ES2828984T3 - Derivados de 2-((5-(1-(3-(metilsulfonil)propil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-D]pirimidin-7(8H)-ona y compuestos relacionados como inhibidores de CDK4 para tratar tumores - Google Patents
Derivados de 2-((5-(1-(3-(metilsulfonil)propil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-D]pirimidin-7(8H)-ona y compuestos relacionados como inhibidores de CDK4 para tratar tumores Download PDFInfo
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Abstract
Un compuestos de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo como se muestra en la fórmula (I): **(Ver fórmula)** En donde: Y se selecciona del grupo que consiste en C y N, y no hay sustitución por R6 cuando Y es N; R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6 y cicloalquilo C3-C6 sustituido con metilo; R2 se selecciona del grupo que consiste en halógeno, COR5 y COOR5; R3 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6; R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido con hidroxi, alquilo C1-C6 sustituido con alcoxi, fenilo, y fenilo sustituido con halógeno; R5 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6, fluoroalquilo C1-C6, y cicloalquilo C3-C6; R6 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CN y CH3; m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 y 2; n se selecciona del grupo que consiste en 1, 2 y 3; y p se selecciona del grupo que consiste en 1, 2 y 3.
Description
DESCRIPCIÓN
Derivados de 2-((5-(1 -(3-(metilsulfonil)propil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-D]pirimidin-7(8H)-ona y compuestos relacionados como inhibidores de CDK4 para tratar tumores
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere al campo técnico de la preparación farmacéutica, particularmente a un compuesto de pirimidina o piridopiridona y una aplicación del mismo.
Antecedentes de la invención
La quinasa dependiente de la ciclina (CDK) y la ciclina son factores importantes en el control del ciclo celular. La CDK puede unirse a la ciclina para formar heterodímeros, en donde la CDK es una subunidad catalítica y la ciclina es una subunidad reguladora, y formar varios complejos ciclina-CDK, fosforilando diferentes sustratos y desempeñando un papel en la promoción y transformación de las diferentes fases del ciclo celular.
Hay al menos nueve CDKs en mamíferos. La transformación de las células de la fase G1 a la S está controlada principalmente por la quinasa G1 CDK. Las CDK quinasas que se unen a la ciclina G1 incluyen principalmente CDK2, CDK4 y CDK6. La ciclina D se une principalmente a CDK4 y CDK6 y regula la actividad de esta última; la ciclina E se une a CDK2 en la fase G1/S, exhibiendo actividad de quinasa CDK2 y promoviendo la entrada de las células en la fase S. La fase G2/M está controlada principalmente por la quinasa CDK1, y la ciclina A, y la ciclina B se unen a la CDK1 y la CDK1 fosforila la proteína del sustrato, por ejemplo, la fosforilación de la histona H1 conducirá a la condensación del cromosoma y la fosforilación de la lamina conducirá a la desintegración de la membrana nuclear. En la fase M, el factor promotor de la fase M (MPF) activa el complejo promotor de la anafase (APC), uniendo la ubiquitina a la ciclina A y la ciclina B, permitiendo que sean degradadas por el proteasoma por la ubiquitinación y completando un ciclo celular (Malumbres M. et al. Nat Cell Biol 11: 1275, 2009; Malumbres M. et al. Nat Rev Cancer 9: 153, 2009).
El trastorno del ciclo celular es una característica común de los tumores humanos. Las células tumorales suelen sufrir una proliferación no convencional, inestabilidad genómica (aumento de mutaciones en el ADN y aberraciones cromosómicas) e inestabilidad cromosómica (aumento del número de cromosomas). El ciclo celular está regulado por las quinasas de la familia CDK. Las células tumorales tienen una actividad de CDK aberrante debido a cambios en las CDKs per se o sus moduladores o genes relacionados con las vías ascendentes mitogénicas y genes genéticos de tabla (Cicenas J.J. Cancer Res Clin Oncol 147: 1409, 2011; Rizzolio F. et al. Curr Drug Targets 11:279, 2010).
Durante la última década, el desarrollo de inhibidores de CDK como un nuevo fármaco antitumoral se ha convertido en un punto caliente en la industria farmacéutica mundial. Se han puesto en desarrollo clínico más de 20 inhibidores de CDK. Aunque los resultados preclínicos farmacodinámicos antitumorales de los inhibidores de CDK son significativos, la mayoría de los resultados de los ensayos clínicos anteriores no fueron satisfactorios. Los principales problemas incluyen la falta de eficacia y mayor toxicidad en tumores sólidos. (Guha M. Nat Rev Drug Dis 11: 892, 2012). El estudio clínico se terminó debido a la eficacia y toxicidad de los inhibidores de CDK AG-24322, ZK-304709, SNS-032, R547, Seliciclib y AZD5438. Sin embargo, después del análisis de las causas de los efectos secundarios graves, se encuentra que estos fármacos carecían de selectividad para la inhibición de los subtipos de CDK y por tanto producían efectos secundarios graves.
Estudios recientes han demostrado que CDK1 participa en el control del ciclo celular normal. En el caso de que se inhiban otras CDKs, la actividad de CDK1 se retiene lo suficiente para mantener el ciclo celular normal. Los efectos secundarios tóxicos de los inhibidores de CDK están relacionados con la inhibición de CDK1 y CDK2. Por el contrario, los subtipos CDK4 y CDK6 no son necesarios para el ciclo celular de los mamíferos, y solo juegan un papel importante en la proliferación de tipos celulares específicos, y se convierten en objetivos clave para la inhibición tumoral (Guha M. Nat Rev Drug Dis 11: 892, 2012).
CDK4 y CDK6 son dos quinasas estrechamente relacionadas que se unen a la ciclina D en el ciclo de las células tumorales y llevan la fase G1 a la fase S, que son esenciales para la progresión del ciclo celular de replicación del ADN y la división celular. En más del 90% de los tumores humanos, se encuentra que el mecanismo de control de transición de la fase G1-S se altera a través de varios genes y adaptaciones bioquímicas. P16 y las proteínas inhibidoras del retinoblastoma humano (Rb) son proteínas inhibidoras de tumores importantes que pueden controlar el ciclo celular. La proteína del gen P16 inhibe los bucles de retroalimentación de CDK4, Ciclina D1 y Rb, y previene la proliferación excesiva de células para lograr el propósito de inhibir el tumor mediante la regulación de la actividad proteica de Rb. Se ha demostrado que la activación de CDK4 y CDK6 en tumores humanos (tales como el cáncer de mama y el mieloma) produce cambios en el ciclo celular. La inhibición de CDK4 y CDK6 puede prevenir la inactivación de la proteína inhibidora tumoral Rb e interferir con la progresión del ciclo celular tumoral (Choi YJ y Anders L, Oncogene 33: 1890-903, 2014).
Estudios recientes también han encontrado que CDK6 induce la expresión del gen inhibidor de tumores p16INK4a y el factor de angiogénesis VEGF-A como parte de un complejo de transcripción. CDK6 puede ejercer un efecto promotor
del tumor al mejorar la proliferación celular y la estimulación de la angiogénesis (Kollmann K. et al. Cáncer Cell 24: 167, 2013).
Palbociclib (PD-0332991) puede inhibir selectivamente CDK4 y CDK6 y restaurar el control del ciclo celular y, por lo tanto, bloquear la proliferación de células tumorales. La corporación de Pfizer presentó una solicitud de NDA (New Drug Application) ante la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) en mayo de este año con la base de los resultados de sus ensayos clínicos provisionales. Según el estudio de fase II de Pfizer, en las mujeres posmenopáusicas, las pacientes con cáncer de mama localmente avanzado o metastásico con receptor de estrógeno positivo (ER+) y receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 negativo (HER2-), en comparación con el grupo de tratamiento estándar con el fármaco terapéutico letrozol, la supervivencia libre de progresión (PFS) de la enfermedad en el grupo de combinación de palbociclib y letrozol se prolongó estadísticamente significativamente (20,2 meses frente a 10,2 meses, p = 0,0004), alcanzando el criterio de valoración principal de la investigación. A diferencia de los inhibidores de CDK no selectivos, el inhibidor de CDK4/6 PD-0332991 tiene menos efectos secundarios, que incluyen principalmente reducción de leucocitos y fatiga (Comunicado de prensa de Pfizer 2014.4.6). En cuanto a la farmacocinética, la exposición sanguínea de la absorción oral de palbociclib es baja. Los resultados clínicos de la Fase I mostraron que la concentración en sangre fue de 10-91 mg/ml y la AUC fue de 58-641 ng h/ml después de una dosis oral única de 25-150 mg. Dado que la semivida de eliminación es larga (promedio de 25,9 horas), la dosificación diaria repetida conducirá a la acumulación del fármaco (Keith T, et al. Clin Cancer Res 18: 568, 2011).
Los inhibidores selectivos de CDK4 y CDK6 Palbociclib, LY2835219 y LEE011 entran en ensayos clínicos de fase III para el tratamiento del cáncer de mama avanzado. Dado que CDK4/6 juega un papel clave en los trastornos del control del ciclo celular de varios tumores sólidos y tumores hematológicos. En la actualidad, la evaluación clínica de estos fármacos incluye además del cáncer de mama metastásico, el liposarcoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de ovario, glioblastoma, melanoma, mieloma múltiple y linfoma y similares.
