ES2833076T3

ES2833076T3 - Métodos para el tratamiento de la obesidad y/o el síndrome metabólico

Info

Publication number: ES2833076T3
Application number: ES12785672T
Authority: ES
Inventors: Ravi Krishnan; Silviu Itescu
Original assignee: Mesoblast Inc
Current assignee: Mesoblast Inc
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2021-06-14
Anticipated expiration: 2032-05-18
Also published as: AU2012255621A1; EP2709634A1; JP2014513701A; JP6091492B2; US20140294775A1; CN107638428A; EP2709634A4; EP2709634B1; CN103619342A; KR20140053909A; CN103619342B; AU2016247132A1; CA2836488A1; KR101967492B1; AU2018247196A1; AU2016247132B2; US9388385B2; IL229438A0; SG194930A1; US20170119822A1

Abstract

Una población de células enriquecidas con células multipotenciales STRO-1+ no hematopoyéticas para su uso en un método de reducción de peso terapéutico de un sujeto o tratamiento terapéutico o prevención de peso excesivo u obesidad en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar al sujeto la población de células, en donde la población de células comprende al menos un 1% de células multipotenciales STRO-1+ no hematopoyéticas.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para el tratamiento de la obesidad y/o el síndrome metabólico

Campo

La presente divulgación se refiere a métodos para tratar o prevenir la obesidad y/o el síndrome metabólico.

Antecedentes

Síndrome metabólico

El síndrome metabólico (syn. síndrome X) es un trastorno complejo con un alto coste socioeconómico que se considera una epidemia mundial. Se considera que aproximadamente el 32% de las personas en E.E.UU. padecen síndrome metabólico, y el riesgo aumenta con la edad (por ejemplo, se considera que el 40% de las personas de entre 40 y 60 años padecen este síndrome). El síndrome metabólico se asocia con un mayor riesgo de muchos trastornos, como enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad aterosclerótica, hipertensión, accidente cerebrovascular y diabetes de tipo 2. Actualmente, el síndrome metabólico se diagnostica en base a la presencia de tres o más de los siguientes criterios:

° Circunferencia de cintura elevada: la definición de elevada depende de la raza, el país y el sexo;

° Triglicéridos elevados: s 150mg/dL de sangre (1,7 mmol/L de sangre) o tratamiento con fármacos por trigli céridos elevados;

° Colesterol por lipoproteína de alta densidad (HDL) reducida: <40 mg/dL de sangre (1,0 mmol/L de sangre) en hombre, <50 mg/dL de sangre (1,3mmol/L de sangre) en mujeres o tratamiento con fármacos para el colesterol por lipoproteína de alta densidad elevado;

° Presión arterial elevada: sistólica S130 mm Hg y/o diastólica s85 mm Hg o tratamiento con fármacos para la hipertensión (o tratamiento con fármacos para la presión arterial elevada); y

° Glucosa en ayunas elevada: S100 mg/dL de sangre (o tratamiento farmacológico para la hipergluce mia)

Las terapias no farmacológicas actuales para el síndrome metabólico incluyen ejercicio y dieta. Los tratamientos farmacológicos generalmente se dirigen a uno de los síntomas del síndrome metabólico. Por ejemplo, se ha sugerido que los compuestos que mejoran los niveles de triglicéridos y HDL son útiles para tratar el síndrome metabólico. Sin embargo, estos medicamentos sufren varios efectos secundarios indeseables. Por ejemplo:

• El clofibrato (un derivado del ácido fíbrico) aumenta las tasas de morbilidad y mortalidad. Además, se ha demostrado la tumorigenicidad en roedores. Los ensayos clínicos han demostrado que algunos fibratos también causan aumentos reversibles en los niveles de creatinina sérica.

• La niacina tiene múltiples efectos adversos, el peor de los cuales es la hepatitis química. Otros efectos secundarios incluyen enrojecimiento, picazón y sarpullido.

• Las estatinas están asociadas con dolor muscular y rabdomiólisis (que puede provocar insuficienaa renal y la muerte), debilidad muscular, neuropatía y pérdida de memoria. Además, las estatinas tienen una vida media relativamente corta y requieren una dosificación regular para proporcionar un beneficio terapéutico. Por ejemplo, la atorvastatina tiene una vida media efectiva de aproximadamente 20-30 horas y se considera una estatina de acción prolongada.

Resultará evidente de lo anterior que existe una necesidad en la técnica de métodos terapéuticos/profilácticos para el síndrome metabólico. Los métodos terapéuticos/profilácticos ilustrativos tratarán o evitarán varios síntomas del síndrome metabólico.

Obesidad

La incidencia de la obesidad ha aumentado dramáticamente en todo el mundo, más particularmente en las últimas 3 décadas. Alrededor del año 2000, un total de 38,8 millones de adultos americanos o el 30% de la población de ese país se clasificaban como obesos (es decir, que tienen una puntuación de índice de masa corporal de al menos 30 kg/m2 para los caucásicos, 25 kg/m2 para los japoneses y 28 kg/m2 para los chinos). La obesidad está asociada con o se piensa que causa un número de enfermedades o trastornos, y se estima que se atribuyen aproximadamente 280.000 muertes cada año en los Estados Unidos a los trastornos relacionados con la obesidad.

La obesidad es un factor de riesgo para desarrollar muchas complicaciones relacionadas con la obesidad, desde condiciones debilitantes no fatales, como, por ejemplo, osteoartritis y trastornos respiratorios, hasta trastornos crónicos potencialmente mortales, como, por ejemplo, hipertensión, diabetes tipo 2, aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, algunas formas de cáncer y accidente cerebrovascular.

A medida que aumenta el número de sujetos obesos (solo en los EE. UU. la incidencia de obesidad aumentó un tercio en la última década), la necesidad de desarrollar estrategias nuevas y efectivas para controlar la obesidad y la obesidad y las complicaciones relacionadas es cada vez más importante.

A pesar de la alta prevalencia de la obesidad y de los muchos avances en nuestra comprensión de cómo se desarrolla, las estrategias terapéuticas actuales han fracasado persistentemente en lograr el éxito a largo plazo. Además, de los sujetos que pierden peso, aproximadamente del 90 al 95 por ciento recuperan posteriormente el peso perdido. Actualmente existen pocos fármacos terapéuticos aprobados por la FDA para el tratamiento a largo plazo de la obesidad. Uno de estos compuestos, orlistat, es un inhibidor de la lipasa pancreática que actúa bloqueando la absorción de grasa en el cuerpo. Sin embargo, el uso de este fármaco también se acompaña de los efectos secundarios desagradables del paso de la grasa no digerida del cuerpo.

Otro fármaco comúnmente utilizado para el tratamiento de la obesidad es la sibutramina, un supresor del apetito. La sibutramina es una p -fenetilamina que inhibe selectivamente la recaptación de noradrenalina y serotonina en el cerebro. Desafortunadamente, el uso de sibutramina también se asocia con presión arterial elevada y aumento de la frecuencia cardíaca. Como resultado de estos efectos secundarios, la dosificación de sibutramina se limita a un nivel por debajo de la dosis más eficaz.

Los compuestos para el tratamiento a corto plazo de la obesidad incluyen supresores del apetito, tales como derivados de anfetaminas. Sin embargo, estos compuestos son altamente adictivos. Además, los sujetos responden de manera diferente a estos medicamentos para bajar de peso, algunos pierden más peso que otros y otros no pierden peso en absoluto.

Resultará evidente para el experto en la técnica basándose en lo anterior, que existe una necesidad en la técnica de métodos para tratar o prevenir la obesidad o reducir el peso corporal.

Compendio

La presente invención se dirige al tema expuesto en las reivindicaciones adjuntas.

Se describe que los presentes inventores han encontrado que son capaces de reducir el peso y/o tratar la obesidad y/o tratar el síndrome metabólico en un modelo de primate no humano utilizando preparaciones de células STRO-1. Por ejemplo, los inventores han encontrado que al administrar preparaciones de células STRO-1+ se reducen los niveles de triglicéridos y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), aumentan los niveles de HDL, mejora la tolerancia a la glucosa, se reducen los niveles de insulina y glucosa en ayunas y se reduce el peso. Por tanto, la divulgaaón muestra que los inventores fueron capaces de tratar numerosos síntomas requeridos para el diagnóstico del síndrome metabólico. Los inventores también divulgan que una sola administración de las preparaciones celulares proporaona un beneficio terapéutico durante al menos tres meses y que múltiples administraciones pueden extender este tiempo y aumentar el nivel de beneficio.

La presente divulgación proporciona un método para reducir el peso de un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una población de células enriquecidas en células STRO-1 y/o su progenie y/o factores soludes derivados de las mismas.

En un ejemplo, el sujeto tiene sobrepeso. En un ejemplo, el sujeto es obeso.

En un ejemplo, el sujeto padece diabetes de tipo 2. En otro ejemplo, el sujeto no padece diabetes de tipo 2.

La presente divulgación proporciona adicionalmente un método de tratamiento o prevención de la obesidad en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una población de células enriquecidas en células STRO-1+ y/o su progenie y/o factores solubles derivados de las mismas.

En un ejemplo, la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles reduce el peso corporal en al menos 3% o 3,5% aproximadamente 4 semanas después de la administración.

En un ejemplo, la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles reduce el peso corporal en al menos 4% o 4,5% aproximadamente 8 semanas después de la administración.

En un ejemplo, la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles reduce el peso corporal en al menos 4% o 4,5% aproximadamente 12 semanas después de la administración.

Por ejemplo, la reducción del peso corporal es después de la administración inicial de las células.

En un ejemplo, el método comprende administrar la población y/o la progenie y/o los factores solubles al menos dos veces. Por ejemplo, cada administración está separada por un período de aproximadamente 12 semanas. En un ejemplo, la administración reduce el peso corporal en al menos aproximadamente un 5% 16 semanas después de la administración inicial.

En un ejemplo, el método comprende administrar la población y/o la progenie y/o los factores solubles al menos dos veces, en donde cada administración está separada por un período de aproximadamente 12 semanas y la administración reduce el cuerpo peso en al menos aproximadamente un 6% 20 semanas después de la administración inicial.

En un ejemplo, la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles no hace que el sujeto consuma significativamente menos alimentos y/o no reduce significativamente el deseo del sujeto de consumir alimentos. Esto no quiere decir que el método no comprenda adicionalmente consumir menos alimentos (p. ej., en comparación con la cantidad consumida antes del tratamiento o antes en el tratamiento del sujeto), solo que la administración no afecta por sí misma el consumo de alimentos del sujeto.

La presente divulgación también proporciona un método de tratamiento o prevención del síndrome metabólico o un síntoma del mismo en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una población de células enriqueadas en células STRO-1+ y/o su progenie y/o factores solubles derivados de las mismas.

En un ejemplo, el síntoma del síndrome metabólico se selecciona del grupo que consiste en triglicéridos elevados, lipoproteínas de baja densidad elevadas, lipoproteínas de alta densidad reducidas, índice de lipoproteínas reducido, niveles elevados de glucosa en ayunas, niveles elevados de insulina en ayunas, aclaramiento reducido de glucosa después de la alimentación, resistencia a la insulina, tolerancia alterada a la glucosa, obesidad y combinaciones de los mismos.

En un ejemplo, el método reduce o previene dos o tres o cuatro o cinco o todos los síntomas anteriores.

En un ejemplo, la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles da como resultado uno o más de los siguientes:

(i) triglicéridos reducidos;

(ii) lipoproteínas de baja densidad reducidas;

(iii) lipoproteínas de alta densidad aumentadas;

(iv) aumento del índice de lipoproteínas;

(v) niveles reducidos de glucosa en ayunas;

(vi) niveles reducidos de insulina en ayunas;

(vii) aclaramiento de glucosa después de la alimentación aumentada;

(viii) resistencia a la insulina reducida; y

(ix) peso corporal reducido.

En un ejemplo, la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles da como resultado dos o tres o cuatro o cinco o todos los anteriores.

En un ejemplo, el método previene la progresión o empeoramiento del síndrome metabólico y/o síntoma del mismo. En un ejemplo, un método tal como se describe en este documento en cualquier ejemplo comprende la administración de una población de células enriquecidas de células STRO-1brillantes y/o su progenie y/o factores solubles derivados de las mismas.

En un ejemplo, un método como se describe en este documento en cualquier ejemplo comprende administrar una población de células enriquecidas en células STRO-1+ y células de fosfatasa+ alcalina no específica de tejido (TNAP)+ y/o su progenie y/o factores solubles derivados de las mismas.

En un ejemplo, la población enriquecida de células STRO-1 y/o su progenie y/o factores solubles derivados de las mismas se administran sistémicamente. Por ejemplo, la población y/o la progenie y/o los factores solubles se administran por vía intravenosa.

En un ejemplo, la población y/o la progenie y/o los factores solubles se administran una pluralidad de veces.

