo dinámico de un inmunoensayo de 1 etapa para la detección de anticuerpos cuando las dos proteínas de captura NS3h se usan en conjunto. Por ejemplo, la proteína del dominio 1 de NS3h detecta muestras que contienen concentraciones más altas de anticuerpo y la proteína helicasa de longitud completa detecta muestras que contienen concentraciones más bajas de anticuerpo.
En general, los inmunoensayos de 1 etapa tienden a tener mejor sensibilidad y precisión que los ensayos de 2 etapas, pero el defecto del formato de 1 etapa es el "efecto gancho". Las muestras que contienen altas concentraciones de analito en la muestra del paciente superan las entradas de las moléculas de captura y detección, lo que da como resultado una respuesta de ensayo disminuida y resultados imprecisamente bajos. En un ensayo cualitativo, la disminución del resultado puede ir por debajo del valor de corte, lo que da como resultado un resultado falso negativo. La presente invención, en determinadas realizaciones, resuelve el problema del "efecto gancho" en un ensayo de 1 etapa para la detección de anticuerpos. La presente invención mejora lo que se sabe, por ejemplo, extendiendo el intervalo dinámico superior de detección de anticuerpos mediante, por ejemplo, la adición de una segunda proteína de menor peso molecular. En realizaciones particulares, esto también simplifica la configuración del ensayo mejorando la estabilidad en un formato combo de Ag/Ab del VHC.
Los métodos, los kits y las composiciones de la presente invención emplean al menos un primer y un segundo anticuerpo de captura de NS3h. En algunas realizaciones, los péptidos de captura NS3h tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en las mostradas en las figuras 1-2 y 5. También se pueden emplear variantes de estos péptidos que incluyen versiones más largas, más cortas o mutadas de tales secuencias de aminoácidos (por ejemplo, secuencias con una identidad de secuencia del 95 %... o 99 % con las secuencias de estas figuras o variantes de las mismas). De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invención, el primer péptido de captura NS3h está compuesto principalmente por solo el Dominio 1 de NS3h del VHC. Cabe señalar que los límites generalmente aceptados de la helicasa NS3 del VHC son los siguientes: Dominio 1 de helicasa NS3 -aprox. 1207-1356 (181-330); Dominio 2 de helicasa NS3 - aprox. 1357-1507 (331-481); y Dominio 3 de helicasa NS3 - aprox. 1508-1654 (482-626). En determinadas realizaciones, se proporcionan péptidos NS3 adicionales o variantes de los mismos en la publicación de Estados Unidos 20140272933 titulada "HCV Antigen-Antibody Combination Assay and Methods and Compositions for use therein" y la publicación de Estados Unidos 20140272932 titulada "HCV NS3 Recombinant Antigens and Mutants Thereof for Improved Antibody Detection", incluyendo las secuencias peptídicas de NS3 desveladas en las mismas.
En determinadas realizaciones de la presente invención, los ensayos descritos en el presente documento detectan además la presencia de anticuerpos contra el antígeno del núcleo. Algunos antígenos del núcleo ejemplares que podrían usarse incluyen antígenos derivados del dominio de unión al ADN (aminoácidos 1-125) de la proteína del núcleo. Aún otros antígenos del núcleo preferidos derivan del dominio de unión a lípidos del núcleo ubicado en los restos de aminoácidos 134-171 de la proteína del núcleo (MGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPG; SEQ ID NO: 17) o de las posiciones 15-68, sin o sin deleciones u otros cambios (véase la SEQ ID NO: 12, que tiene deleciones en 34 y 48). Por tanto, los antígenos del núcleo pueden recubrirse sobre un soporte en fase sólida y/o usarse en fase de solución para capturar los anticuerpos presentes en el suero o plasma humanos que se dirigen hacia la región del núcleo del VHC. Preferentemente, tales antígenos del núcleo pueden evadir la detección por el anticuerpo conjugado utilizado para la detección del antígeno del núcleo presente en una muestra de prueba en un
inmunoensayo de combinación del VHC. Por lo tanto, se puede realizar un inmunoensayo de combinación que detecte tanto el antígeno del núcleo presente en la muestra de prueba al mismo tiempo que detecte anticuerpos anti núcleo que también se esperaría que estuvieran en la muestra de prueba e identificados en el mismo formato de ensayo Combo del VHC.
Como se indica en el presente documento a lo largo de los métodos de la presente invención son, generalmente, métodos de inmunoensayo. En ejemplos de realizaciones, tales métodos incluyen métodos para aislar una molécula de interés (tal como, por ejemplo, un anticuerpo específico que está presente en una muestra de prueba o un antígeno específico que puede estar presente en la muestra de prueba). Para facilitar tal aislamiento, la molécula de interés, por ejemplo, entiende o es atraída a una etiqueta de purificación que contacta con un compañero de unión a la etiqueta. Por tanto, la asociación de la etiqueta de purificación y el compañero de unión a la etiqueta puede usarse para separar la molécula de interés de una mezcla de moléculas. Las etiquetas de purificación pueden comprender restos con estructuras iguales o similares. En determinadas realizaciones, el resto de marcaje de una etiqueta de afinidad se puede asociar con una etiqueta funcional directamente mediante un enlace sencillo o mediante un enlace de enlaces químicos estables, en disposiciones lineales, ramificadas o cíclicas, que opcionalmente incluyen enlaces carbono-carbono sencillos, dobles, triples, aromáticos, así como enlaces carbono-nitrógeno, enlaces nitrógenonitrógeno, enlaces carbono-oxígeno, enlaces carbono-azufre, enlaces fósforo-oxígeno, enlaces fósforo-nitrógeno y cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, la asociación entre el resto de etiquetado y la etiqueta funcional comprende restos éter, tioéter, carboxamida, sulfonamida, urea o uretano. En determinadas realizaciones, el enlace comprende una cadena de polialquileno, es decir, una disposición lineal o ramificada de enlaces carbono-carbono. En otras realizaciones, el enlace incluía una cadena de óxido de polialquileno, incluyendo un resto de polietilenglicol. Los ejemplos de las etiquetas de afinidad incluyen, pero sin limitación, biotina, digoxigenina (Dig), dinitrofenol (DNP), dedos de cinc, polímeros fluorados y secuencias polipeptídicas tales como motivos de polihistidina.
Las etiquetas de afinidad se usan, en algunas realizaciones, ventajosamente para aislar la molécula de interés basándose en la unión o atracción de la etiqueta de afinidad y un grupo funcional que es atraído o se une a la etiqueta de afinidad. En algunas realizaciones, los sustratos sólidos que tienen afinidad por la etiqueta de la que el sustrato sólido se deriva con el compañero de unión de la etiqueta. En algunas realizaciones, el compañero de unión puede inmovilizarse sobre un sustrato de afinidad. La expresión "sustrato de afinidad" puede referirse a una matriz o soporte inmóvil unido a un compañero de unión que es capaz de formar una interacción fuerte y preferentemente reversible con la etiqueta de purificación de una molécula. Un sustrato de afinidad puede incluir una resina, una perla, una partícula, una membrana, un gel. El compañero de unión reconoce o se une específicamente a la etiqueta de purificación. Los compañeros de unión específica dependerán de la etiqueta de afinidad, pero incluyen restos cargados y un miembro de un par de unión, tal como receptor-ligando, anticuerpo-antígeno, carbohidrato-lectina y biotina-estreptavidina (o avidina, neutravidina o un anticuerpo anti-biotina).
En realizaciones específicas, el extremo C o N de cualquiera o todos los antígenos usados en el inmunoensayo pueden estar biotinilados o pueden comprender un resto de unión a biotina (por ejemplo, avidina o estreptavidina o neutravidina o un anti-biotina) como etiqueta de afinidad. Estos péptidos son péptidos biotinilados o conjugados con avidina/estreptavidina y servirán como antígenos de captura. Asimismo, los antígenos se pueden marcar alternativamente con un marcador de detección, en cuyo caso servirán como antígenos de detección. Los antígenos de detección y captura pueden tener la misma secuencia de aminoácidos subyacente o, alternativamente, pueden tener secuencias diferentes. En ejemplos de realizaciones, los antígenos de captura se biotinilan en el extremo C o N para facilitar la unión de los mismos a los soportes sólidos que tienen el compañero de unión a biotina (es decir, avidina o estreptavidina). Para fines de producción ejemplares, los péptidos biotinilados se expresan de forma recombinante en células E. coli BL2L (DE3) mediante un sistema de inducción de IPTG a 25 °C. La biotinilación in situ en la biotinilación en C-terminal o N-terminal se logra mediante la cotransformación de las células BL21(DE3) con el plásmido de expresión del VHC que expresa el péptido deseado y un segundo plásmido que contiene el gen BirA de E. coli (Weiss et al. (1994) Protein Expression & Purif, 14:751-755; Schatz et al. (1993) Biotechnology, 11:1138-1143). La purificación de las proteínas recombinantes se realiza usando quelantes de cationes divalentes que se ha demostrado que previenen la oxidación catalizada por metales y la agregación de la proteína. La estabilidad de la proteína mejora significativamente cuando se añade EDTA o un quelante de cationes divalentes relacionado a los tampones usados durante la purificación y al tampón o tampones de almacenamiento final usados en el inmunoensayo.
En determinadas realizaciones, además de determinar la presencia de anticuerpos objeto en una muestra, los ensayos también determinan la presencia de uno o más antígenos del VHC en la muestra. En tales realizaciones, será deseable usar anticuerpos monoclonales anti-VHC para capturar el antígeno de la muestra de prueba y luego usar más anticuerpos conjugados para detectar la presencia de antígeno que ha sido capturado. Existen numerosos anticuerpos disponibles comercialmente que se pueden usar en este esfuerzo. Específicamente, dichos anticuerpos determinan, preferentemente, la presencia de antígeno del núcleo en la muestra de prueba. Los anticuerpos dirigidos al antígeno del núcleo son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en la publicación de patente de Estados Unidos n.° 20120009196 y 20140272931,
En realizaciones ejemplares específicas, los anticuerpos usados en el inmunoensayo de combinación son
anticuerpos diseñados para detectar la proteína del núcleo del VHC o fragmentos de la misma en una muestra de prueba. Dichos anticuerpos pueden detectar el dominio de unión al ADN, el dominio de unión a lípidos o la proteína del núcleo completa. En algunas realizaciones, el anticuerpo de detección usado en el inmunoensayo se dirige al dominio de unión a lípidos del péptido del núcleo. En todavía otras realizaciones, los anticuerpos anti-núcleo del VHC usados en los ensayos de combinación pueden ser, por ejemplo, C11-3, C11-7, C11-9 y C11-14 (como se describe en la patente de Estados Unidos 6.727.092; Morota, et al, J. Virol. Meth., 2009, 157:8-14).
