ES2830392T3 - Métodos y composiciones relacionados con fragmentos de anticuerpo que se unen a la glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72) - Google Patents

Abstract

Un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72), comprendiendo el fragmento de anticuerpo la SEQ ID nº: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 o 46.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones relacionados con fragmentos de anticuerpo que se unen a la glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72)

Referencia a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 62/028,003, presentada el 23 de julio de 2014.

Campo de la divulgación

Esta divulgación se refiere en general a anticuerpos, más en particular, a anticuerpos que son adecuados para el tratamiento del cáncer.

Antecedentes

Más del 10 % de todas las muertes son causadas por cáncer; por lo tanto, es imperativo que la investigación científica mejore e innove el estado de la técnica en prevención, diagnóstico, formación de imágenes, terapéutica y cirugía (Jemal 2011). Las técnicas tradicionales de formación de imágenes del cáncer se basan en la tomografía computarizada (TC) y la tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés). Ambos métodos adolecen de una resolución deficiente y una relación señal-ruido débil. La detección y cirugía radioinmunodirigida (RIGS, por sus siglas en inglés) es una modalidad poderosa para cartografiar con precisión las superficies de tejido canceroso, pero el catálogo actual de anticuerpos que se unen al cáncer no es ideal para estas aplicaciones (Sun 2007).

Se han desarrollado varias generaciones de anticuerpos monoclonales contra el epítopo sialil-Tn. Los dos primeros, B72.3 (Thor 1986 y Thor 1987) y CC49 (Muraro 1988; Colcher 1988), entraron en ensayos clínicos para cirugía radioinmunodirigida (RIGS), pero una fracción significativa de pacientes desarrolló anticuerpos humanos antirratón (HAMA, por sus siglas en inglés) (Dvigi 1995). En respuesta, se construyó una variante humanizada de CC49 (AKA) (Yoon 2006; Kashmiri 1995). Ninguno de los 21 pacientes experimenta HAMA cuando el procedimiento se realizó con AKA, pero el anticuerpo de tercera generación perdió más del doble de su afinidad de unión. En 2006, Yoon et al. construyeron una biblioteca Fab en CDR3 de a Ka (Yoon 2006). Este estudio produjo un Fab con unión mejorada que luego se convirtió en una IgG de longitud completa denominada 3E8.

La última generación de sialil-Tn IgG (antígenos asociados a tumores) no son inmunogénicos y se unen al epítopo sialil-Tn con una afinidad notable. Sin embargo, para satisfacer todos los requisitos de la formación de imágenes, estos anticuerpos de longitud completa requieren una reducción al armazón scFv más pequeño. Esta operación restante no es trivial, lo que probablemente describe por qué estos agentes de formación de imágenes no son comunes en los hospitales. Los dominios variables se estabilizan mediante los dominios constantes que están vacíos en el scFv truncado. Pavlinkova et al. describieron una de tales construcciones, y la posterior caracterización, de un CC49.scFv en 1999, mediante el cual unieron los genes CC49 V^h y V^l a través de una secuencia de 25 aminoácidos (Pavlinkova 1999). Independientemente, los dominios VH y VL están asociados solo débilmente por interacciones no covalentes (y posiblemente enlaces disulfuro), por lo que se requiere un enlazador de aminoácidos para ensamblar el sitio de unión al antígeno completo. A menudo, estas proteínas modificadas adolecen de pérdida de afinidad, heterogeneidad en la estructura cuaternaria y estabilidad disminuida. Lo que se necesita en la técnica es un fragmento de anticuerpo 3E8 radicalmente estabilizado, como los divulgados en la presente memoria.

Compendio

En la presente memoria se divulgan fragmentos de anticuerpo que se unen al epítopo sialil-Tn de TAG-72, comprendiendo el fragmento de anticuerpo SEQ ID n°: 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45 o 46. El anticuerpo puede ser además un diacuerpo (diabody), un tricuerpo (tribody) o un tetracuerpo (tetrabody).

T ambién se divulgan ácidos nucleicos que codifican dicho fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, estas secuencias de ácido nucleico son al menos en un 96 % idénticas a las SEQ ID n°: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 44.

Se divulga un vector que comprende dicho ácido nucleico.

Se divulgan composiciones que comprenden dichos fragmentos de anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En particular, se divulgan en la presente memoria composiciones adecuadas para el tratamiento del cáncer que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho fragmento de anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable, estando dicho fragmento de anticuerpo unido a un radionúclido, una enzima terapéutica, un fármaco anticanceroso, una citocina, una citotoxina o un agente antiproliferativo con actividad terapéutica.

Se divulga además una composición adecuada para la detección in vivo o in vitro de cáncer que comprende una cantidad eficaz para el diagnóstico de dicho anticuerpo, estando el fragmento de anticuerpo unido a un radionúclido o una enzima. La divulgación técnica detallada que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención per se y también puede proporcionar antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados. Se apreciará que los antecedentes técnicos adicionales proporcionados no están destinados a definir la invención como tal (que está definida exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas), sino más bien a situarla en un contexto técnico más amplio. En consecuencia, se apreciará que los términos "realizaciones", "aspectos", "objeto" reflejan detalles específicos de la divulgación, pero, en la medida en que se refieran a una parte de los antecedentes técnicos adicionales, no están previstos como una definición, como parte del objeto de la invención no incluida en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un esquema que describe la producción, exportación y purificación de scFv. Se muestra el péptido señal con el sitio de escisión de TEV. Téngase en cuenta que la marca 6xHis y la proteasa de TEV se eliminan mediante una segunda columna de agarosa Ni-NTA.

La figura 2 muestra la purificación de la muestra de 3E8.scFv a partir de pCOLD IV. Pista 1: esferoplastos, pista 2: fracción periplásmica después de la unión de Ni-NTA, pista 3: lavado, pista 4: 6xHis-TEV-3E8.scFv eluido, pista 5: 3E8.scFv después de la escisión de la proteasa de TEV para eliminar la marca 6xHis, pista 6: proteína purificada con Ni-NTA después de la eliminación de la proteasa de TEV y la marca 6xHis.

Las figuras 3A y 3B muestran la purificación de 3E8.scFv.Cys a partir de su fragmento proteolítico usando cromatografía de intercambio catiónico. Las dos especies se eluyeron de una columna Resource S con NaCl 450 y 600 mM, eluyéndose primero el producto auténtico. Esto se confirmó mediante SDS-PAGE. Las pistas 1 y 12 son escalera USB, pista 2: 3E8.scFv.Cys antes de la cromatografía de intercambio iónico, pistas 3-4: fracciones 1 y 2, pistas 5-8: fracciones 3-6, pistas 9-11: fracciones 7-9. El producto deseado se indica con un asterisco.

La figura 4 muestra la optimización de la extracción de periplasma. Las fracciones osmótica (O) y periplásmica (P) se comparan a través de nueve métodos de purificación. El procedimiento de lisozima modificado produjo los mejores resultados. La banda tenue por encima del producto deseado es scFv con secuencia líder PelB. Cuando se digieren con proteasa de TEV, ambas bandas de proteínas se resuelven en una sola especie. Todas las muestras purificadas son 3E8.scFv a partir de pCOLD IV en d H10B.

La figura 5 muestra la filtración en gel de fragmentos de anticuerpo. CC49.scFv es una muestra heterogénea que contiene tanto monómero como dímero. Además, el fragmento se eluye como una proteína ligeramente más grande que su peso molecular calculado, mostrando cierto grado de despliegue o expansión. El 3E8.scFv se eluye como una única especie con un peso molecular correspondiente a un monómero bien plegado.

La figura 6 muestra la estabilidad de anticuerpos y fragmentos. A. La propensión a la agregación se mide con una temperatura creciente. 3E8.scFv tiene una estabilidad intermedia entre CC49.scFv, menos estable, y 3E8.IgG, más estable. B. El HTTS muestra resultados similares a los presentados por DSLS, con una segunda transición de despliegue para 3E8.IgG. Los dominios de unión de 3E8.scFv y 3E8.IgG se despliegan ambos a 66 °C.

La figura 7 muestra la unión de anticuerpo y fragmento. A. Un ensayo de transferencia puntual (dot blot) muestra que tanto CC49.scFv como 3E8.scFv se unen a BSM (sialil-Tn), pero no a BSA. B. Un ensayo de inhibición con IgG fluorescente y scFv no marcado muestra que el scFv se une con una fuerza ~16 veces menor que la IgG bivalente. (-)* se realizó con IgG 0,25 pM sin BSM. (-)** se realizó usando fluoresceína libre en ausencia de anticuerpo. C. Sensogramas de SPR para cada variante.

La figura 8 muestra un ensayo de transferencia puntual utilizando peroxidasa de rábano picante como informador. Aquí, el scFv se une específicamente a la sección de nitrocelulosa que se transfirió con mucina que contiene el epítopo t AG-72. El color marrón es el resultado de la reacción química catalizada por peroxidasa de rábano picante, que está enlazada al scFv por la interacción biotina-estreptavidina.

La figura 9 muestra una tinción inmunohistoquímica de cáncer de colon humano. El scFv tiñe intensamente la mucina extracelular y las vacuolas intracelulares que contienen el epítopo TAG-72.

La figura 10 muestra una NHS-PEGilación de 3E8.scFv. Pista 1: escalera USB, pistas 2 y 3: fragmento de anticuerpo no modificado, pista 4: reacción con un exceso molar 5 veces de PEG, pista 5: reacción con un exceso molar 20 veces de PEG.

La figura 11 muestra el marcaje fluorescente de fragmentos de anticuerpo con y sin marcas 6x-His. Las muestras con marcas de hexahistidina (3E8H6d y CC49H6d) generan señales más intensas debido al aumento de las concentraciones de fragmento de anticuerpo.

La figura 12 muestra la PEGilación específica de 3E8.scFv.Cys. El fragmento de anticuerpo se marcó específicamente en el residuo de cisteína C-terminal usando química de maleimida. El scFv se PEGiló casi cuantitativamente. Pista 1: 3E8.scFv.Cys parcialmente purificado, reducido, pista 2: 3E8.scFv.Cys PEGilado. Pista 3: sin relación. Pista 4: escalera.

La figura 13 muestra la caracterización biofísica de 3E8.scFv.

La figura 14 muestra estudios de unión para 3E8.scFv. Un 50 % estimado se unió a 4 j M, es decir, 3E8.scFv es aproximadamente un ligante 16 veces peor que 3E8.IgG (KD = 0,65 nM), así que tiene un KD estimado = 10,4 nM.

La figura 15 muestra una resonancia de plasmón de superficie. 3E8.scFv tiene un Kd medido de 16,4 nM, lo que indica una unión muy estrecha al sustrato adecuado.

La figura 16 muestra la inmunohistoquímica. La biotina unida a 3E8.scFv mediante lisinas puede acoplarse a un complejo enzimático cromogénico que produce un producto marrón. Usando este esquema, se puede visualizar 3E8.scFv unido a su epítopo. Los histólogos pueden utilizar esta técnica para analizar especímenes quirúrgicos para determinar el éxito de los procedimientos quirúrgicos.

La figura 17 muestra resultados de PEGilación. Se muestran PEGilaciones de T4L con un PEG de 2 kDa. Los PEG polidispersos dan como resultado manchas de productos PEGilados; los PEG discretos dan como resultado una escalera de productos PEGilados definidos.

La figura 18 muestra el disacárido Sialil-Tn y la proteína TAG-72.

La figura 19 muestra armazones de anticuerpo representados en gris unidos al antígeno (estrellas negras). También se muestra el esquema del gen scFv. A 60 grados, tanto la IgG como el scFv de 3E8 están bien plegados. A 70 grados, el scFv está completamente desplegado, al igual que el sitio de unión de la IgG. Los dominios constantes de la IgG evitan la agregación de la IgG a esta temperatura. A 85 grados, ambas moléculas se despliegan y se agregan.

La Figura 20 muestra la estructura de ScFv. A. Una exploración de longitud de onda de DC de scFv concuerda con el pliegue del dominio de inmunoglobulina. B. La filtración en gel muestra una única especie monomérica para 3E8.scFv, pero CC49 está ligeramente expandido y existe como scFv.

La figura 21 muestra que la mucina es una glicoproteína grande expresada y secretada por células sanas y enfermas. Se ha demostrado que la mucina de los adenocarcinomas sobreexpresa el disacárido, Sialil-Tn. Este epítopo está guiado con anticuerpos y fragmentos de anticuerpo.

Las figuras 22A y 22B muestran una PEGilación. Figura 22A: Modelo de 3E8.scFv - Las regiones determinantes complementarias son los lazos responsables de la unión del antígeno. La cisteína C-terminal se muestra frente al sitio de unión. Figura 22B: La PEGilación aumenta el radio hidrodinámico de las proteínas, puede reducir la inmunogenicidad, disminuir la agregación y proteger el fragmento de anticuerpo de las proteasas séricas.

La figura 23 muestra un modelado bruto de 3E8.scFv que revela cuatro lisinas dentro de las CDR responsables de la unión del antígeno.

La figura 24 muestra 3E8cys.scFv PEGilado. Se muestran fragmentos de anticuerpo modificados en un gel de SDS-PAGE. Las muestras de 40 kD se cargan a concentraciones 2x y 1x. Los polímeros de PEG no interactúan fuertemente con SDS; por lo tanto, sus masas aparentes son anómalas por SDS-PAGE en comparación con las escaleras de proteínas. Se muestran un PEG de 1,8 kD lineal y otro ramificado.

La figura 25 muestra réplicas de una unión de 3E8cys.scFv Y-40 kD a TAG-72 inmovilizada sobre papel de nitrocelulosa. El antígeno se manchó en la esquina del papel indicada con una marca de lápiz. En el extremo derecho está el control negativo, donde se realizaron todas las operaciones experimentales, pero el papel se incubó con tampón en lugar del fragmento de anticuerpo.

La figura 26 muestra la correlación entre las semividas séricas y la formación de imágenes por microPET/CT. La radiactividad sanguínea (%ID) de cada ratón individual está representada gráficamente frente a su intensidad tumoral normalizada en las imágenes por PET. Recuadro superior, imagen por microPET/CT a las 5 h; recuadro inferior, imagen por microPET/CT a las 24 h. 5 y 24 h son los puntos de tiempo apropiados para una 123I-SPECT/CT radiofarmacéutica.

La figura 27 muestra que 3E8cys.scFv se conjugó con un PEG lineal de 30 kD. Se PEGilaron y purificaron tres alícuotas de fragmento de anticuerpo. La muestra C proporcionó los mayores rendimiento y pureza, por lo tanto, se utilizó para la formación de imágenes de tumores.

La figura 28 muestra que las semividas séricas se pueden ajustar con la conjugación de polietilenglicol (PEG). Los fragmentos de anticuerpo PEGilados se muestran usando lisinas (química de éster NHS) y cisteínas (química de maleimida).

Las figuras 29A-C muestran la resección quirúrgica de prueba de concepto con imágenes intraoperatorias a través del fragmento de anticuerpo marcado con 123I. A. Imagen tomada antes de la cirugía (tumores con flechas). B. Se toma una segunda imagen para evaluar el procedimiento quirúrgico. Téngase en cuenta que el tumor residual permanece en el flanco derecho. C. Imagen tomada después de la extirpación completa del tejido canceroso.

La figura 30 muestra las unidades de respuesta para diversas concentraciones de 3E8^hl(GGGGS)³scFv .

La figura 31 muestra la desnaturalización térmica de variantes de TIM realizada con proteína 25 uM con colorante SYPRO Orange 5x. Las masas fundidas se ensayaron usando un ciclador térmico Bio-Rad C10000 con una tasa de incremento de 1 °C min-1 a intervalos de 0,2 °C. Los datos se exportaron a Microsoft Excel 2013. El T1/2 se calculó como la temperatura con la pendiente máxima determinada a partir de una ventana de 5° alrededor de cada punto.

La figura 32 muestra el inserto de plásmido para 3E8.G4S.

La figura 33 muestra dos cepas de expresión de T7 ensayadas, BLR(DE3) y HMS174(DE3). BLR (DE3) es un derivado de BL21 (DE3) que es recA-, lo que da como resultado una estabilidad mejorada del genoma y del plásmido. HMS174(DE3) es una bacteria K12 que también contiene mutaciones en el gen recA.

La figura 34 muestra las condiciones de optimización del biorreactor. Las dos condiciones principales que se optimizaron fueron el porcentaje y la fuente de oxígeno disuelto, así como la velocidad de agitación. Se utilizó el impulsor estándar de Rushton, pero no incluía deflectores. Inicialmente, se utilizaron deflectores y se ajustó la velocidad de agitación a 100 rpm según la experiencia previa con matraces de agitación; los matraces con deflector a 225 rpm condujeron a una lisis celular.

La figura 35 muestra el papel del punto de inducción y el curso del tiempo de expresión para 3E8.G4S. La muestra se preparó de manera idéntica a como se ha indicado anteriormente, pero se dejó que el cultivo alcanzase una DO600 = 45, antes de añadir IPTG 0,5 mM, desplazando la temperatura a 20 °C, reduciendo la agitación a 500 rpm y añadiendo oxígeno suplementario para mantener el dO2 al 30 %. Este cultivo mantuvo una densidad óptica de 45-50 durante casi 24 horas después de la inducción cuando se terminó el experimento. A las 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 y 8 horas, se cosecharon 50 mL de cultivo, que se congelaron rápidamente para estudios adicionales. Cada sedimento celular se resuspendió hasta una DO600 = 46 y se purificaron en paralelo 10 mL de cultivos normalizados.

La figura 36 muestra que el 3E8.G4S se expresó con una marca de hexahistidina escindible y cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC, por sus siglas en inglés). Después de la elución de la columna de Ni-NTA, la proteína se incubó a temperatura ambiente durante la noche con la cisteína proteasa del Virus del Grabado del Tabaco (TEV, por sus siglas en inglés) y DTT 1 mM. Se utiliza una segunda columna de Ni-NTA para eliminar la marca de hexahistidina, la proteasa de TEV marcada con His. Se utiliza una operación de intercambio catiónico para eliminar varios contaminantes proteicos. Por SDS-PAGE, el producto deseado es casi homogéneo.

La figura 37 muestra que se emplearon estrategias de purificación que eliminan la dependencia de las marcas de hexahistidina y la proteasa de TEV para las licencias y los costos. Como resultado, se clonaron y caracterizaron dos nuevas variantes que eliminan la secuencia de reconocimiento de la proteasa de TEV y la marca de hexahistidina. El 3E8.G4S original deja un pequeño enlazador GSSG en el extremo N. Para ensayar la importancia del enlazador, se ensayaron dos variantes: una que comienza con GSSG-QVQ... y una segunda que comienza con el QVQ... nativo.

La figura 38 muestra el procedimiento de FPLC (expresión de 1 L del matraz de agitación): La columna de proteína L se equilibra primero con 5 volúmenes de columna (VC) de tampón de unión a proteína L. A continuación, la muestra se carga a 1 mL min-1 antes de lavar con 10 VC de tampón de unión a Proteína L (lavado 1 mL min-1). (Figura 38). A continuación, la muestra se eluye con tampón de elución de proteína L (glicina 100 mM pH 3). El gel SDS-PAGE que se muestra a la derecha muestra el flujo, el lavado y la elución del 3E8.G4S marcado con hexahistidina. Téngase en cuenta que el fragmento de anticuerpo deseado está señalado con una flecha y que se unen y se eluyen de la columna de proteína L varios productos proteolíticos o contaminantes de copurificación. Estas bandas pueden eliminarse mediante cromatografía de intercambio iónico.

La figura 39 muestra una columna de intercambio iónico final que se usó para eliminar endotoxinas bacterianas. Cuando 3E8.G4S se cambia a Tris 20 mM a pH 8 o 9. Esta muestra se aplicó a una columna Resource Q donde se observó poca o ninguna unión. Se recogió el flujo, que se espera que carezca tanto de endotoxinas como de ácidos nucleicos. Los datos principales de estos experimentos se muestran en los gráficos posteriores. Téngase en cuenta que las eluciones de Resource S y los flujos de Resource Q se pasaron por gel SDS-PAGE para confirmar la identidad de la proteína.

La figura 40 muestra diversas condiciones de optimización.

La figura 41 muestra un examen por PET de un ratón 3E8.G4S con 124I-diacuerpo a las 24 horas.

La figura 42 muestra curvas de sangre para el fragmento de anticuerpo 3E8.

La figura 43 muestra el porcentaje promedio de ID/g y sd en sangre, pulmón, corazón, hígado, bazo, páncreas, GI, riñón, músculo, piel, cola y canal de ratón.

La figura 44 muestra la construcción y la purificación por IMAC de 3E8.scFv y 3E8*.G⁴S. Arriba: Se muestran los marcos de lectura abierta para los fragmentos de anticuerpo. Abajo: El scFv purificado final aparece en el segundo flujo y lavado, por SDS-PAGE. Extremo derecho: SDS-Pa Ge de escalera y 3E8*.G⁴S purificado de C43(DE3).

La figura 45 muestra un gráfico de sensor (sensorgraph) ejemplar de 3E8.scFv y constantes de disociación para todas las variantes estudiadas. Todas las variantes estudiadas hasta la fecha presentan una unión nanomolar baja a TAG-72. Las dos entradas 3E8*.G⁴S son la misma secuencia de proteínas. La primera expresión y purificación se realizó en los laboratorios de ABT. El Magliery Lab (TJM) repitió el procedimiento en C43(DE3) E. coli. Ambas purificaciones produjeron K^d nanomolares similares.

La figura 46 muestra la farmacocinética de los fragmentos de anticuerpo. Se muestran curvas de sangre de 3E8*.G⁴S, 3E8.scFv y 3E8cys.scFv 11451. La 3E8*.G⁴S presenta la semivida sérica más larga de las tres moléculas estudiadas. Téngase en cuenta que 3E8cys.scFv 10484 se muestra como recuentos/pL en lugar de ID%/g.

La figura 47 muestra datos de biodistribución para cada compuesto. La PEGilación con los PEG de 40 kD afectó radicalmente a las propiedades farmacocinéticas y la biodistribución.

La figura 48 muestra imágenes por microSPECT/CT de ratones de xenoinjerto.

La figura 49 muestra datos de neoprobe 3000.

La figura 50 muestra dos nuevas variantes que eliminan la secuencia de reconocimiento de la proteasa de TEV y la marca de hexahistidina. El extremo N comienza con la secuencia líder PelB para dirigir la proteína que contiene disulfuro hacia el periplasma. Tras la escisión de la secuencia líder por la peptidasa señal endógena de E. coli, las proteínas finales comienzan con los aminoácidos, QVQ.

La figura 51 muestra las operaciones de purificación usadas para extraer 3E8.G4S del lisado aclarado, cromatografía de proteína L. Cuando se eliminó la secuencia de reconocimiento de la proteasa de TEV y la marca de hexahistidina del marco de lectura abierta (variante QVQ), las bandas de copurificación estaban ausentes. La proteína L ha producido una purificación casi cuantitativa y casi una homogeneidad por SDS-PAGE (>95 %).

La figura 52 muestra doce transformantes individuales que fueron seleccionados, expresados, purificados y caracterizados mediante Superdex 75. Todas las preparaciones muestran características de diacuerpo, triacuerpo y tetracuerpo con menos del 10 % separando los extremos (+/- 5 % diferencia con respecto a la media).

La figura 53 muestra que los anticuerpos de longitud completa tienen vidas séricas largas debido a su gran tamaño (~160 kD) y la absorción celular a través de receptores Fc neonatales. Se muestran IgG de longitud completa marcada con ¹²⁵I, y semividas de yodo.

La figura 54 muestra curvas de sangre. 3E8.G4S se radiomarca bien con yodo utilizando el método lodogen estándar (>70 %, y llegando a alcanzar un 95 %).

La figura 55 muestra la biodistribución de 3E8.G4S en ratones. Se muestran las relaciones tumor:tejido aproximadas de la sangre (9:1), el hígado (20:1), los riñones (7:1), el Gl (29:1). Según estos análisis, 3E8.G4S es ideal para la formación de imágenes de una amplia variedad de adenocarcinomas, ya que ningún tejido acumula significativamente 3E8.G4S.

La figura 56 muestra ratones de xenoinjerto a los que se han implantado tumores de adenocarcinoma de colon humano (células LS-174T) y de los que se han obtenido imágenes con ¹⁸FDG, IgG 3E8 de longitud completa y un fragmento de anticuerpo 3E8, específicamente un componente de 3E8.G4S. Como era de esperar, el ratón ¹⁸FDG muestra una absorción inespecífica del radiotrazador y un marcaje deficiente de los dos tumores implantados en los flancos izquierdo y derecho. También se muestran 4 ratones, de los que se han obtenido imágenes a las 48 horas con 3E8.G4S.

Descripción detallada

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el que entendería comúnmente una persona con conocimientos corrientes en la técnica. En la práctica o el ensayo de la presente divulgación se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria. En la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos, que se definirán con los siguientes significados:

A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra "comprender" y otras formas de la palabra, tales como "que comprende" y "comprende", significa que incluye pero no se limita a, y no se pretende que excluya, por ejemplo, otros aditivos, componentes, números enteros u operaciones.

Tal como se usan en la descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo" incluye mezclas de dos o más de tales anticuerpos; la referencia a "la composición" incluye mezclas de dos o más de tales composiciones, y similares.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el acontecimiento o la circunstancia descritos de manera subsiguiente pueden o no ocurrir y que la descripción incluye casos en los que el acontecimiento o la circunstancia ocurren y casos en los que no.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, etc. utilizados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término «aproximadamente». El término «aproximadamente», como se usa en la presente memoria con referencia a un valor mensurable tal como una cantidad de masa, peso, tiempo, volumen, concentración o porcentaje, está destinado a abarcar variaciones de, en algunas realizaciones, ± un 20 %, en algunas realizaciones, ± un 10 %, en algunas realizaciones, ± un 5 %, en algunas realizaciones, ± un 1 %, en algunas realizaciones, ± un 0,5 % y, en algunas realizaciones, ± un 0,1 % de la cantidad especificada, cuando dichas variaciones sean adecuadas para realizar los métodos divulgados y/o emplear las composiciones divulgadas. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos que se indican en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar de acuerdo con las propiedades deseadas que se busque obtener mediante la materia divulgada en la presente memoria.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "y/o", cuando se usa en el contexto de una lista de entidades, se refiere a que las entidades están presentes individualmente o en combinación. Así, por ejemplo, la expresión "A, B, C y/o D" incluye A, B, C y D individualmente, pero también incluye todas y cada una de las combinaciones y subcombinaciones de A, B, C y D.

Con respecto a las expresiones "que comprende", "que consiste en" y "que consiste esencialmente en", cuando una de estas tres expresiones se use en la presente memoria, la materia divulgada y reivindicada en la presente memoria puede incluir el uso de cualquiera de las otras dos expresiones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la materia divulgada en la presente memoria se refiere a composiciones que comprenden anticuerpos. Una persona con conocimientos corrientes en la técnica entenderá, después de revisar la presente divulgación, que la materia divulgada en la presente memoria abarca por tanto composiciones que consisten esencialmente en los anticuerpos de la materia divulgada en la presente memoria, así como composiciones que consisten en los anticuerpos de la materia divulgada en la presente memoria.

