ES2834698T3 - Medios y métodos para tratar el HBV - Google Patents

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Tanja Bauer
Anna Kosinska
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Abstract

Un vector de vacunación recombinante que expresa (a) una proteína de la envoltura (antígeno HBs) del serotipo adw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña o grande del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura pequeña o grande es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña; y (b) una proteína central (antígeno HBc) del serotipo ayw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B; y al menos uno de los siguientes: (c) una proteína de la envoltura inmunogénica (antígeno HBs) del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos estableicda en SEQ ID NO: 1; y/o (d) una proteína central inmunogénica (antígeno HBc) del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos estableicda en SEQ ID NO: 2; y/o (e) un dominio RT inmunogénico de una polimerasa del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos estableicda en SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN
Medios y métodos para tratar el HBV
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un vector de vacunación recombinante mejorado para el tratamiento o vacunación contra el virus de la hepatitis B (HBV) así como a composiciones farmacéuticas o vacunas que comprenden dicha recombinación. La presente invención también se refiere a un vector de vacunación recombinante para su uso en un método de vacunación contra el HBV, así como a kits para la vacunación contra e1HBV.
Antecedentes
Más de 240 millones de seres humanos padecen una infección crónica por el virus de la hepatitis B (HBV). Las opciones de tratamiento aprobadas son los análogos de nucleó(t)sidos y el interferón a. Los análogos de nucleos(t)idos controlan pero no curan la hepatitis B y requieren un tratamiento costoso a largo plazo potencialmente asociado con la aparición de virus resistentes. La terapia con interferón a está limitada por los efectos secundarios y solamente es curativa en 15-20% de los pacientes.
El virus se divide en cuatro serotipos principales (adr, adw, ayr, ayw) que inducen respuestas diferenciales de anticuerpos basadas en epítopos antigénicos presentes en las proteínas de su envoltura, y en (al menos) ocho genotipos (A-I) de acuerdo con la variación general de la secuencia de nucleótidos del genoma. Los genotipos tienen una distribución geográfica distinta y se utilizan para rastrear la evolución y transmisión del virus. Las diferencias entre genotipos afectan a la gravedad de la enfermedad, el curso y la probabilidad de complicaciones, y la respuesta al tratamiento y posiblemente a la vacunación. Además, existen subgenotipos, p. ej. A1-5. En Europa Central y Estados Unidos, el genotipo predominante es A2. Sin embargo, solamente 1% de los seres humanos infectados son portadores del subgenotipo A2, mientras que la mayoría de los pacientes portan HBV de los genotipos B, C o D. Se ha demostrado que las vacunas convencionales contra el HBV proporcionan una mejor protección contra e1HBV del mismo (sub)genotipo que los antígenos del HBV incluidos en la vacuna que a otros (sub)genotipos.
Está bien establecido que el sistema inmunológico adaptativo del anfitrión es esencial para un control eficaz del HBV. Los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el antígeno de superficie pequeño de1HBV (HBsAg) previenen la propagación del virus a los hepatocitos no infectados y la seroconversión de HBsAg en anti-HBs representa el criterio de valoración clínico de la infección por HBV (Rehermann y Nascimben, Nat Rev Immunol 2005; 5: 215-29). Los pacientes que eliminan el virus desarrollan fuertes respuestas de células T CD8+ y CD4+ policlonales y multiespecíficas, mientras que la infección crónica se asocia con el agotamiento y la disfunción progresiva de las células T antivirales (Rehermann et al., J Exp Med 1995; 181: 1047-58). La observación clínica de que la infección crónica por HBV se resolvió en los receptores de trasplante de médula ósea que obtuvieron médula ósea de donantes inmunes al HBV respalda un importante papel de las células T en el control de la infección (Ilan et al., Gastroenterology 1993; 104: 1818-21). Basándose en estas observaciones, se diseñaron vacunas terapéuticas para activar respuestas de células T endógenas específicas del HBV. Sin embargo, numerosos intentos clínicos en pacientes con infección crónica solo tuvieron efectos transitorios sobre las respuestas inmunitarias anti-HBV y no lograron controlar el HBV (Kutscher et al. Microb Biotechnol 2012; 5: 270-82). La exposición continuada a niveles elevados de antígenos virales circulantes parece ser un obstáculo importante para los enfoques inmunoterapéuticos porque inducen tolerancia y disfunción de las células efectoras.
Asimismo, la combinación de la vacunación terapéutica con el tratamiento antiviral, que controla la viremia pero no tiene ningún efecto sobre los niveles de antígenos circulantes, no mejoró la eficacia de la vacuna ni el resultado clínico (Michel et al., J Hepatol 2011; 54: 1286-96).
Para facilitar el desarrollo de nuevas estrategias inmunoterapéuticas, se han desarrollado ratones transgénicos para el HBV (HBVtg), un modelo de infección crónica por HBV de transmisión vertical (Guidotti et al., J Virol 1995; 69: 6158-69). Los ratones HBVtg replican el HBV en los hepatocitos, producen HBcAg, HBsAg y el antígeno e de la hepatitis B (HBeAg) y liberan virus infecciosos en la sangre (Guidotti et al., J Virol 1995; 69: 6158-69). La expresión de los antígenos del HBV comienza alrededor del nacimiento y los ratones son inmunológicamente tolerantes a las proteínas codificadas por el HBV (Shimizu et al., J Immunol 1998; 161: 4520-9), pero esta tolerancia se puede romper (Buchmann et al., Vaccine 2013; 31: 1197-203).
