ES2834129T3 - Administración repetida de agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno no inmunosupresores - Google Patents

Administración repetida de agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno no inmunosupresores Download PDF

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immunomodulator
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Roberto Maldonado
Takashi Kishimoto
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Selecta Biosciences Inc
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Abstract

Una composición inmunoterapéutica específica de antígeno para uso en la inducción de tolerancia específica de antígeno, en donde la administración repetida de la composición a un sujeto no induce inmunosupresión, y en donde la composición comprende nanoportadores sintéticos poliméricos acoplados a un inhibidor de mTOR y a un antígeno exógeno, en donde el antígeno es una proteína terapéutica, o un fragmento antigénico de la misma, que no está acoplado al inhibidor de mTOR, y en donde el inhibidor de mTOR es rapamicina o un análogo de rapamicina.

Description

DESCRIPCIÓN
Administración repetida de agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno no inmunosupresores
CAMPO DE LA INVENCIÓN
El campo técnico de la invención es la inducción de tolerancia específica de antígeno.
ANTECEDENTES
Determinadas enfermedades o afecciones, tales como enfermedades autoinmunes, alergias o deficiencias genéticas o adquiridas que requieren terapias de reemplazo de proteínas o enzimas, y enfermedades que requieren terapias biológicas, a menudo dan como resultado respuestas inmunes no deseadas. Respuestas inmunes de este tipo no deseadas pueden reducirse mediante el uso de fármacos inmunomoduladores. Sin embargo, los fármacos inmunomoduladores convencionales son de acción amplia. Adicionalmente, con el fin de mantener la inmunosupresión, la terapia con fármacos inmunomoduladores es generalmente una propuesta de por vida. Desafortunadamente, el uso de inmunomoduladores de acción amplia está asociado con un riesgo de efectos secundarios graves, tales como tumores, infecciones, nefrotoxicidad y trastornos metabólicos. Por consiguiente, serían beneficiosas nuevas terapias inmunomoduladoras.
Moghimi (2011); J. Thromb. Haemost. 9(8): 1524-1533 describe la administración de Factor VIII y rapamicina. Se enseña que se induce tolerancia al Factor VIII y que (a las dosis utilizadas) la inmunosupresión es leve y transitoria. Zhang (2013); Blood 122(21): 2337 describen nanopartículas con factor VIII y un inmunomodulador, pero este último no se especifica.
El documento WO2008043157 describe composiciones que comprenden un antígeno y un inmunosupresor en forma de partículas, y el uso del mismo en inducir o estimular la tolerancia.
El documento WO2012054920 describe una micropartícula tolerogénica para tratar la diabetes.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Se ha de entender que la invención no se limita a lo que se presenta en los ejemplos a modo de ilustración.
DIVULGACIÓN TÉCNICA DE REFERENCIA
La divulgación técnica de referencia que figura más adelante puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención per se, y también puede proporcionar antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados tal como se ilustra, en particular, en los ejemplos de referencia. Por lo tanto, se apreciará que esta divulgación técnica de referencia no pretende definir la invención como tal, sino más bien colocarla en un contexto técnico más amplio. Esta divulgación técnica describe métodos que comprenden determinar un protocolo para la administración repetida de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que no da como resultado la inmunosupresión en un sujeto; y administrar repetidamente el agente inmunoterapéutico específico de antígeno a otro sujeto utilizando uno o más elementos del protocolo.
En otro aspecto de esta divulgación técnica se describe un método que comprende determinar un protocolo para la administración repetida de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que no dé como resultado la inmunosupresión en un sujeto, en el que la determinación comprende administrar repetidamente el agente inmunoterapéutico específico de antígeno a un sujeto.
En otro aspecto de esta divulgación técnica se describe un método que comprende administrar repetidamente a un sujeto un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que comprende un antígeno o un inmunomodulador, en el que el antígeno o inmunomodulador se administra repetidamente de acuerdo con uno o más elementos de un protocolo que no induce inmunosupresión tras la administración repetida del antígeno o un inmunomodulador.
En un aspecto de esta divulgación técnica, el método comprende, además, obtener o proporcionar un agente inmunoterapéutico específico de antígeno. En otro aspecto de esta divulgación técnica, la determinación comprende, además, demostrar que uno o más elementos del protocolo dan como resultado una tolerancia específica de antígeno en el sujeto.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, se describe una composición que comprende un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que comprende un antígeno exógeno o un inmunomodulador exógeno en una cantidad previamente demostrada en un protocolo no para inducir la inmunosupresión tras la administración repetida. En un aspecto de esta divulgación técnica, la composición es un kit.
En un aspecto de esta divulgación técnica, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno es uno cualquiera de los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno como se describen en esta memoria.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el protocolo es uno que ha sido demostrado previamente no para inducir la inmunosupresión.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el antígeno o inmunomodulador está presente en una cantidad que se muestra adicionalmente para dar lugar a la tolerancia específica de antígeno.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno comprende un inmunomodulador exógeno. En otro aspecto de esta divulgación técnica, el inmunomodulador exógeno comprende una estatina; inhibidor de mTOR; agente de señalización de TGF-p; agonista del receptor de TGF-p ; inhibidor de histona desacetilasa; corticosteroide; inhibidor de la función mitocondrial; inhibidor de P38; inhibidor de NF-Kp; ligando del receptor de lectina; agonista del receptor de adenosina; agonista de prostaglandina E2; inhibidor de la fosfodiesterasa; inhibidor del proteasoma; inhibidor de quinasa; agonista del receptor acoplado a proteína G; antagonista del receptor acoplado a proteína G; glucocorticoide; retinoide; inhibidor de citoquinas; inhibidor del receptor de citoquinas; activador del receptor de citoquinas; antagonista del receptor activado por el proliferador de peroxisomas; agonista del receptor activado por el proliferador de peroxisoma; inhibidor de histona desacetilasa; inhibidor de calcineurina; inhibidor de fosfatasa; ATP oxidado; IDO; vitamina D3; ciclosporina A; inhibidor del receptor de hidrocarburo de arilo; resveratrol; azatiopurina; 6-mercaptopurina; aspirina; ácido niflúmico; estriol; tripolida; interleuquina; ciclosporina A o ARNip que fija como objetivo citoquinas o receptores de citoquinas. En otro caso, el inmunomodulador exógeno comprende rapamicina, ácido micofenólico o un ligando CD22.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno comprende un antígeno exógeno.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, cuando el agente inmunoterapéutico específico de antígeno comprende también un inmunomodulador exógeno, el antígeno exógeno y inmunomodulador exógeno no están acoplados el uno al otro. En otro aspecto de esta divulgación técnica, la administración repetida comprende la administración repetida concomitante del antígeno exógeno y el inmunomodulador exógeno.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el antígeno exógeno comprende una proteína terapéutica, antígeno modificado o antígeno expresado. En otro aspecto de esta divulgación técnica, el antígeno expresado se expresa a partir de ARN mensajero modificado.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno resulta en la tolerancia específica de antígeno a un antígeno endógeno.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el antígeno endógeno comprende un autoantígeno.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el autoantígeno comprende los encontrados en espondilitis aquilosante; pénfigo buloso; artritis reumatoide; esclerosis múltiple; diabetes; eczema; enfermedad inflamatoria del intestino; lupus o lupus eritematoso sistémico; esclerosis múltiple; cirrosis biliar primaria; soriasis; sarcoidosis; esclerosis sistémica; esclerodermia; tiroiditis; enfermedad tiroidea autoinmune; tiroiditis de Hashimoto; tirotoxicosis; alopecia areata; enfermedad de Grave; síndrome de Guillain-Barré; enfermedad celíaca; síndrome de Sjogren; fiebre reumática; gastritis; gastritis atrófica autoinmune; hepatitis autoinmune; insulitis; ooforitis; orquitis; uveítis; uveítis facogénica; miastenia grave; mixedema primario; anemia perniciosa; colangitis esclerosante primaria; anemia emolítica autoinmune; enfermedad de Addison; esclerodermia; síndrome de Goodpasture; nefritis; soriasis; pénfigo vulgar; penfigoide; oftalmía simpática; púrpura trombocitopénica idiopática; feucopenia idiopática; granulomatosis de Wegener o poli/dermatomiositis.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno comprende un antígeno exógeno y resulta en tolerancia específica de antígeno cuando se administra en presencia de un inmunomodulador endógeno.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el inmunomodulador endógeno comprende una sustancia y/o una combinación de sustancias implicadas en la apoptosis o la señalización relacionada, una sustancia y/o una combinación de sustancias que intervienen en la biología de células T o B, o una sustancia y/o una combinación de sustancias implicadas en la biología de células dendríticas.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, la administración repetida se produce 1 semana a 10 años después de una dosis inicial o una administración repetida previa del agente inmunoterapéutico específico de antígeno. En otra realización de uno cualquiera de los métodos o las composiciones descritos en esta memoria, la administración repetida se produce 1 semana después de una dosis inicial o una administración repetida previa del agente inmunoterapéutico específico de antígeno. En otro aspecto de esta divulgación técnica, la administración repetida se produce 2 semanas después de una dosis inicial o una administración repetida previa del agente inmunoterapéutico específico de antígeno. En otro aspecto de esta divulgación técnica, la administración repetida se produce de 1 a 12 meses después de una dosis inicial o una administración repetida previa del agente inmunoterapéutico específico de antígeno.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno comprende un antígeno exógeno y inmunomodulador exógeno, el antígeno exógeno se administra repetidamente por una diferente ruta desde el inmunomodulador exógeno. En otro aspecto de esta divulgación técnica, la administración repetida comprende la administración repetida concomitante.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el antígeno inmunoterapéutico específico de antígeno comprende más de un antígeno exógeno.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, cuando el agente inmunoterapéutico específico de antígeno comprende un antígeno exógeno y inmunomodulador exógeno, los antígenos exógenos se administran repetidamente por una ruta diferente desde el inmunomodulador exógeno. En otro aspecto de esta divulgación técnica, la administración repetida comprende la administración repetida concomitante.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el antígeno exógeno y el inmunomodulador exógeno están acoplados el uno al otro. En otro aspecto de esta divulgación técnica, el inmunomodulador exógeno comprende péptido ERY1.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno se administra repetidamente a otro sujeto utilizando la totalidad o sustancialmente la totalidad de los elementos del protocolo.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno comprende nanoportadores sintéticos poliméricos acoplados a un inmunomodulador exógeno.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, una carga de inmunomodulador fijada a los nanoportadores sintéticos poliméricos, en promedio a través de las nanoportadores sintéticos poliméricos, es de entre 0,1% y 50% (peso/peso). En otro aspecto de esta divulgación técnica, la carga está entre el 0,1% y el 20% (peso/peso).
En otro aspecto de esta divulgación técnica, la carga de inmunomodulador del inmunomodulador exógeno en promedio es de al menos 95%, 97%, 98% o 99% (peso/peso).
En otro aspecto de esta divulgación técnica, cuando el agente inmunoterapéutico específico de antígeno comprende un inmunomodulador exógeno y antígeno exógeno, los nanoportadores sintéticos poliméricos están acoplados adicionalmente al antígeno exógeno. En otro aspecto de esta divulgación técnica, cuando el agente inmunoterapéutico específico de antígeno comprende un inmunomodulador exógeno y un antígeno exógeno, el nanoportador sintético polimérico se administra concomitantemente con un antígeno exógeno.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, se describe en esta memoria un método de fabricación de uno cualquiera de los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno. En un aspecto de esta divulgación técnica, el método comprende producir u obtener un antígeno exógeno o un inmunomodulador exógeno en una cantidad que no induzca inmunosupresión tras la administración repetida. En otro aspecto de esta divulgación técnica, la cantidad está en una cantidad previamente demostrada en un protocolo para no inducir inmunosupresión tras la administración repetida. En otro aspecto de esta divulgación técnica, el método comprende, además, determinar la cantidad o el protocolo.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, se describe un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que comprende un inmunomodulador exógeno o un antígeno exógeno para la fabricación de un medicamento para el logro de la tolerancia específica de antígeno, pero no la inducción de inmunosupresión en un sujeto.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, se describe un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que comprende un inmunomodulador exógeno o un antígeno exógeno para lograr la tolerancia específica de antígeno, pero no la inducción de inmunosupresión en un sujeto. En un aspecto de esta divulgación técnica, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno es para uso en uno cualquiera de los métodos descritos en esta memoria.
En otro aspecto de esta divulgación técnica, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno es uno cualquiera de los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno descritos en esta memoria.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Fig. 1 muestra los resultados de la administración repetida de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que comprende antígeno y rapamicina.
La Fig.2 muestra los resultados de la administración repetida de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que comprende metotrexato, un inmunomodulador exógeno.
La Fig.3 muestra los resultados de la administración repetida de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que comprende metotrexato, un inmunomodulador exógeno.
La Fig. 4 demuestra la deleción o anergia de células T CD8+ con un antígeno exógeno (OVA) fijado a un inmunomodulador exógeno (péptido ERY1).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La divulgación técnica de referencia detallada que figura a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención per se, y también puede proporcionar antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados, tal como se ilustra, en particular, en los ejemplos de referencia. Por lo tanto, se apreciará que esta divulgación técnica de referencia no pretende definir la invención como tal, sino más bien colocarla en un contexto técnico más amplio.
Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el", “la” incluyen referentes en plural, a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye una mezcla de dos o más de moléculas de este tipo o una mezcla de diferentes pesos moleculares de una única especie de polímero, la referencia a "un nanoportador sintético" incluye una mezcla de dos o más de nanoportadores sintéticos de este tipo o un pluralidad de nanoportadores sintéticos de este tipo, la referencia a "una molécula de ADN" incluye una mezcla de dos o más moléculas de ADN de este tipo o una pluralidad de moléculas de ADN de este tipo, la referencia a "un inmunomodulador" incluye una mezcla de dos o más materiales de este tipo o una pluralidad de moléculas inmunomoduladoras.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "comprenden" o variaciones del mismo, tales como "comprende" o "que comprende" se deben leer para indicar la inclusión de cualquier número entero enumerado (p. ej., un rasgo, elemento, característica, propiedad, etapas de método/procedimiento o limitación) o grupo de números enteros (p. ej., rasgos, elemento, características, propiedades, etapas de método/procedimiento o limitación) pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. Por lo tanto, tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "que comprende" es inclusiva y no excluye números enteros adicionales no citados o etapas de método/procedimiento.
En cualquiera de las composiciones y los métodos descritos en esta memoria, "que comprende" puede ser reemplazado por "que consiste esencialmente en' o "que consiste en”. La expresión "que consiste esencialmente en" se utiliza en esta memoria para requerir el o los números enteros o etapas especificados, así como aquellos que no afectan materialmente al carácter o a la función de la invención reivindicada. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "que consiste" se utiliza para indicar la presencia del número entero enumerado (p. ej., un rasgo, elemento, característica, propiedad, etapa de método/procedimiento o limitación) o grupo de números enteros (p. ej., rasgos, elementos, características, propiedades, etapas de método/procedimiento o limitaciones) solo.
A. INTRODUCCIÓN
Tal como se mencionó previamente, las composiciones inmunomoduladores convencionales actuales son de amplia actuación y generalmente dan como resultado una regulación a la baja sistémica global del sistema inmune. Las composiciones y los métodos descritos en esta memoria permiten efectos inmunológicos más fijados como objetivo, particularmente cuando los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno enumerados se utilizan en una administración repetida. La inmunosupresión amplia durante la administración repetida es de particular preocupación, porque generalmente daría como resultado una inmunosupresión a largo plazo que podría conducir a eventos adversos significativos para los sujetos que reciben las composiciones inmunomoduladoras convencionales administradas repetidamente. En cambio, los autores de la invención han descubierto que es posible proporcionar composiciones y métodos inmunomoduladores específicos de antígeno que no den como resultado una inmunosupresión amplia o a largo plazo durante la administración repetida.
Los autores de la invención han descubierto, inesperada y sorprendentemente, que los problemas y las limitaciones indicadas anteriormente se pueden superar mediante la práctica de la invención descrita en esta memoria. En particular, los autores de la invención han descubierto, inesperadamente, que es posible proporcionar métodos que comprenden determinar un protocolo para administrar repetidamente un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que no dé como resultado la inmunosupresión en un sujeto; y administrar repetidamente el agente inmunoterapéutico específico de antígeno a otro sujeto utilizando uno o más elementos del protocolo. Adicionalmente, los autores de la invención han descubierto, inesperadamente, que es posible proporcionar métodos que comprenden: administrar repetidamente a un sujeto un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que comprende un antígeno o un inmunomodulador, en donde el antígeno o inmunomodulador se administra repetidamente de acuerdo con uno o más elementos de un protocolo que no induce la inmunosupresión tras la administración repetida del antígeno o inmunomodulador. En algunas realizaciones, el protocolo es uno que se ha demostrado previamente que no induce inmunosupresión en un sujeto. Además, los autores de la invención han descubierto, inesperadamente, que es posible proporcionar composiciones que comprenden: un agente inmunoterapéutico específico de antígeno que comprende un antígeno exógeno o un inmunomodulador exógeno en una cantidad que no induce inmunosupresión cuando se administra repetidamente. En algunas realizaciones, la cantidad es una que se ha demostrado previamente en un protocolo que no induce inmunosupresión tras la administración repetida en un sujeto.
B. DEFINICIONES
"Administrando" o "administración" o "administrar" significan proporcionar un material a un sujeto de una manera que sea farmacológicamente útil. El término pretende incluir hacer que se administre en algunos casos. "Hacer que se administre" significa causar, instar, alentar, ayudar, inducir o dirigir, directa o indirectamente, a otra parte para que administre el material.
"Una cantidad previamente demostrada en un protocolo que no induce la inmunosupresión tras la administración repetida" en el contexto de una composición, forma de dosificación, o método para la administración a un sujeto se refiere a una cantidad del antígeno o inmunomodulador que no induce inmunosupresión tras la administración repetida cuando se administra de acuerdo con un protocolo previamente demostrado que no induce inmunosupresión.
Las cantidades eficaces dependerán, por supuesto, del sujeto particular que se esté tratando; de la gravedad de una afección, enfermedad o trastorno; de los parámetros individuales del paciente, incluida la edad, la condición física, el tamaño y el peso; la duración del tratamiento; la naturaleza de la terapia concurrente (si la hubiera); la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del médico. Estos factores son bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica y se pueden abordar con sólo una experimentación de rutina. Generalmente se prefiere que se use una dosis máxima, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo con el criterio sólido del médico. Sin embargo, los expertos ordinarios en la técnica entenderán que un paciente puede insistir en una dosis más baja o una dosis tolerable por razones médicas, psicológicas o virtualmente por cualquier otra razón.
En algunos casos, dosis o cantidades de los inmunomoduladores y/o antígenos en las composiciones pueden variar desde aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 100.000 pg/kg. En algunos casos, las dosis pueden oscilar entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg. En aún otros casos, las dosis pueden variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 50 mg/kg a aproximadamente 75 mg/kg o de aproximadamente 75 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg. Alternativamente, la dosis o cantidad se puede administrar basándose en el número de nanoportadores sintéticos que proporcionan la cantidad deseada de inmunomoduladores y/o antígenos. Por ejemplo, dosis o cantidades útiles incluyen más de 106, 107, 108, 109 o 1010 nanoportadores sintéticos (por dosis). Otros ejemplos de dosis o cantidades útiles incluyen de aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x1010, de aproximadamente 1x107 a aproximadamente 1x109 o de aproximadamente 1x108 a aproximadamente 1x109 nanoportadores sintéticos (por dosis).
"Antígeno" significa un antígeno de células B o antígeno de células T. "Tipo(s) de antígenos" significa moléculas que comparten las mismas, o sustancialmente las mismas características antigénicas. En algunos casos, los antígenos pueden ser proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas, glicolípidos, polinucleótidos, polisacáridos o están contenidos o son expresados en células. En algunos casos, tal como cuando los antígenos no están bien definidos o caracterizados, los antígenos pueden estar contenidos en una preparación celular o tisular, restos celulares, exosomas celulares, medios acondicionados, etc. En algunos casos, el antígeno puede ser endógeno o exógeno. El antígeno endógeno comprende un antígeno que es generado por el propio cuerpo de un sujeto y puede dar como resultado respuestas inmunes que pueden conducir a una tolerancia específica de antígeno con un agente inmunoterapéutico específico de antígeno, tal como uno que comprende inmunomodulador exógeno, tras la administración repetida tal como se describe en esta memoria. En algunos casos, el antígeno endógeno da como resultado una tolerancia específica de antígeno con la administración repetida de un inmunomodulador exógeno tal como se describe en esta memoria. Ejemplos de antígeno endógeno comprenden antígenos autoinmunes, algunos de los cuales se describen en otra parte de esta memoria. El antígeno exógeno comprende un antígeno que se administra como parte del agente inmunoterapéutico específico de antígeno o como parte de alguna otra intervención terapéutica, pero no es generado por el propio cuerpo del sujeto. Ejemplos de antígenos exógenos comprenden alérgenos ambientales, proteínas o polipéptidos terapéuticos, etc., algunos de los cuales se describen en otra parte de esta memoria.
"Específico de antígeno" se refiere a cualquier respuesta inmune que resulta de la presencia del antígeno, o parte del mismo, o que genera moléculas que reconocen específicamente o se unen al antígeno. Por ejemplo, cuando la respuesta inmune es la producción de anticuerpos específicos de antígeno, se producen anticuerpos que se unen específicamente al antígeno. Como otro ejemplo, en los casos en los que la respuesta inmune es activación, proliferación y/o actividad de células B o células T CD4+ o células T CD8+ específicas de antígeno, la activación, proliferación y/o actividad resulta del reconocimiento del antígeno, o parte del mismo, solo o en complejo con moléculas MHC, células B, etc.
"Agente inmunoterapéutico específico de antígeno" significa un agente terapéutico que es capaz de tener un efecto tolerogénico en la respuesta inmune de un sujeto a un antígeno de interés. Un agente inmunoterapéutico específico de antígeno puede comprender un antígeno o un inmunomodulador. En determinados casos, agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno pueden comprender tanto un antígeno como un inmunomodulador, en donde el antígeno está acoplado o desacoplado al inmunomodulador. En determinados casos, los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno pueden comprender un antígeno y un inmunomodulador que no están acoplados entre sí y el antígeno y el inmunomodulador se administran repetidamente de forma concomitante. En tales casos, el antígeno y el inmunomodulador pueden administrarse en la misma composición o como composiciones separadas, y es la totalidad de las composiciones que comprenden el antígeno o inmunomodulador lo que constituye el agente inmunoterapéutico específico de antígeno. En ciertos casos, agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno que comprenden antígenos (es decir, antígenos exógenos) y/o inmunomoduladores (es decir, inmunomoduladores exógenos) pueden interactuar con inmunomoduladores endógenos y/o antígenos endógenos, respectivamente, para dar lugar preferiblemente o conducir a respuestas inmunes que pueden resultar en tolerancia específica de antígeno.
“Eficacia inmunoterapéutica específica de antígeno" significa que, para un antígeno de interés (Agi) el título de Agi IgG (reseñado como CE50) cambia de nivel de control positivo a un título (reseñado como CE50) al menos 50% inferior, con la misma dosis de Agi. Véase, en general, J. R. Crowther, "ELISA: Theory and Practice" (1995 Humana Press).
"Promedio", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la media aritmética, a menos que se indique lo contrario.
"Antígeno de células B" significa cualquier antígeno que es reconocido por y desencadena una respuesta inmune en una célula B (p. ej., un antígeno que es reconocida específicamente por una célula B o un receptor de la misma). En algunos casos, un antígeno que es un antígeno de células T también es un antígeno de células B. En otros casos, el antígeno de células T tampoco es un antígeno de células B. Antígenos de células B incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, etc. En algunos casos, el antígeno de células B comprende un antígeno no proteico (es decir, no un antígeno proteico o peptídico).
"Provocar" significa hacer una acción que ocurrió ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un tercero). En algunos casos, la invención encuentra aplicación en métodos que comprenden provocar que el agente inmunoterapéutico específico de antígeno se administre repetidamente a otro sujeto utilizando uno o más elementos del protocolo.
"Combinación", tal como se aplica a dos o más materiales y/o agentes (a los que también se alude en esta memoria como los componentes), pretende definir material en el que los dos o más materiales/agentes están asociados. Los componentes pueden identificarse por separado, p. ej., primer componente, segundo componente, tercer componente, etc. Los términos "combinado" y "combinar" en este contexto deben interpretarse en consecuencia.
