ES2833543T3

ES2833543T3 - Evaluación de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF usando modelos matemáticos de la expresión de genes diana

Info

Publication number: ES2833543T3
Application number: ES15785098T
Authority: ES
Inventors: Ooijen Hendrik Jan Van; De Stolpe Anja Van; Strijp Dianne Arnoldina Margaretha Wilhelmina Van
Original assignee: Koninklijke Philips NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2015-10-26
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2035-10-26
Also published as: AU2015334840B2; WO2016062891A1; CN107077536A; BR112017007965A2; JP6415712B2; CA2965442A1; CA2965442C; US10016159B2; AU2015334840A1; CN107077536B; JP2018503354A; BR112017007965A8; EP3210142A1; US20160113572A1; EP3210142B1; US20180271438A1; DK3210142T3

Abstract

Un método implementado por ordenador para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-β en un sujeto, realizado por un dispositivo de procesamiento digital, en donde la inferencia comprende: recibir niveles de expresión de tres o más genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-β medidos en una muestra del sujeto, determinar una actividad de la ruta de señalización celular de TGF-β basada en la evaluación de un modelo de ruta matemático calibrado que relaciona los niveles de expresión de los tres o más genes diana de TGF-β con un 1nivel de actividad de la familia de elementos del factor de transcripción (TF) de TGF-β, la familia de elementos de TF de TGF-β que controlan la transcripción de los tres o más genes diana de TGF-β, estando definida la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-β por el nivel de actividad de la familia de elementos de TF de TGF-β, siendo el modelo de vía matemática calibrado un modelo que se calibra usando un conjunto de datos de verdad fundamental que incluye muestras en las cuales la transcripción de los tres o más genes diana de TGF-β se induce por la familia de elementos y muestras de TF de TGF-β en las cuales la transcripción de los tres o más genes diana de TGF-β no se induce por la familia de elementos de TF de TGF-β, en donde los tres o más genes diana de TGF-β se seleccionan del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CDKN2B, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, INPP5D, JUNB, MMP2, MMP9, NKX2-5, OVOL1, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI1, SNAI2, TIMP1 y VEGFA, preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2 y VEGFA, más preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, SERPINE1, SKIL, SMAD7, SNAI2 y VEGFA, lo más preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, IL11, JUNB, SERPINE1, SKIL y SMAD7, en donde la ruta de señalización celular de TGF-β se refiere a un proceso de señalización que conduce a la actividad transcripcional de la familia de elementos de TF de TGF-β y en donde la familia de elementos de TF de TGF-β son complejos de proteínas conteniendo cada uno un dímero de un miembro seleccionado del grupo que consiste en SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y SMAD8 con SMAD4 o un trímero de dos miembros seleccionados del grupo que consiste en SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y SMAD8 con SMAD4.

Description

DESCRIPCIÓN

Evaluación de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF usando modelos matemáticos de la expresión de genes diana

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la bioinformática, procesamiento genómico, procesamiento proteómico y técnicas relacionadas. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método implementado por ordenador para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto realizado por un dispositivo de procesamiento digital, en donde la inferencia se basa en los niveles de expresión de tres o más genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p medidos en una muestra del sujeto. La presente invención se refiere además a un aparato para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto que comprende un procesador digital configurado para realizar el método, a un medio de almacenamiento no transitorio para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto que almacena instrucciones que son ejecutables por un dispositivo de procesamiento digital para realizar el método, y a un programa informático para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto que comprende medios de código de programa para hacer que un dispositivo de procesamiento digital realice el método, cuando el programa informático se ejecuta en el dispositivo de procesamiento digital. La presente invención se refiere además a un kit para medir los niveles de expresión de tres o más genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p en una muestra de un sujeto, a un kit para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto y a los usos de los kits para realizar el método.

Antecedentes de la invención

Los análisis genómicos y proteómicos se han realizado sustancialmente y son una promesa potencial para la aplicación clínica en campos médicos tales como la oncología, donde se sabe que diversos cánceres están asociados a combinaciones específicas de mutaciones/variaciones genómicas y/o niveles de expresión altos o bajos para genes específicos, que juegan un papel en el crecimiento y la evolución del cáncer, por ejemplo, proliferación celular y metástasis.

El factor de crecimiento transformante-p (TGF-p) es una citocina que controla diversas funciones en muchos tipos de células en humanos, tales como proliferación, diferenciación y cicatrización de heridas. Con respecto a los trastornos patológicos, tales como cáncer (por ejemplo, de colon, de mama, de próstata), la ruta de señalización celular de TGF-p juega dos papeles opuestos, ya sea como supresor de tumores o como promotor de tumores. Se sabe que TGF-p actúa como supresor de tumores en las primeras fases del desarrollo del cáncer, sin embargo, en tejido canceroso más avanzado, el TGF-p puede actuar como un promotor tumoral actuando como un regulador de la invasión y la metástasis (véase Padua D. y Massagué J., "Roles of TGFbeta in metastasis", Cell Research, Vol. 19, N.° 1, 2009, páginas 89 a 102). TGF-p existe en tres isoformas (nombres de genes: TGFB1, TGFB2, TGFB3) y se secreta como una proteína homodimérica latente inactiva, que se sabe que aumenta en las células cancerosas en comparación con sus contrapartes normales (Massagué J., "How cells read TGF-beta signals", Nature Reviews Molecular Cell Biology, Vol. 1, N.° 3, 2000, páginas 169 a 178). A continuación, el TGF-p latente puede activarse proteolíticamente, tras lo cual puede unirse a los receptores de TGF-p en la membrana celular iniciando de esta manera la ruta de señalización celular canónica de TGF-p, a veces se denomina ruta de señalización celular SMAD. En última instancia, la vía de señalización celular de TGF-p canónica da como resultado la unión de un complejo de factor de transcripción compuesto de R-SMAD regulados por receptor (SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y SMAD8) y SMAD4 al ADN, iniciando de esta manera la transcripción de genes diana de la vía de señalización celular de TGF-p (véase la Figura 1; L. TGF-p = TGF-p latente; PR = Proteosoma; PH = Fosfatasa; Co-R = Correpresores; Co-A = Coactivadores). El término "ruta de señalización celular de TGF-p" en el presente documento se refiere preferentemente a cualquier proceso de señalización que conduce a la actividad transcripcional de los factores de transcripción de TGF-p anteriormente mencionados. Preferentemente, el término se refiere a un proceso de señalización desencadenado por la unión de TGF-p al receptor de TGF extracelular que provoca la cascada de SMAD intracelular, que finalmente conduce a la formación de un complejo SMAD que actúa como factor de transcripción.

Con respecto a la señalización de TGF-p en el cáncer, es importante ser capaz de distinguir entre las actividades supresoras y promotoras de tumores para permitir la elección correcta del tratamiento farmacológico dirigido. Actualmente se están desarrollando terapias anti-TGF-p (véase Yingling JM et al., "Development of TGF-beta signalling inhibitors for cancer therapy", Nature Reviews Drug Discovery, Vol. 3, N.° 12, 2004, páginas 1011 a 1022). Sin embargo, hoy en día no hay ningún ensayo clínico disponible para evaluar el estado funcional con respecto a la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p, que en su estado activo indica que es más probable que sea promotor de tumores y en su estado pasivo indica que es más probable que sea supresor de tumores. Es por lo tanto deseable ser capaz de mejorar las posibilidades de caracterizar a los pacientes que tienen un cáncer, por ejemplo, un cáncer de colon, pancreático, de pulmón, de cerebro o de mama, que esté dirigido al menos parcialmente por una actividad promotora de tumores de la ruta de señalización celular de TGF-p y que, por lo tanto, es probable que responda a inhibidores de la ruta de señalización celular de TGF-p.

El documento WO 2012/154567 A2 desvela un método para determinar si un sujeto que tiene un tumor está en riesgo de metástasis del tumor, o en riesgo de recurrencia del tumor después del tratamiento del tumor usando una firma genética. El documento WO 2013/075059 A1 desvela firmas genéticas para subtipificar el cáncer de mama triple negativo (TNBC, por sus siglas en inglés). El documento WO 2013/003384 A1 desvela firmas genéticas asociadas al cáncer, en particular cáncer de próstata.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto principal de la presente invención, el problema anterior se resuelve mediante un método implementado por ordenador para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto realizado por un dispositivo de procesamiento digital, en donde la inferencia comprende:

recibir niveles de expresión de tres o más, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más, genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p medidos en una muestra del sujeto, determinar una actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p basada en la evaluación de un modelo de ruta matemático calibrado que relaciona los niveles de expresión de los tres o más genes diana de TGF-p con un nivel de actividad de la familia de elementos del factor de transcripción (TF) de TGF-p, la familia de elementos de TF de TGF-p que controlan la transcripción de los tres o más genes diana de TGF-p, estando definida la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p por el nivel de actividad de la familia de elementos de TF de TGF-p, siendo el modelo de vía matemática calibrado un modelo que se calibra usando un conjunto de datos de verdad fundamental que incluye muestras en las cuales la transcripción de los tres o más genes diana de TGF-p se induce por la familia de elementos y muestras de TF TGF-p en las cuales la transcripción de los tres o más genes diana de TGF-p no se induce por la familia de elementos de TF de TGF-p,

en donde los tres o más genes diana de TGF-p se seleccionan del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CDKN2B, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, SERPINE1, INPP5D, JUNB, MMP2, MMP9, NKX2-5, OVOL1, PDGFB, PTHLH, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI1, SNAI2, TIMP1 y VEGFA, preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2, VEGFA, más preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, IL11, JUNB, SERPINE1, PDGFB, SKIL, SMAD7, SNAI2 y VEGFA, más preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, IL11, JUNB, SERPINE1, SKIL y SMAD7,

en donde la ruta de señalización celular de TGF-p se refiere a un proceso de señalización que conduce a la actividad transcripcional de la familia de elementos de TF de TGF-p y

en donde la familia de elementos de TF de TGF-p son complejos de proteínas conteniendo cada uno un dímero de un miembro seleccionado del grupo que consiste en SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y SMAD8 con SMAD4 o un trímero de dos miembros seleccionados del grupo que consiste en SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y SMAD8 con SMAD4.

En el presente documento, el "nivel de actividad" de un elemento TF denota el nivel de actividad del elemento TF con respecto a la transcripción de sus genes diana.

La presente invención se basa en la innovación de los inventores de que una forma adecuada de identificar los efectos que se producen en la ruta de señalización celular de TGF-p pueden basarse en una medición de la salida de señalización de la ruta de señalización celular de TGF-p, que es, entre otros, la transcripción de los genes diana, que está controlada por un elemento del factor de transcripción (TF) de TGF-p que está controlado por la ruta de señalización celular de TGF-p. Esta innovación de los inventores supone que el nivel de actividad de t F se encuentra en un estado cuasi-estacionario en la muestra que puede detectarse por medio de, entre otros, los valores de expresión de los genes diana de TGF-p. Se sabe que la ruta de señalización celular del TGF-p dirigida en el presente documento controla muchas funciones en muchos tipos de células en humanos, tales como proliferación, diferenciación y cicatrización de heridas. Con respecto a los trastornos patológicos, tales como cáncer (por ejemplo, cáncer de colon, pancreático, de pulmón, de cerebro o de mama), la ruta de señalización celular de TGF-p juega dos papeles opuestos, ya sea como supresor de tumores o como promotor de tumores, que es detectable en los perfiles de expresión de los genes diana y, por tanto, se aprovecha mediante un modelo de ruta matemático calibrado.

La presente invención hace posible determinar la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto (i) determinando un nivel de actividad de un elemento TF TGF-p en la muestra del sujeto, en donde la determinación se basa en evaluar un modelo matemático calibrado que relaciona los niveles de expresión de tres o más genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p, cuya transcripción está controlada por el elemento TF TGF-p, al nivel de actividad del elemento TGF-p TF, y (ii) inferir la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p en el sujeto basándose en el nivel de actividad determinado del elemento TF TGF-p en la muestra del sujeto. Esto preferentemente permite mejorar las posibilidades de caracterizar a los pacientes que tienen un cáncer, por ejemplo, un cáncer de colon, pancreático, de pulmón, de cerebro o de mama, que esté dirigido al menos parcialmente por una actividad promotora de tumores de la ruta de señalización celular de TGF-p y que, por lo tanto, es probable que responda a inhibidores de la ruta de señalización celular de TGF-p. En realizaciones particulares, la determinación del tratamiento puede basarse en una actividad específica de la ruta de señalización celular de TGF-p. En una realización particular, el estado de señalización celular de TGF-p puede establecerse en un valor de corte de las probabilidades de que la ruta de señalización celular de TGF-p se active de, por ejemplo, 10:1, 5:1,4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:5,o 1:10.

En el presente documento, la expresión "elemento de factor de transcripción de TGF-p" o "elemento TF TGF-p" o "elemento TF" se define que es un complejo proteico que contiene un dímero de los miembros TGF-p (SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y SMAD8 con SmA d 4) o un trímero (dos proteínas de SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5 y SMAD8 con SMAD4), que es capaz de unirse a secuencias de ADN específicas, controlando de esta manera la transcripción de genes diana. Preferentemente, la expresión se refiere a un factor de transcripción de proteína o complejo de proteína desencadenado por la unión de TGF-p a su receptor o un agente de señalización intermedio en dirección 3' entre la unión de TGF-p a su receptor y la proteína o complejo de proteína del factor de transcripción final. Por ejemplo, se sabe que TGF-p se une a un receptor de TGF-p extracelular que inicia una ruta de señalización intracelular "SMAD" y que una o más proteínas SMa D (regulada por receptor o R-SMAD (SMAD1, SMAD2, SMAD 3, SMAD5 y SMAD8) y SMAD4) participan en y pueden formar un heterocomplejo que participa en, la cascada de señalización de transcripción de TGF-p que controla la expresión.

El modelo de ruta matemática calibrado puede ser un modelo probabilístico, preferentemente un modelo de red bayesiana, basado en probabilidades condicionales que relacionan el nivel de actividad del elemento TF TGF-p y los niveles de expresión de los tres o más genes diana de TGF-p, o el modelo de ruta matemática calibrado puede basarse en una o más combinaciones lineales de la expresión niveles de los tres o más genes diana de TGF-p. En particular, la inferencia de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p puede realizarse como se desvela en la solicitud de patente internacional publicada WO 2013/011479 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression") o como se describe en la solicitud de patente internacional publicada WO 2014/102668 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s) oftarget gene expressions"). Pueden encontrarse detalles adicionales sobre la inferencia de la actividad de la ruta de señalización celular usando modelos matemáticos de la expresión de genes diana en Verhaegh W. et al., "Selection of personalized patient therapy through the use of knowledge-based computational models that identify tumor-driving signal transduction pathways", Cancer Research, Vol. 74, N.° 11, 2014, páginas 2936 a 2945.

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier ser vivo. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal, preferentemente, un mamífero. En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano, preferentemente un sujeto médico.

La expresión "gen diana" como se usa en el presente documento, significa un gen cuya transcripción está directa o indirectamente controlada por un factor de transcripción de TGF-p. El "gen diana" puede ser un "gen diana directo" y/o un "gen diana indirecto" (como se describe en el presente documento). Además, el "gen o genes diana" puede ser "gen o genes diana directos" y/o "gen o genes diana indirectos" (como se describe en el presente documento).

Los genes diana de TGF-p particularmente adecuados se describen en los siguientes pasajes de texto así como en los ejemplos a continuación (véase, por ejemplo, Tablas 1 a 4, 6, 8 y 9 a continuación).

Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferida, los genes diana de TGF-p se seleccionan del grupo que consiste en los genes diana de TGF-p listados en la Tabla 1, la Tabla 2, la Tabla 3, la Tabla 4, la Tabla 6, la Tabla 8 o la Tabla 9 a continuación.

Los presentes inventores han descubierto que los genes diana de TGF-p en las listas sucesivamente más cortas se vuelven cada vez más probatorios para determinar la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p.

Se prefiere que los tres o más, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más, genes diana de TGF-p se seleccionen del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, PTHLH, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2, VEGFA, como alternativa, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, JUNB, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2, VEGFA.

Se prefiere además que los tres o más, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más, genes diana de TGF-p se seleccionen del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, SKIL, SMAD7 y SNAI2, como alternativa, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, JUNB, SERPINE1, SKIL, SMAD7, SNAI2 y VEGFA.

Se prefiere además que los tres o más, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más, genes diana de TGF-p se seleccionen del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, IL11, JUNB, SKIL y SMAD7, como alternativa, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, JUNB, SERPINE1, SKIL y SMAD7.

Preferentemente, los tres o más genes diana de TGF-p seleccionados incluyen ANGPTL4 y CDC42EP3, más preferentemente, ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, JUNB, SERPINE1, SKIL y SMAD7.

