ES2832881T3

ES2832881T3 - Variantes de fibrinógeno gamma prima para su uso en el tratamiento de una infección

Info

Publication number: ES2832881T3
Application number: ES19722534T
Authority: ES
Inventors: Miranda Weggeman; Joseph Grimbergen; Jacob Koopman
Original assignee: Fibriant BV
Current assignee: Fibriant BV
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2019-04-24
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2039-04-24
Also published as: JP2021522336A; JP7320599B2; EP3618853A1; US20200199198A1; CA3066167A1; US11667694B2; WO2019207016A1; EP3618853B1; CN112105377A; AU2019258504A1; AU2019258504B2; DK3618853T3; US20210347853A1; CA3066167C

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, comprendiendo la composición un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia según SEQ ID NO. 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de fibrinógeno gamma prima para su uso en el tratamiento de una infección

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, al uso de variantes de fibrinógeno que comprenden una cadena gamma prima, en particular a su uso para prevenir o tratar infecciones.

Antecedentes de la invención

El fibrinógeno es una glucoproteína plasmática soluble y una molécula dimérica, que consiste en dos pares de tres cadenas polipeptídicas designadas Aa, Bp y y , que están conectadas por puentes disulfuro. Las tres cadenas polipeptídicas están codificadas por tres genes separados y se sintetizan individualmente a partir de 3 ARNm. El ensamblaje de las tres cadenas polipeptídicas (Aa, Bp y y) en su forma final como un dímero de seis cadenas (Aa, Bp, y) 2 ocurre en la luz del retículo endoplásmico (ER). La forma dominante madura del fibrinógeno humano en la circulación consiste en cadenas Aa que tienen 610 aminoácidos de longitud, cadenas Bp de 461 aminoácidos y cadenas y de 411 aminoácidos y se denomina fibrinógeno normal, fibrinógeno HMW, fibrinógeno natural (WT).

Sin embargo, se ha demostrado que el fibrinógeno circulante es una mezcla altamente heterogénea de varias variantes que ocurren en la sangre de todos los individuos sanos y son el resultado de una alteración en cualquiera de las cadenas Aa o cadenas Bp o cadenas y.

Una variante bien conocida del fibrinógeno, que es el resultado de corte y empalme alternativo, es la variante de fibrinógeno gamma prima plasmático (pFib y '). La variante de pFib y ' representa aproximadamente el 10-15 % del fibrinógeno total en el plasma humano. En la circulación, el pFib y ' está presente como un heterodímero en el que la mitad de la molécula de fibrinógeno dimérico contiene la cadena gamma como se encuentra en el fibrinógeno WT, y la otra mitad de la misma molécula de fibrinógeno contiene una cadena gamma de variante. En los seres humanos, la cadena gamma de variante en pFib y ' consiste en 427 aminoácidos (y427) en vez de 411 aminoácidos (y411) como se encuentra en el fibrinógeno WT. En la cadena y427, los cuatro aminoácidos terminales del carboxilo Ala-Gly-Asp-Val (AGDV) de la cadena y411 están sustituidos por un péptido 20-mero.

Más allá de desempeñar una función clave en el control de la hemorragia, el fibrinógeno puede servir de línea de defensa temprana para la protección de hospedadores limitando el crecimiento de patógenos y mediando en los mecanismos de defensa del hospedador contra los patógenos. Sin embargo, varios patógenos han desarrollado formas para interaccionar con el fibrinógeno hospedador para potenciar la virulencia de patógenos. Por ejemplo, S. aureus usa el factor de agrupamiento A (ClfA) anclado a la pared de la célula bacteriana para unirse al fibrinógeno que, supuestamente debido a su estructura dimérica, induce la agrupación dependiente de fibrinógeno de S. aureus en suspensión. El sitio de unión de ClfA en fibrinógeno se mapea con los extremos carboxilo del fibrinógeno y411 del fibrinógeno WT. La unión y el posterior agrupamiento de las bacterias, por ClfA y fibrinógeno, se considera un factor de virulencia importante de las bacterias y se ha estudiado en varios estudios el efecto para prevenir la unión de ClfA a las cadenas gamma de fibrinógeno. El documento de patente US 2011/0171285 desvela estudios in vitro con fibrinógenos de mamífero a los que no se puede unir el ClfA debido a que en ambas cadenas gamma se ha modificado la glutamina (Q) antes de la secuencia de AGDV del extremo carboxilo. Flick et al. (2013) Blood (121): 1783-1794 desvelan ratones transgénicos homocigóticos en los que se ha delecionado la secuencia de QAGDV en el extremo carboxilo en sus cadenas gamma de fibrinógeno (ratones Fib Yñ5/ñ5). Estos ratones mutantes tienen una supervivencia significativamente elevada en comparación con los ratones con fibrinógeno WT cuando se exponen a bacterias S. aureus.

Sin embargo, estos estudios usan moléculas que serían equivalentes al pFib y ' homodímero, que nunca se ha aislado del plasma. No es probable que cantidades suficientes de esta variante de fibrinógeno para uso médico se puedan obtener del plasma. Además, se establece el efecto del fibrinógeno modificado en ratones Fib Yñ5/ñ5 sobre la unión bacteriana, el agrupamiento y la virulencia sin la presencia de fibrinógeno WT y, por tanto, no demuestra que este enfoque fuera útil como producto terapéutico o profiláctico que es capaz de competir con el fibrinógeno WT normal del hospedador y todavía introducir un efecto clínicamente significativo en presencia de fibrinógeno WT.

Por consiguiente, sería deseable encontrar composiciones alternativas de fibrinógeno que estuvieran fácilmente disponibles, tuvieran un efecto sobre la virulencia bacteriana en presencia de fibrinógeno WT hospedador y, por tanto, fueran clínicamente significativas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 Extremo carboxilo de la cadena gamma de fibrinógeno WT humano (y411), según SEQ ID NO. 1. Está subrayado el motivo Gln-Ala-Gly-Asp-Val (QAGDV) en las posiciones 407-411.

Figura 2 El péptido 20-mero, según SEQ ID NO. 2, que sustituye AGDV en la cadena gamma de fibrinógeno gamma prima humano.

Figura 3 Extremo carboxilo de la cadena gamma prima humana (y427), según SEQ ID NO. 3.

Figura 4 Análisis de SDS-PAGE de preparaciones de fibrinógeno purificado a partir de plasma, carril 1: pFib total, carril 2: pFib y411/y411 y carril 3: pFib y427/y411 y fibrinógenos recombinantes, carril 4: rhFib y411/y411 y carril 5 rhFib y427/y427.

Figura 5 Adhesión de S. aureus USA 300 natural (WT) a fibrinógeno inmovilizado 5A) aislado de ratones, plasma humano y fibrinógeno recombinante; 5B) fibrinógeno WT (pFibY411/411), heterodímero de fibrinógeno gamma prima (pFibY427/411) y diversas mezclas de los mismos; 5C) fibrinógeno WT (pFibY411/411), homodímero de fibrinógeno gamma prima (rhFib y427/427) y diversas mezclas de los mismos.

Figura 6 Agrupamiento de S. aureus USA 300 WT inducido por 6A) fibrinógeno aislado de ratones, plasma humano y fibrinógeno recombinante; 6B) fibrinógeno WT (pFibY411/411), heterodímero de fibrinógeno gamma prima (pFibY427/411) y diversas mezclas de los mismos; 6C y 6D) fibrinógeno WT (pFibY411/411), homodímero de fibrinógeno gamma prima (rhFibY427/427) y diversas mezclas de los mismos, células de crecimiento exponencial y células en fase estacionaria, resp.

Figura 7 Perfiles de supervivencia de ratones con fibrinógeno WT (Fib ^ywt/^wt) heterocigóticos (Fib YWT/ñ5) y homocigóticos (Fib Yñ5/ñ5) ratones delta 5 con fibrinógeno transgénicos expuestos a 7A) 2,0x108 UFC; 7B) 6,0x108 UFC y 7C) 7,0 x 108 UFC de S. aureus USA 300 WT.

Figura 8 Perfiles de supervivencia de ratones deficientes en fibrinógeno (Fib-/-) complementados con una dosis única de diferentes especies de fibrinógeno humano de plasma antes de una exposición a 8A) 5,0 x 108 UFC y 8B) 1,0 x 109 UFC de S. aureus USA 300 WT.

Figura 9 Perfiles de supervivencia de ratones con fibrinógeno WT complementados con una dosis única de pFib y427/y411 y pFib y411/411 antes de una exposición a 3,2 x108 UFC de S. aureus USA 300 WT.

Figura 10 Perfiles de supervivencia de ratones deficientes en fibrinógeno complementados con dosis repetidas de pFib y427/y411, en comparación con pFib y411/411 después de una exposición a 6,0 x 108 UFC de S. aureus USA 300 WT

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende una variante de fibrinógeno gamma prima para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección. Las variantes de fibrinógeno gamma prima tienen dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3.

