ES2831380T3

ES2831380T3 - Sistema y método para evaluar cantidades o tamaños de partículas lipoproteínicas de composiciones de partículas lipoproteínicas

Info

Publication number: ES2831380T3
Application number: ES14717963T
Authority: ES
Inventors: Philip Guadagno; William Harris
Original assignee: Helena Laboratories Corp
Current assignee: Helena Laboratories Corp
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: WO2014145678A2; WO2014145678A3; EP2972325B1; EP2972325A2

Abstract

Un metodo para evaluar las cantidades de una o mas de particulas lipoproteinicas de lipoproteina de alta densidad (HDL), lipoproteina de baja densidad (LDL), lipoproteina de muy baja densidad (VLDL), lipoproteina de densidad intermedia (IDL) y lipoproteina (a) (Lp(a)) presentes en una muestra biologica, que comprende: aislar las particulas lipoproteinicas HDL, LDL, VLDL, IDL y Lp(a) de los componentes no lipoproteinicos de la muestra biologica, para generar particulas lipoproteinicas HDL, LDL, VLDL, IDL y Lp(a) aisladas; separar al menos uno de colesterol libre y fosfolipido de las particulas lipoproteinicas HDL, LDL, VLDL, IDL y Lp(a) aisladas; medir la cantidad del al menos uno de colesterol libre y fosfolipido que se ha separado de una o mas de las particulas lipoproteinicas HDL; LDL, VLDL, IDL y Lp(a) aisladas; y determinar las cantidades de una o mas de particulas lipoproteinicas HDL, LDL, VLDL, IDL y Lp(a) basandose en el diametro o los radios de la particula lipoproteinica y la cantidad medida de colesterol libre o fosfolipido.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema y método para evaluar cantidades o tamaños de partículas lipoproteínicas de composiciones de partículas lipoproteínicas

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier divulgación que quede fuera del alcance de dichas reivindicaciones está destinada únicamente a fines ilustrativos, así como comparativos. Esta divulgación se refiere a métodos para evaluar cantidades o tamaños de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas presentes en una muestra biológica. Los resultados pueden usarse para determinar si un sujeto está en riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares y cardiodiabetes.

La RMN puede determinar el tamaño de y contar las partículas HDL, VLDL, IDL y LDL, pero no las partículas Lp(a). La RMN es en el mejor de los casos, una técnica adecuada y sus problemas técnicos influyen en la exactitud de los datos. La RMN se valora por su reproducibilidad, sin embargo, los datos no se comparan bien con la exactitud de los datos generados por otras técnicas tales como electroforesis en gel. Por esta razón, la determinación del tamaño y el recuento de partículas por RMN puede no ser fiable. La electroforesis en gel es buena para determinar el tamaño de y una aproximación general del número de partículas lipoproteínicas por tinción de densidad de las bandas, especialmente para Lp(a), pero no para HDL. Para LDL, como hay una relación estequiométrica 1:1 entre la partícula y la proteína, puede usarse cualquier técnica que mida la cantidad de ApoB para calcular los números de partículas en una muestra.

Las mediciones del colesterol total en una muestra dada del subtipo de lipoproteína aislada tampoco son útiles para determinar el tamaño o número de partículas. Esto se debe a que los métodos convencionales de laboratorio para la medición del colesterol miden tanto el FC en la membrana fosfolipídica de la partícula, así como los colesteroles esterificados en centro de la partícula. Como los colesteroles esterificados en el centro se mezclan con triglicéridos en proporciones variables que dependen de una gran cantidad de factores genéticos, nutritivos y patológicos, el colesterol total se correlaciona solo vagamente con los tamaños de partícula y no es útil para generar datos clínicamente precisos y exactos para números de partículas.

No hay tecnología existente que pueda medir el número de partículas lipoproteínicas para todos los tipos de partículas lipoproteínicas esféricas de manera exacta y en una única etapa basada en la medición objetiva del contenido de PL o FC de una muestra.

Un aspecto de la divulgación se refiere a un método para evaluar las cantidades de una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas presentes en una muestra biológica. El método comprende aislar una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas de los componentes no lipoproteínicos en la muestra biológica. Las partículas lipoproteínicas son esféricas o sustancialmente esféricas. El método también comprende la etapa de separar al menos uno de colesterol libre y fosfolípido de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas aisladas. Una etapa adicional comprende medir la cantidad del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido que se ha separado de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas aisladas. El método comprende además las etapas de determinar las cantidades de la una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas basándose en la cantidad medida del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a un método para evaluar los tamaños promedio de una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas presentes en una muestra biológica. El método comprende la etapa de aislar una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas de los componentes no lipoproteínicos en la muestra biológica. Las partículas lipoproteínicas son esféricas o sustancialmente esféricas. El método también comprende la etapa de separar al menos uno de colesterol libre y fosfolípido de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas aisladas. Una etapa adicional comprende medir la cantidad del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido que se ha separado de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas aisladas. El método comprende además la etapa de determinar los tamaños promedio de la una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas basándose en la cantidad medida del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido.

Otro aspecto de la divulgación se refiere un método de determinación de si un sujeto está en riesgo aumentado de al menos una de enfermedades cardiovasculares y cardiodiabetes. El método comprende: a) evaluar las cantidades de una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas presentes en una muestra biológica. La etapa de evaluación comprende: Aislar una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas de los componentes no lipoproteínicos en la muestra biológica, en la que las partículas lipoproteínicas son esféricas o sustancialmente esféricas; separar al menos uno de colesterol libre y fosfolípido de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas aisladas; medir la cantidad del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido que se ha separado de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas aisladas; y determinar las cantidades de la una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas basándose en la cantidad medida del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido. El método también comprende: b) comparar las cantidades determinadas de la una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas con un valor de control o de referencia para determinar si el sujeto está en riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes.

Otro aspecto de la divulgación se refiere un método de determinación de si un sujeto está en riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares, que comprende: a) evaluar los tamaños promedio de una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas presentes en una muestra biológica. La etapa de evaluación comprende: Aislar una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas de los componentes no lipoproteínicos en la muestra biológica, en la que las partículas lipoproteínicas son esféricas o sustancialmente esféricas; separar al menos uno de colesterol libre y fosfolípido de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas aisladas; medir la cantidad del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido que se ha separado de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas aisladas; y determinar los tamaños promedio de la una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas basándose en la cantidad medida del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido. El método también comprende: b) comparar los tamaños promedio de la una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas con un valor de control o de referencia para determinar si el sujeto está en riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a un sistema para evaluar cantidades o tamaños de una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas en una muestra biológica. El sistema comprende, opcionalmente, un módulo de aislamiento configurado para aislar una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas de los componentes no lipoproteínicos en la muestra biológica, o para aislar las partículas lipoproteínicas en dos o más clases o subclases. El sistema comprende un módulo de separación configurado para separar al menos uno de colesterol libre y fosfolípido de las partículas lipoproteínicas. El sistema también comprende un módulo de medición configurado para producir una señal detectable de un ensayo que indique la cantidad de al menos uno de colesterol libre y fosfolípido. El sistema comprende además un módulo de cálculo configurado para determinar las cantidades o tamaños de las partículas lipoproteínicas basándose en la cantidad medida de al menos uno de colesterol libre y fosfolípido, y un parámetro predeterminado necesario para el cálculo. Opcionalmente, el sistema comprende un módulo de almacenamiento configurado para almacenar información producida por el módulo de cálculo. Opcionalmente, el sistema comprende un módulo de salida para presentar la información producida por el módulo de cálculo, o generar un informe a partir de la información producida para el usuario.

Existe una necesidad comercial de medir de manera precisa y exacta el número de diversas subclases de partículas lipoproteínicas en la sangre, porque los números de partículas se correlacionan con la salud relativa (es decir, riesgo de eventos cardiovasculares, cardiodiabetes, etc.). El propósito de la divulgación es permitir el cálculo de los números de partículas lipoproteínicas para todas las partículas lipoproteínicas esféricas (incluyendo, aunque sin limitación, HDL-P, LDL-P, VLDL-P, IDL-P, Lp(a)-P y sus subclases) de la composición de partículas lipoproteínicas a partir de la medición de las concentraciones de colesterol libre [FC] y fosfolípidos [PL]. Esta divulgación supera los problemas asociados con otras técnicas usadas para averiguar el número aproximado de partículas lipoproteínicas (incluyendo RMN y geles electroforéticos) utilizando las leyes matemáticas subyacentes a la geometría de una partícula esférica y la relación estequiométrica rígida de colesterol libre a fosfolípido en la membrana de monocapa fosfolipídica "de envuelta" de una partícula lipoproteínica esférica. En resumen, según aumenta el radio de una partícula, aumenta el área superficial proporcionalmente de acuerdo con la fórmula geométrica de la relación del radio al área superficial de la esfera. Como existe colesterol libre en la monocapa lipídica de la superficie de la partícula lipoproteínica en una relación constante al radio de la partícula, la cantidad absoluta de colesterol libre (sin esterificar) [FC] en una muestra que contiene partículas lipoproteínicas puede usarse para 1) calcular el tamaño promedio de las partículas (PN y [FC] dados) en la muestra (diámetro de partícula, 2r), y 2) calcular el número (concentración) de partículas lipoproteínicas (diámetro y [FC] dados) en una muestra dada. Explotar la estequiometría del contenido de FC y PL de las partículas lipoproteínicas esféricas con respecto al radio r de las partículas lipoproteínicas elimina la necesidad de medir tanto el tamaño de partícula como el número de partículas por diversas tecnologías en solitario o en combinación, y puede usarse en cualquier tipo de partícula lipoproteínica esférica independientemente de los componentes proteínicos específicos. Esta técnica elegantemente simple, por lo tanto, proporciona ahorros importantes en tiempo y costes que pueden conseguirse en la configuración del laboratorio de diagnóstico. La exactitud de la técnica también permite decisiones clínicas mejoradas en los tratamientos más apropiados para la reducción de riesgo cardiovascular en un paciente dado.

Se exponen aspectos, ventajas y rasgos característicos adicionales en esta memoria descriptiva, y en parte llegarán a ser evidentes para los expertos en la materia al examinar lo siguiente, o pueden aprenderse mediante la práctica de la divulgación. Las divulgaciones divulgadas en esta solicitud no se limitan a ningún conjunto particular de o combinación de aspectos, ventajas y rasgos característicos. Se contempla que diversas combinaciones de los aspectos, ventajas y rasgos característicos indicados componen las divulgaciones divulgadas en esta solicitud.

La figura 1 representa la estructura de una partícula lipoproteínica. Las lipoproteínas, como otras estructuras fosfolipídicas como las micelas, adoptan la forma energética más eficaz, una esfera. La superficie de la esfera está compuesta de las cabezas polares cargadas hidrófilas de los fosfolípidos ("PL") (protuberancias naranjas). Esta membrana externa también tiene colesterol libre sin esterificar en la misma (protuberancias amarillas) en una relación conocida con respecto a los fosfolípidos. Las partículas lipoproteínicas tienen proteínas asociadas con las mismas. La proteína está representada por enrollamientos azules en la superficie de la partícula lipoproteínica. La mayoría de las partículas lipoproteínicas pueden tener más de una proteína dentro y sobre las mismas. La única partícula lipoproteínica con una relación 1: 1 de partícula: proteína es LDL:ApoB.

La figura 2 muestra una vista en sección transversal de una partícula lipoproteínica. Las cabezas PL hidrófilas polares se muestran como esferas naranjas en el exterior de la membrana externa; las colas PL compactadas hidrófobas se muestran como garabatos en el interior de la membrana externa. Las moléculas de colesterol libre también se representan como esferas amarillas. La parte hueca en el centro de la partícula lipoproteínica se compacta con diversas cantidades de éster de colesterol y triglicéridos. El éster de colesterol se representa por "piruletas" amarillas y los triglicéridos se muestran en azul.

La figura 3 es un gráfico que muestra los niveles de riesgo cardiovascular conocidos y los puntos de corte para diversos tipos de lipoproteínas por tamaño y número de partículas.