Se prefiere particularmente que los tres o más genes diana de TGF-p sean ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, JUNB, SERPINE1, SKIL, SMAD7, SNAI2 y VEGFA.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método (como se describe en el presente documento), que comprende, además:

determinar si la ruta de señalización celular de TGF-p está funcionando en el sujeto en un estado en el que se promueve o se suprime el crecimiento de un tumor basándose en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p en el sujeto, en donde la probabilidad de que la ruta de señalización celular de TGF-p esté en un estado de promoción del crecimiento tumoral aumenta con una actividad inferida creciente de la ruta de señalización celular de TGF-p y

en donde la probabilidad de que la ruta de señalización celular de TGF-p esté en un estado supresor del crecimiento tumoral aumenta con una actividad inferida decreciente de la ruta de señalización celular de TGF-p.

La presente invención también se refiere a un método (como se describe en el presente documento), que comprende, además:

recomendar la prescripción de un inhibidor de la ruta de señalización celular de TGF-p para el sujeto que corrige la función de promoción del crecimiento tumoral de la ruta de señalización celular de TGF-p,

en donde la recomendación se realiza si se determina que la ruta de señalización celular de TGF-p está funcionando en el sujeto en un estado en el que se promueve el crecimiento tumoral basándose en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p.

La muestra o muestras a usar de acuerdo con la presente invención pueden ser una muestra extraída, esto es, una muestra que se ha extraído del sujeto. Los ejemplos de la muestra incluyen, pero no se limitan a, un tejido, células, sangre y/o un fluido corporal de un sujeto. Puede estar, por ejemplo, una muestra obtenida de una lesión de cáncer, o de una lesión que se sospecha de cáncer, o de un tumor metastásico, o de una cavidad corporal en la cual hay líquido contaminado con células cancerosas (por ejemplo, cavidad pleural o abdominal o cavidad vesical) o de otros fluidos corporales que contienen células cancerosas, etcétera, preferentemente mediante un procedimiento de biopsia u otro procedimiento de extracción de muestras. Las células de las que se extrae una muestra también pueden ser células tumorales de neoplasias hematológicas (tales como leucemia o linfoma). En algunos casos, la muestra de células también pueden ser células tumorales circulantes, esto es, células tumorales que han entrado en el torrente sanguíneo y pueden extraerse mediante técnicas de aislamiento adecuadas, por ejemplo, aféresis o extracción de sangre venosa convencional. Aparte de la sangre, un fluido corporal del que se extrae una muestra puede ser orina, contenido gastrointestinal o un extravasado. El término "muestra", como se usa en el presente documento, también abarca el caso en que, por ejemplo, se han tomado del sujeto un tejido y/o células y/o un fluido corporal del sujeto y, por ejemplo, se han colocado en un portaobjetos de microscopio y, para realizar el método reivindicado, se extrae una parte de esta muestra, por ejemplo, por medio de microdisección por captura láser (LCM, por sus siglas en inglés), o raspando las células de interés del portaobjetos, o mediante técnicas de clasificación de células activadas por fluorescencia. Además, el término "muestra", como se usa en el presente documento, también abarca el caso en el que, por ejemplo, se ha tomado del sujeto un tejido y/o células y/o un fluido corporal del sujeto y se ha colocado en un portaobjetos de microscopio y el método reivindicado se realiza en el portaobjetos.

De acuerdo con otro aspecto divulgado, un aparato para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto comprende un procesador digital configurado para realizar el método de la presente invención como se describe en el presente documento.

De acuerdo con otro aspecto divulgado, un medio de almacenamiento no transitorio para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto almacena instrucciones que son ejecutables por un dispositivo de procesamiento digital para realizar el método de la presente invención como se describe en el presente documento. El medio de almacenamiento no transitorio puede ser un medio de almacenamiento legible por ordenador, tales como un disco duro u otro medio de almacenamiento magnético, un disco óptico u otro medio de almacenamiento óptico, una memoria de acceso aleatorio (RAM, por sus siglas en inglés), una memoria de solo lectura (ROM, por sus siglas en inglés), una memoria flash u otro medio de almacenamiento electrónico, un servidor de red, etcétera. El dispositivo de procesamiento digital puede ser un dispositivo portátil (por ejemplo, un asistente de datos personales o un teléfono inteligente), un ordenador portátil, un ordenador de sobremesa, un ordenador o dispositivo de tableta, un servidor de red remoto, etcétera.

De acuerdo con otro aspecto divulgado, un programa informático para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto comprende medios de código de programa para hacer que un dispositivo de procesamiento digital realice el método de la presente invención como se describe en el presente documento, cuando el programa informático se ejecuta en el dispositivo de procesamiento digital. El dispositivo de procesamiento digital puede ser un dispositivo portátil (por ejemplo, un asistente de datos personales o un teléfono inteligente), un ordenador portátil, un ordenador de sobremesa, un ordenador o dispositivo de tableta, un servidor de red remoto, etcétera.

De acuerdo con otro aspecto divulgado, un kit para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto comprende:

uno o más componentes para determinar los niveles de expresión de tres o más genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p en una muestra del sujeto,

en donde el uno o más componentes se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en: un chip de micromatrices, un anticuerpo, una pluralidad de sondas, por ejemplo, sondas marcadas, un conjunto de componentes de secuenciación de transcriptasa inversa de ARN, y/o ARN o ADN, incluyendo ADNc, cebadores de amplificación y

el aparato de la presente invención como se describe en el presente documento, el medio de almacenamiento no transitorio de la presente invención como se describe en el presente documento o el programa informático de la presente invención como se describe en el presente documento,

en donde los tres o más genes diana de TGF-p se seleccionan del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CDKN2B, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, INPP5D, JUNB, MMP2, MMP9, NKX2-5, OVOL1, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI1, SNAI2, TIMP1 y VEGFA, preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2 y VEGFA, más preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, SERPINE1, SKIL, SMAD7, SNAI2 y VEGFA, lo más preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, IL11, JUNB, SERPINE1, SKIL y SMAD7.

Se prefiere que los tres o más, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más, genes diana de t Gf -P se seleccionen del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, PTHLH, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2, VEGFA, como alternativa, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, JUNB, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2, VEGFA.

De acuerdo con otro aspecto divulgado, el kit de la presente invención como se describe en el presente documento se usa para realizar el método de la presente invención como se describe en el presente documento.

La presente invención como se describe en el presente documento puede, por ejemplo, usarse también ventajosamente en relación con:

diagnóstico basado en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p en el sujeto; pronóstico basado en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p en el sujeto; prescripción de fármacos basada en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p en el sujeto; predicción de la efectividad del fármaco basada en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p en el sujeto;

predicción de efectos adversos basada en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p en el sujeto;

monitorización de la efectividad de fármacos;

desarrollo de fármacos;

desarrollo de ensayos;

investigación de rutas;

estadificación del cáncer;

inscripción del sujeto en un ensayo clínico basado en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p en el sujeto;

selección de la prueba posterior a realizar; y

selección de pruebas de diagnóstico complementario.

Las ventajas adicionales serán evidentes para los expertos en la materia tras leer y comprender las figuras adjuntas, la siguiente descripción y, en particular, después de leer los ejemplos detallados que se proporcionan a continuación.

Debe entenderse que el método de la reivindicación 1, el aparato de la reivindicación 9, el medio de almacenamiento no transitorio de la reivindicación 10, el programa informático de la reivindicación 11, el kit de la reivindicación 12 y el uso del kit de la reivindicación 13 tienen realizaciones preferidas similares y/o idénticas, en particular, como se define en las reivindicaciones dependientes.

Se entenderá que una realización preferida de la presente invención también puede ser cualquier combinación de las reivindicaciones dependientes o realizaciones anteriores con la respectiva reivindicación independiente.

Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes a partir de y se aclararán con referencia a las realizaciones descritas en lo sucesivo en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra esquemáticamente y a modo de ejemplo que la señalización de TGF-p a través de la ruta de señalización celular canónica (parte izquierda) se inicia tras la unión de la proteína TGF-p al receptor. La ruta de señalización celular iniciada en última instancia da como resultado la translocación de SMAD2/3 y SMAD4 al núcleo y la unión al ADN, iniciando de esta manera la transcripción del gen diana (véase Sheen Y. Y. et al., "Targeting the transforming growth factor-p signaling in cancer therapy", Biomolecules and Therapeutics, Vol. 21, N.° 5, 2013, páginas 323 a 331).

La Figura 2 muestra esquemáticamente y a modo de ejemplo un modelo matemático, en el presente documento, un modelo de red bayesiana, usado para modelar el programa transcripcional de la ruta de señalización celular de TGF-p.

La Figura 3 muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para inferir la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto basándose en los niveles de expresión de genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p medidos en una muestra de un sujeto.

La Figura 4 muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para obtener un modelo de ruta matemático calibrado como se describe en el presente documento.

La figura 5 muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para determinar un nivel de actividad de un elemento factor de transcripción (TF) de TGF-p en una muestra de un sujeto como se describe en el presente documento.

La Figura 6 muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para inferir la actividad de ruta vía de señalización celular de TGF-p en un sujeto usando observables discretizados.

La Figura 7 muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para inferir la actividad de ruta vía de señalización celular de TGF-p en un sujeto usando observables continuos.

La Figura 8 muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para determinar los valores de Cq a partir del análisis de RT-qPCR de los genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p.

Las Figuras 9 a 12 muestran resultados de entrenamiento del modelo de red bayesiana a modo de ejemplo basado en la lista curada por evidencia de genes diana, la lista corta de 20 genes diana, la lista corta de 12 genes diana y la lista corta de 7 genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p (véanse las Tablas 4 a 7), respectivamente. (Leyenda: 1 - Control; 2 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 0,5 h; 3 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 1 h; 4 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 2 h; 5 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 4 h; 6- estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 8 h; 7 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 16 h; Estimulación con 8-TGF-p con 5 ng/ml durante 24 h; 9 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 72 h)

Las Figuras 13 a 16 muestran las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular TGF-p de los modelos de redes bayesianas a modo de ejemplo entrenados usando la lista curada por evidencia de genes diana, la lista corta de 20 genes diana, la lista corta de 12 genes diana y la lista corta de 7 genes diana (véanse las Tablas 4 a 7), respectivamente, para células epiteliales mamarias humanas (HMEC-TR) de GSE28448. (Leyenda: 1 -Control, sin TGF-p; 2 - Control, TGF-p; 3 - ARNip SMAD4, sin TGF-p; 4 - ARNip SMAD4, TGF-p; 5 - ARNip TIFy, sin TGF-p; 6 - ARNip TIFy, TGF-p)

La Figura 17 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana a modo de ejemplo entrenado usando la lista curada por evidencia de genes diana (véase la Tabla 1) para células epiteliales ectocervicales (Ect1) de GSE35830, que se estimularon con plasma seminal o 5 ng/ml de TGF-p. (Leyenda: 1 - Control, sin TGF-p; 2 - Estimulado con 10 % de plasma seminal; 3 - estimulado con 5 ng/ml de TGF-p3)

La Figura 18 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana a modo de ejemplo entrenado usando la lista curada por evidencia de genes diana (véase la Tabla 1) para gliomas de pacientes de GSE16011. (Leyenda: 1 - Astrocitoma (grado II); 2 - Astrocitoma (grado III); 3 -Control; 4 - Glioblastoma multiforme (grado IV); 5 - Oligoastrocítico (grado II); 6 - Oligoastrocítico (grado III); 7 -Oligodendroglial (grado II); 8 - Oligodendroglial (grado III); 9 - Astrocitoma pilocítico (grado I))

La Figura 19 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana a modo de ejemplo entrenado usando la lista curada por evidencia de genes diana (véase la Tabla 1) para muestras de cáncer de mama de GSE21653. (Leyenda: 1 - Luminal A; 2 - Luminal B; 3 - HER2; 4 - Basal; 5 - Tipo normal)

Las Figuras 20 a 23 muestran las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular TGF-p de los modelos de redes bayesianas a modo de ejemplo entrenados usando la lista curada por evidencia de genes diana, la lista corta de 20 genes diana, la lista corta de 12 genes diana y la lista corta de 7 genes diana (véanse las Tablas 4 a 7), respectivamente, para cultivos 2D y 3D de líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón A549 de GSE42373, que se estimularon con o sin un TNF 10 ng/ml y TGF-p 2 ng/ml. (Leyenda: 1 - control 2D; 2 - TGF-p y TNFa 2D; 3 - control 3D; 4 - TGF-p y TNFa 3D)

La Figura 24 ilustra un pronóstico de pacientes con glioma (GSE16011) representado en un gráfico de Kaplan-Meier usando el modelo de red bayesiana a modo de ejemplo entrenado usando la lista curada por evidencia de genes diana (véase la Tabla 1).

La Figura 25 ilustra un pronóstico de pacientes con cáncer de mama (GSE6532, GSE9195, E-MTAB-365, GSE20685 y GSE21653) representado en un gráfico de Kaplan-Meier usando el modelo de red bayesiana a modo de ejemplo entrenado usando la lista curada por evidencia de genes diana (véase la Tabla 1).

La Figura 26 muestra los resultados de entrenamiento del modelo de red bayesiana a modo de ejemplo basado en la amplia lista de la bibliografía de genes diana putativos de la ruta de señalización celular de TGF-p (véase la Tabla 5). (Leyenda: 1 - Control; 2 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 0,5 h; 3 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 1 h; 4 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 2 h; 5- Estimulación de TGF- p con 5 ng/ml durante 4 h; 6 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 8 h; 7 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 16 h; 8- Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 24 h; 9 - Estimulación de TGF-p con 5 ng/ml durante 72 h) La Figura 27 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana entrenado usando la amplia lista de la bibliografía de genes diana putativos (véase la Tabla 5) para gliomas de pacientes de GSE16011. (Leyenda: 1 - Astrocitoma (grado II); 2 - Astrocitoma (grado III); 3 - Control; 4 - Glioblastoma multiforme (grado IV); 5 - Oligoastrocítico (grado II); 6 - Oligoastrocítico (grado III); 7 -Oligodendroglial (grado II); 8 - Oligodendroglial (grado III); 9 - Astrocitoma pilocítico (grado I))

La Figura 28 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana entrenado usando la amplia lista de la bibliografía de genes diana putativos (véase la Tabla 5) para muestras de cáncer de mama de GSE21653. (Leyenda: 1 - Luminal A; 2 - Luminal B; 3 - HER2; 4 - Basal; 5 - Tipo normal)

La Figura 29 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana entrenada usando la "lista de 11 genes diana" para células epiteliales ectocervicales (Ect1) estimuladas con plasma seminal o TGF-p3 5 ng/ml (GSE35830). (Leyenda: 1 - Control, sin TGF-p; 2 - Estimulado con 10 % de plasma seminal; 3 - estimulado con 5 ng/ml de TGF-p3)

La Figura 30 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana entrenada usando la "lista de 11 genes diana SERPINE1" para células epiteliales ectocervicales (Ect1) estimuladas con plasma seminal o TGF-p3 5 ng/ml (GSE35830). (Leyenda: 1 - Control, sin TGF-p; 2 -Estimulado con 10 % de plasma seminal; 3 - estimulado con 5 ng/ml de TGF-p3)

La Figura 31 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana entrenada usando la "lista de 11 genes diana" en cultivos 2D y 3D de líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón A549 estimuladas con o sin un TNF de 10 ng/ml y 2 ng/ml de TGF-p (GSE42373). (Leyenda: 1 - control 2D, 2 - TGF-p y TNFa 2D, 3 - control 3D, 4 - TGF-p y TNFa 3D)

La Figura 32 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana entrenada usando la "lista de 11 genes diana SERPINE1" en cultivos 2D y 3D de líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón A549 estimuladas con o sin un TNF de 10 ng/ml y 2 ng/ml de TGF-p (GSE42373). (Leyenda: 1 - control 2D, 2 - TGF-p y TNFa 2D, 3 - control 3D, 4 - TGF-p y TNFa 3D)

La Figura 33 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana entrenada usando la "lista de 11 genes diana" en pacientes con glioma y algunas muestras de control de GSE16011. (Leyenda: 1 - Astrocitoma (grado II); 2 - Astrocitoma (grado III); 3 - Control; 4 - Glioblastoma multiforme (grado IV); 5 - Oligoastrocítico (grado II); 6 - Oligoastrocítico (grado III); 7 - Oligodendroglial (grado II); 8 - Oligodendroglial (grado III); 9 - Astrocitoma pilocítico (grado I))

La Figura 34 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana entrenada usando la "lista de 11 genes diana SERPINE1" en pacientes con glioma y algunas muestras de control de GSE16011. (Leyenda: 1 - Astrocitoma (grado II); 2 - Astrocitoma (grado III); 3 - Control; 4 -Glioblastoma multiforme (grado IV); 5 - Oligoastrocítico (grado II); 6 - Oligoastrocítico (grado III); 7 - Oligodendroglial (grado II); 8 - Oligodendroglial (grado III); 9 - Astrocitoma pilocítico (grado I))

Descripción detallada de realizaciones

Los siguientes ejemplos meramente ilustran métodos particularmente preferidos y aspectos seleccionados en relación con los mismos. La enseñanza proporcionada en los mismos puede usarse para construir varias pruebas y/o kits, por ejemplo, para detectar, predecir y/o diagnosticar la actividad anormal de una o más rutas de señalización celular. Adicionalmente, tras usar métodos como se describen en el presente documento, la prescripción de medicamentos puede guiarse ventajosamente, puede realizarse la predicción de la respuesta al fármaco y monitorización de la efectividad de fármacos (y/o efectos adversos), puede predecirse y monitorizarse la resistencia a fármacos, por ejemplo, para seleccionar la prueba o pruebas posteriores que se realizarán (como una prueba de diagnóstico complementaria). Los siguientes ejemplos no han de interpretarse como limitaciones del alcance de la invención.

