ES2834656T3 - Método para preparar partículas virales con dinucleótidos cíclicos y uso de dichas partículas para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Método para preparar partículas virales con dinucleótidos cíclicos y uso de dichas partículas para el tratamiento del cáncer Download PDF

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Abstract

Una partícula similar a virus que comprende una envoltura lipoproteica que incluye una glicoproteína fusogénica viral, en donde dicha partícula similar a virus contiene monofosfato de guanosina-monofosfato de adenosina cíclico (cGAMP) empaquetado en dicha partícula similar a virus, para uso en el tratamiento del cáncer.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para preparar partículas virales con dinucleótidos cíclicos y uso de dichas partículas para el tratamiento del cáncer
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la medicina, en particular de las vacunas y la oncología.
Antecedentes de la invención
Los dinucleótidos cíclicos se han descrito recientemente como potentes adyuvantes citosólicos del sistema inmune. Inducen una respuesta inmune innata antiviral tal como contra el VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) y el VHS (virus del herpes simple), y también contra el cáncer (WO2005/087238; WO2007/054279; WO2013/185052). Los dinucleótidos cíclicos se identificaron previamente en bacterias y se sabe que son inmunoestimuladores.
Este campo ha ganado mucha atención recientemente tras la identificación de que un dinucleótido cíclico, cGAMP (2'-3'-GMP-AMP cíclico), también existe en vertebrados y es sintetizado endógenamente por la enzima cGAS tras el reconocimiento del ADN citosólico.
La GMP-AMP sintasa cíclica (cGAS) es un sensor de ADN citosólico que envía señales catalizando la síntesis de un segundo mensajero, cGAMP. cGAS se une al ADN bicatenario de una manera no específica de secuencia y esto induce un cambio conformacional en su sitio enzimático que permite la síntesis de GMP-AMP cíclico (cGAMP) (Wu et al., 2012, Science, 339, 826-830; Sun et al., 2012, Science, 339, 786-791; WO2014/099824; Ablasser et al, 2013, Nature, 498, 380-384). El cGAMP de metazoos tiene tanto un enlace fosfodiéster canónico 3'-5' como un inusual 2'-5'. cGAMP se une y activa el estimulador de genes de interferón (STING). STING juega un papel central en la detección de ADN citosólico transmitiendo una señal de los sensores de ADN aguas arriba para activar factores de transcripción tal como IRF3, que a su vez impulsan la transcripción del gen IFN. Los interferones (IFN) juegan un papel fundamental en la respuesta inmune a la infección por virus. La expresión de IFN es inducida por vías de señalización activadas mediante sensores de presencia de virus, que incluyen sensores de ADN citosólico. Li et al. (2016, Scientific Reports, 6, 19049) describe la inyección intravenosa de cGAMP para el tratamiento del cáncer en modelos de cáncer de ratones.
Sin embargo, los dinucleótidos cíclicos no atraviesan de manera eficaz las membranas plasmáticas de las células y tienen una potencia limitada cuando se utilizan sin vectores. Los vectores actuales consisten principalmente en complejos a base de lípidos tales como las lipofectaminas, que tienen un uso limitado in vivo debido a su toxicidad.
Por lo tanto, existe una gran necesidad de un medio de vectorización de dinucleótidos cíclicos, especialmente el prometedor cGAMP.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona una nueva vectorización de dinucleótidos cíclicos, especialmente cGAMP, utilizando partículas similares a virus envueltas. De hecho, los dinucleótidos cíclicos, especialmente cGAMP, pueden empaquetarse en partículas similares a virus envueltas (VLP) o viriones e inducir una respuesta inmune innata, en particular una respuesta de interferón. Más particularmente, para poder vectorizar dinucleótidos cíclicos, especialmente cGAMP, las VLP necesitan estar envueltas para optimizar el suministro de dinucleótidos cíclicos, especialmente cGAMP, mediante fusión de la VLP con las células diana. En particular, los inventores han mostrado que la administración de VLP mejora sorprendentemente el efecto de cGAMP, en particular su efecto contra el tumor. En una realización preferida, la administración intratumoral de VLP se asocia con un efecto aumentado de cGAMP.
La presente invención se refiere a una partícula similar a virus que comprende una envoltura lipoproteica que incluye una glicoproteína fusogénica viral, en donde dicha partícula similar a virus contiene dinucleótidos cíclicos cGAMP empaquetados en dicha partícula similar a virus para uso para el tratamiento del cáncer. Preferiblemente, la partícula similar a virus comprende además una cápside de retroviridae.
Preferiblemente, la glicoproteína fusogénica viral es una glicoproteína de retroviridae (que incluye lentivirus y retrovirus), herpesviridae, poxviridae, hepadnaviridae, flaviviridae, togavoridae, coronaviridae, virus de la hepatitis D, orthomyxoviridae, paramyxoviridae, filoviridae, rhabpoviridae, bunyaviridae u orthopoxivridae (p. ej. variola), preferiblemente de orthomyxovirus, retrovirus o rhabdovirus. En particular, la glicoproteína fusogénica viral puede ser una glicoproteína del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) que incluye VIH-1 y VIH-2; influenza, que incluye influenza A (p. ej., subtipos H5N1 y H1N1) e influenza B; thogotovirus; o VSV (virus de la estomatitis vesicular).
Preferiblemente, la cápside retroviral es de retroviridae, preferiblemente lentivirus y retrovirus. Más preferiblemente, la cápside retroviral es de VIH o VLM (virus de la leucemia murina).
Los dinucleótidos cíclicos son monofosfato de guanosina-monofosfato de adenosina cíclico (cGAMP). Más preferiblemente, los dinucleótidos cíclicos son cGAMP (2'-3'-GMP-AMP cíclico) o cGAMP (3'-3'-GMP-Am P cíclico).
Opcionalmente, la partícula similar a virus de la invención puede comprender además un antígeno o cualquier otra proteína o ácido nucleico de interés, preferiblemente un antígeno asociado al tumor o una combinación de los mismos.
La presente invención se refiere a la partícula similar a virus como se describe en la presente memoria como un fármaco, especialmente como una vacuna, o como un adyuvante de vacuna. También se refiere a una composición farmacéutica, de vacuna o veterinaria que comprende una partícula similar a virus como se describe en la presente memoria, un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un antígeno o un agente activo terapéutico para uso en el tratamiento del cáncer.
La presente invención se refiere además a un método para tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar una partícula similar a virus como se describe en la presente memoria o una composición como se describe en la presente memoria. Se relaciona con el uso de una partícula similar a virus o una composición como se describe en la presente memoria para la fabricación de un medicamento o vacuna para tratar un cáncer en un sujeto.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica, de vacuna o veterinaria que comprende una partícula similar a virus como se describe en la presente memoria, un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos un antígeno asociado al tumor.
Preferiblemente, la partícula similar a virus se va a administrar por vía intravenosa, subcutánea o intratumoral. En una realización más preferida, la partícula similar a virus se va a administrar por vía intratumoral.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. El HIV-1-GFP producido en las células 293T reconstituidas con cGAS induce IFN en las células infectadas. (A) Esquema de la configuración experimental. (B) Se transfectaron células HEK293 con el promotor indicador de IFNp (p125-F-Luc) y pRL-TK como control. Después de 6-8 horas, se infectaron las células (MOI = 1) con HIV-1-GFP de células productoras que expresan cGAS como se indica o se dejaron sin infectar. Se analizó la actividad de F-Luc después de 24 horas y se normalizó a R-Luc. m-cGAS-AA es un mutante catalíticamente inactivo. (C) Las células infectadas con HIV-1 -GFP se lavaron después de 24 horas y después de 48 horas adicionales, se analizó el IFN en el sobrenadante mediante bioensayo (izquierda) y se recogieron las células para el análisis FACS. Se muestra el porcentaje de células positivas GFP (derecha). Las cuñas representa la MOI de 10, 5, 2, 1, 0,5 y 0,1. (D) Se extrajo ARN de células infectadas como en (C) (MOI = 1). Los ARNm indicados se cuantificaron en relación con el ARNr 18S mediante RT Q-PCR. (E) Los BMDM de los genotipos indicados se infectaron con HIV-1-GFP (MOI = 5) o virus Sendai (SeV, las cuñas representan la MOI de 1, 0,5 y 0,1). Se ensayó el sobrenadante después de 24 horas para mIFNa mediante ELISA. n.d., no detectable. (F) Los BMDM se infectaron como en (E) y los ARNm indicados se cuantificaron en relación con GAPDH ARNm mediante RT Q-PCR. Las cuñas negras representan las MOI de 5 y 1 y las cuñas grises las MOI de 1,0,5 y 0,1. Las barras muestran el promedio de dos (B, D, E) o cuatro (C, F) réplicas y las barras de error representan el intervalo (B, D, E) o la desviación estándar (C, F).
Figura 2. Las células HEK293 expresan STING e inducen IFN en respuesta a cGAMP. (A) Se ensayaron los extractos de células de células THP1 y HEK293 mediante transferencia Western para la expresión de STING. Durante la preparación de la figura se empalmó un carril intermedio irrelevante. (B) Se transfectaron 2x105 células HEK293 transitoriamente con el promotor indicador de IFNp (p125-F-Luc) y con pRL-TK como control. Después de 24 horas, las células se transfectaron con 2 gg de 2'-3'-cGAMP o solo con lipofectamina (control). Se analizó la actividad de luciferasa después de 24 horas adicionales y la actividad de F-Luc se muestra normalizada a R-Luc. Las barras muestran el promedio de dos réplicas y las barras de error representan el intervalo.
Bioensayo de IFN. (C) Se transdujeron las células HEK293 con pGreenFire-ISRE utilizando suministro lentiviral. Se obtuvieron los clones mediante dilución en serie y, en base a las respuestas a IFN, se seleccionó el clon 3C11. Se sembraron 25000 células 3C11 en placas de 96 pocillos y se añadió IFNa2 humano recombinante. Después de 24 horas, se lisaron las células y se midió la actividad luciferasa de luciérnaga. La bioluminiscencia de fondo en las células no tratadas se estableció en 1. Las barras muestran el promedio de dos réplicas y las barras de error representan el intervalo.
El cGAS de tipo salvaje y mutante se expresa igualmente en las células productoras de virus. (D) Se lisaron las células productoras de virus 293T 72 horas después de la transfección y se determinaron los niveles de proteína cGAS mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal que reconoce la etiqueta FLAG.
El adenovirus-GFP (Ad-GFP) producido en células reconstituidas con cGAS no desencadena IFN en células diana recién infectadas. (E) Se produjo Ad-GFP en células HEK293. Algunas células productoras de virus se cotransfectaron con construcciones de expresión de cGAS. Después, se utilizaron cantidades de virus para infectar células HEK293 frescas. Las cuñas representan 0,01 y 0,001 gl de inóculo. La producción de IFN por las células infectadas con Ad-GFP se ensayó mediante bioensayo. Se utilizó IFNa recombinante a las dosis indicadas para demostrar la capacidad de respuesta del bioensayo. Las barras muestran el promedio de dos réplicas y las barras de error representan el intervalo. (F) La infección se monitoreó por FACS.
Figura 3. La inducción de IFN desencadenada por HIV-1-GFP a partir de células que expresan cGAS es independiente de los ácidos nucleicos virales. (A) Las cantidades de virus se trataron o no con DNasa I y luego se utilizaron para infectar células como en la Fig. 1 (MOI = 1). Como controles, se incubaron el medio y el plásmido m-cGAS con DNasa I y luego se añadieron a las células o se transfectaron, respectivamente. (B) Se recogió HIV-1-GFP de células productoras transfectadas como se indica (sobrenadante, SOB). Se sedimentó HIV-1-GFP a partir de una alícuota mediante centrifugación y se resuspendió en medio fresco (sedimentado, SED). Después, se infectaron las células (MOI = 1). (C) Se infectaron las células (MOI = 1) en presencia de nevirapina (Nev) o raltegravir (Ral). El porcentaje de células infectadas se determinó mediante FACS (derecha). (D) Se infectaron las células con 100, 50 o 5 gl (cuñas) de sobrenadante de células que producían HIV-1 -GFP o partículas similres a virus (VLPs). (E) Se pseudotipó e1HIV-1-GFP con VSV-G o THOV-G y se utilizaron los sobrenadantes (VSV-G: 1 y 0,1 gl; t Ho V-G: 100 y 10 gl) de las células productoras para infectar las células. (F) Se produjo HIV-1-GFP en células reconstituidas con m-cGAS que también se trataron con GW4869 20 gM, Ac-DEVD-CHO 60 gM o se dejaron sin tratar (control). Se infectaron células frescas con 10, 1 o 0,1 gl (cuñas) de sobrenadante. En todos los paneles, las células se infectaron durante 24 horas, se lavaron y, después de 48 horas más, se analizó el IFN en el sobrenadante mediante bioensayo. Las barras muestran el promedio de dos (B, C, D, E), tres (F) o cuatro (A) réplicas y las barras de error representan el intervalo (B, C, D, E) o la desviación estándar (A, F).
Figura 4. Los extractos de moléculas pequeñas de HIV-1-GFP de células productoras reconstituidas con cGAS inducen IFN. (A) Esquema de la configuración experimental. (B) Se añadieron extractos de virus producidos en ausencia de cGAS (primer conjunto de barras) o en presencia de cGAS de tipo salvaje o mutante (2o y 3er conjuntos de barras) a las células THP1 permeabilizadas con digitonina. Se determinó el IFN en los sobrenadantes de THP1 mediante bioensayo. Las cuñas grises representan una serie de diluciones 1:2 que comienza con el extracto de 107 unidades infecciosas. Como controles, se añadió cGAMP sintético directamente a las células THP1 (último conjunto de barras) o se añadió al medio y luego se incluyó en el procedimiento de extracción (cuarto conjunto de barras). Las cuñas negras representan una serie de diluciones 1:3 que comienza con 50 ng de cGAMP. (C) Se incubó el extracto de 107 unidades infecciosas HIV-1 -GFP producidas en presencia de cGAS con o sin SVPDE durante 1 hora y luego se añadió a células THP1 permeabilizadas con digitonina. Se evaluó el IFN en los sobrenadantes de THP1 mediante bioensayo. Las cuñas representan una serie de diluciones 1:3. (D) El HIV-1-GFP producido en ausencia o presencia de cGAS o en células transfectadas con biotina-cGAMP se sondeó mediante dot blot para biotina (izquierda). Después, se volvió a sondear la membrana despojada para p24 (derecha). Las cuñas representan una serie de diluciones 1:10 que comienzan con 2x106 unidades infecciosas.
Figura 5. La infección de células dendríticas con HIV-1-GFP de células productoras reconstituidas con cGAS induce la expresión de CD86 y la secreción de IFN. Se infectaron células dendríticas humanas derivadas de monocitos de dos donantes con HIV-1-GFP a las MOI indicadas. Después de 48 horas, se analizó la expresión de CD86 mediante FACS. (A) Se muestra el porcentaje de células CD86+. (B) Se muestra la intensidad de fluorescencia media de CD86. (C) Se ensayó el sobrenadante en el bioensayo de IFN. (A-C) Se muestran los datos promedio de infecciones duplicadas para cada donante; las barras de error representan el intervalo. Tenga en cuenta que estos efectos se observaron en ausencia de Vpx.
Figura 6. El vector lentiviral de cGAS activa las células dendríticas. (A) Expresión de BFP y CD86 después de la infección de monocitos con un lentivirus que codifica BFP-2A o BFP-2A-cGAS, en presencia o ausencia de Vpx. (B) Expresión de CD86 como en (a) con virus titulado sin Vpx y análisis estadístico en la dosis máxima (prueba t pareada; n=4; ***p<0,001). (C) Producción de IP-10 como en (a) con virus titulado sin Vpx y análisis estadístico en la dosis máxima (prueba t pareada; n=4; **p <0,01 en datos transformados logarítmicamente). (D) Expresión de BFP y CD86 después de la infección de monocitos con un lentivirus que codifica BFP-2A o BFP-2A-cGAS, o con las VLP producidas en presencia de un plásmido no lentiviral que codifica para cGAS (PSTCD-cGAS). (E) Expresión de CD86 y producción de IP-10 como en (d) (n=5, prueba t pareada para análisis de expresión de CD86, prueba t pareada sobre datos transformados logarítmicamente para IP-10; ***p<0,001, **p<0,01, ns = no significativo).
Figura 7. Los vectores lentivirales de cGAS activan monocitos y células dendríticas completamente diferenciadas (A) Expresión de CD14 y DC-SIGN 96h después de la transducción de monocitos con un vector que codifica BFP y un vector que codifica cGAS en ausencia de Vpx seguido de diferenciación en las DC con GM-CSF e IL-4 (n=2). (B) Expresión de BFP y CD8648h después de la infección de células dendríticas establecidas derivadas de monocitos con un lentivirus BFP-2A y un lentivirus BFP-2A-cGAS. (C) Expresión de CD86 como en (B) (n=3). (D) Inmunotransferencia de Gag, cGAS y actina en las células productoras y en el sobrenadante sedimentado utilizado en la Fig. 6D.
Figura 8. Las partículas VIH transfieren una señal innata iniciada por cGAS. (A) Expresión de BFP y CD86 después de la infección de monocitos con un lentivirus producido con el vector BFP-2A-cGAS, Gag/Pol y VSV-G. Se infectaron las células con el sobrenadante completo o el retenido y filtrado después de la filtración con un corte de 10 kDa. Se muestra un experimento representativo de cuatro. (B) Expresión de CD86 y producción de IP-10 en infecciones de monocitos de respuesta a la dosis con sobrenadantes fraccionados diferencialmente que contienen las VLP producidas a partir de 293FT que expresan cGAS de tipo salvaje o un mutante inactivo de cGAS que carece del dominio de unión al ADN (ADBD). Se indican el volumen de cada fracción utilizada para la infección y el factor de concentración correspondiente comparado con el sobrenadante inicial (n=3; media y SEM representados gráficamente). (C) Inmunotransferencia de Gag y cGAS en las fracciones obtenidas por centrifugación diferencial del sobrenadante completo como en (B) (representativo de tres experimentos). (D) Inmunotransferencia de los marcadores de exosomas sintenina-1, CD63, CD81 y CD9 en las fracciones obtenidas por centrifugación diferencial del sobrenadante completo como en (B) (representativo de tres experimentos). (E) Análisis de expresión de CD86 del experimento en (A) (n=4; prueba t pareada; **p<0,01, ns = no significativo).