Por ejemplo, la población y/o la progenie y/o los factores solubles se administran una vez cada dos o más semanas. Por ejemplo, la población y/o la progenie y/o los factores solubles se administran una vez cada tres o más semanas. Por ejemplo, la población y/o la progenie y/o los factores solubles se administran una vez cada cuatro o más semanas. En un ejemplo, el método comprende monitorear al sujeto y administrar una dosis adicional de la población y/o la progenie y/o los factores solubles cuando ocurre uno o más de los siguientes:

(i) los niveles de triglicéridos aumentan a un nivel superior al detectado un mes o dos meses después de la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles o un nivel similar al detectado antes de una administración inicial de la población y/o la progenie y/o los factores solubles;

(ii) los niveles de lipoproteínas de baja densidad aumentan a un nivel superior al detectado un mes o dos meses después de la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles o hasta un nivel similar al detectado antes de una administración inicial de la población y/o la progenie y/o los factores solubles;

(iii) los niveles de lipoproteínas de alta densidad disminuyen a un nivel por encima del detectado un mes o dos meses después de la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles o a un nivel similar al detectado antes de una administración inicial de la población y/o la progenie y/o los factores solubles;

(iv) el índice de lipoproteínas se reduce a un nivel superior al detectado un mes o dos meses después de la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles o a un nivel similar al detectado antes de una administración inicial de la población y/o la progenie y/o los factores solubles;

(v) los niveles de glucosa en ayunas aumentan a un nivel superior al detectado un mes o dos meses después de la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles o a un nivel similar al detectado antes de una administración inicial de la población y/o la progenie y/o los factores solubles;

(vi) los niveles de insulina en ayunas se reducen a un nivel superior al detectado un mes o dos meses después de la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles o a un nivel similar al detectado antes de una administración inicial de la población y/o la progenie y/o los factores solubles;

(vii) el aclaramiento de glucosa después de la alimentación se reduce a un nivel superior al detectado un mes o dos meses después de la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles o a un nivel similar al detectado antes de una administración inicial de la población y/o la progenie y/o los factores solubles;

(viii) la resistencia a la insulina aumenta a un nivel superior al detectado un mes o dos meses después de la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles o hasta un nivel similar al detectado antes de una administración inicial de la población y/o la progenie y/o los factores solubles; y

(ix) aumento de peso corporal a un nivel superior al detectado un mes o dos meses después de la administración de la población y/o la progenie y/o los factores solubles o hasta un nivel similar al detectado antes de una administraaón inicial de la población y/o la progenie y/o los factores solubles.

En un ejemplo, un método descrito en este documento según cualquier ejemplo comprende administrar una dosis de la población y/o la progenie y/o los factores solubles suficiente para lograr uno o más de los siguientes:

(i) reducir los triglicéridos;

(ii) reducir las lipoproteínas de baja densidad;

(iii) aumentar las lipoproteínas de alta densidad;

(iv) aumentar el índice de lipoproteínas;

(v) reducir los niveles de glucosa en ayunas;

(vi) reducir los niveles de insulina en ayunas;

(vii) aumentar el aclaramiento de glucosa después de la alimentación;

(viii) reducir la resistencia a la insulina; y

(ix) reducir el peso corporal.

En un ejemplo, la dosis es suficiente para lograr al menos dos o tres o cuatro de cinco o todo lo anterior.

En un ejemplo, un método descrito en este documento según cualquier ejemplo comprende administrar entre 0,1 x 106 a 5 x 106 células STRO-1+ y/o la su progenie por kg.

En un ejemplo, un método descrito en este documento según cualquier ejemplo comprende administrar entre 0,3 x 106 a 2 x 106 células STRO-1+ y/o su progenie por kg. Por ejemplo, el método comprende administrar aproximadamente 1 x 106 o 2 x 106 células STRO-1+ y/o su progenie por kg.

En un ejemplo, un método descrito en este documento según cualquier ejemplo comprende administrar una dosis baja de células STRO-1+ y/o su progenie. Por ejemplo, una dosis baja de células STRO-1+ y/o su progenie comprende entre 0,1 x 105 y 0,5 x 106 células STRO-1+ y/o su progenie por kg. Por ejemplo, una dosis baja de células STRO-1 y/o su progenie comprende aproximadamente 0,3 x 106 STRO-1+ y/o su progenie por kg.

En un ejemplo, la población y/o las células de la progenie son autogénicas o alogénicas y/o los factores solubles pueden derivarse de células autogénicas o alogénicas. En un ejemplo, la población y/o la progenie son alogénicas y/o los factores solubles son de células alogénicas.

De acuerdo con el ejemplo anterior, el método puede comprender adicionalmente obtener la población y/o células de la progenie y/o factores solubles o puede comprender adicionalmente aislar la pobl ación y/o células de progenie y/o factores solubles. En un ejemplo, la población y/o las células de la progenie se basan en la expresión de STRO-1 y/o TNAP.

En un ejemplo, la población y/o las células de la progenie y/o los factores solubles se obtienen d el sujeto que está siendo tratado. En otro ejemplo, la población y/o las células de la progenie y/o los factores solubles se obtienen de un sujeto diferente de la misma especie.

En un ejemplo, la población enriquecida en células STRO-1+ y/o células de la progenie se ha expandido en cultvo antes de la administración y/o antes de obtener los factores solubles.

De acuerdo con el ejemplo anterior, un método como se describe en este documento de acuerdo con cualquier ejemplo puede comprender adicionalmente cultivar la población y/o las células de la progenie.

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie y/o los factores solubles derivados de las mismas se administran en forma de una composición que comprende dichas células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o factores solubles derivados de los mismos y un portador y/o excipiente.

De acuerdo con el ejemplo anterior, un método como se describe en este documento de acuerdo con cualquier ejemplo puede comprender adicionalmente formular la población y/o progenie y/o factores solubles en una composición.

En un ejemplo, el sujeto padece obesidad y/o padece síndrome metabólico. Por ejemplo, el sujeto necesita tratamiento. En un ejemplo, el sujeto tiene riesgo de padecer obesidad y/o padecer síndrome metabólico.

La presente divulgación también proporciona una población de células enriquecidas en células STRO-1+ y/o su progenie y/o factores solubles del mismo derivadas para su uso en el tratamiento o prevención de la obesidad y/o síndrome metabólico y/o un síntoma de síndrome metabólico.

La presente divulgación también proporciona el uso de una población de células enriquecidas para STRO-1+células y/o su progenie y/o factores solubles de los mismos derivados en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir obesidad y/o síndrome metabólico y/o un síntoma de síndrome metabólico en un sujeto.

La presente divulgación también proporciona un kit que comprende una población de células enriquecidas en células STRO-1+ y/o su progenie y/o factores solubles derivados de las mismas envasado con instrucciones para su uso en un método descrito en este documento de acuerdo con cualquier ejemplo.

Por ejemplo, la presente divulgación proporciona un kit que comprende una composición que comprende la población y/o la progenie y/o los factores solubles envasados con información del producto que indica el uso de la composiaón en un método descrito en este documento de acuerdo con cualquier ejemplo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Coexpresión de TNAP (STRO-3) y el Marcador de Células Precursoras Mesenquimales, STRO-1 brillante mediante células morfonucleares de médula ósea Humana Adulta (BMMNC). Se realizó una inmunofluorescencia de color dual y citometría de flujo mediante incubación de BMMNC de STRO-1 seleccionadas por MACS y marcadas indirectamente con un anticuerpo de IgM de cabra antimurino acoplado con FITC (eje x) y mAb STRO-3 (IgG1 murino) marcado indirectamente con una IgG de cabra antimurina acoplada con PE (eje y). El histograma del diagrama de puntos representa 5 x 104 sucesos recogidos como datos en modo lista. La líneas verticales y horizontales se fijaron a los niveles de reactividad de fluorescencia media <1,0% obtenida con los anticuerpos de control emparejados con isótopo, 1B5 (IgG) y 1A6.12 (IgM) tratados en las mismas condiciones. Los resultados demuestran que una población minoritaria de células STRO-1 brillantes coexpresaban TNAP (cuadrante superior derecho), mientras que el resto de células STRO-1+ no conseguían reaccionar con el mAb STRO-3.

Figura 2.Las representaciones gráficas que muestran histogramas de citometría de flujo representativos produados utilizando suspensiones de células individuales de MPC de cynomolgus derivados de médula ósea expandidas en cultivo con expresión positiva en la superficie celular de los marcadores de células madre mesenquimales, STRO-1, STRO-4 y CD146 (sólido) con respecto a los controles negativos (almohadillas) del isotipo (IgM, IgG2a e IgG1) detectados utilizando anticuerpos secundarios de cabra anti-IgM murino o IgG conjugado-FITC. Los histogramas representativos también muestran que las MPC de cynomolgus carecen de expresión en la superficie celular de los marcadores de monocitos/macrófagos (CD14), células madre/progenitoras hematópicas (CD34) y leucocitos maduros (CD45). Niveles de fluorescencia superiores al 1% en comparación con el control de isotipo significan positividad.

Figura 3.Representación gráfica que muestra el área media bajo la curva (AUC), durante un período de un mes de evaluación repetida, para la respuesta a la insulina en la fase inicial (5-20 minutos; lado a mano izquierda) y la fase tardía (30-60 minutos; lado a mano derecha) después del ensayo de tolerancia a la glucosa intravenosa (IVGTT). Los ensayos se realizaron en animales diabéticos y no diabéticos (como se indica).

Figura 4.Representación gráfica que muestra la respuesta de insulina de fase tardía del área bajo la curva (AUC^{30-60 min}) mensual media después de la infusión intravenosa de glucosa. Se representan los datos individuales para cada animal diabético y no diabético (como se indica) durante un mes antes y 6 meses después del tratamiento con MPC. Las flechas indican el momento en el que se infundió MPC.

Figura 5. Representaciones gráficas que muestran que dosis sucesivas de MPC inducen un aumento progresivo en la respuesta de insulina de fase tardía a la carga de glucosa. Las representaciones en el Panel (a) muestran la respuesta de insulina de fase tardía del Área Bajo la Curva (AUC^30-60min) mensual media después de la infusión intravenosa de glucosa para los grupos de animales diabéticos y no diabéticos (como se indica). Se muestran los datos de los grupos de diabéticos y no diabéticos durante un mes antes y 6 meses después del tratamiento con MPC. Las flechas indican el momento en el que se infundió MPC. Las representaciones en el Panel 3(b) ilustran el cambio porcentual mensual medio en la respuesta a la insulina de fase tardía por grupo en relación con los valores de referencia no tratados.

Figura 6. Representación gráfica que muestra la tasa media mensual de aclaramiento de glucosa en sangre durante la fase tardía de la respuesta a la insulina (30-60 min) después de la infusión intravenosa de glucosa. Se demuestran los datos individuales para cada animal diabético y no diabético (como se indica) durante un mes antes y 6 meses después del tratamiento con MPC. Las flechas indican el momento en que se infundieron los MPC.

Figura 7. Las representaciones gráficas que muestran MPC inducen un aumento progresivo en el aclaramiento de glucosa después de una alta carga de glucosa. El panel (a) muestra la tasa media mensual de aclaramiento de glucosa en sangre durante la fase tardía de la respuesta a la insulina (30-60 min) después de la infusión intravenosa de glucosa. Se muestran los datos individuales para los grupos de diabéticos y no diabéticos durante un mes antes y 6 meses después del tratamiento con MPC. Las flechas indican el momento en que se infundieron los MPC. El panel 5(b) representa el cambio porcentual mensual medio en la velocidad de eliminación de glucosa por grupo en relación con la línea de base previa al tratamiento.

Figura 8. Representaciones gráficas que muestran los niveles medios mensuales de glucosa en sangre en ayunas (paneles superiores) y los niveles medios mensuales de insulina en ayunas (paneles inferiores) en monos tratados con MPC. Se representan los datos individuales de los animales no diabéticos (BGL en ayunas >110 mg/dl) y diabéticos (BGL en ayunas <110 mg/dl en el nivel basal) durante un mes antes y 6 meses después del tratamiento con MPC.

Figura 9.Representaciones gráficas que muestran los niveles medios mensuales de glucosa en sangre en ayunas (paneles superiores) y los niveles medios mensuales de insulina en ayunas (paneles inferiores) de los animales que recibieron MPC. Se muestran los datos de los grupos de animales no diabéticos (BGL en ayunas en la línea de base >110 mg/dl) y diabéticos (BGL en ayunas <110 mg/dl en la línea de base) durante un mes antes y 6 meses después del tratamiento con MPC. Las flechas indican el momento en que se infundieron los MPC.

Figura 10. Representaciones gráficas que muestran que el tratamiento con MPC induce una pérdida de peso sostenida, a pesar de una ingesta dietética elevada continua. El panel (a) muestra los cambios medios mensuales del peso corporal en animales diabéticos y no diabéticos. Se muestran los datos individuales para los animales diabéticos y no diabéticos durante un mes antes y 6 meses después del tratamiento con MPC. Las flechas indican el momento en que se infundieron los MPC. La dosis de MPC para cada animal se muestra en la parte superior de cada panel. El panel (b) muestra la cantidad de alimento consumido (número medio de pelets consumidos por semana) para cada animal individual durante el período de mediciones de peso. El panel (c) muestra la pérdida de peso porcentual mensual media en el grupo combinado de animales después de la terapia con MPC en relación con la línea de base no tratada. La pérdida de peso osciló entre el 4% y el 6% durante el curso del tratamiento con MPC.

Figura 11. Representaciones gráficas que muestran perfiles de lípidos en ayunas mensuales (como se indica) en animales diabéticos y no diabéticos. Se representan los datos individuales para animales diabéticos y no diabéticos durante un mes antes y 6 meses después del tratamiento con MPC. Las flechas indican el momento en que se infundieron los MPC. La dosis de MPC para cada animal se muestra en la parte superior de cada panel.