El documento de patente internacional WO2014/183520A1 divulga compuestos de piridopirimidina que pueden inhibir selectivamente la actividad de CDK4 y CDK6 e inhibir la proliferación de líneas celulares cancerígenas selectas tales como Colo-205 y MCF-7. El documento de patente china CN104812756A divulga compuestos de amino naftiridona como inhibidores de kinasa múltiples que inhiben la actividad de las tirosina quinasas tales como BTK y SFK pero que tienen una actividad inhibidora mucho más baja sobre las CDKs. El documento de patente china CN103288824A divulga compuestos de tetrahidropiridopiridona que pueden inhibir la proliferación de la línea celular K562 de cáncer de leucemia, línea celular HO-8910 de cáncer de ovario y línea celular SMMC-7721 de cáncer de hígado.
Descripción de la divulgación
En base a esto, el propósito de la presente divulgación es proporcionar un compuesto de pirimidina o piridopiridona que superen el inconveniente de que los inhibidores de CDK carezcan de selectividad en la técnica anterior. El compuesto puede suprimir selectivamente las quinasas dependientes de la ciclina (Cdks) CDK4 y CDK6 sin casi actividad de supresión sobre la quinasa CDK2. Por tanto, el compuesto puede usarse en diversas enfermedades causadas por trastornos del control del ciclo celular que involucran a CDK4 y CDK6, particularmente en el tratamiento de tumores malignos.
Compuestos de pirimidina o piridopiridona o sus sales o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables como se muestran en la fórmula (I):
En donde: Y se selecciona del grupo que consiste en C y N, y no hay sustitución por R6 cuando Y es N;
R1 se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6 y cicloalquilo C3-C6 sustituido con metilo;
R2 se selecciona del grupo que consiste en halógeno, COR5 y COOR5 ;
R3 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6;
R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido con hidroxi, alquilo C1-C6 sustituido con alcoxi, fenilo, y fenilo sustituido con halógeno;
R5 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6, fluoroalquilo C1-C6, y cicloalquilo C3-C6;
R6 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CN y CH3 ;
m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 y 2;
n se selecciona del grupo que consiste en 1,2 y 3; y
p se selecciona del grupo que consiste en 1,2 y 3.
En algunas realizaciones, R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido con hidroxi, y alquilo C1-C6 sustituido con alcoxi. En donde el alquilo C1-C6 sustituido con hidroxi es preferiblemente etilo sustituido con hidroxi.
En algunas realizaciones, R4 se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo e isopropilo. R4 es preferiblemente metilo.
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3
Compuesto 4 Compuesto 5 Compuesto 6
Compuesto 7 Compuesto 8 Compuesto 9
Compuesto 10 Compuesto 11 Compuesto 12
Compuesto 13 Compuesto 14 Compuesto 15
En algunas realizaciones, m se selecciona de: 1; n se selecciona de: 2; p se selecciona entre: 1 o 2.
En algunas realizaciones, Y se selecciona de: N.
En algunas realizaciones, R1 se selecciona de cicloalquilo C3-C6; R2 se selecciona de COR5 ; R3 se selecciona de alquilo C1-C6; R5 se selecciona de alquilo C1-C6; y R6 se selecciona de: H.
En algunas realizaciones, R1 se selecciona de ciclopentilo; R2 se selecciona de COR5 ; R3 se selecciona de metilo; R5 se selecciona de metilo y etilo; R5 es preferiblemente metilo; R6 se selecciona de: H.
En algunas realizaciones, se seleccionan los siguientes compuestos:
La divulgación divulga además el uso del compuesto de pirimidina o piridopiridona o su sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptables en la preparación de fármacos antitumorales.
En algunas realizaciones, los tumores son tumores sólidos y tumores hematológicos.
En algunas realizaciones, los tumores sólidos y tumores hematológicos incluyen el cáncer de mama, liposarcoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de ovario, glioblastoma, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de células de manto.
En algunas realizaciones, el cáncer de mama incluye cáncer de mama localmente avanzado o metastásico con receptor de estrógeno positivo y receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano negativo en mujeres posmenopáusicas.
La divulgación divulga además una composición de un fármaco antitumoral, que comprende el compuesto de pirimidina o piridopiridona o la sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como ingrediente activo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En comparación con la técnica anterior, la presente divulgación tiene los siguientes efectos beneficiosos:
Los compuestos de pirimidina o piridopiridona que se muestran en la fórmula I de la presente divulgación son una serie de compuestos nuevos que pueden inhibir selectivamente CDK4 y CDK6 y pueden usarse en diversas enfermedades causadas por trastornos del control del ciclo celular que involucran a CDK4 y CDK6, y particularmente en el tratamiento de tumores malignos.
En la presente divulgación, los compuestos tienen gran actividad de CDK6 y CDK4 cuando R4 es alquilo; y los compuestos pierden la actividad CDK6 cuando R4 es arilo.
En particular, algunos de estos compuestos tienen las características de gran selectividad, gran actividad y fuertes efectos de antiproliferación sobre las células tumorales. En los experimentos de inhibición de la actividad enzimática, la IC50 de la inhibición de CDK4 y CDK6 puede ser inferior a 10 nM (10 nmoles/l), y la IC50 de la inhibición de CDK2 es mayor de 500 nM casi sin actividad inhibidora. En el experimento de inhibición de la proliferación de células tumorales, la IC50 de las líneas de células tumorales SW620, ZR-75-1 y MDA-MB-231 puede alcanzar 0,5 pM o incluso menos de 0,1 pM. En el experimento de inhibición del ciclo celular, las células de fase G1 dejaron de crecer y las células de fase S disminuyeron en una manera dependiente de la concentración, con una IC50 de aproximadamente 40 nM, ligeramente mejor que la del control positivo. En el experimento de Western Blot, la fosforilación de Rb en los sitios Ser780 pudo reducirse eficazmente después de actuar sobre las células de cáncer de mama MDA-MB-231.
Además, algunos compuestos mostraron características muy superiores en el experimento farmacocinético. Después de administrar la misma dosis a los animales de prueba, el valor de la AUC de los compuestos de la presente divulgación fue mayor que la del control positivo, especialmente para el Compuesto 2 en el mismo experimento, su AUC fue aproximadamente 9 veces la del control positivo, y tuvo un efecto excelente de absorción oral.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un diagrama esquemático que muestra que un inhibidor de CDK4/6 previene la fosforilación de Rb en células de cáncer de mama MDA-MB-231 en el Ejemplo 6;
La FIG. 2 es una curva de concentración de fármaco en plasma de PD-0332991 en función del tiempo después de la administración oral a ratas en el Ejemplo 7;
La FIG. 3 es una curva de concentración de fármaco en plasma del Compuesto 1 en función del tiempo después de la administración oral a ratas en el Ejemplo 7;
La FIG. 4 es una curva de concentración de fármaco en plasma del Compuesto 2 en función del tiempo después de la administración oral a ratas en el Ejemplo 7;
La FIG. 5 es una curva del cambio de volumen tumoral en los ratones después de la administración oral en el Ejemplo 8; y
La FIG. 6 es una curva del cambio del peso corporal de los ratones después de la administración oral en el Ejemplo 8.
Descripción detallada de las realizaciones
Además de los métodos estándar conocidos en los documentos o ejemplificados en los procedimientos de laboratorio, los compuestos de la presente divulgación pueden prepararse usando las reacciones mostradas en los siguientes esquemas.
Esquema 1
Esquema 2
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Ejemplo 1
Preparación de (6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(1-(2-(metilsulfonil)etil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona) (Compuesto 1)
Paso 1a: Preparación de 5-yodo-2-cloro-4-ciclopentil-aminopirimidina (Compuesto 102)
Se disolvió 5-yodo-2,4-dicloropimidina (Compuesto 101) (80,00 g, 0,291 moles, 1,0 eq.) en etanol (800 ml) y se añadió trietilamina (88,18 g, 0,873 moles, 3,0 eq.). Después, la mezcla se agitó en un baño de hielo. Cuando la temperatura se enfrió a de 0° C - 5° C, se añadió gota a gota ciclopentilamina (49,50 g, 0,582 moles, 2,0 eq.) y se completó la adición en un período de 30 minutos. La reacción se agitó mientras se mantenía una temperatura de alrededor de 5° C. Cuando la relación de área del pico de 2,4-dicloro-5-yodopirimidina, controlada por HPLC, fue menor del 1%, la reacción se detuvo. La solución de reacción se concentró y diluyó con una adición de acetato de etilo (300 ml) y luego se añadió agua (300 ml) y se extrajo y se repartió. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (200 ml x 2). La fase orgánica se combinó y se extrajo con salmuera saturada, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío. El residuo se separó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 50:1) para obtener el compuesto 5-yodo-2-cloro-4-ciclopentil-aminopirimidina (87,88 g, rendimiento: 93,5%). LCMS (ESI): m/z 324 [M 1]+.
Paso 1b: Preparación de ('£j-3-(2-cloro-4-(ciclopentilamino)pirimidin-5-il)but-2-enoato de etilo (Compuesto 104)
Se disolvió 5-yodo-2-cloro-4-ciclopentil-aminopirimidina (Compuesto 102) (20,00 g, 0,0619 moles, 1,0 eq.) en dimetilformamida (200 ml) y después se añadió en secuencia agua (20 ml), carbonato de sodio (16,40 g, 0,1547 moles, 2,5 eq.) y cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II) (2,17 g, 0,0031 moles, 0,05 eq.). Bajo protección de nitrógeno, la mezcla se agitó en un baño de aceite a 90° C. Cuando la temperatura se elevó a 90° C, se añadió gota a gota (Z)-etil3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)but-2-enoato (103) (19,32 g, 0,0805 moles, 1,3 eq.) y la adición se completó en un período de 30 minutos. Después, la reacción se agitó mientras se mantenía una temperatura de alrededor de 90° C. Cuando la relación de área de pico de 5-yodo-2-cloro-4-ciclopentil-aminopirimidina, controlada por HPLC, fue menor del 1%, se detuvo la reacción. La solución de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y la torta del filtro se lavó con metil terc-butil éter (100 ml). Al filtrado se le añadió metil terc-butil éter (200 ml) y agua (400 ml) y se extrajo y se repartió. La fase acuosa se extrajo con metil terc-butil éter (200 ml x 2). La fase orgánica se combinó y se lavó con salmuera saturada (200 ml), se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío. El residuo se separó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo =
20:1) para obtener el compuesto ('£)-3-(2-cloro-4-(c¡clopent¡lam¡no)p¡rim¡d¡n-5-¡l)but-2-enoato de etilo (13,85 g, rendimiento: 72,4%). LCMS (ESI): m/z 310 [M 1]+.
