ES2831298T3

ES2831298T3 - Composición que incluye exosomas derivados de células madre para blanquear la piel o mejorar las arrugas

Info

Publication number: ES2831298T3
Application number: ES18200218T
Authority: ES
Inventors: Yong Woo Cho; Ji Suk Choi; Seong Hyun Yang; Kyoung-Soo Lee; Eun Ji Kim; Hwa In Yoon; Jun Sung Kim
Original assignee: Exocobio Inc
Current assignee: Exocobio Inc
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2015-11-09
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2035-11-09
Also published as: CN107106613B; JP6847080B2; JP6683700B2; JP2018184446A; CN118161444A; US20170152484A1; RU2759508C1; EP3453382A1; CN111773173A; EP3189828A4; US10071050B2; JP2017534629A; CN111773173B; CN118161529A; RU2710373C2; EP3453382B1; JP2021020968A; AU2015343845A1; RU2017116138A3; AU2015343845B2

Abstract

Uso de una composición cosmética que comprende, como un ingrediente activo, exosomas derivados de células madre que comprenden células madre proliferantes, para blanquear la piel o mejorar las arrugas, en el que los exosomas comprenden proteína-1 quimioatrayente de monocitos, MCP-1, proteína-3 quimioatrayente de monocitos, MCP-3, ligando de quimioquina-5, CCL-5, inhibidor tisular de metaloproteinasa-1, TIMP-1, interleuquina-6, IL-6, interleuquina-8, IL-8, factor de crecimiento de hepatocitos, HGF, inhibidor-1 del activador del plasminógeno, PAI- 1, angiogenina y angiopoyetina-1, y en el que las células madre son células madre derivadas de tejido adiposo humano.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición que incluye exosomas derivados de células madre para blanquear la piel o mejorar las arrugas

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a una composición para inducir a las células madre a diferenciarse en adipocitos y/o regenerar tejidos adiposos usando un exosoma derivado de células madre que contiene una sustancia inductora de la diferenciación de los adipocitos. En particular, la presente invención se refiere a una composición cosmética para blanqueo de la piel o mejora de las arrugas que contiene un exosoma derivado de células madre derivadas de tejido adiposo humano que comprenden células madre proliferantes.

Antecedentes de la técnica

Como procedimiento terapéutico para regenerar tejidos adiposos, existe un procedimiento para uso de un agente terapéutico que comprende células madre, cultivadas con una matriz que tiene un tejido adiposo cultivado en forma tridimensional en un hidrogel. Después de cultivar tridimensionalmente el tejido en un hidrogel, las células madre pueden secretar un factor de crecimiento y una matriz extracelular. Sin embargo, para uso del agente terapéutico como un tipo de preparación inyectable, era inadecuado retirar el hidrogel en forma de película de un recipiente de cultivo y tratar el tejido con una liasa. Para superar este inconveniente, se ha desarrollado un procedimiento terapéutico para regenerar tejidos mediante injerto autólogo de grasa o trasplante directo de células madre.

En el caso del injerto autólogo de grasa, el procedimiento usa partes del cuerpo de un individuo en funcionamiento. Por lo tanto, el procedimiento no genera problemas de rechazo del tejido o inmunológico y no se observa una respuesta inmunitaria. Sin embargo, el tejido adiposo es altamente dependiente del oxígeno e interactúa con las células vecinas mientras tiene muchos vasos sanguíneos alrededor. La grasa injertada apenas exhibe capacidad para formar vasos sanguíneos y, por tanto, tiene desventajas. Por ejemplo, se puede inducir apoptosis o necrosis celular debido a la hipoxia, y el individuo puede necesitar varios procedimientos dado que la tasa de injerto no es alta.

Anteriormente, las células madre han sido usadas con frecuencia para restaurar tejidos dañados que habían sido limitados por cirugía o terapia con medicamentos. Por ejemplo, los biopolímeros tal como ácido hialurónico y colágeno son usados para el trasplante de células madre. Debido a que las células madre pueden ser diferenciadas en varias células, que incluyen adipocitos, estas células madre tienen una amplia variedad de aplicaciones. Sin embargo, debido a que la tasa de supervivencia y la tasa de injerto son bajas una vez que se las células son colocadas en el cuerpo, la eficiencia resulta reducida. Además, existe el riesgo de que las células madre indiferenciadas puedan formar tumores.

Actualmente, un procedimiento para diferenciar células madre en adipocitos para la regeneración de tejidos generalmente incluye tratar los materiales inductores de diferenciación tal como insulina, dexametasona, isobutilmetilxantina, etc. en las células madre y cultivarlas durante mucho tiempo. Sin embargo, los materiales inductores de la diferenciación de las células madre mencionados anteriormente son costosos y no son eficaces para la diferenciación solamente en un componente único. Por tanto, tienen desventajas, por ejemplo, se deben tratar mediante la mezcla de varias sustancias y la eficiencia de la diferenciación celular es baja. Esto es problemático.

Por otro lado, de manera convencional, se ha intentado el uso de una solución de cultivo obtenida mediante el cultivo de células madre como cosmético. En general, se usa un medio de cultivo que contiene una cantidad adecuada de antibióticos y suero para cultivar células madre. La mayoría de las soluciones de cultivo de células madre desarrolladas como composiciones cosméticas usan un medio de cultivo normal y una composición cosmética que incluye un liposoma en el que se encapsula una solución de cultivo de células madre en un liposoma (véanse las Patentes de Corea Núm. 1237430; 1047873). Además, ha sido desarrollada una composición cosmética que usa un medio de cultivo preparado sin los ingredientes que no están permitidos como materias primas para cosméticos y una composición cosmética que contiene un medio de cultivo sin suero, y similares (véanse las Patentes de Corea Núm.

1413686; 1108847).

Los medios de cultivo son sustancias que contienen proteínas, aminoácidos, hormonas y factores de crecimiento para la proliferación celular. Los medios han sido preparados y suministrados de una manera muy sofisticada. Sin embargo, debido a que los medios de cultivo celular, antibióticos y el suero tienen riesgos, por lo que no se ha demostrado que sean seguros, deben ser usados solo con fines de investigación y su uso está prohibido para el cuerpo humano. Los componentes incluidos en los medios de cultivo, tales como cloruro de colina, hipoxantina-sal sódica, timidina, diclorhidrato de putrescina, nitrato férrico, L-glutamina y similares, no están permitidos como materias primas para cosméticos. Por tanto, el uso de tales medios de cultivo no es adecuado para una composición cosmética. Como tal, los medios de cultivo contienen diversas proteínas, citoquinas, factores de crecimiento y similares secretados por las células madre. Por el contrario, también contienen componentes tales como productos de desecho secretados a medida que las células crecen, antibióticos añadidos para prevenir la contaminación o suero de origen animal, etc. Por lo tanto, es muy probable que presenten diversos riesgos cuando sean usados en la piel.

Los componentes de las soluciones de cultivo de células madre para uso en cosmética son limitados. Además, durante el procedimiento de encapsulación en los liposomas, se requieren el deterioro y contaminación de los componentes de las soluciones de cultivo, y un procedimiento de tratamiento adicional de encapsulación con liposomas. Por tanto, la técnica de encapsular las soluciones de cultivo de células madre con liposomas que incluyen lípidos para aumentar la tasa de absorción cutánea de las soluciones de cultivo también está limitada en el uso para un cosmético.

Para complementar las desventajas de estas soluciones de cultivo de células madre, han sido desarrolladas técnicas para uso de exosomas derivados de células madre. Las células madre generalmente son cultivadas en un medio que contiene antibióticos y suero. Las bio-nanopartículas secretadas por diversas células presentes en organismos multicelulares, incluidos los seres humanos, se pueden clasificar en exosomas y microvesículas según su tamaño y la diferencia en el mecanismo de secreción. Es sabido que los exosomas, que son vesículas de estructuras de membrana secretadas por varios tipos de células, desempeñan diversas funciones. Por ejemplo, las funciones incluyen la transferencia de componentes de la membrana, proteínas, ARN, etc. mediante la unión a otras células y tejidos. La mayoría de los secretomas, que incluyen los exosomas, se obtienen de un sobrenadante de cultivo celular. Por tanto, con el procedimiento de aislamiento de exosomas derivado de células madre que usado actualmente, es difícil purificar completamente los exosomas debido a la interferencia de proteínas en el medio o suero en la etapa de aislamiento de los secretomas, que incluyen los exosomas.

Por consiguiente, los inventores de la presente han aislado exosomas de células madre y han descubierto que los exosomas derivados de células madre tienen los efectos de diferenciación de células madre, regeneración del tejido adiposo, blanqueamiento, mejora de arrugas y regeneración de la piel.