Figura 12. Representaciones gráficas que muestran perfiles de lípidos en ayunas mensuales medios (como se indica) en animales diabéticos y no diabéticos. Se muestran los datos para los grupos de diabéticos y no diabéticos durante un mes antes y 6 meses después del tratamiento con MPC. Las flechas indican el momento en que se infundieron los MPC.

Descripción detallada

Técnicas Generales y Definiciones Seleccionadas

A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se especifique o que el contexto exija lo contrario, al hacer referencia a una única etapa, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia se entenderá que esta abarca uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de dichas etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupo de composiciones de materia.

Cada ejemplo descrito en este documento se debe aplicar mutatis mutandis a cada y uno de los otros ejemplos de la divulgación a menos que se establezca específicamente otra cosa.

Los expertos en la materia apreciarán que la presente divulgación y los ejemplos individuales de la misma es susceptible a variaciones y modificaciones además de las que se describen específicamente. Se ha de entender que la divulgación incluye todas tales variaciones y modificaciones. La divulgación también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos referidas a o indicadas en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o dos o más cualquiera de dichas etapas o características. El alcance de la presente divulgación no está limitado por los ejemplos específicos descritos en esta invenóón, que están destinados únicamente a fines de ejemplo. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la divulgaaón y ejemplos de la misma. como se describe en este documento.

La presente divulgación se lleva a cabo sin experimentación indebida utilizando, a menos que se indique lo contrario, técnicas convenaonales de biología molecular, microbiología, virología, tecnología de ADN recombinante, síntesis de péptidos en disolución, síntesis de péptidos en fase sólida e inmunología. Tales procedimientos se describen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, segunda edición (1989), totalidad de volúmenes I, II, y III; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I y II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, totalidad del texto; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, totalidad de texto, y en particular los documentos en el mismo de Gait, ppl-22; Atkinson y col., págs. 35-81; Sproat y col, págs. 83-115; y Wu y col., págs. 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practica! Approach (B. D. Flames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, totalidad de texto; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, totalidad de texto; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), totalidad de series, J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Alemania); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fen ichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. y Merrifield, R.B. (1979) en The Peptides (Gross, E. y Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, Nueva York. 12. Wünsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Müler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Partes 1 y 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, VoIs. I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); y Animal Cell Culture: Practica Approach, Tercera Edición (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, totalidad de texto.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto lo exija de otro modo, se entenderá que el término "comprenden”, o variaciones tales como "comprende" o "que comprende/comprenden" implican la inclusión de una determinada etapa o elemento o número entero o grupo de etapas o elementos o números enteros, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

Como se usa en este documento, el término "derivado de" se tomará para indicar que un número entero especificado puede obtenerse de una fuente particular, aunque no necesariamente directamente de esa fuente. En el contexto de los factores solubles derivados de las células STRO-1 y/o las células de su progenie, este término deberá entenderse como uno o más factores, p. ej., proteínas, péptidos, hidratos de carbono, etc., producidos durante el cultivo in vitro de células STRO-1 y/o células progenitoras de las mismas.

Como se usa en este documento, el término "triglicéridos elevados" se entenderá que significa aproximadamente 150 mg de triglicéridos o más por dL de sangre (1,7 mmol/L de sangre). Los métodos para evaluar los niveles de lípidos y/o lipoproteínas en un sujeto serán evidentes para el experto en la técnica e incluyen ultracentrifugaaón, inmunoensayos.

Como se usa en este documento, el término "lipoproteína de baja densidad elevada (LDL)" se entenderá que signifca 100 mg de LDL o más por dL de sangre, o 70 mg de LDL o más por dL para personas que padecen enfermedades cardíacas o aterosclerosis. Los métodos para evaluar los niveles de lípidos y/o lipoproteínas en un sujeto serán evidentes para el experto en la técnica e incluyen ultracentrifugaaón, inmunoensayos.

Como se usa en este documento, el término "colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL) reducido" se entenderá que significa 40 mg HDL o menos por dL de sangre (1,0 mmol/L de sangre) o menos en hombres o 50 mg HDL o menos por dL de sangre (1,3 mmol/L de sangre) en mujeres. Los métodos para evaluar los niveles de lípidos y/o lipoproteínas en un sujeto serán evidentes para el experto en la técnica e incluyen ultracentrifugación, inmunoensayos. Como se usa en este documento, el término "índice de lipoproteínas" se entenderá que significa la proporción de colesterol HDL a colesterol no HDL. Por tanto, cuanto mayor sea el nivel de HDL y/o menor el nivel de colesterol no HDL, mayor será la proporaón.

Como se usa en el presente documento, el término "niveles de glucosa elevados en ayunas" se entenderá que quiere decir un nivel de glucosa en plasma en ayunas de 5,6 mmol de glucosa por L de plasma (o 100 mg de glucosa por dL de plasma) a 6,9 mmol de glucosa por L de plasma (o 125 mg de glucosa por dL de plasma).

Como se usa en este documento, el término "niveles elevados de insulina en ayunas" se entenderá que significa un nivel de insulina en ayunas superior a aproximadamente 60 pmol/l. Esto también es evidencia de resistencia a la insulina.

Como se usa en este documento, el término "tolerancia a la glucosa alterada" se entenderá que significa una concentración de glucosa en plasma de 7,8 mmol/dL (140 mg/dL) o mayor (p. ej., de 7,8 a 11 mmol/dL (140-197mg/dL) dos horas después de la ingesta de una dosis oral de 75 granos de glucosa. Esta definición también contempla definiciones aceptadas, por ejemplo, evaluadas usando un ensayo de tolerancia a la glucosa intravenosa.

Como se usa en este documento, el término "resistenaa a la insulina" abarca una afección caracterizada por tolerancia alterada a la glucosa y/o niveles elevados de insulina en ayunas.

Como se usa en este documento, el término "sobrepeso" o "peso excesivo" se entenderá que significa un índice de masa corporal de 25 o más. En algunos ejemplos, este término abarca la obesidad. En algunos ejemplos, este término abarca la pre-obesidad, es decir, un IMC de 25-30. Este término también contempla otras definiciones clínicamente aceptadas de "sobrepeso". Los sujetos que tienen sobrepeso también se consideran en riesgo de desarrollar obesidad. La referencia en este documento a un sujeto "en riesgo de desarrollar síndrome metabólico" incluye sujetos en su sexta década y/o sujetos de raza hispana y/o asiática y/o mayor o igual a 25 y/o sujetos con antecedentes familiares de diabetes de tipo 2 y/o antecedentes familiares de diabetes durante el embarazo (diabetes gestacional) y/o antecedentes familiares de obesidad y/o un diagnóstico de uno o más de hipertensión arterial, enfermedad cardiovascular o síndrome de ovario poliquístico.

Como se usa en este documento, el término "cantidad eficaz" deberá entenderse como una cantidad suficiente de células STRO-1 y/o células de su progenie y/o factores solubles derivados de las mismas para lograr uno o más de lo siguiente:

(i) reducir los triglicéridos;

(ii) reducir las lipoproteínas de baja densidad;

(iii) aumentar las lipoproteínas de alta densidad;

(iv) aumentar el índice de lipoproteínas;

(v) reducir los niveles de glucosa en ayunas;

(vi) aumentar la secreción de insulina por el páncreas;

(vii) aumentar el aclaramiento de glucosa después de la alimentación;

(viii) reducir la resistencia a la insulina; y

(ix) reducir el peso corporal.

Como se usa en este documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz' deberá entenderse como una cantidad suficiente de células STRO-1 y/o células de su progenie y/o factores solubles derivados de las mismas para tratar el síndrome metabólico y/o la obesidad, es decir, de manera que el sujeto ya no satisfaga los criterios clínicos de síndrome metabólico y/o la obesidad. Por ejemplo, el peso de un sujeto obeso se reduce hasta un punto en el que el sujeto ya no es obeso (p. ej., puede tener sobrepeso o ser normal).

Como se usa en este documento, el término "cantidad profilácticamente eficaz" deberá entenderse como una cantidad suficiente de células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o factores solubles derivados de las mismas para prevenir o inhibir o retrasar la aparición del síndrome metabólico y/o la obesidad, p. ej., evitando que un sujeto desarrolle los criterios clínicos para un diagnóstico de síndrome metabólico y/o la obesidad. Por ejemplo, un sujeto con sobrepeso se trata de manera que no continúe aumentando de peso hasta un punto en el que sea obeso.

Como se usa en este documento, el término "dosis baja" se entiende que significa una cantidad de STRO-1+células y/o progenie de la misma menos de 1x106y aun así suficiente para ser una "efectiva cantidad "como se define en este documento y/o una" cantidad terapéuticamente eficaz "y/o una" cantidad profilácticamente eficaz "como se define en este documento. Por ejemplo, una dosis baja comprende 0,5 x 106 células o menos o 0,4 x 106 o menos células o 0,3 x106 o menos células o 0,1 x 106 o menos células.

Como se usa en este documento, el término "tratar" o "tratamiento" o "tratar" se entenderá que significa administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de factores solubles y/o células y reducir o inhibir síntoma(s) del síndrome metabólico de manera que el sujeto ya no sea diagnosticado clínicamente con el síndrome y/o reduzca el peso de un sujeto de manera que ya no sea obeso.

Como se usa en este documento, el término "prevenir" o "que previene" o "prevención" debe tomarse como que significa administrar una cantidad profilácticamente eficaz de factores solubles y/o células y detener, obstaculizar o retrasar la desarrollo o progresión del síndrome metabólico y/o para detener, dificultar o retrasar el desarrollo de la obesidad.

Como se usa en este documento, el término "factores solubles" deberá tomarse como que significa cualquier molécda, p. ej., proteína, péptido, glicoproteína, glicopéptido, lipoproteína, lipopéptido, hidrato de carbono, etc. produado por células STRO-1+ y/o su progenie que son solubles en agua. Dichos factores solubles pueden ser intracelulares y/o secretados por una célula. Dichos factores solubles pueden ser una mezcla compleja (p. ej., so bren adante) y/o una fracción de los mismos y/o pueden ser un factor purificado. En un ejemplo, los factores solubles están o están contenidos en el sobrenadante. Por consiguiente, cualquier ejemplo en este documento dirigido a la administración de uno o más factores solubles se tomará para aplicarlo mutatismutandis a la administración de sobrenadante.

Como se usa en este documento, el término "sobrenadante" se refiere al material no celular producido después del cultivo in vitro de células STRO-1+ y/o su progenie en un medio adecuado, por ejemplo, medio líquido. Normalmente, el sobrenadante se produce cultivando las células en el medio en condiciones y tiempo adecuados, seguido de la eliminación del material celular mediante un proceso como la centrifugación. El sobrenadante puede o no haber sido sometido a más etapas de purificación antes de la administración. En un ejemplo, el sobrenadante comprende menos de 105, más tal como menos de 104, por ejemplo, menos de 103, por ejemplo, sin células vivas.

Como se usa en este documento, el término "individuo normal o sano" debe entenderse como un sujeto que no padece síndrome metabólico u obesidad según lo evaluado por cualquier método conocido en el arte y/o descrito en este documento. En un ejemplo, un "individuo normal o sano" no padece ninguno de los síntomas del síndrome metabólico y/o tiene un IMC de menos de 35.

Células STRO-1+ o Células de la Progenie, y Sobrenadante o Uno o más Factores Solubles Derivados del Mismo

Las células STRO-1 son células que se encuentran en la médula ósea, sangre, dientes de leche (p. ej., dientes de leche exfoliados), pulpa dental, tejido adiposo, piel, bazo, páncreas, cerebro, riñón, hígado, corazón, retina, cerebro, folículos pilosos, intestino, pulmones, nódulos linfáticos, timo, huesos, ligamentos, tendones, músculo esquelético, dermis y periostio.

En un ejemplo, las células STRO-1 son capaces de diferenciarse en una o más o dos o más y/o tres líneas germinales tales como mesodermo y/o endodermo y/o ectodermo.

Por consiguiente, las células STRO-1+ son células multipotenciales que son capaces de diferenciarse en un gran número de tipos celulares incluyendo, entre otros, de tejido adiposo, óseo, cartilaginoso, elástico, muscular y tejidos conectivos fibrosos. El compromiso con un linaje específico y la ruta de diferenciación con estas células depende enteramente de diversas influencias, desde influencias mecánicas y/o factores bioactivos endógenos, tales como factores de crecimiento, citocinas y/o condiciones microambientales locales establecidas por los tejidos hospedadores. En una realización, las células multipotenciales STRO-1+ son células progenitoras no hematopoyéticas que se dividen para dar células hijas que pueden ser células madre o precursoras que, a su vez, se diferenciarán de manera irreversible para dar origen a una célula fenotípica.

En un ejemplo, las células STRO-1+ están enriquecidas a partir de una muestra obtenida de un sujeto, p. ej., un sujeto que se va a tratar o un sujeto relacionado o un sujeto no relacionado (ya sean de la misma especie o no). Los términos "enriquecido", "enriquecimiento" o variaciones de los mismos se usan en este documento para describir una población de células en que la proporción de un tipo celular particular o la proporción de una serie de tipos celulares particulares aumenta cuando se compara con una población no tratada de las células (p. ej., células en su ambiente nativo). En un ejemplo, una población enriquecida para las células STRO-1+comprende al menos aproximadamente 0,1% o 0,5% o 1% o 2% o 5% o 10% o 15% o 20% o 25% o 30% o 50% o 75% de células STRO-1 . En este sentido, el término "población de células enriquecidas con células STRO-1+" se tomará para proporcionar soporte explícito para el término "población de células que comprende X% de células STRO1+", donde X% es un porcentaje tal como se menciona en este documento. Las células STRO-1+ pueden, en algunos ejemplos, formar colonias clonogénicas, p. ej., CFU-F (fibroblastos) o un subconjunto de las mismas (p. ej., 50% o 60% o 70% o 70% o 90% o 95%) pueden tener esta actividad.