Paso 1c: Preparación de 2-cloro-8-ciclopent¡l-5-met¡l-8H-p¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-ona (Compuesto 105)
Se disolvió el compuesto (E)-etil-3-(2-cloro-4-(c¡clopent¡lam¡no)p¡r¡m¡d¡n-5-¡l)but-2-enoato (104) (20,00 g, 0,0647 moles, 1,0 eq.) en dimetilformamida (200 ml) y luego se añadió carbonato de cesio (42,16 g, 0,1294 moles, 2,0 eq.) y se agitó a temperatura ambiente. Cuando la relación del área del pico del Compuesto 104, controlada por HPLC, fue inferior al 1%, se detuvo la reacción. La solución de reacción se filtró y la torta del filtro se lavó con metil terc-butil éter (100 ml). Al filtrado se le añadió metil terc-butil éter (200 ml) y agua (400 ml) y se extrajo y se repartió. La fase acuosa se extrajo con metil terc-butil éter (200 ml x 2). La fase orgánica se combinó y se lavó con salmuera saturada (200 ml), se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío. El residuo se separó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 10:1) para obtener el compuesto 2-cloro-8-ciclopent¡l-5-met¡l-8H-p¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-ona (13,94 g, rendimiento: 81,9%). LCMS (ESI): m/z 264 [M 1]+.
Paso 1d: Preparación de 6-bromo-2-cloro-8-ciclopent¡l-5-met¡l-8H-p¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-ona (Compuesto 106)
Se disolvió el compuesto 2-cloro-8-ciclopent¡l-5-met¡l-8H-p¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-ona (105) (19,84 g, 0,0754 moles, 1,0 eq.) en ácido acético (200 ml) y se añadió acetato de sodio (24,75 g, 0,3017 moles, 4,0 eq.) y se agitó a temperatura ambiente. Luego se añadió gota a gota lentamente bromo (48,26 g, 0,3017 moles, 4,0 eq.) y se completó la adición en un período de 20 minutos. La mezcla se colocó en un baño de aceite a 50° C y se agitó. Cuando la relación del área del pico del Compuesto 105, controlada por HPLC, fue inferior al 1%, se detuvo la reacción. Después de que la solución de reacción se enfriara a temperatura ambiente, se añadió una solución acuosa saturada de sulfito de sodio (200 ml) y diclorometano (300 ml), se extrajo y se repartió. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (150 ml x 2). La fase orgánica se combinó y se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (200 ml x 3), se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío. El residuo se separó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 30:1 a 10:1) para obtener el compuesto 6-bromo-2-cloro-8-ciclopent¡l-5-met¡l-8H-p¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-ona (21,5 g, rendimiento: 83,1%). LCMS (ESI): m/z 344 [M+1]+.
Paso 1e: Preparación de 4-(6-aminop¡r¡d¡n-3-¡l)p¡per¡d¡na-1-carbox¡lato de terc-butilo (Compuesto 107)
Se disolvieron 5-bromo-2-nitropir¡d¡na (107A) (2,6 g, 12,8 mmoles, 1,0 eq.), 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-¡l)-3,6-d¡h¡drop¡rid¡n-1(2H)-carbox¡lato de terc-butilo (107B) (4,8 g, 15,5 mmoles, 1,2 eq.), cloruro de bis(tr¡fen¡lfosfina)palad¡o(II) (0,9 g, 1,28 moles, 0,1 eq.) y carbonato de cesio (8,4 g, 25,8 mmoles, 2,0 eq.) en 15 ml de agua y 150 ml de N,N-dimetilformamida. Bajo protección de nitrógeno, el sistema de reacción se colocó en un baño de aceite precalentado a 90° C y se hizo reaccionar durante 1 hora. Una vez completada la reacción, el sistema de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó varias veces con salmuera saturada, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se concentró al vacío y finalmente se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 10:1 a 3:1) para obtener un sólido amarillo, que era 6-n¡trop¡rid¡n-3',6'-d¡h¡dro-[3,4'-b¡p¡r¡d¡n]-1'(2'H)-carbox¡lato de terc-butilo (107C) (3,53 g, rendimiento: 90%). LCMS (ESI): m/z 306 [m 1]+.
El compuesto 107C anterior (3,53 g, 11,6 mmoles, 1,0 eq.) se disolvió en 100 ml de metanol y luego se añadió paladio sobre carbono (0,353 g). En condiciones de hidrógeno, la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Una vez completada la reacción, la reacción se filtró para eliminar el paladio sobre carbono en la solución de reacción y se lavó con metanol varias veces. El filtrado se concentró al vacío y finalmente se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 30:1) para obtener un sólido amarillo, que era 4-(6-aminopir¡din-3-¡l)piper¡d¡n-1 -carboxilato de terc-butilo (2,5 g, rendimiento: 78%). LCMS (ESI): m/z 278 [M+1]+.
Paso 1f: Preparación de 4-(6-((6-bromo-8-c¡clopent¡l-5-met¡l-7-oxo-7,8-d¡h¡drop¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-2-¡l)am¡no)p¡r¡din-3-¡l)piperid¡n-1 -carboxilato de terc-butilo (Compuesto 108)
Se disolvió el compuesto 4-(6-aminop¡r¡d¡n-3-¡l)p¡per¡din-1 -carboxilato de terc-butilo (107) (2,5 g, 9,0 mmoles, 2,25 eq.) en 80 ml de tetrahidrofurano anhidro y se colocó en un baño de agua helada. Bajo protección de nitrógeno, se añadió hidruro de sodio (0,452 g, 10,8 moles, 2,7 eq.) y la reacción se agitó durante 15 minutos en el baño de hielo. Después, al sistema de reacción se le añadió una solución de 6-bromo-2-cloro-8-ciclopent¡l-5-met¡l-8H-p¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-ona (106) (1,4 g, 4 mmoles, 2,7 eq.) en 30 ml de tetrahidrofurano gota a gota y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se inactivó con agua, se concentró al vacío y finalmente se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 30:1) para obtener un sólido amarillo, que era 4-(6-((6-bromo-8-c¡clopent¡l-5-met¡l-7-oxo-7,8-d¡h¡drop¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-2-¡l)amino)p¡r¡d¡n-3-¡l)p¡per¡d¡n-1-carbox¡lato de terc-butilo (2,145 g). LCMS (ESI): m/z 583 [M+1]+.
Paso 1g: Preparación de 4-(6-((8-ciclopentil-6-(1 -etox¡vin¡l)-5-metil-7-oxo-7,8-d¡h¡dropirido[2,3-d]p¡rimid¡n-2-¡l)am¡no)pirid¡n-3-il)piperid¡n-1 -carboxilato de terc-butilo (Compuesto 109)
Se disolvieron el compuesto 4-(6-((6-bromo-8-c¡clopent¡l-5-metil-7-oxo-7,8-d¡h¡drop¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-2-il)am¡no)p¡r¡d¡n-3-¡l)p¡peridin-1 -carboxilato de terc-butilo (108) (300 mg, 0,515 mmoles, 1,0 eq.), tetrakis (tr¡fen¡lfosf¡na)palad¡o(0) (54 mg, 0,051 mmoles, 0,1 eq.) y 1-etoxiviniltri-n-butilestaño (371 mg, 1,03 mmoles, 2,0 eq.)
en 40 ml de tolueno. Bajo protección de nitrógeno, la reacción se calentó a 130° C y se mantuvo a reflujo durante la noche. Una vez completada la reacción, el sistema de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se concentró al vacío y finalmente se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 30:1) para obtener un sólido amarillo, que fue el 4-(6-((8-ciclopentil-6-(1-etoxivinil)-5-metil-7-oxo-7,8-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)amino)piridina-3-il)piperidin-1 -carboxilato de terc-butilo (150 mg, rendimiento: 51%). LCMS (ESI): m/z 575 [M 1]+.
Paso 1h: Preparación de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 110)
Se disolvió 4-(6-((8-ciclopentil-6-(1-etoxivinil)-5-metil-7-oxo-7,8-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)amino)piridin-3-il)piperidin-1 -carboxilato de terc-butilo (109) (150 mg, 0,261 mmoles) en 100 ml de diclorometano y se añadió 4 ml de ácido clorhídrico, 6 moles/l, y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Una vez completada la reacción, se ajustó el pH a de 8~9 mediante la adición de una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y luego se filtró para eliminar las sales inorgánicas generadas. El filtrado se concentró al vacío y finalmente se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 15:1) para obtener un sólido blanco, que fue la 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (80 mg, rendimiento: 62%). LCMS (ESI): m/z 447 [M 1]+. 1H RMN (500 MHz, DMSO-ds): 5 10,21 (s, 1H), 8,99 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 7,98 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,69 ( d, J = 8,6 Hz, 1 H), 5,84 (m, 1H), 3,03 (d, J = 11,9 Hz, 2H), 2,60 (dd, J = 23,9, 11,9 Hz, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 1,90 (s, 2H), 1,79 (s, 2H), 1,70 (d, J = 12,0 Hz, 2H), 1,55 (ddd, J = 21,3, 11,3, 7,0 Hz, 4H).