Figura 9. Empaque y transferencia de partículas virales cGAMP. (A) Células 293FT transfectadas con un plásmido indicador de luciferasa bajo el control del promotor IFNp con o sin un plásmido codificante de STING. Las células se estimularon o con cantidades tituladas de sobrenadantes de células que producían partículas virales en presencia (partículas virales cGAS) o en ausencia (partículas virales de control) de cGAS murino y sobrenadantes de células que expresaban cGAS murino (cGAS sin Gag/Pol sin VSV-G), estimulado con cGAMP sintético utilizando lipofectamina o transfectadas con un plásmido codificante para cGAS (transfección de cGAS). Se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes. (B) Actividad de IFN de tipo I medida después de la exposición de células THP-1 permeabilizadas diferenciadas con PMA a 2'-3'-cGAMP sintético (panel izquierdo) o a los extractos resistentes a benzonasa procedentes de células 293FT transfectadas y partículas virales sedimentadas. Se transfectaron células 293FT con un plásmido de empaquetamiento lentiviral en presencia de cGAS o del mutante E225A/D227A catalíticamente inactivo (panel derecho). Se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes. (C) Inmunotransferencia de Gag, cGAS y actina en las células productoras de VLP utilizadas en (A).
Figura 10. La transferencia de cGAMP mediante partículas virales es una propiedad conservada de los retrovirus. (A) Expresión de BFP y CD86 en las DC después de la exposición de monocitos a sobrenadantes libres de células de células transfectadas con combinaciones de plásmidos que expresan Gag/Pol y VSV-G junto con plásmidos que codifican cGAS, cGAS E225A/D227A o control. (B) Análisis de la expresión de CD86 y la producción de IP-10 como en (a) (n=6; prueba t pareada para la expresión de CD86, prueba t pareada en datos transformados logarítmicamente para la producción de IP-10, ****p<0,0001, ***p<0,001, **p<0,01, *0,01<p<0,05). (C) Inmunotransferencia de Gag, VSV-G, cGAS y actina en las células productoras y en los sobrenadantes libres de células sedimentadas. (D) Expresión de CD86 y producción de IP-10 en las DC después de la infección de monocitos con partículas lentivirales pseudotipadas con proteínas de la envoltura de influenza H1N1 (panel izquierdo) o H5N1 (panel derecho) y producidas en presencia o ausencia de cGAS murino (n=4; análisis como en (B)). (E) Expresión de CD86 y producción de IP-10 en las DC después de la infección de monocitos con partículas gammaretrovirales producidas con MLV 10A1 Gag/Pol y pseudotipadas con VSV-G en presencia o ausencia de cGAS (n=4; análisis como en (B)). (F) Expresión de CD86 y producción de IP-10 en las DC después de la infección en presencia de AZT de monocitos con partículas virales de VIH-1 CCR5-trópico producidas en presencia o ausencia de cGAS murino (n=4; análisis como en (B)).
Figura 11. La transferencia de cGAMP mediada por lentivirales está mediada por diversas glicoproteínas fusogénicas de la envoltura (A) Expresión de CD86 y producción de IP-10 en las DC después de la infección de monocitos con dosis tituladas de partículas lentivirales pseudotipadas con proteínas de la envoltura de influenza (panel izquierdo) o H5Na (panel derecho) y producidas en ausencia o presencia de cGAS (n=4). (B) Expresión de CD86 y producción de IP-10 en las DC después de la infección de monocitos con dosis tituladas de partículas gammaretrovirales producidas con MLV 10A1 Gag/Pol y pseudotipadas con VSV-G en presencia o ausencia de cGAS (n=4). (C) Expresión de CD86 y producción de IP-10 en las DC después de la infección de monocitos en presencia de AZT con partículas virales de VIH-1 CCR5-trópico producidas en presencia o ausencia de cGAS. (D) Inmunotransferencia de Gag de MLV, VSV-G, cGAS y actina en células productoras y sobrenadante sedimentado. (E) Inmunotransferencia de HIV-1 Gag, VSV-G, cGAS y actina en células productoras y sobrenadante sedimentado.
Figura 12. Modelo para la transferencia viral mediada del cGAMP entre células. En las células productoras de virus, cGAS produce cGAMP. El cGAMP se empaqueta en vesículas extracelulares y partículas virales. Las partículas virales pueden fusionarse de manera eficaz con las membranas celulares y distribuir cGAMP al citosol de las células diana. cGAMP a su vez activa STING e induce una respuesta inmune innata. Las vesículas extracelulares también pueden empaquetar cGAMP, pero la eficacia de la activación de la célula diana es menor que la de las partículas virales fusogénicas.
Figura 13. La transferencia de cGAMP mediante partículas virales aparece a un nivel fisiológicamente relevante de expresión de cGAS (A) Actividad de IFN de tipo I medida después de la exposición de células THP-1 permeabilizadas tratadas con PMA a los extractos resistentes al calor y resistentes a benzonasa procedentes de células HeLa transfectadas y el material sedimentado. Las células HeLa o no se transfectaron, se transfectaron con un vector vacío o se transfectaron con un vector que expresa Gag/Pol y un vector que expresa VSV-G (n=3). (B) Estimulación de células THP-1 tratadas con PMA con material filtrado ultracentrifugado producido a partir de células HeLa transfectadas como en (A) y cuantificación de la producción de IP-10 soluble (n=3). (C) Células 293FT transfectadas con un plásmido indicador de luciferasa bajo control del promotor de IFN-p con o sin un plásmido codificante de STING. Las células o se estimularon con cantidades tituladas de material ultracentrifugado de células HeLa transfectadas, estimuladas con 2'-3'-cGAMP sintético utilizando lipofectamina o se transfectaron con un plásmido que codifica la proteína constitutivamente activa RIG-I N228 (n=3).
Figura 14. Cuantificación del contenido de cGAMP y eficacia del suministro de las VLP. (a) Extracción de moléculas pequeñas de las MLV Gag VLP (que expresan OVA como fusión en marco al extremo C-terminal de Gag) y cuantificación de las HIV Gag VLP y de cGAMP mediante bioensayo con controles spiking internos incluidos para estimar el contenido de cGAMP en las preparaciones virales. Cada punto representa una dilución 1:3. Se estimó que el contenido de cGAMP de las MLV Gag VLP era 3 veces menor que 100 ng de cGAMP en la dosis máxima (concentración final en la preparación concentrada: 660 ng/ml); Se estimó que el contenido de cGAMP de las HIV Gag VLP era 9 veces menor que 100 ng de cGAMP en la dosis máxima (concentración final en la preparación concentrada: 220 ng/ml). (b) Infección de monocitos de dos donantes independientes con preparaciones virales de Gag de MLV y Gag de HIV. El contenido de cGAMP estimado para las preparaciones virales en base al bioensayo en (a) y para la estimulación de cGAMP se representa en el eje x y la actividad correspondiente en los monocitos medida mediante la regulación al alza de la molécula coestimuladora CD86 se muestra en el eje y. Las MLV Gag VLP y las HIV Gag VLP son aproximadamente 1000 veces más eficaces que el 2'3'-cGAMP complejado con lipofectamina y aproximadamente 10000 veces más eficaces que el 2'3'-cGAMP para inducir la maduración de las células dendríticas.
Figura 15. Adyuvanticidad de cGAS-VLP que contiene un antígeno específico (Figuras A a E) o no (Figuras F a H). (Figura 15A) Se inmunizaron s.c. los ratones con las VLP que contienen cGAMP y proteína Ova a 3 dosis diferentes, diluidas sucesivamente por 3. Los ratones de control recibieron las VLP que contenían el cGAMP sin el antígeno, o la proteína OVA (20 gg) administrada con cGAMP sintético (10 gg) (InVivogen) o CpG (40 gg) (Trilink Technologies) como adyuvante. (Fig. 15B) Programa experimental. Se inmunizaron primero los ratones (6/grupo) y, 11 días después, se analizaron las respuestas inmunes en la sangre. El día 14, se injertaron células tumorales de melanoma B16-OVA mediante s.c. y 11 días después, se analizaron las respuestas inmunes en la sangre de los ratones. (Fig. 15C) Se analizaron las respuestas de las células T CD8 después de la inmunización de las VLP mediante la medida de las células productoras de IFN-g y la detección del tetrámero. Los resultados se expresan como ratones individuales con la media ± SEM. (Fig. 15D) Luego se analizaron las respuestas de CD8 después del injerto tumoral mediante la medida de las células productoras de IFN-g. (Fig. 15E) Curvas individuales para el crecimiento tumoral en cada grupo. (Fig. 15F) Los grupos experimentales recibieron las cGAMP-VLP a 3 dosis diferentes, diluidas sucesivamente por 3. Los ratones de control recibieron solución salina de PBS. (Fig. 15G) Programa experimental. Se injertaron primero los ratones (7 u 8/grupo) mediante el melanoma tumoral B16-OVA y 12 días después, se inyectaron i.t. con las cGAMP-VLP. Después de 10 días, se analizaron las respuestas inmunes en la sangre. (Fig. 15H) Se analizaron las respuestas de las células T CD8 mediante la cuantificación de las células productoras de IFN-g y la detección del tetrámero. Los resultados se expresan como ratones individuales con la media ± SEM.
Figura 16. Las cGAMP-VLP inducen una rápida expresión de IFN-p. (Figura 16A) Concentración de IFN-p en suero 3 horas después de las inyecciones subcutáneas de PBS, Ova-cGAMP-VLP, cGAMP-VLP, proteína Ova cGAMP o proteína Ova CpG. Véase la figura 15A. (Figura 16B) Concentración de IFN-p en suero 3 horas después de las inyecciones intratumorales de PBS o cGAMP-VLP. Véase la figura 15F.
Figura 17. Se requiere la presencia de cGAMP en las cGAMP-VLP para inducir un efecto adyuvante de vacuna in vivo a la dosis subóptima de antígeno. (Figura 17A) Descripción de los grupos de ratones y tratamientos. La dosis inyectada de VLP se estandariza en base a la cuantificación de la cantidad de proteína p30 contenida en las VLP, como se mide mediante ELISA. (Fig. 17B) Esquema del experimento. (Figura 17C) Respuestas de las células T CD8 específicas de antígeno Ova 11 días después de las inyecciones subcutáneas como se describe en (B), medidas por células productoras de IFN-g mediante ELISPOT.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a una partícula similar a virus (VLP) que comprende una envoltura lipoproteica que incluye una glicoproteína fusogénica viral, en donde dicha partícula similar a virus contiene dinucleótidos cíclicos, en particular cGAMP, empaquetados en dicha partícula similar a virus, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.
También se refiere al uso de una VLP envuelta que comprende una envoltura lipoproteica que incluye una glicoproteína fusogénica viral para vectorizar o administrar dinucleótidos cíclicos, en particular cGAMP, a células cancerosas.
Además, se refiere a un método para preparar una VLP envuelta que contiene dinucleótidos cíclicos, en particular cGAMP, y que comprende una envoltura lipoproteica que incluye una glicoproteína fusogénica viral.
Finalmente, se refiere al uso de una partícula similar a virus que comprende una VLP envuelta que comprende una envoltura lipoproteica que incluye una glicoproteína fusogénica viral y que contiene dinucleótidos cíclicos en la VLP, en particular cGAMP, para inducir una respuesta inmune contra las células cancerosas. Se relaciona con su uso como vacuna o adyuvante de vacuna. Por consiguiente, se refiere a una composición farmacéutica o una composición de vacuna que comprende una VLP envuelta que contiene dinucleótidos cíclicos, en particular cGAMP, y que comprende una proteína de la cápside retroviral. Se refiere al uso de una VLP envuelta que contiene dinucleótidos cíclicos, en particular cGAMP, y que comprende una proteína de la cápside retroviral como un fármaco, en particular para tratar el cáncer.
Los inventores mostraron que las VLP de la presente invención son adecuadas para inducir una respuesta de células T específica de tumor, mientras que la administración directa de cGAMP no es capaz de inducir significativamente tal respuesta a una dosis mucho más alta de cGAMP. Se muestra que las cGAMP-VLP fueron capaces de inhibir completamente el crecimiento tumoral cuando se utilizaron en combinación con un antígeno tumoral.
Definiciones
Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de inicio tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.
Secuencias de control: el término "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica una enzima de la presente invención. Las secuencias de control pueden ser nativas (es decir, del mismo gen) o heterólogas (es decir, de un gen diferente y/o una especie diferente) al polinucleótido que codifica la enzima. Preferiblemente, las secuencias de control son heterólogas. Se preferirán las secuencias de control bien conocidas y utilizadas actualmente por el experto en la técnica. Dichas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden proporcionarse con enlazadores a fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica la enzima. La combinación funcional de secuencias de control y secuencias codificantes puede denominarse como casete de expresión.
Expresión: el término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.
Vector de expresión: el término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica la enzima de la invención y está operativamente enlazado a secuencias de control que proporcionan su expresión. Entonces, el vector de expresión comprende un casete de expresión adecuado para expresar la enzima de la invención.
Recombinante: recombinante se refiere a una construcción de ácido nucleico, un vector y una proteína producidos por ingeniería genética.
Heterólogo: en el contexto de una célula huésped, un vector o una construcción de ácido nucleico, designa una secuencia codificante para una dinucleótido sintasa cíclica introducida en la célula huésped, el vector o la construcción de ácido nucleico mediante ingeniería genética. En el contexto de una célula huésped, puede significar que la secuencia codificante de la dinucleótido sintasa cíclica se origina en una fuente diferente de la célula en la que se introduce (p. ej., humano vs ratón o ratón vs humano). Alternativamente, también puede significar que la secuencia codificante de la dinucleótido sintasa cíclica proviene de la misma especie que la célula en la que se introduce, pero se considera heteróloga debido a su entorno que no es natural, por ejemplo, porque está bajo el control de un promotor que no es su promotor natural, o se introduce en un lugar que difiere de su lugar natural.
Construcción de ácido nucleico: el término "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, o monocatenaria o bicatenaria, que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otro modo no existirían en la naturaleza o que es sintética, que comprende uno o más secuencias de control.
Unido operativamente: el término "unido operativamente" significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada en relación con una secuencia de codificación, de tal manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia de codificación.
Adyuvante: sustancias que se añaden y/o co-formulan en una inmunización al antígeno activo para potenciar o provocar o modular la respuesta inmune humoral y/o mediada por células contra el antígeno activo. Preferiblemente, el adyuvante también puede potenciar o provocar la respuesta inmune innata.
Antígeno: una estructura capaz de inducir una respuesta inmune celular o humoral.
Tratamiento o terapia: un proceso que está destinado a producir un cambio beneficioso en el estado de un individuo, p. e. mamífero, especialmente humano. Se contemplan tanto tratamientos humanos como veterinarios. Un cambio beneficioso puede incluir uno o más de: restauración de la función, reducción de síntomas, limitación o retraso de una enfermedad, trastorno, o estado, o prevención, limitación o retraso del deterioro del estado, enfermedad o trastorno de un paciente. En particular, como se emplea en la presente memoria, el término "tratamiento" (también "tratar") se refiere a cualquier administración de una composición inmunogénica que calma, mejora, alivia, inhibe, retrasa el inicio de, reduce la gravedad parcialmente o completamente y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o estado particular (p. ej., infección viral) o la predisposición a la enfermedad. Dicho tratamiento puede ser de un sujeto que no presenta signos relevantes de la enfermedad, trastorno y/o estado y/o de un sujeto que presenta solo signos tempranos de la enfermedad, trastorno y/o estado. Alternativamente o adicionalmente, dicho tratamiento puede ser de un sujeto que presenta uno o más signos establecidos relevantes de la enfermedad, trastorno y/o estado. En determinadas realizaciones, el término "tratar" se refiere a la vacunación de un paciente.
VLP o partícula similar a virus: se parece a los virus pero no son infecciosas. No contiene ningún material genético viral de tipo salvaje y más preferiblemente ningún material genético infeccioso viral. La expresión de proteínas estructurales virales, tal como la envoltura o la cápside, da como resultado el autoensamblaje de la VLP. La VLP puede ser un virosoma (es decir, una envoltura lipoproteica desprovista de cápside) y una VLP que comprende tanto una cápside como una envoltura lipoproteica.
Proteína de fusión: se refiere a un polipéptido que incluye al menos dos segmentos, estos segmentos no están incluidos en un solo péptido en la naturaleza.
Agente activo terapéutico o ingrediente activo: se refiere a una sustancia química que presenta una actividad terapéutica cuando se administra a un sujeto. Estos incluyen, como ejemplos no limitantes, inhibidores, ligandos (p. ej., receptores agonistas o antagonistas), cofactores, fármacos antiinflamatorios (esteroides y no esteroides), fármacos antivirales, fármacos antifúngicos, fármacos antiparasitarios, agentes antipsicóticos, analgésicos, agentes antitrombogénicos, agentes antiplaquetarios, anticoagulantes, antidiabéticos, estatinas, toxinas, agentes antimicrobianos, antihistamínicos, metabolitos, agentes antimetabólicos, agentes vasoactivos, agentes vasodilatadores, agentes cardiovasculares, agentes quimioterapéuticos , antioxidantes, fosfolípidos, agentes antiproliferativos y heparinas.
Partículas similares a virus
La presente invención se refiere a una partícula similar a virus (VLP) que comprende una envoltura lipoproteica que incluye una glicoproteína fusogénica viral, en donde dicha partícula similar a virus contiene dinucleótidos cíclicos empaquetados en dicha partícula similar a virus.
La glicoproteína fusogénica viral puede ser una glicoproteína o una combinación de varias glicoproteínas de retroviridae (que incluye lentivirus y retrovirus, p. ej., alfaretrovirus, betaretrovirus, gammaretrovirus, deltaretrovirus, epsilonretrovirus), herpesviridae, poxviridae, hepadnaviridae, flaviviridae, togavoridae, coronaviridae, virus de la hepatitis D, orthomyxoviridae, paramyxoviridae, filoviridae, rhabdoviridae, bunyaviridae u orthopoxivridae (p. ej., variola). En un aspecto preferido, la glicoproteína fusogénica viral es de flaviviridae, retroviridae, orthomyxoviridae, paramyxoviridae, bunyaviridae o hepadnaviridae. En un aspecto específico, la glicoproteína fusogénica viral es de orthomyxovirus, rhabdoviridae o retroviridae.
