ES2834617T3

ES2834617T3 - Composiciones y métodos de uso para la determinación de HE4a

Info

Publication number: ES2834617T3
Application number: ES11858800T
Authority: ES
Inventors: Ingegerd Hellstrom; Karl-Erik Hellstrom; John Raycroft; Christian Fermer; Eva Roijer
Original assignee: Fujirebio Diagnostics Inc
Current assignee: Fujirebio Diagnostics Inc
Priority date: 2011-02-17
Filing date: 2011-02-17
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2031-02-17
Also published as: CA2827618A1; CA2827618C; RU2013142334A; US20180057575A1; EP2675911A4; KR102074141B1; BR112013021056B1; KR20140025348A; RU2650778C2; US9822169B2; EP2675911B1; US20150353629A1; JP5887364B2; IL227924A0; KR101854110B1; EP2675911A1; CN103492582A; JP2014507153A; BR112013021056A2; US20200325215A1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 12A2, depositado en la ECACC como el No. de depósito de patente 10091401 o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo que conserva la capacidad de unirse específicamente a HE4a, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo une un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos del dominio N-WFDC de un polipéptido de HE4a como se establece en la SEQ ID NO: 17.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos de uso para la determinación de HE4a

La invención incluye a los anticuerpos monoclonales, así como los kits y los métodos para diagnosticar el cáncer de ovario con el empleo de tales anticuerpos.

Antecedentes de la invención

El producto del gen WFDC2 (HE4/HE4a) es un miembro de una familia de proteínas de núcleo estable de 4 disulfuros. HE4 es una proteína secretada y glicosilada que se observó por primera vez en el tejido del epidídimo humano (proteína 4 del epidídimo humano; HE4) y se sobreexpresa en determinados cánceres, incluidos los cánceres de ovario. Se ha informado de la caracterización de las proteínas y de los ácidos nucleicos de HE4/HE4a, por ejemplo, en Kirchhoff C, Habben I, Ivell R, Krull N (marzo de 1992). "A major human epididymis-specific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors". Biol Reprod 45 (2): 350-7 Schummer M, Ng WV, Bumgarner RE, Nelson PS, Schummer B, Bednarski DW, Hassell L, Baldwin RL, Karlan BY, Hood L (diciembre de 1999). "Comparative hybridization of an array of 21,500 ovarian cDNAs forthe discovery of genes overexpressed in ovarian carcinomas". Gene 238 (2): 375-85; Kirchhoff C (1998). "Molecular characterization of epididymal proteins." Rev. Reprod. 3 (2): 86-95.; Kirchhoff C, Osterhoff C, Habben I y otros (1990). "Cloning and analysis of mRNAs expressed specifically in the human epididymis." Int. J. Androl. 13 (2): 155-67; Hellstrom I, y otros; Cancer Res. 2003 1 de julio;63(13):3695-700. La sobreexpresión de HE4/HE4a en las células cancerosas sugiere que esta proteína y sus diversas isoformas pueden ser un biomarcador útil para detectar el cáncer y para identificar a los pacientes que tienen una mayor probabilidad de tener cáncer. Previamente, se han informado los métodos y la composición relacionados con el uso de los marcadores moleculares, tal como HE4/HE4a, incluidos los documentos US7270960; US20100311099; US20080020473; US20070286865; US20100047818; US20090104684y US20030108965. El documento WO 2008/112514 se refiere a las composiciones y a los métodos para diagnosticar el cáncer de ovario en un paciente y para identificar a los pacientes con mayor probabilidad de cáncer de ovario, el documento WO 2006/089125 se refiere a los métodos de detección del cáncer de ovario mediante los biomarcadores. El documento WO 2012/027631 se refiere a las composiciones y a los métodos relacionados con la detección de las células tumorales que expresan HE4 en un sujeto. Se han descrito anticuerpos policlonales de cabra contra los epítopos dentro de los residuos de aminoácidos 29-43 de HE4/HE4a, incluido uno producido por Everest Biotech (y denominado EB09963) y uno producido por Source Bioscience.

Se ha informado que las proteínas HE4/HE4a tienen diferentes isoformas debido al corte y empalme alternativo, así como diferentes glicoformas con diferentes patrones de glicosilación. A la luz de lo anterior, existe una necesidad en la técnica de las composiciones y de los agentes de unión (por ejemplo, los anticuerpos) que sean capaces de detectar la sobreexpresión de los biomarcadores, tales como HE4a, sus variantes, isoformas de corte y empalme y glicoformas para el diagnóstico del cáncer.

Sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier materia que quede fuera del ámbito de las reivindicaciones se proporciona solo con propósitos informativos. Esto incluye a las composiciones, los kits y los métodos para diagnosticar el cáncer de ovario en un sujeto y para identificar a los sujetos con una mayor probabilidad de tener cáncer de ovario. Las composiciones comprenden a los anticuerpos monoclonales, sus variantes y fragmentos que se unen específicamente a las formas solubles y de superficie celular de HE4/HE4a que se sobreexpresan en el carcinoma de ovario. También se proporcionan los anticuerpos monoclonales que tienen las características de unión del anticuerpo contra HE4a descrito. También se describen las líneas celulares de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal contra HE4/HE4a. Las composiciones descritas tienen usos en los métodos de diagnóstico, así como en los métodos de cribado para identificar a los sujetos que tienen una mayor probabilidad de tener cáncer de ovario. En particular, los métodos de diagnóstico pueden comprender un ensayo de inmunohistoquímica (IHC) o un ensayo ELISA de doble sándwich. También se proporcionan los kits que comprenden uno o más de los anticuerpos monoclonales contra HE4a descritos y para practicar los métodos de la invención. También se describen los polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos para un epítopo de HE4a y los métodos para usar estos polipéptidos en la producción de los anticuerpos.

Breve sumario de las figuras

La Figura 1 ilustra una modalidad ilustrativa de la proteína de fusión de HE4a que comprende un dominio de HE4a y una IgG ratón/humana.

La Figura 2 ilustra algunas especificidades de unión de las modalidades de los anticuerpos monoclonales (anticuerpos 12A2 y 14E2) a HE4a de longitud completa, los dominios HE4a-V4 y HE4a-V2 de HE4a. En este ejemplo, los MAb 12a 2 y 14E2 se unieron a la variante HE4a-V4 y a HE4a de longitud completa, pero no al dominio HE4a-V2. Lo que indica que los MAb 12A2 y 14E2 se unieron al dominio N-WFDC de HE4a.

La Figura 3 representa las especificidades de unión de los anticuerpos monoclonales de referencia (anticuerpos 2H5 y 3D8) a las proteínas de fusión. En este ejemplo, los MAb de referencia se unen al dominio HE4a-V2 y a HE4a de longitud completa pero no al dominio HE4a-V4, lo que indica que reconocieron epítopos en el dominio C-WFDC de HE4a.

La Figura 4 muestra las secuencias de nucleótidos y péptidos de HE4a; incluidos los dominios N-WFDC y C-WFDC de HE4a.

La Figura 5 ilustra la interacción de unión de los anticuerpos monoclonales ilustrativos (12A2) a N-WFDC y C-WFDC. En este ejemplo, la especificidad de unión de 12A2 se demuestra mediante el uso de un formato ELISA de fagos en el que el MAb reaccionaba únicamente con la proteína N-WFDC de HE4a fusionada a la pVIII del fago.

La Figura 6 representa la reactividad del MAb 14E2 con la proteína de fusión HE4a-hIg desnaturalizada y reducida. La unión a la proteína de fusión HE4a-hIg desnaturalizada y reducida indicó que el MAb 14E2 reconoce un epítopo lineal de la proteína HE4a.

La Figura 7 muestra una curva de respuesta a las dosis de los inmunoensayos en sándwich que utilizan al 14E2 como MAb de captura y a los MAB 3D8 o 12A2 como MAb de detección. Los resultados para la combinación de los MAb 14E2 y 12A2 indicaron que son capaces de unirse simultáneamente y, por lo tanto, detectar epítopos independientes del dominio N-WFDC de HE4a.

La Figura 8 ilustra algunos inmunoensayos en sándwich de ejemplo y la unión de los MAb 12A2 y 14E2 en combinación con el MAb 2H5. En este ejemplo, los MAb 12A2 y 14E2 reaccionaron solo con HE4a de longitud completa, mientras que la combinación de los MAb 3D8 y 2H5 reaccionó con HE4a de longitud completa y la variante HE4a-V2. El resultado respalda aún más las evidencias de que los MAb 12A2 y 14E2 reconocen el epítopo expuesto en el dominio N-WFDC de HE4a.

La Figura 9 muestra una curva de respuesta a las dosis de HE4a EIA de longitud completa. Este ensayo fue en base a el MAb 2H5 como anticuerpo de captura y en el MAb 12A2 conjugado con HRP como MAb de detección. El procedimiento se realizó como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 10 representa los niveles de HE4a en los sujetos sanos, pacientes con enfermedades ginecológicas benignas y cáncer de ovario determinados en el EIA de HE4a de longitud completa como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 11 ilustra un inmunoensayo ilustrativo de HE4a completa para dar seguimiento al curso clínico del cáncer de ovario. (SD = enfermedad estable; R = respuesta; PD = enfermedad progresiva). En este Ejemplo, e1HE4a de longitud completa demostró que el HE4a de longitud completa sería útil para seguir el curso clínico de la enfermedad de los pacientes con cáncer de ovario diagnosticado.

Figura 12. Ilustra la IHC de los tejidos ováricos benignos y malignos mediante el uso de un MAb ilustrativo específico para el dominio N-WFDC de HE4a. En este ejemplo, el MAb 12A2 ilustrativo se unió fuertemente a las células cancerosas en el cáncer de ovario, pero no se unió a las células en los tumores benignos. A: Adenocarcinoma seroso; B: Adenocarcinoma seroso; C: Carcinoma endometroide de ovario; D: Adenocarcinoma seroso; E: Fibroma; F: Fibrotecoma.

Descripción detallada

En el presente documento se describen diversas composiciones y métodos para diagnosticar el cáncer de ovario en un sujeto y para identificar sujetos con una mayor probabilidad de tener cáncer de ovario. Las composiciones incluyen los anticuerpos monoclonales que son capaces de unirse a HE4/HE4a, una proteína que se ha demostrado que se sobreexpresa en las células de cáncer de ovario. Las composiciones incluyen a los anticuerpos monoclonales y las variantes y los fragmentos de los mismos que se unen específicamente a las formas solubles y de la superficie celular de HE4/HE4a que se sobreexpresa en el carcinoma de ovario. Se describen además los anticuerpos monoclonales que tienen las características de unión de un anticuerpo contra HE4a de la presente descripción. También se describen las líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales de la presente descripción. Más particularmente, se describen líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales que se unen al dominio N-WFDC de HE4a. También se describen los kits que comprenden los anticuerpos monoclonales descritos. También se describen los polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos para un epítopo de HE4a y los métodos para usar estos polipéptidos en la producción de los anticuerpos. Las composiciones encuentran un uso particular en los métodos de ELISA en "sándwich" o IHC para diagnosticar el cáncer de ovario en un sujeto y en los métodos de cribado para identificar sujetos con una mayor probabilidad de tener cáncer de ovario.

En un aspecto, la presente descripción proporciona un anticuerpo monoclonal capaz de unirse específicamente a HE4a, el anticuerpo monoclonal se produce por la línea celular de hibridoma 12A2, depositada en el ECACC como depósito de patente No. 10091401. También se describe un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 14E2, depositada en el ECACC. El anticuerpo monoclonal de la invención se une a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17 N-WFDC de HE4a ( E K T G V C P E L Q A D Q N C T Q E C V S D S E C A D N L K C C S A G C A T F C S L P N D).

En otro aspecto, la invención proporciona un kit para diagnosticar el cáncer de ovario que comprende un anticuerpo monoclonal de la invención y un anticuerpo monoclonal adicional que se une a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 19 C-WFDC de HE4a. ( K E G S C P Q V N I N F P Q L G L C R D Q C Q V D S Q C P G Q M K C C R N G C G K V S C V T P N F ) . También se describe un kit para diagnosticar el cáncer de ovario en una paciente que comprende: un anticuerpo de captura inmovilizado sobre un soporte sólido, en el que el anticuerpo de captura es un primer anticuerpo contra HE4a y un anticuerpo etiqueta, en el que el anticuerpo etiqueta es un segundo anticuerpo contra HE4a que está marcado con una sustancia detectable; en el que dicho primer o segundo anticuerpo contra HE4a es un anticuerpo monoclonal en el que el anticuerpo monoclonal es producido por la línea celular de hibridoma 14E2, depositada en el ECACC) y/o se une a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17 N-WFDC de HE4a (E K T G V C P E L Q A D Q N C T Q E C V S D S E C A D N L K C C S A G C A T F C S L P N D ) .

La presente descripción también divulga un método para producir un anticuerpo monoclonal contra HE4a que comprende: inmunizar un animal con un polipéptido en las condiciones para provocar una respuesta inmune, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos establecida en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5 (HE4a; HE4a V2; HE4a-V4) y las variantes de las mismas; aislar las células productoras de los anticuerpos del animal; fusionar las células productoras de los anticuerpos con las células inmortalizadas en cultivo para formar las células de hibridoma productoras de los anticuerpos monoclonales; cultivar las células de hibridoma y aislar los anticuerpos monoclonales del cultivo.

La presente descripción también divulga un agente de unión a HE4a que se une a: (a) dominio N-WFDC de HE4a; (b) una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 1 de HE4a. En una opción, el agente de unión es un anticuerpo antiHE4a o un fragmento de unión al antígeno HE4a. En una opción adicional, el agente de unión se une selectivamente a N-WFDC de HE4a (SEQ ID NO: 17). En otra opción más, el agente de unión es un anticuerpo policlonal, monoclonal, biespecífico, quimérico o humanizado o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. En otra opción, el agente de unión se marca con un marcador detectable.

También se describe una secuencia de aminoácidos purificada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 12A2, depositada en la ECACC como depósito de patente No. 10091401.

En otra opción, se proporciona una secuencia de aminoácidos purificada en el que la secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo monoclonal se produce por la línea celular de hibridoma 14E2, depositada en la ECACC como depósito de patente 14E2 ECACC No.

La presente descripción también divulga un método para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de HE4a que comprende: a) amplificar un ácido nucleico de una muestra con un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo y otro inverso, en el que los conjuntos de cebadores son seleccionados del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 21 V4 F y la SEQ ID NO: 23_V4 R, la SEQ ID NO: 25 V2F y la SEQ ID NO: 27 V2R; b) aislar el ácido nucleico amplificado.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de unión que se une a la secuencia de la SEQ ID NO 17 N-WFDC de HE4a, en el que la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma 12A2, depositado en el ECACC como depósito de patente No. 10091401 o la línea celular 14E2 depositada en el ECACC como depósito de patente No. 14E2 ECACC No y/o se une a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 17 N-WFDC de HE4a ( E K T G V C P E L Q A D Q N C T Q E C V S D S E C A D N L K C C S A G C A T F C S L P N D ) .

Existen vectores descritos y células huésped que comprenden la molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de unión que se une a la secuencia de la SEQ ID NO 17 N-WFDC de HE4a.

La presente descripción también divulga una proteína de fusión aislada que comprende un polipéptido de HE4a heterólogo unido a un polipéptido del receptor de Fc que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 N-WFDC de HE4a. En una opción, la proteína de fusión aislada se obtiene por amplificación del ácido nucleico mediante el uso de los cebadores codificados por la SEQ ID NO: 29 W1F; la SEQ ID NO: 31 W1R; la SEQ ID NO: 33 W2F, la SEQ ID NO: 35 W2R. En otra opción, la proteína de fusión comprende un polipéptido heterólogo del antígeno HE4a que es una variante de corte y empalme.

