ES2834652T3 - Componentes de vacuna bacterianos de Staphylococcus aureus y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica para su uso en la prevención y/o el tratamiento de infección intramamaria (IMI) estafilocócica en un mamífero, comprendiendo dicha composición: (1) al menos un agente, en la que dicho agente es: (i) un polipéptido codificado por el gen SACOL0029, basándose en la nomenclatura génica del genoma de Staphylococcus aureus COL (SACOL) expuesto en la secuencia de referencia NCBI NC_002951.2, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de proteína n.º YP_184940.1 accesible a través de GenBank; (ii) un polipéptido que tiene al menos el 95% de identidad con (i); o (iii) un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de uno acualquiera de (i) a (ii); o (2) un agente, en la que dicho agente es una forma viva atenuada de Staphyloccocus aureus que comprende una mutación en el gen SACOL0029, en la que la mutación es una deleción, una inserción o una sustitución de uno o más nucleótidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Componentes de vacuna bacterianos de Staphylococcus aureus y usos de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos componentes y dianas de vacuna. Más específicamente, la presente invención se refiere a nuevos antígenos que representan componentes de vacuna, a procedimientos de fabricación de los mismos, a métodos de uso de los mismos y a métodos de prevención y tratamiento de infecciones microbianas que implican la administración de los mismos.

Antecedentes de la invención

La mastitis bovina es la enfermedad más frecuente y costosa para los productores de leche y Staphylococcus aureus se considera la bacteria transmisible que con mayor frecuencia es responsable del desarrollo de la enfermedad (Sears et al., 2003). Las infecciones intramamarias estafilocócicas (IMI, intramammary infection), que pueden conducir a mastitis, son difíciles de tratar y las recaídas frecuentes son comunes (Sandholm et al., 1990). La susceptibilidad de bacterias a los antibióticos in vitro es un mal predictor de la eficacia terapéutica en vacas con infección crónica (Owens et al., 1997). Aunque las infecciones que siguen al tratamiento de la mastitis pueden deberse a cepas recientemente adquiridas, a menudo son el resultado de la persistencia del organismo infeccioso original (Sandholm et al., 1990; Myllys etal., 1997). Portanto, las terapias existentes a menudo no consiguen eliminarla infección y sería muy deseable encontrar nuevos enfoques para prevenir o tratar la IMI estafilocócica.

El documento US 2004147734 divulga polipéptidos y secuencias de ácido nucleico aislados derivados de Staphylococcus epidermidis útil en el diagnóstico y terapia de condiciones patológicas; anticuerpos contra los polipéptidos; y métodos para la producción de polipéptidos. Específicamente, el documento US 2004147734 divulga la SEQ ID 6885.

Se ha observado una falta de eficacia y capacidad protectora de la vacuna para vacunas contra S. aureus disponibles comercialmente (Middleton, 2008). Se han descrito y propuesto varias vacunas contra estafilococos y componentes de vacuna adicionales. El uso de leche o medios con bajo contenido en hierro como sistemas sustitutos para explorar genes de S. aureus que se expresan durante la IMI no replica completamente el entorno real del huésped mamífero que puede variar en cuanto a la composición de nutrientes, las interacciones con las células huésped y los componentes de la respuesta inmunitaria, por nombrar sólo algunas diferencias. Por tanto, los componentes de S. aureus actualmente propuestos como vacuna no son necesariamente los componentes que se expresan durante la IMI en múltiples puntos de tiempo, por múltiples cepas (incluyendo cepas crónicas) y en múltiples huéspedes. Por tanto, sería muy deseable identificar genes de S. aureus que se expresan durante IMI en múltiples puntos de tiempo, por múltiples cepas y en múltiples huéspedes, de modo que una selección de genes y productos codificados por genes (por ejemplo, proteínas) pueden usarse solos o en combinación para la protección contra IMI y mastitis.

La presente invención busca satisfacer estas y otras necesidades.

Sumario de la invención

La divulgación proporciona métodos para prevenir y/o tratar la infección intramamaria estafilocócica en un mamífero usando el producto de uno de varios genes codificados por el genoma de Staphylococcus aureus COL (SACOL) expuesto en la secuencia de referencia NCBI NC_002951.2.

La invención se centra en SACOL0029, y su proteína correspondiente, cuya secuencia puede accederse a través de GENBANK en YP_184940.1, y por tanto tiene la secuencia de aminoácidos MLESREQLSVEEYETFFNRFDNQEFD FERELTQDPYSKVYLYSIEDHIRTYKIEK.

El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos adjuntos:

La figura 1 muestra los tipos de cepas de Staphylococcus aureus aisladas de vacas: cepas aisladas crónicas y sistemáticamente de vacas con síntomas clínicos. Los aislados crónicos se aislaron de vacas que arrojaron una cepa de S. aureus genéticamente idéntica con > 55 días de diferencia entre el secado y el parto, tal como se ilustra (muestras 1a y 2a). Se tomaron cepas aisladas sistemáticamente en el parto o en el periodo de lactancia de vacas que arrojaron recuentos altos de células somáticas (SCC, somatic cell count) en la leche o que presentaban signos de inflamación (mastitis). Las células somáticas son leucocitos (glóbulos blancos). El SCC es un indicador de la calidad de la leche. El número de células somáticas aumenta en respuesta a bacterias patógenas tales como S. aureus.

La figura 2 muestra la relación genética de los aislados de S. aureus usados en los estudios descritos en el presente documento tal como se determina mediante datos comparativos de hibridación de ADN genómico obtenidos para 530 genes impresos en matrices de ADN. Los aislados subrayados son cepas crónicas. A modo de comparación, se muestran las cepas de referencia no relacionadas y los aislados seleccionados aleatoria/sistemáticamente de casos de mastitis bovina con síntomas clínicos durante la lactancia.

La figura 3 muestra análisis de Q-PCR que informan del nivel relativo de expresión génica para indicadores de virulencia: hld (producción de exotoxinas dependiente de Agr), icaC (producción de biopelículas dependiente de ica) y la producción global de biopelículas (medida mediante un método espectrofotométrico con cristal violeta) en aislados de S. aureus cultivados en un medio de cultivo in vitro. Los aislados crónicos n.° 3 (triángulo negro invertido), n.° 557 (círculo negro) y n.° 1290 (rombo negro) se comparan con una colección de cepas aisladas sistemáticamente de mastitis bovina con signos clínicos (cuadrados negros, donde el aislado SHY97-3906, una cepa descrita previamente aislada de un caso típico de mastitis con signos clínicos, se representa como el cuadrado blanco). Los resultados de la Q-PCR se presentan como expresión en veces en comparación con la cepa de referencia Newbould (ATCC 29740) y la producción de biopelícula se informa como un porcentaje de la producida por la cepa SHY97-3906. Todos los resultados de Q-PCR se normalizan usando el nivel de expresión de gyr.

La figura 4 muestra la descripción del método usado para aislar bacterias de muestras de leche de mastitis. (A) Leche antes de la primera centrifugación con caseína proteasa (Prot (+)) o sin (Prot (-)). (B) Después de la primera centrifugación. (C) Después del tratamiento “RNA Protect” y centrifugación (última etapa). Se recupera un sedimento bacteriano de gran tamaño de la leche tratada con caseína proteasa.

La figura 5 muestra perfiles de infección experimentales provocados por las cepas crónicas n.° 3, n.° 557 y n.° 1290 y por una cepa aislada de un caso típico de mastitis SHY97-3906 en vacas notificados en función de los recuentos de células bacterianas (UFC) (eje Y izquierdo) o somáticas (SCC) (eje Y derecho) durante el periodo de infección. Las figuras 5A, 5B y 5C representan la vaca n° 313, vaca n° 307 y vaca n° 5325, respectivamente. Las cuatro cepas diferentes de S. aureus usadas en este estudio se representan como barras y puntos negros (SHY97-3906), barras y puntos blancos (aislado crónico n.° 3), barras y puntos grises (aislado crónico n.° 557) y barras sombreadas y puntos en forma de estrella (aislado crónico n.° 1290). La vaca n.° 5325 fue sacrificada el día 15.

La figura 6 muestra un diagrama de Venn de los genes expresados diferencialmente en las cepas crónicas tomadas en su conjunto (aislados n.° 3, n.° 557 y n.° 1290) frente a SHY97-3906 aislado de un caso típico de mastitis con signos clínicos.

La figura 7 muestra un diagrama de Venn de los 43 genes que se encuentran fuertemente expresados en experimentos de microalineamientos usando muestras bacterianas de la vaca n.° 307 en el día 8 (A) y el día 10 (B) de la infección, y en la vaca n.° 5325 en el día 10 de la infección (C). El número de muestras bacterianas en las que se demostró que se expresaban los genes se indica entre paréntesis y los nombres de los genes en negrita se seleccionaron para los análisis de Q-PCR (véase la figura 8).

La figura 8 muestra análisis cuantitativos de PCR de genes que se encuentran fuertemente expresados por S. aureus recogidos de la IMI de la vaca (vaca). La expresión génica se comparó con la medida en S. aureus cultivado in vitro en caldo de Mueller-Hinton suplementado con hierro (caldo hierro), en caldo con restricción de hierro (caldo - hierro) y en leche sin mastitis recién recogida in vitro (leche in vitro). Todos los resultados se normalizan usando el nivel de expresión de gyrB y se presentan como valores Log10 de las razones de expresión relativa. La barra horizontal representa el valor de la razón mediana de todas las muestras. Se muestran diferencias significativas entre la mediana y una razón de cero (que no representa ningún cambio en la expresión del gen) (* = P <0,05; ** = P <0,01; *** = P <0,005; prueba de la t para datos independientes). Se analizaron muestras de ARN de S. aureus hechos crecer en dos animales diferentes: vaca n.° 5325 en el día 10 de la infección con aislados SHY97-3906 (o), n.° 3 (A), n.° 557 (^ ) y n.° 1290 (□), vaca 307 en el día 8 de la infección (mismas formas de símbolo, símbolos negros) y vaca n.° 307 en el día 14 de la infección (mismas formas de símbolo, símbolos grises). Para la muestra recogida de la cepa n.° 1290 en la vaca n.° 5325 el día 10 de la infección (□), se muestran las barras de error. La expresión génica relativa se muestra para un gen de biosíntesis capsular (capM), un gen de función desconocida (SACOL2171), un regulador transcripcional de función desconocida (SACOL2325), un transportador ABC de función desconocida (SACOL0718) y un gen codificado cromosómicamente no caracterizado previamente (SACOL0442).

La figura 9 muestra la organización del operón predicho SACOL0718-720 en cepas de S. aureus COL, N315, RF122, USA300 y MSSA476. Los dos genes se superponen en 10 nucleótidos. La flecha indica la dirección de la transcripción. También se indica la posición del genoma de las cajas -10 y -35 predichas de la región promotora.

La figura 10 muestra la cinética de crecimiento de la cepa de S. aureus ATCC 29213 y los tres mutantes isogénicos ATCC 29213ASACOL0442a (A442a), ATCC 29213ASACOL0442b (A442b) y ATCC29213ASACOL0720 (A720). Los mutantes para los genes SACOL0442 y SACOL0720 se produjeron por reemplazo de genes (A442a) o por inserción de intrones (A442b y A720). Antes de la IMI bovina experimental, se evaluó el crecimiento relativo de la cepa parental y los mutantes in vitro en leche recién recogida (figura 10A). En la figura 10A, la media de UFC/ml (log10) para las 4 cepas se representa a lo largo del tiempo después de un inóculo pequeño o grande (paneles izquierdo y derecho, respectivamente). La figura 10B muestra los recuentos medios de bacterias recuperadas de la leche de ocho (8) vacas Holstein multíparas infectadas experimentalmente en la mitad de la lactancia en función del tiempo. Cada una de las 8 vacas se infundió por vía intramamaria con las cuatro cepas de S. aureus (ATCC 29213 y mutantes A442a, A442b y A720) y la posición de cada cepa en cada uno de los cuatro cuartos de la glándula mamaria alternó entre los animales. Las infecciones se llevaron a cabo durante 21 días. Se recogió la leche de los cuartos infectados y se realizó la determinación de los recuentos de bacterias viables. Los círculos negros y la línea discontinua representan el crecimiento de la cepa parental y los símbolos blancos y las líneas continuas el crecimiento de los tres mutantes tal como se indica en el gráfico.

Las figuras 11A-11D muestran una alineación de secuencias de ácido nucleico (figuras 11A-C) y aminoácidos (figura 11D) de SACOL0442 de diversas cepas de Staphylococcus aureus (secuencias de ácido nucleico: MW0345 (MW2) (SEQ ID NO: 24); SAS0347 (MSSA476) (SEQ ID NO: 25); SACOL0442 (Col) (SEQ ID NO: 26); SAOUHSC_00354 (nctc8325) (SEQ ID NO: 27); NWMN_0362 (NEWMAN) (SEQ ID NO: 28); SAUSA300_0370 (USA300-FPR3757) (SEQ ID NO: 29); SaurJH1_0429 (JH1) (SEQ ID NO: 30); SAHV_0367 (Mu3) (SEQ ID NO: 31); SaurJH9_0419 (JH9) (SEQ ID NO: 32); SAV0370 (Mu50) (SEQ ID NO: 33); SA0357 (N315) (SEQ ID NO: 34); SAB0321 (RF122) (SEQ ID NO: 35 ); y consenso (SEQ ID NO: 36); secuencias de aminoácidos: SACOL0442 (Col) (SEQ ID NO: 37); SAOUHSC_00354 (nctc8325) (SEQ ID NO: 38); NWMN_0362 (NEWMAN) (SEQ ID NO: 39 ); SAUSA300_0370 (USA300-FPR3757) (SEQ ID NO: 40); SaurJH1_0429 (JH1) (SEQ ID NO: 41); SAHV_0367 (Mu3) (SEQ ID NO: 42); SaurJH9_0419 (JH9) (SEQ ID NO: 43 ); SAV0370 (Mu50) (SEQ ID NO: 44); SA0357 (N315) (SEQ ID NO: 45); SAS0347 (MSSA476) (SEQ ID NO: 46); SAB0321 (RF122) (SEQ ID NO: 47); y consenso (SEQ ID NO: 48). Los alineamientos se basan en las secuencias disponibles de múltiples cepas de Staphylococcus aureus, incluyendo el aislado de mastitis bovina RF122. La secuencia de aminoácidos de MW0345 (MW2) (SEQ ID NO: 75) no está incluida en la alineación. Las características de las cepas comparadas se proporcionan en la figura 13. Debajo de cada alineación, un asterisco (*) indica una coincidencia del 100% de nucleótidos o aminoácidos entre todas las cepas comparadas; un punto doble (:) indica que se han observado sustituciones conservadas y un punto simple ( ) significa que se observan sustituciones semiconservadas.