El término "individuo" tal como se usa en la presente memoria se refiere a un miembro de cualquier especie de invertebrado o vertebrado. En consecuencia, el término "individuo" está destinado a abarcar en algunas realizaciones cualquier miembro del Reino Animalia, incluyendo, pero sin limitarse a, el phylum Chordata (por ejemplo, miembros de las clases Osteichythyes (peces óseos), Amphibia (anfibios), Reptilia (reptiles), Aves (aves) y Mammalia (mamíferos), y todos los Órdenes y Familias comprendidos en las mismas.

Las composiciones y los métodos de la materia divulgada en la presente memoria son particularmente útiles para vertebrados de sangre caliente. Por tanto, en algunas realizaciones, la materia divulgada en la presente memoria concierne a mamíferos y aves. Se proporcionan más particularmente composiciones y métodos obtenidos de y/o para uso en mamíferos tales como seres humanos y otros primates, así como aquellos mamíferos de importancia por estar en peligro de extinción (como los tigres siberianos), de importancia económica (animales criados en granjas para consumo humano) y/o de importancia social (animales mantenidos como mascotas o en zoológicos) para los seres humanos, por ejemplo, carnívoros que no sean seres humanos (tales como gatos y perros), suidos (cerdos, cerdos salvajes y jabalíes), rumiantes (tales como ganado bovino, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes y camellos), roedores (tales como ratones, ratas y conejos), marsupiales y caballos. También se proporciona el uso de los métodos y las composiciones divulgados en aves, incluidos los tipos de ave que están en peligro de extinción, mantenidas en zoológicos, así como pájaros, y más particularmente aves domesticadas, por ejemplo, aves de corral, tales como pavos, pollos, patos, gansos, gallinas de Guinea y similares, ya que también son de importancia económica para los seres humanos. Por tanto, también se proporciona el uso de los métodos y las composiciones divulgados en ganado, incluyendo, pero sin limitarse a, suidos domesticados (cerdos y cerdos salvajes), rumiantes, caballos, aves de corral y similares.

De manera similar, todos los genes, nombres de genes y productos génicos divulgados en la presente memoria pretenden corresponder a homólogos y/u ortólogos de cualesquiera especies para las cuales sean aplicables las composiciones y los métodos divulgados en la presente memoria. Así, los términos incluyen, pero no se limitan a, genes y productos génicos de seres humanos y ratones. Se entiende que cuando se divulga un gen o producto génico de una especie en particular, esta divulgación pretende ser solo ejemplar y no debe interpretarse como una limitación a menos que el contexto donde aparece lo indique claramente. Así, por ejemplo, para los genes presentados en GENBANK® números de acceso: AAA60019 y NP_004976, se pretende que las secuencias de aminoácidos humanas divulgadas abarquen genes homólogos y productos génicos de otros animales, incluyendo, pero sin limitarse a, otros mamíferos, peces, anfibios, reptiles y aves. También se incluyen todas y cada una de las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos divulgadas, incluyendo, pero sin limitarse a, las divulgadas en las correspondientes entradas de GENBANK® (es decir, J05582.1 y NM_004985, respectivamente).

Los términos "cáncer" y "tumor" se usan indistintamente en la presente memoria y pueden referirse a carcinomas y tumores sólidos primarios y metastatizados de cualquier tejido en un individuo, incluyendo, pero sin limitarse a, mama; colon; recto; pulmón; orofaringe; hipofaringe; esófago; estómago; páncreas; hígado; vesícula biliar; conductos biliares; intestino delgado; tracto urinario incluyendo riñón, vejiga y urotelio; tracto genital femenino incluyendo cuello uterino, útero, ovarios (por ejemplo, coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional); tracto genital masculino incluyendo próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de células germinales; glándulas endocrinas incluyendo tiroides, suprarrenales e hipófisis; piel (por ejemplo, hemangiomas y melanomas), huesos o tejidos blandos; vasos sanguíneos (por ejemplo, sarcoma de Kaposi); cerebro, nervios, ojos y meninges (por ejemplo, astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, schwannomas y meningiomas). Tal como se usan en la presente memoria, los términos "cáncer" y "tumor" también pretenden hacer referencia a tumores multicelulares, así como a células neoplásicas o preneoplásicas individuales. En algunas realizaciones, un cáncer o un tumor comprende un cáncer o tumor de un tejido epitelial tal como, pero sin limitarse a, un carcinoma. En algunas realizaciones, un tumor es un adenocarcinoma, que en algunas realizaciones es un adenocarcinoma de páncreas, mama, ovario, colon o recto, y/o una célula metastásica procedente del mismo.

Tal como se usa en la presente memoria en el contexto de moléculas, el término "efector" se refiere a cualquier molécula o combinación de moléculas cuya actividad se desea introducir y/o localizar en una célula. Los efectores incluyen, pero no se limitan a, marcadores, citotoxinas, enzimas, factores de crecimiento, factores de transcripción, fármacos, etc.

Tal como se usa en la presente memoria en el contexto de células del sistema inmunitario, el término "efector" se refiere a una célula del sistema inmunitario que puede inducirse a realizar una función específica asociada con una respuesta inmunitaria a un estímulo. Las células efectoras ejemplares incluyen, pero no se limitan a, células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés) y células T citotóxicas (células Tc).

Tal como se usa en la presente memoria, el concepto "vector de expresión" se refiere a una secuencia de ADN capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos concreta en una célula hospedadora apropiada, que comprende un promotor operativamente enlazado a la secuencia de nucleótidos de interés que está operativamente enlazada a señales de terminación. También comprende típicamente secuencias requeridas para la traducción adecuada de la secuencia de nucleótidos. La construcción que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérica. La construcción también puede ser una de origen natural, pero que se haya obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "hibridoma" se refiere a una célula o línea celular que se produce en el laboratorio a partir de la fusión de un linfocito productor de anticuerpos y una célula cancerosa que no produce anticuerpos, generalmente una célula de mieloma o de linfoma. Como sabrán las personas con conocimientos corrientes en la técnica, un hibridoma puede proliferar y producir un suministro continuo de un anticuerpo monoclonal específico. Los métodos para generar hibridomas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow & Lane, 1988).

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "operativamente enlazado" se refiere a elementos reguladores de la transcripción (tales como, pero sin limitarse a, secuencias promotoras, secuencias de terminación de la transcripción, etc.) que están conectados a una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia codificante o un marco de lectura abierta) de tal manera que la transcripción de la secuencia de nucleótidos está controlada y regulada por ese elemento regulador de la transcripción. De forma similar, se dice que una secuencia de nucleótidos está bajo el "control transcripcional" de un promotor al que está operativamente enlazada. Se conocen en la técnica técnicas para ligar operativamente una región promotora a una secuencia de nucleótidos.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "profármaco" se refiere a un análogo y/o un precursor de un fármaco (por ejemplo, un agente citotóxico) que carece sustancialmente de la actividad biológica del fármaco (por ejemplo, una actividad citotóxica) hasta que se somete a una etapa de activación. Las etapas de activación pueden incluir escisión enzimática, etapas de activación química tales como la exposición a un reductor, y/o etapas de activación física tales como una fotólisis. En algunas realizaciones, la activación ocurre in vivo dentro del cuerpo de un individuo.

Tal como se usan en la presente memoria, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a proteínas que comprenden uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina incluyen típicamente los genes de región constante kappa (k), lambda (A), alfa (a), gamma (y), delta (8), épsilon (e), y mu (p), así como un sinnúmero de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como k o A. En los mamíferos, las cadenas pesadas se clasifican como y, p, a, 8, o e, que definen a su vez las clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Otras especies tienen otros genes de cadena ligera y pesada (por ejemplo, ciertas aves producen lo que se denomina IgY, que es un tipo de inmunoglobulina que las gallinas depositan en las yemas de sus huevos), que están abarcados de manera similar por la materia divulgada en la presente memoria. En algunas realizaciones, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo que está presente en un antígeno tumoral.

El concepto "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que sea menor que la longitud completa. En realizaciones ejemplares, el fragmento de anticuerpo conserva al menos una parte significativa de la capacidad de unión específica del anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab'), scFv, Fv, diacuerpo, tricuerpo, tetracuerpo, fragmentos Fd o mezclas de los mismos. El fragmento de anticuerpo se puede producir por cualquier medio. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede producirse enzimática o químicamente mediante la fragmentación de un anticuerpo intacto, puede producirse de forma recombinante a partir de un gen que codifique la secuencia de anticuerpo parcial, o puede producirse total o parcialmente de forma sintética. El fragmento de anticuerpo puede ser opcionalmente un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. Como alternativa, el fragmento puede comprender múltiples cadenas que estén enlazadas entre sí, por ejemplo, mediante enlaces de tipo disulfuro. El fragmento también puede ser opcionalmente un complejo multimolecular.

Se sabe que una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena «ligera» (peso molecular medio de alrededor de 25 kilodaltons (kDa)) y una cadena «pesada» (peso molecular medio de alrededor de 50-70 kDa). Los dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas se mantienen juntos en forma dimérica mediante enlaces de tipo disulfuro que están presentes dentro de la región de la cadena pesada. El extremo N de cada cadena define una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos (a veces denominada "parátopo"). Los términos cadena ligera variable (VL, por sus siglas en inglés) y cadena pesada variable (VH, por sus siglas en inglés) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.

Los anticuerpos existen típicamente como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados que pueden producirse mediante digestión con diversas peptidasas. Por ejemplo, la digestión de una molécula de anticuerpo con papaína escinde el anticuerpo en una posición N-terminal con respecto a los enlaces de tipo disulfuro. Esto produce tres fragmentos: dos fragmentos "Fab" idénticos, que tienen una cadena ligera y el extremo N de la cadena pesada, y un fragmento "Fc" que incluye el extremo C de las cadenas pesadas que se mantienen unidas mediante los enlaces de tipo disulfuro. La pepsina, por otro lado, digiere un anticuerpo de manera C-terminal con respecto al enlace de tipo disulfuro en la región bisagra para producir un fragmento conocido como el fragmento "F(ab)'2", que es un dímero de los fragmentos Fab unidos por el enlace de tipo disulfuro. El fragmento F(ab)'2 se puede reducir en condiciones moderadas para romper el enlace de tipo disulfuro en la región bisagra y así convertir el dímero (Fab')2 en dos monómeros "Fab'". El monómero Fab' es esencialmente un fragmento Fab con parte de la región bisagra (véase, por ejemplo, Paul, 1993, para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo). Con respecto a estos diversos fragmentos, los fragmentos Fab, F(ab')2 y Fab' incluyen al menos un dominio de unión a antígeno intacto (parátopo) y, por tanto, son capaces de unirse a antígenos.

Si bien se definen diversos fragmentos de anticuerpo en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la técnica apreciará que varios de estos fragmentos (incluyendo, pero sin limitarse a, fragmentos Fab') se pueden sintetizar de novo, ya sea químicamente o utilizando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término "anticuerpo", tal como se usa en la presente memoria, incluye también fragmentos de anticuerpo producidos mediante la modificación de anticuerpos completos y/o sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante. En algunas realizaciones, el término "anticuerpo" comprende un fragmento que tiene al menos un dominio de unión a antígeno (parátopo).

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Tal como se usa en la presente memoria, el término "policlonal" se refiere a anticuerpos que están presentes juntos en una colección dada de anticuerpos y que proceden de diferentes células productoras de anticuerpos (por ejemplo, células B). Los anticuerpos policlonales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellos anticuerpos que se unen a un antígeno en particular y que se encuentran en la sangre de un animal después de que ese animal haya producido una respuesta inmunitaria contra el antígeno. Sin embargo, se entiende que una preparación policlonal de anticuerpos también se puede preparar artificialmente mezclando al menos dos anticuerpos no idénticos. Por lo tanto, los anticuerpos policlonales típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra (es decir, que se unen a) el mismo epítopo y/o diferentes epítopos (a veces denominados "determinante antigénico" o simplemente "determinante") de cualquier antígeno dado.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "monoclonal" se refiere a una sola especie de anticuerpo y/o una población sustancialmente homogénea de una sola especie de anticuerpo. Dicho de otra manera, "monoclonal" se refiere a anticuerpos individuales o poblaciones de anticuerpos individuales en las que los anticuerpos son idénticos en especificidad y afinidad, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades de poca importancia. Típicamente, un anticuerpo monoclonal (mAb o moAb) es generado por una sola célula B o una célula descendiente de la misma (aunque la materia divulgada en la presente memoria también incluye anticuerpos "monoclonales" producidos mediante técnicas de biología molecular como se describe en la presente memoria). Los anticuerpos monoclonales (mAb o moAb) son altamente específicos y están dirigidos típicamente contra un solo sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, un mAb dado está dirigido típicamente contra un solo epítopo del antígeno.

Además de su especificidad, los mAb pueden ser ventajosos para algunos propósitos porque pueden sintetizarse sin contaminarse por otros anticuerpos. Sin embargo, no debe interpretarse que el modificador "monoclonal" requiera la producción del anticuerpo mediante ningún método en particular. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los mAb de la materia divulgada en la presente memoria se preparan utilizando la metodología del hibridoma descrita por primera vez por Kohler et al., 1975, y en algunas realizaciones se preparan utilizando métodos de ADN recombinante en células procariotas o eucariotas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 4,816,567). Los mAb también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos.

Los anticuerpos, fragmentos y derivados de la materia divulgada en la presente memoria también pueden incluir anticuerpos quiméricos. Tal como se usa en la presente memoria en el contexto de anticuerpos, el término "quimérico", y variantes gramaticales del mismo, se refiere a derivados de anticuerpos que tienen regiones constantes procedentes sustancial o exclusivamente de regiones constantes de anticuerpos de una especie y regiones variables procedentes sustancial o exclusivamente de la secuencia de la región variable de otra especie.

La región variable permite que un anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a los epítopos de los antígenos. Es decir, el domino VL y el dominio VH, o subconjuntos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) dentro de estos dominios variables, de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión al antígeno tridimensional. Esta estructura cuaternaria de anticuerpo forma el sitio de unión al antígeno presente al final de cada brazo del anticuerpo. Más específicamente, el sitio de unión al antígeno está definido por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VL. En algunos casos (por ejemplo, ciertas moléculas de inmunoglobulina procedentes de especies de camélidos o diseñadas basándose en inmunoglobulinas de camélidos), una molécula de inmunoglobulina completa puede consistir únicamente en cadenas pesadas, sin cadenas ligeras.

En los anticuerpos de origen natural, hay seis CDR presentes en cada dominio de unión al antígeno que son secuencias cortas y no contiguas de aminoácidos que se colocan específicamente para formar el dominio de unión al antígeno cuando el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión al antígeno, denominados regiones "armazón", muestra menos variabilidad intermolecular. Las regiones armazón adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las CDR forman lazos que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. De este modo, las regiones armazón actúan para formar una armazón que mantiene el posicionamiento de las CDR en una orientación correcta mediante interacciones no covalentes entre cadenas. El dominio de unión al antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo del antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo análogo. Los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones armazón, respectivamente, pueden ser identificados fácilmente por una persona con conocimientos corrientes en la técnica para cualquier dominio variable de cadena ligera o pesada determinado, dado que han sido definidos con precisión (véase, por ejemplo, Chothia & Lesk, 1987; Kabat et al., 1991; Martin, 1996; Johnson & Wu, 2000).

Un tipo especial de anticuerpo quimérico es un anticuerpo "humanizado", en el que los anticuerpos se producen sustituyendo las CDR de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón por las CDR de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Internacional PCT n° WO 1992/22653). Por tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado tiene regiones constantes y regiones variables distintas de las CDR que proceden sustancial o exclusivamente de las regiones correspondientes de un anticuerpo humano, y CDR que proceden sustancial o exclusivamente de un mamífero distinto de un ser humano.

Los fragmentos Fv corresponden a los fragmentos variables en los extremos N de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina. Los fragmentos Fv parecen tener menor energía de interacción de sus dos cadenas que los fragmentos Fab. Para estabilizar la asociación de los dominios VH y VL, pueden enlazarse con péptidos (véase, por ejemplo, Bird et al., 1988; Huston et al., 1988), puentes de tipo disulfuro (véase, por ejemplo, Glockshuber et al., 1990), y/o mutaciones de tipo "botón en ojal" (véase, por ejemplo, Zhu et al., 1997). Los fragmentos de ScFv se pueden producir mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Whitlow et al., 1991; Huston et al., 1993).

Un "fragmento variable de cadena sencilla" (scFv) es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) de las inmunoglobulinas, conectadas con un péptido enlazador corto. El enlazador puede ser rico en glicina para la flexibilidad, así como serina o treonina para la solubilidad, y puede conectar el extremo N de VH con el extremo C de VL, o viceversa. Esta proteína conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción del enlazador. El scFv se puede producir en células bacterianas tales como E. coli o en células eucariotas.

Métodos y composiciones

scFv, diacuerpos, tricuerpos y tetracuerpos, y ácidos nucleicos de los mismos

Los anticuerpos que reconocen TAG-72 proporcionan un enfoque novedoso para la formación de imágenes, la detección y el tratamiento del cáncer. En la presente memoria se divulgan fragmentos de anticuerpo que se unen específicamente a la adhesina superficial de sialil-Tn de TAG-72. Los derivados de fragmentos de anticuerpo de la presente invención son ventajosamente útiles en comparación con otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpo conocidos en la técnica, porque son fáciles de expresar en grandes cantidades, pueden penetrar tejidos fácilmente y carecen de los dominios constantes que promueven funciones efectoras a menudo no deseadas y normalmente superfluas. Los scFv son monovalentes porque las cadenas pesada y ligera están unidas por un enlazador peptídico flexible, que permite que los dos dominios se plieguen e interactúen entre sí. Mediante el uso de fragmentos de anticuerpo, tales como diacuerpos, en los que el péptido enlazador se acorta, forzando así a los dominios variables de cadena pesada y ligera a interactuar para formar un dímero, se supera el inconveniente de usar scFv. Además, como consecuencia de esta interacción, el fragmento de anticuerpo es bivalente como la inmunoglobulina precursora y, por tanto, tiene una mayor avidez de unión.

Los fragmentos de anticuerpo recombinantes se pueden diseñar para ensamblarse en oligómeros multiméricos estables de alta avidez y especificidad de unión (Kortt, et al. (2001) Biomol. Eng. 18:95-108). Una molécula de scFv unida por un enlazador de 3-12 residuos no puede plegarse en un dominio Fv funcional y, en cambio, se asocia con una segunda molécula de scFv para formar un dímero bivalente (diacuerpo, aproximadamente 60 kDa). Para la reticulación de los antígenos de la superficie celular son necesarios al menos dos restos de unión. El diacuerpo es la molécula de anticuerpo bivalente más pequeña capaz de cumplir este requisito.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "diacuerpo" se refiere a una construcción de anticuerpo diseñado preparada aislando los dominios de unión (cadena pesada y ligera) de un anticuerpo de unión y proporcionando un resto de enlace que une o enlaza operativamente las cadenas pesada y ligera en misma cadena polipeptídica conservando así la función de unión como está descrito en detalle por Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:6444 y revisado por Poljak (1994) Structure 2:1121-1123. Esto forma, en esencia, un anticuerpo radicalmente abreviado, que solo tiene el dominio variable necesario para unirse al antígeno. Al utilizar un enlazador que es demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígenos. Estos fragmentos de anticuerpo diméricos, o diacuerpos, son bivalentes y biespecíficos. Es evidente que puede utilizarse cualquier método para generar diacuerpos, u otros tipos de multímeros, como describen, por ejemplo, Holliger, et al. (1993) supra, Poljak (1994) supra, Zhu, et al. (1996) Biotechnology 14:192-196 y la patente de EE.UU n° 6.492.123. Una vez generada, la especificidad de unión se puede determinar mediante, por ejemplo, métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) o radioinmunoanálisis (RIA (por sus siglas en inglés)), o cinética (por ejemplo, análisis BIACORE™). Como alternativa, el diacuerpo puede someterse a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, ensayos de agregación o colonización bacteriana, para evaluar su potencia o actividad farmacológica y su eficacia potencial como agente terapéutico. Tales ensayos se divulgan en la presente memoria y son bien conocidos en la técnica. El término "diacuerpo", tal como se usa en la presente memoria, también puede referirse generalmente a un fragmento de anticuerpo que puede comprender una mezcla de diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos u otros fragmentos de anticuerpo conocidos en la técnica.

La generación de fragmentos de anticuerpo que contienen los dominios variables humanos se describe con más detalle en la sección de ejemplos de la presente solicitud.

En la presente memoria se divulgan fragmentos de anticuerpo que se unen específicamente a la glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72). Incluso más específicamente, pueden unirse al epítopo sialil-Tn de TAG-72. Estos fragmentos de anticuerpo altamente estables, de alta afinidad y que se pueden expresar en bacterias son capaces de unirse específicamente a un epítopo de glicoforma de sialil-Tn que se encuentra en TAG-72, una glicoproteína de tipo mucina que se encuentra en los adenocarcinomas humanos. Este epítopo rara vez se expresa en el microentorno del tejido sano y, por tanto, proporciona una diana específica para la formación de imágenes y la detección. Los anticuerpos radiomarcados que se unen específicamente a Sialil-Tn permiten obtener imágenes a nivel molecular y brindan la capacidad de mejorar la atención al paciente. Diversas moléculas (B72.3, CC49, huCC49, 3E8) demuestran la utilidad de los anticuerpos anti-TAG-72 en el diagnóstico y la formación de imágenes del cáncer.

En la presente memoria se describen 3E8.G4S, un fragmento de anticuerpo que incorpora componentes estructurales y del sitio de unión de un scFv CC49 y el anticuerpo 3E8, así como otras características de secuencia para la purificación y expresión bacteriana. También se describen en la presente memoria las secuencias de ADN, las secuencias de proteínas y el método de expresión en y purificación de Escherichia coli.

Los fragmentos de anticuerpo divulgados en la presente memoria tienen las siguientes propiedades: unión estrecha y específica al epítopo del cáncer, sialil-Tn (Thor 1986; Thor 1987), estabilidad mejorada para una duración útil en almacenamiento más prolongada, rendimiento durante la aplicación, resistencia a las proteasas séricas; mejor expresión y purificación a partir de bacterias; susceptibilidad para un diseño adicional; inmunogenicidad reducida; y mayor penetración tisular en comparación con los anticuerpos de longitud completa (IgG) y dominios de unión a fragmentos de antígeno (Fab) (Yokota 1992). Varias de estas propiedades existen en una o más proteínas de unión a sialil-Tn, pero hasta la fecha, ninguna molécula individual combina todas las características deseadas (Colcher 1999; Yoon 2006).

Específicamente, los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente memoria pueden tener una duración útil en almacenamiento de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses, o 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años más que un anticuerpo de longitud completa (IgG) o dominio Fab. Los fragmentos de anticuerpo divulgados en la presente memoria pueden ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces, o cualquier cantidad menor, mayor o intermedia, más resistentes a las proteasas séricas. Pueden tener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces, o cualquier cantidad menor, mayor o intermedia, más inmunogenicidad reducida que una IgG de longitud completa o un dominio Fab.

Pueden tener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces, o cualquier cantidad menor, mayor o intermedia, más penetración tisular que una IgG de longitud completa o un dominio Fab. Pueden tener 1,2 o 3 o más de estas características.

Para generar un agente de formación de imágenes y detección del cáncer con las características anteriores, se han diseñado fragmentos de anticuerpo (las SEQ ID n° 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 y 45 son ejemplos). Además, la compacidad de los fragmentos de anticuerpo, tales como los diacuerpos o mezclas de los mismos, y la falta de absorción celular mejoran la penetración tisular y proporcionan semividas séricas más flexibles. Las tasas de depuración son más rápidas que las IgG, lo que es deseable cuando se usan radionúclidos nocivos, pero se pueden extender mediante PEGilación para complementar un emparejamiento más amplio de isótopos (Yang 2003). Los fragmentos de anticuerpo inspirados en 3E8 divulgados en la presente memoria están humanizados para reducir la inmunogenicidad, se expresan bien en bacterias, son 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 °C más estables que el CC49.scFv clínicamente probado y se unen al antígeno sialil-Tn con baja afinidad nanomolar.

Los fragmentos de anticuerpo divulgados en la presente memoria se pueden preparar de diversas formas, como apreciará un experto en la técnica. En su forma más esencial, el fragmento de anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada que comprenda SEQ ID n°: 10 y una región variable de cadena ligera que comprenda SEQ ID n°: 11, o un fragmento de SEQ ID n°: 10 y 11. Por ejemplo, se puede producir un fragmento de anticuerpo tal como un diacuerpo que tenga un 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ Id n°: 10, y un 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID n°: 11. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser funcionalmente equivalentes a los que se encuentran en las SEQ ID n° 10 y 11.

El enlazador entre las cadenas pesada y ligera puede tener una longitud de 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 o 10 aminoácidos.

Los fragmentos de anticuerpo pueden tener una afinidad de unión a antígeno para sialil-Tn que sea al menos un 25 % de la de 3E8. 3E8 ha mostrado un efecto terapéutico antitumoral en ratones atímicos que portan xenoinjertos de adenocarcinoma de colon humano (Yoon 2006).

La materia divulgada en la presente memoria incluye equivalentes funcionales de los anticuerpos de la materia divulgada en la presente memoria. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "equivalente funcional", en lo que se refiere a un anticuerpo, se refiere a una molécula que tiene características de unión que son comparables a las de un anticuerpo dado. En algunas realizaciones, los anticuerpos quimerizados, humanizados y de cadena sencilla, así como sus fragmentos, se consideran equivalentes funcionales de los correspondientes anticuerpos en los que se basan.

Los equivalentes funcionales también incluyen polipéptidos con secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la secuencia de aminoácidos de las regiones variables o hipervariables de los anticuerpos de la materia divulgada en la presente memoria. Tal como se usa en la presente memoria con respecto a las secuencias de ácido nucleico y/o de aminoácidos, la expresión "sustancialmente igual" se refiere a una biosecuencia con, en algunas realizaciones, al menos un 80 %, en algunas realizaciones al menos un 85 %, en algunas realizaciones al menos aproximadamente un 90 %, en algunas realizaciones al menos un 91 %, en algunas realizaciones al menos un 92 %, en algunas realizaciones al menos un 93 %, en algunas realizaciones al menos un 94 %, en algunas realizaciones al menos un 95 %, en algunas realizaciones al menos un 96 %, en algunas realizaciones al menos un 97 %, en algunas realizaciones al menos un 98 % y en algunas realizaciones al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia con otra secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos, según lo determinado por el método de búsqueda FASTA de acuerdo con Pearson & Lipman, 1988. En algunas realizaciones, el cálculo del porcentaje de identidad se realiza en toda la longitud de la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos de un anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria.