Se describe un método de cribado para la presencia de un cáncer de ovario en un sujeto, que comprende: poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con al menos un anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno HE4a para determinar la presencia en la muestra biológica de una molécula que se presenta naturalmente en forma soluble en la muestra y que tenga un determinante antigénico que sea reactivo con al menos un anticuerpo, en las condiciones y durante un tiempo suficientes para detectar la unión del anticuerpo al determinante antigénico y luego detectar la presencia de un cáncer de ovario. En una opción, la muestra biológica es seleccionada del grupo que consiste en sangre, suero, fluido seroso, plasma, linfa, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, una secreción mucosal, una secreción vaginal, líquido ascítico, líquido pleural, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido abdominal, medio de cultivo, medio de cultivo acondicionado y líquido de lavado.

La presente descripción además divulga un método de cribado para la presencia de un cáncer de ovario en un sujeto, que comprende: poner en contacto una muestra biológica que comprende una célula de un sujeto con al menos un anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno HE4a para determinar la presencia en la muestra biológica de una molécula de la superficie celular que tiene un determinante antigénico que es reactivo con al menos un anticuerpo, en las condiciones y durante un tiempo suficientes para detectar la unión del anticuerpo al determinante antigénico y detectar, por lo tanto, la presencia de un cáncer de ovario. En una opción, el anticuerpo está marcado de forma detectable. En otra opción, el anticuerpo no está marcado de forma detectable y donde la detección de la unión del anticuerpo a un determinante antigénico es indirecta.

También se describe un método de cribado para la presencia de un cáncer de ovario en un sujeto, que comprende: poner en contacto una muestra biológica del sujeto con al menos un primer anticuerpo inmovilizado específico para un polipéptido del antígeno HE4a para determinar la presencia de una molécula en la muestra, en las condiciones y durante un tiempo suficientes para unir específicamente el primer anticuerpo al polipéptido del antígeno HE4a y formar así un complejo inmune; eliminar los componentes de la muestra que no se unen específicamente al primer anticuerpo y poner en contacto el complejo inmune con al menos un segundo anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno HE4a, en el que el sitio de combinación del antígeno del segundo anticuerpo no inhibe competitivamente el sitio de combinación del antígeno del primer anticuerpo inmovilizado, en las condiciones y durante un tiempo suficiente para detectar la unión específica del segundo anticuerpo al polipéptido del antígeno HE4a y, por lo tanto, detectar la presencia de un cáncer de ovario. En una opción, el primer anticuerpo inmovilizado es seleccionado del grupo que consiste en 12A2, 14E2, 2H5 y 3D8. En una opción, el segundo anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste en de 12A2, 14E2, 2H5 y 3D8. En otra opción, el primer anticuerpo inmovilizado es 14E2. En otra modalidad más, el segundo anticuerpo es 12A2.

También se describe un método para diagnosticar un sujeto con cáncer de ovario, que comprende: detectar el antígeno HE4a en una muestra de prueba del sujeto; poner en contacto la muestra de prueba con un anticuerpo que tiene un dominio de unión al antígeno que se une a N-WFDC de HE4a durante un tiempo y en las condiciones suficientes para la formación de los complejos anticuerpo/antígeno y detectar la presencia de los complejos en una pantalla en el que la presencia de los complejos que indica la presencia de HE4a en la muestra de prueba se correlaciona con la presencia de cáncer de ovario. En una opción, el anticuerpo comprende un dominio de unión al antígeno que se une a los aminoácidos N-WFDC de HE4a. En otra opción, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que tiene ECACC como No. de depósito de patente 10091401.

También se describe un método para diagnosticar un sujeto con cáncer de ovario, que comprende: detectar el antígeno HE4a en una muestra de prueba del sujeto; poner en contacto la muestra de prueba con un primer anticuerpo que tiene un dominio de unión al antígeno que se une a los aminoácidos N-WFDC de HE4a durante un tiempo y en las condiciones suficientes para la formación de los primeros complejos anticuerpo/antígeno; añadir un conjugado a los primeros complejos anticuerpo/antígeno, en el que el conjugado comprende un segundo anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable, durante un tiempo y en las condiciones suficientes para formar los primeros complejos anticuerpo/antígeno/segundo anticuerpo y detectar la presencia de una señal generada por el compuesto generador de señales en una pantalla en el que la presencia de la señal que indica la presencia del antígeno HE4a en la muestra de prueba se correlaciona con la presencia de cáncer de ovario. En una opción, el anticuerpo comprende un dominio de unión al antígeno que se une a los aminoácidos N-WFDC de HE4a. En otra opción, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que tiene ECACC como No. de depósito de patente 10091401.

También se describe un método de pronóstico para un sujeto con cáncer de ovario, que comprende: detectar el antígeno HE4a en una muestra de prueba del sujeto; poner en contacto la muestra de prueba con un anticuerpo que tiene un dominio de unión al antígeno que se une a N-WFDC de HE4a durante un tiempo y en las condiciones suficientes para la formación de los complejos anticuerpo/antígeno y detectar la presencia de los complejos en una pantalla en el que la presencia de los complejos que indican la presencia del antígeno HE4a en la muestra de prueba se correlaciona con las etapas del cáncer de ovario. En una opción, el anticuerpo comprende un dominio de unión al antígeno que se une a los aminoácidos N-WFDC de HE4a. En otra opción, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que tiene ECACC como No. de depósito de patente 10091401.

También se describe un método de pronóstico para un sujeto con cáncer de ovario, que comprende: detectar el antígeno HE4a en una muestra de prueba del sujeto; poner en contacto la muestra de prueba con un primer anticuerpo que tiene un dominio de unión al antígeno que se une a los aminoácidos N-WFDC de HE4a durante un tiempo y en las condiciones suficientes para la formación de los primeros complejos anticuerpo/antígeno; añadir un conjugado al primer complejo anticuerpo/antígeno, en el que el conjugado comprende un segundo anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable, durante un tiempo y en las condiciones suficientes para formar los primeros complejos anticuerpo/antígeno/segundo anticuerpo y detectar la presencia de una señal generada por el compuesto generador de señales en una pantalla en la que la presencia de la señal que indica la presencia del antígeno HE4a en la muestra de prueba se correlaciona con las etapas del cáncer de ovario. En una opción, el anticuerpo comprende un dominio de unión al antígeno que se une a los aminoácidos N-WFDC de HE4a. En otra opción, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que tiene ECACC como No. de depósito de patente 10091401.

También se describe un método de seguimiento de un sujeto sometido a tratamiento por cáncer de ovario, que comprende: detectar el antígeno HE4a en una muestra de prueba del sujeto; poner en contacto la muestra de prueba con un anticuerpo que tiene un dominio de unión al antígeno que se une a N-WFDC de HE4a durante un tiempo y en las condiciones suficientes para la formación de los complejos anticuerpo/antígeno y detectar la presencia de los complejos en una pantalla en el que la presencia de los complejos que indican la presencia del antígeno HE4a en la muestra de prueba se correlaciona con la capacidad de respuesta al tratamiento. En una opción, el anticuerpo comprende un dominio de unión al antígeno que se une a los aminoácidos N-WFDC de HE4a. En otra opción, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que tiene ECACC como No. de depósito de patente 10091401.

La presente descripción proporciona además un método de seguimiento de un sujeto sometido a tratamiento por cáncer de ovario, que comprende: detectar el antígeno HE4a en una muestra de prueba del sujeto; poner en contacto la muestra de prueba con un primer anticuerpo que tiene un dominio de unión al antígeno que se une a los aminoácidos N-WFDC de HE4a durante un tiempo y en las condiciones suficientes para la formación de los primeros complejos anticuerpo/antígeno; añadir un conjugado a los primeros complejos anticuerpo/antígeno, en el que el conjugado comprende un segundo anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable, durante un tiempo y en las condiciones suficientes para formar los primeros complejos anticuerpo/antígeno/segundo anticuerpo y detectar la presencia de una señal generada por el compuesto generador de señales en una pantalla en el que la presencia de la señal que indica la presencia del antígeno HE4a en la muestra de prueba se correlaciona con la capacidad de respuesta al tratamiento. En una opción, el anticuerpo comprende un dominio de unión al antígeno que se une a los aminoácidos N-WFDC de HE4a. En otra opción, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular de hibridoma que tiene ECACC como No. de depósito de patente 10091401.

También se describe un método para detectar la presencia o ausencia de un cáncer de ovario en un paciente, que comprende: poner en contacto una muestra de tejido ovárico de prueba obtenida del sujeto con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido establecido en la SEQ ID NO: HE4; detectar una cantidad del anticuerpo que se une al polipéptido en la muestra de tejido de cáncer de ovario de prueba y comparar la cantidad del anticuerpo que se une al polipéptido en la muestra de tejido de cáncer de ovario de prueba con un valor de corte predeterminado, en el que la muestra de tejido de cáncer de ovario de prueba es positiva para cáncer de ovario cuando la cantidad del anticuerpo que se une al polipéptido en la muestra de tejido ovárico de prueba está por encima del valor de corte predeterminado, que detecta así la presencia o ausencia de un cáncer de ovario en el sujeto. En una opción, la cantidad del anticuerpo que se une al polipéptido en la muestra de tejido de cáncer de ovario de prueba se determina mediante el uso de la inmunohistoquímica.

Los métodos descritos en la presente descripción conciernen a HE4/HE4a, un miembro de la familia de proteínas de "núcleo de cuatro disulfuros" como se describió. La familia de proteínas de "núcleo de cuatro disulfuros" comprende un grupo heterogéneo de pequeñas moléculas estables al ácido y al calor de función divergente y la cual incluye la proteína de núcleo de cuatro disulfuros del epidídimo humano o "HE4" (Kirchhoff y otros, 1991 Biol. Reprod. 45:350-357; Wang y otros, 1999 Gene 229:101; Schummer y otros, 1999 Gene 238:375). El ADNc de HE4 se aisló por primera vez del epidídimo humano (Kirchhoff y otros, 1991 Biol. Reprod. 45:350-357) y el ADNc de HE4 se detectó más tarde con frecuencia alta en las bibliotecas de ADNc construidas a partir de los carcinomas ováricos (Wang y otros, 1999 Gene 229:101; Schummer y otros, 1999 Gene 238:375). La secuencia revisada de HE4a se divulgó en Hellstrom y otros, 2003, Canc. Res. 63: 3695-3700 y en US 7.270.960. HE4a exhibe una secuencia de aminoácidos que es muy similar, pero distinta de, la secuencia deducida de la molécula a la que se hizo referencia como HE4 en las publicaciones anteriores.

Se han informado varias isoformas de la proteína HE4 como se detalla en la Tabla 1 debajo. Un experto en la técnica apreciará que un anticuerpo monoclonal contra HE4/HE4a de la presente descripción puede unirse a más de una isoforma de HE4 siempre que cada isoforma incluya la secuencia del epítopo relevante para el anticuerpo particular contra HE4/HE4a.

Tabla 1: Isoformas de HE4

Isoforma de HE4 No. acceso Identificador de secuencia

1 NP 006094 SEQ ID NO: 1

2 AAL37488 SEQ ID NO: 3

3 AAL37487 SEQ ID NO: 5

4 AAL37486 SEQ ID NO: 7

5 AAL37485 SEQ ID NO: 9

6 AAH46106 SEQ ID NO: 11

7 AAO52683 SEQ ID NO: 13

8 CAA44869 SEQ ID NO:15

Como se usa en la presente descripción, "sujeto" se refiere a un animal que es el objeto de tratamiento, observación o experimentación. "Animal" incluye a los vertebrados e invertebrados de sangre fría y caliente, tales como los peces, mariscos, reptiles y, en particular, los mamíferos. "Mamífero" incluye, sin limitación, ratones; ratas; conejos conejillos de indias; perros; gatos oveja; cabras; vacas caballos; primates, tales como los monos, chimpancés y simios y humanos.

Los métodos descritos en la presente descripción también incluyen las composiciones y los métodos para la detección de las formas de superficie celular y/o solubles de HE4a que se presentan naturalmente en los sujetos, que incluyen los niveles elevados de tales polipéptidos en los sujetos que tienen ciertos cánceres. Por lo tanto, esta descripción proporciona las composiciones y los métodos útiles para la detección y el diagnóstico de una enfermedad maligna en un sujeto (por ejemplo, cáncer de ovario) mediante la detección específica de dichos polipéptidos de HE4a en la superficie celular y/o solubles.

También se proporciona el diseño de los inmunoensayos y la generación de los anticuerpos monoclonales para la determinación del antígeno HE4a de longitud completa y el uso de los inmunoensayos y de los anticuerpos monoclonales para el diagnóstico serológico del cáncer de ovario, seguimiento del curso clínico de la enfermedad y el diagnóstico del cáncer de ovario por análisis de tejido de HE4a. El establecimiento de nuevos anticuerpos monoclonales contra los epítopos específicos del dominio N-WFDC de HE4a y la combinación de estos anticuerpos con los anticuerpos contra el dominio C-WFDC de HE4a hizo posible diseñar inmunoensayos específicos para la determinación de HE4a de longitud completa.

De acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción, un polipéptido del antígeno HE4a humano (o polipéptido de HE4a) puede detectarse en una muestra biológica de un sujeto o de una fuente biológica. Las muestras biológicas pueden proporcionarse mediante la obtención de una muestra de sangre, una muestra de biopsia, un explante de tejido, un cultivo de órganos, un fluido biológico o cualquier otra preparación de tejido o de células de un sujeto o una fuente biológica. El sujeto o la fuente biológica puede ser un animal humano o no humano, un cultivo celular primario o una línea celular adaptada al cultivo que incluye, pero no se limita a las líneas celulares genéticamente modificadas que pueden contener secuencias de ácido nucleico recombinante episomales o cromosómicamente integradas, líneas celulares inmortalizadas o inmortalizables, líneas celulares híbridas de células somáticas, líneas celulares diferenciadas o diferenciables, líneas celulares transformadas. En determinadas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, se puede sospechar que el sujeto o la fuente biológica tiene o está en riesgo de tener un cáncer de ovario.

En algunas modalidades, la muestra biológica incluye al menos una célula de un sujeto o de una fuente biológica y en otras modalidades, la muestra biológica es un fluido biológico que contiene otro marcador tumoral. Los fluidos biológicos son normalmente líquidos a las temperaturas fisiológicas y pueden incluir fluidos naturales presentes en, extraídos de, expresados o de cualquier otro modo extraídos de un sujeto o fuente biológica. Determinados fluidos biológicos se derivan a partir de tejidos particulares, órganos o regiones localizadas y otros determinados fluidos biológicos pueden estar más global o sistémicamente situados en un sujeto o fuente biológica. Los ejemplos no limitantes de los fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, fluido cefalorraquídeo, saliva, fluidos serosos, plasma, linfa, secreciones de la mucosa de los tejidos y órganos secretores, secreciones vaginales, leche materna, lágrimas y fluidos ascíticos, tales como los asociados con los tumores no sólidos. Los ejemplos adicionales incluyen los fluidos de las cavidades pleural, pericárdica, peritoneal, abdominal y otras cavidades corporales. Los fluidos biológicos pueden incluir, además, soluciones líquidas puestas en contacto con un sujeto o fuente biológica, por ejemplo, un medio de cultivo celular y de órganos que incluye un medio acondicionado para las células u órganos y los fluidos de lavado. En otras modalidades, la muestra biológica es una solución líquida libre de células, tal como suero sanguíneo, plasma o el sobrenadante de la orina centrifugada.

En otras determinadas modalidades, la muestra biológica comprende una célula intacta. En otras determinadas opciones, la muestra biológica comprende un extracto celular que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido del antígeno HE4a o un fragmento o variante del mismo. En aún otras modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, se desea que las células se rompan o lisen física o químicamente antes del ensayo para proporcionar el contenido celular para el análisis.