En un ensayo específico de la presente invención, el inmunoensayo detecta al menos anticuerpos objeto específicos de NS3h, antígeno del núcleo, además de detectar anticuerpos del núcleo en la muestra de prueba. En tales realizaciones, se vuelve deseable, aunque no es esencial para asegurar que el antígeno de captura que está diseñado para capturar anti-núcleo, uno que, preferentemente comprenda ciertas deleciones o sustituciones en las regiones de unión al epítopo conocidas para anticuerpos monoclonales específicos, de modo que los anticuerpos monoclonales utilizados para la detección del antígeno del núcleo del VHC no pudieran detectar estos antígenos del núcleo modificados pero, no obstante, detectarían el antígeno del núcleo completo de la muestra de prueba. Los anticuerpos anti-núcleo ejemplares que se utilizarán como anticuerpos de captura incluyen los anticuerpos AOT3, C11-3, C11 -7, C11-9 y C11-14 como se describe en la patente de Estados Unidos 6.727.092 así como Morota, et al, J. Virol. Meth., 2009, 157:8-14.
En realizaciones particulares, los antígenos y anticuerpos descritos en el presente documento se contemplan para su uso como reactivos inmunodiagnósticos en inmunoensayos combinados diseñados para la detección de múltiples componentes de VHC encontrados en una muestra de prueba sospechosa de haber sido infectada con VHC. Los reactivos de inmunodiagnóstico (ya sean anticuerpos o antígenos) estarán compuestos por los polipéptidos antigénicos y anticuerpos descritos en el presente documento (típicamente en combinación) de modo que puedan usarse en un inmunoensayo combinado diseñado para la detección de antígenos del VHC que incluyen, entre otros, la región NS3 del VHC, el antígeno del núcleo del VHC, la región NS4 del VHC o combinaciones de las mismas, así como los anticuerpos anti-VHC dirigidos contra una o más de estas regiones. Para fines de captura, los antígenos y/o anticuerpos de los que está compuesto el reactivo inmunodiagnóstico pueden recubrirse sobre un soporte sólido, tal como, por ejemplo, una micropartícula, (por ejemplo, partícula magnética), perla, tubo de ensayo, placa de microtitulación, cubeta, membrana, molécula de andamio, película, papel de filtro, disco o microplaca. En este sentido, cuando el reactivo de inmunodiagnóstico comprende una combinación de antígenos (por ejemplo, dirigido a diferentes proteínas del VHC o diferentes fragmentos de la misma proteína del VHC), los antígenos pueden recubrirse de forma conjunta en el mismo soporte sólido o pueden estar en soportes sólidos separados. Asimismo, donde el reactivo inmunodiagnóstico comprende uno o más anticuerpos que se usarán para capturar uno o más antígenos de la muestra de prueba, tales anticuerpos pueden recubrirse de forma conjunta en el mismo soporte sólido o pueden estar en soportes sólidos separados.
De forma notable, el reactivo de inmunodiagnóstico puede marcarse con un marcador detectable o marcarse con un compañero específico que permita la captura o detección. Por ejemplo, los marcadores pueden ser un marcador detectable, tal como un fluoróforo, fracción radiactiva, enzima, marcador de biotina/avidina, cromóforo, marcador quimioluminiscente o similares. Tales marcadores se describen con más detalle a continuación.
Además, la invención contempla la preparación de kits de diagnóstico de VHC que comprenden los reactivos de inmunodiagnóstico descritos en el presente documento y puede incluir además instrucciones para el uso de los reactivos de inmunodiagnóstico en inmunoensayos para determinar la presencia de VHC en una muestra de prueba. Por ejemplo, el kit puede comprender instrucciones para analizar la muestra de prueba para el anticuerpo anti-VHC (por ejemplo, un anticuerpo anti-NS3h en la muestra de prueba) mediante inmunoensayo. Si bien ciertas realizaciones emplean inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes para analizar la muestra de prueba, debe entenderse que los antígenos y anticuerpos usados en los inmunoensayos de la presente divulgación pueden usarse en cualquier otro formato de inmunoensayo conocido por los expertos en la técnica para determinar la presencia de VHC en una muestra de prueba. Las instrucciones pueden estar en papel o en formato legible por ordenador, tal como un disco, CD, DVD o similar. Como alternativa o adicionalmente, el kit puede contener un calibrador o control, por ejemplo, anticuerpo anti-VHC o antígeno purificado y, opcionalmente liofilizado, y/o al menos un envase (por ejemplo, tubo, placas o tiras de microtitulación, que pueden estar ya recubiertos con uno o más de los componentes de captura (antígenos y/o anticuerpos) del inmunoensayo de combinación) para realizar el ensayo y/o un tampón, tal como un tampón de ensayo o un tampón de lavado, cualquiera de los cuales puede proporcionarse como una solución concentrada, una solución de sustrato para el marcador detectable (por ejemplo, un marcador enzimático) o una solución de parada. Preferentemente, el kit comprende todos los componentes, es decir, reactivos, patrones, tampones, diluyentes, etc., que son necesarios para realizar el ensayo. En realizaciones específicas, es preferente que todos los componentes se presenten individualmente en el kit de modo que el inmunoensayo pueda realizarse como un inmunoensayo de tipo captura sobre la marcha en el que el soporte sólido está recubierto con un agente que permite la unión del resto de captura (por ejemplo, un antígeno biotinilado o un anticuerpo biotinilado) y el kit comprende además cada uno de los pares de antígenos de captura y detección individuales y los anticuerpos de captura biotinilados en un envase y un segundo envase proporciona el conjugado de anticuerpos de detección. Las instrucciones para realizar el ensayo también pueden incluir instrucciones para generar una curva patrón o un patrón de referencia con el fin de cuantificar el anticuerpo anti-VHC.
Cualquier anticuerpo, que se proporciona en el kit o sistemas del presente documento, tales como anticuerpos anti-IgG y anticuerpos anti-IgM, también puede incorporar un marcador detectable, tal como un fluoróforo, fracción radiactiva, enzima, marcador de biotina/avidina, cromóforo, marcador quimioluminiscente o similares o el kit puede incluir reactivos para marcar los anticuerpos o reactivos para detectar los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de detección) y/o para marcar los analitos o reactivos para detectar el analito. Los anticuerpos, calibradores y/o controles pueden proporcionarse en envases separados o dispensados previamente en un formato de ensayo apropiado, por ejemplo, en placas de microtitulación. En una realización, se proporcionan dos envases. En el primer envase se proporciona al menos un primer, segundo y/o tercer pares de antígenos, donde el primer antígeno en cada par es un antígeno de captura de una proteína de VHC (por ejemplo, NS3h) dada que está biotinilada y el segundo antígeno en cada par es un antígeno de detección de la misma proteína que el primer antígeno pero está marcado con un marcador detectable (por ejemplo, está acridinilado) así como uno o más anticuerpos biotinilados diseñados para detectar uno o más antígenos de VHC de una muestra de prueba; y en el segundo envase se proporciona el anticuerpo que forma el compañero de conjugación para la detección del antígeno capturado por los anticuerpos biotinilados del primer envase. Se contempla que donde hay múltiples anticuerpos biotinilados en el primer envase, los múltiples anticuerpos que forman los compañeros de conjugación pueden estar presentes en un solo envase o en envases individuales para cada anticuerpo conjugado de detección de antígeno diferente.
En determinadas realizaciones, el kit incluye componentes de control de calidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad, calibradores y controles positivos). La preparación de reactivos de control de calidad es bien conocida en la técnica y se describe en hojas de inserción para una diversidad de productos de inmunodiagnóstico. Los miembros del panel de sensibilidad se utilizan opcionalmente para establecer las características de rendimiento del ensayo y de forma adicional opcionalmente son indicadores útiles de la integridad de los reactivos del kit de inmunoensayo y la estandarización de los ensayos.
Los kits también pueden incluir otros reactivos necesarios para realizar un ensayo de diagnóstico o facilitar evaluaciones de control de calidad, tales como tampones, sales, enzimas, cofactores enzimáticos, sustratos, reactivos de detección y similares. Otros componentes, tales como tampones y soluciones para el aislamiento y/o tratamiento de una muestra de prueba (por ejemplo, reactivos de pretratamiento), se pueden incluir también en el kit. El kit puede incluir adicionalmente uno o más controles diferentes. Uno o más de los componentes del kit pueden liofilizarse, en cuyo caso el kit puede comprender adicionalmente reactivos adecuados para la reconstitución de los componentes liofilizados.
Los diversos componentes del kit se pueden proporcionar en envases adecuados según sea necesario, por ejemplo, una placa de microtitulación. El kit puede incluir además envases para contener o almacenar una muestra (por ejemplo, un envase o cartucho para una muestra). Cuando sea apropiado, el kit opcionalmente también puede contener Recipientes de reacción, recipientes de mezcla y otros componentes que facilitan la preparación de reactivos o la muestra de prueba. El kit también puede incluir uno o más instrumentos para ayudar a obtener una muestra de prueba, tales como una jeringuilla, pipeta, fórceps, cuchara medidora o similares.
En determinadas realizaciones, el marcador detectable es al menos un compuesto de acridinio. En tales realizaciones, el kit puede comprender al menos una acridinio-9-carboxamida, al menos un éster arílico de acridinio-9-carboxilato o cualquier combinación de los mismos. Si el marcador detectable es al menos un compuesto de acridinio, el kit también puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno, tal como un tampón, solución y/o al menos una solución básica. Debe entenderse que, en el reactivo inmunodiagnóstico, los antígenos para la detección de anticuerpos pueden marcarse de manera detectable y cualquier anticuerpo proporcionado en el kit para su uso junto con dichos reactivos también puede marcarse de manera detectable.
En determinadas realizaciones, el kit puede contener una fase de soporte sólida, tal como una partícula magnética, perla, tubo de ensayo, placa de microtitulación, cubeta, membrana, molécula de andamio, película, papel de filtro, disco o microplaca.