El virus Vaccinia modificado Ankara (MVA) está relacionado con el virus vaccinia, un miembro del género Orthopoxvirus, en la familia de Poxviridae. El MVA se generó mediante 516 pases en serie en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa Ankara del virus vaccinia (CVA) (para una revisión, véase Mayr, A. et al. Infection 3, 6­ 14 (1975)). Como consecuencia de estos pases a largo plazo, el genoma del virus MVA resultante tenía aproximadamente 31 kilobases de su secuencia genómica suprimidas y, por lo tanto, se describió como una célula anfitriona altamente restringida para la replicación en células aviares (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)). Se demostró en una variedad de modelos animales que el MVA resultante era significativamente avirulento (Mayr, A. y Danner, K., Dev. Biol. Stand. 41: 225-34 (1978)) pero aún así aumentaron las respuestas inmunitarias protectoras contra los poxvirus. Por lo tanto, esta cepa de MVA se ha sometido a prueba en ensayos clínicos como vacuna para inmunizar contra la enfermedad de la viruela humana (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hig. I, Abt. Org. B 167, 375-390 (1987); Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974)). Estos estudios involucraron a más de 120.000 seres humanos, incluidos pacientes de alto riesgo, y demostraron que, en comparación con las vacunas basadas en vaccinia, el MVA había disminuido la virulencia y era bien tolerado, mientras que aún inducía una buena respuesta inmunitaria específica.
En las décadas siguientes, se modificó genéticamente el MVA para su uso como vector viral para la expresión de genes recombinantes o como vacuna recombinante (Sutter, G. et al., Vaccine 12: 1032-40 (1994)). Se han descrito cepas de MVA para el desarrollo de vacunas o fármacos. Véanse las Patentes de Estados Unidos Núm. 6.761.893 y 6.193.752. Tales cepas son susceptibles de replicación reproductiva en distintas células y líneas celulares no humanas, especialmente en fibroblastos de embriones de pollo (CEF), pero no son susceptibles de replicación reproductiva significativa en líneas celulares humanas conocidas por permitir la replicación de otras cepas de vaccinia conocidas.
Basándose en lo anterior, existe una necesidad en la técnica de medios y métodos mejorados que se puedan utilizar en la vacunación terapéutica contra el HBV. Estos medios y métodos deberían inducir en paralelo respuestas de anticuerpos neutralizantes y una respuesta de células T multiespecífica dirigida a múltiples subtipos de HBV.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a un nuevo vector de vacunación recombinante para el tratamiento o vacunación frente al virus de la hepatitis B (HBV) así como a composiciones farmacéuticas o vacunas que comprenden dicho MVA. La presente invención también se refiere a un método de vacunación contra e1HBV utilizando MVA recombinante. Se prevé que los medios y métodos de la presente invención induzcan tanto una respuesta de anticuerpos como una respuesta de células T contra el HBV en un sujeto, y además se prevé que la respuesta inmunitaria inducida sea eficaz contra una amplia variedad de genotipos y serotipos de HBV.
Un "vector de vacunación recombinante", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un virus o bacteria atenuados. En este contexto, "vector" se refiere al virus o bacteria utilizados como portador. Normalmente, este virus o bacteria atenuados se utilizan para introducir ácido nucleico que codifica antígenos en las células del sujeto.
Un vector de vacunación recombinante de la invención puede ser una Cepa de Salmonella atenuada. Sin embargo, alternativamente, se pueden utilizar otros microorganismos procarióticos, tales como cepas atenuadas de Escherichia coli, Shigella, Yersinia, Lactobacillus, Mycobacteria, Listeria o Vibrio. Los ejemplos de cepas adecuadas de microorganismos incluyen Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella dublin, Salmonella enteretidis, Shigella flexeneri, Shigella sonnel. Las cepas de Salmonella atenuadas son uno de los portadores de vacunas mucosas mejor caracterizados. Se han utilizado cepas de Salmonella recombinante atenuadas pero invasivas como vectores de vacunas orales para transportar epítopos protectores de varios patógenos al tejido linfoide asociado a la mucosa, induciendo así respuestas inmunitarias mucosas, sistémicas y CTL tanto contra el portador como contra los antígenos foráneos.
Adicionalmente, un vector de vacunación recombinante de la invención puede ser una cepa de Salmonella atenuada, un vector basado en CMV, VSV, un vector adenoviral o un vector del Sarampión.
Un vector de vacunación recombinante de la invención puede ser un vector viral que puede ser una partícula viral que tiene infectividad, que también es un portador para introducir un gen en una célula. Los vectores de vacunación viral son familiares para el experto en la técnica. La invención contempla particularmente un vector de poxvirus. Un poxvirus recombinante puede ser un poxvirus que se produce mediante métodos convencionales de ingeniería genética. En una realización preferida, el vector de vacunación recombinante de la invención es un MVA.
El MVA es particularmente adecuado como sistema de vectores. Se ha demostrado su potencia para ser eficaz en la inducción de respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares en un corto período de tiempo después de la vacunación, por ejemplo, contra el virus de la viruela. Se ha establecido su seguridad. Se conoce su potencia incluso para inducir una respuesta inmunitaria en sujetos inmunodeprimidos.
Sin embargo, aparte de las ventajas que tiene el MVA para su uso como vacuna contra e1HBV, el mayor desafío para una vacuna contra el HBV es que sea capaz de inducir una respuesta inmunitaria tanto humoral como celular y que esta respuesta inmunitaria se dirija preferentemente a múltiples genotipos y/o serotipos de1HBV. La elección del vector, el esquema de vacunación y los antígenos de HBV pueden contribuir a la eficacia de la vacunación.