La asociación de los dos o más materiales/agentes en una combinación puede ser física o no física. Ejemplos de materiales/agentes combinados físicamente asociados incluyen:
• composiciones (p. ej., formulaciones unitarias) que comprenden los dos o más materiales/agentes en mezcla (por ejemplo, dentro de la misma dosis unitaria);
• composiciones que comprenden material, en que los dos o más materiales/agentes están unidos química/físico-químicamente (por ejemplo, mediante reticulación, aglomeración molecular o unión a un resto de vehículo común);
• composiciones que comprenden material, en que los dos o más materiales/agentes están co-envasados química/físico-químicamente (por ejemplo, dispuestos sobre o dentro de vesículas lipídicas, partículas (p. ej., micropartículas o nanopartículas) o gotitas de emulsión);
• kits farmacéuticos, envases farmacéuticos o envases para pacientes en los que dos o más materiales/agentes se envasan o presentan conjuntamente (p. ej., como parte de una serie de dosis unitarias);
Ejemplos de materiales/agentes combinados no asociados físicamente incluyen:
• material (p. ej., una formulación no unitaria) que comprende al menos uno de los dos o más materiales/agentes junto con instrucciones para la asociación extemporánea del al menos un compuesto/agente para formar una asociación física de los dos o más materiales/agentes;
• material (p. ej., una formulación no unitaria) que comprende al menos uno de los dos o más materiales/agentes junto con instrucciones para la terapia de combinación con los dos o más materiales/agentes;
• material que comprende al menos uno de los dos o más materiales/agentes junto con instrucciones para la administración a una población de pacientes en la que se han administrado (o se están administrando) el otro u otros de los dos o más materiales/agentes;
• material que comprende al menos uno de los dos o más materiales/agentes en una cantidad o en una forma específicamente adaptada para su uso en combinación con el otro u otros de los dos o más materiales/agentes.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "terapia de combinación" pretende definir terapias que comprenden el uso de una combinación de dos o más materiales/agentes (como se define en esta memoria). Por lo tanto, referencias a "terapia de combinación", "combinaciones" y el uso de materiales/agentes "en combinación" en esta solicitud pueden referirse a materiales/agentes que se administran como parte del mismo régimen de tratamiento general. Como tal, la posología de cada uno de los dos o más materiales/agentes puede diferir: cada uno puede administrarse al mismo tiempo o en momentos diferentes. Por lo tanto, se apreciará que los materiales/agentes de la combinación se pueden administrar secuencialmente (p. ej., antes o después) o simultáneamente, ya sea en la misma formulación farmacéutica (es decir, juntos) o en diferentes formulaciones farmacéuticas (es decir, por separado). Simultáneamente en la misma formulación es como una formulación unitaria mientras que simultáneamente en diferentes formulaciones farmacéuticas es no unitaria. Las posologías de cada uno de los dos o más materiales/agentes en una terapia de combinación también pueden diferir con respecto a la vía de administración.
"Concomitantemente" significa la administración de dos o más materiales/agentes a un sujeto de una manera que está correlacionada en el tiempo, de preferencia, suficientemente correlacionados en el tiempo con el fin de proporcionar una modulación en una respuesta inmune, e incluso más preferiblemente los dos o más los materiales/agentes se administran en combinación. En algunos casos, la administración concomitante puede abarcar la administración de dos o más materiales/agentes dentro de un período de tiempo especificado, preferiblemente dentro de 1 mes, más preferiblemente dentro de 1 semana, aún más preferiblemente dentro de 1 día, e incluso más preferiblemente dentro de 1 hora. En algunos casos, los materiales/agentes pueden administrarse repetidamente de forma concomitante; es decir, la administración concomitante en más de una ocasión.
"Pareja" o "acoplado" o "parejas" (y similares) significa asociar químicamente una entidad (por ejemplo, un resto) con otra. En algunos casos, el acoplamiento es covalente, lo que significa que el acoplamiento se produce en el contexto de la presencia de un enlace covalente entre las dos entidades. En casos no covalentes, el acoplamiento no covalente está mediado por interacciones no covalentes que incluyen, pero no se limitan a interacciones de carga, interacciones de afinidad, coordinación de metales, adsorción física, interacciones hospedante-huésped, interacciones hidrofóbicas, interacciones de apilamiento TT, interacciones de enlace de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo y/o combinaciones de las mismas. En algunos casos, la encapsulación es una forma de acoplamiento.
"Determinando" o "determinar" o "demostrando" o "demostrar" significa verificar una relación de hechos. Estos términos significan establecer una conexión entre una o más entradas, por ejemplo, los elementos de un protocolo o el protocolo completo, y una o más salidas, por ejemplo, la presencia o ausencia de inmunosupresión o el logro de tolerancia específica de antígeno. En algunos casos, se prevé determinar que uno o más elementos de un protocolo para administrar repetidamente un agente inmunoterapéutico específico de antígeno no dan como resultado una inmunosupresión en un sujeto.
La determinación, etc. se puede realizar en un cierto número de formas, que incluyen, pero no se limitan a la realización de experimentos o a hacer proyectos. Por ejemplo, uno o más elementos de un protocolo, tal como una dosis de un inmunomodulador, se pueden determinar comenzando con uno o más elementos de un protocolo de ensayo, tal como una dosis de ensayo, y utilizando técnicas de escalado conocidas (tales como escalados alométricos o isométricos) para determinar el protocolo, tal como la dosis, para la administración. En otro caso, uno o más elementos de un protocolo, tal como una dosis, se pueden determinar testando variaciones en el uno o más elementos, tales como varias dosis en un sujeto, p. ej., mediante experimentación directa basada en la experiencia y los datos de orientación. En algunos casos, "determinando" o "determinar" o "demostrando" o "demostrar" comprende "hacer que se determine" "o hacer que se demuestre". "Hacer que se determine" "o hacer que se demuestre" significa provocar, instar, alentar, ayudar, inducir o dirigir o actuar en coordinación con una entidad para que la entidad determine una relación fáctica; incluyendo directa o indirectamente, o expresa o implícitamente.
"Forma de dosificación" significa un material farmacológicamente y/o inmunológicamente activo en un medio, portador, vehículo o dispositivo adecuado para la administración a un sujeto. Una cualquiera de las composiciones o dosis descritas en esta memoria puede estar en una forma de dosificación.
"Encapsular" significa encerrar al menos una parte de una sustancia dentro de un nanoportador sintético. En algunos casos, una sustancia está completamente encerrada dentro de un nanoportador sintético. En otros casos, la mayor parte o la totalidad de una sustancia encapsulada no está expuesta al entorno local externo al nanoportador sintético. En otros casos, no más del 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% (peso/peso) está expuesto al entorno local. La encapsulación es distinta de la absorción, que coloca la mayor parte o la totalidad de una sustancia en la superficie de un nanoportador sintético y deja la sustancia expuesta al entorno local externo al nanoportador sintético.
"inmunomodulador" significa un compuesto o una combinación de compuestos que provoca que una APC (célula presentadora de antígeno) tenga un efecto tolerogénico. Un efecto tolerogénico generalmente se refiere a la producción o expresión de citoquinas u otros factores por parte de la APC o cambios en el perfil de expresión genético de las APCs (p. ej., cambios en la expresión de moléculas co-estimuladoras) que reduce, inhibe o previene una respuesta inmune específica de antígeno no deseada, o que fomenta una respuesta inmune tolerogénica específica de antígeno deseada. En algunos casos, el inmunomodulador puede ser endógeno o exógeno. Inmunomoduladores endógenos comprenden inmunomoduladores que son generados por el propio cuerpo de un sujeto y pueden dar como resultado respuestas inmunes que pueden conducir a tolerancia específica de antígeno con un agente inmunoterapéutico específico de antígeno, tal como uno que comprende antígeno exógeno tras la administración repetida tal como se describe en esta memoria. En algunos casos, el inmunomodulador endógeno puede dar como resultado una tolerancia específica de antígeno cuando se administra un antígeno exógeno como se describe en esta memoria. Ejemplos de inmunomoduladores endógenos comprenden células apoptóticas y otros ligandos o marcadores apoptóticos, citoquinas tolerogénicas, tales como IL-10, y marcadores de la superficie celular implicados en respuestas tolerogénicas, tales como CD22. Inmunomoduladores exógenos comprenden inmunomoduladores que se administran como parte del agente inmunoterapéutico específico de antígeno o como parte de alguna otra intervención terapéutica, pero no son generados por el propio cuerpo del sujeto. Ejemplos de inmunomoduladores exógenos comprenden rapamicina y otros inmunomoduladores descritos en esta memoria.
En un caso, el inmunomodulador es uno que provoca que una APC fomente un fenotipo regulador en una o más células inmunes efectoras. Por ejemplo, el fenotipo regulador puede caracterizarse por la inhibición de la producción, inducción, estimulación o reclutamiento de células T CD4+ o células B específicas de antígeno, la inhibición de la producción de anticuerpos específicos de antígeno, la producción, inducción, estimulación o el reclutamiento de células Treg (p. ej., células Treg CD4+CD25highFoxP3+), etc. Esto puede ser el resultado de la conversión de células T CD4+ o células B a un fenotipo regulador. Esto también puede ser el resultado de la inducción de FoxP3 en otras células inmunitarias, tales como las células T CD8+, los macrófagos y las células iNKT. En un caso, el inmunomodulador es uno que afecta la respuesta de la APC después de que procesa un antígeno. En otro caso, el inmunomodulador no es uno que interfiera con el procesamiento del antígeno. En un caso adicional, el inmunomodulador no es una molécula de señalización apoptótica. En otro caso, el inmunomodulador no es un fosfolípido.
Inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a estatinas; inhibidores de mTOR, tales como rapamicina o un análogo de rapamicina; agentes de señalización de TGF-p ; agonistas del receptor de TGF-p; inhibidores de histona desacetilasa, tales como Tricostatina A; corticosteroides; inhibidores de la función mitocondrial, tales como rotenona; inhibidores de P38; inhibidores de NF-Kp, tales como 6Bio, Dexametasona, TCPA-1, IKK VII; agonistas del receptor de adenosina; agonistas de prostaglandina E2 (PGE2), tales como Misoprostol; inhibidores de fosfodiesterasa, tales como el inhibidor de fosfodiesterasa 4 (PDE4), tales como Rolipram; inhibidores del proteasoma; inhibidores de quinasas; agonistas del receptor acoplado a proteína G; antagonistas del receptor acoplado a proteína G; glucocorticoides; retinoides; inhibidores de citoquinas; inhibidores del receptor de citoquinas; activadores del receptor de citoquinas; antagonistas de los receptores activados por el proliferador de peroxisomas; agonistas del receptor activado por el proliferador de peroxisomas; inhibidores de histona desacetilasa; inhibidores de calcineurina; inhibidores de fosfatasa; inhibidores de PI3KB, tales como TGX-221; inhibidores de la autofagia, tales como 3-metiladenina; inhibidores del receptor de hidrocarburos de arilo; inhibidor de proteasoma I (PSI); y ATPs oxidados, tales como bloqueadores del receptor P2X. Inmunomoduladores también incluyen IDO, vitamina D3, ciclosporinas, tales como ciclosporina A, inhibidores del receptor de hidrocarburos de arilo, resveratrol, azatiopurina (Aza), 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), FK506, sanglifehrina A, salmeterol, mofetil micofenolato (MMF), aspirina y otros inhibidores de COX, ácido niflúmico, estriol y triptolida. En algunos casos, el inmunomodulador puede comprender uno cualquiera de los agentes descritos en esta memoria.
El inmunomodulador puede ser un compuesto que proporciona directamente el efecto tolerogénico en las APCs o puede ser un compuesto que proporciona el efecto tolerogénico indirectamente (es decir, después de ser procesado de alguna manera después de la administración). Inmunomoduladores, por lo tanto, incluyen formas de profármaco de cualquiera de los compuestos descritos en esta memoria.
Inmunomoduladores también incluyen ácidos nucleicos que codifican los péptidos, polipéptidos o proteínas descritos en esta memoria que dan como resultado una respuesta inmune tolerogénica. En algunos casos, por lo tanto, el inmunomodulador es un ácido nucleico que codifica un péptido, polipéptido o proteína que da como resultado una respuesta inmune tolerogénica, y es el ácido nucleico el que se acopla al nanoportador sintético.
El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, tal como ARNm. En algunos casos, las composiciones comprenden un complemento, tal como un complemento de longitud completa, o uno degenerado (debido a la degeneración del código genético) de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en esta memoria. En algunos casos, el ácido nucleico es un vector de expresión que se puede transcribir cuando se transfecta a una línea celular. En algunos casos, el vector de expresión puede comprender un plásmido, entre otros. Los ácidos nucleicos se pueden aislar o sintetizar utilizando enfoques de biología molecular estándar, por ejemplo, utilizando una reacción en cadena de la polimerasa para producir un fragmento de ácido nucleico, que luego se purifica y clona en un vector de expresión. Se pueden encontrar técnicas adicionales útiles en la práctica de esta invención en Current Protocols in Molecular Biology 2007 de John Wiley and Sons, Inc.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (tercera edición) Joseph Sambrook, Peter MacCallum Cancer Institute, Melbourne, Australia; David Russell, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, Cold Spring Harbor.
En algunos casos, los inmunomoduladores descritos en esta memoria están acoplados a nanoportadores sintéticos. En casos preferibles, el inmunomodulador es un elemento que se suma al material que forma la estructura del nanoportador sintético. Por ejemplo, en un caso en el que el nanoportador sintético está compuesto por uno o más polímeros, el inmunomodulador es un compuesto que está además acoplado a uno o más polímeros. Como otro ejemplo, en un caso en el que el nanoportador sintético está formado por uno o más lípidos, el inmunomodulador está de nuevo además y acoplado a uno o más lípidos. En algunos casos, como cuando el material del nanoportador sintético también resulta en un efecto tolerogénico, el inmunomodulador es un elemento presente además del material del nanoportador sintético que da como resultado un efecto tolerogénico.
Otros inmunomoduladores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a fármacos de moléculas pequeñas, productos naturales, anticuerpos (p. ej., anticuerpos contra CD20, CD3, CD4), fármacos basados en agentes biológicos, fármacos basados en hidratos de carbono, nanopartículas, liposomas, ARNi, ácidos nucleicos antisentido, aptámeros, metotrexato, NSAIDs; fingolimod; natalizumab; alemtuzumab; anti-CD3; tacrolimus (FK506), etc. Los expertos en la técnica conocen inmunomoduladores adicionales.
En algunos de los métodos o las composiciones descritos en esta memoria, el inmunomodulador está en una forma, tal como una forma nanocristalina, en donde la forma del propio inmunomodulador es una partícula o similar a una partícula. En algunos casos, estas formas imitan un virus u otro patógeno extraño. Se han nanonizado muchos fármacos y los expertos en la técnica conocerán métodos apropiados para producir formas de fármacos de este tipo. Nanocristales de fármacos, tales como rapamicina nanocristalina, son conocidos por los expertos ordinarios en la técnica (Katteboinaa, et al. 2009, International Journal of PharmTech Resesarch; Vol. 1, N° 3; págs. 682-694. Tal como se utiliza en esta memoria, un "nanocristal de fármaco" se refiere a una forma de un fármaco (p. ej., un inmunomodulador) que no incluye un portador o material de matriz. En algunos casos, los nanocristales de fármacos comprenden 90%, 95%, 98% o 99% o más de fármaco. Métodos para producir los nanocristales de fármacos incluyen, sin limitación, molienda, homogeneización a alta presión, precipitación, secado por pulverización, expansión rápida de la solución supercrítica (RESS), tecnología Nanoedge® (Baxter Healthcare) y Nanocrystal Technology™ (Elan Corporation). En algunos casos, se puede utilizar un tensioactivo o un estabilizador para la estabilidad estérica o electrostática del nanocristal de fármaco. En algunos casos, la forma de nanocristal o nanocristalina de un inmunomodulador puede utilizarse para aumentar la solubilidad, estabilidad y/o biodisponibilidad del inmunomodulador, en particular inmunomoduladores que son insolubles o lábiles.
"Inmunosupresión" significa (1) regulación a la baja no duradera, estadísticamente significativa, de una respuesta inmune como resultado de la administración repetida de un agente inmunoterapéutico específica de antígeno, o (2) la respuesta de un sujeto de ensayo no humano a un ensayo ELISA de respuesta de anticuerpos dependiente de células T enfrentado a KLH, asumiendo que KLH no es el antígeno de interés, después de al menos una administración repetida de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno, en donde la respuesta se caracteriza porque el título de IgG de KLH (reseñado como CE50) cambia de nivel de control positivo a un título (reseñado como CE50) equivalente a o menor que 3 desviaciones estándares por encima del control negativo medio ("fondo"), con la misma dosis de KLH. Véase, en general, J. R. Crowther, "ELISA: Theory and Practice" (1995 Humana Press). En un caso preferido, la regulación a la baja no duradera y estadísticamente significativa significa que la regulación a la baja (el brazo de tratamiento medido frente al brazo sin tratamiento) no evidencia una diferencia estadísticamente significativa durante más de una semana después de la última administración repetida del agente inmunoterapéutico específico de antígeno. Diversas composiciones, métodos, protocolos y formas de dosificación no dan como resultado, o no inducen, una inmunosupresión.
Ensayos ELISA de exposición a KLH se describen en general en la bibliografía, por ejemplo en J.T. Brisbin et al., Influence of In-Feed Virginiamycin on the Systemic and Mucosal Antibody Response of Chickens, Poultry Science 87: 1995-1999 (2008); o pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, de Stellar Biotechnologies (332 East Scott Street, Port Hueneme, California 93041 EE.UU.) como artículo El I-01 G Mouse Anti-KLH IgG ELISA Kit, o ELI-03G NHP Anti-KLH IgG ELISA Kit.
Un método ELISA para la medición de una concentración de anticuerpo anti-KLH, por ejemplo, un ELISA sándwich típico, puede consistir en las siguientes etapas (i) preparar un material de recubrimiento de placa de ELISA de tal manera que la diana del anticuerpo de interés se acopla a un polímero de sustrato u otro material adecuado (ii) preparar el material de recubrimiento en una solución acuosa (tal como PBS) y suministrar la solución de material de recubrimiento a los pocillos de una placa de múltiples pocillos para la deposición durante la noche del recubrimiento sobre la placa de múltiples pocillos (iii) lavar a fondo la placa de pocillos múltiples con tampón de lavado (tal como Tween-20 al 0,05% en PBS) para eliminar el exceso de material de recubrimiento (iv) bloquear la placa para una unión no específica mediante la aplicación de una solución de diluyente (tal como suero bovino fetal al 10% en PBS), (v) lavar la solución de bloqueo/diluyente de la placa con tampón de lavado (vi) diluir la o las muestras de suero que contienen anticuerpos y estándares apropiados (controles positivos) con diluyente según sea necesario para obtener una concentración que sature adecuadamente la respuesta de ELISA (vii) diluir en serie las muestras de plasma en la placa de múltiples pocillos para cubrir un intervalo de concentraciones adecuadas para generar una curva de respuesta de ELISA (viii) incubar la placa para proporcionar la unión anticuerpo-diana (ix) lavar la placa con tampón de lavado para eliminar los anticuerpos no unidos al antígeno (x), añadiendo una concentración adecuada de un anticuerpo de detección secundario en el mismo diluyente, tal como un anticuerpo de detección acoplado a biotina capaz de unirse al anticuerpo primario (xi) incubando la placa con el anticuerpo de detección aplicado, seguido de lavado con tampón de lavado (xii) añadiendo una enzima tal como estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) que se unirá a la biotina que se encuentra en los anticuerpos biotinilados e incubando (xiii) lavando la placa de múltiples pocillos (xiv) añadiendo sustrato(s) (tales como solución de TMB) a la placa (xv) aplicando una solución de parada (tal como ácido sulfúrico 2N) cuando se completa el desarrollo del color (xvi) leyendo la densidad óptica de los pocillos de la placa a una longitud de onda específica para el sustrato (450 nm con la resta de lecturas a 570 nm) (xvi) aplicando una curva multiparamétrica adecuada que se ajuste a los datos y definiendo la concentración media máxima efectiva (CE50) como la concentración en la curva en la que se consigue la mitad del valor máximo de DO para los patrones de la placa.
"Carga" es la cantidad de inmunomodulador de una composición inmunomoduladora exógena (peso/peso). Por ejemplo, cuando se une a un nanoportador sintético, la carga se basa en el peso total de la receta seca de los materiales en un nanoportador sintético completo (peso/peso). Generalmente, dicha carga se calcula como un promedio de una población de nanoportadores sintéticos. En un caso, la carga promedio a través de los nanoportadores sintéticos está entre el 0,1% y el 99%. En otro caso, la carga está entre el 0,1% y el 50%. En otro caso, la carga del inmunomodulador está entre el 0,1% y el 20%. En otro caso, la carga del inmunomodulador no supera el 25% en promedio en una población de nanoportadores sintéticos. En algunos casos, la carga se calcula como se puede describir en los Ejemplos o como se conoce en la técnica.
Como otros ejemplos, cuando la forma del inmunomodulador es en sí una partícula o similar a una partícula, tal como un inmunomodulador nanocristalino, la carga de inmunomodulador es la cantidad del inmunomodulador en las partículas o similares (peso/peso). En tales casos, la carga puede acercarse al 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más.
"Dimensión máxima de un nanoportador sintético" significa la dimensión más grande de un nanoportador medida a lo largo de cualquier eje del nanoportador sintético. "Dimensión mínima de un nanoportador sintético" significa la dimensión más pequeña de un nanoportador sintético medida a lo largo de cualquier eje del nanoportador sintético. Por ejemplo, para un nanoportador sintético esferoidal, la dimensión máxima y mínima de un nanoportador sintético sería sustancialmente idéntica y sería el tamaño de su diámetro. De manera similar, para un nanoportador sintético cuboidal, la dimensión mínima de un nanoportador sintético sería la más pequeña de su altura, anchura o longitud, mientras que la dimensión máxima de un nanoportador sintético sería la mayor de su altura, anchura o longitud. En un caso, una dimensión mínima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es igual a o mayor que 100 nm. En un caso, una dimensión máxima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es igual a o menor que 5 pm. Preferiblemente, una dimensión mínima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es mayor que 110 nm, más preferiblemente mayor que 120 nm, más preferiblemente mayor que 130 nm y más preferiblemente aún mayor que 150 nm. Las relaciones de aspectos de las dimensiones máximas y mínimas de los nanoportadores sintéticos pueden variar. Por ejemplo, las relaciones de aspecto de las dimensiones máximas a mínimas de los nanoportadores sintéticos pueden variar de 1:1 a 1.000.000:1, preferiblemente de 1:1 a 100.000:1, más preferiblemente de 1:1 a 10.000:1, más preferiblemente de 1:1 a 1000:1, aún más preferiblemente de 1:1 a 100:1, y aún más preferiblemente de 1:1 a 10:1. Preferiblemente, una dimensión máxima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra es igual a o menor que 3 pm, más preferiblemente igual a o menor que 2 pm, más preferiblemente igual a o menor que 1 pm, más preferiblemente igual a o menor que 800 nm, más preferiblemente igual a o menor que 600 nm, y más preferiblemente aún igual a o menor que 500 nm. En casos preferidos, una dimensión mínima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es igual a o mayor que 100 nm, más preferiblemente igual a o mayor que 120 nm, más preferiblemente igual a o mayor que 130 nm, más preferiblemente igual a o mayor que 140 nm y más preferiblemente aún igual a o mayor que 150 nm. La medición de las dimensiones del nanoportador sintético (p. ej., el diámetro) se obtiene suspendiendo los nanoportadores sintéticos en un medio líquido (habitualmente acuoso) y utilizando dispersión de la luz dinámica (DLS) (p. ej., utilizando un instrumento Brookhaven ZetaPALS). Por ejemplo, una suspensión de nanoportadores sintéticos se puede diluir de un tampón acuoso en agua purificada para lograr una concentración final de suspensión de nanoportadores sintéticos de aproximadamente 0,01 a 0,1 mg/mL. La suspensión diluida puede prepararse directamente en el interior o transferirse a una cubeta adecuada para el análisis por DLS. La cubeta se puede colocar entonces en la DLS, dejar que se equilibre a la temperatura controlada y luego escanear durante el tiempo suficiente para adquirir una distribución estable y reproducible basada en entradas apropiadas para la viscosidad del medio y los índices de refracción de la muestra. Luego se reseña el diámetro efectivo, o la media de la distribución. La determinación de los tamaños efectivos de nanoportadores sintéticos de alta relación de aspecto o no esferoidales puede requerir técnicas aumentativas, tales como microscopía electrónica, para obtener medidas más precisas. "Dimensión" o "tamaño" o "diámetro" de nanoportadores sintéticos significa la media de una distribución de tamaños de partículas, por ejemplo, obtenida utilizando la dispersión dinámica de luz.