Las figuras 12A-12K muestran una alineación de secuencias de ácido nucleico (figuras 12A-H) y aminoácidos (figura 12I-K) de SACOL0720 de diversas cepas de Staphylococcus aureus. (secuencias de ácido nucleico: SaurJH1_0700 (JH1) (SEQ ID NO: 49); SaurJH9_0685 (JH9) (SEQ ID NO: 50); SAHV_0659 (Mu3) (SEQ ID NO: 51); SAV0662 (Mu50) (SEQ ID NO: 52); SA0617 (N315) (SEQ ID NO: 53); MW0624 (MW2) (SEQ ID NO: 54); SAS0627 (MSSA476) (SEQ ID NO: 55); SACOL0720 (SEQ ID NO: 56); SAUSA300_0648 (USA300-FPR3757) (SEQ ID NO: 57); SAOUHSC_00668 (NCTC8325) (SEQ ID NO: 58); NWMN_0631 (Newman) (SEQ ID NO: 59); SAB0611 (RF122) (SEQ ID NO: 60); consenso (SEQ ID NO: 61); secuencia de aminoácidos: SACOL0720 (SEQ ID No : 62); Sa UsA300_0648 (USA300-FPR3757) (SEQ ID NO: 63); SAOUHSC_00668 (NCTC8325) (SEQ ID NO: 64); NWMN_0631 (Newman) (SEQ ID NO: 65); SaurJH1_0700 (JH1) (SEQ ID NO: 66); SaurJH9_0685 (JH9) (SEQ ID NO: 67); SAHV_0659 (Mu3) (SEQ ID NO: 68); SAV0662 (Mu50) (SEQ ID NO: 69); SA0617 (N315) (SEQ ID NO: 70); MW0624 (MW2) (SEQ ID NO: 71); SAS0627 (MSSA476) (SEQ ID NO: 72); SAB0611 (RF122) (SEQ ID NO: 73); consenso (SEQ ID NO: 74). Los alineamientos se basan en las secuencias disponibles de múltiples cepas de Staphylococcus aureus, incluyendo el aislado de mastitis bovina RF122. Las características de las cepas comparadas se proporcionan en la figura 13. Debajo de cada alineación, un asterisco (*) indica una coincidencia del 100% de nucleótidos o aminoácidos entre todas las cepas comparadas; un punto doble (:) indica que se han observado sustituciones conservadas y un punto simple ( ) significa que se observan sustituciones semiconservadas.

La figura 13 muestra las características de las cepas de Staphylococcus aureus cuyas secuencias están alineadas en las figuras 11A-D y 12A-K.

Las figuras 14A-14C muestran la localización celular predicha de las proteínas SACOL0442 (figura 14A), SACOL0718 (figura 14B) y SACOL0720 (figura 14C), y la figura 14D muestra las hélices transmembrana predichas de la proteína SACOL0720 (SEQ ID NO: 62). En la figura 14D, “I” e “ i” representan aminoácidos intracelulares, “H” y “h” representan aminoácidos que forman parte de la hélice y están localizados en la membrana, “O” y “o” representan aminoácidos extracelulares, es decir, localizados fuera de la membrana citoplasmática (las letras mayúsculas indican una predicción más fuerte en relación con las letras minúsculas). La secuencia resaltada y encuadrada es la secuencia extracelular más larga de la proteína que se usó como componente de vacuna en el ejemplo 7. La localización celular se determinó usando el sitio web: http://psort.org/index.html (Gardy J. L. et al., Bioinformatics 2005 21(5): 617-623; doi: 10.1093/bioinformatics/bti057) y composición de aminoácidos en el sitio web: http://www.expasy.ch/tools/protparam.html (Gasteiger E. et al., The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005), págs. 571-607). La localización de la hélice transmembrana fue proporcionada por el servidor proteómico ExPASy™: http://www.enzim.hu/hmmtop/index.html (G.E Tusnády e I. Simon (2001), Bioinformática 17, 849-850).

La figura 15 muestra los títulos de IgG totales en sueros de ratones vacunados con SACOL0442 y SACOL0720. Los títulos de anticuerpos se determinaron mediante ELISA. Un grupo de animales (10 ratones por grupo) recibió dos inyecciones de solución salina, un grupo recibió 2 inyecciones de 100 |ig de polipéptido SACOL0442, un grupo recibió 2 inyecciones de 100 |ig de polipéptido SACOL720, un grupo recibió 2 inyecciones de 100 |ig de polipéptido SACOL1781 y un grupo recibió 2 inyecciones de 100 |ig de cada uno de los tres polipéptidos premezclados juntos (SACOL0442, SACOL0720 y SAc Ol 1781). Las 2 inyecciones se realizaron con 3 semanas de diferencia. Tres semanas después de la segunda inmunización, los ratones se sacrificaron y se extrajo sangre para la determinación de los títulos de IgG totales mediante ELISA. Cada punto representa el título en suero de un ratón. Las barras horizontales son las medias para cada grupo (líneas grises punteadas, antígenos inyectados individualmente; líneas negras continuas, antígenos inyectados en combinación).

La figura 16 muestra los títulos de anticuerpos IgG totales en sueros de vacas lecheras vacunadas con SACOL0442 y SACOL0720. Un grupo de animales (5 vacas por grupo) recibió dos inyecciones de solución salina, un grupo recibió 2 inyecciones de 300 |ig de polipéptido SACOL0442, un grupo recibió 2 inyecciones de 300 |ig de polipéptido SACOL720 y un grupo recibió 2 inyecciones de 300 |ig de cada uno de los dos polipéptidos premezclados juntos (SACOL0442, SACOL0720). Las 2 inyecciones se realizaron con 10 semanas de diferencia. Se recogió sangre cada dos semanas para la determinación de los títulos de anticuerpos IgG totales mediante ELISA. Los datos representan la media de cada grupo. Las líneas continuas y los símbolos negros representan el título total de anticuerpos IgG contra SACOL0720 y las líneas discontinuas y los símbolos blancos representan los títulos totales de anticuerpos IgG contra SACOL0442. Los círculos (negros para SACOL0720 y blancos para SACOL0442) representan los títulos de anticuerpos para el grupo que recibió solución salina. Los triángulos (negros para SACOL0720 y blancos para SACOL0442) representan los títulos de anticuerpos para los dos grupos que recibieron cada uno de los dos polipéptidos. Los cuadrados (negros para SACOL0720 y blancos para SACOL0442) representan los títulos de anticuerpos para el grupo que recibió ambos polipéptidos.

La figura 17 muestra los títulos de anticuerpos IgG1 e IgG2 en la semana 16, en sueros de vacas lecheras vacunadas con SACOL0442 y SACOL0720 (los títulos de IgG totales de las mismas muestras en la semana 16 se mostraron en la figura 16). Tal como se describe en la figura 16, un grupo de animales (5 vacas por grupo) recibió dos inyecciones de solución salina, un grupo recibió 2 inyecciones de 300 |ig de polipéptido SACOL0442, un grupo recibió 2 inyecciones de 300 |ig de polipéptido SACOL720 y un grupo recibió 2 inyecciones de 300 |ig de cada uno de los dos polipéptidos premezclados juntos (SACOL0442, SACOL0720). Las 2 inyecciones se realizaron con 10 semanas de diferencia. Se recogió sangre en la semana 16 para la determinación de los títulos de anticuerpos IgG1 e IgG2 mediante ELISA. Las figuras 17A y B muestran títulos de isotipos IgG1 e IgG2, respectivamente contra el polipéptido SACOL0442, las figuras 17C y D muestran títulos de isotipos IgG2 e IgG1, respectivamente, contra el polipéptido SACOL0720. Cada punto en los gráficos representa el título en suero de una vaca (cuadrados negros, semana 16; círculos blancos, títulos preinmunitarios antes de la inmunización). Las barras horizontales son las medianas de cada grupo (líneas continuas, sueros inmunitarios en la semana 16; líneas discontinuas, sueros preinmunitarios antes de las inmunizaciones).

La figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 76) de SACOL01781 de la cepa MW2 de S. aureus.

Descripción

En un primer aspecto, la presente divulgación proporciona un método para prevenir y/o tratar la infección intramamaria (IMI) estafilocócica en un mamífero, comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un agente, en el que dicho agente es: (a) un polipéptido codificado por un gen, en el que dicho gen es SACOL0029, SACOL0100, SACOL0101, SACOL0105, SACOL0148 SACOL0154 SACOL0204 SACOL0205 SACOL0264 SACOL0442, SACOL0461, SACOL0608, SACOL0660 SACOL0688 SACOL0690 SACOL0704 SACOL0718 SACOL0720, SACOL0829, SACOL1054, SACOL1142 SACOL1145 SACOL1320 SACOL1353 SACOL1416 SACOL1611, SACOL1637, SACOL1680, SACOL1781 SACOL1812 SACOL1867 SACOL1912 SACOL1944 SACOL2092, SACOL2144, SACOL2169, SACOL2171 SACOL2321 SACOL2325 SACOL2342 SACOL2365 SACOL2379, SACOL2385 i SACOL2599 basándose en la nomenclatura génica del genoma de Staphylococcus aureus COL (SACOL) expuesto en la secuencia de referencia NCBI NC_002951.2; (b) un polipéptido codificado por un gen de un mismo operón que uno de los genes de (a); (c) un fragmento inmunogénico de (a) o (b); (d) una variante inmunogénica de uno cualquiera de (a) a (c); (e) un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de uno cualquiera de (a) a (d); o (f) cualquier combinación de (a) a (e).

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de un agente, en el que dicho agente es: (a) un polipéptido codificado por un gen, en el que dicho gen es SACOL0029, SACOL0100, SACOL0101, SACOL0105, SACOL0148, SACOL0154, SACOL0204, SACOL0205, SACOL0204 , SACOL0442, SACOL0461, SACOL0608, SACOL0660, SACOL0688, SACOL0690, SACOL0704, SACOL0718, SACOL0720, SACOL0829, SACOL1054, SACOL1142, SACOL1145, SACOL1320, SACOL1353, SACOL1416, SACOL1611, SACOL1637, SACOL1680, SACOL1781, SACOL1812, SACOL1867, SACOL1912, SACOL1944, SACOL2092 , SACOL2144, SACOL2169, SACOL2171, SACOL2321, SACOL2325, SACOL2342, SACOL2365, SACOL2379, SACOL2385 o SACOL2599, basándose en la nomenclatura génica del genoma de Staphylococcus aureus COL (SACOL) expuesto en la secuencia de referencia NCBI NC_002951.2; (b) un polipéptido codificado por un gen de un mismo operón que uno de los genes de (a); (c) un fragmento inmunogénico de (a) o (b); (d) una variante inmunogénica de cualquiera de (a) a (c); (e) un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de uno cualquiera de (a) a (d); o (f) cualquier combinación de (a) a (e), para prevenir y/o tratar una infección intramamaria (IMI) estafilocócica en un mamífero.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de un agente, en el que dicho agente es: (a) un polipéptido codificado por un gen, en el que dicho agente es SACOL0029, SACOL0100, SACOL0101, SACOL0105, sAc OL0148, SACOL0154, SACOL0204, SACOL0205, SACOL0264 , SACOL0442, SACOL0461, SACOL0608, SACOL0660, SACOL0688, SACOL0690, SACOL0704, SACOL0718, SACOL0720, SACOL0829, SACOL1054, SACOL1142, SACOL1145, SACOL1320, SACOL1353, SACOL1416, SACOL1611, SACOL1637, SACOL1680, SACOL1781, SACOL1812, SACOL1867, SACOL1912, SACOL1944, SACOL2092 , SACOL2144, SACOL2169, SACOL2171, SACOL2321, SACOL2325, SACOL2342, SACOL2365, SACOL2379, SACOL2385 o SACOL2599, basándose en la nomenclatura génica del genoma de Staphylococcus aureus COL (SACOL) expuesto en la secuencia de referencia NCBI NC_002951.2; (b) un polipéptido codificado por un gen de un mismo operón que uno de los genes de (a); (c) un fragmento inmunogénico de (a) o (b); (d) una variante inmunogénica de uno cualquiera de (a) a (c); (e) un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de uno cualquiera de (a) a (d); o (f) cualquier combinación de (a) a (e), para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar la infección intramamaria (IMI) estafilocócica en un mamífero.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica (por ejemplo, una vacuna) para prevenir y/o tratar la infección intramamaria (IMI) estafilocócica en un mamífero, comprendiendo dicha composición un agente, en la que dicho agente es: (a) un polipéptido codificado por un gen, donde dicho gen es SACOL0029, SACOL0100, SACOL0101, SACOL0105, SACOL0148, SACOL0154, SACOL0204, SACOL0205, SACOL0264, SACOL0442, SACOL0461, SACOL0608, SACOL0660, SACOL0688, SACOL0690, SACOL0704, SACOL0718, SACOL0720, SACOL0829, SACOL1054, SACOL1142, SACOL1145, SACOL1320, SACOL1353, SACOL1416, SACOL1611, SACOL1637, SACOL1680, SACOL1781, SACOL1812, SACOL1867, SACOL1912, SACOL1944, SACOL2092, SACOL2144, SACOL2169, SACOL2171, SACOL2321, SACOL2325, SACOL2342, SACOL2365, SACOL2379, SACOL2385 o SACOL2599, basándose en la nomenclatura génica del genoma de Staphylococcus aureus COL (SACOL) expuesto en la secuencia de referencia NCBI NC_002951.2; (b) un polipéptido codificado por un gen de un mismo operón que uno de los genes de (a); (c) un fragmento inmunogénico de (a) o (b); (d) una variante inmunogénica de uno cualquiera de (a) a (c); (e) un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de uno cualquiera de (a) a (d); o (f) cualquier combinación de (a) a (e), y opcionalmente uno o más excipientes/portadores farmacéuticamente aceptables.

Los números de registro de Genbank para los genes de S. aureus y polipéptidos codificados mencionados anteriormente se representan en la tabla I a continuación:

Tabla I: números de registro de Genbank para los genes de S. aureus genes y polipéptidos codificados asociados con IMI descritos en el presente documento.

En una realización, el gen mencionado anteriormente es SACOL0029, SACOL0264, SACOL0442, SACOL0718, SACOL0720, SACOL1353, SACOL1416, SACOL1611, SACOL1944, SACOL2144, SACOL2365 o SACOL2599.

Tal como se usa en el presente documento, el término “vacuna” se refiere a cualquier compuesto/agente (“componente de vacuna”), o combinaciones de los mismos, capaz de inducir/provocar una respuesta inmunitaria en un huésped y que permite tratar y/o prevenir una infección y/o una enfermedad. Por tanto, los ejemplos no limitativos de tal agente incluyen proteínas, polipéptidos, fragmentos de proteína/polipéptido, inmunógenos, antígenos, epítopos de péptidos, epítopos, mezclas de proteínas, péptidos o epítopos, así como ácidos nucleicos, genes o porciones de genes (que codifican para un polipéptido o proteína de interés o un fragmento del mismo) añadidos por separado o en una secuencia contigua tal como en las vacunas de ácido nucleico y similares.

Un fragmento inmunogénico de una proteína/polipéptido se define como parte de una proteína/polipéptido que es capaz de inducir/provocar una respuesta inmunitaria en un huésped. En una realización, el fragmento inmunogénico es capaz de provocar la misma respuesta inmunitaria en cuanto al tipo, aunque no necesariamente en cuanto a la cantidad, que la proteína/polipéptido. Un fragmento inmunogénico de una proteína/polipéptido comprende preferiblemente uno o más epítopos de dicha proteína/polipéptido. Un epítopo de una proteína/polipéptido se define como un fragmento de dicha proteína/polipéptido de al menos aproximadamente 4 ó 5 aminoácidos de longitud, capaz de provocar un anticuerpo específico y/o una célula inmunitaria (por ejemplo, una célula T o célula B) que porta un receptor capaz de unirse específicamente a dicho epítopo. Existen dos tipos diferentes de epítopos: epítopos lineales y epítopos conformacionales. Un epítopo lineal comprende un tramo de aminoácidos consecutivos. Un epítopo conformacional está formado normalmente por varios tramos de aminoácidos consecutivos que se pliegan en su posición y juntos forman un epítopo en una proteína adecuadamente plegada. Un fragmento inmunogénico tal como se usa en el presente documento se refiere a uno, o ambos, de dichos tipos de epítopos. En una realización, el fragmento inmunogénico de una proteína/polipéptido comprende al menos 4 ó 5 residuos de aminoácidos. En una realización adicional, el fragmento inmunogénico comprende al menos 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 50 ó 100 aminoácidos consecutivos de la proteína/polipéptido nativo.