La figura 4 es un gráfico que muestra una matriz de diagrama de dispersión del análisis de la correlación de múltiples variables derivada de los datos de las figuras 5 y 6, que muestran las correlaciones de HDL-C a HDL-P y HDL3. Los óvalos rojos representan el intervalo de confianza del 95 % para ambas mediciones. La correlación entre HDL-C y HDL-P total es 0,6877. Puede observarse claramente que la mayoría de los datos puntuales que están fuera del intervalo de confianza del 95 % lo están cuando el recuento de partículas o la medición de colesterol total es elevado. La correlación entre el número de partículas HDL-C y HDL3 es 0,8794, que es mejor que la correlación de HDL-C y HDL-P total, porque HDL3 tiene un diámetro pequeño por definición (7-9 Ángstrom), en oposición a la amplia variabilidad en los diámetros de las partículas HDL totales (7-13 Ángstrom). Sin embargo, ni la correlación es suficientemente buena para permitir un cálculo exacto de los números de partículas a partir de HDL-C, ni viceversa, debido a errores de las mediciones introducidos por la técnica de RMN.

La figura 5 es un gráfico que muestra un diagrama de regresión y el análisis del ajuste de dos variables de los números de partículas HDL totales por HDL-C. Se extrajeron los resultados de ensayo de laboratorio almacenados en una base de datos de registros electrónicos de 11 108 individuos de forma aleatoria y se realizó el análisis de correlación lineal para el ajuste de dos variables del número de partículas HDL por HDL-C. Los números de partícula se midieron con la técnica de RMN y el HDL-C total se midió por la técnica de precipitación convencional. Los datos demuestran que la correlación entre el número de partículas HDL total y h DL-C es mala y que cuanto mayor sea el número de partículas medidas por RMN, peor llegará a ser la correlación. Esto demuestra que el cálculo de HDL-P usando HDL-C medida sería muy inexacto, y muy particularmente, cuando hay números de partículas elevados y/o niveles elevados de HDL-C.

La figura 6 es un gráfico que muestra un diagrama de regresión y el análisis del ajuste de dos variables del número de partículas HDL por HDL3. Se extrajeron los resultados de ensayo de laboratorio almacenados en una base de datos de registros electrónicos de 11 108 individuos aleatoriamente y se realizó un análisis de correlación lineal para el ajuste de dos variables del número de partículas HDL por HDL3. Los números de partícula se midieron con la técnica de RMN. Los datos demuestran que la correlación entre el número de partículas HDL total y el número de partículas HDL3 medido por RMN es menos exacta cuando uno o ambos números de partículas son elevados. Como HDL-3 es un subconjunto de HDL-P total, se esperaría una correlación más estrecha ya que debe variar de manera similar en magnitud y dirección en un paciente dado; la correlación algo mala puede explicarse parcialmente por la ausencia de exactitud en el recuento de partículas por RMN

La primera etapa de esta divulgación es poner en contacto una muestra biológica y manipular la muestra de acuerdo con diversas estrategias de separación conocidas por los expertos en la materia para obtener una cantidad pura o razonablemente pura de una especie o subespecie de lipoproteína dada.

La práctica previa entonces era determinar el contenido de colesterol total de la especie de lipoproteína por precipitación; este es un proceso de 2 etapas en que la muestra en primer lugar se somete a colesterol esterasa y después a colesterol oxidasa. Esto libera todo el colesterol de las partículas para la medición.

En esta divulgación, el problema principal es FC o PL en la membrana de la partícula fosfolipídica, ya que solamente FC y PL tienen una relación estequiométrica tanto con el tamaño de partícula como con el número de partículas. Por lo tanto, cuando el contenido de PL o FC en una muestra se ha determinado, puede calcularse la otra. La descripción general del método de determinación del contenido de colesterol libre (o no esterificado) de la especie de lipoproteína es por precipitación o electroforesis:

Precipitación: Primero se usa DxS04 (suero humano deslipidado con sulfato de dextrano) para precipitar todas las partículas que no son HDL. El FC puede medirse a partir del sobrenadante y se calcula e1HDL-P.

Precipitación/HDL-P fraccionada: Además, el fraccionamiento de HDL-P puede producir sobrenadantes con HDL-P de diversos tamaños para análisis de FC para calcular de manera más exacta HDL-P para las subclases específicas.

La separación de partículas lipídicas también puede conseguirse con el uso de detergentes y/o tensioactivos con posterior análisis de FC.

Puede usarse electroforesis para separar simultáneamente todas las familias de partículas lipídicas y los geles electroforéticos posteriormente pueden sondearse para FC. Dados los diámetros para estas partículas, puede calcularse PN para todos los lípidos, (HDL-P, VLDL-P, IDL-P y LDL-P), simultáneamente.

Usando la cantidad medida de colesterol libre, es posible trabajar a la inversa usando las fórmulas de Shen publicadas en su artículo de 1977 (véase Shen et al., "Structure of Human Serum Lipoproteins Inferred from Compositional Analysis", PNAS USA 74(3):837-41 (1977)) para calcular los números de partículas.

Realización alternativa: puede hacerse lo mismo con la medición de fosfolípidos que están presentes únicamente en la membrana, usando un cálculo diferente del artículo de Shen.

Realización a modo de ejemplo: Cálculo de HDL-P a partir de las concentraciones de colesterol libre (FC) o fosfolípido (PL) en HDL (o subfracciones de HDL que pueden separarse por precipitación, ultracentrifugación o métodos electroforéticos )

1. A partir de la concentración de fosfolípidos en HDL (o subfracciones HDL²y HDL³)

a. Medir las concentraciones de PL para cada uno

b. Usar la ecuación 1 de Shen para calcular [HDL-P] = [PL] x (62Á²*7molécula de PL) x (1/4nr²***)t

2. A partir de la concentración de colesterol libre en HDL (o subfracciones HDL²y HDL³)

Usar la ecuación 2 de Shen para calcular [HDL-P] = [FC] x 1/N^fcdonde N^fc= moléculas de colesterol libre/partícula

N^fc= [r³-(r-20,2)3]e^{(-84’4/r-6’09)}t

a. Medir la concentración de FC en la muestra biológica de lipoproteína

b. Insertar los radios conocidos*** para HDL²o HDL³

c. Resolver para el número de partículas

** volumen específico para una molécula de PL en la cubierta

***insertar los radios conocidos para HDL²y HDL³(HDL³es de 7-9 nm de diámetro y HDL²es de 9-13 nm de diámetro). Como alternativa, se mide físicamente el tamaño promedio de las partículas en la muestra biológica y se inserta el radio en esta ecuación; radio = diámetro/2.

t El número de partículas se presenta como una concentración, pero se describe como un "recuento" o "número".

La medición de FC puede realizarse por cualquier técnica conocida en la técnica.

En lugar de los radios estimados para los cálculos, pueden sustituirse las mediciones de tamaño reales del tamaño promedio de partícula lipoproteínica del paciente por cualquier método en las ecuaciones para obtener el número de partículas.

Las mediciones y derivaciones pueden realizarse sobre cualquier lipoproteína esférica, no solamente HDL.

Los números (concentraciones) de partícula derivados estarán relacionados con los niveles de riesgo conocidos para enfermedades cardiovasculares y se harán recomendaciones para el tratamiento terapéutico del riesgo basándose en las determinaciones.

Una etapa adicional del análisis composicional del colesterol esterificado en lipoproteína y triglicéridos puede realizarse y relacionarse los datos con el tamaño/número de partículas calculado para la estratificación del riesgo

También pueden usarse algoritmos derivados empíricamente determinados experimentalmente a partir de estudios de poblaciones que relacionan FC con el número de partículas para obtener el número de partículas para cualquier especie de partícula lipoproteínica, incluyendo HDL-1 y las subclases HDL-2 y HDL-3.

Esta divulgación utiliza relaciones matemáticas geométricas no apreciadas previamente de las esferas y las propiedades físicas conocidas de FC y LP para derivar matemáticamente los números de partículas lipoproteínicas a partir de una sola medición de FC (y, en algunos casos, el radio medido real derivado del tamaño de partícula medido real). La divulgación permitirá una medición más exacta y precisa (con menos "interferencias") del tamaño de partícula global, eliminando la necesidad de usar tecnologías inexactas para generar una medición real. Los cálculos dependen de la medición de FC, que es una técnica muy reproducible y exacta, y de los intervalos de tamaños de partícula conocidos y/o las medidas de los tamaños de partículas por diversas tecnologías.

La divulgación puede usarse para cualquier partícula lipoproteínica esférica, a diferencia de las tecnologías existentes.

El método es una alternativa simple, rápida, automatizada y rentable a las tecnologías previas. El método elimina la necesidad de múltiples mediciones. Los cálculos pueden automatizarse por un programa informático para la generación de informes. La técnica puede emplearse en todas las lipoproteínas esféricas, incluyendo las difíciles subclases HDL y LP(a) que confunden otras técnicas. Como solamente se mide FC, el proceso de precipitación y medición del colesterol no será tan largo; también como no tiene que añadirse colesterol esterasa a la reacción, el coste de los materiales para realizar el ensayo es menor. El ensayo puede automatizarse en equipos robóticos existentes; esto elimina la necesidad de "enviar" muestras para análisis de RMN o comprar máquinas de RMN, que son muy grandes y valen 1 millón de dólares cada una.

Los términos "magnitudes", "niveles", "cantidades", "concentraciones" y "números", cuando se usan para describir la cantidad de partículas lipoproteínicas, colesterol, fosfolípido, etc., son intercambiables en este documento.

El término "apolipoproteína", como se usa en este documento, se refiere una proteína que se combina con lípidos para formar una partícula lipoproteínica. Ejemplos de tipos de apolipoproteína se describen en más detalle a continuación. La naturaleza única de la apolipoproteína es su relación estequiométrica con las partículas lipoproteínicas, proporcionando una estimación del número de partículas lipoproteínicas, que se describe en mayor detalle a continuación.

Para los propósitos del resto de esta divulgación, "cardiodiabetes" se define como cualquier afección relacionada con el desarrollo e inicio del proceso de la enfermedad diabética o enfermedad cardiovascular, o complicaciones que surgen de los mismos, incluyendo, aunque sin limitación, las siguientes: resistencia a la insulina, síndrome metabólico, diabetes mellitus de tipo 2 (T2DM), diabetes mellitus de tipo 1 (T1DM), esteatosis hepática, nefropatía diabética, neuropatía diabética, vasculitis, ateroesclerosis, arteriopatía coronaria (CAD), formación de placas vulnerables, infarto de miocardio (MI), cardiomiopatía, disfunción endotelial, hipertensión, apoplejía oclusiva, apoplejía isquémica, acontecimiento isquémico transitorio (TIA), trombosis venosa profunda (Dv T), dislipidemia, diabetes gestacional (GDM), periodontopatía, obesidad, obesidad mórbida, infecciones crónicas y agudas, parto pretérmino, retinopatía diabética e inflamación sistémica o específica de órgano.

Las muestras biológicas adecuadas incluyen, aunque sin limitación, matrices biológicas humanas, orina, plasma, suero, componente sanguíneo, líquido sinovial, líquido ascítico y fracciones lipoproteínicas humanas. Por ejemplo, la muestra puede ser sangre fresca o sangre almacenada o fracciones de sangre. La muestra puede ser una muestra de sangre obtenida expresamente para los ensayos de esta divulgación o una muestras de sangre obtenida con otro propósito que puede submuestrearse para su uso de acuerdo con los métodos descritos en este documento. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser sangre completa. La sangre completa puede obtenerse del sujeto usando procedimientos clínicos convencionales. La muestra biológica también puede ser plasma. El plasma puede obtenerse de muestras de sangre completa por centrifugación de sangre anticoagulada. La muestra biológica también puede ser suero. La muestra puede pretratarse según lo necesario por dilución en una solución tampón apropiada, concentrarse si se desea o fraccionarse por muchos métodos incluyendo, aunque sin limitación, ultracentrifugación, fraccionamiento por cromatografía líquida de alto rendimiento (FPLC) o precipitación. Puede usarse cualquiera de varias soluciones acuosas de tampón convencionales, empleando uno de diversos tampones, tal como fosfato, Tris o similares, a pH fisiológico a alcalino.

Aislamiento de clases y subclases de partículas lipoproteínicas

Como antecedente, el colesterol y los monoacilgliceroles se absorben en el intestino. Las células epiteliales intestinales sintetizan triacilgliceroles. Una parte del colesterol se esterifica para formar ésteres de colesterol. Las células intestinales forman quilomicrones a partir de los triacilgliceroles, ésteres de colesterol, fosfolípidos, colesterol libre y apolipoproteínas.