“Excipiente farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéuticamente aceptable" significa un material farmacológicamente inactivo utilizado junto con un material farmacológicamente activo para formular las composiciones. Excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden una diversidad de materiales conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a sacáridos (tales como glucosa y lactosa), conservantes, tales como agentes antimicrobianos, auxiliares de reconstitución, colorantes, solución salina (tal como solución salina tamponada con fosfato) y tampones.
“Protocolo" significa un patrón de administrar repetidamente agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno a un sujeto. Los protocolos se componen de elementos; por lo tanto, un protocolo comprende uno o más elementos. Dichos elementos del protocolo pueden comprender cantidades de dosificación, frecuencia de dosificación, vías de administración, duración de la dosificación, tasas de dosificación, intervalos entre dosificaciones y combinaciones de cualquiera de los anteriores. En algunos casos, se puede utilizar un protocolo para administrar una o más composiciones a uno o más sujetos de ensayo. Las respuestas inmunes en estos sujetos de ensayo pueden evaluarse luego para determinar si el protocolo fue eficaz o no para generar un nivel deseado de un efecto inmunológico. Uno o más de los elementos pueden haberse demostrado previamente en sujetos de ensayo, tales como sujetos no humanos, y luego traducirse a protocolos humanos. Por ejemplo, las cantidades de dosificación demostradas en sujetos no humanos se pueden escalar como un elemento de un protocolo humano utilizando técnicas establecidas tales como escalado alimetrico u otros métodos de escalado. Se puede determinar si un protocolo tuvo o no un efecto deseado utilizando cualquiera de los métodos descritos en esta memoria o conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener una población de células de un sujeto al que se le ha administrado repetidamente una composición mencionada y/o un agente inmunoterapéutico específico de antígeno descrito en esta memoria de acuerdo con un protocolo específico con el fin de determinar si células inmunes, citoquinas, anticuerpos específicos, etc. se redujeron, generaron, activaron, etc. o no. Métodos útiles para detectar la presencia y/o el número de células inmunes incluyen, pero no se limitan a métodos de citometría de flujo (p. ej., FACS) y métodos de inmunohistoquímica. Anticuerpos y otros agentes aglutinantes para la tinción específica de marcadores de células inmunitarias están disponibles comercialmente. Kits de este tipo incluyen típicamente reactivos de tinción para múltiples antígenos que permiten la detección, separación y/o cuantificación basada en FACS de una población de células deseada de una población heterogénea de células. En algunos casos, el agente inmunoterapéutico específico de antígeno se administra repetidamente a otro sujeto utilizando todos o sustancialmente todos los elementos que componen el protocolo.
"Protocolo previamente demostrado que no induce inmunosupresión tras la administración repetida" significa un protocolo en el que se demostró en un momento anterior que uno o más de los elementos de dicho protocolo (hasta e incluyendo el protocolo completo) no da como resultado inmunosupresión durante al menos un punto durante, preferiblemente la totalidad de la administración repetida.
"Proporcionar" significa una acción o conjunto de acciones que un individuo realiza que suministran un elemento necesario o conjunto de elementos o métodos para la práctica de la presente invención. La acción o el conjunto de acciones pueden tomarse directamente uno mismo o indirectamente.
"Proporcionar un sujeto" es cualquier acción o conjunto de acciones que hace que un médico clínico entre en contacto con un sujeto y administre una composición descrita en esta memoria al mismo o para llevar a cabo acto seguido un método descrito en esta memoria. Preferiblemente, el sujeto es uno que necesita una respuesta inmune tolerogénica como se describe en esta memoria. La acción o el conjunto de acciones puede ser directamente uno mismo o indirectamente. En un caso de uno cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, el método comprende, además, proporcionar un sujeto.
"La administración repetida" o "administrar repetidamente" o "administrando repetidamente" y similares significa impulsar o extender la persistencia de una tolerancia inmune previamente establecida. Estas operaciones generalmente implican una administración o un ciclo corto de tratamiento en un momento en el que la tolerancia establecida está disminuyendo o corre el riesgo de disminuir. La administración repetida comienza con la siguiente dosis o dosis del agente inmunoterapéutico específico de antígeno administrado después de la administración de una dosis inicial de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno. El agente inmunoterapéutico específico de antígeno inicial administrado puede ser el mismo o diferente (en términos de composición, dosificación, etc.) del agente inmunoterapéutico específico de antígeno administrado durante la administración repetida. El refuerzo se realiza generalmente de 2 semanas a 1 año, y preferiblemente de 1 a 6 meses después de una dosis inicial del agente inmunoterapéutico específico de antígeno o una administración repetida previa. También se incluyen los casos que implican administraciones periódicas repetidas en un programa de administraciones que ocurren bisemanalmente, semanalmente, quincenalmente o en cualquier otro programa regular.
"Sujeto" significa animales, incluyendo mamíferos de sangre caliente, tales como seres humanos y primates; aves de corral; animales domésticos o de granja, tales como gatos, perros, ovejas, cabras, vacas, caballos y cerdos; animales de laboratorio, tales como ratones, ratas y cobayas; peces; reptiles; animales de zoológico y salvajes.
"Nanoportador(es) sintético(s)" significa un objeto discreto que no se encuentra en la naturaleza y que posee al menos una dimensión que es menor que o igual a 5 micras de tamaño. Las nanopartículas de albúmina se incluyen generalmente como nanoportadores sintéticos, sin embargo, en determinados casos, los nanoportadores sintéticos no comprenden nanopartículas de albúmina. Nanoportadores sintéticos pueden no comprender quitosano. En otros casos, los nanoportadores sintéticos no son nanopartículas basadas en lípidos. En otros casos, los nanoportadores sintéticos no comprenden un fosfolípido.
Un nanoportador sintético puede ser, pero no se limita a uno o una pluralidad de nanopartículas basadas en lípidos (a las que también se alude en esta memoria como nanopartículas lipídicas, es decir, nanopartículas, en las que la mayoría del material que compone su estructura son lípidos), nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsiones basadas en tensioactivos, dendrímeros, buckyballs, nanocables, partículas similares a virus (es decir, partículas que están compuestas principalmente de proteínas estructurales virales, pero que no son infecciosas o tienen baja infectividad), partículas basadas en péptidos o proteínas (a las que también se alude en esta memoria como partículas de proteínas, es decir, partículas en las que la mayoría del material que forma su estructura son péptidos o proteínas) (tales como nanopartículas de albúmina) y/o nanopartículas que se desarrollan utilizando una combinación de nanomateriales, tales como nanopartículas de lípido-polímero. Los nanoportadores sintéticos pueden tener una diversidad de formas diferentes, que incluyen, pero no se limitan a esferoidales, cuboidales, piramidales, oblongas, cilíndricas y toroidales. Nanoportadores sintéticos comprenden una o más superficies. Nanoportadores sintéticos ilustrativos que pueden adaptarse para uso en la práctica de la presente invención comprenden: (1) las nanopartículas biodegradables descritas en la patente de EE.UU. 5.543.158 expedida a Gref et al., (2) las nanopartículas poliméricas de la solicitud de patente de EE.UU. publicada 20060002852 expedida a Saltzman et al., (3) las nanopartículas construidas litográficamente de la solicitud de patente de EE.UU. publicada 20090028910 expedida a DeSimone et al., (4) la divulgación del documento WO 2009/051837 expedido a von Andrian et al., (5) las nanopartículas descritas en la solicitud de patente de EE.UU. publicada 2008/0145441 expedida a Penades et al., (6) las nanopartículas de proteína descritas en la solicitud de patente de EE.UU. publicada 20090226525 expedida a de los Rios et al., (7) las partículas similares a virus descritas en la solicitud de patente de EE.UU. publicada 20060222652 expedida a Sebbel et al., (8) las partículas similares a virus acopladas a ácido nucleico descritas en la solicitud de patente de EE.UU. publicada 20060251677 expedida a Bachmann et al., (9) las partículas similares a virus descritas en los documentos WO2010047839A1 o WO2009106999A2, (10) las nanopartículas nanoprecipitadas descritas en P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Partycles” Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010), (11) células apoptóticas, cuerpos apoptóticos o los miméticos sintéticos o semisintéticos descritos en la publicación de EE.UU. 2002/0086049 o (12) los de Look et al., “Nanogelbased delivery of mycophenolic acid ameliorates systemic lupus erythematosus in mice" J. Clinical Investigation 123(4):1741-1749 (2013). En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden poseer una relación de aspecto superior a 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 o mayor que 1:10.
Nanoportadores sintéticos que tienen una dimensión mínima igual a o menor que aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual a o menor que 100 nm, no comprenden una superficie con grupos hidroxilo que activan el complemento o alternativamente comprender una superficie que consiste esencialmente en restos que no son grupos hidroxilo que activan el complemento. En un caso preferido, nanoportadores sintéticos que tienen una dimensión mínima igual a o menor que aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual a o menor que 100 nm, no comprenden una superficie que active sustancialmente el complemento o, alternativamente, comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no activan sustancialmente el complemento. En un caso más preferido, nanoportadores sintéticos que tienen una dimensión mínima igual a o menor que aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual a o menor que 100 nm, no comprenden una superficie que active el complemento o, alternativamente, comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no activan el complemento. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos excluyen partículas similares a virus. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden poseer una relación de aspecto superior a 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 o superior a 1:10.
"Antígeno de células T" significa un antígeno de células T CD4+ o antígeno de células CD8+. "Antígeno de células T CD4+" significa cualquier antígeno que es reconocido por una célula T CD4+ y desencadena una respuesta inmune en una célula T CD4+, p. ej., un antígeno que es específicamente reconocido por un receptor de células T en una célula T CD4+ mediante la presentación del antígeno o parte del mismo unida a una molécula del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de Clase II. "Antígeno de células T CD8+" significa cualquier antígeno que es reconocido por y desencadena una respuesta inmune en una célula T CD8+, por ejemplo, un antígeno que es específicamente reconocido por un receptor de células T en una célula T CD8+ mediante la presentación del antígeno o porción del mismo unida a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de Clase I. En algunos casos, un antígeno que es un antígeno de células T también es un antígeno de células B. En otros casos, el antígeno de células T no es también un antígeno de células B. Los antígenos de células T son generalmente proteínas o péptidos.
Una "proteína terapéutica" se refiere a cualquier proteína o terapia basada en proteínas que se pueden administrar a un sujeto y que tiene un efecto terapéutico. Terapias de este tipo incluyen terapias de reemplazo de proteínas y de complementación de proteínas. Terapias de este tipo también incluyen la administración de proteínas exógenas o extrañas, terapias con anticuerpos y terapias celulares o basadas en células. Proteínas terapéuticas incluyen enzimas, cofactores enzimáticos, hormonas, factores de coagulación sanguínea, citoquinas, factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales. Se describen ejemplos de otras proteínas terapéuticas en otra parte de esta memoria. Las proteínas terapéuticas pueden producirse en, sobre o por parte de células y pueden obtenerse a partir de dichas células o administrarse en forma de dichas células. En algunos casos, la proteína terapéutica se produce en, sobre o por parte de células de mamíferos, células de insectos, células de levaduras, células bacterianas, células vegetales, células animales transgénicas, células vegetales transgénicas, etc. La proteína terapéutica puede producirse de forma recombinante en este tipo de células. La proteína terapéutica también se puede producir en, sobre o por parte de células autólogas que han sido transfectadas, transducidas o manipuladas de otro modo para expresarla. Alternativamente, la proteína terapéutica puede administrarse como un ácido nucleico o introduciendo un ácido nucleico en un liposoma, etc. Alternativamente, la proteína terapéutica puede obtenerse de formas de este tipo y administrarse como la propia proteína terapéutica. Sujetos, por lo tanto, incluyen cualquier sujeto que haya recibido, esté recibiendo o recibirá cualquiera de las anteriores.
"Respuesta inmune no deseada" se refiere a cualquier respuesta inmune no deseada que resulta de la exposición a un antígeno, fomenta o agrava una enfermedad, trastorno o afección descrito en esta memoria (o un síntoma de la misma), o es un síntoma de una enfermedad, trastorno o condición descrito en esta memoria. Respuestas inmunes de este tipo tienen generalmente un impacto negativo en la salud de un sujeto o son sintomáticas de un impacto negativo en la salud de un sujeto. Respuestas inmunes no deseadas incluyen producción de anticuerpos específicos de antígeno, proliferación y/o actividad de células B específicas de antígeno o proliferación y/o actividad de células T CD4+ específicas de antígeno.
C. INFORMACIÓN TÉCNICA RELATIVA A LAS COMPOSICIONES
Agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno
Nanoportadores sintéticos
En algunos casos, los agentes inmunoterapéuticos específicas de antígeno comprenden composiciones de nanoportadores sintéticos que comprenden un inmunomodulador y/o un antígeno, junto con métodos relacionados.
Se puede utilizar una amplia diversidad de nanoportadores sintéticos. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos son esferas o esferoides. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos son planos o en forma de placa. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos son cubos o cúbicos. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos son óvalos o elipses. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos son cilindros, conos o pirámides.
En algunos casos, es deseable utilizar una población de nanoportadores sintéticos que sea relativamente uniforme en términos de tamaño, forma y/o composición, de manera que cada uno de los nanoportadores sintéticos tiene propiedades similares. Por ejemplo, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95% de los nanoportadores sintéticos, basado en el número total de nanoportadores sintéticos, pueden tener una dimensión mínima o máxima que cae dentro del 5%, 10% o 20% del diámetro medio o dimensión media de los nanoportadores sintéticos.
Nanoportadores sintéticos pueden ser macizos o huecos y pueden comprender una o más capas. En algunos casos, cada una de las capas tiene una composición única y propiedades únicas en relación con las otras capas. Por dar solo un ejemplo, los nanoportadores sintéticos pueden tener una estructura de núcleo/envoltura, en la que el núcleo es una capa (p. ej., un núcleo polimérico) y la envoltura es una segunda capa (p. ej., una bicapa o monocapa lipídica). Nanoportadores sintéticos pueden comprender una pluralidad de capas diferentes.
En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente uno o más lípidos. En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender un liposoma. En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender una bicapa lipídica. En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender una monocapa lipídica. En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender una micela. En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender un núcleo que comprende una matriz polimérica rodeada por una capa lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.). En algunos casos, un nanoportador sintético puede comprender un núcleo no polimérico (p. ej., partícula de metal, punto cuántico, partícula de material cerámico, partícula de hueso, partícula viral, proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, etc.) rodeado por una capa lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.).
En otros casos, nanoportadores sintéticos pueden comprender partículas de metal, puntos cuánticos, partículas de material cerámico, etc. En algunos casos, un nanoportador sintético no polimérico es un agregado de componentes no poliméricos, tales como un agregado de átomos de metales (p. ej., átomos de oro).
En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente una o más entidades anfifílicas. En algunos casos, una entidad anfifílica puede fomentar la producción de nanoportadores sintéticos con estabilidad incrementada, uniformidad mejorada o viscosidad incrementada. En algunos casos, las entidades anfifílicas pueden asociarse con la superficie interior de una membrana lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.). Muchas entidades anfifílicas conocidas en la técnica son adecuadas para su uso en la fabricación de nanoportadores sintéticos. Tales entidades anfifílicas incluyen, pero no se limitan a fosfoglicéridos; fosfatidilcolinas; dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC); dioleilfosfatidil etanolamina (DOPE); dioleiloxipropiltrietilamonio (DOTMA); dioleoilfosfatidilcolina; colesterol; éster de colesterol; diacilglicerol; succinato de diacilglicerol; difosfatidil glicerol (DPPG); hexanodecanol; alcoholes grasos, tales como polietilenglicol (PEG); polioxietilen-9-lauril éter; un ácido graso tensioactivo, tal como ácido palmítico o ácido oleico; ácidos grasos; monoglicéridos de ácidos grasos; diglicéridos de ácidos grasos; amidas de ácidos grasos; glicocolato de trioleato de sorbitán (Span®85); monolaurato de sorbitán (Span®20); polisorbato 20 (Tween®20); polisorbato 60 (Tween®60); polisorbato 65 (Tween®65); polisorbato 80 (Tween®80); polisorbato 85 (Tween®85); monoestearato de polioxietileno; surfactina; un poloxómero; un éster de ácido graso de sorbitán, tal como trioleato de sorbitán; lecitina; lisolecitina; fosfatidilserina; fosfatidilinositol, esfingomielina; fosfatidiletanolamina (cefalina); cardiolipina; ácido fosfatídico; cerebrósidos; dicetilfosfato; dipalmitoilfosfatidilglicerol; estearilamina; dodecilamina; hexadecil-amina; palmitato de acetilo; ricinoleato de glicerol; esterato de hexadecilo; miristato de isopropilo; tiloxapol; poli(etilenglicol)5000-fosfatidiletanolamina; monoestearato de poli(etilenglicol) 400; fosfolípidos; detergentes sintéticos y/o naturales que tienen altas propiedades tensioactivas; desoxicolatos; ciclodextrinas; sales caotrópicas; agentes de apareamiento de iones; y combinaciones de los mismos. Un componente de entidad anfifílica puede ser una mezcla de diferentes entidades anfifílicas. Los expertos en la técnica reconocerán que esta es una lista ilustrativa, no completa, de sustancias con actividad tensioactiva. Se puede utilizar cualquier entidad anfifílica en la producción de nanoportadores sintéticos.
En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente uno o más hidratos de carbono. Los hidratos de carbono pueden ser naturales o sintéticos. Un hidrato de carbono puede ser un hidrato de carbono natural derivatizado. En determinados casos, un hidrato de carbono comprende monosacárido o disacárido, incluyendo, pero no limitados a glucosa, fructosa, galactosa, ribosa, lactosa, sacarosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, manosa, xilosa, arabinosa, ácido glucorónico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galatosamina y ácido neurámico. En determinados casos, un hidrato de carbono es un polisacárido, incluyendo, pero no limitado a pululano, celulosa, celulosa microcristalina, hidroxipropil metilcelulosa (HPMC), hidroxicelulosa (HC), metilcelulosa (MC), dextrano, ciclodextrano, glucógeno, hidroxietil almidón, carragenano, glicon, amilosa, quitosano, N,O-carboxilmetilquitosano, algina y ácido algínico, almidón, quitina, inulina, konjac, glucomanano, pustulano, heparina, ácido hialurónico, curdlan y xantano. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos no comprenden (o excluyen específicamente) hidratos de carbono, tal como un polisacárido. En determinados casos, el hidrato de carbono puede comprender un derivado de hidrato de carbono tal como un alcohol de azúcar, incluyendo, pero no limitado a manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, maltitol y lactitol.
En algunos casos, nanoportadores sintéticos pueden comprender uno o más polímeros. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros que es un polímero plurónico no terminado en metoxi. En algunos casos, al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% (peso/peso) de los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos son polímeros plurónicos no terminados en metoxi. En algunos casos, todos los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos son polímeros plurónicos no terminados en metoxi. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros que es un polímero no terminado en metoxi. En algunos casos, al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% (peso/peso) de los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos son polímeros no terminados en metoxi. En algunos casos, todos los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos son polímeros no terminados en metoxi. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros que no comprenden polímero plurónico. En algunos casos, al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% (peso/peso) de los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos no comprenden polímero plurónico. En algunos casos, todos los polímeros que componen los nanoportadores sintéticos no comprenden polímero plurónico. En algunos casos, un polímero de este tipo puede estar rodeado por una capa de revestimiento (p. ej., liposoma, monocapa lipídica, micela, etc.). En algunos casos, diversos elementos de los nanoportadores sintéticos pueden acoplarse con el polímero.
Los inmunomoduladores y/o antígenos pueden ser acoplados a los nanoportadores sintéticos mediante cualquiera de un cierto número de métodos. Generalmente, el acoplamiento puede ser el resultado de la unión entre los inmunomoduladores y/o antígenos y los nanoportadores sintéticos. Esta unión puede dar como resultado que los inmunomoduladores y/o antígenos se unan a la superficie de los nanoportadores sintéticos y/o se contengan (se encapsulen) dentro de los nanoportadores sintéticos. En algunos casos, sin embargo, los inmunomoduladores y/o antígenos son encapsulados por los nanoportadores sintéticos como resultado de la estructura de los nanoportadores sintéticos en lugar de unirse a los nanoportadores sintéticos. En casos preferibles, el nanoportador sintético comprende un polímero tal como se describe en esta memoria, y los inmunomoduladores y/o antígenos se acoplan al polímero.
Cuando el acoplamiento se produce como resultado de la unión entre los inmunomoduladores y/o antígenos y nanoportadores sintéticos, el acoplamiento puede ocurrir a través de un resto de acoplamiento. Un resto de acoplamiento puede ser cualquier resto a través del cual un inmunomodulador y/o antígeno se une a un nanoportador sintético. Restos de este tipo incluyen enlaces covalentes, tales como un enlace amida o un enlace éster, así como moléculas separadas que unen (covalente o no covalentemente) el inmunomodulador y/o antígeno al nanoportador sintético. Moléculas de este tipo incluyen enlazadores o polímeros o una unidad de los mismos. Por ejemplo, el resto de acoplamiento puede comprender un polímero cargado al que se une electrostáticamente un inmunomodulador y/o antígeno. Como otro ejemplo, el resto de acoplamiento puede comprender un polímero o una unidad del mismo al que está unido covalentemente.
En casos preferidos, los nanoportadores sintéticos comprenden un polímero tal como se describe en esta memoria. Estos nanoportadores sintéticos pueden ser completamente poliméricos o pueden ser una mezcla de polímeros y otros materiales.
En algunos casos, los polímeros de un nanoportador sintético se asocian para formar una matriz polimérica. En algunos de estos casos, un componente, tal como un inmunomodulador o antígeno, puede asociarse covalentemente con uno o más polímeros de la matriz polimérica. En algunos casos, la asociación covalente está mediada por un enlazador. En algunos casos, un componente puede asociarse de forma no covalente con uno o más polímeros de la matriz polimérica. Por ejemplo, en algunos casos, un componente puede encapsularse dentro, rodearse y/o dispersarse por una matriz polimérica. Alternativa o adicionalmente, un componente puede asociarse con uno o más polímeros de una matriz polimérica mediante interacciones hidrofóbicas, interacciones de carga, fuerzas de van der Waals, etc. Se conoce convencionalmente una amplia diversidad de polímeros y métodos para formar matrices poliméricas a partir de los mismos.
Los polímeros pueden ser polímeros naturales o no naturales (sintéticos). Los polímeros pueden ser homopolímeros o copolímeros que comprenden dos o más monómeros. En términos de secuencia, los copolímeros pueden ser aleatorios, de bloques o pueden comprender una combinación de secuencias aleatorias y de bloques. Típicamente, los polímeros son polímeros orgánicos.
En algunos casos, el polímero comprende un poliéster, policarbonato, poliamida o poliéter, o unidad de los mismos. En otros casos, el polímero comprende poli(etilenglicol) (PEG), polipropilenglicol, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o una policaprolactona, o unidad de los mismos. En algunos casos, se prefiere que el polímero sea biodegradable. Por lo tanto, en estos casos, se prefiere que, si el polímero comprende un poliéter, tal como poli(etilenglicol) o polipropilenglicol o unidad del mismo, el polímero comprenda un copolímero de bloque de un poliéter y un polímero biodegradable de manera que el polímero sea biodegradable. En otros casos, el polímero no comprende únicamente un poliéter o una unidad del mismo, tal como poli(etilenglicol) o polipropilenglicol o unidad del mismo.
Otros ejemplos de polímeros adecuados para uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a polietilenos, policarbonatos (p. ej., poli(1,3-dioxan-2-ona)), polianhídridos (p. ej., poli(anhídrido sebácico)), polipropilfumaratos, poliamidas (p. ej., policaprolactama), poliacetales, poliéteres, poliésteres (p. ej., polilactida, poliglicólido, polilactida-coglicólido, policaprolactona, polihidroxiácido (p. ej., poli(p-hidroxialcanoato)), poli(ortoésteres), policianoacrilatos, poli(alcoholes vinílicos), poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliureas, poliestirenos y poliaminas, polilisina, copolímeros de polilisina-PEG y copolímeros de poli(etilenimina), poli(etilenimina)-PEG.