Tal como entenderá el experto habitual en la técnica, los agentes (proteínas/polipéptidos, fragmentos de los mismos) que tienen modificaciones que no se producen de manera natural (por ejemplo, variantes inmunogénicas) y que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria específica para el agente no modificado (por ejemplo, capaces de inducir la producción de anticuerpos capaces de reconocer el agente no modificado) también se encuentran dentro del alcance del término “componente de vacuna”. Por ejemplo, los componentes de vacuna de la presente divulgación pueden modificarse para potenciar su actividad, estabilidad y/o biodisponibilidad y/o reducir su toxicidad. Pueden realizarse sustituciones conservadoras de aminoácidos, como por ejemplo, la sustitución de un aminoácido que comprende una cadena lateral ácida por otro aminoácido que comprende una cadena lateral ácida, la sustitución de un aminoácido voluminoso por otro aminoácido voluminoso, la sustitución de un aminoácido que comprende una cadena lateral básica por otro aminoácido que comprende una cadena lateral básica y similares. Un experto en la técnica podrá generar variantes de una proteína/polipéptido. Esto se hace, por ejemplo, mediante el cribado de una biblioteca de péptidos o mediante programas de cambio de péptidos. Una variante inmunogénica según la divulgación tiene esencialmente las mismas propiedades inmunogénicas de dicha proteína en cuanto al tipo, no necesariamente en cuanto a la cantidad. Una variante inmunogénica de una proteína/polipéptido de la divulgación puede comprender, por ejemplo, una proteína de fusión y/o una proteína quimérica. Por ejemplo, se predice que la función biológica de la proteína SACOL0442 identificada en el presente documento es una exotoxina, enterotoxina o superantígeno y podría interferir potencialmente con el sistema inmunitario de mamíferos y la producción de anticuerpos y/o mostrar alguna toxicidad en el huésped. Aunque tal interferencia no se observó cuando el polipéptido SACOL0442 se usó en combinación con, por ejemplo, SACOL0720 durante la inmunización (figura 15), puede ser útil modificar la proteína o polipéptido usado para la vacunación de modo que la actividad biológica de la exotoxina disminuya. Para tal fin, es posible inactivar la exotoxina con productos químicos (por ejemplo, formaldehído). También es posible usar técnicas de biología molecular para delecionar o mutar la región o regiones supuestas involucradas en la actividad de exotoxina sin perder inmunogenicidad (Chang et al., 2008). Otro ejemplo es la conjugación o mezcla de componentes basados en aminoácidos con ácidos nucleicos (por ejemplo, genes o porciones de genes añadidos por separado o en una secuencia contigua), hidratos de carbono tales como los que se encuentran en cápsulas de polisacáridos microbianos o biopelículas.

En una realización, el polipéptido mencionado anteriormente es un polipéptido que se secreta o expresa normalmente en la superficie de las bacterias (por ejemplo, Staphylococcus aureus).

En otra realización, el polipéptido mencionado anteriormente, o un polipéptido sustancialmente idéntico a dicho polipéptido, se expresa en al menos dos cepas diferentes de Staphylococcus aureus. Sustancialmente idéntico, tal como se usa en el presente documento, se refiere a que los polipéptidos tienen al menos el 60% de similitud, en realizaciones al menos el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de similitud en sus secuencias de aminoácidos. En realizaciones adicionales, los polipéptidos tienen al menos el 60%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad en sus secuencias de aminoácidos.

En una realización, el fragmento inmunogénico mencionado anteriormente comprende una secuencia que se conserva (es decir, idéntica) en al menos dos cepas diferentes de Staphylococcus aureus. En realizaciones adicionales, el fragmento inmunogénico mencionado anteriormente comprende una secuencia que se conserva (es decir, idéntica) en al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 cepas diferentes de Staphylococcus aureus. En otra realización, las cepas de Staphylococcus aureus mencionadas anteriormente son COL, RF122, NCTC 8325, JH1, JH9, Newman, Mu3, Mu50, USA300-FPR3757, N315, MW2 o MSSA476. En una realización, las cepas de Staphylococcus aureus mencionadas anteriormente están asociadas con mastitis bovina (por ejemplo, RF122).

La similitud e identidad entre las secuencias de aminoácidos o nucleótidos pueden determinarse comparando cada posición en las secuencias alineadas. La alineación óptima de secuencias para comparaciones de similitud y/o identidad puede realizarse usando una variedad de algoritmos, por ejemplo, usando un programa/software de alineación de secuencias múltiples bien conocido en la técnica tal como ClustalW™, SAGA™, UGENE™ o T-coffee™. En los ejemplos a continuación se describen ejemplos de alineamientos de secuencias múltiples y se representan en las figuras 10A-D y 11A-K.

También se encuentra dentro del contexto de la presente divulgación la administración in vivo de un ácido nucleico de la divulgación a un mamífero de modo que una o más proteínas/polipéptidos (o un fragmento de los mismos) de interés se expresen en el mamífero (por ejemplo, vacuna de ácido nucleico, vacuna de ADN o ARN).

El ácido nucleico de la presente divulgación comprende preferiblemente una secuencia de nucleótidos que codifica para una o más proteínas/polipéptidos indicados anteriormente (o fragmentos de los mismos) unidos operativamente a elementos reguladores necesarios para la expresión génica, tales como un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada, potenciadores y una señal de poliadenilación. Los elementos reguladores se seleccionan preferiblemente para que sean operativos en las especies a las que van a administrarse.

El ácido nucleico de la presente vacuna puede ser ADN “desnudo” o puede incorporarse operativamente en un vector.

Los ácidos nucleicos pueden administrarse a las células in vivo usando métodos bien conocidos en la técnica tales como inyección directa de ADN, captación de ADN mediada por receptores, transfección mediada por virus o transfección no viral y transfección basada en lípidos, todos los cuales pueden implicar el uso de vectores. Se ha usado la inyección directa para introducir ADN desnudo en las células in vivo (véase, por ejemplo, Acsadi et al. (1991) Nature 332: 815-818.; Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468). Puede usarse un aparato de administración (por ejemplo, una “pistola de genes”) para inyectar ADN en las células in vivo. Tal aparato puede estar disponible comercialmente (por ejemplo, de BioRad). También puede introducirse ADN desnudo en las células complejando el ADN con un catión, tal como polilisina, que se acopla a un ligando para un receptor de la superficie celular (véase, por ejemplo, Wu, G. y Wu, C. H. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967; y la patente estadounidense n.° 5,166,320). La unión del complejo ADN-ligando al receptor puede facilitar la captación del ADN por endocitosis mediada por receptor. Un complejo de ADN-ligando unido a cápsides de adenovirus que rompen los endosomas, liberando así material al interior del citoplasma, puede usarse para evitar la degradación del complejo por los lisosomas intracelulares (véase, por ejemplo, Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850; Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2122-2126).

Los vectores de administración útiles incluyen microcápsulas, complejos inmunoestimulantes (ISCOM) o liposomas biodegradables, y vectores vivos atenuados modificados por ingeniería genética tales como virus o bacterias. Los ejemplos de vectores bacterianos vivos atenuados adecuados incluyen Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, bacilo de Calmette-Guerin (BCG), Escherichia coli, Vibrio cholerae, Campylobacter, o cualquier otro vector bacteriano adecuado, tal como se conoce en la técnica. Los métodos para transformar vectores bacterianos vivos con un constructo de ADN exógeno están bien descritos en la técnica. Véase, por ejemplo, Joseph Sambrook y David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001).

Los vectores virales preferidos incluyen bacteriófagos, virus del herpes, adenovirus, virus de la poliomielitis, virus de la vaccinia, retrovirus defectuosos, virus adenoasociados (AAV) y Avipox. Los métodos para transformar un vector viral con un constructo de ADN exógeno también están bien descritos en la técnica. Véase Sambrook y Russell, anteriormente.

Los vectores de liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares, que tienen una porción de membrana formada por material lipófilo y una porción acuosa interior. La porción acuosa se usa en la presente divulgación para contener el material polinucleotídico que se administrará a la célula diana. Generalmente, se prefiere que los materiales formadores de liposomas tengan un grupo catiónico, tal como un grupo amonio cuaternario, y uno o más grupos lipófilos, tales como grupos alquilo saturados o insaturados que tienen de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. Un grupo de materiales adecuados se describe en la publicación de patente europea n.° 0187702, y se comenta adicionalmente en la patente estadounidense n.° 6,228,844 de Wolff et al. En la bibliografía se describen muchos otros compuestos lipídicos catiónicos formadores de liposomas adecuados. Véase, por ejemplo, L. Stamatatos, et al., Biochemistry 27: 3917 3925 (1988); y H. Eibl, et al., Biophysical Chemistry 10: 261 271 (1979). Alternativamente, puede usarse una microesfera tal como una microesfera biodegradable de polilactida-coglicolida. Se encapsula un constructo de ácido nucleico o se compleja de otro modo con el liposoma o microesfera para la administración del ácido nucleico a un tejido, tal como se conoce en la técnica.

Alternativamente, el ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) puede incorporarse en una célula in vitro o ex vivo mediante transfección o transformación, y la célula transfectada o transformada (por ejemplo, una célula inmunitaria tal como una célula dendrítica), que expresa la proteína o polipéptido de interés (o un fragmento del mismo), puede administrarse al huésped. Tras la administración, la célula expresará la proteína o polipéptido de interés (o un fragmento del mismo) en el huésped, lo que a su vez conducirá a la inducción de una respuesta inmunitaria dirigida contra la proteína, polipéptido o fragmento de los mismos.

Los métodos, usos, composiciones farmacéuticas y kits de la presente divulgación también abarcan la inmunización pasiva, que es la inyección de anticuerpos o antisuero, previamente generados contra el patógeno, con el fin de proteger o curar a un animal receptor de una infección o infección futura. La protección se desvanece en el transcurso de unas pocas semanas, durante las cuales la inmunización activa con proteína y/o ADN (tal como se describió anteriormente) tendrá tiempo para generar una respuesta protectora duradera. El suero para inmunización pasiva puede generarse mediante la inmunización de animales donantes usando los antígenos de S. aureus (proteínas, polipéptidos o ácidos nucleicos), tal como se describió anteriormente. Este suero, que contiene anticuerpos contra los antígenos, puede usarse inmediatamente o almacenarse en condiciones adecuadas. Puede usarse para combatir infecciones agudas (IMI) o como profiláctico (Tuchscherr et al., 2008). El uso de anticuerpos o sueros en una inmunización pasiva puede combinarse con otros agentes, tales como un antibióti

de una infección actualmente en curso o para aumentar la protección contra una infección inminente.

Los métodos, usos, composiciones farmacéuticas y kits de la presente divulgación también abarcan la inmunización con las bacterias de Staphylococcus aureus en forma viva atenuada o inactivada (por ejemplo, S. aureus que tiene al menos uno de los genes de la presente divulgación mutado (por ejemplo, A442a, A442b y A720 de SACOL442 y SACOL720, tal como se describe en el ejemplo 6). La mutación, tal como se usa en el presente documento, incluye una sustitución, una deleción y/o una inserción de uno o más nucleótidos que evita la expresión del polipéptido codificado por un gen de la presente divulgación o que evita la expresión de un polipéptido funcional. En una realización preferida, la mutación evita la expresión del polipéptido (por ejemplo, A442a, A442b y A720 de SACOL442 y SACOL720, tal como se describe en el ejemplo 6). En otra realización específica, la mutación es una deleción o una inserción. Se espera que una cepa mutada de S. aureus que tiene una mutación en cualquier posición de uno de los genes de la presente divulgación que evita la expresión del polipéptido puede usarse como una vacuna viva atenuada según la presente divulgación. Las vacunas vivas atenuadas, es decir, las vacunas que comprenden la bacteria según la divulgación en una forma viva atenuada, tienen la ventaja sobre las vacunas inactivadas de que imitan mejor la forma natural de infección. Además, sus capacidades de replicación permiten la vacunación con bajas cantidades de bacterias; su número aumentará automáticamente hasta que alcance el nivel de activación del sistema inmunitario. A partir de ese momento, el sistema inmunitario se activará y finalmente eliminará las bacterias. Sin embargo, una desventaja menor del uso de bacterias vivas atenuadas podría ser que, de manera inherente, queda un determinado nivel de virulencia. Esto no tiene por qué ser una desventaja real siempre que el nivel de virulencia sea aceptable, es decir, siempre que la vacuna al menos disminuya los síntomas de IMI en mamíferos. Por supuesto, cuanto menor es la virulencia en reposo de la vacuna viva atenuada, menos influencia tiene la vacunación sobre el aumento de peso durante/después de la vacunación.

Los componentes identificados según las enseñanzas de la presente divulgación tienen un valor profiláctico y/o terapéutico tal como pueden usarse para generar una respuesta inmunitaria para prevenir y/o combatir enfermedades o estados, y más particularmente enfermedades o estados relacionados con infecciones microbianas.

Los términos “tratar/que trata/tratamiento” y “prevenir/que previene/prevención”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a provocar la respuesta biológica deseada, es decir, un efecto terapéutico y profiláctico, respectivamente. Según la divulgación en cuestión, el efecto terapéutico comprende una o más de una disminución/reducción en la gravedad de la enfermedad (por ejemplo, una reducción o inhibición de la infección), una disminución/reducción de los síntomas y efectos relacionados con la enfermedad, una mejoría de los síntomas y efectos relacionados con la enfermedad, y un mayor tiempo de supervivencia del animal huésped afectado, tras la administración de al menos un agente (o de una composición que comprende el agente). Según la divulgación, un efecto profiláctico puede comprender una evitación/inhibición total o parcial o un retraso de la infección, y un mayor tiempo de supervivencia del animal huésped afectado, tras la administración del al menos un agente (o de una composición que comprende el agente).

Tal como se usa en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a componentes y composiciones de vacuna (por ejemplo, excipientes, portadores) que son fisiológicamente tolerables y no producen normalmente una reacción alérgica o adversa similar, tal como malestar gástrico, mareos y similares, cuando se administran a un sujeto. Preferiblemente, tal como se usa en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por la agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y en humanos. El término “excipiente” se refiere a un diluyente, portador o vehículo con el que pueden administrarse los componentes de vacuna de la presente divulgación. Pueden emplearse como portadores agua estéril o soluciones salinas acuosas y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para disoluciones inyectables.