La presente divulgación proporciona métodos de inmunoensayo para determinar la presencia, cantidad o concentración de anticuerpos anti-VHC o anticuerpos anti-VHC y antígenos del VHC en una muestra de prueba. Cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica puede usarse en dicho método siempre que dicho ensayo use uno o más de los antígenos para detectar anticuerpos del VHC. Los ejemplos de tales ensayos incluyen, pero sin limitación, inmunoensayo, tal como un inmunoensayo en sándwich (por ejemplo, inmunoensayos en sándwich monoclonal-policlonal, incluyendo la detección de radioisótopos (radioinmunoensayo (RIA)) y la detección de enzimas (inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA) (por ejemplo, Ensayos de ELISA Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, Minn.)), inmunoensayo de inhibición competitiva (por ejemplo, directo e inverso), inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA), técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT), transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) y ensayo quimioluminiscente homogéneo, etc.
En realizaciones particulares, los antígenos recombinantes (por ejemplo, antígenos NS3h) pueden usarse como reactivos de captura (por ejemplo, mediante el uso de dichos antígenos en los que el terminal amino o carboxi del antígeno comprende una etiqueta de biotina) o como reactivos de detección (conjugados) en los que los antígenos
están directa o indirectamente marcados con acridinio. El mareaje indirecto puede emplear el uso de BSA acridinilada covalentemente acoplada al tiol libre de restos de cisteína no apareados dentro de una proteína a través de un enlazador de tipo SMCC. Para facilitar tal marcaje indirecto, algunos de los antígenos usados en los inmunoensayos de la presente divulgación pueden además modificarse fácilmente para incluir restos de cisteína adicionales en el extremo C-terminal.
Típicamente, los inmunoensayos se realizan en formato de 1 o 2 etapas. Los reactivos en fase sólida para la captura de complejos inmunitarios formados en solución en el ensayo de 1 etapa incluyen, por ejemplo, anticuerpo monoclonal anti-biotina, estreptavidina o neutravidina para capturar el resto biotinilado (por ejemplo, un antígeno biotinilado para la captura de un anticuerpo del VHC).
En un inmunoensayo basado en SELDI, un reactivo de captura que se une específicamente al anticuerpo anti-VHC o un antígeno del VHC está unido a la superficie de una sonda de espectrometría de masas, tales como una matriz de chips de proteínas preactivadas. El anticuerpo anti-VHC o el antígeno, a continuación, se captura específicamente en el biochip, y el resto capturado se detecta por espectrometria de masas. Como alternativa, el anticuerpo anti-VHC puede eluirse del reactivo de captura y detectarse mediante MALDI tradicional (desorción/ionización láser asistida por matriz) o mediante SELDI. Un inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes, en particular, uno que emplea el analizador automatizado ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, I11.), es un ejemplo de un inmunoensayo particular en el que se puede emplear fácilmente una combinación de múltiples antígenos (preferentemente dos o más antígenos NS3h). Un ensayo de aglutinación, tal como un ensayo de hemaglutinación pasiva, también puede usarse. En un ensayo de aglutinación se detecta una reacción de antígeno-anticuerpo por aglutinación o aglomeración. En un ensayo de hemaglutinación pasiva, los eritrocitos se recubren con el antígeno y los eritrocitos recubiertos se usan en el ensayo de aglutinación.
Los métodos conocidos en la técnica para recoger, manipular y procesar orina, sangre, suero y plasma y otros fluidos corporales se usan en la práctica de la presente divulgación, por ejemplo, cuando los reactivos de inmunodiagnóstico comprenden múltiples antígenos y/o en un kit de inmunoensayo de anticuerpos anti-VHC. La muestra de prueba puede comprender restos adicionales además del polipéptido de interés, tales como anticuerpos, antígenos, haptenos, hormonas, fármacos, enzimas, receptores, proteínas, péptidos, polipéptidos, oligonucleótidos o polinucleótidos. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre entera obtenida de un sujeto. Puede ser necesario o deseado que una muestra de prueba, particularmente sangre entera, se trate antes del inmunoensayo como se describe en el presente documento, por ejemplo, con un reactivo de pretratamiento. Incluso en los casos en que no es necesario el pretratamiento (por ejemplo, la mayoría de las muestras de orina), el pretratamiento opcionalmente puede hacerse por simple conveniencia (por ejemplo, como parte de un régimen en una plataforma comercial).
El reactivo de pretratamiento puede ser cualquier reactivo apropiado para su uso con los inmunoensayos y kits descritos en el presente documento. El pretratamiento opcionalmente comprende: (a) uno o más disolventes (por ejemplo, metanol y etilenglicol) y sal, (b) uno o más disolventes, sal y detergente, (c) detergente o (d) detergente y sal. Los reactivos de pretratamiento son conocidos en la técnica y dicho pretratamiento puede emplearse, por ejemplo, como se usa para los ensayos en Abbott TDx, analizadores AxSYM® y ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill.), como se describe en la bibliografía (véanse, por ejemplo, Yatscoff et al., Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990) y Wallemacq et al., Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1999)) y/o como está disponible en el mercado. Adicionalmente, el pretratamiento puede realizarse como se describe en la patente de Estados Unidos de Abbott n.° 5.135.875, publicación de patente europea n.° 0 471293, solicitud de patente provisional de Estados Unidos 60/878.017, presentada el 29 de diciembre de 2006 y publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2008/0020401. El reactivo de pretratamiento puede ser un agente heterogéneo o un agente homogéneo.
Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo, el reactivo de pretratamiento precipita la proteína de unión al analito (por ejemplo, proteína que puede unirse al anticuerpo anti-VHC o un antígeno que puede unirse al anticuerpo anti-VHC del presente documento en la muestra). Tal etapa de pretratamiento comprende eliminar cualquier proteína de unión a analito separando de la proteína de unión a analito precipitada el sobrenadante de la mezcla formada por la adición del agente de pretratamiento a la muestra. En tal ensayo, el sobrenadante de la mezcla en ausencia de cualquier proteína de unión se usa en el ensayo, procediendo directamente a la etapa de captura de anticuerpos.
Con el uso de un reactivo de pretratamiento homogéneo no existe tal etapa de separación. La mezcla completa de la muestra de prueba y el reactivo de pretratamiento se ponen en contacto con un compañero de unión específica marcado para el anticuerpo anti-VHC (es decir, un antígeno) o el compañero de unión específica marcado para el antígeno de VHC (es decir, un anticuerpo). El reactivo de pretratamiento empleado para tal ensayo típicamente se diluye en la mezcla de muestra de prueba pretratada, ya sea antes o durante la captura por el primer compañero de unión específica. A pesar de tal dilución, una cierta cantidad del reactivo de pretratamiento (por ejemplo, metanol 5 M y/o 0,6 metilenglicol) todavía está presente (o permanece) en la mezcla de muestra de prueba durante la captura.
En un formato heterogéneo, después de obtenerse la muestra de un sujeto, se prepara una primera mezcla. La mezcla contiene la muestra de prueba que se está evaluando para los anticuerpos anti-VHC y un primer compañero de unión de captura específico, donde el primer compañero de unión de captura específica y cualquier anticuerpo anti-VHC contenido en la muestra de prueba forman un primer complejo de anticuerpo de compañero de unión de captura específica-anti-VHC. El primer compañero de unión de captura específica puede ser un antígeno NS3. Asimismo, en los ensayos proporcionados en el presente documento de combinación de la invención, la mezcla también puede contener un segundo y tercer compañero de unión de captura específica y estos segundo y tercero compañeros de unión de captura específica forman complejos de compañero de unión-anticuerpo anti-VHC con los anticuerpos anti-VHC que están presentes en la muestra de prueba. Dichos segundos, tercero y cuarto antígenos pueden ser uno o más de al menos un antígeno del VHC seleccionado del grupo que consiste en el antígeno del núcleo, NS3, NS4, NS5 y porciones del mismo.
Además de los inmunoensayos, además de incluir al menos dos antígenos de captura NS3h como se ha indicado anteriormente, puede incluir al menos un anticuerpo de captura anti-VHC que formará un complejo específico con un cuarto compañero de unión específica que se encuentra en la muestra de prueba (es decir, un antígeno o proteína del VHC que se encuentra en la muestra de prueba) para formar un complejo anticuerpo anti-VHC-tercer o cuarto compañero de unión específica con el cuarto antígeno que está presente en la muestra de prueba. En determinadas realizaciones, este compañero de unión específica es uno que detecta el antígeno del núcleo en una muestra de prueba y, por lo tanto, el par de unión es un anticuerpo anti-núcleo para la detección del antígeno (núcleo) en la muestra de prueba.
El orden en que se añaden la muestra de prueba y los diversos compañeros de unión específica para formar la mezcla puede variar. En algunas realizaciones, el primero, segundo, tercero, etc. compañeros de unión de captura específica (es decir, antígenos) y cualquier anticuerpo de captura anti-VHC se inmovilizan en una fase sólida. En todavía otras realizaciones, ninguno de estos componentes está inmovilizado, sino que se añade al mismo tiempo a la muestra de prueba para efectuar la captura en la fase sólida. La fase sólida utilizada en el inmunoensayo puede ser cualquier fase sólida conocida en la técnica, tales como, pero sin limitación, una partícula magnética, una perla, un tubo de ensayo, una placa de microtitulación, una cubeta, una membrana, una molécula de andamio, una película, un papel de filtro, un disco y una microplaca.
Después de que se forman los inmunocomplejos entre los compañeros de unión de captura específica y sus respectivos anticuerpos anti-VHC encontrados en la muestra de prueba y cualquier anticuerpo de captura anti-VHC (por ejemplo, anti-núcleo) y sus respectivos antígenos de VHC o proteínas de VHC encontrados en la prueba muestra, cualquier anticuerpo anti-VHC no unido o antígeno/proteína del VHC se retira del complejo usando cualquier técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo o antígeno anti-VHC no unido puede retirarse mediante lavado. Deseablemente, sin embargo, los compañeros de unión específica y cualquier anticuerpo anti-VHC están presentes en exceso de cualquier anticuerpo anti-VHC y antígenos, respectivamente presentes en la muestra de prueba, de manera que todos los anticuerpos anti-VHC y antígenos que están presentes en la muestra de prueba se unan al compañero de unión específica y cualquier anticuerpo de captura anti-VHC, respectivamente.