Paso 1i: Preparación de metanosulfonato de 2-(metilsulfonil)etilo (Compuesto 111-1)
Bajo protección de nitrógeno, se disolvió 2-(metanosulfonil) etanol (143 mg, 1,15 mmoles, 1,0 eq.) en 20 ml de diclorometano y se añadió gota a gota cloruro de metanosulfonilo (144 mg, 1,26 mmoles, 1,1 eq.) a temperatura ambiente seguido de una adición de trietilamina (349 mg, 3,45 mmoles, 3,0 eq.). La mezcla se agitó a 40° C durante 20 horas y luego se enfrió a temperatura ambiente. La solución de reacción se lavó con solución acuosa de bicarbonato de sodio y se secó para dar una solución en diclorometano de metanosulfonato de 2-(metilsulfonil)etilo (0,056 M, 20 ml), que se usó para la siguiente etapa directamente.
Paso 1j: Preparación de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(1-(2-(metilsulfonil)etil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 1)
Se disolvió el Compuesto 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (110) (100 mg, 0,22 mmoles, 1,0 eq.) en acetonitrilo (30 ml) y se añadió carbonato de potasio (30 mg, 0,22 mmoles, 1,0 eq.). Bajo protección de nitrógeno, la reacción se calentó a 80° C y se añadió gota a gota lentamente una solución de 2-(metilsulfonil)etil metanosulfonato (111-1) (50 ml, 0,28 mmoles, 1,2 eq.) y se agitó a 80° C durante 4 horas y luego se enfrió a temperatura ambiente. La solución de reacción se extrajo con diclorometano y agua y se repartió. La fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para dar el producto bruto como un sólido amarillo que se separó y purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 10:1) para obtener 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(1-(2-(metilsulfonil)etil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona como un sólido blanco (80 mg, rendimiento: 65,8%). LCMS (ESI): m/z 553 [M 1]+. P.f. 256,3-260,2° C; 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 10,21 (s, 1H), 8,99 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 7,98 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,73 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,84 (p, J = 9,0 Hz, 1H), 3,31 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 3,03 (m, 5H), 2,75 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,55 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 2,26 (s, 2H), 2,09 (t, J = 11,3 Hz, 2H), 1,90 (s, 2H), 1,79 (d, J = 10,2 Hz, 4H), 1,65 (m, 4 H).
Ejemplo 2
Preparación de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(1-(3-(metilsulfonil)propil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 2)
Paso 2a: Preparación de 1-bromo-3-(metilsulfonil)propano (Compuesto 112-2).
Bajo protección de nitrógeno, se disolvió 3-(metilsulfonil)propan-1-ol (50 mg, 0,36 mmoles, 1,0 eq.) en 10 ml de diclorometano, y en una condición de baño de hielo, se añadió gota a gota tribromuro de fósforo (0,04 ml, 0,43 mmoles, 1,2 eq.). Después, la solución de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó y se hizo reaccionar durante 15 horas. La solución de reacción se añadió lentamente a agua helada y luego la mezcla se extrajo con diclorometano y se repartió. La fase orgánica se lavó con agua, se secó y se concentró para dar 1-bromo-3-(metilsulfonil)propano como un líquido aceitoso incoloro (49 mg, rendimiento: 68%).
Paso 2b: Preparación de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(1-(3-(metilsulfonil)propil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 2)
Se disolvió el Compuesto 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (110) (30 mg, 0,067 mmoles, 1,0 eq.) en acetonitrilo (20 ml) y se añadió carbonato de potasio (18 mg, 0,134 mmoles, 2,0 eq.). A continuación, se añadió gota a gota lentamente una solución de 1 -bromo-3-(metilsulfonil)propano
(112-2) (20 mg, 0,1 mmoles, 1,5 eq.). Bajo protección de nitrógeno, la reacción se calentó a 80° C y se agitó durante 4 horas y luego se enfrió a temperatura ambiente. La reacción se extrajo con diclorometano y agua y se repartió. La fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para dar un producto bruto que se separó y purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 10:1) para obtener el compuesto 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(1-(3-(metilsulfonil)propil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona como un sólido blanco (10 mg, rendimiento: 26,4%). lCm S (ESI): m/z 567 [M 1]+. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 10,21 (s, 1H), 8,99 (s, 1H), 8,24 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 8,6 Hz, 1H) , 7,73 (dd, J = 8,6, 2,4 Hz, 1H), 5,84 (m, 1H), 3,13 (m, 2H), 2,97 (d, J = 13,3 Hz, 5H), 2,55 (dd, J = 9,6, 6,0 Hz, 1H), 2,43 (m, 5H), 2,32 (s, 3H), 2,27 (m, 2H), 2,03 (t, J = 10,8 Hz, 2H), 1,87 (m, 4H), 1,78 (d, J = 10,4 Hz, 4H), 1,70 (td, J = 12,3, 3,3 Hz, 2H), 1,60 (m, 2H).
Ejemplo 3
Preparación de 6-acetil-2-((5-(1-(2-((4-clorofenil)sulfonil)etil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)-8-ciclopentil-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 4)
Paso 3a: Preparación de 1-((2-bromoetil)sulfonil)-4-clorobenceno (Compuesto 112-4)
Se disolvió 1,2-dibromoetano (4,7 g, 25 mmoles, 5,0 eq.) en 100 ml de acetonitrilo y se añadió carbonato de potasio (828 mg, 6,0 mmoles, 1,2 eq.) a temperatura ambiente seguido de la adición de una solución de 4-clorotiofenol (720 mg, 5,0 mmoles, 1,0 eq.) en acetonitrilo (10 ml) lentamente. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se extrajo con acetato de etilo y agua y se repartió. La fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para obtener el producto bruto que se separó y purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 100:1) para obtener (2-bromoetil)(4-clorofenil)sulfano (1,0 g, rendimiento: 80%). El (2-bromoetil)(4-clorofenil)sulfano obtenido se disolvió en 100 ml de diclorometano y se añadió ácido 3-cloroperbenzoico (2,06 mg, 12 mmoles, 3,0 eq.) en lotes en condiciones de baño de hielo y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de reacción se extrajo con acetato de etilo y agua y se repartió. La fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para dar el producto bruto que se separó y purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 100:1 a 30:1) para obtener el compuesto. 1 -((2-bromoetil)sulfonil)-4-clorobenceno (500 mg, rendimiento: 44%).
Paso 3b: Preparación de 6-acetil-2-((5-(1-(2-((4-clorofenil)sulfonil)etil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)-8-ciclopentil-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 4)
Se disolvió el Compuesto 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (110) (100 mg, 0,22 mmoles, 1,0 eq.) en N,N-dimetilformamida (30 ml) y se calentó a 80° C bajo protección de nitrógeno. Después de que el sólido se disolviera completamente, la solución de reacción se enfrió a temperatura ambiente y luego se añadió carbonato de potasio (30 mg, 0,22 mmoles 1,0 eq.) y luego se añadió una solución de 1-((2-bromoetil)sulfonil)-4-clorobenceno (112-4) (80 mg, 0,28 mmoles, 1,2 eq.) en 2 ml de acetonitrilo lentamente. La reacción se agitó a 40° C durante 4 horas y luego se enfrió a temperatura ambiente. La solución de reacción se extrajo con diclorometano y agua y se repartió. La fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para obtener un producto bruto como un sólido amarillo que se separó y purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 10:1) para obtener 6-acetil-2-((5-(1-(2-((4-clorofenil)sulfonil)etil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)-8-ciclopentil-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona como un sólido blanco (20 mg, rendimiento: 14%). lCm S (ESI): m/z 649 [M 1]+. 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 10,22 (s, 1H), 8,99 (s, 1H), 8,14 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,96 (m, 3H), 7,75 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,56 (dd, J = 8,6, 2,3 Hz, 1H), 5,85 (m, 1H), 3,58 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,75 (d, J = 11,0 Hz, 2H), 2,64 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H), 2,38 (s, 1H), 2,32 (s, 3H), 2,26 (dd, J = 11,4, 7,9 Hz, 2H), 1,90 (dd, J = 13,4, 8,0 Hz, 4H), 1,80 (m, 2H), 1,59 (m, 4H), 1,15 (dd, J = 12,2, 3,0 Hz, 2H).
Ejemplo 4
Preparación de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(1-(2-(metilsulfonil)etil)piperidin-3-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 5)
Paso 4a: Preparación de 2-cloro-8-ciclopentil-6-yodo-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 201)
Se disolvió 2-cloro-8-ciclopentil-5-metil-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona (105) (20 g, 76 mmoles, 1,0 eq.) en 250 ml de ácido trifluoroacético y 10 ml de anhídrido trifluoroacético. Bajo protección de nitrógeno, se añadió N-yodosuccinimida (68,5 g, 304 mmoles, 4,0 eq.) y la mezcla se calentó a 80° C. Después de 1 hora, la solución de reacción se concentró al vacío y se añadió una solución de bisulfito de sodio para eliminar el resto de N-yodosuccinimida, se extrajo con diclorometano y se lavó con salmuera saturada dos veces. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío para obtener el compuesto 2-cloro-8-ciclopentil-6-yodo-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona como un sólido blanco. (29 g, rendimiento: 98,5%). LCMS (ESI): m/z 390 [M 1].