En una realización, el agente de la presente divulgación se administra en combinación con un adyuvante o inmunoestimulante. Los adyuvantes o inmunoestimulantes adecuados que pueden mejorar la eficacia de los componentes para generar una respuesta inmunitaria incluyen, pero no se limitan a, aceites (por ejemplo, aceites minerales, aceite emulsionado como EMULSIGEN™-D), sales metálicas (por ejemplo, alumbre, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio), componentes microbianos naturales y artificiales (por ejemplo, liposacáridos bacterianos, adyuvantes de Freund, dipéptido de muramilo (MDP), diguanosín-5-monofosfato cíclico (c-di-GMP), patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPS)), componentes vegetales (por ejemplo, Quil A), y/o una o más sustancias que tienen efecto portador (por ejemplo, bentonita, partículas de látex, liposomas, copolímeros de ISCOM™ y polifosfazina (PCPP)). La inmunización con nanopartículas sintéticas (tales como las fabricadas a partir de un polímero sintético biodegradable como ácido poli(D,L-láctico-co-glicólico)) que contienen antígenos más ligandos que envían señales a través de TLR para estimular citocinas proinflamatorias también es posible (Kasturi et al, 2011).

Los componentes de vacuna de la divulgación pueden administrarse en una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en forma de dosificación unitaria. Puede emplearse cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intramamaria, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intraarticular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, oral o por aerosol. Los ejemplos de vías de administración específicas incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramamaria; oral (por ejemplo, inhalación); transdérmica (tópica); transmucosa y rectal.

Puede emplearse la práctica farmacéutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar tales componentes de vacuna con o sin adyuvantes a los sujetos. Los métodos bien conocidos en la técnica para preparar composiciones y formulaciones farmacéuticas se encuentran en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20a ed.) Ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott: Filadelfia. Las formulaciones para administración parenteral pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, migliol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Para controlar la liberación de los compuestos pueden usarse polímero de lactida, copolímero de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno biocompatibles y biodegradables. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles para los compuestos de la divulgación incluyen partículas de copolímero de etilenoacetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para inhalación o inyección intramamaria pueden contener excipientes, o por ejemplo, lactosa, o pueden ser disoluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietilen-9-lauril éter, migliol, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser disoluciones oleosas (por ejemplo, aceite de parafina) para administración en forma de gotas nasales o como gel.

Las formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de disoluciones o suspensión líquidas; para administración oral, las formulaciones pueden estar en forma de comprimidos o cápsulas; y para formulaciones intranasales, en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles. Las disoluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica, intramamaria o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijados (por ejemplo, aceite de parafina), polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol, migliol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; agentes reductores tales como ditiotreitol, tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples elaborados de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones acuosas (cuando sean solubles en agua) o dispersiones estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa o intramamaria, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor™ ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse para dar comprimidos o pienso. Para el propósito de la administración de una vacuna oral, los componentes activos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos, cápsulas o en piensos. Pueden incluirse agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes componentes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel™ o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para la administración por inhalación, los componentes de vacuna se administran en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador a presión que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser mediante medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que va a permearse. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles o cremas tal como se conoce generalmente en la técnica.

Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a tipos celulares específicos) también pueden usarse como portadores farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas también pueden contener agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, odorantes, sales para la variación de la presión osmótica, tampones, agentes de recubrimiento o antioxidantes. También pueden contener otros agentes terapéuticamente valiosos.

La administración intravenosa, intramuscular, intramamaria u oral es una forma de uso preferida. Las dosificaciones en las que se administran los componentes de la presente divulgación en cantidades eficaces dependen de la naturaleza del principio activo específico, el huésped y los requisitos del sujeto y el modo de aplicación. En general, se considera una cantidad de aproximadamente 0,01 mg - 500 mg por dosis.

La toxicidad o eficacia de los componentes de vacuna para provocar una respuesta inmunitaria puede determinarse mediante procedimientos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación. Puede medirse la relación de dosis entre los efectos estimulantes tóxicos e inmunitarios. Se prefieren los componentes que presentan grandes proporciones. Si bien pueden usarse componentes que presentan efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado de diseñar un sistema de administración para minimizar el daño potencial a las células y, por tanto, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios con animales de laboratorio pueden usarse para formular una gama de dosificación para su uso en animales grandes y humanos. La dosificación de tales componentes se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones administradas que incluyen eficacia con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada.

El experto en la técnica apreciará que determinados factores pueden influir en la dosificación requerida para generar de manera eficaz una respuesta inmunitaria en un sujeto. Además, la cantidad terapéuticamente eficaz de un componente de la presente divulgación puede requerir una serie de dosis.

La presente divulgación también incluye kits que comprenden los componentes de la presente divulgación. Por ejemplo, el kit puede comprender uno o más componentes. Los componentes se pueden empaquetar en un recipiente y dispositivo adecuados para su administración. El kit puede comprender además instrucciones para el uso del kit.

La presente divulgación también proporciona un método para diagnosticar IMI estafilocócica en un mamífero, comprendiendo dicho método: determinar un nivel de expresión de al menos un gen, en el que dicho gen es SACOL0029, SACOL0100, SACOL0101, SACOL0105, SACOL0148, SACOL0154, SACOL0204, SACOL0205, SACOL0264, SACOL0442, SACOL0461, SACOL0608, SACOL0660, SACOL0688, SACOL0690, SACOL0704, SACOL0718, SACOL0720, SACOL0829, SACOL1054, SACOL1142, SACOL1145, SACOL1320, SACOL1353, SACOL1416, SACOL1611, SACOL1637, SACOL1680, SACOL1781, SACOL1812, SACOL1867, SACOL1912, SACOL1944, SACOL2092, SACOL2144, SACOL2169, SACOL2171, SACOL2321, SACOL2325, SACOL2342, SACOL2365, SACOL2379, SACOL2385 < SACOL2599, basándose en la nomenclatura génica del genoma de Staphylococcus aureus expuesto en la secuencia de referencia NCBI NC_002951.2 o el nivel de actividad de un polipéptido codificado por dichos uno o más genes (al menos un gen), en una muestra biológica de dicho mamífero; y comparar dicho nivel de expresión o actividad con un nivel de referencia de expresión o actividad; en el que una mayor expresión o actividad en dicha muestra biológica en relación con dicha expresión o actividad de referencia es indicativa de que dicho mamífero tiene IMI estafilocócica.

En una realización, la expresión o actividad de referencia mencionada anteriormente es un nivel de expresión o actividad determinado en una muestra biológica correspondiente de un mamífero que se sabe que no tiene IMI estafilocócica. Tal expresión o actividad de referencia puede ser una expresión o actividad correspondiente a una expresión o actividad media o mediana calculada basándose en las mediciones realizadas en varios sujetos que no padecen el estado (por ejemplo, que se sabe que no tienen IMI estafilocócica). La expresión o actividad de referencia puede ajustarse o normalizarse por edad, sexo, raza u otros parámetros.

En una realización, el al menos un gen mencionado anteriormente es SACOL0029, SACOL0264, SACOL0442, SACOL0718, SACOL0720, SACOL1353, SACOL1416, SACOL1611, SACOL1944, SACOL2144, SACOL2365 o SACOL2599.

“Muestra” o “muestra biológica” se refiere a cualquier muestra sólida o líquida aislada de un ser vivo. En una realización particular, se refiere a cualquier muestra sólida (por ejemplo, muestra de tejido) o líquida aislada de un mamífero, tal como leche, un material de biopsia (por ejemplo, muestra de tejido sólido), sangre (por ejemplo, plasma, suero o sangre total), saliva, líquido sinovial, orina, líquido amniótico y líquido cefalorraquídeo. Tal muestra puede ser, por ejemplo, nueva, fijada (por ejemplo, fijada con formalina, alcohol o acetona), incrustada en parafina o congelada antes del análisis del nivel de expresión del agente infeccioso.

En una realización, la muestra biológica mencionada anteriormente es leche.

En una realización, el mamífero mencionado anteriormente es una vaca.

En una realización, el nivel de expresión mencionado anteriormente se determina midiendo el nivel de expresión de un polipéptido/proteína codificado por dichos uno o más genes. Los métodos para medir la cantidad/nivel de polipéptidos/proteínas seleccionados de esta divulgación (uno o más de los polipéptidos indicados anteriormente) se conocen bien en la técnica. Los niveles de proteína/polipéptido pueden detectarse directamente usando reactivos de afinidad, tales como un anticuerpo o un fragmento del mismo (para métodos, véase, por ejemplo, Harlow, E. y Lane, D (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), o un ligando (natural o sintético) que se une a la proteína. Los niveles de proteína/polipéptido pueden detectarse basándose en otras propiedades, por ejemplo, mediante la medición de la actividad de la proteína, que puede implicar una actividad enzimática para producir un producto detectable (por ejemplo, con propiedades espectroscópicas alteradas) o un fenotipo detectable (por ejemplo, alteraciones en el crecimiento/función celular).

Los ejemplos de métodos para medir la cantidad/nivel de proteínas/polipéptidos seleccionados incluyen, pero no se limitan a: inmunotransferencia de tipo Western, inmunotransferencia, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación, resonancia de plasmón superficial, quimioluminiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, análisis inmunohistoquímico, desorción láser asistida por matriz/tiempo de vuelo de ionización (MALDI-TOF), espectrometría de masas, microcitometría, microalineación, microscopía, citometría de flujo y ensayos basados en una propiedad de la proteína, que incluyen, pero no se limitan a, unión de ADN, unión de ligando, interacción con otras parejas de proteína o actividad enzimática.

En una realización, la cantidad del polipéptido/proteína dentro de los métodos de la presente divulgación se detecta usando anticuerpos que se dirigen específicamente contra el polipéptido/proteína. El término “anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica o la especificidad deseada. Los “fragmentos de anticuerpo” comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión al antígeno o variable del mismo. Las interacciones entre anticuerpos y un polipéptido diana se detectan mediante medios radiométricos, colorimétricos o fluorométricos. La detección de complejos antígeno-anticuerpo puede lograrse mediante la adición de un anticuerpo secundario que se acopla a una etiqueta detectable, tal como por ejemplo, una enzima, un fluoróforo o un cromóforo.

Los métodos para elaborar anticuerpos se conocen bien en la técnica. Los anticuerpos policlonales pueden prepararse inmunizando a un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el polipéptido/proteína de interés o un fragmento del mismo como un inmunógeno. Un “fragmento”, “porción” o “segmento” de polipéptido/proteína es un tramo de residuos de aminoácidos de al menos aproximadamente 5, 7, 10, 14, 15, 20, 21 o más aminoácidos del polipéptido indicado anteriormente. El título de anticuerpos en el sujeto inmunizado puede monitorizarse a lo largo del tiempo mediante técnicas convencionales, tales como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando polipéptido marcador exosómico inmovilizado o un fragmento del mismo. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpos son más altos, las células productoras de anticuerpos pueden obtenerse del animal, generalmente un ratón, y pueden usarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales, tales como la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4: 72), la técnica de EBV-hibridoma (Cole et al. (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld y Sell (Alan R. Liss, Inc., Nueva York, NY), págs. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas se conoce bien (véase, en general, Coligan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY).

Como alternativa a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, puede identificarse y aislarse un anticuerpo monoclonal mediante el cribado de una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos) con un polipéptido o un fragmento del mismo para aislar así los miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unen al polipéptido. Los kits para generar y cribar bibliotecas de presentación en fagos están disponibles comercialmente (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System™, número de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación en fagos Stratagene SurfZAP™, número de catálogo 240612).

Además, los anticuerpos dirigidos contra uno o más de los polipéptidos/proteínas descritos en el presente documento pueden obtenerse de fuentes comerciales.

El uso de anticuerpos inmovilizados específicos para los polipéptidos/proteínas también se contempla en la presente divulgación y lo conoce bien el experto en la técnica. Los anticuerpos podrían inmovilizarse en una variedad de soportes sólidos, tales como partículas de matriz magnética o cromatográfica, la superficie de un lugar de ensayo (tales como pocillos de microtitulación), piezas de un material de sustrato sólido (tal como plástico, nailon, papel) y similares. Podría prepararse una tira de ensayo recubriendo el anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos en una matriz sobre un soporte sólido. Esta tira podría luego sumergirse en la muestra de prueba y luego procesarse rápidamente a través de lavados y etapas de detección para generar una señal medible, tal como una mancha de color.

El análisis de una pluralidad (2 o más) de polipéptidos/proteínas puede realizarse por separado o simultáneamente con una muestra de prueba. Pueden combinarse varios polipéptidos/proteínas en una prueba para el procesamiento eficaz de múltiples muestras.

El análisis de polipéptidos/proteínas también podría llevarse a cabo en una variedad de formatos físicos. Por ejemplo, podrían usarse placas de microtitulación o la automatización para facilitar el procesamiento de un gran número de muestras de prueba. Alternativamente, podrían desarrollarse formatos de muestra única para facilitar el tratamiento y el diagnóstico inmediatos de manera oportuna. Los formatos físicos particularmente útiles comprenden superficies que tienen una pluralidad de localizaciones direccionables discretas para la detección de una pluralidad de analitos diferentes. Tales formatos incluyen microalineamientos de proteínas o “chips de proteínas” (véase, por ejemplo, Ng e Ilag, J. Cell Mol. Med. 6: 329-340, 2002) y dispositivos capilares.

En una realización, el nivel de expresión mencionado anteriormente se determina midiendo el nivel de expresión de un ARNm transcrito a partir de dichos uno o más genes.

Los métodos para determinar los niveles de ácido nucleico (ARNm) se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), SAGE, PCR cuantitativa (q-PCR), transferencia de tipo Southern, transferencia de tipo Northern, análisis de secuencia, análisis de microalineamientos, detección de un gen indicador u otras plataformas de hibridación de ADN/ARN. Para la expresión de ARN, los métodos preferidos incluyen, pero no se limitan a: extracción de ARNm celular y transferencia de tipo Northern usando sondas marcadas que se hibridan con transcritos que codifican para todo o parte de uno o más de los ácidos nucleicos que codifican para la proteína/polipéptido de esta divulgación; amplificación de ARNm expresado a partir de uno o más de los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas/polipéptidos de esta divulgación usando cebadores específicos, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR cuantitativa (q-PCR) y reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR ), seguida de la detección cuantitativa del producto mediante cualquiera de los diversos medios; extracción de ARN total de la muestra biológica, que luego se marca y se usa para sondar ADNc u oligonucleótidos que codifican para todos o parte de los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas/polipéptidos de esta divulgación, dispuestos en una variedad de superficies.

La presente divulgación también proporciona un kit o paquete que comprende reactivos útiles para determinar la cantidad/nivel de una o más proteínas/polipéptidos de la presente divulgación, por ejemplo, un ligando que se une específicamente a proteínas/polipéptidos, tal como un anticuerpo específico, o a un ácido nucleico que codifica para proteínas/polipéptidos, tal como un oligonucleótido (por ejemplo, cebador o sonda). Tal kit puede comprender además, por ejemplo, instrucciones para el diagnóstico de iM i estafilocócica, muestras de control (por ejemplo, muestras con las que puede compararse la muestra de ensayo para establecer el diagnóstico), recipientes, reactivos útiles para realizar los métodos (por ejemplo, tampones, enzimas, reactivos de inmunodetección, etc.). El kit puede incluir además, cuando sea necesario, agentes para reducir la interferencia de fondo en una prueba, agentes para aumentar la señal, software y algoritmos para combinar e interpolar valores de marcadores para producir una predicción del resultado clínico de interés, aparatos para realizar una prueba, curvas de calibración y gráficos, curvas y gráficos de estandarización, y similares. La presente divulgación también proporciona un kit o paquete que comprende uno o más agentes de la presente divulgación para tratar y/o prevenir la IMI estafilocócica. Tal kit puede comprender además, por ejemplo, instrucciones para la prevención y/o el tratamiento de IMI en un mamífero.