Después de retirar cualquier anticuerpo anti-VHC y antígeno no unido, la detección se logra mediante la adición de un primer compañero de unión de detección específica (por ejemplo, conjugado) a la mezcla para formar un primer complejo de compañero de unión de captura específica-anticuerpo anti-VHC-primer compañero de unión de detección específica. El primer compañero de unión de detección específica puede ser un antígeno marcado (por ejemplo, antígeno NS3h) o un anticuerpo anti-IgG o un anticuerpo anti-IgM. Por otra parte, el primer compañero de unión de detección específica puede estar marcado o contener un marcador detectable como se ha descrito anteriormente.
Cualquier marcador detectable adecuado como se conoce en la técnica puede usarse como cualquiera o más de los marcadores detectables. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador radiactivo (tal como 3H, 1251,35S, 14C, 32P y 33P), un marcador enzimático (tales como peroxidasa de rábano picante, peroxidasa alcalina, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y similares), un marcador quimioluminiscente (tal como ésteres de acridinio, tioésteres o sulfonamidas; luminol, isoluminol, ésteres de fenantridinio y similares), un marcador fluorescente (tal como fluoresceína (por ejemplo, 5-fluoresceína, 6-carboxifluoresceína, 3'6-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína y similares)), rodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, puntos cuánticos (por ejemplo, seleniuro de cadmio con capuchón de sulfuro de cinc), un marcador termométrico o un marcador de reacción en cadena de inmunopolimerasa. Una introducción a los marcadores, los procedimientos de marcaje y la detección de marcadores se encuentra en Polak y Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2a ed., Springer Verlag, N.Y. (1997) y en Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), que es un manual combinado y un catálogo publicado por Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg. Puede usarse un marcador fluorescente en FPIA (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.593.896, 5.573.904, 5,496.925, 5.359.093 y 5.352.803).
Puede usarse un compuesto de acridinio como marcador detectable en un ensayo quimioluminiscente homogéneo (véanse, por ejemplo, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004); y Adamczyk
et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003)).
Un compuesto de acridinio de ejemplo es una acridinio-9-carboxamida. Los métodos para preparar acridinio 9-carboxamidas se describen en Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1: 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000); Mattingly et al., En Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton, págs. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003); y las patentes de Estados Unidos n.° 5.468.646, 5.543.524 y 5.783.699).
Otro compuesto de acridinio de ejemplo es un éster arílico de acridinio-9-carboxilato. Un ejemplo de un éster arílico de acridinio-9-carboxilato de fórmula II es fluorofosfonato de 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridinio (disponible de Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich.). Los métodos para preparar ésteres arílicos de 9-carboxilato de acridinio se describen en McCapra et al., Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15: 239-244 (2000); y la patente de EE.UU. N.° 5.241.070). Dichos ésteres arílicos de acridinio-9-carboxilato son indicadores quimioluminiscentes eficientes para el peróxido de hidrógeno producido en la oxidación de un analito por al menos una oxidasa en términos de la intensidad de la señal y/o la rapidez de la señal. El transcurso de la emisión quimioluminiscente para el éster arílico de acridinio-9-carboxilato se completa rápidamente, es decir, en menos de 1 segundo, mientras que la emisión quimioluminiscente de la acridinio-9-carboxamida se prolonga a lo largo de 2 segundos. El éster arílico de acridinio-9-carboxilato, sin embargo, pierde sus propiedades quimioluminiscentes en presencia de proteínas. Por lo tanto, su uso requiere la ausencia de proteínas durante la generación y detección de señales. Los expertos en la técnica conocen bien métodos para separar o retirar proteínas en la muestra e incluyen, pero sin limitación, ultrafiltración, extracción, precipitación, diálisis, cromatografía y/o digestión (véase, por ejemplo, Wells, High Throughput Bioanalytical Sample Preparation. Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003)). La cantidad de proteína retirada o separada de la muestra de prueba puede ser de aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. Se exponen detalles adicionales con respecto al éster arílico de acridinio-9-carboxilato y su uso en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 11/697.835, presentada el 9 de abril de 2007 y publicada el 9 de octubre de 2008, como la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2008/0248493. Los ésteres arílicos de acridinio-9-carboxilato pueden disolverse en cualquier disolvente adecuado, tales como N,N-dimetilformamida anhidra desgasificada (DMF) o colato de sodio acuoso.
Pueden llevarse a cabo ensayos quimioluminiscentes de acuerdo con los métodos descritos en Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006). Si bien puede usarse cualquier formato de ensayo adecuado, un quimioluminómetro de microplaca (Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S.A., LLC, Oak Ridge, Tenn.) permite analizar múltiples muestras de pequeños volúmenes rápidamente. El quimioluminómetro puede equiparse con inyectores de reactivos múltiples utilizando microplacas de poliestireno negro de 96 pocillos (Costar n.° 3792). Cada muestra puede añadirse a un pocillo separado, seguido de la adición simultánea/secuencial de otros reactivos según lo determinado por el tipo de ensayo empleado. Deseablemente, se evita la formación de pseudobases en soluciones neutras o básicas que emplean un éster arílico de acridinio, tal como por acidificación. La respuesta quimioluminiscente se registra después pocillo a pocillo. En este sentido, el tiempo para registrar la respuesta quimioluminiscente dependerá, en parte, del retraso entre la adición de los reactivos y el acridinio particular empleado.
Puede generarse peróxido de hidrógeno in situ en la mezcla o proporcionarse o suministrarse a la mezcla antes, simultáneamente o después de la adición de un compuesto de acridinio descrito anteriormente. Puede generarse peróxido de hidrógeno in situ de varias maneras, como será evidente para un experto en la técnica. Como alternativa, puede añadirse simplemente una fuente de peróxido de hidrógeno a la mezcla. Por ejemplo, la fuente del peróxido de hidrógeno puede ser uno o más tampones u otras soluciones que se sabe que contienen peróxido de hidrógeno. En este sentido, puede simplemente añadirse una solución de peróxido de hidrógeno. Tras la adición simultánea o posterior de al menos una solución básica a la muestra, se genera una señal detectable, concretamente, una señal quimioluminiscente, indicativa de la presencia de anticuerpos anti-VHC (cuando la captura es con un antígeno) o antígeno (cuando la captura es con un anticuerpo). La solución básica contiene al menos una base y tiene un pH mayor o igual a 10, preferentemente, mayor o igual a 12. Los ejemplos de soluciones básicas incluyen, pero sin limitación, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido amónico, hidróxido de magnesio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio y bicarbonato de calcio. La cantidad de solución básica añadida a la muestra depende de la concentración de la solución básica. Basándose en la concentración de la solución básica usada, un experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de solución básica para añadir a la muestra.
La señal quimioluminiscente que se genera puede detectarse usando técnicas de rutina conocidas por los expertos en la materia. Basándose en la intensidad de la señal generada, puede cuantificarse la cantidad de antígeno y/o anticuerpo anti-VHC en la muestra. Específicamente, la cantidad de anticuerpo anti-VHC y/o en la muestra es proporcional a la intensidad de la señal generada. La cantidad de antígeno y/o anticuerpo anti-VHC presente puede
cuantificarse comparando la cantidad de luz generada con una curva patrón para el antígeno y/o anticuerpo anti-VHC o por comparación con un patrón de referencia. La curva patrón puede generarse usando diluciones en serie o soluciones de concentraciones conocidas de anticuerpo anti-VHC por espectroscopia de masas, métodos gravimétricos y otras técnicas conocidas en la técnica.
Los inmunoensayos de antígeno y/o anticuerpos anti-VHC pueden realizarse usando cualquier formato adecuado conocido en la técnica. En términos generales, en determinadas realizaciones, una muestra que se está probando (por ejemplo, si se sospecha que contiene) para anticuerpos anti-VHC puede ponerse en contacto con un antígeno de captura y al menos un anticuerpo conjugado de detección, peptídico o conjugado (que puede ser un segundo anticuerpo de detección o un tercer anticuerpo de detección), tales como los anticuerpos anti-IgG y anti-IgM marcados, ya sea simultánea o secuencialmente y en cualquier orden. De manera similar, la prueba de presencia de un antígeno puede ponerse en contacto con un anticuerpo capturado que se une al antígeno en la muestra de prueba y el antígeno unido puede detectarse por un anticuerpo de detección.
Por ejemplo, la muestra de prueba puede ponerse en contacto primero con al menos dos antígenos de captura NS3h y, después, (secuencialmente) con al menos un anticuerpo de detección. Como alternativa, la muestra de prueba puede ponerse en contacto primero con al menos un anticuerpo de detección y después (secuencialmente) con al menos dos antígenos de captura NS3h. En otra alternativa más, la muestra de prueba puede ponerse en contacto simultáneamente con un antígeno de captura y un anticuerpo de detección. En el formato de ensayo de tipo sándwich, una muestra sospechosa de contener anticuerpos anti-VHC (o un fragmento de los mismos) se pone primero en contacto con al menos dos antígenos de captura NS3h en condiciones que permiten la formación de un primer complejo antígeno de captura/anticuerpo anti-VHC y un segundo complejo de antígeno/anticuerpo anti-VHC. En ciertos ensayos, lo mismo se repite o se realiza simultáneamente con un segundo, tercero o más antígenos de captura. En un ensayo de tipo sándwich, los antígenos) preferentemente, los al menos dos antígenos de captura NS3h se utilizan en cantidades molares en exceso de la cantidad máxima de anticuerpos anti-VHC esperados en la muestra de prueba. Por ejemplo, pueden usarse de aproximadamente 5 ug a aproximadamente 1 mg de antígeno por ml de tampón (por ejemplo, tampón de recubrimiento de micropartículas).