Más específicamente, la glicoproteína fusogénica viral puede ser del virus de la hepatitis C (VHC), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que incluye VIH-1 y VIH-2, virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS), virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), lentivirus de puma, virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), virus de la enfermedad de Jembrana, virus de la anemia de infecciones equinas, virus Visna/maedi, virus de la encefalitis-artritis caprina, virus de la leucemia felina (VLFe), virus de la leucemia murina (VLM), virus de la leucemia bovina (VLB), virus linfotrópico T humano (HTLV, p. ej., HTLV-1, -2, -3 o -4), virus del sarcoma de Rous, virus de la leucosis del sarcoma aviar, virus de la enfermedad de Newcastle (ND), virus del dengue, virus de Hantaan, virus de la influenza A o B (p. ej., H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9 o cualquier combinación de los mismos), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus del sarampión (MV), thogotovirus, virus del herpes que incluye HSV-1 y HSV-2, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV), virus del Ébola o virus de Marburg, virus de la encefalitis del valle de Murray, virus sincitial respiratorio (VSR), virus de la encefalitis japonesa, virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental. En un aspecto muy específico, la glicoproteína fusogénica viral es una glicoproteína del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) que incluye VIH-1 y VIH-2, thogotovirus, virus Chikungunya, coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave humano (SARS CoV) y VSV (virus de la estomatitis vesicular). En una realización particular, la glicoproteína fusogénica viral es un virus linfotrópico T humano, especialmente HTLV-1, -2 o -3.
En una realización particular, la glicoproteína fusogénica viral puede elegirse no exhaustivamente del grupo que consiste en HBsAg del VHB (p. ej., M-, S- o L-HBsAg), proteínas E1 y/o E2 del VHC (p. ej., el documento WO2014/128568), HA (hemaglutinina) y NA (neuraminidasa) de influenza, glicoproteína G del VSV, glicoproteína GP del virus del Ébola o Marburg, glicoproteínas Gp120 (o su dominio de unión a CD4) y Gp41 de lentivirus, proteína envolvente (DENV E) y proteína de pre-membrana (prM DENV) del virus del Dengue, dos glicoproteínas de envoltura del virus Hantaan, glicoproteína E2 del virus Chikungunya, glicoproteínas HN y F del virus de Newcastle, gp85 y gp37 del virus del sarcoma de Rous, y proteína E y prM del virus de la encefalitis del valle de Murray. La glicoproteína viral puede ser un derivado de la proteína de tipo salvaje, por ejemplo, mediante truncamiento tal como la eliminación del dominio citoplásmico o mediante la introducción de mutación(es).
Opcionalmente, la glicoproteína viral puede fusionarse o unirse covalentemente a un antígeno de interés o a un resto diana.
Alternativamente, la envoltura lipoproteica o las VLP pueden comprender además otras proteínas de interés, tal como un antígeno, una resto diana o una molécula de adhesión inmunoestimuladora y citocinas, como el ligando de CD40 unido a membrana (CD40L), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos anclado a membrana (GM -CSF) para mejorar la inmunogenicidad de las VLP. También puede comprender además flagelina, en particular flagelina anclada a la membrana, especialmente en combinación con influenza.
Una lista no exhaustiva de antígenos que pueden incluirse además en las VLP, además de la glicoproteína viral y las proteínas de la cápside. Más específicamente, las VLP pueden incluir también antígenos de antígenos asociados a tumores tal como Her2/neu, CEA (antígeno carcinoembriogénico), HER2/neu, MAGE2 y MAGE3 (antígeno asociado a melanoma), RAS, mesotelina o p53, del VIH como Vpr, Vpx, Vpu, Vif y Env, de bacterias tal como C. albicans SAP2 (aspartil proteinasa secretada-2), Clostridium difficile, de parásitos tal como P. falciform proteínas tal como CSP (proteína circumsporozoíto), AMA-1 (antígeno 1 de la membrana apical), TRAP/SSP2 (proteína 2 de superficie del esporozoito, LSA (antígeno de la etapa hepática), Pf Exp1 (proteína 1 exportada Pf), SALSA (antígeno 2 del esporozoíto de Pf y antígeno de la etapa hepática), STARP (proteína del esporozoíto rica en treonina y asparagina) o cualquier proteína descrita en el documento WO2011/138251.
Las VLP envueltas pueden incluir varios, en particular dos o más, epítopos/antígenos diferentes que se seleccionan o (a) de diferentes cepas virales del mismo virus y/o (b) de diferentes serotipos del mismo virus y/o (c) de diferentes cepas virales específicas para diferentes huéspedes. Diferentes cepas virales son, por ejemplo, diferentes cepas del virus de la influenza, por ejemplo, las cepas del virus de la influenza A H1N1, H5 N1 , H9N1, H1 N2, H2N2, H3N2 o H9N2, o también el virus de la influenza B o el virus de la influenza C. Los diferentes serotipos son, por ejemplo, diferentes serotipos del virus del papiloma humano (VPH), por ejemplo, los serotipos 6, 11, 16, 18, 31,33, 35, 39, 45, 48, 52, 5862, 66, 68, 70, 73 y 82, pero también de los tipos proto-oncogénicos del VPH 5, 8, 14, 17, 20 y 47 o de los tipos relevantes del papiloma VPH 6, 11, 13, 26, 28, 32 y 60.
Por ejemplo, el documento WO14068001 describe las VLP que tiene proteínas de superficie de CMV. Las proteínas de superficie podrían elegirse entre el grupo que consiste en gpUL75 (gH), gpUL115 (gL), gpUL55 (gB), gpUL74 (gO), gpUL100 (gM), gpUL73 (gN), gpUL128, gpUL130 y gpUL131A. Las VLP pueden comprender además proteínas del tegumento de CMV tales como pUL83 y pUL32. Las proteínas de CMV pueden ser de diferentes cepas seleccionadas del grupo de cepas Towne, Toledo, AD169, Merlin, TB20 y VR1814.
En otro ejemplo, las VLP comprenden proteínas L1 del VPH o fragmentos antigénicos de las mismas. En particular, incluye al menos proteínas L1 de VPH16 y VPH18, y opcionalmente de VPH6 y VPH11.
En el contexto de la vacuna contra la influenza, las VLP comprenden proteínas de superficie HA y NA. Pueden incluir además o alternativamente proteínas M1 y/o M2, en particular el dominio externo de M2.
La partícula similar a virus descrita en la presente memoria preferiblemente comprende además una cápside. Preferiblemente, la cápside es de retroviridae. Retroviridae incluye lentivirus y retrovirus, p. ej. alfaretrovirus, betaretrovirus, gammaretrovirus, deltaretrovirus, epsilonretrovirus. Por ejemplo, la cápside es del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), incluidos VIH-1 y VIH-2, virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS), virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), lentivirus de Puma, virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), virus de la encefalitisartritis caprina, virus de la leucemia felina (VLFe), virus de la leucemia murina (VLM), virus de la leucemia bovina (VLB), virus linfotrópico T humano (HTLV, p. ej., HTLV-1, -2, -3 o -4), virus del sarcoma de Rous (VSR), virus de la leucosis del sarcoma aviar, virus de la anemia de infecciones equinas, virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV). Más preferiblemente, la cápside retroviral es de VIH o VLM (virus de la leucemia murina).
Los dinucleótidos cíclicos empaquetados en dicha partícula similar a virus son segundos mensajeros ubicuos de moléculas pequeñas capaces de unirse directamente al receptor STING (estimulador de genes de interferón) residente en el retículo endoplásmico y activar una vía de señalización que induce la expresión del interferón tipo I y también de citocinas inflamatorias dependientes del factor nuclear - k B (NF k B). El dinucleótido cíclico es monofosfato de guanosina-monofosfato de adenosina cíclico (cGAMP), más específicamente c[G(2',5')pA(3',5')p] y c[G(3',5')pA(3',5')p]. En una realización preferida, la VLP contiene al menos 0,015 ng/ml de cGAMP.
Método para preparar una partícula similar a virus que contiene dinucleótidos cíclicos.
Los inventores observaron sorprendentemente que una VLP que contiene dinucleótidos cíclicos, especialmente cGAMP, puede prepararse cuando la correspondiente dinucleótido sintasa cíclica tal como cGAS, diguanilato ciclasa o diadenilato ciclasa se coexpresa en una célula con los componentes de las VLP. Sin embargo, los inventores definieron que la VLP necesita ser una VLP envuelta. Por lo tanto, la presente descripción se refiere a un método para preparar una partícula similar a virus envuelta que contiene dinucleótidos cíclicos, especialmente c-di-GMP, c-di-AMP o cGAMP, que comprende la coexpresión de la dinucleótido sintasa cíclica tal como cGAS, diguanilato ciclasa o diadenilato ciclasa y de las proteínas de la partícula similar a virus envuelta en una célula.
La dinucleótido sintasa cíclica también se llama dinucleótido ciclasa y pertenece a la superfamilia de nucleotidil transferasas. Incluye la GMP-AMP sintasa cíclica perteneciente a EC 2.7.7.86, la diadenilato ciclasa perteneciente a EC 2.7.7.85 y la diguanilato ciclasa perteneciente a EC 2.7.7.65. cGAS es una GMP-AMP sintasa cíclica. Recientemente se han identificado y caracterizado varios miembros de esta familia, en particular cGAS murino y cGAS humano (Wu et al., 2012, Science, 339, 826-830; Sun et al., 2012, Science, 339, 786-791). Se hace referencia a cGAS humano en UniprotKB ID No Q8N884. Las secuencias de referencia se describen en NCBI RefSeq como NP_612450.2 para la secuencia de aminoácidos y como NM_138441.2 para la secuencia de ARNm.
MQPWHGKAMQRASEAGATAPKASARNARGAPMDPTESPAAPEAALPKAGKFGPARKSGSR QKKSAPDTQERPPVRATGARAKKAPQRAQDTQPSDATSAPGAEGLEPPAAREPALSRAGS CRQRGARCSTKPRPPPGPWDVPSPGLPVSAPILVRRDAAPGASKLRAVLEKLKLSRDDIS TAAGMVKGVVDHLLLRLKCDSAFRGVGLLNTGSYYEHVKISAPNEFDVMFKLEVPRIQLE EYSNTRAYYFVKFKRNPKENPLSQFLEGEILSASKMLSKFRKIIKEEINDIKDTDVIMKR KRGGSPAVTLLISEKISVDITLALESKSSWPASTQEGLRIQNWLSAKVRKQLRLKPFYLV PKHAKEGNGFQEETWRLSFSHIEKEILNNHGKSKTCCENKEEKCCRKDCLKLMKYLLEQL KERFKDKKHLDKFSSYHVKTAFFHVCTQNPQDSQWDRKDLGLCFDNCVTYFLQCLRTEKL ENYFIPEFNLFSSNLIDKRSKEFLTKQIEYERNNEFPVFDEF (SEQ ID No 1)
Se hace referencia a cGAS murino en UniprotKB ID No Q8C6L5. Las secuencias de referencia se describen en NCBI RefSeq como NP_775562.2 para la secuencia de aminoácidos y como NM_173386.4 para la secuencia de ARNm.
MEDPRRRTTAPRAKKPSAKRAPTQPSRTRAHAESCGPQRGARSRRAERDGDTTEKPRAPG PRVHPARATELTKDAQPSAMDAAGATARPAVRVPQQQAILDPELPAVREPQPPADPEARK WRGPSHRRGARSTGQPRAPRGSRKEPDKLKKVLDKLRLKRKDISEAAETVNKVVERLLR RMQKRESEFKGVEQLNTGSYYEHVKISAPNEFDVMFKLEVPRIELQEYYETGAFYLVKFK RIPRGNPLSHFLEGEVLSATKMLSKFRKIIKEEVKEIKDIDVSVEKEKPGSPAVTLLIRN PEEISVDIILALESKGSWPISTKEGLPIQGWLGTKVRTNLRREPFYLVPKNAKDGNSFQG ETWRLSFSHTEKYILNNHGIEKTCCESSGAKCCRKECLKLMKYLLEQLKKEFQELDAFCS YHVKTAIFHMWTQDPQDSQWDPRNLSSCFDKLLAFFLECLRTEKLDHYFIPKFNLFSQEL IDRKSKEFLSKKIEYERNNGFPIFDKL (SEQ ID No 2)
cGAS también se han caracterizado bien en bovinos, porcinos y Vibrio cholera serotipo O1 (véase UniprotKB ID Nos E1BGN7, I3LM39 y Q9KVG7, respectivamente) y también puede encontrarse en Drosophila (p. ej., D. melanogaster), pez cebra (D. rerio), A. carolinensis, A. melanoleuca, A. mellifera, B. floridae, C. lupus familiaris, E. caballus, F. catus, G. gallus, G. gorilla gorilla, H. magnipapillata, I. scapularis, M. brevicollis, M. domestica, M. gallopavo, M. mulatta, N. vectensis, N. vitrioennis, O. anatinus, O. aries, O. cuniculus, O. latipes, P. abelii, P. anubis, P. paniscus, P. troglodytes, R. norvegicus, S. harrisii, T. castaneum, T. guttata y X. tropicalis o Laevis (Wu et al, 2014, Nucleic Acids Research, 42, 8243-8257). En una descripción preferida, se utiliza la secuencia de ácido nucleico que codifica o el cGAS humano o el murino.
Los dinucleótidos cíclicos cGAMP pueden ser cGAMP (2'-3'-GMP-AMP cíclico) o cGAMP (3'-3'-GMP-AMP cíclico). En una primera realización, cGAMP es cGAMP (2'-3'-GMP-AMP cíclico) [también llamado [G(2',5')pA(3',5')p] cíclico; Número de CAS: 1441190-66-4)]. En una segunda realización, cGAMP puede ser cGAMP (3'-3'-Gm P-a MP cíclico) [también llamado A-P(3'-5')G-P(3'-5') cíclico; Número de CAS: 849214-04-6].
En una descripción preferida, se utiliza cGAS humano o murino para preparar cGAMP (2'-3'-GMP-AMP cíclico). En otra descripción preferida, se utiliza cGAS de Vibrio cholera serotipo O1 para preparar cGAMP (3'-3'-GMP-AMP cíclico).
La diadenilato ciclasa es una di-AMP sintasa cíclica. También puede llamarse DisA (proteína de escaneo de integridad del ADN) o CdaA. Se han identificado numerosos miembros de esta familia (véase, Corrigan and Gründling, 2013, Nature, 11,513-524;). Por ejemplo, la diadenilato ciclasa puede elegirse entre las enzimas de Bacillus subtilis (UniProt No P37573), Listeria monocytogenes (UniProt No Q8Y5E4), Bacillus thuringiensis (UniProt No D5TK88) y Thermotoga maritima (UniProt No Q9WY43).
La diguanilato ciclasa es una di-GMP sintasa cíclica. Se han identificado varios miembros de esta familia (véase, Massie et al, 2012, PNAS, 109). Por ejemplo, la diguanilato ciclasa puede elegirse entre las enzimas de Thermotoga maritima (UniProt No Q9X2A8), Desulfotalea psychrophila (UniProt No Q6ARU5), Anaplasma phagocytophilum (UniProt No Q2GKF8), E. coli (UniProt No P0AA89), Vibrio chloerae (UniProt No Q9KPJ7), Caulobacter vibrioides (UniProt No Q9A5I5), Pseudomonas fluorescens (UniProt No Q3K751 o Q3KFC4), Marinobacter hydrocarbonoclasticus (UniProt No A1U3W3) y Pseudomonas aeruginosa (Q9I4M8).
Por dinucleótido sintasa cíclica se incluyen también variantes de la misma que mantienen la actividad para la síntesis de dinucleótidos cíclicos. En particular, incluye la dinucleótido sintasa cíclica que tiene un resto etiqueta, en particular útil para la purificación o inmovilización de la enzima. Tal etiqueta es bien conocida por el experto en la técnica, por ejemplo, una etiqueta His (His6), una etiqueta FLAG, una etiqueta HA (epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza), una proteína de unión a maltosa (MPB), una etiqueta MYC (epítopo derivado de la protooncoproteína humana MYC) o una etiqueta GST (pequeña glutatión S-transferasa). También incluye variantes que tienen mutaciones, en particular mutaciones que mejoran la actividad para la síntesis de dinucleótidos cíclicos. Tales variantes pueden variar en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos. Preferiblemente, las variantes tienen al menos 75, 80, 85, 90, 95 o 99% de identidad con la dinucleótido sintasa cíclica de tipo salvaje. La variante puede obtenerse mediante diversas técnicas bien conocidas en la técnica. En particular, los ejemplos de técnicas para alterar la secuencia de ADN que codifica la proteína de tipo salvaje incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria y construcción de oligonucleótidos sintéticos.
Como se emplea en la presente memoria, el término "identidad de la secuencia" o "identidad" se refiere al número (%) de coincidencias (residuos de aminoácidos idénticos) en posiciones de un alineamiento de dos secuencias polipeptídicas. La identidad de la secuencia se determina comparando las secuencias cuando se alinean para maximizar el solapamiento y la identidad mientras se minimizan los huecos de la secuencia. En particular, la identidad de la secuencia puede determinarse utilizando cualesquiera de un número de algoritmos matemáticos de alineación global o local, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias de longitudes similares se alinean preferiblemente utilizando algoritmos de alineación global (p. ej., el algoritmo de Needleman y Wunsch; Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol 48:443) que alinea las secuencias de manera óptima en toda la longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferiblemente utilizando un algoritmo de alineación local (p. ej., el algoritmo de Smith y Waterman (Smith and Waterman, 1981, Adv. Apl. Math. 2:482) o el algoritmo de Altschul (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Altschul et al., 2005, FEBSJ. 272:5101-5109)). La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando el software de ordenador disponible públicamente disponible en sitios web de Internet tales como http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ o http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, que incluye los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los fines de la presente memoria, los valores del % de identidad de la secuencia de aminoácidos se refieren a valores generados utilizando el programa de alineación de secuencias por pares EMBOSS Needle que crea una alineación global óptima de dos secuencias utilizando el algoritmo Needleman-Wunsch, en donde todos los parámetros de búsqueda se establecen en valores predeterminados, es decir matriz de puntuación = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0,5, End gap penalty = falso, End gap open = 10 y End gap extend = 0,5.