En el contexto de la presente invención, el extremo carboxilo de una cadena gamma de fibrinógeno se refiere a las posiciones de aminoácidos 390-411 de la cadena gamma de fibrinógeno WT. La posición de un aminoácido particular dentro de una cadena gamma se puede determinar por alineamiento con la secuencia de aminoácidos de la cadena gamma de fibrinógeno WT (SEQ ID NO. 6). Se puede alinear toda o parte de la secuencia de la cadena gamma, en particular su extremo carboxilo. Para el alineamiento se puede usar una herramienta habitual de alineamiento de secuencias, tal como, por ejemplo, el algoritmo de Smith-Waterman. Se dice que las secuencias están alineadas cuando la puntuación de alineamiento es la más alta, cuando se alinea con esta secuencia.

En el contexto de la presente invención, el término fibrinógeno natural (WT) se refiere a la forma madura dominante del fibrinógeno humano en circulación que consiste en cadenas Aa que tienen 610 aminoácidos en longitud, cadenas Bp de 461 aminoácidos y cadenas ^yde 411 aminoácidos. El extremo carboxilo de la cadena gamma de fibrinógeno WT es según SEQ ID NO. 1 y también se representa en la Fig. 1.

La sustitución de AGDV en el extremo carboxilo de la cadena gamma de fibrinógeno WT (SEQ ID NO. 1) por VRPEHPAETEYDSLYPEDDL (SEQ ID NO. 2 y Fig. 2) conduce a una cadena gamma según SeQ ID NO. 3, también denominada una cadena polipeptídica gamma prima. Como se usa en el presente documento, las abreviaturas de aminoácidos son según la nomenclatura de la IUPAC, por tanto, QAGDV se refiere a Gln-Ala-Gly-Asp-Val y VRPEHPAETEYDSLYPEDDL se refiere a Val-Arg-Pro-Glu-His-Pro-Ala-Glu-Thr-Glu-Tyr-Asp-Ser-Leu-Tyr-Pro-Glu-Asp-Asp-Leu.

En seres humanos, esta cadena polipeptídica gamma prima tiene 427 aminoácidos. Si una molécula de fibrinógeno comprende una cadena polipeptídica gamma WT (y411) y una cadena polipeptídica gamma prima (y427), esta variante se refiere aquí como heterodímero de fibrinógeno gamma prima o Fib y427/411. Si ambas cadenas polipeptídicas gamma son del mismo tipo gamma prima (y427), esta variante se denomina homodímero de fibrinógeno gamma prima o Fib y427/427. Las composiciones para su uso según la invención pueden comprender o consistir en mezclas de estas variantes gamma prima, tales como una mezcla de heterodímero de fibrinógeno gamma prima y homodímero, o pueden comprender o consistir en un tipo de variante gamma prima.

Los solicitantes han descubierto sorprendentemente que las composiciones que comprenden una variante de fibrinógeno gamma prima tienen varias ventajas en comparación con el fibrinógeno WT y en comparación con los fibrinógenos mutantes sugeridos hasta la fecha para el tratamiento de infección. Las composiciones que comprenden una variante de fibrinógeno gamma prima proporcionan una mejora significativa en la supervivencia cuando se usan para tratar o prevenir infección en un sujeto, en particular cuando se administra por inyección o infusión. A diferencia del fibrinógeno WT, las variantes de fibrinógeno gamma prima reducen la virulencia de las infecciones bacterianas en modelos animales, a pesar de que algunas de estas variantes se comportan similarmente al fibrinógeno WT en experimentos de adhesión y agrupamiento bacteriano in vitro. Otra ventaja es que parece que las composiciones que comprenden fibrinógeno gamma prima tienen un efecto sobre la infección que es independiente de la reducida unión bacteriana al fibrinógeno. Otra ventaja es que las composiciones que comprenden fibrinógeno gamma prima son eficaces tanto en el tratamiento profiláctico como en el tratamiento terapéutico. Otra ventaja es que algunas realizaciones de estas variantes de fibrinógeno gamma prima están presentes en plasma en cantidades suficientemente altas para ser aisladas del plasma. Otra ventaja más es que estas variantes de fibrinógeno gamma prima tienen un efecto sobre la virulencia bacteriana en presencia de fibrinógeno WT del hospedador. Otra ventaja más es que el efecto sobre la supervivencia de estas variantes de fibrinógeno gamma prima es independiente de la intensidad de la infección o la carga bacteriana. Por tanto, son clínicamente significativas.

La invención muestra que las composiciones para su uso según la invención son eficaces en el tratamiento o la prevención de infección en modelos animales, aunque las variantes de fibrinógeno gamma prima o las composiciones que las comprenden se pueden comportar como fibrinógeno WT en experimentos de unión o agrupamiento in vitro. La unión o el agrupamiento se puede determinar midiendo la absorbancia a 570 nm, por ejemplo, como se describe por Flick et al. (2013) Blood (121): 1783-1794.

Infección se refiere a la invasión o multiplicación de microorganismos, tales como bacterias y hongos, que no están normalmente presentes dentro del cuerpo de un individuo o que están presentes en cantidades anormales. Dichos microorganismos infecciosos también se denominan aquí patógenos. Una infección puede ser subclínica, sin síntomas, o puede ser clínica, con síntomas evidentes. El efecto del tratamiento o la prevención puede ser permanente o temporal, tal como durante varios días, varias semanas, varios meses o varios años. Puede ser completo o parcial. La prevención eficaz parcial incluye la prevención de la invasión o multiplicación de algunos microorganismos, y no otros. El tratamiento eficaz parcial incluye la reducción de la invasión o multiplicación de algunos microorganismos que están presentes en cantidades anormales, por ejemplo, una reducción del 5 % al 100 % o 5 % al 60 % o 60 % al 100 %. Preferentemente, la prevención o el tratamiento es completo y permanente. En una realización, las composiciones para su uso según la invención se usan en el tratamiento o la prevención de un patógeno que se une a fibrinógeno en un sujeto humano, en particular los que se unen al extremo carboxilo de la cadena gamma.

La composición para su uso según la invención puede comprender desde 0,05 % p/p hasta 20 % p/p de fibrinógeno en peso de la composición, tal como desde 0,1 % p/p hasta 10 % p/p o 0,5 % hasta 15 % p/p de fibrinógeno en peso de la composición y opcionalmente un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como diluyentes, lubricantes, aglutinantes, colorantes, antioxidantes, tensioactivos, conservantes, antioxidantes, disolventes, agentes de suspensión, agentes humectantes o tensioactivos. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable", "diluyente farmacéuticamente aceptable", "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "adyuvante farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente, diluyente, vehículo o adyuvante que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que, en general, es segura, no tóxica y ni biológicamente ni otro modo no deseable. Estos materiales no deben afectar adversamente la estabilidad de la composición ni de componente de la misma.

Si el fibrinógeno gamma prima es la única variante de fibrinógeno en la composición, la composición para su uso según la invención puede comprender desde 0,05 % p/p hasta 20 % p/p de la variante de fibrinógeno gamma prima en peso de la composición, tal como desde 0,1 % p/p hasta 10 % p/p o 0,5 % hasta 15 % p/p de la variante de fibrinógeno gamma prima en peso de la composición.

Alternativamente, la composición para su uso según la invención puede comprender otras variantes de fibrinógeno, además de las variantes gamma prima, tales como fibrinógeno con dos cadenas polipeptídicas gamma que comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 1. En ese caso, el contenido de fibrinógeno total de la composición es desde 0,05 % p/p hasta 20 % p/p, tal como desde 0,1 % p/p hasta 10 % p/p o 0,5 % hasta 15 % p/p en peso de la composición y el contenido de la variante de fibrinógeno gamma prima es al menos 25 % p/p del fibrinógeno total en la composición. En una realización, una composición para su uso según la invención comprende una combinación de fibrinógeno gamma prima homodímero o heterodímero y fibrinógeno WT. Por tanto, en una realización de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, comprendiendo la composición:

(i) una variante de fibrinógeno gamma prima que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3.

(ii) no más de aproximadamente 75 % de fibrinógeno WT en peso del fibrinógeno total en la composición.

Por consiguiente, dicha composición puede comprender no más de aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 50 % o aproximadamente 60 % o aproximadamente 1 % a 25 %, 25 % a 50 %, 25 % a 70 % o 50 % a 70 % de fibrinógeno WT, en peso del fibrinógeno total en la composición, por lo que el contenido de fibrinógeno total de la composición es preferentemente desde 0,05 % p/p hasta 20 % p/p, tal como desde 0,1 % p/p hasta 10 % p/p o 0,5 % hasta 15 % p/p, en peso de la composición y el contenido de la variante de fibrinógeno gamma prima es al menos 25 % p/p del fibrinógeno total en la composición.