Ejemplo 1: Construcción del modelo matemático

Como se describe en detalle en la solicitud de patente internacional publicada WO 2013/011479 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression"), mediante la construcción de un modelo probabilístico, por ejemplo, un modelo de red bayesiana, e incorporando relaciones probabilísticas condicionales entre los niveles de expresión de uno o más genes diana de una ruta de señalización celular, en el presente documento, la ruta de señalización celular de TGF-p y el nivel de actividad de un elemento factor de transcripción (TF), en el presente documento, el elemento TF TGF-p, controlando el elemento TF la transcripción de uno o más genes diana de la ruta de señalización celular, un modelo tal puede usarse para determinar la actividad de la ruta de señalización celular con un alto grado de precisión. Además, el modelo probabilístico puede actualizarse fácilmente para incorporar conocimientos adicionales obtenidos por estudios clínicos posteriores, ajustando las probabilidades condicionales y/o añadiendo nuevos nodos al modelo para representar fuentes de información adicionales. De esta manera, el modelo probabilístico puede actualizarse según sea apropiado para incorporar los conocimientos médicos más recientes.

En otro enfoque fácil de comprender e interpretar descrito en detalle en la solicitud de patente internacional publicada WO 2014/102668 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s) of target gene expressions"), la actividad de una ruta de señalización celular, en el presente documento, la ruta de señalización celular TGF-p, puede determinarse construyendo y evaluando un modelo lineal o (pseudo-)lineal que incorpora relaciones entre los niveles de expresión de uno o más genes diana de la ruta de señalización celular y el nivel de un elemento de factor de transcripción (TF), en el presente documento, el elemento TF TGF-p, controlando el elemento TF la transcripción de uno o más genes diana de la ruta de señalización celular, estando el modelo basado en una o más combinación o combinaciones lineales de niveles de expresión de uno o más gen o genes diana.

En ambos enfoques, los niveles de expresión de uno o más gen o genes diana pueden ser preferentemente mediciones del nivel de ARNm, que puede ser el resultado de, por ejemplo, (RT)-PCR y técnicas de micromatrices que usan sondas asociadas a las secuencias de ARNm del gen o genes diana, y de secuenciación de ARN. En otra realización, los niveles de expresión del uno o más gen o genes diana pueden medirse mediante niveles de proteína, por ejemplo, las concentraciones y/o la actividad de la proteína o proteínas codificadas por el gen o genes diana.

Los niveles de expresión mencionados anteriormente pueden convertirse opcionalmente de muchas formas que podrían o podrían no adaptarse mejor a la solicitud. Por ejemplo, cuatro transformaciones diferentes de los niveles de expresión, por ejemplo, niveles de ARNm basados en micromatrices, pueden ser:

- "datos continuos", es decir, niveles de expresión obtenidos después del preprocesamiento de micromatrices usando algoritmos bien conocidos tales como MAS5.0 y fRMA,

- "puntuación z", es decir, niveles de expresión continuos escalados de manera que el promedio de todas las muestras sea 0 y la desviación estándar sea 1,

- "discreto", es decir, cada expresión por encima de un cierto umbral se establece en 1 y por debajo de él en 0 (por ejemplo, el umbral para un conjunto de sondas puede elegirse como la mediana (ponderada) de su valor en un conjunto de un número de positivos y el mismo número de muestras clínicas negativas),

- "difuso", es decir, los niveles de expresión continua se convierten en valores entre 0 y 1 usando una función sigmoidea del siguiente formato: 1 / (1 exp((thr - expr) I se)), siendo expr los niveles de expresión continuos, siendo thr el umbral como se mencionó anteriormente y siendo se un parámetro de suavizado que influye en la diferencia entre 0 y 1.

Uno de los modelos lineales más sencillos que pueden construirse es un modelo que tiene un nodo que representa el elemento del factor de transcripción (TF), en el presente documento, el elemento TF TGF-p, en una primera capa y nodos ponderados que representan mediciones directas de los niveles de expresión de los genes diana, por ejemplo, por un conjunto de sondas que está particularmente altamente correlacionado con el gen diana particular, por ejemplo, en experimentos de micromatrices o (q)PCR, en una segunda capa. Las ponderaciones pueden basarse en cálculos de un conjunto de datos de entrenamiento o en conocimientos de expertos. Este enfoque de usar, en el caso de que posiblemente se midan múltiples niveles de expresión por gen diana (por ejemplo, en el caso de experimentos de micromatrices, donde un gen diana puede medirse con múltiples conjuntos de sondas), solo un nivel de expresión por gen diana es particularmente sencillo. Una forma específica de seleccionar el nivel de expresión que se usa para un gen diana particular es usar el nivel de expresión del conjunto de sondas que es capaz de separar mejor las muestras activas y pasivas de un conjunto de datos de entrenamiento. Un método para determinar este conjunto de sondas es realizar una prueba estadística, por ejemplo, la prueba t, y seleccionar el conjunto de sondas con el valor p más bajo. Los niveles de expresión del conjunto de datos de entrenamiento del conjunto de sondas con el valor p más bajo son, por definición, el conjunto de sondas con la menor probabilidad de que los niveles de expresión de las muestras activas y pasivas (conocidas) se superpongan. Otro método de selección se basa en razones de probabilidades. En un modelo tal, se proporcionan uno o más nivel o niveles de expresión para cada uno de los uno o más gen o genes diana y la una o más combinación o combinaciones lineales comprenden una combinación lineal que incluye para cada uno de los uno o más genes diana un término ponderado, basándose cada término ponderado en sólo un nivel de expresión del uno o más nivel o niveles de expresión proporcionados para el gen diana respectivo. Si solo se elige un nivel de expresión por gen diana como se describe anteriormente, el modelo puede denominarse modelo de "conjuntos de sondas más discriminantes".

En una alternativa al modelo de "conjuntos de sondas más discriminantes", es posible, en el caso de que posiblemente se midan múltiples niveles de expresión por gen diana, hacer uso de todos los niveles de expresión que se proporcionan por gen diana. En un modelo tal, se proporcionan uno o más nivel o niveles de expresión para cada uno de los uno o más gen o genes diana y la una o más combinación o combinaciones lineales comprenden una combinación lineal de todos los niveles de expresión del uno o más nivel o niveles de expresión proporcionado para uno o más gen o genes diana. En otras palabras, para cada uno del uno o más gen o genes diana, cada uno de los uno o más nivel o niveles de expresión proporcionados para el gen diana respectivo puede ponderarse en la combinación lineal por su propio peso (individual). Esta variante puede denominarse modelo de "todos los conjuntos de sondas". Tiene la ventaja de ser relativamente sencillo y al mismo tiempo hacer uso de todos los niveles de expresión proporcionados.

Los dos modelos descritos anteriormente tienen en común que son lo que pueden considerarse modelos de "capa única", en los cuales el nivel de actividad del elemento TF se calcula basándose en una combinación lineal de niveles de expresión del uno o más conjuntos de sondas del uno o más gen o genes diana.

Después del nivel de actividad del elemento TF, en el presente documento, el elemento TF TGF-p, se ha determinado evaluando el modelo respectivo, el nivel de actividad del elemento TF determinado puede establecerse como umbral para inferir la actividad de la ruta de señalización celular, en el presente documento, la ruta de señalización celular TGF-p. Un método preferido para calcular un umbral tan apropiado es comparando los niveles de actividad del elemento TF determinados wlc de muestras de entrenamiento que se sabe que tienen una ruta de señalización celular pasiva y muestras de entrenamiento con una ruta de señalización celular activa. Un método que lo hace y también tiene en cuenta la varianza en estos grupos se da mediante el uso de un umbral

awlcpas^ wlcact awlcact^ wlcpas _{th r =} ₍₁₎

donde a y m son la desviación estándar y la media de los niveles de actividad del elemento TF determinados w/c para las muestras de entrenamiento. En caso de que solo haya una pequeña cantidad de muestras disponibles en las muestras de entrenamiento activo y/o pasivo, puede añadirse un pseudorecuento a las varianzas calculadas basándose en el promedio de las varianzas de los dos grupos:

vwlcact Vwlc

v = pas

2

xv+(nact-l)vwiCa

vwlc„rt x+nact-1 ⁽²⁾

xv (npas - 1)vwlCij

vwlc„rt x + np - 1

donde v es la varianza de los niveles de actividad del elemento TF determinados wlc de los grupos, X es un pseudorecuento positivo, por ejemplo, 1 o 10, y nact y npas son el número de muestras activas y pasivas, respectivamente. A continuación, puede obtenerse la desviación estándar a tomando la raíz cuadrada de la varianza v.

El umbral puede restarse de los niveles de actividad del elemento TF determinados wlc para facilitar la interpretación, dando como resultado una puntuación de actividad de la ruta de señalización celular en la cual los valores negativos corresponden a una ruta de señalización celular pasiva y los valores positivos corresponden a una ruta de señalización celular activa.

Como alternativa a los modelos de "capa única" descritos anteriormente, también puede usarse uno de "dos capas" en un ejemplo. En un modelo tal, se calcula un valor de resumen para cada gen diana usando una combinación lineal basada en las intensidades medidas de sus conjuntos de sondas asociados ("primera capa (inferior)"). El valor de resumen calculado se combina posteriormente con los valores de resumen de los otros genes diana de la ruta de señalización celular usando una combinación lineal adicional ("segunda capa (superior)"). De nuevo, las ponderaciones pueden aprenderse de un conjunto de datos de entrenamiento o basarse en el conocimiento de expertos o una combinación de los mismos. Expresado de manera diferente, en el modelo de "dos capas", se proporcionan uno o más nivel o niveles de expresión para cada uno de los uno o más gen o genes diana y una o más combinación o combinaciones lineales comprenden para cada uno de los uno o más gen o genes diana una primera combinación lineal de todos los niveles de expresión del uno o más nivel o niveles de expresión proporcionados para el gen diana respectivo ("primera capa (inferior)"). El modelo se basa además en una combinación lineal adicional que incluye para cada uno de los uno o más gen o genes diana un término ponderado, basándose cada término ponderado en la primera combinación lineal para el gen diana respectivo ("segunda capa (superior)").

El cálculo de los valores de resumen puede, en una versión preferida del modelo de "dos capas", incluir definir un umbral para cada gen diana usando los datos de entrenamiento y restar el umbral de la combinación lineal calculada, produciendo el resumen del gen diana. En este caso, el umbral puede elegirse de manera que un valor de resumen del gen diana negativo corresponda a un gen diana regulado negativamente y que un valor de resumen del gen diana positivo corresponda a un gen diana regulado positivamente. También, es posible que los valores de resumen del gen diana se transformen usando, por ejemplo, una de las transformaciones descritas anteriormente (difusa, discreta, etc.), antes de que se combinen en la "segunda capa (superior)".

Una vez que se ha determinado el nivel de actividad del elemento TF mediante la evaluación del modelo de "dos capas", el nivel de actividad del elemento TF determinado puede establecerse como umbral para inferir la actividad de la ruta de señalización celular, como se ha descrito anteriormente.

En lo sucesivo, los modelos descritos anteriormente se denominan colectivamente modelos "(pseudo-)lineales". Una descripción más detallada del entrenamiento y uso de modelos probabilísticos, por ejemplo, un modelo de red bayesiana, se proporciona en el Ejemplo 3 a continuación.

Ejemplo 2: Selección de genes diana

Un factor de transcripción (TF) es un complejo de proteínas (es decir, una combinación de proteínas unidas en una estructura específica) o una proteína que es capaz de regular la transcripción de genes diana al unirse a secuencias de ADN específicas, controlando de esta manera la transcripción de información genética de ADN a ARNm. El ARNm producido directamente debido a esta acción del complejo TF se denomina en el presente documento un "gen diana directo" (del factor de transcripción). La activación de la vía de señalización celular también puede resultar en una mayor transcripción de genes secundarios, denominados "genes diana indirectos". En lo sucesivo, se prefieren los modelos (pseudo-)lineales o modelos de redes bayesianas (como modelos matemáticos a modo de ejemplo) que comprenden o consisten en genes diana directos como enlaces directos entre la actividad de la vía de señalización celular y el nivel de ARNm, sin embargo, la distinción entre genes diana directos e indirectos no siempre es evidente. En el presente documento, se presenta un método para seleccionar genes diana directos usando una función de puntuación basada en los datos de la bibliografía científica disponible. Sin embargo, no puede descartarse una selección accidental de genes diana indirectos debido a la información limitada, así como a las variaciones biológicas e incertidumbres. Para seleccionar los genes diana, se empleó la base de datos MEDLINE del National Institute of Health accesible en "www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed" y denominado además en el presente documento "Pubmed" para generar unas listas de genes diana. Adicionalmente, se seleccionaron tres listas adicionales de genes diana basándose en la naturaleza probatoria de su expresión.

Las publicaciones que contienen genes diana de TGF-p putativos se buscaron mediante consultas como ("TGF-p" Y "gen diana") en el período del cuarto trimestre de 2013 y el primer trimestre de 2014. Las publicaciones resultantes se analizaron posteriormente de forma manual siguiendo la metodología que se describe con más detalle a continuación.

Se seleccionaron genes diana de ARNm de la ruta de señalización celular específica de la bibliografía científica, mediante el uso de un sistema de clasificación en el que se dio una clasificación a la evidencia científica para un gen diana específico, dependiendo del tipo de experimentos científicos en los que se acumuló la evidencia. Si bien algunas pruebas experimentales sugieren simplemente que un gen es un gen diana directo, como, por ejemplo, un ARNm que aumenta según se detecta mediante una intensidad creciente de un conjunto de sondas en una micromatriz de una línea celular en la que se sabe que la ruta de señalización celular de TGF-p está activa, otra evidencia puede ser muy fuerte, como la combinación de un sitio de unión TF de la ruta de señalización celular de TGF-p identificada y la recuperación de este sitio en un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) después de la estimulación de la ruta de señalización celular específica en la célula y aumento de ARNm después de la estimulación específica de la ruta señalización celular en una línea celular.

En la bibliografía científica pueden identificarse diversos tipos de experimentos para encontrar genes diana de rutas de señalización celular específicas:

1. Experimentos ChIP en los cuales se muestra la unión directa de un TF de la ruta de señalización celular de interés a su sitio de unión en el genoma. Ejemplo: Mediante el uso de la tecnología de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), posteriormente, los sitios de unión de TF TGF-p funcionales putativos en el ADN de líneas celulares con y sin inducción activa de la ruta de señalización celular de TGF-p, por ejemplo, por estimulación con TGF-p, se identificaron, como un subconjunto de los sitios de unión reconocidos puramente basándose en la secuencia de nucleótidos. La funcionalidad putativa se identificó como evidencia derivada de ChIP de que se encontró que el TF se unía al sitio de unión del ADN.

2. Ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) que muestran la unión in vitro de un TF a un fragmento de ADN que contiene la secuencia de unión. En comparación con la evidencia basada en ChIP, la evidencia basada en EMSA es menos sólida, ya que no puede traducirse a la situación in vivo.

3. Estimulación de la ruta de señalización celular y medición de la expresión de ARNm usando una micromatriz, secuenciación de ARN, PCR cuantitativa u otras técnicas, usando líneas celulares inducibles por la ruta de señalización celular de TGF-p y midiendo los perfiles de ARNm medidos al menos uno, pero preferentemente varios puntos de tiempo después de la inducción, en presencia de cicloheximida, que inhibe la traducción a proteína, por lo tanto, se supone que los ARNm inducidos son genes diana directos.

4. Similar a 3, pero, alternativamente, mide la expresión de ARNm adicionales en dirección 3' con mediciones de abundancia de proteínas, tales como transferencia Western.