Como se usa en la presente descripción, una "molécula que se presenta naturalmente en forma soluble" en una muestra puede ser una proteína soluble, polipéptido, péptido, aminoácido o derivado de los mismos; un lípido, ácido graso o similar o derivado del mismo; un carbohidrato, sacárido o similar o derivado de los mismos, un ácido nucleico, nucleótido, nucleósido, purina, pirimidina o molécula relacionada o derivado de los mismos o similares o cualquier combinación de los mismos, tales como, por ejemplo, una glicoproteína, un glicolípido, una lipoproteína, un proteolípido o cualquier otra molécula biológica que sea un constituyente soluble o libre de células de una muestra biológica como se proporciona en la presente descripción. Una "molécula que se presenta naturalmente en forma soluble" se refiere además a una molécula que está en solución o presente en una muestra biológica, que incluye un fluido biológico como se proporciona en la presente descripción y que no se une a la superficie de una célula intacta. Por ejemplo, una molécula que se presenta naturalmente en forma soluble puede incluir, pero no necesita limitarse a un soluto; un componente de un complejo macromolecular; un material que se desprende, se secreta o se exporta a partir de una célula; un coloide; una micropartícula o nanopartícula u otra partícula en suspensión fina o similar.

La presencia de una enfermedad maligna en un sujeto (por ejemplo, cáncer de ovario) se refiere a la presencia de células displásicas, cancerosas y/o transformadas en el sujeto, que incluyen, por ejemplo, células neoplásicas, tumorales, células inhibidas sin contacto o transformadas oncogénicamente o similares. A modo de ilustración y no de limitación, en el contexto de los métodos descritos en la presente descripción, una enfermedad maligna puede referirse además a la presencia en un sujeto de células cancerosas que son capaces de secretar, diseminar, exportar o liberar un polipéptido del antígeno HE4a (o un polipéptido de HE4a) de tal manera que se puedan detectar los niveles elevados de dicho polipéptido en una muestra biológica del sujeto. En algunas modalidades, por ejemplo, dichas células cancerosas son células epiteliales malignas, tales como las células de carcinoma y en algunas modalidades particularmente, dichas células cancerosas son células de mesotelioma maligno, las cuales son variantes transformadas de las células epiteliales escamosas o células mesoteliales que se encuentran, por ejemplo, en el recubrimiento de las cavidades pleurales, pericárdicas, peritoneales, abdominales y otras cavidades corporales.

En una modalidad, las células tumorales de ovario, cuya presencia significa la presencia de un cáncer de ovario, pueden incluir las células de cáncer de ovario primario y metastásico. Los criterios para clasificar un tumor maligno como se conocen bien en la técnica, son el establecimiento y la caracterización de las líneas celulares de carcinoma de ovario humano a partir de los tumores primarios y metastásicos. En otras opciones, la presente descripción también contempla que la enfermedad maligna puede ser mesotelioma, carcinoma pancreático, carcinoma de pulmón de células no pequeñas u otra forma de cáncer, que incluye cualquiera de los diversos carcinomas, tales como carcinomas de células escamosas y adenocarcinomas y también incluye sarcomas y tumores malignos hematológicos (por ejemplo, leucemias, linfomas, mielomas, etc.). La clasificación de estas y de otras enfermedades malignas se conoce por aquellos que están familiarizados con la técnica y la presente descripción proporciona la determinación de la presencia de un polipéptido de HE4a en una enfermedad maligna de este tipo sin experimentación excesiva.

Los valores de referencia se proporcionan en los ejemplos contenidos en la presente descripción. Dichos valores son adecuados para la práctica de los métodos descritos en la presente descripción. Sin embargo, debe señalarse que el uso de los métodos descritos en la presente descripción no se limita a aquellos valores de referencia o esos datos. Los expertos en la técnica pueden obtener un valor de referencia para sus necesidades particulares. Dicho valor de referencia puede obtenerse mediante el análisis de la expresión de HE4 en los pacientes a medida que se someten a los procedimientos de biopsia para las masas de cáncer de ovario sospechosas de ser malignas. Los métodos para obtener dichos valores de referencia se proporcionan en los ejemplos. Además, se pueden obtener otros valores de referencia para centrarse en categorías específicas de los pacientes. Se prevé que dichas categorías pueden incluir edad, antecedentes genéticos, riesgo de cáncer, historial médico, tipo de sangre, características físicas, tales como la masa corporal y otras categorías.

Como se proporciona en la presente descripción, el método de cribado para la presencia de una enfermedad maligna en un sujeto puede emplear un anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno HE4a o un anticuerpo específico para un polipéptido de HE4a. Los anticuerpos que son específicos para un polipéptido del antígeno HE4a (o un polipéptido de HE4a) se generan fácilmente como anticuerpos monoclonales o como antisueros policlonales o se pueden producir como inmunoglobulinas (Ig) modificadas genéticamente que están diseñadas para tener propiedades deseables mediante el uso de los métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, los anticuerpos pueden incluir las IgG recombinantes, las proteínas de fusión quiméricas que tienen secuencias derivadas de inmunoglobulinas o de anticuerpos "humanizados" (véase, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. No. 5,693,762; 5,585,089; 4,816,567; 5,225,539; 5,530,101) que pueden usarse todas para la detección de un polipéptido de HE4a humano de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción. Dichos anticuerpos pueden prepararse como se proporciona en la presente descripción, que incluye mediante la inmunización con los polipéptidos de HE4a como se describe más abajo. Por ejemplo, se describen las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de HE4a, de manera que los expertos en la técnica pueden preparar rutinariamente estos polipéptidos para su uso como inmunógenos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales, tales como 12A2, 14E2, 2H5 y 3D8, los cuales se describen con mayor detalle más abajo, pueden usarse para practicar determinados métodos de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción.

El término "anticuerpos" incluye a los anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de los mismos, tales como F(ab')²y fragmentos Fab, así como cualquiera pareja de unión que se presenta naturalmente o producida recombinantemente, las cuales son moléculas que se unen específicamente a un polipéptido de HE4a. Los anticuerpos se definen como "inmunoespecíficos" o específicamente unidos si se unen al polipéptido de HE4a con una Ka mayor que o igual a aproximadamente 104-M-1, preferentemente mayor que o igual a aproximadamente 105 M-1, con mayor preferencia mayor que o igual a aproximadamente 106 M-1 y aún con mayor preferencia mayor que o igual a aproximadamente 107 M-1. Las afinidades de las parejas de unión o de los anticuerpos pueden determinarse fácilmente mediante el uso de las técnicas convencionales. La determinación de otras proteínas como parejas de unión de un polipéptido de HE4a puede realizarse mediante el uso de cualquiera de una serie de métodos conocidos para identificar y obtener proteínas que interactúan específicamente con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, un sistema de cribado de dos híbridos en levadura, tales como, por ejemplo, los descritos en los documentos U.S. 5,283,173 y U.S.

5,468,614. Los métodos descritos en la presente descripción también incluyen el uso de un polipéptido de HE4a y los péptidos en base a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de HE4a, para preparar las parejas de unión y los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de HE4a.

Los anticuerpos pueden prepararse generalmente mediante cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. En una de dicha técnica, un inmunógeno que comprende un polipéptido de HE4a, por ejemplo, una célula que tiene un polipéptido de HE4a en su superficie o un polipéptido de HE4a aislado, se inyecta inicialmente en un animal adecuado (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas y cabras), preferentemente de acuerdo con un esquema predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo y los animales se sangran periódicamente. Los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido de HE4a pueden purificarse luego a partir de tales antisueros mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad mediante el uso del polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.

Los anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos de HE4a o variantes de los mismos pueden prepararse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, estos métodos pueden involucrar la preparación de las líneas celulares inmortales capaces de producir los anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Dichas líneas celulares pueden producirse, por ejemplo, a partir de las células de bazo obtenidas de un animal inmunizado como se describió anteriormente. Luego, las células del bazo se inmortalizan mediante, por ejemplo, la fusión con una pareja de fusión de células de mieloma, tal como una que es singénica con el animal inmunizado. Por ejemplo, las células del bazo y las células de mieloma pueden combinarse con un agente promotor de la fusión de las membranas, tales como el polietilenglicol o un detergente no iónico durante pocos minutos y luego sembrarse a baja densidad en un medio selectivo que soporta el crecimiento de las células híbridas, pero no de las células de mieloma. Un ejemplo de una técnica de selección preferida usa la selección con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, usualmente aproximadamente de 1 a 2 semanas, se observan las colonias de los híbridos. Las colonias individuales se seleccionan y se prueban para la actividad de unión contra el polipéptido. Se prefieren los hibridomas que tienen alta reactividad y especificidad. Los hibridomas que generan los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a los polipéptidos de HE4 se contemplan en los métodos descritos en la presente descripción.

Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse a partir de los sobrenadantes de las colonias de hibridomas en crecimiento. Además, pueden emplearse diversas técnicas para mejorar el rendimiento, tales como la inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, tal como un ratón u otro huésped adecuado. Luego, los anticuerpos monoclonales pueden cosecharse a partir del fluido de ascitis o la sangre. Los contaminantes pueden eliminarse de los anticuerpos mediante las técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse mediante cromatografía sobre Proteína G o Proteína A inmovilizadas mediante el uso de las técnicas comunes.

Dentro de determinadas modalidades, pueden usarse los fragmentos de anticuerpos con unión al antígeno. Dichos fragmentos incluyen los fragmentos Fab, los cuales pueden prepararse mediante el uso de las técnicas comunes (por ejemplo, mediante digestión con la papaína para producir los fragmentos Fab y Fc). Los fragmentos Fab y Fc pueden separarse mediante cromatografía de afinidad (por ejemplo, en columnas de proteína A inmovilizada), mediante el uso de las técnicas comunes. Dichas técnicas se conocen bien en la técnica, véase, por ejemplo, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston.

También se describen las proteínas de fusión de HE4. Se conocen en la técnica las proteínas de fusión multifuncionales que tienen afinidades de unión específicas para los antígenos preseleccionados en virtud de los dominios de la región V de inmunoglobulina codificados por las secuencias de ADN unidas en marco a las secuencias que codifican diversas proteínas efectoras, por ejemplo, como se describe en los documentos EP-B1-0318554, U.S. 5,132,405, U.S. 5,091,513 y U.S. 5,476,786. Dichas proteínas efectoras incluyen los dominios polipeptídicos que pueden usarse para detectar la unión de la proteína de fusión mediante cualquiera de una variedad de técnicas con las cuales los expertos en la técnica estarán familiarizados, que incluyen, pero no se limitan a, una secuencia mimética de biotina, modificación covalente directa con una fracción marcadora detectable, unión no covalente a una molécula indicadora marcada específica, modificación enzimática de un sustrato detectable o inmovilización (covalente o no covalente) sobre un soporte en fase sólida.

Pueden generarse y seleccionarse también los anticuerpos de cadena sencilla para su uso en los métodos descritos en la presente descripción por un método, tal como presentación en fagos (véase a manera de ejemplo, el documento U.S.

5,223,409). Brevemente, en este método, las secuencias de ADN se pueden insertar en el gen III o el gen VIII de un fago filamentoso, tal como el M13. Se han desarrollado varios vectores con sitios de clonación múltiple para la inserción ^{(McLafferty, M. A., Kent, K. A., Ladner, R. C. y Markland, W. Gene 128, 29-36 (1993); Scott JK, Smith}Gp. ^{Searching for}peptide ligands with an epitope library. Science. 27 de julio de 1990; 249(4967):386-390; Smith GP, Scott JK. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. Methods Enzymol. 1993; 217:228-257). Las secuencias de ADN insertadas pueden generarse aleatoriamente o pueden ser variantes de un dominio de unión conocido por unirse a un polipéptido de HE4a. El péptido codificado por la secuencia insertada se presenta en la superficie del bacteriófago. Los bacteriófagos que expresan un dominio de unión para un polipéptido de HE4a se seleccionan por unión a un polipéptido de HE4a inmovilizado, por ejemplo, un polipéptido recombinante preparado mediante el uso de los métodos bien conocidos en la técnica y las secuencias codificantes de ácidos nucleicos como se describe en la presente descripción. Los fagos no unidos se eliminan mediante un lavado, que contiene normalmente 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA y sin sal o con una baja concentración de sal. Los fagos unidos se eluyen con un tampón que contiene sal, por ejemplo. La concentración de NaCl se incrementa gradualmente hasta que se eluyen todos los fagos. Normalmente, los fagos que se unen con mayor afinidad se liberarán mediante las concentraciones más elevadas de sal. Los fagos eluidos se propagan en el huésped bacteriano. Pueden realizarse rondas adicionales de selección para seleccionar unos pocos fagos que se unen con alta afinidad. Luego, se determina la secuencia de ADN del inserto en el fago unido que se une. Una vez que se conoce la secuencia de aminoácidos predicha del péptido que se une, puede prepararse suficiente péptido para su uso en la presente descripción como un anticuerpo específico para un polipéptido de HE4a, mediante medios recombinantes o sintéticamente. Los medios recombinantes se usan cuando el anticuerpo se produce como una proteína de fusión. El péptido también puede generarse como una serie en tándem de dos o más péptidos similares o diferentes, para maximizar la afinidad o la unión.

En la presente descripción, se proporcionan varios formatos de ensayo. Para detectar un determinante antigénico reactivo con un anticuerpo específico para un polipéptido de HE4a, el reactivo de detección es normalmente un anticuerpo, el cual puede prepararse como se describe en la presente descripción o mediante cualquiera de los diversos métodos conocidos en la técnica. Existe una variedad de formatos de ensayo conocidos por los que tienen experiencia normal en la técnica para usar un anticuerpo para detectar un polipéptido en una muestra, que incluyen, pero no se limitan a, el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión y otras técnicas. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston. Por ejemplo, el ensayo puede realizarse en un formato de transferencia Western, en el que una preparación de proteína a partir de la muestra biológica se somete a una electroforesis en gel, se transfiere a una membrana adecuada y se deja reaccionar con el anticuerpo. Luego, la presencia del anticuerpo en la membrana puede detectarse mediante el uso de un reactivo de detección adecuado, como se conoce bien en la técnica y se describe más abajo.

En otra modalidad, el ensayo implica el uso de un anticuerpo inmovilizado en un soporte sólido para unirse al polipéptido de HE4 diana y retirarlo del resto de la muestra. Luego, el polipéptido de HE4a unido puede detectarse mediante el uso de un segundo anticuerpo reactivo con un determinante antigénico del polipéptido de HE4a diferente, por ejemplo, un reactivo que contiene una fracción indicadora detectable. Como un ejemplo no limitante, de acuerdo con esta modalidad, el anticuerpo inmovilizado y el segundo anticuerpo que reconocen determinantes antigénicos diferentes pueden ser dos de los anticuerpos monoclonales ilustrativos 2H5 y 3D8. Alternativamente, puede usarse un ensayo competitivo, en el cual un polipéptido de HE4a se marca con una fracción indicadora detectable y se permite que se una al anticuerpo específico por el polipéptido de HE4a inmovilizado después de la incubación del anticuerpo inmovilizado con la muestra. El grado al cual los componentes de la muestra inhiben la unión del polipéptido marcado al anticuerpo es indicativo de la reactividad de la muestra con el anticuerpo inmovilizado y como resultado, es indicativo del nivel de HE4a en la muestra.

El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por los expertos en la técnica a los cuales puede unirse el anticuerpo, tal como un pocillo de prueba en una placa de microtitulación, un filtro de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una perla o disco, tales como vidrio, fibra de vidrio, látex o un plástico, tales como poliestireno o polivinilcloruro. El anticuerpo puede inmovilizarse en el soporte sólido mediante el uso de una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, las cuales se describen ampliamente en la bibliografía científica y en las patentes.