Sumario de la invención

Es proporcionada una composición para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos. La composición puede incluir, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre que se diferencian en adipocitos.

Un aspecto de la presente invención es proporcionar una composición cosmética que comprende una composición para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos. La composición cosmética incluye, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre que se diferencian en adipocitos.

También puede ser proporcionada una composición de medio para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos. La composición del medio puede incluir, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre que se diferencian en adipocitos.

También puede ser proporcionada una preparación inyectable que comprende una composición para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos. La preparación inyectable puede incluir, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre que se diferencian en adipocitos y un hidrogel.

La presente invención usa una composición cosmética para blanquear la piel o mejorar las arrugas. La composición cosmética puede incluir, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre proliferantes. La invención se define en las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

Una realización de la presente invención proporciona el uso de una composición para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos. La composición incluye, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre que se diferencian en adipocitos.

Como se usa en la presente memoria, las "células madre que se diferencian en adipocitos" se refieren a células madre que se diferencian en adipocitos, por ejemplo, de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC). En la FIG. 1 se muestra un ejemplo de células madre derivadas de tejido adiposo. A partir de esto, se pueden aislar los exosomas que contienen información genética, proteínas y factores de crecimiento.

Específicamente, cuando las células madre se diferencian en adipocitos, sus formas cambian claramente y los exosomas se aíslan en este momento. Por lo tanto, es diferente de aislar exosomas de células madre indiferenciadas.

Los exosomas se refieren a vesículas mensajeras derivadas de células que contienen componentes específicos de la célula que desempeñan una función en la comunicación de célula a célula mediante la fusión con una célula receptora. En una realización, los exosomas son de origen endocítico y son vesículas, involucradas en la comunicación celular, secretadas por una célula que contiene componentes específicos de la célula, tales como lípidos, material genético y proteínas.

El exosoma puede ser preparado mediante un procedimiento de aislamiento de exosoma conocido en la técnica o mediante las siguientes etapas, por ejemplo, 1) cultivo de células madre en un medio de cultivo y después subcultivo en un medio sin suero y sin antibióticos; 2) recuperación del sobrenadante del cultivo celular; 3) centrifugación del sobrenadante del cultivo celular recuperado; y 4) separación y purificación de los exosomas, pero sin limitarse a esto.

Las células madre que se diferencian en adipocitos son células madre derivadas de tejido adiposo y son células madre derivadas de seres humanos.

El exosoma puede ser usado en células madre a una concentración de 1 a 150 |jg por 1 ml de la composición para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos, específicamente a una concentración de 5 a 150 jg , más específicamente a una concentración de 10 a 150 jg , incluso más específicamente a una concentración de 20 a 130 jg , y más específicamente a una concentración de 20 a 100 jg , pero no se limita a esto.

Como se usa en la presente memoria, el término "inducir la diferenciación en adipocitos" se refiere a la inducción de células madre para diferenciarse en adipocitos.

La composición incluye, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre que se diferencian en adipocitos. La composición puede diferenciar las células madre en adipocitos. Por tanto, la composición puede ser usada como composición para inducir la diferenciación en adipocitos.

Como se usa en la presente memoria, el término "regeneración de tejidos adiposos" se refiere a la regeneración de tejidos adiposos mediante la recuperación de tejidos adiposos dañados o inducción de la producción de tejidos adiposos deficientes.

Además, la composición puede regenerar tejidos adiposos. Por lo tanto, la composición puede ser usada como una composición para regenerar tejidos adiposos.

La composición para inducir la diferenciación en adipocitos puede ser usada alternativamente como composición farmacéutica. Específicamente, la composición farmacéutica puede estar contenida en una cantidad de 0,001 a 10 partes en peso sobre la base de 100 partes en peso de la composición total.

La composición farmacéutica puede ser de varias formulaciones orales o parenterales. Las formulaciones pueden ser preparadas usando un agente diluyente o un excipiente, tal como agentes de carga, agentes lastrantes, agentes aglutinantes, agentes humectantes, agentes desintegrantes, tensioactivos comúnmente usados y similares. Las formulaciones sólidas para administración oral incluyen comprimidos, pastillas, polvos, gránulos, cápsulas y similares. Tales formulaciones sólidas se pueden preparar mediante la mezcla de al menos un compuesto con al menos un excipiente, por ejemplo, almidón, carbonato de calcio, sacarosa o lactosa, gelatina y similares. Además de los excipientes simples, también pueden ser usados lubricantes, tal como estearato de magnesio, talco y similares. Las formulaciones líquidas para administración oral incluyen suspensión, líquido para uso interno, emulsión, jarabe y similares. Además de los diluyentes simples comúnmente usados, tal como agua y parafina líquida, las formulaciones líquidas también pueden incluir varios excipientes, por ejemplo, agentes humectantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, conservantes y similares. Las formulaciones para administración parenteral incluyen soluciones acuosas estériles, disolventes no acuosos, suspensiones, emulsiones, formulaciones de liofilización y supositorios.

En cuanto a la composición farmacéutica, puede ser usado aceite vegetal, tal como propilenglicol, polietilenglicol y aceite de oliva, y un éster inyectable, tal como oleato de etilo y similares, como disolventes no acuosos y agentes de suspensión. Witepsol, macrogol, tween 61, manteca de cacao, laurinum, gelatina de glicerol y similares puede ser usados como base para supositorios.

Las formas de dosis de la composición farmacéutica pueden estar en la forma farmacéuticamente aceptable de las mismas, o pueden ser usadas solas o en combinación adecuada con otros compuestos farmacéuticamente activos. La sal del compuesto de exosoma no está particularmente limitada a condición de que sea farmacéuticamente aceptable. La sal incluye, por ejemplo, las sales de ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido fluorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fórmico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido succínico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido toluensulfónico, ácido naftalenosulfónico y similares.

La composición farmacéutica puede ser administrada por vía parenteral u oral de acuerdo con el propósito, y se puede administrar una o múltiples veces al día según sea necesario, de modo que la cantidad administrada sea de 0,1 a 500 mg, 1 a 100 mg por kg. La dosis efectiva para un paciente específico varía de acuerdo con el peso corporal, edad, sexo, condiciones de salud, dieta, período de administración, modo de administración, tasa de excreción, gravedad de la enfermedad y similares del paciente.

De acuerdo con un procedimiento convencional, las composiciones farmacéuticas pueden ser usadas mediante la formulación en cualquier forma adecuada para una formulación farmacéutica, que incluye composiciones orales tal como polvos, gránulos, comprimidos, cápsulas, suspensiones, emulsiones, jarabes, aerosoles y similares, preparaciones externas tales como ungüentos, cremas y similares, supositorios y soluciones inyectables esterilizadas.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas a mamíferos tal como ratas, ratones, ganado, seres humanos y similares usando varias vías tal como parenteral, oral y similares, y aunque se pueden esperar todas las vías de administración, preferentemente se pueden administrar mediante inyección oral, rectal o intravenosa, intramuscular, subcutánea, intrauterina o intracerebroventricular.

La composición farmacéutica para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos puede incluir además materiales inductores de diferenciación tales como insulina, dexametasona, dehidroepiandrosterona (DHEA), histamina e isobutilmetilxantina, etc. para diferenciar las células madre en adipocitos, pero sin limitación.

Una realización de la presente invención proporciona el uso de una composición cosmética para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos e incluye, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre que se diferencian en adipocitos. La composición cosmética puede promover la regeneración de los tejidos adiposos al inducir la diferenciación en adipocitos.

El exosoma puede estar contenido en la composición cosmética a una concentración de 1 a 150 |jg por 1 ml de la composición cosmética, específicamente a una concentración de 5 a 150 jg , más específicamente a una concentración de 10 a 150 jg , incluso más específicamente a una concentración de 20 a 130 jg , y más específicamente a una concentración de 20 a 100 jg , pero sin limitación.

La composición cosmética puede contener adyuvantes comúnmente usados en la ciencia cosmética o dermatológica tal como sustancias grasas, disolventes orgánicos, agentes solubilizantes, agentes espesantes, agentes gelificantes, agentes suavizantes, antioxidantes, agentes de suspensión, agentes estabilizantes, agentes espumantes, agentes aromatizantes, tensioactivos, agua, emulsionantes iónicos o no iónicos, agentes de carga, agentes secuestrantes, agentes quelantes, conservantes, vitaminas, bloqueantes, agentes humectantes, aceites esenciales, colorantes, pigmentos, agentes activos hidrófilos o lipófilos, vesículas lipídicas o cualquier otro ingrediente comúnmente usado en cosmética. Dichos adyuvantes se introducen en las cantidades comúnmente usadas en el campo cosmético o dermatológico.