La presente invención abarca el uso de una combinación de antígenos de HBV de diferentes genotipos y/o serotipos de HBV. Esta combinación no solamente condujo a una amplia respuesta inmunitaria contra múltiples cepas de HBV, sino también a una respuesta inmunitaria más fuerte contra cada genotipo de HBV en comparación con las vacunas que comprenden solamente antígenos de un solo genotipo de HBV. De hecho, utilizando los medios y métodos de la presente invención, los autores de la presente invención pudieron incluso superar la tolerancia inmunitaria en sujetos con niveles de antígeno bajos, medios e incluso altos.
Las vacunas basadas en MVA son ventajosas por varias razones. Por ejemplo, la cepa MVA preferida, MVA-F6 (Sutter y Staib, 2003. Curr. Drug Targets Infect. Disord. 3:263-271), crece bien en células primarias de fibroblasto de embrión de pollo (CEF) y no replica en células humanas. En las células humanas, se expresan los genes virales, así como un transgén modificado, pero no se produce ningún virus infeccioso. El rango restringido de anfitriones de MVA puede explicar el fenotipo no virulento observado in vivo en una amplia gama de especies de mamíferos, incluidos los seres humanos. Se ha demostrado que el MVA es seguro en numerosos estudios de toxicidad. La construcción, producción y uso de MVA recombinante se ha descrito en la técnica, por ejemplo en los documentos WO 97/02355, Sutter and Staib, 2003 (más arriba), y WO 2003/008533.
La presente invención contempla un vector de vacunación recombinante, preferiblemente un virus vaccinia modificado Ankara (MVA), que expresa uno o más antígenos del virus de la hepatitis B (HBV). Los uno o más antígenos se pueden seleccionar entre una proteína de la envoltura (antígeno HBs) de HBV, una proteína central (antígeno HBc) de HBV o un dominio RT de una polimerasa de HBV. La proteína de la envoltura puede ser, por ejemplo, una proteína de la envoltura del serotipo adw del HBV, tal como el serotipo adw del genotipo A de1HBV, tal como el serotipo adw2 del genotipo A2 del HBV. La proteína central puede ser, por ejemplo, una proteína central del serotipo ayw del HBV, tal como del serotipo ayw del genotipo D del HBV.
El vector de vacunación recombinante, preferiblemente MVA, de la presente invención puede expresar más de una proteína de la envoltura, en donde las más de una proteína de la envoltura pueden ser de diferentes genotipos o serotipos de HBV. Por ejemplo, el MVA de la presente invención puede expresar una proteína de la envoltura del serotipo adw del genotipo A del HBV así como una proteína de la envoltura del genotipo C. De manera similar, el MVA de la presente invención puede expresar más de una proteína central, en donde las más de las proteínas centrales pueden ser de diferentes genotipos o serotipos de HBV. Por ejemplo, el MVA de la presente invención puede expresar una proteína central del serotipo ayw del genotipo D del HBV así como una proteína central del genotipo C.
El vector de vacunación recombinante, preferiblemente MVA, de la presente invención también puede expresar una polimerasa de HBV o un dominio RT de la polimerasa de HBV. Esta polimerasa puede ser de cualquier genotipo o serotipo. La polimerasa puede ser preferiblemente una polimerasa del genotipo D de HBV.
El vector de vacunación recombinante, preferiblemente MVA, de la presente invención puede expresar (a) una proteína de la envoltura (antígeno HBs) del serotipo adw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína grande de la envoltura o una proteína pequeña de la envoltura del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B; preferiblemente una proteína pequeña de la envoltura y (b) una proteína central (antígeno HBc) del serotipo ayw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B; y al menos uno de los siguientes: (c) una proteína de la envoltura (antígeno HBs) del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, (d) una proteína central (antígeno HBc) del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2, y/o (e) un dominio RT de una polimerasa del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3. Se entiende que el MVA de la presente invención puede expresar tres, preferiblemente cuatro o lo más preferiblemente cinco antígenos de HBV, tales como los antígenos (a), ( b), (c), los antígenos (a), (b), (d), o los antígenos (a), (b), (e), los antígenos (a), (b), (c), (d), los antígenos (a), (b), (c), (e), los antígenos (a), (b), (d), (e), o los antígenos (a), (b), (c), (d), (e).
Como se emplea en la presente memoria, una "proteína de la envoltura", "antígeno HBs" o "HBsAg" de HBV se refiere al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBV). La "proteína de la envoltura", el "antígeno HBs" o el "HBsAg" se pueden relacionar con cualquiera de las tres variantes, la proteína de la envoltura pequeña, media y grande, que se traducen a partir de ARNm distintos. El epítopo determinante "a" que se encuentra en las posiciones de codón 124 a 147 dentro de la región hidrófila principal (MHR) del gen S es común a las tres variantes. Este determinante "a" es una de las principales dianas de los anticuerpos anti-HBs durante el curso de la respuesta inmunitaria inicial en la hepatitis B aguda. Los términos "proteína de la envoltura", "antígeno HBs" o "HBsAg" se pueden referir opcionalmente a un fragmento inmunogénico de la proteína de la envoltura. Un fragmento inmunogénico de una proteína de la envoltura se refiere a proteínas o péptidos derivados de cualquier proteína de envoltura completa que está N-terminal y/o C-terminalmente acortada, es decir, que carece de al menos uno de los aminoácidos N-terminal y/o C-terminal. Tal fragmento comprende preferiblemente al menos 70, preferiblemente al menos 80, preferiblemente al menos 90, preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 125, lo más preferiblemente al menos 150 aminoácidos consecutivos de la secuencia primaria de una proteína de la envoltura y normalmente es inmunogénico. Normalmente, tal fragmento inmunogénico comprende, en comparación con la proteína completa, al menos los aminoácidos 99 a 168 correspondientes a las posiciones de aminoácidos de la proteína de envoltura pequeña.