En algunos casos, los polímeros incluyen polímeros que han sido aprobados para su uso en seres humanos por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) bajo 21 CFR § 177.2600, incluyendo, pero no limitados a poliésteres (p. ej., ácido poliláctico, poli(ácido láctico-co-glicólico), policaprolactona, polivalerolactona, poli(1,3-dioxan-2ona)); polianhídridos (p. ej., poli(anhídrido sebácico)); poliéteres (p. ej., polietilenglicol); poliuretanos; polimetacrilatos; poliacrilatos; y policianoacrilatos.
En algunos casos, los polímeros pueden ser hidrofílicos. Por ejemplo, los polímeros pueden comprender grupos aniónicos (p. ej., grupo fosfato, grupo sulfato, grupo carboxilato); grupos catiónicos (p. ej., grupo amina cuaternaria); o grupos polares (p. ej., grupo hidroxilo, grupo tiol, grupo amina). En algunos casos, un nanoportador sintético que comprende una matriz polimérica hidrofílica genera un entorno hidrofílico dentro del nanoportador sintético. En algunos casos, los polímeros pueden ser hidrofóbicos. En algunos casos, un nanoportador sintético que comprende una matriz polimérica hidrofóbica genera un entorno hidrofóbico dentro del nanoportador sintético. La selección de la hidrofilicidad o hidrofobicidad del polímero puede tener un impacto sobre la naturaleza de los materiales que se incorporan (p. ej., acoplados) dentro del nanoportador sintético.
En algunos casos, los polímeros se pueden modificar con uno o más restos y/o grupos funcionales. Puede utilizarse una diversidad de restos o grupos funcionales. En algunos casos, los polímeros pueden modificarse con polietilenglicol (PEG), con un hidrato de carbono y/o con poliacetales acíclicos derivados de polisacáridos (Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301). Se pueden utilizar las enseñanzas generales de la patente de EE.UU. N° 5543158 expedida a Gref et al., o la publicación WO WO2009/051837 expedida a Von Andrian et al.
En algunos casos, los polímeros pueden ser modificados con un lípido o grupo ácido graso. En algunos casos, un grupo ácido graso puede ser uno o más de los ácidos butírico, caproico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico, behénico o lignocérico. En algunos casos, un grupo ácido graso puede ser uno o más de los ácidos palmitoleico, oleico, vaccénico, linoleico, alfa-linoleico, gamma-linoleico, araquidónico, gadoleico, araquidónico, eicosapentaenoico, docosahexaenoico o erúcico.
En algunos casos, los polímeros pueden ser poliésteres, incluyendo copolímeros que comprenden unidades de ácido láctico y ácido glicólico, tales como poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) y poli(lactida-co-glicolida), a las que se alude colectivamente en esta memoria como "PLGA"; y homopolímeros que comprenden unidades de ácido glicólico, a las que se alude en esta memoria como "PGA", y unidades de ácido láctico, tales como ácido poli-L-láctico, ácido poli-D-láctico, ácido poli-D,L-láctico, poli-L-lactida, poli-D-lactida y poli-D,L-lactida, a las que se alude colectivamente en esta memoria como "PLA". En algunos casos, poliésteres ilustrativos incluyen, por ejemplo, polihidroxiácidos; copolímeros de PEG y copolímeros de lactida y glicólido (p. ej., copolímeros de PLA-PEG, copolímeros de PGA-PEG, copolímeros de PLGA-PEG y sus derivados. En algunos casos, los poliésteres incluyen, por ejemplo, poli(caprolactona), copolímeros de poli (caprolactona)-PEG, poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de serina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina), poli[ácido a-(4-aminobutil)-L-glicólico], y derivados de los mismos.
En algunos casos, un polímero puede ser PLGA. PLGA es un copolímero biocompatible y biodegradable de ácido láctico y ácido glicólico, y diversas formas de PLGA se caracterizan por la relación de ácido láctico:ácido glicólico. El ácido láctico puede ser ácido L-láctico, ácido D-láctico o ácido D,L-láctico. La tasa de degradación de PLGA se puede ajustar alterando la relación ácido láctico:ácido glicólico. En algunos casos, PLGA se caracteriza por una relación ácido láctico:ácido glicólico de aproximadamente 85:15, aproximadamente 75:25, aproximadamente 60:40, aproximadamente 50:50, aproximadamente 40:60, aproximadamente 25:75 o aproximadamente 15:85.
En algunos casos, los polímeros pueden ser uno o más polímeros acrílicos. En determinados casos, los polímeros acrílicos incluyen, por ejemplo, copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de metacrilato de aminoalquilo, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), copolímero de alquilamida de ácido metacrílico, poli(metacrilato de metilo), poli(anhídrido del ácido metacrílico), metacrilato de metilo, polimetacrilato, copolímero de poli(metacrilato de metilo), poliacrilamida, copolímero de metacrilato de aminoalquilo, copolímeros de metacrilato de glicidilo, policianoacrilatos y combinaciones que comprenden uno o más de los polímeros anteriores. El polímero acrílico puede comprender copolímeros completamente polimerizados de ésteres de ácido acrílico y metacrílico con un bajo contenido de grupos amonio cuaternario.
En algunos casos, los polímeros pueden ser polímeros catiónicos. En general, los polímeros catiónicos pueden condensar y/o proteger cadenas de ácidos nucleicos cargadas negativamente (p. ej., ADN o derivados del mismo). Polímeros que contienen amina, tales como poli(lisina) (Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; y Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7), poli(etilenimina) (PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297) y dendrímeros de poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; y Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372) están cargados positivamente a pH fisiológico, forman pares de iones con ácidos nucleicos y median en la transfección en una diversidad de líneas celulares. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden no comprender (o pueden excluir) polímeros catiónicos.
En algunos casos, los polímeros pueden ser poliésteres degradables que portan cadenas laterales catiónicas (Putnam et al, 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al, 1993, J. Am. Chem Soc., 115:11.010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633; y Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23: 3399). Ejemplos de estos poliésteres incluyen poli(L-lactida-co-L-lisina) (Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010), poli(éster de serina) (Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; y Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633) y poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; y Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633).
Las propiedades de estos y otros polímeros y métodos para prepararlos son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 6.123.727; 5.804.178; 5.770.417; 5.736.372; 5.716.404; 6.095.148; 5.837.752; 5.902.599; 5.696.175; 5.514.378; 5.512.600; 5.399.665; 5.019.379; 5.010.167; 4.806.621; 4.638.045; y 4.946.929; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; y Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181). De manera más general, se describe una diversidad de métodos para sintetizar determinados polímeros adecuados en Concise Encyclopedia of Polymer Science y Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. por Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization de Odian, John Wiley & Sons, Cuarta Edición, 2004; Contemporary Polymer Chemistry de Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; y en las patentes de EE.UU. 6.506.577, 6.632.922, 6.686.446 y 6.818.732.
En algunos casos, los polímeros pueden ser polímeros lineales o ramificados. En algunos casos, los polímeros pueden ser dendrímeros. En algunos casos, los polímeros se pueden reticular sustancialmente entre sí. En algunos casos, los polímeros pueden estar sustancialmente libres de enlaces cruzados. En algunos casos, los polímeros se pueden utilizar sin sufrir una etapa de reticulación. Además, debe entenderse que los nanoportadores sintéticos pueden comprender copolímeros de bloques, copolímeros de injerto, combinaciones, mezclas y/o aductos de cualquiera de los polímeros anteriores y otros. Los expertos en la técnica reconocerán que los polímeros enumerados en esta memoria representan una lista ilustrativa, no exhaustiva, de polímeros que pueden ser útiles.
En algunos casos, los nanoportadores sintéticos no comprenden un componente polimérico. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos pueden comprender partículas metálicas, puntos cuánticos, partículas de material cerámico, etc. En algunos casos, un nanoportador sintético no polimérico es un agregado de componentes no poliméricos, tal como un agregado de átomos metálicos (p. ej., átomos de oro).
Composiciones pueden comprender nanoportadores sintéticos en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como conservantes, tampones, solución salina o solución salina tamponada con fosfato. Las composiciones se pueden preparar utilizando técnicas de fabricación y composición farmacéuticas convencionales para llegar a formas de dosificación útiles. En un caso, los nanoportadores sintéticos se suspenden en una solución salina estéril para inyección junto con un conservante.
En algunos casos, cuando se preparan nanoportadores sintéticos como portadores, los métodos para el acoplamiento de componentes a las nanoportadores sintéticos pueden ser útiles. Si el componente es una molécula pequeña, puede resultar ventajoso unir el componente a un polímero antes del ensamblaje de los nanoportadores sintéticos. En algunos casos, también puede ser una ventaja preparar los nanoportadores sintéticos con grupos de superficie que se utilizan para acoplar el componente al nanoportador sintético mediante el uso de estos grupos de superficie en lugar de unir el componente a un polímero y luego utilizar este polímero conjugado en la construcción de nanoportadores sintéticos.
En determinados casos, el acoplamiento puede ser un enlazador covalente. En algunos casos, los péptidos se pueden acoplar covalentemente a la superficie externa a través de un enlazador de 1,2,3-triazol formado por la reacción de cicloadición 1,3-dipolar de grupos azido en la superficie del nanoportador con antígeno o inmunomodulador que contiene un grupo alquino o por la reacción de cicloadición 1,3-dipolar de alquinos en la superficie del nanoportador con antígenos o inmunomoduladores que contienen un grupo azido. Reacciones de cicloadición de este tipo se llevan a cabo preferiblemente en presencia de un catalizador de Cu(I) junto con un ligando de Cu(I) adecuado y un agente reductor para reducir el compuesto de Cu(II) a un compuesto de Cu(I) catalítico activo. Esta cicloadición de azidaalquino catalizada por Cu(I) (CuAAC) también puede denominarse reacción de clic.
Adicionalmente, el acoplamiento covalente puede comprender un enlazador covalente que comprende un enlazador de amida, un enlazador de disulfuro, un enlazador de tioéter, un enlazador de hidrazona, un enlazador de hidrazida, un enlazador de imina u oxima, un enlazador de urea o tiourea, un enlazador de amidina, un enlazador de amina y un enlazador de sulfonamida.
Un enlazador de amida se forma a través de un enlace amida entre una amina en un componente tal como un antígeno o inmunomodulador con el grupo ácido carboxílico de un segundo componente, tal como el nanoportador. El enlace amida en el enlazador se puede preparar utilizando cualquiera de las reacciones de formación de enlaces amida convencionales con aminoácidos adecuadamente protegidos y ácido carboxílico activado, tal como éster activado con N-hidroxisuccinimida.
Un enlazador de disulfuro se hace a través de la formación de un enlace disulfuro (S-S) entre dos átomos de azufre de la forma, por ejemplo, R1-S-S-R2. Se puede formar un enlace disulfuro mediante el intercambio de tiol de un componente que contiene un grupo tiol/mercaptano (-SH) con otro grupo tiol activado en un polímero o nanoportador o un nanoportador que contiene grupos tiol/mercaptano con un componente que contiene un grupo tiol activado.
Un enlazador de triazol, específicamente un 1,2,3-triazol de la forma
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en donde R1 y R2 pueden ser cualesquiera entidades químicas, se hace por la reacción de cicloadición 1,3-dipolar de una azida unida a un primer componente, tal como el nanoportador con un alquino terminal unido a un segundo componente, tal como el inmunomodulador o antígeno. La reacción de cicloadición 1,3-dipolar se realiza con o sin un catalizador, preferiblemente con catalizador de Cu(I), que enlaza los dos componentes a través de una función 1,2,3-triazol. Esta química se describe en detalle por Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41 (14), 2596, (2002) y Meldal, et al, Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015 y a menudo se la alude como una reacción de "clic" o CuAAC.
En algunos casos, se prepara un polímero que contiene un grupo azida o alquino, terminal a la cadena polimérica. Este polímero se utiliza luego para preparar un nanoportador sintético de tal manera que una pluralidad de grupos alquino o azida se colocan en la superficie de ese nanoportador. Alternativamente, el nanoportador sintético puede prepararse por otra ruta y posteriormente funcionalizarse con grupos alquino o azida. El componente se prepara con la presencia de un grupo alquino (si el polímero contiene una azida) o un grupo azida (si el polímero contiene un alquino). A continuación, se deja que el componente reaccione con el nanoportador mediante la reacción de cicloadición 1,3-dipolar con o sin un catalizador que acopla covalentemente el componente a la partícula a través del enlazador 1,2,3-triazol 1,4-disustituido.
Un enlazador de tioéter se hace mediante la formación de un enlace azufre-carbono (tioéter) en la forma, por ejemplo, R1-S-R2. El tioéter se puede preparar mediante la alquilación de un grupo tiol/mercaptano (-SH) en un componente con un grupo alquilante tal como haluro o epóxido en un segundo componente. Los enlazadores de tioéter también pueden formarse mediante la adición de Michael de un grupo tiol/mercaptano en un componente a un grupo alqueno deficiente en electrones en un segundo componente que contiene un grupo maleimida o un grupo vinilsulfona como el aceptor de Michael. De otra forma, los enlazadores de tioéter se pueden preparar mediante la reacción radical tioleno de un grupo tiol/mercaptano en un componente con un grupo alqueno en un segundo componente.
Un enlazador de hidrazona se prepara mediante la reacción de un grupo hidrazida en un componente con un grupo aldehído/cetona en el segundo componente.
Un enlazador de hidrazida se forma por la reacción de un grupo hidrazina en un componente con un grupo ácido carboxílico en el segundo componente. Una reacción de este tipo se realiza generalmente utilizando una química similar a la formación de un enlace amida, en que el ácido carboxílico se activa con un reactivo activador.
Un enlazador de imina u oxima se forma por la reacción de un grupo amina o N-alcoxiamina (o aminooxi) en un componente con un aldehído o grupo cetona en el segundo componente.
Un enlazador de urea o tiourea se prepara mediante la reacción de un grupo amina en uno de los componentes con un grupo isocianato o tioisocianato en el segundo componente.
Un enlazador de amidina se prepara por la reacción de un grupo amina en un componente con un grupo imidoéster en el segundo componente.
Un enlazador de amina se hace mediante la reacción de alquilación de un grupo amina en un componente con un grupo alquilante tal como haluro, epóxido, o grupo éster de sulfonato en el segundo componente. Alternativamente, también se puede preparar un enlazador de amina mediante aminación reductora de un grupo amina en un componente con un grupo aldehído o cetona en el segundo componente con un reactivo reductor adecuado, tal como cianoborohidruro de sodio o triacetoxiborohidruro de sodio.
Un enlazador de sulfonamida se hace mediante la reacción de un grupo amina en un componente con un grupo haluro de sulfonilo (tal como cloruro de sulfonilo) en el segundo componente.
Un enlazador de sulfona se hace por adición de Michael de un nucleófilo a una vinilsulfona. La vinilsulfona o el nucleófilo pueden estar en la superficie del nanoportador o fijados a un componente.
El componente también puede conjugarse al nanoportador a través de métodos de conjugación no covalentes. Por ejemplo, un antígeno o inmunomodulador cargado negativamenmte se puede conjugar con un nanoportador cargado positivamente mediante adsorción electrostática. Un componente que contiene un ligando metálico también se puede conjugar con un nanoportador que contiene un complejo metálico mediante un complejo de metal-ligando.
En algunos casos, el componente puede estar fijado a un polímero, por ejemplo, ácido poliláctico-bloquepolietilenglicol, antes del ensamblaje del nanoportador sintético o el nanoportador sintético se puede formar con grupos reactivos o activables en su superficie. En este último caso, el componente puede prepararse con un grupo que sea compatible con la química de unión que se presenta por la superficie de los nanoportadores sintéticos. En otros casos, se puede unir un componente peptídico a VLPs o liposomas utilizando un enlazador adecuado. Un enlazador es un compuesto o reactivo capaz de acoplar dos moléculas. En un caso, el enlazador puede ser un reactivo homobifuncional o heterobifuncional tal como se describe en Hermanson 2008. Por ejemplo, un nanoportador sintético de VLP o liposomas que contiene un grupo carboxílico en la superficie se puede tratar con un enlazador homobifuncional, dihidrazida adípica (ADH), en presencia de EDC para formar el nanoportador sintético correspondiente con el enlazador ADH. El nanoportador sintético unido a ADH resultante se conjuga luego con un componente peptídico que contiene un grupo ácido a través del otro extremo del enlazador ADH en NC para producir el correspondiente conjugado de VLP o péptido liposómico.
Para una descripción detallada de métodos de conjugación disponibles, véase Hermanson GT "Bioconjugate Techniques", 2a edición publicada por Academic Press, Inc., 2008. Además de la unión covalente, el componente puede acoplarse mediante adsorción a un nanoportador sintético pre-conformado o puede acoplarse mediante encapsulación durante la formación del nanoportador sintético.
Antígenos modificados
En algunos casos, uno cualquiera de las composiciones citadas y/o los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno enumeradas puede comprender un antígeno modificado, en donde la modificación puede servir a una diversidad de propósitos, incluyendo pero no limitado a una estabilidad incrementada de la circulación (tal como pegilación de antígenos proteicos o peptídicos), sensibilidad reducida a la degradación de la peptidasa (tal como la sustitución de aminoácidos naturales por aminoácidos no naturales) y para potenciar el rendimiento tolergénico (tal como la unión a los eritrocitos).
En un caso preferido, el antígeno modificado comprende una proteína de fusión que comprende un antígeno de interés condensado con un resto de unión que une eritrocitos. Un ejemplo de un resto de unión de este tipo comprende un péptido sintético de 12 aa (ERY1) descrito en la bibliografía como H2N-WMVLPWLPGTLDGGSGCRGCONH2 (SEQ ID NO: 1), que incluye una secuencia 12 mera descrita en la bibliografía como un aglutinante de glicoforina-A de ratón. Se describió que la región GGSG sirve como un enlazador para el residuo de cisteína utilizado para la conjugación, y se describió que el residuo de arginina flanqueante sirve para reducir el pKa y, por tanto, aumentar la reactividad del residuo de cisteína. En otro caso, se puede generar una proteína de fusión que comprende el antígeno de interés condensado con un resto de unión tal como un resto de unión a glicoforina A murina o un resto equivalente de este tipo para otras especies (p. ej., seres humanos). En un caso específico, el Ab TER-119 de unión a glucoforina A murina, o fragmentos del mismo (como un scFv de TER-119, se pueden fusionar con el antígeno de interés. Véase, en general, S. Kontos et al., "Engineering antigens for in situ erythrocyte binding induces T-cell deletion" Proc Natl Acad Sci USA. 2 de enero de 2013; 110(1 ):E60-8 ("Kontsos"). Se pueden generar restos de unión de eritrocitos adicionales utilizando la presentación de fagos o enfoques de fragmentos mAb/mAb generalmente descritos en el Artículo de Kontos y en la bibliografía relevante.
Antígenos modificados se pueden formular en una diversidad de formas, para la administración utilizando una diversidad de rutas. Enfoques de formulación apropiados y las rutas útiles se describen en otra parte de esta memoria y se pueden aplicar a composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno de acuerdo con la presente divulgación.
Antígeno expresado:
En algunos casos, las composiciones enumeradas y/o los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno enumerados pueden comprender un antígeno expresado, en donde el antígeno expresado se expresa después de la administración de una construcción genética, preferiblemente una construcción genética no altamente inmunogénica. Ejemplos de construcciones genéticas de este tipo se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a inyección directa, liposomal, lípido catiónico; o partículas condensadas de ADN/ARN, o suministro por pistola de genes de: diversas construcciones que comprenden ADN o ARN; plásmidos; o ADN o ARN desnudo (que incluye ADNc, ARN mensajero, ARN mensajero modificado y formas de ARNi). Véase, en general, J. R. Ohlfest et al., "Phenotypic correction and long-term expression of factor VIII in hemophilic mice by immunotolerization and nonviral gene transfer using the Sleeping Beauty transposon system" Blood 2005;105:2691-2698; A Tautzenberger et al., "Nanoparticles and their potential for application in bone" Int’l. J. of Nanomedicine 2012:74545-4557. Los ARN mensajeros modificados, incluyendo la inyección directa de los mismos, se describen en la solicitud de patente de EE.UU. publicada 2013/0115272 expedida a de Fougerolles et al. y en la solicitud de patente de EE.UU. publicada 2012/0251618 expedida a Schrum et al. Cualquiera de las proteínas enumeradas en otra parte de esta memoria, o conocidas generalmente en la técnica, se puede considerar para su suministro en el contexto de un antígeno expresado.
Los antígenos expresados se pueden formular de diversas formas, para la administración utilizando diversas vías. Enfoques de formulación apropiados y rutas útiles se describen en otra parte de esta memoria y se pueden aplicar a composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno de acuerdo con la presente divulgación.
Antígenos
Antígenos útiles en la práctica de la presente invención se pueden seleccionar de una amplia gama de antígenos, incluidos los antígenos exógenos y endógenos.
Antígenos exógenos
Los antígenos exógenos, tal como se indica en otra parte de esta memoria, pueden comprender proteínas terapéuticas, antígenos modificados y antígenos expresados.
Las proteínas terapéuticas pueden comprender cualquiera de las proteínas terapéuticas, o fragmentos o derivados de las mismas, descritos en esta memoria. Proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a proteínas terapéuticas infusibles, enzimas, cofactores enzimáticos, hormonas, factores de coagulación de la sangre, citoquinas e interferones, factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales, y proteínas asociadas con la enfermedad de Pompe (p. ej., alglucosidasa alfa, rhGAA (p. ej., Myozyme y Lumizyme (Genzyme)) (p. ej., que se administran a un sujeto como terapia de reemplazo). Las proteínas terapéuticas también incluyen proteínas implicadas en la cascada de coagulación sanguínea. Las proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a Factor VIII, Factor VII, Factor IX, Factor V, Factor von Willebrand, Factor von Heldebrant, activador del plasminógeno tisular, insulina, hormona del crecimiento, eritropoyetina alfa, VEGF, trombopoyetina, lisozima y antitrombina. Proteínas terapéuticas también incluyen adipocinas, tales como leptina y adiponectina. Otros ejemplos de proteínas terapéuticas son como se describe a continuación y en otras partes de esta memoria. También se incluyen fragmentos o derivados de cualquiera de los proteínas terapéuticas descritas como el antígeno.
Ejemplos de proteínas terapéuticas utilizadas en la terapia de reemplazo enzimático de sujetos que tienen un trastorno de almacenamiento lisosómico incluyen, pero no se limitan a imiglucerasa para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher (p. ej., CEREZYME™), a-galactosidasa A (a-gal A) para el tratamiento de la enfermedad de Fabry (p. ej., agalsidasa beta, FABRYZYME™) , a-glucosidasa ácida (GAA) para el tratamiento de la enfermedad de Pompe (p. ej., alglucosidasa alfa, LUMIZYME™, MYOZYME™), arilsulfatasa B para el tratamiento de mucopolisacaridosis (p. ej., laronidasa, ALDURAZYME™, idursulfasa, ELAPRASE™, arilsulfatasa B, NAGLAZYME™).
Ejemplos de enzimas incluyen oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas.
Ejemplos de hormonas incluyen melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina), serotonina, tiroxina (o tetrayodotironina) (una hormona tiroidea), triyodotironina (una hormona tiroidea), epinefrina (o adrenalina), norepinefrina (o noradrenalina), Dopamina (u hormona inhibidora de la prolactina), hormona antimulleriana (o factor u hormona inhibidora de Muller), adiponectina, hormona adrenocorticotrópica (o corticotropina), angiotensinógeno y angiotensina, hormona antidiurética (o vasopresina, arginina vasopresina) o péptido atrio-natriurético, calcitonina, colecistoquinina, hormona liberadora de corticotropina, eritropoyetina, hormona estimulante del folículo, gastrina, grelina, glucagón, péptido similar al glucagón (GLP-1), GIP, hormona liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de hormona del crecimiento, hormona coriónica humana, gonadotropina lactógeno placentario humano, hormona del crecimiento, inhibina, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina (o somatomedina), leptina, hormona luteinizante, hormona estimulante de melanocitos, orexina, oxitocina, hormona paratiroidea, prolactina, relaxina, secretina, somatostatina, trombopoyetina, hormona estimulante del tiroides (o tirotropina), hormona liberadora de tirotropina, cortisol, aldosterona, testosterona, deshidroepiandrosterona, androstenodiona, dihidrotestosterona, estradiol, estorna, estriol, progesterona, calcitriol (1,25-dihidroxivitamina D3), calcidiol (25-hidroxivitamina D3), prostaglandinas, leucotrienos, prostaciclina, tromboxano, hormona liberadora de prolactina, lipotropina, péptido natriurético cerebral, neuropéptido Y, histamina, endotelina, polipéptido pancreático, renina y encefalina.