En un ejemplo, la población de células se enriquece a partir de una preparación celular que comprende células STRO-1+ en forma seleccionable. A este respecto, se entenderá que el término "forma seleccionable" significa que las células expresan un marcador (p. ej., un marcador de superficie celular) que permite la selección de células portadoras de STRO-1 . El marcador puede ser STRO-1, pero no es necesario. Por ejemplo, como se describe y/o ejemplifica en este documento, células (p. ej., MPC) que expresan STRO-2 y/o STRO-3 (TNAP) y/o STRO-4 y/o VCAM-1 y/o CD146 y/o 3G5 también expresa STRO-1 (y puede ser STRO-1brillante). Por consiguiente, una indicación de que las células son STRO-1+ no significa que las células se seleccionen mediante la expresión de STRO-1. En un ejemplo, las células se seleccionan basándose en al menos la expresión de STRO-3, por ejemplo, son STRO-3+ (TNAP+).

La referencia a la selección de una célula o población de la misma no requiere la selección de una fuente de tejido específica. Como se describe en este documento, las células STRO-1+ pueden seleccionarse o aislarse o enriquecerse de una gran variedad de fuentes. Dicho esto, en algunos ejemplos, estos términos proporcionan soporte para la selección de cualquier tejido que comprenda células STRO-1+ (por ejemplo, MPC) o tejido vascularizado o tejido que comprenda pericitos (por ejemplo, pericitos STRO-1+) o uno o más de los tejidos citados en este documento.

En una realización, las células usadas en métodos de la presente divulgación expresan uno o más marcadores individualmente o colectivamente seleccionados del grupo que consiste en TNAP+, VCAM-1 , THY-1+, STRO-2+, STRO-4+ (HSP-90p), CD45+, CD146+, 3G5+ o cualquier combinación de los mismos.

El término "individualmente" significa que la divulgación abarca los marcadores o grupos de marcadores mencionados por separado, y que, sin perjuicio de que los marcadores individuales o grupos de marcadores no hayan sido nombrados en este documento por separado, las reivindicaciones adjuntas pueden definir tal marcador o grupos de marcadores por separado y en forma divisible entre sí.

El término "colectivamente" significa que la divulgación abarca cualquier número o combinación de los marcadores o grupos de péptidos mencionados, y que, sin perjuicio de que dichos números o combinaciones de marcadores o grupos de marcadores pueden no ser específicamente nombrados en este documento, las reivindicaciones adjuntas pueden definir dichas combinaciones o subcombinaciones por separado y de manera divisible de cualquier otra combinación de marcadores o grupos de marcadores.

Por ejemplo, las células STRO-1+ son STRO-1brillantes(syn. STRO-1bri). En un ejemplo, las células Stro-1bri se enriquecen preferentemente con respecto a las células STRO-1tenues o STRO-1intermedias

En un ejemplo, las células STRO-1brillantes son además una o más de TNAP+, VCAM-1 , THY-1+'STRO-2+, STRO-4+ (HSP-90p) y/o CD146+. Por ejemplo, las células se seleccionan de uno o más de los marcadores anteriores y/o se muestra que expresan uno o más de los marcadores anteriores. A este respecto, no es necesario ensayar específicamente una célula que se muestra que expresa un marcador, sino que se pueden ensayar células previamente enriquecidas o aisladas y se puede suponer razonablemente que las células usadas, aisladas o enriquecidas posteriormente también expresan el mismo marcador.

En un ejemplo, las células precursoras mesenquimales son células precursoras mesenquimales perivasculares como se define en el documento WO 2004/85630.

Cuando se hace referencia a una célula como "positiva" de un marcador dado, puede expresar o bien un nivel bajo (lo o tenue) o alto (brillante, bri) de ese marcador, dependiendo del grado en que el marcador esté presente sobre la superficie celular, donde los términos se relacionan con la intensidad de fluorescencia u otro marcador usado en el proceso de clasificación de las células. La distinción de lo (o tenues u opaco o tenue) y bri se entenderá en el contexto del marcador usado en una población celular particular que se está clasificando. Una célula a la que se hace referencia como "negativa" para un marcador dado no necesariamente implica que la misma esté completamente libre del mismo. Estos términos significan que el marcador está expresado a un nivel relativamente muy bajo por esa célula, y que genera una señal muy baja cuando se lo etiqueta de manera detectable o que es indetectable por enama de los niveles de fondo, p ej., niveles detectados demandando un anticuerpo de control de isotipo.

El término "brillante", cuando se usa en este documento, se refiere a un marcador en una superficie celular que genera una señal relativamente alta cuando está marcada de forma detectable. Aunque no se desea limitarse a una teoría, se propone que las células "brillantes" expresan más de la proteína marcadora diana (por ejemplo, el antígeno reconocido por STRO-1) que otras células en la muestra. Por ejemplo, las células STRO-1bri producen una mayor señal de fluorescencia cuando se marcan con un anticuerpo STRO-1 conjugado con FITC, como se determina por análisis (FACS) de clasificación de células activadas por fluorescencia, que las células no brillantes (STRO-1opaca/tenue). Preferiblemente, las células "brillantes" constituyen al menos aproximadamente un 0,1% de las células mononucleares de médula ósea más brillantemente marcadas contenidas en la muestra de partida. En otras realizaciones, las células "brillantes" constituyen al menos aproximadamente un 0,1%, al menos aproximadamente un 0,5%, al menos aproximadamente un 1%, al menos aproximadamente un 1,5% o al menos aproximadamente un 2% de las células mononucleares de médula ósea marcadas brillantemente contenidas en la muestra de partida. En un ejemplo, las células STRO-1brillantes tienen una expresión de magnitud 2 log mayor de expresión en superficie de STRO-1 con relación al "fondo", concretamente células que son STRO-1-. En comparación, las células STRO-1tenue y/o STRO-1intermedias tienen menos de una expresión de magnitud 2 log mayor de expresión en superficie de STRO-1, típicamente aproximadamente 1 log o menos que el "fondo".

Cuando se usa en este documento el término "TNAP", pretende abarcar todas las isoformas de la fosfatasa alcalina no específica del tejido. Por ejemplo, el término abarca la isoforma hepática (LAP), la isoforma ósea (BAP) y la isoforma renal (KAP). En un ejemplo, el TNAP es BAP. En un ejemplo, la TNAP como se usa en este documento hace referencia a una molécula que puede unirse al anticuerpo STRO-3 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC el 19 de diciembre de 2005 bajo las disposiciones del Tratado de Budapest, con número de acceso al depósito PTA-7282.

Además, en un ejemplo preferido, las células STRO-1+ son capaces de dar lugar a CFU-F clonogénicas.

Se prefiere que una proporción significativa de las células multipotenciales STRO-1+ sea capaz de diferenciación en al menos dos tipos distintos de linajes germinales. Los ejemplos no limitantes de linajes con los que pueden estar comprometidos las células multipotenciales incluyen células precursoras óseas; progenitores hepatocíticos, que son multipotentes para células epiteliales de conducto biliar y hepatocitos; células restringidas neurales, que pueden generar precursores de células gliales que evolucionan hasta oligodendrocitos y astrocitos; precursores neuronales que evolucionan hasta neuronas; precursores de músculo cardíaco y cardiomiocitos y líneas celulares beta pancreáticas secretoras de insulina sensibles a glucosa. Otros linajes incluyen, pero no se limitan a, odontoblastos, células productoras de dentina y condrocitos y células precursoras de las siguientes: células epiteliales de pigmento retinal, células cutáneas tales como queratinocitos, células dendríticas, células de folículo piloso, células epiteliales de conducto renal, células de músculo liso y esquelético, progenitores testiculares, células endoteliales vasculares, tendón, ligamento, cartílago, adipocito, fibroblasto, estroma medular, músculo cardiaco, músculo liso, músculo esquelético, pericito, células vasculares, epiteliales, gliales, neuronales, astrocíticas y oligodendrocíticas.

En otro ejemplo, las células STRO-1+ no son capaces de dar lugar, tras el cultivo, a células hematopoyéticas.

En un ejemplo, las células son tomadas del sujeto que se va a tratar, cultivadas in vitro usando técnicas estándares y utilizadas para obtener factores sobrenadantes o solubles, o bien células expandidas para la administración al sujeto como una composiaón autóloga o alogénica. En un ejemplo alternativo, se utilizan células de uno o más linajes celulares humanos establecidos. En otro ejemplo útil, se usan células de un animal no humano (o, si el paciente no es un humano, de otra especie).

La presente divulgación también contempla el uso de factores sobrenadantes o solubles obtenidos o derivados de células STRO-1+ y/o células de su progenie (a las últimas también se las denomina células expandidas) que se producen a partir de un cultivo in vitro. Las células expandidas pueden tener una amplia variedad de fenotipos dependiendo de las condiciones de cultivo (incluyendo el número y/o tipo de factores estimulantes en el medio de cultivo), el número de pases y similares. En ciertos ejemplos, las células de progenie se obtienen después de aproximadamente 2, aproximadamente 3,aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 pases de la población parental. Sin embargo, las células de progenie pueden obtenerse después de cualquier número de pases de la poblaaón parental.

Las células de progenie pueden obtenerse mediante el cultivo en cualquier medio apropiado. El término "medio", según su uso en referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea a las células. El medio puede ser sólido, líquido, gaseoso o una combinación de fases y materiales. El medio incluye medios de crecimiento líquido, así como también medios que no sostienen el crecimiento celular. El medio también incluye medios gelatinosos como agar, agarosa, gelatina y matrices de colágeno. Los medios gaseosos ilustrativos incluyen la fase gaseosa a la que se exponen las células que crecen en una placa de petri u otro soporte sólido o semi sólido. El término "medio" también hace referencia al material que se pretende utilizar en un cultivo celular, incluso si aún no ha estado en contacto con las células. En otras palabras, un líquido rico en nutrientes preparado para el cultivo bacteriano es un medio. Una mezcla de polvo que, al mezclarse con agua u otro líquido, se convierte en adecuada para el cultivo celular puede denominarse como "medio en polvo".

En un ejemplo, las células de progenie útiles para los métodos de la divulgación se obtienen aislando las células TNAP+ STRO-1 de la médula ósea usando cuentas magnéticas marcadas con el anticuerpo STRO-3 y después expandiendo el cultivo de las células aisladas (véase Gronthos et al. Blood 85: 929-940, 1995 para un ejemplo de condiciones adecuadas de cultivo).

En una realización, tales células expandidas (de progenie) (al menos después de 5 pases) pueden ser TNAP-, CC9+, HLA de clase I+, HLA de clase II-, CD14-, CD19-, CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86-, CD34- y/o CD80-. Sin embargo, es posible que, en condiciones de cultivo diferentes a las descritas en este documento, la expresión de los diferentes marcadores pueda variar. También, aunque las células de estos fenotipos pueden predominar en la población de células expandidas, no significa que haya una menor proporción de las células que no tienen este(os) fenotipo(s) (por ejemplo, un pequeño porcentaje de las células expandidas puede ser CC9-). En un ejemplo, las células expandidas tienen todavía la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos celulares.

En un ejemplo, una población celular expandida utilizada para obtener factores sobrenadantes o solubles, o céldas per se, comprende células en donde al menos un 25%, p. ej., al menos 50% de las células, son CC9+.

En otro ejemplo, una población celular expandida utilizada para obtener factores sobrenadantes o solubles, o células per se, comprende células en donde al menos un 40%, más preferiblemente al menos un 45% de las células, son STRO-1+.

En un ejemplo adicional, las células expandidas pueden expresar uno o más marcadores de manera colectiva o individual seleccionados de entre el grupo consistente en: LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-selectina, L-selectina, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD90, CD29, CD18, CD61, integrina beta, 6-19, trombomodulina, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R. FGF-R, Leptina-R, (STRO-2= leptina-R), RANKL, STRO-4 (HSP-90p), STRO-1brillante y CD146 o cualquier combinación de las mismas.

En un ejemplo, las células de progenie son Progenie de Células Multipotenciales STRO-1+ Expandidas Multipotenciales (MEMP), tal como se definen y/o describen en el documento WO 2006/032092. En el documento WO 01/04268 y WO 2004/085630 se describen métodos para preparar poblaciones enriquecidas de células multipotenciales STRO-1 de las que se pueden derivar progenies. En un contexto in vitrolas células potenciales STRO-1 estarán raramente presentes como una preparación totalmente pura y generalmente estarán presentes con otras células que son células absolutamente específicas de tejidos (TSCCs). El documento WO 01/04268 se refiere a la recolección de tales células de la médula espinal a niveles de pureza de aproximadamente 0,1% a 90%. La población que comprende MCP de las que se deriva la progenie pueden recolectarse directamente de una fuente de tejido o, de manera alternativa, puede tratarse de una población que ya haya sido expandida ex vivo.