El fibrinógeno en la composición para su uso según la invención se puede obtener por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener por aislamiento de plasma, preferentemente plasma de mamífero o de mezcla total de fibrinógeno plasmático. El fibrinógeno plasmático, que normalmente comprende una mezcla de variantes de fibrinógeno, se puede obtener comercialmente, por ejemplo de Enzyme Research Labs, Swansea, Reino Unido como FIB 3, o se pueden aislar de un individuo mamífero, preferentemente humano. El plasma se puede obtener de un individuo o se puede reunir de más individuos. Un método adecuado para el aislamiento de plasma puede comprender precipitación o cromatografía, en particular intercambio aniónico, por ejemplo, como se describe por Lawrence et al. Blood 1993, vol 82, pp 2406-2413.

Alternativamente, el fibrinógeno en la composición se puede obtener por producción recombinante, por ejemplo por clonación o síntesis química del ADN genómico codificante o ADNc, o seguido por transfección usando una célula hospedadora o sistema de cultivo celular, tal como un sistema de cultivo celular mamífero o humano. La producción recombinante de proteínas tiene muchas ventajas con respecto al uso de materiales derivados del plasma. Estos incluyen su perfil de seguridad preferido, la posibilidad de hacer variantes de una forma pura y hay un suministro ilimitado. Sin embargo, para producirlo de una forma económicamente factible, se requieren altos niveles de expresión de fibrinógeno funcional intacto o sus variantes. Además, para aplicaciones específicas, se requieren modificaciones postraduccionales apropiadas (por ejemplo, glucosilación). Por tanto, en una realización adicional de la invención, para patrones farmacéuticos, la variante de fibrinógeno se produce en un sistema de cultivo celular de mamífero, tal como en células de riñón de hámster bebé (BHK), células NSO, células Sp2/0, células PER.C6, células HEK293, células de insecto, células de ovario de hámster chino (CHO) o células obtenidas de mono verde africano COS. En una realización preferida, el fibrinógeno de mamífero en la composición para su uso según la invención se produce en células CHO.

La producción recombinante de fibrinógeno comprendido en composiciones para su uso según la invención normalmente implica la transfección de una célula hospedadora de mamífero, preferentemente una célula CHO, con un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídicas alfa, un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídicas beta y vectores que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas polipeptídicas gamma prima deseadas.

En una realización, la composición comprende mezclas de moléculas de fibrinógeno gamma prima recombinantemente producidas y obtenidas de plasma. Estas mezclas pueden comprender un tipo de variante de fibrinógeno gamma prima o varias variantes de fibrinógeno gamma prima. Por supuesto, se puede mutar el fibrinógeno gamma prima recombinantemente producido y obtenido de plasma, o modificar después de la producción o el aislamiento para obtener una variante con propiedades deseadas, por ejemplo para potenciar la actividad, la semivida de la proteína, la estabilidad de la proteína, la localización de la proteína y la eficacia de la proteína, en tanto que las moléculas de fibrinógeno gamma prima proporcionadas para su uso según la invención hayan retenido las funciones normales de una molécula de fibrinógeno gamma prima.

En una realización, el fibrinógeno gamma prima en la composición para su uso según la invención es fibrinógeno gamma prima como se encuentra en el plasma (pFib y'), opcionalmente producido recombinantemente, en su forma homodimérica o heterodimérica.

Se conocen varios polimorfismos de sustitución de un único aminoácido comunes que no alteran ninguna función conocida de la molécula de fibrinógeno gamma prima. Dicho polimorfismo o alteraciones pueden estar presentes en la cadena gamma fuera del extremo carboxilo. Las modificaciones postraduccionales, la degradación proteolítica y el corte y empalme alternativo pueden estar presentes en una o ambas de las cadenas alfa o beta de la molécula de fibrinógeno gamma prima. Por ejemplo, la molécula de fibrinógeno gamma prima en la composición para su uso según la invención puede comprender una cadena alfa de variante que ha surgido mediante polimorfismos genéticos, diferencias en la glucosilación o fosforilación, proteólisis (parcial) de su parte del extremo carboxilo o corte y empalme alternativo. En algunos casos, esto puede conducir a variantes de fibrinógeno con diferencias en la función (por ejemplo, polimerización de fibrina, unión de plaquetas, degradación proteolítica). Preferentemente, no altera la unión de trombina, la actividad de formación de coágulos o la reticulación mediada por el factor Xllla en moléculas de fibrinógeno gamma prima para su uso según la invención.

La composición para su uso según la invención se usa para el tratamiento o la prevención de una infección. La infección normalmente se provoca por o está asociada con la invasión o multiplicación de microorganismos, tales como bacterias y hongos, que normalmente no están presentes dentro del cuerpo de un individuo o que están presentes en cantidades anormales. Dichos microorganismos infecciosos también se denominan aquí patógenos. En una realización, la infección se provoca por o se asocia a bacterias Gram-negativas o bacterias Gram-positivas, tales como Escherichia, Bacteroides, Salmonella, Yersinia, Neisseria, Pseudomonas, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Clostridium, Listeria, Bacillus, en particular Staphylococcus aureus, que incluye cepas de S. aureus resistentes a vancomicina, S. aureus resistentes a meticilina y de S. aureus multirresistentes, que incluyen S. aureus USA 300 WT y S. aureus Newman. En otra realización, la infección se provoca por o se asocia con hongos, tales como Aspergillus o Candida. Los patógenos pueden ser de unión al fibrinógeno, en particular, unión al extremo carboxilo de la cadena gamma de fibrinógeno, más en particular al sitio AGDV de la cadena polipeptídica gamma de fibrinógeno.

La composición para su uso según la invención se puede usar ventajosamente para el tratamiento o la prevención de cualquier infección, tal como neumonía; septicemia; bacteremia; peritonitis; endocarditis; infección de la piel o de tejido blando; infecciones osteoarticulares; infección de articulaciones protésicas; infección de hueso; infección pleuropulmonar; infección de heridas; abscesos epidurales; meningitis; síndrome de choque tóxico; infección urinaria o tromboflebitis séptica.

La composición puede comprender además uno o más antimicrobianos, que incluyen antibióticos, tales como penicilina, amoxicilina, ampicilina, cefalosporinas y tetraciclinas, y agentes antifúngicos.

La composición para su uso según la invención se puede administrar por diversas vías, preferentemente por vía sistémica, ya sea por vía enteral o por vía parenteral. Preferentemente, se administra por inyección o infusión. En una realización, se administra por vía parenteral, por ejemplo por inyección, tal como por inyección intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, intraglandular o intravesicular, o infusión. Los términos "administración" o "administrar", como se usa en el presente documento, pueden incluir el proceso en el que las composiciones, solas o en combinación con otras variantes o composiciones de fibrinógeno, se administran a un sujeto humano o animal.

La administración de las composiciones para obtener un efecto terapéutico o profiláctico se puede determinar por las circunstancias del sujeto, como se conoce en la técnica, y se puede llevar a cabo mediante dosis individuales o unitarias de las composiciones, o por una dosis combinada o previamente envasada o previamente formulada de una composición. La administración puede depender de la cantidad de composición administrada, el número de dosis y la duración del tratamiento. Por ejemplo, se pueden administrar dosis múltiples. La duración de la administración de la composición, por ejemplo, el periodo de tiempo durante el que se administra la composición, puede variar, dependiendo de cualquiera de una variedad de factores, que incluyen la respuesta del sujeto. La cantidad de la composición administrada puede variar según factores tales como el grado de susceptibilidad del individuo y la edad, el sexo y el peso del individuo.

La composición para su uso según la presente invención se puede administrar a un "individuo", "paciente" o "sujeto" vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos también incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales de competición y mascotas. Para aplicaciones veterinarias, los sujetos adecuados pueden incluir, por ejemplo, ganado tal como ganado vacuno, ovejas, cabras, vacas, cerdos; aves de corral tales como pollos, patos, gansos y pavos; y animales domesticados, particularmente mascotas, tales como perros, conejos, ratones y gatos. Otros animales adecuados para la administración de una composición de fibrinógeno gamma prima desvelada en el presente documento incluyen caballo, mula, burro, reno, alpaca, llama, bisonte, búfalo, jabalí y yak.

En una realización, la presente invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección en un individuo humano, comprendiendo la composición un fibrinógeno de variante que consiste en dos cadenas Aa según SEQ ID NO. 4, dos cadenas Bp según SEQ ID NO. 5 y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3.

En una realización, la presente invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección en un individuo humano, comprendiendo la composición un fibrinógeno de variante que consiste en dos cadenas Aa como se encuentran en el fibrinógeno WT o según SEQ ID NO. 4, dos cadenas Bp como se encuentran en el fibrinógeno WT o según SEQ ID NO. 5 y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma es como se encuentra en el fibrinógeno gamma prima plasmático o según SEQ ID NO. 7.

En otra realización, la presente invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección en un individuo humano, comprendiendo la composición un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3 y en donde el fibrinógeno en la composición se produce recombinantemente, opcionalmente en donde dicho fibrinógeno recombinante es humano.