Ejemplos de sangre y factores de coagulación de la sangre incluyen Factor I (fibrinógeno), Factor II (protrombina), factor tisular, Factor V (proaccelerina, factor lábil), Factor VII (factor estable, proconvertina), Factor VI 1 (globulina antihemofílica), Factor IX (factor Christmas o componente de tromboplastina plasmática), Factor X (factor de Stuart-Prower), Factor Xa, Factor XI, Factor XII (factor de Hageman), Factor XIII (factor estabilizador de fibrina), factor von Willebrand, precalicreína (factor de Fletcher), cininógeno de alto peso molecular (HMWK) (factor de Fitzgerald), fibronectina, fibrina, trombina, antitrombina III, cofactor de heparina II, proteína C, proteína S, proteína Z, inhibidor de proteasa relacionado con proteína Z (ZPI), plasminógeno, alfa 2-antiplasmina, activador tisular del plasminógeno (tPA), uroquinasa, inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI1), inhibidor del activador del plasminógeno-2 (PAI2), procoagulante del cáncer y epoetina alfa (Epogen, Procrit).
Ejemplos de citoquinas incluyen linfoquinas, interleuquinas y quimioquinas, citoquinas de tipo 1, tales como I FN-y, TGF-p, y citoquinas de tipo 2, tales como IL-4, IL-10 e IL-13.
Ejemplos de factores de crecimiento incluyen adrenomedulina (AM), angiopoyetina (Ang), factor de motilidad autocrina, proteínas morfogenéticas óseas (BMPs), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina (EPO), Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de diferenciación del crecimiento 9 (GDF9), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado de hepatoma (HDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor estimulante de la migración, miostatina (GDF-8), factor de crecimiento nervioso (NGF) y otras neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), vía de señalización Wnt, factor de crecimiento placentario (PlGF), [(somatotropina bovina fetal)] (FBS), IL-1, I L-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-7.
Ejemplos de anticuerpos monoclonales incluyen Abagovomab, Abciximab, Adalimumab, Adecatumumab, Afelimomab, Afutuzumab, Alacizumab pegol, ALD, Alemtuzumab, Altumomab pentetato, Anatumomab mafenatox, Anrukinzumab, globina anti-timocitos, Apolizumab, Arcitumomab, Aselizumab, Atlizumab (tocilizumab), Atorolimumab, Bapineuzumab, Basiliximab, Bavituximab, Bectumomab, Belimumab, Benralizumab, Bertilimumab, Besilesomab, Bevacizumab, Biciromab, Bivatuzumab mertansina, Blinatumomab, Brentuximab vedotina, Briakinumab, Canakinumab, Cantuzumab mertansina, Capromab pendetida, Catumaxomab, Cedelizumab, Certolizumab pegol, Cetuximab, Citatuzumabbogatox, Cixutumumab, Clenoliximab, Clivatuzumab tetraxetano, Conatumumab, Dacetuzumab, Daclizumab, Daratumumab, Denosumab, Detumomab, Dorlimomab aritox, Dorlixizumab, Ecromeximab, Eculizumab, Edobacomab, Edrecolomab, Efalizumab, Efungumab, Elotuzumab, Elsilimomab, Enlimomab pegol, Epitumomab cituxetano, Epratuzumab, Erlizumab, Ertumaxomab, Etaracizumab, Exbivirumab, Fanolesomab, Faralimomab, Farletuzumab, Felvizumab, Fezakinumab, Figitumumab, Fontolizumab, Foravirumab, Fresolimumab, Galiximab, Gantenerumab, Gavilimomab, Gemtuzumab ozogamicina, GC1008, Girentuximab, Glembatumumab vedotina, Golimumab, Gomiliximab, Ibalizumab, Ibritumomab tiuxetano, Igovomab, Imciromab, Infliximab, Intetumumab, Inolimomab, Inotuzumab ozogamicina, Ipilimumab, Iratumumab, Keliximab, Labetuzumab, Lebrikizumab, Lemalesomab, Lerdelimumab, Lexatumumab, Libivirumab, Lintuzumab, Lorvotuzumab mertansina, Lucatumumab, Lumiliximab, Mapatumumab, Maslimomab, Matuzumab, Mepolizumab, Metelimumab, Milatuzumab, Minretumomab, Mitumomab, Morolimumab, Motavizumab, Muromonab-CD3, Nacolomab tafenatox, Naptumomab estafenatox, Natalizumab, Nebacumab, Necitumumab, Nerelimomab, Nimotuzumab, Nofetumomab merpentano, Ocrelizumab, Odulimomab, Ofatumumab, Olaratumab, Omalizumab, Oportuzumab monatox, Oregovomab, Otelixizumab, Pagibaximab, Palivizumab, Panitumumab, Panobacumab, Pascolizumab, Pemtumomab, Pertuzumab, Pexelizumab, Pintumomab, Priliximab, Pritumumab, Rafivirumab, Ramucirumab, Ranibizumab, Raxibacumab, Regavirumab, Reslizumab, Rilotumumab, Rituximab, Robatumumab, Rontalizumab, Rovelizumab, Ruplizumab, Satumomab pendetida, Sevirumab, Sibrotuzumab, Sifalimumab, Siltuximab, Siplizumab, Solanezumab, Sonepcizumab, Sontuzumab, Stamulumab, Sulesomab, Tacatuzumab tetraxetano, Tadocizumab, Talizumab, Tanezumab, Taplitumomab paptox, Tefibazumab, Telimomab aritox, Tenatumomab, Teneliximab, Teplizumab, Ticilimumab (tremelimumab), Tigatuzumab, Tocilizumab (atlizumab), Toralizumab, Tositumomab, Trastuzumab, Tremelimumab, Tucotuzumab celmoleuquina, Tuvirumab, Urtoxazumab, Ustekinumab, Vapaliximab, Vedolizumab, Veltuzumab, Vepalimomab, Visilizumab, Volociximab, Votumumab, Zalutumumab, Zanolimumab, Ziralimumab y Zolimomab aritox.
Ejemplos de terapia de infusión o proteínas terapéuticas inyectables incluyen, por ejemplo, Tocilizumab (Roche/Actemra®), alfa-1 antitripsina (Kamada/AAT), Hematide® (Affymax y Takeda, péptido sintético), albinterferón alfa-2b (Novartis/Zalbin™), Rhucin® (Pharming Group, terapia de reemplazo del inhibidor de C1), tesamorelina (Theratechnologies/Egrifta, factor de liberación de hormona de crecimiento sintético), ocrelizumab (Genentech, Roche y Biogen), belimumab (GlaxoSmithKline/Benlysta®), pegloticasa (Savient Pharmaceuticals/Krystexxa™), pegsiticasa, taliglucerasa alfa (Protalix/Uplyso), agalsidasa alfa (Shire/Replagal®), velaglucerasa alfa (Shire).
Proteínas terapéuticas adicionales útiles de acuerdo con aspectos de esta invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica, y la invención no está limitada en este respecto.
Antígenos exógenos adicionales pueden comprender antígenos modificados o antígenos expresados.
Antígenos modificados, tales como construcciones de fusión entre un antígeno de interés y un resto que fija como objetivo eritrocitos, se han descrito en otra parte en esta memoria y pueden ser útiles en la práctica de la presente invención.
Antígenos expresados, tales como los antígenos generados por la administración de vectores de genes no inmunogénicos o poco inmunogénicos, ADN plasmídico, ácidos nucleicos (p. ej., ADN o ARN), o ácidos nucleicos modificados, se han descrito en otra parte de esta memoria y pueden ser útiles en la práctica de la presente invención.
Antígenos endógenos
Algunas composiciones descritas en esta memoria comprenden antígenos que son antígenos endógenos. Los antígenos endógenos comprenden autoantígenos, tales como los que se encuentran en enfermedades autoinmunes. Autoantígenos incluyen, pero no se limitan a los que se encuentran en la espondilitis anquilosante; pénfigo buloso; artritis reumatoide; esclerosis múltiple; diabetes, que incluye, pero no se limita a diabetes mellitus insulino-dependiente, diabetes mellitus, diabetes juvenil, diabetes autoinmune espontánea, diabetes mellitus inmuno-mediada o de Tipo I; excema; enfermedad inflamatoria del intestino (p. ej., enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa), tal como enfermedad inflamatoria del intestino autoinmune; lupus o lupus eritematoso sistémico; esclerosis múltiple; cirrosis biliar primaria; psoriasis; sarcoidosis; esclerosis sistémica; esclerodermia; tiroiditis; enfermedad tiroidea autoinmune; tiroiditis de Hashimoto; tirotoxicosis; alopecia areata; enfermedad de Grave; síndrome de Guillain-Barré; enfermedad celíaca; síndrome de Sjogren; fiebre reumática; gastritis, gastritis atrófica autoinmune; hepatitis autoinmune; insulitis; ooforitis; orquitis; uveítis; uveítis facogénica; miastenia grave; mixedema primario; anemia perniciosa; colangitis esclerosante primaria; anemia hemolítica autoinmune; enfermedad de Addison; esclerodermia; síndrome de Goodpasture; nefritis, por ejemplo, glomerulonefritis; psoriasis; pénfigo vulgar; penfigoide; oftalmía simpática; púrpura trombocitopénica idiopática; feucopenia idiopática; granulomatosis de Wegener y poli/dermatomiositis.
Algunas enfermedades adicionales ejemplares autoinmunes, autoantígenos asociados, y autoanticuerpos, que se contemplan, se describen en la Tabla 1 que figura a continuación:
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Antígenos endógenos también pueden incluir los asociados con tejido trasplantado, tales como trasplante de órgano sólido o trasplante de médula ósea. La enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) es una complicación que puede ocurrir después de un trasplante de células pluripotentes (p. ej., células madre) o de médula ósea, en el que el material recién trasplantado da como resultado un ataque al cuerpo del receptor del trasplante. En algunos casos, la GVHD se produce después de una transfusión de sangre.
Antígenos endógenos adicionales comprenden antígenos asociados con enfermedades inflamatorias. Dichos antígenos incluyen, pero no se limitan a aquellos asociados con el Alzheimer, artritis, asma, aterosclerosis, enfermedad de Crohn, colitis, fibrosis quística, dermatitis, diverticulitis, hepatitis, síndrome del intestino irritable (IBS), lupus eritematoso, distrofia muscular, nefritis, Parkinson, herpes y colitis ulcerosa. Antígenos asociados a enfermedades inflamatorias también incluyen, por ejemplo, los asociados con enfermedad cardiovascular, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), bronquiectasia, colecistitis crónica, tuberculosis, tiroiditis de Hashimoto, sarcoidosis, silicosis.
En algunos casos, los antígenos endógenos pueden ser los asociados con la enfermedad inflamatoria del intestino no autoinmune, adherencias post-quirúrgicas, enfermedad de la arteria coronaria, fibrosis hepática, síndrome de dificultad respiratoria aguda, pancreatitis inflamatoria aguda, pancreatitis inducida por colangiopancreatografía retrógrada endoscópica, quemaduras, aterogénesis de arterias coronarias, cerebrales y periféricas, apendicitis, colecistitis, diverticulitis, trastornos fibróticos viscerales, cicatrización de heridas, trastornos de la cicatrización de la piel (queloides, hidradenitis supurativa), trastornos granulomatosos (sarcoidosis, cirrosis biliar primaria), asma, pioderma gandrenoso, síndrome de Sweet, enfermedad de Behcet o colangitis esclerosante primaria.
Inmunomoduladores
Inmunomoduladores exógenos
Inmunomoduladores exógenos incluyen, pero no se limitan a, estatinas; inhibidores de mTOR, tales como rapamicina o un análogo de rapamicina; agentes de señalización de TGF-p ; agonistas del receptor de TGF-p; inhibidores de histona desacetilasa (HDAC); corticosteroides; inhibidores de la función mitocondrial, tales como rotenona; Inhibidores de P38; Inhibidores de NF-Kp; ligandos del receptor de lectina (p. ej., CD22); agonistas del receptor de adenosina; agonistas de prostaglandina E2; inhibidores de fosfodiesterasa, tales como inhibidor de fosfodiesterasa 4; inhibidores del proteasoma; inhibidores de quinasas; agonistas del receptor acoplado a proteína G; antagonistas del receptor acoplado a proteína G; glucocorticoides; retinoides; inhibidores de citoquinas; inhibidores del receptor de citoquinas; activadores del receptor de citoquinas; antagonistas del receptor activado por el proliferador de peroxisomas; agonistas del receptor activado por el proliferador de peroxisomas; inhibidores de histona desacetilasa; inhibidores de calcineurina; inhibidores de fosfatasa y ATPs oxidados. Inmunomoduladores también incluyen IDO, vitamina D3, ciclosporina A, inhibidores del receptor de hidrocarburos de arilo, resveratrol, azatiopurina, 6-mercaptopurina, aspirina, ácido niflúmico, estriol, tripolida, interleuquinas (p. ej., IL-1, IL-10), ciclosporina A, ARNip que fija como objetivo citoquinas o receptores de citoquinas.
Ejemplos de estatinas incluyen atorvastatina (LIPITOR®, TORVAST®), cerivastatina, fluvastatina (LESCOL®, LEs Co L® XL), lovastatina (MEVACOR®, ALTo Co R®, AlTo PREV®), mevastatina (COMPACTIN®), pitavastatina (LIVALO®), PIAVA®), rosuvastatina (PRAVACHOL®, SELEKTINE®, LIPOSTAT®), rosuvastatina (CRESTOR®) y simvastatina (ZOCOR®, LIPEX®).
Ejemplos de inhibidores de mTOR incluyen rapamicina y análogos de la misma (p. ej., CCL-779, RAD001, AP23573, C20-metalilrapamicina (C20-Marap), C16-(S)-butilsulfonamidorapamicina (C16-BSrap), C16-(S)-3-metilindolrapamicina (C16- iRap) (Bayle et al. Chemistry & Biology 2006, 13:99-107)), AZD8055, BEZ235 (n V p -BEZ235), ácido crisofánico (crisofanol), deforolimus (MK-8669), everolimus (RAD0001), KU-0063794, PI-103, PP242, temsirolimus y WYE-354 (disponibles de Selleck, Houston, TX, EE.UU.).
Ejemplos de agentes de señalización de TGF-p incluyen ligandos de TGF-p (p. ej., activina A, GDF1, GDF11, proteínas morfogénicas óseas, nodal, TGF-ps) y sus receptores (p. ej., ACVR1B, ACVR1C, ACVR2A, ACVR2B, BMPR2, BMPR1A, BMPR1B, TGFpRI, TGFpRII), R-SMADS/co-SMADS (p. ej., SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD5, SMAD8) e inhibidores de ligandos (p. ej., folistatina, nogina, cordina, DAN, lefty, LTBP1, THBS1, Decorina).
Ejemplos de inhibidores de la función mitocondrial incluyen atractilosido (sal dipotásica), ácido bongkrekico (sal de triamonio), cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona, carboxiatractilósido (p. ej., de Atractylis gummifera), CGP-37157, (-)-Deguelina (p. ej., de Mundulea sericea), F16, péptido del dominio de unión de VDAC de hexoquinasa II, oligomicina, rotenona, Ru360, SFK1 y valinomicina (p. ej., de Streptomyces fulvissimus) (EMD4Biosciences, EE.UU.).
Ejemplos de inhibidores de P38 incluyen SB-203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)1H-imidazol), SB-239063 (trans-1 -(4hidroxiciclohexil))-4-(fluorofenil)-5-(2-metoxi-pirimidin-4-il)imidazol), SB-220025 (5-(2-amino-4-pirimidinil)-4-(4-fluorofenil)-1 -(4-piperidinil)imidazol)) y ARRY-797.
Ejemplos de inhibidores de NF (p. ej., NK-Kp) incluyen IFRD1, 2-(1,8-naftiridin-2-il)fenol, ácido 5-aminosalicílico, BAY 11-7082, BAY 11-7085, CAPE (Éster fenetílico del ácido cafeico), maleato de dietilo, inhibidor IV de IKK-2, IMD 0354, lactacistina, MG-132 [Z-Leu-Leu-Leu-CHO], inhibidor III de la activación de NFkB, inhibidor de la activación II de NF-KB, JSH-23, partenólido, óxido de fenilarsina (PAO), PPM-18, sal de amonio del ácido pirrolidinditiocarbámico, QNZ, RO 106-9920, rocaglamida, rocaglamida AL, rocaglamida C, rocaglamida I, rocaglamida J, rocaglaol, (R)-MG-132, salicilato de sodio, triptolida (PG490), wedelolactona.
Ejemplos de ligandos del receptor de lectina incluyen ligandos de CD22, tales como los 9-azido-9-desoxisialiloligosacáridos y otros ligandos de CD22 descritos en B. E. Collins et. al. "High-Affinity Ligand Probes of CD22 Overcome the Threshold Set by cis Ligands to Allow for Binding, Endocytosis, and Killing of B Cells" J. Immunol 1 de septiembre, 2006 vol. 177 n° 5 2994-3003; y los ligandos descritos en G-J Boons, "Liposomes Modified by Carbohydrate Ligands can Target B cells for the Treatment of B-Cell Lymphomas" Expert Rev Vaccines. Noviembre de 2010; 9(11):1251 -1256).
Ejemplos de agonistas del receptor de adenosina incluyen CGS-21680 y ATL-146e.
Ejemplos de agonistas de prostaglandina E2 incluyen E-Prostanoide 2 y E-Prostanoide 4.
Ejemplos de inhibidores de fosfodiesterasa (inhibidores no selectivos y selectivos) incluyen cafeína, aminofilina, IBMX (3-isobutil-1-metilxantina), paraxantina, pentoxifilina, teobromina, teofilina, xantinas metiladas, vinpocetina, EHNA (eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil)adenina), anagrelida, enoximona (PERFAN™), milrinona, levosimendón, mesembrina, ibudilast, piclamilast, luteolina, drotaverina, roflumilast (DAXAS™, DALIReSp™), sildenafil (REVATION®, VIAGRA®), tadalafil (ADCIRCA®, CIALIS®), vardenafil (LEVITRA®, STAXYN®), udenafilo, avanafilo, icariina, 4-metilpiperazina y pirazolo pirimidina-7-1.
Ejemplos de inhibidores del proteasoma incluyen bortezomib, disulfiram, epigalocatequina-3-galato y salinosporamida A.
Ejemplos de inhibidores de quinasas incluyen bevacizumab, BIBW 2992, cetuximab (ERBITUX®), imatinib (GLEEVEC®), trastuzumab (HERCEPTIN®), gefitinib (IRESSA®), ranibizumab (LUCENTIS®), pegaptanib, sorafenib, dasatinib, sunitinib, erlotinib, nilotinib, lapatinib, panitumumab, vandetanib, E7080, pazopanib, mubritinib.
Ejemplos de glucocorticoides incluyen hidrocortisona (cortisol), acetato de cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, triamcinolona, beclometasona, acetato de fludrocortisona, acetato de desoxicorticosterona (DOCA) y aldosterona.
Ejemplos de retinoides incluyen retinol, retinal, tretinoína (ácido retinoico, RETIN-A®), isotretinoína (ACCUTANE®, AMNESTEEM®, CLARAVIS®, SOTRET®), alitretinoína (PANRETIN®), etretinato (TEGISON™) y su metabolito acitretina (SORIATANE®), tazaroteno (TAZORAC®, AVAGE®, ZORAC®), bexaroteno (TARGRETIN®) y adapaleno (DIFFERIN®).
Ejemplos de inhibidores de citoquinas incluyen IL1ra, antagonista del receptor de IL1, IGFBP, TNF-BF, uromodulina, alfa-2-macroglobulina, ciclosporina A, pentamidina y pentoxifilina (PENTo Pa K®, PENTOXIL®, TRENTAL®).
Ejemplos de antagonistas de receptores activados por el proliferador de peroxisomas incluyen GW9662, antagonista III de PPARy, G335, T0070907 (EMD4Biosciences, EE.UU.).
Ejemplos de agonistas del receptor activado por el proliferador de peroxisomas incluyen pioglitazona, ciglitazona, clofibrato, GW1929, GW7647, L-165,041, lY 171883, activador PPARy, Fmoc-Leu, troglitazona y WY-14643 (EMD4Biosciences, EE. UU.).
Ejemplos de inhibidores de histona desacetilasa incluyen ácidos hidroxámicos (o hidroxamatos), tales como tricostatina A, tetrapéptidos cíclicos (tales como trapoxina B) y depsipéptidos, benzamidas, cetonas electrofílicas, compuestos de ácido alifático, tales como fenilbutirato y ácido valproico, ácidos hidroxámicos, tales como vorinostat (Sa Ha ), belinostat (PXD101), LAQ824 y panobinostat (LBH589), benzamidas, tales como entinostat (MS-275), CI994 y mocetinostat (MGCD0103), nicotinamida, derivados de NAD, dihidrocumarina, naftopiranona y 2-hidroxinafaldehídos.
Ejemplos de inhibidores de calcineurina incluyen ciclosporina, pimecrolimus, voclosporina y tacrolimus.
Ejemplos de inhibidores de fosfatasa incluyen hidrocloruro de BN82002, CP-91149, caliculina A, ácido cantaridico, cantaridina, cipermetrina, etil-3,4-defostatina, sal de fostriecina sódica, MAZ51, metil-3,4-defostatina, NSC 95397, norcantaridina, sal de amonio del ácido okadaico de prorocentrum concavum, ácido okadaico, sal de potasio del ácido okadaico, sal sódica del ácido okadaico, óxido de fenilarsina, diversos cócteles inhibidores de fosfatasa, proteína fosfatasa 1C, proteína inhibidora de la proteína fosfatasa 2A, proteína fosfatasa 2A1 sódica, ortovanadato de proteína fosfatasa 2A1.
Inmunomoduladores endógenos
En determinados casos, los inmunomoduladores están disponibles de forma endógena. Inmunomduladores endógenos son generados por el propio cuerpo del sujeto, pero no se administran repetidamente como parte del agente inmunoterapéutico específico de antígeno o como parte de alguna otra intervención terapéutica. Ejemplos de inmunomoduladores endógenos comprenden sustancias y/o combinaciones de sustancias implicadas en la apoptosis o señalización relacionada, sustancias y/o combinaciones de sustancias implicadas en la biología de células T o B, y sustancias y/o combinaciones de sustancias implicadas en la biología de células dendríticas. En tales casos, el suministro del antígeno a través de la administración repetida del agente inmunoterapéutico específico de antígeno puede iniciar, o mantener, un proceso tolerogénico específico del antígeno de interés.
Ejemplos específicos de inmunomoduladores endógenos incluyen eritrocitos apoptóticos (descritos en S. Kontos et al, "Engineering antigens for in situ erythocyte binding induces T-cell deletion" Proc Natl Acad Sci USA 2 de enero de 2013; 110(1 ):E60-8); combinaciones de citoquinas particulares generadas cuando el antígeno se presenta sin suministrar también moléculas implicadas en la estimulación de células inmunes (p. ej., MHC I/II o moléculas co­ estimuladoras) o sin permitir que las células inmunes (tales como las células T, particularmente las células T naif) adquieran la función efectora (descrita en la Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada 2012/0076831 expedida a Miller et al.); y combinaciones de citoquinas generadas cuando el antígeno se presenta en un complejo de MHC-antígeno que induce la proliferación de células T tolerogénicas específicas de antígeno (descritas en la Solicitud de Patente de Ee .UU. Publicada 2009/0155292 expedida a Santamaria et. al.).
En algunos casos, se puede aislar un componente de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno, tal como un antígeno o inmunomodulador. Aislar se refiere a que el elemento está siendo separado de su entorno nativo y está presente en cantidades suficientes para permitir su identificación o uso. Esto significa, por ejemplo, que el elemento puede (i) producirse selectivamente mediante clonación de la expresión o (ii) purificarse mediante cromatografía o electroforesis. Los elementos aislados pueden ser sustancialmente puros, pero no es necesario que lo sean. Debido a que un elemento aislado se puede mezclar con un excipiente farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, el elemento puede comprender solo un pequeño porcentaje en peso de la preparación. No obstante, el elemento está aislado porque ha sido separado de las sustancias con las que puede estar asociado en los sistemas vivos, es decir, aislado de otros lípidos o proteínas. Cualquiera de los elementos descritos en esta memoria puede aislarse e incluirse en las composiciones y/o el agente inmunoterapéutico específico de antígeno en forma aislada.