Por ejemplo, la progenie puede obtenerse de una población recolectada y no expandida de células multipotenciales STRO-1+ sustancialmente purificadas que comprende al menos aproximadamente 0,1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 95% del total de células de la población en la que se encuentran presentes. Este nivel puede alcanzarse, por ejemplo, mediante la selección de células que son positivas en al menos un marcador individual o colectivamente seleccionadas de entre el grupo consistente en TNAP, STRO-4 (HSP-90p), STRO-1brilante, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD 146 y STRO-2.

Las MEMP pueden distinguirse de las células multipotenciales STRO-1+ cultivadas recientemente por el hecho de ser positivas para el marcador STRO-1bri y negativas para el marcador de fosfatasa alcalina (FAL). En contraste, las células multipotenciales STRO-1+ recientemente aisladas son tanto para STRO-1bri como para ALP. En un ejemplo de la presente divulgación, al menos un 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las células administradas tiene el fenotipo STRO-1 ALP. En un ejemplo adicional, las MEMP son positivas para uno o más marcadores Ki67, CD44 y/o CD49c/CD29, VLA-3, a3p1. Incluso en otro ejemplo, las MEMP no muestran actividad TERT y/o son negativas para el marcador CD18.

La población inicial de células STRO-1+ pueden derivarse de cualquiera o más de un tipo de tejidos de los descritos en los documentos WO 01/04268 o WO 2004/085630, es decir, médula ósea, células de la pulpa dental, tejido adiposo y piel, o tal vez de manera más amplia del tejido adiposo, dientes, pulpa dental, piel, hígado, riñón, corazón, retina, cerebro, folículos pilosos, intestino, pulmón, bazo, ganglio linfático, timo, páncreas, hueso, ligamento, médula ósea, tendón y músculo esquelético.

Se entenderá que al realizar los métodos descritos en la presente divulgación, la separación de células que portan cualquier marcador de superficie celular puede llevarse a cabo mediante un número de distintos métodos, sin embargo, los métodos ilustrativos se basan en la unión de un agente de unión (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo) al marcador en cuestión, seguido de una separación de aquellos que muestran unión, ya sea con un nivel de unión alto, nivel de unión bajo o sin unión. Los agentes de unión más convenientes son anticuerpos o moléculas basadas en anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monodonales o basados en anticuerpos monoclonales (p. ej., proteínas que comprenden fragmentos de unión al antígeno de los mismos) debido a la especificidad de estos últimos agentes. Los anticuerpos pueden utilizarse para ambas etapas, sin embargo, también se podrían usar otros agentes, de este modo, los ligandos para estos marcadores también pueden emplearse para enriquecer en células que los portan, o que carecen de ellos.

Los anticuerpos o ligandos pueden unirse a un soporte sólido para permitir una separación bruta. Por ejemplo, las técnicas de separación maximizan la retención de viabilidad de la fracción que se va a recoger. Pueden emplearse diversas técnicas de diferente eficacia para obtener separaciones relativamente brutas. La técnica particular empleada dependerá de la eficiencia de separación, la citotoxicidad asociada, la facilidad y velocidad de rendimiento y la necesidad de un equipo sofisticado y/o habilidades técnicas. Los procedimientos para la separación pueden incluir, pero sin limitación, separación magnética usando perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo, cromatografía de afinidad e "inmunopurificación" con anticuerpo unido a una matriz sólida. Las técnicas que proporcionan una separación precisa induyen, entre otros, la FACS. Los métodos para la realización de FACS resultarán evidentes para los expertos en la materia.

Los anticuerpos frente a cada uno de los marcadores descritos en este documento se encuentran comercialmente disponibles (p. ej., anticuerpos monocl onales frente a las STRO-1 se encuentran comercialmente disponibles de R&D Systems, EE.UU.), disponibles en la ATCC u otras organizaciones de depósito y/o pueden producirse mediante técnicas reconocidas en la técnica.

En un ejemplo, el método para aislar cél ulas STRO-1 , comprende una primera etapa que es una etapa de clasificaaón de fase sólida que usa, por ejemplo, una clasificación magnética de células activadas (MACS) que reconoce el alto nivel de expresión de las STRO-1. A continuación puede seguir una segunda etapa de clasificación, si se desea, para dar como resultado un nivel mayor de expresión celular del precursor como se describe en la memoria descriptiva de la patente WO 01/14268. Esta segunda etapa de clasificación puede involucrar el uso de dos o más marcadores.

El método de obtención de células STRO-1+ también puede incluir la recolección de una fuente de las células antes de la primera etapa de enriquecimiento usando técnicas conocidas. Por consiguiente, el tejido será eliminado quirúrgicamente. Entonces, se separarán las células que comprenden el tejido fuente en lo que se denomina una suspensión celular simple. Esta separación puede conseguirse por medios físicos o enzimáticos.

Una vez que una población adecuada de células STRO-1+ haya sido obtenida, es posible cultivarla o expandirla mediante cualquier medio adecuado para obtener las MEMP.

En un ejemplo, las células son tomadas del sujeto que se va a tratar, cultivadas in vitro usando técnicas estándares y utilizadas para obtener factores sobrenadantes o solubles, o bien células expandidas para la administración al paaente como una composición autóloga o alogénica. En un ejemplo alternativo, se utilizan células de uno o más lin ajes celulares humanos establecidos para obtener los factores sobrenadantes o solubles. En otro ejemplo útil de la divulgación, se usan células de un animal no humano (o, si el paciente no es un humano, de otra especie) para obtener factores sobrenadantes o solubles.

Los métodos y usos de la presente divulgación pueden practicarse usando células de cualquier especie animal no humana, incluyendo, entre otras, células de primates no humanos, de ungulados, caninos, felinos, lagomorfos, roedores, aves y peces. Las células de primates con las que puede llevarse a cabo la divulgación incluyen, entre otras, las células de chimpancés, babuinos, monos cangrejeros y cualquier mono del Nuevo o el Viejo Mundo. Las células de ungulados con las que puede llevarse a cabo la divulgación incluyen, entre otras, las células de bovinos, poranos, ovinos, caprinos, equinos, búfalos y bisontes. Las células de roedores con las que puede llevarse a cabo la divulgación incluyen, entre otras, las de ratones, ratas, conejillos de indias, hámsters y jerbos. Los ejemplos de especies de lagomorfos con los que puede llevarse a cabo la divulgación induyen conejos domesticados, salvajes, liebres, conejos de rabo blanco, liebres americanas y ochotonas. Los pollos (Gallus gallus) constituyen un ejemplo de especie aviar con la que puede llevarse a cabo la divulgación.

En un ejemplo, las células son células humanas.

Las células útiles para los métodos de la invención pueden almacenarse antes de su uso, o antes de obtener los factores sobrenadantes o solubles. Los métodos y protocolos para conservar y almacenar células eucarióticas, y en particular células de mamíferos, se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Pollard, J. W. y Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Segunda Edición, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Cuarta Edición, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.). Cualquier procedimiento que mantenga la actividad biológica de las células madre aisladas, tal como las células madre mesenquimales/progenitoras, o la progenie de las mismas, puede utilizarse en conexión con la presente invención. En un ejemplo, las células se mantienen y almacenan usando criopreservación.

Células Genéticamente Modificadas

En un ejemplo, las células STRO-1+ y/o las células de su progenie se modifican genéticamente, p. ej., para expresar y/o secretar una proteína de interés. Por ejemplo, las células están diseñadas para expresar una proteína útil en el tratamiento del síndrome metabólico o la obesidad, como la proteína 1 similar al glucagón (GLP-1) o el péptido YY (PYY) o fragmentos activos de los mismos (p. ej., PYY[3-36]), exendina-4 o Exenatida.

Los métodos para modificar genéticamente una célula resultarán evidentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, un ácido nucleico que debe expresarse en una célula se une de manera operativa a un promotor para inducir la expresión en la célula. Por ejemplo, el ácido nucleico se une a un promotor operativo en una serie de células de un sujeto, tal como, por ejemplo, un promotor viral, p. ej., un promotor de CMV (p. ej., un promotor de CMV-IE) o un promotor SV-40. En la materia también se conocen otros promotores adecuados, de los que debe interpretarse una aplicación mutatis mutandis a la presente realización de la invención.

En un ejemplo, el ácido nucleico se proporciona en la forma de un constructo de expresión. Como se utiliza en este documento, el término "constructo de expresión" se refiere a un ácido nucleico que tiene la habilidad de conferir una expresión en un ácido nucleido (p. ej., un gen reportero y/o un gen reportero contraseleccionable) al que se encuentra conectado de manera operativa, en una célula. Dentro del contexto de la presente divulgación, debe entenderse que un constructo de expresión puede comprender o ser un plásmido, un bacteriófago, un fagémido, un cósmido, un fragmento genómico o subgenómico de un virus u otro ácido nucleico capaz de mantener y/o replicar ADN heterólogo en un formato expresable.

Los métodos para la elaboración de un constructo de expresión adecuado para la realización de la divulgación serán evidentes para los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Intersaence, ISBN 047 150338, 1987) o Sambrook et al (en: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, tercera edición 2001). Por ejemplo, cada uno de los componentes del constructo de expresión se amplifica a partir de un ácido nucleico patrón adecuado usando, por ejemplo, PCR y posteriormente clonado en un constructo de expresión adecuada, por ejemplo, un plásmido o fagómido.

Los vectores adecuados para tal constructo de expresión son conocidos en la técnica y/o descritos en este documento. Por ejemplo, un vector de expresión adecuado para métodos de la presente divulgación en una célula de mamífero, por ejemplo, un vector del conjunto de vectores pcADN suministrado por Invitrogen, un vector del co njunto de vectores pCI (Promega), un vector del conjunto de vectores pCMV (Clontech), un vector pM (Clontech), un vector pSI (Promega), un vector VP 16 (Clontech) o un vector del conjunto de vectores pcADN (Invitrogen).

El experto en la materia estará informado de los vectores adicionales y fuentes de tales vectores, tal como, por ejemplo, Invitrogen Corporation, Clontech o Promega.

Los medios para introducir la molécula de ácido nucleico aislado o un constructo de genes que comprende los mismos en una célula para su expresión resultan conocidos para un experto en la materia. La técnica usada para un organismo dado depende de las técnicas exitosas conocidas. Los medios para introduar de ADN recombinante dentro de las células incluyen microinyección, transfección mediadas por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas como en el uso de lipofectamina (Gibco, MD, EE.UU.) y/o celfectina (Gibco, MD, EE.UU.), captación de ADN mediada por PEG, electroporación y bombardeo con micropartículas como usando wolframio recubierto de ADN o partículas de oro (Agraceuts Inc., WI, EE.UU.), entre otros.

De manera alternativa, un constructo de expresión de la divulgación es un vector viral. Los vectores virales adecuados son conocidos en la materia y se encuentran comercialmente disponibles. Los sistemas convencionales basados en virales para el suministro de un ácido nucleico e integración del ese ácido nucleico en un genoma de células huésped incluyen, por ejemplo, un vector retroviral, un vector lentiviral o un vector viral adenoasociado. De manera alternativa, un vector adenoviral es útil en la introducción de un ácido nucleico que permanece episomal en una célula huésped. Los vectores virales constituyen un método eficiente y versátil para la transferencia de genes en las células y tejidos diana. De manera adicional, las altas eficiencias de transducción se han observado en muchos tipos de células y tejidos diana diferentes.

Por ejemplo, un vector retroviral en general comprende repeticiones terminales largas actuando en cis (LTR) con una capacidad de empaquetado de hasta 6-10 kb de secuencia extranjera. Las LTR mínimas actuando en cis son suficientes para la replicación y empaquetado de un vector, lo que luego se utiliza para integrar el constructo de expresión en la célula diana para proporcionar una expresión a largo plazo. Los vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de los simios (SrV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (ver, por ejemplo, Buchscher et al, J Virol. 56: 2731-2739 (1992); Johann et al, col., J. Virol. 65: 1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol. 76: 58-59 (1990); Wilson et al, J. Virol. 63: 274-2318 (1989); Miller et al, J. Virol. 65: 2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller y Rosman BioTechniques 7: 980-990, 1989;Miller, AD Human Gene Therapy 7: 5-14, 1990;Scarpa et al Virology 75: 849-852, 1991;Burns et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 8033-8037, 1993).

También se han desarrollado varios sistemas de vectores de virus adenoasociados (AAV) para el suministro de ácido nucleico. Los vectores AAV pueden construirse fácilmente usando técnicas conocidas en la técnica. Véase p. ej., las patentes de EE.UU. Nos. 5.173.414 y 5.139.941; las publicaciones internacionales Nos. WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5: 3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter Current Opinion in Biotechnology 5: 533-539, 1992; Muzyczka. Temas actuales en microbiología e inmunol. 158: 97-129, 1992;Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801, 1994;Shelling y Smith Gene Therapy 7: 165-169, 1994; y Zhou et al. J Exp. Med. 179: 1867-1875, 1994.

Vectores virales adicionales útiles para el suministro de un constructo de expresión de la divulgación incluyen, por ejemplo, aquellos derivados de la familia de virus de la viruela, como el virus vacuna y el virus de la viruela aviaria, o un alfavirus o un conjugado del vector del virus (p. ej., aquel descrito en Fisher-Hoch et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 56:317-321, 1989).