Las apolipoproteínas son el componente proteínico de las partículas lipoproteínicas. Las apolipoproteínas recubren las partículas lipoproteínicas que incluyen ésteres de colesterol y triacilglicérido. El recubrimiento de la partícula lipoproteínica está compuesto de colesterol no esterificado, fosfolípidos y apolipoproteínas. Véanse las figuras 1 y 2. La naturaleza única de la apolipoproteína es su relación estequiométrica con las partículas lipoproteínicas, proporcionando una estimación del número de partículas lipoproteínicas. Estas partículas lipoproteínicas proporcionan un modo de hacer circular los componentes hidrófobos a través del torrente sanguíneo. Las diferentes partículas lipoproteínicas incluyen quilomicrón-P, VLDL-P, IDL-P, LDL-P, Lp(a)-P y HDL-P. Las partículas lipoproteínicas varían en tamaño, forma, densidad, composición apolipoproteínica y composición lipídica. Hay heterogeneidad dentro de cada clase compartiendo cada clase características físicas similares. Variando las condiciones, es posible visualizar diferentes partículas dentro de una clase. Hay un mérito clínico en hacerlo porque, por ejemplo, una clase puede ser aterógena y una clase puede ser ateroprotectora.

Las clases lipoproteínicas normalmente son heterogéneas y consisten en un conjunto de subpoblaciones diferenciadas con distintas propiedades moleculares, incluyendo densidad, tamaño, composición lipídica, etc. Estas subpoblaciones de clases lipoproteínicas pueden denominarse subclases, subespecies o subfracciones. Dependiendo de la metodología usada para separar y analizar las subclases lipoproteínicas, el número de subclases en que se divide cada clase lipoproteínica puede ser ligeramente diferente. A continuación se muestran en el esquema 1 varias clasificaciones diferentes de subclases lipoproteínicas por diversos métodos comerciales. Harold E. Bays etal., "Once-Daily Niacin Extended Release/Lovastatin Combination Tablet Has More Favorable Effects on Lipoprotein Particle Size and Subclass Distribution Than Atorvastatin and Simvastatin", Preventive Cardiology 6(4): 179-88, 187 (2003).

E squem a 1

Una muestra biológica que contiene una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas se manipula de acuerdo con diversas estrategias de separación o aislamiento conocidos por los expertos en la materia para aislar una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas de las que no son lipoproteínicas contenidas en la muestra.

Las partículas lipoproteínicas pueden aislarse o separarse adicionalmente en dos o más clases, de modo que la separación posterior de colesterol libre y/o fosfolípido de las partículas lipoproteínicas se realiza en una o más clases de partículas lipoproteínicas deseadas a medir. Por ejemplo, una clase de partícula lipoproteínica o partes de la misma puede aislarse de las clases lipoproteínicas restantes para determinar las cantidades o tamaños de esa partícula lipoproteínica. Cada una de las clases lipoproteínicas restantes puede aislarse de manera similar y secuencial para determinar las cantidades o tamaños de cada clase de partícula lipoproteínica.

Además, para cada clase de partícula lipoproteínica que se ha aislado, la partícula lipoproteínica puede fraccionarse adicionalmente en una o más subclases, de modo que la separación posterior de colesterol libre y/o fosfolípido de las partículas lipoproteínicas se realiza en una o más subclases de la partícula lipoproteínica.

Las partículas lipoproteínicas o partes de las mismas que pueden medirse incluyen, aunque sin limitación, apolipoproteína A, apolipoproteína B, apolipoproteína C, apolipoproteína D, apolipoproteína E, apolipoproteína H, lipoproteína (a) (Lp(a)), lipoproteína de alta densidad (HDL), lipoproteína de densidad intermedia (IDL), lipoproteína de baja densidad (LDl), lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), quilomicrones, lipoproteína X, variantes oxidadas o mezclas de las mismas. Las clases lipoproteínicas típicas o partes de las mismas a medir son LP(a), apolipoproteína B, HDL, IDL, LDL, VLDL y quilomicrón. Las subclases lipoproteínicas adecuadas a medir incluyen cualquier clasificación de subclases mostrada en el esquema 1, dependiendo de la metodología usada para separar o fraccionar las partículas lipoproteínicas.

Como alternativa, usando tecnología de aislamiento y separación adecuada, pueden aislarse todas o casi todas las clases de las partículas lipoproteínicas de los componentes no lipoproteínicos contenidos en la muestra biológica simultáneamente, y también pueden aislarse o separarse diferentes clases o subclases de las partículas lipoproteínicas entre sí, simultáneamente.

Las partículas lipoproteínicas que pueden aislarse o separarse simultáneamente incluyen dos o más de HDL, IDL, LDL, VLDL. Dependiendo de la metodología usada para separar o fraccionar las partículas lipoproteínicas, todas las subclases de estas clases lipoproteínicas pueden separarse simultáneamente también.

Aislar una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas de las que no son lipoproteínicas, y aislar una clase de las partículas lipoproteínicas o partes de las mismas de las clases lipoproteínicas restantes puede realizarse por cualquier método conocidos por los expertos en la materia. Los métodos de aislamiento adecuados incluyen, aunque sin limitación, precipitación, electroforesis, ultracentrifugación, usando un tensioactivo, usando un detergente o combinaciones de los mismos. Asimismo, fraccionar una clase de partícula lipoproteínica en una o más subclases también puede realizarse por métodos conocidos por los expertos en la materia. Pueden encontrarse más detalles acerca de las diversas tecnologías de aislamiento, separación o fraccionamiento para partículas lipoproteínicas en Nader Rifai et al., "Handbook of Lipoprotein Testing", (2.a Ed. American Association for Clinical Chemistry, Inc. 2001).

Puede usarse precipitación para aislar partículas lipoproteínicas de las no lipoproteínicas contenidas, y para aislar o separar diferentes clases de partículas lipoproteínicas entre sí, con el uso de reactivos o disolventes apropiados. La precipitación selectiva explota las diferencias en el tamaño y las propiedades de carga de las lipoproteínas. Reactivos a modo de ejemplo son heparina-Mn2+, sulfato de dextrano y Mg2+, polietilenglicol y polietilenglicol y sulfato de dextrano. Por ejemplo, las partículas lipoproteínicas pueden aislarse de suero humano por precipitación con polianiones, cationes divalentes o heparina. Además, puede precipitarse una mezcla de LDL y VLDL conjuntamente y separarse de las partículas lipoproteínicas restantes. Los reactivos usados pueden incluir heparina y cationes divalentes, por ejemplo, MnCl²en solitario, MnCl²con sacarosa, MgCl²con fosfotungstato de sodio o MnCl²con sulfato de dextrano. Cuando la precipitación de LDL y VLDL se consigue con sulfato de dextrano y MnCh, o fosfotungstato de sodio y MgCl², la HDL puede precipitarse posteriormente aumentando las concentraciones de los reactivos. La separación adicional de LDL y VLDL entre sí y la purificación para eliminar los contaminantes proteínicos puede realizarse por ultracentrifugación.

Puede usarse ultracentrifugación para aislar partículas lipoproteínicas de las no lipoproteínicas contenidas, y para aislar o separar diferentes clases de partículas lipoproteínicas entre sí, con el uso de reactivos o disolventes apropiados, así como para fraccionar una clase de partícula lipoproteínica en una o más subclases. Normalmente, la tecnología de ultracentrifugación se basa en las diferencias en las densidades de las partículas lipoproteínicas. Las tecnologías de ultracentrifugación a modo de ejemplo son ultracentrifugación analítica, ultracentrifugación por densidad secuencial y ultracentrifugación en gradiente de densidad, usando, por ejemplo, rotores de cubeta oscilante, rotores verticales o rotores zonales.

Pueden usarse procedimientos cromatográficos, basados en los tamaños de las partículas lipoproteínicas, para aislar las partículas lipoproteínicas de las no lipoproteínicas contenidas, y para aislar o separar diferentes clases de partículas lipoproteínicas entre sí, con el uso de reactivos o disolventes apropiados, así como para fraccionar una clase de partícula lipoproteínica en una o más subclases. La tecnología cromatográfica típica es cromatografía de líquidos, tal como HPLC.

La tecnología de electroforesis, basada en los tamaños de las partículas lipoproteínicas, puede usarse para aislar partículas lipoproteínicas de las no lipoproteínicas contenidas, y para aislar o separar diferentes clases de partículas lipoproteínicas entre sí, así como para fraccionar una clase de partícula lipoproteínica en una o más subclases. La tecnología de electroforesis típica es electroforesis en gel, tal como electroforesis en gel de gradiente. La electroforesis en gel puede ser unidimensional o bidimensional. También puede realizarse enfoque isoeléctrico. Los sustratos de gel electroforético adecuados son conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, los sustratos de gel adecuados incluyen, aunque sin limitación, agarosa o poliacrilamida. Los geles de SDS-PAGE (poliacrilamida) separan las proteínas basándose en su tamaño, porque el SDS recubre las proteínas con una carga negativa. La separación de las proteínas en el gel de agarosa es por carga.

Mediante electroforesis, pueden aislarse todas o casi todas las clases de las partículas lipoproteínicas de los componentes no lipoproteínicos en la muestra biológica simultáneamente, y pueden aislarse o separarse diferentes clases o subclases de las partículas lipoproteínicas entre sí, simultáneamente. Por consiguiente, el gel electroforético resultante para cada partícula lipoproteínica aislada puede usarse para medir la cantidad del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido en la partícula lipoproteínica. En este caso, las cantidades o tamaños de todas las clases o subclases aisladas de las partículas lipoproteínicas pueden determinarse simultáneamente o casi simultáneamente. Las partículas lipoproteínicas determinadas simultáneamente pueden comprender dos o más clases o subclases diferentes de partículas lipoproteínicas esféricas o casi esféricas. Por ejemplo, las partículas lipoproteínicas determinadas simultáneamente comprenden dos o más de HDL-P, VLDL-P, IDL-P y LDL-P. Todas las subclases de estas clases lipoproteínicas pueden separarse simultáneamente también.

El uso de un detergente o tensioactivo para separar partículas lipoproteínicas puede realizarse como se ejemplifica en la patente de Estados Unidos n.° 6479249, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20l 3/0078659 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2010/0227309. Los tensioactivos y/o detergentes se usan normalmente para el aislamiento de partículas lipoproteínicas en el transcurso de medición de colesterol y triglicéridos en partículas. En estos métodos, las partículas lipoproteínicas se descomponen selectivamente, dejando únicamente partículas intactas de interés para análisis adicional. La aplicación de los mismos protocolos de tensioactivo y/o detergente al aislamiento de partículas lipoproteínicas cambiará únicamente en que se mide colesterol libre y/o fosfolípidos en lugar de colesterol total o triglicéridos totales. Pueden usarse etapas adicionales como se describe en este documento para medir particularmente colesterol libre y/o fosfolípidos. Por ejemplo, los detergentes Triton™ o Tween™, o las mezclas de los dos son útiles en el aislamiento de partículas lipoproteínicas para el análisis de triglicéridos. Los mismos protocolos para el aislamiento de partículas usando los detergentes Triton™ y Tween™ son útiles para las mediciones de colesterol libre y/o fosfolípidos, con la ventaja añadida de poderse automatizar fácilmente. Un protocolo automatizado usando detergentes y/o tensioactivos facilita el aumento de escala a un método de alto rendimiento.

Los aislamientos de clases y subclases de partículas lipoproteínicas para la medición de las cantidades y tamaños de las partículas se ejemplifican por los aislamientos de las clases y subclases de HDL, y las clases y subclases de LDL, como se describe a continuación.

Las partículas HDL pueden aislarse de partículas que no son HDL y otros componentes no lipoproteínicos contenido en la muestra biológica, de modo que puede medirse al menos uno de colesterol libre y fosfolípido separado de las partículas HDL aisladas para determinar la cantidad o tamaño de la partícula HDL. Esta etapa de aislamiento puede realizase por precipitación con un precipitante, tal como sulfato de dextrano. Las partículas HDL aisladas pueden fraccionarse adicionalmente en una o más subclases, de modo que al menos uno de colesterol libre y fosfolípido separado de cada partícula de la subclase de HDL fraccionada puede medirse para determinar la cantidad o tamaño de la partícula de la subclase de HDL fraccionada. Por ejemplo, las partículas HDL pueden fraccionarse en una o más subclases, comprendiendo una o más de HDL-1, HDL-2 y HDL-3. Pueden determinarse otras subclases de HDL mostradas en el esquema 1, dependiendo de la metodología usada para fraccionar las partículas HDL. Este fraccionamiento puede realizarse por precipitación, electroforesis, ultracentrifugación, usando un tensioactivo, usando un detergente o combinaciones de los mismos. Dependiendo de la tecnología de fraccionamiento usada, el fraccionamiento de HDL puede realizarse secuencial o simultáneamente. Por ejemplo, el fraccionamiento por precipitación se realiza en etapas secuenciales, precipitando una partícula de la subclase de HDL cada vez; y el fraccionamiento por electroforesis puede separar simultáneamente todas las subclases de HDL entre sí.