La secuencia codificante de la dinucleótido sintasa cíclica está en una construcción de ácido nucleico que incluye todos los elementos necesarios para su expresión en las células, en particular los elementos necesarios para la transcripción y traducción en la célula huésped. Preferiblemente, la secuencia codificante de la dinucleótido sintasa cíclica se sobreexpresa en la célula. Por lo tanto, la secuencia codificante para la secuencia codificante de la dinucleótido sintasa cíclica está bajo el control de un promotor fuerte tal como los promotores PGK, CMV, Ubiquitina, MHC-II, beta2-migroglobulina, Ca G, SV40, SFFV Lt R, EF1a, LTR retroviral.
De manera similar, las secuencias codificantes de las proteínas de la partícula similar a virus envuelta, especialmente la glicoproteína de la envoltura y la proteína de la cápside, están comprendidas en una construcción de ácido nucleico que incluye todos los elementos necesarios para su expresión en las células, en particular los elementos necesarios para la transcripción y traducción en la célula huésped.
La secuencia codificante para la dinucleótido sintasa cíclica en la célula puede ser episomal, p. ej. en un vector de expresión, o puede incorporarse en el cromosoma de la célula. Opcionalmente, la secuencia codificante de la dinucleótido sintasa cíclica puede estar en un vector de expresión distinto del (de los) vector(es) que comprende(n) la(s) secuencia(s) codificante(s) de la(s) proteína(s) de la partícula similar a virus envuelta. Alternativamente, la secuencia codificante para la dinucleótido sintasa cíclica y las secuencias codificantes para las proteínas de la partícula similar a virus envuelta están comprendidas en el mismo vector de expresión.
Por consiguiente, cuando las secuencias codificantes para la dinucleótido sintasa cíclica y para las proteínas de la partícula similar a virus envuelta no están comprendidas en el mismo vector de expresión o construcción, la presente descripción se refiere a una combinación o kit de construcciones de ácido nucleico o vectores de expresión que comprenden al menos una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende la secuencia que codifica la dinucleótido sintasa cíclica y una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende la secuencia que codifica al menos una proteína de la partícula similar a virus envuelta, en particular la glicoproteína de la envoltura y/o de la cápside.
La presente descripción se refiere a una construcción nucleica o un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica una dinucleótido sintasa cíclica y una secuencia que codifica una glicoproteína fusogénica viral y/o una secuencia que codifica una cápside, especialmente una cápside de retroviridae. Preferiblemente, la construcción nucleica o el vector de expresión comprende una secuencia que codifica una cápside, especialmente una cápside de retroviridae, y una secuencia que codifica una glicoproteína fusogénica viral. La glicoproteína fusogénica, la dinucleótido sintasa cíclica y la cápside pueden ser cualquiera de las descritas anteriormente. La construcción nucleica o el vector de expresión comprenden una secuencia que codifica cGAS, en particular bajo el control de un promotor fuerte. Opcionalmente, la construcción nucleica o el vector de expresión pueden comprender además una secuencia que codifica un antígeno o una proteína de interés o ácido nucleico de interés (siARN, miARN, antisentido y similares).
Los vectores de expresión que pueden utilizarse en la presente invención incluyen no exhaustivamente vectores de expresión eucariotas, en particular vectores de expresión de mamíferos, vectores de expresión basados en virus, vectores de expresión de baculovirus, vectores de expresión de plantas y vectores de expresión de plásmidos. El vector de expresión adecuado puede derivarse de virus tales como baculovirus, virus papova tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus, especialmente lentivirus, o combinaciones de los mismos.
En el método puede utilizarse cualquier célula eucariota. Por ejemplo, las células utilizadas para la producción pueden ser una célula de mamífero, por ejemplo, células COS-1, CHO (ovario de hámster chino) (EE.UU. 4,889,803; EE.UU.
5,047,335), líneas celulares HEK (riñón embrionario humano) tales como líneas celulares 293 y 293T y líneas celulares HL-116, líneas celulares Vero, líneas celulares BHK (riñón de hámster bebé); una célula vegetal (p. ej., N. bethamiana); una célula de insecto tal como Spodoptera frugiperda (células derivadas de Sf tales como células Sf-9), células SF21, Hi-5, Express Sf+ y S2 Schneider, en particular con sistema de expresión baculovirus-célula de insecto; una célula aviar.
La presente descripción se refiere a una célula huésped recombinante que comprende una construcción nucleica o un vector de expresión como se describe anteriormente.
La presente descripción se refiere a un método para producir una partícula similar a virus que comprende dinucleótidos cíclicos empaquetados en dicha partícula similar a virus como se describe anteriormente, en donde el método comprende: coexpresión de una dinucleótido sintasa cíclica y una glicoproteína fusogénica viral en una célula huésped eucariota en condiciones que permitan la síntesis y la actividad de los dinucleótidos cíclicos y la glicoproteína fusogénica viral en dicha célula; y la recuperación de las partículas similares a virus producidas por dicha célula.
Preferiblemente, la célula huésped coexpresa además una cápside de retroviridae. La glicoproteína fusogénica, la dinucleótido sintasa cíclica y la cápside pueden ser cualquiera de las proteínas como se describe anteriormente.
En una descripción particular, el método puede comprender además la etapa preliminar de introducir en la célula huésped una construcción nucleica o vector de expresión que codifica la glicoproteína fusogénica viral. También puede comprender la introducción en la célula huésped de una construcción nucleica o vector de expresión que codifica la dinucleótido sintasa cíclica y/o una construcción nucleica o vector de expresión que codifica la proteína de la cápside. En una descripción preferida, el método comprende una etapa de introducir en la célula huésped ADN bicatenario por transfección, en particular una construcción nucleica o vector de expresión por transfección.
En una descripción preferida, la dinucleótido sintasa cíclica es cGAS, en particular un cGAS humano o murino, más preferiblemente un cGAS murino. En otra descripción, la dinucleótido sintasa cíclica es cGAS de Vibrio cholera serotipo O1.
Los métodos para producir las VLP son bien conocidos por el experto en la técnica (Zeltins, 2013, Mol Biotechnol, 53, 92-107); en particular, en el sistema de expresión de Baculovirus (Liu et al, 2013, Protein Exper Purif, 90, 104-116; Sokolenko et al, 2012, Biotechnol Adv, 30, 766-81; Vicente et al, 2011, J Invertebr Pathol, 107 suppl.,); en plantas (Scotti and Rybicki, 2013, Expert Rev Vaccines., 12, 211-24; Chen and Lai, 2013, Hum Vaccin Immunother., 9, 26­ 49,), en el sistema de expresión aviar. De hecho, ya se comercializan varias vacunas basadas en VLP. Para revisión, por favor consulte, por ejemplo a Kushnir et al (2012, Vaccine, 31, 58-83), y Grgacic and Anderson (2006, Methods, 40, 60-65).
Las VLP producidas pueden recuperarse y/o purificarse según cualquier técnica conocida, como centrifugación, cromatografía y similares.
La presente invención se refiere a la partícula similar a virus como se describe anteriormente como un adyuvante de fármaco o de vacuna. Se refiere al uso de la partícula similar a virus como se describe anteriormente para la fabricación de un fármaco o una vacuna, especialmente contra un cáncer. Por lo tanto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica, de vacuna o veterinaria que comprende una partícula similar a virus como se describe en la presente memoria y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además adyuvante. La composición puede comprender también o administrarse en combinación con una o más sustancias terapéuticamente activas adicionales.
La presente descripción se refiere al vector de expresión o combinación del mismo como se describe en la presente memoria como adyuvante de fármaco o de vacuna. De hecho, el vector de expresión puede administrarse a un sujeto y, cuando se expresa en las células receptoras, las células producen in vivo las partículas similares a virus como se describe anteriormente. Por consiguiente, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica, de vacuna o veterinaria que comprende un vector de expresión o combinación del mismo y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Se refiere al uso de un vector de expresión o combinación del mismo como se describe anteriormente para la fabricación de un fármaco o una vacuna, especialmente contra un cáncer. El vector de expresión o combinación del mismo comprende la secuencia codificante para proteínas necesarias para producir las VLP como se describe en la presente memoria.
De manera similar, las células huesped como se describe anteriormente pueden utilizarse también como adyuvante de vacuna o vacuna. De hecho, cuando tales células huésped se administran al sujeto, producen in vivo las partículas similares a virus como se describe anteriormente. En este contexto, las células huésped pueden ser células del sujeto receptor que han sido modificadas por ingeniería genética antes de la administración o son células huésped compatibles con el sujeto. Por consiguiente, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica, de vacuna o veterinaria que comprende células huésped y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La presente descripción se refiere al uso de una célula huésped como se describe anteriormente para la fabricación de un fármaco o una vacuna, especialmente contra un cáncer. Las células huésped pueden producir las VLP como se describe en la presente memoria.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable que, como se emplea en la presente memoria, puede ser o comprender disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según convenga a la forma de dosificación particular deseada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21a edicion, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) describe diversos excipientes utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de los mismos. Excepto en tanto que cualquier medio de excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como por ejemplo produciendo cualquier efecto biológico indeseable o interactuando de otro modo de una manera perjudicial con cualquier (cualesquiera) otro(s) componente(s) de la composición farmacéutica, se contempla que su uso esté dentro del alcance de esta invención. Los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser conservantes, diluyentes inertes, agentes dispersantes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes tamponantes y similares. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, sacarosa, trehalosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH o adyuvantes que mejoran la efectividad de las vacunas. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más conservantes. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas no contienen conservantes.
Las composiciones farmacéuticas como se describe en la presente memoria pueden comprender un adyuvante. Puede utilizarse cualquier adyuvante de acuerdo con la presente invención. Se conocen un gran número de adyuvantes; los Institutos Nacionales de Salud preparan un compendio útil de muchos de tales compuestos, que puede encontrarse (www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf). Véase también Allison (1998, Dev. Biol. Stand., 92:3-11;), Unkeless et al. (1998, Annu. Rev. Immunol., 6:251-281;), y Phillips et al. (1992, Vaccine, 10:151-158;). Se conocen en la técnica cientos de adyuvantes diferentes y pueden emplearse en la práctica de la presente invención. Adyuvantes ejemplares que pueden utilizarse de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, citocinas, adyuvantes tipo gel (p. ej., hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, etc.); adyuvantes microbianos (p. ej., secuencias de ADN inmunomoduladoras que incluyen motivos CpG; endotoxinas tales como monofosforil lípido A; exotoxinas tales como toxina del cólera, toxina termolábil de E. coli y toxina pertussis; dipéptido de muramil, etc.); adyuvantes basados en emulsión de aceite y emulsionantes (p. ej., adyuvante de Freund, MF59 [Novartis], SAF, etc.); adyuvantes particulados (p. ej., liposomas, microesferas biodegradables, saponinas, etc.); adyuvantes sintéticos (p. ej., copolímeros de bloques no iónicos, análogos de péptidos de muramilo, polifosfaceno, polinucleótidos sintéticos, etc.); y/o combinaciones de los mismos. Otros adyuvantes ejemplares incluyen algunos polímeros (p. ej., los polifosfacenos; descritos en la patente de EE.UU. 5,500,161), Q57, QS21, escualeno, tetraclorodecaóxido, etc. Se han descrito previamente con más detalle excipientes farmacéuticamente aceptables en la sección anterior titulada "Composiciones farmacéuticas".
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente y/o administrarse en combinación con una o más sustancias terapéuticamente activas adicionales, en particular un antígeno tal como se describe anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas como se describe en la presente memoria son útiles para inducir o potenciar una respuesta inmune. La presente invención se refiere a un método para inducir o potenciar una respuesta inmune en un sujeto en necesidad de la misma, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica como se describe en la presente memoria.
Una respuesta inmune puede referirse a inmunidad celular, inmunidad humoral o puede involucrar a ambas. Una respuesta inmune puede limitarse también a una parte del sistema inmune. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una composición inmunogénica puede inducir una respuesta aumentada de IFNy. En determinadas realizaciones, una composición inmunogénica puede inducir una respuesta de IgA mucosal (p. ej., como se mide en lavados nasales y/o rectales). En determinadas realizaciones, una composición inmunogénica puede inducir una respuesta de IgG sistémica (p. ej., como se mide en suero). En determinadas realizaciones, una composición inmunogénica puede inducir anticuerpos neutralizantes de virus o una respuesta de anticuerpos neutralizantes. En determinadas realizaciones, una composición inmunogénica puede inducir una respuesta de CTL.
Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas o veterinarias son útiles como vacuna o como adyuvante de vacuna. También son útiles para tratar un cáncer. La presente invención se refiere a un método para tratar un cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica como se describe en la presente memoria.
El cáncer puede seleccionarse en la lista no exhaustiva que comprende cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de mama, cáncer de próstata, melanoma maligno, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal o de colon, linfoma, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, glioblastoma, glioma, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, mieloma, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, neuroblastoma, cáncer gástrico y sarcoma.
Como se emplea en esta memoria, el término "vacunación" se refiere a la administración de una composición destinada a generar una respuesta inmune, por ejemplo, a un agente causante de enfermedad (p. ej., virus). Para los fines de la presente invención, la vacunación puede administrarse antes, durante y/o después de la exposición a un agente causante de enfermedad y, en ciertas realizaciones, antes, durante y/o poco después de la exposición al agente. En algunas realizaciones, la vacunación incluye múltiples administraciones, apropiadamente espaciadas en el tiempo, de una composición de vacunación.
Como se emplea en la siguiente memoria, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para conferir un efecto terapéutico en el sujeto tratado, con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible mediante algún ensayo o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación o siente un efecto). En particular, la "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una proteína o composición terapéutica eficaz para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o estado deseado, o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable, tal como mejorando los síntomas asociados con la enfermedad, previniendo o retrasando el inicio de la enfermedad y/o disminuyendo también la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz se administra comúnmente en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier composición inmunogénica particular, una cantidad terapéuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la vía de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. Además, la cantidad específica terapéuticamente eficaz (y/o dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el momento de administración, vía de administración y/o velocidad de excreción o metabolismo de la composición inmunogénica específica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares como es bien conocido en las técnicas médicas.
Como se emplea en la presente memoria, el término "mejora" o "mejoría" significa la prevención, reducción o paliación de un estado, o mejoría del estado de un sujeto. La mejora incluye, pero no requiere, la recuperación completa o la prevención completa de una enfermedad, trastorno o estado. El término "prevención" se refiere a un retraso en el inicio de una enfermedad, trastorno o estado. La prevención puede considerarse completa cuando el inicio de una enfermedad, trastorno o estado se ha retrasado durante un período de tiempo predefinido.
Como se emplea en la presente memoria, los términos "forma de dosificación" y "forma de dosificación unitaria" se refieren a una unidad físicamente discreta de un agente terapéutico para el paciente a tratar. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado. Sin embargo, se entenderá que la dosis total de la composición la decidirá el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico.
"Régimen de dosificación" (o "régimen terapéutico"), como se emplea ese término en la presente memoria, es un conjunto de dosis unitarias (normalmente más de una) que se administran individualmente a un sujeto, normalmente separadas por períodos de tiempo. En algunas realizaciones, un agente terapéutico dado tiene un régimen de dosificación recomendado, que puede implicar una o más dosis. En algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una multitud de dosis, cada una de las cuales está separada una de otra por un período de tiempo de la misma duración; en algunas realizaciones, un régimen de dosificación comprende una multitud de dosis y al menos dos períodos de tiempo diferentes que separan las dosis individuales.
Como se emplea en la presente memoria, los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se refieren a un sujeto mamífero humano o no humano. El individuo (también denominado como "paciente" o "sujeto") que está siendo tratado es un individuo (feto, bebé, niño, adolescente o adulto) que padece un cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano. En algunas otras realizaciones, el sujeto es un animal, especialmente una mascota (p. ej., gato y perro), un animal de granja (p. ej., ganado, cerdo, oveja, conejo, porcino, pescado, aves de corral), caballos.
La composición farmacéutica, veterinaria o de vacuna puede administrarse o ser adecuada para la administración mediante cualquier vía de administración conveniente. Por ejemplo, las vías contempladas son las vías subcutánea, intramuscular, mucosa (p. ej., sublingual, intranasal, intrarrectal, intravaginal o intrabronquial), intravenosa o intratumoral. Las vías de administración preferidas son intratumorales y sistémicas, p. ej., intravenosas. Sin embargo, en una realización preferida, la vía contemplada es la intratumoral.
Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas aquí pueden proporcionarse en una forma inyectable estéril (p. ej., una forma que sea adecuada para inyección subcutánea o infusión intravenosa). Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma de dosificación líquida que es adecuada para la inyección. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se proporcionan como polvos (p. ej., liofilizados y/o esterilizados), opcionalmente al vacío, que se reconstituyen con un diluyente acuoso (p. ej., agua, tampón, solución salina, etc.) antes de la inyección. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se diluyen y/o reconstituyen en agua, solución de cloruro de sodio, solución de acetato de sodio, solución de alcohol bencílico, solución salina tamponada con fosfato, etc. En algunas realizaciones, el polvo debe mezclarse suavemente con el diluyente acuoso (p. ej., no agitado)
Las composiciones farmacéuticas pueden proporcionarse en una forma que pueda refrigerarse y/o congelarse. Alternativamente, pueden proporcionarse en una forma que no pueda refrigerarse y/o congelarse. Opcionalmente, las soluciones reconstituidas y/o las formas de dosificación líquidas pueden almacenarse durante un cierto período de tiempo después de la reconstitución (p. ej., 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 5 días, 7 días, 10 días, 2 semanas, un mes, dos meses o más).
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden prepararse mediante cualquier método conocido o desarrollado de aquí en adelante en la técnica de la farmacología. Dichos métodos preparatorios incluyen la etapa de poner el ingrediente activo en asociación con uno o más excipientes y/o uno o más de otros ingredientes accesorios, y luego, si es necesario y/o deseable, dar forma y/o empaquetar el producto en una unidad de dosis única o multidosis deseada.
Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede prepararse, empaquetarse y/o venderse a granel, como una dosis de unidad única y/o como una multitud de dosis unitarias únicas.