En otra realización de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, que comprende un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3, en donde la infección se provoca por o se asocia a un patógeno que se une a fibrinógeno en un sujeto humano o animal, en particular los que se unen al extremo carboxilo de la cadena gamma.

En otra realización más de la invención, se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, que comprende un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3, en donde la infección se provoca por o se asociada a un patógeno que se une a fibrinógeno, en particular que se une al extremo carboxilo de la cadena gamma en un sujeto humano o animal, seleccionado de bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas u hongos, y combinaciones de los mismos. El patógeno se puede seleccionar del grupo que consiste en los géneros Escherichia, Bacteroides, Salmonella, Yersinia, Neisseria, Pseudomonas, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Clostridium, Listeria, Bacillus; Aspergillus o Candida y preferentemente es S. aureus, que incluye cepas de S. aureus resistentes a vancomicina, S. aureus resistentes a meticilina y de S. aureus multirresistentes. La infección se puede seleccionar de uno o más de: neumonía, por ejemplo neumonía intrahospitalaria; septicemia; bacteremia; peritonitis; endocarditis; infección de la piel o de tejido blando, por ejemplo, impétigo; infecciones osteoarticulares, por ejemplo, osteomielitis, artritis séptica; infección de articulaciones protésicas; infección de hueso; infecciones pleuropulmonares; infección de heridas, por ejemplo, úlceras diabéticas; abscesos epidurales; meningitis; síndrome de choque tóxico; infección urinaria o tromboflebitis séptica.

En una realización adicional de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, que comprende un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3, y que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento, la prevención o la reducción de la infección o la virulencia de un patógeno que se une a fibrinógeno en un sujeto humano o animal, seleccionado de bacterias Gramnegativas, bacterias Gram-positivas, hongos, o combinaciones de los mismos, o para el tratamiento, la prevención o la reducción de un síntoma en un sujeto provocado por o asociado a un patógeno que se une a fibrinógeno, en donde dicha prevención o reducción de un síntoma, y/o virulencia, da como resultado la prolongación de la supervivencia y/o sensibilización del hospedador a terapia antimicrobiana, que incluye antibióticos y antifúngicos.

En una realización adicional de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, que comprende un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3, y que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento, la prevención o la reducción de la infección o la virulencia de un patógeno que se une a fibrinógeno en un sujeto humano o animal, seleccionado de bacterias Gramnegativas, bacterias Gram-positivas, hongos o combinaciones de los mismos. Por consiguiente, dicho patógeno puede ser una bacteria Gram-negativa, tales como Escherichia coli, Bacteroides fragilis, Salmonella spp, Yersinia spp, Neisseria meningitides o Pseudomonas aeruginosa; una bacteria Gram-positiva tal como de los géneros Staphylococci, Enterococci, Streptococci, Clostridium, Listeria o Bacilli; o un hongo tal como Aspergillus o Candida.

En una realización adicional de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, que comprende un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3, comprendiendo además dicha composición uno o más agentes antimicrobianos, tales como antibióticos o antifúngicos.

En una realización adicional de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, que consiste en un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3. La variante de fibrinógeno puede tener dos cadenas polipeptídicas alfa según SEQ ID NO. 4 y dos cadenas polipeptídicas beta según SEQ ID NO. 5.

En otra realización más de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, que consiste en un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende un extremo carboxilo según SEQ ID NO. 1 y la otra cadena polipeptídicas gamma comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO. 3.

En otra realización más de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, que consiste en un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde ambas cadenas polipeptídicas gamma comprenden un extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3, también representado en la Fig. 3.

En otra realización de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, que comprende un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3, en donde el fibrinógeno en la composición se produce recombinantemente, opcionalmente en donde dicho fibrinógeno recombinante es de mamífero.

En una realización adicional de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, que comprende un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3, comprendiendo además dicha composición uno o más agentes antimicrobianos seleccionados de, pero no se limitan a: penicilina G, oxacilina, vancomicina, flucloxacilina, amoxicilina, ampicilina, cloxacilina, penicilinas antipseudomonales, meticilina, nafcilina, dicloxacilina, cefalosporinas, carbapenémicos, imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, tetraciclinas, macrólidos, fluoroquinolonas, trimetoprim/sulfametoxazol (TMP/SMX), gentamicina, vancomicina, daptomicina, telavancina, cefazolina, mupirocina, teicoplanina, tetraciclinas, minociclina, doxiciclina, eritromicina, rifampina, clindamicina, linezolida, aminoglucósidos y antifúngicos. En una realización adicional, las bacterias Gram-positivas se seleccionan de S. afermentans, S. aureus, MRSA, S. auricularis, S. capitis, S. caprae, S. cohnii, S. epidermidis, S. felis, S. haemolyticus, S. hominis, S. intermedius, S. lugdunensis, S. pettenkoferi, S. saprophyticus, S. schleiferi, S. simulans, S. vitulus, S. Warner y S. xylosus y especies estreptocócicas que incluyen Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) y Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A).

En una realización adicional de la invención, la bacteria Gram-positiva es S. aureus, tal como cepas de S. aureus resistentes a vancomicina, S. aureus resistentes a meticilina o de S. aureus multirresistentes, tal como BD-635, ST250 MRSA-1, ST2470-MRSA-I, ST239-MRSA-IN, ST5-MRSA-II, ST5-MRSA-IV, ST239- MRSA-III, EMRSA15, EMRSA 16, MRSA252, ST5:USA100, EMRSA 1, ST8:USA300, ST1 USA400, ST8:USA500, ST59:USA1000, USA1100, USA600, USA800, USA300, ST30, ST93, ST80, ST59, CC22, CC8, CC425 y CC398.

En otra realización de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención es para administración por inyección o infusión, en particular por inyección intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, intraglandular o intravesicular, o infusión, que comprende opcionalmente además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención es una composición o preparación farmacéutica, preferentemente estéril.

En una realización adicional de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención se administra simultáneamente, por separado o uno detrás de otro con uno o más agentes antimicrobianos, que incluyen antibióticos, y se pueden seleccionar de, pero no se limitan a: penicilina G, oxacilina, vancomicina, flucloxacilina, amoxicilina, ampicilina, penicilinas antipseudomonales, meticilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina, vancomicina, cefalosporinas, carbapenémicos, imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, tetraciclinas, macrólidos, fluoroquinolonas, trimetoprim/sulfametoxazol, cefazolina, (TMP/SMX), gentamicina, daptomicina, telavancina, mupirocina, teicoplanina, tetraciclinas, minociclina, doxiciclina, eritromicina, rifampina, clindamicina, linezolida, aminoglucósidos y agentes antifúngicos.

En una realización adicional de la invención se proporciona un método de tratamiento, retraso o prevención de la aparición, y/o reducción o control de la intensidad de la infección asociada al patógeno que se une a fibrinógeno en un sujeto humano o animal, que comprende las etapas de administrar una composición de fibrinógeno, como se desvela en el presente documento, a un sujeto humano o animal, para tratar, retrasar o prevenir la aparición y/o para tratar, reducir o controlar la intensidad de los síntomas clínicos asociados al patógeno que se une a fibrinógeno, opcionalmente en donde dicho patógeno se selecciona de: bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas, hongos o combinaciones de los mismos.

En una realización adicional de la invención se proporciona un método de tratamiento o prevención de la carga de patógeno que se une a fibrinógeno en la circulación sanguínea o corazón en un sujeto humano o animal, por ejemplo, como se asocia a endocarditis, que comprende las etapas de administrar una composición de fibrinógeno según la invención desvelada en el presente documento, a un sujeto humano o animal, para reducir dicha carga de patógeno que se une a fibrinógeno en la circulación sanguínea o corazón, opcionalmente antes de la cirugía en un paciente en riesgo de dicha endocarditis.

En una realización adicional de la invención se proporciona el uso de un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3, en la preparación de un medicamento para el tratamiento, la prevención o la reducción de la infección o la virulencia de un patógeno que se une a fibrinógeno en un sujeto humano o animal.

En todavía una realización adicional de la invención se proporciona un uso de un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia del extremo carboxilo según SEQ ID NO. 3, en la preparación de un medicamento para el tratamiento, la prevención o la reducción de un síntoma en un sujeto provocado por o asociado a un patógeno que se une a fibrinógeno, tal como: neumonía, por ejemplo neumonía intrahospitalaria; septicemia; bacteremia; peritonitis; endocarditis; infección de la piel o de tejido blando, por ejemplo, impétigo; infecciones osteoarticulares, por ejemplo, osteomielitis, artritis séptica; infección de articulaciones protésicas; infección de hueso; infecciones pleuropulmonares; infección de heridas, por ejemplo, úlceras diabéticas; abscesos epidurales; meningitis; síndrome de choque tóxico; infección urinaria o tromboflebitis séptica, o combinaciones de los mismos.