En determinadas modalidades, el ensayo para la detección del polipéptido del antígeno HE4 en una muestra es un ensayo en sándwich de dos anticuerpos. Este ensayo puede realizarse al poner en contacto primero un anticuerpo específico para el polipéptido de HE4a (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, tales como 12A2, 14E2, 2H5 y 3D8) que se han inmovilizado sobre un soporte sólido, comúnmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la muestra biológica, de manera que una molécula soluble que se presenta naturalmente en la muestra y que tiene un determinante antigénico que es reactivo con el anticuerpo se deja que se una al anticuerpo inmovilizado (por ejemplo, es suficiente generalmente un tiempo de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente) para formar un complejo antígeno-anticuerpo o un complejo inmunológico. Luego, los constituyentes no unidos de la muestra se eliminan de los complejos inmunes inmovilizados. A continuación, se añade un segundo anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno HE4a, en donde el sitio de combinación del antígeno del segundo anticuerpo no inhibe competitivamente la unión del sitio de combinación del antígeno del primer anticuerpo inmovilizado a un polipéptido de HE4a (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, tal como 2H5 o 3D8 que no es el mismo que el anticuerpo monoclonal inmovilizado en el soporte sólido). El segundo anticuerpo puede marcarse de manera detectable como se proporciona en la presente descripción, de manera que se puede detectar directamente. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede detectarse indirectamente mediante el uso de un antianticuerpo secundario marcado de manera detectable (o "segunda etapa") o mediante el uso de un reactivo de detección específico como se proporciona en la presente descripción. Los métodos descritos en la presente descripción no se limitan a ningún método de detección en particular, ya que aquellos que están familiarizados con los inmunoensayos apreciarán que existen numerosos reactivos y configuraciones para detectar inmunológicamente un antígeno en particular en un inmunoensayo en sándwich de dos anticuerpos.

En determinadas opciones de los métodos descritos en la presente descripción que usan el ensayo en sándwich de dos anticuerpos descrito anteriormente, el primer anticuerpo inmovilizado específico para un polipéptido del antígeno HE4a es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno HE4a es un anticuerpo policlonal. Pueden usarse cualquier combinación de los anticuerpos contra HE4 no competitivos con los métodos descritos en la presente descripción. Lo que incluyen a los anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y las combinaciones de los mismos. En otras modalidades determinadas de los métodos descritos en la presente descripción, el primer anticuerpo inmovilizado específico para un polipéptido del antígeno HE4 es un anticuerpo monoclonal de la invención y el segundo anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno de HE4 es un anticuerpo policlonal. En otras modalidades determinadas de los métodos descritos en la presente descripción, el primer anticuerpo inmovilizado específico para un polipéptido del antígeno HE4 es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno HE4 es un anticuerpo monoclonal de la invención. En otras opciones determinadas altamente preferidas de los métodos descritos en la presente descripción, el primer anticuerpo inmovilizado específico para un polipéptido del antígeno HE4a es un anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno HE4a es un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, en estas modalidades, se debe señalar que los anticuerpos monoclonales 12A2, 14E2, ²H⁵y 3D8 como se proporcionan en la presente descripción reconocen determinantes antigénicos diferentes y no competitivos (por ejemplo, epítopos) en los polipéptidos de HE4, de manera que puede emplearse cualquier combinación por pares de estos anticuerpos monoclonales. En particular, determinadas combinaciones son útiles para detectar las variantes específicas de HE4 de longitud completa o las variantes de corte y empalme. En otras opciones de los métodos descritos en la presente descripción, el primer anticuerpo inmovilizado específico para un polipéptido del antígeno HE4a y/o el segundo anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno HE4a puede ser cualquiera de los tipos de anticuerpos conocidos en la técnica y referidos en la presente descripción, por ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')², proteínas de fusión de la región V de inmunoglobulina o anticuerpos de cadena sencilla. Aquellos familiarizados con la técnica apreciarán que los métodos descritos en la presente descripción abarcan el uso de otras formas de anticuerpos, fragmentos y derivados en los métodos descritos y reivindicados en la presente descripción.

En determinadas modalidades, el segundo anticuerpo puede contener un marcador o fracción indicadora detectable, tal como una enzima, colorante, radionúclido, grupo luminiscente, grupo fluorescente o biotina o similares. Pueden usarse cualquier fracción indicadora o marcador con los métodos descritos en la presente descripción siempre que la señal de los mismos se relacione directamente o sea proporcional a la cantidad de anticuerpo que permanece en el soporte después del lavado. La cantidad del segundo anticuerpo que permanece unida al soporte sólido se determina luego mediante el uso de un método apropiado para el marcador o la fracción indicadora detectable específica. Para los grupos radioactivos, son apropiados generalmente el conteo por centelleo o los métodos autorradiográficos. Los conjugados anticuerpo-enzima se pueden preparar mediante el uso de una variedad de técnicas de acoplamiento (a modo de ejemplo, véase Scouten, W. H. (1987) A survey of enzyme coupling techniques. Methods in. Enzymology 135, 30-65). El método espectroscópico puede usarse para detectar los colorantes (que incluyen, por ejemplo, los productos colorimétricos de las reacciones enzimáticas), grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede detectarse mediante el uso de la avidina o la estreptavidina, acoplada a un grupo indicador diferente (comúnmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos indicadores de las enzimas pueden detectarse generalmente mediante la adición del sustrato (generalmente durante un período de tiempo específico), seguido de análisis espectroscópico, espectrofotométrico u otro análisis de los productos de la reacción. Pueden usarse estándares y adiciones estándar para determinar el nivel del antígeno en una muestra, mediante el uso de las técnicas bien conocidas.

Determinados métodos descritos en la presente descripción implican el uso de un polipéptido del antígeno HE4a como se proporciona en la presente descripción para cribar la presencia de un cáncer de ovario mediante la detección de los anticuerpos inmunoespecíficamente reactivos en una muestra biológica de una fuente biológica o sujeto. De acuerdo con esta opción, un polipéptido del antígeno HE4a (o un fragmento o variante del mismo que incluye un polipéptido del antígeno HE4a truncado como se proporciona en la presente descripción) se marca de manera detectable y se pone en contacto con una muestra biológica para detectar la unión al polipéptido del antígeno HE4a de un anticuerpo que se presenta naturalmente en forma soluble en la muestra. Por ejemplo, el polipéptido del antígeno HE4a puede marcarse biosintéticamente mediante el uso de las secuencias descritas en la presente descripción junto con los métodos bien conocidos, tales como la incorporación durante la traducción in vitro de un aminoácido fácilmente detectable (por ejemplo, marcado radiactivamente) o mediante el uso de otras fracciones indicadoras detectables, tales como las descritas anteriormente. El experto en la técnica apreciaría fácilmente que esta opción indica que determinados polipéptidos de HE4a, tales como los polipéptidos de fusión de HE4a descritos en la presente descripción pueden proporcionar los péptidos que son particularmente inmunogénicos y dan lugar a los anticuerpos específicos y detectables. Por ejemplo, de acuerdo con esta teoría, determinados polipéptidos de fusión de HE4a pueden representar antígenos "no propios" que provocan una respuesta inmune ávida, mientras que los polipéptidos de HE4a que carecen de los dominios de fusión pueden ser vistos por el sistema inmunitario como más parecidos a los antígenos "propios" que no provoca fácilmente inmunidad humoral o mediada por células.

Un método de cribado para la presencia de una enfermedad maligna de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción puede mejorarse adicionalmente mediante la detección de más de un marcador asociado a tumor en una muestra biológica de un sujeto. En consecuencia, los métodos descritos proporcionan un método de cribado que, además de detectar la reactividad de un componente que se presenta naturalmente con un anticuerpo específico para un polipéptido del antígeno HE4a, también incluye la detección de al menos un marcador soluble adicional de una enfermedad maligna mediante el uso de los métodos establecidos conocidos en la técnica, así como los descritos. Como se indicó anteriormente, existen actualmente varios antígenos asociados a tumores solubles que son detectables en las muestras de los fluidos biológicos obtenidos fácilmente.

Los métodos de cribado ilustrativos para identificar a los pacientes con una mayor probabilidad de tener cáncer de ovario comprenden generalmente detectar en una muestra del cuerpo del paciente la expresión de una pluralidad de biomarcadores que se sobreexpresan selectivamente en el cáncer de ovario. La sobreexpresión de los biomarcadores es indicativa de una mayor probabilidad de que la paciente tenga cáncer de ovario. Los métodos de la presente descripción pueden comprender, por ejemplo, un análisis de "dos etapas", en el que se realiza una primera etapa de ensayo para detectar la expresión de un primer biomarcador (por ejemplo, HE4/HE4a) o un panel de biomarcadores. Si el primer biomarcador o panel de biomarcadores está sobreexpresado, se realiza una segunda etapa de ensayo para detectar la expresión de un segundo biomarcador o panel de biomarcadores. La sobreexpresión del primer y segundo biomarcadores o paneles de biomarcadores es indicativo de una mayor probabilidad de que la paciente tenga cáncer de ovario.

Como se describe en la presente descripción, se pueden detectar las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de HE4a, mediante el uso de las técnicas comunes de hibridación y/o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los expertos en la técnica pueden diseñar las sondas y los cebadores adecuados en base a las secuencias de ADNc de HE4a proporcionadas en la presente descripción. Los ensayos generalmente se pueden realizar mediante el uso cualquiera de una variedad de muestras obtenidas de una fuente biológica, tal como células eucariotas, bacterias, virus, extractos preparados a partir de dichos organismos y fluidos encontrados dentro de los organismos vivos.

Las técnicas comunes de recombinación del ADN y de clonación molecular usadas en los ejemplos se conocen bien en la técnica.

A partir de las propiedades fisicoquímicas e inmunoquímicas de los polipéptidos de HE4a descritos en la presente memoria y mediante el uso de las secuencias de ácido nucleico descritas actualmente que codifican HE4a, una persona con experiencia normal en la técnica también puede preparar un polipéptido de HE4a recombinante que se puede utilizar para producir y caracterizar a los anticuerpos específicos de acuerdo con las metodologías bien conocidas. Los polipéptidos de HE4a se pueden expresar en las células de mamíferos, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de los promotores apropiados. También se pueden emplear los sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas mediante el uso de ARN derivados de las regiones codificantes de ADN del polipéptido de HE4a descritas en la presente descripción. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso en los huéspedes procarióticos y eucarióticos se han descrito previamente y son bien conocidos por los expertos en la técnica. En las opciones preferidas descritas en la presente descripción, los polipéptidos de HE4a se expresan en las células de mamífero.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido del antígeno HE4a o una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con dicho ácido nucleico que codifica el polipéptido de HE4a o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria al mismo.

Las variantes exhiben preferentemente al menos aproximadamente 70 % de identidad, más preferentemente al menos aproximadamente 80 %-85 % de identidad y lo más preferentemente al menos aproximadamente 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identidad con una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido del antígeno HE4a nativo o una porción del mismo. El porcentaje de identidad se puede determinar fácilmente mediante la comparación de las secuencias mediante el uso de algoritmos informáticos bien conocidos por los que tienen una experiencia normal en la técnica, tales como Align o el algoritmo BLAST (Altschul S.F. (1991) Amino acid substitution matrices from an information theoretic perspective. Journal of Molecular Biology 219: 555-565; Henikoff S, Henikoff JG. Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc Natl Acad Sci U S A. 15 de noviembre de 1992; 89(22): 10915-9, que está disponible en el sitio web de NCBI (http://www/ncbi.nlm.n¡h.gov/cg¡-bin/BLAST).

Determinadas variantes son sustancialmente homólogas a un gen nativo. Tales variantes de polinucleótidos son capaces de hibridar en condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia de ADN o ARN que se presentan naturalmente que codifican un antígeno HE4a nativo (o una secuencia complementaria). Las condiciones moderadamente rigurosas adecuadas incluyen, por ejemplo, las siguientes etapas o sus equivalentes: prelavar en una solución de SSC 5x, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridar a 50 °C-65 °C, SSC 5x, durante la noche; seguido de dos lavados a 65 °C durante 20 minutos con cada uno de SSC 2x, 0,5x y 0,2x que contienen SDS al 0,1 %. Para mayor rigurosidad, las condiciones pueden incluir, por ejemplo, un lavado en SSC 0,1x y SDS al 0,1 % a 60 °C durante 15 minutos o el equivalente. Una persona con experiencia normal en la técnica apreciará fácilmente los parámetros que pueden variarse como una cuestión de rutina para crear las condiciones de hibridación apropiadamente estrictas que sean de alguna manera selectivas para un ácido nucleico particular de interés y apreciará además que tales condiciones pueden ser una función de las secuencias de ácidos nucleicos particulares implicadas en la hibridación.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de HE4a o cualquier otro polipéptido de HE4a para su uso como se describe en la presente descripción, pueden incluir, pero no se limitan a: sólo la secuencia codificante del polipéptido de HE4a; la secuencia codificante del polipéptido de HE4a y la secuencia codificante adicional; la secuencia codificante para el polipéptido de HE4a (y la secuencia codificante opcionalmente adicional) y la secuencia no codificante, tales como los intrones o las secuencias no codificantes 5' y/o 3' de la secuencia codificante para el polipéptido de HE4a, que por ejemplo puede incluir además pero no es necesario limitarse a una o más secuencias reguladoras de ácido nucleico que pueden ser un promotor regulado o regulable, potenciador, otra secuencia reguladora de la transcripción, secuencia de unión al represor, secuencia reguladora de la traducción o cualquier otra secuencia reguladora de ácido nucleico. Por lo tanto, el término "ácido nucleico que codifica un polipéptido de HE4a" abarca un ácido nucleico que incluye solo la secuencia codificante del polipéptido, así como un ácido nucleico que incluye la(s) secuencia(s) codificantes y/o no codificantes adicionales.

También se describen las variantes de los ácidos nucleicos descritos en la presente descripción que codifican los fragmentos, análogos y derivados de un polipéptido de HE4a, por ejemplo, los polipéptidos de HE4a humano que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de la s Eq ID NO: HE4. Las variantes de los ácidos nucleicos que codifican HE4a pueden ser las variantes alélicas o de corte y empalme que se presentan naturalmente de los ácidos nucleicos o las variantes de origen no natural. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de ácido nucleico que puede tener al menos una sustitución, una deleción o una adición de uno o más nucleótidos, cualquiera de los cuales no altera sustancialmente la función del polipéptido de HE4a codificado. Pueden obtenerse las variantes y los derivados de HE4a mediante las mutaciones de las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de HE4a. Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa se pueden lograr mediante cualquiera de varios métodos convencionales. Las mutaciones se pueden introducir en loci particulares mediante la síntesis de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por los sitios de restricción que permiten la ligación a los fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción deseada del aminoácido.

Alternativamente, se pueden emplear los procedimientos de mutagénesis específicos de sitio dirigidas por oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado en el que los codones predeterminados se pueden alterar por sustitución, deleción o inserción como es bien conocido por los expertos en la técnica.

También se describen en la presente descripción las construcciones de ADN equivalentes que codifican diversas adiciones o sustituciones de los residuos o las secuencias de aminoácidos o deleciones de los residuos o las secuencias terminales o internas que no son necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, las secuencias que codifican los residuos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica pueden alterarse para hacer que los residuos de Cys sean eliminados o reemplazados por otros aminoácidos, que evitan la formación de los puentes disulfuro intramoleculares incorrectos tras la renaturalización. Pueden prepararse otros equivalentes mediante la modificación de los residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para potenciar la expresión en los sistemas de levadura en los que está presente la actividad proteasa de KEX2. A modo de ejemplo, el documento EP 212,914 divulga el uso de la mutagénesis específica de sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 se inactivan mediante la eliminación, adición o sustitución de los residuos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg para eliminar la aparición de estos residuos básicos adyacentes. Los emparejamientos de Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la escisión de KEX2 y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en Lys-Lys representa un enfoque conservador y preferido para inactivar los sitios de KEX2.