La forma externa de la composición cosmética contiene un medio o base cosmética o dermatológicamente aceptable. La composición cosmética puede estar en cualquier forma adecuada para la aplicación tópica. Por ejemplo, la composición cosmética se puede presentar en forma de soluciones, geles, sólidos, pasta, productos anhidros, emulsiones obtenidas por dispersión de la fase oleosa en fase acuosa, suspensiones, microemulsiones, microcápsulas o iónicas (liposomas) y dispersantes de vesículas no iónicas, y estas composiciones pueden ser preparadas de acuerdo con un procedimiento convencional en la técnica.

La composición cosmética es aplicada preferentemente en forma de absorción en la piel usando una microaguja, etc., pero no se limita a esto.

La composición cosmética para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos incluye, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre que se diferencian en adipocitos. La composición cosmética también puede incluir materiales inductores de diferenciación tales como insulina, dexametasona, dehidroepiandrosterona (DHEA), histamina e isobutilmetilxantina, etc. para diferenciar las células madre en adipocitos, pero no se limita a estas.

Otro ejemplo adicional proporciona una composición de medio para la diferenciación de células madre que contiene un exosoma derivado de células madre que se diferencian en adipocitos e induce a las células madre a diferenciarse en adipocitos.

El exosoma puede estar contenido en la composición del medio para la diferenciación de células madre a una concentración de 1 a 150 jg por 1 ml de la composición del medio para la diferenciación de células madre, específicamente a una concentración de 5 a 150 jg , más específicamente a una concentración de 10 a 150 jg , incluso más específicamente a una concentración de 20 a 130 jg , y también más específicamente a una concentración de 20 a 100 jg , pero no se limita a esto.

La composición del medio para la diferenciación de células madre puede incluir además un medio de cultivo de células madre, pero sin limitación.

La composición del medio para la diferenciación de células madre puede incluir además materiales inductores de diferenciación tales como insulina, dexametasona, dehidroepiandrosterona (DHEA), histamina e isobutilmetilxantina, etc. para diferenciar las células madre en adipocitos, pero sin limitación.

Además, otro ejemplo proporciona una preparación inyectable que comprende una composición para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos. La preparación inyectable puede incluir, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre que se diferencian en adipocitos; y un hidrogel.

El exosoma puede estar contenido en la preparación inyectable a una concentración de 1 a 150 jg por 1 ml, específicamente a una concentración de 5 a 150 jg , más específicamente a una concentración de 10 a 150 jg , incluso más específicamente a una concentración de 20 a 130 jg , y también más específicamente a una concentración de 20 a 100 jg , pero sin limitación. El hidrogel puede ser al menos un hidrogel tal como gelatina, alginato, quitosano, fibrina, elastina, ácido hialurónico, colágeno, metilcelulosa o hidrogel de colágeno y metilcelulosa, pero sin limitación.

La preparación inyectable puede ser una preparación inyectable para inducir la diferenciación en adipocitos o regenerar tejidos adiposos, pero sin limitación. Es decir, cuando la preparación inyectable es administrada a un animal a través de una inyección, pueden ser presentados los efectos de inducción de la diferenciación en adipocitos o regeneración de los tejidos adiposos.

En un ejemplo, el hidrogel es preparado mediante la adición de polvo de metilcelulosa a una solución de colágeno.

Específicamente, el polvo de metilcelulosa fue añadido a una solución de colágeno disuelto en ácido acético 0,02 N a una concentración de 3 mg/ml de modo que la concentración final de metilcelulosa fue 6% en peso. Después, la mezcla fue agitada a 4 °C durante 1 hora para preparar hidrogel de colágeno y metilcelulosa.

En un ejemplo, la preparación inyectable fue preparada mediante el transporte de los exosomas, derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos, en el colágeno y el hidrogel de metilcelulosa. Específicamente, los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos fueron transportados al hidrogel a una concentración final de 50 mg/ml, y después dispersados en el hidrogel mediante pipeteo.

La preparación inyectable puede ser administradas a mamíferos tal como ratas, ratones, ganado, seres humanos y similares por medio de inyección oral, rectal o intravenosa, intramuscular, subcutánea, intrauterina o intracerebroventricular.

En un ejemplo, los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos de acuerdo con la presente invención, en comparación con los exosomas derivados de las células madre proliferantes, muestran una excelente tasa de expresión de factores bioactivos que afectan la diferenciación en adipocitos (FIGS. 4 y 5).

En otro ejemplo, el exosoma derivado de las células madre que se diferencian en adipocitos, y el exosoma derivado de las células madre proliferantes, como grupo de control, fueron añadidos en un experimento para diferenciar las células madre en adipocitos. En estos casos, ha sido confirmado que, cuando fueron usados los exosomas de acuerdo con la presente invención, los adipocitos se diferenciaron a un nivel similar al de las células madre cultivadas en el medio de diferenciación el día 7 y, en consecuencia, se produjo el aceite. Sin embargo, en el caso de las células madre tratadas con los exosomas derivados de las células madre proliferantes, ha sido confirmado que estas células madre solo proliferaron sin diferenciarse en adipocitos (FIGS. 6 y 7).

En otro ejemplo adicional, la preparación inyectable en el que los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos fueron transportados al hidrogel de colágeno/metilcelulosa mostró un excelente efecto sobre la regeneración de los tejidos adiposos en comparación con la preparación inyectable transportada con los exosomas derivados de las células madre proliferantes (FIGS. 9 y 10).

La composición para la diferenciación de células madre y la regeneración del tejido adiposo incluye los exosomas que contienen información genética, proteínas y factores de crecimiento de los adipocitos relacionados con la diferenciación en adipocitos. Por lo tanto, la composición puede ser usada eficazmente para la diferenciación de células madre, ya que no es necesario añadir factores de crecimiento complejos y diversos para la diferenciación. Las células madre se diferencian en adipocitos por los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos, de este modo se ejerce un efecto ventajoso sobre la regeneración de los tejidos adiposos cuando se aplican in vivo. El exosoma derivado de las células madre que se diferencian en adipocitos es un material derivado de células y, por tanto, es biocompatible, lo que minimiza los efectos secundarios de los agentes de terapia celular existentes. Además, el exosoma mismo puede actuar como un portador, lo que permite una fácil aplicación al cuerpo humano de los componentes transportados. Por lo tanto, el exosoma puede ser aplicado como inductor de diferenciación de células madre, una preparación inyectable para la regeneración de tejidos, un agente de carga para fines cosméticos, una formulación para manipulación genética de tejidos y similares.

En la presente memoria es descrito el uso de una composición cosmética que contiene, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre, y más específicamente, una composición cosmética para blanqueo de la piel o mejora de las arrugas que contiene, un ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre.

El exosoma derivado de la célula madre en un medio sin suero y sin antibiótico contiene derivados de la matriz extracelular así como colágeno y factores de crecimiento eficaces para la regeneración de la piel y, por lo tanto, puede ser aplicado eficazmente para la mejora de la piel.

En la realización anterior, el término "células madre" se refiere a células madre que proliferan. A partir de esto, es posible aislar exosomas que contienen la información genética de las células madre, proteínas y factores de crecimiento.

Las células madre son células madre derivadas de tejido adiposo y son células madre derivadas de seres humanos. Como se usa en la presente memoria, el término "células madre derivadas de tejido adiposo humano" se refiere a células madre derivadas de adipocitos humanos. A partir de esto, es posible aislar exosomas que contienen la información genética, proteínas y factores de crecimiento de las células madre.