Determinación del Potencial Terapéutico/Profiláctico de las Células y los Factores Solubles

Los métodos para determinar la capacidad de las células o los factores solubles para tratar o prevenir o retrasar el inicio o la progresión del síndrome metabólico u obesidad serán evidentes para el experto en la materia.

Por ejemplo, se administran células o factores solubles (p. ej., una mezcla de factores o un factor único o una fracción de factores (p. ej., derivados por purificación o cromatografía de afinidad)) a un modelo de síndrome metabólico y/o obesidad y se evalúa el efecto sobre uno o más síntomas.

Los modelos ilustrativos de síndrome metabólico incluyen ratones KK/Ta alimentados con alto contenido de g rasas (Akagiri et al., J Clin Biochem Nutr. 42: 150-157, 2008), C57B1/6NCrl- Ratones Leprdb-lb/ Crl (Charles River Laboratories), roedores alimentados con alto contenido de fructosa (Lé y Tappy, Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care, 9: 469-475, 2006), ratas alimentadas con alto contenido de sacarosa (Coelho et al., Regulatory Peptides, 162: 61-67, 2010), roedores alimentados con alto contenido de grasas y roedores alimentados con alto contenido de grasas y hidratos de carbono (p. ej., según lo revisado en Panchal y Brown, Journal of Biomedicine and Biotechnology (2011).

Los modelos genéticos ejemplares de obesidad incluyen ratonesdb/db, ratones ob/ob, ratas grasas diabéticas Zucker y ratas grasas Otsuka Long-Evans Tokushima.

Los modelos inducidos ilustrativos de obesidad incluyen roedores alimentados con alto contenido de grasas y/o roedores alimentados con alto contenido de grasas e hidratos de carbono.

En un ejemplo, un modelo de síndrome metabólico y/u obesidad es un primate no humano alimentado con alto contenido de grasas, p. ej., monos cynomolgus).

Será evidente para el experto en la técnica a partir de lo anterior que la presente divulgación también proporciona un método para identificar o aislar una célula o un factor soluble para el tratamiento, prevención o retraso del síndrome metabólico o la obesidad, comprendiendo el método:

(i) administrar una célula o un factor soluble a un sujeto de ensayo que padece síndrome metabólico y/u obesidad y evaluar un síntoma de síndrome metabólico y/o peso corporal en el sujeto;

(ii) comparar el síntoma del síndrome metabólico y/o los niveles de peso corporal del sujeto en (i) con el síntoma de síndrome metabólico y/o el peso corporal de un sujeto de control que padece el síndrome metabólico y/o la obesidad al que no se ha administrado la célula o el factor soluble,

en donde una mejora en el síntoma y/o peso corporal reducido en el sujeto de ensayo en comparación con el sujeto de control indica que la célula o factor soluble trata el síndrome metabólico y/o la obesidad del mismo.

La célula puede ser cualquier célula descrita en este documento según cualquier ejemplo.

Los síntomas i lustrativos se describen en este doc umento.

Composiciones Celulares

En un ejemplo de la presente divulgación, las células STRO-1 y/o las células de su progenie se administran en forma de una composición. En un ejemplo, tal composición comprende un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los términos "portador" y "excipiente" se refieren a composiciones de materia que se usan convencionalmente en la técnica para facilitar el almacenamiento, administración y/o la actividad biológica de un compuesto activo (véase, p.

ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Mac Publishing Company (1980). Un portador también puede reducir cualquier efecto secundario no deseado del compuesto activo. Un vehículo adecuado es, por ejemplo, estable, p. ej., incapaz de reaccionar con otros ingredientes en el portador. En un ejemplo, el portador no produce efectos adversos locales o sistémicos significativos en receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas para tratamiento.

Los portadores adecuado para la presente divulgación induyen aquellos usados convencionalmente, p. ej., agua, disolución salina, dexttrosa acuosa, lactosa, disolución de Ringer, una disoludón tamponada, hialuronano y glicoles son líquidos portadores ilustrativos, particularmente para disoluciones (cuando son isotónicos). Los portadores farmacéuticamente adecuados incluyen almidón, celulosa, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro sódico, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.

En otro ejemplo, un portador es una composición de medio, p. ej., en la que una célula crece o se suspende. Por ejemplo, tal composición de medio no induce ningún efecto adverso en un sujeto al que se le administra.

Los portadores y excipientes ilustrativos no afectan negativamente a la viabilidad de una célula y/o la capacidad de una célula para reducir, prevenir o retrasar el síndrome metabólico y/o la obesidad.

En un ejemplo, el portador o excipiente proporciona una actividad amortiguadora para mantener las células y/o los factores solubles a un pH adecuado para ejercer de ese modo una actividad biológica, p. ej., el portador o excipiente es disolución salina tamponada con fosfato (PBS). El PBS representa un portador o excipiente atractivo porque interactúa mínimamente con las células y los factores y permite la liberación rápida de las células y los factores; en tal caso, la composición de la divulgación se puede producir como un líquido para su aplicación directa al torrente sanguíneo o en un tejido o una región circundante o adyacente a un tejido, p. ej., mediante inyección.

Las células STRO-1 y/o las células de su progenie también se pueden incorporar o incrustar dentro de armazones que son compatibles con el receptor y que se degradan en productos que no son dañinos para el receptor. Estos armazones proporcionan soporte y protección para las células que se van a transplantar a los sujetos receptores. Los armazones biodegradables naturales y/o sintéticos son ejemplos de tales armazones.

Se puede usar con éxito una variedad de diferentes armazones en la práctica de los métodos de la divulgación. Los armazones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, armazones degradables biológicos. Los armazones biodegradables naturales incluyen armazones de colágeno, fibronectina y laminina. El material sintético adecuado para un armazón de transplante de células debería ser capaz de soportar un crecimiento y una función celulares extensivos. Dichos armazones también pueden ser reabsorbibles. Los armazones adecuados incluyen armazones de ácido poliglicólico, p. ej., como describe Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23: 3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38: 145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88: 753-9 1991; o polímeros sintéticos tales como polianhídridos, poliortoésteres y ácido poliláctico.

En otro ejemplo, las células pueden administrarse en un armazón de gel (tal como Gelfoam de Upjohn Company.

Las composiaones celulares útiles para los métodos descritos en este documento pueden administrarse solas o como mezclas con otras células. Las células que pueden administrarse junto con las composiciones de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, otras células multipotentes o pluripotentes o células madre o células de médula ósea. Pueden mezclarse células de diferentes tipos con una composiaón de la divulgación inmediatamente o poco antes de la administración, o pueden cocultivarse conjuntamente durante un periodo de tiempo antes de la administración.

En un ejemplo, la composición comprende una cantidad efectiva o una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de células. Por ejemplo, la composición comprende aproximadamente 1x105 células STRO-1+/kg a aproximadamente 1x107 células STRO-1+/kg o aproximadamente 1x106 células STRO-1+/kg a aproximadamente 5x106 células STRO-1+/kg. La cantidad exacta de células que se van a administrar depende de una variedad de factores, que incluyen la edad, el peso y el sexo del paciente, y la extensión y gravedad del síndrome metabólico y/o la obesidad.

En un ejemplo, se administra al sujeto una dosis baja de células. Las dosificaaones ilustrativas incluyen entre aproximadamente 0,1 x 104 y 0,5 x 106 células por kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 x 105 y 0,5 x 106 células por kg, tales como, entre aproximadamente 0,5 x 105 y 0,5 x 106 células por kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 x 106 y 0,5 x 106 células por kg, p. ej., aproximadamente 0,2 x 106 o 0,3 x 106 o 0,4 x 106 células por kg.

En algunos ejemplos, las células están contenidas dentro de una cámara que no permite que las células salgan a la circulación de un sujeto, sin embargo, permite que los factores secretados por las células entren en la circulación. De esta manera, se pueden administrar factores solubles a un sujeto permitiendo que las células secreten los factores en la circulación del sujeto. Tal cámara puede igualmente implantarse en un sitio en un sujeto para aumentar los niveles locales de los factores solubles, p. ej., implantado en o cerca de un páncreas.

En algunas realizaciones de la divulgación, puede no ser necesario o deseable inmunosuprimir un paciente antes de inicio de la terapia con composiciones celulares. Por consiguiente, el transplante con MPC alogénicas o incluso xenogénicas, células STRO-1+ o su progenie puede tolerarse en algunos casos.

Sin embargo, en otros aspectos, puede ser deseable o apropiado inmunosuprimir farmacológicamente un paciente antes de iniciar la terapia celular y/o reducir una respuesta inmune de un sujeto frente a la composición celular. Esto puede lograrse mediante el uso de agentes inmunosupresores sistémicos o locales, o puede lograrse suministrando las células en un dispositivo encapsulado. Las células pueden encapsularse en una cápsula que sea permeable a los nutrientes y oxígeno requeridos por la célula y a factores terapéuticos, pero la célula es incluso impermeable a factores humorales inmunitarios y células. Preferiblemente, el encapsulante es hipoalergénico, se sitúa fácil y establemente en un tejido diana y proporciona una protección añadida a la estructura implantada. Estos y otros medios para reducir una respuesta inmune a las células transplantadas son conocidos en la materia. Como una alternativa, las células pueden ser modificadas genéticamente para reducir su inmunogeninidad.

Composiciones de Factores Solubles

En un ejemplo, el sobrenadante o los factores solubles derivados de células STRO-1+ y/o derivados de células de la progenie se administran en forma de una composición, p. ej., que comprende un portador y/o excipiente adecuado. En un ejemplo, el portador o excipiente no afecta negativamente al efecto biológico de los factores solubles o de sobrenadante.

En un ejemplo, la composición comprende una composición de materia para estabilizar un factor soluble o un componente del sobrenadante, p. ej., un inhibidor de proteasa. En un ejemplo, el inhibidor de proteasa no se incluye en una cantidad suficiente para tener un efecto adverso en un sujeto.

Las composiciones que comprenden sobrenadante o factores solubles derivados de células STRO-1+ y/o derivados de células de progenie pueden prepararse como suspensiones líquidas apropiadas, p. ej., en medio de cultivo o en un portador estable o una disolución tampón, p. ej., una disolución salina tamponada de fosfato. Los portadores adecuados se describen anteriormente en este documento. En otro ejemplo, las suspensiones que comprenden sobrenadante o factores solubles derivados de células STRO-1+ y/o derivados de células de la progenie son suspensiones oleosas para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados induyen aceites grasos tales como aceite de sésamo; o ésteres de ácido graso sintético tales como oleato de etilo o trigli céri dos; o liposomas. Las suspensiones que se usan para inyección pueden contener también sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.

Las disoluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante incorporación del sobrenadante o factores solubles en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes descritos anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtrado.

Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el sobrenadante o factores solubles en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente.

En el caso de los polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación ilustrativos son secado a vacío y liofilización, que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una disolución previamente esterilizada por filtrado. De acuerdo con un ejemplo alternativo de la divulgación, el sobrenadante o los factores solubles se puede formular con uno o más compuestos adicionales que potencien su solubilidad.

Otros portadores o excipientes ilustrativos se describen, por ejemplo, en Hardman, et al. (2001) Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science ad Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams y Wilkins, Nueva York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y.

Las composiciones terapéuticas deberían ser típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse en forma de solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, se incluyen en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, los factores solubles se pueden administrar en una formulación de liberación con el tiempo, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegerán al compuesto frente a una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros poliláctico-poliglicólico (PLG). Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica.

El sobrenadante o los factores solubles se pueden administrar en combinación con una matriz apropiada, por ejemplo, para proporcionar una liberación lenta de los factores solubles.

Componentes Adicionales de Composiciones

Los sobrenadantes o factores solubles derivados de células STRO-1 , las células STRO-1+ o su progenie pueden administrarse con otras medicaciones o moléculas biológicas beneficiosas (factores de crecimiento, factores tróficos). Cuando se administran con otros agentes, pueden administrarse conjuntamente en una sola composiaón farmacéutica, o en composiciones farmacéuticas separadas, simultánea o secuencialmente con los otros agentes (antes o después de la administración de los otros agentes). Los factores bioactivos que pueden coadministrarse incluyen agentes antiapoptóticos (por ejemplo, EPO, mimeticuerpos de EPO, TPO, IGF-I e IGF-II, HGF, inhibidores de caspasa); agentes antiinflamatorios (por ejemplo, inhibidores de p38 MAPK, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS y AINE (fármacos antiinfl amatorios no esteroideos; p. ej., TEPOXALINA, TOLMETINA, SUPROFENO); agentes inmunosupresores/inmunomoduladores (p. ej., inhibidores de calcineurina tales como ciclosporina, tacrolimús; inhibidores de mTOR (p. ej., SIROLIMUS, Ev e Ro LIMUS); antiproliferativos (p. ej., azatioprina, micofenolato de mofetilo); corticosteroides (por ejemplo, prednisolona, hidrocortisona); anticuerpos tales como anticuerpos monocl onales anti-receptor IL-2Ralfa (por ejemplo, basiliximab, daclizumab), anticuerpos policlonales anti-linfocitos T (p. ej., anti-globulina de timocito (ATG); anti globulina de linfocito (ALG); anticuerpo monoclonal anti-linfocitos T OKT3)); agentes antitrombogénicos (p. ej., heparina, derivados de heparina, urocinasa, PPack (dextrofenilalanina, prolina, arginina, clorometilcetona), compuestos antitrombina, antagonistas de receptor de plaquetas, anticuerpos tromboangitis, anticuerpos anti-receptor de plaquetas, aspirina, dipiridamol, protamina, hirudina, inhibidores de prostaglandina e inhibidores de plaquetas); y antioxidantes (p. ej., probucol, vitamina A, ácido ascórbico, tocoferol, coenzima Q-10, glutation, L-cisteína, N-acetilcisteína) así como anestésicos locales.