La(s) secuencia(s) de ADN apropiada(s) puede(n) insertarse en cualquiera de varios vectores bien conocidos apropiados para la célula huésped seleccionada mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en sitio(s) de restricción por endonucleasa apropiado(s) mediante los procedimientos conocidos en la técnica. Las técnicas comunes para la clonación, aislamiento, amplificación y purificación del ADN, para las reacciones enzimáticas que involucran la ligasa de ADN, la polimerasa de ADN y las endonucleasas de restricción y diversas técnicas de separación son las conocidas y comúnmente empleadas por los expertos en la técnica.

Los ejemplos de los sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. enero de 1981;23(1): 175-82 y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados y además cualquier sitio de unión al ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, secuencias transcripcional de terminación y secuencias 5' no transcritas flanqueantes. Las secuencias de ADN derivadas, por ejemplo, de los sitios de poliadenilación y corte y empalme de SV40 pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. La introducción de la construcción en la célula huésped puede realizarse mediante una diversidad de métodos con los que los expertos en la técnica estarán familiarizados, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano o electroporación (Davis, L.G., Dibner, M.D. y Battey, J.F.: Basic Methods in. Molecular Biology. Elsevier, New York, 1986).

El polipéptido de HE4a descrito en la presente descripción puede ser un polipéptido no modificado o puede ser un polipéptido que ha sido modificado postraduccionalmente, por ejemplo, mediante glicosilación, fosforilación, acilación grasa que incluye la modificación de anclaje de glicosilfosfatidilinositol o similar, escisión de fosfolipasa, tal como la hidrólisis específica por fosfatidilinositol mediada por la fosfolipasa c o similares, escisión por proteasa, desfosforilación o cualquier otro tipo de modificación postraduccional de proteína, tal como una modificación que implica la formación o escisión de un enlace químico covalente.

Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a los polipéptidos de HE4a, los polipéptidos del antígeno HE4a o las proteínas de fusión HE4a, se refieren a cualquier polipéptido de HE4a que retiene esencialmente la misma función biológica y/o actividad como tal polipéptido. Por lo tanto, un análogo puede incluir una isoforma del polipéptido del antígeno HE4a, tal como un polipéptido de HE4a modificado postraduccionalmente de manera diferencial o una variante, tal como una variante de corte y empalme. Como es bien conocido en la técnica, una "variante de corte y empalme" incluye las formas alternativas o variantes de un polipéptido que surgen del procesamiento intracelular diferencial de una transcripto de ARN. Por ejemplo, dos especies de ARNm distintas pueden ser variantes de corte y empalme entre sí donde solo difieren por la inclusión de toda o una parte de una secuencia correspondiente a un exón particular en una especie de ARNm y su ausencia en la otra especie. Como apreciarán los familiarizados con la técnica, pueden existir otras relaciones estructurales entre las especies de ARNm que generalmente se considerarían como variantes de corte y empalme. Un polipéptido de HE4a incluye además una proproteína que puede activarse por escisión de la porción de proproteína para producir un polipéptido de HE4a activo.

Las funciones y/o actividades biológicas de los fragmentos, los derivados y los análogos de los polipéptidos de HE4a o de los polipéptidos del antígeno HE4a incluyen, pero no se limitan a, el uso de dichos polipéptidos como marcadores en un método de cribado de la presencia de una enfermedad maligna en un sujeto como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, al detectar en una muestra del sujeto una molécula que se presenta naturalmente en forma soluble y que tiene un determinante antigénico que es reactivo con al menos un anticuerpo específico para un polipéptido de HE4a, un experto en la técnica puede dar seguimiento a una función biológica y/o actividad de un polipéptido de HE4a. Además, debe tenerse en cuenta que en determinadas modalidades el método de cribado de la presente invención está dirigido a comparar las cantidades relativas, niveles y/o cantidades de una molécula detectable que se presenta naturalmente en forma soluble y que tiene un determinante antigénico que es reactivo con al menos un anticuerpo específico para un polipéptido de HE4a en cada uno de (i) una primera muestra biológica de un primer sujeto sospechoso de tener una enfermedad maligna y (ii) una segunda muestra biológica de un segundo sujeto que se sabe que está libre de una enfermedad maligna. En consecuencia, la presencia cuantitativa relativa de un polipéptido de HE4a en una muestra biológica puede ser una función y/o actividad biológica de un polipéptido de HE4a, aunque dicha función y/o actividad no debería estar tan limitada.

Un fragmento, derivado o análogo de un polipéptido de HE4a puede ser (i) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un residuo de aminoácido conservado); (ii) uno en el que se fusionan aminoácidos adicionales al polipéptido de HE4a, incluidos los aminoácidos que pueden emplearse para la purificación del polipéptido de HE4a o una secuencia de proproteína o (iii) un polipéptido de HE4a truncado. Se considera que tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en la presente descripción.

Un polipéptido de HE4a truncado puede ser cualquier molécula del polipéptido de HE4a que comprenda menos que una versión completa del polipéptido de HE4a. Las moléculas truncadas descritas en la presente descripción pueden incluir los polímeros biológicos truncados y, en opciones preferidas, tales moléculas truncadas pueden ser moléculas de ácido nucleico truncadas o polipéptidos truncados. Las moléculas de ácido nucleico truncadas tienen menos que la secuencia de nucleótidos de longitud completa de una molécula de ácido nucleico conocida o descrita, donde dicha molécula de ácido nucleico conocida o descrita puede ser una molécula de ácido nucleico que se presenta naturalmente, sintética o recombinante, siempre que un experto en la técnica la consideraría como una molécula de longitud completa. Por lo tanto, por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico truncadas que corresponden a una secuencia de gen contienen menos que el gen de longitud completa donde el gen comprende las secuencias codificantes y no codificantes, promotores, potenciadores y otras secuencias reguladoras, secuencias flanqueantes y otras secuencias funcionales y no funcionales que se reconocen como parte del gen. En otro ejemplo, las moléculas de ácido nucleico truncadas que corresponden a una secuencia de ARNm contienen menos que el transcripto de ARNm de longitud completa, que puede incluir varias regiones traducidas y no traducidas, así como otras secuencias funcionales y no funcionales. En otras opciones preferidas, las moléculas truncadas son polipéptidos que comprenden menos que la secuencia de aminoácidos de longitud completa de una proteína particular.

Como se usa en la presente descripción, "deleción" tiene su significado común como lo entienden los familiarizados con la técnica y puede referirse a las moléculas que carecen de una o más de una porción de una secuencia tanto del extremo como de una región no terminal, en relación con una molécula correspondiente de longitud completa, por ejemplo, como en el caso de las moléculas truncadas proporcionadas en la presente descripción. Las moléculas truncadas que son polímeros biológicos lineales, tales como las moléculas de ácido nucleico o los polipéptidos pueden tener una o más de una deleción tanto del extremo terminal de la molécula o una deleción de una región no terminal de la molécula, donde tales deleciones pueden ser deleciones de 1-1500 de nucleótidos o residuos de aminoácidos contiguos, preferentemente 1-500 nucleótidos o residuos de aminoácidos contiguos y con mayor preferencia 1-300 nucleótidos o residuos de aminoácidos contiguos.

Como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina al comparar la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de aminoácidos conservados de la misma del polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La similitud entre dos secuencias de polipéptidos o nucleótidos o incluso el porcentaje de identidad, puede determinarse fácilmente al comparar las secuencias mediante el uso de los algoritmos informáticos bien conocidos por los que tienen experiencia normal en la técnica, tal como el algoritmo BLAST. Los ejemplos de otros algoritmos informáticos útiles son los que se utilizan en los programas, tales como Align y FASTA, a los que se puede acceder, por ejemplo, en el sitio web de internet Genestream del Institut de Genetique Humaine, Montpellier, Francia (www2.igh.cnrs.fr/home.eng.html). Pueden emplearse los fragmentos o las porciones de los polipéptidos descritos en la presente descripción para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante la síntesis de péptidos; por lo tanto, los fragmentos se pueden emplear como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa.

El término "aislado" se refiere que el material que se separa de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que se presenta naturalmente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos polipéptidos o polinucleótidos podrían ser parte de una composición y aún estar aislados porque dicha composición no es parte de su entorno natural.

Las técnicas de afinidad son particularmente útiles en el contexto del aislamiento de los polipéptidos de HE4a para su uso de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción y pueden incluir cualquier método que aproveche una interacción de unión específica con un polipéptido de HE4a para efectuar una separación. Por ejemplo, debido a que los polipéptidos de HE4a pueden contener restos oligosacáridos unidos covalentemente, una técnica de afinidad, tal como la unión de un polipéptido de HE4a a una lectina adecuada inmovilizada en las condiciones que permitan la unión de los carbohidratos por la lectina puede ser una técnica de afinidad particularmente útil. Otras técnicas de afinidad útiles incluyen las técnicas inmunológicas para aislar un polipéptido de HE4a, técnicas que dependen de la interacción de unión específica entre los sitios de combinación de los anticuerpos para el antígeno y los determinantes antigénicos presentes en los complejos. Las técnicas inmunológicas incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación, inmunoadsorción en fase sólida u otros métodos de inmunoafinidad.

En la presente descripción se describe una proteína de fusión que comprende un polipéptido fusionado a HE4a. Dichas proteínas de fusión de HE4a están codificadas por ácidos nucleicos que tienen la secuencia de codificación de HE4a fusionada en marco a una secuencia de codificación adicional para proporcionar la expresión de una secuencia de polipéptido de HE4a fusionada a una secuencia de polipéptido funcional o no funcional adicional que permite, por ejemplo, de manera de ilustración y no de limitación, la detección, el aislamiento y/o la purificación de la proteína de fusión de HE4a. Tales proteínas de fusión de HE4a pueden permitir la detección, aislamiento y/o purificación de la proteína de fusión de HE4a mediante afinidad proteína-proteína, afinidad por metales o purificación de polipéptidos basada en afinidad de carga o por escisión de proteasa específica de una proteína de fusión que contiene una secuencia de fusión que es escindible mediante una proteasa de modo que el polipéptido de HE4a sea separable de la proteína de fusión.

Por lo tanto, las proteínas de fusión de HE4a pueden comprender secuencias polipeptídicas de etiqueta de afinidad, que se refiere a los polipéptidos o péptidos añadidos a HE4a para facilitar la detección y el aislamiento de1HE4a mediante una interacción de afinidad específica con un ligando. El ligando puede ser cualquier molécula, receptor, contrarreceptor, anticuerpo o similar con el que la etiqueta de afinidad pueda interactuar a través de una interacción de unión específica como se proporciona en la presente descripción. Dichos péptidos incluyen, por ejemplo, poliHis o los péptidos de identificación antigénica descritos en el documento U.S. 5,011,912 y en T.P. Hopp, B. Gallis y K.S. Prickett (1988). A short polypeptide marker sequence useful in protein identification and purification. Bio/Technology 6:1204-1210 o la etiqueta del epítopo XPRESS™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). La secuencia de afinidad puede ser una etiqueta de hexa-histidinas como es suministrada, por ejemplo, por un vector pBAD/His (Invitrogen) o por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado con el marcador en el caso de un huésped bacteriano o, por ejemplo, la secuencia de afinidad puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) cuando se usa un huésped de mamífero, por ejemplo, las células COS-7. La etiqueta HA corresponde a un epítopo definido por un anticuerpo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson IA, Niman HL, Houghten RA, Cherenson AR, Connolly ML, Lerner RA. The structure of an antigenic determinant in a protein. Cell. Julio de 1984;37(3):767-78).

Las proteínas de fusión de HE4a pueden, en opciones particulares y como se describe con mayor detalle debajo, comprender además los polipéptidos de la región constante de inmunoglobulina añadidos a HE4a para facilitar la detección, aislamiento y/o localización de HE4a. El polipéptido de la región constante de inmunoglobulina preferentemente se fusiona con el extremo C-terminal de un polipéptido de HE4a. De acuerdo con la teoría no limitante, la inclusión de los dominios de la región constante de inmunoglobulina (Ig) en las proteínas de fusión de HE4a como se proporciona en la presente descripción puede ofrecer ventajas, por ejemplo, aquellas asociadas con las propiedades inmunogénicas/no inmunogénicas de las regiones particulares de Ig cuando se usan en huéspedes particulares (es decir, "propio" frente a "no propio") o aquellos que facilitan el aislamiento y/o la detección de una proteína de fusión. Las personas familiarizadas con la técnica apreciarán estas y otras ventajas de las proteínas de fusión de Ig. Se ha descrito, la preparación general de las proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos heterólogos fusionados con diversas porciones de los polipéptidos derivados de los anticuerpos (incluido el dominio Fc), por ejemplo, por Ashkenazi A, Marsters SA, Capon DJ, Chamow SM, Figari IS, Pennica D, Goeddel DV, Palladino MA, Smith DH. Protection against endotoxic shock by a tumor necrosis factor receptor immunoadhesin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1 de diciembre de 1991;88(23):10535-9 y Byrn y otros ^{(Byrn RA, Mordenti J, Lucas C, Smith D, Marsters SA, Johnson JS, Cossum P, Chamow}sM, ^{Wurm FM, Gregory T, y}otros Biological properties of a CD4 immunoadhesin. Nature. 12 de abril de 1990;344(6267):667-70. Se inserta una fusión génica que codifica la proteína de fusión HE4a:Fc en un vector de expresión apropiado. En determinadas opciones descritas en la presente descripción, se puede permitir que las proteínas de fusión HE4a:Fc se ensamblen de manera muy similar a las moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman los enlaces disulfuro intercatenarios entre los polipéptidos de Fc, que producen las proteínas de fusión de HE4a diméricas.

También se describen en la presente descripción las proteínas de fusión de HE4a que tienen afinidades de unión específicas por los antígenos preseleccionados en virtud de los polipéptidos de fusión que comprenden los dominios de la región V de inmunoglobulina codificados por las secuencias de ADN enlazadas en marco a las secuencias que codifican HE4a, que incluyen las variantes y los fragmentos de las mismas como se proporciona en la presente descripción. Las estrategias generales para la construcción de las proteínas de fusión que tienen los polipéptidos de fusión de la región V de inmunoglobulina se describen, por ejemplo, en los documentos eP ^{0318554; U.S. 5,132,405; U.S. 5,091,513 y U.S.}

5,476,786.

El ácido nucleico como se describe en la presente descripción también puede codificar una proteína de fusión que comprende un polipéptido de HE4a fusionado con otros polipéptidos que tienen las propiedades de afinidad deseables, por ejemplo, una enzima, tal como la glutatión-S-transferasa. Como otro ejemplo, las proteínas de fusión de HE4a también pueden comprender un polipéptido de HE4a fusionado a un polipéptido de la proteína A de Staphylococcus aureus; los ácidos nucleicos que codifican la proteína A y su uso en la construcción de las proteínas de fusión que tienen afinidad por las regiones constantes de inmunoglobulina se describen generalmente, por ejemplo, en el documento U.S. 5,100,788. Otros polipéptidos de afinidad útiles para la construcción de las proteínas de fusión de HE4a pueden incluir las proteínas de fusión de estreptavidina, como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 89/03422; U. S. 5,489,528; U. S.