Las partículas LDL pueden aislarse de partículas que no son LDL y otros componentes no lipoproteínicos contenidos en la muestra biológica, de modo que al menos uno de colesterol libre y fosfolípido separado de las partículas LDL aisladas puede medirse para determinar la cantidad o tamaño de la partícula LDL. Esta etapa de aislamiento puede realizase por precipitación con un precipitante, tal como sulfato de dextrano. Las partículas LDL aisladas pueden fraccionarse adicionalmente en una o más subclases, de modo que al menos uno de colesterol libre y fosfolípido separado de cada partícula de la subclase de LDL fraccionada puede medirse para determinar la cantidad o tamaño de la partícula de la subclase de LDL fraccionada. Por ejemplo, las partículas l Dl pueden fraccionarse en una o más subclases, comprendiendo una o más de LDL dinámicas grandes, LDL densas pequeñas (sdlDL), VLDL, IDL, Lp(a) y quilomicrones. Pueden determinarse otras subclases de LDL mostradas en el esquema 1, dependiendo de la metodología usada para fraccionar las partículas LDL. Este fraccionamiento puede realizarse por precipitación, electroforesis, ultracentrifugación, usando un tensioactivo, usando un detergente o combinaciones de los mismos. Dependiendo de la tecnología de fraccionamiento usada, el fraccionamiento de LDL puede realizarse secuencial o simultáneamente. Por ejemplo, el fraccionamiento por precipitación se realiza en etapas secuenciales, precipitando una partícula de la subclase de LDL individual cada vez; y el fraccionamiento por electroforesis puede separar simultáneamente todas las subclases de LDL entre sí.

Evaluación de cantidades o tamaños de las partículas lipoproteínicas

Una vez que la partícula lipoproteínica (clase o subclase) deseada a analizar está aislada, puede medirse el colesterol libre o fosfolípido en la partícula lipoproteínica para determinar la cantidad o tamaño medio de la partícula lipoproteínica.

Separar el colesterol libre y el fosfolípido de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas aisladas puede realizarse por cualquier método conocidos por los expertos en la materia. La medición del colesterol libre y fosfolípido también puede realizarse por cualquier método conocidos por los expertos en la materia.

La práctica convencional implica determinar el contenido de colesterol total de la especie lipoproteínica por precipitación, que un proceso de 2 etapas que libera todos los colesteroles (incluyendo colesterol libre y el éster de colesterol) de las partículas lipoproteínicas como colesterol libre para la medición. En la primera etapa, la muestra se somete a colesterol esterasa o lipasa en cantidad suficiente para descomponer todos los ésteres de colesterol en colesterol libre y ácidos grasos. En la segunda etapa, la muestra se trata adicionalmente con un reactivo que contiene colesterol oxidasa (CO) a medir espectroscópicamente.

Aquí, el colesterol libre a medir de las partículas lipoproteínicas aisladas se separa de las partículas lipoproteínicas tratando la muestra con un reactivo que contiene colesterol oxidasa (CO), para medir el colesterol libre en las partículas lipoproteínicas. Por ejemplo, una muestra del sobrenadante se trata con un reactivo que contiene CO, peroxidasa (POD), 4-aminoantipirina y un cromógeno. Se produce químicamente una quinonaimina en proporción a la cantidad de colesterol libre originalmente presente en el sobrenadante; la cantidad de quinonaimina producida puede medirse espectroscópicamente. La reacción puede mostrarse de la siguiente manera:

Por ejemplo, se usan cromógenos de baja sensibilidad tales como fenol o p-hidroxibenzoato; y puede medirse la absorbancia a aproximadamente 510 nm y compararse con la absorbancia de patrones de referencia a esa longitud de onda para determinar la concentración de quinonaimina. Esto puede medirse por, por ejemplo, espectroscopia de absorbancia del uv-visible.

En la medición del colesterol libre, a diferencia de la práctica convencional, los ésteres de colesterol de las partículas lipoproteínicas no se convierten en colesterol libre porque solamente el colesterol libre original en la partícula lipoproteínica tiene una relación estequiométrica con los tamaños y números de partículas. Por consiguiente, cuando se mide el contenido de colesterol libre, no se usa una colesterol esterasa en la separación del colesterol libre de las partículas lipoproteínicas aisladas. El colesterol esterificado en el núcleo de la partícula lipoproteínica, por tanto, no se libera como colesterol libre, y el colesterol libre medido solamente contiene colesterol libre original en la partícula lipoproteínica, no el colesterol esterificado en el núcleo de la partícula lipoproteínica.

Por consiguiente, el método puede determinar de manera exacta las cantidades y tamaños de una pluralidad de diferentes clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas en la muestra biológica.

Las cantidades y tamaños de las partículas lipoproteínicas pueden determinarse basándose en algoritmos derivados empíricamente que se determinan experimentalmente a partir de estudios de poblaciones que se refieren a cantidades de colesterol libre o fosfolípido con respecto a los números de partículas lipoproteínicas o tamaño de partículas lipoproteínicas.

Cuando se determinan las cantidades de las partículas lipoproteínicas, pueden determinarse los radios de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas. Por tanto, las cantidades de las partículas lipoproteínicas pueden determinarse basándose en la cantidad medida de uno de colesterol libre y fosfolípido, y los radios predeterminados.

Por ejemplo, puede usarse una medida de fosfolípido y los radios predeterminados en la determinación de las cantidades de las partículas lipoproteínicas. En este caso, puede usarse la siguiente ecuación:

Número de partículas por volumen unitario = cantidad medida de fosfolípido por volumen unitario en una muestra x (62Á2 / molécula fosfolipídica) x (1/4nr2).

Como alternativa, puede usarse una cantidad medida de colesterol libre y los radios predeterminados en la determinación de las cantidades de las partículas lipoproteínicas. En este caso, puede usarse la siguiente ecuación:

Número de partículas por volumen unitario = cantidad medida de colesterol libre por volumen unitario x 1/N^fe,

en la que N^fc=[r3-(r-20,2)3]e(-84'4/r-609)]

En ambas ecuaciones anteriores, r es el radio de la partícula lipoproteínica o el radio promedio de la clase o subclase de las partículas lipoproteínicas en A.

Los radios de las partículas lipoproteínicas pueden determinarse basándose en estimación teórica. Como alternativa, los radios de las partículas lipoproteínicas pueden determinarse basándose en medición experimental de los tamaños promedio de las clases y subclases de las partículas lipoproteínicas en un individuo o en una población de individuos.

Cuando se determinan los tamaños de las partículas lipoproteínicas, pueden predeterminarse los números de partículas de las partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas. Por tanto, los tamaños de las partículas lipoproteínicas pueden determinarse basándose en la cantidad medida de uno de colesterol libre y fosfolípido, y los números de partículas predeterminados.

Por ejemplo, puede usarse una cantidad medida de fosfolípido y números de partículas predeterminados en la determinación de los tamaños de las partículas lipoproteínicas. En este caso, puede usarse la siguiente ecuación:

Número de partícula por volumen unitario = cantidad medida de fosfolípido por volumen unitario en una muestra x (62Á²/ molécula fosfolipídica) x (1/4nr²).

r es el radio de la partícula lipoproteínica o el radio promedio de la clase o subclase de las partículas lipoproteínicas en Á, y puede calcularse por esta ecuación.

Como alternativa, puede usarse una cantidad medida de colesterol libre y los números de partículas predeterminados en la determinación de los tamaños de las partículas lipoproteínicas. En este caso, puede usarse la siguiente ecuación:

Número de partícula por volumen unitario = cantidad de colesterol libre medido por volumen unitario x 1/N^fc, en la que N^fc= [r³-(r-20,2)³]e ^{(-84’4/r-6’09)}.

Los números de partículas de las partículas lipoproteínicas pueden predeterminarse basándose en estimación teórica. Como alternativa, los números de partículas de las partículas lipoproteínicas pueden determinarse basándose en medición experimental de los números de partículas de las clases y subclases de las partículas lipoproteínicas en un individuo o en una población de individuos.

Puede realizarse una etapa adicional de análisis de composición de las partículas lipoproteínicas para determinar el nivel de colesterol esterificado y triglicéridos en las partículas lipoproteínicas. Los valores resultantes pueden relacionarse con el tamaño/número de partículas calculado de las partículas lipoproteínicas para la estratificación de riesgos.

Determinación del riesgo de enfermedades cardiovasculares y cardiodiabetes

La familia de apolipoproteína A (Apo A) constituye las proteínas principales encontradas en HDL-P y partículas lipoproteínicas ricas en triglicéridos. Apo A, como parte de HDL, está implicada en la eliminación del colesterol libre de los tejidos extrahepáticos y también desempeña una función en la activación de la lecitina aciltransferasa. La apolipoproteína A activa las enzimas que dirigen la transferencia del colesterol desde los tejidos en HDL y también está implicada en el reconocimiento de HDL y la unión de los receptores en el hígado.

Hay múltiples formas de apolipoproteína A. Las formas más comunes son Apo A-I y Apo A-II. La apolipoproteína A (A I, A-II y A-IV) se encuentra en quilomicrones y HDL. Apo A-I es la apolipoproteína A principal adherida a HDL. Apo A I es responsable de activar la lecitina-colesterol aciltransferasa y la Apo A-II modula esa activación. La lecitinacolesterol aciltransferasa convierte el colesterol libre en un éster de colesterol. Las secreciones de Apo A-IV aumentan cuando se absorbe grasa en los intestinos. Apo A-IV también puede funcionar en la activación de la lecitina-colesterol aciltransferasa.

Apo A-I se encuentra en mayor proporción que Apo A-II (aproximadamente 3 a 1). Niveles inferiores de Apo A se correlacionan normalmente con la presencia de enfermedades cardiovasculares (CVD) y vasculopatía periférica. Apo A-I puede ser un mejor factor de predicción de riesgo aterógeno que HDL-colesterol (HDL-C). Determinados trastornos genéticos provocan deficiencias de Apo A-I y niveles bajos asociados de partículas HDL. Estos pacientes también tienden a tener hiperlipidemia con partículas LDL elevadas. Esto contribuye a tasas aceleradas de ateroesclerosis. Los niveles de Apo A pueden ser extremadamente bajos en alfa lipoproteinemia (también conocida como deficiencia de lipoproteína de alta densidad familiar).

La función de HDL y su apolipoproteína principal Apo A-I en el flujo saliente de colesterol desde los macrófagos se ha estudiado ampliamente. Aunque la HDL compite por la unión de Apo A-I, Apo A-I no es un competidor de la unión a HDL. Esta observación sugiere que HDL y Apo A-I se unen a macrófagos al menos en parte por distintos receptores. Por ejemplo, pre-HDL y Apo A-I sin lípidos son malos ligandos para el receptor aceptor (SR-BI), lo que explica la ausencia de competición de la unión a HDL por Apo A-I. A la inversa, se ha demostrado que Apo A-I puede disociarse de HDL, de modo que podría estar disponible Apo A-I sin lípidos para la competición del sitio de unión a Apo A-I por HDL. Lorenzi et al., "Apolipoprotein A-I but not high-density lipoproteins are internalised by RAW macrophages: roles of ATP-binding cassette transporter Al and scavenger receptor". BIJMol Med. 86: 171-183 (2008). Apo A-II, otro componente de HDL, ha demostrado ser proaterógeno en modelos animales. Meyers et al., "Pharmacologic elevation of high-density lipoproteins: recent insights on mechanism of action and atherosclerosis protection". Curr Opin Cardiol.

19(4):366-373 (2004).

La apolipoproteína B (Apo B-100 y Apo B-48) es el componente proteínico de LDL. Una molécula de Apo B está presente en la capa fosfolipídica de cada LDL. Más de un 90 % de la partícula LDL está compuesta de Apo B. Apo B funciona solubilizando el colesterol dentro del complejo LDL, que a su vez aumenta la capacidad de transporte de LDL para el posterior depósito de colesterol LDL en la pared arterial. El depósito contribuye a enfermedades cardiovasculares. Apo B también es un componente proteínico de los quilomicrones, VLDL, IDL y Lp(a). Apo B es una glucoproteína helicoide anfipática grande con 2 isoformas: Apo B-100 (sintetizada en los hepatocitos) y Apo B-48 (la proteína estructural de los quilomicrones). Los quilomicrones contienen Apo B-48 mientras que otras partículas lipoproteínicas que contienen Apo B contienen Apo B-100.