En la presente memoria se divulga específicamente una secuencia de aminoácidos que comprende un 90 % de identidad con las SEQ ID n° 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 o 45. Se divulga además una secuencia de ácido nucleico a partir de la cual se puede expresar un fragmento de anticuerpo, tal como los fragmentos de anticuerpo divulgados en la presente memoria. También se divulga una secuencia de ácido nucleico a partir de la cual se pueden expresar a partir de los fragmentos de anticuerpo de la presente invención. En la presente memoria se divulga una secuencia de ácido nucleico que comprende un 90 % de identidad con las SEQ ID n°: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44. También se divulga un vector que comprende los ácidos nucleicos divulgados en la presente memoria. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, un segmento de ácido nucleico desnudo, un segmento de ácido nucleico asociado a un soporte, una nucleoproteína, un plásmido, un virus, un viroide o un elemento transponible. También se divulga una célula que produce los fragmentos de anticuerpo de la presente invención.

Métodos de tratamiento

En la presente memoria se divulgan composiciones que comprenden un fragmento de anticuerpo de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, se divulgan composiciones útiles para el tratamiento del cáncer que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un fragmento de anticuerpo, tal como un diacuerpo. Por ejemplo, el diacuerpo puede estar, directa o indirectamente, asociado o enlazado a un resto efector que tenga actividad terapéutica, y la composición es adecuada para el tratamiento del cáncer. El resto efector puede ser un radionúclido, una enzima terapéutica, un fármaco anticanceroso, una citocina, una citotoxina o un agente antiproliferativo.

En la presente memoria se divulga un método para el tratamiento in vivo de un mamífero que tenga un cáncer que exprese TAG-72, que comprende una etapa de administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un fragmento de anticuerpo de la presente invención.

También se divulga un método para suprimir el crecimiento tumoral en un individuo, comprendiendo el método administrar a un individuo portador de un tumor una cantidad eficaz de una composición de fragmento de anticuerpo, en donde el fragmento de anticuerpo se acopla a una composición antitumoral. Por "suprimir el crecimiento tumoral" se entiende que un tumor crezca menos que uno que no se trate (un control). Por ejemplo, el crecimiento tumoral suprimido puede significar que el tumor que se está tratando crezca un 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % menos que el crecimiento medido de un control durante el mismo período de tiempo.

Administración

Los fragmentos de anticuerpo se pueden administrar a un mamífero de acuerdo con los métodos de tratamiento antes mencionados en una cantidad suficiente para producir tal efecto con un fin terapéutico, profiláctico o de diagnóstico. Tales anticuerpos se pueden administrar a tal mamífero en una forma de dosificación convencional preparada combinando el anticuerpo con un soporte o vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable convencional según técnicas conocidas para formar una suspensión, solución inyectable u otra formulación. Un experto en la técnica reconocerá que la forma y el carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable vienen dictados por la cantidad de ingrediente activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas.

Las formulaciones farmacéuticamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, un disolvente adecuado, conservantes tales como alcohol bencílico si se desea, y un tampón. El disolvente útil puede incluir, por ejemplo, agua, alcoholes acuosos, glicoles y ésteres de fosfato y carbonato. Estas soluciones acuosas contienen no más de un 50 % en volumen de disolvente orgánico. Las formulaciones de tipo suspensión pueden incluir un medio de suspensión líquido como vehículo, por ejemplo, polivinilpirrolidona acuosa, aceites inertes tales como aceites vegetales o aceites minerales altamente refinados, o éteres de celulosa acuosos tales como carboximetilcelulosa acuosa. También puede estar presente un espesante tal como gelatina o un alginato, pueden usarse uno o más tensioactivos naturales o sintéticos o agentes antiespumantes, y pueden emplearse uno o más agentes de suspensión tales como sorbitol u otro azúcar en las mismas. Tales formaciones pueden contener uno o más adyuvantes.

La vía de administración del fragmento de anticuerpo puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral tal como se usa en la presente memoria incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. Generalmente se prefieren las formas subcutánea, intravenosa e intramuscular de administración parenteral. Las pautas posológicas parenterales y orales diarias para emplear anticuerpos humanizados de manera profiláctica o terapéutica estarán por lo general en un intervalo de aproximadamente 0,005 a 100, pero con preferencia de aproximadamente 0,5 a 10, miligramos por kilogramo de peso corporal por día.

El fragmento de anticuerpo también se puede administrar por inhalación. Por "inhalación" se entiende la administración por inhalación intranasal y oral. Las formas de dosificación apropiadas para tal administración, tales como una formulación en aerosol o un inhalador de dosis fija, se pueden preparar mediante técnicas convencionales. La cantidad de dosificación preferida de un compuesto que se vaya a emplear está por lo general dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a 1.000 miligramos, con preferencia de aproximadamente 10 a 100 miligramos/kilogramo de peso corporal.

El fragmento de anticuerpo también se puede administrar por vía tópica. Por administración tópica se entiende la administración no sistémica. Esto incluye la administración de una formulación de anticuerpo humanizado (o fragmento de anticuerpo humanizado) externamente a la epidermis o la cavidad bucal, y la instilación de tal anticuerpo en el oído, ojo o nariz, y donde sea que no entre de manera significativa en el torrente sanguíneo. Por administración sistémica se entiende administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea e intramuscular. La cantidad de un anticuerpo requerida para el efecto terapéutico, profiláctico o de diagnóstico variará, por supuesto, con el anticuerpo elegido, la naturaleza y gravedad de la afección que se está tratando y el animal que se somete al tratamiento, y en última instancia queda a discreción del médico. Una dosis tópica adecuada de un anticuerpo estará generalmente dentro de un intervalo de aproximadamente 1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal al día.

Formulaciones

Si bien es posible administrar un fragmento de anticuerpo solo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica. El ingrediente activo puede comprender, para la administración tópica, de un 0,001 % a un 10 % p/p, por ejemplo, de un 1 % a un 2 % en peso de la formulación, aunque puede llegar a comprender un 10 % p/p, pero preferiblemente no más de un 5 % p/p y más preferiblemente de un 0,1 % a un 1 % p/p de la formulación. Las formulaciones tópicas de la presente invención comprenden un ingrediente activo junto con uno o más vehículos aceptables para el mismo, y opcionalmente cualquier o cualesquiera otros ingredientes terapéuticos. El vehículo o los vehículos deben ser "aceptables" en el sentido de que sean compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no sean perjudiciales para su receptor.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas adecuadas para la penetración a través de la piel al sitio donde se requiera tratamiento, tales como linimentos, lociones, cremas, ungüentos o pastas, y gotas adecuadas para la administración en ojos, oídos o nariz. Las gotas según la presente invención pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleaginosas estériles y pueden prepararse disolviendo el ingrediente activo en una solución acuosa adecuada de un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado, y preferiblemente incluyendo un agente tensioactivo. La solución resultante puede luego clarificarse y esterilizarse por filtración y transferirse al recipiente mediante una técnica aséptica. Ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para su inclusión en las gotas son nitrato o acetato de fenilmercurio (0,002 %), cloruro de benzalconio (0,01 %) y acetato de clorhexidina (0,01 %). Los disolventes adecuados para la preparación de una solución oleaginosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol.

Las lociones de acuerdo con la presente invención incluyen las adecuadas para la aplicación en la piel o en los ojos (colirio). Un colirio puede comprender una solución acuosa estéril, que opcionalmente contiene un bactericida, y puede prepararse mediante métodos similares a los usados para la preparación de gotas. Las lociones o los linimentos para la aplicación en la piel también pueden incluir un agente para acelerar el secado y para enfriar la piel, tal como un alcohol o una acetona, y/o un humedecedor tal como glicerol, o un aceite tal como aceite de ricino o aceite de cacahuete.

Las cremas, los ungüentos o las pastas de acuerdo con la presente invención son formulaciones semisólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Pueden elaborarse mezclando el ingrediente activo en forma finamente dividida o en polvo, solo o en solución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, por medio de una maquinaria adecuada, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos tales como parafina dura, blanda o líquida, glicerol, cera de abejas, un jabón metálico; un mucílago; un aceite de origen natural tal como aceite de almendras, de maíz, de cacahuete, de ricino o de oliva; lanolina o sus derivados, o un ácido graso tal como ácido esteárico u oleico junto con un alcohol tal como propilenglicol o macrogeles. La formulación también puede comprender cualquier agente tensioactivo adecuado, por ejemplo, un tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico tal como ésteres de sorbitano o derivados de polioxietileno de los mismos. También se pueden incluir agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices silicáceas, y otros ingredientes tales como lanolina.

Los kits de acuerdo con la presente invención incluyen fragmentos de anticuerpo como se divulga en la presente memoria, e instrucciones para su uso. En estos kits también se pueden usar fragmentos de anticuerpo humanizados congelados o liofilizados que se han de reconstituir, respectivamente, mediante una descongelación (opcionalmente seguida de una dilución adicional) o mediante suspensión en un vehículo líquido (preferiblemente tamponado). Los kits también pueden incluir soluciones tampón y/o de excipientes (en forma líquida o congelada), o preparaciones tampón y/o de excipientes en polvo que se han de reconstituir con agua, con el fin de mezclarlas con los anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpo humanizados para producir una formulación adecuada para la administración. Por tanto, preferiblemente los kits que contienen los anticuerpos humanizados o los fragmentos de anticuerpo humanizados se congelan, liofilizan, prediluyen o premezclan a una concentración tal que la adición de una cantidad predeterminada de calor, de agua o de una solución proporcionada en el kit dé como resultado una formulación de concentración y pH suficientes como para ser eficaz para el uso in vivo o in vitro en el tratamiento o diagnóstico del cáncer. Preferiblemente, tal kit también comprenderá instrucciones para reconstituir y usar la composición de anticuerpo humanizado o de fragmento de anticuerpo humanizado para tratar o detectar el cáncer. El kit también puede comprender dos o más partes componentes de la composición activa reconstituida. Por ejemplo, una segunda parte componente, además de los anticuerpos humanizados o los fragmentos de anticuerpo humanizados, puede ser un quelante bifuncional, un quelato bifuncional o un agente terapéutico tal como un radionúclido, que cuando se mezcle con los anticuerpos humanizados o los fragmentos de anticuerpo humanizados forme un sistema conjugado con los mismos. Los tampones, excipientes y otras partes componentes mencionados anteriormente se pueden vender por separado o junto con el kit.

Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad y el intervalo óptimos de las dosificaciones individuales de un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo humanizado dependerán de la naturaleza y el alcance de la afección que se está tratando, la forma, la vía y el sitio de administración, y el animal en particular que está siendo tratado, y que tales parámetros óptimos pueden determinarse mediante técnicas convencionales. Un experto en la técnica también apreciará que el curso óptimo de tratamiento, es decir, el número de dosis de un anticuerpo o fragmento del mismo administradas por día durante un número definido de días, puede ser determinado por los expertos en la técnica utilizando ensayos convencionales de determinación del curso de tratamiento.

Agentes activos

Las composiciones de la materia divulgada en la presente memoria pueden comprender un agente activo, comprendiendo el agente activo un resto terapéutico, un resto de diagnóstico y/o un resto biológicamente activo. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "agente activo" se refiere por tanto a un componente de las composiciones divulgadas en la presente memoria que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo, permite la visualización de células o tejidos en los que se acumulan las composiciones de la materia divulgada en la presente memoria, la detección de epítopos a los que se unen los fragmentos de anticuerpo divulgados en la presente memoria, y/o mejora cualquiera de estas actividades. En algunas realizaciones, un agente activo de la materia divulgada en la presente memoria se selecciona del grupo que consiste en una molécula radiactiva (incluyendo, pero sin limitarse a, radionúclidos y radioisótopos), una molécula sensibilizadora, un agente de formación de imágenes u otro agente detectable, una toxina, una citotoxina, un agente antiangiogénico, un agente antitumoral, un agente quimioterapéutico, un inmunomodulador, una citocina, un grupo informador y combinaciones de los mismos. Se entiende que estas categorías no pretenden ser mutuamente excluyentes, ya que algunas moléculas radiactivas, por ejemplo, también son agentes quimioterapéuticos, algunos inmunomoduladores son citocinas, etc.

En algunas realizaciones, un agente activo comprende un quimioterapéutico. Una persona con conocimientos corrientes de la técnica conoce diversos quimioterapéuticos, que incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes tales como mostazas nitrogenadas (por ejemplo, clorambucil, ciclofosfamida, isofamida, mecloretamina, melfalán, mostaza de uracilo), aziridinas (por ejemplo, tiotepa), ésteres de metanosulfonato (por ejemplo, busulfán), nitrosoureas (por ejemplo, carmustina, lomustina, estreptozocina), complejos de platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino) y alquilantes biorreductores (por ejemplo, mitomicina C, procarbacina); agentes de rotura de la cadena de ADN (por ejemplo, bleomicina); inhibidores de la ADN topoisomerasa I (por ejemplo, camptotecina y derivados de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a, 10-hidroxicamptotecina), inhibidores de la a Dn topoisomerasa II (por ejemplo, amsacrina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, etopósido, tenipósido, podofilotoxina); agentes de unión al surco menor de ADN (por ejemplo, plicamicina); antimetabolitos tales como antagonistas del folato (por ejemplo, metotrexato y trimetrexato), antagonistas de la pirimidina (por ejemplo, fluorouracilo, fluorodesoxiuridina, CB3717, azacitidina, citarabina, floxuridina), antagonistas de la purina (por ejemplo, mercaptopurina, 6-tioguanina, fludarabina, pentostatina), análogos modificados de azúcares (por ejemplo, cictrabina, fludarabina) e inhibidores de la ribonucleótido reductasa (por ejemplo, hidroxiurea); agentes interactivos de tubulina (por ejemplo, vincristina, vinblastina, paclitaxel); corticosteroides suprarrenales (por ejemplo, prednisona, dexametasona, metilprednisolona, prednisolona); agentes de bloqueo hormonal tales como estrógenos y compuestos afines (por ejemplo, etinilestradiol, dietilestilbestrol, clorotrianiseno, dienestrol), progestinas (por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona, medroxiprogesterona, megestrol), andrógenos (por ejemplo, testosterona, propionato de testosterona; fluoximesterona, metiltestosterona), agentes hormonales liberadores de hormona luteinizante y/o antagonistas de la hormona liberadora de gonadotropina (por ejemplo, acetato de leuprolide; acetato de goserelina), agentes antiestrogénicos (por ejemplo, tamoxifeno), agentes antiandrógenos (por ejemplo, flutamida), y agentes antiadrenales (por ejemplo, mitotano, aminoglutetimida). Otros quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitarse a, taxol, ácido retinoico y derivados del mismo (por ejemplo, ácido 13-cis-retinoico, ácido holo-trans-retinoico y ácido 9-cisretinoico), sulfatiazol, mitomicina C, ácido micofenólico, sulfadietoxano y gemcitabina (4-amino-1-(2-desoxi-2,2-difluoro- -D-eryi/7ro-pentofuranosil)pimidin-2(1H)-on-2',2'-difluoro-2'-desoxicitidina).

Los fragmentos de anticuerpo en cuestión también se pueden administrar en combinación con otros agentes anticancerosos, por ejemplo, otros anticuerpos o fármacos. Además, los fragmentos de anticuerpo humanizados en cuestión pueden unirse directa o indirectamente al efector que tiene actividad terapéutica. Los restos efectores adecuados incluyen, a modo de ejemplo, citocinas (IL-2, TNF, interferones, factores estimulantes de colonias, IL-1, etc.), citotoxinas (exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, etc.), radionúclidos, tales como 90Y, 131I, 99mTc, 111In, 125I, entre otros, fármacos (metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, etc.), inmunomoduladores, enzimas terapéuticas (por ejemplo, beta-galactosidasa), agentes antiproliferativos, etc. La unión de anticuerpos a los efectores deseados es bien conocida. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5,435,990 a Cheng et al. Además, los enlazadores bifuncionales para facilitar tal unión son bien conocidos y pueden conseguirse con facilidad. Además, los agentes de quelación (quelantes y quelatos) que proporcionan la unión de radionúclidos son bien conocidos y están disponibles. Las composiciones de la materia divulgada en la presente memoria pueden comprender además un vehículo de fárma

Los fragmentos de anticuerpo divulgados también se pueden acoplar a fármacos o soportes de fármacos usando métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, la conjugación de carbodiimida, esterificación, oxidación con peryodato de sodio seguida de alquilación reductora, y reticulación con glutaraldehído (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. n° 6,071,890; y patente europea n° 0439095).

Métodos de detección

Se divulgan composiciones adecuadas para la detección in vivo o in vitro de cáncer que comprenden una cantidad eficaz para el diagnóstico de un fragmento de anticuerpo divulgado en la presente memoria. El fragmento de anticuerpo puede estar, directa o indirectamente, asociado o enlazado a una marcación detectable, y la composición puede ser adecuada para la detección de cáncer. También se divulga un método para la inmunodetección in vitro de células cancerosas que expresan TAG-72 que comprende una etapa de poner en contacto las células cancerosas con una composición que comprende un fragmento de anticuerpo de la presente invención. El fragmento de anticuerpo puede unirse a un soporte sólido, por ejemplo.

También se divulga un método de inmunodetección in vivo de células cancerosas que expresan TAG-72 en un mamífero que comprende una etapa de administrar al mamífero una cantidad eficaz para el diagnóstico de una composición que comprende el fragmento de anticuerpo de la presente invención.

Para aplicaciones de diagnóstico, se administra a un individuo una cantidad detectable de una composición de la materia divulgada en la presente memoria. Una "cantidad detectable", tal como se usa en la presente memoria para referirse a una composición, se refiere a una dosis de dicha composición tal que la presencia de la composición se pueda determinar in vivo o in vitro. Una cantidad detectable variará según diversos factores, que incluyen, pero no se limitan a, las características químicas de la composición que se está marcando, la marcación detectable, los métodos de marcaje, el método de formación de imágenes y los parámetros relacionados con el mismo, el metabolismo del fármaco marcado en el individuo, la estabilidad de la marcación (que incluye, pero no se limita a, la semivida de una marcación de radionúclido), el tiempo transcurrido después de la administración de la composición antes de la obtención de imágenes, la vía de administración, el estado físico y el historial médico previo del individuo y el tamaño y la longevidad del tumor o del presunto tumor. Por tanto, una cantidad detectable puede variar y puede adaptarse a una aplicación en particular. Después del estudio de la presente divulgación, está dentro del conocimiento de un experto en la técnica determinar tal cantidad detectable.

Tal como se usan en la presente memoria, las expresiones "resto detectable", "marcador detectable" y "agente detectable" se refieren a cualquier molécula que pueda ser detectada por cualquier resto que pueda añadirse a un fragmento de anticuerpo que permita la detección del fragmento de anticuerpo in vitro y/o in vivo. Los restos detectables representativos incluyen, pero no se limitan a, cromóforos, restos fluorescentes, enzimas, antígenos, grupos con reactividad específica, restos quimioluminiscentes y restos detectables electroquímicamente, etc. En algunas realizaciones, los anticuerpos están biotinilados.

La detección y la obtención de imágenes del fragmento de anticuerpo se pueden sintonizar, de modo que la obtención de imágenes se puede realizar en menos de 1, 2, 4, 6, 12, o 18, 24, 36 o 48 horas, o en cualquier cantidad inferior, superior o intermedia con respecto a esta cantidad. Se ha demostrado que los PEG/fragmentos mayores aumentan la semivida sérica en un 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 %, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces, en comparación con un fragmento menor. Esto permite obtener imágenes en diferentes momentos. Con fines terapéuticos, permite aumentar la ventana terapéutica.

Restos detectables

En algunas realizaciones, un resto detectable comprende un fluoróforo. Se puede emplear cualquier fluoróforo con las composiciones de la materia divulgada en la presente memoria, siempre que la conjugación del fluoróforo dé como resultado una composición que sea detectable in vivo (por ejemplo, después de la administración a un individuo) y/o in vitro, y además no afecte negativamente a la capacidad del fragmento de anticuerpo para unirse a su epítopo. Los fluoróforos representativos incluyen, pero no se limitan a, ácido 7-dimetilaminocumarin-3-carboxílico, cloruro de dansilo, nitrobenzodiazolamina (NBD), cloruro de dabsilo, ácido cinámico, ácido fluoresceincarboxílico, azul del Nilo, tetrametilcarboxirrodamina, tetraetilsulforrodamina, 5-carboxi-X-rodamina (5-ROX) y 6-carboxi-X-rodamina (6-ROX). Se entiende que estos fluoróforos representativos son únicamente ejemplares, y también se pueden emplear fluoróforos adicionales. Por ejemplo, la serie de colorantes ALEXA FLUOR® incluye al menos 19 colorantes diferentes que se caracterizan por diferentes espectros de emisión. Estos colorantes incluyen ALEXA FLUOR® 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700 y 750 (disponibles en Invitrogen Corp., Carlsbad, California, Estados Unidos de América), y el experto en la materia puede elegir qué colorante emplear después de considerar la presente memoria descriptiva basándose en criterios que incluyen, pero no se limitan a, las composiciones químicas del ALEXA FLUOR® específico, si se van a emplear múltiples restos detectables y los espectros de emisión de cada uno, la técnica de detección que se va a emplear, etc.

En algunas realizaciones, un resto detectable comprende un colorante de cianina. Los ejemplos no limitativos de colorantes de cianina que se pueden conjugar con los fragmentos de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria incluyen los ésteres de succinimida Cy5, Cy5.5 y Cy7, suministrados por Amersham Biosciences (Piscataway, Nueva Jersey, Estados Unidos de América).

En algunas realizaciones, un resto detectable comprende un colorante del infrarrojo cercano (NIR, por sus siglas en inglés). Los ejemplos no limitativos de colorantes del infrarrojo cercano que se pueden conjugar con el fragmento de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria incluyen NIR641, NIR664, NIT7000 y NIT782.

En algunas realizaciones, los anticuerpos biotinilados se detectan usando un anticuerpo secundario que comprende un grupo avidina o estreptavidina y también se conjuga con una marcación fluorescente que incluye, pero no se limita a, Cy3, Cy5, Cy7 y cualquiera de la serie ALEXA FLUOR®® de marcaciones fluorescentes disponibles en INVITROGEN™ (Carlsbad, California, Estados Unidos de América). En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo se marca directamente con una marcación fluorescente y las células que se unen al fragmento de anticuerpo se separan mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. Los expertos en la técnica conocen estrategias de detección adicionales.

Para aplicaciones de diagnóstico (que incluyen, pero no se limitan a, aplicaciones de detección y aplicaciones de formación de imágenes), los anticuerpos de la materia divulgada en la presente memoria se pueden marcar con un resto detectable. El resto detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, un resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como, pero no limitado a, 3H, 14C, 32P, 35S, 125I o 31; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente tal como, pero no limitado a, isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como, pero no limitada a, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.

La materia divulgada en la presente memoria proporciona además métodos para diagnosticar un tumor, en los que se evalúa in vitro una muestra o biopsia de un tumor. En algunas realizaciones, un ligando de guiado de la materia divulgada en la presente memoria comprende una marcación detectable tal como una marcación fluorescente, una marca de epítopo o una marcación radiactiva, cada una de las cuales se describe brevemente a continuación en la presente memoria.

Detección de una marca de epítopo

Si se ha usado una marca de epítopo, se puede usar una proteína o un compuesto que se una al epítopo para detectar el epítopo. Una marca de epítopo representativa es la biotina, que puede detectarse mediante la unión de un fluoróforo conjugado con avidina, por ejemplo, avidina-FITC. Como alternativa, la marcación puede detectarse mediante la unión de un conjugado de estreptavidina avidina-peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés), seguida de una detección colorimétrica de un producto enzimático de HRP. La producción de un producto/conjugado colorimétrico o luminiscente puede medirse utilizando un espectrofotómetro o un luminómetro, respectivamente.

Detección autorradiográfica

En el caso de un marcador radiactivo (por ejemplo, 1311 o 99mTc), la detección se puede realizar mediante autorradiografía convencional o utilizando un fosforimager, como es conocido por un experto en la técnica. Un método autorradiográfico preferido emplea placas de formación de imágenes de luminiscencia fotoestimulables (Fuji Medical Systems of Stamford, Connecticut, Estados Unidos de América). Brevemente, la luminiscencia fotoestimulable es la cantidad de luz emitida por placas de fósforo irradiadas después de la estimulación con un láser durante el barrido. La respuesta luminiscente de las placas es linealmente proporcional a la actividad.

Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para conjugar un anticuerpo con un resto detectable.

Inmunohistoquímica

En la presente memoria se divulgan métodos de uso de inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) que utilizan los fragmentos de anticuerpo divulgados en la presente memoria para detectar cáncer. La IHC detecta moléculas diana a través de complejos antígeno-anticuerpo en un espécimen patológico utilizando anticuerpos o antígenos enlazados a enzimas. La presencia de la molécula diana se puede detectar mediante un inmunoensayo enzimático.

Con la IHC se obtienen multitud de beneficios en comparación con la inmunofluorescencia tradicional. Por ejemplo, a diferencia de la inmunofluorescencia, la IHC se puede utilizar con especímenes de tejido embebidos en parafina fijados con formalina de uso común. Los especímenes patológicos, incluidas secciones de tejido histológicas y/u otras preparaciones biológicas, tales como células de cultivo de tejidos y frotis de PAP, se utilizan comúnmente en patología diagnóstica y pueden escrutarse fácilmente mediante IHC. Además, la tinción IHC es permanente y conserva la morfología celular. Una comparación de la morfología celular y la proliferación de antígenos en dos portaobjetos diferentes puede ser útil para realizar el seguimiento de la progresión de una enfermedad.

Una vez que se ha unido un anticuerpo marcado, ya sea directa o indirectamente, al espécimen, se añade un sustrato, específico para la enzima, al espécimen. Cuando se añade el sustrato, la marcación enzimática convierte el sustrato provocando un cambio de color que se puede ver con microscopía óptica. La presencia de un cambio de color indica la presencia de la molécula diana y permite a un observador determinar, evaluar y diagnosticar el nivel y la gravedad de la enfermedad.

Formación de imágenes in vivo

Los fragmentos de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria también son útiles para la formación de imágenes in vivo, en la que se administra a un individuo un anticuerpo marcado con un resto detectable tal como un agente radioopaco y/o un radioisótopo, en algunas realizaciones mediante administración intravenosa, y se ensaya la presencia y ubicación del anticuerpo marcado en el hospedador. Esta técnica de formación de imágenes puede ser útil en el estadiaje y el tratamiento de malignidades.

Por lo tanto, se divulga un método de tratamiento in vivo del cáncer que comprende las etapas de: (a) administrar por vía intravenosa un fragmento de anticuerpo marcado con radionúclido; (b) posteriormente detectar células tumorales usando una sonda de actividad de radionúclido; y (c) posteriormente eliminar mediante extirpación quirúrgica las células tumorales detectadas.

Por tanto, en algunas realizaciones, una composición de la materia divulgada en la presente memoria comprende una marcación que puede detectarse in vivo. El término "in vivo", tal como se usa en la presente memoria para describir métodos de formación de imágenes o de detección, se refiere a métodos generalmente no invasivos tales como métodos de gammagrafía, formación de imágenes por resonancia magnética, ultrasonidos o fluorescencia, cada uno de los cuales se describe brevemente a continuación en la presente memoria. La expresión "métodos no invasivos" no excluye los métodos que emplean la administración de un agente de contraste para facilitar la formación de imágenes in vivo.