5,672,691; WO 93/24631; U. S. 5,168,049; U. S. 5,272,254 y en otros lugares y las proteínas de fusión de avidina (véase, por ejemplo, EP 511,747). Como se proporciona en la presente descripción y en las referencias citadas, las secuencias de los polipéptidos de HE4a pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos de fusión que pueden ser polipéptidos de fusión de longitud completa y que alternativamente pueden ser variantes o fragmentos de los mismos.

También se describen en la presente descripción las proteínas de fusión de HE4a que contienen secuencias polipeptídicas que dirigen la proteína de fusión al núcleo celular, para residir en la luz del retículo endoplásmico (RE), para ser secretadas por una célula mediante la vía secretora clásica ER-Golgi (véase, por ejemplo, von Heijne, G. (1990) The Signal Peptide. J.Membr.Biol. 115, 195-201, para incorporarse a la membrana plasmática, para asociarse con un componente citoplásmico específico que incluye el dominio citoplásmico de un receptor transmembrana de la superficie celular o para dirigirse a una ubicación subcelular particular mediante cualquiera de una diversidad de mecanismos de clasificación de proteínas intracelulares conocidos, con los que los expertos en la técnica serán familiares (véase a modo de ejemplo, Rothman JE. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 3 de noviembre de 1994;372(6501):55-63., Advani RJ, Bae HR, Bock JB, Chao DS, Doung YC, Prekeris R, Yoo JS, Scheller RH Seven novel mammalian SNARE proteins localize to distinct membrane compartments. J Biol Chem. 1998). En consecuencia, estas y otras opciones relacionadas están incluidas en las presentes composiciones y métodos dirigidos a dirigir un polipéptido de interés a una localización intracelular, de membrana o extracelular predefinida.

También se describen en la presente descripción los vectores y las construcciones que incluyen a los ácidos nucleicos como se describe en la presente descripción y en particular a las "construcciones de expresión recombinante" que incluyen a cualquier ácido nucleico que codifique los polipéptidos de HE4a como se proporcionó anteriormente; a las células huésped que se manipulan genéticamente con los vectores y/o las construcciones y a la producción de los polipéptidos de HE4a y proteínas de fusión o fragmentos o variantes de los mismos, mediante las técnicas recombinantes. Las proteínas de HE4a pueden expresarse en las células de mamíferos, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de los promotores apropiados. También se pueden emplear los sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas mediante el uso de ARN derivados de las construcciones de ADN descritas en la presente descripción.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán los orígenes de replicación y los marcadores seleccionables que permitan la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y S. cerevisiae, gen TRP1 y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Dichos promotores pueden derivarse de operones que codifican enzimas glicolíticas, tales como la 3-fosfoglicerato cinasa (PGK), factor a, fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada con las secuencias de inicio y terminación de la traducción. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que imparte las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Las construcciones de expresión útiles para uso bacteriano se construyen mediante la inserción en un vector de expresión de una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con las señales adecuadas de iniciación y terminación de la traducción en la fase de lectura operable con un promotor funcional. La construcción puede comprender uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento de la construcción del vector y, si se desea, para proporcionar amplificación dentro del huésped. Los huéspedes procarióticos adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces, y Estafilococo, aunque también se pueden emplear otros como opción. Puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sean replicables y viables en el huésped.

Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano derivado de los plásmidos comercialmente disponibles que comprenden los elementos genéticos del conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega, Madison, Wis., Estados Unidos). Estas secciones del "esqueleto" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que se va a expresar.

Después de la transformación de una cepa huésped adecuada y el crecimiento de la cepa huésped a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado, si es un promotor regulado como se proporciona en la presente descripción, se induce por los medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan por un período adicional. Las células se recolectan normalmente mediante centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto crudo resultante se retiene para una purificación adicional. Las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, que incluyen ciclos de congelación descongelación, sonicación, rotura mecánica o el uso de agentes que lisan las células; dichos métodos se conocen bien por los expertos en la técnica.

Por lo tanto, por ejemplo, los ácidos nucleicos como se describen en la presente descripción pueden incluirse en cualquiera de una diversidad de construcciones de vectores de expresión como una construcción de expresión recombinante para expresar un polipéptido de HE4a. Dichos vectores y construcciones incluyen las secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN del fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral, tales como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y pseudorrabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector para la preparación de una construcción de expresión recombinante siempre que sea replicable y viable en el huésped.

La(s) secuencia(s) de ADN apropiadas se pueden insertar en el vector mediante una diversidad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en sitio(s) de restricción por endonucleasa apropiado(s) mediante los procedimientos conocidos en la técnica. Las técnicas comunes para la clonación, el aislamiento, la amplificación y la purificación del ADN, para las reacciones enzimáticas que implican la ligasa de ADN, la polimerasa de ADN, endonucleasas de restricción y diversas técnicas de separación son las conocidas y comúnmente empleadas por los expertos en la técnica. Puede utilizarse una o más de una serie de técnicas comunes conocidas.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está operativamente ligada a al menos una de las secuencias de control de la expresión apropiada (por ejemplo, un promotor o un promotor regulado) para dirigir la síntesis del ARNm. Los ejemplos representativos de tales secuencias de control de la expresión incluyen el promotor LTR o SV40, el lac o trp de E. coli, el promotor Pl del fago lambda y otros promotores conocidos por controlar la expresión de los genes en las células procariotas o eucariotas o sus virus. Las regiones promotoras pueden ser seleccionadas de cualquier gen deseado mediante el uso de los vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos particulares incluyen lac, lacZ, T3, T7, gpt, lambda Pr, PLytrp. Los promotores eucariotas incluyen el temprano inmediato de CMV, timidina cinasa de HSV, temprano y tardío de SV40, los lTr de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está dentro del nivel de la experiencia normal en la técnica y se describe en la presente descripción la preparación de determinadas construcciones de expresión recombinantes particularmente preferidas que comprenden al menos un promotor o promotor regulado operativamente ligado a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HE4a.

Como se señaló anteriormente, en determinadas opciones, el vector puede ser un vector viral, tal como un vector retroviral. Por ejemplo, los retrovirus de los que se pueden derivar los vectores plasmídicos retrovirales incluyen, pero no se limitan a, el virus de la leucemia murina de Moloney, el virus de la necrosis del bazo, los retrovirus, tales como el virus del sarcoma de Rous, el virus del sarcoma de Harvey, el virus de la leucosis aviar, el virus de la leucemia del mono gibón, el virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, el virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario.

El vector viral incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, el LTR retroviral; el promotor de SV40 y el promotor del citomegalovirus humano (CMV) descrito en Miller y otros, Biotechniques 7:980-990 (1989) o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares, tales como los promotores celulares eucarióticos que incluyen, pero no se limitan a, los promotores de histona, pol III y p-actina). Otros promotores virales que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, los promotores de adenovirus, los promotores de timidina cinasa (Tk ) y los promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado resultará evidente para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas en la presente descripción y puede ser de entre los promotores regulados o entre los promotores descritos anteriormente.

El vector plasmídico retroviral se emplea para transducir líneas celulares de empaquetamiento para formar las líneas celulares productoras. Los ejemplos de las células de empaquetamiento que pueden transfectarse incluyen, pero no se limitan a, PE501, PA317, ^-2, Y-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, y CRE, y CPKIP GP+E-86, GP+envAm12 y las líneas celulares DAN como se describe en Miller, Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990). El vector puede transducir las células de empaquetamiento a través de cualquier medio conocido en la técnica. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a, electroporación, el uso de liposomas y precipitación con fosfato de calcio. En una alternativa, el vector plasmídico retroviral puede encapsularse en un liposoma o acoplarse a un lípido y luego administrarse a un huésped.

La línea celular productora genera partículas del vector retrovírico infeccioso que incluyen la(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de HE4a o las proteínas de fusión. Luego, se pueden emplear tales partículas del vector retrovírico para transducir las células eucariotas, in vitro o in vivo. Las células eucariotas transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifican el polipéptido de HE4a o la proteína de fusión. Las células eucariotas que pueden transducirse incluyen, pero no se limitan a, las células madre embrionarias, las células de carcinoma embrionario, así como las células madre hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, células epiteliales bronquiales y diversas otras líneas celulares adaptadas al cultivo.

Como otro ejemplo de una técnica descrita en la presente descripción en la que se usa un vector viral para preparar la construcción de expresión de HE4a recombinante, en una opción preferida, las células huésped transducidas por una construcción viral recombinante que dirige la expresión de los polipéptidos de HE4a o las proteínas de fusión pueden producir las partículas virales que contienen los polipéptidos de HE4a expresados o las proteínas de fusión que se derivan de las porciones de la membrana celular del huésped incorporadas por las partículas virales durante la gemación viral. En otra opción preferida, las secuencias de ácido nucleico que codifican HE4a se clonan en un vector lanzadera de baculovirus, que luego se recombina con un baculovirus para generar una construcción de expresión de baculovirus recombinante que se usa para infectar, por ejemplo, las células huésped Sf9, como se describe en Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 39, C. D. Richardson, Editor, Human Press, Totowa, Nueva Jersey, 1995; Piwnica-Worms, "Expression of Proteins in Insect Cells Using Baculoviral Vectors," sección II en el Capítulo 16 en: Short Protocols in Molecular Biology, 2da Ed., Ausubel y otros, eds., John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1992, páginas 16 32 a 1648.

También se describe en la presente descripción las células huésped que contienen las construcciones de expresión de HE4a recombinante descritas anteriormente. Las células huésped se modifican por ingeniería genética (transducen, transforman o transfectan) con los vectores y/o las construcciones de expresión descritas en la presente descripción que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación, un vector lanzadera o una construcción de expresión. El vector o construcción puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, partícula viral, fago, etc. Las células huésped manipuladas pueden cultivarse en medios nutritivos convencionales modificados según sea apropiado para activar los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar genes particulares, tales como los genes que codifican los polipéptidos de HE4a o las proteínas de fusión de HE4a. Las condiciones de cultivo para las células huésped particulares seleccionadas para la expresión, tales como la temperatura y el pH, serán fácilmente evidentes para el experto en la materia.

La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura o la célula huésped puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. Los ejemplos representativos de las células huésped apropiadas como se describe en la presente descripción incluyen, pero no necesariamente se limitan a, las células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; las células de hongos, tal como levadura; las células de insectos, tales como Drosophila 52 y Spodoptera Sj9; las células animales, tales como las células CHO, COS o 293; adenovirus; células vegetales o cualquier célula adecuada ya adaptada a la propagación in vitro o así establecida de novo. Se considera que la selección de un huésped apropiado está dentro del ámbito de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente memoria.

Distintos sistemas de cultivo celulares de mamíferos también se pueden emplear para expresar la proteína recombinante. Por lo tanto, se describe un método de producción de un polipéptido de HE4a recombinante, al cultivar una célula huésped que comprende una construcción de expresión recombinante que comprende al menos un promotor ligado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un HE4a. En determinadas opciones, el promotor puede ser un promotor regulado como se proporciona en la presente descripción, por ejemplo, un promotor reprimible por tetraciclina. En determinadas opciones, la construcción de expresión recombinante es una construcción de expresión viral recombinante como se proporciona en la presente descripción. Los ejemplos de los sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas c OS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. Enero de 1981; 23(1):175-82 y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión en mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados y además cualquier sitio de unión al ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, secuencias de terminación transcripcional y secuencias 5' no transcritas flanqueantes, por ejemplo, como se describe en la presente descripción en relación a la preparación de las construcciones de expresión de m Ra . Las secuencias de ADN derivadas del empalme de SV40 y los sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. La introducción de la construcción en la célula huésped puede realizarse mediante una diversidad de métodos con los que los expertos en la técnica estarán familiarizados, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano o electroporación (Davis, L.G., Dibner, M.D. y Battey, J.F.: Basic Methods in. Molecular Biology. Elsevier, New York, 1986).

Los polipéptidos del antígeno HE4a recombinante expresados (o polipéptidos de HE4a) o las proteínas de fusión derivadas de los mismos, pueden ser útiles como inmunógenos en la forma de células huésped intactas; orgánulos intactos, tales como las membranas celulares, vesículas intracelulares u otros orgánulos celulares o las preparaciones de las células rotas que incluyen, pero no se limitan a, homogeneizados o lisados celulares, vesículas de membrana unilaminares y multilaminares u otras preparaciones. Alternativamente, los polipéptido del antígeno recombinante expresados o las proteínas de fusión puede recuperarse y purificarse a partir de los cultivos celulares recombinantes mediante los métodos que incluyen la precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacciones hidrófobas, cromatografía de afinidad, que incluye cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Las etapas de replegamiento de proteínas pueden usarse, según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se puede emplear para las etapas finales de purificación. Los polipéptidos del antígeno HE4a recombinantes expresados (o polipéptidos de HE4a) o proteínas de fusión también pueden ser útiles como antígenos diana en cualquiera de una serie de configuraciones de ensayo para el cribado de los anticuerpos de rutina, que pueden realizar fácilmente los que tienen una experiencia normal en la técnica.

El polipéptido del antígeno HE4a (o polipéptido de HE4a) que es un inmunógeno para la producción de un anticuerpo específico que se usará en el método descrito en la presente descripción puede ser, por lo tanto, un producto purificado naturalmente o un producto de los procedimientos químicos sintéticos o producido mediante las técnicas recombinantes de un huésped procariota o, preferentemente, eucariota. Depende del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos descritos en la presente descripción pueden glicosilarse o de otro modo modificarse postraduccionalmente como se conoce en la técnica y como se proporciona en la presente descripción.

El tema de esta descripción se describe ahora con referencia a los siguientes Ejemplos.

EJEMPLOS

Antes de los experimentos descritos en la presente descripción, no existía un protocolo publicado que permitiera la medición óptima del dominio N-WFDC de HE4a en una muestra de un sujeto mediante el uso de un formato de ensayo de inmunocitoquímica (IHC). Los aspectos y las modalidades de la presente descripción se derivan del descubrimiento inesperado de que los anticuerpos monoclonales 12A2 y 14E2 tienen una utilidad y eficacia sorprendentes e inesperadas cuando se usan simultáneamente o en combinación para evaluar la presencia de HE4/HE4a de longitud completa.

En los experimentos descritos en la presente descripción, se descubrieron varios factores que permitieron la inesperada eficacia mejorada/potenciada. Por ejemplo, se descubrió que al usar los anticuerpos 12A2/14E2 en determinadas combinaciones con 2H5/3D8, se pueden obtener perfiles de unión y reconocimiento de HE4 de longitud completa más específicos. Además, también se descubrió que durante el análisis de HE4 en las muestras de prueba de cáncer de ovario (incluidas las muestras de HE4 de longitud completa), el uso de los anticuerpos 12A2 o 14E2 en combinación con 2H5 o 3D8, en un ensayo de diagnóstico ilustrativo, que incluye IHC, los datos clínicos correspondientes resultantes y/o la correlación de la enfermedad mostraron un fondo reducido inesperado y/o una resolución sorprendentemente mejorada en la evaluación de los perfiles de HE4.

A modo de ejemplo, se desarrollaron las proteínas de fusión de HE4 recombinantes para la inmunización en la producción de Ab monoclonal de HE4.

Ejemplo 1

Producción de las proteínas de fusión HE4ahIg/mIg, HE4a-V4HIg/mIg y HE4a-V2- hIg/mIg recombinantes de longitud completa: Amplificación del ADNc de HE4a (WFDC2) a partir de un clon de ADNc de HE4a de alto rendimiento hacia la construcción de una construcción de fusión.

El gen de HE4a (WDFC2) se combinó con los genes que codifican IgG para construir las proteínas de fusión para inmunizar a los ratones y obtener los anticuerpos monoclonales (MAb). Los ratones se inmunizaron contra las proteínas de fusión con una cola de Ig de ratón y los hibridomas se cribaron contra las proteínas de fusión con una cola de Ig humana. Posteriormente, se desarrolló un ELISA de doble determinante (Sandwich).