D. MÉTODOS DE FABRICACIÓN Y UTILIZACIÓN DE LAS COMPOSICIONES Y MÉTODOS RELACIONADOS
Los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno se pueden preparar de diversas formas, dependiendo de la naturaleza de la composición. Se pueden conocer en la técnica elementos específicos de este tipo de preparaciones. Se presentan a continuación métodos de preparación para determinados casos preferidos de los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno enumerados; otros métodos de preparación para otros casos se pueden encontrar en la bibliografía relevante.
Nanoportadores sintéticos, útiles en diversas realizaciones de la presente invención, se pueden preparar utilizando una amplia diversidad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los nanoportadores sintéticos se pueden formar mediante métodos tales como como nanoprecipitación, enfoque de flujo utilizando canales fluídicos, secado por pulverización, evaporación de disolvente de emulsión simple y doble, extracción de disolvente, separación de fases, molienda, procedimientos de microemulsión, microfabricación, nanofabricación, capas de sacrificio, coacervación simple y compleja y otros métodos bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Alternativa o adicionalmente, se han descrito síntesis de disolventes acuosos y orgánicos para nanomateriales semiconductores monodispersos, conductores, magnéticos, orgánicos y otros (Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; y Trindade y col., 2001, Chem. Mat., 13:3843). Se han descrito métodos adicionales en la bibliografía (véase, p. ej., Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy", CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; y Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; Patentes de EE.UU. 5578325 y 6007845 ; P. Paolicelli et al., “Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)).
Diversos materiales pueden ser encapsulados en nanoportadores sintéticos como sea deseable utilizando una diversidad de métodos, incluyendo, pero no limitados a C. Astete et al., Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, N° 3, págs. 247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333(2004); C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drugloaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8-21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010). Se pueden utilizar otros métodos adecuados para encapsular materiales en nanoportadores sintéticos, incluyendo, sin limitación, los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos 6.632.671 expedida a Unger el 14 de octubre de 2003.
En determinados casos, nanoportadores sintéticos se preparan mediante un proceso de nanoprecipitación o secado por pulverización. Las condiciones utilizadas en la preparación de nanoportadores sintéticos pueden alterarse para producir partículas de un tamaño o propiedad deseados (p. ej., hidrofobicidad, hidrofilicidad, morfología externa, "pegajosidad", forma, etc.). El método de preparación de los nanoportadores sintéticos y las condiciones (p. ej., disolvente, temperatura, concentración, caudal de aire, etc.) utilizados pueden depender de los materiales que se han de acoplar a los nanoportadores sintéticos y/o la composición de la matriz polimérica.
Si las partículas preparadas por cualquiera de los métodos anteriores tienen un intervalo de tamaños fuera del intervalo deseado, las partículas se pueden cribar, por ejemplo, utilizando un tamiz.
Elementos (es decir, componentes) de los nanoportadores sintéticos (tales como restos de los cuales se compone una superficie de inmunorregulación, restos de fijación de objetivo, matrices poliméricas, antígenos e inmunomoduladores) pueden acoplarse al nanoportador sintético general, p. ej., por uno o más enlaces covalentes, o pueden acoplarse mediante uno o más enlazadores. Pueden adaptarse métodos adicionales de funcionalización de nanoportadores sintéticos de la Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada 2006/0002852 expedida a Saltzman et al., Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada 2009/0028910 expedida a DeSimone et al., o la Solicitud de Patente Internacional Publicada WO/2008/127532 A1 expedida a Murthy et al.
Alternativa o adicionalmente, nanoportadores sintéticos pueden ser acoplados a componentes, tales como inmunomoduladores o antígenos, directa o indirectamente a través de interacciones no covalentes. En casos no covalentes, el acoplamiento no covalente está mediado por interacciones no covalentes que incluyen, pero no se limitan a interacciones de carga, interacciones de afinidad, coordinación de metales, adsorción física, interacciones hospedante-huésped, interacciones hidrofóbicas, interacciones de apilamiento TT, interacciones de enlaces hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo y/o combinaciones de las mismas. Acoplamientos de este tipo pueden disponerse para estar en una superficie externa o una superficie interna de un nanoportador sintético. En algunos casos, la encapsulación y/o absorción es una forma de acoplamiento. En algunos casos, los nanoportadores sintéticos descritos se pueden combinar con un antígeno mezclándolos en el mismo vehículo o sistema de suministro. Se pueden producir formas de dosificación farmacéuticas de nanoportadores sintéticos utilizando métodos farmacéuticos tradicionales.
Antígenos modificados o expresadas se pueden preparar de acuerdo con las referencias citadas en otra parte en esta memoria. En particular, las construcciones de fusión para antígenos modificados pueden prepararse utilizando técnicas de producción de proteínas convencionales, tal como se describe en Kontos. Los antígenos expresados se pueden preparar utilizando una diversidad de técnicas, dependiendo de cómo se ha de administrar el material de nucleótidos que servirá como molde para la expresión de proteínas. Por ejemplo, se pueden encontrar técnicas para el suministro de material nucleotídico dependiendo de la forma de suministro/dosificación del material (p. ej., ADN/ARN desnudo, administración liposomal, pistola de genes, etc.).
Composiciones típicas y/o agentes inmunoterapéuticos específicas de antígeno pueden comprender tampones inorgánicos u orgánicos (p. ej., sales de sodio o potasio de fosfato, carbonato, acetato o citrato) y agentes de ajuste de pH (p. ej., ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o de potasio, sales de citrato o acetato, aminoácidos y sus sales) antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, alfa-tocoferol), tensioactivos (p. ej., polisorbato 20, polisorbato 80, polioxietilen9-10 nonil fenol, desoxicolato de sodio), solución y/o crio/lio-estabilizadores lio (p. ej., sacarosa, lactosa, manitol, trehalosa), agentes de ajuste osmótico (p. ej., sales o azúcares), agentes antibacterianos (p. ej., ácido benzoico, fenol, gentamicina), agentes antiespumantes (p. ej., polidimetilsilozona), conservantes (p. ej., timerosal, 2-fenoxietanol, EDTA), estabilizadores poliméricos y agentes de ajuste de la viscosidad (p. ej., polivinilpirrolidona, poloxámero 488, carboximetilcelulosa) y co-disolventes (p. ej., glicerol, polietilenglicol, etanol).
Composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno se pueden formular para que comprendan excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones y/o los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno se pueden preparar utilizando técnicas convencionales de fabricación y composición farmacéuticas para llegar a formas de dosificación útiles. Técnicas adecuadas para uso en la práctica de la presente invención se pueden encontrar en Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, editado por Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng y Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; y Pharmaceutics:The Science of Dosage Form Design, 2a Ed. Editado por M. E. Auten, 2001, Churchill Livingstone. En un caso, los nanoportadores sintéticos se suspenden en una solución salina estéril para inyección junto con un conservante.
Ha de entenderse que las composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno de la invención se pueden hacer de cualquier manera adecuada, y la invención no se limita de modo alguno a composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno que se pueden producir utilizando los métodos descritos en esta memoria. La selección de un método apropiado puede requerir atención a las propiedades de los restos particulares asociados.
En algunos casos, composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno se fabrican en condiciones estériles o se esterilizan terminalmente. Esto puede garantizar que las composiciones y/o los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno resultantes sean estériles y no infecciosos, mejorando así la seguridad cuando se comparan con composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno no estériles. Esto proporciona una valiosa medida de seguridad, especialmente cuando los sujetos que reciben composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno tienen defectos inmunes, padecen una infección y/o son susceptibles de una infección. En algunos casos, las composiciones y/o los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno pueden liofilizarse y almacenarse en suspensión o como polvo liofilizado dependiendo de la estrategia de formulación durante períodos prolongados sin perder actividad.
Administración
Las composiciones de la invención, incluyendo el agente inmunoterapéutico específico de antígeno según sea apropiado, se pueden administrar por una diversidad de vías, incluyendo, pero no limitados a subcutánea, intranasal, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transmucosal, transmucosal, sublingual, rectal, oftálmica, pulmonar, intradérmica, transdérmica, transcutánea o intradérmica, o mediante una combinación de estas vías. Las vías de administración también incluyen la administración por inhalación o aerosol pulmonar. Técnicas para preparar sistemas de suministro de aerosol son bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sciarra y Cutie, "Aerosols", en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, 1990, págs. 1694-1712).
Las composiciones y/o los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno de la invención se pueden administrar en cantidades eficaces, tales como las cantidades eficaces descritas en otra parte en esta memoria. Dosis de las composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno pueden contener cantidades variables de inmunomoduladores y/o antígenos. La cantidad de inmunomoduladores y/o antígenos presentes en las composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno puede variarse de acuerdo con la naturaleza de los antígenos y/o inmunomoduladores, el beneficio terapéutico a lograr y otros parámetros de este tipo. En algunos casos, se pueden realizar estudios de intervalos de dosis para establecer la cantidad terapéutica óptima de inmunomoduladores y/o antígenos que deben estar presentes en las composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno. En algunos casos, los inmunomoduladores y/o antígenos están presentes en las composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmune tolerogénica a antígenos de interés tras la administración a un sujeto.
Administración repetida
Las composiciones y los métodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para inducir o potenciar una respuesta inmune tolerogénica y/o para suprimir, modular, directa o redirigir una respuesta inmune no deseada.
"Administración repetida" o "administrar repetidamente" o "administrando repetidamente" y similares significa potenciar o extender la persistencia de una tolerancia inmune previamente establecida o un efecto que es característico de la tolerancia. La administración repetida puede implicar una administración o un ciclo corto de tratamiento en un momento en el que la tolerancia establecida está disminuyendo o corre el riesgo de disminuir. La administración repetida comienza con la siguiente dosis o dosis del agente terapéutico específico de antígeno administrado después de la administración de una dosis inicial de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno. El agente inmunoterapéutico específico de antígeno inicial administrado puede ser el mismo o diferente (en términos de composición, dosificación, etc.) del agente inmunoterapéutico específico de antígeno administrado durante la administración repetida. La dosificación repetida se realiza preferiblemente de 1 semana a 10 años, y más preferiblemente de 1 a 12 meses después de una dosis inicial del agente terapéutico específico de antígeno o una administración repetida previa. La aplicación de la invención puede implicar administraciones repetidas regulares en un programa de administraciones que se realizan bisemanalmente, semanalmente, quincenalmente o en cualquier otro programa regular.
Las composiciones y/o los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno se pueden administrar en una diversidad de frecuencias. En un caso preferido, al menos una administración de las composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno dentro de una administración repetida son suficientes para generar una respuesta farmacológicamente relevante. En casos más preferidos, se utilizan al menos dos administraciones, al menos tres administraciones, o al menos cuatro administraciones de las composiciones y/o agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno para asegurar una respuesta farmacológicamente relevante dentro de la administración repetida global.
La administración profiláctica repetida de las composiciones y/o los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno se puede iniciar antes de la aparición de la enfermedad, trastorno o afección o la administración repetida terapéutica se puede iniciar después de establecer un trastorno, trastorno o afección.
En algunos casos, la administración de un inmunomodulador se lleva a cabo, p. ej., antes de la administración de un antígeno exógeno. En casos ilustrativos, los inmunomoduladores se administran en uno o más momentos, incluyendo, pero no limitados a 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 días antes de la administración de un antígeno exógeno. Además, o alternativamente, se pueden administrar inmunomoduladores a un sujeto después de la administración del antígeno exógeno. En casos ilustrativos, los inmunomoduladores se administran en uno o más momentos, incluyendo, pero no limitados a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ,25 , 30, etc. días después de la administración de un antígeno exógeno.
Demostración de Protocolos y Elementos de los Mismos
Protocolos y elementos que componen los protocolos se pueden demostrar en sujetos humanos o no humanos. En los casos en los que los protocolos se demuestran en sujetos no humanos, dichos protocolos o elementos de los mismos pueden traducirse en protocolos humanos. Por ejemplo, los resultados de los ensayos de los protocolos llevados a cabo en roedores o primates no humanos pueden sugerir elementos del protocolo tales como la frecuencia de dosificación repetida, las cantidades de dosis del agente inmunoterapéutico específico del antígeno, el número de administraciones del agente inmunoterapéutico específico del antígeno en cada caso de dosis repetidas, vías de administración y variaciones de los elementos anteriores dentro de cada uno de los protocolos. En un caso, los resultados del protocolo de roedores y/o primates no humanos pueden sugerir una cantidad de dosis (incluyendo las dosis máxima y mínima que definen una ventana terapéutica) que luego se aumenta para su uso en un protocolo humano, basado en las técnicas de escalado habituales, tales como escalado alimétrico. Elementos de protocolo no humanos también pueden sugerir la frecuencia óptima de la dosificación repetida que se puede traducir a protocolos humanos; con determinados casos que tienen aproximadamente la misma frecuencia, y otros casos que tienen una frecuencia ajustada basada en diferencias entre las especies no humanas y los seres humanos.
Protocolos no humanos, o elementos de protocolo, de este tipo se pueden seleccionar basándose en los resultados que mostraron la no inducción de inmunosupresión tras la administración repetida. Protocolos no humanos, o elementos de los mismos, de este tipo pueden traducirse para su uso en seres humanos, para proporcionar un beneficio esperado de seguridad (y posiblemente eficacia) en seres humanos cuando las composiciones y/o los agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno se administran repetidamente. Protocolos no humanos, o elementos de los mismos, se pueden traducir en protocolos humanos, o elementos de los mismos, utilizando las técnicas y consideraciones indicadas anteriormente, en otras partes de esta memoria y, en general, en la técnica.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a kits. En algunos casos, el kit comprende una dosis o más de una dosis de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno tal como se describe en esta memoria. En tales casos, el kit comprende más de una dosis de un inmunomodulador. El kit también puede comprender o comprende además más de una dosis de un antígeno. Las dosis de inmunomodulador y/o antígeno pueden estar contenidas en recipientes separados o dentro del mismo recipiente del kit. En algunos casos, el recipiente es un vial o una ampolla. En algunos casos, las dosis de inmunomodulador y/o antígeno están contenidas dentro de una solución separada de los recipientes, de modo que las dosis se pueden añadir al recipiente en un momento posterior. En algunos casos, las dosis de inmunomodulador y/o antígeno se encuentran en forma liofilizada cada una en un recipiente separado o en el mismo recipiente, de manera que puedan reconstituirse en un momento posterior. En algunos casos, el kit comprende, además, instrucciones para la reconstitución, mezcladura, administración, etc. En algunos casos, las instrucciones incluyen una descripción de los métodos descritos en esta memoria. Las instrucciones pueden estar en cualquier forma adecuada, p. ej., como un inserto impreso o una etiqueta. En algunos casos, el kit comprende además una o más jeringas.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos contienen Ejemplos de Referencia, los cuales ilustran un cierto número de otros y desarrollos adicionales que se describen en las anteriores Divulgación Técnica de Referencia y Divulgación Detallada, pero no se presentan o reivindican como la invención como tal, la cual se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1: Demostración de un Protocolo no inmunosupresor Utilizando Agente Inmunoterapéutico Específico de Antígeno que se Administra Repetidamente
Materiales nanoportadores sintéticos
Rapamicina se adquirió de TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Catálogo de Producto n° R1017). Se adquirió PLGA de aproximadamente 25.000 Da de Lakeshore Biochemicals (756 Tom Martin Dr Birmingham, AL 35211). Código de producto 5050 DLG 2.5A. El copolímero de bloques PLA-PEG-OMe con un bloque de PeG terminado en metil éter de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de 48.000 Da se adquirió de Lakeshore Biochemicals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211). Código de producto 100 DL mPEG 50005CE. OPII.323 se adquirió de BACHEM (3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505; Número de lote n° B06481). El poli(alcohol vinílico) EMPROVE® 4-88, USP (85-89% hidrolizado, viscosidad de 3,4-4,6 mPa.s) se adquirió de EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027. Número de Pieza 1.41354).
Método del Nanoportador Sintético
Soluciones se prepararon como sigue: Solución 1: PLGA a 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 2: PLA-PEG a 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 3: Rapamicina a 50 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se preparó disolviendo rapamicina en cloruro de metileno puro. Solución 4: OPII.323 a 20 mg/mL en HCl 0,13 M. La solución se preparó disolviendo OPII.323 en HCl 0,13 M. Solución 5: Poli(alcohol vinílico) a 50 mg/mL en tampón fosfato 100 mM pH 8. Solución 6: tampón fosfato 70 mM, pH 8. Primero se creó una emulsión primaria (W1/O) mezclando las Soluciones 1 a 4. Solución 1 (0,75 mL), Solución 2 (0,25 mL), Solución 3 (0,20 mL) y Solución 4 (0,2 mL) se combinaron en un pequeño tubo de presión de vidrio y se trataron con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos utilizando un Sonicador Digital Branson 250.
Entonces se formó una emulsión secundaria (W1/O/W2) mediante la adición de Solución 5 (3,0 mL) a la emulsión primaria, agitación vorticial para crear una dispersión bruta y, a continuación, tratamiento con ultrasonidos a 30% de amplitud durante 60 segundos utilizando el Sonicador Digital Branson 250. La emulsión secundaria se añadió a un vaso de precipitados abierto de 50 mL que contenía Solución 6 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y los nanoportadores se formaran en suspensión. A continuación, se lavó una parte de los nanoportadores suspendidos transfiriendo la suspensión de los nanoportadores a un tubo de centrífuga, girando a 75.600 rcf durante 35 minutos, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió este proceso de lavado y luego se resuspendió el sedimento en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportador que tenía una concentración nominal de 10 mg/mL sobre una base de polímero. La suspensión se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.
El tamaño del nanoportador se determinó mediante dispersión de luz dinámica. La cantidad de rapamicina en el nanoportador se determinó mediante análisis de HPLC. La cantidad de OPII.323 en el nanoportador se determinó mediante análisis de HPLC. La masa total del nanoportador seco por mL de suspensión se determinó mediante un método gravimétrico.
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ELISA: Medición de IgG Anti-OVA
Se midió el nivel de anticuerpos IgG. Se usó Caseína Blocker en PBS (Thermo Fisher, Catálogo n° 37528) como diluyente. Se utilizó Tween-20 al 0,05% en PBS como tampón de lavado, preparado mediante la adición de 10 ml de Tween-20 ((Sigma, Catálogo n° P9416-100 mL) a 2 litros de una solución madre de PBS 10x (PBS: Concentrado líquido OmniPur® 10X PBS, 4L, EMD Chemicals, Catálogo n° 6505) y 18 litros de agua desionizada.
Se utilizó proteína OVA a una concentración madre de 5 mg/ml como material de recubrimiento. Se utilizó una dilución 1:1000 a 5 qg/ml como concentración de trabajo. Cada uno de los pocillos de las placas de ensayo se recubrió con 100 ql de OVA diluido por pocillo, las placas se sellaron con una película selladora (VWR catálogo n° 60941 -120) y se incubaron durante la noche a 4°C. Se utilizaron placas de fondo plano de 96 pocillos Costar9017 como placas de ensayo, Costar9017.
Se utilizaron una placa de polipropileno de 96 pocillos o tubos de baja unión como placas de configuración, en las que se prepararon las muestras antes de ser transferidas a la placa de ensayo. Las placas de configuración no contenían antígeno alguno y, por lo tanto, los anticuerpos del suero no se unieron a la placa durante la preparación de las muestras. Las placas de configuración se utilizaron para la preparación de muestras para minimizar la unión que podría ocurrir durante la preparación o el pipeteo de muestras si se utilizara una placa recubierta de antígeno para preparar las muestras. Antes de preparar las muestras en la placa de configuración, los pocillos se cubrieron con diluyente para bloquear cualquier unión no específica y la placa se selló y se incubó a 4°C durante la noche.
Las placas de ensayo se lavaron tres veces con tampón de lavado, y el tampón de lavado se aspiró completamente de los pocillos después del último lavado. Después del lavado, se añadieron 300 ql de diluyente a cada uno de los pocillos de la o las placas de ensayo para bloquear la unión no específica y las placas se incubaron al menos 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras de suero se prepararon en la placa de configuración a las diluciones iniciales apropiadas. A veces, las diluciones iniciales también se prepararon en tubos de 1,5 ml utilizando diluyente. Las diluciones iniciales apropiadas se determinaron en base a datos anteriores, cuando estaban disponibles. Cuando no se disponía de datos previos, la dilución inicial más baja fue 1:40. Una vez diluido, se transfirieron 200 pl de la dilución inicial de la muestra de suero al pocillo apropiado de la placa de configuración.
Una disposición ilustrativa de la placa de configuración se describe como sigue: Las columnas 2 y 11 contenían patrón isotipo IgG2b anti-Ovoalbúmina monoclonal (AbCam, ab17291), diluido a 1 pg/mL (dilución 1:4000). Las columnas 3­ 10 contenían muestras de suero (en diluciones apropiadas). Las columnas 1 y 12 no se utilizaron para muestras o patrones para evitar cualquier sesgo de las mediciones debido al efecto de borde. En cambio, las columnas 1 y 12 contenían 200 pl de diluyente. Se utilizó suero de ratón normal diluido 1:40 como control negativo. Se utilizó IgG2a anti-ratón diluido 1: 500 a partir de 0,5 mg/mL de material (BD Bioscience) como un control de isotipo.
Una vez que todas las muestras se prepararon de la placa de configuración, la placa se selló y se almacenó a 4°C hasta que el bloqueo de las placas de ensayo se había completado. Las placas de ensayo se lavaron tres veces con tampón de lavado y el tampón de lavado se aspiró por completo después del último lavado. Después del lavado, se añadieron 100 pL de diluyente a todos los pocillos de las filas B-H de las placas de ensayo. Se utilizó una pipeta de 12 canales para transferir muestras desde la placa de configuración a la placa de ensayo. Las muestras se mezclaron antes de la transferencia pipeteando 150 pl de suero diluido hacia arriba y hacia abajo 3 veces. Después de mezclar, se transfirieron 150 pl de cada una de las muestras de la placa de configuración y se añadieron a la fila A de la placa de ensayo respectiva.
Una vez que las diluciones de partida de cada una de las muestras fueron transferidas de la placa de configuración a la fila A de la placa de ensayo, diluciones en serie se pipetearon en la placa de ensayo como sigue: 50 pl de cada una de las muestras de suero se retiraron de la fila A utilizando una pipeta de 12 canales y se mezclaron con los 100 pl de diluyente previamente añadido a cada uno de los pocillos de la fila B. Esta etapa se repitió en toda la placa. Después de pipetear la dilución de la última fila, se retiraron 50 pl de fluido de los pocillos de la última fila y se desecharon, lo que dio como resultado un volumen final de 100 pl en cada uno de los pocillos de la placa de ensayo. Una vez que se prepararon las diluciones de la muestra en las placas de ensayo, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 2 horas.
Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado. El anticuerpo de detección (anti-IgG anti-ratón de cabra, conjugado con HRP, AbCam ab98717) se diluyó 1:1500 (0,33 pg/mL) en diluyente y se añadieron 100 pl del anticuerpo diluido a cada uno de los pocillos. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron tres veces con tampón de lavado, incluyendo cada etapa de lavado un tiempo de remojo de al menos 30 segundos.
Después del lavado, se añadió sustrato de detección a los pocillos. Se combinaron partes iguales de sustrato A y sustrato B (BD Biosciences TMB Substrate Reagent Set, catálogo n° 555214) inmediatamente antes de la adición a las placas de ensayo, y se añadieron 100 pl de la solución de sustrato mixto a cada uno de los pocillos y se incubaron durante 10 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo añadiendo 50 pl de solución de parada (H2SO4 2 N) a cada uno de los pocillos después del período de 10 minutos. La densidad óptica (DO) de los pocillos se evaluó inmediatamente después de añadir la solución de parada en un lector de placas a 450 nm con sustracción a 570 nm. El análisis de los datos se realizó utilizando el software SoftMax Pro v5.4 de Molecular Device. En algunos casos, se preparó un gráfico de ajuste de curva logística de cuatro parámetros con la dilución en el eje x (escala logarítmica) y el valor de DO en el eje y (escala lineal), y se determinó la mitad del valor máximo (CE50) para cada una de las muestras. La plantilla de la placa en la parte superior del diseño se ajustó para reflejar la dilución de cada una de las muestras (1 por columna).
ELISA: Medición de IgG Anti-KLH
Se midió el nivel de anticuerpos IgG. Se usó Caseína Blocker en PBS (Thermo Fisher, catálogo n° 37528) como diluyente. Se usó Tween-20 al 0,05% en PBS como tampón de lavado, preparado mediante la adición de 10 ml de Tween-20 ((Sigma, Catálogo n° P9416-100 mL) a 2 litros de una solución madre de PBS 10x (PBS: Concentrado líquido OmniPur® 10X PBS, 4L, EMD Chemicals, Catálogo n° 6505) y 18 litros de agua desionizada.