Las cantidades relativas de ingrediente activo, excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualesquiera ingredientes adicionales en una composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden variar, dependiendo de la identidad, tamaño y/o estado del sujeto tratado y/o dependiendo de la vía por la que se va a administrar la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1% y 100% (p/p) de ingrediente activo.
Las composiciones descritas en la presente memoria se administrarán generalmente en tales cantidades y por tal tiempo como sea necesario o suficiente para inducir una respuesta inmune. Los regímenes de dosificación pueden consistir en una dosis única o una multitud de dosis durante un período de tiempo. La cantidad exacta de una composición inmunogénica (p. ej., las VLP) a administrar puede variar de sujeto a sujeto y puede depender de varios factores. Por tanto, se apreciará que, en general, la dosis precisa utilizada será terminada por el médico prescriptor y dependerá no solo del peso del sujeto y de la vía de administración, sino también de la edad del sujeto y la gravedad de los síntomas y/o riesgo de infección. En un primer aspecto, se administra una cantidad particular de la composición farmacéutica como una dosis única. Alternativamente, se administra una cantidad particular de la composición farmacéutica como más de una dosis (p. ej., 1 -3 dosis que están separadas por 1 -12 meses). En su lugar, se administra una cantidad particular de la composición farmacéutica como una dosis única en varias ocasiones (p. ej., 1-3 dosis que están separadas por 1-12 meses). La composición farmacéutica puede administrarse en una dosis inicial y en al menos una dosis de refuerzo.
Los métodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse para aplicaciones veterinarias, p. ej., aplicaciones caninas y felinas. Si se desea, los métodos de la presente memoria también pueden utilizarse con animales de granja, tales como las razas ovina, aviar, bovina, porcina y equina.
Ejemplos
Ejemplo 1
Los inventores mostraron que cGAMP puede incorporarse en partículas lentivirales cuando estas se producen en células que expresan cGAS. El cGAMP se transfiere a las células infectadas y desencadena la inducción de interferón tipo I (IFN) dependiente de STING.
Este efecto era independiente de la transcripción inversa y la integración y podía acelerar las respuestas antivirales y ampliar el espectro de células en las que se induce el IFN.
Resultados
Entre los virus que desencadenan respuestas de IFN dependientes de cGAS en células infectadas estan los retrovirus, que incluye el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se cree que las respuestas al VIH implican la detección mediante cGAS de cADN viral producido tras la transcripción inversa, lo que conduce a la transcripción del gen IFN en la misma célula donde ocurrió la detección de cDNA. Sin embargo, es concebible que la inducción de IFN tras la infección por retrovirus podría producirse también independientemente de la transcripción inversa o cGAS si el virus infectante llevara dentro el segundo mensajero cGAMP. Los inventores plantearon la hipótesis de que cGAMP puede empaquetarse en partículas de VIH-1 y provocar una respuesta de IFN en células recién infectadas independientemente de la expresión de cGAS por este último, lo que permite la potenciación de la inmunidad antiviral innata.
Para ensayar esta idea, los inventores produjeron lentivectores basados en VIH-1 en células 293T, una línea celular humana que no expresa cGAS. Las partículas de virus se pseudotiparon con glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) y el genoma viral contenía proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en el marco de lectura abierto env. Estos virus, en lo sucesivo denominados como HIV-1-GFP, son incompetentes para la replicación debido a la falta de env funcional. Además de los dos plásmidos necesarios para la producción de virus (pNL4-3-deltaE-EGFP y pVSV-G), se cotransfectaron algunas células 293T con construcciones de expresión para o m-cGAS de tipo salvaje o m-cGAS-G198A/S199A (m-cGAS-AA) catalíticamente inactivo (Sun et al, 2013, Science, 339, 786-791). Después, se utilizaron cantidades de virus titulados para infectar células HEK293 frescas (Fig. 1A), que expresan STING endógeno (Fig. 2A) e inducen IFN en respuesta a cGAMP (Fig. 2B). El HIV-1 -GFP recogido de las células que expresan cGAS desencadenó la inducción de un promotor indicador de IFNp, mientras que los virus producidos en ausencia de cGAS exógeno o en presencia de cGAS mutante no lo hicieron (Fig. 1B). A continuación, los inventores analizaron la secreción de IFN transfiriendo los sobrenadantes de las células infectadas a una línea celular indicadora (HEK293-ISRE-luc), en la que la expresión de luciferasa de luciérnaga es impulsada por elementos de respuesta estimulados por interferón (Fig. 2C). Las cantidades de virus producidas en células que expresan cGAS desencadenaron la secreción de IFN, mientras que los virus de control no (Fig. 1C). La infectividad de estas cantidades de virus era comparable (Fig. 1C) y cGAS de tipo salvaje y mutante se expresaron a niveles similares en las células productoras de virus (Fig. 2D). Además, las células infectadas indujeron los ARNm de IFNp, IFI44 y IFIT1 específicamente cuando cGAS estaba presente en las células productoras de virus, lo que demuestra además la inducción de IFN y genes estimulados por interferón (ISG) (Fig. 1D). Los inventores a continuación infectaron macrófagos primarios derivados de médula ósea de ratón (BMDM). La inducción de IFN y los ISG aumentó en los BMDM infectados con HIV-1-GFP producido en células 293T reconstituidas con cGAS (Fig. 1E, F). Los BMDM deficientes en STING no indujeron IFN e ISG en respuesta a las mismas preparaciones de virus, aunque la producción de IFN dependiente de RIG-I desencadenada por la infección por el virus Sendai fue normal (Fig. 1E, F).
Para excluir la posibilidad de que la transferencia de ADN plasmídico o de un factor soluble sea la causa de la producción de IFN por células recién infectadas, los inventores trataron preparaciones de virus con DNasa o viriones sedimentados mediante centrifugación. Ningún tratamiento afectó la capacidad de1HIV-1-GFP producido en células que expresan cGAS para inducir IFN (Fig. 3A, B). Además, la respuesta de IFN en las células diana fue independiente de la transcripción inversa y la integración, como lo muestra la inhibición farmacológica con nevirapina y raltegravir, respectivamente (Fig. 3C). Además, las partículas similares a virus que carecen de un genoma de ARN viral indujeron IFN en las células diana cuando se recogieron de células productoras que expresan cGAS (Fig. 3D), lo que demuestra que ni el genoma viral ni sus productos de transcripción inversa son la causa de la inducción de IFN en este entorno. La sustitución de VSV-G con glicoproteína de thogotovirus no disminuyó la propiedad inductora de IFN de las cantidades de virus de células que expresan cGAS, lo que demuestra que estos efectos no están relacionados con la pseudotipificación de VSV-G (Fig. 3E). Es posible que las cantidades de HIV-1-GFP contengan exosomas y otras vesículas envueltas tal como cuerpos apoptóticos. El tratamiento de células productoras reconstituidas con cGAS con el inhibidor del exosoma GW4869 (Li et all., 2013, Nat Immunol, 14, 793-803) o el inhibidor de caspasa Ac-DEVD-CHO durante la preparación del virus no disminuyó la inducción de IFN por HIV-1-GFP (Fig. 3F), de acuerdo con la idea de que la actividad inductora de IFN está presente dentro de los viriones.
A continuación, los inventores prepararon extractos de moléculas pequeñas a partir de preparaciones de virus. En el curso de este protocolo, las proteínas y ácidos nucleicos se degradan y eliminan. Se añadieron extractos de virus a células THP1 diferenciadas con PMA que se permeabilizaron levemente con digitonina y los inventores analizaron la secreción de IFN (Fig. 4A). Los extractos de HIV-1-GFP recogidos de células productoras reconstituidas con cGAS de tipo salvaje indujeron la secreción de IFN por las células THP1 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4B). La preincubación de extractos con fosfodiesterasa I de veneno de serpiente, que escinde cGAMP, anuló este efecto (Fig. 4C). Para ensayar además si cGAMP está presente en partículas lentivirales, los inventores transfectaron células productoras de virus con cGAMP marcado con biotina. Las cantidades de virus sedimentadas se rociaron en una membrana de nailon que luego se sondeó con estreptavidina. De hecho, era detectable la biotina-cGAMP en preparaciones de virus (Fig. 4D). Queda por determinar si la incorporación de cGAMP en las partículas de virus es un proceso selectivo o se basa en la difusión. Es probable que la envoltura lipídica del VIH-1 incluya cGAMP en la partícula de virus tras la gemación de una célula infectada. De acuerdo con esta noción, el adenovirus no envuelto producido en células reconstituidas con cGAS no indujo IFN en células recién infectadas (Fig. 2E, F).
Tomados en conjunto, estos datos muestran que cGAMP puede empaquetarse en viriones lentivirales envueltos e induce IFN vía STING en células recién infectadas. Estos resultados tienen implicaciones para la terapia génica y la vacunación ya que la incorporación de cGAMP en vectores lentivirales, que se producen normalmente en células 293T deficientes en cGAS, puede ser indeseable en el primer caso pero ventajosa en el último caso. De hecho, las cantidades de virus que contienen cGAMP indujeron de manera potente IFN y la expresión de la molécula coestimuladora CD86 en células dendríticas humanas sin suministro de Vpx (Fig. 5).
La vía de cGAS se caracteriza únicamente empleando la pequeña molécula difusible cGAMP y esto tiene implicaciones interesantes para la inducción de respuestas inmunes innatas. Por ejemplo, cGAMP puede difundirse desde células infectadas por virus a través de uniones gap hasta células vecinas no infectadas, en las que se induce un estado antiviral vía STING. Aquí, los inventores muestran que cGAMP puede empaquetarse adicionalmente en partículas de VIH-1 y que la infección de las células diana da como resultado el suministro de cGAMP en el citosol y la posterior activación de STING. Este mecanismo de caballo de Troya permite que las células infectadas de manera productiva transfieran su conocimiento de la presencia de la infección a otras células. Esto puede actuar para ampliar el espectro de células que inician una respuesta de IFN ya que la transcripción inversa, que es inhibida en algunas células por SAMHD1, no es necesaria para la detección de virus vía transferencia de cGAMP. Además, la transferencia de cGAMP en partículas de virus puede acelerar la respuesta de IFN. Finalmente, es tentador especular que otros virus envueltos llevan cGAMP en sus viriones. En resumen, los inventores han identificado un mecanismo novedoso mediante el cual se transfiere entre células una señal de inmunidad innata.
Materiales y métodos
Plásmidos
Las construcciones FLAG-m-cGAS, FLAG-m-cGAS-G198A/S199A y m-Sting-HA pcDNA se han descrito en otra parte (Sun et al, 2013, Science, 339, 786-791; Burdette et al, 2011, Nature, 478, 515-518). pNL4-3-deltaE-EGFP era del programa de reactivos del SIDA del NIH. pCAAGS-THOV-G era de G. Kochs. pGreenFire-ISRE se adquirió de System Biosciences. pSIV4+, pVSV-G, p125-F-Luc y pRL-TK se han descrito anteriormente (Rehwinkel et al., 2013, eMbOJ, 32, 2454-2462; Rehwinkel et al., 2010, Cell, 140, 397-408).
Células
Los BMDM se obtuvieron de médula ósea fresca utilizando el sobrenadante de L929 al 20% como se describe (Rehwinkel et al., 2013, EMBO J, 32, 2454-2462). Las células dendríticas humanas se obtuvieron de monocitos CD14+ con 40 ng/ml de GM-CSF y 40 ng/ml de IL-4 (Peprotech) durante 5 días. La pureza de las células dendríticas era >95% según la tinción DC-SIGN. Se aislaron monocitos CD14+ de las PBMC utilizando columnas de separación MACS y microperlas CD14 (Miltenyi). Las PBMC se recolectaron de conos de leucocitos de DC (NHS Blood & Transplant, Bristol, Reino Unido) utilizando lymphoprep (Alere, Reino Unido). Se cultivaron células HEK293 y células 293T en medio DMEM. Se cultivaron células THP1, BMDM y células dendríticas humanas en medio RPMI 1640. Todos los medios contenían FCS al 10% y glutamina 2 mM. Se añadieron adicionalmente 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 2-mercaptoetanol 50 pM al medio RPMI utilizado para los BMDM y las células dendríticas humanas.
Anticuerpos, transferencia Western y FACS
El anticuerpo a-hSTING era de Cell Signalling (n° de cat. 3337s; 1:1000) y se utilizó para la transferencia Western con anticuerpo secundario acoplado a HRP (GE Healthcare Life Science; n° de cat. NA934; 1:5000). Los anticuerpos conjugados con HRP a-FLAG y a-actina eran de Sigma (n° de cat. A8592, 1:5000 y A3854, 1:10000). El a-CD86 PE (clon IT2.2) y el a-CD209 (DC-SIGN) APC (clon eB-h209) eran de eBioscience. Se utilizó 1 pg/ml de DAPI (Sigma Aldrich) para excluir las células muertas. Los datos de FACS se obtuvieron en analizadores de células Beckmann Coulter CyAn o BD Biosciences LSRFortessa.
Ratones
Se han descrito anteriormente animales deficiente en STING (Mpys-/-) (Jin et al, 2011, The Journal of Immunology, 187, 2595-2601) y tienen un fondo de C57BL/6. Se obtuvieron los fémures y tibias de animales sacrificados humanitariamente de 2 a 3 meses de edad y de animales de control de tipo salvaje C57BL/6 emparejados por género. Este trabajo se realizó de acuerdo con la Ley de animales (Procedimientos Científicos) de Reino Unido de 1986 y las pautas institucionales para el cuidado de los animales. Este trabajo fue aprobado por una licencia de proyecto concedida por el Ministerio del Interior de Reino Unido (PPL N° 40/3583) y también fue aprobado por la Junta de Revisión del Comité de Ética Animal Institucional de la Universidad de Oxford.
Bioensayo de IFN
Se generaron células indicadoras de IFN humano transduciendo células HEK293 con lentivirus derivado de pGreenFire-ISRE. Se establecieron clones únicos limitando la dilución y se seleccionó el clon 3C11 en base a su capacidad de respuesta al IFN. Para el bioensayo, las células se recubrieron con sobrenadante de cultivo celular y, después de 24 horas, se cuantificó la expresión de luciferasa utilizando el sistema de ensayo de luciferasa One-Glo (Promega) según las instrucciones del fabricante. El límite de detección del bioensayo es 1,6 U/ml de hIFNa2 (R&D systems) como se muestra en la figura 2C.
RT Q-PCR
Se han descrito la extracción de ARN de las células, la transcripción inversa y la PCR cuantitativa (Rehwinkel et al., 2013, EMBO J, 32, 2454-2462). Los reactivos de ensayo Predeveloped Taqman que contienen cebadores y sonda fluorescente para ARNr 18S humano, IFNp, IFI-44 y iFiT 1 y para Ga PDH, IFIT1 y IFI-44 murino eran de Applied Biosystems.
Producción de HIV-1-GFP
Se produjo HIV-1-GFP pseudotipado con VSV-G en células 293T transfectadas con pNL4-3-deltaE-EGFP, pVSV-G y m-cGAS (o m-cGAS-AA) en una proporción de 2:1:2 utilizando FuGene HD (Promega, n° de cat. E2311). Se produjo el virus pseudotipado THOV-G con pCAAGS-THOV-G en lugar de VSV-G y utilizando una relación de plásmido de 1:1:1. El medio se reemplazó al día siguiente. En este punto, se añadieron DEVD (60 pM; A0835, Sigma) y GW4869 (20 pM; D1692, Sigma) en algunos experimentos. Después de 48 horas adicionales, se filtraron los sobrenadantes (0,22 pm) y, si se requirió, se concentraron mediante centrifugación sobre una base de sacarosa al 20% (64,000 g, 2,5 horas, 4 °C). Se determinaron los títulos virales como unidades infecciosas/ml mediante infección de células 293T con una serie de diluciones de cantidades de virus, seguido de análisis FACS de la expresión de GFP.
Se produjo HIV-1-GFP que contenía biotina-cGAMP como anteriormente en células 293T transfectadas con pNL4-3-deltaE-EGFP, pVSV-G y biotina-cGAMP (Biolog, n° de cat. 157-001) en una proporción de 2:1:1,6 utilizando FuGene HD.
Se produjeron las VLP transfectando células 293T con pSIV4+ (deficiente en Vpx), pVSV-G y m-cGAS o m-cGAS-AA en una proporción de 2:1:2. El medio se cambió al día siguiente. Después de 48 horas adicionales, se recogieron las VLP y se procesaron como el HIV-1-GFP (véase arriba).
Infección por HIV-1-GFP
Se sembraron 105 HEK293 en 24 pocillos. Después de 24 horas, se añadieron cantidades de virus en presencia de polibreno (8 pg/ml). 18 horas después se cambió el medio. Después de 48 a 72 horas adicionales, se recolectaron los sobrenadantes y las células para el bioensayo de IFN y el análisis FACS o el análisis RT Q-PCR, respectivamente.
Para el ensayo del promotor indicador de IFNp, se transfectaron adicionalmente las células con 125 ng de p125-F-Luc y con 25 ng de pRL-TK utilizando Lipofectamine 2000. Esto se realizó 6-8 horas antes de la infección. Se analizó la actividad de luciferasa 24 horas después de la infección y la actividad de F-Luc se normalizó a R-Luc.
En algunos experimentos, se trataron las células durante 1 hora antes de la infección con nevirapina (5 pM; n° de cat.
4666; programa de reactivos del SIDA del NIH) o raltegravir (5 pM; n° de cat. 11680; programa de reactivos del SIDA del NIH). Alternativamente, las cantidades de virus o el plásmido cGAS se pretrataron con DNasa I (40 pg/ml; Roche, 11284932001) durante 1 hora a 37 °C antes de la infección.
Se sembraron 4-8x105 BMDM en 12 pocillos y, después de la incubación O/N, se infectaron en presencia de polibreno (8 pg/ml) mediante infección por rotación (1100 g; 90 min; temperatura ambiente). Después, se eliminó el inóculo y se añadió medio fresco. El sobrenadante y las células se recolectaron 24 horas después. Se detectó mIFNa mediante ELISA como se describe en (Rehwinkel et al., 2013, EMBOJ, 32, 2454-2462).
Se sembraron 0,5x105 células dendríticas humanas en 24 pocillos y se infectaron durante 2 horas en presencia de polibreno (8 pg/ml). Se lavó el inóculo y las células se incubaron durante 48 horas con medio fresco. Las células se recolectaron para el análisis FACS y el sobrenadante se ensayó con el bioensayo de IFN.