En una realización adicional de la invención se proporciona un uso de un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia según SEQ ID NO. 3, en la preparación de un medicamento para el tratamiento, la prevención o la reducción de la infección o la virulencia de un patógeno que se une a fibrinógeno en un sujeto humano o animal, en donde dicho fibrinógeno es fibrinógeno humano.

La composición de fibrinógeno según la invención puede incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" del fibrinógeno de variante o composición según la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Un experto en la técnica puede determinar una cantidad terapéuticamente eficaz de un fibrinógeno de variante o composiciones del mismo y puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad del fibrinógeno de mamífero o composición para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de los fibrinógenos de variante o composiciones de la invención se compensa por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, puesto que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una fase más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de fibrinógeno de variante de la presente divulgación puede ser aproximadamente 2,0 mg/kg a aproximadamente 800 mg/kg, aproximadamente 3,0 mg/kg a aproximadamente 700 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 650 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 600 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg a aproximadamente 550 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg a aproximadamente 400 mg/kg, aproximadamente 65 mg/kg a aproximadamente 350 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, aproximadamente 85 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg y aproximadamente 90 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, con respecto a la dosis de fibrinógeno de variante por kg de peso corporal del sujeto.

En una realización adicional de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención se administra una vez o en múltiples veces que ocurren dentro de un periodo de aproximadamente 2, 3, 6, 12 o 24 horas. En algunos métodos, el fibrinógeno se administra múltiples veces en intervalos de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, o más días.

En una realización adicional de la invención, la variante de fibrinógeno según la invención demuestra una semivida in vivo de aproximadamente 6, 12, 24, 36, 48 o 72 horas o más.

Algunos ejemplos de materiales que pueden servir de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen agentes de tamponamiento tales como, pero no se limitan a, hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua sin pirógenos; solución salina isotónica; disolución de Ringer; alcohol etílico y disoluciones de tampón fosfato, así como otros excipientes no tóxicos tales como, pero no se limitan a, laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como conservantes y antioxidantes que también pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador. Las técnicas y formulaciones se pueden encontrar, en general, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", (Meade Publishing Co., Easton, Pa.). Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables para administración sistémica según la invención pueden incluir al menos uno de diluyentes, lubricantes, aglutinantes, colorantes, antioxidantes, tensioactivos, conservantes, antioxidantes, disolventes, agentes de suspensión, humectantes, tensioactivos, combinaciones de los mismos, y otros. Preferentemente, el excipiente, vehículo o diluyente incluye agua estéril para inyección, solución salina isotónica estéril, disolución de Ringer estéril o disolución de lactato estéril, cuya selección sería bien conocida por los expertos en la técnica. Los disolventes adecuados incluyen agua, solución salina isotónica, oleato de etilo, glicerina, aceites de ricino hidroxilados, alcoholes tales como etanol y disoluciones de tampón fosfato. La cantidad de disolvente(s) en una composición sistémica puede variar de 80 % a aproximadamente 99,95 % p/p o p/v. Estos materiales no deben afectar adversamente la estabilidad de la composición o cualquier componente de los mismos.

Aunque las cantidades de componentes en las composiciones sistémicas pueden variar dependiendo del tipo de composición sistémica preparada, en general, las composiciones sistémicas incluyen desde 0,05 % p/p hasta 20 % p/p, tal como desde 0,1 % p/p hasta 10 % p/p o 0,5 % al 15 % p/p de fibrinógeno y 80 % al 99,95 % p/p o p/v de uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Las composiciones para administración parenteral pueden incluir desde 0,05 % p/p hasta 20 % p/p, tal como desde 0,1 % p/p hasta 10 % p/p o 0,5 % hasta 15 % p/p de fibrinógeno y 90 % hasta 99,9 % p/p o p/v de un vehículo farmacéuticamente aceptable que incluye un diluyente y/o un disolvente.

Las composiciones para su uso según la invención son normalmente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede estar en una variedad de formas, adecuadas para administración sistémica. Preferentemente, la composición es adecuada para inyección y, por ejemplo, se formula para administración parenteral por una vía seleccionada de inyección intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, intraglandular o intravesicular, o infusión. En este contexto, intraglandular incluye la administración directa a la luz de las glándulas, tales como las ubres de animales mamíferos, particularmente ganado tal como vacas, ovejas y cerdos. Otros animales adecuados para administración de una composición de fibrinógeno desvelada en el presente documento incluyen oveja, vaca, cabra, cerdo, caballo, mula, burro, reno, perro, gato, conejo, ratón, alpaca, llama, bisonte, búfalo, jabalí y yak Normalmente, se usaría fibrinógeno no humano, sino el equivalente animal de fibrinógeno. De esta forma, se puede prevenir o tratar la mastitis en ganado vacuno lácteo, en particular la vaca.

En un primer aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, comprendiendo o consistiendo la composición en un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia según SEQ ID NO. 3.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según el primer aspecto, en donde una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia según SEQ ID NO. 1 y la otra cadena polipeptídicas gamma comprende una secuencia según SEQ ID NO. 3.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según el primer o segundo aspecto, en donde las dos cadenas polipeptídicas alfa son según SEQ ID NO. 4 y las dos cadenas polipeptídicas beta son según SEQ ID NO. 5.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según el primer a tercer aspecto, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma es según SEQ ID NO. 7.

En un quinto aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según cualquiera de los aspectos previos, que comprende además no más de aproximadamente 75 % de un fibrinógeno que comprende dos cadenas polipeptídicas alfa, dos beta y dos gamma, en donde ambos extremos carboxilo de las cadenas polipeptídicas gamma son según SEQ ID NO. 1 y en donde el 75 % es en peso del fibrinógeno total en la composición.

En un sexto aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según cualquiera de los aspectos previos, en donde el fibrinógeno en la composición es recombinante o se obtiene de plasma, o mezclas de los mismos.

En un séptimo aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según cualquiera de los aspectos previos, en donde la infección en un sujeto humano o animal se provoca por o asociados a un patógeno que se une al extremo carboxilo de la cadena gamma de fibrinógeno.

En un octavo aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según cualquiera de los aspectos previos, en donde la infección se provoca por uno o más patógenos seleccionados del grupo que consiste en bacterias Gramnegativas, bacterias Gram-positivas y hongos.

En un noveno aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según cualquiera de los aspectos previos, en donde el patógeno es Staphylococcus aureus, que incluye cepas de S. aureus resistentes a vancomicina, S. aureus resistentes a meticilina y de S. aureus multirresistentes.

En un décimo aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según cualquiera de los aspectos previos, en donde la infección se selecciona de una o más de: neumonía; septicemia; bacteremia; peritonitis; endocarditis; infección de la piel o de tejido blando; infecciones osteoarticulares; infección de articulaciones protésicas; infección de hueso; infección pleuropulmonar; infección de heridas; abscesos epidurales; meningitis; síndrome de choque tóxico; infección urinaria o tromboflebitis séptica.

En un undécimo aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según cualquiera de los aspectos previos, en donde la composición es para administración por inyección o infusión, preferentemente para administración por inyección intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, intraglandular o intravesicular, o infusión.

En un duodécimo aspecto, la invención se refiere a una composición para su uso según cualquiera de los aspectos previos, en donde la composición comprende además un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Cualquier intervalo numérico citado en el presente documento incluye todos los valores desde el valor más bajo hasta el valor más alto y se debe considerar que se establecen explícitamente en la presente solicitud todas las posibles combinaciones de valores numéricos entre y que incluyen el valor más bajo y el valor más alto enumerados.

Como se usa en el presente documento, "tratar", "tratamiento", "tratando" y similares se refieren a que actúan sobre una afección con un agente para afectar la afección mejorándola o alterándola. La afección incluye, pero no se limita a, infección, tal como la provocada por bacterias. El agente incluye, pero no se limita a, variantes o composiciones de fibrinógeno capaces de inhibir o prevenir la infección, tal como la provocada por bacterias. Por ejemplo, el agente puede incluir la variante de fibrinógeno gamma prima o composiciones descritas en el presente documento. La mejora o alteración puede incluir una mejora en los síntomas o una alteración en las vías fisiológicas asociadas a la afección. Los términos anteriormente mencionados cubren uno o más tratamientos de una afección en un sujeto (por ejemplo, un mamífero, normalmente un animal humano o no humano de interés veterinario), e incluyen: (a) reducir el riesgo de manifestación de la afección en un sujeto que se ha determinado que tiene predisposición a la afección pero que aún no se ha diagnosticado, (b) impedir el desarrollo de la afección, (c) reducción de la afección/infección, y/o virulencia y/o manifestaciones clínicas, (d) retraso o prevención de la aparición de la afección/infección, (e) para tratar, reducir o controlar la intensidad de la afección, y/o (f) aliviar la afección, por ejemplo, causar la regresión de la afección y/o el alivio de uno o más síntomas de la afección (por ejemplo, reducir o eliminar la infección).