El procedimiento de aislamiento de exosomas puede ser llevado a cabo mediante un procedimiento conocido en la técnica, pero sin limitación. En un ejemplo, los exosomas fueron aislados durante el procedimiento de subcultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano. Específicamente, las células madre derivadas de tejido adiposo humano (pasajes 3 a 7) fueron cultivadas en un medio de cultivo normal (medio Eagle modificado por Dulbecco, DMEM que contiene suero fetal bovino 10%, penicilina/estreptomicina 1%). Después, 24 horas antes de aislar los exosomas, fue reemplazado el medio de cultivo celular con medio DMEM, que es un medio libre de suero y de antibiótico sin rojo fenol, y después se mantuvo durante 24 horas. Después de 24 horas, fue recuperado el sobrenadante del cultivo celular. El sobrenadante del cultivo celular recuperado fue centrifugado a 300 xg durante 10 minutos para eliminar las células y después se centrifugó a 2000 xg durante 30 minutos para eliminar la secreción celular. A continuación, las células se concentraron por centrifugación a 5000 xg durante 60 minutos usando un tubo de centrífuga equipado con un filtro que tiene un peso molecular de 3000. El sobrenadante obtenido después de la concentración fue mezclado con un reactivo de aislamiento de exosomas en una relación de 1: 0,5 y almacenado a 4 °C durante un día. Fue obtenido un precipitado de exosoma mediante centrifugación a 10000 xg durante 60 minutos, después fue filtrado a través de un filtro de 0,22 pm y lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS). El precipitado de exosoma lavado fue centrifugado a 10000 xg durante 60 minutos y resuspendido en PBS (FIG. 1). Después de recuperar el sobrenadante, fue añadido el medio de cultivo normal a las células madre y cultivado. Este procedimiento fue repetido hasta los pasajes 7 de las células madre. La composición cosmética fue preparada usando los exosomas aislados durante el procedimiento de proliferación de las células madre hasta los pasajes 7.

El exosoma puede estar contenido en una concentración de 1 a 150 pg por 1 ml de la composición cosmética en la composición cosmética para blanquear la piel o mejorar las arrugas, específicamente a una concentración de 5 a 150 pg, más específicamente a una concentración de 10 a 150 pg, incluso más específicamente a una concentración de 20 a 130 pg, y también más específicamente a una concentración de 20 a 100 pg, pero sin limitación.

En una realización descrita en la presente, los exosomas derivados de las células madre derivadas de tejido adiposo humano fueron usados a una concentración de 10, 30 o 50 mg/ml. Además, fue confirmada una excelente cicatrización de heridas de fibroblastos de prepucio humano (FIG. 18), una excelente tasa de síntesis de colágeno (FIG. 19) y una disminución en la síntesis de melanina (FIG. 20).

El exosoma puede estar contenido en la composición cosmética en forma de un liposoma que encapsula el exosoma mediante la encapsulación del exosoma en el liposoma, pero sin limitación. En algunas realizaciones, el exosoma puede estar en cualquier forma a condición de que sea adecuado para usar como composición cosmética. También es posible usar el exosoma mismo sin estar encapsulado en un liposoma.

Cuando es usado el exosoma en la forma de encapsulación del liposoma, el exosoma puede estar contenido en una cantidad de 0,1 a 10,0% en peso, más específicamente en una cantidad de 0,1 a 1,0% en peso sobre la base del peso total del liposoma, pero sin limitación.

El liposoma que encapsula puede estar contenido en una cantidad de 0,001 a 10,0% en peso, específicamente en una cantidad de 0,001 a 1,0% en peso, más específicamente en una cantidad de 0,01 a 1,0% en peso, e incluso más específicamente en una cantidad de 0,01 a 0,1% en peso sobre la base del peso total de la composición cosmética entera, pero sin limitación.

En un ejemplo, 3% en peso de lecitina fue dispersado en una fase acuosa que contiene 0,01% en peso de los exosomas derivados de las células madre a temperatura ambiente (por ejemplo, 15 °C), y después una emulsión de micelas inversas (agua/dióxido de carbono de procedimiento a baja temperatura) fue formada usando dióxido de carbono supercrítico. Después, la reacción fue terminada y el dióxido de carbono supercrítico fue vaporizado a presión reducida para eliminar la fase de dióxido de carbono supercrítico, obteniendo de este modo una suspensión de liposomas de procedimiento a baja temperatura en la que se encapsulan los exosomas. La composición cosmética fue preparada de manera tal que el liposoma así preparado que encapsulaba los exosomas estuviera contenido en una cantidad de 5% en peso basado en el peso total de la composición cosmética completa.

En tecnología convencional es usada una solución de cultivo obtenida durante el cultivo de las células madre derivadas de tejido adiposo humano. Sin embargo, la realización mencionada anteriormente se diferencia de la misma en que el exosoma en forma de nano vesícula presente en la solución de cultivo es aislado y purificado para uso como ingrediente cosmético, sin usar la solución de cultivo como tal. Cuando los exosomas de células madre son aislados y purificados, las proteínas relacionadas con la regeneración, los derivados de colágeno y diversos factores de crecimiento contenidos en los exosomas pueden ser usados efectivamente de tal manera que eliminen la interferencia de los componentes del medio. Por tanto, pueden ser resueltos los problemas provocados por los componentes del medio, que incluyen los antibióticos y el suero.

El exosoma contiene la información genética, proteínas y factores de crecimiento de las células madre, y el exosoma mismo puede servir como portador. El exosoma compuesto por lípidos de aproximadamente 50 a 150 nm de tamaño es biocompatible porque es un material derivado de células y muestra una excelente tasa de absorción celular. Por tanto, tiene las ventajas de que no son necesarios procedimientos adicionales de encapsulación de la solución de cultivo en el liposoma como en la tecnología convencional, y que puede ser aplicado fácilmente a la piel.

Además, la composición cosmética que contiene los exosomas derivados de las células madre de acuerdo con la realización anterior puede ser usada como una formulación para mejorar el aspecto de las cicatrices. Debido a que los exosomas derivados de células madre contienen proteínas y factores de crecimiento que inducen la proliferación y diferenciación celular y la regeneración de la piel, pueden ser aplicados a heridas viejas y cicatrices de acné para reducir las cicatrices o su aspecto. Por lo tanto, cuando es usada como formulación para mejorar el tejido cicatricial, puede ser aplicada en forma de aerosoles, ungüentos tipo gel y parches que contienen el exosoma derivado de células madre, etc.

Además, otro ejemplo adicional proporciona una composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre, más específicamente, una composición farmacéutica para la regeneración de la piel que contiene, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre. En consecuencia, la composición cosmética para la regeneración de la piel que contiene, como ingrediente activo, un exosoma derivado de células madre puede ser usado como composición farmacéutica.

Las células madre son células madre derivadas de tejido adiposo y son células madre derivadas de seres humanos. En otras palabras, estas células madre son las células madre derivadas de tejido adiposo humano.

Cuando fue examinado el tamaño del exosoma derivado de la proliferación de las células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-EXO), el tamaño fue de aproximadamente 69 nm, lo que confirma que es más pequeño que el exosoma derivado de queratinocitos epidérmicos humanos (K -EXO) o el exosoma derivado de fibroblastos de prepucio humano (F-EXO) (FIG. 13).

Cuando fueron comparados y analizados los factores bioactivos involucrados en la mejora de las arrugas, el blanqueamiento y la regeneración de la piel presentes en Stem-EXO, K-EXO y F-EXO, ha sido confirmado que la proteína quimioatrayente de monocitos-1, -3 (MCP-1, -3), el ligando de quimioquina 5 (CCL-5) y el inhibidor de colagenasa (el inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1)) están relacionados con los mecanismos asociados con la promoción de la síntesis de colágeno e inhibición de su degradación, interleuquina-6, -8 (IL-6, -8) asociado con blanqueamiento, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1), angiogenina y angiopoyetina-1 asociados con la regeneración de la piel y la angiogénesis se sobreexpresaron en Stem-EXO en comparación con K-EXO y/o F-EXO (FIGS. 15, 16 y 17).

Fue examinado el efecto de curación de heridas de los fibroblastos del prepucio humano en Stem-Exo. Como resultado, cuando fue usado Stem-EXO en una concentración de 10, 30 y 50 mg/ml, mostró un excelente efecto sobre la migración de fibroblastos del prepucio en comparación con K-EXO o F-EXO, de este modo se muestra un excelente efecto sobre la curación de heridas (FIG. 18).

Ha sido confirmado el efecto de mejora de las arrugas de Stem-EXO. Como resultado, la síntesis de colágeno aumentó a medida que aumentó la concentración a la que se usó Stem-EXO. Específicamente, Stem-EXO mostró una tasa de síntesis de colágeno notablemente excelente en comparación con K-EXO o F-EXO a 50 mg/ml, de este modo es confirmada un excelente efecto sobre la mejora de las arrugas (FIG. 19).

Ha sido examinado el efecto inhibidor de Stem-EXO sobre la formación de melanina. Como resultado, cuando es usado Stem-EXO en melanoma de ratón a una concentración de 10, 30 y 50 mg/ml, ha sido confirmado que la síntesis de melanina disminuyó, confirmando de este modo un efecto blanqueador notablemente excelente (FIG. 20).