En algunas realizaciones, el resto detectable se puede conjugar o asociar de otro modo con el fragmento de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria, un agente terapéutico, un agente de diagnóstico, un vehículo de fármacos o combinaciones de los mismos como se ha expuesto con más detalle anteriormente en la presente memoria. Después de la administración de la composición marcada a un individuo, y después de un tiempo suficiente para la unión, se puede visualizar la biodistribución de la composición. La expresión "tiempo suficiente para la unión" se refiere a una duración temporal que permite la unión del agente marcado a una molécula diana inducida por radiación.

Formación de imágenes gammagráficas

Los métodos de formación de imágenes gammagráficas incluyen SPECT (Tomografía Computarizada por Emisión de Fotón Único), PET (Tomografía por Emisión de Positrones), formación de imágenes con gammacámara y barrido rectilíneo. Una gammacámara y un escáner rectilíneo representan instrumentos que detectan radiactividad en un solo plano. La mayoría de los sistemas SPECT se basan en el uso de una o más gammacámaras que giran alrededor del individuo analizado y, por lo tanto, integran la radiactividad en más de una dimensión. Los sistemas PET comprenden un conjunto ordenado de detectores en un anillo que también detectan radiactividad en múltiples dimensiones.

Los instrumentos de formación de imágenes adecuados para realizar la detección y/o los métodos de formación de imágenes de la materia divulgada en la presente memoria, y las instrucciones para su uso, pueden obtenerse fácilmente de fuentes comerciales. Por ejemplo, un escáner SPECT se puede utilizar con un escáner CT, con corregistro de imágenes. Como en la PET/CT, esto permite la localización de tumores o tejidos que pueden verse en la gammagrafía SPECT, pero son difíciles de localizar con precisión con respecto a otras estructuras anatómicas. ADAC de Milpitas, California, Estados Unidos de América, y Siemens de Hoffman Estates, Illinois, Estados Unidos de América, ofrecen ambos sistemas PET y SPECT. También se pueden usar dispositivos relacionados para la formación de imágenes gammagráficas, tales como un dispositivo de formación de radioimágenes que incluye una pluralidad de sensores con estructuras colimadoras que tienen un foco de fuente común.

Cuando se emplean imágenes gammagráficas, la marcación detectable comprende en algunas realizaciones una marcación de radionúclido, en algunas realizaciones una marcación de radionúclido seleccionada del grupo que consiste en 18F, 64Cu, 65Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 80mBr, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 99mTc, 107Hg, 203Hg, 123I, 124I, 125I, I 131I, 133I, 111In, 113mln, 99mRe, 105Re, 101Re, 186Re, 188Re, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm y formas de nitruro u óxido derivadas de las mismas. En algunas realizaciones, la marcación de radionúclido comprende 131I o 99mTc.

Se conocen en la técnica métodos para el marcaje con radionúclidos de una molécula para su uso de acuerdo con los métodos divulgados. Por ejemplo, una molécula de guiado puede derivatizarse de modo que un radioisótopo pueda unirse directamente a la misma. Como alternativa, se puede añadir un enlazador para permitir la conjugación. Los enlazadores representativos incluyen isotiocianato de pentaacetato de dietilentriamina (DTPA, por sus siglas en inglés), clorhidrato de nicotinato de succinimidil 6-hidracinio (SHNH, por sus siglas en inglés), y hexametilpropileno amina oxima (patente de EE.UU. n° 6.024.938). Pueden hallarse métodos adicionales en la patente de EE.UU. n° 6,080,384.

Cuando el resto de marcaje es un radionúclido, se pueden añadir estabilizadores para prevenir o minimizar el daño radiolítico, tales como ácido ascórbico, ácido gentísico, u otros antioxidantes apropiados, a la composición que comprende la molécula de guiado marcada.

Formación de imágenes por resonancia magnética (IRM)

Las técnicas basadas en imágenes de resonancia magnética crean imágenes basadas en las tasas de relajación relativas de los protones del agua en entornos químicos únicos. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "formación de imágenes por resonancia magnética" se refiere a técnicas de fuente magnética que incluyen formación de imágenes por resonancia magnética convencional, formación de imágenes por transferencia de magnetización (MTI, por sus siglas en inglés), espectroscopia por resonancia magnética de protones (MRS, por sus siglas en inglés), formación de imágenes ponderadas por difusión (DWI, por sus siglas en inglés) y formación de imágenes por RM funcional.

Los agentes de contraste para la formación de imágenes por fuente magnética incluyen, pero no se limitan a, iones paramagnéticos o superparamagnéticos, partículas de óxido de hierro y agentes de contraste solubles en agua. Los iones paramagnéticos y superparamagnéticos pueden seleccionarse del grupo de metales que incluye hierro, cobre, manganeso, cromo, erbio, europio, disprosio, holmio y gadolinio. Los metales preferidos son hierro, manganeso y gadolinio; el más preferido es el gadolinio.

Los expertos en la técnica del marcaje de diagnóstico reconocen que los iones metálicos pueden unirse mediante restos quelantes, que a su vez pueden conjugarse con un agente terapéutico de acuerdo con los métodos de la materia divulgada en la presente memoria. Por ejemplo, los iones de gadolinio son quelados por el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA). Los iones de lantánidos son quelados por compuestos de tetraazaciclododocano. Véanse las patentes de EE.UU. n° 5,738,837 y 5,707,605. Como alternativa, se puede llevar un agente de contraste en un liposoma.

Las imágenes obtenidas utilizando una fuente magnética pueden obtenerse usando, por ejemplo, un magnetómetro de dispositivo superconductor de interferencia cuántica (SQUID, por sus siglas en inglés, disponible con instrucciones en Quantum Design de San Diego, California, Estados Unidos de América; véase también la patente de EE.UU. n° 5,738,837).

Ultrasonidos

La formación de imágenes por ultrasonidos se puede utilizar para obtener información cuantitativa y estructural de un tejido diana, incluido un tumor. La administración de un agente de contraste, tal como microburbujas de gas, puede mejorar la visualización del tejido diana durante un reconocimiento por ultrasonidos. En algunas realizaciones, el agente de contraste puede guiarse selectivamente al tejido diana de interés, por ejemplo, utilizando un péptido para la administración de fármacos guiada (por ejemplo, administración de fármacos guiada por radiación) como se describe en la presente memoria. Los agentes representativos para proporcionar microburbujas in vivo incluyen, pero no se limitan a, burbujas basadas en lípidos o lipofílicas llenas de gas (por ejemplo, patentes de EE.u U. n° 6,245,318; 6,231,834; 6,221,018; y 5,088,499). Además, puede atraparse gas o líquido en partículas inorgánicas porosas que faciliten la liberación de las microburbujas al administrarse a un individuo (patentes de EE.UU. n° 6,254,852 y 5,147,631).

Los gases, líquidos y combinaciones de los mismos adecuados para su uso con la materia divulgada en la presente memoria incluyen aire; nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; óxido nitroso; un gas inerte tal como helio, argón, xenón o criptón; un fluoruro de azufre tal como hexafluoruro de azufre, decafluoruro de disulfuro o pentafluoruro de trifluorometilsulfuro; hexafluoruro de selenio; un silano opcionalmente halogenado tal como tetrametilsilano; un hidrocarburo de bajo peso molecular (por ejemplo, que contenga hasta 7 átomos de carbono), por ejemplo, un alcano tal como metano, etano, un propano, un butano o un pentano, un cicloalcano tal como ciclobutano o ciclopentano, un alqueno tal como propeno o un buteno o un alquino tal como acetileno; un éter; una cetona; un éster; un hidrocarburo halogenado de bajo peso molecular (por ejemplo, que contenga hasta 7 átomos de carbono); o una mezcla de cualquiera de los anteriores. Los gases de hidrocarburos halogenados pueden mostrar una mayor longevidad y, por lo tanto, se prefieren para algunas aplicaciones. Los gases representativos de este grupo incluyen decafluorobutano, octafluorociclobutano, decafluoroisobutano, octafluoropropano, octafluorociclopropano, dodecafluoropentano, decafluorociclopentano, decafluoroisopentano, perfluoropexano, perfluorociclohexano, perfluoroisohexano, hexafluoruro de azufre, y perfluoroctainos, perfluorononanos; perfluorodecanos, opcionalmente bromados.

La unión de ligandos de guiado a burbujas lipofílicas se puede lograr mediante agentes de reticulación químicos de acuerdo con métodos estándar de unión proteína-polímero o proteína-lípido (por ejemplo, mediante carbodiimida (EDC) o tiopropionato (SPDP)). Para mejorar la eficacia del guiado, pueden acoplarse burbujas grandes llenas de gas a un ligando de guiado utilizando un brazo espaciador flexible, tal como un polímero sintético ramificado o lineal (patente de EE.UU. n° 6,245,318). Un ligando de guiado puede unirse a las partículas inorgánicas porosas mediante revestimiento, adsorción, disposición de capas o sometimiento a reacción de la superficie exterior de la partícula con el ligando de guiado (patente de EE.UU. n° 6,254,852).

Formación de imágenes por fluorescencia

Los métodos de formación de imágenes no invasivos también pueden comprender la detección de una marcación fluorescente. Un fármaco que comprenda un componente lipofílico (agente terapéutico, agente de diagnóstico, vector o vehículo de fármaco) puede marcarse con uno cualquiera de diversos colorantes lipofílicos que son adecuados para la formación de imágenes in vivo. Las marcaciones representativas incluyen, pero no se limitan a, colorantes de carbocianina y aminoestirilo, preferiblemente dialquilcarbocianinas de cadena larga (por ejemplo, Dil, DiO y DiD disponibles en Molecular Probes Inc. de Eugene, Oregón, Estados Unidos de América) y colorantes de dialquilaminoestirilo. Pueden incorporarse marcaciones fluorescentes lipofílicas usando métodos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, las soluciones de marcaje de células VYBRANT™ son efectivas para marcar células cultivadas de otros componentes lipofílicos (Molecular Probes Inc. de Eugene, Oregón, Estados Unidos de América).

Una marcación fluorescente también puede comprender colorantes de cianina sulfonada, incluidos Cy5.5 y Cy5 (disponibles en Amersham de Arlington Heights, Illinois, Estados Unidos de América), IRD41 e IRD700 (disponibles en Li-Cor, Inc. de Lincoln, Nebraska), NIR-1 (disponible en Dejindo de Kumamoto, Japón) y LaJolla Blue.

Además, una marcación fluorescente puede comprender un quelato orgánico derivado de iones de lantánidos, por ejemplo, quelatos fluorescentes de terbio y europio (patente de EE.UU. n° 5,928,627). Tales marcaciones se pueden conjugar o enlazar de manera covalente a un fármaco como se describe en la misma.

Para la detección in vivo de una marcación fluorescente, se crea una imagen utilizando espectros de emisión y absorbancia que sean apropiados para la marcación concreta utilizada. La imagen se puede visualizar, por ejemplo, mediante espectroscopia óptica difusa. En las patentes de EE.UU. n° 5,865,754; 6,083,486; y 6,246,901, entre otros lugares, se describen métodos y sistemas de formación de imágenes adicionales.

Radioimmunoguided System® (sistema radioinmunodirigido) (RIGS, por sus siglas en inglés)

Otra aplicación preferida de los fragmentos de anticuerpo consiste en el Radioimmunoguided System®. Esta técnica, también conocida como sistema RIGS®, implica la administración intravenosa de un anticuerpo monoclonal radiomarcado o su fragmento antes de la cirugía. Después de permitir la absorción tumoral y la eliminación de la radiactividad de la sangre, se lleva al paciente al quirófano donde se realiza la exploración quirúrgica con la ayuda de una sonda de actividad gamma de mano, por ejemplo, Neoprobe®1000. Esto ayuda al cirujano a identificar las metástasis del tumor y mejorar las complicaciones de la extirpación. El sistema RlGs® es ventajoso porque permite la detección de tumores que de otro modo no serían detectables mediante inspección visual y/o palpación. Véase O'Dwyer et al., Arch. Surg., 121:1 391-1394 (1986). Esta técnica se describe en detalle en Hinkle et al, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmacouticals, 4 :(3)339-358 (1991) (que cita numerosas referencias que describen esta técnica). Esta referencia también describe el uso de esta técnica con el propio anticuerpo monoclonal CC49. Esta técnica es particularmente útil para los cánceres de colon, mama, páncreas y ovarios.

En algunas realizaciones, los fragmentos de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria se emplean para la formación de imágenes in vivo de tumores, en donde se administra a un individuo una composición de la materia divulgada en la presente memoria, que se ha marcado con un resto de formación de imágenes tal como un agente radioopaco, un radioisótopo u otro agente de formación de imágenes, y se ensaya la presencia y ubicación de la composición marcada de manera detectable en el individuo. Esta técnica de formación de imágenes puede ser útil en el estadiaje y el tratamiento de malignidades. En algunas realizaciones, un anticuerpo se marca con cualquier resto que sea detectable in situ en un individuo, por ejemplo, mediante resonancia magnética nuclear, radiología u otros métodos de detección conocidos en la técnica.

Como tal, la materia divulgada en la presente memoria también proporciona métodos para detectar tumores en individuos. En algunas realizaciones, los métodos divulgados en la presente memoria comprenden (a) administrar al individuo una composición que comprende el fragmento de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria conjugado con una marcación detectable; y (b) detectar la marcación detectable para detectar de ese modo el tumor.

Métodos para predecir la recurrencia y/o progresión del cáncer en un individuo

En algunas realizaciones, la materia divulgada en la presente memoria también proporciona métodos para predecir la recurrencia del cáncer en un individuo. En algunas realizaciones, los métodos comprenden (a) aislar una muestra biológica que comprende células de un individuo con cáncer; (b) poner en contacto la muestra biológica con un fragmento de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria; y (c) identificar en la muestra biológica una o más células que se unen al fragmento de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria, mediante lo cual se predice la recurrencia de un cáncer en el individuo. Con respecto a estos métodos, la identificación de células que se unen al fragmento de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria puede ser indicativa de una recurrencia del cáncer de un individuo cuando el individuo había sido previamente negativo para tales células circulantes. En algunas realizaciones, la presencia de células que se unen a uno o más de los fragmentos de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria indica que el individuo tiene un riesgo aumentado de enfermedad metastásica en relación con un individuo que sea negativo para tales células.

Métodos para pronosticar la progresión del cáncer

La materia divulgada en la presente memoria también proporciona métodos para pronosticar la progresión de un cáncer en individuos. En algunas realizaciones, los métodos comprenden aislar una muestra biológica que comprende células de un individuo con cáncer; poner en contacto la muestra biológica con el fragmento de anticuerpo de la materia divulgada en la presente memoria en condiciones suficientes para que el diacuerpo se una a un epítopo presente en un tumor y/o una célula cancerosa, si está presente, en la muestra biológica; e identificar en la muestra biológica una o más células que se unen al fragmento de anticuerpo, mediante lo cual se pronostica la progresión de un cáncer en el individuo. En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende una muestra de sangre, una muestra de linfa o una fracción de la misma. En algunas realizaciones, el cáncer es un adenocarcinoma o cáncer de colon.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "pronosticar la progresión de un cáncer" se refiere a evaluar los indicios de una enfermedad cancerosa en un momento dado y compararlos con los indicios de la enfermedad cancerosa tomados en un momento anterior, siendo la comparación indicativa de una progresión del cáncer en el individuo. En algunas realizaciones, la progresión del cáncer comprende metástasis del cáncer en el individuo.

Otros usos

Los anticuerpos de la materia divulgada en la presente memoria también se pueden emplear en diversos métodos de ensayo, tales como, pero no limitados a, ensayos de unión competitiva, ensayos en sándwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación (véase, por ejemplo, Zola, 1987; Harlow& Lane, 1988).

Los anticuerpos de la materia divulgada en la presente memoria también son útiles como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, uno o más anticuerpos se inmovilizan sobre un soporte adecuado (tal como, pero sin limitarse a, una resina Sephadex o papel de filtro) usando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow & Lane, 1988.

Preparación de fragmentos de anticuerpo

También se divulgan métodos para preparar fragmentos de anticuerpo, tales como diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos o mezclas de los mismos, que comprenden: (a) cultivar una célula aislada que comprende un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo como se divulga en la presente memoria, en condiciones tales que se expresa dicho fragmento de anticuerpo; y (b) recuperar dicho fragmento de anticuerpo de la célula.

Como se divulga en la presente memoria, los fragmentos de anticuerpo divulgados en la presente memoria se pueden preparar por diversos métodos. Es importante destacar que un dominio VH y un dominio VL están presentes y están enlazados entre sí. Los dominios VH y VL pueden comprender las SEQ ID n° 10 y 11, por ejemplo.

Habiendo descrito en general la invención, ésta se entenderá más fácilmente a través de una referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan con fines ilustrativos y que no pretenden ser limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Secuencias y métodos de purificación para fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla estables y de alta afinidad que se unen al marcador de adenocarcinoma humano TAG-72

Secuencias de proteínas para 3E8.scFv y 3E8.scFv.Cys 3E8.scFv MKYLLPTAAAGLLLLAAOPAMAAHHHHHHGSSGGGENLYFOGSSGDIVMTOSP

DSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDR

FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGGGTKVEÍKLSADDAKKDAAKK

DDAKKDDAKKDLQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHAIHW VR.QAPGQR

LEW M GYFSPGNDDFKYSQKFQGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSW IM

QYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n° : 1)

3E8.scFv.Cys

M KYLLPTAAAGLLLLAAQPAM AAHHHHHHGSSGGGENLYFOGSSGDIVMTOSP

DSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDR

FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGGGTKVEIKLSADDAKKDAAKK

DDAKKDDAKKDLQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHAÍHWVRQAPGQR

LEW M GYFSPGNDDFKYSQKFQGRVTITADK8A8TAYM ELS8LRSEDTAVYYCAR8W IM

QYWGQGTLVTVSSC (SEQ ID n° : 2)

Las secuencias incluyen la secuencia líder pelB para la exportación periplásmica con la secuencia de la peptidasa señal subrayada (m KYl LPTAAAGLLLLAAQPAmA (SEQ ID n°: 3)), una marca 6xHis escindible con la secuencia de reconocimiento de proteasa de TEV (AHHHHHHGSSGGGENLYfQ (SEQ ID n°: 4)), un enlazador corto (GSSG (SEQ ID n°: 5)), el dominio VL derivado de 3E8, un enlazador conocido como 205C (LSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDL (SEQ iD n°: 6)) derivado de un scFv CC49, y el dominio VH derivado de 3E8.

Secuencias de ADN para la expresión de 3E8.scFv y 3E8.scFv.Cys

3E8.scFv (SEQ ID n°: 7)

S’CATATGAAATATCTGTTACCTACTGCTGCTGCGGGCCTGCTATTATTAGCGG

CACAACCAGCAATGGCGGCGCATCATCATCATCATCATGGGTCCTCGGGCGGTGGC

GAAAATCTGTATTTTCAGGGTAGCAGCGGCGATATTGTGATGACCCAGAGCCCGGA

TAGTTTGGCCGTTAGCCTGGGCGAACGTGCGACGATTAATTGCAAGAGCAGCCAGA

GCGTGCTTTACAGCAGCAACAATAAGAATTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCC

GGCCAGCCGCCGAAACTTTTGATTTATTGGGCGAGCACCCGTGAAAGCGGCGTGCC

GGATCGTTTCTCGGGCTCAGGCAGCGGGÁCCGATTTTACGCTGACCATCAGCAGCCT

TCAGGCGGAGGATGTCGCGGTGTACTACTGCCAGCAGTATTACAGCTATCCGTTGAC

CTTTGGGGGAGGCACCAAAGTGGAGATCAAACTGAGCGCGGATGATGCTAAGAAA

GATGCGGCGAAGAAGGACGATGCGAAAAAAGACGACGCAAAAAAGGATCTGCAGG

TGCAGCTGGTGCAGTCGGGTGCGGAAGTGAAGAAACCTGGGGCGTCGGTGAAAGTG

AGCTGCAAAGCGAGCGGCTATACCTTTACCGATCATGCGATTCATTGGGTGCGTCAA

GCGCCAGGCCAGCGTCTGGAATGGATGGGCTATTTTTCCCCAGGCAACGATGATTTC

AAGTATTCCCAGAAGTTCCAAGGGCGCGTGACCATTACCGCCGATAAAAGCGCAAG

CACCGCGTATATGGAGCTGTCCAGCCTGCGTAGCGAAGATACAGCGGTTTACTATTG

CGCACGGAGCTGGATTATGCAATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCA

GCTAAGGATCC3 ’

3E8.scFv.Cys (SEQ ID n°: 8)

5 ’CATATGAAATAT'CTGTTACCTACTGCTGCTGCGGGCCTGCTATTATTAGCGG

CACAACCAGCAATGGCGGCGCATCATCATCATCATCATGGGTCCTCGGGCGGTG

GCGAAAATCTGTATTTTCAGGGTAGCAGCGGCGATATTGTGATGA.CCCAGAGCC

CGGATAGTTTGGCCGTTAGCCTGGGCGAACGTGCGACGATTAATTGCAAGAGCA

GCCAGAGCGTGCTTTACAGCAGCAACAATAAGAATTACCTGGCGTGGTATCAGC

AAAAACCCGGCCAGCCGCCGAAACTTTTGATTTATTGGGCGAGCACCCGTGAAA

GCGGCGTGCCGGATCGTTTCTCGGGCTCAGGCAGCGGGACCGATTTTACGCTGA

CCATCAGCAGCCTTCAGGCGGAGGATGTCGCGGTGTACTACTGCCAGCAGTATT

ACAGCTATCCGTTGACCTTTGGGGGAGGCACCAAAGTGGAGATCAAACTGAGCG

CGGATGATGCTAAGAAAGATGCGGCGAAGAAGGACGATGCGAAAAAAGACGAC

G CAA A A A A G G AT CT G C AG GT G C AG CTGG T GC AGT C G GG TGC G G A AG T G A AG A A

ACCT GGGGCGTCG GTG AAAGT GAGCTGC AA AG CG AGCGGCT ATACCTTT ACCG A

TCATGCGATTCATTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGCCAGCGTCTGGAATGGATGGG

CTATTTTTCCCCAGGCAACGATGATTTCAAGTATTCCCAGAAGTTCCAAGGGCGC

GTGACCATTACCGCCGATAAAAGCGCAAGCACCGCGTATATGGAGCTGTCCAGC

CTGCGTAGCGAAGATACAGCGGTTTACTATTGCGCACGGAGCTGGATTATGCAA

T AC TGGGGC C AGGGC ACC CTGG T G A CC GrI G AGC AGCT GrI T A AG G ATC C 3 ’

Esta secuencia se ha subclonado en los plásmidos pCOLD IV (bajo el control del promotor cspA) y pHLIC (bajo el control del promotor T7), en ambos casos entre los sitios de restricción NdeI y BamHI. Se ha demostrado la expresión de 3E8.scFv a partir de pCOLD IV y pHLIC y 3E8.scFv.Cys a partir de pCOLD IV y pHLIC.

Método de expresión y purificación

Ambos scFv se producen a partir de la expresión bacteriana con exportación al periplasma, purificación por IMAC y escisión proteolítica de la marca 6xHis (figura 1).

Expresión a partir de pCOLD IV: Los plásmidos resistentes a ampicilina (3E8.scFv o 3E8.scFv.Cys) se transformaron en DH10B para la expresión de choque frío. Se cultivaron células a 37 °C en matraces de agitación con 2xYT hasta una DO600 = 0,7-1,0. En la fase logarítmica media, los matraces se sumergieron en agua helada durante 10 minutos. A continuación, las células se indujeron con IPTG 0,2 mM y se movieron a 4 °C durante 20 minutos. Después del choque frío, los matraces se devolvieron al agitador y se cultivaron durante ~16 horas a 16 °C.

Expresión a partir de pHLIC: Los plásmidos resistentes a ampicilina se transformaron en DE3 (expresión exitosa lograda en BL21 (DE3), C41 (DE3), C43 (DE3), C43 (DE3) pLysS, T7 Express LysY (NEB), T7 Express LysY/Iq (NEB)), cepas bacterianas para la expresión de choque frío. Se cultivaron células a 37 °C en matraces de agitación con 2xYT hasta una DO600 = —1,0-1,5. En la fase logarítmica tardía, los matraces se sumergieron en agua helada durante 10 minutos. A continuación, las células se indujeron con IPTG 0,05 mM y se movieron a 4 °C durante 20 minutos. Después del choque frío, los matraces se devolvieron al agitador y se cultivaron durante aproximadamente 16 horas a 16 °C.

Purificación a partir de bacterias: Se cosecharon células mediante centrifugación a 8.000 g y se resuspendieron las mismas (40 mL/1 L de cultivo) en Tris^HCl 30 mM, sacarosa al 20 %, pH 8. Se aislaron esferoplastos de 1 L de cultivo añadiendo 30 mg de lisozima, 0,05 mg de RNasa (Pierce), 100 U de DNasa (Fisher) y MgCl22 mM. La suspensión se mezcla a 4 °C con una barra de agitación magnética durante 20 minutos antes de diluirla con 80 mL de agua helada. La muestra diluida se agita durante otros 30 minutos a 4 °C antes de centrifugarla a 8.000 g. El fragmento de anticuerpo se purifica del sobrenadante mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). Por cada litro de cultivo, se añade 1 mL de agarosa Ni-NTA (Thermo) al 50 % a una columna preinstalada (Bio-Rad). A continuación, se pasa el sobrenadante a través de la resina y se lava el material unido (Tris^HCl 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM pH 8,0) antes de una elución (Tris^HCl 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM pH 8,0). El 6xHis-TEV-3E8.scFv se digiere durante la noche con proteasa de TEV marcada con 6xHis con DTT 1 mM. Después de la escisión, la muestra se dializa en fosfato de potasio 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8. La marca de hexahistidina y la proteasa de TEV fusionada con 6xHis se eliminan mediante una segunda columna de Ni-NTA. La concentración y la pureza se analizan mediante SDS-PAGE y la absorbancia a 280 nm.

Purificación de 3E8.scFv.Cys: La variante de cisteína C-terminal se purifica de manera idéntica a 3E8.scFv con las siguientes modificaciones. (1) Todas las soluciones se complementan con TCEP 1 mM para evitar enlaces disulfuro no deseados entre los residuos de cisteína C-terminal. (2) El 3E8.scFv.Cys se copurifica con un producto de degradación. Para eliminar esta proteína, se dializó el 6xHis-3E8.scFv.Cys en acetato 50 mM pH 5, NaCl 15 mM, TCEP 1 mM y se realizó una cromatografía de intercambio iónico con una columna Resource S (GE). La proteína se eluye con concentraciones crecientes de NaCl en acetato 50 mM pH 5, TCEP 1 mM. El scFv de longitud completa se eluye con NaCl 450 mM y se separa fácilmente del contaminante, que se eluye con NaCl 600 mM. Después de la elución, las fracciones deseadas se dializan en fosfato de potasio 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8 y se digieren con TEV durante la noche. La marca 6xHis y la proteasa de TEV se eliminan mediante una segunda columna de Ni-NTA.