Como se emplea en la presente memoria, una "proteína central" o "antígeno HBc" de HBV se refiere a la proteína estructural de la nucleocápside. La proteína central completa tiene 183 aminoácidos de longitud y consiste en un dominio de ensamblaje (aminoácidos 1 a 149) y un dominio de unión de ácido nucleico (aminoácidos 150 a 183). El dominio de unión de ácido nucleico de 34 restos es extremadamente alcalino, con 17 argininas, de acuerdo con su función. La proteína central es dimérica en solución; estos dímeros se autoensamblan en cápsides icosaédricas. Se entiende que también las proteínas centrales truncadas, que comprenden solo los aminoácidos 1 a 149, son capaces de formar cápsides. El término "proteína central" o "antígeno HBc" se puede referir opcionalmente a un fragmento inmunogénico de la proteína central. Un fragmento inmunogénico de una proteína central se refiere a proteínas o péptidos derivados de cualquier proteína central completa que esté acortada en el extremo N-terminal y/o C-terminal, es decir, que carece de al menos uno de los aminoácidos N-terminal y/o C-terminal. Tal fragmento comprende preferiblemente al menos 100, más preferiblemente 125, lo más preferiblemente 149 o más aminoácidos consecutivos de la secuencia primaria de una proteína central y normalmente es inmunogénico. Normalmente, tal fragmento inmunogénico comprende, en comparación con la proteína central completa, al menos los aminoácidos 18 a 143 correspondientes a las posiciones de secuencia indicadas en SEQ ID NO: 11. Un ejemplo típico es un fragmento de proteína central que consiste en los aminoácidos 1 a 149 de la proteína central completa estableicda en SEQ ID NO: 11.
Como se emplea en la presente memoria, "inmunogénico" se refiere a la capacidad de una sustancia particular, tal como un antígeno o epítopo, para provocar una respuesta inmunitaria en el organismo de un ser humano o animal. En otras palabras, la inmunogenicidad es la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células. La capacidad de un antígeno para provocar respuestas inmunitarias se denomina inmunogenicidad, que puede ser una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se supone que cualquier antígeno HBs, antígeno HBc o polimerasa de HBV que se encuentre de forma natural es inmunogénico. Asimismo, se supone que hay muchas variantes de antígeno HBs, antígeno HBc o polimerasa de HBV de origen natural, en las que se intercambian, eliminan o insertan uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de origen natural. Como ejemplo ilustrativo, una variante inmunogénica de un antígeno HBs natural es un antígeno HBs, en el que el epítopo determinante "a" ha sido reemplazado por el determinante "a" de un antígeno HBs de otro serotipo. Normalmente, una variante inmunogénica de un antígeno HBs, antígeno HBc o polimerasa de origen natural puede tener una identidad de secuencia de 90% con la secuencia de aminoácidos del antígeno HBs, antígeno HBc o polimerasa naturales.
El vector de vacunación recombinante, preferiblemente MVA, de la presente invención comprende una proteína de la envoltura del serotipo adw del virus de la hepatitis B. Tal proteína de la envoltura puede ser una proteína de la envoltura pequeña, media o grande, prefiriéndose la proteína de la envoltura pequeña o grande, siendo la más preferida la proteína de la envoltura pequeña. La proteína de la envoltura es preferiblemente de genotipo A, serotipo adw (A/adw), preferiblemente de HBV A2/adw2. Sin embargo, cualquier proteína de la envoltura de origen natural o manipulada que tenga la inmunogenicidad de una proteína de la envoltura de origen natural de un HBV adw es adecuada para la presente invención. Las proteínas de la envoltura preferidas comprenden una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 08, o preferiblemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos estableicda en SEQ ID NO: 08. La proteína de la envoltura también puede tener aminoácidos adicionales en el extremo N- o C-terminal. Preferiblemente, la proteína de la envoltura tiene 30 o menos, preferiblemente 25 o menos, preferiblemente 20 o menos, preferiblemente 15 o menos, preferiblemente 10 o menos, preferiblemente 5 o menos, preferiblemente 4 o menos, preferiblemente 3 o menos, preferiblemente 2 o menos, preferiblemente 1 o menos, aminoácidos adicionales en el extremo N- y/o C-terminal. Estos aminoácidos son preferiblemente fragmentos de sitios de autoescisión, tales como P2A o T2A, que han sido descritos por Kim et al. 2011, PLoS ONE, 6 (4): e18556. Por tanto, la proteína de la envoltura comprende opcionalmente en el extremo N-terminal una prolina adicional y/o en su extremo C terminal la secuencia adicional GSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 09). Por tanto, la proteína de la envoltura puede tener una secuencia establecida en SEQ ID NO: 10.