Los inmunoensayos de inhibición competitiva, que a menudo se usan para medir analitos pequeños, comprenden formatos secuenciales y clásicos. En un inmunoensayo de inhibición competitiva secuencial, al menos uno o al menos dos antígenos de captura NS3h se recubren sobre un pocillo de una placa de microtitulación. Cuando la muestra que contiene el anticuerpo/anticuerpos de interés se añade al pocillo, el anticuerpo de interés se une a los antígenos de captura. Tras el lavado, se añade al pocillo una cantidad conocida de anticuerpo marcado (por ejemplo, biotina o peroxidasa de rábano picante (HRP). Un sustrato para un marcador enzimático es necesario para generar una señal. Un ejemplo de un sustrato adecuado para HRP es 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). Tras el lavado, la señal generada por el anticuerpo marcado se mide y es inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpo en la muestra. En un clásico inmunoensayo de inhibición competitiva, el antígeno para un anticuerpo de interés se recubre sobre un pocillo de una placa de microtitulación. Sin embargo, a diferencia del inmunoensayo de inhibición competitiva secuencial, la muestra que contiene el anticuerpo de interés (es decir, un anticuerpo anti-VHC) y el anticuerpo marcado se añaden al pocillo al mismo. Cualquier anticuerpo en la muestra compite con el anticuerpo marcado para unirse al antígeno de captura. Tras el lavado, la señal generada por el analito marcado se mide y es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra.
En otras realizaciones, antes de poner en contacto la muestra de prueba con el al menos dos antígenos de captura NS3h, los antígenos de captura se pueden unir a un soporte sólido, que facilita la separación del primer y segundo complejos antígeno/anticuerpo anti-VHC de la muestra de prueba. El sustrato al que se unen los antígenos de captura puede ser cualquier soporte sólido adecuado o fase sólida que facilite la separación del complejo de antígeno de captura-anticuerpo anti-VHC de la muestra. Los ejemplos incluyen un pocillo de una placa, tal como una placa de microtitulación, un tubo de ensayo, un gel poroso (por ejemplo, gel de sílice, agarosa, dextrano o gelatina), una película polimérica (por ejemplo, poliacrilamida), perlas (por ejemplo, perlas de poliestireno o perlas magnéticas), una tira de filtro/membrana (por ejemplo, nitrocelulosa o nilón), micropartículas (por ejemplo, partículas de látex, micropartículas magnetizables (por ejemplo, micropartículas que tienen núcleos de óxido férrico u óxido de cromo y capas homopoliméricas o heteropoliméricas y radios de aproximadamente 1-10 micrómetros). El sustrato puede comprender un material poroso adecuado con una afinidad superficial adecuada para unir antígenos y suficiente porosidad para permitir el acceso mediante anticuerpos de detección. Generalmente se prefiere un material microporoso, aunque puede usarse un material gelatinoso en estado hidratado. Tales sustratos porosos están, preferentemente, en forma de láminas que tienen un espesor de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 mm, preferentemente aproximadamente 0,1 mm. Aunque el tamaño de poro puede variar bastante, preferentemente, el tamaño de poro es de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 15 micrómetros, más preferentemente de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 15 micrómetros. La superficie de tales sustratos puede activarse mediante procesos químicos que provocan la unión covalente de un anticuerpo al sustrato. La unión irreversible, generalmente por adsorción a través de fuerzas hidrófobas, del antígeno al sustrato da como resultado; como alternativa, puede usarse un agente de acoplamiento químico u otro medio para unir covalentemente el antígeno al sustrato, siempre que dicha unión no interfiera con la capacidad del antígeno para unirse a los anticuerpos anti-VHC.
En otras realizaciones, los anticuerpos anti-VHC de la muestra de prueba pueden unirse a micropartículas, que se han recubierto previamente con antígeno. Si se desea, uno o más reactivos de captura, tal como uno o más o dos o más antígenos NS3h como se describe en el presente documento, cada uno de los cuales puede estar unido por un anticuerpo anti-VHC, puede unirse a fases sólidas en diferentes ubicaciones físicas o direccionables (por ejemplo, tal como en una configuración de biochip (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.225.047, la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 99/51773; la patente de Estados Unidos n.° 6.329.209; la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 00/56934 y la patente de Estados Unidos n.° 5.242.828). Si los reactivos de captura están unidos a una sonda de espectrometria de masas como soporte sólido, la cantidad de anticuerpos anti-VHC unidos a la sonda puede detectarse mediante espectrometria de masas por ionización por desorción láser. Como alternativa, una sola columna puede empaquetarse con diferentes perlas, que se derivatizan con uno o más reactivos de captura, capturando de esta manera el anticuerpo anti-VHC en un solo lugar (véase, anticuerpo derivatizado, tecnologías basadas en perlas, por ejemplo, la tecnología xMAP de Luminex (Austin, Tex.)).
En determinadas realizaciones, después de que la muestra de prueba que se está analizando para detectar anticuerpos anti-VHC se ponga en contacto con al menos dos antígenos NS3h, la mezcla se incuba para permitir la formación de un primer y segundo complejos de antígeno-anticuerpo anti-VHC. La incubación se puede llevar a cabo, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 10,0, a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 45 °C, y durante un período de al menos aproximadamente un (1) minuto a aproximadamente dieciocho (18) horas o de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 minutos o durante aproximadamente 4 a aproximadamente 18 minutos.
En determinadas realizaciones, se emplea al menos un anticuerpo de detección y contiene un marcador detectable. El marcador detectable puede unirse al menos a un anticuerpo de detección antes de, simultáneamente con, o después de la formación del (primer o múltiple) complejo de antígeno captura/anticuerpo anti-VHC/anticuerpo de detección (segundo o múltiple). Puede usarse cualquier marcador detectable conocido en la técnica (véase la discusión anterior, incluyendo Polak y Van Noorden (1997) y Haugland (1996)). El marcador detectable puede unirse a los anticuerpos (o antígenos que pueden comprender marcadores detectables) directamente o a través de un agente de acoplamiento. Un ejemplo de un agente de acoplamiento que puede usarse es EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil}carbodiimida, clorhidrato), que está comercializado por Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo. Otros agentes de acoplamiento que pueden usarse son conocidos en la técnica. Los métodos para unir un marcador detectable a un anticuerpo son conocidos en la técnica. Adicionalmente, pueden comprarse o sintetizarse muchos marcadores detectables que ya contienen grupos terminales que facilitan el acoplamiento del marcador detectable al anticuerpo, tal como CpSP-éster de acridinio (es decir, 9-[N-tosil-N-(3-carboxipropil)]-10-(3-sulfopropil)acridinio carboxamida) o SPSP-éster de acridinio (es decir, N10-(3-sulfopropil)-N-(3-sulfopropil)-acridinio-9-carboxamida).
El primero y segundo (o más) complejo de antígeno de captura/anticuerpo anti-VHC/antígeno conjugado marcado puede, pero no tiene por qué, separarse del resto de la muestra de prueba antes de la cuantificación del marcador. Por ejemplo, si los antígenos de captura están unidos a un soporte sólido, tales como un pocillo o una perla, la separación puede lograrse retirando el fluido (de la muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. Como alternativa, si los antígenos de captura están unidos a un soporte sólido, puede ponerse en contacto simultáneamente con la muestra que contiene el anticuerpo anti-VHC y un péptido conjugado marcado para formar un complejo, seguido de la retirada del fluido (muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. Si los antígenos de captura no están unidos a un soporte sólido, entonces, no es necesario eliminar el complejo de la muestra de prueba para cuantificar la cantidad del marcador.
Después de la formación de los complejos de detección (por ejemplo, antígeno de captura/anticuerpo objeto/antígeno conjugado marcado), la cantidad de marcador en el complejo se puede cuantificar usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, si se usa un marcador enzimático, el complejo marcado se hace reaccionar con un sustrato para el marcador que da una reacción cuantificable, tal como el desarrollo del color. Si el marcador es un marcador radiactivo, el marcador se cuantifica usando un contador de centelleo. Si el marcador es un marcador fluorescente, el marcador se cuantifica estimulando el marcador con una luz de un color (que se conoce como "longitud de onda de excitación") y detectando otro color (que se conoce como "longitud de onda de emisión") que emite el marcador en respuesta al estímulo. Si el marcador es un marcador quimioluminiscente, el marcador se cuantifica detectando la luz emitida visualmente o usando luminómetros, película de rayos x, película fotográfica de alta velocidad, una cámara CCD, etc. Una vez que se ha cuantificado la cantidad del marcador en el complejo, se determina la concentración de anticuerpo anti-VHC o antígeno en la muestra de prueba, por ejemplo, mediante el uso de una curva estándar que se ha generado utilizando diluciones en serie de anticuerpos anti-VHC o antígenos de concentración conocida. Aparte de usar diluciones en serie de anticuerpos anti-VHC o antígenos del VHC, la curva patrón puede generarse gravimétricamente, por espectroscopia de masas y por otras técnicas conocidas en la técnica.
En un ensayo de micropartículas quimioluminiscentes que emplea el analizador ARCHITECT®, el pH del diluyente conjugado debe ser aproximadamente 6,0+/-0,2, el tampón de recubrimiento de micropartículas debe mantenerse a temperatura ambiente (es decir, de aproximadamente 17 a aproximadamente 27 °C), el pH del tampón de recubrimiento de micropartículas debe ser aproximadamente 6,5+/-0,2 y el pH del diluyente de micropartículas debe ser aproximadamente 6,5+/-0,2. Los sólidos son, preferentemente, menos de aproximadamente el 0,2 %, tal como
menos de aproximadamente el 0,15%, menos de aproximadamente el 0,14%, menos de aproximadamente el 0,13 %, menos de aproximadamente el 0,12 % o menos de aproximadamente el 0,11 %, tal como aproximadamente el 0,10%.
Pueden usarse anticuerpos anti-VHC comercialmente disponibles, así como anticuerpos anti-IgG y anti-IgM en los métodos de ensayo y kits de los mismos. Los anticuerpos disponibles comercialmente incluyen los disponibles en Abnova (Walnut, Calif., y Taiwan) y GenWay Biotech, Inc. (San Diego, California). Véase, también, la solicitud de patente europea EP2099825 A2 relativa a la preparación de anticuerpos anti-VHC. Puede usarse cualquier composición de control adecuada en los inmunoensayos de anticuerpos anti-VHC y de antígenos del VHC. La composición de control generalmente comprende anticuerpos anti-VHC y antígenos conocidos y cualquier aditivo deseable.
En general, puede emplearse un nivel predeterminado como valor de referencia frente al que se evalúan los resultados obtenidos tras analizar una muestra de prueba para anticuerpos anti-VHC. En general, al hacer dicha comparación, el nivel predeterminado se obtiene ejecutando un ensayo en particular un número suficiente de veces y en condiciones apropiadas de manera que se pueda establecer una vinculación o asociación de presencia de analito, cantidad o concentración con una etapa particular o criterio de valoración de una enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, preeclampsia o enfermedad cardiovascular) o con indicios particulares. Típicamente, el nivel predeterminado se obtiene con ensayos de sujetos de referencia (o poblaciones de sujetos).