5. Identificación de sitios de unión de TF en el genoma mediante un enfoque bioinformático. Ejemplo para el elemento TGF-p TF: Usando el motivo de unión a SMAD 5'-AGAC-3 se ejecutó un programa de software en la secuencia del genoma humano y se identificaron los sitios de unión potenciales, tanto en regiones promotoras de genes como en otras regiones genómicas.

6. Similar a 3, solo en ausencia de cicloheximida.

7. Similar a 4, solo en ausencia de cicloheximida.

En la forma más sencilla, puede asignarse a cada gen potencial 1 punto para cada uno de estos enfoques experimentales en los cuales el gen se identificó como un gen diana de la familia de factores de transcripción TGF-p. Usando esta estrategia de clasificación relativa, puede hacerse una lista de los genes diana más fiables.

Como alternativa, la clasificación de otra manera puede usarse para identificar los genes diana que tienen más probabilidades de ser genes diana directos, dando un mayor número de puntos a la tecnología que proporciona la mayor evidencia de un gen diana directo en vivo. En la lista anterior, esto significaría 8 puntos para el enfoque experimental 1), 7 para 2) y bajando a 1 punto para el enfoque experimental 8). Esta lista puede denominarse una "lista general de genes diana".

A pesar de las variaciones biológicas e incertidumbres, los inventores supusieron que los genes diana directos son los que tienen más probabilidades de inducirse de forma independiente del tejido. Una lista de estos genes diana puede denominarse una "lista de genes diana curada por pruebas". Esta lista de genes diana curada por pruebas se ha usado para construir modelos computacionales de la ruta de señalización celular de TGF-p que pueden aplicarse a muestras procedentes de diferentes fuentes de tejido.

Lo siguiente ilustrará a modo de ejemplo cómo se construyó específicamente la selección de una lista de genes diana curada por evidencia para la ruta de señalización celular de TGF-p.

Se introdujo una función de puntuación que daba un punto por cada tipo de evidencia experimental, tales como ChIP, EMSA, expresión diferencial, atenuación/inactivación génica, ensayo del indicador del gen de la luciferasa, análisis de secuencia, que se informó en una publicación. La misma evidencia experimental a veces se menciona en múltiples publicaciones, lo que da como resultado un número correspondiente de puntos, por ejemplo, dos publicaciones que mencionan un resultado de ChIP dan como resultado el doble de la puntuación que se da para un solo resultado de ChIP. Se realizaron análisis adicionales para permitir solo genes que tenían diversos tipos de evidencia experimental y no solo un tipo de evidencia experimental, por ejemplo, expresión diferencial. Se seleccionaron aquellos genes que tenían más de un tipo de evidencia experimental disponible (como se muestra en la Tabla 1).

Los inventores realizaron una selección adicional de la lista de genes diana curada por pruebas (enumerada en la tabla 2). Se seleccionaron los genes diana de la lista curada por evidencias de pruebas que demostraron ser más probatorios en la determinación de la actividad de la ruta de señalización de TGF-p de las muestras de entrenamiento. En el presente documento, Las muestras de GSE17708 estimuladas con 5 ng/ml de TGF-p durante 4 horas se eligieron como activas o con actividad de TGF-p promotora de tumores, mientras que las muestras no estimuladas se eligieron como muestras de TGF-p pasivas o supresoras de tumores para entrenamiento, como alternativa, pueden usarse muestras de pacientes de células primarias u otras líneas celulares estimuladas y privadas de TGF-p, por ejemplo, GSE6653, GSE42373 y GSE18670. Todos los genes diana que tenían una razón de probabilidades "suave" (véase a continuación) entre las muestras de entrenamiento activo y pasivo de más de 2 o menos de 0,5 para genes diana regulados negativamente se seleccionaron para la "lista corta de 20 genes diana". Los genes diana que se encontró que tenían una razón de probabilidades "suave" de más de 10 o menos de 0,1 se seleccionan para la "lista corta de 12 genes diana" (véase la Tabla 3). La "lista corta de 7 genes diana" (véase la Tabla 4) consiste en genes diana que se encontró que tenían una razón de probabilidades "suave" de más de 15 o menos de 1/15. La lista corta de 20 genes diana, la lista de 12 genes diana y la lista de 7 genes diana se muestran en las Tablas 5 a 7, respectivamente.

Tabla 1: "Lista curada por evidencia de genes diana" de la ruta de señalización celular de TGF-p usada en los modelos de ruta de señalización celular de TGF-p y conjuntos de sondas asociadas usados para medir el nivel de x r i n ÁRNm l n i n .

continuación

Tabla 2: "Lista corta de 20 genes diana" de genes diana de TGF-p basada en la lista curada por evidencia de genes diana de TGF- .

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Tabla 3: "Lista corta de 12 genes diana" de genes diana de TGF-p basada en la lista curada por evidencia de genes diana de TGF- .

Tabla 4: "Lista corta de 7 genes diana" de genes diana de TGF-p basada en la lista curada por evidencia de genes diana de TGF- .

Ejemplo 3: Entrenamiento y uso del modelo matemático

Antes de que el modelo matemático pueda usarse para inferir la actividad de la ruta de señalización celular, en el presente documento, la ruta de señalización celular TGF-p, en un sujeto, el modelo debe estar apropiadamente entrenado.

Si el modelo de ruta matemática es un modelo probabilístico, por ejemplo, un modelo de red bayesiana, basado en probabilidades condicionales que relacionan el nivel de actividad del elemento TF TGF-p y los niveles de expresión de tres o más genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p medidos en la muestra del sujeto, el entrenamiento puede realizarse preferentemente como se describe en detalle en la solicitud de patente internacional publicada WO 2013/011479 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression").

Si el modelo de ruta matemática se basa en una o más combinación o combinaciones lineales de niveles de expresión de tres o más genes diana de la ruta de señalización celular TGF-p medida en la muestra del sujeto, el entrenamiento puede realizarse preferentemente como se describe en detalle en la solicitud de patente internacional publicada WO 2014/102668 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s) of target gene expressions").

En el presente documento, se usó un modelo de red bayesiana a modo de ejemplo como se muestra en la Figura 2 para modelar el programa transcripcional de la ruta de señalización celular de TGF-p de una manera sencilla. El modelo consiste en tres tipos de nodos: (a) un elemento de factor de transcripción (TF) (con estados "ausente" y "presente") en una primera capa 1; (b) genes diana TG¹, TG², TGⁿ(con estados "activo" e "inactivo") en una segunda capa 2, y; (c) nodos de medición vinculados a los niveles de expresión de los genes diana en una tercera capa 3. Estos pueden ser conjuntos de sondas de micromatrices PS^1,1, PS^1,2, PS^1,3, PS^2,1, PS^{n , i}, PD^n,m (con estados "bajo" y "alto"), como se usa preferentemente en el presente documento, pero también podrían ser otras medidas de expresión génica tales como RNAseq o RT-qPCR.

Una implementación adecuada del modelo matemático, en el presente documento, el modelo de red bayesiana a modo de ejemplo, se basa en datos de micromatrices. El modelo describe (i) cómo los niveles de expresión de los genes diana dependen de la activación del elemento TF y (ii) cómo las intensidades de conjuntos de sondas, a su vez, dependen de los niveles de expresión de los genes diana respectivos. Para lo último, las intensidades del conjunto de sondas pueden tomarse de micromatrices Affymetrix HG-U133Plus2.0 preprocesadas con fRMA, que están ampliamente disponibles de Gene Expression Omnibus (GEO, www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) y ArrayExpress (www. ebi.ac.uk/arrayexpress).

Como el modelo de red bayesiana a modo de ejemplo es una simplificación de la biología de una ruta de señalización celular, en el presente documento, la ruta de señalización celular de TGF-p, y como las mediciones biológicas son normalmente ruidosas, se optó por un enfoque probabilístico, es decir, las relaciones entre (i) el elemento TF y los genes diana, y (ii) los genes diana y sus respectivos conjuntos de sondas, se describen en términos probabilísticos. Adicionalmente, se asumió que la actividad de la ruta de señalización celular oncogénica que impulsa el crecimiento tumoral no se altera de forma transitoria y dinámica, sino a largo plazo o incluso se altera irreversiblemente. Por lo tanto, se desarrolló el modelo de red bayesiana a modo de ejemplo para la interpretación de una condición celular estática. Por esta razón, las características complejas de la ruta de señalización celular dinámica no se incorporaron al modelo.

Una vez que se construye y se calibra el modelo de red bayesiana a modo de ejemplo (véase a continuación), el modelo puede usarse en datos de micromatrices de una nueva muestra introduciendo las mediciones del conjunto de sondas como observaciones en la tercera capa 3, e infiriendo hacia atrás en el modelo cuál debe haber sido la probabilidad de que el elemento TF esté "presente". En este caso, se considera "presente" el fenómeno de que el elemento TF esté unido al ADN y esté controlando la transcripción de los genes diana de la ruta de señalización celular, y "ausente" el caso de que el elemento TF no esté controlando la transcripción. Esta probabilidad es, por tanto, la lectura principal que puede usarse para indicar la actividad de la ruta de señalización celular, en el presente documento, la ruta de señalización celular TGF-p, que a continuación puede traducirse en las probabilidades de que la ruta de señalización celular esté activa tomando la relación entre la probabilidad de que esté activa frente a la de estar pasiva (es decir, las probabilidades están dadas por p/(1 -p), donde p es la probabilidad predicha de que la ruta de señalización celular esté activa).

En el modelo de red bayesiana a modo de ejemplo, las relaciones probabilísticas se han hecho cuantitativas para permitir un razonamiento probabilístico cuantitativo. Para mejorar el comportamiento de generalización entre tipos de tejidos, los parámetros que describen las relaciones probabilísticas entre (i) el elemento TF y los genes diana han sido cuidadosamente seleccionados. Si el elemento TF está "ausente", lo más probable es que el gen diana esté "inactivo", por tanto, se elige una probabilidad de 0,95 para esto, y se elige una probabilidad de 0,05 para que el gen diana esté "activo". La última probabilidad (distinta de cero) es para dar cuenta de la posibilidad (rara) de que el gen diana esté regulado por otros factores o de que se observe accidentalmente como "activo" (por ejemplo, debido al ruido de medición). Si el elemento TF está "presente", entonces con una probabilidad de 0,70, el gen diana se considera "activo", y con una probabilidad de 0,30 el gen diana se considera "inactivo". Los últimos valores se eligen de esta manera, debido a que puede haber varias causas por las que un gen diana no se expresa en gran medida aunque el elemento TF esté presente, por ejemplo, porque la región promotora del gen está metilada. En el caso de que un gen diana no esté regulado positivamente por el elemento TF, sino regulado negativamente, las probabilidades se eligen de manera similar, pero reflejando la regulación negativa en presencia del elemento TF. Los parámetros que describen las relaciones entre (ii) los genes diana y sus respectivos conjuntos de sondas se han calibrado con datos experimentales. Para lo último, en este ejemplo, se usaron datos de micromatrices de muestras de pacientes que se sabe que tienen una ruta de señalización celular de TGF-p activa mientras que se usaron muestras normales, sanas del mismo conjunto de datos como muestras de la ruta de señalización celular de TGF-p pasiva, pero esto también podría realizarse usando experimentos de líneas celulares u otras muestras de pacientes con un estado conocido de actividad de la ruta de señalización celular. Las tablas de probabilidad condicional resultantes vienen dadas por: A: para genes diana regulados positivamente

B: para genes diana regulados negativamente

En estas tablas, las variables ALy, AHy, PLy y PHy indican el número de muestras de calibración con un complejo de transcripción "ausente" (A) o "presente" (P) que tienen una intensidad del conjunto de sondas "baja" (L) o "alta" (H), respectivamente. Se han añadido recuentos ficticios para evitar probabilidades extremas de 0 y 1.

Para discretizar las intensidades del conjunto de sondas observadas, para cada conjunto de sondas Psy se usó un umbral t¡j, por debajo del cual la observación se denomina "baja" y por encima del cual se denomina "alta". Este umbral se ha elegido para que sea la intensidad media (ponderada) del conjunto de sondas en el conjunto de datos de calibración usado. Debido al ruido de los datos de micromatrices, se usó un método difuso al comparar la intensidad de un conjunto de sonda observado con su umbral, asumiendo una distribución normal con una desviación estándar de 0,25 (en una escala Iog2) alrededor de la intensidad informada, y determinando la masa de probabilidad por debajo y por encima del umbral.

Si en lugar de la red bayesiana a modo de ejemplo descrita anteriormente, se empleó un modelo (pseudo-)lineal como se describe en el Ejemplo 1 anterior, los pesos que indican el signo y la magnitud de la correlación entre los nodos y un umbral para indicar si un nodo está "ausente" o "presente" deberían determinarse antes de que el modelo pueda usarse para inferir la actividad de la ruta de señalización celular en una muestra de prueba. Podría usarse el conocimiento experto para completar los pesos y el umbral a priori, pero normalmente el modelo se entrenaría usando un conjunto representativo de muestras de entrenamiento, de los cuales preferentemente se conoce la verdad fundamental, por ejemplo, datos de expresión de conjuntos de sondas en muestras con un complejo de factor de transcripción "presente" conocido (= ruta de señalización celular activa) o complejo de factor de transcripción "ausente" (= ruta de señalización celular pasiva).

Se conoce en el campo una multitud de algoritmos de entrenamiento (por ejemplo, regresión) que toman en cuenta la topología del modelo y cambian los parámetros del modelo, en este caso, los pesos y el umbral, de tal manera que la salida del modelo, en este caso, una puntuación lineal ponderada, se optimiza. Como alternativa, también es posible calcular los pesos directamente a partir de los niveles de expresión observados sin la necesidad de un algoritmo de optimización.

Un primer método, denominado método "blanco y negro" en el presente documento, se reduce a un sistema ternario, en el cual cada peso es un elemento del conjunto {-1, 0, 1}. Si esto se pone en un contexto biológico, el -1 y el 1 corresponden a genes diana o conjuntos de sondas que están regulados negativa y positivamente en caso de actividad de la vía ruta de señalización celular, respectivamente. En caso de que no se pueda demostrar estadísticamente que un conjunto de sondas o un gen diana esté regulado positiva o negativamente, recibe un peso de 0. En un ejemplo, puede usarse una prueba t de dos muestras de lado izquierdo y de lado derecho de los niveles de expresión de la ruta de señalización celular activa frente a los niveles de expresión de las muestras con una ruta de señalización celular pasiva para determinar si una sonda o gen está regulado positiva o negativamente dados los datos de entrenamiento usados. En los casos en los cuales el promedio de las muestras activas sea estadísticamente mayor que las muestras pasivas, es decir, el valor p está por debajo de un cierto umbral, por ejemplo, 0,3, se determina que el gen o conjunto de sondas diana está regulado positivamente. A la inversa, en los casos en los cuales el promedio de las muestras activas sea estadísticamente menor que las muestras pasivas, se determina que el gen o conjunto de sondas diana está regulado negativamente tras la activación de la ruta de señalización celular. En caso de que el valor p más bajo (del lado izquierdo o derecho) exceda el umbral mencionado anteriormente, el peso del gen diana o el conjunto de sondas puede definirse que es 0.

Un segundo método, denominado "probabilidades de registro" - pesos en el presente documento, se basa en el logaritmo (por ejemplo, en base e) de la razón de posibilidades. La razón de probabilidades para cada gen diana o conjunto de sondas se calcula basándose en el número de muestras de entrenamiento positivas y negativas para las que el nivel del conjunto de sondas/gen objetivo está por encima y por debajo del umbral correspondiente, por ejemplo, la mediana (ponderada) de todas las muestras de entrenamiento. Puede añadirse un pseudo recuento para eludir las divisiones entre cero. Otro refinamiento es contar las muestras por encima o por debajo del umbral de una manera algo más probabilística, asumiendo que los niveles de conjuntos de sondas/genes diana están, por ejemplo, distribuidos normalmente alrededor de su valor observado con una cierta desviación estándar especificada (por ejemplo, 0,25 en una escala de 2-log) y contando la masa de probabilidad por encima y por debajo del umbral. En el presente documento, una razón de probabilidades calculada en combinación con un pseudo-recuento y usando masas de probabilidad en lugar de valores de medición deterministas se denomina razón de probabilidades "suave".

Pueden encontrarse detalles adicionales sobre la inferencia de la actividad de la ruta de señalización celular usando modelos matemáticos de la expresión de genes diana en Verhaegh W. et al., "Selection of personalized patient therapy through the use of knowledge-based computational models that identify tumor-driving signal transduction pathways", Cancer Research, Vol. 74, N.° 11, 2014, páginas 2936 a 2945.