La secuencia de ARNm de HE4a publicada originalmente por Kirchoff y otros (15, 22) y depositado en GenBank (No. de acceso X63 187) proporcionó la base para el diseño de los cebadores oligonucleotídicos para clonar el ADNc que codifica HE4a. Para clonar el ADNc de HE4a, se preparó el ARN a partir de los tumores de ovario, epidídimo normal y de varias líneas celulares de tumores de ovario, incluidas 4007 y OVCAR3 (24), mediante el uso de TRIzol (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se preparó el ADNc mediante el uso de 1-3 |jg de ARN, hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc de HE4a se amplificó por PCR a partir del ADNc cebado aleatoriamente mediante el uso de condiciones comunes. Se obtuvieron y luego se clonaron los productos de PCR del tamaño esperado para HE4a de longitud completa. El análisis de secuencia identificó diferencias en comparación con la secuencia de Kirchoff y otros y se utilizó la secuencia corregida para HE4a, depositada en GenBank (No de acceso AY212888) para construir las proteínas de fusión. Se clonó un fragmento de ADNc de secuencia verificada que contenía el gen de HE4a de longitud completa en pSPORT y este ADN plasmídico se usó como molde de PCR para la construcción de los clones de fusión.

Se construyeron las proteínas de fusión que incorporaron el producto del gen de HE4a completo fusionado con el dominio Fc de IgG humana o de ratón. Se diseñaron los cebadores que codificaban los sitios de restricción apropiados para la clonación y se crearon las fusiones necesarias en marco de los dominios de proteínas para la construcción final. El cebador 5' (SEQ IDXX: 5-GTTGTTAAGC TTGCCGCCAT GCCTGCTTGT CGCCTAGGC-3') incluía un sitio HindIII, una secuencia Kozak para mejorar la expresión adyacente al primer ATG y una porción del péptido líder de HE4a en base a la secuencia de HE4a. El cebador 3' (SEQ IDXX: 5-GTTGTTGGAT CCGAAATTGG GAGTGACACA GGACAC-3') incluía un sitio BamHI en marco para la fusión con el ADNc de la cola de Ig humano/ratón, con el extremo 3' de la secuencia codificante de HE4a truncada justo antes del codón STOP. Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ExTaq; Takara Bio, Inc., Otsu, Shiga, Japón) mediante el uso de 100 ng del plásmido HE4a/pSPORT como plantilla y 30 ciclos de amplificación (1 min a 94 °C, 1 min a 55 °C y 30 s a 72 °C). Se obtuvieron los productos de PCR del tamaño esperado (400 pb) para HE4a de longitud completa y luego se purificaron mediante el uso del kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA). Los fragmentos de PCR purificados se digirieron por restricción, se purificaron mediante el uso del kit QIAEx II Gel Extraction Kit (Qiagen) y se ligaron en fusión con el Fc de IgG2a de ratón (mIgG2a) y Fc de IgG1 humana (hIgGI) en el vector de expresión de mamíferos pD18, un derivado de pCDNA 3 como se describió anteriormente. La Figura 1 muestra esquemáticamente cómo se insertaron las construcciones del ADNc HE4a-mIgG2a y HE4a-hIgG1 de FL como un fragmento HindIII-XbaI en el sitio de clonación múltiple de pD18.

Los productos de ligación se transformaron en las células bacterianas DH5a y los transformantes se cribaron para detectar la presencia de los insertos de genes de fusión HE4a-mIgG2a y HE4a-hIgG1 de FL y se verificaron mediante análisis de secuencia. Además, la expresión de proteínas se confirmó mediante el uso del ADN plasmídico de estos aislados para transfectar transitoriamente a las células COS7 mediante la técnica DEAE-Dextrana como se describió. Los sobrenadantes del cultivo se cosecharon después de 72 h y se cribaron mediante inmunoprecipitación con agarosa con proteína A (Repligen, Cambridge, MA), electroforesis reductora de SDS-PAGE y transferencia Western. Las transferencias de Western se probaron mediante el uso de un conjugado de peroxidasa de rábano picante IgG antihumana de cabra (Caltag, Burlingame, CA) a 1:5000, seguido de un desarrollo de quimioluminiscencia mejorado (Amersham, Little Chalfont, Reino Unido). El ADN plasmídico con el gen de HE4a de secuencia verificada en fusión con la cola Fc de IgG1 humana (plásmido pD18-HE4a-hIgG) se utilizó como plantilla para la amplificación y clonación de las variantes de corte y empalme de HE4a HE4a-V4 y HE4a-V2 descritas en la publicación de Bingle y otros (Bingle L., Singleton V., Bingle C. D. The putative ovarian tumour marker gene HE4 (WFDC2), is expressed in normal tissues and undergoes complex alternative splicing to yield multiple protein isoforms. Oncogene, 21: 2768-2773, 2002). Las variantes de corte y empalme HE4a-V4 y HE4a-V2 se clonaron en fusión con el Fc de IgG de ratón y humano como se describió para e1HE4a de longitud completa anteriormente. Los cebadores de nucleótidos utilizados para la amplificación se enumeran debajo.

Para HE4a-V4:

Cebador directo SEQ ID3: 5'-GTTGTTACCGGTGCAGCAGAGAAGACTGGCGTGTGCCCC-3'

Cebador inverso SEQ ID4: 5'-AATCTCCCAGAGCCTCCGTGTCTTTAGGTGCCAGTGGAACAGTGCATT-GGGCAGAGA GCA-3'

Para HE4a-V2:

Cebador directo SEQ ID5: 5'-GTTGTTACCGGTGCAAAGGAGGGTTCCTGCCCCCAG-3'

Cebador Inverso: SEQ ID6: 5'-GTTGTTGGA TCCGAAATTGGGAGTGACACAGGA-3'

Producción de las proteínas de fusión de HE4aIg.

Se establecieron líneas celulares estables de las construcciones de ADNc HE4a-mIgG2a y HE4a-hIgG1 de longitud completa y las construcciones correspondientes con las variantes de corte y empalme HE4a-V4 y HE4a-V2. Se usaron las células CHO-DG44 para construir las líneas estables que expresan altos niveles de las proteínas de fusión de interés. Se crearon las líneas de CHO estables mediante electroporación de alta copia de las construcciones del plásmido y selección de los clones resistentes al metotrexato mediante dilución limitante en medio Excell 302 CHO (JRH Biosciences, Denver, PA) que contiene insulina recombinante (Life Technologies, Inc.), piruvato de sodio ( Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), L-glutamina (Invitrogen Corp.), aminoácidos no esenciales 2X (Invitrogen Corp.) y metotrexato 100 nM (Sigma, St. Louis, MO). Luego, se ensayaron los sobrenadantes de cultivo de los clones resistentes mediante ELISA tipo sándwich de IgG para cribar las líneas de alta producción. Los sobrenadantes gastados se cosecharon a partir de los cultivos a gran escala y la proteína de fusión de IgG se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína A, después de lo cual las proteínas de fusión se comprobaron mediante transferencia Western (datos no mostrados). La proteína de fusión de HE4a-hIgG1 migró a un peso molecular aparente de Mw 48 000 en geles reducidos o en las transferencias Western, mayor que el Mr 36000 esperado en base a la secuencia de aminoácidos predicha, sugiriendo que la molécula estaba glicosilada. Se usaron los transfectantes estables para producir suficiente proteína para la inmunización de los ratones BALB/c.

A modo de ejemplo, se desarrollaron los hibridomas y los anticuerpos monoclonales específicos para el dominio N-WFDC de HE4a.

Ejemplo 2

Establecimiento de los hibridomas y de los anticuerpos monoclonales específicos para el dominio N-WFDC de HE4a

Se inmunizaron ratones BALB/c quincenalmente, 5 veces, con HE4a-V4 mIgG y una sexta vez con FL HE4a. Tres días después de la última inmunización, se sacrificaron los ratones y se prepararon los hibridomas como se describió previamente para la mesotelina. Los sobrenadantes de los hibridomas se cribaron en HE4a-V4 hIgG y los hibridomas 12A2 y 14E2 se seleccionaron en base a su reactividad con HE4a-V4 hIgG. Los hibridomas se clonaron dos veces de acuerdo con procedimientos comunes y los clones seleccionados se usaron para la producción del MAb contra el N-WFDC de HE4a. Los anticuerpos monoclonales se produjeron mediante cultivo in vitro de los clones de hibridoma mediante la inoculación de 104 células/ml en DMEM, suero de ternera fetal al 5 % en frascos giratorios y se dejó crecer durante 10 a 14 días. Luego, los anticuerpos monoclonales se purificaron del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad de proteína A de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes.

Ejemplo 3. Caracterización de la especificidad de unión del mAb contra el dominio N-WFDC de HE4a

3.1 Reactividad con las proteínas de fusión de hIgG de HE4a

Luego, se ensayó la especificidad de los MAb 12A2 y 14E2 en ELISA en proteínas de fusión HE4a FL, HE4a-V4 y HE4a-V2 hIgG. Los MAb 12A2 y 14E2 se recubrieron en pocillos de placas de microtitulación mediante incubación de los MAb (10 |jg/ml) en tampón carbonato-bicarbonato (C-3041; Sigma). Después de eliminar el sobrenadante, los pocillos se bloquearon durante 2 h a temperatura ambiente con 200 jl/pocillo de tampón de bloqueo de GSC (Genetic Systems, Seattle). A esto le siguieron cuatro lavados, 200 jl/pocillo, con PBS que contenía Tween al 0,1 %.

Los pocillos recubiertos con el MAb se incubaron luego con 100 jl/pocillo de HE4a FL, HE4a-V4 y HE4a V2 durante 2 h. La proteína de fusión HIgG HE4a unida se detectó luego mediante incubación con AntihIgG1 conjugado con HRP y determinación de OD450 nm.

Los MAb 12A2 y 14E2 reaccionaron con HE4a de longitud completa y HE-V4, lo que indica que eran específicos para el dominio N-WFDC de HE4a, Figura 2.

La especificidad de los MAb 3D8 y 2H5 también se ensayaron como MAb de referencia mediante el uso de la misma metodología, Figura 3.

3.2 Reactividad con los dominios de HE4a presentados como proteínas de fusión de fagos

La especificidad de los MAb 12A2 y 14E2 para el dominio N-WFDC de HE4a se confirmó adicionalmente al ensayar la reactividad hacia el dominio N-WFDC de HE4a y el dominio C-WFDC de HE4a expresados como proteínas de fusión con la proteína pVIII de la cubierta del fago en un ELISA de fagos.

El ADNc, preparado a partir de ARNm aislado de células OvCar-3, sirvió como molde para la amplificación por PCR de las partes del gen que codifican las regiones WFDC C- y N-terminales para la clonación en el vector de presentación de fagos f88-4. Se construyeron los pares de cebadores de PCR, enumerados en la Tabla 2, para la amplificación de las regiones codificantes de los residuos de aminoácidos 31-75 (N-WFDC) y 76-124 (C-WFDC) respectivamente. En los extremos 5' se insertaron los sitios de restricción para HindIII y PstI para la clonación en fusión con el péptido señal pVIII y la proteína de la cubierta pVIII madura.

Tabla 2. Cebadores de PCR utilizados para la amplificación de N- y C- WFDC de HE4a

Las regiones WFDC se amplificaron por separado a partir de 0,5 j l de ADNc en una mezcla de reacción que contenía 1 jM de cada cebador directo e inverso, Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25 °C), (N H ^S O ⁴20 mM, Tween 20 al 0,1 % (v/v), MgCl²2 mM, Taq-polimerasa 0,02 u /jl (Abgene, Surrey, Reino Unido) y 0,1 mM de cada desoxinucleótido en un volumen final de 25 j l con el siguiente ciclo de temperatura repetido 30 veces: 30 segundos de incubación a 95 °C, 50 °C y 72 °C.

Los productos de PCR y f88-4, digeridos con HindIII y PstI, se ligaron y transfectaron en E. coli JM109 donde después se seleccionaron los clones en placas LB con tetraciclina. Se amplificaron dos clones de cada construcción en E. coli JM109 y se preparó el ADN de doble cadena para la secuenciación del ADN. La secuenciación del ADN se realizó mediante el uso del kit de secuenciación de ciclo v1.1 Big dye terminator y un cebador específico del vector f88-4. Las reacciones de secuenciación se enviaron a CyberGene AB (Huddinge, Suecia) para su análisis. Los datos crudos de la secuencia se analizaron mediante el uso del software gratuito Chromas versión 1,45 (Technelysium Pty Ltd., Australia). La secuenciación de nucleótidos verificó la inserción en marco con el péptido líder y la proteína pVIII de la cubierta del fago maduro. Los insertos de HE4a demostraron identidad con la secuencia HE4a (número de acceso AY212888), Figura 4.

ELISA de fagos

Los clones de fagos verificados en secuencia se amplificaron, purificaron, concentraron con PEG/NaCl y se diluyeron en BSA al 1 % en PBS para su uso como antígeno en el ensayo ELISA de fagos. Se inmovilizaron los MAb 3D8 y 2H5, diluidos a 1 jg/m l en BSAal 1 % en PBS y el MAb 12A2, en 100 j l de medio de clon, en pocillos (100 jl/pocillo) recubiertos con IgG de cabra antirratón (Jackson Immuno Research,). Las placas se sellaron y almacenaron durante la noche a temperatura ambiente. Los pocillos revestidos con los MAb contra HE4a se lavaron tres veces y se añadieron las partículas de fago en un volumen de 100 jl/pocillo. Después de dos horas de incubación, se lavaron los pocillos y se añadió un anticuerpo antiM13 de conejo (establecido internamente). Después de la incubación y el lavado, se añadió un anticuerpo anticonejo porcino marcado con HRP (Dako). Después del lavado final se añadió el sustrato TMB y se midió la placa a 620 nm después de 5 minutos de incubación, Figura 5.

Los estudios de ELISA de fagos que utilizaron los dominios N-WFDC y C-WFDC presentados como proteínas de fusión con la proteína del fago pVIII y la reactividad hacia las proteínas de fusión HE4a-V2, HE4a-V4 y HE4a hIgG1 FL confirmaron que los MAb 12A2 y 14E2 eran específicos para el dominio N-WFDC de HE4a.

3.3 Caracterización de los epítopos reconocidos por los MAb 12A2 y 14E2

El tipo de epítopos, es decir, los epítopos lineales o dependientes de la conformación, reconocidos por los MAb 12A2 y 14E2 se determinaron al ensayar la reactividad de los anticuerpos hacia los antígenos de HE4a desnaturalizados y reducidos. El medio gastado de la línea celular estable que produce HE4a-hIgG1 de longitud completa, sin diluir y diluido cinco veces, se desnaturalizó a 70 °C y se separó con SDS-PAGE en condiciones reductoras. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF de acuerdo con las técnicas comunes. Después de incubar la membrana con los anticuerpos primarios contra HE4a, los anticuerpos unidos se rastrearon mediante un anticuerpo de cerdo antirratón HRP (Dako). El anticuerpo HRP se detectó por quimioluminiscencia mediante el uso de los sistemas de detección Amersham™ ECL™.

El MAb 12A2 no demostró reactividad contra el antígeno HE4a desnaturalizado y reducido (datos no mostrados), lo que indica que el anticuerpo reconoció un epítopo dependiente de la conformación. El MAb 14E2, por otro lado, demostró una tinción específica en una banda de aproximadamente 48 kDa que es el tamaño esperado de la molécula de fusión HE4ahIgG1 glicosilada. En el carril con la concentración de antígeno más alta se observó una banda de aproximadamente el doble del tamaño. Esta banda muy probablemente representa un dímero del antígeno en el que los enlaces de disulfuro en la parte Fc no se han roto por completo. Los datos de la transferencia de Western indican que el MAb 14E2 reconoció un epítopo lineal, Figura 6.