Adenovirus
El adenovirus se produjo en células HEK293 transfectadas con m-cGAS o m-cGAS-AA utilizando FuGene HD o en células no transfectadas. 2 horas después de la transfección, se infectaron las células con el virus AdenoCreGfp (n° de cat. 1700, Vector Biolabs) a una MOI de 1. Se recolectó el virus de las células 48 horas después mediante tres ciclos de congelación, descongelación y sonicación.
Se infectaron células HEK293 frescas durante 18 horas. Después, las células se lavaron y se les proporcionó un nuevo medio. Después de 48 horas adicionales, se recolectaron los sobrenadantes para su análisis con el bioensayo de IFN y se recogieron las células para el análisis FACS.
Virus Sendai
El virus Sendai era de LGC Standards (n° de cat. VR-907). Las células se infectaron mediante la adición de virus Sendai al medio de cultivo.
Extracciones de moléculas pequeñas y estimulación de THP1
El método para la extracción de moléculas pequeñas de viriones se adaptó de (Ablasser et al., 2013, Nature, 498, 380­ 384). Los viriones sedimentados se resuspendieron en tampón de lisis (Triton X-100 al 1%, Tris.Hcl 10 mM pH 7,4, NaCl 1 mM, EDTA 1 mM y MgCl2 3 mM) y se dejó en hielo durante 20 min. Se clarificaron los lisados mediante centrifugación durante 10 min a 1000 g a 4 °C. Para eliminar los ácidos nucleicos, las muestras se trataron durante 45 min con 50 U/ml de benzonasa (Sigma) en hielo. A continuación, se eliminaron las proteínas mediante dos extracciones secuenciales de fenolcloroformo seguidas de un lavado con cloroformo para eliminar las trazas de fenol. Se filtró el extracto utilizando filtros centrífugos Amicon Ultra de 3 kDa (Millipore, n° de cat. UFC500396) y el filtrado se concentró mediante centrifugación al vacío. Las muestras se resuspendieron en 20 pl de agua y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.
La actividad de cGAMP en estos extractos se midió utilizando un protocolo adaptado de (31). Se sembraron 100000 células THP-1 tratadas con 30 ng/ml de PMA en placas de 96 pocillos y se dejaron durante la noche. Después, se lavaron las células con medio y se recubrieron con 25 pl de tampón de permeabilización (10 pg/ml de digitonina, Hepes 50 mM pH 7,4, KCl 100 mM, MgCl23 mM, DTT 0,1 mM, sacarosa 85 mM, BSA al 0,2%, At P 1 mM y GTP 0,1 mM) que contenía extractos de virión o 2'3'-cGAMP estándar (n° de cat. C161-005, Biolog) durante 30 min a 37 °C. A continuación, se lavaron las células con medio y se añadió 75 pl de medio fresco. Después de 24 horas, se ensayó el sobrenadante en el bioensayo de IFN.
En algunos experimentos, se incubaron 5 pl de extracto o 1 pg de cGAMP en Tris 50 mM pH 8,8, MgCl210 mM con o sin 0,002 unidades de SVPDE (n° de cat. P3243, Sigma) a 37 °C durante 1 hora. Después, los extractos tratados y el cGAMP se diluyeron en serie en tampón de permeabilización y se añadieron a las células THP1 como anteriormente.
Dot blot
Se resuspendieron las preparaciones de virus en tampón de lisis (Triton X-100 al 1%, Tris.HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 1 mM, EDTA 1 mM y MgCh 3 mM) y se transfirieron sobre una membrana de nailon (membrana Zeta-probe GT, n° de cat. 162-0197, Biorad), que se dejó secar y se reticuló por UV (UV Stratalinker 2400; 2x autocross link, 120000 pJ/cm2). Se detectó biotina-cGAMP con estreptavidina-HRP (n° de cat. 3310-9, Mabtech, 1:1000). Se inactivó la HRP con azida sódica al 0,2% y se validó la ausencia de señal residual exponiendo la membrana durante una hora. Después, la membrana se volvió a sondear con a-p24 de ratón (n° de cat. 4313, Advance Bioscience Laboratory, 1:5000) seguido de a-HRP de ratón (n° de cat. NA931VS, GE Healthcare Life Sciences, 1:3000).
Ejemplo 2
Resultados
Para estudiar la función de cGAS, los inventores buscaron manipular su expresión en las DC (células dendríticas) derivadas de monocitos humanos. Generaron un vector lentiviral que expresa cGAS, produjeron partículas lentivirales e infectaron monocitos con el sobrenadante viral libre de células antes de diferenciarlos en las DC. En el día 4 de diferenciación, la mayoría de las DC diferenciadas expuestas al virus con cGAS expresaron CD86 y, por lo tanto, se activaron, aunque la eficacia de la transducción como se indica por la expresión de la proteína fluorescente indicadora BFP fue baja (Fig. 6A). Por el contrario, la infección con un lentivirus que codifica sólo para BFP transdujo de manera eficaz monocitos pero no aumentó el porcentaje de las DC activadas, en comparación con las células no expuestas al virus (Fig. 6A). Esto confirmó que el proceso general de infección por vector lentiviral no es detectado por los monocitos y las DC y que no podría ser responsable de inducir la activación observada en el caso del vector lentiviral de cGAS. De manera importante, las DC estaban completamente diferenciadas, como se muestra por la expresión de DC-SIGN y la regulación por disminución de CD14 (Fig. 7A). El vector lentiviral de cGAS también activó las DC que estaban completamente diferenciadas antes de la infección (Fig. 7B, Fig. 7C). Esto indicó que estaba presente una señal inmune innata activadora y estaba asociada con el proceso aparente de infección de las DC con un vector lentiviral que expresa cGAS.
La expresión eficaz de un gen codificado por lentivirus en las DC requiere la proteína lentiviral Vpx que alivia una restricción constitutiva a la infección por VIH impuesta por SAMHD1, por tanto conduce a una transducción eficaz de las células por el vector. Para verificar si se requería la expresión de cGAS en la célula diana para la activación de las células, los inventores omitieron la proteína Vpx del procedimiento de transducción. En este caso, la restricción de SAMHD1 está activa e impide la transducción eficaz, como se muestra por la falta de detección de la proteína fluorescente indicadora BFP con el virus de control (Fig. 6A, paneles inferiores). Inesperadamente, la activación de las DC por el lentivirus con cGAS se conservó sin Vpx (Fig. 6A, 8B), lo que sugiere que no se requería la expresión de cGAS en las células diana. La activación no se restringió a la expresión de CD86 ya que las DC también produjeron la citocina IP-10 inducible por interferón tipo I (gen CXCL10) (Fig. 6C). Para confirmar esta observación y excluir que un nivel bajo de transducción del vector con cGAS fuera responsable de la activación, los inventores produjeron partículas similares a virus HIV-1 (VLP) que no contenían un genoma lentiviral en las células que expresan cGAS de un plásmido no lentiviral (Fig. 7D). El sobrenadante que contenía VLP de las células que expresan cGAS activó las DC en la misma medida que el vector lentiviral competente en la transducción, medido por la expresión de CD86 (Fig. 6D) y la producción de IP-10 (Fig. 6E). Por tanto, el sobrenadante de las células que producen partículas virales y expresan cGAS puede transmitir una señal innata a las células inmunes.
Para determinar la naturaleza de esta señal, los inventores primero fraccionaron los sobrenadantes virales sobre un filtro de 10 kDa. El retenido indujo de manera eficaz la expresión de CD86 y la producción de IP-10 en los monocitos, mientras que se agotó la actividad de filtrado, lo que indica que la actividad era llevada por componentes mayores de 10 kDa (Fig. 8A, Fig. 8E). Después, los inventores realizaron ultracentrifugación diferencial, para separar los diversos tipos de vesículas encerradas en membranas liberadas por las células en su medio, denominadas colectivamente vesículas extracelulares (EV), de los factores solubles. Primero sedimentaron los restos celulares (2000 g), seguidos de vesículas grandes tales como ampollas apoptóticas (10000 g) y, finalmente, pequeñas EV que incluyen exosomas y virus (100000 g). Sorprendentemente, se recuperó el sobrenadante del cultivo después de que estas ultracentrifugaciones habían perdido casi completamente la capacidad de activar monocitos (Fig. 8B). Por el contrario, se recuperó la mayor parte de la actividad en el sedimento de 100,000 g, que contenía Gag así como algunas proteínas asociadas al exosoma, las tetraspaninas CD63, CD9 y CD81 y la sintenina-1 citosólica (Fig.8B, Fig.8C, Fig. 8D). También estuvo presente alguna actividad en el sedimento de 10,000 g, que solo contenía Gag y ningún marcador de exosoma, mientras que los restos celulares más grandes que contenían solo trazas de Gag (no mostrados) mostraron una actividad marginal (Fig. 8B, Fig. 8C, Fig. 8D). Estos resultados muestran que la señal innata transferida por las células que expresan cGAS a las DC está contenida en pequeñas EV, que incluye las partículas virales que contienen Gag, en vez de ser un factor soluble difusible.
La señal innata que se transmite por las EV podría estar mediada por el empaquetamiento y la transferencia de la proteína cGAS a las células diana. Los inventores no favorecieron esta hipótesis porque no pudieron detectar la proteína cGAS en los sobrenadantes sedimentados (Fig. 7D). Como posibilidad alternativa, el segundo mensajero cGAMP podría por tanto transmitir la señal innata. cGAMP es una pequeña molécula de 675 Da producida en el citosol y, por tanto, podría empaquetarse en las partículas virales y en las EV, ya que estas estructuras contienen citosol de las células productoras.
Los inventores razonaron que si cGAMP estaba presente en las partículas virales derivadas de células, deberían activar una respuesta de interferón tipo I de una manera dependiente de STING pero independiente de cGAS. Transfectaron una construcción indicadora de interferón con o sin un plásmido STING en las células 293FT que carecen de expresión de cGAS detectable (datos no mostrados). El suministro de cGAMP sintético con lipofectamina o la transfección del plásmido de expresión de cGAS activó el indicador solo en presencia de STING, validando el ensayo (Fig. 9A, Fig. 9C). Las VLP que se produjeron a partir de células que expresan cGAS activaron el indicador en presencia de STING, pero no se detectó activación sin STING o cuando las partículas se produjeron en ausencia de cGAS (Fig. 9A). Los sobrenadantes de células que expresaban cGAS que no produjeron las VLP fueron mucho menos efectivos al activar el indicador (Fig. 9A). Por lo tanto, las partículas virales pueden transmitir una señal innata de cGAS en las células producidas con STING en las células diana. Para demostrar además que cGAMP estaba presente en las partículas virales, los inventores utilizaron un bioensayo basado en las THP-1 permeabilizadas y una línea celular indicadora de IFN (Fig. 9B). Extrajeron pequeñas moléculas de células productoras virales y sedimentaron las VLP. Como se esperaba, la actividad de cGAMP se detectó a partir de células transfectadas con cGAS, pero no en las células de control. Sorprendentemente, también se detectó actividad de cGAMP en las VLP sedimentadas y esta actividad se perdió cuando se utilizó el mutante catalítico de cGAS E225A/D227A (Fig. 9B).
Para confirmar que la actividad medida en los extractos correspondía a cGAMP, los inventores realizaron el análisis de espectrometría de masas utilizando cGAMP sintético. Detectaron la presencia de cGAMP en las VLP sedimentadas. En general, estos datos proporcionan fuertes indicaciones de que las partículas virales empaquetan y transfieren el segundo mensajero cGAMP.
Después, los inventores examinaron qué componentes eran necesarios para transmitir cGAMP. La transmisión de cGAMP por las partículas virales se anuló cuando se utilizó cGAS E225A/D227A, lo que indica que se requiere una proteína cGAS funcional (Fig. 10A). Las VLP se produjeron expresando las proteínas virales Gag/Pol y la proteína de envoltura viral fusogénica VSV-G. Omitir la expresión de o Gag/Pol o VSV-G o ambos disminuyó la capacidad de los sobrenadantes para inducir CD86 e IP-10 en las DC (Fig. 10A, 10B). La ausencia de VSV-G disminuyó más fuertemente la activación de las DC (Fig. 10A, 10B), lo que indica que el material extracelular fusogénico es el principal factor de activación de las DC. Los inventores confirmaron que las VLP que contenían Gag todavía estaban presentes en el sobrenadante en ausencia de VSV-G, y que las EV que contenían VSV-G se secretaban en ausencia de Gag (Fig. 10C). En general, esto indica que cGAS y las EV competentes en fusión que incluyen partículas virales, son necesarias para transmitir cGAMP.
La expresión de VSV-G por las células conduce a la producción de estructuras tubulovesiculares. Para excluir que la transmisión de cGAMP era una especificidad de VSV-G, los inventores produjeron VLP que llevaban proteínas de la envoltura de influenza H1N1 y H5N1 en lugar de VSV-G. Tales partículas, que se produjeron en presencia de cGAS, activaron los monocitos en todos los casos (Fig. 10D, Fig. 11A, Fig. 11E). Después, los inventores consideraron si el empaquetamiento de cGAMP y la transferencia a las células diana eran específicos de las partículas de VIH-1. Produjeron VLP a partir de otro retrovirus, el gammaretrovirus del MLV, y encontraron que también podían transmitir cGAMP (Fig. 10E, Fig. 11B, Fig. 11D). Finalmente, examinaron si las partículas de VIH-1 que expresan la proteína de envoltura BaL CCR5-trópico de tipo salvaje podían transferir cGAMP. De hecho, encontraron que las partículas de VIH-1 producidas con cGAS podrían transmitir cGAMP y activarse en una respuesta inmune innata en células diana (Fig. 10F, Fig. 11C, Fig. 11E). Por tanto, el empaquetamiento y transferencia de cGAMP a las células diana es una propiedad general de las partículas retrovirales de orígenes diferentes.
En conjunto, los presentes resultados proporcionan la evidencia de que cGAMP puede transferirse entre células en virtud del empaquetamiento en las partículas virales o las EV competentes en fusión, que define un nuevo mecanismo de transmisión de señales inmunes innatas (Fig. 12). La propagación de las respuestas innatas se atribuye generalmente a la producción de citocinas que incluye los interferones. Las señales innatas resultantes inducen la producción de moléculas efectoras. De manera interesante, algunos efectores antivirales pueden empaquetarse en partículas virales y EV, tal como APOBEC3G, pero los efectores no inducen directamente una respuesta inmune innata en las células diana. cGAMP tiene la capacidad de difundirse entre células que están conectadas físicamente por uniones gap. La transferencia viral de cGAMP no requiere un contacto directo entre las células, lo que puede permitir la transmisión de una molécula de señalización innata en el organismo o durante la transmisión entre huéspedes. Este proceso podría maximizar la inducción rápida de respuestas efectoras en las células diana. De manera interesante, los dinucleótidos cíclicos inmunoestimuladores que son producidos por bacterias pueden administrarse a la célula diana e inducir una señal inmune innata, que proporciona un atractivo paralelo con la transferencia viral mediada del cGAMP.
Los presentes resultados indican adicionalmente que las EV derivadas de células no virales que podrían ser exosomas también pueden transmitir cGAMP hasta cierto punto. De acuerdo con este hallazgo, las EV pueden transmitir ARN celular entre células. Sin embargo, la transmisión de cGAMP es de baja eficacia en ausencia de una proteína de envoltura viral fusogénica. Los inventores especulan que la etapa de fusión de la membrana con la membrana de la célula diana es limitante en el caso de las EV de células no infectadas. Sin embargo, además de su función como un sensor viral, el cGAS parece contribuir a establecer el nivel tónico de genes inducidos por interferón en ratones no infectados, lo que juega un papel crucial en la determinación de la susceptibilidad posterior a la infección. Aunque todavía no se conoce si esta función de cGAS requiere la síntesis de cGAMP, la transmisión de cGAMP por las EV huéspedes podría contribuir a establecer la respuesta tónica de interferón.
Los inventores demuestran que la vectorización de cGAMP mediante la VLP de la presente invención es mucho más eficaz que 2'3'-cGAMP complejado con lipofectamina (es decir, las MLV Gag VLP y las HIV Gag VLP son aproximadamente 1000 veces más eficaces) y que 2'3'-cGAMP en la inducción de la maduración de las células dendríticas (es decir, las MLV Gag VLP y las HIV Gag VLP son aproximadamente 10000 veces más eficaces) (Fig. 14).
Los inventores proponen que el empaquetamiento de cGAMP en las partículas virales puede interpretarse como un proceso de etiquetado inmune. Esto puede permitir que las células infectadas sigan identificando a los virus de la progenie como no propios o peligrosos, para alertar a las células objetivo posteriores. Es tentador especular que otras moléculas de señalización también están empaquetadas y diseminadas mediante partículas virales.
Por último, el empaquetamiento de cGAMP expresando su enzima sintetizadora en células que producen partículas virales proporciona una estrategia atractiva para vectorizar dinucleótidos cíclicos inmunogénicos para terapias y vacunas.
Materiales y métodos
Células
Se cultivaron células 293FT y HL-116 como se describió previamente (Lahaye et al, 2013, Immunity, 39, 1132-1142). Se aislaron los monocitos de sangre humana adulta periférica como se describió previamente (Lahaye et al, supra). Los monocitos se cultivaron y diferenciaron en células dendríticas en medio RPMI con Glutamax, FBS al 10% (Biowest o GIBCO), Penicilina-estreptomicina (GIBCO), Gentamicina (50 mg/ml, GIBCO) y HEPES (GIBCO) en presencia de GM-CSF humano recombinante (Miltenyi) a 10 ng/ml e IL-4 (Miltenyi) a 50 ng/ml. Se cultivaron las THP-1 en medio RPMI con Glutamax, FBS al 10% (GIBCO), Penicilina-estreptomicina (GIBCO).