Paso 4b: Preparación de 2-cloro-8-ciclopentil-6-(1-etoxivinil)-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 202)
Bajo protección de nitrógeno, se disolvió 2-cloro-8-ciclopentil-6-yodo-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (201) (15 g, 38,56 mmoles, 1,0 eq.) y 1-etoxiviniltri-n-butilestaño (13,8 g, 42,4 mmoles, 1,1 eq.) en 150 ml de tolueno y se calentó a 120° C. Se añadió cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II) (2,43 g, 3,8 mmoles, 0,1 eq.) y se hizo reaccionar a 125° C durante 3 horas. La solución de reacción se concentró al vacío para dar un producto bruto que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: acetato de etilo/éter de petróleo = 1/10 a 1/5) para obtener 2-cloro-8-ciclopentil-6-(1-etoxivinil)-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona como un sólido marrón (282 mg, rendimiento: 18,5%). LCMS (ESI) m/z 334 [M 1]+.
Paso 4c: Preparación de 3-(6-aminopiridin-3-il)piperidin-1 -carboxilato de terc-butilo (Compuesto 203)
Se mezclaron 5-bromo-2-nitropiridina (107A) (1,0 g, 4,98 mmoles, 1,0 eq.), cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II) (174 mg, 0,25 mmoles, 0,05 eq.) y carbonato de cesio anhidro (2,43 g, 7,47 mmoles), 1,5 eq.) en 5 ml de agua y 50 ml de N,N-dimetilformamida. Bajo protección de nitrógeno, se añadió el compuesto 5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxoborolan-2-il)-3,4-dihidropiridin-1(2H)-carboxilato de terc-butilo (203A) (2,13 g, 6,89 mmoles, 1,4 eq.) y se calentó a 85° C. Después de 1 hora, la reacción se enfrió a temperatura ambiente, se extrajo con acetato de etilo y se lavó con salmuera saturada dos veces. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró al vacío para dar el producto bruto que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: acetato de etilo/éter de petróleo = 10/100 a 50/100) para obtener un sólido amarillo, que fue el compuesto 6'-nitro-5,6-dihidro-[3,3'-bipiridina]-1 (4H)-carboxilato de terc-butilo (203B) (282 mg, rendimiento: 18,5%). LCMS (ESI): m/z 306 [M 1]+.
Bajo protección de hidrógeno, el compuesto 203B preparado anteriormente (100 mg, 0,33 mmoles, 1,0 eq.) y paladio sobre carbono (10 mg, 10%) se añadieron a un matraz de reacción que contenía metanol (10 ml) y se agitó a 30° C durante la noche. Después de la filtración, el filtrado se concentró al vacío para dar el compuesto 3-(6-aminopiridin-3-il)piperidin-1 -carboxilato de terc-butilo (89 mg, bruto, usado directamente para la siguiente etapa). LCMS (ESI): m/z 278 [M 1]+.
Paso 4d: Preparación de 3-(6-((8-ciclopentil-6-(1-etoxivinil)-5-metil-7-oxo-7,8-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)amino)piridin-3-il)piperidin-1 -carboxilato de terc-butilo (Compuesto 204)
Bajo protección de nitrógeno, se añadió el Compuesto 3-(6-aminopiridin-3-il)piperidin-1 -carboxilato de terc-butilo (203) (89 mg, 0,32 mmoles, 1,0 eq.), el compuesto 2-cloro-8-ciclopentil-6-(1 -etoxivinil)-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (202) (106 mg, 0,32 mmoles, 1,0 eq.), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (17 mg, 0,029 mmoles, 0,09 eq.), carbonato de cesio (156 mg, 0,48 mmoles, 2,0 eq.) y tris(dibencilidenacetona)dipaladio (15 mg, 0,016 mmoles, 0,05 eq.) a un matraz de reacción que contenía tolueno y se calentó a 90° C y se agitó durante 5 horas. La solución de reacción se concentró al vacío para dar un producto bruto que se separó y purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: metanol/diclorometano = 0/100 a 5/100) para obtener 3-(6-((8-ciclopentil-6-(1-etoxivinil)-5-metil-7-oxo-7,8-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)amino)piridin-3-il)piperidin-1 -carboxilato de terc-butilo como un coloide amarillo (96 mg, rendimiento: 52,2%). LCMS (ESI): m/z 575 [M 1]+.
Paso 4e: preparación de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(piperidin-3-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 205).
El compuesto 3-(6-((8-ciclopentil-6-(1-etoxivinil)-5-metil-7-oxo-7,8-dihidropirido [2,3-d]pirimidin-2-il) amino) piridin-3-il)piperidin-1 -carboxílato de terc-butilo (204) (96 mg, 0,167 mmoles, 1,0 eq.) se disolvió en diclorometano (50 ml) y se añadió lentamente gota a gota una solución metanólica de ácido clorhídrico (5 ml). Después de agitar durante 3 horas, el disolvente se eliminó al vacío para dar el compuesto 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(piperidin-3-il)piridin-2-ilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (83 mg, en bruto) que fue usado directamente en el siguiente paso. LCMS (ESI): m/z 447 [M 1]+.
Paso 4f: preparación de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(1-(2-metilsulfonil)etil)piperidin-3-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d] pirimidin-7(8H)-ona (Compuesto 5)
Se disolvió el compuesto 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(piperidin-3-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (205) (60 mg, 0,134 mmoles, 1,0 eq.) en acetonitrilo (30 ml) y se añadió carbonato de potasio (18 mg, 0,134 mmoles, 1,0 eq.). Bajo protección de nitrógeno, la reacción se calentó a 70° C y se añadió gota a gota lentamente una solución de 2-(metilsulfonil)etilmetanosulfonato(111-1) en diclorometano (3 ml, 0,161 mmoles, 1,2 eq.). Después se agitó a 70° C durante 3 horas y se enfrió a temperatura ambiente. La reacción se extrajo con diclorometano y agua y se repartió. La fase orgánica se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para dar un producto bruto como un sólido amarillo que se separó y purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 10:1) para obtener el compuesto 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-((5-(1-(2-(metilsulfonil)etil)piperidin-3-il)piridin-2-il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona como un sólido amarillo (58 mg, rendimiento: 78,4%). LCMS (ESI): m/z 553 [M 1]+. Pf: 109-113° C;1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 10,24 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,27 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,75 (dd, J = 8,6, 2,3 Hz, 1H), 5,85 (m, 1H), 3,31 (dd, J = 6,6, 2,8 Hz, 2H), 3,03 (s, 3H), 2,93 (dd, J = 23,9, 11,2 Hz, 2H), 2,77 (m, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 2,27 (m, 2H),
2,07 (dt, J = 11,3, 10,0 Hz, 2H), 1,92 (dd, J = 7,6, 5,5 Hz, 2H), 1,78 (m, 4H), 1,60 (dd, J = 13,8, 8,9 Hz, 3H), 1,47 (dd, J = 12,2, 3,5 Hz, 1H).
Ejemplo 5
Preparación de 3-acetil-1 -ciclopentil-4-metil-7-((5-(1 -(2-(metilsulfonil)etil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (Compuesto 13)
Paso 5a: preparación de 2-cloro-5-yodopiridin-4-amina (Compuesto 302)
Bajo protección de nitrógeno, se disolvió 2-cloropiridin-4-amina (301) (15 g, 0,116 moles, 1 eq.) en acetonitrilo (200 ml) y se calentó a 70° C en un baño de aceite, y luego se añadió lentamente N-yodosuccinimida (NIS) (33 g, 0,139 moles, 1,2 eq.). La reacción se agitó durante 16 horas y se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió una solución saturada de tiosulfato de sodio hasta que el sistema de reacción se volvió blanco como la leche. El pH del sistema de reacción se ajustó a de 9-10 mediante la adición de una solución acuosa saturada de carbonato de sodio y se extrajo con acetato de etilo (500 ml). Se separó la fase orgánica que se lavó con salmuera saturada (100 ml) dos veces, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se concentró al vacío y se separó y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 20/1) para obtener 2-cloro-5-yodopiridin-4-amina (23 g, rendimiento: 78,1%). LCMS (ESI): m/z 255 [M 1]++
Paso 5b: preparación de 2-cloro-N-ciclopentil-5-yodopiridin-4-amina (Compuesto 303)
Bajo protección de nitrógeno, se añadieron 2-cloro-5-yodopiridin-4-amina (302) (23 g, 90,6 mmoles, 1 eq.), carbonato de cesio (177 g, 0,544 moles, 6 eq.) y bromociclopentano (81 g, 0,544 moles, 6 eq.) a un matraz de reacción que contenía cloruro de tionilo (500 ml) como disolvente y se calentó a 90° C y se agitó durante 36 horas. La reacción se filtró y el filtrado se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó tres veces con agua (500 ml) y salmuera saturada (400 ml) tres veces, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se concentró al vacío y se separó y purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 10/1) para obtener 2-cloro-N-ciclopentil-5-yodopiridin-4-amina (6 g, rendimiento: 20,5%). LCMS (ESI): m/z 323 [M 1]+.