Adición de alanina adicional después del sitio de escisión de la peptidasa señal

La purificación inicial de 3E8.scFv dio como resultado bajos rendimientos y la mayoría del fragmento de anticuerpo residía en la fracción insoluble. Parecía que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n°: 1 era un sustrato pobre para la peptidasa señal. Para mejorar la reacción de escisión, se insertó un segundo codón de alanina en la secuencia de ADN. El producto proteico resultante, MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAAHHHHHHGSSGGGENLYFQGSSGDIV (SEQ ID n°: 9), aumenta la fracción de fragmento de anticuerpo soluble (liberado por membrana).

Optimización de la extracción de periplasma

La metodología de purificación aquí descrita es el resultado de una optimización empírica que se desvía significativamente de los protocolos de purificación periplásmica estándar. La estrategia más común es resuspender las células en tampón TSE (Tris-Sacarosa-EDTA). En este protocolo, después de la incubación en TSE, las células se cosechan de la fracción osmótica por centrifugación y se resuspenden en agua complementada con magnesio. Después de la incubación en agua, la muestra se centrifuga para separar la fracción periplásmica y las células. A continuación, la fracción periplásmica se dializa para eliminar el EDTA residual antes de una IMAC. Este proceso genera volúmenes excesivamente grandes que complican las etapas de diálisis o requieren concentración. Además, pueden perderse en la fracción osmótica algunas o la totalidad de las proteínas. El 3E8.scFv se purificó con escaso rendimiento al ejecutar este protocolo estándar.

Para mejorar el rendimiento, se optimizó el procedimiento de purificación y se cuantificó la cantidad de proteína recuperada de las fracciones osmótica y periplásmica. Se cree que la diálisis es necesaria para eliminar el EDTA residual antes de aplicar la proteína a la columna de Ni-NTA. De hecho, cuando se omitió la etapa de diálisis, la cantidad de proteína recuperada disminuyó tanto en la fracción osmótica como en la periplásmica. A continuación, se cuestionó si el propio EDTA era necesario o no. El EDTA quela los cationes divalentes, dando como resultado la desestabilización de la membrana. Cuando se repitió el procedimiento en ausencia de EDTA, la etapa de diálisis ya no fue necesaria. Aquí, se obtuvo una mayor recuperación en la fracción osmótica, pero se aisló material mínimo de la fracción periplásmica. A continuación, se planteó la hipótesis de que la lisozima podría desestabilizar la membrana en lugar del EDTA. Una vez más, no se requirió diálisis y se observaron mayores rendimientos en ambas fracciones. Finalmente, el protocolo de la lisozima se modificó omitiendo la etapa de centrifugación y cosecha entre Tris-Sacarosa y agua. Esto generó proteína pura con el mayor rendimiento.

Efecto del recipiente de expresión

Las preparaciones tempranas de scFv periplásmico dieron como resultado un crecimiento lento y una lisis celular significativa. Para impedir la lisis celular, el protocolo se cambió de matraces con deflectores de aireación a matraces Erlenmeyer estándar y se redujo la agitación de 200 rpm a 100 rpm. Estas adaptaciones condujeron a valores DO600 más altos con una lisis mínima.

Propiedades físicas

Estado oligomérico

Se ha descrito que el scFv CC49 de Pavlinkova (1999) es una mezcla de monómero y dímero. Se ensayó la estructura cuaternaria de ambos scFv mediante cromatografía de filtración en gel. El 3E8.scFv tiene un peso molecular de 28 kDa y se eluye como una sola especie con un peso molecular calculado de 25 kDa. El scFv diseñado de 3E8 es monomérico sin dímero visible ni formación de oligómeros superiores. El CC49.scFv se eluye antes con un peso molecular calculado de 31 kDa, lo que sugiere cierto grado de despliegue/expansión. Además, el cromatograma de CC49 tiene un segundo pico más pequeño con una masa molecular calculada de 64 kDa, que corresponde a alguna formación de dímeros. El CC49.scFv existe como una mezcla heterogénea y puede expandirse o desplegarse ligeramente.

Estabilidad

La IgG de longitud completa y ambos scFv se ensayaron para determinar la estabilidad a la agregación mediante Dispersión de Luz Estática Diferencial (DSLS, por sus siglas en inglés) y Barrido Térmico de Alto Rendimiento (HTTS, por sus siglas en inglés). La DSLS mide la difracción de luz de 600 nm con una temperatura creciente. A medida que las proteínas se despliegan y se agregan, los productos de precipitación difractan la luz, lo que conduce a valores altos de DO600. El CC49.scFv experimenta una sola transición cooperativa con Tagg = 54,0 °C (temperatura a la que está agregada la mitad de la proteína). Se observa una transición similar en 3E8.scFv, pero la variante diseñada es ~12 °C más estable (66,0 °C). El anticuerpo de longitud completa, 3E8.IgG, es 21 °C adicionales más estable que su pariente truncado. Estos resultados muestran que el 3E8.scFv es significativamente más estable a la agregación que el CC49.scFv, pero más propenso a la agregación que la IgG correspondiente.

Una segunda técnica para medir la estabilidad de las proteínas se basa en la unión de colorantes hidrófobos de productos intermedios desnaturalizados térmicamente (HTTS). Aquí, se informa de que los valores THTTS (temperatura a la que está desplegada la mitad de la proteína) concuerdan en gran medida con los valores Tagg mostrados para ambos scFv (55,4 °C - CC49.scFv y 66,0 °C - 3E8.scFv). La IgG de longitud completa muestra dos transiciones de despliegue - una a 66,2 °C y una segunda a 83,6 °C. La primera transición se superpone al acontecimiento de despliegue observado para 3E8.scFv y puede describir los dominios variables de despliegue. La segunda transición, por tanto, corresponde al despliegue de los dominios constantes. Estos datos, junto con los valores de DSLS, muestran que la estabilidad aumentada de los dominios constantes evita que la IgG se agregue, pero tanto el scFv de 3E8 como la IgG se inactivan a 66 °C. Por lo tanto, se ha producido con éxito un fragmento variable de cadena sencilla que es radicalmente más estable que CC49.scFv e igual a la estabilidad de 3E8.IgG.

Unión

Transferencia puntual de fluorescencia

La mucina submaxilar bovina es positiva para el epítopo de TAG-72, sialil-Tn. Para ensayar cualitativamente la unión, se manchó una membrana de nitrocelulosa con BSM (mucina submaxilar bovina) y luego se bloqueó ésta con albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés). Los anticuerpos y fragmentos se marcaron de forma inespecífica en lisinas con el éster NHS de fluoresceína, y luego se añadieron a las transferencias puntuales. Después de un lavado moderado, se obtuvieron imágenes de las muestras usando un fosforimager Typhoon. El círculo más oscuro indica un resultado positivo para la unión de sialil-Tn y se observó tanto para CC49.scFv como para nuestra variante diseñada, 3E8.scFv (figura 7A).

Transferencia puntual de competencia

Se realizó un experimento de transferencia puntual similar usando concentraciones constantes de BSM e IgG 3E8 marcada con fluoresceína. Los ensayos se realizaron con concentraciones crecientes de 3E8.scFv sin marcar. Si scFv e IgG reconocen el mismo epítopo en BSM, y la afinidad de scFv es comparable a la de IgG, debería observarse una disminución de la fluorescencia a concentraciones crecientes de scFv. Se realizaron dos controles negativos en paralelo. En primer lugar, se preparó la membrana de nitrocelulosa utilizando solo BSA para mostrar que los anticuerpos no se unen a nitrocelulosa o BSA de forma inespecífica. En segundo lugar, se añadió fluoresceína libre a los puntos de BSM para mostrar que la interacción no está mediada por el fluoróforo. Como se muestra en la figura 7B, IgG 3E8 se une fuertemente hasta ~ 3E8.scFv competidor 2 pM. En scFv 4 pM aproximadamente la mitad de la IgG está desplazada y en 8 pM la transferencia puntual se asemeja al control negativo. Este análisis estima que 3E8.scFv se une de una manera aproximadamente 16 veces más débil que 3E8.IgG y ambos se unen al mismo epítopo. Se espera una ligera pérdida de afinidad, ya que la IgG nativa es bivalente frente al scFv monovalente.

Resonancia de plasmón de superficie

Para confirmar aún más los datos de unión, se realizó una resonancia de plasmón de superficie en IgG 3E8, CC49.scFv y 3E8.scFv (figura 7C). Se ha descrito previamente que la IgG 3E8 se une al epítopo sialil-Tn con una KD de ~1 nM (Yoon 2006). La IgG 3E8 preparada comercialmente se ensayó mediante SPR y se determinó que la afinidad era similar, 4 ± 2 nM. CC49.scFv se une en el rango nanomolar medio con una constante de disociación de 30 ± 8 nM.

3E8.scFv se unió 2 veces más fuertemente que CC49.scFv y solo 4 veces más débilmente que la IgG bivalente. A 16 ± 4 nM, 3E8.scFv se une mejor que las variantes CC49 IgG y scFv de CC49 probadas clínicamente y tiene propiedades biofísicas más deseables que los anticuerpos de longitud completa.

IHC

3E8.scFv se biotiniló de forma inespecífica (utilizando NHS-biotina) para investigar su candidatura para la inmunohistoquímica (IHC) y para validar su capacidad para unirse al sialil-Tn en tejido humano. En general, el anticuerpo se incubó con tejido antes de un lavado moderado y la adición de un anticuerpo secundario biotinilado. A continuación, se añadió al tejido peroxidasa de rábano picante (HRPO, por sus siglas en inglés) enlazada a estreptavidina, en presencia de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB, por sus siglas en inglés). La oxidación de dA b da como resultado un producto cromogénico que tiñe el tejido localizado. El fragmento se marcó directamente con biotina en lisinas superficiales. Antes de teñir el tejido humano, se realizó con éxito una transferencia puntual de nitrocelulosa análoga a la figura 8A.

Se obtuvo colon enfermo a partir de una resección quirúrgica y se incluyó el mismo en parafina antes de seccionarlo. La muestra se tiñó con el kit comercial B72.3 (Biocare Medical) y 3E8.scFv. Ambas muestras tiñeron intensamente la mucina extracelular, así como las vesículas intracelulares llenas de mucina (figura 9). No se detectó unión inespecífica en las dos muestras de colon analizadas.

Se cortó tejido incluido en parafina a 4 pm y se colocaron las secciones en portaobjetos cargados positivamente. A continuación, se pusieron los portaobjetos a 60 °C durante una hora, se enfriaron, se desparafinaron y se rehidrataron a través de xileno y soluciones de etanol graduadas en agua. Todos los portaobjetos se enfriaron rápidamente durante 5 minutos en peróxido de hidrógeno al 3 % para bloquear la peroxidasa endógena. La recuperación de antígeno se realizó mediante Recuperación de Epítopo Inducida por Calor (HIER, por sus siglas en inglés), donde los portaobjetos se incuban en solución de recuperación de diana pH 6 (Dako) durante 25 minutos a 96 °C. Los portaobjetos se tiñeron con scFv 5 pM usando un sistema de inmunotinción Dako Autostainer a temperatura ambiente. Los portaobjetos se contratiñeron en hematoxilina Richard-Allan, se deshidrataron a través de una solución de etanol graduada, se aclararon con xileno y se cubrieron con un cubreobjetos.

Conjugación de 3E8.scFv y 3E8.scFv.Cys

NHS-PEG

Se PEGiló inespecíficamente 3E8.scFv en lisinas superficiales utilizando química de éster NHS. Se hizo reaccionar un PEG discreto con un peso molecular de 1,8 kD (Quanta BioDesign - 10910) con el fragmento de anticuerpo en un exceso molar de 0,5x y 20x. La reacción se desarrolló en solución salina tamponada con fosfato durante 1 hora a temperatura ambiente antes de extinguir con etanolamina. El PEG sin reaccionar se eliminó mediante diálisis. También se demostró la conjugación de un PEG deuterizado para la detección por espectroscopia Raman o de IR.

NHS-fluoresceína

Se marcó 3E8.scFv de forma inespecífica con fluoresceína en lisinas superficiales utilizando química de éster NHS. Se hizo reaccionar NHS-fluoresceína (Pierce - 46410) con el fragmento de anticuerpo en un exceso molar de 20x. La reacción se desarrolló en solución salina tamponada con fosfato durante 2 horas a 4 °C. El fluoróforo que no reaccionó se eliminó mediante diálisis.

NHS-biotina

Se marcó 3E8.scFv de forma inespecífica con biotina en lisinas superficiales utilizando química de éster NHS. Se hizo reaccionar una NHS-biotina (Sigma-H1759) con el fragmento de anticuerpo en un exceso molar de 5x. La reacción se desarrolló en solución salina tamponada con fosfato durante 1 hora a temperatura ambiente. La biotina sin reaccionar se eliminó mediante diálisis.

Maleimida-PEG

Se PEGiló específicamente 3E8.scFv.Cys en la cisteína C-terminal usando química de maleimida. Se hizo reaccionar un PEG discreto con un peso molecular de 2,7 kD (Quanta BioDesign - 10931) con el fragmento de anticuerpo en un exceso molar de 20 veces. La reacción se desarrolló en solución salina tamponada con fosfato durante 1 hora a temperatura ambiente. El PEG sin reaccionar se eliminó mediante diálisis.

Ejemplo 2: Mejora de la proteína terapéutica a través de PEGilación: anticuerpos para el diagnóstico por imágenes de cáncer

Un moderno sistema de diagnóstico por imágenes de cáncer, la cirugía radioinmunodirigida (RIGS), utiliza anticuerpos marcados con radionúclidos que se unen a un epítopo presente solo en ciertas células cancerosas. Los estudios sobre la unión covalente de moléculas de polietilenglicol (PEG) a proteínas indican que la PEGilación puede mejorar la eficacia terapéutica. En la presente memoria se divulgan los efectos de la PEGilación (usando diferentes tipos de PEG) con el objetivo final de mejorar 3E8.scFv como un anticuerpo RIGS. En la presente memoria se describe lo que los PEG realmente hacen con la proteína a la que están unidos. Se examina la diferenciación entre dos modelos, interacción PEG-proteína: perlas semejantes a un polímero cerca del punto de unión frente a envoltura alrededor de la proteína a modo de hilo. Se utiliza una proteína modelo (lisozima T4, T4L) para observar el comportamiento general de las proteínas PEGiladas y comparar los diferentes tipos de PEG. Se analiza un análisis de los efectos de la PEGilación con electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en inglés) SDS y un ensayo de actividad de lisozima. Se utilizan dicroísmo circular para realizar un análisis en profundidad para medir el plegado; cromatografía de filtración en gel para medir el tamaño; dispersión de luz estática diferencial y barrido térmico de alto rendimiento para medir la estabilidad; y ultracentrifugación analítica y dispersión de rayos X de ángulo pequeño para medir el tamaño/la forma.

Se ha desarrollado un procedimiento de PEGilación que une PEG activados a T4L o 3E8.scFv. El análisis por SDS-PAGE indica proteínas con números enteros de PEG unidos. Se ha evaluado la actividad de T4L y la unión de 3E8.scFv (PEGilado y no PEGilado) usando un ensayo de actividad basado en fluorescencia y ensayos de unión por resonancia de plasmón de superficie e inmunohistoquímica, respectivamente.

Las aplicaciones clínicas de RIGS incluyen que RIGS se puede realizar durante la cirugía, eliminando horas de formación de imágenes preoperatorias y posoperatorias. Además, se puede ajustar la semivida sérica de las proteínas PEGiladas cambiando la cantidad de PEGilación. También se puede ajustar la semivida del radionúclido para que coincida con la semivida del anticuerpo.

El diagnóstico por imágenes tradicional del cáncer incluye tomografías computarizadas y PET y no es muy sensible ni específico. El diagnóstico por imágenes moderno del cáncer utiliza la cirugía radioinmunodirigida (RIGS), que utiliza anticuerpos radiomarcados producidos contra un disacárido (sialil-TN) presente en la glicoproteína asociada a tumores (TAG-72) que está presente en la superficie de muchas células cancerosas. Es muy sensible y muy específico. El anticuerpo actualmente utilizado es CC49. 3E8 es un buen ligante y se puede modificar para obtener un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) como se divulga en la presente memoria.

Se ha demostrado que unir PEG a proteínas puede mejorar las propiedades terapéuticas de la proteína. Se puede unir a proteínas (como la proteína modelo, llamada T4L), en residuos de lisina utilizando química de éster NHS; en residuos de cisteína usando química de maleimida. Cuando se unen a proteínas, los PEG: no son inmunogénicos, disminuyen la agregación y la proteólisis y aumentan la semivida sérica.

Los PEG existen como mezclas polidispersas de moléculas, moléculas discretas (homogéneas) (dPEG de Quanta Biodesign) y moléculas lineales y ramificadas, así como moléculas neutras y cargadas. 3E8.scFv es un monómero plegado correctamente. Es tan estable como el dominio de unión de 3E8.IgG. Tiene una KD = 16,4 nM y se une correctamente. El 3E8.scFv pegilado todavía se une al tejido correcto. La T4L PEGilada se puede PEGilar con números enteros de PEG en los residuos de lisina.

Ejemplo 3: Diseño y caracterización biofísica de un fragmento de anticuerpo variable de cadena sencilla estabilizado que se une a la glicoproteína 72 asociada a tumores

Resultados

Construcción y purificación

Se descubrió un agente de detección y formación de imágenes para los adenocarcinomas que expresan el epítopo de TAG-72, sialil-Tn. En la presente memoria se divulga un scFv inspirado en 3E8 con secuencias enlazadoras cuidadosamente seleccionadas y protocolos de expresión y purificación mejorados. El dominio ligero variable (VL) se fusiona con el dominio pesado variable (VH) mediante la secuencia enlazadora 205C (Denzin 1991). El scFv se produce como una fusión de hexahistidina escindible y se transmite al periplasma para mejorar el plegamiento (figura 18). Finalmente, el gen de longitud completa se subclona en el vector de expresión pCOLD para hacer uso del sistema de chaperona de choque frío (Takara Bio, Inc.).

Los scFv se purifican a partir de la fracción periplásmica mediante digestión con lisozima y choque osmótico. Se prefiere el protocolo modificado a los procedimientos estándar por su falta de grandes volúmenes, eliminación de las etapas de diálisis y compatibilidad con la purificación por Ni-NTA. Se ha demostrado que el EDTA desestabiliza la membrana mediante la quelación del calcio divalente, pero debe eliminarse antes de la unión de níquel (Prachayasittkul 2007). En cambio, la membrana externa se ve perturbada por una digestión moderada con lisozima. Después del choque osmótico, la fracción periplásmica puede unirse directamente a agarosa Ni-NTA y purificarse por medios estándar. La adición de proteasa de t Ev y una segunda etapa IMAC produce fragmentos variables nativos de cadena sencilla.

En condiciones de choque de frío podemos expresar y purificar >2 mg L'1 de 3E8.scFv en matraces de agitación, con la capacidad de incrementar la producción por fermentación. También construimos un CC49.scFv descrito en la bibliografía como control que, en las mismas condiciones, produce ~1 mg L'1 (Pavlinkova 1999).

Estructura

Las IgG de longitud completa constan de cuatro cadenas polipeptídicas, incluidas dos cadenas pesadas (~ 50 kDa) y dos ligeras (~ 25 kDa). Las dos cadenas pesadas interactúan entre sí y con la cadena ligera tanto a través de contactos no covalentes como de enlaces disulfuro. La unión al antígeno se logra usando los lazos variables en los dominios N-terminales de las cadenas pesada y ligera, las cuales pertenecen al pliegue de la inmunoglobulina. Un pliegue de inmunoglobulina se compone de 7-9 cadenas p antiparalelas (Bork 1994). Estas estructuras secundarias forman dos láminas p con arquitectura de greca. Para estabilizar la interacción V^h y V^l en scFv, se usa un enlazador de aminoácidos para conectar el extremo C del dominio V^l al extremo N del dominio V^h. Para evaluar las características estructurales generales de 3E8.scFv y CC49.scFv se realizó un dicroísmo circular (CD, por sus siglas en inglés) (figura 20a). CC49.scFv tiene los mínimos esperados alrededor de 215-220 nm para las cadenas p. 3E8.scFv tiene un espectro de forma similar, pero también muestra un gran pico positivo alrededor de 205 nm consistente con los dominios de inmunoglobulina. Se predice que el enlazador 205C posee alguna estructura en espiral que puede conducir a una señal mejorada a 222 nm.

A continuación, se ensayó la estructura cuaternaria de ambos scFv mediante filtración en gel. 3E8.scFv tiene un peso molecular de 28 kDa y se eluye como una sola especie con un peso molecular calculado de 25 kDa (figura 20b). El scFv diseñado de 3E8 es monomérico sin formación visible de dímeros o trímeros, ni agregación. CC49.scFv se eluye antes con un peso molecular calculado de 31 kDa, que es 3 kDa mayor que la masa predicha que muestra cierto grado de despliegue o expansión.

Unión

La regulación positiva de los genes metabólicos en las células cancerosas conduce a un aumento en la manifestación del disacárido sialil-Tn en mucina (Kjeldsen 1988). Las moléculas dirigidas a este epítopo proporcionan un medio poderoso para distinguir el tejido canceroso del sano. La mucina submaxilar bovina es positiva para el epítopo de TAG-72, sialil-Tn. Para ensayar cualitativamente la unión, se manchó una membrana de nitrocelulosa con BSM y luego se bloqueó la misma con albúmina de suero bovino (BSA). Los anticuerpos y fragmentos se marcaron de forma inespecífica en lisinas con fluoresceína y luego se añadieron a las transferencias puntuales. Después de un lavado moderado, se obtuvieron imágenes de las muestras usando un fosforimager Typhoon. El círculo más oscuro indica un resultado positivo para la unión de sialil-Tn y se observó tanto para nuestro control positivo, CC49.scFv, como para nuestra variante diseñada, 3E8.scFv (figura 7a).

A continuación, se realizó un experimento de transferencia puntual similar usando concentraciones constantes de BSM y 3E8.IgG marcado con fluorescencia. Los ensayos se realizaron con una concentración creciente de 3E8.scFv no marcado. Si scFv e IgG reconocen el mismo epítopo en BSM, y la afinidad de scFv es comparable a la de IgG, debería observarse una disminución de la fluorescencia a concentraciones crecientes de scFv. Se realizaron paralelamente dos controles negativos. En primer lugar, se preparó la membrana de nitrocelulosa utilizando solo BSA para mostrar que los anticuerpos no se unen a nitrocelulosa o BSA de forma inespecífica. En segundo lugar, se añadió fluoresceína libre a los puntos de BSM para mostrar que la interacción no está mediada por el fluoróforo. Como se muestra en la figura 7b, 3E8.IgG se une fuertemente hasta ~3E8.scFv competidor 2 pM. En scFv 4 pM aproximadamente la mitad de la IgG está desplazada y en 8 pM la transferencia puntual se asemeja al control negativo. Este análisis estima que 3E8.scFv se une aproximadamente 16 veces peor que 3E8.IgG y ambos se unen al mismo epítopo. Se espera una ligera pérdida de afinidad, ya que la IgG nativa es bivalente frente al scFv monovalente.

Para confirmar aún más los datos de unión, se determinó la resonancia del plasmón de superficie en 3E8.IgG, CC49.scFv y 3E8.scFv (figura 7c). Se ha informado previamente que el 3E8.IgG se une al epítopo sialil-Tn con una Kd de ~1 nM7. Se ensayó 3E8.IgG mediante SPR y se determinó que la afinidad era similar, 4 ± 2 nM. A continuación, se midió la afinidad del scFv de CC49. CC49.scFv se une en el rango nanomolar medio con una constante de disociación de 30 ± 8 nM. Finalmente, se llevó a cabo una SPR en 3E8.scFv y se encontró que se unía 2 veces mejor que CC49.scFv y solo 4 veces más débilmente que la IgG bivalente. A 16 ± 4 nM, 3E8.scFv se une mejor que las variantes CC49.IgG y scFv clínicamente probadas de CC49, y tiene propiedades biofísicas más deseables que los anticuerpos de longitud completa.

Inmunohistoquímica

El fragmento variable de cadena sencilla de 3E8 se biotiniló de forma inespecífica para investigar su candidatura para la inmunohistoquímica (IHC) y para validar su capacidad para unirse a sialil-Tn en tejido humano. En general, se incuba un anticuerpo con tejido antes de un lavado moderado y la adición de un anticuerpo secundario biotinilado. A continuación, se añade al tejido peroxidasa de rábano picante (HRPO) enlazada a estreptavidina, en presencia de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (Dab). La oxidación de Dab da como resultado un producto cromogénico que tiñe el tejido localizado. Debido a que el scFv carece del dominio constante donde se une el anticuerpo secundario, nuestro fragmento se marcó directamente con biotina en lisinas superficiales. Antes de teñir el tejido humano, se realizó con éxito una transferencia puntual de nitrocelulosa análoga.

Se obtuvo colon enfermo a partir de una resección quirúrgica y se incluyó el mismo en parafina antes de seccionarlo. La muestra se tiñó con el kit comercial B72.3 y 3E8.scFv. Ambas muestras tiñeron intensamente la mucina extracelular, así como las vesículas intracelulares llenas de mucina (figura 9).

Estabilidad

El objetivo era diseñar un fragmento variable de cadena sencilla con mayor estabilidad y resistencia a la agregación. Se ensayó la estabilidad de la IgG de longitud completa y de ambos scFv mediante Dispersión de Luz Estática Diferencial (DSLS) (Senisterra 2009) y Barrido Térmico de Alto Rendimiento (HTTS) (Lavinder 2009). La DSLS mide la difracción de luz de 600 nm con una temperatura creciente (figura 6a). A medida que las proteínas se despliegan y se agregan, los productos de precipitación difractan la luz, lo que conduce a valores altos de DO600. El CC49.scFv experimenta una sola transición cooperativa con Tagg=54,0 °C (temperatura a la que está agregada la mitad de la proteína). Se observa una transición similar en 3E8.scFv, pero la variante diseñada es ~12 °C más estable (66,0 °C). El anticuerpo de longitud completa, 3E8.IgG, es 21 °C adicionales más estable que su pariente truncado. Estos resultados por sí solos muestran que el 3E8.scFv es significativamente más estable que el CC49.scFv.

Una segunda técnica para medir la estabilidad de las proteínas se basa en la unión de colorantes hidrófobos de productos intermedios desnaturalizados térmicamente (HTTS). Aquí, se muestra que los valores T^htts (temperatura a la que está desplegada la mitad de la proteína) concuerdan en gran medida con los valores Tagg mostrados para ambos scFv (55,4 °C-CC49.scFv y 66,0 °C-3E8.IgG). La IgG de longitud completa muestra dos transiciones de despliegue -una a 66,2 °C y una segunda a 83,6 °C (figura 6b). La primera transición se superpone al acontecimiento de despliegue observado para 3E8.scFv y puede describir los dominios variables de despliegue. La segunda transición, por tanto, corresponde al despliegue de los dominios constantes. Estos datos, junto con los valores de DSLS, muestran que la estabilidad aumentada de los dominios constantes evita que la IgG se agregue, pero tanto el scFv de 3E8 como la IgG se inactivan a 66 °C. Por lo tanto, se ha producido un fragmento variable de cadena sencilla que es radicalmente más estable que CC49.scFv e igual a la estabilidad de 3E8.IgG.