Apo B modula la actividad de enzimas que actúan en partículas lipoproteínicas, mantiene la integridad estructural del complejo de la partícula lipoproteínica y facilita la captación de partículas lipoproteínicas actuando como ligandos para receptores de superficie celular específicos.

Las enzimas que actúan sobre partículas lipoproteínicas incluyen, aunque sin limitación, lipoproteína lipasa, lecitinacolesterol aciltransferasa, triglicérido lipasa hepática y la proteína de transferencia de éster de colesterol. Se encuentran niveles elevados de Apo B en hiperlipoproteinemia. Apo B-100 está ausente en formas de abetalipoproteinemia. Puede haber altos niveles de Apo B-100 presentes en hiperlipoproteinemia, angina aguda e infarto de miocardio. Apo B-48 permanece en el intestino en la enfermedad de retención de quilomicrones.

Está bien establecido que una concentración plasmática aumentada de partículas lipoproteínicas que contienen Apo B está asociada con un riesgo aumentado de desarrollar enfermedad ateroesclerótica. Estudios de control de casos han encontrado concentraciones plasmáticas de Apo B que tienen mayor capacidad de discriminación que otros lípidos plasmáticos y partículas lipoproteínicas en la identificación de pacientes con cardiopatía coronaria (CHD). Véanse, De Backer et al., "European Guidelines on Cardiovascular Disease Prevention in Clinical Practice. Third Joint Task Force of European and other Societies on Cardiovascular Disease Prevention in Clinical Practice", Eur Heart J 24: 1601-1610 (2003); Walldius y Jungner, "Apolipoprotein B and Apolipoprotein A-I: Risk Indicators of Coronary Heart Disease and Targets for Lipid-modifying Therapy", J Intern Med 255(2): 188-205 (2004); Walldius, et al., "The apoB/apoA-I ratio: A Strong, New Risk Factor for Cardiovascular Disease and a Target for Lipidlowering Therapy- A Review of the Evidence", J Intern Med. 259(5):493-519 (2006); Yusuf et al., "Effect of Potentially Modifiable Risk Factors Associated with Myocardial Infarction in 52 Countries (the TNTERHEART Study): Case-control Study", Lancet 364: 937-52 (2004). La utilidad de Apo B en la determinación del riesgo de CHD se ha confirmado por estudios prospectivos, aunque el grado al que las concentraciones de Apo B son mejores que los lípidos séricos en la predicción del riesgo era variable. Apo B es un componente de todas las partículas aterógenas o potencialmente aterógenas, incluyendo las partículas lipoproteínicas de muy baja densidad (VLDL-P), partículas lipoproteínicas de densidad intermedia (IDL-P), partículas lipoproteínicas de baja densidad (LDL-P) y partículas lipoproteínicas(a) (Lp(a)-P), y cada partícula contiene una molécula de Apo B. Por lo tanto, Apo B proporciona una medida directa del número de partículas lipoproteínicas aterógenas en la circulación. La Apo B total no es homogénea. La Apo B total estará influida por su presencia de Apo B en las diversas partículas anteriores. Medir la Apo B total en solitario sin separar las partículas no indica la partícula con que está asociada.

Ahora hay un claro consenso de que Apo B es un factor de predicción más fuerte de enfermedades cardiovasculares (CVD) que el colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C) y un informe reciente de conferencia consenso de la American Diabetes Association (ADA) y la American College of Cardiology (ACC) reconoce la importancia de la medición de Apo B (véanse, Kannel et al., "Cholesterol in the Prediction of Atherosclerotic Disease", Ann Intern Med 90:85-91 (1979) y Jeyarajah et al., "Lipoprotein Particle Analysis by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy", Clin Lab Med 26: 847-70 (2006). Un nivel elevado de Apo B y LDL-P significa que un individuo tiene riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares. Un nivel elevado de Apo B y Lp(a)-P significa que un individuo tiene riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares.

Además, la relación de Apo B/Apo A-I ha demostrado estar fuertemente relacionada con el riesgo de infarto de miocardio (MI), apoplejía y otras manifestaciones CV como se muestra en el estudio de riesgo de mortalidad relacionada con apolipoproteína (AMORIS) (Véanse, Walldius y Jungner, "Apolipoprotein B and Apolipoprotein A-I: Risk Indicators of Coronary Heart Disease and Targets for Lipidmodifying Therapy", J Intern Med 255(2): 188-205 (2004); Walldius, et al., "The apoB/apoA-I ratio: A Strong, New Risk Factor for Cardiovascular Disease and a Target for Lipid-Lowering Therapy-A Review of the Evidence", J Intern Med. 259(5):493-519 (2006); Walldius et al., "Stroke Mortality and the Apo B/Apo A-I Ratio: Results of the AMORIS Prospective Study". J Intern Med. 259: 259-66 (2006)) e INTERHEART (Yusuf et al., "Effect of Potentially Modifiable Risk Factors Associated with Myocardial Infarction in 52 Countries (the INTERHEART Study): Case-control Study", Lancet 364: 937-52 (2004) y Yusuf et al., "Obesity and the risk of myocardial infarction in 27,000 participants from 52 countries: a case-control study", Lancet 366: 1640-9 (2005)).

La apolipoproteína C (Apo C-I, C-II, C-III) es un componente de las partículas quilomicrones, partículas VLDL, partículas IDL y partículas HDL. Apo C-II es un activador de la lipoproteína lipasa y una deficiencia provoca una acumulación de quilomicrones y triacilgliceroles. Niveles elevados de Apo C-II son indicadores de angina e infarto de miocardio. La apolipoproteína C-II (Apo C-II) es un tipo específico de proteína encontrada en partículas grandes absorbidas del tubo gastrointestinal. También se encuentra en partículas lipoproteínicas de muy baja densidad (VLDL-P) que están compuestas principalmente de colesterol. Apo C-II es una apolipoproteína responsable de la activación de lipoproteína lipasa (LPL) en capilares y, por tanto, comienza el catabolismo de las partículas quilomicrones y VLDL-P. También se encuentra en h DL-P. La carencia de esta Apo C-II se presenta con hipertrigliceridemia grave e hiperquilomicronemia durante el ayuno.

Las mediciones de Apo C-II pueden ayudar a determinar el tipo específico o causa de elevadas concentraciones de lípidos en sangre (hiperlipidemia). Las personas con deficiencia de lipoproteína lipasa familiar pueden tener altas cantidades de Apo C-II. Otros trastornos que pueden estar asociados con altos niveles de Apo C-II incluyen angina de pecho y ataque cardíaco. Se observan bajos niveles de Apo C-II en personas con una afección infrecuente denominada deficiencia de Apo C-II familiar.

La apolipoproteína C-III (Apo C-III) se encuentra en partículas lipoproteínicas de muy baja densidad (VLDL-P). Apo C III inhibe la lipoproteína lipasa y la lipasa hepática y se cree que inhibe la captación hepática de partículas ricas en triglicéridos. Apo C-IV se encuentra en al menos VLDL-P y HDL-P.

Los genes de Apo A-I, Apo C-III y Apo A-IV están muy ligados en los genomas tanto de rata como de ser humano. Los genes de A-I y A-IV se transcriben desde la misma hebra, mientras que los genes de A-I y C-III se transcriben de manera convergente. Un aumento en los niveles de Apo C-III induce el desarrollo de hipertrigliceridemia.

La apolipoproteína D es un componente minoritario de HDL. Altas concentraciones de Apo D están correlacionadas con diversas enfermedades tales como enfermedad quística macroscópica de mama y enfermedad de Alzheimer.

La apolipoproteína E (Apo E-2, E-3 y E-4) se encuentra en quilomicrones e IDL. Apo E se une a un receptor en hepatocitos y células periféricas. Apo E es esencial para el catabolismo normal de los constituyentes de partículas lipoproteínicas ricas en triglicéridos. Apo E se reconoció inicialmente por su importancia en el metabolismo de las partículas lipoproteínicas y enfermedades cardiovasculares. Desempeña una función en el transporte de lípidos a los tejidos, el transporte de colesterol desde los órganos al hígado, en el metabolismo de partículas lipoproteínicas eliminando las VLDL y quilomicrones, y en la formación de lesiones ateroescleróticas. La parte Apo E de las partículas lipoproteínicas media la unión de las partículas lipoproteínicas Apo E al receptor de LDL. Apo E unida a HDL-P inhibe la agregación plaquetaria inducida por agonista mediante unión a sitios en las plaquetas. Existen tres alelos diferentes del gen de Apo E, Apo E e2, e3 y e4. Apo E e4 está asociado con un riesgo aumentado de enfermedad de Alzheimer de aparición tardía.

La apolipoproteína H funciona uniéndose a cardiolipina. Se encuentra anticuerpos anticardiolipina en sífilis, esclerosis y lupus y en algunas enfermedades los anticuerpos requieren que Apo H sea activa e inhiben la liberación de serotonina por parte de las plaquetas y evitan la agregación de las plaquetas. Apo H también inhibe la liberación de serotonina por parte de las plaquetas y evita la agregación de las plaquetas.

Los perfiles de partículas lipoproteínicas son diferentes para diferentes individuos y para el mismo individuo en momentos diferentes. Los quilomicrones se producen en el intestino y transportan la grasa digerida a los tejidos. La lipoproteína lipasa hidroliza el triacilgilcerol para formar ácidos grasos. Los quilomicrones son una de las partículas dinámicas más grandes. La VLDL se forma a partir de ácidos grasos libres tras el metabolismo de los quilomicrones en el hígado. La lipoproteína lipasa hidroliza el triacilgilcerol para formar ácidos grasos. La IDL es el triacilglicerol no hidrolizado de VLDl . La IDL se convierte en LDL debido a la lipasa hepática. La HDL desempeña una función en la transferencia del colesterol al hígado desde tejidos periféricos. La HDL se sintetiza en el hígado y los intestinos.

Las partículas LDL se unen a receptores de LDL. Tras la unión al receptor, la LDL se retira de la sangre. Las células usan el colesterol dentro de la LDL para las membranas y la síntesis de hormonas. La LDL deposita el colesterol LDL en la pared arterial, lo que contribuye al desarrollo de enfermedades cardiovasculares. La LDL provoca inflamación cuando se acumula dentro de una pared arterial. Los macrófagos se ven atraídos a la inflamación y se convierten en macrófagos espumosos cuando captan la LDL, provocando más inflamación. La LDL más densa, más pequeña, contiene más éster de colesterol que la LDL dinámica más grande.

La estructura de las partículas de lipoproteína(a) (LP(a)-P) es la de una partícula similar a LDL con apolipoproteína A unida a apolipoproteína B por un enlace disulfuro. Las partículas de lipoproteína(a) parecen desempeñar una función en la coagulación y pueden estimular a los inmunocitos para que depositen el colesterol en las paredes arteriales. Un alto nivel de lipoproteína(a)-P indica un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares. Específicamente, un alto nivel de una banda de Lp(a)-P más catódica, de migración más lenta, puede ser un indicador de mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares, ya que puede estar asociado con la isoforma de Lp(a)-P más aterógena. Por lo tanto, Lp(a)-P es útil en la evaluación diagnóstica y de riesgos estadísticos. Lp(a)-P puede servir para facilitar el depósito de placas de LDL-P. Los niveles de Lp(a)-P están aumentados en acontecimientos aterógenos.

Lp(a)-P puede tener un vínculo entre trombosis y ateroesclerosis, impidiendo la función del plasminógeno en la cascada fibrinolítica. Numerosos estudios han documentado la relación de altas concentraciones plasmáticas de Lp(a)-P con diversos trastornos cardiovasculares, incluyendo vasculopatía periférica, enfermedad cerebrovascular y coronariopatía prematura. Un amplio estudio en americanos ancianos, en particular, demostró que niveles elevados de Lp(a)-P predicen independientemente un riesgo aumentado de apoplejía, muerte por vasculopatía y muerte por todas las causas en hombres (véase Fried et al., "The Cardiovascular Health Study: Design and Rationale", Ann. Epidemiol. 3:263-76 (1991)).

El colesterol de lipoproteína de baja densidad, (LDL-C) se ha usado para medición para evaluar el riesgo cardiovascular. Sin embargo, debido a la variabilidad de HDL-C, Apo B es una mejor medida del número de partículas LDL (LDL-P) en circulación y, por lo tanto, un indicador más fiable de riesgo que el LDL-C tradicional porque hay una estequiometría 1:1 de Apo B y partículas LDL. La suma de Apo B total incluye, aunque sin limitación, el complemento Apo B de LDL-P (partículas dinámicas grandes y partículas densas pequeñas), VLDL+IDL+Lp(a)+quilomicrones. La medición de los niveles de Apo B y las partículas lipoproteínicas asociadas proporciona información adicional sobre el riesgo de cardiopatía ateroesclerótica más allá de la de las mediciones individuales o los ensayos tradicionales de LDL-C. La medición de los niveles plasmáticos de insulina en ayunas y el tamaño de partículas LDL también proporciona información útil.