En el presente documento, los datos de expresión de muestras de líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón humano A549 que se trataron con TGF-p 5 ng/ml, dando como resultado una actividad promotora de tumores de la ruta de señalización celular de TGF-p (de ahora en adelante denominada TGF-p activo) y un experimento control sin estimulación de TGF-p, dando como resultado una actividad supresora de tumores de la ruta de señalización celular de TGF-p (de ahora en adelante denominada TGF-p pasivo), se usó para la calibración. Estas micromatrices están disponibles públicamente bajo GSE17708 del ómnibus de expresión génica (GEO, www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, última consulta el miércoles, 5 de marzo de 2014). Las muestras estimuladas con TGF-p 5 ng/ml durante 4 horas se eligieron como representantes de las líneas celulares TGF-p activas o promotoras de tumores en función del cambio de veces observado de los genes seleccionados (Tabla 1) en comparación con las muestras no estimuladas que se eligieron como las muestras de TGF-p pasivo o supresor de tumores para el entrenamiento. Como alternativa, pueden usarse muestras de pacientes de células primarias u otras líneas celulares estimuladas y privadas de TGF-p, por ejemplo, GSE6653, GSE42373 y GSE18670.

Las Figuras 9 a 12 muestran resultados de entrenamiento del modelo de red bayesiana a modo de ejemplo basado en la lista de genes diana curada por evidencia, la lista corta de 20 genes diana, la lista corta de 12 genes diana y la lista corta de 7 genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p (véanse las Tablas 1 a 4), respectivamente. En los diagramas, el eje vertical indica las probabilidades de que el elemento TF esté "presente" respecto a "ausente", que corresponde a que la ruta de señalización celular de TGF-p esté activa respecto a pasiva, donde los valores por encima del eje horizontal corresponden a que el elemento TF es más probable que esté "presente"/activo y los valores por debajo del eje horizontal indican que las probabilidades de que el elemento TF esté "ausente"/pasivo son mayores que las probabilidades de que esté "presente"/activo. Las muestras de la línea celular A549 que fueron estimuladas con TGF-p durante 4 horas (grupo 5) se usaron para representar las muestras de entrenamiento activas o que promueven el tumor, mientras que las muestras no estimuladas (grupo 1) se utilizaron como una representación de la ruta de señalización celular de TGF-p pasiva o supresora de tumores. Los modelos que usan las diferentes listas de genes diana pudieron separar claramente las muestras de entrenamiento pasivas de las activas. Además, puede apreciarse a partir de los resultados que toda estimulación de 1 hora o más dio como resultado que la ruta de señalización celular de TGF-p tenga actividades de promoción de tumores para las cuatro listas de genes diana. La estimulación de 0,5 h con TGF-p dio como resultado actividades de TGF-p que varían de TGF-p pasivo a activo, que probablemente está provocado por la estimulación de TGF-p relativamente corta.

En lo sucesivo, los resultados de validación del modelo de red bayesiana a modo de ejemplo entrenado usando la lista de genes diana curada por evidencia, la lista corta de 20 genes diana, la lista corta de 12 genes diana y la lista corta de 7 genes diana, respectivamente, se muestran en las Figuras 13 a 23.

Las Figuras 13 a 16 muestran las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular TGF-p de los modelos de redes bayesianas a modo de ejemplo entrenados usando la lista curada por evidencia de genes diana, la lista corta de 20 genes diana, la lista corta de 12 genes diana y la lista corta de 7 genes diana (véanse las Tablas 1 a 4), respectivamente, para células epiteliales mamarias humanas (HMEC-TR) de GSE28448. En los diagramas, el eje vertical indica las probabilidades de que el elemento TF esté "presente" respecto a "ausente", que corresponde a que la ruta de señalización celular de TGF-p esté activa respecto a pasiva, donde los valores por encima del eje horizontal corresponden a que el elemento TF es más probable que esté "presente"/activo y los valores por debajo del eje horizontal indican que las probabilidades de que el elemento Tf esté "ausente"/pasivo son mayores que las probabilidades de que esté "presente"/activo. Cada barra representa una muestra del conjunto de datos. Algunas de las muestras se transfectaron con ARNip para TIFy (grupos 5 y 6) o SMAD4 (grupos 3 y 4) y otro conjunto de muestras consistió en controles (sin transfección, grupos 1 y 2). Las muestras de los grupos 2, 4 y 6 se estimularon con 5 ng/ml de TGF-p y las de los grupos 1, 3 y 5 no se estimularon. Los modelos que usan las diferentes listas de genes diana predichos correctamente para los cuatro genes diana enumeran un aumento de la actividad de TGF-p en las muestras estimuladas con TGF-p en los grupos 2 (controles) y 6 (silenciado con TIFy) y ningún aumento significativo en las muestras silenciadas con SMAD (grupo 4) en comparación con las muestras no estimuladas correspondientes (véase Hesling C. et al., "Antagonistic regulation of EMT by TIF1y and SMAD4 in mammary epithelial cells", EMBO Reports, Vol. 12, N.° 7, 2011, páginas 665 a 672).

La Figura 17 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana a modo de ejemplo entrenado usando la lista curada por evidencia de genes diana (véase la Tabla 1) para células epiteliales ectocervicales (Ect1) de GSE35830, que se estimularon con plasma seminal o 5 ng/ml de TGF-p3. En el diagrama, el eje vertical indica las probabilidades de que el elemento TF esté "presente" respecto a "ausente", que corresponde a que la ruta de señalización celular de TGF-p esté activa respecto a pasiva, donde los valores por encima del eje horizontal corresponden a que el elemento TF es más probable que esté "presente"/activo y los valores por debajo del eje horizontal indican que las probabilidades de que el elemento TF esté "ausente"/pasivo son mayores que las probabilidades de que esté "presente"/activo. Cada barra representa una muestra del conjunto de datos. El plasma seminal también contiene altos niveles de TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3. Sin embargo, están predominantemente (entre el 95 % y el 99 %) presentes en la variante latente, en contraposición a la forma activa (véase Sharkey D. J. et al., "TGF-beta mediates proinflammatory seminal fluid signaling in human cervical epithelial cells", Journal of Immunology, Vol. 189, N.° 2, 2012, páginas 1024 a 1035). La tercera y la cuarta, es decir, dos de las cuatro, muestras estimuladas con TGF-p3 (grupo 3) muestran una fuerte preferencia por la actividad de TGF-p promotora de tumores, las otras dos muestras, es decir, la primera y la segunda muestras, se encontraron ser más similares a la tercera y cuarta muestra del grupo de líquido seminal (grupo 2) con análisis de aglomerados. Las muestras no estimuladas (grupo 1) predicen correctamente una actividad de TGF-p pasiva o supresora de tumores, mientras que se predijo que las muestras estimuladas con plasma seminal tenían una actividad de TGF-p intermedia que puede estar provocada por la alta fracción de isoformas de TGF-p latentes (es decir, pasivas) y, por lo tanto, una menor estimulación de la ruta de TGF-p.

La Figura 18 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana a modo de ejemplo entrenado usando la lista curada por evidencia de genes diana (véase la Tabla 1) para gliomas de pacientes de GSE16011. En el diagrama, el eje vertical indica las probabilidades de que el elemento TF esté "presente" respecto a "ausente", que corresponde a que la ruta de señalización celular de TGF-p esté activa respecto a pasiva, donde los valores por encima del eje horizontal corresponden a que el elemento TF es más probable que esté "presente"/activo y los valores por debajo del eje horizontal indican que las probabilidades de que el elemento TF esté "ausente"/pasivo son mayores que las probabilidades de que esté "presente"/activo. Cada barra representa una muestra del conjunto de datos. Se sabe de la bibliografía que los gliomas producen más TGF-p (todas las isoformas) que las células normales (véase Kaminska B. et al., "TGF beta signaling and its role in glioma pathogenesis", Advances in Experimental Medicine and Biology, Vol. 986, 2013, páginas 171 a 187). Esto también es visible en las actividades de TGF-p predichas que son negativas para todos los controles (grupo 3), sin embargo, en aproximadamente el 15 % de los gliomas (grupos 1, 2, 4-9) se predijo un TGF-p que promueve tumores debido a al aumento de la secreción de TGF-p en estos tumores.

La Figura 19 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana a modo de ejemplo entrenado usando la lista curada por evidencia de genes diana (véase la Tabla 1) para muestras de cáncer de mama de GSE21653. En el diagrama, el eje vertical indica las probabilidades de que el elemento TF esté "presente" respecto a "ausente", que corresponde a que la ruta de señalización celular de TGF-p esté activa respecto a pasiva, donde los valores por encima del eje horizontal corresponden a que el elemento TF es más probable que esté "presente"/activo y los valores por debajo del eje horizontal indican que las probabilidades de que el elemento TF esté "ausente"/pasivo son mayores que las probabilidades de que esté "presente"/activo. Cada barra representa una muestra del conjunto de datos. Como cabía esperar, se predijo que la mayoría de los cánceres de mama tenía una ruta de señalización celular de TGF-p pasiva. También en línea con las expectativas, la fracción más alta de actividad de TGF-p activa o promotora de tumores de TGF-p se encontró en las muestras basales.

Las Figuras 20 a 23 muestran las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular TGF-p de los modelos de redes bayesianas a modo de ejemplo entrenados usando la lista curada por evidencia de genes diana, la lista corta de 20 genes diana, la lista corta de 12 genes diana y la lista corta de 7 genes diana (véanse las Tablas 1 a 4), respectivamente, para cultivos 2D y 3D de líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón A549 de GSE42373, que se estimularon con o sin TNF 10 ng/ml y TGF-p 2 ng/ml. En el diagrama, el eje vertical indica las probabilidades de que el elemento TF esté "presente" respecto a "ausente", que corresponde a que la ruta de señalización celular de TGF-p esté activa respecto a pasiva, donde los valores por encima del eje horizontal corresponden a que el elemento TF es más probable que esté "presente"/activo y los valores por debajo del eje horizontal indican que las probabilidades de que el elemento TF esté "ausente"/pasivo son mayores que las probabilidades de que esté "presente"/activo. Cada barra representa una muestra del conjunto de datos. Cieslik et al., "Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition", Epigenetics & Chromatin, Vol. 6, N.° 1,2013, demostraron que en estos experimentos la transición epitelio-mesenquimal (EMT) se induce de manera eficiente en el modelo de cultivo 3D. Esto también se demuestra en las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p ya que ambas muestras de este grupo (grupo 4) son las únicas muestras predichas con un tumor que promueve la actividad de TGF-p que se sabe que provoca la EMT. Se predijo correctamente que el grupo control del cultivo 2D sin estimulación (grupo 1) no tenía actividad de TGF-p, mientras que el cultivo 2D estimulado_ (grupo 2) evidentemente no fue capaz de iniciar la actividad promotora de tumores TGF-p (no EMT), que también fue descubierto por Cieslik et al. También se predice que las muestras de cultivo 3D no estimuladas (grupo 3) tendrán una actividad TGF-p pasiva, aunque las probabilidades son muy pequeñas.

La Figura 24 ilustra la supervivencia global de 284 pacientes con glioma (GSE16011; véase también la Figura 18) representada en un diagrama de Kaplan-Meier. En el diagrama, el eje vertical indica la supervivencia global como una fracción del grupo de pacientes y el eje horizontal indica el tiempo en años. El gráfico indica que una ruta de señalización celular de TGF-p supresora de tumores (TGF-p pasivo, línea de puntos) protege la supervivencia general, mientras que tener una ruta de TGF-p promotora de tumores se asocia a un riesgo de muerte significativamente mayor (indicado por la pendiente más pronunciada de la curva). (El grupo de pacientes con un elemento de TF TGF-p activo predicho consistió en 37 pacientes (línea continua), mientras que el grupo de pacientes con un elemento de TF TGF-p pasivo predicho consistió en 235 pacientes (línea de puntos)). El valor pronóstico del nivel de actividad del elemento t F TGF-p también se demuestra en el cociente de riesgo de la probabilidad predicha de actividad de TGF-p: 2,17 (95 % Cl: 1,44 - 3,28, p = 1,22e-4) y la mediana de supervivencia que es de 0,7 años para los pacientes activos con TGF-p promotor de tumores frente a 1,34 años para los pacientes con TGF-p supresor de tumores.

La Figura 25 ilustra la supervivencia libre de enfermedad de una cohorte de 1169 pacientes con cáncer de mama (GSE6532, GSE9195, E-MtAB-365, GSE20685 y GSE21653; véase también la Figura 13 anterior) representada en un diagrama de Kaplan-Meier. En el diagrama, el eje vertical indica la supervivencia libre de enfermedad como una fracción del grupo de pacientes y el eje horizontal indica el tiempo en meses. El gráfico indica que una ruta de señalización celular de TGF-p supresora de tumores (TGF-p pasivo, línea de puntos) protege la supervivencia libre de enfermedad, mientras que tener una ruta de TGF-p promotora de tumores se asocia a un riesgo de recurrencia de la enfermedad significativamente mayor (indicado por la pendiente más pronunciada de la curva). (El grupo de pacientes con un elemento de TF TGF-p activo predicho consistió en 103 pacientes (línea continua), mientras que el grupo de pacientes con un elemento de TF TGF-p pasivo predicho consistió en 1066 pacientes (línea de puntos)). El valor pronóstico del nivel de actividad del elemento TF TGF-p también se demuestra en el cociente de riesgo de la probabilidad predicha de actividad de TGF-p: 3,66 (95 % Cl: 2,37 - 5,33, p = 4,0e-10) y el 75 % de supervivencia que es de 2,3 años para los pacientes activos con TGF-p promotor de tumores frente a 6,4 años para los pacientes con TGF-p supresor de tumores.

En lugar de aplicar el modelo matemático calibrado, por ejemplo, el modelo de red bayesiana a modo de ejemplo, en datos de entrada de ARNm provenientes de micromatrices o secuenciación de ARN, puede ser beneficioso en aplicaciones clínicas desarrollar ensayos específicos para realizar las mediciones de la muestra, por ejemplo, en una plataforma integrada que usa qPCR para determinar los niveles de ARNm de genes diana. Las secuencias de ARN/ADN de los genes diana desvelados pueden usarse después para determinar qué cebadores y sondas seleccionar en dicha plataforma.

La validación de dicho ensayo dedicado puede realizarse usando el modelo matemático basado en micromatrices como modelo de referencia y verificando si el ensayo desarrollado da resultados similares en un conjunto de muestras de validación. Junto a un ensayo dedicado, esto también puede realizarse para construir y calibrar modelos matemáticos similares usando datos de secuenciación de ARN como medidas de entrada.

El conjunto de genes diana que mejor indican la actividad de la ruta de señalización celular específica, por ejemplo, las Tablas 1 a 4, 6, 8 y 9, basado en una investigación basada en secuenciación de micromatrices/ARN usando el modelo matemático calibrado, por ejemplo, el modelo de red bayesiana a modo de ejemplo, puede traducirse en un ensayo de PCR cuantitativa múltiplex para realizar en una muestra del sujeto y/o un ordenador para interpretar las medidas de expresión y/o inferir la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p. Para desarrollar una prueba de este tipo (por ejemplo, una prueba aprobada por la FDA o una prueba exenta de CLIA en un laboratorio de servicio central o una prueba desarrollada en un laboratorio para uso exclusivo en investigación) para la actividad de la ruta de señalización celular, se requiere el desarrollo de un kit de prueba normalizado, que debe validarse clínicamente en ensayos clínicos para obtener la aprobación regulatoria.

La presente invención se refiere a un método implementado por ordenador para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto realizado por un dispositivo de procesamiento digital, en donde la inferencia se basa en los niveles de expresión de tres o más genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p medidos en una muestra del sujeto. La presente invención se refiere además a un aparato para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto que comprende un procesador digital configurado para realizar el método, a un medio de almacenamiento no transitorio para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto que almacena instrucciones que son ejecutables por un dispositivo de procesamiento digital para realizar el método, y a un programa informático para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto que comprende medios de código de programa para hacer que un dispositivo de procesamiento digital realice el método, cuando el programa informático se ejecuta en el dispositivo de procesamiento digital.

El método puede usarse, por ejemplo, en el diagnóstico de una actividad (anormal) de la ruta de señalización celular de TGF-p, en el pronóstico basado en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p, en la inscripción de un sujeto en un ensayo clínico basado en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p, en la selección de la prueba o pruebas posteriores que se realizarán, en la selección de pruebas de diagnóstico complementarias, en sistemas de apoyo a la toma de decisiones clínicas, o similares. A este respecto, se hace referencia a la solicitud de patente internacional publicada WO 2013/011479 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression"), a la solicitud de patente internacional publicada WO 2014/102668 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s) of target gene expressions") y a Verhaegh W. et al., "Selection of personalized patient therapy through the use of knowledgebased computational models that identify tumor-driving signal transduction pathways", Cancer Research, Vol. 74, N.° 11, 2014, páginas 2936 a 2945, que describen estas aplicaciones con más detalle.