El uso de la palabra “un” o “una” cuando se usa junto con el término “que comprende” en las reivindicaciones y/o la memora descriptiva puede significar “uno/a” pero también es coherente con el significado de “uno/a o más”, “al menos uno/a” y “uno/a o más de uno/a”.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y en la(s) reivindicación/reivindicaciones, las palabras “que comprende” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), “que tiene” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “que incluye” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “ incluyen”) o “que contiene” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos o etapas de método adicionales no enumerados.

Ejemplos

EJEMPLO 1: materiales y métodos

Cepas de Staphylococcus aureus. Se usaron dos tipos de aislados de Staphylococcus aureus de vacas en este estudio: cepas aisladas crónicas y sistemáticamente (es decir, cepas aisladas de mastitis bovina con signos clínicos (recuentos altos de células somáticas (CCE) en la leche o signos de inflamación). Los aislados crónicos vinieron de vacas que arrojaron una cepa de S. aureus genéticamente idéntica con > 55 días de diferencia entre el secado y el parto, tal como se ilustra en la figura 1 (muestras 1a y 2a). Se tomaron cepas aisladas sistemáticamente en el parto o en el periodo de lactancia de vacas que arrojaron recuentos altos de células somáticas (SCC) en la leche o signos de inflamación (mastitis). Para las infecciones experimentales descritas adicionalmente a continuación, se usaron 3 cepas crónicas (n.° 3, n.° 557 y n.° 1290) y se compararon con SHY97-3906, una cepa descrita anteriormente aislada de un caso típico de mastitis con signos clínicos (Diarra et al., 2002) y de un transcriptoma conocido in vitro (Allard et al., 2006). La colección de aislados usados en este estudio se muestra en la tabla II a continuación.

Tabla II. Aislados de Staphylococcus aureus de mastitis usados en los estudios descritos en el presente documento.

Chr, crónico; R, aleatorio; C, mezcla de todos los cuartos; NA, no disponible

Hibridación genómica comparativa de aislados de S. aureus. Se determinó la relación genética de aislados de S. aureus mediante datos comparativos de hibridación de ADN genómico obtenidos para 530 genes impresos en matrices tal como se describió anteriormente (Atalla et al., 2008) y se muestra en la figura 2.

Producción de biopelículas mediante aislados de S. aureus. Se evaluó la formación de biopelículas mediante espectrofotometría en microplacas usando tinción con cristal violeta, tal como se describió anteriormente con algunas modificaciones (Brouillette et al., 2005). Brevemente, se cultivaron las cepas a partir de reservas congeladas en placas de agar BHI y se incubaron durante la noche a 35°C. A continuación, se inocularon tres colonias en 7 ml de BHI que contenía el 0,25% de glucosa suplementaria y se incubaron a 35°C durante 18 h con agitación a 225 rpm. Luego se diluyó este cultivo en McFarland 0,5 en glucosa BHI al 0,25% y se transfirió a los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno de fondo plano llenos hasta la mitad con el mismo medio. A continuación, se incubaron las placas a 35°C durante 24 ó 48 h. Luego se descartó el sobrenadante y se lavaron los pocillos delicadamente tres veces con 200 |il de PBS. Se secaron las placas, se tiñeron durante 30 min con cristal violeta, se lavaron dos veces con 200 |il de agua y se dejaron secar de nuevo. Se añadió un volumen de 200 |il de etanol al 95% a cada pocillo y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 h con agitación frecuente. A continuación, se midió la absorbancia de cada pocillo a 560 nm usando un lector de placas (Bio-Tek Instruments). Se recogieron los resultados de al menos tres experimentos independientes en los que se evaluó la formación de biopelículas de cada cultivo sometido a prueba en cuatro réplicas.

Condiciones de cultivo in vitro. Para el crecimiento bacteriano en concentraciones bajas y altas en hierro, se hicieron crecer las bacterias en primer lugar en caldo de Mueller-Hinton (MHB, Becton Dickinson Sparks, MD, EE.UU.) en un agitador orbital (225 RPM) a 35°C. A una Aeoonm de 0,6 (aprox. 1 x 108 UFC/ml), se dividió el cultivo en dos matraces estériles precalentados. Se indujo la limitación de hierro mediante la adición de 2,2-dipiridilo (Sigma Chemicals, St-Louis, MO) a 600 |iM a un cultivo, mientras que se añadió FeCh al otro cultivo a 10 |iM. La tasa de crecimiento de S. aureus en presencia de 2,2-dipiridilo o FeCh suplementario fue equivalente en ambas condiciones de prueba y estos suplementos no afectaron el crecimiento exponencial durante el periodo de tratamiento de una hora. Después de 1 h, los cultivos alcanzaron una Aeoonm de 1,0 (aprox. 109 UFC/ml) y se trataron 5 ml de cada cultivo con RNAprotect™ (QIAgen, Mississauga, ON, Canadá) durante 10 min antes de recoger las células por centrifugación. Para el crecimiento de bacterias en leche sin mastitis recién recogida, se hicieron crecer S. aureus SHY97-3906, n° 3, n° 557 y n° 1290 en primer lugar durante la noche en MHB en un agitador orbital (225 RPM) a 35°C. Por la mañana, se inocularon 250 ml de leche fresca con bacterias del cultivo durante la noche para obtener una concentración bacteriana de aproximadamente 104 UFC/ml. Se permitió el crecimiento bacteriano durante 7 h en un agitador orbital (225 RPM) a 35°C antes de aislar las bacterias de la leche tal como se describe a continuación. Para el crecimiento de bacterias destinadas a la amplificación de los genes icaC y hld por qPCR, se hizo crecer S. aureus en caldo de infusión cerebrocorazón (BHI) (BD, ON, Canadá) hasta que los cultivos alcanzaron una Aeoonmde 0,6.

Animales. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por los comités de cuidado animal institucionales locales y se llevaron a cabo según las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal. Los animales se mantuvieron en un establo de confinamiento de nivel 2 durante toda la duración de cada ensayo. Se alojaron ocho vacas Holstein multíparas en la mitad de la lactancia en el Centro de Investigación y Desarrollo de Bovinos Lecheros y Cerdos de Departamento de Agricultura y Agroalimentación de Canadá en Sherbrooke, QC, Canadá. Las vacas se seleccionaron como no infectadas antes del experimento mediante análisis bacteriano de muestras asépticas de leche y determinación del recuento de células somáticas (SCC).

Infecciones experimentales. Antes de los ensayos con animales, se determinó la relación entre la absorbancia de cultivos bacterianos (Ae⁰⁰nm) y UFC tal como se describió anteriormente (Petitclerc et al., 2007). La mañana de la exposición, se transfirió un volumen del cultivo durante la noche de S. aureus en MHB a 200 ml de MHB recién preparado para obtener una Ae⁰⁰nm de 0,1 y se cultivó a 35°C sin agitar hasta que la Ae⁰⁰nm alcanzó un valor correspondiente a 108 UFC/ml en la fase exponencial de crecimiento. A continuación, se diluyeron las bacterias en solución salina fisiológica estéril (Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL) para obtener 50 UFC en 3 ml. Se realizaron las infusiones intramamarias (IM) el mismo día inmediatamente después del ordeño al final de la tarde. Se infundió cada cuarto de glándula mamaria individual con 3 ml de una suspensión bacteriana. Se infundió cada una de las 8 vacas con las cuatro cepas de S. aureus diferentes y se alternó la posición de cada cepa en los cuatro cuartos entre los animales. Se realizó la infusión de cuartos mamarios con bacterias según el procedimiento descrito por Nickerson et al. (1999) con pocas modificaciones. Se realizaron todas las infusiones después del ordeño. Antes de la inoculación, se limpió minuciosamente el extremo de la ubre de cada cuarto para eliminar la contaminación visible y se sumergió en una disolución de yodo. Después de un tiempo de contacto mínimo de 30 segundos, se secaron las ubres y posteriormente se frotaron con gasas empapadas en etanol al 70%. Se dejaron secar al aire las ubres. Luego se descartó la primera leche y se realizó la infusión IM. Inmediatamente después, se masajearon todos los cuartos a fondo y se sumergieron las ubres nuevamente en una disolución de yodo. Se usaron guantes desechables durante todo el procedimiento y se cambiaron antes de pasar al siguiente animal.

Muestras de leche. Se recogieron las muestras de leche siempre de manera aséptica antes de ordeñar las vacas infectadas experimentalmente usando el procedimiento sugerido por el Consejo Nacional de Mastitis (1996). Después de descartar la leche inicial, se recogió una muestra de leche de 10 ml para cada cuarto individual en un vial estéril de 50 ml. Se diluyeron en serie las muestras de leche y se sembraron 200 |il en TSA y en placas de agar con sal de manitol (MSA; Becton Dickinson Sparks, MD, EE.UU.) para la identificación de S. aureus. A continuación, se incubaron las placas durante 24 h a 35°C antes del recuento de colonias. La dilución que mostró entre 30 y 300 colonias fue la considerada para el cálculo de la concentración bacteriana. Considerando la amplia gama de diluciones sembradas en placa y la gran cantidad de muestras que va a analizarse, sólo se consideró una placa por muestra. Se consideró que las muestras que mostraban 0 colonias para la leche sin diluir tenían una concentración < 5 UFC/ml. La concentración de lactosa, proteína, grasa y SCC en la leche que indica la presencia de leucocitos en respuesta a una infección se determinó en un laboratorio comercial (Valacta Inc., Ste-Anne-de-Bellevue, QC, Canadá). Esto se hizo cada dos días durante el periodo de 18 días de infecciones experimentales.

Recogida de leche para aislamiento de bacterias. Se recogió la leche de cada cuarto de cada vaca cada 2-4 días por la mañana durante un total de 18 días. Se recogió la leche usando unidades de ordeño de cuartos individuales. Antes del ordeño, los cuatro depósitos se desinfectaron con etanol al 70%. Se recogió un máximo de un litro de leche para centrifugación y aislamiento de bacterias.

Aislamiento de bacterias de la leche. Se trató la leche de mastitis de vacas infectadas experimentalmente o la leche recién recogida de vacas no infectadas usada para el crecimiento bacteriano in vitro con 200 |ig/ml de proteasa de páncreas bovino (Sigma) durante 10 min en un agitador orbital (100 RPM) a 35°C. Después del tratamiento, se centrifugó la leche durante 15 minutos a 4000 g. Se descartó el sobrenadante y se lavó el sedimento con PBS y se centrifugó. Se descartó el sobrenadante y se suspendió el sedimento de células bacterianas en 1 ml de PBS y se trató con RNAprotect™ durante 10 min antes de recoger las células mediante centrifugación. A continuación, se almacenó el sedimento celular congelado a -86°C.

Extracción y purificación de ARN. Se suspendieron sedimentos bacterianos de condiciones de crecimiento in vitro e in vivo en 200 |il de tampón TE que contenía 200 |ig/ml de lysostaphin™ (Sigma). Se permitió la lisis celular durante 1 h a temperatura ambiente antes de la extracción de ARN con el kit de aislamiento de ARN bacteriano TRIzol™ Max (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) seguido de un tratamiento con ADNasa con ADNasa TURBO™ (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). Se sometió el ARN de bacterias aisladas de la leche de vacas infectadas a una etapa de purificación adicional usando el kit MICROBEnrich™ de Ambion seguido de una segunda ronda de tratamiento con ADNasa con ADNasa TURBO™ (Ambion). Se determinó la concentración de ARN en las muestras mediante una lectura a A²⁶⁰nmy se almacenaron las muestras a -86°C hasta su uso.

Síntesis de sondas de ADNc. Se generaron sondas fluorescentes para la hibridación con matrices de ADN mediante un procedimiento de marcaje de ADNc con aminoalilo. Brevemente, se mezclaron 2,5-5 |ig de ARN total con 5 |ig de hexámeros aleatorios (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.). Se desnaturalizó esta mezcla a 70°C durante 10 min. Se llevó a cabo la transcripción inversa en presencia de tampón RT (Invitrogen), se añadieron DDT 10 mM, mezcla de dNTP (concentración final: dATP 500 |iM, dCTP, dGTP, dTTP 300 |iM y 5-[3-aminoalil]-2-dUTP 200 |iM (Sigma)) y 400 U de Superscript™ II RT a la preparación de ARN y se dejó que se produjera la reacción durante 2 h a 42°C. Se hidrolizó el A r N después de la transcripción con NaOH 200 mM y EDTA 100 mM a 65°C durante 15 min. Se neutralizó la reacción con HEPES 333 |iM, pH 7,5. Se purificaron los ADNc antes del marcaje fluorescente a través de tres pases en un Microcon™ YM30 (Millipore). Se acopló el aadUTP-ADNc resultante con NHS-Cy5 (paquete monorreactivo Fluorolink™ Cy5, Amersham Biosciences) en presencia de NaHCO³ 100 |iM, pH 9,0 durante 1 h a temperatura ambiente. Se extinguieron las reacciones con hidroxilamina 1,25 |iM durante 15 min a temperatura ambiente. Se purificaron los ADNc fluorescentes usando un kit de purificación de PCR QIAquick™ (QIAgen), que incluía tres etapas de lavado con tampón PE, antes de eluir en agua.

Matrices de ADN. Las matrices se describieron previamente (Allard et al., 2006; Moisan et al., 2006) y contenían una selección de 530 genes conocidos o supuestos implicados en los sistemas de adquisición y transporte de hierro/cationes, virulencia (genes de biopelícula, adhesinas, toxinas y homólogos de tales genes), secreción, respuestas generales al estrés, sistemas sensoriales/reguladores, resistencia a antibióticos y diversos genes de biosíntesis y metabolismo. En primer lugar, se amplificaron los genes mediante PCR usando cebadores Sigma Genosys™ (Oakville, ON, Canadá) basados en la secuencia genómica publicada del genoma de S. aureus COL, así como otros cebadores que se diseñaron con el software Primer3™ (primer3_www.cgi v 0,2). Luego, se purificaron los productos de PCR usando el kit de purificación de PCR QIAquick™, se precipitaron, se suspendieron a una concentración de 150 ng/|il en DMSO al 50% y se imprimieron por triplicado en portaobjetos Corning™ GAPS II (Corning, Corning, NY, EE.UU.) con la ayuda de la plataforma de impresión de microalineamientos del Instituto de Investigación Biotecnológica de Montreal (Montreal, Qc , Canadá). Los puntos de control fueron de Lucidea Universal Scorecard (Amersham, Piscataway, NJ).

Hibridación con matrices de ADN y análisis. Se suspendieron las sondas en 16,5 |il de tampón de hibridación (5X SSC, SDS al 0,1%, formamida al 25%). Se realizaron las etapas de prehibridación, hibridación y lavado según lo recomendado para los portaobjetos Corning™ Gaps II. Se cuantificaron las señales de hibridación para cada punto con el ScanArrayExpress™ Microarray Scanner y el software ScanArrayExpress™ V 2.2.0.0022 (Perkin Elmer, Wellesley, MA, EE.UU.). Se calculó un valor de intensidad medio como: Z (intensidad de todos los puntos)/número de genes en la matriz = 100%. Sólo se analizaron los genes con una intensidad de señal Cy5 de > 100%, es decir, mayor o igual a la intensidad media de Cy5 de toda la matriz. Por tanto, este informe identifica sólo genes que se expresaron fuertemente in vivo durante la mastitis porque sus intensidades de señal en las matrices eran más altas que el promedio.