En particular, con respecto a un nivel predeterminado como se emplea para controlar la progresión y/o tratamiento de la enfermedad, la cantidad o concentración de anticuerpos anti-VHC puede permanecer "sin cambios", "favorable" (o "alterada favorablemente") o "desfavorable" (o "alterada desfavorablemente"). "Elevada" o "aumentada" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es mayor que un intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado) o es mayor que otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra anterior o basal). El término "disminuida" o "reducida" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es menor que un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado) o es menor que otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra anterior o basal). El término "alterada" se refiere a una cantidad o a una concentración en una muestra que está alterada (aumentada o reducida) frente a un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado) o frente a otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra anterior o basal).
El nivel o intervalo típico o normal para anticuerpos anti-VHC o antígenos del VHC se define de acuerdo con la práctica convencional. Debido a que los niveles de anticuerpos anti-VHC y/o antígenos del VHC en algunos casos serán muy bajos, se puede considerar que se ha producido un denominado nivel alterado o alteración cuando hay algún cambio neto en comparación con el nivel o intervalo típico o normal, o el nivel o intervalo de referencia, que no se puede explicar por error experimental o variación de la muestra. Por tanto, se comparará el nivel medido en una muestra particular con el nivel o intervalo de niveles determinados en muestras similares en un sujeto denominado normal. En este contexto, un "sujeto normal" es un individuo sin hepatitis detectable, por ejemplo, y un paciente o población "normal" (a veces denominado "control") es uno(s) que no presenta hepatitis detectable, por ejemplo. Adicionalmente, dado que los anticuerpos anti-VHC y los antígenos del VHC no se encuentran habitualmente en un nivel elevado en la mayoría de la población humana, un "sujeto normal" puede considerarse un individuo sin una cantidad o concentración aumentada o elevada sustancialmente detectable de anticuerpos anti-VHC o antígenos del VHC, y un paciente o población "normal" (a veces denominado "control") es uno(s) que no exhiba una cantidad o concentración aumentada o elevada sustancialmente detectable de anticuerpos anti-VHC. Un "sujeto aparentemente normal" es aquel en el que los anticuerpos anti-VHC o el antígeno del VHC no se han evaluado o se están evaluando. Se dice que el nivel de un analito es "elevado" cuando el analito es normalmente indetectable (por ejemplo, el nivel normal es cero o dentro de un intervalo de aproximadamente el percentil 25 a aproximadamente al percentil 75 de poblaciones normales), pero se detecta en una muestra de prueba, así como cuando el analito está presente en la muestra de prueba a un nivel superior al nivel normal. Por tanto, entre otros, la divulgación proporciona un método para explorar a un sujeto que tiene o se encuentra en riesgo de tener, hepatitis, por ejemplo, como se define en el presente documento.
En consecuencia, los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse para determinar si un sujeto padece hepatitis o se encuentra en riesgo de desarrollarla. Específicamente, dicho método puede comprender las etapas de: (a) determinar la concentración o cantidad en una muestra de prueba de un sujeto de anticuerpos anti-VHC (por ejemplo, usando los métodos descritos en el presente documento); y (b) comparar la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC determinada en la etapa (a) con un nivel predeterminado, donde, en caso de que la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC y/o antígenos del VHC determinada en la etapa (a) sea favorable con respecto a un nivel predeterminado, entonces, se determina que el sujeto no tiene o no corre riesgo de contraer hepatitis. Sin embargo, en caso de que la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC de la etapa (a) sea desfavorable con respecto al nivel predeterminado, entonces, se determina que el sujeto tiene o está en riesgo de contraer hepatitis.
En determinadas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para monitorizar el tratamiento en un sujeto que recibe tratamiento con una o más composiciones farmacéuticas. Específicamente,
dichos métodos implican proporcionar una primera muestra de prueba de un sujeto antes de que se le haya administrado al sujeto una o más composiciones farmacéuticas. A continuación, se determina la concentración o cantidad en una primera muestra de prueba de un sujeto de anticuerpos anti-VHC (y opcionalmente antígenos del VHC) (por ejemplo, usando al menos uno o al menos dos métodos de péptido de captura NS3h descritos en el presente documento). Después de determinar la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC, opcionalmente, a continuación se compara la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC con un nivel predeterminado. En caso de que la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC determinada en la primera muestra de prueba sea menor que el nivel predeterminado, no se trata al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas. Sin embargo, en caso de que la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC determinada en la primera muestra de prueba sea mayor que el nivel predeterminado, se trata al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo. El periodo de tiempo durante el que se trata al sujeto las una o más composiciones farmacéuticas puede determinarlo un experto en la técnica (por ejemplo, el periodo de tiempo puede ser de aproximadamente siete (7) días a aproximadamente dos años, preferentemente de aproximadamente catorce (14) días a aproximadamente un (1) año).
Durante el transcurso del tratamiento con las una o más composiciones farmacéuticas, a continuación se obtienen del sujeto las muestras de prueba segunda y posteriores. El número de muestras de prueba y el tiempo en que se obtienen dichas muestras de prueba del sujeto no son críticos. Por ejemplo, se puede obtener una segunda muestra de prueba siete (7) días después de que se administre al sujeto por primera vez las una o más composiciones farmacéuticas, una tercera muestra de prueba podría obtenerse dos (2) semanas después de que se administre al sujeto por primera vez las una o más composiciones farmacéuticas, se podría obtener una cuarta muestra de prueba tres (3) semanas después de que se administre al sujeto por primera vez las una o más composiciones farmacéuticas, se podría obtener una quinta muestra de prueba cuatro (4) semanas después de que se administre al sujeto por primera vez las una o más composiciones farmacéuticas, etc.
Después de obtener cada segunda o posterior muestra de prueba del sujeto, la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC (y opcionalmente antígenos de VHC) se determina en la segunda o posterior muestra de prueba. Después, se compara la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC y/o antígenos del VHC determinada en cada una de las segundas y posteriores muestras de prueba con la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC y/o antígenos del VHC determinada en la primera muestra de prueba (por ejemplo, la muestra de prueba que se comparó opcionalmente inicialmente con el nivel predeterminado). Si la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC y/o antígenos del VHC según se determina en la etapa (c) es favorable cuando se compara con la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC y/o antígenos del v Hc según se determina en la etapa (a), a continuación, se determina que la enfermedad en el sujeto se ha interrumpido, remitido o mejorado y el sujeto debe continuar con la administración de las una o más composiciones farmacéuticas de la etapa (b). Sin embargo, en caso de que la concentración o cantidad determinada en la etapa (c) no haya cambiado o sea desfavorable cuando se compara con la concentración o cantidad de anticuerpos anti-VHC y/o antígenos del VHC determinada en la etapa (a), a continuación, se determina que la enfermedad en el sujeto ha continuado, progresado o empeorado y el sujeto debe tratarse con una mayor concentración de las una o más composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en la etapa (b) o se debe tratar al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas que son diferentes de las una o más composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en la etapa (b). Específicamente, puede tratarse al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas que son diferentes de las una o más composiciones farmacéuticas que ha recibido el sujeto anteriormente para reducir o aminorar el nivel de anticuerpos anti-VHC y/o antígenos del VHC de dicho sujeto.
En general, para los ensayos en los que pueden efectuarse ensayos repetidos (por ejemplo, supervisión de la progresión de la enfermedad y/o de la respuesta al tratamiento), se obtiene una segunda o posterior muestra en un periodo en el tiempo después de que se haya obtenido la primera muestra de prueba del sujeto. Específicamente, puede obtenerse una segunda muestra de prueba del sujeto minutos, horas, días, semanas o años después de que se haya obtenido la primera muestra de prueba del sujeto. Por ejemplo, puede obtenerse la segunda muestra de prueba del sujeto en un periodo de tiempo de aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas,
aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1,5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2,5 años, aproximadamente 3,0 años, aproximadamente 3,5 años, aproximadamente 4,0 años, aproximadamente 4,5 años, aproximadamente 5,0 años, aproximadamente 5,5. años, aproximadamente 6,0 años, aproximadamente 6,5 años, aproximadamente 7,0 años, aproximadamente 7,5 años, aproximadamente 8,0 años, aproximadamente 8,5 años, aproximadamente 9,0 años, aproximadamente 9,5 años o aproximadamente 10,0 años después de que se obtenga la primera muestra de prueba del sujeto. Cuando se usa para supervisar la progresión de la enfermedad, puede usarse el ensayo anterior para supervisar la progresión de la enfermedad en sujetos que padecen afecciones agudas. Las afecciones agudas, también conocidas como afecciones de cuidados críticos, hacen referencia a enfermedades agudas potencialmente letales u otras afecciones médicas críticas que afectan, por ejemplo, al sistema cardiovascular o al sistema excretor.
Típicamente, las afecciones de cuidados críticos se refieren a las afecciones que requieren intervención médica aguda en un ambiente hospitalario (incluyendo, pero sin limitación, la sala de urgencias, la unidad de cuidados intensivos, el centro de traumatismos u otro ambiente de cuidados de urgencia) o la administración por un paramédico u otro personal médico basado en el campo. Para las afecciones de cuidados críticos, la supervisión repetida se efectúa generalmente en un espacio de tiempo más corto, concretamente, minutos, horas o días (por ejemplo, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, 4 aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días) y el ensayo inicial igualmente se efectúa generalmente en un espacio de tiempo más corto, por ejemplo, aproximadamente minutos, horas o días desde la aparición de la enfermedad o afección.
Los ensayos también pueden usarse para supervisar la progresión de la enfermedad en sujetos que padecen afecciones crónicas o no agudas. Afecciones no críticas o no agudas, se refiere a afecciones que no son agudas, enfermedades potencialmente letales u otras afecciones médicas críticas que afectan, por ejemplo, al sistema cardiovascular y/o al sistema excretor. Típicamente, las afecciones no agudas incluyen aquellas de mayor duración o de duración crónica. Para las afecciones no agudas, la supervisión repetida se efectúa generalmente con un espacio de tiempo mayor, por ejemplo, horas, días, semanas, meses o años (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1,5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2,5 años, aproximadamente 3,0 años, aproximadamente 3,5 años, aproximadamente 4,0 años, aproximadamente 4,5 años, aproximadamente 5,0 años, aproximadamente 5,5. años, aproximadamente 6,0 años, aproximadamente 6,5 años, aproximadamente 7,0 años, aproximadamente 7,5 años, aproximadamente 8,0 años, aproximadamente 8,5 años, aproximadamente 9,0 años, aproximadamente 9,5
años o aproximadamente 10,0 años) y el ensayo inicial igualmente se efectúa generalmente en un espacio de tiempo más prolongado, por ejemplo, aproximadamente horas, días, meses o años desde la aparición de la enfermedad o afección.