Como se usa en el presente documento, los términos "reducir", "suprimir", "inhibir", "disminuir", "retirar" o similares en referencia a los microorganismos significa la inhibición completa o parcial (superior al 50 %, preferentemente superior al 90 %, todavía más preferentemente superior al 95 % o incluso más del 99 %) de microorganismos (en términos del número de células restantes o biomasa total restante). Además, la inhibición puede ser permanente o temporal. En términos de inhibición temporal, los microorganismos se pueden inhibir durante un tiempo suficiente para producir el efecto deseado (por ejemplo, al menos 5 días, preferentemente al menos 10 días o más). Preferentemente, la inhibición de microorganismos es completa y/o permanente (no persistente) ("erradicar" o "erradicación").

Como se usa en el presente documento, "prevenir" o similares en referencia a microorganismos significa la prevención completa o parcial (superior al 50 %, preferentemente superior al 90 %, todavía más preferentemente superior al 95 % o incluso más del 99 %) de microorganismos (en términos del número de células restantes o biomasa total restante) y también incluye dentro de su alcance procesos asociados a microorganismos. Además, la prevención puede ser permanente o temporal. En términos de prevención temporal, los microorganismos se pueden inhibir durante un tiempo suficiente para producir el efecto deseado (por ejemplo, al menos 5 días, preferentemente al menos 10 días o más). Preferentemente, la prevención de microorganismos es completa y/o permanente.

"Herida", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier daño a cualquier tejido de un paciente que da como resultado la pérdida de sangre del aparato circulatorio o cualquier otro líquido del cuerpo del paciente. El daño puede haber sido provocado por cualquier agente o fuente, que incluye lesión traumática, infección o intervención quirúrgica. Una herida puede ser en un tejido blando, tal como un órgano, o en tejido duro, tal como hueso. El tejido puede ser un tejido interno, tal como un órgano o vaso sanguíneo, o un tejido externo, tal como la piel. La pérdida de sangre puede ser interna, tal como de un órgano roto, o externa, tal como de una laceración.

El experto entenderá que las realizaciones anteriores se pueden combinar para formar nuevas realizaciones dentro del alcance de la invención.

Habiendo descrito ahora, en general, la invención, lo mismo se entenderá más fácilmente mediante referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración, y no pretenden ser limitantes de la presente invención, a menos que se especifique.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 Aislamiento de variantes de fibrinógeno de plasma

Se obtuvo mezcla de fibrinógeno plasmático total (pFib total) que comprendía fibrinógeno natural (WT) (pFib y411/411) y fibrinógeno gamma prima (pFibY427/411) de Enzyme Research Labs, Swansea, Reino Unido (FIB 3). Esto se usó como material de partida para separar el fibrinógeno plasmático con dos cadenas polipeptídicas gamma WT (pFib Y411/411) de la variante de fibrinógeno plasmático con una cadena polipeptídica gamma prima y una cadena polipeptídica gamma WT (pFib y427/411) usando cromatografía de intercambio aniónico como se describe en Lawrence et al. (Blood 1993, vol 82, no 8, pp 2406-2413). Se analizaron pFib total, pFib y411/411 y pFib y427/411 en SDS-PAGE (Ejemplo 3) y se usaron en experimentos adicionales como se describe a continuación. Se aisló fibrinógeno de ratón de ratones WT (mFib yWT/WT) y de ratones transgénicos delta5 homocigóticos (mFib yA 5/A5) como se describe por Flick et al. (2013) Blood (121): 1783-1794.

Ejemplo 2 Producción recombinante de fibrinógeno WT y fibrinógeno gamma prima homodímero.

Se clonaron secuencias de ADNc que codificaban la cadena Aa610 (natural alfa, SEQ ID NO. 4), cadena Bp (SEQ ID NO. 5), cadena y411 (gamma) (SEQ ID NO. 6) y cadena y427 (gamma prima) (SEQ ID NO. 7) de fibrinógeno en el plásmido pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) para construir vectores de expresión para las diferentes cadenas de fibrinógeno. Se usaron las combinaciones de plásmidos de expresión que contenían ADNc que codificaban las cadenas Aa , Bp y y para producir fibrinógeno WT humano recombinante completamente ensamblado (rhFib Y411/411) y homodímero de fibrinógeno gamma prima recombinante (rhFib y427/427) por expresión transitoria en células HEK 293 (sistema EXPI293 de Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Estas variantes de fibrinógeno recombinantes se purificaron usando purificación por afinidad en una columna GPRP como se describe en Kuyas C et al. (Thrombosis Haemostasis 1990 Jun 28; 63 (3): 439-444) y se analizaron en SDS-PAGE (como se describe en el Ejemplo 3)

Ejemplo 3 Análisis por SDS-PAGE de fibrinógeno aislado de plasma y fibrinógeno recombinantemente producido

Se sometieron pFib y411/411 y pFib y427/411 aislado de fibrinógeno plasmático total (pFib total) a análisis de SDS-PAGE en condiciones reductoras. Se cargaron aproximadamente 0,5 a 1,0 microgramos de las muestras de fibrinógeno sobre el gel de SDS-PAGE, se separaron por electroforesis durante 1 hora a 200 voltios y se tiñeron con tinción con azul de Coomassie. El resultado se muestra en la Fig. 4

Carril 1: el pFib total (fibrinógeno plasmático total) mostró como bandas dominantes Aa 610, Bp 461 y y411. Se observa una banda Aa ligeramente degradada precisamente por debajo de la banda de Aa610 y está presente una ligera banda en la posición y427 posición. Carril 2: pFib y411/411 solo contiene solo la banda y411 en la posición de polipéptido gamma. Carril 3: pFib y427/411 aislado de pFib total contiene polipéptidos Aa610 y Bp461 naturales, pero el polipéptido de cadena y consiste en aproximadamente cantidades iguales de y411 y y427, que demuestra que pFib Y427/411 es un heterodímero con respecto al polipéptido gamma.

Para los productos recombinantes, se prepararon rhFib y411/411 y rhFib y427/427 en el Ejemplo 2, los resultados se muestran en el Carril 4: rhFib y411/411, que contiene cadenas polipeptídicas Aa610, Bp461 y y411. Carril 5: rhFib Y427/427 que contiene Aa610, Bp461 y y427. Las cadenas polipeptídicas de las variantes recombinantemente producidas corresponden a las secuencias de ADNc usadas en las transfecciones.

Ejemplo 4 Unión de S. aureus USA 300 WT a composiciones inmovilizadas de diferentes especies de fibrinógeno.

Los experimentos de unión se realizaron como se describe en Flick (2013) (Blood (121): 1783-1794). Brevemente, se inmovilizaron diluciones sucesivas de las diferentes especies de fibrinógeno a placas de microtitulación de 96 pocillos a concentraciones que variaban desde 0 hasta 25 microgramos/mL. Se añadieron suspensiones que tenían una densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 0,4 de cepas ClfA- de S. aureus USA 300 WT y USA 300 en crecimiento exponencial o estacionario a placas de microtitulación con fibrinógeno inmovilizado y se incubaron durante 2 horas a 37 °C. Se retiraron las bacterias no de unión y se fijaron bacterias adherentes con 25 % de disolución de formaldehído y se tiñeron con 0,1 % p/v de disolución de violeta cristal. El violeta cristal unido se disolvió en 10 % v/v de acético y se midió la absorbancia a 570 nm. Se representó la absorbancia a 570 nm contra la concentración de fibrinógeno en la disolución de recubrimiento de fibrinógeno. Cada muestra se midió por triplicado.

La Fig. 5A demuestra que cultivar exponencialmente S. aureus USA 300 WT no se une a especies de fibrinógeno en las que el motivo QAGDV se deleciona completamente (mFib y A5/A5) o en donde la secuencia de AGDV se ha sustituido por SEQ ID NO. 2 (rhFib y427/427). S. aureus USA 300 WT en la fase de crecimiento estacionario muestra un perfil de unión similar en comparación con bacterias que crecen exponencialmente (datos no mostrados). La cepa ClfA- USA 300 no mostró unión a ninguna de las especies de fibrinógeno probadas (datos no mostrados). Estos datos muestran que mFib y A5/A5 y rhFib y427/427 demuestran propiedades de unión in vitro similares para S. aureus USA 300 WT.

La Fig. 5B muestra que, sorprendentemente, el perfil de unión de S. aureus USA 300 WT de crecimiento exponencial a pFib y427/411 y pFib y411/411 es prácticamente idéntico. El perfil de unión de pFib y427/411 que contiene una cantidad aproximadamente igual del polipéptido gamma y411 y y427 no muestra diferencia significativa con el de pFib Y411/411, que solo contiene polipéptidos y411. También el perfil de unión de las mezclas de pFib y427/411 y pFib Y411/411 son muy similares al perfil de unión de 100 % de pFib y411/411. Las bacterias de S. aureus en la fase de crecimiento estacionario mostraron resultados similares (datos no mostrados)

La Fig. 5C muestra que, sorprendentemente, el perfil de unión de S. aureus USA 300 WT de crecimiento exponencial de PFib y411/411 no está influido por la presencia de hasta 75 % de rhFib y427/427 en la composición de fibrinógeno inmovilizada.