Paso 5c: Preparación de (E)-3-(6-cloro-4-(ciclopentilamino)piridin-3-il)but-2-enoato de etilo (Compuesto 304)
Bajo protección de nitrógeno, se añadieron 2-cloro-N-ciclopentil-5-yodopiridin-4-amina (303) (6 g, 18,6 mmoles, 1 eq.), carbonato de sodio (4,93 g, 46,5 mmoles, 2,5 eq.), (Z)-etil-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxoborolan-2-il)but-2-enoato (103) (5,8 g, 24,2 mmoles, 1,3 eq.) y bis(trifenilfosfina)cloruro de paladio(II) (0,9 g, 1,28 moles, 0,1 eq.) a un matraz de reacción que contenía DMF y agua (10:1) como disolvente. La reacción se calentó a 90° C y se hizo reaccionar durante 3,5 horas. Se añadió acetato de etilo (400 ml) y se lavó con agua (200 ml) tres veces y salmuera (100 ml) una vez, y se concentró para dar el producto bruto que se separó y purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 4/1) para obtener (E)-3-(6-cloro-4-(ciclopentilamino)piridin-3-il)but-2-enoato de etilo (304) (5,2 g, rendimiento: 90,9%). LCMS (ESI): m/z 309 [M 1]++
Paso 5d: Preparación de 7-cloro-1-ciclopentil-4-metil-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (Compuesto 305)
Se disolvió (E)-3-(6-cloro-4-(ciclopentilamino)piridin-3-il)but-2-enoato de etilo (304) (5,2 g, 16,9 mmoles, 1 eq.) en tolueno (20 ml) y se añadió DBU (1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno) (2,57 g, 1,69 mmoles, 0,1 eq.) y se calentó a reflujo y se agitó durante 16 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, se concentró, separó y purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 15/1) para obtener 7-cloro-1-ciclopentil-4-metil-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (3,7 g, rendimiento: 83,4%) LCMS (ESI): m/z 263 [M 1]+.
Paso 5e: Preparación de 3-bromo-7-cloro-1-ciclopentil-4-metil-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (Compuesto 306)
Se disolvió el compuesto 7-cloro-1-ciclopentil-4-metil-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (305) (3,7 g, 14,1 mmoles, 1 eq.) en ácido acético glacial (10 ml) y se añadió acetato sódico (4,62 g, 56,4 mmoles, 4 eq.) y se calentó a 50° C. Se disolvió bromo (4,9 g, 15,5 mmoles, 1,1 eq.) en ácido acético y se añadió gota a gota lentamente al matraz de reacción. La reacción se agitó durante 3,5 horas y se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió lentamente solución saturada de tiosulfato de sodio hasta que la reacción se volvió clara y luego se ajustó el pH del sistema de reacción a de 9-10 mediante la adición de una solución acuosa saturada de carbonato de sodio. La mezcla se extrajo con diclorometano (200 ml) y se concentró para dar el producto bruto que se separó y purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 10/1) para obtener 3-bromo-7-cloro-1-ciclopentil-4-metil-1,6-naftiridin-2(1 H)-ona (3 g, rendimiento: 62,6%). LCMS (ESI): m/z 341 [M 1]+.
Paso 5f: Preparación de 7-cloro-1-ciclopentil-3-(1-etoxivinil)-4-metil-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (Compuesto 307)
Bajo protección de nitrógeno, se disolvieron 3-bromo-7-cloro-1 -ciclopentil-4-metil-1,6-naftiridin-2(1 H)-ona (306) (1,5 g, 4,41 mmoles, 1 eq.), tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (509 mg, 0,44 mmoles, 0,1 eq.) y 1-etoxiviniltri-n-butilestaño (2,07 g, 5,73 mmoles, 1,3 eq.) en tolueno (20 ml) en un matraz de reacción y se calentó a reflujo para hacerlos reaccionar
durante 16 horas. La reacción se concentró al vacío para dar el producto bruto que se separó y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 10/1) para obtener 7-cloro-1-ciclopentil-3-(1-etoxivinil)-4-metil-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (1,0 g, rendimiento: 68,3%). LCMS (ESI): m/z 333 [M 1]+ .
Paso 5g: Preparación de 4-(6-((1-ciclopentil-3-(1-etoxivinil)-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-1,6-naftiridin-7-il)amino)piridin-3-il)piperidin-1 -carboxilato de terc-butilo (Compuesto 308)
Se dispersaron en 30 ml de tolueno 7-cloro-1 -ciclopentil-3-(1 -etoxivinil)-4-metil-1,6-naftiridin-2(1 H)-ona (307) (150 mg, 0,45 mmoles, 1,0 eq.), 4-(6-aminopiridin-3-il)piperidin-1 -carboxilato de tercbutilo (107) (165 mg, 0,585 mmoles, 1,3 eq.), carbonato de cesio (300 mg, 0,9 mmoles, 2,0 eq.) y 4,5-bis (difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (21 mg, 0,036 mmoles, 0,08 eq.). Bajo protección de nitrógeno, se añadió Pd2(dba)3 (tris(dibencilidenoacetona)dipaladio (16 mg, 0. 018 mmoles, 0,04 eq.). El sistema de reacción se colocó en un baño de aceite precalentado a 130° C y se refluyó y se agitó durante 6 horas. Una vez completada la reacción, se enfrió a temperatura ambiente, se concentró al vacío y finalmente se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 15:1) para obtener un sólido amarillo, que fue el 4-(6-((1 -ciclopentil-3-(1 -etoxivinil)-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-1,6-naftiridin-7-il)amino)piridin-3-il)piperidin-1 -carboxilato de terc-butilo (176 mg, rendimiento: 68%) LCMS (ESI): m/z 574 [M 1]+ .*
Paso 5h: Preparación de 3-acetil-1-ciclopentil-4-metil-7-((5-(piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (Compuesto 309)
Se disolvió en 30 ml de diclorometano 4-(6-((1-ciclopentil-3-(1-etoxivinil)-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-1,6-naftiridin-7-il)amino)piridin-3-il)piperidin-1 -carboxilato de terc-butilo (308) (176 mg, 0,307 mmoles) y se añadió 6 ml de ácido clorhídrico de 6 moles/l y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. A la solución de reacción se le añadió una solución saturada de bicarbonato de sodio para ajustar el pH a de 8-9 y luego se filtró para eliminar las sales inorgánicas generadas. El filtrado se concentró al vacío y finalmente se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 10:1) para obtener un sólido amarillo, que era la 3-acetil-1-ciclopentil-4-metil-7-((5-(piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (62 mg, rendimiento: 45%). LCMS (ESI): m/z 446 [M 1]+ . Pf: 190,5-191,7° C; 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 10,08 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 8,77 (d, J = 11,5 Hz, 1H), 8,30 (s, 1H), 8,14 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 7,61 (m, 1H), 7,41 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,70 (m, 1H), 3,36 (m, 3H), 2,98 (t, J = 11,5 Hz, 1H) , 2,86 (t, J = 11,9 Hz, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,36 (d, J = 8,5 Hz, 3H), 2,26 (m, 4H), 1,85 (m, 8H).
Paso 5i: Preparación de 3-acetil-1 -ciclopentil-4-metil-7-((5-(1 -(2-(metilsulfonil)etil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (Compuesto 13)
El compuesto 3-acetil-1-ciclopentil-4-metil-7-((5-(piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)-1,6-naftiridin-2(1H)-ona (309) (140 mg, 0,31 mmoles, 1,0 eq.) se disolvió en acetonitrilo (50 ml) y se añadió carbonato de potasio (43 mg, 0,31 mmoles, 1,0 eq.). Después de que la temperatura de reacción se elevó a 50° C, se añadió gota a gota lentamente una solución de metanosulfonato de 2-(metilsulfonil)etilo (111-1) (20,7 ml, 0,37 mmoles, 1,2 eq.). Después, la reacción se agitó a 80° C durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, se extrajo con diclorometano y agua y se repartió. La fase orgánica se lavó dos veces con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para obtener el producto bruto como un sólido amarillo que se separó y purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol = 100:1 a 10:1). para dar 3-acetil-1-ciclopentil-4-metil-7-((5-(1-(2-(metilsulfonil)etil)piperidin-4-il)piridin-2-il)amino)-1,6-naftiridin-2(1H)-ona como un sólido amarillo (117 mg, rendimiento: 68,4%). LCMS (ESI): m/z 552 [M 1]+ . Pf: 140,7-144,9 °C; 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 10,03 (s, 1H), 8,77 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,63 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,68 (p, J = 9,1 Hz, 1H), 3,31 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 3,05 (s, 3H), 3,01 (d, J = 10,2 Hz, 2H), 2,74 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 2,51 (s, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 2,24 (d, J = 15,0 Hz, 2H), 2,18 (s, 2H), 2,08 (t, J = 11,2 Hz, 2H), 1,89 (d, J = 9,3 Hz, 2H), 1,76 (d, J = 11,9 Hz, 4H), 1,63 (dd, J = 22,7, 11,5 Hz, 2H).
Ejemplo 6 Prueba de actividad biológica
1. Experimento de inhibición de la actividad enzimática
1. Método experimental
(1) Experimento de inhibición de la actividad CDK2
La actividad de la proteína quinasa CDK2 se midió usando el ensayo de cambio de movilidad Caliper (véase J Biomol Screen 14: 31, 2009).Los compuestos obtenidos anteriormente se disolvieron en DMSO y luego se diluyeron con solución tampón de quinasa (20 mM de HEPES-pH 7,5, Triton X-100 al 0,01%, MgCl210 mM, DTT 2 mM), se añadió 5 pl de los compuestos disueltos en 10% de DMSO a cinco veces la concentración final a una placa de 384 pocillos, el pocillo de control sin compuesto fue 5 gl de DMSO al 10%, el pocillo de control sin actividad enzimática fue 5 gl de solución tampón de quinasa. Se añadió 10 gl de la solución de enzima CDK2, 2,5 veces diluida (Carna, N° de catálogo 04-103) y después se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se añadió 10 gl de la solución 2,5 veces diluida del sustrato de péptido FAM-P18 (GL Biochem, N° de catálogo 114202). Después de ser incubados a
28° C durante 60 minutos, se añadió 25 |jl de solución de parada para detener la reacción. Los datos de la tasa de conversión se leyeron del Caliper EZ Reader II (Caliper Life Sciences). Los datos de la tasa de conversión se convirtieron en datos de la tasa de inhibición. En donde max se refiere a la tasa de conversión del pocillo de control de DMSO sin compuesto y min se refiere a la tasa de conversión del pocillo de control sin actividad enzimática. La curva se representó gráficamente con la concentración del compuesto y la tasa de inhibición como coordenadas horizontales y verticales, y la IC50 se calculó mediante el ajuste de la curva usando XLFit de Excel software add-in versión 4.3.1. La tasa de inhibición% = (tasa de conversión max) / (max-mín) x 100.