El vector de vacunación recombinante, preferiblemente MVA, de la presente invención comprende una proteína central del serotipo ayw del virus de la hepatitis B. La proteína central es preferiblemente del genotipo D/ayw del HBV. Cualquier proteína central de origen natural o manipulada que tenga la inmunogenicidad de una proteína central de origen natural de un HBV ayw es adecuada para la presente invención. En realizaciones preferidas, la proteína central es u n fragmento de una proteína central completa que consiste en los aminoácidos 1 a 149 de la proteína completa. Las proteínas centrales preferidas comprenden una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11, o preferiblemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11. La proteína central también puede tener aminoácidos adicionales en el extremo N- o C-terminal. Preferiblemente, la proteína central tiene 30 o menos, preferiblemente 25 o menos, preferiblemente 20 o menos, preferiblemente 15 o menos, preferiblemente 10 o menos, preferiblemente 5 o menos, preferiblemente 4 o menos, preferiblemente 3 o menos, preferiblemente 2 o menos, preferiblemente 1 o menos, aminoácidos adicionales en el extremo N- y/o C terminal. Estos aminoácidos son preferiblemente fragmentos de sitios de autoescisión, tales como P2A o T2A. Por tanto, la proteína central comprende opcionalmente en el extremo N-terminal una prolina adicional y/o en su extremo C terminal la secuencia adicional establecida en SEQ ID NO: 12. Se considera que un fragmento de la proteína central que consiste en los aminoácidos completos 1 a 149 y que tiene una secuencia C terminal como se describe en la presente memoria todavía tiene la capacidad de ensamblar las cápsides y se supone que la secuencia C-terminal adicional no interfiere en la formación de la cápside.
El vector de vacunación recombinante, preferiblemente MVA, de la presente invención puede comprender una proteína de la envoltura inmunogénica (antígeno HBs) del virus de la hepatitis B que tiene al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 01. SEQ ID NO: 01 es una secuencia consenso de proteínas de la envoltura grandes de cepas de genotipo C, que se generó basándose en un alineamiento de 500 secuencias de HBV que representan la distribución mundial de cepas de HBV. Un ejemplo ilustrativo de una proteína de la envoltura inmunogénica que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 04, que tiene 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, que corresponde a la secuencia establecida derivada de la supuesta proteína prepre-S del HBV con el número de acceso GenBank ABV02797 (versión ABV02797.1 GI: 157057635 del 12 de septiembre de 2007), en la que se modificó el determinante A (la secuencia diana más importante para los anticuerpos anti-HBs) a ayw (para la formación de anticuerpos dirigidos contra el serotipo ayw) mediante el intercambio de 2 aminoácidos. La existencia de una cepa de HBV que tiene esencialmente la misma secuencia que SEQ ID NO: 04 asegura que los procesos esenciales (plegamiento/procesamiento/presentación) son funcionales para la proteína codificada. Por lo tanto, también se contempla en la invención que la proteína de la envoltura inmunogénica que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1 es una proteína de la envoltura que tiene al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98% preferiblemente al menos aproximadamente el 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 04. Por otra parte, la secuencia consenso para las proteínas de la envoltura de las cepas del genotipo C es muy similar a la secuencia consenso para proteínas de la envoltura de cepas de genotipo B. Dado que la proteína de la envoltura inmunogénica se basa en la secuencia consenso de la proteína de la envoltura para las cepas del genotipo C, que es al mismo tiempo muy similar a la secuencia consenso para la proteína de la envoltura de las cepas del genotipo B, esta proteína de la envoltura inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. contra un amplio espectro de cepas de al menos genotipo B y genotipo C. Se entiende que la proteína de la envoltura inmunogénica que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1 opcionalmente también se refiere a un fragmento inmunogénico de la misma que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con el fragmento correspondiente de SEQ ID NO: 1. La proteína de la envoltura también puede tener aminoácidos adicionales en el extremo N- o C-terminal. Preferiblemente, la proteína de la envoltura tiene 30 o menos, preferiblemente 25 o menos, preferiblemente 20 o menos, preferiblemente 15 o menos, preferiblemente 10 o menos, preferiblemente 5 o menos, preferiblemente 4 o menos, preferiblemente 3 o menos, preferiblemente 2 o menos, preferiblemente 1 o menos, aminoácidos adicionales en el extremo N- y/o C terminal. Estos aminoácidos son preferiblemente fragmentos de sitios de autoescisión, tales como P2A o T2A. Por tanto, la proteína de la envoltura comprende opcionalmente en el extremo N-terminal una prolina adicional y/o en su extremo C terminal la secuencia adicional GSGEGRGSLLTCGDVEENPG (SEQ ID NO: 13). Por tanto, la proteína de la envoltura puede tener una secuencia establecida en SEQ ID NO: 14.