Los datos en la Fig. 5B y 5C indican que la ausencia solo completa del motivo de unión QAGDV o la sustitución completa del motivo AGDv en la cadena gamma de fibrinógeno conduce a unión mediada por ClfA reducida de S. aureus a fibrinógeno inmovilizado.

Ejemplo 5 Agrupamiento de S. aureus inducido y soportado por diversas composiciones que comprenden diferentes especies de fibrinógeno

Se realizó el agrupamiento dependiente de fibrinógeno de cepas ClfA- de S. aureus USA 300 WT y USA 300 de crecimiento exponencial y estacionario esencialmente como se describe por Flick et al. (Blood (121): 1783-1794; 2013). En resumen, se mezclaron diluciones sucesivas de las diferentes variantes de fibrinógeno purificadas y mezclas de las mismas con suspensiones de S. aureus en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se midió la disminución en la absorbancia a 570 nm y se representó 1/absorbancia 570 nm frente a la concentración de fibrinógeno como medida de la cantidad de agrupamiento.

La Fig. 6A demuestra que el agrupamiento de S. aureus USA 300 WT de crecimiento exponencial no está respaldado por las especies de fibrinógeno en las que el motivo QAGDV está completamente delecionado (mFib y A5/A5) o en donde la secuencia de AGDV se ha sustituido por SEQ ID NO. 2 (rhFib y427/427). S. aureus USA 300 WT en la fase de crecimiento estacionario muestra un perfil similar en comparación con las bacterias de crecimiento exponencial (datos no mostrados). La cepa ClfA- USA 300 no mostró agrupamiento con ninguna de las especies de fibrinógeno probadas (datos no mostrados). Estos datos muestran que mFib y A5/A5 y rhFib y427/427 demuestran ambos de un modo similar ausencia completa de propiedades de agrupamiento in vitro para S. aureus USA 300 WT.

La Fig. 6B muestra muy sorprendentemente que pFibY427/411 respalda el agrupamiento de bacterias de S. aureus de crecimiento exponencial. La curva de agrupamiento es prácticamente idéntica a la curva de pFib y411/411. La curva de agrupamiento siguió siendo similar para las mezclas de pFibY427/411 y pFib y411/41. No se observó inhibición por pFib y427/411 sobre el agrupamiento respaldado por pFib y411/411. Las bacterias de S. aureus en una fase de crecimiento estacionario mostraron resultados similares (datos no mostrados).

Las Fig. 6C y 6D muestra que 100 % de rhFib y427/427 no respaldó el agrupamiento de bacterias S. aureus de crecimiento exponencial. Sin embargo, usando bacterias S. aureus de crecimiento exponencial (Fig. 6C), las mezclas de rhFib y427/427 con pFib y411/411, a bajas concentraciones de fibrinógeno, mostraron una inhibición dependiente de la dosis del agrupamiento inducido por pFib y411/411, a pesar del hallazgo (Fig. 5C) de que la unión a pFib y411/411 no estaba afectado por la presencia de rhFib y427/427 en las mezclas. La Fig. 6D muestra que cuando se usa S. aureus en la fase de crecimiento estacionario, la inhibición del agrupamiento por mezclas de rhFib y427/427 con pFib Y411/411 solo ocurre a bajas concentraciones de fibrinógeno y solo en la mezcla que contiene 75 % de rhFib y427/427. La inhibición completa del agrupamiento en estos experimentos solo se observó también con 100 % de rhFib y427/427.

Los experimentos de agrupamiento usando la cepa ClfA negativa de S. aureus USA 300 (datos no mostrados) demostraron la ausencia completa de agrupamiento con cualquiera de las especies de fibrinógeno usadas, que indica que el agrupamiento de S. aureus es completamente dependiente de las interacciones mediadas por ClfA con fibrinógeno.

Los resultados in vitro del Ejemplo 4 demuestran que la unión mediada por ClfA (adhesión) de S. aureus a fibrinógeno, que se considera un factor de virulencia in vivo importante, solo se reduce si está ausente el 100 % de los sitios de unión en el extremo carboxilo de fibrinógeno (100 % de rhFib y427/427 en la Fig. 5B y 5C). No se observa unión reducida cuando se usaron el heterodímero pFibY 427/411, que contiene 50 % de los sitios de unión del extremo carboxilo gamma para ClfA (fig 5A) o mezclas de rhFib y427/427 y pFib y411/411.

Además, los resultados in vitro del Ejemplo 5 demuestran que el agrupamiento mediado por ClfA de S. aureus está respaldado por el heterodímero pFib y427/411 al mismo grado que pFib y411/411. Mezclas de rhFibY427/427 y pFib Y411/411 muestran una disminución dependiente de la dosis del agrupamiento en S. aureus USA 300 WT, pero solo a bajas concentraciones de fibrinógeno. La inhibición completa del agrupamiento con tanto S. aureus de crecimiento exponencial como estacionario solo se observa si el 100 % del fibrinógeno usado era rhFib y427/427, que carece completamente del motivo de unión de ClfA en la región del extremo carboxilo de la cadena gamma.

Por tanto, estos resultados in vitro sugieren que solo cabe esperar un efecto clínicamente significativo de reducir el motivo de unión de ClfA de la cadena gamma de fibrinógeno en un animal humano u hospedador infectado con S. aureus, si este motivo de unión a fibrinógeno está completamente ausente. No se espera efecto clínico que proporcione una reducción parcial en las cadenas gamma de fibrinógeno que contienen el motivo de unión a ClfA.

Ejemplo 6 Perfiles de supervivencia de ratones delta 5 homocigóticos (Fib yA5/A5) y heterocigóticos (Fib yWT/A5) después de diferentes exposiciones de S. aureus USA 300 WT

Se compararon la supervivencia de ratones delta 5 heterocigóticos (Fib ywt/A5) y homocigóticos (Fib yA5/A5) con fibrinógeno (con el motivo QAGDV delecionado en una o ambas de las cadenas gamma), y ratones WT después de la inyección en la vena de la cola con 2,0 x 208 UFC de S. aureus USA 300 WT (Fig. 7A) y 6,0 x 108 UFC de S. aureus USA 300 WT (Fig. 7B) y con 7,0 x 108 UfC de S. aureus USA 300 WT (Fig. 7C). Como era de esperar de los datos in vitro en los Ejemplos 4 y 5, los ratones delta 5 homocigóticos (Fib yA5/A5) demostraron una ventaja de supervivencia sustancial en comparación con los ratones WT en todas las exposiciones diferentes a S. aureus. Esto también es según el resultado publicado por Flick et al. (2013) (Blood (121): 1783-1794). Sorprendentemente, los ratones delta 5 heterocigóticos (Fib yw™5), que carecían de solo el 50 % del motivo de unión a ClfA de la cadena gamma de fibrinógeno, también demostraron una ventaja de supervivencia significativa en comparación con los ratones con fibrinógeno WT. Sin embargo, la ventaja de la supervivencia en Fib ywt/A5 fue fuertemente dependiente de la dosis de S. aureus inyectada. A baja dosis, el efecto sobre la supervivencia de la mutación Fib yw™5 es similar al de los ratones Fib yA5/A5 (Fig. 7A), a dosis media es más pequeño que para ratones Fib yA5/A5 (Fig. 7B) y a dosis alta ya no se observó ventaja de supervivencia de Fib ywt/A5 (Fig. 7C).

Estos resultados indican sorprendentemente que, a pesar de los resultados in vitro en el Ejemplo 4 y 5, la presencia de fibrinógeno que carece del motivo de unión a ClfA en la cadena gamma a niveles del 50 % del nivel del fibrinógeno WT (que contiene el motivo de unión de ClfA) todavía podría proporcionar un efecto clínico significativo sobre la virulencia de S. aureus. Sin embargo, parece que se reduce el efecto protector de la deleción del motivo de QAGDV en los ratones Fib ywt/A5 al aumentar la intensidad de la infección por S. aureus.

Ejemplo 7 Perfiles de supervivencia de ratones deficientes en fibrinógeno (Fib-/-) tratados profilácticamente con pFib total, heterodímero de pFiby427/411 y pFib y411/411 humano después de la exposición a S. aureus USA 300 WT

Se administró ratones deficientes en fibrinógeno (Fib-/-) de un acervo C57Black/6J, generados como se describe en Suh et al. (Genes & Development. 1995 Aug 15; 9 (16): 2010-2033), de edad y sexo equiparados, entre 8-12 semanas, con pFib y411/411 o pFibY427/411 humano o pFib total por inyección en la vena de la cola. Todos los grupos de tratamiento consistieron en al menos 9 animales. Después de la inyección con diversas especies de fibrinógeno o PBS como control, los animales se expusieron a 5 x 108 UFC (Fig. 8A) o 1,0 x 109 UFC (Fig. 8B) de S. aureus USA 300 WT.