3.4 Epítopos independientes de los anticuerpos establecidos específicos para el N-WFDC de HE4

La diferencia en la reactividad de los MAb 12A2 y 14E2 hacia el antígeno HE4a desnaturalizado y reducido indica que los dos anticuerpos reconocieron dos epítopos independientes del dominio N-WFDC de HE4a.

El reconocimiento de los epítopos independientes en el dominio N-WFDC de HE4a por los MAb 12A2 y 14E2 se confirmó además al combinar los MAb 12A2 y 14E2 en un inmunoensayo en sándwich. Se utilizó el MAb 14E2 como MAb de captura en combinación con el MAb 12A2 marcado con HRP como anticuerpo de detección y determinación de la curva de respuesta a la dosis con el antígeno HE4a. Se capturó el MAb 14E2 en medio de hibridoma concentrado en micropocillos recubiertos con un anticuerpo de cabra antirratón (Jackson ImmunoResearch Lab). Después del lavado, se añadieron 25 pl del antígeno HE4a (0 - 900 pM) del kit EIA de HE4a (Fujirebio Diagnostics Inc) y, posteriormente, se añadió el MAb 12A2 marcado con HRP. Como experimento de control, se realizó una ejecución en paralelo con la fase sólida del MAb 14E2 y el MAb 3D8 trazador marcado con HRP, usado en el EIA de HE4a. Se sabe que el MAb 3D8 se dirige a la región WAP C-terminal y, por lo tanto, debería formar un par EIA en sándwich con el MAb 14E2. Después de las etapas de incubación y lavado, se añadió el sustrato TMB y se analizó la absorbancia a 620 nm después de una etapa de incubación de 30 minutos. Tanto el MAb 3D8 como el 12A2 demostraron una curva de respuesta a la dosis con el MAb 14E2, Figura 7.

La curva de respuesta a la dosis positiva del inmunoensayo tipo sándwich del MAb 12A2 y del MAb 14E2, además de su diferente reactividad con el antígeno HE4a reducido, demostró que el MAb 14E2 y el MAb 12A2 reconocían epítopos independientes específicos para el dominio N-WFDC de HE4a.

También se desarrollaron los inmunoensayos específicos para HE4a de longitud completa.

Ejemplo 4

Establecimiento de los inmunoensayos específicos para el HE4a de longitud completa

Los ensayos específicos para HE4a de longitud completa (HE4a FL) se diseñaron mediante el uso de los anticuerpos específicos para el dominio N-WFDC y C-WFDC.

En un aspecto de la invención, los anticuerpos específicos para el dominio N-WFDC de HE4a se combinaron con los anticuerpos específicos para el dominio C-WFDC de HE4a para permitir el diseño de un inmunoensayo específico para HE4a de longitud completa, sin detectar el N-WFDC de HE4a, los dominios C-WFDC de HE4a o las variantes HE4a-V4 o HE4a-V2.

En un experimento inicial, el MAb 12A2 y 14E2MAb de acuerdo con la presente invención y el MAb 3D8 reactivos hacia el dominio C-WFDC de HE4a (Hellstrom y otros; The HE4 (WFDC2) Protein Is a Biomarker for Ovarian Carcinoma; Cancer Res 1 de julio de 200363; 3695) se utilizaron como anticuerpo de captura en un ensayo tipo sándwich mediante el uso del MAb 2H5 reactivo hacia al dominio C-WFDC de HE4a como anticuerpo de detección. En los ensayos tipo sándwich, los diferentes MAb de captura se inmovilizaron en pocilios de microvaloración mediante el uso de un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 2 y se incubaron con las proteínas de fusión de hIgFc de HE4a FL, dominios HE4a-V4 y HE4a-V2. Las proteínas HE4a unidas se detectaron luego mediante incubación con el MAb 2H5 biotinilado seguido de incubación con estreptavidina HRP y determinación de la DO a 450 nm después de la incubación con el sustrato OPD HRP. El ensayo tipo sándwich demostró que la combinación del MAb 12A2 o MAb 14E2 en combinación con el MAb 2H5 detectó solo la proteína de fusión HE4a FL, mientras que la combinación del MAb 3D8 y MAb 2H5 detectó tanto HE4a FL como la variante HE4a.V2, Figura 8.

En la configuración preferida para el diseño de un inmunoensayo específico para HE4a FL, el MAb 2H5 se usó como anticuerpo de captura y el MAb 12A2 como anticuerpo de detección. Se biotiniló el MAb 2H5 con éster de caproato de biotina-NHRS, Sigma Chemical Co, EE. UU., mediante el uso de los procedimientos comunes y se usó como anticuerpo de captura. El MAb 12A2 se conjugó con HRP de acuerdo con una modificación del procedimiento de Nakone. El MAb 2H5 biotinilado y el MAb 12A2 conjugado con HRP se usaron en EIA de una etapa de acuerdo con el siguiente protocolo. Procedimiento de ensayo:

Añadir 25 pL del antígeno recombinante HE4a-hIgG FL (0 - 1000 pM en PBS, 60 g/L de BSA, pH 7,2) 100 pL del MAb 2H5 Biotina, 1 pg/ml y el MAb HRP12A2, 1 pg/ml en tampón de ensayo en placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina, Kaivogen Oy, Turku, Finlandia.

2. Incubar durante 1 h ± 10 min con agitación.

3. Lavar 6 veces con tampón Tris 5 mM, Tween 40 al 0,05 %, pH 7,75.

4. Agregue 100 pL de TMB, Neogen, EE. UU.

5. Incubar 30 min ± 5 min

6. Determine la DO a 620 nm en un lector ELISA.

En la Figura 9 se muestra un ejemplo de la curva de respuesta a la dosis mediante el uso de HE4a-hlgG diluido en PBS, 60 g/L de BSA para el ensayo. La sensibilidad del ensayo fue < 5 pM, que fue significativamente menor que la que se ^{encuentra en los sujetos sanos. Por lo tanto, el ensayo sería adecuado para la determinación de HE4a}Fl ^{en sujetos}sanos y en individuos con cáncer de ovario conocido o sospechado.

El propósito de este estudio es evaluar la idoneidad del nuevo MAb 12A2 al evaluar sus capacidades para evaluar la presencia de HE4 de longitud completa en un formato de ensayo ilustrativo.

Ejemplo 5

Diagnóstico de cáncer de ovario mediante el uso de los inmunoensayos específicos para HE4a de longitud completa. En un aspecto de la descripción, se usaron los anticuerpos para diseñar los inmunoensayos para el diagnóstico serológico del cáncer de ovario. El inmunoensayo para HE4a FL mediante el uso del MAb 2H5 en combinación con el MAb 12A2 como se describe en el Ejemplo 3 se usó para determinar las concentraciones de HE4a de longitud completa en las muestras de suero de los individuos sanos, pacientes con enfermedad ginecológica benigna y pacientes con cáncer de ovario.

Los niveles de HE4a FL fueron significativamente más altos en los pacientes con cáncer de ovario (p < 0,001) en comparación con los pacientes con enfermedad ginecológica benigna o sujetos sanos, Tabla 3, Figura 10.

Tabla 3. Niveles de HE4a en los sujetos sanos e individuos con enfermedad ginecológica benigna y pacientes con cáncer de ovario.

El propósito de este estudio es evaluar la idoneidad del nuevo formato de ensayo del MAb 12A2/HE4 de longitud completa mediante la evaluación de sus capacidades para determinar y dar seguimiento al curso del cáncer de ovario.

Ejemplo 6

Seguimiento del curso de la enfermedad en el cáncer de ovario mediante la determinación de HE4a FL.

En otro aspecto de la invención, los inmunoensayos para la determinación de HE4a FL de acuerdo con el Ejemplo 3 se utilizaron para seguir el curso clínico de la enfermedad en los pacientes con cáncer de ovario diagnosticado.

Los niveles de HE4a FL en tres pacientes con cáncer de ovario se muestran durante el curso clínico de la enfermedad en la Figura 11. Los niveles de HE4a FL siguieron el curso clínico de la enfermedad y serían adecuados para completar el efecto de la terapia del cáncer de ovario, así como para la detección de la enfermedad recurrente.

A modo de ejemplo, el propósito de este estudio es evaluar la idoneidad del nuevo formato de ensayo del MAb 12A2/HE4 de longitud completa para determinar HE4 en las muestras de tejido.

Ejemplo 7

Diagnóstico del cáncer de ovario mediante la determinación de HE4a en los cortes de tejido

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para el diagnóstico del cáncer de ovario al incubar los anticuerpos específicos para el dominio N-WFDC de HE4a con tejidos o células obtenidos de los pacientes con sospecha de cáncer de ovario y determinación de la unión de los anticuerpos al tejido o las células.

Los portaobjetos de matriz de tejido (Super Bio Chips) se desparafinaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la recuperación del antígeno, los portaobjetos se calentaron en microondas en tampón citrato 10 mM pH 6,0 durante 10 min. La peroxidasa endógena se inactivó mediante incubación en 3 % de H²O²durante 5 min. En la configuración preferida, las secciones de tejido se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con el MAb 12A2. Para la visualización del MAb 12A2 unido, se usó En Vision System-HRP (Dako AS, Dinamarca) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los portaobjetos se contratiñeron en hematoxilina (Dako Cytomation), se montaron y analizaron por microscopía. Las diferentes secciones del cáncer de ovario (Figura 12 A-D) se tiñeron para el N-WFDC de HE4a, mientras que los tejidos de los tejidos no cancerosos fueron negativos (Figura 12 E-F).

Los términos y expresiones empleados se usaron como los términos de la descripción y no de limitación y no hay intención en el uso de tales términos y expresiones para excluir ningún equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de los mismos.

Listado de secuencias:

SEQ ID No 1:

Precursor de la proteína 2 con dominio de núcleo de 4 disulfuros WAP

Homo sapiens

Acceso NP_0Q50t)4

124 a. a.

1mpacrlgplaaalllslJ.lt gftlvsgtga ektgvcpelqadqnctqecvsdsecadnlk

61 ccsagcatfcslpndkegscpqvninfpqlglcrdqcqvdsqcpgqmkccrngcgkvscv

121tpnt

SEQ ID No 3: _

Proteína HE4-V4 que contiene el dominio WAP

Homo sapiens

Acceso AAL374S8

102 a. a.

1mpacrlgplaaalllslllf gftlvsgtga ektgvcpelqadqnctqecvsdsecadnlk

61ccsagcatteslpnalthwhlktrrlweis gprprrptwdss

SEQ ID No 5: _

Proteína HE4-V3 que contiene el dominio WAP

Homo sapiens

Acceso AAL374S7

73 a. a.

1 mlqvqvnlpvsplptypysf typdkegscpqvnintpqlgIcrdqcqvdsqcpgqmkccr

61ngcgkvscvtpnf

SEQ ID No 7:

Proteína HE4-V2 que contiene el dominio WAP

Homo sapiens

Acceso AAL374S6

76 a. a.

1 mpdcrlgpla aalllslllf gftlvsdkeg sepqvniníp qlglcrdgcq vdsqcpgqmk 61 ccrngcgkvs cvtpnf

SEQ ID No 9:

Proteína HE4-V1 que contiene el dominio WAP

Homo sapiens

Acceso AAL374S5

00 a. a.

1 mpacrlgpla aalllslllf gftlvsgtga ektgvcpelq adqnctqecv sdsecadnlk 61 ccsagcatfc llcpngqlae

SEQ ID No 11:

Dominio 2 del núcleo de 4 disulfuros WAP

Homo sapiens

Acceso AAH46106

124 a. a.

1 inpacrlgpla aalllslllf gftlvsgtga ektgvcpelq adqnctqecv sdsecadnlk 61 ccsagcatfc slpndkegsc pqvninípql glcrdqcqvd sqcpgqmkcc rngcgkvscv 121 tpnf

SEQ ID No 13:

Proteína HE4

Homo sapiens

Acceso AAO52603

124 a. a.

1 mpacrlgpla aalllslllf gftlvsgtga ektgvcpelq adqnctqecv sdsecadnlk 61 ccsagcatfc slpndkegsc pqvninfpql glcrdqcqvd sqcpgqmkcc rngcgkvscv 121 Cpnf

SEQ ID No 15:

Proteín î HE4

Homo sapiens

Acceso CAA44S69

125 a. a.

1 mpacrlgpla aalllslllf gftlvsgtga ektgvcpelq adqnctqecv sdsecadnlk 61 ccsagcatfc llcpndkegs cpqvnintpq lglcrdgcqv dtqcpgqmkc crngcgkvsc 121 vtpnf

SEQ ID No 17:

N-WFDC do HE4a

Homo sapiens

D N L K C C S A G C A T F C S L P N D

SEQ ID No 19:

C-WFDC do HE4a

Homo sapiens

K E G 5 C P C V N I N F P Q L G L C R D q c ^qv o 5 Q C P G Q M K C C P. M G C <3 K V 3 C V T p it F

SEQ ID No 21:

HE4a-V4: Cebador directo

5'-GTTGTTACCGGTGCAGCAGAGAAGACTGGCGTGTGCCCC-3'

SEQ ID No 23:

HE4a-V4: Cebador inverso

5'-AATCTCCCAGAGCCTCCGTGTCTTTAGGTGCCAGTGGAACAGTGCATTGGGCAGAGAGCA-3'

SEQ ID No 25:

HE4a-V2: Cebador directo

5'-GTTGTTACCGGTGCAAAGGAGGGTTCCTGCCCCCAG-3'

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 12A2, depositado en la ECACC como el No.

de depósito de patente 10091401 o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo que conserva la capacidad de unirse específicamente a HE4a, en donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo une un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos del dominio N-WFDC de un polipéptido de HE4a como se establece en la SEQ ID NO: 17.

2. Un kit para diagnosticar el cáncer de ovario que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1.

3. Un kit de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al dominio C-WFDC de un polipéptido de HE4a como se establece en la SEQ ID NO: 19, en donde el anticuerpo que se une específicamente al dominio C-WFDC del polipéptido de HE4a está opcionalmente marcado de forma detectable.

4. Un método para diagnosticar un sujeto con cáncer de ovario, el método comprende:

(a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto con al menos un anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la muestra se pone en contacto en condiciones y durante un tiempo suficiente para detectar la unión del anticuerpo al polipéptido de HE4a y

(b) diagnosticar un sujeto con cáncer de ovario en el que la muestra biológica contiene un polipéptido de HE4a que se une específicamente al menos a un anticuerpo.

5. El método de la reivindicación 4, que comprende además poner en contacto la muestra biológica del sujeto con un anticuerpo que se une específicamente al dominio C-WFDC del polipéptido del antígeno HE4a como se establece en la SEQ ID NO: 19

en donde la muestra se pone en contacto en condiciones y durante un tiempo suficiente para detectar la unión de los anticuerpos al polipéptido de HE4a y

(c) detectar el cáncer de ovario o diagnosticar un sujeto con cáncer de ovario en el que la muestra biológica contiene un polipéptido de HE4a que se une específicamente al menos a un anticuerpo de la reivindicación 1 y el anticuerpo que se une específicamente al dominio C-WFDC del polipéptido del antígeno HE4a.

6. El método de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde el polipéptido de HE4a se presenta naturalmente en forma soluble y la muestra comprende sangre, suero, fluido seroso, plasma, linfa, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, una secreción mucosal, una secreción vaginal, medio de cultivo acondicionado o un líquido de lavado.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde al menos un anticuerpo está inmovilizado sobre un soporte sólido.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el método se configura como un ensayo tipo sándwich de dos anticuerpos.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el sujeto se somete a un tratamiento para el cáncer de ovario y el método se lleva a cabo para dar seguimiento al curso de la enfermedad.