El vector de vacunación recombinante, preferiblemente MVA, de la presente invención también puede comprender una proteína central inmunogénica (antígeno HBc) del virus de la hepatitis B que tiene al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 es una secuencia consenso de proteínas centrales de cepas de genotipo C que se generó basándose en el alineamiento de 500 secuencias de HBV que representan la distribución mundial de Cepas de HBV. Un ejemplo ilustrativo de una proteína central inmunogénica que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 05, que tiene 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, que es esencialmente idéntica a la secuencia derivada de la proteína de la cápside del HBV con el número de acceso GenBank NP_647607 (versión NP_647607.1 GI: 21326588 de 9 de julio de 2015). Por lo tanto, también se contempla en la invención que la proteína central inmunogénica que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 es una proteína de la envoltura que tiene al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 05. Además, la secuencia consenso para las cepas del genotipo C es idéntica a la secuencia consenso de las cepas del genotipo B. Dado que la proteína de la envoltura inmunogénica se basa en la secuencia consenso de la proteína de la envoltura para las cepas del genotipo C, que es idéntica a la secuencia de consenso para la proteína de la envoltura de las cepas del genotipo B, esta proteína de la envoltura inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra un amplio espectro de al menos cepas de genotipo B y genotipo C. Se entiende que la proteína central inmunogénica que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2 opcionalmente también se refiere a un fragmento inmunogénico de la misma que tiene al menos 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con el fragmento correspondiente de SEQ ID NO: 2. Como ejemplo ilustrativo, tal fragmento inmunogénico puede ser un fragmento que tiene 90% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1 a 149 de SEQ ID NO: 2. La proteína central también puede tener aminoácidos adicionales en el extremo N- o C-terminal. Preferiblemente, la proteína central tiene 30 o menos, preferiblemente 25 o menos, preferiblemente 20 o menos, preferiblemente 15 o menos, preferiblemente 10 o menos, preferiblemente 5 o menos, preferiblemente 4 o menos, preferiblemente 3 o menos, preferiblemente 2 o menos, preferiblemente 1 o menos, aminoácidos adicionales en el extremo N- y/o C terminal. Estos aminoácidos son preferiblemente fragmentos de sitios de autoescisión, tales como P2A o T2A. Por tanto, la proteína central comprende opcionalmente en el extremo N-terminal una prolina adicional. La proteína central puede comprender adicionalmente opcionalmente en su extremo C terminal una secuencia adicional como se establece en SEQ ID NO: 09 o 13. Por tanto, la proteína central puede tener una secuencia estableicda en SEQ ID NO: 15.
El vector de vacunación recombinante, preferiblemente MVA, de la presente invención también puede comprender un dominio RT inmunogénico de una polimerasa del virus de la hepatitis B que tiene al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3 es una secuencia consenso de dominios RT de cepas de genotipo A, B, C y D que se generó basándose en el alineamiento de 500 secuencias de HBV que representan la distribución mundial de las cepas del HBV. Un ejemplo ilustrativo de tal dominio RT inmunogénico de una polimerasa es una proteína con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6, que tiene una identidad de secuencia de 97% con SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 6 corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio RT de una polimerasa derivada de la polimerasa parcial de HBV con el número de acceso GenBank AFY09280 (versión AFY09280.1 GI: 425891330 de 31 de enero de 2013). SEQ ID NO: 6 es un ejemplo típico porque es el dominio de RT de origen natural de una polimerasa que tiene la mayor similitud con la secuencia consenso generada de los genotipos A, B, C y D. La existencia de una cepa de HBV con esta secuencia asegura que los procesos esenciales (plegamiento/procesamiento/presentación) sean funcionales para el dominio RT codificado. Por lo tanto, también se contempla en la invención que el dominio de RT inmunogénico que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 sea una proteína de la envoltura que tiene al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 06. Dado que el dominio RT de la polimerasa comprende varios epítopos altamente conservados y dado que el dominio RT de la polimerasa comprendido en el MVA de la invención se basa en la secuencia consenso del dominio RT para las cepas de genotipo A, B, C y D, este dominio RT inmunogénico de una polimerasa es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra un amplio espectro de al menos las cepas de genotipo A, B, C y D. La presente invención también prevé que el dominio RT de una polimerasa puede estar comprendido en una polimerasa completa. Por tanto, también una polimerasa completa o una polimerasa completa truncada que comprende el dominio RT inmunogénico está dentro del alcance de la invención. Se entiende que el dominio RT inmunogénico de una polimerasa que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 opcionalmente también se refiere a un fragmento inmunogénico de la misma que tiene al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con el fragmento correspondiente de SEQ ID NO: 3. El dominio RT de la polimerasa también puede tener aminoácidos adicionales en el extremo N- o C-terminal. Preferiblemente, el dominio RT tiene 30 o menos, preferiblemente 25 o menos, preferiblemente 20 o menos, preferiblemente 15 o menos, preferiblemente 10 o menos, preferiblemente 5 o menos, preferiblemente 4 o menos, preferiblemente 3 o menos, preferiblemente 2 o menos, preferiblemente 1 o menos, aminoácidos adicionales en el extremo N- y/o C terminal. Estos aminoácidos son preferiblemente fragmentos de sitios de autoescisión, tales como P2A o T2A. Por tanto, el dominio RT comprende opcionalmente en el extremo N-terminal una prolina adicional. La proteína central puede comprender adicionalmente opcionalmente en su extremo C terminal una secuencia adicional como se establece en SEQ ID NO: 13. El dominio RT puede por tanto tener una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16.
El vector de vacunación recombinante como se describe en la presente memoria, preferiblemente MVA, también puede comprender o expresar adicionalmente una molécula de CD70. Preferiblemente, el CD70 es un CD70 humano.
CD70 es el ligando de CD27 y también se conoce como CD27L. Es una proteína transmembrana de tipo II y se expresa en linfocitos altamente activados (como en linfomas de células T y B). Adicionalmente, se expresa en carcinoma de células renales y se evalúa como diana tumoral). La expresión del ligando CD70 normalmente está estrechamente regulada, sin embargo, cuando CD27L se expresa de forma constitutiva en las células B, se desarrolla una reserva extensa y eficaz de células T de tipo memoria (Arens, R. et al 2004 J Exp Med 199(11) 1595­ 605). En las infecciones virales crónicas, la señalización de CD70 puede ser relevante para el resultado.