También pueden detectarse variantes oxidadas de las lipoproteínas indicadas anteriormente. Las variantes oxidadas de lipoproteínas contribuyen al desarrollo de aterogénesis, dando lugar la oxidación a calcio intracelular aumentado, producción de energía reducida, activación de citocinas, daño a la membrana, provocando todo ello apoptosis, necrosis y, por último, muerte celular. La oxidación normalmente comienza cuando un radical reactivo extrae un átomo de hidrógeno de un ácido graso poliinsaturado en la partícula LDL. Se forman radicales peroxilo y alcoxilo lipídicos, que a su vez pueden iniciar la oxidación en ácidos grasos adyacentes, provocando la propagación de la peroxidación lipídica. Estas formas oxidadas de lipoproteínas se absorben por los macrófagos más rápidamente que las lipoproteínas naturales y esto provoca acumulación de colesterol en los macrófagos y la posterior formación de macrófagos espumosos e inhibición de la motilidad de los macrófagos de los tejidos y las células endoteliales. Esta cascada de acontecimientos provoca disfunción vascular y formación y activación de lesiones ateroescleróticas.

Los métodos para evaluar las cantidades o tamaños de una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas esféricas o sustancialmente esféricas presentes en una muestra biológica y las realizaciones preferidas se han analizado en las realizaciones anteriores, y todos son adecuados para determinar el riesgo de enfermedades cardiovasculares y cardiodiabetes.

Una vez se han determinado las cantidades o tamaños de las partículas lipoproteínicas, también pueden determinarse las cantidades de determinados componentes o partes de las partículas lipoproteínicas basándose en su relación estequiométrica con las partículas lipoproteínicas. Por ejemplo, las apolipoproteínas son el componente proteínico de las partículas lipoproteínicas y tienen una relación estequiométrica con las partículas lipoproteínicas. Por tanto, las cantidades de apolipoproteína pueden estimarse basándose en las cantidades o tamaños evaluados de las partículas lipoproteínicas.

Las partículas lipoproteínicas o partes de las mismas a evaluar para determinar el riesgo de enfermedades cardiovasculares y cardiodiabetes incluyen, aunque sin limitación, apolipoproteína A, apolipoproteína B, apolipoproteína C, apolipoproteína D, apolipoproteína E, apolipoproteína H, LP(a), HDL, IDL, LDL, VLDL, quilomicrones, lipoproteína X, variantes oxidadas o mezclas de las mismas. Partículas lipoproteínicas o partes de las mismas a modo de ejemplo a evaluar son apolipoproteína B, LP(a), HDL, IDL, LDL, VLDL, variantes oxidadas o mezclas de las mismas.

El método para determinar el riesgo de enfermedades cardiovasculares o cardiodiabetes puede comprender evaluar los niveles de las diferentes apolipoproteínas y/o partículas lipoproteínicas presentes en la muestra biológica. En una realización, al menos una de las partículas lipoproteínicas o partes de las mismas evaluadas es LDL oxidada. En una realización, al menos una de las partículas lipoproteínicas o partes de las mismas evaluadas es apolipoproteína B.

Las partículas lipoproteínicas o partes de las mismas a evaluar para determinar el riesgo de enfermedades cardiovasculares y cardiodiabetes pueden comprender al menos apolipoproteína B y LDL. Por ejemplo, un nivel elevado de apolipoproteína B y LDL-P indica que un individuo tiene riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares.

Las partículas lipoproteínicas o partes de las mismas a evaluar para determinar el riesgo de enfermedades cardiovasculares y cardiodiabetes pueden comprender al menos apolipoproteína B y la isoforma LP(a). Por ejemplo, un nivel elevado de apolipoproteína B y el tipo de isoforma LP(a) indica que un individuo tiene riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares.

Determinar enfermedades cardiovasculares relacionadas con lípidos y/o cardiodiabetes a partir de sus correlaciones con las cantidades y tamaño de la una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas o parte de las mismas se refiere a una correlación estadística de la concentración y distribución de tamaños de lipoproteínas resultante con la mortalidad de la población y factores de riesgo, como se conoce en la técnica. La determinación en el contexto de vigilancia de enfermedades cardiovasculares y cardiodiabetes (por ejemplo, para la sensibilidad a intervención terapéutica) se refiere a la comparación de la concentración y distribución de tamaños de lipoproteínas en dos puntos temporales (por ejemplo, antes y después de realizar una intervención terapéutica).

La determinación puede incluir correlacionar los niveles determinados de las diferentes apolipoproteínas y/o partículas lipoproteínicas con un valor de control o de referencia para determinar si el sujeto está en riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes.

La determinación también puede incluir asignar el sujeto a una categoría de riesgo seleccionada del grupo que consiste en grupos de alto riesgo, riesgo intermedio y bajo riesgo (u óptimo) para desarrollar o tener enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes. Hay recomendaciones bien establecidas para los valores de corte para marcadores bioquímicos (por ejemplo, y sin limitación, niveles de colesterol y lipoproteínas) para determinar el riesgo. Por ejemplo, la unión/detección de anti-ApoB puede correlacionarse con estimulaciones de corte para asignar una categoría de riesgo basándose en Lp(a)-P y l DL-P. Por ejemplo, los valores de corte para asignar dichas categorías de riesgo pueden ser los siguientes: Lp(a)-P: <75 nmol/l óptimo, 76-125 nmol/l riesgo intermedio, >126 nmol/l alto riesgo; LDL-P: <1000 nmol/l óptimo, 1000-1299 nmol/l riesgo intermedio, >1300 nmol/l alto riesgo.

Las dos o más diferentes partículas lipoproteínicas o partes de las mismas anteriores pueden comprender al menos ApoB y LDL. Un nivel elevado de apolipoproteína B y partículas LDL detectado indica que un individuo tiene riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares. Como hay una estequiometría 1:1 entre ApoB y VLDL, un nivel elevado de ApoB está aritméticamente relacionado con VLDL-P.

El método para determinar el riesgo de enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes puede comprender además vigilar el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes. La vigilancia también puede evaluar el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes. Este método implica determinar si el sujeto está en riesgo elevado de desarrollar enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes, lo que puede incluir asignar el sujeto a una categoría de riesgo seleccionada del grupo que consiste en grupos de alto riesgo, riesgo intermedio y bajo riesgo (es decir, óptimo) para desarrollar o tener enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes. Este método también implica repetir la determinación si el sujeto está en riesgo elevado de desarrollar enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes después de un periodo de tiempo (por ejemplo, antes y después de tratamiento). El método también puede implicar comparar la primera y segunda categoría de riesgo obtenidas en diferente periodo de tiempo; y determinar, basándose en la comparación, si el riesgo del sujeto de desarrollar enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes ha aumentado o disminuido, vigilando de ese modo el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes.

El método para determinar el riesgo de enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes puede comprender una etapa adicional de separar el colesterol esterificado y/o los triglicéridos de cada partícula esférica o sustancialmente esférica aislada. La cantidad de colesterol esterificado y/o triglicéridos en cada partícula lipoproteínica aislada puede medirse entonces usando el método de medición del colesterol o triglicéridos conocido por los expertos en la materia.

Esta cantidad medida del colesterol esterificado y/o triglicéridos de las partículas lipoproteínicas entonces puede compararse con un valor de control o de referencia para determinar si el sujeto está en riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares.

Pauta terapéutica

Después de determinar que el sujeto está en riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares y/o cardiodiabetes, puede seleccionarse una pauta terapéutica/de tratamiento basándose en el riesgo elevado.

La pauta terapéutica seleccionada puede comprender administrar fármacos o complementos. Por ejemplo, el fármaco puede ser un agente antiinflamatorio, un agente antitrombótico, un agente antiplaquetario, un agente fibrinolítico, un agente reductor de lípidos, un inhibidor directo de la trombina, un inhibidor del receptor de glucoproteína IIb/IIIa, un agente que se une a moléculas de adhesión celular e inhibe la capacidad de los glóbulos blancos de fijarse en dichas moléculas, un bloqueante de los canales de calcio, un bloqueante de los receptores beta-adrenérgicos, un inhibidor del sistema de angiotensina, una glitazona, un análogo de GLP-1, tiazolidinadiononas, biguanidas, neglitinidas, inhibidores de alfa glucosidasa, una insulina, un inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV, metformina, una sulfonurea, fármacos diabéticos peptidílicos tales como pramlintida y exenatida, o combinaciones de los mismos.

Una pauta terapéutica incluye, por ejemplo, fármacos o complementos. El fármaco o complemento puede ser cualquier fármaco o complemento útil para el tratamiento o prevención de la diabetes y enfermedades cardiovasculares relacionadas. Ejemplos de agentes adecuados incluyen un agente antiinflamatorio, un agente antitrombótico, un agente antiplaquetario, un agente fibrinolítico, un agente reductor de lípidos, un inhibidor directo de la trombina, un inhibidor del receptor de glucoproteína IIb/IIIa, un agente que se une a moléculas de adhesión celular e inhibe la capacidad de los glóbulos blancos de fijarse en dichas moléculas, un inhibidor de PCSK9, un inhibidor de MTP, mipmercina, un bloqueante de los canales de calcio, un bloqueante de los receptores beta-adrenérgicos, un inhibidor del sistema de angiotensina, una glitazona, un análogo de GLP-1, tiazolidinadiononas, biguanidas, neglitinidas, inhibidores de alfa glucosidasa, una insulina, un inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV, metformina, una sulfonurea, fármacos diabéticos peptidílicos tales como pramlintida y exenatida, o combinaciones de los mismos. El agente se administra en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o trastorno cardiovascular o para reducir el riesgo del sujeto de desarrollar una futura enfermedad o trastorno cardiovascular.

Una pauta terapéutica también puede incluir el tratamiento de infecciones crónicas tales como UTI, infecciones del sistema reproductor y periodontopatías. Los tratamientos pueden incluir antibióticos apropiados y/u otros fármacos, y procedimientos quirúrgicos y/o dentífrico para el tratamiento de periodontopatías.

Una pauta terapéutica puede incluir la remisión a un especialista sanitario o especialista relacionado basándose en la determinación de los niveles de riesgo. La determinación puede provocar la remisión a un cardiólogo, endocrinólogo, oftalmólogo, lipidólogo, especialista de adelgazamiento, nutricionista titulado, "entrenador en salud", entrenador personal, etc. La intervención terapéutica adicional por los especialistas basándose en la determinación puede adoptar la forma de cateterismo cardiaco, stents, obtención de imágenes, cirugías de derivación coronaria, EKG, ecografía Doppler, ensayo y ajustes hormonales, regímenes de adelgazamiento, cambios en la rutina de ejercicios, la dieta y otros hábitos de estilo de vida personal.