Ejemplo 4: Comparación de la lista curada de evidencias con una amplia lista de bibliografía

La lista de genes diana de TGF-p construida basándose en la evidencia de la bibliografía siguiendo el procedimiento como se describe en el presente documento ("lista curada por evidencia de genes diana", véase la Tabla 1) se compara aquí con una "amplia lista de literatura" de genes diana de TGF-p putativos construidos sin seguir el procedimiento mencionado anteriormente. La lista alternativa es una compilación de genes atribuidos a responder a la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p proporcionada dentro del Metacore de Thomson-Reuters (consultado por última vez el 14 de mayo de 2013). Esta base de datos fue consultada para genes que están transcripcionalmente regulados directamente en dirección 3' de la familia de proteínas SMAD, es decir, SMAD1, SMAD2, SmAd 3, SMAD4, SMAD5 y/o SMAD8. Esta consulta dio como resultado 217 genes únicos. Se realizó una selección adicional basada en el número de referencias de publicación que apoyan la regulación transcripcional atribuida del gen respectivo por la familia SMAD. Los genes que tenían tres o más referencias se seleccionaron para la amplia lista de bibliografía. En otras palabras, no se realizó la curación manual de las referencias ni el cálculo de una puntuación de evidencia basada en la evidencia experimental. Este procedimiento dio como resultado 61 genes, de los cuales un micro-ARN (MIR29B2) no disponible en la plataforma de micromatrices Affymetrix HG-U133Plus2.0 y un gen (BGLAP) no se encontró que tuviera un conjunto de sondas disponible en la plataforma de micromatrices Affymetrix HG-U133Plus2.0 según el complemento Bioconductor de R. Finalmente, esto da lugar a 59 genes diana de TGF-p putativos que se muestran en la Tabla 5 con los conjuntos de sondas asociados en la plataforma de micromatrices Affymetrix HG-U133Plus2.0.

Tabla 5: "Lista de bibliografía amplia" de genes diana de TGF-p putativos usados en los modelos de rutas de señalización celular de TGF-p y conjuntos de sondas asociadas usados para medir el nivel de expresión de ARNm l n .

continuación

Posteriormente se construyó un modelo de red bayesiana a modo de ejemplo usando el procedimiento que se explica en el presente documento. De manera similar a la descripción del modelo de la ruta de señalización celular de TGF-p basada en la lista curada de evidencia, las tablas de probabilidad condicional de los bordes entre conjuntos de sondas y sus respectivos genes diana de TGF-p putativos de este modelo, incluida la amplia lista de bibliografía, se entrenaron usando datos procesados con fRMA de GSE17708. Los resultados del entrenamiento que se muestran en la Figura 26 muestran una clara separación entre las muestras de entrenamiento pasivo (grupo 1) y activo (grupo 5). Se encuentran valores más extremos de actividad de la ruta, especialmente en el grupo 2 y 3, en comparación con los resultados de entrenamiento del modelo bayesiano basado en las listas de evidencias curadas (véanse las Figuras 9 a 12). En el diagrama, el eje vertical indica las probabilidades de que el elemento TF esté "presente" respecto a "ausente", que corresponde a que la ruta de señalización celular de TGF-p esté activa respecto a pasiva, donde los valores por encima del eje horizontal corresponden a que el elemento TF es más probable que esté "presente"/activo y los valores por debajo del eje horizontal indican que las probabilidades de que el elemento TF esté "ausente"/pasivo son mayores que las probabilidades de que esté "presente"/activo. Cada barra representa una muestra del conjunto de datos.

A continuación, se probó el modelo de red bayesiana a modo de ejemplo entrenado basado en la amplia lista de bibliografía en una serie de conjuntos de datos.

La Figura 27 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana entrenado basado en una amplia lista de bibliografía para gliomas de pacientes de GSE16011. En el diagrama, el eje vertical indica las probabilidades de que el elemento TF esté "presente" respecto a "ausente", que corresponde a que la ruta de señalización celular de TGF-p esté activa respecto a pasiva, donde los valores por encima del eje horizontal corresponden a que el elemento TF es más probable que esté "presente"/activo y los valores por debajo del eje horizontal indican que las probabilidades de que el elemento TF esté "ausente"/pasivo son mayores que las probabilidades de que esté "presente"/activo. Cada barra representa una muestra del conjunto de datos. Aunque se sabe de la bibliografía que los gliomas producen más TGF-p (todas las isoformas) que las células normales (véase Kaminska B. et al., "TGF beta signaling and its role in glioma pathogenesis", Advances in Experimental Medicine and Biology, Vol. 986, 2013, páginas 171 a 187), la gran fracción (> 50 %) de los pacientes con glioblastoma multiforme (grado IV) (grupo 4) es aparentemente una sobreestimación del número de tumores con una ruta de señalización celular de TGF-p activa. Por otro lado, se predice correctamente que la actividad TGF-p promotora de tumores de todos los controles (grupo 3) sea negativa.

La Figura 28 muestra las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p del modelo de red bayesiana entrenado basado en una amplia lista de bibliografía para muestras de cáncer de mama de GSE21653. En el diagrama, el eje vertical indica las probabilidades de que el elemento TF esté "presente" respecto a "ausente", que corresponde a que la ruta de señalización celular de TGF-p esté activa respecto a pasiva, donde los valores por encima del eje horizontal corresponden a que el elemento TF es más probable que esté "presente"/activo y los valores por debajo del eje horizontal indican que las probabilidades de que el elemento TF esté "ausente"/pasivo son mayores que las probabilidades de que esté "presente"/activo. Cada barra representaba una muestra del conjunto de datos. Inesperadamente, se predijo que la mayoría de las muestras de cáncer de mama tenía una ruta de señalización celular de TGF-p promotora de tumores. Además, la fracción más alta de muestras de pacientes con actividad de TGF-p promotora de tumores se encuentra en el subtipo luminal A. Se sabe que el luminal A tiene el mejor pronóstico entre los diferentes subtipos de cáncer de mama, lo que no se corresponde con la agresividad de la actividad TGF-p promotora de tumores.

Ejemplo 5: Selección de SERPINE1 como gen diana de TGF-p genuino

En enero de 2015 se realizó una revisión de la evidencia de la bibliografía disponible para la ruta de señalización celular de TGF-p, incluyendo también todos los artículos científicos nuevos hasta el 19 de enero de 2015. De forma similar, las publicaciones se encontraron utilizando la base de datos MEDLINE del National Institute of Health accesible en "www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed" usando consultas tales como ("TGF-p" Y "gen diana"). Después de evaluar manualmente los artículos científicos en busca de evidencia experimental de que varios genes diana son genes diana putativos de la ruta de señalización celular de TGF-p usando la metodología descrita en el Ejemplo 2 anterior, se encontraron varios genes diana de TGF-p putativos, sin aprovechar en la evaluación inicial durante el cuarto trimestre de 2013 y el primer trimestre de 2014. Se reevaluó toda la evidencia experimental disponible y se preparó una nueva clasificación de genes diana putativos basándose en la solidez de la evidencia experimental disponible para cada gen diana putativo usando la metodología descrita en el Ejemplo 2. Esto dio como resultado un gen diana de TGF-p putativo adicional, en concreto, SERPINE1, que logró una puntuación de evidencia experimental por encima del umbral establecido. Por consiguiente, se consideró que SERPINE1 era un gen diana directo genuino de la ruta de señalización celular de TGF-p y se probó para determinar una inferencia mejorada de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p.

Usando dos redes bayesianas basadas en los 11 genes diana mejor clasificados ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, JUNB, SKIL, SMAD7, SNAI2 y VEGFA más o menos el SERPINE1 recién seleccionado entrenado usando los mismos datos y metodología que se describen en el Ejemplo 3 anterior, dando como resultado un modelo de "lista de 11 genes diana SERPINE1" (véase la Tabla 6) y un modelo de "lista de 11 genes diana" (véase la Tabla 7), respectivamente.

Tabla 6: "Lista de 11 genes diana SERPINE1" (o "lista breve de 12 genes diana revisados") de genes diana de

T l 7: "Li 11 n i n" n i n T F- .

Basado en la inclusión adicional del gen SERPINE1, las listas de genes diana (véanse las Tablas 2 y 4) pueden revisarse en realizaciones adicionales no limitantes, como se describe en las Tablas 8 y 9.

T l : "Li r 2 n i n r vi " n i n T F-p.

Ta l : "Li r 7 n i n r vi " n i n T F-p.

Se espera que la inclusión de un gen diana más en la inferencia matemática de los niveles de actividad de la ruta tenga un pequeño efecto en las predicciones de los niveles de actividad de la ruta, que se prevé escalará minuciosamente el nivel de actividad de la ruta. Sin embargo, se determina que, además de este efecto anticipado, también hay niveles de actividad de la ruta marcadamente diferentes en diversos ejemplos que solo pueden explicarse por el hecho de que SERPINE1 tiene un efecto inesperado, ventajoso sobre la inferencia de la actividad de la ruta.

Las Figuras 29 y 30 muestran las predicciones de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p usando ambos modelos en líneas celulares Ect1 estimuladas con plasma seminal o TGF-p3 5 ng/ml o sin estimulación de GSE35830. Es claramente visible que incluir SERPINE1 como un gen diana adicional mejora la capacidad del modelo para detectar muestras pasivas con mayor precisión. Adicionalmente, las predicciones del modelo del segundo grupo estimulado con plasma seminal y del tercer grupo estimulado con TGF-p3 son más precisas ya que predicen una mayor actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p.

Un segundo ejemplo de predicciones mejoradas de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p se encuentra en muestras de la línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549 cultivadas en cultivos 2D y 3D estimulados con o sin TNF y TGF-p. Las predicciones del modelo que usa tanto el modelo de red bayesiana de "lista de 11 genes diana" como el modelo de red bayesiana de "11 genes diana SERPINE1" se muestran en las Figuras 31 y 32. La EMT solo se indujo de manera eficiente en el modelo de cultivo 3D con estimulación (grupo 4). Esta inducción de EMT se diagnostica con mayor precisión en el modelo de "lista de 11 genes diana SERPINE1" en comparación con el modelo de "lista de 11 genes diana", también en caso de que se considere la diferencia relativa entre los grupos 3 y 4.

Un tercer ejemplo son las predicciones de la actividad de ruta de señalización celular de TGF-p usando ambos modelos en pacientes con glioma y algunas muestras de control de GSE16011. Se sabe por la bibliografía que la señalización de TGF-p juega un papel importante en los gliomas (véase B.Kaminska et al., "TGF beta signaling and its role in glioma pathogenesis", Advances in Experimental Medicine and Biology, Vol. 986, 2013, páginas 171 a 187). La red bayesiana basada en la "lista de 11 genes diana SERPINE1" de genes diana de TGF-p mejora la separación de muestras pasivas de las activas en comparación con la red bayesiana de la "lista de 11 genes diana". Además, se predice que una mayor fracción de pacientes tendrá una ruta de señalización celular de TGF-p activa que está más en línea con el consenso científico (véase, por ejemplo, Kaminska et al.). Además, se predice que las muestras cerebrales normales tienen una ruta de señalización celular de TGF-p pasiva con probabilidades más altas, lo cual está de acuerdo con el hecho de que se espera que la ruta de señalización celular del TGF-p esté en su función supresora de tumores o función pasiva.

El último ejemplo que demuestra las predicciones mejoradas de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p al incluir SERPINE1 en el modelo de ruta matemática se muestra comparando los resultados del análisis de regresión de Cox de los 284 pacientes con glioma de GSE16011 usando el modelo de red bayesiana basado en la "lista 11 genes diana SERPINEÍ' de genes diana DE TGF-p y la "lista de 11 genes diana" de genes diana. Como se muestra en las Figuras 33 y 34, la tasa de riesgo de la probabilidad de actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p es significativamente mayor en caso de que se utilice la "lista de 11 genes diana SERPINE1" de genes diana de TGF-p: 2,57, p = 7,87e-10 frente a 2,33, p = 3,06e-7.

Ejemplo 6: Información adicional para ilustrar la presente invención

(1) Medir los niveles de expresión génica

Los datos derivados del conjunto único de genes diana descritos en el presente documento se usan además para inferir una actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p usando los métodos descritos en el presente documento.

Los métodos para analizar los niveles de expresión génica en muestras extraídas se conocen generalmente. Por ejemplo, los métodos tales como transferencia Northern, el uso de PCR, PCR anidada, PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), RNA-seq o micromatrices, pueden usarse todos para derivar datos del nivel de expresión génica. Todos los métodos conocidos en la técnica para analizar la expresión génica de los genes diana se contemplan en el presente documento.

Los métodos para determinar el producto de expresión de un gen usando métodos basados en PCR pueden ser de uso particular. Para cuantificar el nivel de expresión génica mediante PCR, la cantidad de cada producto de PCR de interés se estima típicamente usando PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) convencional para medir la acumulación de productos de PCR en tiempo real después de cada ciclo de amplificación. Esto normalmente utiliza un indicador detectable, tal como un tinte intercalante, un tinte de unión al surco menor o una sonda fluorogénica mediante la cual la aplicación de luz excita al indicador a emitir fluorescencia y la fluorescencia resultante se detecta típicamente usando una cámara CCD o un sistema de detección de fotomultiplicador, tales como los desvelados en la Pat. de EE.UU. N.° 6.713.297.

En algunas realizaciones, las sondas usadas en la detección de productos de PCR en el ensayo de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) pueden incluir un marcador fluorescente. Numerosos marcadores fluorescentes están disponibles en el mercado. Por ejemplo, Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oreg.) vende una amplia diversidad de tintes fluorescentes. Los ejemplos no limitantes incluyen Cy5, Cy3, TAMRA, R6G, R110, ROX, Jo E, FAM, Texas Red™ y Oregon Green™. Los marcadores fluorescentes adicionales pueden incluir sondas de doble extinción IDT ZEN con sondas de hidrólisis 5' tradicionales en ensayos de qPCR. Estas sondas pueden contener, por ejemplo, un tinte FAM de 5' con un Quencher TAMRA de 3', un extintor de agujero negro de 3' (BHQ, Biosearch Technologies) o un extintor ZEN interno y un extintor fluorescente negro de 3' lowa (IBFQ).

Los tintes fluorescentes útiles de acuerdo con la invención pueden unirse a cebadores oligonucleotídicos usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una forma común de añadir un marcador fluorescente a un oligonucleótido es hacer reaccionar un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) del tinte con un grupo amino reactivo en la diana. Los nucleótidos pueden modificarse para que porten un grupo amino reactivo mediante, por ejemplo, inclusión de un grupo alil amina en la nucleobase. Se describe el marcaje mediante alil amina, por ejemplo, en las Pat. de EE.UU. N.° 5.476.928 y 5.958.691. Otros medios de marcaje fluorescente de nucleótidos, oligonucleótidos y polinucleótidos son bien conocidos por los expertos en la materia.

Otros enfoques fluorogénicos incluyen el uso de sistemas de detección genéricos tales como el tinte SYBR-green, que emite fluorescencia cuando se intercala con el ADN amplificado de cualquier producto de expresión génica como se describe en las Pat. de EE.UU. N.° 5.436.134 y 5.658.751.

Otro método útil para determinar los niveles de expresión de genes diana incluye RNA-seq, una poderosa herramienta analítica usada para análisis de transcriptomas, incluyendo la diferencia del nivel de expresión génica entre diferentes condiciones fisiológicas o cambios que ocurren durante el desarrollo o durante el curso de la progresión de la enfermedad.

Otro enfoque para determinar los niveles de expresión génica incluye el uso de micromatrices, por ejemplo, micromatrices de ARN y ADN, que son bien conocidas en la técnica. Las micromatrices pueden usarse para cuantificar la expresión de un gran número de genes simultáneamente.

(2) Flujo de trabajo generalizado para determinar la actividad de la señalización celular TGF-p

En la Figura 3 se muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para inferir la actividad de la señalización celular de TGF-p a partir de una muestra aislada de un sujeto. En primer lugar, se aísla el ARNm de una muestra (11). Segundo, los niveles de expresión de ARNm de un conjunto único de al menos tres o más genes diana de TGF-p, como se describe en el presente documento, se miden (12) usando métodos para medir la expresión génica que se conocen en la técnica. A continuación, Se determina un nivel de actividad de un elemento (13) del factor de transcripción TGF-p (TF) usando un modelo de ruta matemático calibrado (14) que relaciona los niveles de expresión de los tres o más genes diana de TGF-p con el nivel de actividad del elemento TF de TGF-p. Finalmente, la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p en el sujeto se infiere (15) basándose en el nivel de actividad determinado del elemento TF TGF en la muestra del sujeto. Por ejemplo, Se determina que la ruta de señalización celular de TGF-p está activa si la actividad está por encima de un cierto umbral y puede clasificarse como pasiva si la actividad cae por debajo de un cierto umbral.