CD27/CD70 es un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral/factor de necrosis tumoral ("TNFR/TNF") bien conocida por sus propiedades de conformación de células T. Entre CD27/CD70, esta familia incluye CD30/CD30L, CD40/CD40L, OX40/OX40L, 4-1BB/4-1BBL, GITR/GITRL y Fas/FasL. El rol de CD70, entre otros, tales como OX40L y 4-1BBL para respuestas de células T primarias y secundarias, se ha investigado en una amplia gama de modelos de enfermedades infecciosas [Hendrick et al., "CD27 is required for generation and longterm maintenance of T-cell immunity'', Nature Immunol. 1(5):433-440 (2000); Matter et al., "Virus-induced polyclonal B-cell activation improves protective CTL memory via retained CD27 expression on memory CTL," Eur. J. Immunol.
35(11):3229-3239 (2005); A. Schildknecht et al., "Priming of CD8+ T-cell responses by pathogens typically depends on CD70-mediated interactions with dendritic cells," Eur. J. Immunol. 37(3):716-728 (2007)]. Curiosamente, la regulación por incremento de moléculas co-estimuladoras incluyendo, entre otras, CD70 sobre células dendríticas ("DC") puede ser inducida por la estimulación de TLR/CD40 combinados [Sanchez et al., "Combined TLR/CD40 stimulation mediates potent cellular immunity by regulating dendritic cell expression of CD70 in vivo," J. Immunol.
178(3):1564-1572 (2007)].
Por tanto, también se contempla en la invención que el CD70 tenga al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos aproximadamente 91%, preferiblemente al menos aproximadamente 92%, preferiblemente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 94%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos aproximadamente 96%, preferiblemente al menos aproximadamente 97%, preferiblemente al menos aproximadamente 98%, preferiblemente al menos aproximadamente 99%, preferiblemente aproximadamente 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 26.
El vector de vacunación recombinante, preferiblemente MVA, de la presente invención está optimizado para la vacunación terapéutica contra un amplio espectro de HBV y comprende secuencias antigénicas de varios genotipos de HBV que ocurren con frecuencia. Por tanto, este MVA es capaz de inducir una respuesta inmunitaria frente al HBV de diferentes genotipos y serotipos. Los autores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que, en comparación con una vacuna de MVA que solamente comprende antígenos de HBV D/ayw, la combinación de un antígeno HBs de HBV A/adw con un antígeno HBc de HBV D/ayw no solo induce una amplia respuesta inmunitaria contra el HBV de los genotipos A y D, sino que también induce una respuesta de células T aún más fuerte contra el HBV D/ayw. Además, el MVA de la presente invención también puede expresar un antígeno HBs o un antígeno HBc que se basan en la secuencia consenso de cepas de HBV de genotipo C. Estas secuencias consenso de las cepas de HBV de genotipo C son además muy similares o incluso idénticas a la secuencia consenso de las cepas de genotipo B. Esto significa que el MVA de la presente invención que comprende una o ambas de estas secuencias inducirá además una amplia respuesta inmunitaria contra al menos las cepas del genotipo B y del genotipo C. Además, el MVA de la presente invención puede expresar un dominio RT de una polimerasa que se basa en la secuencia consenso de las cepas de genotipo A, B, C y D y que contienen antígenos altamente conservados. Por tanto, la introducción de este dominio RT en el MVA promoverá aún más la inducción de una amplia respuesta inmunitaria contra el HBV de al menos los genotipos A, B, C y D. El MVA de la presente invención es, por tanto, una vacuna eficaz contra el MBV de al menos los genotipos A, B, C y D.
El término "antígeno" se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos que estimulan el sistema inmunitario de un anfitrión para producir una respuesta inmunitaria específica de antígeno celular o una respuesta de anticuerpo humoral. Los antígenos pueden incluir proteínas, polipéptidos, fragmentos de proteínas antigénicas y similares. Además, el antígeno puede derivar de cualquier virus, bacteria, parásito, prión, planta, protozoo u hongo conocido y puede ser un organismo completo. El término también incluye antígenos tumorales. También se incluyen en esta solicitud antígenos sintéticos tales como poliepítopos, epítopos flanqueantes y otros antígenos recombinantes u obtenidos sintéticamente. En una realización preferida, el antígeno de la presente invención es un polipéptido o proteína.
En relación con el término "epítopo", el término "antígeno" se refiere a una secuencia (más larga), en particular una secuencia de aminoácidos o secuencia de proteína (más larga), mientras que la frase "epítopo antigénico" o "un epítopo del antígeno" abarca un tramo de secuencia más corta de la secuencia más larga. Por tanto, el término "antígeno" abarca epítopos. El término "antígeno" también incluye variantes de proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteínas antigénicas como se describe en la presente memoria. Asimismo, el término "antígeno" abarca secuencias idénticas a la secuencia nativa así como modificaciones de la secuencia nativa, tales como deleciones, adiciones, inserciones y sustituciones. Preferiblemente, una variante de antígeno tiene al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60% o 65%, al menos aproximadamente 70% o 75%, al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% o 89%, más típicamente, al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93% o 94% e incluso más típicamente al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, más típicamente, al menos aproximadamente 99% de identidad de aminoácidos con el antígeno de referencia (es decir, el antígeno del que se obtiene).