Los agentes antiinflamatorios incluyen, aunque sin limitación, aldlofenaco; dipropionato de aldlometasona; algestona acetonida; alfa amilasa; amcinafal; amcinafida; amfenaco sódico; clorhidrato de amiprilosa; anakinra; anirolaco; anitrazafeno; apazona; balsalazida disódica; bendazaco; benoxaprofeno; clorhidrato de bencidamina; bromelaínas; broperamol; budesonida; carprofeno; cicloprofeno; cintazona; cliprofeno; propionato de clobetasol; butirato de clobetasona; clopiraco; propionato de cloticasona; acetato de cormetasona; cortodoxona; deflazacort; desonida; desoximetasona; dipropionato de dexametasona; diclofenaco potásico; diclofenaco sódico; diacetato de diflorasona; diflumidona sódica; diflunisal; difluprednato; diftalona; dimetilsulfóxido; drocinonida; endrisona; enlimomab; enolicam sódico; epirizol; etodolaco; etofenamato; felbinaco; fenamol; fenbufeno; fenclofenaco; fencloraco; fendosal; fenpipalona; fentiazaco; flazalona; fluazacort; ácido flufenámico; flumizol; acetato de flunisolida; flunixina; flunixina meglumina; butilo de fluocortina; acetato de fluorometolona; flucuazona; flurbiprofeno; fluretofeno; propionato de fluticasona; furaprofeno; furobufeno; halcinonida; propionato de halobetasol; acetato de halopredona; ibufenaco; ibuprofeno; ibuprofeno de aluminio; ibuprofeno piconol; ilonidap; indometacina; indometacina sódica; indoprofeno; indoxol; intrazol; acetato de isoflupredona; isoxepaco; isoxicam; ketoprofeno; clorhidrato de lofemizol; lomoxicam; etabonato de loteprednol; meclofenamato sódico; ácido meclofenámico; dibutirato de meclorisona; ácido mefenámico; mesalamina; meseclazona; suleptanato de metilprednisolona; momiflumato; nabumetona; naproxeno; naproxeno sódico; naproxol; nimazona; olsalazina sódica; orgoteína; orpanoxina; oxaprozina; oxifenbutazona; clorhidrato de paranilina; polisulfato de pentosano sódico; glicerato sódico de fenbutazona; pirfenidona; piroxicam; cinamato de piroxicam; piroxicam olamina; pirprofeno; prednazato; prifelona; ácido prodólico; procuazona; proxazol; citrato de proxazol; rimexolona; romazarit; salcolex; salnacedina; salsalato; salicilatos; cloruro de sanguinarina; seclazona; sermetacina; sudoxicam; sulindaco; suprofeno; talmetacina; talniflumato; talosalato; tebufelona; tenidap; tenidap sódico; tenoxicam; tesicam; tesimida; tetridamina; tiopinaco; pivalato de tixocortol; tolmetina; tolmetina sódica; triclonida; triflumidato; zidometacina; glucocorticoesteroides; zomepiraco sódico.

Los agentes antitrombóticos y/o fibrinolíticos incluyen, aunque sin limitación, plasminógeno (para plasmina mediante interacciones de precalicreína, cininógenos, factores XII, XHIa, proactivador de plasminógeno y activador tisular del plasminógeno [TPA]) estreptocinasa; urocinasa: complejo activador de plasminógeno anisoilado-estreptocinasa; prourocinasa; (Pro-UK); rTPA (alteplasa o activasa; r indica recombinante); rPro-UK; abocinasa; eminasa; clorhidrato de anagrelida sreptasa; bivalirudina; dalteparina sódica; danaparoid sódico; clorhidrato de dazoxibeno; sulfato de efegatrano; enoxaparina sódica; ifetrobano; ifetrobano sódico; tinzaparina sódica; retaplasa; trifenagrel; warfarina; dextranos; heparina.

Los agentes antiplaquetarios incluyen, aunque sin limitación, clopridogrel; sulfinpirazona; aspirina; dipiridamol; clofibrato; carbamato de piridinol; p GE; glucagón; fármacos antiserotonina; cafeína; teofilina pentoxifilina; ticlopidina; anagrelida.

Los agentes reductores de lípidos incluyen, aunque sin limitación, gemfibrozilo, colistiramina, colestipol, ácido nicotínico, probucol lovastatina, fluvastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina, cerivastatina y otros inhibidores de la HMG-CoA reductasa.

Los inhibidores directos de la trombina incluyen, aunque sin limitación, hirudina, hirugen, hirulog, agatroban, PPACK, aptámeros de trombina.

Los inhibidores del receptor de glucoproteína IIb/IIIa son tanto anticuerpos como distintos de anticuerpos, e incluyen, aunque sin limitación, ReoPro (abcixamab), lamifiban, tirofiban.

Los bloqueantes de los canales de calcio son una clase químicamente diversa de compuestos que tienen valor terapéutico importante en el control de diversas enfermedades incluyendo varios trastornos cardiovasculares, tales como hipertensión, angina y arritmias cardiacas. Los bloqueantes de los canales de calcio son un grupo heterogéneo de fármacos que evitan o ralentizar la entrada de calcio en células regulando los canales celulares de calcio (REMINGTON, THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (vigesimoprimera edición, Mack Publishing Company, 2005)). La mayoría de los bloqueantes de los canales de calcio actualmente disponibles pertenecen a uno de tres grupos químicos principales de fármacos, las dihidropiridinas, tales como nifedipina, las fenil alquil aminas, tales como verapamilo, y las benzotiazepinas, tal como diltiazem. Otros bloqueantes de los canales de calcio incluyen, aunque sin limitación, anrinona, amlodipino, benciclano, felodipino, fendilina, flunarizina, isradipino, nicardipino, nimodipino, perhexileno, gallopamilo, tiapamilo y análogos de tiapamilo (tales como 1993RO-11-2933), fenitoína, barbituratos y los péptidos dinorfina, omega-conotoxina y omega-agatoxina, y similares y/o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Los agentes bloqueantes de los receptores beta-adrenérgicos son una clase de fármacos que antagonizan los efectos cardiovasculares de las catecolaminas en angina de pecho, hipertensión y arritmias cardiacas. Los bloqueantes de los receptores beta-adrenérgicos incluyen, aunque sin limitación, atenolol, acebutolol, alprenolol, beftunolol, betaxolol, bunitrolol, carteolol, celiprolol, hedroxalol, indenolol, labetalol, levobunolol, mepindolol, metipranol, metindol, metoprolol, metrizoranolol, oxprenolol, pindolol, propranolol, practolol, practolol, sotalolnadolol, tiprenolol, tomalolol, timolol, bupranolol, penbutolol, trimepranol, HCl de 2-(3-(1, 1 -dimetiletil) amino-2-hidroxipropoxi)-3-piridencarbonitrilo, 1-butilamino-3-(2,5-diclorofenoxi-)-2-propanol, 1-isopropilamino-3-(4-(2-ciclopropilmetoxietil)fenoxi)-2-propanol, 3-isopropilamino-1-(7-metilindan-4-iloxi)-2-butanol, 2-(3-t-butilamino-2-hidroxi-propiltio)-4-(5-carbamoil-2-tienil)tiazol, 7-(2-hidroxi-3-t-butilaminpropoxi)ftalida. Los compuestos identificados anteriormente pueden usarse como mezclas isoméricas, o en su forma levógira o dextrógira respectiva.

Un inhibidor del sistema de angiotensina es un agente que interfiere con la función, síntesis o catabolismo de angiotensina II. Estos agentes serán conocidos por los expertos en la materia e incluyen, aunque sin limitación, inhibidores de enzima convertidora de la angiotensina ("ACE"), antagonistas de la angiotensina II, antagonistas del receptor de angiotensina II, agentes que activan el catabolismo de la angiotensina II y agentes que evitan la síntesis de angiotensina I a partir de la que finalmente deriva la angiotensina II. El sistema de renina-angiotensina está implicado en la regulación de la hemodinámica y el equilibrio de agua y electrolitos. Los factores que reducen el volumen sanguíneo, la presión de perfusión renal o la concentración de Na+ en plasma tienden a activar el sistema, mientras que los factores que aumentan estos parámetros tienden a suprimir su función.

Los inhibidores del sistema de angiotensina (renina-angiotensina) son compuestos que actúan impidiendo la producción de angiotensina II a partir de angiotensinógeno o angiotensina I o impidiendo la actividad de angiotensina II. Dichos inhibidores son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen compuestos que actúan inhibiendo las enzimas implicadas en la producción final de angiotensina II, incluyendo renina y ACE. También incluyen compuestos que impiden la actividad de angiotensina II, una vez producida. Ejemplos de clases de dichos compuestos incluyen anticuerpos (por ejemplo, contra renina), aminoácidos y análogos de los mismos (incluyendo los conjugados con moléculas más grandes), péptidos (incluyendo análogos peptídicos de angiotensina y angiotensina I), análogos relacionados con prorrenina, etc. Entre los inhibidores del sistema de renina-angiotensina más potentes y útiles están los inhibidores de renina, los inhibidores de ACE y los antagonistas de angiotensina II, que son bien conocidos por los expertos en la materia.

Ejemplos de fármacos que actúan impidiendo la interacción de PSK9 con los receptores de LDL incluyen Aln-PCS (Alnylam); REG 727 (Regeneron); y AMG-145 (Amgen).

Los fármacos y/o complementos (es decir, agentes terapéuticos) pueden administrarse mediante cualquier vía convencional de administración conocida en la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intratecal), oral (por ejemplo, alimenticia), tópica, transmucosa o por inhalación (por ejemplo, inhalación intrabronquial, intranasal u oral, gotas intranasales). Normalmente, la administración oral es el modo de administración preferido.

Una pauta terapéutica también puede incluir aportar recomendaciones sobre la toma y mantenimiento de elecciones de estilo de vida útiles para el tratamiento o prevención de la diabetes y enfermedades cardiovasculares basándose en los resultados del riesgo aumentado, determinado a partir de las cantidades y tamaño de las partículas lipoproteínicas o partes de las mismas y sus niveles de riesgo asociados en el sujeto. Las elecciones de estilo de vida pueden implicar cambios en la alimentación, cambios en el ejercicio, reducción o eliminación del tabaquismo, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, la pauta terapéutica puede incluir el control de la glucosa, el control del metabolismo de los lípidos, el control del adelgazamiento y el abandono del tabaco. Como se entenderá, la elección de estilo de vida es una que afectará al riesgo de desarrollar o tener enfermedad o trastorno cardiovascular (véase Haskell et al., "Effects of Intensive Multiple Risk Factor Reduction on Coronary Atherosclerosis and Clinical Cardiac Events in Men and Women with Coronary Artery Disease", Circulation 89(3):975-990 (1994); Ornish et al., "Intensive Lifestyle Changes for Reversal of Coronary Heart Disease", JAMA 220(23):2001-2007 (1998); y Wister et al., "Oneyear Follow-up of a Therapeutic Lifestyle Intervention Targeting Cardiovascular Disease Risk", CMAJ 177(8):859-865 (2007)).

Las recomendaciones puede proporcionarlas un profesional sanitario tal como un médico, enfermera, asesor sanitario, dietista u otro profesional sanitario capacitado. El profesional sanitario puede repetir la interacción con un paciente después de un periodo de tiempo para reforzar las recomendaciones y vigilar el progreso.

Pueden generarse informes basados en los resultados de determinación del riesgo de diabetes y enfermedades cardiovasculares relacionadas del sujeto. Los informes pueden incluir pautas terapéuticas sugeridas basadas en el riesgo de diabetes y enfermedades cardiovasculares del sujeto. Este informe puede transmitirse o distribuirse a un médico del paciente o directamente al paciente. Después de transmitir o distribuir el informe, al sujeto se le puede orientar o aconsejar basándose en las recomendaciones de tratamiento.

Los métodos de acuerdo con la divulgación pueden implicar también administrar la pauta terapéutica seleccionada al sujeto. Por consiguiente, la divulgación también se refiere a métodos de tratamiento de un sujeto para reducir el riesgo de una enfermedad o un trastorno cardiovascular.

Tratar al sujeto implica administrar al sujeto un agente adecuado para tratar la diabetes o una enfermedad o trastorno cardiovascular o para reducir el riesgo de un sujeto de desarrollar una futura diabetes o enfermedad o trastorno cardiovascular. Los agentes adecuados incluyen un agente antiinflamatorio, un agente antitrombótico, un agente antiplaquetario, un agente fibrinolítico, un agente reductor de lípidos, un inhibidor directo de la trombina, un inhibidor del receptor de glucoproteína 11 b/111 a, un agente que se une a moléculas de adhesión celular e inhibe la capacidad de los glóbulos blancos de fijarse en dichas moléculas, un inhibidor de PCSK9, un inhibidor de MTP, mipmercina, un bloqueante de los canales de calcio, un bloqueante de los receptores beta-adrenérgicos, un inhibidor del sistema de angiotensina, una glitazona, un análogo de GLP-1, tiazolidinadiononas, biguanidas, neglitinidas, inhibidores de alfa glucosidasa, una insulina, un inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV, metformina, una sulfonurea, fármacos diabéticos peptidílicos tales como pramlintida y exenatida, o combinaciones de los mismos. El agente se administra en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o trastorno cardiovascular o para reducir el riesgo del sujeto de desarrollar una futura enfermedad o trastorno cardiovascular.

La vigilancia también puede evaluar el riesgo de desarrollar diabetes y enfermedades cardiovasculares. Este método implica determinar si el sujeto está en riesgo elevado de desarrollar diabetes y enfermedades cardiovasculares, lo que puede incluir asignar el sujeto a una categoría de riesgo seleccionada del grupo que consiste en grupos de alto riesgo, riesgo intermedio y bajo riesgo (es decir, óptimo) para desarrollar o tener diabetes o enfermedades cardiovasculares.