Materiales y métodos

Diseño y construcción

Los genes scFv se diseñaron como fusiones VL-enlazador-VH. Los genes codifican la secuencia líder PelB para el tráfico periplásmico, una marca de hexahistidina para la purificación, y el sitio de reconocimiento de la proteasa del Virus del Grabado del Tabaco (TEV) para eliminar la marca de purificación. Los genes de ADN de longitud completa se pidieron a Genewiz, Inc. (South Plainfield, NJ) y se subclonaron en pCOLD IV (Takara Bio, Japón). El anticuerpo monoclonal, 3E8.IgG, se recibió como regalo de Enlyton, Ltd. (Columbus, OH).

Expresión y purificación

Los plásmidos resistentes a ampicilina se transformaron en DH10p para una expresión de choque frío. Se cultivaron células a 37 °C en matraces de agitación con 2xYT hasta una DO600 = ~0,7. En la fase logarítmica media, los matraces se sumergieron en agua helada durante 10 minutos. A continuación, las células se indujeron con IPTG 0,3 mM y se movieron a 4 °C durante 30 minutos. Después del choque frío, los matraces se devolvieron al agitador y se cultivaron durante ~16 horas a 16 °C.

Las células se cosecharon por centrifugación a 8.000 g y se resuspendieron (40 mL/1 L de cultivo) en Tris^HCl 30 mM, sacarosa al 20 %, pH 8. Se generaron esferoplastos a partir de 1 L de cultivo añadiendo 30 mg de lisozima, 0,05 mg de RNasa (Pierce), 100 unidades de DNasa (Fisher), y MgCh 1,5 mM. La suspensión se mezcló a 4 °C con una barra de agitación magnética durante 30 minutos antes de diluirla con 160 mL de agua helada. La muestra diluida se agitó durante otros 30 minutos a 4 °C antes de centrifugarla a 8.000 g. El sobrenadante se decantó y se preparó para una unión de Ni-NTA añadiendo 4 mL de imidazol 0,5 M y 1 mL de agarosa Ni-NTA al 50 % (Qiagen). Después de 1 hora de unión de níquel a 4 °C, la fracción periplásmica se vertió en una columna previamente fritada (Bio-Rad) y se lavó (Tris^HCl 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM pH 8,0) antes de una elución (Tris^HCl 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM pH 8,0). Los 6xHis-TEV-scFv se digirieron durante la noche con proteasa de 6xHis-TEV con DTT 5 mM. Después de la escisión, la muestra se dializó en fosfato de potasio 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8. La marca de hexahistidina y 6xHis-TEV se eliminaron mediante una segunda columna de Ni-NTA. La concentración y la pureza de las proteínas se ensayaron mediante SDS-PAGE y absorbancia a 280 nm.

Dicroísmo circular

Se registraron espectros en un espectrómetro Jasco J-185 con proteína 10 pM en HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, EDTA 3,4 pM, tensioactivo P20 al 0,005 % (GE Healthcare). Se recogieron barridos de longitud de onda por triplicado de 190 a 275 nm con una integración de 2 segundos a una velocidad de barrido de 100 nm min-1. Se descartaron los datos reunidos con un voltaje de AT superior a 600 V.

Filtración en gel

Se realizó una cromatografía de exclusión por tamaños en un purificador GE Pharmacia AKTA. Se inyectaron fragmentos de anticuerpo a 10 pM y se eluyeron los mismos de una columna Superdex 75 10/300 (GE Amersham) con Tris^HCl 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8 a 0,4 mL min-1. Se calcularon los pesos moleculares de los scFv basándose en conformidades de estándares conocidos: aprotinina (6,5 kDa-14,6 mL), citocromo c (12,5 kDa-12,9 mL), anhidrasa carbónica (29,0 kDa-11,21 mL) y albúmina de suero bovino (66,5 kDa-9,2 mL).

Estabilidad

La estabilidad del anticuerpo de longitud completa y los scFv se determinó mediante Barrido Térmico de Alto Rendimiento (HTTS). Aquí, se incubó proteína 5 pM con colorante SYPRO Orange 5x (Invitrogen). Las masas fundidas se ensayaron usando un ciclador térmico Bio-Rad C1000 con una tasa de incremento de 1 °C min-1 a intervalos de 0,2 °C. Los datos se exportaron a Microsoft Excel 2010. Los T^htts se calcularon como la temperatura con la pendiente máxima determinada a partir de una ventana de 5 °C alrededor de cada punto.

La temperatura de agregación se ensayó mediante Dispersión de Luz Estática Diferencial (DSLS) utilizando la característica de absorbancia del espectrómetro Jasco J-185 con proteína 10 pM en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 pM, tensioactivo P20 al 0,005 % (GE Healthcare). Los datos se reunieron en pasos de 1 °C con equilibrado de temperatura de 6 segundos, incremento de 1 °C min'1, y 2 segundos de integración. Todas las masas fundidas se exportaron a Microsoft Excel 2010. Los T^agg se calcularon como la temperatura con la pendiente máxima determinada a partir de una ventana de 5 °C alrededor de cada punto.

Marcaje

El anticuerpo y los fragmentos se marcaron de forma inespecífica en lisinas de superficie con un exceso 20 molar de NHS-fluoresceína (53209-Pierce). El marcaje se confirmó con un fluorímetro Olis DM-45P. Se marcó ScFv en lisinas expuestas de la superficie con un exceso 3 molar de NHS-biotina (H1759-Sigma). El exceso de reactivo de marcaje se eliminó mediante diálisis en fosfato de potasio 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8.

Unión

La unión cualitativa a sialil-Tn se ensayó mediante transferencia puntual. Primero, se manchó una membrana de nitrocelulosa con 2 pl de 5 mg mL-1 de mucina submaxilar bovina (M3895-Sigma). Se dejó secar la membrana durante la noche antes de bloquearla con 5 mg mL-1 de BSA. Después de la incubación durante la noche, se eliminó el exceso de BSA mediante un lavado antes de añadir scFv marcados con fluoresceína. Los scFv se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente antes de lavarlos. La fluorescencia se observó usando un fosforimager Typhoon con excitación de 488 nm.

Se analizó la unión del epítopo de 3E8.scFv para determinar su capacidad para inhibir la unión de 3E8.IgG. Aquí, 3E8.IgG marcado 0,25 pM competía con concentraciones crecientes de 3E8.scFv sin marcar (0 a 8 pM). La pérdida de fluorescencia se observó usando el fosforimager Typhoon con excitación de 488 nm.

Se evaluaron los parámetros de unión utilizando resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés). Se inmovilizó BSM en un chip sensor de dextrano CM5 usando el kit de acoplamiento de amina de GE Pharmacia (BR-1000-50). Las condiciones de exploración fueron 200 pg mL’1 de BSM en acetato sódico 100 mM, pH 4 para el canal 2, y 10 pg mL_1 de BSA en acetato sódico 100 mM, pH 4 para el canal 1. El protocolo de inmovilización continuó hasta que se obtuvieron 700 RU. La unión se midió como 2-1. Se dializaron anticuerpo y fragmentos en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 pM, tensioactivo P20 al 0,005 % (GE Healthcare) y se ensayaron a partir de 0-400 nM. Las muestras se unieron durante 120 segundos a 10 pl min_1 y se midió la disociación durante 180 segundos. El chip CM5 se regeneró entre experimentos con guanidina 6 M y ácido acético 200 mM sin pérdida de actividad. Los parámetros de unión promedio se evaluaron utilizando el software BIAevaluation.

Inmunohistoquímica

Se cortó tejido incluido en parafina a 4 pm y se colocaron secciones en portaobjetos cargados positivamente. A continuación, se pusieron los portaobjetos a 60 °C durante una hora, se enfriaron, se desparafinaron y se rehidrataron a través de xileno y soluciones de etanol graduadas en agua. Todos los portaobjetos se enfriaron rápidamente durante 5 minutos en peróxido de hidrógeno al 3 % para bloquear la peroxidasa endógena. La recuperación de antígeno se realizó mediante Recuperación de Epítopo Inducida por Calor (HIER) en la que los portaobjetos se incubaron en solución de recuperación de diana pH 6 (Dako) durante 25 minutos a 96 °C. Los portaobjetos se tiñeron con scFv 5 pM usando un sistema de inmunotinción Dako Autostainer a temperatura ambiente. Los portaobjetos se contratiñeron en hematoxilina Richard Alien, se deshidrataron a través de una solución de etanol graduada, se aclararon con xileno y se cubrieron con un cubreobjetos.

Ejemplo 4: Fragmentos variables de cadena sencilla de 3E8, PEGilación y conjugación con 3E8cys.scFv

Diseño y clonación de fragmentos de anticuerpo

Un fragmento variable de cadena sencilla de primera generación (scFv) se basaba en el anticuerpo humanizado de afinidad optimizada, 3E8 (Yoon 2006). Se ha informado que el anticuerpo precursor se une al epítopo sialil-Tn que se encuentra en la glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72) con una constante de disociación en un intervalo de 5­ 10 nM (Thor 1986; Thor 1987; Muraro 1988; Colcher 1988). Los fragmentos scFv son fusiones monoméricas y diméricas, respectivamente, de los dominios de unión del anticuerpo y tienen pesos moleculares en un intervalo de 25 y 50 kD, respectivamente (Bird 1988; Kortt 2001). A diferencia de las IgG de longitud completa y los fragmentos Fab, estos fragmentos más pequeños se pueden expresar en bacterias (Sandhu 1992; Pini 2000).

Los dominios variables de 3E8 se conectaron mediante el enlazador 205C con la siguiente orientación: V^l-205C-V^h Denzin, 1991). La secuencia se anexó con la secuencia líder PelB para dirigir la proteína al periplasma de E. coli, una marca de hexahistidina para purificación, y un sitio de proteasa de TEV para la eliminación posterior de la marca de hexahistidina. El marco de lectura abierta de longitud completa se clonó en el plásmido pHLIC para la sobreexpresión (Durani 2012). Se generó una segunda construcción, 3E8cys.scFv, mediante PCR de la construcción precursora con cebadores mutagénicos. Esta variante coloca una única cisteína en el extremo C de 3E8.scFv para permitir la PEGilación específica del sitio mediante química de maleimida. Ambas construcciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

Expresión y purificación de fragmentos de anticuerpo

Las construcciones se transformaron en C43(DE3) Escherichia coli para la sobreexpresión bajo el promotor T7 (Miroux 1996). Se realizaron cultivos a 37 °C hasta una DO⁶⁰⁰=1,0 antes de un choque frío y una inducción con IPTG 0,05 mM. Las células continuaron expresando proteína durante la noche a 16 °C. A la mañana siguiente, las células se cosecharon, se resuspendieron, y se lisaron con Avestin Emulsiflex. La fracción soluble se recuperó por centrifugación y se purificó mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). Las marcas de hexahistidina se escindieron mediante proteasa de TEV y se purificaron adicionalmente mediante una segunda etapa de IMAC (figura 20), hasta una pureza superior al 90 %. Se requirió una columna de intercambio iónico adicional para purificar 3E8cys.scFv hasta casi la homogeneidad debido a la presencia de lo que parece ser un contaminante proteolítico. Aquí, una columna de intercambio catiónico Resource S separó el producto deseado del contaminante de 17 kD (figura 4). En estas condiciones, se purificaron ~2 mg L^{' 1} de cada variante de scFv y se generaron >10 mg a partir de una sola purificación de material a partir de 6 L de medio en matraces de agitación.

Selección de PEG y conjugación

Se ha demostrado que la PEGilación aumenta la semivida sérica de los fragmentos de anticuerpo al aumentar el radio hidrodinámico de la molécula, disminuyendo la filtración renal (Chen 2011; Veronese 2008). Además, se ha informado que la PEGilación reduce la proteólisis, la inmunogenicidad y la agregación. Los PEG pueden unirse a proteínas en lisinas y cisteínas mediante PEG activados por éster NHS o maleimida, respectivamente. El modelado bruto de 3E8.scFv revela cuatro lisinas dentro de las CDR responsables de la unión al antígeno (figura 23A). Se diseñó 3E8cys.scFv, que añade una cisteína C-terminal. Se espera que esta cisteína sea el único tiol libre dentro del fragmento de anticuerpo, lo que permite la PEGilación específica de sitio del scFv en un sitio distal con respecto a la superficie de interacción del antígeno.

Se eligió PEGilado 3E8cys.scFv para la PEGilación con PEG 10484 y 11451 de Quanta BioDesign. Ambos PEG son discretos, lo que significa que cada molécula tiene un número exacto de unidades poliméricas repetidas ((-CH2-CH2-O)n), a diferencia de los PEG polidispersos que contienen una distribución de números de unidades monoméricas. El primer PEG (10484) tiene un peso molecular de, exactamente, 8.323,78 Da. Es un PEG neutro con tres brazos grandes, cada uno de los cuales contiene tres ramas más. El segundo PEG (11451) tiene un peso molecular de, exactamente, 4.473,17 Da. Tiene tres ramas, cada una de las cuales termina en un ácido carboxílico cargado negativamente. Para investigar los efectos de PEG aún más grandes, se obtuvieron PEG de 40 kD lineales y en forma de Y (ramificados) de JenKem Technology USA. Estos PEG grandes son polidispersos, pero el índice de polidispersidad para estas moléculas es de 1,03, lo que significa que las moléculas de PEG tienen masas distribuidas estrechamente alrededor de 40.000 Da. Todos los PEG se activaron con grupos funcionales de maleimida (figura 24 y tabla 1).

Tabla 1:

Las muestras de proteína se dializaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) con TCEP 1 mM para mantener las cisteínas C-terminales reducidas para la PEGilación. Las reacciones prosiguieron hasta casi completarse durante la noche en presencia de un exceso molar ~50x de PEG. El PEG sin reaccionar y el 3E8cys.scFv sin modificar se eliminaron mediante cromatografía de intercambio iónico seguida de diálisis en PBS. Se generaron entre 150-350 |jg de cada compuesto.

Unión de 3E8.scFv y fragmentos de anticuerpo PEGilados

Los fragmentos de anticuerpo purificados se analizaron para determinar la unión a mucina submaxilar bovina (BSM, por sus siglas en inglés) inmovilizada, que es positiva para el epítopo Sialil-Tn, mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR) (Goel 2000). A partir de estos datos, se pueden determinar la tasa de asociación (ka), la tasa de disociación (kd) y la constante de disociación de equilibrio (K^d).

El scFv de 3E8 se une al epítopo Sialil-Tn con baja afinidad nanomolar (12 nM). De hecho, el scFv se une casi tan bien como la IgG bivalente (4 nM). Las tres construcciones no PEGiladas se unen todas al antígeno mejor que la IgG CC49 investigada clínicamente (~30 nM)¹⁵.3E8cys.scFv muestra una afinidad de unión aparente ligeramente menor (K^d 3 veces mayor), pero equiparable a CC49. La unión de 3E8cys.scFv mejora ligeramente cuando se PEGila con 10484 y 11451; cuando se PEGila con los PEG más grandes de 40 kD, la unión no se altera.

Además, la unión de estas moléculas ha sido validada por transferencias puntuales contra mucina submaxilar bovina (figura 25). Aquí, el papel de nitrocelulosa se mancha con mucina (positiva para TAG-72) y se bloquea con BSA. Las proteínas se marcan con biotina para la unión a estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) y la química de desarrollo de HRP. Un color marrón indica la localización del fragmento de anticuerpo con respecto a TAG-72.

Se ha demostrado la capacidad de 3E8.scFv para dirigirse a tejido canceroso mediante tinción inmunohistoquímica (IHC) del tejido del colon. Aquí, el tejido resecado se obtuvo de un paciente con cáncer de colon avanzado. El tejido incluido en parafina se cortó a 4 jm y las secciones se colocaron en portaobjetos cargados positivamente. El 3E8.scFv se marcó de forma inespecífica en lisinas con NHS-biotina y se aplicó al tejido con un sistema de inmunotinción Dako. A continuación, se añade HRP ligada a estreptavidina al tejido en presencia de DAB. La oxidación de DAB por HRP da como resultado un producto coloreado que tiñe el tejido localizado de marrón. La figura 9 muestra una tinción intensa de la mucina extracelular cancerosa, así como de las vesículas intracelulares que contienen TAG-72. El scFv de 3E8 se dirigió a los mismos sitios que el B72.3 usado clínicamente.

Estabilidad de los fragmentos de anticuerpo

Los fragmentos de anticuerpo con estabilidad aumentada pueden tener propiedades farmacocinéticas más favorables y resistir a la agregación. Se ensayó la estabilidad de 3E8.IgG de longitud completa y scFv basados en 3E8 y CC49 mediante Dispersión de Luz Estática Diferencial (DSLS) y Fluorimetría Diferencial de Barrido (DSF/HTTS, por sus siglas en inglés) (Senisterra 2009; Lavinder 2009). DSLS mide la dispersión de luz de 600 nm con temperatura creciente (figura 10a), que está relacionada con la agregación. CC49.scFv experimenta una sola transición cooperativa con Tagg=54,0 °C (temperatura a la que la mitad de la proteína está agregada). Se observa una transición similar en 3E8.scFv, pero la variante diseñada es ~12 °C más estable (66,0 °C). El anticuerpo de longitud completa, 3E8.IgG, es 21 °C adicionales más estable a la agregación que su pariente truncado. Estos resultados por sí solos muestran que el 3E8.scFv es significativamente más estable que el CC49.scFv.

Una segunda técnica para medir la estabilidad de las proteínas se basa en la unión de colorantes hidrófobos de productos intermedios desnaturalizados térmicamente (DSF/HTTS). Aquí, informamos valores de T^dsf (temperatura a la que está desplegada la mitad de la proteína) que concuerdan en gran medida con los valores de Tagg mostrados para ambos scFvs (55,4 °C-CC49.scFv y 66,0 °C-3E8.scFv). La IgG de longitud completa muestra dos transiciones de despliegue - una a 66,2 °C y una segunda a 83,6 °C (figura 10b). La primera transición se superpone al acontecimiento de despliegue observado para 3E8.scFv y, por lo tanto, probablemente describe los dominios variables de despliegue. Por tanto, la segunda transición correspondería al despliegue de dominios constantes. Estos datos, junto con los valores de DSLS, sugieren que la estabilidad aumentada de los dominios constantes evita que la IgG se agregue, pero tanto el scFv de 3E8 como la IgG se inactivan a 66 °C. Por lo tanto, se ha producido un fragmento variable de cadena sencilla que es radicalmente más estable que CC49.scFv e igual a la estabilidad funcional de 3E8.IgG.

Radiomarcaje y propiedades farmacocinéticas

Los fragmentos de anticuerpo se radiomarcaron primero utilizando el método lodogen estándar (Bailey 1996; Paus 1982). El yodo radiactivo libre se separó del anticuerpo marcado mediante cromatografía de exclusión por tamaños y las fracciones con la radiactividad más alta se utilizaron para las curvas de sangre animal.

Radiomarcaje

En un experimento de radiomarcaje típico, se transfirieron ~50 - 100 |jg de proteína a un tubo de lodogen (Pierce, Rockford, IL) que contenía 100 jL de tampón fosfato (0,1 M, pH 7,4) y a continuación se añadieron cantidades conocidas de ¹²⁵INa (Perkin Elmer, Waltham MA) o ¹²³INa (Nordion, Ottowa, Ontario, Canadá) en NaOH 0,02 M. Luego se añadieron 50 jL adicionales de tampón fosfato (0,1 M, pH 7,4) a la mezcla, se cubrió con parafilm, y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 30 a 45 min agitándola ocasionalmente con movimientos circulares. La proteína marcada se cargó en una columna de exclusión por tamaños Sephadex G-25 (PD-10) y se eluyó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para separar la proteína marcada del ^125/123| libre. Se recogieron varias fracciones, que contenían aproximadamente 10 gotas, y las fracciones que contenían la radiactividad más alta se recogieron y se agruparon en un vial de plástico previamente pesado.

La cantidad de radiactividad se determinó usando un calibrador de dosis. El rendimiento porcentual de radiomarcaje se calculó dividiendo la radiactividad total de las muestras agrupadas por la cantidad de radiactividad añadida al tubo de lodogen. La pureza de las muestras se determinó mediante tiras de Cromatografía en Capa Fina (TLC, por sus siglas en inglés) (Whatman) eluidas con una mezcla de metanol al 85%:agua al 15%. La proteína unida no migró y el yoduro no unido se movió al frente del solvente.

Biodistribución y farmacocinética

Se estudiaron moléculas CC49¹²⁴I-Fab'-dPEG usando estructuras de dPEG similares o idénticas a las usadas en este estudio actual. Se utilizaron los mismos tumores (LS-174T) y la misma diana TAG-72. En el estudio Fab'-dPEG de 4 moléculas diferentes, medimos las curvas de depuración de la sangre de 1 a 24 horas e imágenes microPET/CT de todo el cuerpo. Se encontró una sólida correlación entre la radiactividad sanguínea a las 5 y 24 horas y la intensidad del tumor en las imágenes microPET/CT tanto a las 5 como a las 24 horas posteriores a la administración (figura 25). Estos puntos de tiempo (5 y 24 horas) son tiempos de formación de imágenes apropiados para las imágenes ¹²³I-SPECT/CT. Las curvas de sangre de ratón de 1 a 24 horas fueron, por tanto, buenos indicadores cuantitativos de la absorción y retención tumoral en el tiempo temprano. Los datos completos de biodistribución tisular se recogen a las 24 horas.

Para evaluar la depuración de la sangre, a las 0,5, 1, 3, 6 y 24 h, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y la piel de las patas se esterilizó con una gasa de etanol al 70 %. Se pinchó la vena safena usando una aguja de jeringa 25G y se recogieron 5-10 j l de sangre usando un tubo capilar. Se contó la radiactividad de las muestras de sangre utilizando el contador gamma Wiz II, y se calculó el %ID/g utilizando los mismos métodos que los mencionados anteriormente. Se usó un factor sanguíneo de 78 mL/kg para calcular el %ID para cada ratón basándose en el peso individual del ratón. Se determinó el %ID medio para cada grupo de dosis en cada punto de tiempo.

Los ratones se sacrificaron después del punto de tiempo de 24 h. Se diseccionaron órganos y tejidos, incluidos el corazón, los pulmones, el bazo, el hígado, los riñones, el páncreas, el tracto gastrointestinal (Gl), los músculos, la piel, la sangre, la cola y la canal. A continuación, se pesaron los órganos y tejidos y se contó la radiactividad usando un contador gamma (Perkin Elmer Wizard II, Modelo 2480, Waltham, MA).

Ahora se ha demostrado que 3E8.scFv puede ajustarse desde semividas séricas muy cortas a muy largas modulando la longitud y el tipo de polímero PEG.

Resultados farmacocinéticos

Inclusión de un PEG lineal de 30 kD

El scFv no modificado se filtró rápidamente y la conjugación con 11451 y 10484 no extendió las semividas séricas del fragmento de anticuerpo de 25 kD. Se estudiaron dos conjugados de 40 kD que aumentan la masa total a 65 kD, lo que se aproxima a la masa de corte para la depuración renal de primer paso. Estas dos moléculas mostraron aumentos radicales en la residencia en suero. De hecho, a las 24 horas se registró una actividad sérica del 8 y el 18 % para los PEG lineales y en forma de Y, respectivamente.

Modelo de tumor animal

Los estudios en animales se llevaron a cabo en conformidad con los protocolos para animales aprobados en el Recurso para Animales de Laboratorio de la Universidad Estatal de Ohio. Se obtuvo una línea celular de adenocarcinoma de colon humano LS-174T de American Type Culture Collection (Manassas, VA), que se mantuvo en McCOY's 5A (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con FBS al 10 % (Invitrogen) y penicilina y estreptomicina al 1 % (Invitrogen) a 37 °C con un 5 % de CO2. En la línea celular LS-174T se efectuaron dos pases por semana después de un lavado en PBS y una tripsinización. Para cada fragmento de anticuerpo, se inyectaron por vía subcutánea a siete ratones hembra atímicos nu/nu de 4-6 semanas de edad (Charles River Laboratories, MA) 6 x 106 células LS-174T en 100 |jl de PBS en los flancos derecho e izquierdo. Se dejó que los tumores crecieran durante 10 días y en los siguientes estudios se reclutaron cinco ratones con tamaños adecuados en ambos flancos. El yoduro de potasio (UPSHER-SMITH, MN) estuvo en ClearH2O HydroGels a 290 mg/L 24 horas antes de la inyección para bloquear la absorción tiroidea del yodo metabolizado.

Formación de imágenes con MicroSPECT/CT

Se inyectaron proteínas de fragmento de 3E8 de marcadas con 123I a 1,8 mCi para conjugado 3E8cys.scFv 30 kD por ratón a través de la cola en 200 jL de PBS. N = Se tomaron imágenes de 4 ratones. Se tomaron imágenes Micro-SPECT/CT (Inveon, Siemens Preclinical, Knoxville, TN) de ratones a las 5-7 y 20 h después de una inyección IV. Se anestesiaron los animales utilizando inhalación de isoflurano con un 5 % del selector del vaporizador para la inducción y un 1,5-2 % para el mantenimiento. El proceso de barrido por microSPECT/CT duró una hora en el punto de tiempo de las 5 h y dos horas en el punto de tiempo de las 20 h. La diferencia se debió a la descomposición del 123I durante una semivida (13 h) y, por lo tanto, tasas de recuento mucho menores a las 20 h. Los barridos por CT duraron tres minutos. Las imágenes por microSPECT/CT se reconstruyeron con el algoritmo OSEM3D para tratar de reducir los posibles artefactos debidos al contenido de la vejiga y los recuentos de localización bajos. La discrepancia en el umbral se debió a una baja relación señal/ruido (SNR, por sus siglas en inglés) y diferencias en el rendimiento del agente. Estos niveles proporcionaron el mejor rango en todas las muestras para mostrar la depuración y el fondo en los tejidos circundantes. Las grandes cantidades de absorción en el contenido del estómago y la vejiga contribuyeron a una mala visualización. Sin embargo, esto no afectó con frecuencia a las evaluaciones de la región de interés (ROI, por sus siglas en inglés) de los tumores. En todos los casos se utilizó un barrido por CT para ayudar en la determinación del volumen del tumor. Las fascias y la grasa subcutánea proporcionaron suficiente contraste tisular para separar el xenoinjerto en los volúmenes de Ct .

Ejemplo 5: Fragmentos de anticuerpo que se unen a TAG-72

Se describen en la presente memoria una serie de moléculas VH-enlazador-VL y VL-enlazador-VH basadas en la secuencia del anticuerpo 3E8 que se une con alta afinidad y especificidad al epítopo sialil-Tn encontrado en TAG-72 en adenocarcinomas en seres humanos. Los enlazadores varían desde un único residuo de glicina, hasta enlazadores cortos que contienen Gly-Ser, hasta repeticiones más largas de secuencias de Gly-Ser, hasta el enlazador 205C 3E8.scFv. Todas las moléculas se expresaron, purificaron y caracterizaron como se muestra en la presente memoria. En resumen, se empleó inicialmente el mismo esquema de purificación que el utilizado para 3E8.scFv, con purificación por IMAC del material marcado con 6xHis, escisión por proteasa de TEV y repurificación por IMAC.