En un ejemplo, una composición como se describe en este documento según cualquier ejemplo comprende un factor adicional para el tratamiento o profilaxis del síndrome metabólico y/o la obesidad, p. ej., como se describe en este documento, tal como una estatina.

Alternativamente, o además, las células, los factores secretados y/o una composición como se describe en este documento según cualquier ejemplo se combinan con un tratamiento conocido del síndrome metabólico y/o la obesidad.

En un ejemplo, una composición farmacéutica como se describe en este documento de acuerdo con cualquier ejemplo comprende un compuesto usado para tratar el síndrome metabólico y/o la obesidad. Alternativamente, un método de tratamiento/profilaxis como se describe en este documento de acuerdo con cualquier ejemplo de la divulgación comprende además administrar un compuesto usado para tratar el síndrome metabólico y/o la obesidad. En este documento se describen compuestos ilustrativos y se debe considerar que se aplican mutatis mutandis a estos ejemplos de la presente divulgación.

En otro ejemplo, una composición como se describe en este documento de acuerdo con cualquier ejemplo comprende adicionalmente un factor que induce o mejora la diferenciación de una célula progenitora en una célula vascular. Los factores ilustrativos incluyen factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF; p. ej., PDGF-BB) y FGF.

En otro ejemplo, una composición como se describe en este documento según cualquier ejemplo comprende adicionalmente una célula comprometida específica de tejido (TSCC). A este respecto, la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/AU2005/001445 demuestra que la administración de células TSCC y STRO-1+ puede conducir a una mayor proliferación de las TSCC. En un ejemplo, el TSCC es una célula vascular. La administración de tal composición a un sujeto puede conducir a una producción aumentada de vasculatura, p. ej., que conduce a que se suministren más nutrientes al tejido afectado.

Dispositivos Médicos

La presente divulgación también proporciona dispositivos médicos para su uso o cuando se usan en un método como se describe en este documento de acuerdo con cualquier ejemplo. Por ejemplo, la presente divulgación proporaona una jeringa o catéter u otro dispositivo de administración adecuado que comprende células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o factores solubles de las mismas y/o una composición como se describe en este documento según cualquier ejemplo. Opcionalmente, la jeringa o catéter se envasa con instrucciones para uso en un método como se describe en este documento de acuerdo con cualquier ejemplo.

En otro ejemplo, la presente divulgación proporciona un implante que comprende células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o factores solubles de las mismas y/o una composición como se describe en este documento según cualquier ejemplo. Opcionalmente, el implante está envasado con instrucciones para uso en un método como s e describe en este documento de acuerdo con cualquier ejemplo. Los implantes adecuados se pueden formar con un armazón, p. ej., como se describe en este documento anteriormente y células STRO-1+ y/o células de su progenie y/o factores solubles de las mismas.

Modos de Administración

Los sobrenadantes o factores solubles derivados de células STRO-1 , las células STRO-1+ o su progenie pueden implantarse quirúrgicamente, inyectarse, suministrarse (p.ej., mediante un catéter o jeringa) o administrarse de otro modo directa o indirectamente al sitio necesitado de reparación o aumento, p, ej., en una depósito de grasa.

En un ejemplo, el sobrenadante o factores solubles derivados de células STRO-1+, las células STRO-1+ o su progenie se administra(n) al torrente sanguíneo de un sujeto. Por ejemplo, el sobrenadante o factores solubles derivados de células STRO-1+ las células STRO-1+ o su progenie se administran por vía parenteral. Vías ilustrativas de administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, intraperitoneal, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal o intravenosa. En un ejemplo, el sobrenadante o factores solubles derivados de células STRO-1 , las células STRO-1+ o su progenie se administran intraarterialmente, en una aorta, en una aurícula o ventrículo del corazón o en un vaso sanguíneo, p. ej., por vía intravenosa.

En el caso del suministro de células a una aurícula o ventrículo del corazón, las células se pueden administrar a la aurícula o ventrículo izquierdo para evitar complicaciones que pueden surgir del suministro rápido de células a los pulmones.

En un ejemplo, el sobrenadante o los factores solubles derivados de células STRO-1 , las células STRO-1+ o su progenie se administran por vía intravenosa.

En un ejemplo, el sobrenadante o los factores solubles derivados de células STRO-1 , las células STRO-1+ o su progenie se inyectan en el sitio de administración, por ejemplo, usando una jeringa o mediante un catéter o una vía central.

La selección de un régimen de administración para una formulación terapéutica depende de varios factores, que incluyen la tasa de recambio sérico o tisular de la entidad, el nivel de síntomas y la inmunogenicidad de la entidad. En un ejemplo, un régimen de administración maximiza la cantidad de compuesto terapéutico administrada al paciente de acuerdo con un nivel aceptable de efectos secundarios. Por consiguiente, la cantidad de formulación administrada depende en parte de la entidad particular y la gravedad de la afección que se está tratando.

En un ejemplo, el sobrenadante o factores solubles derivados de células STRO-1+, las células STRO-1+ o su progenie se administran como una única dosis en bolo. Alternativamente, el sobrenadante o factores solubles derivados de células STRO-1 , las células STRO-1+ o su progenie se administran mediante infusión continua o mediante dosis a intervalos de, p. ej., un día, una semana o 1-7 veces por semana. Un protocolo de dosis ilustrativo es uno que implica la dosis máxima o la frecuencia de dosis que evita efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semana total depende del tipo y la actividad del compuesto/célula que se va a utilizar. La determinación de la dosis apropiada es hecha por un médico, p. ej., usando parámetros o factores conocidos o que se sospecha en la técnica que afectan al tratamiento o que se prevé que afecten al tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y se incrementa en pequeños incrementos a partir de entonces hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo.

Los presentes inventores han mostrado los beneficios terapéuticos proporcionados por las células STRO-1+ y/o su progenie y/o los factores solubles derivados de las mismas se observan durante al menos cuatro semanas en un sujeto. Por consiguiente, en algunos ejemplos, las células se administran semanalmente, quincenalmente, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas.

De acuerdo con los ejemplos de la divulgación dirigidos a tratar o retrasar la progresión del síndrome metabólico y/o la obesidad, las células STRO-1+ y/o las células su progenie y/o los factores solubles derivados de las mismas se administran después del diagnóstico del trastorno, p. ej., usando métodos estándar conocidos en la técnica y/o descritos en este documento.

Para aquellos ejemplos dirigidos a prevenir o retrasar la aparición del síndrome metabólico y/o la obesidad, las céldas STRO-1+ y/o las células de su progenie y/o los factores solubles derivados de las mismas se pueden administrar antes de diagn ósti co clínico del trasto rno.

La presente divulgación induye los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Inmunoselección de MPC mediante selección de células STRO-3+

La médula ósea (BM, por sus siglas en inglés) se recolecta de voluntarios adultos normales sanos (20-35 años). Brevemente, se aspiran 40 ml de BM de la cresta ilíaca posterior en tubos que contienen anticoagulante de litioheparina.

Se preparan BMMNC mediante separación por gradiente de densidad usando Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) como se describe previamente (Zannettino A.C. et al. (1998) Blood 92:2613-2628). Después de centrifugación a 400 x g durante 30 minutos a 4 °C, se retira la capa leucocítica con una pipeta de transferencia y se lava tres veces con "HHF" compuesto por disolución salina equilibrada de Hank (HBSS; Life Technologies, Gaithersburg, MD), que contiene un 5% de suero fetal de ternero (FCS, CSL Limited, Victoria, Australia).

Las células STRO-3+(o TNAP+) se aislaron posteriormente mediante clasificación de células activadas magnéticamente como se describió anteriormente (Gronthos et al. (2003) Journal of Cell Science 116: 1827-1835; Gronthos, S. y Simmons, PJ (1995) Blood 85: 929-940). Brevemente, aproximadamente 1-3 x 108 BMMNC se incuban en tampón de bloqueo, que consiste en suero de conejo normal al 10% (v/v) en HHF durante 20 minutos en hielo. Se incuban las células con 200 pl de una disolución 10 pg/ml de mAb STRO-3 en tampón de bloqueo durante 1 hora en hielo. Posteriormente, las células se lavan dos veces en HHF mediante centrifugación a 400 x g. Se añade una dilución 1/50 de Y-biotina de cabra anti-ratón (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, RU) en tampón HHF y se incuban las células durante 1 hora en hielo. Las células se lavan dos veces en tampón MACS (Ca2+ - y PBS sin Mn2+-suplementado con BSA al 1%, EDTA 5 mM y azida de sodio al 0,01%) como anteriormente y resuspendido en un volumen final de 0,9 ml de tampón MACS.r

Se añaden cien pl de microperlas de estreptavidina (Miltenyi Biotech; Bergisch Gladbach, Alemania) a la suspensión celular y se incuba en hielo durante 15 minutos. Se lava la suspensión celular dos veces y se resuspende en 0,5 ml de tampón de MACS, se carga posteriormente en una columna mini MACS (MS Columns, Milteny Biotec) y se lava tres veces con 0,5 ml de tampón de MACS para recuperar las células que no se unen al mAb STRO-3 (depositado el 19 de diciembre de 2005 en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-7282 - véase la publicación internacional No. WO 2006/108229). Después de la adición de 1 ml adicional de tampón de MACS, se retira la columna del imán y se aíslan la células TNAP+ por presión positiva. Puede teñirse una alícuota de células de cada fracción con estreptavidina-FITC y valorarse la pureza por citometría de flujo.

Ejemplo 2: Las células seleccionadas por mAb STRO-3 son células STRO-1brillantes

Se diseñaron los experimentos para confirmar el potencial de uso del mAb STRO-3 como un reactivo único para aislar células STRO-1brillantes

Dado que el de STRO-3 (IgG1) es un isotipo diferente al de STRO-1 (IgM), se valoró la capacidad de STRO-3 de identificar CFU-F clonogénicas mediante análisis FACS de dos colores basado en su coexpresión con células STRO-1- aisladas usando el procedimiento de MACS (Figura 1). El histograma del diagrama de puntos representa 5 x 104 sucesos recogidos como datos en modo lista. Las líneas verticales y horizontales se fijaron a los niveles de reactividad de fluorescencia media <1,0% obtenidos con los anticuerpos de control emparejados con isotipo, 1B5 (IgG) y 1A6.12 (IgM) tratados en las mismas condiciones. Los resultados demuestran que una población minoritaria de células STRO-1brillantes coexpresaban TNAP (cuadrante superior derecho), mientras que el resto de células STRO-1+ no conseguían reaccionar con el mAb STRO-3. Se ensayaron posteriormente células aisladas por FACS de los cuatro cuadrantes la incidenda de CFU-F (Tabla 1).

Tabla 1. Enriquecimiento de células de médula ósea humanas por análisis FACS de dos colores basado en la coexpresión de los marcadores de superficie celular STRO-1 y TNAP (con referencia a la Figura 1). Se cultivaron células clasificadas por FACS en condiciones clonogénicas estándar en alfa-MEM suplementado con 20% de FCS. El dato representa el número medio de células formadoras de colonias el día 14 (CFU-F) por 105 células en placa ± SE (n=3 aspirados de médula ósea diferentes). Estos datos sugieren que las MPC humanas están exclusivamente restringidas a la fracción positiva de TNAP de BM que coexpresa el antígeno de STRO-1 brillantemente.

Ejemplo 3: Caracterización de Mono Cynomolgus STRO-3+MPC

Se aislaron células progenitoras de médula de simio (de monos cynomolgus; cyno-MPC) de ~ 15 ml de aspirado de médula ósea recogido de una Macaca fascicularis hembra. La suspensión de aspirado de médula se separó usando un gradiente de Ficoll y se lavó para eliminar las células no nucleadas (glóbulos rojos). Las células nucleadas se contaron, después se separaron uniendo el anticuerpo CA12 (anti-STRO-3) y Dynalbeads. Las células con anticuerpo y perlas unidas se seleccionaron positivamente mediante el campo magnético de un imán MPC-1. Las células positivas seleccionadas se contaron y se sembraron en matraces en T en el paso (p.) 0 en Medio de Crecimiento. Se utilizaron células de preselección, positivas y negativas en un ensayo de formación de colonias (CFU-F).

Las células cyno-MPC se alimentaron con medio de crecimiento. Todos los cultivos (p.0 - p.5) se alimentaron cada 2 a 4 días hasta que alcanzaron la confluencia deseada. A continuación, las células se pasaron o se recolectaron usando lavado con HBSS y después colagenasa seguido de Tripsina/Versene. Las células p. 1 se contaron y se sembraron en matraces en T. Cuando el cyno-MPC p. 1 alcanzó la confluencia deseada, las células se recolectaron y se crioconservaron usando un congelador de velocidad controlada.