Adicionalmente, los ensayos descritos en el presente documento pueden efectuarse utilizando una primera muestra de prueba obtenida de un sujeto, donde la primera muestra de prueba se obtiene de una fuente, tal como orina, suero o plasma. Opcionalmente, a continuación los ensayos anteriores pueden repetirse utilizando una segunda muestra de prueba obtenida del sujeto, donde la segunda muestra de prueba se obtiene de otra fuente. Por ejemplo, en caso de que la primera muestra de prueba se obtuviese de orina, la segunda muestra de prueba puede obtenerse de suero o plasma. Los resultados obtenidos de los ensayos utilizando la primera muestra de prueba y la segunda muestra de prueba pueden compararse. La comparación puede utilizarse para evaluar el estado de una enfermedad o afección en el sujeto.
Por otra parte, la presente divulgación también se refiere a métodos para determinar si un sujeto predispuesto a padecer o que padece hepatitis se beneficiará del tratamiento. En particular, la divulgación se refiere a métodos y productos de diagnóstico de VHC complementarios. Por tanto, el método para "supervisar el tratamiento de la enfermedad en un sujeto", como se describe en el presente documento, puede abarcar además óptimamente seleccionar o identificar candidatos para terapia. Por tanto, en realizaciones particulares, la divulgación también proporciona un método para determinar si un sujeto que sufre, o está en riesgo de sufrir, la hepatitis es candidata a terapia. En general, el sujeto es uno que ha experimentado algún síntoma de hepatitis o que ha sido diagnosticado realmente que padece o que está en riesgo de padecer, hepatitis y/o que demuestra una concentración o cantidad desfavorable de anticuerpos anti-VHC o un fragmento de los mismos y/o antígenos del VHC, como se describe en el presente documento.
Los kits y sistemas (o componentes de los mismos), así como el método para determinar la concentración de anticuerpos anti-VHC y/o antígenos de VHC en una muestra de prueba mediante un inmunoensayo como se describe en el presente documento, puede adaptarse para su uso en una diversidad de sistemas automatizados y semiautomatizados (incluyendo aquellos en los que la fase sólida comprende una micropartícula), como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 5.089.424 y 5.006.309 y como se comercializa, por ejemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, Ill.) como ARCHITECT®. Algunas de las diferencias entre un sistema automatizado o semiautomatizado en comparación con un sistema no automatizado (por ejemplo, ELISA) incluyen el sustrato al que está unido el primer compañero de unión específica (por ejemplo, antígeno) (que puede afectar a la formación de sándwich y la reactividad del analito) y la duración y la temporalización de las etapas de captura, detección y/o cualesquiera etapas de lavado opcionales. Si bien un formato no automatizado, tal como un ELISA, puede requerir un tiempo de incubación relativamente más prolongado con la muestra y el reactivo de captura (por ejemplo, aproximadamente 2 horas), un formato automatizado o semiautomatizado (por ejemplo, ARCHITECT®, Abbott Laboratories) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, de aproximadamente 18 minutos para ARCHITECT®). De manera similar, mientras que un formato no automatizado,tal como un ELISA, puede incubar un anticuerpo de detección, tal como el reactivo conjugado durante un tiempo de incubación relativamente más largo (por ejemplo, aproximadamente 2 horas), un formato automatizado o semiautomático (por ejemplo, ARCHITECT®) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 4 minutos para ARCHITECT®). Otras plataformas comercializadas por Abbott Laboratories incluyen, pero sin limitación, AxSYM®, IMx® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.294.404), PRISM®, EIA (perla) y Quantum.TM. II, así como otras plataformas. Adicionalmente, los ensayos, los kits y los componentes del kit pueden emplearse en otros formatos, por ejemplo, en sistemas electroquímicos u otros sistemas de ensayo portátiles o del punto de atención. La presente divulgación es, por ejemplo, aplicable al sistema de inmunoensayo electroquímico en el punto de atención comercializado por Abbott (i-STAT®, Abbott Laboratories) que realiza inmunoensayos de tipo sándwich. Se describen inmunosensores y sus métodos de fabricación y operación en dispositivos de prueba de un solo uso, por ejemplo en, la patente de Estados Unidos n.° 5.063.081, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2003/0170881, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2004/0018577, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005/0054078 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2006/0160164.
Ejemplos
Ejemplo 1
Ensayos de 1 frente a múltiples péptidos NS3 del VHC para la detección de títulos de anticuerpos de VHC variables
Este ejemplo describe una comparación de la detección de títulos de anticuerpos contra el VHC variables entre ensayos de VHC que emplean un único péptido NS3 (con varios tamaños y número de dominios) y un ensayo de combinación del VHC que emplea tanto un péptido de helicasa NS3 de longitud completa como un péptido NS3 de un solo dominio. Los resultados de este trabajo se muestran en la Tabla 1 que se expone a continuación.
TABLA 1
En la segunda columna de la Tabla 1 anterior, el ensayo ARCHITECT Anti-VHC se realizó como sigue. En la primera etapa, 10 ul de muestra humana, 90 ul de diluyente específico del ensayo y 50 ul de micropartículas recubiertas con NS3 del VHC, antígenos del núcleo y NS4 se añaden a un recipiente de reacción, se agitan en vórtex y se incuban durante 18 minutos. Después de esta incubación, las micropartículas se secuestran en el lado del recipiente de reacción usando un imán mientras se elimina el sobrenadante de la reacción. Las micropartículas se lavan posteriormente con una solución de agua/detergente. Durante esta primera etapa, los complejos antígeno-anticuerpo del VHC se forman y capturan en las micropartículas. En la segunda etapa, inmediatamente después del lavado, se añaden 50 ul de reactivo que contiene anticuerpos IgG e IgM anti-humanos acridinilados al recipiente de reacción, se agitan en vórtex y se dejan incubar durante 4 minutos. Durante esta etapa, los conjugados de acridinio:anti-IgG e IgM humanas se unen más a los complejos antígeno-anticuerpo del VHC formados en la 1a etapa. Después de la incubación, las micropartículas se secuestran en el lado del recipiente de reacción usando un imán y se elimina el sobrenadante de reacción. Las micropartículas se lavan posteriormente con una solución de agua/detergente. Las partículas lavadas se suspenden en una solución básica que contiene peróxido de hidrógeno para activar el acridinio con medición simultánea de la salida de luz (en unidades de luz relativas o ULR), que es proporcional a la cantidad de conjugado unido a las micropartículas. Los resultados se informan en la Tabla 1 anterior, que muestra S/CO progresivamente más altos desde la parte superior de la tabla hacia abajo, correspondiente a títulos más altos de anticuerpos en la muestra del paciente.
En la tercera columna de la Tabla 2 anterior, el ensayo ARCHITECT Single Marker Core Ag se realizó de la siguiente manera. En la primera etapa, 110 ul de muestra humana, 25 ul de diluyente específico del ensayo, 50 ul de reactivo que contiene micropartículas recubiertas de estreptavidina y 25 ul de reactivo que contiene MAb anti-núcleo biotinilado (C11-7) se añaden a un recipiente de reacción, se agitan en vórtex y se incuban durante 18 minutos. Durante esta primera etapa, se forman los complejos biotina: MAb anti-núcleo:Ag del núcleo y capturan en las micropartículas. Después de esta incubación, las micropartículas se secuestran en el lado del recipiente de reacción usando un imán mientras se elimina el sobrenadante de la reacción. Las micropartículas se lavan posteriormente con una solución de agua/detergente. En la segunda etapa, inmediatamente después del lavado, se añaden 50 ul de reactivo que contiene MAb anti-núcleo acridinilados (C11-9 y C11-14) al recipiente de reacción, se agitan en vórtex y se dejan incubar durante 4 minutos. Durante esta etapa, el conjugado acridinio:MAb anti-núcleo se une más al complejo biotina: MAb anti-núcleo:Ag del núcleo formado en la primera etapa. Después de la incubación, las micropartículas se secuestran en el lado del recipiente de reacción usando un imán y se elimina el sobrenadante de reacción. Las micropartículas se lavan posteriormente con una solución de agua/detergente. Las partículas lavadas se suspenden en una solución básica que contiene peróxido de hidrógeno para activar el acridinio con medición simultánea de la salida de luz (en unidades de luz relativas o ULR), que es proporcional a la cantidad de conjugado unido a las micropartículas. Los resultados se informan en la Tabla 1 anterior, lo que muestra que no hay niveles detectables de Ag del núcleo en estas 3 muestras.
En las columnas 4-7 de la Tabla 1 anterior, los ensayos de anticuerpos de marcador único ARCHITECT se realizaron de la siguiente manera. En la primera etapa, 110 ul de muestra humana, 25 ul de reactivo que contiene antígeno del VHC acridinilado (ya sea NS3h-D1(1192-1356), NS3h-DelN15 (1205-1658), 9NB49 (1192-1457) o péptido del núcleo (15-68, con una deleción en 34 y 48)), A un recipiente de reacción se añaden 50 ul de reactivo que contiene micropartículas recubiertas de estreptavidina y 25 ul de reactivo que contiene antígenos del VHC biotinilados (ya sea NS3h-D1 (1192-1356), NS3h-DelN15 (1205-1658), 9NB49 (1192-1457) o péptido del núcleo (15 68 con una deleción en 34 y 48), se agitan en vórtex y se incuban durante 18 minutos. Durante esta primera etapa, se forman complejos de biotina:antígeno-anticuerpo frente al VHC-acridinio:antígeno y se capturan en las micropartículas. Después de esta incubación, las micropartículas se secuestran en el lado del recipiente de reacción usando un imán mientras se elimina el sobrenadante de la reacción. Las micropartículas se lavan posteriormente con una solución de agua/detergente. En la segunda etapa, inmediatamente después del lavado, se añaden al recipiente de reacción 50 ul de reactivo que contiene una solución de lavado, se agitan en vórtex y se dejan incubar durante 4 minutos. Después de la incubación, las micropartículas se secuestran en el lado del recipiente de reacción usando un imán y se elimina el sobrenadante de reacción. Las micropartículas se lavan posteriormente con una
solución de agua/detergente. Las partículas lavadas se suspenden en una solución básica que contiene peróxido de hidrógeno para activar el acridinio con medición simultánea de la salida de luz (en unidades de luz relativas o ULR), que es proporcional a la cantidad de conjugado unido a las micropartículas. Los resultados se informan en la Tabla 1 anterior, que muestra que el ensayo que utiliza la proteína NS3h-DelN15 (1205-1658) puede detectar las 2 primeras muestras de título de anticuerpo más bajo, mientras que los ensayos que utilizan NS3h-D1, 9NB49 y péptido del núcleo no pueden hacerlo. La última muestra, de mayor título de anticuerpos, no puede detectarse mediante el ensayo usando la proteína NS3h-DelN15 o el péptido del núcleo, pero puede detectarse mediante los ensayos que utilizan las proteínas 9NB49 y NS3h-D1. Además, la proteína NS3h-D1 muestra una mayor reactividad para esta última muestra que la proteína 9NB49.