(3) Modelo de ruta matemática calibrada

Como se contempla en el presente documento, los niveles de expresión del conjunto único de tres o más genes diana de TGF-p descritos en el presente documento se usan para determinar un nivel de actividad de un elemento de TF de TGF-p usando un modelo de ruta matemático calibrado como se describe adicionalmente en el presente documento. El modelo de ruta matemático calibrado relaciona los niveles de expresión de los tres o más genes diana de TGF-p con el nivel de actividad del elemento TF TGF-p.

Como se contempla en el presente documento, el modelo de ruta matemática calibrada se basa en la aplicación de un modelo de ruta matemática. Por ejemplo, el modelo de ruta matemática calibrada puede basarse en un modelo probabilístico, por ejemplo, un modelo de red bayesiana o un modelo lineal o pseudo-lineal.

En una realización, el modelo de ruta matemática calibrada es un modelo probabilístico que incorpora relaciones probabilísticas condicionales que relacionan el elemento TGF-p TF y los niveles de expresión de los tres o más genes diana de TGF-p. En una realización, el modelo probabilístico es un modelo de red bayesiana.

En una realización alternativa, el modelo matemático de la ruta calibrada puede ser un modelo lineal o pseudo-lineal. En una realización, el modelo lineal o pseudo-lineal es un modelo de combinación lineal o pseudo-lineal como se describe adicionalmente en el presente documento.

En la Figura 4 se muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para generar un modelo de ruta matemático calibrado. Como una etapa inicial, se recopilan y normalizan los datos de entrenamiento para los niveles de expresión de ARNm. Los datos pueden recopilarse usando, por ejemplo, intensidades de conjuntos de sondas de micromatrices (101), valores de Cq de PCR en tiempo real (102), lecturas de RNAseq sin procesar (103) o modalidades de medición alternativas (104) conocidas en la técnica. Los datos del nivel de expresión sin procesar pueden normalizarse para cada método, respectivamente, por normalización usando un algoritmo de normalización, por ejemplo, análisis militar robusto congelado (fRMA) o MAS5.0 (111), normalización a Cq promedio de genes de referencia (112), normalización de lecturas en lecturas/fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas (RPKM/FPKM) (113) o normalización con genes/proteínas de referencia (114). Este procedimiento de normalización conduce a una intensidad de conjunto de sondas normalizada (121), valores de Cq normalizados (122), RPKM/FPKM normalizados (123) o medición normalizada (124) para cada método, respectivamente, que indican los niveles de expresión de genes diana dentro de las muestras de entrenamiento.

Una vez normalizados los datos de entrenamiento, se obtiene una ID o ID de muestra de entrenamiento (131) y los datos de entrenamiento de estas muestras específicas se obtienen de uno de los métodos para determinar la expresión génica (132). Los resultados finales de expresión génica de la muestra de entrenamiento se generan como datos de entrenamiento (133). Todos los datos de diversas muestras de entrenamiento se incorporan para calibrar el modelo (incluyendo, por ejemplo, umbrales, CPT, por ejemplo en el caso de la red probabilística o bayesiana, los pesos, por ejemplo, en el caso del modelo lineal o pseudo-lineal, etc.) (144). Además, los genes diana de la ruta y los nodos de medición (141) se usan para generar la estructura del modelo, por ejemplo, como se describe en la Figura 2 (142). La estructura del modelo resultante (143) de la ruta se incorpora luego con los datos de entrenamiento (133) para calibrar el modelo (144), en donde los niveles de expresión génica de los genes diana son indicativos de la actividad del elemento del factor de transcripción. Como resultado de la determinación del elemento TF en las muestras de entrenamiento, se genera un modelo de ruta calibrado (145), que asigna la actividad de la ruta de señalización celular TGF-p para una muestra de interés examinada posteriormente, por ejemplo de un sujeto con cáncer, basado en los niveles de expresión génica diana en las muestras de entrenamiento.

(4) Determinación del elemento TF

En la Figura 5 se muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para determinar un nivel de actividad de un elemento TF. Los datos de nivel de expresión (datos de prueba) (163) de una muestra extraída de un sujeto se introducen en el modelo de ruta matemática calibrada (145). El modelo de ruta matemática puede ser un modelo probabilístico, por ejemplo, un modelo de red bayesiana, un modelo lineal o un modelo pseudo-lineal.

El modelo de ruta matemática puede ser un modelo probabilístico, por ejemplo, un modelo de red bayesiana, basado en probabilidades condicionales que relacionan el elemento TF TGF-p y los niveles de expresión de los tres o más genes diana de la vía de señalización celular TGF-p medidos en la muestra del sujeto, o el modelo matemático puede basarse en una o más combinación o combinaciones lineales de los niveles de expresión de los tres o más genes diana de la ruta de señalización celular TGF-p medidos en la muestra del sujeto. En particular, la determinación de la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p puede realizarse como se describe en la solicitud de patente internacional publicada WO 2013/011479 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression"). En resumen, los datos se introducen en una llamada de motor de inferencia de red bayesiana (BN) (por ejemplo, una Toolbox BNT) (154). Esto conduce a un conjunto de valores para las probabilidades BN marginales calculadas de todos los nodos en el BN (155). De estas probabilidades, se determina la probabilidad del nodo del factor de transcripción (TF) (156) y se establece el nivel de actividad del elemento TF (157).

Como alternativa, el modelo matemático puede ser un modelo lineal. Por ejemplo, puede usarse un modelo lineal como se describe en la solicitud de patente internacional publicada WO 2014/102668 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination(s) of target gene expressions"). Pueden encontrarse detalles adicionales sobre el cálculo/la determinación de la actividad de la ruta de señalización celular usando modelos matemáticos de la expresión de genes diana en Verhaegh W. et al., "Selection of personalized patient therapy through the use of knowledge-based computational models that identify tumor-driving signal transduction pathways", Cancer Research, Vol. 74, N.° 11, 2014, páginas 2936 a 2945. En resumen, los datos se introducen en una puntuación combinada lineal ponderada calculada (w/c) (151). Esto conduce a un conjunto de valores para la puntuación de combinación lineal ponderada calculada (152). A partir de estas puntuaciones de combinación lineal ponderada, se determina la puntuación de combinación lineal ponderada del nodo del factor de transcripción (TF) (153) y se establece el nivel de actividad del elemento de TF (157).

(5) Procedimiento para observables discretizados

En la Figura 6 se muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto como un observable discretizado. En primer lugar, se extrae la muestra de prueba y se le asigna un iD de muestra de prueba (161). A continuación, se recopilan y normalizan los datos de prueba para los niveles de expresión de ARNm (162). Los datos de prueba pueden recopilarse usando los mismos métodos que se analizaron para las muestras de entrenamiento en la Figura 5, usando intensidades de conjuntos de sondas de micromatrices (101), valores de Cq de PCR en tiempo real (102), lecturas de RNAseq sin procesar (103) o modalidades de medición alternativas (104). Los datos del nivel de expresión sin procesar pueden normalizarse para cada método, respectivamente, por normalización usando un algoritmo, por ejemplo, fRMA o MAS5.0 (111), normalización a Cq promedio de genes de referencia (112), normalización de lecturas en RPKM/FPKM (113) y normalización con genes/proteínas de referencia (114). Este procedimiento de normalización conduce a una intensidad de conjunto de sondas normalizada (121), valores de Cq normalizados (122), RPKM/FPKM normalizados (123) o medición normalizada (124) para cada método, respectivamente.

Una vez normalizados los datos de prueba, los datos de prueba resultantes (163) se analizan en una etapa umbral (164) basada en el modelo de ruta matemático calibrado (145), dando como resultado los datos de prueba con umbral (165) . Al usar observables discretos, en un ejemplo no limitante, cada expresión por encima de un cierto umbral es, por ejemplo, dado un valor de 1 y los valores por debajo del umbral reciben un valor de 0, o en una realización alternativa, la masa de probabilidad por encima del umbral como se describe en el presente documento se usa como valor umbral. Basado en el modelo de ruta matemática calibrada, este valor representa el nivel de actividad del elemento TF (157), que después se usa para calcular la actividad de la ruta de señalización celular (171). La salida final da la actividad de la vía de señalización celular (172) en el sujeto.

(6) Procedimiento para observables continuos

En la Figura 7 se muestra un diagrama de flujo que ilustra a modo de ejemplo un proceso para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto como un observable continuo. En primer lugar, se extrae la muestra de prueba y se le asigna un ID de muestra de prueba (161). A continuación, se recopilan y normalizan los datos de prueba para los niveles de expresión de ARNm (162). Los datos de prueba pueden recopilarse usando los mismos métodos que se analizaron para las muestras de entrenamiento en la Figura 5, usando intensidades de conjuntos de sondas de micromatrices (101), valores de Cq de PCR en tiempo real (102), lecturas de RNAseq sin procesar (103) o modalidades de medición alternativas (104). Los datos del nivel de expresión sin procesar pueden normalizarse para cada método, respectivamente, por normalización usando un algoritmo, por ejemplo, fRMA (111), normalización a Cq promedio de genes de referencia (112), normalización de lecturas en RPKM/FPKM (113) y normalización con respecto a genes/proteínas de referencia (114). Este procedimiento de normalización conduce a una intensidad de conjunto de sondas normalizada (121), valores de Cq normalizados (122), RPKM/FPKM normalizados (123) o medición normalizada (124) para cada método, respectivamente.

Una vez normalizados los datos de prueba, los datos de prueba resultantes (163) se analizan en el modelo de ruta matemático calibrado (145). Al usar observables continuos, como un ejemplo no limitante, los niveles de expresión se convierten en valores entre 0 y 1 usando una función sigmoidea como se describe con más detalle en el presente documento. La determinación del elemento TF como se describe en el presente documento se usa para interpretar los datos de prueba en combinación con el modelo de ruta matemática calibrada, el valor resultante representa el nivel de actividad del elemento TF (157), que después se usa para calcular la actividad de la ruta de señalización celular (171). La salida final da la actividad de la vía de señalización celular (172) en el sujeto.

(7) Procedimiento de determinación del nivel de expresión del gen diana

En la Figura 8 se muestra un diagrama de flujo a modo de ejemplo que ilustra un proceso para derivar los niveles de expresión del gen diana a partir de una muestra extraída de un sujeto. En una realización a modo de ejemplo, las muestras se reciben y se registran en un laboratorio. Las muestras pueden incluir, por ejemplo, muestras fijadas en formalina, embebidas en parafina (FFPE) (181) o muestras frescas congeladas (FF) (180). Las muestras de f F pueden lisarse directamente (183). Para muestras FFPE, la parafina puede retirarse con una etapa de incubación calentada tras la adición de Proteinasa K (182). Después, las células se lisan (183), lo que destruye las membranas celulares y nucleares, lo que hace que el ácido nucleico (AN) esté disponible para su procesamiento posterior. El ácido nucleico está unido a una fase sólida (184) que podría, por ejemplo, ser perlas o un filtro. Después el ácido nucleico se lava con tampones de lavado para retirar todos los restos celulares que están presentes después de la lisis (185). A continuación, el ácido nucleico limpio se separa de la fase sólida con un tampón de elución (186). El ADN se elimina mediante un tratamiento con DNAsa para garantizar que solo haya ARN presente en la muestra (187). La muestra de ácido nucleico puede usarse directamente en la mezcla de muestras RT-qPCR (188). Las mezclas de muestras de RT-qPCR contienen la muestra de ARN, la enzima RT para preparar ADNc a partir de la muestra de ARN y una enzima de PCR para amplificar el ADNc, una solución tampón para asegurar el funcionamiento de las enzimas y potencialmente puede contener agua de calidad molecular para establecer un volumen fijo de concentración. La mezcla de muestra puede añadirse a una placa de pocillos múltiples (es decir, una placa de 96 pocillos o de 384 pocillos) que contiene ensayos de RT-qPCR secos (189). El RT-qPCR puede ejecutarse en una máquina de PCR de acuerdo con un protocolo específico (190). Un ejemplo de protocolo de PCR incluye i) 30 minutos a 50 °C; ii) 5 minutos a 95 °C; iii) 15 segundos a 95 °C; iv) 45 segundos a 60 °C; v) 50 ciclos repitiendo las etapas Hi e iv. Los valores de Cq se determinan después con los datos brutos usando el método de la segunda derivada (191). Los valores de Cq se exportan para su análisis (192).

(8) Enfermedades y trastornos mediados por TGF-p y métodos de tratamiento

Como se contempla en el presente documento, los métodos y aparatos de la presente invención pueden usarse para evaluar la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto, por ejemplo, un sujeto sospechoso de tener, o que tiene, una enfermedad o trastorno en el que el estado de la ruta de señalización del TGF-p es probatorio, ya sea total o parcialmente, de la presencia o progresión de la enfermedad. En una realización, se proporciona en el presente documento un método para tratar a un sujeto que comprende recibir información sobre el estado de actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p derivada de una muestra extraída del sujeto usando los métodos descritos en el presente documento y administrar al sujeto un inhibidor de TGF-p si la información con respecto a la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p es indicativa de una vía de señalización de TGF-p activa. En una realización particular, la indicación de actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p se establece en un valor de corte de probabilidades de que la ruta de señalización celular de TGF-B esté activa de 10:1, 5:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:5, 1:10.

Los inhibidores de TGF-p que pueden usarse en la presente invención son bien conocidos. Los ejemplos de inhibidores de TGF-p incluyen, pero no se limitan a, Terameprocol, Fresolimumab, Sotatercept, Galunisertib, SB431542, LY2109761, LDN-193189, SB525334, SB505124, GW788388, LY364947, RepSox, LDN-193189 HCI, K02288, LDN-214117, SD-208, EW-7197, ML347, LDN-212854, DMH1, Pirfenidona, Hesperetina, Trabedersen, Lerdelimumab, Metelimumab, trx-SARA, ID11, Ki26894 o SB-431542.

En una realización, la enfermedad o trastorno es uno de un trastorno autoinmunitario y otros trastornos inmunitarios, cáncer, asma bronquial, cardiopatía, diabetes, telangiectasia hemorrágica hereditaria, síndrome de Marfan, Síndrome de Ehlers-Danlos vascular, síndrome de Loeys-Dietz, enfermedad de Parkinson, enfermedad renal crónica, esclerosis múltiple, enfermedades fibróticas tales como fibrosis hepática, pulmonar o renal, enfermedad de Dupuytren o enfermedad de Alzheimer.

En una realización particular, el sujeto padece o se sospecha que tiene, un cáncer, por ejemplo, pero no se limita a, un tumor primario o un tumor metastásico, un tumor sólido, por ejemplo, melanoma, cáncer de pulmón (incluyendo adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células basales, carcinoma escamocelular, carcinoma macrocítico, Carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiogénico, carcinoma de células no microcíticas, carcinoma de células microcíticas, mesotelioma); cáncer de mama (incluyendo carcinoma ductal, carcinoma lobular, cáncer de mama inflamatorio, carcinoma de células claras, carcinoma mucinoso, carcinoma de mama de cavidades serosas); cáncer colorrectal (cáncer de colon, cáncer de recto, adenocarcinoma colorrectal); cáncer anal; cáncer de páncreas (incluyendo adenocarcinoma pancreático, carcinoma de células de los islotes, tumores neuroendocrinos); cáncer de próstata; adenocarcinoma de próstata; carcinoma de ovario (carcinoma epitelial de ovario o tumor del estroma epitelial de superficie, incluyendo tumor seroso, tumor endometrioide y cistadenocarcinoma mucinoso, tumor del estroma del cordón sexual); carcinoma de hígado y conductos biliares (incluyendo carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, hemangioma); carcinoma de esófago (incluyendo adenocarcinoma de esófago y carcinoma de células escamosas); carcinoma de células escamosas oral y orofaríngeo; carcinoma adenoide quístico de glándula salival; cáncer de vejiga; carcinoma de vejiga; carcinoma de útero (incluyendo adenocarcinoma de endometrio, ocular, carcinoma seroso papilar uterino, carcinoma uterino de células claras, sarcomas uterinos y leiomiosarcomas, tumores mullerianos mixto); glioma, glioblastoma, meduloblastoma y otros tumores del cerebro; cánceres de riñón (incluyendo carcinoma de células renales, carcinoma de células claras, tumor de Wilm); cáncer de cabeza y cuello (incluyendo carcinomas de células escamosas); cáncer de estómago (cánceres gástricos, adenocarcinoma de estómago, tumor estromal gastrointestinal); cáncer testicular; tumor de las células germinales; tumor neuroendocrino; cáncer cervicouterino; carcinoides del tracto gastrointestinal, mama y otros órganos; carcinoma de células de anillo de sello; tumores mesenquimales, incluyendo sarcomas, fibrosarcomas, hemangioma, angiomatosis, hemangiopericitoma, hiperplasia estromal seudoangiomatosa, miofibroblastoma, fibromatosis, tumor miofibroblástico inflamatorio, lipoma, angiolipoma, tumor de células granulares, neurofibroma, schwannoma, angiosarcoma, liposarcoma, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, leiomioma, leiomisarcoma, de piel, incluyendo melanoma, de cuello del útero, retinoblastoma, cáncer de cabeza y cuello, pancreático, de cerebro, tiroideo, testicular, renal, de vejiga, de tejido blando, de glándula adrenal, de uretra, cánceres del pene, mixosarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma, cordoma, histiocitoma fibroso maligno, linfangiosarcoma, mesotelioma, carcinoma de células escamosas; carcinoma epidermoide, tumores malignos de los anexos cutáneos, adenocarcinoma, hepatoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renales, hipernefroma, colangiocarcinoma, carcinoma de células transicionales, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma de células embrionarias, glioma anaplásico; glioblastoma multiforme, neuroblastoma, meduloblastoma, meningioma maligno, schwannoma maligno, neurofibrosarcoma, carcinoma de paratiroides, carcinoma medular de tiroides, carcinoide bronquial, feocromocitoma, carcinoma de células de los islotes, carcinoma maligno, paraganglioma maligno, melanoma, neoplasia de células de Merkel, cistosarcoma filoide, cánceres salivales, carcinomas tímicos y cánceres de vagina entre otros.