(2) Experimento de inhibición de la actividad CDK4
La actividad de la proteína quinasa CDK2 se midió usando el ensayo de cambio de movilidad Caliper (véase J Biomol Screen 14:31, 2009). Los compuestos obtenidos anteriormente se disolvieron en DMSO y luego se diluyeron con solución tampón de quinasa (h Ep ES 20 mM-pH 7,5, Triton X-100 al 0,01%, MgCl210 mM, DTT 2 mM), se añadió 5 pl de los compuestos disueltos en 10% de DMSO a cinco veces la concentración final a una placa de 384 pocillos, el pocillo de control sin compuesto fue 5 j l de DMSO al 10%, el pocillo de control sin actividad enzimática fue 5 j l de solución tampón de quinasa. Se añadió 10 j l de la solución de enzima CDK4 diluida 2,5 veces (GST-CDK4 (1-303end) / GST-CycD3 (1-292end; Carna, N° de catálogo 04-105) y luego se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos, a continuación, se añadió 10 j l de la solución sustrato de péptido FAM-P8 (GL Biochem, Cat. N°. 112396) diluida 2,5 veces. Después de ser incubados a 28° C durante 3 horas, se añadió 25 j l de solución de parada para detener la reacción. Los datos de la tasa de conversión se leyeron de Caliper EZ Reader II (Caliper Life Sciences). Los datos de la tasa de conversión se convirtieron en datos de la tasa de inhibición según el método descrito anteriormente. Tasa de inhibición% = (max-tasa de conversión) / (max-mín) x 100.
(3) Experimento de inhibición de la actividad CDK6
La actividad de la proteína quinasa CDK6 se midió usando el ensayo de cambio de movilidad Caliper (véase J Biomol Screen 14:31, 2009). Los compuestos obtenidos anteriormente se disolvieron en DMSO y luego se diluyeron con solución tampón de quinasa (h Ep ES 20 mM-pH 7,5, Triton X-100 al 0,01%, MgCh 10 mM, DTT 2 mM), se añadió 5 j l de los compuestos disueltos en 10% de DMSO a cinco veces la concentración final a una placa de 384 pocillos, el pocillo de control sin compuesto fue 5 j l de DMSO al 10%, el pocillo de control sin actividad enzimática fue 5 j l de solución tampón de quinasa. Se añadió 10 j l de la solución de enzima CDK6 diluida 2,5 veces (GST-CDK6 (1-326end); Carna, N° de catálogo 04-107) y después se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se añadió 10 j l de la solución sustrato de péptido FAM-P8 (GL Biochem, N° de catálogo 112396) diluida 2,5 veces. Después de ser incubados a 28° C durante 40 minutos, se añadió 25 j l de solución de parada para detener la reacción. Los datos de la tasa de conversión se leyeron de Caliper EZ Reader II (Caliper Life Sciences). Los datos de la tasa de conversión se convirtieron en datos de la tasa de inhibición. En donde max se refiere a la tasa de conversión del control DMSO (sin compuesto) y min se refiere a la tasa de conversión del control sin actividad enzimática. Los datos de la tasa de conversión se convirtieron en datos de la tasa de inhibición según el método descrito anteriormente. Tasa de inhibición % = (max-tasa de conversión) / (máx.-mín.) x 100.
2. Resultados experimentales
Los resultados experimentales anteriores se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 1 Resultados de la inhibición de la actividad enzimática
Nota: I significa IC50 > 500 nM, II significa 500 nM > IC50 >100 nM, III significa 100 nM > IC50 > 50 nM, IV significa 50 nM > IC50 > 10 nM y V significa IC50 á 10 nM.
De los resultados anteriores, se puede observar que los compuestos proporcionados por la presente divulgación tienen una IC50 de I para la inhibición de CDK2, es decir, al menos > 500 nM, con casi no actividad inhibitoria, una IC50 de menos de 50 nM para la inhibición de CDK6 (excepto para el Compuesto 4), y una IC50 de menos de 10 nM para la
inhibición de CDK4. Es decir, los compuestos pueden inhibir selectivamente CDK4 y CDK6 sin casi actividad inhibidora sobre CDK2, y tienen mayores actividades inhibidoras sobre CDK4 y CDK6 alcanzando 50 nM, o incluso por debajo de 10 nM, con características de gran selectividad y gran actividad.
II. Experimento de inhibición de la proliferación de células tumorales
1. Método experimental
El contenido de trifosfato de adenosina (ATP) se determinó usando el kit de ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo luminiscente (Promega, Madison, Wisconsin) para evaluar la viabilidad celular. Las líneas de células tumorales (SW620, ZR-75-1, MdA-MB-231) se adquirieron del Cell Resource Center de IBS, Fudan University, Shanghai y la American Type Culture Collection (ATCC). La densidad celular se determinó usando un contador celular automatizado Sceptre (Millipore # PHCC00000) después de que las células se digirieran con pancreatina en placas de cultivo celular y se suspendieran de nuevo en medio DPBS. Las células se diluyeron hasta una solución de 44.000 células por ml. La solución celular cuya densidad se había ajustado, se añadió a la placa de ensayo celular a 90 microlitros por pocillo. La placa de pocillos se incubó en una incubadora con 5% de CO2 a 37° C durante 24 horas y después se añadió los compuestos de ensayo a diferentes concentraciones. Las células se incubaron con los compuestos en presencia de suero bovino fetal al 10% durante 72 horas. El contenido de ATP se analizó usando el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (véase las instrucciones del fabricante) para evaluar la inhibición del crecimiento celular. En resumen, 30 pl de reactivo CellTiter-Glo® se añadió a cada pocillo, se balanceó durante 10 minutos para inducir la lisis celular, y las señales de fluorescencia se detectaron y grabaron con FluoroskanAscet FL (Thermo). El valor máximo de la señal se obtuvo de las células tratadas con dimetilsulfóxido durante 72 horas. El valor mínimo de la señal se obtuvo del medio de cultivo separado (el número de células fue cero). Tasa de inhibición % = (valor de señal máximo - valor de señal del compuesto)/(valor de señal máximo - valor de señal mínimo) x 100. Los datos se procesaron utilizando el software GraphPad Prism V5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Los valores IC50 se calcularon mediante el ajuste de las curvas de dosis-respuesta en forma de S.
2. Resultados experimentales
Los resultados experimentales anteriores se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 2 Resultados de la inhibición de la proliferación celular del tumor
Nota: I significa IC50 > 5 pM, II significa 5 pM > IC50 >1 pM, III significa 1 pM > IC50>0,5 pM, IV significa 0,5 pM > IC50 > 0,1 pM y V significa IC50 á 0,1 pM
A partir de los resultados anteriores, se puede ver que los compuestos proporcionados por la presente divulgación tienen actividad inhibidora sobre las líneas de células tumorales SW620, ZR-75-1, MDA-MB-231, y algunos compuestos tienen una actividad superior.
III. Experimento de inhibición del ciclo celular
1. Método experimental
El kit de ensayo de ciclo celular y apoptosis (Beyotime, C1052) utilizado en este experimento es un kit de ensayo para analizar el ciclo celular y la apoptosis mediante el método clásico de tinción con Propidio (tinción PI). El propidio (PI) es un tinte fluorescente de ADN de doble hebra. La combinación de propidio y ADN de doble hebra puede producir fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN de doble hebra. Después de teñir el ADN de las células con propidio, el contenido de ADN de las células se puede medir mediante citometría de flujo y, a continuación, se pueden analizar el ciclo celular y la apoptosis según la distribución del contenido de ADN.
Células MDA-MB-231 se sembraron en una placa de 6 pocillos a 3 x 105 por pocillo y se cultivaron durante 24 horas. Después de la adición de los compuestos a ensayar o los controles (PD-0332991 o LY2835219) durante 24 horas, las células se centrifugaron a 1000 rcf, (fuerza centrífuga relativa), durante 3 minutos y luego se recogieron y lavaron dos veces con PBS (solución tampón de fosfato); las células se fijaron a 4° C durante la noche con la adición de etanol al 70% previamente enfriado, y luego se centrifugaron a 1000 rcf durante 10 minutos y se lavaron dos veces con 1 x PBS; y se tiñeron con solución de tinción PI durante 30 minutos; y la detención del ciclo celular G1 se detectó y analizó mediante citometría de flujo.