Efectos ventajosos

Los exosomas muestran una excelente tasa de expresión de factores bioactivos que influyen en la diferenciación en adipocitos y tienen el efecto de diferenciar las células madre en adipocitos. En consecuencia, pueden ser aplicados como agentes inductores de la diferenciación de células madre, preparaciones inyectables para la regeneración de tejidos, agentes de carga con fines cosméticos, preparaciones para manipulación genética de tejidos, etc. Además, los exosomas son exosomas que se secretan durante la proliferación de células madre y contienen genes, proteínas, factores de crecimiento y similares asociados con la proliferación, diferenciación y regeneración celular de células madre, y por lo tanto pueden inducir la regeneración de la piel sin otros aditivos tales como activadores celulares o factores de crecimiento. Además, los exosomas son componentes purificados que no incluyen antibióticos, sueros o factores 'perjudiciales de una solución de cultivo y, por tanto, pueden ser superados los problemas asociados con los cosméticos de cultivo. Además, los exosomas son portadores de lípidos derivados de células, por lo que muestran una excelente infiltración celular y son muy eficaces en la administración de factores eficaces. En consecuencia, se pueden aplicar a composiciones cosméticas funcionales que tengan funciones de blanqueamiento de la piel, mejora de las arrugas y regeneración de la piel, y preparaciones de mejora del aspecto de las cicatrices con fines cosméticos, etc.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama esquemático de los exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos y su aplicación.

La FIG. 2 es un diagrama esquemático del procedimiento para aislar exosomas de células madre que se diferencian en adipocitos.

Las FIGS. 3A a 3C muestran diagramas que ilustran las características de los exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos; A: estructura y forma de los exosomas (microscopio electrónico de transmisión), B: tamaño del exosoma (analizador de nanopartículas, dispersión dinámica de luz), C: marcador de superficie de la membrana del exosoma (transferencia Western).

Las FIGS. 4A a 4C muestran diagramas que ilustran factores bioactivos relacionados con los lípidos en los exosomas a través de una micromatriz; A: exosomas derivados de células madre proliferantes (hASC-EXO), B: exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos (D-EXO), C: mapa de matriz de adipoquinas.

La FIG. 5 muestra un diagrama que ilustra la tasa de expresión de factores que afectan la diferenciación en adipocitos; exosomas derivados de células madre proliferantes (hASC-EXO) y exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos (D-EXO).

La FIG. 6 muestra el resultado de inducción de la diferenciación de las células madre derivadas de tejido adiposo humano en adipocitos; A: las células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASCs), B: grupo control positivo (DM), exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos (D-EXO) y exosomas derivados de células madre proliferantes (hASC-EXO).

La FIG. 7 muestra el resultado de la tinción de rojo aceite O de las células madre inducidas a diferenciarse en adipocitos; A: células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASCs), B: grupo control positivo (DM), exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos (D-EXO) and exosomas derivados de células madre proliferantes (hASC-EXO).

La FIG. 8 muestra el resultado de la inducción de la formación de tejidos adiposos durante 3 semanas mediante el transporte de los exosomas en un hidrogel obtenido mediante la mezcla de colágeno y metilcelulosa e inyección subcutánea de los exosomas en modelos de ratones desnudos; A: hidrogel de colágeno/metilcelulosa (Gel), B: hidrogel que porta los exosomas derivados de las células madre proliferantes (hASC-EXO), C: hidrogel que porta los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos (D-EXO).

La FIG. 9 muestra el resultado de la tinción con hematoxilina-eosina de los geles inyectados subcutáneamente en modelos de ratones desnudos. Un gel no porta el exosoma (Gel) y los otros geles portan los exosomas derivados de células madre proliferantes (hASC-EXO) y los exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos (D-EXO), respectivamente. A, C, E: aumento de 40x; B, D, F: aumento de 100x.

La FIG. 10 muestra el resultado de la tinción con rojo aceite O de los geles inyectados subcutáneamente en modelos de ratones desnudos. Un gel no portas el exosoma (Gel) y los otros geles portan los exosomas derivados de células madre proliferantes (hASC-EXO) y los exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos (D-EXO), respectivamente.

La FIG. 11 es un diagrama esquemático del procedimiento de aislamiento de exosomas de células madre derivadas de tejido adiposo humano proliferantes.

La FIG. 12 muestra imágenes de células madre derivadas de tejido adiposo humano, queratinocitos epidérmicos humanos y fibroblastos de prepucio humano observados con un microscopio.

Las FIGS. 13A a 13C muestran diagramas que ilustran las características de los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-Exo). Los exosomas derivados de queratinocitos humanos (K-Exo) y de fibroblastos de prepucio humano (F-Exo) fueron usados como grupos de control. La estructura y forma de los exosomas (microscopio electrónico de transmisión) y el tamaño de los exosomas (analizador de nanopartículas, dispersión dinámica de luz) se ilustraron respectivamente; A: Stem-Exo (las barras de escala indican 50 nm (negro), 100 nm (blanco), respectivamente), B: K-Exo (las barras de escala indican 50 nm (negro), 100 nm (blanco), respectivamente) y C: F-Exo (las barras de escala indican 50 nm (negro) y 200 nm (blanco), respectivamente).

Las FIGS. 14A a 14D muestran diagramas que muestran una comparación de los niveles de expresión de factores bioactivos contenidos en los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-EXO), los exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos (K-EXO) y los exosomas derivados de fibroblastos humanos (F-EXO) usando una micromatriz; A: tabla de micromatrices, B: resultado de micromatrices, C y D: gráfico que muestra los niveles de expresión relativa de factores bioactivos.

Las FIGS. 15A a 15I muestran gráficos que ilustran el nivel de expresión del factor bioactivo (A: PDGF-AA, B: PDGF-AB, C: PDGF-BB, D: FGF-6, E: MCP-F: MCP-3, G: Eotaxina, H: CCL-5, I: TIMP-1) relacionado con el efecto de mejora de las arrugas en los exosomas usando una micromatriz; Stem-EXO: exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano proliferantes, K-EXO: exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos, F-EXO: exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano.

Las FIGS. 16A a 16D muestran gráficos que ilustran el nivel de expresión de factor bioactivo (A: TGF-beta, B: TNF-alfa, C: IL-6, D: IL-8) relacionado con el efecto de mejora de las arrugas en los exosomas usando una micromatriz; Stem-EXO: exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano proliferantes, K-EXO: exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos, F-EXO: exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano.

Las FIGS. 17A a 17F muestran gráficos que ilustran el nivel de expresión de los factores bioactivos (A: EGF, B: HGF, C: PAI-1, D: VEGF, E: Angiogenina, F: Angiopoietina-1) relacionado con la regeneración de la piel y angiogénesis en los exosomas usando una micromatriz; Stem-EXO: exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano proliferantes, K-EXO: exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos, F-EXO: exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano.

Las FIGS. 18A a 18B muestran diagramas que ilustran el efecto de exosomas de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-EXO) sobre la migración de los fibroblastos humanos; GM: medio de cultivo de células madre (medio de crecimiento), SFM: medio libre de suero, Stem-EXO: exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano proliferantes, K-EXO: exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos, F-EXO: exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano.

La FIG. 19 muestra un gráfico que ilustra el efecto de los exosomas de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-EXO) sobre la síntesis de colágeno de fibroblastos humanos; SFM: medio libre de suero, Stem-EXO: exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano proliferantes, K-EXO: exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos, F-EXO: exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano.

La FIG. 20 muestra un gráfico que ilustra el efecto de exosomas de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-EXO) sobre la síntesis de melanina de los melanocitos de ratón; GM: medio de cultivo de células madre (medio de crecimiento), SFM: medio libre de suero, Stem-EXO: exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano proliferantes, K-EXO: exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos, F-EXO: exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano.

Ejemplos

En adelante en la presente memoria, son proporcionadas realizaciones preferentes para ayudar a comprender la presente invención, pero las realizaciones son sólo para fines ilustrativos. Además, resultará evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar diversas modificaciones y formas alternativas, que se hallan dentro del alcance de la invención.

Ejemplo 1: Exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos

Ejemplo 1-1: A islam iento de exosomas

Para aislar los exosomas de las células madre que se diferencian en adipocitos, se indujo la diferenciación en adipocitos mediante el cultivo de las células madre en un medio de diferenciación.

La diferenciación en adipocitos ha sido confirmada a medida que se formaban gotitas de lípidos en el citoplasma mientras que las células madre se volvían gradualmente desiguales. Los medios de cultivo de células madre de diferenciación fueron reemplazados con un medio libre de suero y se mantuvieron durante 48 horas, y fue recuperado el sobrenadante del cultivo celular. El sobrenadante del cultivo celular recuperado fue centrifugado a 300 xg durante 10 minutos para eliminar las células y después fue centrifugado a 2000 xg durante 30 minutos para eliminar la secreción celular.