La Fig. 8A muestra que más del 50 % de los animales en el grupo inyectado con 6 mg de pFib y411/411 murieron en 16 horas después de la exposición a las bacterias S. aureus. En el grupo inyectado con 6 mg de pFibY427/411, esto necesitó más de 48 horas. La sustitución de 50 % del sitio de unión a ClfA en el extremo carboxilo de la cadena gamma de fibrinógeno (AGDV) con el 20-mero de SEQ ID NO. 2 parece proporcionar un aumento de 2-3 veces en el tiempo de supervivencia (véase también el Ejemplo 10). Esto no se podría esperar de la bibliografía o de los resultados para FibY wt/A 5 en el Ejemplo 6.

La Fig. 8B muestra que más del 70 % de los animales inyectados con PBS (control), 3 mg de pFib total o 3 mg de pFib Y411/411 murieron en 16 horas después de la exposición a las bacterias de S. aureus. Muy sorprendentemente, de los animales inyectados con 3 mg de pFibY427/411, más del 70 % murieron solo después del periodo de 68 horas. Este fuerte aumento en el tiempo de supervivencia después de la infección de S. aureus de alta dosis fue altamente sorprendente en vista del pequeño aumento en el tiempo de supervivencia observado con ratones Fib YWT/ñ5 a una dosis moderada (Fig. 7B) y la ausencia de cualquier ventaja de supervivencia en ratones Fib yw™5 a la alta dosis de S. aureus (Fig. 7C). Por tanto, el efecto de supervivencia de pFib y427/411, en el que el motivo AGDV está sustituido por un péptido 20-mero (SEQ ID NO. 2), parece ser significativamente diferente de y superior al efecto de supervivencia del fibrinógeno delta 5 en el que el motivo QAGDV está delecionado. Sin desear quedar ligado a teoría, parece que el efecto observado con el 20-mero de SEQ ID NO. 2 solo está parcialmente relacionado con la inhibición de la interacción de ClfA con su motivo de unión en la cadena gamma del extremo carboxilo de fibrinógeno, que indica que la secuencia 20-mera podría tener un efecto inesperado y desconocido adicional sobre el patógeno o el hospedador, efecto que es independiente de la unión al fibrinógeno.

Ejemplo 8 Tratamiento profiláctico de ratones WT con dosis única de pFib Y427/411 y pFib Y411/411

Se administró ratones WT (C57Black/6J), edad y sexo equiparados, entre 8-12 semanas, con 6 mg de pFib y411/411 o pFib y427/411 por inyección en la vena de la cola. Todos los grupos de tratamiento consistieron en 10 animales. La infección con S. aureus USA 300 WT también se estableció por inyección en la vena de la cola. Después de 30 minutos, los animales se expusieron a 3,2 x 108 UFC de la cepa de S. aureus USA 300 WT. Se administró los animales de control con PBS solo. El periodo de observación total fue 6 días.

La Fig. 9 muestra que más del 50 % de los animales inyectados con pFib y411/411 murieron en 35 horas después de la exposición a bacterias de S. aureus. De los animales inyectados con pFibY427/411, más del 50 % muere después de durante un periodo de aproximadamente 84 horas. Esto muestra que el tratamiento profiláctico de ratones WT con una dosis única de pFibY427/411 proporciona una ventaja de supervivencia en comparación con el tipo pFib ^y411/411. Esto es altamente sorprendente en vista de: 1) la unión y el comportamiento de agrupamiento del heterodímero de pFibY427/411 y pFib ^y411/411 es muy similar y 2) los resultados también muestran que el heterodímero de pFibY427/411 proporciona un aumento en la supervivencia, a pesar de la presencia del propio fibrinógeno WT de los ratones. Estos resultados indican que pFibY427/411 tiene relevancia clínica, puesto que proporciona una ventaja en la supervivencia en presencia del propio fibrinógeno del hospedador.

Ejemplo 9 Tratamiento terapéutico de ratones deficientes en fibrinógeno con dosis repetidas de pFib Y427/411 o pFib y411/411

Se expusieron en primer lugar los ratones deficientes en fibrinógeno a 5 x 108 UFC de la cepa S. aureus USA 300 WT y luego se trataron 1-2 horas después de la infección con una dosis de 0,30 mL de fibrinógeno disuelta en PBS hasta una concentración de 20 mg/mL (6 mg/animal), seguido por un segundo tratamiento a las 96 horas después de la infección con la misma dosis de fibrinógeno. Se administraron 0,3 mL de PBS en ambos momento de tiempo del tratamiento al grupo de control.

La Figura 10 muestra que más del 50 % de los animales inyectados con PBS (control) murieron después de 60 horas, mientras que en el grupo tratado con pFib y411/411 > 50 % murieron después de 92 horas. Se observó una mejora sorprendentemente significativa en la supervivencia en el grupo tratado con pFib y427/411 donde más del 50 % de los animales murieron después de 146 horas. Estos resultados indican que todavía cabe esperar un efecto terapéutico significativo de pFib y427/411 sobre la infección con S. aureus cuando se administra después de que haya ocurrido la infección.

Ejemplo 10 Mejora del tiempo de supervivencia para la deleción y la sustitución de sitios de unión bacterianos.

Se compararon las mejoras del tiempo de supervivencia en ratones transgénicos que llevan la mutación delta 5 (aminoácidos del sitio de unión a ClfA delecionados, no sustituidos) como se informa en el Ejemplo 6, con mejoras del tiempo de supervivencia del tratamiento profiláctico con pFib y 427/411 (aminoácidos del sitio de unión a ClfA sustituidos con péptido 20-mero SEQ ID NO. 2) como se informa en el Ejemplo 7 y 8. El aumento relativo en el tiempo de supervivencia se calcula a partir de los datos de supervivencia en los Ejemplos 6, 7 y 8 determinando el momento de tiempo en el que el 50 % o menos de los ratones en tratamiento y de control han sobrevivido (t < 50 %) usando la siguiente fórmula:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección, comprendiendo la composición un fibrinógeno de variante que tiene dos cadenas polipeptídicas alfa, dos cadenas polipeptídicas beta y dos cadenas polipeptídicas gamma, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia según SEQ ID NO. 3.

2. Una composición para su uso según la reivindicación 1, en donde una de las cadenas polipeptídicas gamma comprende una secuencia según SEQ ID NO. 1 y la otra cadena polipeptídicas gamma comprende una secuencia según SEQ ID NO. 3.

3. La composición para su uso según cualquier reivindicación precedente, que comprende además no más de aproximadamente 75 % de un fibrinógeno que comprende dos cadenas polipeptídicas alfa, dos beta y dos gamma, en donde los extremos carboxilo de ambas cadenas polipeptídicas gamma son según SEQ ID NO. 1 y en donde el 75 % es en peso del fibrinógeno total en la composición.

4. La composición para su uso según cualquier reivindicación precedente, en donde el fibrinógeno en la composición es recombinante o se obtiene de plasma o mezclas de los mismos.

5. La composición para su uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la infección en un sujeto humano o animal se provoca por o se asocia a un patógeno que se une al extremo carboxilo de la cadena gamma de fibrinógeno.

6. La composición para su uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la infección se provoca por uno o más patógenos seleccionados del grupo que consiste en bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas y hongos.

7. La composición para su uso según la reivindicación 6, en donde el patógeno se selecciona del grupo que consiste en los géneros Escherichia, Bacteroides, Salmonella, Yersinia, Neisseria, Pseudomonas, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Clostridium, Listeria, Bacillus; Aspergillus y Candida.

8. La composición para su uso según cualquiera de la reivindicación 6 o 7, en donde el patógeno es Staphylococcus aureus, que incluye cepas de S. aureus resistentes a vancomicina, S. aureus resistentes a meticilina y de S. aureus multirresistentes.

9. La composición para su uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la infección se selecciona de una o más de: neumonía; septicemia; bacteremia; peritonitis; endocarditis; infección de la piel o de tejido blando; infecciones osteoarticulares; infección de articulaciones protésicas; infección de hueso; infección pleuropulmonar; infección de heridas; abscesos epidurales; meningitis; síndrome de choque tóxico; infección urinaria o tromboflebitis séptica.

10. La composición para su uso según cualquier reivindicación precedente, que comprende además uno o más antimicrobianos.

11. La composición para su uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la composición es para administración por inyección o infusión.

12. La composición para su uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la composición es para administración por inyección intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, intraglandular o intravesicular, o infusión.

13. La composición para su uso según cualquier reivindicación precedente, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. La composición para su uso según cualquier reivindicación precedente que se administra a seres humanos, mascotas, aves de corral, ganado, animales de competición o roedores.