2. Resultados experimentales
En el ciclo de las células tumorales, la unión de CDK4 y CDK6 a la ciclina D promueve la entrada desde la fase G1 a la fase S. El inhibidor de CDK4/6 detiene selectivamente el paso de las células tumorales de la fase G1 a la fase S. Los resultados de detección del ciclo celular de las células de cáncer de mama MDA-MB-231 mediante citometría de flujo indican que los compuestos inhibidores de CDK4/6 proporcionados por la presente divulgación detienen el crecimiento de las células en la fase G1 y reducen las células de la fase S en una manera dependiente de la concentración, como se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 3 Resultados del experimento del ciclo celular
IV. Experimento de Western Blot
1. Método experimental
Se cultivaron células MDA-MB-231 en cultivo de monocapa. Después de la incubación con los compuestos a ensayar o los compuestos de control (PD-0332991 o LY2835219) durante 16 horas, las células se lavaron dos veces con PBS previamente enfriado y se recogieron, luego se homogeneizaron de 2-3 veces con un homogeneizador de muestras biológicas y luego se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min a 4° C, finalmente tomándose el sobrenadante. La concentración de proteína se determinó por el método de Branfor. Después de agregar un tampón de carga (Beyotime, # P0015L), el sobrenadante se hirvió a 100° C durante 8 minutos y la proteína se separó mediante electroforesis SDS-PAGE al 8%-10%, y luego se transfirió a la membrana de PVDF, la membrana se bloqueó con leche desnatada en polvo al 5% durante 45 minutos, y luego las células se incubaron durante la noche a 4° C con el anticuerpo primario p-actina (CST, #4970), Rb (D20) mAB de conejo (CST, #9313), mAb de conejo Phospho-Rb (Ser780) (D59B7) (CST, #8180), y luego se lavó la membrana con solución de TBST durante 3 x 10 minutos. Las células se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 horas con el anticuerpo secundario fluorescente IRDye@680CW de carnero (policlonal) Anti-conejo 1gG (H+L), Highly Cross Adsorbed(Ll-COR, #926-68071), y luego, la membrana se lavó en las mismas condiciones anteriores. Finalmente, se detectó la membrana y se obtuvieron imágenes en un sistema de escaneo de fluorescencia infrarroja LI-COR Odyssey, y los resultados se muestran en la FIG.1.
2. Resultados experimentales
CDK4/6 puede hacer que la proteína Rb pierda la detención del ciclo celular al fosforilar la proteína Rb, la proteína supresora de tumores. El inhibidor de CDK4/6 puede prevenir la inactivación de la proteína supresora de tumores Rb y, por tanto, restaurar la detención de Rb del ciclo celular. Se puede observar en la FIG.1 que los compuestos 1 y 2 proporcionados por la presente divulgación pueden reducir eficazmente la fosforilación de Rb en el sitio Ser780 actuando sobre las células de cáncer de mama MDA-MB-231.
Ejemplo 7 Experimento farmacocinético (PK)
1. Método experimental
Se mantuvieron en ayunas durante la noche ratas SD macho que pesaban de 300-350 g antes del experimento. Los compuestos a ensayar se disolvieron en 30% sulfobutiléter-p-ciclodextrina (SBE-p-CD) y las ratas se administraron por vía intragástrica a 20 mg/kg. La sangre se extrajo de las colas de las ratas a los 15 minutos, 30 minutos y 1,2, 3, 4, 6, 8 y 24 horas después de la administración, con aproximadamente 0,3 ml de sangre en cada punto de tiempo, y luego la sangre se colocó en un tubo de centrífuga que contenía K2-EDTA y se centrifugó (2000 g, 10 minutos, 4° C) para tomar el plasma, que luego se almacenó en un congelador de temperatura ultra baja a -80° C. Se mezcló 50 pl de muestra de plasma con 5 pl de estándar interno (IS) y se extrajo con acetato de etilo. El residuo se volvió a disolver en acetonitrilo después de secar al vacío. La muestra se filtró y se inyectó en LC-MS/MS para su análisis para determinar la concentración de los compuestos a ensayar.
2. Resultados experimentales
Los resultados se muestran en la siguiente tabla y las FIGS. 2-4.
Tabla 4 Resultados del experimento farmacocinético
En la tabla: Tmax se refiere al tiempo en que sucede el pico máximo, Cmax se refiere a la concentración plasmática máxima del fármaco, T1/2 es la semivida, la AUC last se refiere al área bajo la curva de la curva de concentración en el tiempo de 0-24 horas, la AUC inf se refiere al área bajo la curva de concentración en el tiempo 0-Infinito.
Puede verse a partir de los resultados anteriores que los compuestos 1 y 2 proporcionados por la presente divulgación tienen una buena absorción y una alta exposición en la sangre después de la administración intragástrica. En comparación con el control PD-0332991, la C„„ de los compuestos es aproximadamente de 4-7 veces mayor y la AUC es aproximadamente de 3-9 veces mayor. Los resultados clínicos de la Fase I mostraron que la exposición sanguínea de palbociclib (PD-0332991) después de la absorción oral fue baja, puesto que la semivida de eliminación fue larga (promedio de 25,9 horas), la dosificación diaria repetida conduciría a la acumulación del fármaco (Keith T, et al. Clin Cancer Res 18: 568, 2011). Los compuestos 1 y 2 se absorbieron bien por vía oral, la Cmax y la AUC aumentaron significativamente, mientras que las semividas fueron relativamente cortas.
Ejemplo 8 Experimento farmacodinámico
1. Método experimental
Las células de cáncer de mama MDA-MB-435 se obtuvieron del Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Sciences. Células crioconservadas se descongelaron en un baño de agua a 37° C y después se colocaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de insulina (Bioman Biotech, Shanghai) y se incubaron en 5% de CO2 en la incubadora de cultivo de tejidos. Las células cultivadas se recogieron cuando alcanzaron la cantidad deseada y luego se lavaron con solución tampón de fosfato de Dulbecco sin suero (DPBS). Se inyectaron 3,5 x 106 células suspendidas en 0,1 ml de RPMI 1640 y 0,1 ml de gel ECM (Sigma-Aldrich) en el área subcutánea del lado posterior derecho de cada ratón evitando cuidadosamente los vasos sanguíneos. El signo de un trasplante exitoso fue la formación de un bulto redondo y abultado debajo de la piel. El tamaño del tumor se puede medir aproximadamente dos semanas después de la implantación. El tamaño del tumor se midió con un calibre. El volumen del tumor se calculó mediante la siguiente fórmula: volumen del tumor = (largo x ancho2)/2, tasa de cambio de crecimiento del tumor (T/C%) = 100 x AT/AC.
2. Resultados experimentales
Después de 6 días de administración oral de PD-0332991 a 150 mg/kg una vez al día, el peso corporal medio de los ratones se redujo significativamente y la dosis se ajustó posteriormente a 100 mg/kg con administración oral una vez al día. El Compuesto 1 se administró por vía oral dos veces al día a 75 mg/kg, y se detuvo la administración de PD-0332991 y Compuesto 1 después de 2 semanas de administración, y se continuó observando el tamaño del tumor y el cambio de peso corporal.
Los resultados se muestran en la FIG. 5 y la FIG. 6, la FIG. 5 es una curva de cambio del volumen tumoral y la FIG. 6 es una curva de cambio del peso corporal de los ratones. PD-0332991 y el Compuesto 1 inhibieron el crecimiento tumoral con los valores de T/C de 41% y 25%, respectivamente, después de 14 días de administración, lo que muestra que el compuesto 1 tiene mayor actividad anticancerígena y mejor seguridad que PD- 0332991. El día 6 después de la interrupción (es decir, D 20), los valores de T/C de PD-0332991 y el compuesto 1 fueron 35% y 32%, respectivamente, lo que muestra largos efectos de los dos compuestos.
Claims (13)
1. Un compuestos de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo como se muestra en la fórmula (I):
En donde: Y se selecciona del grupo que consiste en C y N, y no hay sustitución por R6 cuando Y es N;
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6 y cicloalquilo C3-C6 sustituido con metilo; R2 se selecciona del grupo que consiste en halógeno, COR5 y COOR5 ;
R3 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6;
R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido con hidroxi, alquilo C1-C6 sustituido con alcoxi, fenilo, y fenilo sustituido con halógeno;
R5 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C1-C6, fluoroalquilo C1-C6, y cicloalquilo C3-C6;
R6 se selecciona del grupo que consiste en H, F, CN y CH3 ;
m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 y 2;
n se selecciona del grupo que consiste en 1,2 y 3; y
p se selecciona del grupo que consiste en 1,2 y 3.
2. El compuesto de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, en donde,
R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido con hidroxi, y alquilo C1-C6 sustituido con alcoxi.
3. El compuestos de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 2, en donde,
R4 se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo e isopropilo.
4. El compuestos de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, en donde,
m se selecciona de: 1;
n se selecciona de: 2; y
p se selecciona entre: 1 o 2.
5. El compuestos de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, en donde,
Y se selecciona de: N.
6. El compuesto de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde,
R1 se selecciona de cicloalquilo C3-C6;
R2 se selecciona de COR5 ;
R3 se selecciona de alquilo C1-C6;
R5 se selecciona de alquilo C1-C6; y
R6 se selecciona de: H.
7. El compuestos de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 6, en donde,
R1 se selecciona de ciclopentilo;
R2 se selecciona de COR5 ;
R3 se selecciona de metilo;
R5 se selecciona de metilo y etilo; y
R6 se selecciona de: H.
8. El compuestos de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, que es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3
Compuesto 4 Compuesto 5 Compuesto 6
Compuesto 7 Compuesto 8 Compuesto 9
Compuesto 10 Compuesto 11 Compuesto 12
Compuesto 13 Compuesto 14 Compuesto 15
9. El uso de un compuesto de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la preparación de fármacos antitumorales.
10. El uso según la reivindicación 9, en donde los tumores son tumores sólidos y tumores hematológicos.
11. El uso según la reivindicación 10, en donde los tumores sólidos y los tumores hematológicos incluyen el cáncer de mama, liposarcoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de ovario, glioblastoma, melanoma, mieloma múltiple y linfoma de células de manto.
12. El uso según la reivindicación 11, en donde el cáncer de mama incluye el cáncer de mama localmente avanzado o cáncer de mama metastásico con receptor de estrógeno positivo y receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano negativo en mujeres posmenopáusicas.
13. Una composición de fármaco antitumoral, en donde comprende el compuesto de pirimidina o piridopiridona o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como ingrediente activo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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