A continuación, las células fueron concentradas por centrifugación a 5000 xg durante 60 minutos usando un tubo de centrífuga (límite de peso molecular = 3000, tubo Amicon) equipado con un filtro que tiene un peso molecular de 3000. El sobrenadante obtenido después de la concentración fue mezclado con un reactivo de aislamiento de exosomas en una relación de 1:0,5 y almacenado a 4 °C durante un día. Después, las células fueron concentradas a 10000 xg durante 60 minutos para obtener un precipitado de exosoma, después fueron filtradas a través de un filtro (columna de centrifugación de exosomas) que tiene un peso molecular de 3000 y lavadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS). El precipitado de exosoma lavado fue centrifugado a 10000 xg durante 60 minutos y resuspendido en PBS (FIG. 2).

Ejemplo 1-2: Análisis m icroscópico de exosomas

El tamaño y la forma de los exosomas derivados del Ejemplo 1-1 fueron confirmados usando un microscopio electrónico de transmisión y dispersión dinámica de luz, y la proteína de superficie de los exosomas fue confirmada usando la transferencia Western que detecta una proteína específica en la superficie de la membrana de los exosomas.

Como resultado, los exosomas aislados como se muestra en la FIG. 3A fueron confirmados mediante un microscopio electrónico de transmisión, y fue confirmado que su tamaño era de aproximadamente 50,75 a 58,77 nm en promedio, como se muestra en la FIG. 3B. Además, como se muestra en la FIG. 3C, un marcador específico de exosoma expresado en la superficie de la membrana del exosoma se confirmó mediante una reacción de anticuerpos.

Ejemplo 1-3: Análisis de proteínas y factores bioactivos relacionados con la diferenciación de adipocitos en los exosomas

Fue usada una micromatriz para analizar los factores bioactivos relacionados con los lípidos presentes en los exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos y los exosomas derivados de células madre proliferantes. La micromatriz se llevó a cabo mediante una reacción antígeno-anticuerpo y se midió el grado de expresión de fluorescencia (estreptavidina-Cy3) usando un barredor óptico láser (GenePix 4000B).

Además, el factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF), factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), leptina, insulina, angiopoyetinal (ANGPT1) y proteína relacionada con el complemento de adipocitos de 30 kDa (Acrp30), todos los cuales son factores bioactivos que influyen en la diferenciación en adipocitos entre los factores expresados en el análisis de micromatrices, y a este respecto, fueron comparados los niveles de expresión relativa de los mismos en los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos y de células madre proliferantes.

Como resultado, como se muestra en las FIG. 4A a 4C y la Tabla 1, ha sido confirmado que existen diferentes tipos de factores bioactivos relacionados con los lípidos presentes en los exosomas derivados de las células madre proliferantes (hASC-EXO) y los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos (D- EXO), y también ha sido confirmado que había una diferencia significativa en los niveles de expresión de factores bioactivos que afectan la diferenciación en adipocitos (FIG. 5).

Tabla 1

Ejemplo 1-4: Inducción de diferenciación de adipocitos usando exosomas

Para inducir la diferenciación de adipocitos de células madre usando los exosomas, fueron usadas composiciones de medio que contienen cada uno de los exosomas derivados del medio de cultivo de células madre proliferantes y los exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos. Las composiciones de medio fueron usadas mediante la adición de los exosomas al medio de cultivo de células madre a una concentración de 30, 50 y 100 pg/ml. Después de tratar cada composición de medio en las células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASC) cultivadas, las composiciones de medio se reemplazaron una vez cada 3 días durante 14 días.

Fueron usados las células madre cultivadas en medio rico en glucosa del medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene suero bovino fetal 5%, dexametasona 1 mM, insulina 1 mg/ml, indometacina 100 mM, 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM como grupo de control positivo. Las células madre tratadas con los exosomas derivados de las células madre proliferantes fueron usadas como grupo de control positivo. Después, se analizó la forma celular y si se llevó a cabo la diferenciación con respecto a las células madre, en las cuales se indujo la diferenciación en adipocitos, usando un microscopio y tinción de rojo aceite O durante 14 días.

Como resultado, cuando fueron usados los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos (D-EXO), las células madre se diferenciaron en adipocitos a un nivel similar al del control positivo (DM) el día 7 (FIG.

6), y en consecuencia, se confirmó la producción de aceite (FIG. 7). Sin embargo, en el caso de las células madre tratadas con los exosomas derivados de células madre proliferantes (hASC-EXO), ha sido confirmado que solo se llevó a cabo la proliferación sin diferenciación en adipocitos.

Ejemplo 1-5: Composición cosmética que comprende exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos

De acuerdo con el Ejemplo 1-1, fue preparado un liposoma que encapsula los exosomas derivados de células madre que se diferenciaban en adipocitos. Específicamente, fue dispersado 3% en peso de lecitina en una fase acuosa que contiene 0,01% en peso de los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos a temperatura ambiente (15 °C), y después una emulsión de micelas inversas (agua/dióxido de carbono del procedimiento a temperatura ambiente) fue preparada usando dióxido de carbono supercrítico. Después, la reacción fue terminada, el dióxido de carbono supercrítico fue vaporizado a presión reducida para eliminar la fase de dióxido de carbono supercrítico, y se obtuvo una suspensión de liposomas del procedimiento a baja temperatura, en la que se encapsulan los exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos. En este caso, la temperatura del procedimiento de reacción fue de 4 °C o menos.

La composición cosmética fue preparada mediante la composición que se muestra en la siguiente Tabla 2 usando el liposoma que encapsula los exosomas.

Tabla 2

Ejemplo 1-6: Inducción de regeneración del te jido adiposo usando exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos

Para confirmar el efecto sobre la regeneración del tejido adiposo cuando los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos se inyectan en el cuerpo, los exosomas derivados de las células madre proliferantes y los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos se transportan de forma independiente en un hidrogel de colágeno/metilcelulosa.

Específicamente, el hidrogel fue preparado mediante la adición de polvo de metilcelulosa a una solución de colágeno para formar el hidrogel de colágeno/metilcelulosa. Es decir, es añadido polvo de metilcelulosa a una solución de colágeno disuelta en ácido acético 0,02 N a una concentración de 3 mg/ml, de modo que la concentración final de metilcelulosa fue 6% en peso, y después la mezcla fue agitada a 4 °C durante 1 hora para preparar el gel. En el hidrogel de colágeno/metilcelulosa así preparado, se transportaron los exosomas derivados de las células madre proliferantes o los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos. Específicamente, los exosomas fueron transportados en el hidrogel de colágeno/metilcelulosa a una concentración final de 50 mg/ml y después dispersados en el hidrogel mediante pipeteo. Además, el hidrogel que contiene los exosomas fue inyectado subcutáneamente en los ratones desnudos y observado durante 3 semanas. El hidrogel que no contienen exosoma fue usado como grupo de control negativo, y el hidrogel que contiene los exosomas derivados de células madre proliferantes (hASC-EXO) se usó como grupo de control positivo (FIG. 8). Tres semanas más tarde, fueron realizadas la tinción con hematoxilina-eosina y tinción con rojo aceite O para confirmar la regeneración de los tejidos adiposos en el hidrogel trasplantado.

Como resultado, se introdujo una gran cantidad de células de ratón en el gel que contiene los exosomas derivados de las células madre que se diferencian en adipocitos (D-EXO) (FIG. 9), y fue observada una gran cantidad de adipocitos en los que se produjo aceite (FIG. 10), en comparación con los grupos de control negativo y positivo. A partir de estos resultados, se puede concluir que los exosomas derivados de células madre que se diferencian en adipocitos o el hidrogel de colágeno/metilcelulosa que transporta los exosomas fueron notablemente eficaces para inducir la regeneración de los tejidos adiposos.

Ejemplo 2: Exosomas derivados de células madre proliferantes

Ejemplo 2-1: A islam iento de exosomas de células madre derivadas de te jido adiposo humano proliferantes

Los exosomas fueron aislados durante la proliferación de células madre derivadas de tejido adiposo humano hasta el pasaje 7. Es decir, los exosomas fueron aislados de las células madre derivadas de tejido adiposo humano proliferantes.