En la última columna de la Tabla 1 anterior, se realizó el ensayo Ag/Ab del VHC Combo. De manera importante, este ensayo utiliza dos tipos diferentes de antígenos NS3, incluyendo uno que contiene los tres dominios de LA helicasa (por ejemplo, para detectar de forma cuantitativa o cualitativa (con un cierto valor de corte) muestras de anticuerpos de título bajo) y uno que contiene solo el dominio 1 de la helicasa (por ejemplo, para detectar cuantitativa o cualitativamente muestras de anticuerpos de título alto). En la primera etapa, 110 ul de muestra humana, al envase de reacción se añaden 25 ul de reactivo que contiene antígenos NS3 del VHC acridinilados (tanto NS3h-D1 (1192 1356) como NS3h-DelN15 (1205-1658)) y un antígeno del núcleo(15-68, con una deleción en 34 y 48), 50 ul de reactivo que contiene micropartículas recubiertas de estreptavidina y 25 ul de reactivo que contiene MAb anti-núcleo biotinilado (C11-7), antígenos NS3 del VHC biotinilados (ambos NS3h-D1 (1192-1356) y NS3h-DelN15 (1205-1658)) y un antígeno del núcleo biotinilado (15-68, con una deleción en 34 y 48), se agitan en vórtex y se incuban durante 18 minutos. Durante esta primera etapa, se forman complejos de biotina:antígeno-anticuerpo frente al VHC-acridinio:antígeno, así como complejos de biotina:MAb anti-VHC-Ag del núcleo del VHC y se capturan sobre las micropartículas. Después de esta incubación, las micropartículas se secuestran en el lado del recipiente de reacción usando un imán mientras se elimina el sobrenadante de la reacción. Las micropartículas se lavan posteriormente con una solución de agua/detergente. En la segunda etapa, inmediatamente después del lavado, se añaden 50 ul de reactivo que contiene MAb anti-núcleo acridinilados (C11-9 y C11-14) al recipiente de reacción, se agitan en vórtex y se dejan incubar durante 4 minutos. Durante esta etapa, el conjugado acridinio:MAb anti-VHC se une además al complejo biotina:antígeno-anticuerpo frente al VHC-acridinio-antígeno formado en la primera etapa. Después de la incubación, las micropartículas se secuestran en el lado del recipiente de reacción usando un imán y se elimina el sobrenadante de reacción. Las micropartículas se lavan posteriormente con una solución de agua/detergente. Las partículas lavadas se suspenden en una solución básica que contiene peróxido de hidrógeno para activar el acridinio con medición simultánea de la salida de luz (en unidades de luz relativas o ULR), que es proporcional a la cantidad de conjugado unido a las micropartículas. Los resultados se informan en la Tabla 1 anterior, lo que muestra que cuando las proteínas NS3h-DelN15 y NS3h-D1 se combinan en un ensayo combinado, las 3 muestras se detectan, lo que permite un intervalo mayor de concentraciones de anticuerpos de la muestra en comparación con el uso de una única proteína NS3 sola.
En el trabajo posterior, se analizó una serie de diluciones en serie de 6 muestras positivas para Ac del VHC de título alto en dos ensayos diferentes de 1 etapa de NS3 anti-VHC que utilizaron 2 proteínas NS3. El ensayo NS3h, que se muestra en la tabla 2 que se expone a continuación, utilizó la proteína NS3h-DelN15 (1205-1658) que tiene los tres dominios de la helicasa NS3. El ensayo NS3h-D1, que se muestra en la tabla 2 que se expone a continuación, usó la NS3h-D1 (1192-1356) que abarca solo el dominio 1 de la helicasa NS3. Los resultados de esta prueba se muestran en la Tabla 2 que se expone a continuación.
TABLA 2
Concentraciones
decrecientes de
Ab
Tal como se muestra en la Tabla 2, el ensayo de una etapa compuesto por el dominio NS3 único (D1) detectó las concentraciones más altas de Ab pero no las concentraciones más bajas. Lo contrario es cierto para el ensayo compuesto por la proteína NS3h de longitud completa que detecta las concentraciones más bajas de anticuerpos en
lugar de los títulos altos de anticuerpos.
Diversas modificaciones y variaciones de los métodos y composiciones descritos de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica sin que se desvíen del alcance de la invención como se define igual en las reivindicaciones adjuntas. Aunque la invención se ha descrito en relación con realizaciones preferidas específicas, debe entenderse que la invención según se reivindica no debe considerarse limitada indebidamente a dichas realizaciones específicas. En efecto, se pretende que diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que serán evidentes para los expertos en los campos relevantes entren dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.
Claims (13)
1. Un método para detectar la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en un sujeto, que comprende:
(a) poner en contacto una muestra biológica inicial sospechosa de contener anticuerpos anti-VHC objeto con los péptidos de captura NS3h primero y segundo y los péptidos conjugados marcados de forma detectable primero y segundo para generar una muestra biológica mixta que comprende la muestra biológica inicial, el primer y segundo péptidos de captura NS3h y el primer y segundo péptidos conjugados, donde
(i) el primer péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC y no tiene más de 350 aminoácidos de longitud,
(ii) el segundo péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con una helicasa NS3 de VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3, y (iii) los anticuerpos anti-VHC objeto no están en forma purificada en la muestra biológica,
b) incubar la muestra biológica mixta en condiciones tales que:
(i) el primer péptido de captura NS3h se une específicamente al menos a uno de los anticuerpos objeto para formar un primer complejo de captura y el primer péptido conjugado se une al anticuerpo objeto en el primer complejo de captura para formar un primer complejo detectable, y
(ii) el segundo péptido de captura NS3h se une específicamente al menos a uno de los anticuerpos objeto para formar un segundo complejo de captura y el segundo péptido conjugado se une al anticuerpo objeto en el segundo complejo de captura para formar un segundo complejo detectable;
c) lavar la muestra biológica mixta para generar una muestra lavada; y
d) detectar la presencia del primer y/o segundo complejo detectable, detectando así la infección por VHC en el sujeto,
donde la presencia tanto del primero como del segundo péptidos de captura NS3h en la muestra biológica mixta amplía el intervalo dinámico para detectar cualitativamente los anticuerpos objeto en comparación con el uso de, únicamente, el primero o segundo péptido de captura NS3h.
2. El método de la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos del segundo péptido de captura NS3h comprende una secuencia de helicasa de NS3 del VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el primer péptido de captura NS3h y/o el primer péptido conjugado marcado de forma detectable comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el segundo péptido de captura NS3h y/o el segundo péptido conjugado marcado de forma detectable comprende una secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos que es un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde se sospecha que la muestra contiene partículas de VHC o fragmentos de las mismas y el método comprende además (i) poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo anti-VHC para formar un tercer complejo que comprende el primer anticuerpo anti-VHC unido a una partícula de VHC o fragmento de la misma, (ii) poner en contacto la muestra con un segundo anticuerpo anti-VHC marcado de forma detectable que une la partícula de VHC o fragmento de la misma en el tercer complejo y (iii) detectar el tercer complejo.
6. El método de la reivindicación 5, que comprende además poner en contacto la muestra con un primer péptido del núcleo del VHC y un segundo péptido del núcleo del VHC marcado de forma detectable, donde cada uno de los péptidos del núcleo del VHC primero y segundo se une específicamente al menos a uno de los anticuerpos objeto para formar un cuarto complejo y detectar la presencia del cuarto complejo.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde la helicasa NS3 del VHC de longitud completa es de un genotipo del VHC seleccionado del genotipo 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 2d, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 5a y 6a.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el sujeto es un ser humano.
9. Un kit que comprende:
(a) primer y segundo péptidos de captura NS3h que se unen al menos a un anticuerpo anti-VHC objeto en una
muestra biológica, donde
(i) el primer péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC y no tiene más de 350 aminoácidos de longitud, y
(ii) el segundo péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con una helicasa NS3 del VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3, (b) los primero y segundo péptidos conjugados, donde el primer y segundo péptidos conjugados pueden unirse al menos a un anticuerpo anti-VHC objeto en la muestra biológica y
(c) instrucciones de uso.
10. Una composición que comprende:
(a) primer y segundo péptidos de captura NS3h que se unen al menos a un anticuerpo anti-VHC objeto en una muestra biológica, donde
(i) el primer péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de secuencia con el Dominio 1 de una helicasa NS3 del VHC y no tiene más de 350 aminoácidos de longitud, y
(ii) el segundo péptido de captura NS3h comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con una helicasa NS3 del VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3, y (b) los primero y segundo péptidos conjugados, donde los primero y segundo péptidos conjugados pueden unirse al menos a un anticuerpo anti-VHC objeto en la muestra biológica.
11. El kit o composición de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, donde la secuencia de aminoácidos del segundo péptido de captura NS3h comprende una secuencia de helicasa de NS3 del VHC de longitud completa que tiene los Dominios 1, 2 y 3.
12. El kit o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, donde el primer péptido de captura NS3h y/o el primer péptido conjugado comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.
13. El kit o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde el segundo péptido de captura NS3h y/o el segundo péptido conjugado comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos que es un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.
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