PCR cuantitativa (qPCR). Se obtuvieron preparaciones de ARN adicionales para análisis de qPCR. Se recogieron bacterias de cultivos de caldo (bajo contenido en hierro y alto contenido en hierro) así como de la leche (in vitro e in vivo) tal como se describió anteriormente. Además, se extrajo ARN tal como se mencionó anteriormente. Se transcribió de manera inversa el ARN total (2-5 |ig) con dNTP 0,5 mM, 50 ng de hexámeros aleatorios y 200 U de transcriptasa inversa Invitrogen Superscript™ II según las recomendaciones del fabricante. Se desnaturalizó el ARN y se purificaron los ADNc con el kit de purificación de PCR QIAquick ™. Se amplificó 1 |il de ADNc en la PCR en tiempo real Stratagene™ MX3000P (Sratagene, LaJolla, CA, EE.UU.) con una mezcla maestra que se componía de Tris-HCI 6 mM pH 8,3, KCI 25 mM, MgCh 4 mM, trehalosa 75 mM, Tween™ 20 al 0,1% (v/v), BSA no acetilado 0,1 mg/ml, 0,07x SYBR verde (Invitrogen), dNTP 125 nM y 0,5 U de la ADN polimerasa JumpStart™ Taq (Sigma) y 100 nM de los cebadores enumerados en la tabla III a continuación. Se desnaturalizaron las mezclas de reacción durante 10 min a 95°C, seguido de 40 ciclos de 1 min a 60°C, 1 min a 72°C y se terminaron con una rampa de disociación de 55°C a 95°C. Se calculó el nivel de expresión de cada gen usando el Ct de los experimentos in vitro como calibrador (veces de expresión = 2'ACt, donde ACt representa la diferencia entre el Ct de las condiciones in vitro e in vivo). Se normalizó luego la expresión en veces de los genes de cada experimento con su respectivo nivel de expresión de gyrB. Se descubrió que el gen gyrB se expresa constitutivamente durante el crecimiento hasta la fase estacionaria temprana (Goerke et al., 2000), que está dentro de los límites de los experimentos de crecimiento descritos en el presente documento. Además, se encontró que la expresión de gyrB en las condiciones in vitro así como in vivo no se moduló significativamente.

Tabla III: secuencia de cebadores usados para PCR cuantitativa (qPCR).

Alineamientos de secuencia. Se obtuvieron secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de genes de S. aureus (incluyendo SACOL0442 y SACOL0720, así como otros genes) y proteínas codificadas a partir de las cepas de Staphylococcus aureus COL, RF122, NCTC 8325, JH1, JH9, Newman, Mu3, Mu50, USA300-FPR3757, N315, MW2 o MSSA476 del Comprehensive Microbial Resource (CMR) del J. Craig Venter™ Institute en http://cmr.jcvi.org/tigrscripts/CMR/CmrHomePage.cgi (Peterson, J. D. et al., Nucleic Acids Res. 2001 29 (1): 123-5). Se sometieron las secuencias a un programa de alineación de secuencias múltiples para ADN o proteínas, ClustalW2™, disponible en línea deforma gratuita en el Instituto Europeo de Bioinformática (www.ebi.ac.uk; Larkin M.A. etal., 2007. Bioinformatics 23 (21): 2947-2948).

Purificación de proteínas codificadas por genes de S. aureus expresados durante IMI. Se clonaron los genes o parte de los genes en el vector pQE-30 (Qiagen) aguas abajo de una señal de polihistidina para permitir la expresión de proteínas en Escherichia coli y la purificación de los polipéptidos etiquetados con his expresados usando una columna de afinidad de níquel (Qiagen Ni-NTA 1018244). Se realizó la expresión de las proteínas recombinantes y su purificación según las recomendaciones del fabricante (Qiagen).

Inmunización de especies de mamíferos y medición de títulos de anticuerpos. Se inmunizaron los ratones con los antígenos (proteínas recombinantes purificadas, polipéptidos o epítopos de interés, solos o en combinación). Por ejemplo, cada grupo de animales que se componía de diez ratones recibió un antígeno diferente (100 |ig por inyección), una combinación de antígenos (100 |ig de cada uno por inyección) o solución salina (es decir, el grupo de control no inmunizado). Se inmunizaron los ratones dos veces con 3 semanas de diferencia. Se combinaron los antígenos o la solución salina con el adyuvante Emulsigen®-D (MVP Technologies, Omaha, EE.UU.). Se realizaron las inyecciones por vía subcutánea en 400 |il en el lomo de los ratones. Se tomaron muestras de sangre en la vena mandibular antes de cada inyección y, 3 semanas después de la segunda inyección, se sacrificaron los ratones y se tomó la muestra máxima de sangre. Se determinaron los niveles de anticuerpos específicos contra los antígenos inmunizantes. Se evaluaron los niveles de anticuerpos usando la metodología ELISA convencional (Loiselle et al., 2009). Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con antígeno purificado individual y luego se saturaron con proteína no específica. Después de la incubación con diluciones en serie de los sueros y lavados, se añadió un anticuerpo secundario conjugado a una enzima (HRP) y se detectó la presencia de anticuerpos con una reacción colorimétrica.

Inmunización en vacas. Cada grupo de animales que se compone de 5 vacas recibe un antígeno diferente (300 |ig por inyección), una combinación de antígenos (300 |ig de cada uno por inyección) o solución salina (es decir, el grupo de control no inmunizado). Se combinan los antígenos o la solución salina con el adyuvante Emulsigen®-D. Después de tomar muestras de sangre para la determinación de los niveles preinmunitarios de anticuerpos, se inyecta un volumen final de 3 ml por dosis de antígenos o solución salina por vía subcutánea en el cuello de las vacas. Se realiza la toma de muestras de sangre cada 2 semanas. Diez semanas después de la primera inyección, se realiza la segunda inyección por vía subcutánea en el cuello del otro lado de los animales. Se determinan los niveles de anticuerpos específicos tal como se describe para la inmunización de ratones.

Evaluación de la unión de anticuerpos en la superficie de bacterias. Se incubaron las bacterias a 4°C, con agitación suave, con una disolución de PBS-BSA al 2% que contenía una dilución 1/500 de suero de conejo para bloquear la proteína A estafilocócica, que puede unirse de manera no específica al fragmento Fc de inmunoglobulinas. Después de 2 lavados con PBS-BSA al 2%-Tween20™ al 0,02%, se incubaron las bacterias a 4°C, con agitación suave, en PBS-PBS al 2% que contenía 10 |il de suero preinmunitario o inmunitario bovino contra el antígeno de interés. Después de 2 lavados con PBS-BSA al 2%-Tween20™ al 0,02%, se incubaron las bacterias durante una hora a 4°C, con agitación suave, en PBS-PBS al 2% que contenía una dilución 1/1000 de anticuerpo de cabra anti-IgG bovina conjugado con FITC. Después de 3 lavados con PBS-BSA al 2%-Tween20™ al 0,02%, se suspendieron las bacterias en PBS con formaldehído al 1%. A continuación, se analizó el marcaje de la superficie mediante citometría de flujo usando un instrumento BD FACSCalibur™ y el software CellQuest™ Pro.

Identificación de epítopos de células B. Con una combinación de software de predicción que incluye BCPred Predictions (EL-Manzalawy et al., 2008a), AAP Predictions (Chen J et al., 2007), FBCPred Predictions (EL-Manzalawy et al., 2008b) y ABCPred (Saha, S. y Raghava GPS, 2006), disponible en http://bioinfo.bgu.ac.il/bsu/immunology/epitope_pred/index.htm, http://ailab.cs.iastate.edu/bcpreds/index.html y en otros lugares, se determinaron epítopos de células B, es decir, secuencias cortas de aminoácidos que serán reconocidas por células B, induciendo así la producción de anticuerpos por las células B, para varios componentes de vacuna.

Identificación de epítopos de células T. Los algoritmos controlados por ordenador también pueden usarse para facilitar la identificación de epítopos de células T, es decir, secuencias cortas de aminoácidos que se unirán a moléculas de CMH (CMH de clase I y/o II) y serán reconocidas por las células T, induciendo así una respuesta inmunitaria celular. Los antígenos pueden someterse a análisis mediante el sistema Epimatrix™ (http://www.epivax.com/platform/) para identificar supuestos epítopos de células T. Esta técnica in silico divide la secuencia total del antígeno en fragmentos de 9 aminoácidos superpuestos por 8 aminoácidos. Esta agrupación de péptidos de 9 meros se criba luego para determinar la afinidad predicha contra un grupo de alelos conocidos de c Mh de clase I y clase II. Las puntuaciones resultantes pueden usarse para calificar los supuestos epítopos en una escala común que luego puede someterse a prueba in vitro. La técnica es aplicable a cualquier animal para el que se disponga de un conocimiento suficiente de las secuencias del CMH. (De Groot et al., 2008).

EJEMPLO 2: validación de cepas crónicas de S. aureus

Los datos comparativos de hibridación genómica para los miembros de pares de aislados crónicos recogidos de vacas con > 55 días de diferencia entre el secado y el parto (figura 2, aislados subrayados) muestran una alta relación genética. En la figura 2 también se muestran para comparación cepas de referencia no relacionadas (S. aureus N315, MRSACOL, Newbould, ATCC 49775, ATCC 51811 y SHY97-3906) y aislados escogidos aleatoria o sistemáticamente de casos de mastitis bovina con síntomas clínicos durante la lactancia (anotada como “R” en la tabla I anterior). Este análisis confirmó que los aislados que se recogieron de la misma vaca y el mismo cuarto con > 55 días de diferencia eran genéticamente idénticos. Está claro que los aislados crónicos n.° 3, n.° 557 y n.° 1290 usados en los estudios descritos en el presente documento tienen la capacidad de provocar una IMI y persistir en la glándula mamaria durante un largo periodo de tiempo (es decir, pueden provocar una IMI crónica).

La figura 3 muestra análisis de Q-PCR que informan el nivel relativo de expresión génica para indicadores de virulencia tales como hld (producción de exotoxinas dependiente de Agr), icaC (producción de biopelículas dependiente de ica) y la producción total de biopelículas (medida por un método espectrofotométrico con cristal violeta) para aislados de S. aureus que se hicieron crecer en un medio de cultivo in vitro. Los aislados crónicos (n° 3, 557, 1290) se compararon con una colección de cepas aisladas sistemáticamente de mastitis bovina con signos clínicos (donde el aislado SHY97-3906 se representa como un cuadrado blanco). Los resultados de la Q-PCR se presentan como expresión en veces en relación con la cepa de referencia Newbould (ATCC 29740) y la producción de biopelículas se informa como un porcentaje de la producida por la cepa SHY97-3906. Todos los resultados de Q-PCR se normalizaron en función del nivel de expresión de gyrA. Los cebadores usados para el análisis se muestran en la tabla II anterior. Este análisis confirmó que los aislados crónicos usados en los ejemplos descritos en el presente documento difieren sustancialmente en su nivel basal de expresión génica para determinantes de virulencia conocidos y para la producción de biopelículas en comparación con la población de aislados recogidos sistemáticamente de casos clínicos de mastitis durante la lactancia. Estas características descritas para los aislados crónicos se asemejan a las informadas para cepas de S. aureus aisladas de IMI bovina persistente (Melchior et al., 2009).

EJEMPLO 3: aislamiento eficaz de bacterias de la leche de vacas infectadas experimentalmente

El método usado para aislar bacterias de muestras de leche de mastitis se ilustra en la figura 4. El sedimento bacteriano recuperado de la leche tratada con proteasas (prot+, figura 4) era mucho más grande y permitió aislar mayores cantidades de ARN microbiano para experimentos de microalineamientos de ADN y qPCR en comparación con el obtenido del sedimento bacteriano no tratado (prot-, figura 4). Un experimento de microalineamientos de ADN que compara los perfiles transcripcionales de S. aureus que se hizo crecer in vitro en la leche tratada con caseína proteasa con los de células de S. aureus que se hicieron crecer en leche sin tratar no mostraron una modulación génica significativa. El análisis cuantitativo de PCR para 4 genes expresados en S. aureus que se hizo crecer en un medio con restricción de hierro in vitro y en condiciones ricas en hierro muestra que un retraso de 2 horas antes de la extracción de ARN (periodo de tiempo entre el ordeño y la extracción de ARN) no afectó a las modulaciones observadas en la expresión de genes regulados por hierro (isdB, ferritina y SACOL2170) y no afectó a la expresión del gen de mantenimiento gyrB. Por tanto, la integridad del ARN mensajero bacteriano aislado directamente de la leche de mastitis no debería verse afectada por el tiempo requerido para el aislamiento de las bacterias después del ordeño de la vaca infectada.

EJEMPLO 4: perfiles de infección experimentales en vacas

Los perfiles de infección experimentales para la cepa SHY97-3906 y las 3 cepas crónicas (n° 3, 557, 1290) en 3 vacas diferentes se informan en la figura 5 en función de los recuentos de células bacterianas (eje Y izquierdo) o somáticas (eje Y derecho) durante el periodo de infección. Los datos muestran que todos los aislados bacterianos pueden establecer una infección intramamaria en las vacas, aunque el huésped (vaca) parece influir en el nivel de recuentos de bacterias, mostrando la vaca n.° 313 un recuento de bacterias bajo frente a la vaca n.° 5325 que muestra recuentos altos para todos los aislados sometidos a prueba. Se usaron posteriormente las muestras de leche con altos recuentos de bacterias (obtenidas de las vacas n° 307 y 5325) para análisis transcripcionales.

EJEMPLO 5: genes de S. aureus expresados durante IMI en vacas

Se determinó el perfil transcripcional de las cepas de S. aureus que infectan las glándulas mamarias de las vacas mediante experimentos de microalineamientos de ADN. Los niveles relativos de expresión de los genes expresados diferencialmente y los 20 genes expresados por ambos grupos de aislados (es decir, de mastitis crónica o aguda) se informan en la tabla IV a continuación. La figura 6 muestra el diagrama de Venn de los genes expresados diferencialmente en las cepas crónicas tomadas todas juntas (aislados n.° 3, n.° 557 y n.° 1290) frente a SHY97-3906 aislado de un caso típico de mastitis con signos clínicos (mastitis aguda). Este análisis muestra que los dos tipos de aislados (aislado de mastitis crónica frente a típica (aguda)) presentan diferentes perfiles de expresión génica y que genes específicos pueden expresarse más fuertemente en cada grupo. Estos subgrupos específicos de genes constituyen dianas terapéuticas o de vacuna para tratar casos clínicos específicos. También son de interés los genes comúnmente expresados por ambos tipos de aislados (20 genes en este caso, identificados por un signo más [+] en la tabla IV a continuación), que pueden usarse para tratar casos agudos y/o crónicos.

La figura 7 muestra el diagrama de Venn de los 43 genes que se encuentran fuertemente expresados en experimentos de microalineamientos (tabla IV a continuación) usando muestras bacterianas de la vaca n.° 307 en el día 8 (A) y el día 10 (B) de la infección, y en la vaca n.° 5325 en el día 10 de la infección (C). El número de muestras bacterianas en las que se demostró que se expresaban los genes se indica entre paréntesis y los nombres de los genes que están representados en negrita se eligieron para los análisis de qPCR (figura 8). Este análisis permite la identificación de genes que son expresados por uno o más aislados en una o más vacas en uno o más puntos de tiempo durante la infección.