Este método también implica repetir la determinación de si el sujeto está en riesgo elevado de desarrollar diabetes y enfermedades cardiovasculares después de un periodo de tiempo (por ejemplo, antes y después de tratamiento). El método también puede implicar comparar la primera y segunda categoría de riesgo obtenidas en diferente periodo de tiempo, y determinar, basándose en la comparación, si el riesgo del sujeto de desarrollar diabetes y enfermedades cardiovasculares ha aumentado o disminuido, vigilando de ese modo el riesgo de desarrollar diabetes y enfermedades cardiovasculares.

Sistema para evaluar partículas lipoproteínicas y riesgo de enfermedades cardiovasculares

Los métodos descritos en este documento pueden implementarse usando cualquier dispositivo que pueda implementar los métodos. Los ejemplos de dispositivos que pueden usarse incluyen, aunque sin limitación, dispositivos informáticos electrónicos, incluyendo ordenadores de todos los tipos. Cuando los métodos se implementan en un ordenador, el programa informático que puede usarse para configurar el ordenador para realizar las etapas de los métodos puede estar contenido en cualquier medio legible por ordenador que pueda contener el programa informático.

Por ejemplo, el sistema informático para evaluar cantidades o tamaños de una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas en una muestra biológica puede comprender opcionalmente, un módulo de aislamiento configurado para aislar una o más clases o subclases de partículas lipoproteínicas de los componentes no lipoproteínicos en la muestra biológica, o para aislar las partículas lipoproteínicas en dos o más clases o subclases. El sistema informático puede comprender un módulo de separación configurado para separar al menos uno de colesterol libre y fosfolípido de las partículas lipoproteínicas. El sistema informático también puede comprender un módulo de medición configurado para producir una señal detectable de un ensayo que indique la cantidad de al menos uno de colesterol libre y fosfolípido. El sistema informático puede comprender además un módulo de cálculo configurado para determinar las cantidades o tamaños de las partículas lipoproteínicas basándose en la cantidad medida de al menos uno de colesterol libre y fosfolípido, y un parámetro predeterminado necesario para el cálculo. Opcionalmente, el sistema informático puede comprender un módulo de almacenamiento configurado para almacenar información producida por el módulo de cálculo. Opcionalmente, el sistema informático puede comprender un módulo de salida para presentar la información producida por el módulo de cálculo, o generar un informe a partir de la información producida para el usuario.

El módulo de medición o el módulo de separación pueden comprender un ensayo que está automatizado en un equipo robótico.

El módulo de cálculo puede comprender un programa informático para automatizar la determinación de cantidades o tamaños de las partículas lipoproteínicas.

El módulo de cálculo también puede comprender un programa informático para usar un algoritmo derivado empíricamente que se determina experimentalmente a partir de los estudios de poblaciones que relacionan cantidades o tamaños de al menos uno de colesterol libre y fosfolípido con los tamaños o números de partículas lipoproteínicas, para calcular parámetros predeterminados (por ejemplo, tamaño de partícula, cuando se evalúan las cantidades de las partículas lipoproteínicas; y número de partículas cuando se evalúa el tamaño de las partículas lipoproteínicas).

El programa informático, incluyendo los niveles o tamaños de referencia de diferentes clases y/o subclases de partículas lipoproteínicas y factores cardiovasculares, y parámetros predeterminados (por ejemplo, tamaños de partícula y/o números de partículas predeterminados) puede estar contenido en un medio legible por ordenador. Los ejemplos del medio legible por ordenador que puede usarse incluyen, aunque sin limitación, disquetes, CD-ROM, DVD, ROM, RAM y otros dispositivos de memoria y almacenamiento informático.

El sistema informático que puede usarse para configurar el ordenador para realizar las etapas de los métodos también puede proporcionarse en una red electrónica, por ejemplo, en Internet, la multimalla mundial, una intranet u otra red. También puede descargarse a un ordenador u otro dispositivo electrónico tal como un ordenador portátil, listófono, ipad o la red IT en el departamento del proveedor. Una aplicación a modo de ejemplo que realiza las etapas de los métodos descargable a un ordenador o a un listófono (tal como iphone o ipad) se ha descrito en detalle en la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 61/747.505, titulada, "Biomarker Bliki", presentada el 31 de diciembre de 2012 y la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 14/144.269, presentada el 30 de diciembre de 2013.

Referencias:

1. Publicación de solicitud de Estados Unidos n.° 2008/0038829 A1 Process for the determination of lipoproteins in body fluids. Kremer et al./LipoFIT Analytic GhmbH.

2. Solicitud de Estados Unidos n.° 12/861.829 Assay for Determination of levels of Lipoprotein Particles in Bodily Fluids Guadagno et al./Helena HDL Inc. (que incluye tamaño de partículas)

3. Circulation. 2002; 106: 1930-1937; LDL Particle concentration and size as determined by NMR spectroscopy as predictors of CVD in Women

4. Clin Chem 54:8; 1307-1316 (2008). Direct determination of lipoprotein particle sizes and concentrations by Ion Mobility Analysis

5. ClinChem 2004.032383 Tech Briefs. Rapid, Simple Laser-Light Scattering method for HDL particle sizing in whole plasma

6. Circulation. 2009;119:2396-2404. Advanced Lipoprotein Testing andsubfractionation are not (yet) ready for routine clinical use. (proporciona referencias para protocolos de gel en gradiente y ultracentrifugación).

7. Solicitudes provisionales de Estados Unidos n.° 61/651.975 y 61/770.406 de Health Diagnostic Laboratory, Inc, tituladas "FLUORESCENT IN-SITU DETECTION OF LIPID PARTICLE APOLIPOPROTEINS WITHIN PRIMARY ELECTROPHORETIC MATRIX".

8. Solicitudes provisionales de Estados Unidos n.° 61/779.567 y 61/652.608 de Health Diagnostic Laboratory, Inc, tituladas "COMPOSITION AND METHOD FOR IN SITU CALIBRATION FOR GEL ELECTROPHORESIS."

Tabla 1. Datos demostrativos preliminares. Para 3 grupos de números de partículas de RMN medidos por RMN (bajo < 25, intermedio 33-34 y alto > 42), se seleccionaron 5 muestras de suero humano por grupos aleatoriamente de extracciones de sangre del 9-10 de octubre de 2012. Para cada muestra, se midió FC. Usando la cantidad medida de FC en HDL-P total y un diámetro promedio de partícula para HDL-P, se estimó el número de HDL-P usando los cálculos descritos en esta divulgación y los valores calculados de HDL-P se compararon con las mediciones de RMN reales de HDL-P para las muestras. Los resultados muestran una excelente concordancia entre la HDL-P calculada y las mediciones por RMN de HDL-P, lo que demuestra la viabilidad técnica de la divulgación descrita en este documento. Indica un solo valor atípico y, de forma interesante, esta muestra de paciente tuvo el valor de FC más alto de cualquiera de las 15 muestras ensayadas, lo que indica que el recuento de HDL-P debe ser teóricamente el más alto en este grupo, sugiriendo, por lo tanto, que el número de partículas calculado varía en la dirección correcta y puede ser más exacto que la RMN

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para evaluar las cantidades de una o más de partículas lipoproteínicas de lipoproteína de alta densidad (HDL), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), lipoproteína de densidad intermedia (IDL) y lipoproteína (a) (Lp(a)) presentes en una muestra biológica, que comprende:

aislar las partículas lipoproteínicas HDL, LDL, VLDL, IDL y Lp(a) de los componentes no lipoproteínicos de la muestra biológica, para generar partículas lipoproteínicas HDL, LDL, VLDL, IDL y Lp(a) aisladas;

separar al menos uno de colesterol libre y fosfolípido de las partículas lipoproteínicas HDL, LDL, VLDL, IDL y Lp(a) aisladas;

medir la cantidad del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido que se ha separado de una o más de las partículas lipoproteínicas HDL; LDL, VLDL, IDL y Lp(a) aisladas; y

determinar las cantidades de una o más de partículas lipoproteínicas HDL, LDL, VLDL, IDL y Lp(a) basándose en el diámetro o los radios de la partícula lipoproteínica y la cantidad medida de colesterol libre o fosfolípido.

2. El método de la reivindicación 1,

(i) en donde el método comprende además, antes de la etapa de separación, aislar las partículas lipoproteínicas en dos o más clases y/o subclases, en donde la posterior etapa de separación se realiza sobre una o más partículas lipoproteínicas en una o más de las clases y/o subclases aisladas,

(ii) en donde la separación del colesterol libre de las partículas lipoproteínicas HDL, LDL, VLDL, IDL y Lp(a) aisladas se realiza sometiendo las partículas lipoproteínicas a una colesterol oxidasa, o en donde no se usa una colesterol esterasa en la separación de colesterol libre de las partículas lipoproteínicas HDL, LDL, VLDL, IDL y Lp(a) aisladas, por lo que el colesterol esterificado en el núcleo de la partícula lipoproteínica no se libera como colesterol libre, (iii) en donde la muestra biológica es matriz biológica humana, fracción lipoproteínica humana, componente sanguíneo, orina, plasma, suero, líquido sinovial o líquido ascítico.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la etapa de aislamiento de las partículas lipoproteínicas en dos o más clases y/o subclases comprende:

aislar partículas HDL de las partículas que no son HDL, midiéndose el al menos uno de colesterol libre y fosfolípido separados de las partículas HDL aisladas para determinar las cantidades de las partículas HDL.

4. El método de la reivindicación 3, en el que las partículas HDL se aíslan de las partículas que no son HDL por precipitación con un precipitante, tal como sulfato de dextrano.

5. El método de la reivindicación 3, que comprende además

fraccionar las partículas HDL aisladas en una o más subclases, midiéndose el al menos uno de colesterol libre y fosfolípido separado de cada partícula de la subclase de HDL fraccionada para determinar la cantidad de la partícula de la subclase de HDL fraccionada,

opcionalmente en donde la subclase de HDL comprende una o más de HDL-1, HDL-2 y HDL-3.

6. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 5, en el que alguna o las dos etapas de aislamiento, o el fraccionamiento, se realiza por precipitación, electroforesis, centrifugación, ultracentrifugación, uso de un tensioactivo, uso de un detergente o una combinación de los mismos,

opcionalmente en el que el fraccionamiento por precipitación se realiza en etapas secuenciales, precipitando una partícula de la subclase de HDL cada vez.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el aislamiento de las partículas lipoproteínicas se realiza por electroforesis para aislar todas o casi todas las clases de las partículas lipoproteínicas de las componentes no lipoproteínicos en la muestra biológica, y para aislar diferentes clases o subclases de las partículas lipoproteínicas entre sí simultáneamente y,

opcionalmente, en donde el gel electroforético resultante para cada partícula lipoproteínica aislada se usa para medir la cantidad del al menos uno de colesterol libre y fosfolípido en la partícula lipoproteínica, por lo que las cantidades de todas las clases o subclases aisladas de las partículas lipoproteínicas pueden determinarse simultáneamente o casi simultáneamente y, opcionalmente, en donde las partículas lipoproteínicas determinadas simultáneamente comprenden dos o más clases o subclases diferentes de partículas lipoproteínicas, o en el que las partículas lipoproteínicas determinadas simultáneamente comprenden dos o más de h DL-P, VLDL-P, IDL-P y LDL-P.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación se basa en algoritmos derivados empíricamente, determinados experimentalmente a partir de estudios de poblaciones que relacionan las cantidades de al menos uno de colesterol libre y fosfolípido con los números de partículas lipoproteínicas.

9. El método de la reivindicación 1, en el que se predeterminan el diámetro o los radios de las partículas lipoproteínicas; y la etapa de determinación se basa en la cantidad medida de al menos uno de colesterol libre y fosfolípido y el diámetro o radios predeterminados, opcionalmente en el que el diámetro o radios de las partículas lipoproteínicas se predeterminan basándose en la estimación teórica o se predeterminan basándose en la medición experimental de los tamaños promedio de las clases y subclases de las partículas lipoproteínicas en un individuo o en una población de individuos.

10. El método de la reivindicación 2(i), en el que la etapa de aislamiento de las partículas lipoproteínicas en dos o más clases y/o subclases comprende:

aislar partículas LDL de las partículas que no son LDL, en donde se mide el al menos uno de colesterol libre y fosfolípido separado de las partículas LDL aisladas para determinar las cantidades de las partículas LDL; opcionalmente que comprende además:

fraccionar las partículas LDL aisladas en una o más subclases, en donde se mide el al menos uno de colesterol libre y fosfolípido separado de cada partícula de la subclase de LDL fraccionada para determinar la cantidad de la partícula de la subclase de LDL fraccionada.