Específicamente, las células madre derivadas de tejido adiposo humano (pasajes 3 a 7) fueron cultivadas en un medio de cultivo normal (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene suero bovino fetal 10%, penicilina/estreptomicina 1%). Después, 24 horas antes de aislar los exosomas, fue reemplazado el medio de cultivo celular con medio DMEM, que es un medio libre de suero y antibiótico sin rojo fenol, y después se mantuvo durante 24 horas. Después de 24 horas, fue recuperado el sobrenadante del cultivo celular. El sobrenadante del cultivo celular recuperado fue centrifugado a 300 xg durante 10 minutos para eliminar las células y después se centrifugó a 2000 xg durante 30 minutos para eliminar la secreción celular. A continuación, las células fueron concentradas por centrifugación a 5000 xg durante 60 minutos usando un tubo de centrífuga equipado con un filtro que tiene un peso molecular de 3000 (límite de peso molecular = 3000, tubo Amicon). El sobrenadante obtenido después de la concentración fue mezclado con un reactivo de aislamiento de exosomas en una relación de 1:0,5 y almacenado a 4 °C durante un día. Fue obtenido un precipitado de exosoma mediante centrifugación a 10000 xg durante 60 minutos, después fue filtrado a través de un filtro de 0,22 |im (columna de centrifugación de exosomas) y lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS). El precipitado de exosoma lavado fue centrifugado a 10000 xg durante 60 minutos y resuspendido en PBS (FIG. 11). Después de recuperar el sobrenadante, es añadido el medio de cultivo normal a las células madre y se cultivaron. Este procedimiento fue repetido hasta 7 pasajes de las células madre. Los exosomas aislados durante el procedimiento de proliferación hasta 7 pasajes fueron usados en los siguientes experimentos. Para comparar la eficacia de los exosomas de las células madre derivadas de tejido adiposo humano, los exosomas fueron aislados de queratinocitos epidérmicos humanos y fibroblastos de prepucio humano de la misma manera mediante el procedimiento anterior (FIG. 12).

Ejemplo 2-2: Análisis m icroscópico de exosomas

Los tamaños y las formas de los exosomas derivados de las células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-Exo), los exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos (K-Exo) y los exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano (F-EXO) del Ejemplo 2-1 fueron confirmados mediante el uso de un microscopio electrónico de transmisión y dispersión dinámica de luz.

Como resultado, la forma de cada exosoma derivado fue confirmada mediante un microscopio electrónico de transmisión. Además, los tamaños de los exosomas derivados de las células madre derivadas de tejido adiposo humano, los exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos, y los exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano fueron aproximadamente de 69 nm, aproximadamente 79,7 nm y aproximadamente 94,6 nm, respectivamente, y el tamaño de los exosomas (Stem-Exo) derivados de las células madre derivadas de tejido adiposo humano fue el menor (FIGS. 13A a 13C).

Ejemplo 2-3: Análisis de proteínas y factores bioactivos asociados a la mejora de arrugas blanqueamiento y regeneración de la piel en exosomas

Fue realizado un análisis de micromatrices para comparar y analizar los factores bioactivos asociados con la mejora de las arrugas, el blanqueamiento y la regeneración de la piel presentes en los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-Exo), exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos (K-Exo) y exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano (F-EXO). El análisis de micromatrices fue llevado a cabo mediante una reacción antígeno-anticuerpo y fue medido el grado de expresión de fluorescencia (estreptavidina-Cy3) usando un barredor óptico láser (GenePix 4000B).

A través del análisis de micromatrices, fueron confirmados 9 factores bioactivos que influyen en la mejora de las arrugas (PDFG-AA, PDGG-AB,35 PDGF-BB, FGF-6, MCP-1, MCP-3, Eotaxina, CCL-5, TIMP-1), 4 factores bioactivos relacionados con el blanqueamiento (TGF-beta, TNF-alfa, IL-6, IL-8) y 6 factores bioactivos relacionados con la regeneración de la piel y la angiogénesis (EGF, HGF, PAI-1, VEGF, Angiogenina, Angiopoyetina-1) y a este respecto, fueron comparados los niveles de expresión relativa de cada factor bioactivo en los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano y los exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos y de fibroblastos de prepucio humano (FIG. 14). Las FIGS. 14C y 14D muestran los niveles de expresión relativa de los factores bioactivos, y el eje horizontal indica los exosomas de células madre derivadas de tejido adiposo humano y el eje vertical indica los exosomas de queratinocitos epidérmicos y exosomas de fibroblastos, respectivamente. Además, la línea superior y la línea inferior con la línea media del gráfico en el centro muestran un aumento/disminución de 1,5 veces con respecto al valor de referencia, respectivamente. Las FIGS. 15A a 15I muestran los factores bioactivos relacionados con el efecto de mejora de las arrugas de los exosomas, las FIGS. 16A a 16D muestran los factores bioactivos relacionados con el efecto blanqueador de los exosomas, y las FIGS. 17A a 17F muestran los factores bioactivos relacionados con la regeneración de la piel y la angiogénesis de los exosomas.

Como resultado, como se muestra en las FIGS. 15, 16 y 17, ha sido confirmado que existen diferentes tipos de factores bioactivos presentes en los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-Exo), los exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos (K-Exo) y los exosomas derivado de fibroblastos de prepucio humano (F-EXO). Específicamente, se confirmó que la proteína quimioatrayente de monocitos-1, -3 (MCP-1, -3), ligando de quimioquina 5 (CCL-5) y el inhibidor de colagenasa (el inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1)) estaban relacionados con los mecanismos asociados con la promoción de la síntesis de colágeno e inhibición de su degradación, interleuquina-6, -8 (IL-6, -8) asociada con el blanqueamiento, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), inhibidor del activador de palsminógeno-1 (PAI-1), angiogenina y angiopoyetina-1 asociadas con la regeneración de la piel y la angiogénesis se sobreexpresaron en los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-EXO) en comparación con K-EXO y/o F-EXO (FIGS. 15, 16 y 17).

Ejemplo 2-4: Efecto de migración de fibroblastos de prepucio humano usando exosomas derivados de células madre derivadas de te jido adiposo humano proliferantes

Para examinar el efecto de los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano sobre la migración de fibroblastos de prepucio humano, fueron usados composiciones de medio que contienen cada una los exosomas derivados de la células madre derivadas de tejido adiposo humano proliferantes (Stem-EXO), los exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos (K-EXO) y los exosomas extraídos de fibroblastos de prepucio humano (F-EXO). Cada una de las composiciones de medio fue preparada mediante la adición de Stem-EXO a un medio de cultivo libre de suero DMEM a concentraciones de 10, 30 y 50 pg/ml, y la adición de K-EXO y F-EXO a un medio de cultivo libre de suero DMEM a una concentración de 50 pg /ml, respectivamente. El medio DMEM que contiene suero 10% fue usado como grupo de control positivo y el medio DMEM libre de suero fue usado como grupo de control negativo. Los fibroblastos del prepucio humano fueron marcados con colorante verde fluorescente, después fueron sembrados en una placa de 24 pocillos a razón de 1 x 105 células/pocillo y fueron cultivados en un medio de cultivo (DMEM que contiene suero bovino fetal 10%, penicilina/estreptomicina 1%) durante 72 horas. Después del cultivo, fue preparado un intervalo de heridas artificialmente uniforme en el centro del fondo de la placa a la que se adhirieron las células usando una punta amarilla esterilizada, y fueron aplicadas a las células las composiciones de medio que contienen cada una los exosomas.

Como resultado, las células tratadas con el medio que contiene Stem-EXO a las 24 horas mostraron un mayor grado de migración que las células tratadas con el control negativo, K-EXO y F-EXO, y tal tendencia fue aún más prominente en el medio que contiene Stem-EXO a una concentración de 30 y 50 pg/ml. Después de 48 horas, la migración tuvo lugar rápidamente en el medio que contiene 10, 30 y 50 pg/ml de Stem-EXO, que muestra mejor efecto de curación de heridas (por ejemplo, más rápido, con menos cicatrices o menos cambio de coloración) en comparación con los medios que contienen K-EXO y F-EXO (FIGS. 18A y 18B).

Por lo tanto, los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-Exo) mostraron un efecto excelente sobre la migración de fibroblastos de prepucio humano en comparación con K-EXO o F-EXO.