Por tanto, varios genes mostrados en la figura 7 se expresaron en una de las siguientes situaciones: (i) se expresaron en más de una cepa, (ii) se observaron en más de una vaca y/o (iii) en más de un punto de tiempo. Por tanto, la expresión de 5 genes de S. aureus tan interesantes en de 5 a 12 muestras independientes recogidas de vacas con IMI se verificó y confirmó mediante qPCR (figura 8). Estos incluyeron el gen de biosíntesis capsular (cap), un gen de función desconocida (SACOL2171), un regulador transcripcional de función desconocida (SACOL2325), un transportador ABC de función desconocida (SACOL0718) y un gen codificado cromosómicamente no caracterizado previamente (SACOL0442). Paralelamente, se comparó la expresión génica con la medida en S. aureus cultivado in vitro en caldo de Muller-Hinton suplementado con hierro (caldo hierro), en caldo con restricción de hierro (caldo -hierro) y en leche sin mastitis recién recogida in vitro (leche in vitro) con el fin de identificar los estímulos ambientales implicados en la expresión génica (figura 8).

Se observó que (i) la expresión de capM se redujo en las vacas y en la leche en comparación con lo observado in vitro, (ii) el gen SACOL2171 se reguló por incremento mediante restricción de hierro en vacas, en leche o en caldo con restricción de hierro in vitro, (iii) la expresión de SACOL0718 y SACOL2325 se indujo específicamente por el ambiente lácteo (es decir, regulada por incremento en vacas en comparación con cualquier caldo in vitro pero equivalente a la observada en la leche fresca) y (iv) el gen SACOL0442 se expresó exclusivamente durante la infección en la vaca, es decir, se expresó más en las vacas en comparación con cualquier otro entorno. El resumen del perfil de expresión determinado por análisis de qPCR y matriz de ADN para los genes SACOL0442 y SACOL0718 en diferentes cepas, vacas y puntos de tiempo durante la infección se informa en la tabla V a continuación. Tal como se observa, SACOL442 y SACOL0718 son ejemplos representativos de genes de S. aureus que presentan una expresión sostenida durante la IMI y esto independientemente de las cepas de S. aureus individuales. La tabla VI a continuación enumera 11 genes (es decir, SACOL442, SACOL0718 y otros 9 genes) para los que nunca se había informado de expresión antes, cuando S. aureus se hizo crecer en “otros” entornos de mamíferos (es decir, distintos del entorno de la glándula mamaria bovina, tal como se usa en el presente documento) (Allard et al., 2006; Burlak et al., 2007; Goerke et al., 2000; Garzoni et al., 2007) o en medios de cultivo sustitutos tales como en neutrófilos humanos in vitro (Voyich et al., 2005), un medio con restricción de hierro in vitro (Allard et al., 2006; Maresso et al., 2006), en leche in vitro (Lammers et al., 2000) o cuando se hicieron crecer aislados de mastitis de S. aureus in vitro (Taberna et al., 2007). Por tanto, los genes representados en la tabla VI representan excelentes dianas para la prevención y/o el tratamiento de IMI por S. aureus, por ejemplo, como componentes de una composición de vacuna destinada a prevenir la IMI por S. aureus. Además, informes de genes de S. aureus expresados en medios sustitutos o en un entorno de mamíferos distinto de la glándula mamaria pueden en realidad alejarse de lo que se informa en este caso para genes de S. aureus expresados durante IMI bovina. Por ejemplo, se informó que el gen capM (SACOL0148) se expresó en un aislado de mastitis que se hizo crecer en una placa de agar sangre in vitro (Taberna et al., 2007) pero en este caso se muestra que se expresa menos durante la IMI bovina que el medido después del crecimiento in vitro (figura 8). Se ha demostrado previamente que los genes capM, csb33, csb28, pflB, glpK y SACOL0154 (enumerados en la tabla III anterior) se expresaron menos durante el crecimiento de S. aureus en jaulas de tejido implantadas en la cavidad peritoneal de ratones que cuando se midieron in vitro (Allard et al., 2006), mientras que en los estudios actuales se muestra una fuerte expresión de todos estos genes durante la IMI bovina. De hecho, las barreras de defensa del huésped y la respuesta inmunitaria, el tejido de la glándula mamaria infectada y el daño tisular, así como la composición alterada y la baja tensión de oxígeno de la leche de mastitis de las vacas que padecen IMI, crean un entorno único y complejo que sería difícil de imitar en otros modelos animales de infección, en sistemas sustitutos u otros medios de cultivo (Mayer et al., 1988; Park et al., 2007).

El gen SACOL0718 identificado en las tablas III y V es parte de un operón que comprende los genes SACOL0718-SACOL0720 tal como se ilustra en la figura 9 y tal como se determina mediante programas conocidos por aquellos en el campo (Predicción de operón: www.microbesonline.org, Dehal P.S. et al., Nucleic Acids Res. Enero de 2010; 38 (edición de la base de datos): D396-400. Publicación electrónica del 11 de noviembre de 2009; Búsqueda de promotores: www.softberry.com, Srivastava S et al., Bioinformation 2008; 3 (4): 173-6. Publicación electrónica 6 de diciembre de 2008). La función predicha de estos genes es la formación de un transportador ABC que se compone de una proteína de unión a ATP y una permeasa (tabla V a continuación). SACOL0720 no se detectó en los experimentos de microalineamientos (tabla III anterior) porque no se incluyó en la composición de la matriz de ADN (Allard et al., 2006). Sin embargo, se conoce bien que los genes de los operones se expresan a partir de la misma secuencia promotora y se traducen en proteínas a partir del mismo ARN mensajero. Por tanto, dado que la expresión de SACOL0718 se detecta durante IMI, puede predecirse que la expresión de SACOL0720 ciertamente también se produce y, por tanto, tanto SACOL0718 como SACOL720 representan dianas para la prevención y/o el tratamiento de IMI por S. aureus.

Tabla IV: genes de S. aureus (43 genes) con niveles significativos de expresión (intensidad> 100%) durante la IMI bovina tal como se determina en experimentos de microalineamientos. Los genes se enumeran por nombre (si se atribuye), así como por números de marco de lectura abierto (ORF) para tres cepas diferentes de S. aureus para las que se secuencia el genoma (MRSA COL, N315 y el aislado de mastitis RF122). Tales genes también se informan en los diagramas de Venn de las figuras 6 y 7. Los 20 genes expresados tanto por cepas crónicas como por la cepa SHY97-3906 (común) se indican mediante un signo más (+).

Tabla V: muestras de leche de mastitis en las que se detectó la expresión de SACOL0442 (panel superior) o SACOL0718 (panel inferior) en una matriz de ADN o mediante qPCR para 4 cepas diferentes de S. aureus en 3 puntos de tiempo diferentes en dos vacas.

Gen Cepas de S. aureus

SACOL0442

Vaca Día de la infección SHY97-3609 3 557 1290

307 8 • • • •

307 10 • ND • •

307 14 • • • •

5325 10 • • • •

Gen Cepas de S. aureus

SACOL0718

Vaca Día de la infección SHY97-3609 3 557 1290

307 8 • • • •

307 10 • • ND ND

307 14 • • • •

5325 10 • • • •

ND, no detectado.

Tabla VI: nombres y anotaciones para una selección de 11 genes u operones tomados de los 43 genes que se encuentran fuertemente expresados en experimentos de microalineamientos (tabla III anteriormente) y para los cuales nunca se informó expresión cuando S. aureus se hizo crecer en un entorno de mamíferos diferente o en medios de cultivo sustitutos, tales como en neutrófilos humanos in vitro, en medios con restricción de hierro o en leche in vitro o cuando aislados de mastitis de S. aureus se hicieron crecer in vitro. Las anotaciones se comparan para representantes de los genomas secuenciados de S. aureus (MRSA COL, N315, RF122 [un aislado de mastitis], USA300, MSSA476).

EJEMPLO 6: atenuación de la virulencia de S. aureus

Se produjeron los mutantes para los genes SACOL0442 y SACOL0720 mediante reemplazo génico para el mutante A442a, (Mitchell et al., 2008) y mediante inserción de intrones para los mutantes A442b y A720 (TargeTron Gene Knockout System, Sigma Aldrich (Chen et al., 2007)). Se llevaron a cabo los mutantes en la cepa parental de S. aureus ATCC 29213 que podría transformarse fácilmente mediante electroporación. Para crear el mutante A442a, se delecionó un fragmento de 223 pb del gen SACOL0442 en la cepa ATCc 29213 y se reemplazó por la inserción del gen de resistencia a eritromicina de 1300 pb ermA entre las posiciones 188 y 411 de la secuencia de nucleótidos de SACOL0442. Para crear los mutantes A442b y A720, el intrón del grupo II (tamaño de fragmento de aproximadamente 2 Kb) del TargeTron Gene Knockout System se insertó en el gen cromosómico diana entre las posiciones de nucleótidos 45 y 46 para el gen SACOL0442 y entre las posiciones 803 y 804 para el gen SACOL0720, respectivamente. Antes de la IMI experimental con los mutantes, se evaluó su crecimiento, en comparación con la cepa parental, in vitro en leche recién recogida (figura 10A). No se observó ninguna diferencia entre el crecimiento de los 3 mutantes y la cepa parental. A continuación, se inocularon por vía intramamaria ocho vacas lactantes sanas con 25-250 UFC de la cepa parental y de los tres mutantes y se siguió la infección durante 21 días. Se infundió cada una de las 8 vacas con las cuatro cepas de S. aureus y se alternó la posición de cada cepa en los cuatro cuartos entre los animales. Se recogió la leche de los cuartos infectados y se realizó la determinación de los recuentos de bacterias viables. Cada uno de los tres mutantes mostró una reducción significativa de los recuentos de bacterias en la leche en comparación con la cepa parental (figura 10B). Por tanto, la virulencia de cada uno de los mutantes se atenúa en comparación con la cepa parental. Estos resultados demuestran la importancia de la expresión de los genes SACOL0442 y SACOL0718-720 para el proceso de infección. Los anticuerpos dirigidos hacia sus productos génicos deberían afectar en gran medida a la capacidad de S. aureus de provocar IMI bovina (véanse los ejemplos 8-11). Además, se han usado cepas bacterianas atenuadas como vacunas vivas (por ejemplo, PRIORIX® es una vacuna combinada contra el sarampión, las paperas y la rubéola, viva, atenuada; VARILRIX®, es una vacuna contra el virus de la varicela, viva, atenuada (cepa Oka); bCg , es una vacuna contra la tuberculosis que usa las bacterias vivas atenuadas Mycobacterium bovis) y, por tanto, el uso de los mutantes descritos en el presente documento (por ejemplo, mutantes A442a, A442b y A720) para la inmunización de vacas es otro enfoque para estimular la inmunidad y proteger al animal contra una futura infección por una cepa completamente virulenta. Por tanto, una mutación/deleción de cualquiera de los genes identificados en este caso como expresados por S. aureus durante la IMI bovina puede atenuar la virulencia y tales mutantes atenuados resultantes podrían usarse en un método de vacuna viva atenuada para inmunización.

EJEMPLO 7: relación de algunos genes y proteínas de S. aureus

La figura 11 muestra los alineamientos de ácidos nucleicos (figuras 11A-11C) y aminoácidos (figura 11D) de los componentes de vacuna SACOL0442 y SACOL0720 de todas las cepas secuenciadas de Staphylococcus aureus, incluyendo la cepa RF122 aislada de mastitis bovina. Las secuencias de SACOL0442 y SACOL0720 muestran una similitud de alrededor del 94 al 100% entre las cepas comparadas y, por tanto, se consideran altamente conservadas entre estas cepas de S. aureus representativas. El hecho de que estos genes/proteínas puedan encontrarse en cepas aisladas de múltiples fuentes refuerza su potencial como dianas (por ejemplo, candidatos de vacuna) ya que actuarán sobre la mayoría de infecciones de la ubre por S. aureus (infecciones IMI).

De manera similar, la tabla VII a continuación muestra el porcentaje de similitud e identidad de las secuencias de aminoácidos correspondientes a algunos de los genes de S. aureus expresados in vivo durante la IMI bovina (tabla VI anterior) para algunos representantes de los genomas secuenciados de S. aureus. De nuevo, se observó un alto grado de similitud e identidad (> 92,7%), lo que confirma que estos genes y proteínas codificadas representan una buena diana para la protección contra múltiples cepas de S. aureus. También hay aproximadamente un 40% de identidad y aproximadamente un 60% de similitud entre la secuencia de aminoácidos de SACOL0442 y la de otras supuestas exotoxinas tales como SACOL0469, SACOL0470, SACOL0472 y SACOL0473 (también conocida como SA0383 exotoxina 7 [set7], SA0384 exotoxina 8 [set8], SA0385 exotoxina 9 [set9] y SA0389 exotoxina 13 [set13] en la cepa N315, respectivamente) (www.jcvi.org). Aunque estos componentes no son los mismos genes o proteínas, es posible encontrar regiones, fragmentos o epítopos de proteínas comunes para su uso en vacunas con aplicaciones más amplias y así tener como objetivo la prevención y el control de muchos tipos de infecciones por S. aureus además de IMI. Algunas especies o géneros bacterianos relacionados genéticamente tales como Staphylococcus epidermidis, Streptococcocus, Listeria y otros también pueden tener homólogos de estos genes o proteínas. Por tanto, también puede ser posible encontrar regiones, fragmentos o epítopos de proteínas comunes para su uso en vacunas con aplicaciones más amplias destinadas a la prevención y el control de muchos tipos de infecciones bacterianas. Por ejemplo, el gen de S. aureus SACOL1416 muestra aproximadamente un 30% de homología de secuencia con el gen de Streptococcus agalactiae SAJ1496 y el gen de Listeria LWE0119 y el gen de S. aureus SACOL0718 muestran aproximadamente un 40-50% de homologías de secuencia con el gen de Streptococcus agalactiae SAJ1013 y el gen de Listeria LWE1764 (www.jcvi.org). Es destacable que Streptococcus agalactiae también es un patógeno implicado en la IMI y Listeria es un patógeno que a menudo contamina los productos lácteos (Bradley, 2002; Jayarao et al., 2001).

Tabla VII: porcentaje de similitud (% de sim.) e identidad (% de ide.) de las secuencias de aminoácidos correspondientes a algunos de los genes de S. aureus expresados in vivo durante la IMI bovina (tabla IV anterior) para algunos representantes de los genomas secuenciados de Staphylococcus aureus (cepas N315, RF122, USA300-FPR3757 y MSSA476 en comparación con la cepa MRSA COL).

Gen COL N315 RF122 USA300 MSSA476 SACOL % de ide. % de sim. % de ide. % de sim. % de ide. % de sim. % de ide. % de sim. % de ide. % de sim.