En una realización, los métodos descritos en el presente documento son útiles para tratar a un hospedador que padece un linfoma o un trastorno o anomalía de proliferación linfocítica o mielocítica. Por ejemplo, el sujeto que padece un linfoma de Hodgkin o un linfoma no Hodgkiniano. Por ejemplo, el sujeto puede padecer un linfoma no Hodgkiniano tales como, pero no limitado a: un linfoma relacionado con el SIDA; linfoma anaplásico de células grandes; linfoma angioinmunoblástico; linfoma blástico de células NK; linfoma de Burkitt; linfoma tipo Burkitt (linfoma de células pequeñas no escindidas); leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño; linfoma cutáneo de células T; linfoma difuso de células B grandes; linfoma de células T de tipo enteropatía; linfoma folicular; linfoma hepatoesplénico de células T gama-delta; linfoma linfoblástico; linfoma de células del manto; linfoma de la zona marginal; linfoma nasal de células T; linfoma pediátrico; linfomas periféricos de célulasT; linfoma del sistema nervioso central primario; leucemias de células T; linfomas transformados; linfomas de células T relacionados con el tratamiento; o macroglobulinemia de Waldenstrom.

Como alternativa, el sujeto puede padecer un linfoma de Hodgkin, tales como, pero no limitado a: linfoma de Hodgkin clásico con esclerosis nodular (CHL); CHL de celularidad mixta; CHL con depleción linfocitaria; CHL rico en linfocitos; linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos; o HL con predominio de linfocitos nodulares.

En una realización, el sujeto puede padecer un linfoma, un trastorno proliferativo o una anomalía específicos basados en células T, B o NK. Por ejemplo, el sujeto puede padecer un linfoma específico de células T o NK, por ejemplo, pero no limitado a: Linfoma periférico de células T, por ejemplo, linfoma periférico de células T y linfoma periférico de células T no especificado de otra manera (PTCL-NOS); linfoma anaplásico de células grandes, por ejemplo, linfoma quinasa anaplásico (ALK) positivo, Linfoma anaplásico de células grandes ALK negativo o linfoma anaplásico cutáneo primario de células grandes; linfoma angioinmunoblástico; linfoma cutáneo de células T, por ejemplo micosis fungoide, síndrome de Sezary, linfoma anaplásico cutáneo primario de células grandes, trastorno linfoproliferativo de células T CD30+ cutáneo primario; linfoma cutáneo primario agresivo epidermitrópico de células T citotóxicas CD8 ; linfoma cutáneo primario de células T gamma-delta; linfoma cutáneo primario de células T CD4+ pequeñas/medianas y papulosis linfomatoide; linfoma/leucemia de células T en adulto (ATLL); linfoma blástico de células NK; linfoma de células T de tipo enteropatía; linfoma hepatoesplénico de células T gama-delta; linfoma linfoblástico; linfomas nasales de células NK/T; linfomas de células T relacionados con el tratamiento; por ejemplo, linfomas que aparecen después de un trasplante de órganos sólidos o de médula ósea; leucemia prolinfocítica de células T; leucemia linfocítica granular de células T grandes; trastorno linfoproliferativo crónico de células NK; leucemia agresiva de células NK; enfermedad sistémica linfoproliferativa de células T por VEB+ de la infancia (asociada a infección crónica activa por VEB); linfoma similar a hidroa vacciniforme; leucemia/linfoma de células T del adulto; linfoma de células T asociado a enteropatía; linfoma hepatosplénico de células T; o linfoma subcutáneo de células T de tipo paniculitis.

Como alternativa, el sujeto puede padecer un linfoma de células B específico o un trastorno proliferativo tales como, pero no limitado a: mieloma múltiple; linfoma difuso de células B grandes; linfoma folicular; linfoma de tejido linfático asociado a mucosas (MALT); linfoma linfocítico de células pequeñas; linfoma de células del manto (LCM); linfoma de Burkitt; linfoma mediastínico de células B grandes; macroglobulinemia de Waldenstrom; linfoma nodal de la zona marginal de células B (NMZL); linfoma esplénico de la zona marginal (SMZL); linfoma intravascular de células B grandes; linfoma primario con derrame; o granulomatosis linfomatoide; leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño; leucemia prolinfocítica de células B; tricoleucemia; linfoma/leucemia esplénica, no clasificable; linfoma esplénico de células B pequeñas con infiltración difusa de la pulpa roja; tricoleucemia variante; linfoma linfoplasmacítico; enfermedades de la cadena pesada, por ejemplo, enfermedad de la cadena pesada alfa, enfermedad de la cadena pesada gamma, enfermedad de la cadena pesada Mu; mieloma de células plasmáticas; plasmacitoma solitario del hueso; plasmacitoma extraóseo; linfoma cutáneo primario del centro folicular; linfoma de células B grandes rico en células T/histiocitos; DLBCL asociado a inflamación crónica; Virus de Epstein-Barr (EBV) DLBCL de los ancianos; linfoma primario de mediastino (tímico) de células B grandes; DLBCL primario cutáneo, tipo pierna; ALK+ linfoma de células B grandes; linfoma plasmablástico; linfoma de células B grandes originado en enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8; enfermedad de Castleman; linfoma de células B, no clasificable, con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Burkitt; linfoma de células B, no clasificable, con características intermedias entre el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma de Hodgkin clásico; linfoma de Hodgkin clásico de esclerosis nodular; linfoma de Hodgkin clásico rico en linfocitos; linfoma de Hodgkin clásico de celularidad mixta; o linfoma de Hodgkin clásico con depleción linfocitaria.

En una realización, el sujeto padece una leucemia. Por ejemplo, el sujeto puede padecer una leucemia aguda o crónica de origen linfocítico o mielógeno, tales como, pero no limitado a: leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia mielógena aguda (LMA); leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia mielógena crónica (LMC); leucemia mielomonocítica juvenil (JMML); tricoleucemia (HCL); leucemia promielocítica aguda (un subtipo de AML); leucemia prolinfocítica de células T (TPLL); leucemia linfocítica granular grande; o leucemia crónica de células T del adulto; leucemia linfocítica granular grande (LGL). En una realización, el sujeto padece una leucemia mielógena aguda, por ejemplo, una AML indiferenciada (MO); leucemia mieloblástica (M1; con/sin maduración celular mínima); leucemia mieloblástica (M2; con maduración celular); leucemia promielocítica (M3 o variante de M3 [M3V]); leucemia mielomonocítica (M4 o variante de M4 con eosinofilia [M4E]); leucemia monocítica (M5); eritroleucemia (M6); o leucemia megacarioblástica (M7).

En una realización particular, el sujeto padece, o se sospecha que padece, un cáncer de mama, cáncer de pulmón, un cáncer de colon, cáncer de páncreas o cáncer de cerebro. En una realización particular, el sujeto padece, o se sospecha que padece, un cáncer de mama.

Esta solicitud describe varias realizaciones preferidas. Pueden producirse modificaciones y alteraciones a otras al leer y comprender la descripción detallada anterior. Se pretende que la solicitud se construya incluyendo todas estas modificaciones y alteraciones en la medida en que entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas o equivalentes de las mismas.

Otras variaciones de las realizaciones divulgadas pueden entenderse y efectuase por los expertos en la materia al poner en práctica la invención reivindicada, a partir de un estudio de los dibujos, la divulgación y las reivindicaciones adjuntas.

En las reivindicaciones, la expresión "que comprende" no excluye otros elementos o etapas y el artículo indefinido "uno" o "una" no excluye una pluralidad.

Una única unidad o dispositivo puede cumplir las funciones de varios elementos enunciados en las reivindicaciones. El mero hecho de que determinadas medidas se enuncien en reivindicaciones dependientes mutuamente diferentes no indica que una combinación de estas medidas no se pueda aprovechar.

Los cálculos como la determinación de la puntuación de riesgo realizado por una o varias unidades o dispositivos pueden realizarse por cualquier otro número de unidades o dispositivos.

Un programa informático puede almacenarse/distribuirse en un medio adecuado, tal como un medio de almacenamiento óptico o un medio de estado sólido, suministrado junto con o como parte de otro hardware, pero también puede distribuirse en otras formas, tal como a través de Internet u otros sistemas de telecomunicaciones por cable o inalámbricos.

Ejemplo 6: Listados de secuencias usados en la aplicación

LISTADO DE SECUENCIAS: Seq. n.° Gen:

Seq. 1 ANGPTL4 Seq. 2 ATF3 Seq. 3 CCL2 Seq. 4 CDC42EP3 Seq. 5 CDH1 Seq. 6 CDKN1A Seq. 7 CDKN2B Seq. 8 COL1A2 Seq. 9 COL3A1 Seq. 10 COL7A1 Seq. 11 CTGF Seq. 12 CTNNB1 Seq. 13 DLX5 Seq. 14 EDN1 Seq. 15 FN1 Seq. 16 FOXP3 Seq. 17 FSHB Seq. 18 FST Seq. 19 FSTL3 Seq. 20 GADD45A Seq. 21 GADD45B Seq. 22 GNRHR Seq. 23 GSC Seq. 24 HAMP Seq. 25 HEY1 Seq. 26 HMGA2 Seq. 27 IBSP Seq. 28 ID1

Seq. 29 ID2

Seq. 30 ID3

Seq. 31 IL11 Seq. 32 IL6

Seq. 33 INPP5D Seq. 34 ITGB1 Seq. 35 ITGB5 Seq. 36 JUN Seq. 37 JUNB Seq. 38 LEFTY2 Seq. 39 MIXL1 Seq. 40 MMP13 Seq. 41 MMP2 Seq. 42 MMP9 Seq. 43 MSX2 Seq. 44 MYC Seq. 45 NKX2-5 Seq. 46 NODAL Seq. 47 OVOL1 Seq. 48 PDGFB Seq. 49 PMEPA1 Seq. 50 PPARG (continuación)

Seq. n.° Gen:

Seq.51 PTGS2

Seq.52 PTHLH

Seq.53 SERPINE1

Seq.54 SGK1

Seq.55 SKIL

Seq.56 SLC25A5

Seq.57 SMAD4

Seq.58 SMAD5

Seq.59 SMAD6

Seq.60 SMAD7

Seq.61 SNAI1

Seq.62 SNAI2

Seq.63 SP7

Seq.64 SPP1

Seq.65 TAGLN

Seq.66 TERT

Seq.67 TGFBR1

Seq.68 TIMP1

Seq.69 VEGFA

Seq.70 VIM

Seq.71 SERPINE1

T l 1: n i li r n i n T F-f

continuación

T l 11: n i li r n r f r ni

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método implementado por ordenador para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto, realizado por un dispositivo de procesamiento digital, en donde la inferencia comprende:

recibir niveles de expresión de tres o más genes diana de la ruta de señalización celular de TGF-p medidos en una muestra del sujeto,

determinar una actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p basada en la evaluación de un modelo de ruta matemático calibrado que relaciona los niveles de expresión de los tres o más genes diana de TGF-p con un nivel de actividad de la familia de elementos del factor de transcripción (TF) de TGF-p, la familia de elementos de TF de TGF-p que controlan la transcripción de los tres o más genes diana de TGF-p, estando definida la actividad de la ruta de señalización celular de TGF-p por el nivel de actividad de la familia de elementos de TF de TGF-p, siendo el modelo de vía matemática calibrado un modelo que se calibra usando un conjunto de datos de verdad fundamental que incluye muestras en las cuales la transcripción de los tres o más genes diana de T GF-p se induce por la familia de elementos y muestras de TF de TGF-p en las cuales la transcripción de los tres o más genes diana de TGF-p no se induce por la familia de elementos de TF de TGF-p,

en donde los tres o más genes diana de TGF-p se seleccionan del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CDKN2B, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, INPP5D, JUNB, MMP2, MMP9, NKX2-5, OVOL1, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI1, SNAI2, TIMP1 y VEGFA, preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2 y VEGFA, más preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, SERPINE1, SKIL, SMAD7, SNAI2 y VEGFA, lo más preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, IL11, JUNB, SERPINE1, SKIL y SMAD7,

2. El método de la reivindicación 1, en donde los tres o más genes diana de TGF-p se seleccionan del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, PTHLH, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2, VEGFA, como alternativa, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, JUNB, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2, VEGFA.

3. El método de la reivindicación 1, en donde los tres o más genes diana de TGF-p se seleccionan del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, SKIL, SMAD7 y SNAI2, como alternativa, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, JUNB, SERPINE1, SKIL, SMAD7, SNAI2 y VEGFA.

4. El método de la reivindicación 1, en donde los tres o más genes diana de TGF-p se seleccionan del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, IL11, JUNB, SKIL y SMAD7, como alternativa, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, JUNB, SERPINE1, SKIL y SMAD7.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde los tres o más genes diana de TGF-p seleccionados incluyen ANGPTL4 y CDC42EP3, más preferentemente, ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, JUNB, SERPINE1, SKIL y SMAD7.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende, además:

determinar si la ruta de señalización celular de TGF-p está funcionando en el sujeto en un estado en el que se promueve o se suprime el crecimiento de un tumor basándose en la actividad inferida de la ruta de señalización celular de TGF-p en el sujeto,

en donde la probabilidad de que la ruta de señalización celular de TGF-p esté en un estado de promoción del crecimiento tumoral aumenta con una actividad inferida creciente de la ruta de señalización celular de TGF-p y en donde la probabilidad de que la ruta de señalización celular de TGF-p esté en un estado supresor del crecimiento tumoral aumenta con una actividad inferida decreciente de la ruta de señalización celular de TGF-p.

7. El método de la reivindicación 6, que comprende, además:

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el modelo calibrado de ruta matemática es un modelo probabilístico, preferentemente un modelo de red bayesiana, basado en probabilidades condicionales que relacionan el nivel de actividad del elemento TF TGF-p y los niveles de expresión de los tres o más genes diana de TGF-p, o en donde el modelo de ruta matemática se basa en una o más combinación o combinaciones lineales de la expresión niveles de los tres o más genes diana de TGF-p.

9. Un aparato para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto que comprende un procesador digital configurado para realizar el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un medio de almacenamiento no transitorio para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto almacenando instrucciones que son ejecutables por un dispositivo de procesamiento digital para realizar el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Un programa informático para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto que comprende medios de código de programa para hacer que un dispositivo de procesamiento digital realice el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, cuando el programa informático se ejecuta en el dispositivo de procesamiento digital.

12. Un kit para inferir la actividad de una ruta de señalización celular de TGF-p en un sujeto, que comprende:

el aparato de la reivindicación 9, el medio de almacenamiento no transitorio de la reivindicación 10 o el programa informático de la reivindicación 11, en donde los tres o más genes diana de TGF-p se seleccionan del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CDKN2B, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, INPP5D, JUNB, MMP2, MMP9, NKX2-5, OVOL1, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI1, SNAI2, TIMP1 y VEGFA, preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45A, GADD45B, HMGA2, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, PTHLH, SERPINE1, SGK1, SKIL, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SNAI2 y VEGFA, más preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, CDKN1A, CTGF, GADD45B, ID1, IL11, JUNB, PDGFB, SERPINE1, SKIL, SMAD7, SNAI2 y VEGFA, lo más preferentemente, del grupo que consiste en: ANGPTL4, CDC42EP3, ID1, IL11, JUNB, SERPINE1, SKIL y SMAD7.

13. Uso del kit de la reivindicación 12 para realizar el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.