Ejemplo 2-5: Efecto de los exosomas derivados de células madre derivadas de te jido adiposo humano proliferantes sobre la mejora de las arrugas

A fin de examinar el efecto de los exosomas derivados de las células madre derivadas de tejido adiposo humano sobre la síntesis de colágeno de fibroblastos de prepucio humano, fueron usadas composiciones del medio, cada una de las cuales contiene los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo proliferante (Stem-EXO), los exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos (K-EXO) y exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano (F-EXO). Cada una de las composiciones de medio se preparó mediante la adición de Stem-EXO a un medio de cultivo DMEM libre de suero a concentraciones de 10, 30 y 50 pg/ml, y adición de K-EXO y F-EXO a un medio de cultivo DMEM libre de suero a una concentración de 50 pg/ml, respectivamente. El medio DMEM libre de suero fue usado como grupo de control negativo. Los fibroblastos de prepucio humano fueron sembrados en una placa de 48 pocillos a 5 x104 células/pocillo y fueron cultivadas en un medio de cultivo (DMEM que contiene suero bovino fetal 10%, penicilina/estreptomicina 1%) durante 72 horas y después fueron lavados con PBS y las composiciones del medio que contienen cada uno de los exosomas fueron aplicadas a las células.

Después de completar el cultivo, fue recuperada la solución de cultivo de cada pocillo, centrifugada a 25 °C a 3000 rpm durante 10 minutos, y después fue tomado el sobrenadante y usado para la extracción y cuantificación de colágeno soluble. Cada pocillo de la placa de la que se había extraído la solución de cultivo fue lavado con PBS. Después, las células fueron separadas del fondo de cada pocillo mediante la aplicación de tripsina (tripsina-EDTA) y fue medido el número de células.

Fue usado el kit de ensayo de colágeno Sircol (Biocolor, UK) para la cuantificación del colágeno soluble. El sobrenadante así obtenido fue tratado con tampón Tris-HCl (pH 7,6) mezclado con polietilenglicol y se mantuvo a 4 °C durante 12 horas o más. A continuación, el resultante fue centrifugado a 12000 rpm durante 10 minutos para concentrar colágeno. Después de eliminar el sobrenadante, es añadido 1 ml del colorante de adsorción de colágeno proporcionado (reactivo de colorante sircol) al pellet de colágeno y después se cultivó con agitación durante 30 minutos. El colorante no absorbido se eliminó mediante centrifugación a 12000 rpm durante 10 minutos y el pellet se lavó con un tampón de sal ácida. Después, se disolvió el colorante adsorbido sobre el colágeno mediante la aplicación de un reactivo alcalino y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 555 nm. La absorbancia se sustituyó en la ecuación de la curva estándar para calcular la cantidad de colágeno soluble en los pocillos a los que se añadieron Stem-EXO, K-EXO, F-EXO y la sustancia de control negativo, respectivamente. La cantidad calibrada de colágeno se sustituyó en la ecuación para calcular la tasa de síntesis.

Como resultado, la tasa de síntesis de colágeno soluble para el grupo tratado con Stem-EXO aumentó de acuerdo con la concentración del exosoma usado, en comparación con el grupo de control negativo (0,138 pg). Específicamente, en el caso del grupo tratado con Stem-EXO a 50 pg/ml, la cantidad de síntesis de colágeno fue de 2,59 pg, que se incrementó significativamente en comparación con la misma cantidad de K-EXO (1,4 pg) o F-EXO (0,8 pg). Por lo tanto, esto puede implicar que los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano tienen el efecto de promover la síntesis de colágeno de fibroblastos del prepucio humano (FIG. 19).

Ejemplo 2-6: Efecto inh ib idor de los exosomas derivados de células madre derivadas de te jido adiposo humano proliferantes sobre la producción de melanina usando melanoma de ratón

El efecto blanqueador de los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano (Stem-EXO), y los exosomas derivados de queratinocitos epidérmicos humanos (K-EXO) y los exosomas derivados de fibroblastos de prepucio humano (F-EXO) como grupo control fue determinado mediante el grado de inhibición de la producción de melanina en el melanoma de ratón. Las células de melanoma son células que se derivan del melanoma de ratón y secretan un pigmento de melanina denominado "melanina". Las células de melanoma fueron sembradas a una densidad de 1 x105 células/pocillo en una placa de 96 pocillos para adherir las células, y después fueron cultivadas durante 3 días mediante el reemplazo del medio de cultivo con un medio que contiene Stem-EXO, K-EXO y F-EXO, respectivamente. Después de 3 días, el medio fue recuperado y centrifugado a 4.500 rpm durante 10 minutos, y fue medida la absorbancia a 405 nm para calcular la cantidad de melanina liberada de las células. Las células adheridas a la placa fueron eliminadas mediante la aplicación de tripsina (tripsina-EDTA) y fue medido el número de células, seguido de centrifugación para recuperar las células. Las células se lavaron una vez con PBS y se centrifugaron para obtener pellets celulares. A los microgránulos celulares, es añadido 1 ml de solución de hidróxido de sodio (NaOH) 1 N que contiene dimetilsulfóxido (DMSO) 10% para disolver la melanina a 80 °C durante 2 horas, después es añadido el producto resultante a una placa de 96 pocillos y se midió la absorbancia a 405 nm. La melanina se cuantificó usando la absorbancia medida y se normalizó a la concentración de proteína de la muestra para determinar la concentración de la melanina sintetizada.

Los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo humano fueron usados en las células de melanoma en una concentración de 10, 30 y 50 pg/ml, y se examinó el grado de síntesis de melanina. Como resultado, ha sido confirmado que la síntesis de melanina se redujo en todas las concentraciones de los exosomas derivados de las células madre (FIG. 20).

Ejemplo 2-7: Composiciones cosméticas que contienen exosomas derivados de células madre derivadas de te jido adiposo humano proliferantes

De acuerdo con el Ejemplo 2-1, fue preparado un liposoma que encapsula los exosomas y fue derivado de las células madre derivadas de tejido adiposo humano proliferante.

Específicamente, fue dispersado 3% en peso de lecitina en una fase acuosa que contiene 0,01% en peso de los exosomas derivados de las células madre proliferantes a temperatura ambiente (15 °C), y después fue preparada una emulsión de micelas inversas (agua/dióxido de carbono del procedimiento de temperatura baja) usando dióxido de carbono supercrítico. Después, la reacción fue terminada, el dióxido de carbono supercrítico fue vaporizado a presión reducida para eliminar la fase de dióxido de carbono supercrítico, y fue obtenida una suspensión de liposomas del procedimiento a baja temperatura, en la que se obtuvieron los exosomas derivados de las células madre proliferantes encapsulados. En este caso, la temperatura del procedimiento de reacción fue de 4 °C o menos.

La composición cosmética fue preparada mediante la composición que se muestra en la Tabla 3 a continuación usando el liposoma que encapsula los exosomas.

Tabla 3

Ejemplo de formulación 1: Preparación de agua cosmética suavizante de la piel (loción para la piel) El agua cosmética suavizante para la piel (loción para la piel) fue preparada mediante la composición que se muestra en la siguiente Tabla 4 usando el liposoma que encapsula los exosomas derivados de las células madre proliferantes obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo 2-7.

Tabla 4

Ejemplo de formulación 2: Preparación de agua cosmética nutritiva (loción tipo leche)

El agua cosmética nutritiva (loción lechosa) fue preparada mediante la composición que se muestra en la siguiente Tabla 5 usando el liposoma que encapsula los exosomas derivados de las células madre proliferantes obtenidas mediante el procedimiento del Ejemplo 2-7.

Tabla 5

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una composición cosmética que comprende, como un ingrediente activo, exosomas derivados de células madre que comprenden células madre proliferantes, para blanquear la piel o mejorar las arrugas,

en el que los exosomas comprenden proteína-1 quimioatrayente de monocitos, MCP-1, proteína-3 quimioatrayente de monocitos, MCP-3, ligando de quimioquina-5, CCL-5, inhibidor tisular de metaloproteinasa-1, TIMP-1, interleuquina-6, IL-6, interleuquina-8, IL-8, factor de crecimiento de hepatocitos, HGF, inhibidor-1 del activador del plasminógeno, PAI-1. angiogenina y angiopoyetina-1, y en el que las células madre son células madre derivadas de tejido adiposo humano.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que los exosomas están comprendidos en una concentración de 1 a 150 |jg por 1 ml de la composición cosmética.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que el cosmético es uno cualquiera de las formulaciones seleccionadas del grupo que consiste en loción para la piel, suavizante para la piel, tónico para la piel, astringente, loción, loción tipo leche, loción hidratante, loción nutritiva, crema de masaje, crema nutritiva, crema hidratante, crema de manos, base, esencia, esencia nutritiva, mascarillas, jabón, espuma de limpieza, loción de limpieza, crema de limpieza, loción corporal, limpiador corporal, limpiador, tratamiento, solución cosmética, paquetes de cosméticos, ungüentos, geles, linimentos, líquidos, parches y spray.