0442 100 100 99,5 99,5 94,6 98 100 100 95,6 98,0 0718 100 100 99,6 100 99,6 100 99,6 100 99,6 100 0720 100 100 99,4 99,7 99,4 100 100 100 99,4 99,7 2365 100 100 98,5 98,5 97,1 98,1 100 100 99,0 99,0 0029 100 100 100 100 - - 100 100 - -1416 100 100 99,6 100 98,2 99,6 100 100 100 100 1944 100 100 100 100 99,6 99,6 100 100 100 100 1611 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 2599 100 100 99,8 100 99,1 99,8 100 100 99,8 99,8 2144 100 100 94,6 98,5 92,7 96,2 99,6 99,6 96,2 99,2 1353 100 100 99,6 99,6 - - 100 100 99,6 100 0264 100 100 99,5 99,5 99,1 99,5 100 100 99,1 99,1

EJEMPLO 8: Preparación de vacunas

El software bioinformático proporcionó información secuencial y estructural sobre las proteínas SACOL0718, SACOL0720 y SALCOL0442 que fueron útiles para preparar tales proteínas en composiciones de vacunas (figura 14). Por ejemplo, se determinó que la proteína SACOL0442 era extracelular (proteína bacteriana secretada). La localización celular de la proteína SACOL0718 y su composición de aminoácidos que muestra un 45% de aminoácidos hidrófobos sugieren que está asociada con la membrana citoplasmática bacteriana. También se predijo que la proteína SACOL0720 estaría asociada con la membrana citoplasmática bacteriana. La proteína SACOL0720 contiene 10 hélices transmembrana y fue posible identificar una región expuesta en la superficie de la bacteria.

Para la preparación de vacuna, se usó la mayor parte de la proteína SACOL0442 (polipéptido que comprende los aminoácidos 44 a 159 en la secuencia representada en la figura 11D (la secuencia completa de SACOL0442 se expone en SEQ ID NO: 37)) y como tal, se excluyó su señal de transporte (aminoácidos 1 a 35). También se usó la región extracelular predicha de la proteína SACOL0720 (aminoácidos 309 a 508 anotados en o en la secuencia representada en la figura 14D (la secuencia completa de SACOL0720 se expone en SEQ ID NO: 62)) en una composición de vacuna. De la misma manera, se usó la región extracelular de la proteína SACOL1781 (polipéptido que comprende los aminoácidos 41 a 895 de la proteína IsdH (la secuencia completa de SACOL1781 se expone en SEQ ID NO: 76), véase también la figura 18); (www.jcvi.org)) como componente adicional de vacuna.

EJEMPLO 9: inmunogenicidad de la vacuna de la presente divulgación en ratones

Cada uno de los polipéptidos purificados derivados de SACOL0442, SACOL0720 y SACOL1781, independientemente o todos juntos en combinación, se sometieron a prueba para determinar la producción de anticuerpos en ratones. Los títulos de anticuerpos en sueros de ratones vacunados con SACOL0442, SACOL0720 y SACOL1781 (en presencia del adyuvante Emulsigen®-D) se muestran en la figura 15. Un grupo de animales (10 animales por grupo) recibió dos veces solución salina, un grupo recibió 2 inyecciones de 100 |ig del polipéptido SACOL0442, un grupo recibió 2 inyecciones de 100 |ig del polipéptido SACOL0720, un grupo recibió 2 inyecciones de 100 |ig del polipéptido SACOL1781 y un grupo recibió 2 inyecciones de 100 |ig de cada uno de los tres polipéptidos SACOL0442, SACOL0720 y SACOL1781 premezclados juntos en una combinación. Las 2 inyecciones se realizaron con 3 semanas de diferencia y 3 semanas después de la segunda inmunización, se sacrificaron los ratones y se extrajo sangre para la determinación de los títulos de anticuerpos mediante ELISA. Los resultados de la figura 15 muestran que los polipéptidos usados para la inmunización eran de hecho inmunogénicos (es decir, capaces de estimular una respuesta inmunitaria y la producción de anticuerpos). Los resultados también muestran que la combinación de polipéptidos SACOL0442 y SACOL0720 con otro antígeno tal como SACOL1781 no redujo ni alteró la producción de anticuerpos en comparación con la medida cuando se inyectaron SACOL0442 y SACOL0720 de manera independiente. Una composición de vacuna de este tipo (SACOL0442 y/o SACOL0720 con o sin otros antígenos) es, por tanto, una estrategia útil práctica para producir anticuerpos contra múltiples antígenos de interés. Una vacuna combinada de este tipo podría entonces proporcionar protección contra IMI bovina así como protección contra otras enfermedades que pueden requerir otros componentes de vacuna para la inmunización.

EJEMPLO 10: inmunogenicidad de la vacuna de la presente divulgación en vacas

También se realizaron inmunizaciones en vacas lecheras. Los títulos de anticuerpos en sueros de vacas vacunadas con los fragmentos polipeptídicos de SACOL0442, SACOL0720 descritos en el ejemplo 8 (en presencia del adyuvante Emulsigen®-D) se muestran en la figura 16. Un grupo de animales (5 animales por grupo) recibió 2 inyecciones de solución salina, un grupo recibió 2 inyecciones de 300 |ig del polipéptido SACOL0442, un grupo recibió 2 inyecciones de 300 |ig del polipéptido SACOL0720 y un grupo recibió 2 inyecciones de 300 |ig de cada uno de los dos polipéptidos SACOL0442 y SACOL0720 mezclados previamente juntos en una combinación. Las 2 inyecciones se realizaron con 10 semanas de diferencia y se recogió sangre para la determinación de los títulos de anticuerpos IgG totales mediante ELISA. Los resultados de la figura 16 muestran que los polipéptidos usados para la inmunización también fueron altamente inmunogénicos en las vacas y que la combinación de los antígenos para la inmunización tampoco modifica significativamente la respuesta inmunitaria en comparación con la obtenida usando antígenos individuales. La determinación de los isotipos se presenta en la figura 17. La inmunización de las vacas conduce a la inducción de una respuesta inmunitaria con la presencia tanto de IgG1 como de IgG2. Se sabe que el isotipo IgG2 es útil para la opsonización de S. aureus y aumentar las funciones de los neutrófilos bovinos (Guidry et al., 1993; Barrio et al., 2003). Se sabe que el uso de diferentes tipos de portadores o vías de administración de adyuvantes y/o vacunas puede modular el equilibrio resultante de IgG1 e IgG2 para necesidades específicas (Spickler y Roth, 2003). La capacidad de los anticuerpos bovinos inducidos por inmunización para unirse a sus proteínas diana (por ejemplo, SACOL0720) en la superficie bacteriana. Para este ensayo se usaron bacterias cultivadas durante 8 horas en leche recién recogida ya que se demostró que esta condición permitía la expresión de SACOL0718-720 tal como se mide mediante qPCR (figura 8). La evaluación de la unión del anticuerpo sobre la superficie de las bacterias se realizó usando citometría de flujo tal como se describe en “Materiales y métodos del ejemplo 1”. Se encontró que un 22,2% más de bacterias estaban unidas por anticuerpos marcados en presencia del suero inmunitario bovino producido contra SACOL0720 en comparación con el marcaje obtenido en presencia del suero preinmunitario de control. Esto demuestra que los anticuerpos bovinos inducidos contra SACOL0720 son capaces de unirse a la proteína en la superficie de las bacterias. Se sabe que tal unión de anticuerpos (opsonización) ayuda a la actividad fagocítica y destructora de los neutrófilos (Guidry et al., 1993; Barrio et al., 2003).

EJEMPLO 11: epítopos de interés

Como alternativa al uso de las proteínas completas o una región larga de los polipéptidos de interés para la vacunación, también es posible usar específicamente regiones de péptidos pequeños que se predice que serán reconocidos por las células B o T del sistema inmunitario de mamíferos. Se muestra en la tabla VIII a continuación la identificación de los epítopos de células B (es decir, secuencias cortas de aminoácidos que serán reconocidas por el sistema inmunitario y capaces de inducir la producción de anticuerpos por las células B) entre algunas de las proteínas de interés tales como SACOL0442 y SACOL0720. Para cada proteína, los epítopos de células B predichos se presentan con su posición en la secuencia de proteína. La puntuación se obtuvo de 4 programas distintos: BCPred Predictions, AAP Predictions, FBCPred Predictions y ABCPred.

De manera similar, los algoritmos controlados por ordenador también pueden usarse para facilitar la identificación de epítopos de células T (es decir, secuencias cortas de aminoácidos que serán reconocidas por el sistema inmunitario y capaces de inducir una respuesta celular por las células T) para su uso como vacunas contra infección por Staphylococcus aureus. Las proteínas de interés pueden someterse a análisis mediante el sistema Epimatrix™ para identificar supuestos epítopos de células T. Esta técnica in silico divide la secuencia total del antígeno en fragmentos de 9 aminoácidos superpuestos por 8 aminoácidos. Esta agrupación de 9 meros se analiza para determinar la afinidad prevista contra un grupo de alelos conocidos de CMH de clase I y clase II. Las puntuaciones resultantes pueden usarse para calificar los supuestos epítopos en una escala común que luego puede someterse a prueba in vitro. La técnica es aplicable a cualquier animal para el que se disponga de un conocimiento suficiente de las secuencias del CMH. (De Groot et al., 2008)

Por tanto, los epítopos de células B o T pueden usarse en composiciones de vacuna solos o en combinación con un ensamblaje de proteínas, péptidos u otros epítopos. Además, cualquier epítopo de células B o T, así como cualquier otro epítopo, puede presentarse en una secuencia contigua (tal como en un enfoque de fusión de proteínas) usando métodos de ingeniería genética y de proteínas.

Tabla VIII. Identificación de epítopos de células B entre algunas de las proteínas de interés. (A) SACOL0442 y (B) SACOL0720. Para cada proteína, los epítopos de células B predichos se presentan con su posición en la secuencia de proteína y la puntuación de predicción que obtuvieron usando 4 programas distintos: BCPred Predictions, AAP Predictions, FBCPred Predictions y ABCPred.

(A) SACOL0442

Epítopo potencial de células B Posición en la secuencia Puntuación

TFGIYPKADASTQN (SEC ID N.°: 17) 26 0,840

KDTINGKSNKSRNW (SEC ID N.°: 18) 72 0,848

KDGGKYTLESHKELQ (SEC ID N.°: 19) 159 1,000

(B) SACOL0720

Epítopo potencial de células B Posición en la secuencia Puntuación

QFGFDLKHKKDALA (SEQ ID NO: 20) 468 0,981

TIKDQQKANQLAS (SEC ID N.°: 21) 325 0,898

KDINKIYFMTDVDL (SEQ ID NO: 22) 428 0,890

DVDLGGPTFVLND (SEQ ID NO: 23) 436 0,993

EJEMPLO 12: uso de genes de S. aureus expresados durante IMI como herramientas de diagnóstico

El diagnóstico de IMI por S. aureus es difícil y requiere tiempo. Tradicionalmente, se recogen las muestras de leche y se envían a un laboratorio de microbiología donde se consigue el cultivo de S. aureus usando diversos medios de crecimiento artificiales. Tras el crecimiento y si se produce el crecimiento (habitualmente 24 h después de la llegada de la muestra), el microorganismo debe identificarse como S. aureus entre otros posibles patógenos mediante una variedad de pruebas bioquímicas que podrían tardar hasta 24 h adicionales. Para los productores de leche, este retraso representa una pérdida económica grave, ya que las vacas que se sospecha que han adquirido una IMI deben retirarse del rebaño de producción de leche, mientras que las vacas no sometidas a prueba para detectar S. aureus pero que tienen IMI subclínica pueden continuar contaminando el tanque de leche a granel. Por tanto, sería muy deseable desarrollar una nueva herramienta para la detección rápida de S. aureus en la leche para permitir una rápida intervención por parte de los productores de leche o de los veterinarios.

Como alternativa al uso de cultivos microbianos tradicionales para identificar S. aureus en muestras de leche de vacas con o sin signos clínicos de IMI y mastitis, los productos de los genes de S. aureus identificados como expresados durante IMI (o bien el ARN mensajero, la proteína o bien el producto metabólico posterior a la actividad de la proteína) pueden usarse como herramientas de diagnóstico. De hecho, la detección de tales productos específicos, por ejemplo, en leche, sangre o biopsias, indicaría la presencia de S. aureus. Dado que dichos productos se expresan fuertemente durante la IMI, su detección también se correlacionaría fuertemente con este tipo específico de infección.

Por ejemplo, la detección de la supuesta exotoxina SACOL0442 que se secreta en el medio extracelular, es decir, en la leche durante la mastitis, sería un fuerte indicio de que la vaca está infectada por S. aureus ya que el gen sólo se expresa durante IMI. La detección de la supuesta exotoxina SACOL0442 puede lograrse fácilmente mediante el uso de un anticuerpo específico y una técnica de ELISA o un enfoque de tira reactiva o similar, y la señal de detección puede amplificarse fácilmente mediante una variedad de técnicas de amplificación de señal. Tales técnicas podrían realizarse rápidamente por el laboratorio de microbiología o incluso en la granja por el propio productor de leche, ganando así un tiempo valioso. Alternativamente, la detección de ARN mensajero (ARNm) de los genes expresados durante IMI también indicaría la presencia de S. aureus en la leche. La detección de ARNm es posible después de su liberación de las bacterias mediante una etapa de lisis celular, copiando ARNm en ADN complementario mediante transcripción inversa y amplificación por PCR.

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Documento WO/2004/043405

Documento WO/2008/152447

Documento WO/2005/007683

Documento WO/2006/059846

Ziebandt, A.K., H. Kusch, M. Degner, S. Jaglitz, M.J. Sibbald, J.P. Arends, M.A. Chlebowicz, D. Albrecht, R. Pantucek, J. Doskar, W. Ziebuhr, B.M. Broker, M. Hecker, J.M. van Dijl y S. Engelmann. 2010. Proteomics uncovers extreme heterogeneity in the Staphylococcus aureus exoproteome due to genomic plasticity and variant gene regulation. Proteomics 285(47)36794-36803.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Composición farmacéutica para su uso en la prevención y/o el tratamiento de infección intramamaria (IMI) estafilocócica en un mamífero, comprendiendo dicha composición:

(1) al menos un agente, en la que dicho agente es:

(1) un polipéptido codificado por el gen SACOL0029, basándose en la nomenclatura génica del genoma de Staphylococcus aureus COL (SACOL) expuesto en la secuencia de referencia NCBI NC_002951.2, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de proteína n.° YP_184940.1 accesible a través de GenBank;

(ii) un polipéptido que tiene al menos el 95% de identidad con (i); o

(iii) un ácido nucleico que codifica para el polipéptido de uno acualquiera de (i) a (ii); o

(2) un agente, en la que dicho agente es una forma viva atenuada de Staphyloccocus aureus que comprende una mutación en el gen SACOL0029, en la que la mutación es una deleción, una inserción o una sustitución de uno o más nucleótidos.

2. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho mamífero es una vaca.

3. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha IMI estafilocócica, preferiblemente asociada con mastitis bovina, está provocada por una o más cepas de Staphylococcus aureus.

4. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una combinación de agentes.

5. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un adyuvante, en la que dicho adyuvante es preferiblemente alumbre, un aceite emulsionado, diguanosín-5'-monofosfato cíclico (c-di-GMP), polifosfazina o patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPS), y en la que PAMPS es más preferiblemente dinucleótidos no metilados (CpG) o polisacáridos microbianos.

6. Composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha composición farmacéutica comprende además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

7. Kit para su uso en el diagnóstico de una infección intramamaria (IMI) estafilocócica, comprendiendo dicho kit:

(a) al menos un ligando que se une específicamente con un polipéptido codificado por el gen SACOL0029, basándose en la nomenclatura génica del genoma de Staphylococcus aureus COL (SACOL) expuesto en la secuencia de referencia NCBI NC_002951.2, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de proteína n.° YP_184940.1 accesible a través de GenBank;

(b) instrucciones para usar el kit para el diagnóstico de IMI estafilocócica.

8. Kit para su uso según la reivindicación 7, que comprende una combinación de ligandos.