Se examinaron las moléculas en cuanto a la estabilidad mediante fluorimetría diferencial de barrido (DSF), en cuanto al estado oligomérico mediante cromatografía de filtración en gel y en cuanto a la unión mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR). El descubrimiento clave para esta divulgación es que se descubrió que 3E8HL(GGGGS) es casi puro desde el punto de vista oligomérico, era la más estable de las moléculas ensayadas y su afinidad para TAG-72 (2,6 nM) es tan buena como la descrita para cualquier ligante de TAG-72. Éste se denomina en todo momento 3E8.G4S. Dado que 3E8.G4S procede de un anticuerpo humanizado (3E8), no es probable que provoque una respuesta inmunitaria humana.

Se ha demostrado que 3E8.G4S es útil no solo para obtener imágenes de adenocarcinomas en ratones de xenoinjerto, sino también para la radioyodación del fragmento de anticuerpo. Los estudios de imágenes y biodistribución muestran que la molécula se elimina en horas del suero, se dirige al tumor de manera eficiente y no se acumula en otros órganos. Diversas moléculas (B72.3, CC49, huCC49, 3E8) demuestran la utilidad de los anticuerpos anti-TAG-72 en el diagnóstico y la formación de imágenes del cáncer. Se han descrito diversos fragmentos de anticuerpo, que incluyen Fab, Fab con dominio eliminado, diacuerpos y scFv, sobre la base de los anticuerpos nombrados anteriormente. La expresión similar a GMP como cantidades cercanas al proceso para la producción de un producto biológico se ha demostrado a partir de bacterias. 3E8.G4S es, por tanto, un prototipo de laboratorio avanzado.

Secuencias, producción de laboratorio y caracterización

Nomenclatura

Para describir completamente un fragmento de anticuerpo, se debe incluir una descripción de la orientación del dominio variable (VH-VL o VL-VH), la secuencia enlazadora de aminoácidos, otras características mantenidas en el producto proteico purificado final (por ejemplo, una cisteína C-terminal o marca de hexahistidina) y la estructura cuaternaria (scFv, diacuerpo, triacuerpo, multímero, etc.). Las construcciones incluidas en este documento están escritas como 3E8w(X) y.z, donde W describe la orientación (LH para VL-VH y HL para VH-VL), X describe la secuencia enlazadora, Y explica las características adicionales y Z informa de las principales especies cuaternarias. La molécula denominada 3E8HL(GGGGS) (SEQ ID n°: 32) se denomina en la presente memoria 3E8.G4S.

Clonación

Variantes cuaternarias:

Se generaron marcos de lectura abierta de 3E8LH(G).multímero (SEQ ID n°: 18 y 19), 3E8LH(GG).multímero (SEQ ID n°: 20 y 21), 3E8LH(GGG).multímero (SEQ ID n°: 22 y 23), 3E8LH(GGGG), (SEQ ID n°: 24 y 25), 3E8LH(GSSG), (SEQ ID n°: 26 y 27), 3E8LH(GGGGS), (SEQ ID n°: 28 y 29), y 3E8LH(SGGGG) (SEQ ID n°: 30 y 31) a partir de reacciones en cadena de la polimerasa superpuestas utilizando 3E8.scFv como plantilla. Los genes de longitud completa se digirieron con endonucleasas de restricción NdeI y BamHI antes de la ligación en el vector de sobreexpresión, pCOLD IV (Takara Bio.). Cada clon de ADN se verificó mediante digestión con endonucleasa de restricción analítica y secuenciación de ADN en Genewiz Inc. Cada variante se subclonó en el plásmido de expresión de T7, pHLIC. Primero, se digirieron las secuencias genéticas completas de pCOLD con NdeI y BamHI. A continuación, el gen se ligó en pHLIC que había sido digerido previamente con las mismas endonucleasas de restricción. Cada clon de ADN se verificó mediante digestión con endonucleasa de restricción analítica y secuenciación de ADN en Genewiz Inc.

Además, se construyeron otras dos variantes cuaternarias, 3E8HL(GGGGS) (SEQ ID n°: 32) y 3E8HL(GGGGS)his6 (SEQ ID n°: 12). Las secuencias de proteínas deseadas se tradujeron de forma inversa en secuencias de nucleótidos y se añadieron a los sitios de restricción CATATG y GGATCC para la subclonación en pCOLD IV y pHLIC en NdeI y BamHI, respectivamente. Los marcos de lectura abierta fueron sintetizados por Genewiz Inc. Los productos confirmados por secuencia se digirieron y ligaron en vectores de expresión. Los clones se confirmaron mediante reacciones de endonucleasa de restricción analíticas y secuenciación de ADN en Genewiz Inc.

Se generaron marcos de lectura abierta de 3E8HL(205C).scFv (SEQ ID n°: 34 y 35), 3E8HL(GGGGS)4.scFv (SEQ ID n°: 36 y 37), 3E8HL(GGGGS)3.scFv (SEQ ID n°: 38 y 39), 3E8HL(GSSG), (SEC ID n°: 42 y 43), 3E8HL(GGGGS), (SEC ID n°: 32 y 33) y 3E8HL(SGg Gg ), (SEC ID n°: 30 y 31) a partir de reacciones en cadena de la polimerasa superpuestas usando 3E8HL(GGGGS), como plantilla. Se generaron marcos de lectura abierta de 3E8LH(GGGGS)4.scFv y 3E8LH(GGGGS)3.scFv a partir de reacciones en cadena de la polimerasa superpuestas usando 3E8.scFv como plantilla. Los genes de longitud completa se digirieron con endonucleasas de restricción NdeI y BamHI antes de la ligación en el vector de sobreexpresión, pHLIC. Cada clon de ADN se verificó mediante digestión con endonucleasa de restricción analítica y secuenciación de ADN en Genewiz Inc.

Variantes de orientación:

Expresión

Las variantes de pHLIC se transformaron en C43(DE3) E. coli y se extendieron en placas de agar LB complementadas con ampicilina. Se seleccionan colonias individuales al día siguiente para inocular cultivos de semillas (25 ml de 2xYT con ampicilina por 1 L de medio de expresión deseado). Una vez que las semillas alcanzan la saturación, se utilizan para inocular 1 L de 2xYT con ampicilina en matraces sin deflectores de 4 L. Los cultivos de expresión se cultivan hasta una DO600 = ~0,8 at 37 °C antes del choque frío. Aquí, el choque frío se describe como 1 hora a 4 °C, o sumergido en agua helada durante aproximadamente 20 minutos. A mitad de camino del proceso de choque frío, se inducen los cultivos con IPTG 0,05 mM. Una vez finalizado el choque frío, los matraces se devuelven al agitador/incubador durante la noche (16 horas) a 16 °C.

Purificación

Se cosechan células posteriores a la expresión a 5.000 g por centrifugación. Los sedimentos se congelan a -80 °C o se purifican inmediatamente. Para purificar, los sedimentos celulares se resuspenden en 25 mL de tampón de lisis (Tris^HCl 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM pH 8,0) para cada 1 L de medio de expresión. Se añadieron a las células resuspendidas los siguientes reactivos para facilitar la lisis y la purificación: MgCl25 mM, CaCl2 0,5 mM, 2 U mL-1 de DNasa (Pierce), 200 ng mL-1 de RNasa (Fisher), 0,5 mg mL-1 de lisozima (Fisher), y Triton-X-100 al 0,1 %. Las muestras se incubaron a 4 °C durante 30 minutos con agitación suave. A continuación, se lisan las células mecánicamente mediante un Avestin Emulsiflex C2 entre 15.000 y 20.000 psi. Se realizó una centrifugación a 15.000 g para separar las fracciones soluble e insoluble. La fracción soluble se unió a 1 mL de resina Ni-NTA al 50 % (Thermo) por cada 1 L de medio expresado durante al menos 1 hora. Después de la unión de níquel, la muestra se añadió a una columna previamente fritada y se lavó (Tris^HCl 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM pH 8,0) antes de una elución (T ris^C l 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM pH 8,0).

La fracción eluida se trató con DTT 1 mM y la cisteína proteasa del Virus del Grabado del Tabaco (TEV) para escindir la fusión de hexahistidina. La reacción se realizó a temperatura ambiente durante la noche (16 horas), antes de añadir una segunda alícuota de TEV y DTT durante 4 horas más. La muestra escindida se dializó en tampón de lisis y se incubó con agarosa Ni-NTA al 50% durante al menos 1 hora antes de la aplicación a una segunda columna previamente fritada. El flujo se recogió y se dializó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para su caracterización. La concentración y la pureza se ensayaron mediante SDS-PAGE contra estándares conocidos.

Caracterización

Unión (resonancia de plasmón de superficie)

Las constantes de unión se determinaron utilizando un Biacore T100. Las concentraciones de proteína se realizaron a 0,5, 10, 25, 50, 75, 100, 150 y 200 nM con la realización a 75 nM por duplicado (figura 30). Los tiempos de asociación y disociación de las diluciones de proteínas fueron de 120 y 180 segundos, respectivamente.

Construcción y KD (nM)

3E8LH(G).multímero 3,7

3E8LH(GG).multímero 4,6

3E8LH(GGG).multímero 5,5

3E8LH(GGGG).diacuerpo 14,9

3E8LH(GSSG).diacuerpo 11,9

3E8LH(GGGGS).diacuerpo 14,0

3E8LH(SGGGG).diacuerpo 11,8

3E8LH(GGGGS)4.scFv 11,0

3E8LH(GGGGS)3.scFv 7

3E8HL(GGGG).diacuerpo 5,3

3E8HL(GSSG).diacuerpo 5,6

3E8HL(GGGGS).diacuerpo 2,6

3E8HL(GGGGS)his6.diacuerpo 11,1

3E8HL(SGGGG).diacuerpo 5,5

3E8HL(GGGGS)4.scFv 5

3E8HL(GGGGS)3.scFv 5

3E8HL(205c).scFv 7,8

Estabilidad (fluorimetría diferencial de barrido)

La desnaturalización térmica de las variantes de TIM se realizó con proteína 25 uM con colorante SYPRO Orange 5x. Las masas fundidas se ensayaron usando un ciclador térmico Bio-Rad C10000 con una tasa de incremento de 1 °C min-1 a intervalos de 0,2 °C. Los datos se exportaron a Microsoft Excel 2013. El T1/2 se calculó como la temperatura con la pendiente máxima determinada a partir de una ventana de 5° alrededor de cada punto (figura 31).

Estructura cuaternaria (cromatografía de filtración en gel)

Estado oligomérico

Se ensayó la estructura cuaternaria de scFv, diacuerpo y construcciones multiméricas mediante cromatografía por filtración en gel. Las construcciones 3E8.scFv tienen pesos moleculares que van de 26,5 a 28,3 kDa y se eluyen en su mayoría como especie monomérica con alguna especie dimérica. Las construcciones 3E8.G4S tienen pesos moleculares que van de 25,8 a 27,1 kDa y se eluyen como una sola especie dimérica. Las construcciones 3E8.multímero tienen pesos moleculares que van de 25,6 a 25,7 kDa.

Datos de secuencia y producción similar a GMP de 3E8.G4S

La proteína es un fragmento de anticuerpo que se une al disacárido, Sialil-Tn, que se sobreexpresa en una amplia gama de adenocarcinomas humanos.

II. Composición y materiales

A. Secuencia de proteínas

ARSWIMOYWGOGTLVTVSSGGGGSDIVMTOSPDSLAVSLGERA.TINCKSSOSVLYSSNNKNYL

AWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLT FGGGTKVEIK* (SEQ ÍD n° : 46)

La estructura primaria de 3E8.G4S se muestra con el dominio pesado variable subrayado, el enlazador GGGGS en negrita y el dominio ligero variable en cursiva. La proteína se expresa con una secuencia líder PelB para exportar (SEQ ID n°: 3) al periplasma. La peptidasa señal endógena de E. coli escinde la secuencia líder en el "/" entre la alanina y la glutamina dejando el producto final "QVQ ...". El producto no contiene modificaciones postraduccionales adicionales. El producto final contiene 233 residuos de aminoácidos. Las siguientes propiedades se calculan basándose en la secuencia de aminoácidos de 3E8.G4S:

Número de residuos 233

Peso molecular 25.610,5 Da

pI 8,36

Carga a (pH) 22,9(3), 18,0(4), 8,6(5), 4,9(6), 3,3(7), 1,3(8), -3,6(9), -16,4(10)

B. Secuencia de ADN

5 ’ATGAAATACTTGTTACCAACGGCAGCTGCTGGACTACTCCTATTGGCGGCTCAACC

TGCTATGGCTCAAGTACAACTAGTACAGTCGGGGGCGGAAGTCAAGAAACCGGGTG CAAGCGTGAAGGTGAGTTGTAAAGCATCTGGTTATACATTCACAGACCATGCGATA CATTGGGTCAGACAAGCACCGGGGCAACGTCTGGAATGGATGGGGTACTTTAGCCC TGGGAAT GACGATTTCAAGTACTCTCAAAAATTT CAAGGCCGGGTTACAATCACCGC CGATAAATCATCGTCAACAGCCTATATGGAGCTTTCGTCCTTGAGATCTGAGGATAC GGCTGTTTACTATT GCGCGAGATCTT GGATAATGCAGTATTGGGGACAAGGTACCCT CGTAACTGTGTCATCTGGCGGAGGTGGCTCCGACATTGTGATGACACAGAGTCCTGA CT CATTAGCGGTTTCCTTGGGGGAACGGGCAACTATTAACTGTAAGT CCAGTCAATC GGTC CT GT ACTCGT C AAAT AAC AAG AATT ATTT AG CTT GGT AC C AGC AAAAGC CTGG GCAGCCGCCTAAACTTTTGATCTACTGGGCGAGCACTAGAGAGTCCGGAGTACCAG ACCGCTTTAGTGGGTCAGGTTCTGGAACGGATTTTACCCTCACTATTTCGAGCTTAC AGGCGGAAGATGTAGCTGTCTATTACTGCCAGCAGTATTATAGCTATCCACTTACGT TCGGCGGTGGCACCAAGGTTGAAATAAAATAA3’ (SEQ ID n° : 47)

C. Características del plásmido

Se clona 3E8.G4S en el vector de sobreexpresión de T7, pHLICK (Durani, Sullivan y Magliery (2012) Protein Expression and Purification 85, 9-17) (figura 32). El plásmido está relacionado con pHLIC, pero sustituye el gen de la P-lactamasa para la resistencia a la ampicilina por el gen de la neomicina fosfotransferasa II para la resistencia a la kanamicina. Ambos vectores son derivados de pET11a. El marco de lectura abierta para 3E8.G4S se coloca corriente abajo con respecto al promotor T7 entre los sitios de endonucleasa de restricción Ndel y BamHI. Finalmente, el plásmido alberga el origen ColE1 para un alto número de copias. La secuencia completa del ADN plasmídico se encuentra en SEQ ID n°: 48.

Materiales

ADN: minipreparación de plásmido de 3E8.G4S pHLICK

Cepa transformada: 3E8.G4S pHLICK en DH10P

Cepa transformada: 3E8.G4S pHLICK en BLR(DE3)

Todas las construcciones confirmadas por secuenciación de ADN en Genewiz Inc.

Expresión

Selección de cepas y plásmidos

Se clonaron fragmentos de anticuerpo de 3E8 originalmente en pCOLD IV (Takara Bio Inc.) para la expresión de choque frío bajo el promotor cspA. Una vez transformados y escrutados en DH10p, XL1-Blue y NEB Express, se obtuvieron rendimientos similares (~0,05 mg L-1). Aquí, se utilizaron transformantes individuales para inocular 20 mL de 2xYT (16 g de triptona Bacto, 10 g de extracto de levadura Bacto, 5 g de NaCl) complementado con glucosa al 1 % y antibiótico apropiado. Los cultivos de semillas se cultivaron durante la noche a 37 °C con agitación rigurosa (225 rpm). Al día siguiente, los 20 mL de semillas saturadas se diluyeron en 1 L de 2xYT en un matraz con deflectores de 2 L y se cultivaron a 37 °C y 225 rpm hasta una DO600=0,75. En la fase logarítmica media se sumergieron los matraces en agua helada durante 10 minutos y se trataron los mismos con IPTG 0,1 mM para inducir el promotor cspA/lac en tándem. Después de una inducción de choque frío, los cultivos se devolvieron al incubador con agitador y se cultivaron durante la noche a 1 °C. Este protocolo y este plásmido produjeron bajos rendimientos con resultados inconsistentes. Como resultado, los genes del fragmento de anticuerpo se subclonaron en pHLIC para la expresión de T7.

El protocolo de expresión anterior se replicó para pHLIC transformado en BL21(DE3), C41(DE3), C43(DE3), T7 Express, T7 Express Iq, T7 Express LysY, T7 Express LysY/Iq, y Novablue(DE3). A partir de este estudio, se determinó que la mejor expresión se obtenía a partir de Overexpress C43(DE3) de Lucigen. Este es un derivado de BL21(DE3) originalmente seleccionado para la sobreexpresión de variantes tóxicas que incluyen proteínas de membrana.

Se ensayaron dos cepas de expresión de T7 adicionales, BLR(DE3) y HMS174(DE3). BLR(DE3) es un derivado de BL21(d E3) que es recA-, lo que da como resultado una estabilidad mejorada del genoma y del plásmido. HMS174(DE3) es una bacteria K12 que también contiene mutaciones en el gen recA. (Figura 33). Cuando se escrutaron ambas cepas para la sobreexpresión de T7 con pHLIC, BLR(DE3) superó sistemáticamente a HMS 174(DE3) y generó resultados comparables a C43(DE3). Por lo tanto, 3E8.G4S se optimizó con pHLICK en BLR(DE3).

Matraz de agitación

Los siguientes parámetros se han optimizado para la expresión de 3E8.G4S en matraces de agitación: concentración de IPTG, temperatura, tiempo de inducción, velocidad del agitador, elección del matraz y complementación con glucosa.

i. Concentración de IPTG. Nuestro laboratorio ha expresado fragmentos de anticuerpo de 3E8 bajo diversas concentraciones de IPTG, que incluyen 1 mM, 0,1 mM y 0,05 mM. Se ha determinado que IPTG 0,05 mM produce las mayores expresión y consistencia totales.

ii. Temperatura: Los matraces se incuban a 37 °C desde la inoculación hasta la inducción. En la fase logarítmica media a tardía, los matraces se retiran del incubador con agitador y se someten a un choque frío para inducir la expresión de la chaperona. Esto se logra sumergiendo los cultivos en agua helada durante 10 minutos o incubando los matraces durante 30-60 minutos a 4 °C. Después del choque frío, los matraces se devuelven al incubador con agitador y se cultivan a 16 °C durante la noche.

iii. Tiempo de inducción. La inducción tenía lugar originalmente a una DO600 = 0,6-0,75, pero se concluyó que se obtenían mayores rendimientos realizando una inducción más tarde. Actualmente, la inducción tiene lugar a una DO600 = 1,0-1,5.

iv. Velocidad del agitador y elección del matraz. Varias expresiones de fragmentos de anticuerpo 3E8 dieron como resultado densidades ópticas reducidas a partir de la lisis celular después de la inducción con IPTG. El control de calidad confirmó que estos cultivos no adolecían de fagos. Se planteó la hipótesis de que la lisis celular era el resultado de la inestabilidad de la membrana causada por la exportación periplásmica de nuestra proteína sobreexpresada. Las proteínas se expresaron en matraces sin deflectores a velocidades reducidas (125 rpm). Para compensar la pérdida de oxigenación, se prepara 1 L de medio en matraces de 4 L. Estas adaptaciones mejoraron la reproducibilidad, pero no afectaron negativamente al rendimiento. Como resultado, se usaron matraces sin deflectores a 225 rpm hasta la inducción, luego la velocidad se reduce a 125 después de la adición de IPTG.

v. Complementación con glucosa. Para limitar la expresión con pérdidas de la ARN polimerasa de T7, los transformantes se extienden en placas de agar LB (10 g de triptona Bacto, 5 g de extracto de levadura Bacto, 5 g de NaCl, 15 g de agar Bacto por litro) complementado con antibióticos apropiados y glucosa al 1 %. Los cultivos de semillas de 2xYT se inoculan con una sola colonia, antibiótico apropiado y glucosa al 1 %. Los matraces de expresión no se complementan con glucosa, y los cultivos de semillas saturados que contienen glucosa al 1 % se diluyen al menos 40 veces en el medio de expresión.

En resumen, 3E8.G4S se expresa en BLR(DE3) a partir del plásmido de sobreexpresión, pHLICK. Los transformantes se extienden en placas de agar LB complementado con kanamicina y glucosa al 1 % y se cultivan durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se utiliza una sola colonia para inocular 20 mL (por 1 L de expresión deseada) de 2xYT con kanamicina y glucosa al 1 %. El cultivo de semillas se cultiva durante la noche a 37 °C a 225 rpm. Al tercer día, los 20 mL de semilla saturada se diluyen en 1 L de 2xYT con kanamicina en un matraz sin deflectores de 4 L. El cultivo se cultiva a 37 °C y 225 rpm hasta una DO600 = 1,0-1,5. En esta fase, los matraces se sumergen en agua helada durante 10 minutos o se llevan a la cámara frigorífica a 4 °C durante 30-60 minutos. A mitad de camino del proceso de choque frío, se añade IPTG hasta una concentración final de 0,05 mM (50 pL de IPTG 1 M por 1 L de medio). Al concluir el choque frío, los cultivos se devuelven al agitador/incubador a 16 °C y 125 rpm durante aproximadamente 16 horas. Estos procedimientos produjeron ~0,25 mg L-1.

Fermentación discontinua:

Toda la optimización de la fermentación se ha realizado en un New Brunswick Bioflo 110. Este biorreactor tiene un recipiente de 4 L y las expresiones se realizaron en la escala de 3 L. Además, todas las expresiones hasta la fecha se realizaron en 3E8.G4S pHLICK en BLR(DE3).

i. Cultivos de semillas. Se seleccionó un solo transformante de medio sólido para inocular un cultivo previo a la siembra de 20 mL de 2xYT complementado con antibiótico apropiado y glucosa al 1 % (37 °C, 225 rpm, durante la noche). A continuación, se utilizaron 10 mL del cultivo previo a la siembra saturado para inocular el cultivo de semillas. El cultivo de semillas contiene 250 mL de 2xYT, antibiótico apropiado y glucosa al 1 % en un matraz de 500 mL (con deflectores o sin deflectores). Este cultivo se cultiva hasta la saturación a 37 °C y 225 rpm. Se usa todo el cultivo de semillas saturado para inocular el cultivo de expresión de 3 L (dilución 12x).

ii. Medio Se utilizó el siguiente medio químico (sin animales) como base para los experimentos iniciales de fermentación (todos los valores son por 1 L):

4 g de K2HPO4

1 g de KH2PO4

1 g de NH4Cl

2,4 g de K2SO4

20 g de casaminoácidos Bacto

3 g de extracto de levadura Bacto

40 g de glicerol

10 mL de elementos trazas*

pH 7

*Solución de elementos trazas (todos los valores son por 1 L)

5 g de EDTA

0,5 g de FeCl3^6H2O

0,05 g de ZnO

0,01 g de CuCl2^2H2O

0,01 g de Co(NO3)2^6H2O

0,01 g de (NH4)6Mo7O24^4H2O

pH 7

iii. Condiciones del biorreactor. Las siguientes condiciones están resumidas a partir de varios experimentos (37 °C hasta la inducción, 20 °C después de la adición de IPTG). Las dos condiciones principales que se optimizaron fueron el porcentaje y la fuente de oxígeno disuelto, así como la velocidad de agitación. Se utilizó el impulsor estándar de Rushton, pero no incluía deflectores. Inicialmente, se utilizaron deflectores y se ajustó la velocidad de agitación a 100 rpm según la experiencia previa con matraces de agitación; los matraces con deflectores a 225 rpm condujeron a una lisis celular. (Figura 34). Cuando se aumentaron las velocidades de agitación a 300 rpm, las densidades ópticas alcanzaron ~7 utilizando el medio base descrito anteriormente. Los cultivos cultivados a 300 rpm pudieron llevarse a una DO600 > 10 mediante la adición de pasadas adicionales de carbón filtrado estéril (glucosa, glicerol, casaminoácidos Bacto, etc.). Se realizó un medio más rico sobre la base de la composición anterior.

Las modificaciones incluyeron 30 g de casaminoácidos Bacto, 5 g de triptona Bacto, 60 g de glicerol y glucosa al 1 % por 1 L de medio. Además, las velocidades de agitación se aumentaron a 1.000 rpm antes de la inducción. En estas condiciones se obtuvieron densidades ópticas superiores a 15. Con esta densidad óptica, la inducción tuvo lugar con IPTG 0,5 mM y la temperatura y la velocidad de agitación se redujeron a 20 °C y 500 rpm, respectivamente. Este cultivo inducido agotó rápidamente el dO2 y el crecimiento se estancó en DO600 < 20. Se añadió oxígeno suplementario hasta dO2 = 30 % y las densidades celulares aumentaron a casi 50 durante la expresión a lo largo de la noche. A las 24 horas, las células se cosecharon y se purificaron. Se alcanzaron rendimientos de 10 mg L-1.

A continuación, se determinó el papel del punto de inducción y el curso del tiempo de expresión para 3E8.G4S. La muestra se preparó de idéntica manera a como se ha indicado anteriormente, pero se dejó que el cultivo alcanzase una DO600 = 45, antes de añadir IPTG 0,5 mM, desplazando la temperatura a 20 °C, reduciendo la agitación a 500 rpm y añadiendo oxígeno suplementario para mantener el dO2 al 30 %. Este cultivo mantuvo una densidad óptica de 45-50 durante casi 24 horas después de la inducción cuando se terminó el experimento. A las 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 y 8 horas se cosecharon 50 mL de cultivo, que se congelaron rápidamente para estudios adicionales (figura 35). Cada sedimento celular se resuspendió hasta una DO600 = 46 y se purificaron en paralelo 10 mL de cultivos normalizados.

Los resultados muestran que en estas condiciones se pueden obtener los mayores rendimientos cuando los cultivos se cosechan entre 2 y 3 horas de inducción. El punto de tiempo de cuatro horas parece ser una anomalía (distribución gaussiana entorpecida), probablemente debido a una purificación inconsistente. A partir de este experimento se calculó que se habrían obtenido 33 mg L-1 (100 mg en total) si se hubiese cosechado y purificado todo el cultivo entre 2-3 horas.

iv. Parámetros adicionales. El pH se mantuvo a 7 mediante titulación básica con hidróxido de amonio y titulación ácida con ácido fosfórico. La temperatura se mantuvo mediante una manta calefactora y haciendo circular agua fría a través de serpentines de circuito cerrado.

Purificación

Resumen

Se expresó 3E8.G4S con una marca de hexahistidina escindible y cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). Después de la elución de la columna de Ni-NTA, la proteína se incubó a temperatura ambiente durante la noche con la cisteína proteasa del Virus del Grabado del Tabaco (TEV) y DTT 1 mM. Se utiliza una segunda columna de Ni-NTA para eliminar la marca de hexahistidina, la proteasa de TEV marcada con His. Se utiliza una operación de intercambio catiónico para eliminar varios contaminantes proteicos. Por SDS-PAGE, el producto deseado es casi homogéneo. (Figura 36).