Se utilizó proteína KLH (Sigma, Catálogo n° H7127) a una concentración madre de 10 mg/ml como material de recubrimiento. Se utilizó una dilución 1:2000 a 5 pg/ml como concentración de trabajo. Cada uno de los pocillo de las placas de ensayo se recubrió con 100 pl de KLH diluida por pocillo, las placas se sellaron con una película selladora (catálogo VWR n° 60941 -120) y se incubaron durante la noche a 4°C. Se utilizaron placas de fondo plano de 96 pocillos Costar 9017 como placas de ensayo (Costar 9017).
Se utilizaron una placa de polipropileno de 96 pocillos o tubos de baja unión como placas de configuración, en las que se prepararon las muestras antes de ser transferidas a la placa de ensayo. Las placas de configuración no contenían antígeno alguno y, por lo tanto, los anticuerpos del suero no se unieron a la placa durante la preparación de las muestras. Las placas de configuración se utilizaron para la preparación de muestras para minimizar la unión que podría ocurrir durante la preparación o el pipeteo de muestras si se utilizara una placa recubierta de antígeno para preparar las muestras. Antes de preparar las muestras en la placa de configuración, los pocillos se cubrieron con diluyente para bloquear cualquier unión no específica y la placa se selló y se incubó a 4°C durante la noche.
Las placas de ensayo se lavaron tres veces con tampón de lavado, y el tampón de lavado se aspiró completamente de los pocillos después del último lavado. Después del lavado, se añadieron 300 pl de diluyente a cada uno de los pocillos de la o las placas de ensayo para bloquear la unión no específica y las placas se incubaron al menos 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras de suero se prepararon en la placa de configuración a las diluciones iniciales apropiadas. A veces, las diluciones iniciales también se prepararon en tubos de 1,5 ml utilizando diluyente. Las diluciones iniciales apropiadas se determinaron en base a datos anteriores, cuando estaban disponibles. Cuando no se disponía de datos previos, la dilución inicial más baja fue 1:40. Una vez diluido, se transfirieron 200 pl de la dilución inicial de la muestra de suero al pocillo apropiado de la placa de configuración.
Una disposición ilustrativa de la placa de configuración se describe como sigue: Las columnas 2 y 3 contenían patrón isotipo IgG monoclonal de ratón anti-KLH (AbCam, ab34607), diluido a 0,2 pg/mL (dilución 1:5000 a partir de 1 mg/mL de material). Las columnas 4-12 contenían muestras de suero (en diluciones apropiadas). La columna 1 no se utilizó para muestras o patrones, de modo que se pudo evaluar el efecto del diluyente solo sobre el material de recubrimiento. En cambio, la columna 1 contenía 200 pl de diluyente. Se utilizó suero de ratón normal diluido 1:40 como control negativo. Se utilizó IgG2a anti-ratón diluido 1: 500 a partir de 0,5 mg/mL de material (BD Bioscience) como un control de isotipo.
Una vez que todas las muestras se prepararon de la placa de configuración, la placa se selló y se almacenó a 4°C hasta que el bloqueo de las placas de ensayo se había completado. Las placas de ensayo se lavaron tres veces con tampón de lavado y el tampón de lavado se aspiró por completo después del último lavado. Después del lavado, se añadieron 100 pL de diluyente a todos los pocillos de las filas B-H de las placas de ensayo. Se utilizó una pipeta de 12 canales para transferir muestras desde la placa de configuración a la placa de ensayo. Las muestras se mezclaron antes de la transferencia pipeteando 150 pl de suero diluido hacia arriba y hacia abajo 3 veces. Después de mezclar, se transfirieron 150 pl de cada una de las muestras de la placa de configuración y se añadieron a la fila A de la placa de ensayo respectiva.
Una vez que las diluciones de partida de cada una de las muestras fueron transferidas de la placa de configuración a la fila A de la placa de ensayo, diluciones en serie se pipetearon en la placa de ensayo como sigue: 50 pl de cada una de las muestras de suero se retiraron de la fila A utilizando una pipeta de 12 canales y se mezclaron con los 100 pl de diluyente previamente añadido a cada uno de los pocillos de la fila B. Esta etapa se repitió en toda la placa. Después de pipetear la dilución de la fila final, se retiraron 50 pl de fluido de los pocillos de la fila final y se desecharon, lo que dio como resultado un volumen final de 100 pl en cada uno de los pocillos de la placa de ensayo. Una vez que se prepararon las diluciones de la muestra en las placas de ensayo, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 2 horas.
Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado. El anticuerpo de detección (anti-IgG anti-ratón de cabra, conjugado con HRP, AbCam ab98717) se diluyó 1:1500 (0,33 pg/mL) en diluyente y se añadieron 100 pl del anticuerpo diluido a cada uno de los pocillos. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron tres veces con tampón de lavado, incluyendo cada etapa de lavado un tiempo de remojo de al menos 30 segundos.
Después del lavado, se añadió sustrato de detección a los pocillos. Se combinaron partes iguales de sustrato A y sustrato B (BD Biosciences TMB Substrate Reagent Set, catálogo n° 555214) inmediatamente antes de la adición a las placas de ensayo, y se añadieron 100 pl de la solución de sustrato mixto a cada uno de los pocillos y se incubaron durante 10 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo añadiendo 50 pl de solución de parada (H2SO4 2 N) a cada uno de los pocillos después del período de 10 minutos. La densidad óptica (DO) de los pocillos se evaluó inmediatamente después de añadir la solución de parada en un lector de placas a 450 nm con sustracción a 570 nm. El análisis de los datos se realizó utilizando el software SoftMax Pro v5.4 de Molecular Device. En algunos casos, se preparó un gráfico de ajuste de curva logística de cuatro parámetros con la dilución en el eje x (escala logarítmica) y el valor de DO en el eje y (escala lineal), y se determinó la mitad del valor máximo (CE50) para cada una de las muestras. La plantilla de la placa en la parte superior del diseño se ajustó para reflejar la dilución de cada una de las muestras (1 por columna).
Actividad Tolerógena Específica de Antígeno de Agentes Inmunoterapéuticos Específicos de Antígeno Bajo Administración Repetida
El propósito de este experimento fue evaluar el potencial para la inmunosupresión del efecto de protocolo de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno administrado repetidamente en las respuestas de anticuerpos nacientes midiendo inmunoglobulinas específicas de antígeno. Un grupo de animales permaneció sin vacunar como control. Todos los grupos de animales se inmunizaron con ovoalbúmina de pollo (OVA) y CpG con 3 inyecciones (tratamiento inicial el d0, d14 y d28) en las almohadillas de las patas delanteras y traseras derechas y con hemocianina de lamprea bocallave (KLH) en las almohadillas de las patas delanteras y traseras izquierdas. Se inyectaron agentes inmunoterapéuticos específicos de antígeno (nanoportadores sintéticos hechos de acuerdo con los procedimientos anteriores, y etiquetados como "t2SVP") que contenían OPII el día 0 y luego se administraron repetidamente los días 14, 28, 42 y 56. Para la inmunización, los animales recibieron 20 gl/extremidad de OVA CpG, 12,5 gg OVA 10 gg CpG (KLH como se indica en la Fig. 1), ambas extremidades traseras s.c. t2SVP se diluyeron de tal manera que se inyectaron las mismas cantidades de OVA323-339 en los grupos tratados. Los resultados de la Fig.1 demuestran que, tras la administración repetida de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno, los títulos contra OVA se ven muy afectados por el tratamiento con t2SVP (cinco conjuntos de columnas de la izquierda) pero no los títulos anti KLH (cinco conjuntos de columnas de la derecha). Para cada uno de los grupos de animales tratados de forma diferente, se muestran los títulos para los días 21,35, 49 y 63 (de izquierda a derecha). Por tanto, se demostró que el protocolo no induce inmunosupresión tras la administración repetida.
Protocolo de Administración Repetida de Agente Inmunoterapéutico Específica de Antígeno No Inmunosupresor (Profético)
En la práctica de la presente invención, este protocolo, o elementos del mismo, sería utilizado para generar un protocolo no inmunosupresor para su uso en otros sujetos. El elemento cantidad de dosis aumentaría, por ejemplo, en seres humanos incrementando la dosis utilizando técnicas de escalado alimétricas para preservar aún la no inmunosupresión del protocolo subyacente establecido anteriormente.
Ejemplo 2: Nanoportadores Sintéticos Tolerógenos Acoplados a PLP que Utilizan Antígeno Endógeno Administrado Repetidamente (Profético)
Nanoportadores sintéticos acoplados a PLP se preparan de acuerdo con los métodos expuestos en el Ejemplo 21 de la Solicitud de Patente de EE.Uu . Publicada 2012/0076831 de Miller et. al. ("Miller"). Los nanoportadores sintéticos se administran inicialmente a ratones SJL por vía intravenosa a una dosis de 10 mg de nanoportadores/kg de peso corporal el día 0, y luego se administran repetidamente i.v. cada dos semanas durante 6 semanas después de la administración inicial. Se toman muestras de sangre el día 0, inmediatamente antes de cada una de las administraciones repetidas y una semana después de la administración repetida final.
Se analizan las muestras de sangre para establecer los títulos de IgG de KLH utilizando un procedimiento ELISA de IgG de KLH como generalmente se recoge en el Ejemplo 1 anterior. Puede observarse la ausencia de inmunosupresión, según se evidencia por los títulos de IgG de KLH que están por encima del fondo en una o más de las muestras tomadas después de una administración repetida de los nanoportadores sintéticos.
Después de una dosis inicial de 10 mg/kg, los nanoportadores sintéticos se administran entonces repetidamente i.v. a sujetos humanos en una cantidad de dosis aumentadas basada en la masa relativa entre ratón y ser humano a la misma dosis de 10 mg/kg. La frecuencia de dosificación repetida es semanal durante 3 semanas después de la administración inicial y luego mensualmente. Los sujetos humanos se monitorizan para detectar signos clínicos de infecciones oportunistas u otros síntomas de un sistema inmunológico suprimido.
Ejemplo de Referencia 3: Nanoportadores Sintéticos Tolerógenos de tipo Nanogel que Utilizan Antígeno Endógeno Administrado Repetidamente (Profético)
Nanoportadores sintéticos de tipo nanogel que contienen ácido micofenólico se preparan de acuerdo con los métodos descritos en M. Look et. al. “Nanogel-based delivery of mycophenolic acid ameliorates systemic lupus erythematosus in mice" J Clin Invest. doi:10.1172/JCI65907 (2013). Los nanoportadores sintéticos se administran inicialmente a ratones C57BL/6 diariamente durante 4 días a una dosis de 0,625 mg de MPA por kilogramo de peso corporal del animal ("mpk") por vía intravenosa, y luego se administran repetidamente i.v. mensualmente durante 6 meses después de la administración inicial. Se toman muestras de sangre el día 0, inmediatamente antes de cada administración repetida y una semana después de la administración repetida final.
Se analizan las muestras de sangre para establecer los títulos de IgG de KLH utilizando un procedimiento ELISA de IgG de KLH como generalmente se recoge en el Ejemplo 1 anterior. Puede observarse la ausencia de inmunosupresión, según se evidencia por los títulos de IgG de KLH que están por encima del fondo en una o más de las muestras tomadas después de una administración repetida de los nanoportadores sintéticos.
Los nanotransportadores sintéticos se administran entonces repetidamente i.v. a sujetos humanos en una cantidad de dosis, es decir, 0,625 mpk, aumentada en base a la masa relativa entre ratón y ser humano. La dosis inicial es diaria durante dos días. La frecuencia de dosificación repetida es mensual durante 6 meses después de la administración inicial, a 0.625 mpk. Los sujetos humanos se monitorizan para detectar signos clínicos de infecciones oportunistas u otros síntomas de un sistema inmunológico suprimido.
Ejemplo de Referencia 4: Proteína de Fusión de Antígeno que Utiliza Inmunomodulador Endógeno Administrado Repetidamente (Profético)
Se genera una proteína de fusión que combina eritropoyetina con un fragmento de anticuerpo Fv de cadena sencilla (scFv) específico de eritrocitos murinos utilizando la divulgación de Kontos et al., discutida en otra parte de esta memoria. A continuación, la proteína de fusión se administra inicialmente i.v. a ratones hembra C57BL/6 de 12 semanas de edad diariamente durante 3 días con la dosis calculada para contener 10 pg de proteína de fusión por dosis, y luego se administra repetidamente i.v. cada dos semanas durante 6 meses después de la administración inicial. Se toman muestras de sangre el día 0, inmediatamente antes de cada administración repetida y una semana después de la administración repetida final.
Se analizan las muestras de sangre para establecer los títulos de IgG de KLH utilizando un procedimiento ELISA de IgG de KLH como generalmente se recoge en el Ejemplo 1 anterior. Puede observarse la ausencia de inmunosupresión, según se evidencia por los títulos de IgG de KLH que están por encima del fondo en una o más de las muestras tomadas después de una administración repetida de los nanoportadores sintéticos.
Luego se genera una proteína de fusión humana, incluyendo eritropoyetina humana y un fragmento scFV específico para eritrocitos humanos. A continuación, la proteína de fusión se administra inicialmente i.v. diariamente durante tres días a sujetos humanos en una cantidad de dosis basada en la dosis de ratón de 10 pg, aumentada en función del volumen de sangre relativo entre el ratón y el ser humano. La dosis repetida es la misma que la dosis inicial. La frecuencia de administración repetida es mensual durante 6 meses después de la administración inicial, a la mitad de la dosis inicial. Los sujetos humanos se monitorizan para detectar signos clínicos de infecciones oportunistas u otros síntomas de un sistema inmunológico suprimido.
Ejemplo de Referencia 5: Nanoportadores Sintéticos Tolerogénicos que Utilizan Antígeno de ARNm Exógeno e Inmunomodulador Exógeno Administrados Repetidamente (Profético)
Un sistema degradable de nanoportador sintético compuesto de un núcleo poli(p-amino-éster) sensible al pH (PBAE) y una envoltura de fosfolípidos se prepara de acuerdo con la divulgación de Su et al., "In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH responsive polymer nanoparticles" Mol Pharm. 6 de junio de 2011; 8(3):774-787 ("Su"). Se sigue la estrategia de formulación de doble emulsión, y ácido micofenólico, presente como una solución que tiene una concentración de MPA de 100 mg/ml se encapsula en la emulsión primaria y posteriormente en los nanoportadores sintéticos. Véase también Moon et al., "Interbilayer-Crosslinked Multilamellar Vesicles as Synthetic Vaccines for Potent Humoral and Cellular Immune Responses" Nat Mater. Marzo de 2011; 10(3):243-251 para otras estrategias de encapsulación que se pueden utilizar. A continuación, el ARNm para EPO se acopla a los nanoportadores sintéticos, de acuerdo con los métodos descritos generalmente por Su. Alternativamente, pueden utilizarse el ARNm que codifica otras proteínas terapéuticas, tales como vacunas basadas en ARNm o reemplazos de proteínas, como se establece en Su.
Los nanoportadores sintéticos se administran entonces inicialmente mediante infusión i.v. a monos Rhesus con la dosis calculada para que contenga 7 mg/kg de nanoportadores sintéticos, y luego se administran repetidamente i.v. cada dos meses durante 6 meses después de la administración inicial. Se toman muestras de sangre el día 0, inmediatamente antes de cada administración repetida y una semana después de la administración repetida final. Se analizan las muestras de sangre para establecer los títulos de IgG de KLH utilizando un procedimiento ELISA de IgG de KLH como generalmente se recoge en el Ejemplo 1 anterior. Puede observarse la ausencia de inmunosupresión, según se evidencia por los títulos de IgG de KLH que están por encima del fondo en una o más de las muestras tomadas después de una administración repetida de los nanoportadores sintéticos.
Los nanoportadores sintéticos se administran entonces repetidamente i.v. a sujetos humanos en una cantidad de dosis basado en la duplicación de la dosis inicial de 7 mg/kg (es decir, 14 mg/kg), aumentada en base a la masa relativa entre mono y ser humano. La frecuencia de administración repetida es mensual durante 6 meses después de la administración inicial. Los sujetos humanos se monitorizan para detectar signos clínicos de infecciones oportunistas u otros síntomas de un sistema inmunológico suprimido.
Ejemplo de Referencia 6: Nanoportadores Sintéticos Tolerógenos que Utilizan Antígeno de ADNc Exógeno e Inmunomoulador Exógeno Administrados Repetidamente (Profético)
Se preparan nanoportadores sintéticos de formiato Genosphere. La rapamicina se encapsula en los nanoportadores sintéticos disolviendo rapamicina en etanol y combinando la solución de rapamicina con la solución de lípidos para llegar a una carga calculada de rapamicina del 4% p/p, basada en el peso de los ingredientes secos añadidos a la formulación del nanoportador. La fase de ADN comprende un plásmido que incorpora ADNc que codifica eritropoyetina CEPO"), utilizando una tecnología de plásmido convencional que puede traducirse tanto en seres humanos como en primates no humanos.
Los nanotransportadores sintéticos se administran inicialmente mediante infusión i.v. diaria durante dos días a monos macacos con la dosis calculada para que contenga 12 mg/kg de nanoportadores sintéticos, y luego se administran repetidamente i.v. mensualmente durante 6 meses después de la administración inicial comenzando con el doble de la dosis inicial (es decir, 24 mg/kg) y luego disminuyendo en un 25% cada dos meses a partir de entonces (18 mg/kg, 12 mg/kg, 6 mg/kg). Se toman muestras de sangre el día 0, inmediatamente antes de cada administración repetida y una semana después de la administración repetida final.
Se analizan las muestras de sangre para establecer los títulos de IgG de KLH utilizando un procedimiento ELISA de IgG de KLH como generalmente se recoge en el Ejemplo 1 anterior. Puede observarse la ausencia de inmunosupresión, según se evidencia por los títulos de IgG de KLH que están por encima del fondo en una o más de las muestras tomadas después de una administración repetida de los nanoportadores sintéticos.
Los nanoportadores sintéticos se administran entonces repetidamente i.v. a sujetos humanos en una cantidad de dosis basada en la duplicación de la dosis inicial de 24 mg/kg de mono (p. ej., 24, 18, 12 y 6 mg/kg, y la disminución gradual se produce a intervalos de dos meses) que se administró repetidamente en monos, aumentada en base a la masa relativa entre mono y ser humano. La frecuencia de administración repetida es mensual durante 6 meses después de la administración inicial. Los sujetos humanos se monitorizan para detectar signos clínicos de infecciones oportunistas u otros síntomas de un sistema inmunológico suprimido.
Ejemplo de Referencia 7: Nanoportadores Sintéticos Tolerógenos que Utilizan Antígeno de ARNmm Exógeno e Inmunomuladores Exógenos Administrados Repetidamente (Proféticos)
Materiales
Rapamicina se adquiere de TSZ CHEM (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; catálogo de producto n° R1017). PLGA de aproximadamente 25.000 Da se adquiere de Lakeshore Biochemicals (756 Tom Martin Dr Birmingham, AL 35211). Código de producto 5050 DLG 2.5A. El copolímero de bloques PLA-PEG-OMe con un bloque de pEG terminado en metil éter de aproximadamente 5.000 Da y un bloque de PLA de 48.000 Da se adquieren de Lakeshore Biochemicals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211). Código de producto 100 d L mPEG 5000 5CE. Poli(alcohol vinílico) EMPROVE® 4-88, USP (85-89% hidrolizado, viscosidad de 3,4-4,6 mPa.s) se adquiere de EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027. Número de pieza 1.41354).
El ARNm modificado con factor estimulante de colonias de granulocitos humano recombinante (rhuG-CSF) se prepara de acuerdo con la divulgación de la Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada 2013/0115272 expedida a de Fougerolles et al.
Método
Se preparan soluciones como sigue: Solución 1: PLGA a 100 mg/ml en cloruro de metileno. La solución se prepara disolviendo PLGA en cloruro de metileno puro. Solución 2: PLA-PEG a 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se prepara disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 3: Rapamicina a 50 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se prepara disolviendo rapamicina en cloruro de metileno puro. Solución 4: ARNm modificado con rhuG-CSF a 20 mg/mL en HCl 0,13 M. La solución se prepara disolviendo el ARNmm en HCl 0,13 M. Solución 5: Poli(alcohol vinílico) a 50 mg/mL en tampón fosfato 100 mM pH 8. Solución 6: Tampón fosfato 70 mM, pH 8. Primero se crea una emulsión primaria (W1/O) mezclando las Soluciones 1 a 4.
La solución 1 (0,75 mL), la solución 2 (0,25 mL), la solución 3 (0,20 mL) y la solución 4 (0,2 mL) se combinan en un pequeño tubo de presión de vidrio y se tratan con ultrasonidos al 50% de amplitud durante 40 segundos utilizando un Sonicador Branson Digital 250. La emulsión secundaria (W1/O/W2) se forma luego añadiendo la Solución 5 (3,0 mL) a la emulsión primaria, agitando para crear una dispersión bruta y luego tratando con ultrasonidos a una amplitud del 30% durante 60 segundos utilizando el Sonicador Branson Digital 250. La emulsión secundaria se añade a un vaso de precipitados abierto de 50 mL que contiene Solución 6 (30 mL) y se agita a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y los nanoportadores se formaran en suspensión. A continuación, se lavó una parte de los nanoportadores suspendidos transfiriendo la suspensión de los nanoportadores a un tubo de centrífuga, girando a 75.600 rcf durante 35 minutos, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repitió este proceso de lavado y luego se resuspendió el sedimento en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportador que tenía una concentración nominal de 10 mg/mL sobre una base de polímero. La suspensión se almacena congelada a -20°C hasta su uso.
Los nanoportadores sintéticos se administran entonces inicialmente a través de infusión i.v. al día durante dos días a monos macacos con la dosis calculada para que contenga 12 mg/kg de nanotransportadores sintéticos, y entonces se administran repetidamente i.v. mensualmente durante 6 meses después de la administración inicial a la misma dosis (es decir, 12 mg/kg). Se toman muestras de sangre el día 0, inmediatamente antes de cada administración repetida y una semana después de la administración repetida final.
Se analizan las muestras de sangre para establecer los títulos de IgG de KLH utilizando un procedimiento ELISA de IgG de KLH como generalmente se recoge en el Ejemplo 1 anterior. Puede observarse la ausencia de inmunosupresión, según se evidencia por los títulos de IgG de KLH que están por encima del fondo en una o más de las muestras tomadas después de una administración repetida de los nanoportadores sintéticos.
Los nanoportadores sintéticos se administran entonces repetidamente i.v. a sujetos humanos en una cantidad de dosis basada en la dosis inicial de 12 mg/kg que se administró repetidamente en monos, aumentada en base a la masa relativa entre mono y ser humano. La frecuencia de administración repetida es mensual durante 6 meses después de la administración inicial. Los sujetos humanos se monitorizan para detectar signos clínicos de infecciones oportunistas u otros síntomas de un sistema inmunológico suprimido.
Ejemplo de Referencia 8: Nanoportadores Sintéticos Tolerógenos que Utilizan Antígeno de ARNmm Exógeno e Inmunomuladores Exógenos Administrados Repetidamente (Proféticos)
Se repiten los procedimientos del Ejemplo 7, excepto que el ARNm modificado de Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos humano recombinante (rhuG-CSF) se reemplaza por ARNm modificado de eritropoyetina humana recombinante (huEPO). El ARNm modificado con eritropoyetina humana (rhuEPO) se prepara de acuerdo con la divulgación de la Solicitud de Patente de EE.UU. Publicada 2013/0115272 expedida a de Fougerolles et al.
Ejemplo de Referencia 9: Nanopartículas de Sílice Mesoporosa con Ibuprofeno Acoplado (Profético) Núcleos de nanopartículas de SiO2 mesoporoso se crean a través de un procedimiento de sol-gel. Bromuro de hexadeciltrimetil-amonio (CTAB) (0,5 g) se disuelve en agua desionizada (500 mL) y luego se añade una solución acuosa de NaOH 2 M (3,5 mL) a la solución de CTAB. La solución se agita durante 30 min y luego se añade tetraetoxisilano (TEOS) (2,5 mL) a la solución. El gel resultante se agita durante 3 h a una temperatura de 80 °C. El precipitado blanco que se forma se captura mediante filtración, seguido de lavado con agua desionizada y secado a temperatura ambiente. A continuación, el tensioactivo restante se extrae de las partículas mediante suspensión en una solución etanólica de HCl durante la noche. Las partículas se lavan con etanol, se centrifugan y se redispersan con ultrasonidos. Este proceso de lavado se repite dos veces más.