Construcciones
El marco de lectura abierto de cGAS WT humano se amplificó mediante PCR a partir de ADNc preparado de células dendríticas derivadas de monocitos. El marco de lectura abierto de cGAS WT murino se amplificó mediante PCR a partir de ADNc preparado de células dendríticas C57BL6 derivadas de médula ósea murina. El mutante de cGAS E225A/D227A humano se obtuvo mediante mutagénesis por PCR superpuesta. El ntcGAS se obtuvo mediante mutagénesis por PCR superpuesta para generar una variante de cGAS que no es dirigible por los ARNhc descritos previamente (Lahaye et al, supra). La secuencia mTagBFP2 (Subach et al, 2011, PLoS One, 6, e28674) se generó sintéticamente (Invitrogen). Se describieron previamente los plásmidos pSIV3+, psPAX2, pCMV-VSV-G y pTRIP-CMV (Satoh et al, 2013, Methods Mol Biol, 960, 401 -409). Se clonaron BFP-2A, BFP-2A-FLAG-ntcGAS, BFP2AFLAG-cGAS E225A/D227A, Puro-2A en pTRIP-CMV. Los vectores no lentivirales se basaron en el plásmido de expresión de mamíferos pcDNA3.1-Hygro(+) (Invitrogen). Se clonaron ratón WT, cGAS humano WT, cgAs E225A/D227A humano, PSTCD-cGAS y PSTCD-cGa S ADBD en pcDNA3.1-Hygro(+) mediante PCR. El dominio transcarboxilasa de Propionibacterium shermanii (PSTCD) es una proteína de unión a estreptavidina (Fukata et al., 2013, J Cell Biol, 202, 145-161). Se generó PSTCD-cGAS ADBD eliminando las regiones de aminoácidos K173-I220 y H390-C405 por PCR superpuesta. La isoforma humana de cGAS se utilizó en todos los experimentos excepto que se indique lo contrario. Se clonó el marco de lectura abierto de STING humano mediante pCr a partir del clon IMAGE 5762441. Este clon codifica un residuo de histidina en la posición 232, que se mutó en un residuo de arginina mediante mutagénesis por PCR superpuesta (Diner et al, 2013, Cell reports, 3, 355-1361). Se clonó STING R232 en pMSCVhygro (Addgene) mediante PCR. En todas las construcciones finales, los fragmentos de ADN completos que se originaron de la PCR y que abarcan los sitios de restricción utilizados para la clonación se verificaron completamente mediante secuenciación. Se obtuvo el plásmido IFNp-pGL3 del laboratorio de Olivier Schwartz, Instituto Pasteur. Los plásmidos de envoltura de influenza que codifican para H1, H5 y N1 se obtuvieron del laboratorio de Adolfo García-Sastre, Mount Sinai Medical Center. Se expresó Gag/Pol de MLV a partir de pCL-10A1 (Naviaux et al., 1996, J Virol, 70, 5701-5705). La construcción R5GFP CCR5-trópico competente en replicación fue NL4-3/BaL env, Anef, que codifica GFP en nef, descrita previamente (Lahaye et al, supra).
Virus
Se produjeron las partículas virales como se describió previamente a partir de células 293FT (Lahaye et al, supra). Se produjeron partículas virales lentivirales y partículas similares a virus transfectando 1 gg de psPAX2 y 0,4 gg de pCMV-VSV-G junto con 1,6 gg de un plásmido de expresión de mamífero o un plásmido de vector lentiviral por pocillo de placa de 6 pocillos.
Para el virus NL4-3/BaL env CCR5 trópico, se cotransfectaron 1,6 pg del plásmido pcDNA3.1-Hygro(+)-ms cGAS con 1,4 pg del plásmido R5GFP. Para las VLP pseudotipadas de influenza, se cotransfectó 1 pg de plásmido pcDNA3.1-Hygro(+)-ms cGAS con 1 pg de psPAX2 y 0,5 pg de o H1 o H5 y 0,5 pg de plásmidos que codifican N1. Para las partículas virales del VLM, se mezclaron 1,6 pg de pTRIP-CMV-BFP-2A o pTRlP-CMV-BFP2A-FLAG-ntcGAS con 1 pg de pCL-10A1 y 0,4 pg de pCMV-VSV-G. Cuando se omitieron psPAX2 y/o pCMV-VSV-G, se sustituyó la misma cantidad de ADN por pcDNA3.1-Hygro(+). Se filtraron sistemáticamente los sobrenadantes de células que contenían los virus sobre filtros de 0,45 pM.
Para las cGAMP OVA VLP y las cGAMP VLP utilizadas en la Fig. 14, las partículas virales se concentraron y purificaron como sigue. Se cargaron 34 ml de sobrenadante bruto procedente de 293FT en tubos de centrífuga Ultra-Clear (Beckman Coulter) encima de 6 ml de una base de sacarosa (Sigma) (disuelto en PBS al 20%) y se ultracentrifugaron a 100000 g en un rotor SW32 (Beckman Coulter). El sedimento viral recuperado se resuspendió en 13 ml de PBS y se transfirió a nuevos tubos de centrífuga Ultra-Clear y se ultracentrifugó a 100000 g en un rotor SW41 (Beckman Coulter). Después, el sedimento recuperado se resuspendió en 750 pl de PBS para las cGAMP OVA VLP o en 1350 pl de PBS para las cGAMP VLP. Se transfirieron tres alícuotas de 50 pl de cada preparación en un tubo separado para la extracción de cGAMP, la infección de monocitos y el ELISA de p24/p27, respectivamente. Después, todas las alícuotas se congelaron a -80 °C hasta su uso posterior.
Infecciones
Se sembraron 50000 monocitos recién aislados o las DC diferenciadas del día 4 en placas de fondo en U de 96 pocillos y se infectaron en un volumen final de 200 pl con Protamina (Sigma) a 8 pg/ml en presencia de GM-CSF recombinante humano (Miltenyi) a 10 ng/ml y IL-4 (Miltenyi) a 50 ng/ml. Se realizaron infecciones con las VLP pseudotipadas de envoltura de influenza y los virus VIH1 NL4-3/BaL env con una etapa de espinoculación adicional a 1200 g, 25 °C durante 2 horas. Cuando se indicó, se administró Vpx añadiendo 50 pl de las SIVmac VLP producidas como se describió previamente (Lahaye et al, supra). Se añadió AZT (Sigma) a 25 pM. Para el ensayo de luciferasa, se utilizaron las VLP producidas en presencia o ausencia de pcDNA3.1-Hygro(+)-ms cGAS para infectar 293FT en un volumen final de 2,5 ml con Protamina a 8 pg/ml.
Transferencia Western
Se separaron las células 293FT con PBS y los sedimentos celulares se lisaron en tampón de muestra (SDS al 2%, glicerol al 10%, Tris-HCl 0,05 M pH 6,8, azul de bromofenol al 0,025%, DTT 0,05 M). Se filtraron los sobrenadantes de virus a 0,45 pm y se centrifugaron a 16000 g durante 2 horas a 4 °C. A menos que se indique lo contrario, los sedimentos de virus se lisaron en 65 pl de tampón de muestra. Los lisados de proteínas celulares y virales se resolvieron en geles SDS-PAGE al 4%-20% (Biorad) y se transfirieron sobre membrana de nitrocelulosa (Biorad). Se transfirieron las proteínas con anticuerpos como sigue: anti-Gag monoclonal de ratón (clon 183-H12-5C-producido en la casa), etiqueta anti-VSV monoclonal de ratón (clon P5D4-producido en la casa), anti-MB21 D1 policlonal de conejo (Sigma), anti-actina monoclonal de ratón (clon C4-Millipore), sobrenadante del hibridoma R187 para Gag de MLV (Chesebro et al, 1983, Virology, 127, 134-148) (proporcionado por Marc Sitbon y Jean-Luc Battini), anti-CD9 monoclonal de ratón (clon MM2/57-Millipore), anti-CD81 monoclonal de ratón (clon B-11-Santa Cruz Biotechnology), anti-CD63 monoclonal de ratón (clon H5C6-BD Bioscience), anti-sintenina-1 policlonal de conejo (proporcionado amablemente por Pascale Zimmerman) (Zimmermann et al, 2001, Molecular Biology of the cell, 12, 339-350) y estreptavidina-HRP (Pierce) en el caso de proteínas PSTCD-cGAS. Se registró la señal ECL en el ChemiDoc XRS Biorad Imager. Los datos se analizaron con Image Lab (Biorad).
Ensayo de luciferasa
Las células 293FT se cultivaron en placas en una placa de 24 pocillos. Al día siguiente, se transfectaron las células con 300 ng de ADN total que comprendía IFNp-pGL3 y el vector vacío pTRIP-CMV-Puro-2A o pMSCVhygro-STING R232 con TransIT-293 (Mirus). Al día siguiente, se retiró el medio y se reemplazó con 2,5 ml de sobrenadante bruto procedente de células productoras de 293FT. Se administró 3'3'-cGAMP (InvivoGen) con transfección de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) (1 pg de 3'3'-cGAMP:1 pl de Lipofectamine 2000) en un volumen final de 500 pl. Después de 24 horas, se lavaron las células con PBS y se lisaron con tampón de lisis pasivo (Promega) y se utilizaron 10 pl del lisado para realizar el ensayo de luciferasa. Se midió la actividad de luciferasa utilizando reactivo de ensayo de luciferasa (Promega). Se obtuvo la luminiscencia en un lector de microplacas FLUOstar OPTIMA (BMG labtech).
Extracción de cGAMP y bioensayo
El ensayo se adaptó de los protocolos descritos previamente (Woodward et al, 2010, Science, 328, 1703-1705; Ablasser et al, 2013, Nature, 497, 380-384; Wu et al, 2012, Science, 339, 826-830). Se recuperaron las células 293FT y los sobrenadantes como se describe para la transferencia Western. Después de la centrifugación, las células y los sedimentos virales se lisaron en tampón de lisis (NaCl 1 mM, MgCl23 mM, EdTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,4, Triton X-100 al 1%) durante 20 minutos a 4 °C. Las células y los lisados virales se centrifugaron a 1000 g durante 10 min y el sobrenadante se trató con 50 U/ml de benzonasa (Sigma) durante 45 minutos a 4 °C. Después, se extrajo la suspensión utilizando fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1, v/v-Sigma) durante dos tandas, y después se lavó la fase acuosa recuperada con cloroformo (VWR Chemicals). La fase acuosa restante se cargó en una columna Amicon de 3 KDa de corte (Millipore) y se centrifugó a 14000 g durante 30 minutos. Después, la solución eluida se sometió a vacío rápido en Savant DNA Speed Vac DNA 110 a 43 °C durante 2 horas. Para las cGAMP OVA VLP y las cGAMP VLP utilizadas en la fig. 14, a una alícuota de 50 pl se añadieron 50 pl de DNasa/RNAasa libre de agua (GIBCO); los 100 pl obtenidos se lisaron después con 400 pl de metanol (VWR Chemicals) para obtener una mezcla 80/20 (v/v) de MeOH/hbO. Los lisados se sometieron a 5 ciclos de congelación y descongelación y se centrifugaron a 16000 g a 4 °C durante 20 min. Después, los sobrenadantes recuperados se sometieron a velocidad de vacío en Savant DNA Speed Vac DNA 110 a 43 °C durante 2,5 horas o a 65 °C durante 2,5 horas. Como control interno para el proceso de extracción, se enriquecieron cantidades conocidas de 2'3'-cGAMP en una mezcla 80/20 (v/v) de MeOH/H2O y se extrajeron como las preparaciones virales, omitiendo las etapas de congelar y descongelar. Los sedimentos se resuspendieron en 25 pl (extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico) o 30 pl (extracción con metanol/agua) de RNAasa-DNasa libre de agua (GIBCO) y se utilizaron en las THP-1.24 horas antes del ensayo, se resuspendieron 100000 células THP-1 en medio fresco con PMA (Sigma) a 30 ng/ml y se sembraron en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Después se lavó el PMA y las células THP-1 se trataron con las muestras resuspendidas durante la permeabilización con un tampón que contenía HEPES 50 mM (GIBCO), KCI 100 mM, MgCl23 mM, DTT 0,1 mM, sacarosa 85 mM (Sigma), ATP 1 mM (Sigma), GTP 1 mM (Sigma), BSA al 0,2% (Euromedex), digitonina al 0,001% (Calbiochem) durante 30 minutos a 37 °C, atmósfera de CO2 al 5%. Al mismo tiempo, las células THP-1 permeabilizadas se trataron con 2'3'-cGAMP sintético (InvivoGen). Después, se lavó el tampón y se añadió medio fresco en las células y se incubó durante la noche. Para muestras extraídas con MeOH/H2O, se añadieron 50 U/ml de benzonasa durante la fase de estimulación inicial. Después, se transfirió el sobrenadante en células HL-116 para medir la actividad del interferón como se describe (Lahaye et al, supra).
Filtración
Se transfectaron células 293FT con 1,6 pg de pTRIP-CMV-BFP-2A-FLAG-ntcGAS, 1 pg de psPAX2 y 0,4 pg de pCMV-VSV-G y se trataron como se describió previamente para la producción del virus. Después, se recuperó el sobrenadante y se centrifugó en un tubo de Amicon de 10 kDa de corte (Millipore) durante 30 minutos a 4000 g a 4 °C. Se resuspendió el retenido en los medios de DC descritos previamente. El retenido resuspendido y la fracción filtrada se utilizaron después para tratar los monocitos como se describió previamente.
Fraccionamiento
Se agotó el medio RPMI con Glutamax que contenía FBS al 10% y penicilina-estreptomicina de las EV bovinas mediante centrifugación durante la noche a 100000 g y luego se filtró a 0,22 pm. Se transfectaron 293FT como se describe para los virus. 12 horas después de la transfección, el medio se reemplazó con medios agotados de EV. 30 horas más tarde, se recuperó el sobrenadante y se filtró a 0,45 pm. Las vesículas se aislaron del medio acondicionado mediante etapas de untracentrifugación secuencial: 20 minutos a 2000 g (centrífuga de sobremesa); 25 minutos a 9000 rpm (ultracentrífuga XL-100K Beckman con rotor SW55Ti, factor_k=1759,27, fracción de 10000 g); 1 hora a 30000 rpm (ultracentrífuga XL-100K Beckman con rotor SW55Ti, factor_k=169,44, fracción de 100000 g). Se suspendió cada sedimento en o 50 pl de PBS (transferencia Western) o 600 pl de medios agotados de EV (infección de monocitos). El sobrenadante restante de la fracción de 100000 g se utilizó solo para la infección de monocitos.
Citometría de flujo
Se realizó la tinción de la superficie celular en PBS, BSA al 1% (Euromedex), EDTA 1 mM (GIBCO). Los anticuerpos utilizados fueron anti-CD86 PE humano (clon IT2.2-eBioscience), anti-CD14 FITC humano (clon 61 D3-eBioscience) y anti-DC SIGN PE humano (clon 120507-R&D Systems). Las células se tiñeron durante 15 minutos a 4 °C, se lavaron dos veces y se fijaron en paraformaldehído al 1% (Electron Microscopy Sciences). Los datos se obtuvieron en un FACSVerse (BD) o un Accuri C6 (BD) y se analizaron en FlowJo.
Cuantificación de proteínas IP-10
Se midió la concentración de IP-10 en diluciones puras o de 10 veces (fracción de 100000 g, partículas virales pseudotipadas de influenza, virus NL4-3/BaL env) de sobrenadantes de monocitos tratados. Se midió la concentración de IP-10 con un ensayo citométrico de IP-10 humano (BD) según el protocolo del fabricante. Los datos se obtuvieron en un BD FACSVerse (BD) y se analizaron en FCAP Array (BD).
Estadísticas
Los análisis estadísticos se realizaron en Prism (GraphPad).
Espectrometría de masas
Los extractos obtenidos después del procedimiento de extracción de cGAMP se diluyeron (1/1000, 1/100 o 1/10) en la solución A de acetonitrilo/agua (al 2% (v/v), ácido fórmico al 0,1% (v/v)) y se analizaron (1 pl) utilizando un sistema HPLC capilar dividido activamente (Ultimate 3000, Dionex, Germering, Alemania) conectado a un espectrómetro de masas QSTAR Elite tiempo de vuelo de cuadrupolo (Q-TOF) (Applied Biosystems/MDS SCIEX). La separación de la muestra se logró en una columna analítica C18 (75 pm de d.i. x 150 mm de largo, empaquetada con partículas de 3 pm con un tamaño de poro de 100 Á, C18 PepMapTM, Dionex SA) utilizando una elución isocrática B de 30 min (B al 5% (v/v), A al 95% (v/v), con fase móvil B, acetonitrilo/agua al 80% (v/v), ácido fórmico al 0,085% (v/v)) a 200 nl/min.
La adquisición de datos se realizó utilizando el software Analyst QS (2.0), configurado para el modo de iones positivos con un voltaje de electropulverización (ESI) de 2,2 kV. El escaneo de encuesta TOF-MS se obtuvo durante 1 s en un intervalo de masa de 300-800 m/z. Después, se utilizó un método de adquisición de productos para obtener exploracines de iones de productos de iones m/z 675,1 a la energía de colisión (CE) de 40 eV por ciclo de 2 s sobre un intervalo de masa de 50-680 m/z y tres exploraciones de iones de productos en el modo de pseudo monitorización de la reacción seleccionada (pseudo-SRM) de iones m/z 675,1 a la CE de 30 eV por ciclo de 1 s sobre el intervalo de masa 520-530 m/z, a la CE de 60 eV por ciclo de 1 s sobre el intervalo de masa 120-170 m/z y a la CE de 40 eV por ciclo de 1 s sobre el intervalo de masa de 460-490 m/z.
Ejemplo 3
Resultados
Los inventores buscaron determinar si la transferencia de cGAMP mediante partículas virales se produciría a niveles fisiológicamente relevantes de expresión de cGAS. Las células HeLa expresan la proteína cGAS. Las células HeLa no contenían cantidades detectables de cGAMP intracelular en estado estacionario, pero se detectó después de la estimulación del ADN. La alteración del gen cGAS por CRISPR/Cas9 en HeLa anuló la producción de cGAMP después de la estimulación del ADN. A continuación, los inventores recolectaron el material extracelular sedimentable de HeLa control, HeLa estimulada por ADN o HeLa transfectada con plásmidos codificantes de las VLP (que también proporcionan un estímulo de ADN). Se detectó cGAMP en el material de todas las HeLa estimuladas por ADN, de acuerdo con que se empaquetara en vesículas extracelulares (EV) y partículas virales (Figura 13A). Sin embargo, solo las VLP derivadas de HeLa indujeron la producción de IP-10 en células THP-1 tratadas con PMA, y no las EV de HeLa control o HeLa estimulada por ADN (Figura 13B). Para averiguar que se transfirió cGAMP, los inventores ensayaron el material en el ensayo de indicador luciferasa STING. Las VLP derivadas de HeLa, pero no las EV de HeLa estimulada por ADN, activaron el promotor de interferón de una manera dependiente de STING (Figura 13C). En general, estos datos demuestran que las partículas virales y las EV empaquetan el cGAMP producido por cGAS endógeno, pero solo el material viral puede transferir de manera eficaz el segundo mensajero cGAMP.