Se emplearon estrategias de purificación que eliminan la dependencia de las marcas de hexahistidina y la proteasa de TEV para las licencias y los costos. Como resultado, se clonaron y caracterizaron dos nuevas variantes que eliminan la secuencia de reconocimiento de la proteasa de TEV y la marca de hexahistidina. El 3E8.G4S original deja un pequeño enlazador GSSG en el extremo N. Para ensayar la importancia del enlazador, se ensayaron dos variantes: una que comienza con GSSG-QVQ... y una segunda que comienza con el QVQ... nativo. (Figura 37).

Nota: El enlazador GSSG no afectó al plegamiento, la estabilidad, la función o la expresión de 3E8.G4S. Como resultado, la construcción más inferior mostrada anteriormente. Aquí, el extremo N comienza con la secuencia líder PelB para dirigir la proteína que contiene disulfuro al periplasma. Tras la escisión de la secuencia líder mediante la peptidasa señal endógena de E. coli, las proteínas finales comienzan con los aminoácidos, QVQ.

Cosecha y almacenamiento

Después de un crecimiento durante la noche, las células se cosechan por centrifugación. Aquí, la expresión se centrifuga a 5.000 g durante 10 minutos usando una centrífuga Sorvall RC6+. El medio se decanta y la pasta celular se transfiere a cubetas para especímenes para su almacenamiento a -80 °C. Se han almacenado pastas celulares a esta temperatura durante seis meses sin pérdida de actividad.

Lisis celular y clarificación

Las pastas celulares se retiran del congelador a -80 °C y se descongelan en hielo durante aproximadamente 20-30 minutos. A continuación, las células se resuspenden en tampón de unión a proteína L (fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 7,2). Para la expresión en matraz de agitación, las pastas celulares se resuspenden en 20-25 mL de tampón de unión por 1 L de expresión. No hemos escalado esta etapa para fermentaciones completas de 3 L que alcanzan una DO600 = -40. Las células se resuspenden hasta la homogeneidad antes de la adición secuencial de 75 |jL de MgCl2 2 M, 150 pL de CaCl2, 10 pL de RNasa A (10 mg mL-1, USB Cat. #: 78020Y), 5 pL de DNasa (10 unidades pL-1, Roche Cat. #: 04716728001), 300 pL de Triton-X-100 al 10 %: todos los valores por 30 mL de resuspensión.

Concentraciones finales

MgCl25 mM

CaCl20,5 mM

RNasa 3,3 |jg mL-1

DNasa 1,6 unidades mL-1

Tritón X-100 al 0,1 %

El 3E8.G4S se exporta al periplasma de BLR(DE3). Se utilizó lisis celular, donde el citoplasma y el periplasma se aíslan juntos. Este procedimiento aumentó el rendimiento, pero no afectó a la actividad. Después de la adición de los suplementos enumerados, las células se lisan mecánicamente con un Avestin Emulsiflex C3. Aquí, la resuspensión se aplica al sistema y se somete a un ciclo sin diferencial de presión. Una vez completada esta etapa, las células se lisan alternando la presión entre 0 y 15.000-20.000 psi. La resuspensión completa se hace circular a través del aparato 3-4 veces para asegurar una lisis y homogeneidad completas. A continuación, la lisis celular se transfiere a tubos SS34 y se centrifuga a 15.000 g durante 45 minutos en una centrífuga Sorvall RC6+ para separar las fracciones celulares soluble e insoluble. Después de los 45 minutos de centrifugación, se transfiere el sobrenadante a un segundo tubo SS34 y se centrifuga durante 45 minutos más a 15.000 g. El sobrenadante representa el lisado aclarado.

Cromatografía de proteína L

La primera etapa de purificación para extraer 3E8.G4S del lisado aclarado es la cromatografía de proteína L. Los procedimientos de purificación se optimizaron utilizando una columna de proteína L de GE Healthcare HiTrap de 1 mL (Cat #: 29-0486-65). El lisado aclarado se diluyó 1:1 en tampón de unión a proteína L (fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 7,2), o se dializa el lisado aclarado en tampón de unión a proteína L (4 cambios de 1 L durante 30 minutos cada uno, suponiendo ~25 mL de muestra). Estos dos procedimientos unieron la columna de forma casi cuantitativa.

Procedimiento de FPLC (expresión de 1 L del matraz de agitación): La columna de proteína L se equilibra primero con 5 volúmenes de columna (VC) de tampón de unión a proteína L. A continuación, la muestra se carga a 1 mL min-1 antes de lavar con 10 VC de tampón de unión a Proteína L (lavado 1 mL min-1). (Figura 38). A continuación, la muestra se eluye con tampón de elución de proteína L (glicina 100 mM pH 3). El gel SDS-PAGE que se muestra a la derecha muestra el flujo, el lavado y la elución del 3E8.G4S marcado con hexahistidina. Téngase en cuenta que el fragmento de anticuerpo deseado está marcado con una flecha y que se unen y se eluyen de la columna de proteína L varios productos proteolíticos o contaminantes de copurificación. Estas bandas pueden eliminarse mediante cromatografía de intercambio iónico. Afortunadamente, cuando se eliminó la secuencia de reconocimiento de la proteasa de TEV y la marca de hexahistidina del marco de lectura abierta, las bandas de copurificación están ausentes (véase gel a la derecha, abajo). La proteína L ha producido una purificación casi cuantitativa y casi una homogeneidad mediante SDSPAGE (>95 %).

Cromatografía de intercambio iónico

A la purificación de la proteína L le siguió un intercambio iónico como etapas de pulido y para eliminar las endotoxinas y el ácido nucleico contaminantes. Basándose en Protein Calculator V3.3 de Scripp, el pH de 3E8.G4S es 8,4 y, por lo tanto, más susceptible de unirse a intercambiadores de iones cargados negativamente. Aquí, se muestra la optimización a escala de investigación para la unión de 3E8.unión y la elución a partir de columnas Resource Q (GE Cat. #: 17-1177-01) y Resource S (GE Cat. #: 17-1178-01) de 1 mL.

Tradicionalmente, 3E8.G4S se cambia a tampón de unión Resource S (acetato de potasio 50 mM, cloruro de sodio 15 mM, pH 5) mediante cromatografía de exclusión por tamaño (PD10, GE Cat. #: 17-0851-01) antes de la carga de la columna Resource S. Después de equilibrar la columna con 5 VC de tampón de unión Resource S, la muestra se añade a 1 mL min-1. La columna se lava con 2 VC de tampón de unión Resource S antes de la elución. Se realizó un gradiente de tampón de unión Resource S a tampón de elución Resource S (acetato de potasio 50 mM, NaCl 1 M, pH 5). El 3E8.G4S se eluye generalmente a una concentración de 300 mM de cloruro sódico (~30 % de tampón de elución). En estas condiciones, la unión y la elución posterior son casi cuantitativas.

Para ensayar la viabilidad de la purificación en tándem entre la cromatografía de proteína L y el intercambio iónico Resource S, el tampón del fragmento de anticuerpo se cambió a tampón de elución de proteína L y el fragmento de anticuerpo se aplicó a la columna Resource S. Aquí, la muestra se unió muy fuertemente y se eluyó con un perfil amplio entre cloruro sódico 600-800 mM (60-70 % de glicina 100 mM, cloruro sódico 1 M pH 3). La caída adicional en el pH de 5 a 3 probablemente dicta la unión mejorada a la columna Resource S. Puede ser beneficioso ajustar el pH antes de la elución de la proteína L con tampón concentrado de aproximadamente pH 5.

Se sabe que los ácidos nucleicos y las endotoxinas bacterianas se asocian estrechamente con resinas iónicas cargadas positivamente. Se utilizó una columna de intercambio iónico final para eliminar estos contaminantes. Cuando 3E8.G4S se cambia a Tris 20 mM con un pH 8 o 9. Esta muestra se aplicó a una columna Resource Q donde se observó poca o ninguna unión. Se recogió el flujo, que se espera que carezca tanto de endotoxinas como de ácidos nucleicos. Los datos principales de estos experimentos se muestran en los gráficos posteriores. Téngase en cuenta que las eluciones de Resource S y los flujos de Resource Q se pasaron por gel SDS-PAGE para confirmar la identidad de la proteína. (Figura 39).

Análisis de ácidos nucleicos de baja sensibilidad

Para ensayar la contaminación bruta de ácido nucleico, se analizaron varias muestras mediante electroforesis en gel de ADN y tinción con bromuro de etidio, así como absorbancia a 260 nm. Una alícuota de las siguientes muestras se transfirió a solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se normalizó para la concentración de 3E8.G4S mediante cuantificación en gel y A280: elución de proteína L antes de intercambio iónico, elución de proteína L después del intercambio iónico a partir de Resource S (acetato de potasio), elución de proteína L después del intercambio iónico a partir de Resource S (glicina), elución de proteína L después del intercambio iónico a partir de Resource Q (T ris pH 8), elución de proteína L después del intercambio iónico a partir de Resource Q (Tris pH 9). Cada muestra se ensayó mediante A280, A260 y tinción con bromuro de etidio en gel de agarosa. No hubo tinción observable con bromuro de etidio y no se detectaron puntos de inflexión mediante espectrofotometría UV-Vis. (Figura 40).

Flujo de proceso

Basándose en las optimizaciones actuales, se puede utilizar el siguiente flujo de proceso.

1. Expresión por fermentación

2. Cosecha de células por centrifugación

3. Resuspensión en tampón de unión a proteína L

4. Lisis celular por presión diferencial automatizada (Avestin Emulsiflex o similar)

5. Eliminación de material insoluble por centrifugación

6. Cromatografía de proteína L

7. Ajustar la elución a pH 5 con tampón concentrado

8. Cromatografía de intercambio catiónico

9. Ajustar la elución a pH 8-9 con tampón concentrado

10. Cromatografía de intercambio iónico

11. T ransferir al tampón de almacenamiento

Ensayo de actividad

Se puede utilizar un ensayo en placa de 96 pocillos para determinar la actividad (unión) que asegura la calidad. Se basará en un ELISA competitivo con B72.3 disponible comercialmente. La unión de 3E8.G4S se cuantifica mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR).

Ejemplo 6: Fragmentos de anticuerpo

Tabla 2. Proteína radiomarcada, cantidad, rendimiento de radiomarcaje, pureza radioquímica, radioconcentración y actividad específica de la proteína radiomarcada

El análisis preliminar de los datos de distribución muestra que se observa aproximadamente un 5% ID/g a las 3 horas con el fragmento de anticuerpo y aproximadamente a 1 hora tanto con el scFv desnudo como con el scFv conjugado con 11451. Por tanto, el scFv más pequeño parece eliminarse más rápidamente que el fragmento de anticuerpo, como se esperaba, pero la adición de los p Eg pequeños y discretos no aumentó radicalmente los tiempos de residencia en suero del scFv. Las representaciones gráficas semilogarítmicas de los datos de concentración sanguínea no fueron concluyentes. El scFv desnudo y el scFv PEGilado de 40 kDa mostraron sólo una única gráfica lineal, mientras que el resto produjo dos compartimentos de pendiente bastante similar, lo que hace que las comparaciones de cualquier dato de velocidad no sean significativas. La amplia gama de retención sanguínea y el orden de los compuestos se visualiza bien en los gráficos de curva de sangre %ID vs. tiempo en la figura 46.

Los dos PEG de 40 kD, uno lineal y otro ramificado, ampliaron enormemente la depuración de la sangre, mucho más allá del fragmento de anticuerpo no PEGilado. Las semividas séricas de los PEG de 40 kD casi coinciden con las obtenidas para la IgG CC49 de longitud completa. La absorción y retención tumoral debería ser muy fuerte en estos derivados, según nuestra correlación conocida entre la depuración de la sangre y la señal tumoral; sin embargo, la biodistribución tisular a las 24 horas (el modo de formación de imágenes del día siguiente para la formación de imágenes por 123I-SPECT/CT) indica que queda un fondo de sangre significativo que probablemente comprometa las imágenes.

El barrido por microSPECT/CT indicó una absorción significativa de cada molécula ensayada en xenoinjertos de carcinoma de colon humano LS-174T en ratones sin timo. Los principales tejidos de fondo de ambas moléculas fueron el estómago y la vejiga. En la figura 48 se muestra el barrido por microSPECT/CT a las 5 y 20 h. Se observó menos fondo para 3E8.G4S a las 20 h, pero se observó una mayor cantidad de señal total en los tumores para conjugado 3E8cys.scFv 30 kD en el mismo punto de tiempo. Esto concuerda con los datos de biodistribución.

Biodistribución en ratones de xenoinjerto

Se determinaron las biodistribuciones de 3E8.G4S y 3E8.scFv PEG de 30 kD marcados con 123I en ratones de xenoinjerto a las 22 h como se ha descrito anteriormente para las moléculas marcadas con 125I con ratones normales. El fragmento de anticuerpo se dirige al tumor con buena especificidad a las 22 h, quedando poco material en la sangre y encontrándose material significativo sólo en los riñones (además del tumor). Se encontró un mayor porcentaje de la dosis inicial del conjugado scFv 30 kD en el tumor en comparación con el fragmento de anticuerpo, pero permanecieron cantidades significativas de scFv PEGilado en la sangre, los riñones, los pulmones y el corazón.

Datos de la sonda

Además de la formación de imágenes por SPECT/CT, se registró la radioactividad utilizando una sonda de mano. En los primeros momentos, el Neoprobe 2000 diferencia mal entre fondo y tumor. Esto es de esperar, ya que los fragmentos de anticuerpo no han tenido tiempo de localizarse en el tejido enfermo y están circulando activamente en el suero sanguíneo. Las relaciones señal-ruido mejoran con el tiempo y a las 22 horas hay un triple aumento en la señal del tumor con respecto al fondo para 3E8.G4S.

Se produjeron al menos 3 mg de los siguientes tres fragmentos de anticuerpo: (1) diacuerpo HuCC49; (2) 3E8.G4S; (3) 3E8 scFv cadena sencilla. Las proteínas son puras en al menos un 95 % y demuestran unión al antígeno TAG-72. Tabla 4:

Se logró la producción de conjugados del fragmento de anticuerpo de cadena sencilla 3E8 scFv con tres moléculas de dPEG diferentes. Se recuperan al menos 100 |jg de cada uno de los conjugados, con una pureza > 95 %. Los conjugados de proteínas demuestran unión al antígeno TAG-72 in vitro.

Tabla 5

Ejemplo 7: Purificación de 3E8.G4S

Se expresó 3E8.G4S con una marca de hexahistidina escindible y cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). Después de la elución de la columna de Ni-NTA, la proteína se incubó a temperatura ambiente durante la noche con la cisteína proteasa del Virus del Grabado del Tabaco (TEV) y DTT 1 mM. Se utiliza una segunda columna de Ni-NTA para eliminar la marca de hexahistidina, la proteasa de TEV marcada con His. Se utiliza una operación de intercambio catiónico para eliminar varios contaminantes proteicos. Por SDS-PAGE, el producto deseado es casi homogéneo (figura 36).

Se clonaron dos nuevas variantes que eliminan la secuencia de reconocimiento de la proteasa de TEV y la marca de hexahistidina. El 3E8.G4S original deja un pequeño enlazador GSSG en el extremo N. Una variante comienza GSSG-QVQ..., y la segunda comienza con el QVQ... nativo. El enlazador GSSG no afectó al plegamiento, la estabilidad, la función o la expresión de 3E8.G4S. Como se muestra en la figura 50, el extremo N comienza con la secuencia líder PelB para dirigir la proteína que contiene disulfuro al periplasma. Tras la escisión de la secuencia líder mediante la peptidasa señal endógena de E. coli, las proteínas finales comienzan con los aminoácidos, QVQ.

La primera etapa de purificación para extraer 3E8.G4S del lisado aclarado es la cromatografía de proteína L. El procedimiento de purificación implica el uso de una columna de proteína L GE Healthcare HiTrap de 1 mL o 5 mL. El lisado aclarado puede diluirse 1:1 en tampón de unión a proteína L (fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 7,2), o se dializa el lisado aclarado en tampón de unión a proteína L (4 cambios de 1 L durante 30 minutos cada uno, suponiendo ~25 mL de muestra). Estos dos procedimientos unieron la columna de forma casi cuantitativa.

Procedimiento de FPLC (se supone una expresión de 1 L del matraz de agitación): La columna de proteína L se equilibró primero con 5 volúmenes de columna (VC) de tampón de unión a proteína L. A continuación, la muestra se cargó a 1 mL min^{' 1} antes de lavar con 10 VC de tampón de unión a proteína L (1 mL min^{' 1} de lavado). A continuación, la muestra se eluyó con tampón de elución de proteína L (glicina 100 mM pH 3). El gel SDS-PAGE que se muestra en la figura 51 muestra el flujo, el lavado y la elución del 3E8.G4S marcado con hexahistidina. Téngase en cuenta que el fragmento de anticuerpo deseado está marcado con una flecha y que se unen y se eluyen de la columna Proteína L varios productos proteolíticos o contaminantes de copurificación. Estas bandas pueden eliminarse mediante cromatografía de intercambio iónico. Cuando se eliminaron la secuencia de reconocimiento de la proteasa de TEV y la marca de hexahistidina del marco de lectura abierta (variante QVQ), las bandas de copurificación estaban ausentes (figura 51). La proteína L ha producido una purificación casi cuantitativa y casi una homogeneidad por SDS-PAGE (>95 %).

Ejemplo 8: Caracterización biofísica

Estructura cuaternaria. La longitud del enlazador de aminoácidos que conecta el dominio pesado variable y el dominio ligero variable de los fragmentos de anticuerpo determina la estructura cuaternaria de la proteína. En general, las longitudes de enlazador mayores conducen a scFv, mientras que las menores de ~ 12 aminoácidos conducen a diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, etc. Según estudios en animales (PK, BioD y formación de imágenes), además de estudios biofísicos, el mejor enlazador de 3E8 para formación de imágenes y diagnóstico con ¹²³I y ¹²⁴I es GGGGS (G4S).

Para determinar la estructura cuaternaria de 3E8.G4S, se realizaron una filtración en gel (medio GE Superdex 75) y una ultracentrifugación analítica (Beckman). Por filtración en gel, se observaron dos picos con un punto de inflexión de mayor peso molecular, lo que sugiere tres especies. Se describió la misma observación mediante ultracentrifugación analítica (AUC, por sus siglas en inglés). Aquí, la AUC se realizó a 1 mg mL^{’ 1}. Los ajustes se realizaron utilizando software de Beckman y se confirmaron con SedFit. Los datos de absorbancia e interferencia de la AUC se ajustaron para determinar el peso molecular y la distribución de las tres especies. 3E8.G4S existe como una formulación estable de diacuerpo (50 kD), triacuerpo (75 kD) y tetracuerpo (100 kD). La distribución es 50 % de diacuerpo, 35-40 % de triacuerpo y 10-15 % de tetracuerpo (figura 52). No se identificaron especies de peso molecular de composición mayor (incluidos los agregados) o menor mediante filtración en gel de ultracentrifugación analítica.

Para ensayar la coherencia del material producido por E. coli, se seleccionaron, expresaron, purificaron y caracterizaron doce transformantes individuales mediante Superdex 75 (figura 52). Todas las preparaciones muestran características de diacuerpo, triacuerpo y tetracuerpo con menos de un 10 % separando los extremos (+/- 5 % de diferencia con respecto a la media).

Ejemplo 9: Caracterización de moléculas

Farmacocinética

3E8.G4S mostró una farmacocinética ideal como se muestra en las figuras 53 y 54. A las 24 horas y más, se identifica en el suero menos del 5 % del fondo y, a diferencia del scFv, existe un tiempo de circulación adecuado para asegurar la interacción y unión con los tumores. Todas las curvas de sangre se realizaron en ratones sanos. Téngase en cuenta que 3E8.G4S se radiomarca bien con yodo utilizando el método lodogen estándar (>70 % y llegando a alcanzar un 95 %).

Biodistribución

Para comprender mejor la biodistribución de 3E8.G4S en ratones, los animales se sacrificaron a las 72 horas y los sistemas de órganos se aislaron para análisis adicionales. Como puede observarse en la figura 55, ningún tejido acumula significativamente 3E8.G4S.

Para comprender mejor la biodistribución de la molécula, se realizaron estudios de necropsia de ratones en dos puntos de tiempo adicionales. Téngase en cuenta que el punto de tiempo de 48 horas fue en ratones de xenoinjerto sin timo. Para estos animales, la absorción tumoral promedio fue de un 7 % ID/g. En la figura 55 se muestran las relaciones tumor:tejido aproximadas de la sangre (9:1), el hígado (20:1), los riñones (7:1), el GI (29:1). Según estos análisis, 3E8.G4S es ideal para la formación de imágenes de una amplia gama de adenocarcinomas.

Formación de imágenes, ¹²⁴I-3E8.G4S a través de PET

El estado actual de la técnica en la formación de imágenes del cáncer es ¹⁸FDG. Esta modalidad de formación de imágenes adolece de un alto nivel de fondo, numerosos falsos positivos y una mala relación tumor:fondo para las sondas de mano. Se obtuvieron imágenes de ratones con xenoinjerto a los que se les habían implantado tumores de adenocarcinoma de colon humano (células LS-174T) con ¹⁸FDG, IgG 3E8 de longitud completa y un fragmento de anticuerpo 3E8, específicamente un componente de 3E8.G4S. Como era de esperar, el ratón ¹⁸FDG muestra absorción inespecífica del radiotrazador y un mal marcaje de los dos tumores implantados en los flancos izquierdo y derecho. La IgG de longitud completa marca bien los tumores, pero a las 24 horas todavía reside en el suero, lo que produce un alto nivel de fondo. El fragmento más pequeño de 3E8 es ideal. Marca fuertemente ambos tumores, incluido un tumor pequeño (1 mm) en el flanco izquierdo, y el fondo es mínimo. En la figura 56, se muestran 4 ratones de los cuales se habían obtenido imágenes a las 48 horas con 3E8.G4S. Estos animales tienen tumores únicos en los flancos derechos. Aquí, el único fondo que se ve es una cantidad mínima en la vejiga y la tiroides. A los pacientes humanos se les bloquea la tiroides con yodo frío y el cateterismo vacía la radiactividad de la vejiga antes de la obtención de imágenes y la cirugía. 3E8.G4S muestra un mayor %ID/g para el tumor que los diacuerpos previamente caracterizados.

Caracterización biofísica

Estructura cuaternaria. La longitud del enlazador de aminoácidos que conecta el dominio pesado variable y el dominio ligero variable de los fragmentos de anticuerpo determina la estructura cuaternaria de la proteína. En general, las longitudes de enlazador mayores conducen a scFv, mientras que las menores de ~ 12 aminoácidos conducen a diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, etc. Según estudios en animales (PK, BioD y formación de imágenes), además de estudios biofísicos, el mejor enlazador de 3E8 para formación de imágenes y diagnóstico con ¹²³I y ¹²⁴I es GGGGS (G4S).

Para determinar la estructura cuaternaria de 3E8.G4S, se realizaron una filtración en gel (medio GE Superdex 75) y una ultracentrifugación analítica (Beckman). Por filtración en gel, se ven dos picos con un punto de inflexión de mayor peso molecular, lo que muestra tres especies (figura 57). Se describió la misma observación mediante ultracentrifugación analítica (AUC). Los datos de absorbancia e interferencia de la AUC se ajustaron para determinar el peso molecular y la distribución de las tres especies. 3E8.G4S existe como una formulación estable de diacuerpo (50 kD), triacuerpo (75 kD) y tetracuerpo (100 kD). La distribución es 50 % de diacuerpo, 35-40 % de triacuerpo y 10­ 15 % de tetracuerpo. No se identificaron especies de peso molecular de composición mayor (incluidos agregados) o menor mediante filtración en gel de ultracentrifugación analítica.

Para comprender mejor la formulación de 3E8.G4S, se aislaron las especies de bajo (~ 50 kD) y alto (>75 kD) peso molecular mediante cromatografía de filtración en gel. Téngase en cuenta que esta separación no es susceptible de una producción a escala de proceso. La formulación completa y los componentes se estudiaron individualmente. La farmacocinética, la biodistribución y la formación de imágenes del diacuerpo se han mostrado anteriormente (especies de alto PM de 3E8.G4S y especies de bajo PM de 3E8.G4S en los gráficos). Como era de esperar, las especies de alto PM producen semividas séricas más largas que la formulación completa y las especies de bajo PM. Como consecuencia, las biodistribuciones también son ligeramente superiores. Es importante señalar que las especies de mayor peso molecular no se agregan ni se acumulan en el hígado. Las especies de menor peso molecular se excretan rápidamente del suero, pero aún interactúan con el tumor; sin embargo, el %ID/g es menor que la formulación completa. La formulación completa y los componentes separados se estudiaron mediante filtración en gel los días 0, 71 y 107. La distribución de la formulación completa no cambió con el tiempo y los componentes separados mantuvieron su identidad después del fraccionamiento.

Para ensayar la coherencia del material producido por E. coli, se seleccionaron, expresaron, purificaron y caracterizaron doce transformantes individuales mediante Superdex 75 (gráfico inferior arriba). Todas las preparaciones muestran características de diacuerpo, triacuerpo y tetracuerpo con menos de un 10 % separando los extremos (+/- 5 % de diferencia con respecto a la media).

Unión. La actividad de unión de 3E8.G4S y sus componentes se determinó mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR). Aquí, se adhirió mucina submaxilar bovina (TAG-72+) a un chip sensor CM5 y se hizo fluir fragmento de anticuerpo sobre el antígeno inmovilizado a concentraciones variables. Calculamos una constante de unión (K^d) de 3,6 nM para el 3E8.G4S, y de 1,6 nM y 9 nM para las especies de alto PM y de bajo PM, respectivamente. Todos los componentes de la formulación son ingredientes activos con una constante de unión nM de un solo dígito. Cabe señalar que 3,6 nM se une aproximadamente 10 veces mejor que CC49 y 100 veces mejor que B72.3. CC49 y B72.3 son anticuerpos de longitud completa que, como ya se ha mostrado previamente, se unen a TAG-72. 3E8 se une de una manera significativamente más estrecha y es más estable térmicamente que estas moléculas.

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72), comprendiendo el fragmento de anticuerpo la SEQ ID n°: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 o 46.

2. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1.

3. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 2, siendo la secuencia de ácido nucleico idéntica en un 96 % a la SEQ ID n°: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 o 44.

4. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 3.

5. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, siendo el fragmento de anticuerpo un diacuerpo, un tricuerpo o un tetracuerpo.

6. Una composición que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición de la reivindicación 6, estando dicho fragmento de anticuerpo enlazado a un radionúclido, una enzima terapéutica, un fármaco anticanceroso, una citocina, una citotoxina o un agente antiproliferativo que tiene actividad terapéutica y siendo la composición adecuada para el tratamiento del cáncer.

8. Una composición adecuada para la detección in vivo o in vitro de cáncer que comprende una cantidad eficaz para el diagnóstico de un fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1.

9. La composición de la reivindicación 8, estando dicho fragmento de anticuerpo enlazado a un radionúclido o una enzima y siendo la composición adecuada para la detección de cáncer.