Las nanopartículas de SiO2 son entonces funcionalizados con grupos amino utilizando (3-aminopropil)-trietoxisilano (APTMS). Para hacer esto, las partículas se suspenden en etanol (30 mL) y se añade APTMS (50 pL) a la suspensión. Se deja reposar la suspensión a temperatura ambiente durante 2 h y luego se hierve durante 4 h, manteniendo constante el volumen mediante la adición periódica de etanol. Los reaccionantes restantes se eliminan mediante cinco ciclos de lavado por centrifugación y redispersión en etanol puro.
En una reacción separada, se crean semillas de oro de 1-4 nm de diámetro. Toda el agua utilizada en esta reacción se desioniza primero y luego se destila del vidrio. Se añade agua (45,5 mL) a un matraz de fondo redondo de 100 mL. Mientras se agita, se añade NaOH acuoso 0,2 M (1,5 mL), seguido de una solución acuosa al 1% de cloruro de tetraquis(hidroximetil)fosfonio (THPC) (1,0 mL). Dos minutos después de la adición de la solución de THPC, se añade una solución acuosa de 10 mg/mL de ácido cloroáurico (2 mL), que se ha envejecido al menos durante 15 minutos. Las semillas de oro se purifican mediante diálisis contra agua.
Para formar los nanoportadores de núcleo-envoltura, las nanopartículas de SiO2 amino-funcionalizadas formadas anteriores se mezclan primero con las semillas de oro durante 2 h a temperatura ambiente. Las partículas de SiO2 decoradas con oro se recogen mediante centrifugación y se mezclan con una solución acuosa de ácido cloroáurico y bicarbonato de potasio para formar la envoltura de oro. A continuación, las partículas se lavan por centrifugación y se vuelven a dispersar en agua. Se carga ibuprofeno suspendiendo las partículas en una solución de ibuprofeno sódico (1 mg/L) durante 72 h. El ibuprofeno libre se lava después de las partículas mediante centrifugación y se redispersa en agua.
Ejemplo de Referencia 10: Liposomas que Contienen Ciclosporina A (Profético)
Los liposomas se forman utilizando hidratación de película delgada. 1,2-dipalmitoyl-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na (DPPC) (32 pmol), colesterol (32 pmol) y ciclosporina A (6,4 pmol) se disuelven en cloroformo puro (3 mL). Esta solución lipídica se añade a un matraz de fondo redondo de 50 mL y el disolvente se evapora en un evaporador rotatorio a una temperatura de 60 °C. A continuación, el matraz se enjuaga con gas nitrógeno para eliminar el disolvente restante. Se añaden al matraz solución salina tamponada con fosfato (2 mL) y cinco perlas de vidrio, y la película lipídica se hidrata agitando a 60 °C durante 1 h para formar una suspensión. La suspensión se transfiere a un pequeño tubo de presión y se somete a ultrasonidos a 60 °C durante cuatro ciclos de pulsos de 30 s con un retraso de 30 s entre cada uno de los pulsos. A continuación, se deja reposar la suspensión a temperatura ambiente durante 2 h para permitir una hidratación completa. Los liposomas se lavan mediante centrifugación seguida de resuspensión en solución salina tamponada con fosfato de reciente aportación.
Ejemplo 11: Nanoportador Polimérico que Contiene Conjugado de Polímero-Rapamicina (Profético)
Preparación del conjugado de PLGA-rapamicina:
Polímero de PLGA con grupo ácido terminal (7525 DLG1A, índice de acidez 0,46 mmol/g, Lakeshore Biomaterials; 5 g, 2,3 mmol, 1,0 eq) se disuelve en 30 mL de diclorometano (DCM). Se añade N,N-diciclohexilcarbodimida (1,2 eq, 2,8 mmol, 0,57 g) seguido de rapamicina (1,0 eq, 2,3 mmol, 2,1 g) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (2,0 eq, 4,6 mmol, 0,56 g). La mezcla se agita a ta durante 2 días. Después, la mezcla se filtra para eliminar la diciclohexilurea insoluble. El filtrado se concentra a aprox. 10 mL de volumen y se añade a 100 mL de alcohol isopropílico (IPA) para precipitar el conjugado de PLGA-rapamicina. Se retira la capa de IPA y luego se lava el polímero con 50 mL de IPA y 50 mL de metil t-butil éter (MTBE). A continuación, el polímero se seca en vacío a 35 °C durante 2 días para dar PLGA-rapamicina en forma de un sólido blanco (aproximadamente 6,5 g).
Preparación de nanoportador que contiene conjugado de PLGA-rapamicina y péptido de ovoalbúmina (323-339):
Nanoportador que contiene PLGA-rapamicina se prepara de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 como sigue:
Las soluciones para la formación de nanoportadores se preparan como sigue:
Solución 1: Péptido de ovoalbúmina 323-339 a 20 mg/mL en solución acuosa de ácido clorhídrico diluido. La solución se prepara disolviendo péptido de ovoalbúmina en una solución de ácido clorhídrico 0,13 M a temperatura ambiente. Solución 2: PLGA-rapamicina a 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se prepara disolviendo PLGA-rapamicina en cloruro de metileno puro. Solución 3: PLA-PEG a 100 mg/mL en cloruro de metileno. La solución se prepara disolviendo PLA-PEG en cloruro de metileno puro. Solución 4: Poli(alcohol vinílico) a 50 mg/mL en tampón fosfato 100 mM pH 8.
Primero se prepara una emulsión primaria de agua-en-aceite. W1/O1 se prepara combinando solución 1 (0,2 mL), solución 2 (0,75 mL) y la solución 3 (0,25 mL) en un tubo de presión pequeño y tratando con ultrasonidos a 50% de amplitud durante 40 segundos utilizando un Sonicador Branson Digital 250. Una emulsión secundaria (W1/O1/W2) se prepara combinando solución 4 (3,0 mL) con la emulsión primaria W1/O1, agitando en vórtice durante 10 s y tratando con ultrasonidos a 30% de amplitud durante 60 segundos utilizando el Sonicador Branson Digital 250. La emulsión W1/O1/W2 se añade a un vaso de precipitados que contiene una solución tampón fosfato 70 mM de pH 8 (30 mL) y se agita a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evapore el cloruro de metileno y se formen los nanoportadores. Una porción de los nanoportadores se lava transfiriendo la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600 x g y 4 °C durante 35 min, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Se repite el procedimiento de lavado y el sedimento se resuspende en solución salina tamponada con fosfato para obtener una dispersión de nanoportador final de aproximadamente 10 mg/mL.
Ejemplo de Referencia 12: Preparación de Nanoportadores de Oro (AuNC) que Contienen Rapamicina (Profético)
Preparación de HS-PEG-rapamicina:
Una solución de disulfuro de ácido PEG (1,0 eq), rapamicina (2,0-2,5 eq), DCC (2,5 eq) y DMAP (3,0 eq) en DMF seca se agita a ta durante la noche. La diciclohexilurea insoluble se elimina por filtración y el filtrado se añade a alcohol isopropílico (IPA) para precipitar el éster de PEG-disulfuro-di-rapamicina y se lava con IPA y se seca. A continuación, el polímero se trata con hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina en DMF para reducir el disulfuro de PEG a éster de rapamicina tiol PEG (HS-PEG-rapamicina). El polímero resultante se recupera por precipitación de IPA y se seca como se describió previamente y se analizó por H RMN y GPC.
Formación de NC de Oro (AuNC):
Una solución ac. de 500 mL de HAuCl4 1 mM se calienta a reflujo durante 10 min con agitación vigorosa en un matraz de fondo redondo de 1 L equipado con un condensador. A continuación, se añade rápidamente una solución de 50 mL de citrato trisódico 40 mM a la solución en agitación. La solución de color rojo vino profundo resultante se mantiene a reflujo durante 25-30 min y se retira el calor y la solución se enfría a temperatura ambiente. A continuación, la solución se filtra a través de un filtro de membrana de 0,8 pm para dar la solución de AuNCs. Los AuNCs se caracterizan utilizando espectroscopia visible y microscopía electrónica de transmisión. Los AuNCs son de aprox. 20 nm de diámetro cubierto por citrato con un pico de absorción a 520 nm.
Los AuNCs se conjugan con HS-PEG-rapamicina:
Una solución de 150 pl de HS-PEG-rapamicina (10 pM en tampón carbonato 10 mM pH 9,0) se añade a 1 mL de nanoportadores de oro cubiertos con citrato de 20 nm de diámetro (1,16 nM) para producir una relación molar de tiol a oro de 2500:1. La mezcla se agita a temperatura ambiente bajo argón durante 1 hora para permitir el intercambio completo de tiol con citrato en los nanoportadores de oro. Los AuNCs con PEG-rapamicina en la superficie se purifican luego mediante centrifugación a 12.000 g durante 30 minutos. Se decanta el sobrenadante y luego se lava el sedimento que contiene AuNC-S-PEG-rapamicina con tampón PBS 1x. Los nanoportadores de Oro-pEG-rapamicina purificados se resuspenden luego en un tampón adecuado para análisis y bioensayos adicionales.
Ejemplo de Referencia 13: Liposomas que Contienen Rapamicina y Ovoalbúmina (Profético)
Los liposomas se forman por la hidratación de película delgada. 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) (32 pmol), colesterol (32 pmol) y rapamicina (6,4 pmol) se disuelven en cloroformo puro (3 mL). Esta solución lipídica se añade a un tubo de vidrio de 10 mL y el disolvente se separa bajo una corriente de gas nitrógeno y se deseca durante 6 horas en vacío. Se obtienen vesículas multilaminares por hidratación de la película con 2,0 ml de tampón MOPS 25 mM pH 8,5, que contiene una cantidad en exceso de ovoalbúmina. El tubo se agita con vórtice hasta que la película lipídica se desprende de la superficie del tubo. Para romper las vesículas multilaminares en monolaminares, se aplican diez ciclos de congelación (nitrógeno líquido) y descongelación (baño de agua a 30°C). A continuación, la muestra se diluye a 1 ml en tampón MOPS 25 mM pH 8,5. El tamaño del liposoma resultante se homogeneiza por extrusión haciendo pasar la muestra 10 veces a través de filtros de policarbonato de poros de 200 nm. Los liposomas resultantes se utilizan luego para análisis y bioensayos adicionales.
Ejemplo de Referencia 14: Diversos Nanoportadores Sintéticos Tolerógenos Adicionales que Utilizan Antígeno Endógeno Administrado Repetidamente (Profético)
Los nanoportadores sintéticos descritos en los Ejemplos 9, 10 y 12 son administrados inicialmente a ratones C57BL/6 por vía intravenosa diariamente durante 4 días a una dosis de nanoportadores sintéticos que proporciona 30 pg de inmunomodulador por dosis, y después se administra repetidamente i.v. mensualmente durante 6 meses después de la administración inicial. Se toman muestras de sangre el día 0, inmediatamente antes de cada una de las administraciones repetidas y una semana después de la administración repetida final.
Se analizan las muestras de sangre para establecer los títulos de IgG de KLH utilizando un procedimiento ELISA de IgG de KLH como generalmente se recoge en el Ejemplo 1 anterior. Puede observarse la ausencia de inmunosupresión, según se evidencia por los títulos de IgG de KLH que están por encima del fondo en una o más de las muestras tomadas después de una administración repetida de los nanoportadores sintéticos.
Los nanoportadores sintéticos se administran entonces repetidamente i.v. a sujetos humanos en una cantidad de dosis aumentada en base al volumen relativo de sangre entre ratón y ser humano. La dosis inicial es diaria durante tres días. La frecuencia de dosificación repetida es mensual durante 6 meses después de la administración inicial, a la misma dosis que la dosis inicial. Los sujetos humanos se monitorizan para detectar signos clínicos de infecciones oportunistas u otros síntomas de un sistema inmunológico suprimido.
Ejemplo de Referencia 15: Nanoportadores Sintéticos Tolerogénicos que Utilizan Antígeno Exógeno e Inmunomodulador Exógeno Administrados Repetidamente (Profético)
Los nanoportadores sintéticos de los Ejemplos 11 y 13 se administran inicialmente a través de infusión i.v. al día durante dos días a beagles hembras con la dosis calculada para que contenga 25 mg/kg de nanoportadores sintéticos, y luego se administran repetidamente i.v. mensualmente durante 6 meses después de la administración inicial a la misma dosis. Se toman muestras de sangre el día 0, inmediatamente antes de cada una de las administraciones repetidas y una semana después de la administración repetida final.
Se analizan las muestras de sangre para establecer los títulos de IgG de KLH utilizando un procedimiento ELISA de IgG de KLH como generalmente se recoge en el Ejemplo 1 anterior. Puede observarse la ausencia de inmunosupresión, según se evidencia por los títulos de IgG de KLH que están por encima del fondo en una o más de las muestras tomadas después de una administración repetida de los nanoportadores sintéticos.
Los nanoportadores sintéticos se administran entonces repetidamente i.v. a sujetos humanos en una cantidad de dosis aumentada en base a la dosis de 25 mg/kg administrada repetidamente a los beagle, a escala basada en la masa relativa entre beagles y seres humanos. La frecuencia de dosificación repetida es mensual durante 6 meses después de la administración inicial. Los sujetos humanos se monitorizan para detectar signos clínicos de infecciones oportunistas u otros síntomas de un sistema inmunológico suprimido.
Ejemplo de Referencia 16: Diversos Nanoportadores Sintéticos Tolerógenos Adicionales que Utilizan Antígeno Exógeno Administrado Repetidamente (Profético)
Los nanoportadores sintéticos descritos en los Ejemplos 9, 10 y 12 son administrados inicialmente a ratones C57BL/6 por vía intravenosa diariamente durante 4 días a una dosis de nanoportadores sintéticos que proporciona 30 pg de inmunomodulador por dosis, y después se administran de forma repetida i.v. mensualmente durante 6 meses después de la administración inicial. El ARNm modificado con eritropoyetina humana recombinante (rhuEPO) del Ejemplo 7 se administra de forma concomitante con los nanoportadores sintéticos, específicamente dentro de las 24 horas siguientes a cada una de las dosis de nanoportadores sintéticos. Se administra suficiente ARNmm para alcanzar 10 miliunidades por mililitro de huEPO. Se toman muestras de sangre el día 0, inmediatamente antes de cada una de las administraciones repetidas y una semana después de la administración repetida final.
Se analizan las muestras de sangre para establecer los títulos de IgG de KLH utilizando un procedimiento ELISA de IgG de KLH como generalmente se recoge en el Ejemplo 1 anterior. Puede observarse la ausencia de inmunosupresión, según se evidencia por los títulos de IgG de KLH que están por encima del fondo en una o más de las muestras tomadas después de una administración repetida de los nanoportadores sintéticos.
Los nanoportadores sintéticos se administran entonces repetidamente i.v. a sujetos humanos en una cantidad de dosis aumentada en base al volumen de sangre relativo entre ratón y ser humano. El ARNm modificado que codifica rhuEPO (tal como se describió arriba) se dosifica concomitantemente (en este caso, dentro de las 24 horas) en una cantidad administrada para alcanzar 10-20 miliunidades por mililitro de rhuEPO en los sujetos humanos. La dosis inicial es diaria durante tres días. La frecuencia de dosificación repetida es mensual durante 6 meses después de la administración inicial, a la misma dosis que la dosis inicial. Los sujetos humanos se monitorizan para detectar signos clínicos de infecciones oportunistas u otros síntomas de un sistema inmunológico suprimido.
Ejemplo de Referencia 17: Metotrexato (MTX) Conduce a Tolerancia Inmunológica específica de Antígeno
A ratones hembra C57BL/6 de la misma edad (5-6 semanas) se inyectaron 5 veces por vía intravenosa en la vena de la cola inyecciones semanales de 25 pg de una forma en partículas inmunogénica de ovoalbúmina de pollo (pOVA). Un grupo de animales recibió 3 inyecciones intraperitoneales de 200 pg de MTX junto con las 3 primeras inyecciones de antígeno el mismo día y los 2 días siguientes. El grupo no tratado recibido sólo antígeno, mientras que el grupo tratado recibió 9 inyecciones en total de MTX i.p. (días 1-3, 7-9, 14 -16). En los días 4° y 5° de la inyección, todos los animales recibieron 20 pg de hemocianina de lamprea bocallave (KLH) por vía subcutánea en las extremidades traseras mezclada con 2 pg de CpG además de la inyección i.v. de pOVA.
Las respuestas de anticuerpos anti-KLH y anti-OVA fueron monitorizadas en la sangre en estos animales en diferentes momentos. Como se muestra en la en ausencia de cualquier tratamiento, los animales desarrollaron una fuerte respuesta inmune contra OVA. Por el contrario, la administración de MTX bloqueó la respuesta de anticuerpos y solo se detectaron títulos mínimos, incluso después de 5 inyecciones con el antígeno. Cuando se inyectaron KLH y CpG después de los tratamientos con MTX (desde el d21), se pudo detectar una respuesta anti-KLH robusta en todos los grupos. Estos resultados demuestran que el efecto inmunosupresor de MTX se levantó después del día 21 y que el efecto tolerogénico de las inyecciones de MTX se restringió al antígeno administrado concomitantemente (OVA) (no al antígeno proporcionado después del período de tratamiento con MTX).
Por consiguiente, estos resultados demuestran que las administraciones repetidas de inyecciones concomitantes con MTX y antígeno pueden prevenir la formación de anticuerpos específicos de antígeno sin conducir a la inmunosupresión. Por lo tanto, se demostró que el protocolo no induce inmunosupresión tras la administración repetida.
Ejemplo de Referencia 18: Metotrexato (MTX) Conduce a la Inducción de Tolerancia a Múltiples Antígenos y Vías
Con el fin de testar si inyecciones múltiples de MTX pueden conducir al establecimiento de la tolerancia inmunológica, ratones hembra C57BL/6 de la misma edad (5-6 semanas) fueron inyectados por vía intravenosa en la vena de la cola con inyecciones semanales de 200 gg de hemocianina de hemocianina de lamprea bocallave (KLH) y por vía subcutánea en las extremidades traseras con 25 gg de una forma en partículas de ovoalbúmina de pollo (pOVA) mezclada con 2 gg de oligodesoxinucleótidos CpG (ODN). Con las tres primeras inyecciones de antígeno, un grupo de animales recibió 3 inyecciones intraperitoneales de MTX el mismo día y los 2 días siguientes. Todos los animales recibieron 5 inyecciones de antígeno (d0, 7, 14, 21 y 28) y un grupo recibió 9 inyecciones adicionales de MTX i.p. (días 1-3, 7-9, 14-16).
Las respuestas de anticuerpos anti-KLH y anti-OVA fueron monitorizadas en la sangre en estos animales en diferentes momentos. Como se muestra en la inimales desarrollaron una fuerte respuesta inmune contra KLH y OVA que se puede medir por los títulos de anticuerpos anti-KLH y IgG anti-OVA. Por el contrario, la administración de MTX bloqueó ambas respuestas y los animales mostraron bajos títulos incluso después de 5 inyecciones con el antígeno.
Por consiguiente, estos resultados demuestran que las administraciones repetidas de inyecciones concomitantes con MTX y antígeno pueden prevenir la formación de anticuerpos específicos de antígeno sin conducir a la inmunosupresión. Esto se encontró con más de un antígeno y con administración por diferentes vías. Además, se demostró que el protocolo no induce inmunosupresión tras la administración repetida.
Ejemplo 19: Modelo OTI utilizando ERY1-OVA
Material
Ovoalbúmina activada con maleimida Imject: Thermoscientific, se obtuvieron Producto n° 77126, Lote n° OF185798, 10 mg, y péptido ERY1 (secuencia: Trp-Met-Val-Leu-Pro-Trp-Leu-Pro-Gly-Thr-Leu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Cys-Arg-Gly-NH2) (SEq ID NO: 1), CSBio, Producto n° CS11662, Lote n° M613, p M 2001, sal de t Fa , 6 mg, agua ultrapura y tampón PBS 1x.
Métodos
Se disolvió OVA activada con maleimida Imject (10 mg) en 2 mL de agua ultrapura. A esta solución se añadió una solución de péptido ERY1 (6 mg) en 0,6 mL de agua ultrapura. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y luego a 8°C durante la noche. La solución ligeramente turbia se diluyó con 3 mL de PBS 1x y se filtró a través de un filtro de 0,45 micras. A continuación, el filtrado se lavó en un tubo de diafiltración Amicon-15 MWCO de 10 KD con agua ultrapura para eliminar el exceso de péptido ERY1. A continuación, el concentrado se diluyó con agua ultrapura hasta una concentración de 1 mg/mL (aprox. 9 mL). La solución se filtró finalmente a través de un filtro de 0,2 micras para dar la solución de conjugado ERY1-OVA (1 mg/mL, aprox. 9 mL). El análisis de HPLC confirmó el material como conjugado de ERY1-OVA.
Inducción de Tolerancia de Células T CD8+ Utilizando Péptido de Unión a Eritrocitos:
Un péptido de 12 aa sintético (ERY1) descubierto por presentación en fagos que se une a glicoforina-A de ratón específicamente ({Kontos, 2013 n° 8387}) está presente únicamente en los eritrocitos y puede conjugarse con antígenos a los eritrocitos diana e inducir tolerancia inmunológica. Sin estar ligado a teoría particular alguna, se cree que la unión a eritrocitos da como resultado la manipulación del antígeno como un autoantígeno durante el reciclaje y recambio de eritrocitos.
Para observar deleción o anergia de células T CD8+ después de la administración de ERY1 conjugado a ovoalbúmina (OVA), se aislaron células T de animales transgénicos OTI+ que expresan una TCR que reconoce un péptido de OVA en el complejo MHC-CLI. Estas células se transfirieron el día 1 a animales con un pequeño desajuste en las moléculas CD45 (CD45.1+) para poder rastrear las células del donante (CD45.2+). Un grupo de animales (n = 3) permaneció sin tratar y sin inmunizar (naif), otro grupo de animales permaneció sin tratar, pero fue inmunizado (Sin Tratamiento) mientras que el último grupo recibió OVA conjugado con ERY1 los días 0 y 5. Todos los animales (excepto el primero, grupo "Naif") se inmunizaron con OVA (10 gg) y CpG ODN (10 gg) en la extremidad trasera por vía subcutánea el día 14. Cinco días después (día 19) se sacrificaron todos los animales y los ganglios linfáticos que drenaban el sitio de inmunización (poplíteal) se escindieron y se analizaron para determinar la presencia de las células CD45.2 OTI+ transferidas mediante FACS.
Como se muestra en la Fig. 4 , los animales que permanecieron siendo naif tienen aproximadamente 0,7x104 células OTI+ en sus ganglios linfáticos. Las inyecciones de OVA CpG inducen la activación y aproximadamente una expansión 30 veces de estas células (21x104), mientras que el tratamiento con complejos de ERY1-OVA dio como resultado la inhibición completa de las capacidades proliferativas de las células OTI. Estos resultados demuestran que las composiciones descritas en esta memoria pueden aniquilar la capacidad de las células T CD8+ de reconocer y activarse en presencia del antígeno. Esto ilustra la capacidad para una regulación a la baja no duradera y específica de antígeno de una respuesta inmune como resultado de un agente inmunoterapéutico específico de antígeno tal como se describe en esta memoria.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunoterapéutica específica de antígeno para uso en la inducción de tolerancia específica de antígeno, en donde la administración repetida de la composición a un sujeto no induce inmunosupresión, y en donde la composición comprende nanoportadores sintéticos poliméricos acoplados a un inhibidor de mTOR y a un antígeno exógeno, en donde el antígeno es una proteína terapéutica, o un fragmento antigénico de la misma, que no está acoplado al inhibidor de mTOR, y en donde el inhibidor de mTOR es rapamicina o un análogo de rapamicina.
2. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la carga del inhibidor de mTOR en promedio es al menos 95%, 97%, 98% o 99% (peso/peso).
3. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína terapéutica es una enzima.
4. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición comprende más de un antígeno exógeno.
5. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la administración repetida se produce 1 semana después de una dosis inicial o una administración repetida previa de la composición.
6. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la administración repetida se produce 2 semanas después de una dosis inicial o una administración repetida previa de la composición.
7. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la administración repetida se produce 1 a 12 meses después de una dosis inicial o una administración repetida previa de la composición.
8. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición está comprendida en un kit.
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