Métodos
Transfección de HeLa
Se sembraron 0,8 millones de células HeLa por pocillo en una placa de 6 pocillos y se transfectaron el mismo día. La transfección se realizó con 7,5 gl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y 4 gg de ADN total. En el caso de las transfecciones del vector vacío, se administraron 4 gg de pcDNA3.1-Hygro(+). En el caso de las VLP, se transfectaron 3,5 gg de psPAX2 y 0,5 gg de pCMV-VSV-G. En el caso de HIVGFP, se transfectaron 3,5 gg de HIVGFP env-nef- y 0,5 gg de pCMV-VSV-G. El medio se cambió después de 14-16 horas. El sobrenadante se recogió luego, después de 28-30 horas y se filtró sistemáticamente a 0,45 gm. Para la extracción de cGAMP y estimulación de THP-1, se centrifugó primero el sobrenadante a 2000 g durante 20 minutos a 4 °C, y después se cargaron 30 ml en tubos de centrífuga Ultra-Clear (Beckman Coulter) y se ultracentrifugó a 100000 g en un rotor SW32 (cortador Beckman). Para el ensayo de indicador luciferasa IFN-p, se omitió la centrifugación a 2000 g. Los sedimentos ultracentrifugados obtenidos se resuspendieron en RPMI FBS al 10% (GIBCO), PenStrep para tratar THP-1, en DMEM FBS al 10% (GIBCO), PenStrep para el ensayo de indicador luciferasa IFN-p y en 500 gl de tampón de lisis (NaCl 1 mM, MgCl23 mM, EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,4, Triton X-100 al 1%) para la extracción de cGAMP. Las células se recuperaron mediante tripsinización, se sedimentaron, se lavaron con PBS, se resuspendieron en tampón de lisis para la extracción de cGAMP y luego se congelaron a -80 °C.
Estimulación de THP-1
Se sembraron 100000 células THP-1 el día antes de la estimulación en una placa de 96 pocillos de fondo plano en medio fresco que contenía PMA (SIGMA) a 30 ng/ml. Antes de la estimulación, el medio se reemplazó con medio fresco y después las células se trataron con el material ultracentrifugado resuspendido en presencia de 8 g/ml de Protamina (SIGMA). 48 horas después de la estimulación, se recogió el sobrenadante y se almacenó a 4 °C hasta la cuantificación de IP-10.
Cuantificación de proteínas IP-10
Se midió la concentración de IP-10 en diluciones puras o de 10 veces de sobrenadantes de THP-1 tratadas. Se midió la concentración de IP-10 con un ensayo citométrico de IP-10 humano (BD) según el protocolo del fabricante. Los datos se obtuvieron en un BD FACSVerse (BD) y se analizaron en FCAP Array (BD).
Ensayo de luciferasa
Se cultivaron en placas 45000 células 293FT en una placa de 24 pocillos. Al día siguiente, las células se transfectaron con 500 ng de ADN total que comprendía 200 ng de IFNp-pGL3 y 300 ng del vector vacío pMSCV-hygro o pMSCV-hygro-STING R232 con TransIT-293 (Mirus). Para las transfecciones de RIG-I N228, se cotransfectaron 150 ng de pCAGGS-FlagRIGIN228 con 150 ng del vector vacío o que expresaba STING. Al día siguiente, se retiró el medio y se reemplazó con 380 gl del material sedimentado resuspendido en presencia de 8 gg/ml de Protamina (SIGMA). En el caso de los sedimentos de HIVGFP env-nef-(G) las células 293FT se trataron con AZT 25 gM (SIGMA) y nevirapina 10 gM (SIGMA). Se administró 2'3'-cGAMP (InvivoGen) con transfección con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) (1 gg de 2'3'-cGAMP:1 gl de Lipofectamine 2000) en un volumen final de 380 gl. Después de 24 horas, las células se lavaron con PBS y se lisaron en tampón de lisis pasivo (Promega). Se utilizaron 10 gl del lisado para realizar el ensayo de luciferasa. La actividad de luciferasa se midió utilizando reactivo de ensayo de luciferasa (Promega). Se obtuvo la luminiscencia en un lector de microplacas FLUOstar OPTIMA (BMG labtech).
Extracción de cGAMP y bioensayo
Se recuperaron las células y los sobrenadantes como se describe. Los lisados se sometieron a 5 ciclos de congelación descongelación. Después, los lisados se hirvieron a 95 °C, se enfriaron en hielo y se centrifugaron en una centrífuga de sobremesa a 16000 g durante 20 minutos a 4 °C. Después, se recuperó el sobrenadante y se trató con 50 U/ml de benzonasa (Sigma) durante 45 minutos a 4 °C. Después, la suspensión se extrajo utilizando fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1, v/v-Sigma) durante dos tandas, y la fase acuosa recuperada se lavó después con cloroformo (VWR Chemicals). La fase acuosa restante se cargó en una columna Amicon de 3 KDa de corte (Millipore) y se centrifugó a 14000 g durante 30 minutos. Después, la solución eluida se sometió a vacío rápido en Savant DNA Speed Vac DNA 110 a 65 °C durante 2 horas. Se resuspendió el sedimento en RNAasa-DNasa libre de agua (GIBCO) y se utilizó en las THP-1.24 horas antes del ensayo, se resuspendieron 100000 células THP-1 en medio fresco con PMA (Sigma) a 30 ng/ml y se sembraron en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Después se lavó el PMA y se trataron las células THP-1 con las muestras resuspendidas durante la permeabilización con un tampón que contenía HEPES 50 mM (GIBCO), KCI 100 mM, MgCl23 mM, DTT 0,1 mM, sacarosa 85 mM (Sigma), ATP 1 mM (Sigma), GTP 1 mM (Sigma), BSA al 0,2% (Euromedex), digitonina al 0,001% (Calbiochem) durante 30 minutos a 37 °C, atmósfera de CO2 al 5%. Al mismo tiempo, las células THP-1 permeabilizadas se trataron con 2'3'-cGAMP sintético (InvivoGen). Después, se lavó el tampón y se añadió medio fresco a las células y se incubó durante la noche. Después, se transfirió el sobrenadante en las células HL-116 para medir la actividad del interferón como se describe.
Bioensayo cuantitativo para los IFN
Se analizaron los sobrenadantes de las células estimuladas con THP-1 para determinar la actividad de IFN con la línea celular HL116, que lleva un indicador de luciferasa controlado por el promotor 6-16 inducible por IFN, como se describió previamente (Uze' et al., 1994). En resumen, las células indicadoras se expusieron a los sobrenadantes de los cultivos celulares durante 5 horas y se analizaron para las actividades de luciferasa (Promega), que después se tradujeron a actividades de IFN utilizando una curva estándar generada a partir de una dilución en serie de IFNalpha-2a humano (ImmunoTools).
Ejemplo 4
Resultados
Para ensayar la actividad de las cGAMP-VLP para controlar el crecimiento tumoral en el entorno de vacunación profiláctica, los inventores trataron ratones con las Ova-cGAMP-VLP, las cGAMP-VLP de control, proteína Ova cGAMP o proteína Ova CpG (Figura 15A, B). El día 11 después de la inmunización, se detectaron células T CD8+ específicas de Ova con las Ova-cGAMP-VLP pero no con las VLP de control (Figura 15C). Se injertó un tumor que expresaba Ova el día 14. El día 25, se confirmó y aumentó la presencia de la respuesta de células T CD8+ específicas de Ova (Figura 15D). En ratones no tratados y ratones vacunados con las cGAMP-VLP de control o proteína Ova cGAMP, se observó crecimiento tumoral (Figura 15E). Por el contrario, los ratones tratados con Ova-cGAMP-VLP y proteína Ova CpG estaban completamente protegidos del crecimiento tumoral. Por tanto, esto establece que las Ova-cGAMP-VLP son funcionales in vivo como vacuna profiláctica para inducir respuestas de células T CD8+ y prevenir el crecimiento tumoral.
Después, para ensayar la actividad de cGAMP como inmunomodulador terapéutico en la ausencia de antígenos tumorales, los inventores injertaron un tumor que expresaba Ova en ratones y el día 12 se trataron intratumoralmente con las cGAMP-VLP o con control (Figura 15F, 15G). En ratones tratados con las cGAMP-VLP, se detectó una respuesta de células T CD8+ específica de Ova, pero no en ratones tratados con control. (Figura 15H). Esto establece que las cGAMP-VLP pueden proporcionar una señal inmunomoduladora terapéutica para inducir una respuesta de células T CD8+ específica de tumor.
Métodos
Ratones y vacunación
Se adquirieron ratones hembra C57BL/6J de 5/6 semanas de edad de Charles River France. Para el cuidado y uso de los animales utilizados aquí se aplicó estrictamente la normativa europea y nacional para la protección de animales vertebrados utilizados para fines experimentales y otros fines científicos en vigor (licencia de instalación #C75-05-18). También se cumplió con los principios establecidos internacionalmente de sustitución, reducción y refinamiento de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NRC 2011). Se inyectaron los ratones o por vía subcutánea (s.c.) en las almohadillas de las patas o intratumoralmente (i.t.).
Cuantificación de las respuestas de las células T CD8+
10 días después de la inyección de las VLP, se recogieron muestras de sangre mediante punción retroorbital y se midieron las respuestas de las células T CD8+ específicas de Ova utilizando el análisis del tetrámero y cuantificación de células productoras de IFN-g mediante ELISPOT. Se tiñeron las células sanguíneas totales con tetrámero H-2Kb/SIINFEKL conjugado con PE (Beckman Coulter), anticuerpos anti-CD8 y anti-TCR (BD Biosciences), seguido de lisis de glóbulos rojos para cuantificar las células T CD8+ específicas de Ova. Las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo estándar LSR-II (BD Biosciences) y los datos de FACS se analizaron utilizando el software FlowJo. Se acotaron las células del tetrámero+ en las células TCR+ CD8+. Al mismo tiempo, se midieron las células T CD8+ o CD4+ específicas de OVA que producen de IFNy mediante ELISPOT en las PBMC después de la lisis de los glóbulos rojos. En resumen, se revistieron microplacas (Multiscreen HTS IP, Millipore) con anticuerpo anti-IFNY murino (Diaclone). Se cultivaron las PBMC (0,2 x 106/pocillo) durante la noche en presencia de o medio de control o del péptido OVA restringido de clase I 257-264 (SIlNFEKL) (10 pM) (Polypeptide Group, Estrasburgo, Francia) en medio completo (RPMI-Glutamax, suero de ternera fetal al 10%, antibióticos, p-mercaptoetanol). Se realizó la detección con un anti-IFN biotinilado (pares emparejados, Diaclone) seguida de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Mabtech) y revelada utilizando el sustrato apropiado (Biorad). Las manchas se contaron utilizando un sistema de lectura ELISPOT ELR02 (AID, Alemania) y los resultados se expresaron como el número de células productoras de citocinas por 0,2 x 106 PBMC.
Cuantificación de las respuestas de anticuerpos específicos de OVA
12 días después de la inmunización, se recogieron los sueros mediante punción retroorbital y se midieron las inmunoglobulinas específicas de OVA mediante ELISA estándar. Brevemente, se revistieron placas Maxisorp de 96 pocillos a 4 °C con OVA (10 pg/ml) en tampón carbonato/bicarbonato. Después de bloquear con PBS-leche al 5% durante 2 horas, se añadieron sueros diluidos en serie durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de un lavado extenso, se añadieron IgG, IgG1 o IgG2b anti-ratón conjugadas con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch) a cada pocillo y las placas se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado extenso, se midió la actividad de la fosfatasa alcalina añadiendo el sustrato CDP-star® Ready-to-Use (Applied Biosystems). Se leyeron las microplacas utilizando un luminómetro Centro LB 960 (Berthold) y se compararon los sueros de muestra con una curva estándar positiva para expresar los resultados en unidades arbitrarias (AU).
Ensayos de tumores in vivo
Se administraron 0,5 x 106 células B16F10-OVA por vía subcutánea en el flanco afeitado de los ratones. Se midió el crecimiento tumoral dos veces por semana utilizando un calibre para determinar el tamaño del tumor, calculado como (largo x ancho2)/2). Los ratones se sacrificaron cuando el tumor alcanzó los 2 cm3.
Para los experimentos de prevención de tumores, se inyectaron ratones con las VLP (Ova-cGAMP-VLP:11 ng de cGAMP estimados y 10 ng de p30 de MLV por inyección) y se inyectaron s.c. células tumorales 14 días después. Para el entorno terapéutico tumoral, se inyectaron células tumorales s.c. y cuando los tumores alcanzaron los 30-100 mm3 se inyectaron i.t. los ratones con las VLP (cGAMP-VLP:33 ng de cGAMP estimados y 43 ng de VIH p24 por inyección).
Ejemplo 5
Se sabe que cGAMP envía señales a través del receptor STING que conduce a la producción de IFN-p. Para ensayar si las cGAMP-VLP activan una respuesta de IFN-p in vivo, los inventores midieron la concentración de IFN-p en el suero de los ratones 3 horas después de la inyección subcutánea de las Ova-cGAMP-VLP, cGAMP-VLP, proteína Ova cGAMP, proteína Ova CpG o PBS. Los inventores de hecho observaron que las VLP que contenían cGAMP y cGAMP sintético, pero no CpG o PBS, indujeron la producción de IFN-p (Figura 16A). De manera similar, detectaron IFN-p en el suero 3 horas después de la inyección intratumoral de las cGAMP-VLP, pero sin PBS. Por tanto, las cGAMP-VLP conducen a la inducción de IFN-p in vivo.
A continuación, los inventores deseaban determinar si la inmunogenicidad de las Ova-cGAMP-VLP en un entorno de vacunación profiláctica requería la presencia de cGAMP en las VLP. De hecho, se mostró previamente que cGAMP era un adyuvante. De manera importante, las propiedades adyuvantes se detectan normalmente en dosis de antígeno subóptimas y, por tanto, fue necesario ensayar varias dosis de las VLP. Para ensayar esta idea, los inventores inyectaron ratones por vía subcutánea con dosis de las Ova-cGAMP-VLP, OVA-VLP sin cGAMP, proteína Ova cGAMP y proteína Ova CpG (Figura 17A). 11 días después de la inyección, los inventores midieron las respuestas de IFN-g específicas de Ova mediante ELISPOT (Figura 17B). A la dosis más alta de las VLP (1 dosis), tanto las OvacGAMP-VLP como las OVA-VLP inducen una respuesta de IFN-g específica de Ova por las células T CD8+ y, por tanto, no revelaron un efecto adyuvante del cGAMP contenido en las Ova-cGAMP-VLP (Figura 17C). Por el contrario, a una dosis más baja de las VLP (1/3 de dosis), solo las Ova-cGAMP-VLP, pero no las OVA-VLP, indujeron respuestas de IFN-g específica de Ova por las células T CD8+. Por tanto, se requiere la presencia de cGAMP en las VLP para inducir un efecto adyuvante en un entorno de vacunación.
Métodos
Ensayo de concentración de IFN-p en suero
Se recogieron sueros de ratones 3 h después de la inmunización con las diversas vacunas. Después, se midió el IFN-p mediante ELISA utilizando el kit VeriKine-HS (PBL laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante.
(Véase los métodos del ejemplo 4).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una partícula similar a virus que comprende una envoltura lipoproteica que incluye una glicoproteína fusogénica viral, en donde dicha partícula similar a virus contiene monofosfato de guanosina-monofosfato de adenosina cíclico (cGAMP) empaquetado en dicha partícula similar a virus, para uso en el tratamiento del cáncer.
2. La partícula similar a virus para uso según la reivindicación 1, en donde la partícula similar a virus comprende además una cápside de retroviridae.
3. La partícula similar a virus para uso según la reivindicación 1 o 2, en donde la glicoproteína fusogénica viral es una glicoproteína de retroviridae (que incluye lentivirus y retrovirus), herpesviridae, poxviridae, hepadnaviridae, flaviviridae, togavoridae, coronaviridae, virus de la hepatitis D, orthomyxoviridae, paramyxoviridae, filoviridae, rhabdoviridae, bunyaviridae u orthopoxivridae (p. ej., variola), preferiblemente de orthomyxovirus, retrovirus, rhabdovirus
4. La partícula similar a virus para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la glicoproteína fusogénica viral es una glicoproteína del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) que incluye VIH-1 y VIH-2, influenza que incluye influenza A (p. ej., los subtipos H5N1 y H1N1) e influenza B, thogotovirus o VSV (virus de la estomatitis vesicular).
5. La partícula similar a virus para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde la cápside retroviral es de retroviridae, preferiblemente lentivirus y retrovirus.
6. La partícula similar a virus para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde la cápside retroviral es de VIH o VLM (virus de la leucemia murina).
7. La partícula similar a virus para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde los dinucleótidos cíclicos son 2'-3'-GMP-AMP cíclico.
8. La partícula similar a virus para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde los dinucleótidos cíclicos son 3'-3'-GMP-AMP cíclico.
9. La partícula similar a virus para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en donde comprende además un antígeno o cualquier otra proteína o ácido nucleico de interés, preferiblemente un antígeno asociado al tumor o una combinación de los mismos.
10. La partícula similar a virus para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde se utiliza en combinación con un antígeno o un agente activo terapéutico.
11. La partícula similar a virus para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la partícula similar a virus se va a administrar por vía intravenosa, subcutánea o intratumoral.
12. La partícula similar a virus para uso según la reivindicación 11, en donde la partícula similar a virus se va a administrar por vía intratumoral.
13. Una composición farmacéutica, de vacuna o veterinaria que comprende una partícula similar a virus según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y al menos un antígeno asociado al tumor.
14. La composición farmacéutica, de vacuna o veterinaria según la reivindicación 13, en donde el al menos un antígeno asociado al tumor está incluido en la partícula similar a virus.
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