Los cyno-MPC crioconservados paso 1 se descongelaron y se sembraron en matraces en T (p.2). Las células p.2 se pasaron a una Cell Factory en p.3. Las células p.3 se recolectaron y se pasaron a p.4 en una Cell Factory. Se crioconservaron células p.3 adicionales. Las células p.4 se pasaron a 6 x Cell Factories en p.5. Cuando el cyno-MPC p.5 alcanzó la confluencia deseada, las células se recolectaron y se crioconservaron usando un congelador de velocidad controlada. Las células se crioconservaron en 50% de AlphaMEM, 42,5% de Profreeze y 7,5% de DMSO. Las muestras se analizaron para el ensayo CFU-F, FACS, esterilidad, micoplasma y endotoxina.

Los resultados del análisis de citometría de flujo representativo del inmunofenotipo de cyno-MPC cultivadas se muestran en la Figura 2. Como se muestra, estas células son STRO-1+, STRO-4+ y CD146+.

Cyno MPC en p5 se descongeló y se usó para la inyección intravenosa de monos cynomolgus diabéticos y no diabéticos como se describe en el Ejemplo 4.

Ejemplo 4: Los MPC de STRO-3 son eficaces en el Tratamiento del Síndrome Metabólico y la Obesidad Incluso a Dosis Bajas

Se seleccionaron cinco (5) monos cynomolgus para el tratamiento. Los monos tenían síndrome metabólico dietético (índice de masa corporal> 35, triglicéridos> 75 mg/dL y niveles bajos de HDL. Se evaluó a los monos durante un período de un mes para detectar signos evidentes de diabetes en función de los niveles de glucosa en ayunas, los niveles de insulina en ayunas y la respuesta de insulina/glucosa después del ensayo de tolerancia a la glucosa intravenosa (IVGTT). Se identificó que tres de los cinco monos tenían diabetes (glucosa en ayunas media mensual > 110). Las características iniciales de los monos se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Características de los animales diabéticos no diabéticos

Los monos se asignaron a los Grupos 1, 2 o 3. Los animales recibieron una única infusión intravenosa (IV) lenta de MPC alogénico (aislado como se describe en el Ejemplo 2) en la vena cefálica o una vena periférica adecuada a la siguiente dosis (la dosis se ajustó al último peso corporal registrado):

Tabla 3. Resumen de ru os de tratamiento

Tres meses después, los monos recibieron una segunda infusión de MPC a la misma dosis.

Durante los seis meses siguientes a las primeras infusiones, se evaluó bisemanalmente el peso, los perfiles lipídicos, los niveles de glucosa en sangre en ayunas, los niveles de insulina en sangre en ayunas y las respuestas de glucosa e insulina a IVGTT.

Resultados

La Figura 3 demuestra que los animales diabéticos muestran un defecto en la respuesta de la insulina de fase tardía a la carga de glucosa antes de la infusión de MPC.

Los resultados que se muestran en la Figura 4 indican que en animales no diabéticos la primera dosis de MPC induce un cambio modesto en la respuesta a la insulina y la segunda dosis induce una respuesta profunda a la insulina que sostenido durante 3 meses (es decir, del mes 4 al 6). En el grupo de diabéticos, tanto la primera como la segunda dosis de MPC demostraron secuencialmente respuestas de insulina aumentadas que se mantuvieron durante 6 meses. Estos datos apoyan que las MPC son capaces de mejorar la función de las células beta pancreáticas, como se describe en la inducción de la respuesta de la insulina después de la carga de glucosa en los animales diabéticos y moderadamente diabéticos.

Consistente con los datos de animales individuales que se muestran en la Figura 5, los datos agrupados para animales no diabéticos en la Figura 5 (Panel a) muestran que la segunda infusión de MPC indujo una profunda respuesta de la insulina que se mantuvo durante 3 meses (es decir, del mes 4 al 6). Esto se corrobora en la Figura 5 (Panel b) que muestra que hay una inducción del 50-100% en la respuesta de insulina de fase tardía después de la segunda infusión de MPC.

Sin embargo, en la Figura 5 (Panel a) los datos agrupados del grupo de diabéticos muestran que tanto la primera como la segunda dosis de MPC aumentaron secuencialmente las respuestas de insulina de fase tardía que se mantuvieron durante 6 meses. Se observó un aumento del 40-75% y del 75-175% en las respuestas de insulina de fase tardía después de la primera y segunda infusiones de MPC, respectivamente. Estos datos apoyan que dosis sucesivas de MPC inducen una respuesta de insulina de fase tardía después de la carga de glucosa.

tratamiento con MPC también produjo un aumento en la velocidad de aclaramiento de glucosa después del primer y segundo tratamiento con MPC en animales no diabéticos (Figura 6). Por ejemplo, la segunda dosis indujo una respuesta sostenida durante 3 meses (es decir, del mes 4 al 6). Además, en animales diabéticos, tanto la primera como la segunda dosis de MPC demostraron secuencialmente velocidades aumentadas de aclaramiento de glucosa que se mantuvieron durante 6 meses. Estos datos indican que la inducción en la respuesta de insulina de fase tardía después de la carga de glucosa, como se ilustra en las Figuras 4 y 5, es responsable del aumento en el aclaramiento de glucosa después del tratamiento con MPC en comparación con los valores i nidales previos al tratamiento que se muestran en la Figura 6.

También se observó una velocidad aumentada en el aclaramiento de glucosa en el grupo no diabético después del primer y segundo tratamientos con MPC (Figura 7 Panel a). El aumento se muestra como el cambio porcentual medio en el aclaramiento de glucosa (5-10% durante los meses 1-3 frente a 15-25% durante los meses 4-6) en la Figura 7 (Panel b).

En el grupo de Diabéticos, tanto la primera como la segunda dosis de MPC demostraron secuencialmente una velocidad aumentada constante del aclaramiento de glucosa que se mantuvo durante 6 meses a un 10-20% en relación con el valor inicial, como se muestra en la Figura 7 (Panel b). Estos datos implican que los sucesivos tratamientos con MPC inducen un aumento progresivo en la velocidad de aclaramiento de glucosa después de la carga de glucosa iv. También se demostró que la administración de MPC induce una reducción sostenida en los niveles medios mensuales de glucosa en sangre y mejora los niveles de insulina en ayunas (Figura 8). En el animal no diabético n° 1880 (valor inicial medio de 80 mg/dl), la primera dosis de MPC produjo una reducción del nivel de glucosa en ayunas. El animal # 1880 también mostró una reducción en el nivel de insulina en ayunas después de la primera dosis.

animal n° 3351 mostró una reducción de la glucosa en sangre en ayunas después del segundo mes de la segunda dosis de MPC. Este animal (que era hiperinsulinémico al inicio del estudio antes de la terapia con MPC) mostró normalización de los niveles de insulina durante 6 meses después de la infusión de MPC.

Todos los animales diabéticos demostraron una reducción profunda de BGL en ayunas después de los valores del tratamiento con MPC (mantenidos por debajo del valor inicial durante 6 meses) en comparación con el valor i nicial previo al tratamiento. Estos datos demuestran que el tratamiento con MPC induce una reducción sostenida de los niveles medios mensuales de glucosa en sangre.

Figura 9 muestra que en el grupo de no diabéticos tanto la primera como la segunda dosis de MPC produjeron una reducción en el nivel de glucosa en ayunas en comparación con los valores iniciales antes del tratamiento con MPC. Después de la infusión de MPC también hubo una normalización sostenida de los niveles de insulina durante 6 meses. En el grupo de diabéticos hubo una profunda reducción de BGL en ayunas después del tratamiento con MPC en comparación con los valores iniciales previos al tratamiento y se mantuvo durante 6 meses por debajo del valor inicial. Además, en el grupo de diabéticos, el primer MPC redujo los niveles de insulina en ayunas en comparación con los valores iniciales previos al tratamiento. Estos datos demuestran que el tratamiento con MPC induce una reducción sostenida de los niveles medios mensuales de glucosa en sangre en ayunas. Hubo una reducción sostenida de los niveles de insulina en ayunas en animales no diabéticos que padecían síndrome metabólico durante 6 meses, y este efecto fue transitorio durante 3 meses en el grupo diabético.

Figura 9(a) muestra los cambios de peso corporal mensuales medios en animales tanto diabéticos como no diabéticos. Se demuestran los datos individuales para los animales No Diabéticos y Diabéticos durante un mes antes y 6 meses después del tratamiento con MPC. Las flechas indican el momento en que se infundieron los MPC. La dosis de MPC para cada animal se muestra en la parte superior de cada panel.

Como se muestra en la Figura 10 Panel (a), la primera dosis de MPC tuvo un efecto transitorio sobre la pérdida de peso y la segunda dosis de MPC tuvo un efecto progresivo sobre la pérdida de peso en animal no diabético n° 1880 en comparación con los pesos corporales previos al tratamiento. El animal No Diabético n° 3351 mostró un patrón de pérdida de peso progresiva con ambas dosis de MPC. Sorprendentemente, la pérdida de peso se produjo a pesar de consumo estable de alimentos durante el período de las mediciones de peso, como se muestra en el panel (b) de la Figura 10 para cada animal individual.

En los animales diabéticos n° 1624 y n° 7581, hubo una pérdida de peso corporal consistente después de la primera y segunda dosis de MPC. El peso corporal del animal n° 2875 estuvo por debajo de la línea de base sin tratar durante todo el tratamiento con MPC.

Figura 10 El panel (c) muestra la pérdida de peso porcentual mensual media en el grupo combinado de animales después de la terapia con MPC en relación con la línea de base no tratada. La pérdida de peso osciló entre el 4% y el 6% durante el curso del tratamiento con MPC. Estos datos demuestran que el tratamiento con MPC induce la pérdida de peso en animales Diabéticos y No Diabéticos que se asocia con niveles reducidos de glucosa en sangre en ayunas, aumento de las velocidades de aclaramiento de glucosa y producaón de insulina estimulada por glucosa inducida después del tratamiento con MPC.

Figura 11 muestra que en los animales no diabéticos hubo una reducción sostenida de triglicéridos y VLDL e incrementos en los niveles de HDL después de la terapia con MPC en comparación con los valores previos al tratamiento. En el animal n° 1880, también hubo evidencia de un efecto de la segunda dosis de MPC, que mostró un aumento en el índice de lipoproteínas después de la segunda dosis de MPC en comparación con la primera dosis de MPC. Ambos animales no diabéticos demostraron un aumento sostenido en el índice de lipoproteínas durante 6 meses. Los datos presentados en la Figura 11 demuestran que el tratamiento con MPC mejora los perfiles de lípidos a largo plazo en animales no diabéticos y a corto plazo en animales diabéticos.

En el grupo de no diabéticos hubo una reducción sostenida de triglicéridos y VLDL e incrementos en los niveles de HDL después de la terapia con MPC en comparación con los valores previos al tratamiento por una duración de 6 meses (Figura 12). De acuerdo con los cambios en el perfil lipídico, el grupo no diabético demostró un aumento sostenido del índice de lipoproteínas durante 6 meses. Los animales diabéticos mostraron efectos a corto plazo después de la primera dosis de MPC sobre el índice de lipoproteínas que duró un período de 2 meses. Estos datos demuestran que el tratamiento con MPC mejora los perfiles de lípidos a largo plazo en animales no diabéticos y a corto plazo en animales diabéticos.

Los datos presentados en este documento demuestran que los monos cynomolgus de Mauricio estudiados tienen síndrome metabólico inducido por la dieta y que la progresión a diabetes tipo 2 se asocia con niveles reducidos de insulina y un defecto en fase de las respuestas de la insulina a la carga de glucosa. Las dosis sucesivas de MPC separadas 3 meses dan como resultado un aumento progresivo de las respuestas de la insulina de fase tardía a la carga de glucosa y una mejora en el aclaramiento de glucosa durante 6 meses. Además, la infusión intravenosa de MPC normaliza los niveles de glucosa en sangre en ayunas durante 6 meses, sin ninguna hipoglucemia. El tratamiento con MPC también produce una pérdida de peso progresiva durante 6 meses y normaliza el perfil lipídico aberrante asociado con el síndrome metabólico. Los efectos hipolipemiantes se mantienen durante 6 meses en sujetos sin diabetes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una población de células enriquecidas con células multipotenciales STRO-1 no hematopoyéticas para su uso en un método de reducción de peso terapéutico de un sujeto o tratamiento terapéutico o prevención de peso excesivo u obesidad en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar al sujeto la población de células, en donde la población de células comprende al menos un 1% de células multipotenciales STRO-1 no hematopoyéticas.

2. La población de células para uso según la reivindicación 1, en donde las células multipotenciales STRO-1+ son células STRO-1brillantes

3. La población de células para uso según la reivindicadón 1 o 2, en donde la población se administra por vía sistémica.

4. La población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la población se administra una pluralidad de veces.

5. La población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde l a población se administra una vez cada cuatro o más semanas.

6. La población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la población se administra a una dosis de entre 0,1 x 106 a 5 x 106 células STRO-1+ por kg o entre 0,3 x 106 a 2 x 106 células STRO-1+ por kg.

7. La población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la población se administra a una dosis de entre 0,1 x 105 y 0,5 x 106 células STRO-1+ por kg o aproximadamente 0,3 x 106 células STRO-1+ por kg.

8. La población de células para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la población es autógena o alogénica.

9. La población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la población se ha expandido en cultivo antes de la administración.

10. La población de células para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde las céldas STRO-1+ son STRO-1brillantes y/o expresan fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP).

11. La población de células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la población se administra en forma de una composición que comprende dicha población y un portador y/o excipiente.