Un epítopo, también denominado en la presente memoria "epítopo antigénico", forma parte del antígeno que aún provoca una respuesta inmunitaria en un anfitrión. Sin embargo, un epítopo no se limita a la secuencia exacta del antígeno del que se obtiene. Por tanto, el término "epítopo" abarca secuencias idénticas a la secuencia nativa así como también modificaciones de la secuencia nativa, tales como deleciones, adiciones, inserciones y sustituciones. Preferiblemente, una variante de epítopo tiene al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60% o 65%, al menos aproximadamente 70% o 75%, al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% o 89%, más típicamente, al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93% o 94% e incluso más típicamente al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, más típicamente, al menos aproximadamente 99% de identidad de aminoácidos con el epítopo de referencia (es decir, el epítopo del que se obtiene).
Los mecanismos para determinar la identidad de secuencia entre dos ácidos nucleicos y aminoácidos se conocen en la técnica. Se pueden comparar dos o más secuencias (polinucleótidos o aminoácidos) determinando su "porcentaje de identidad". El porcentaje de identidad de dos secuencias, ya sean de ácido nucleico o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido por la longitud de las secuencias más cortas y multiplicado por 100.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a los antígenos o epítopos descritos en la presente memoria se define como el porcentaje de restos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácido en la secuencia de referencia (es decir, el antígeno o epítopo del que se obtiene), después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando un soporte lógico informático disponible públicamente, tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluidos los algoritmos necesarios para lograr el máximo alineamiento a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se comparan.
Lo mismo es aplicable al "porcentaje (%) de identidad de secuencia de nucleótidos", mutatis mutandis.
Por ejemplo, un alineamiento apropiado para las secuencias de ácido nucleico es proporcionado por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1981), Advances in Applied Mathematics 2:482-489. Este algoritmo se puede aplicar a secuencias de aminoácidos mediante el uso de la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EE.UU., y normalizado por Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763. Una implementación ilustrativa de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia es proporcionada por Genetics Computer Group (Madison, Wis.) en la aplicación de utilidad "BestFit". Los parámetros predeterminados para este método se describen en el Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Versión 8 (1995) (disponible en Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Un método preferido para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención consiste en utilizar el paquete de programas MPSRCH con derechos de autor de la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif.). A partir de este conjunto de paquetes, se puede emplear el algoritmo Smith-Waterman donde se utilizan parámetros predeterminados para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización por apertura de hueco de 12, penalización por extensión de hueco de uno y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor "Coincidencia" refleja la "identidad de secuencia". Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias se conocen generalmente en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, utilizado con parámetros predeterminados. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden utilizar empleando los siguientes parámetros predeterminados: código genético = convencional; filtro = ninguno; hebra = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenar por = PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos = no redundantes, GenBank EMBL DDBJ PDB traducciones de CDS de GenBank Swiss Protein Spupdate PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la siguiente dirección de Internet: http://wvw.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Los ácidos nucleicos que codifican los antígenos del HBV en el MVA de la invención pueden estar comprendidos en casetes de expresión individuales, o preferiblemente todos juntos en un solo casete de expresión. El término "casete de expresión", como se emplea en la presente memoria, abarca tanto secuencias de ADN como de ARN que son capaces de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula anfitriona apropiada. En general, comprende un promotor conectado operablemente a un polinucleótido de interés, que opcionalmente está conectado operablemente a una señal de terminación y/u otros elementos reguladores. El casete de expresión puede comprender una secuencia de nucleótidos que regula la transcripción. Un casete de expresión también puede comprender las secuencias necesarias para la traducción adecuada de la secuencia de nucleótidos. El casete de expresión puede ser uno que se produzca de forma natural pero que se haya obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. La región codificante suele codificar una proteína de interés. El casete de expresión que comprende la secuencia de polinucleótidos de interés también puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. Normalmente, el casete de expresión en la presente memoria no se produce de forma natural (es decir, heterólogo o exógeno o foráneo) en el genoma de MVA y es susceptible de transcripción en células infectadas.
La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible, que inicia la transcripción solamente cuando la célula anfitriona se expone a algún estímulo externo particular. En los casetes de expresión de la presente invención, el promotor es preferiblemente un promotor de poxvirus. Tal promotor de poxvirus puede ser un promotor natural o un promotor sintético. Como ejemplo ilustrativo, el promotor de poxvirus es un promotor Pr7.5, un promotor híbrido temprano/tardío, un promotor PrS, un promotor temprano o tardío sintético o natural tal como uno de los promotores descritos en el documento WO 2010/102822 o en el documento WO 2005/054484, o el promotor ATI del virus de la viruela vacuna Por ejemplo, el promotor de poxvirus es P7.5 (SEQ ID NO: 17) (Endo et al. J Gen Virol. Marzo de 1991; 72 (Pt 3): 699-703). Los promotores preferidos, sin embargo, son promotores que son más fuertes que P7.5, por ejemplo, el promotor PH5 como se describe en el documento US 2011/0064769 que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 18.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican el antígeno o un epítopo del mismo tienen preferiblemente codones optimizados. Una secuencia de ácido nucleico "con codones optimizados" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene codones que son reemplazados por codones preferidos por la célula anfitriona deseada, preferiblemente una célula anfitriona humana. Una secuencia de ácido nucleico se convierte en una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados que tiene una secuencia de polipéptido traducida idéntica, pero con un uso de codones alternativo, en particular utilizando los codones más frecuentes del organismo diana. El método para crear una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados de un antígeno generalmente incluye la identificación de codones en la secuencia natural de un antígeno que comúnmente no están asociados con genes de alta expresión en el organismo diana y el remplazo de los mismos por codones que se sabe que son ampliamente utilizados en la expresión génica del organismo diana. Una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados puede mostrar una expresión mejorada sobre la secuencia de origen natural en la célula anfitriona deseada. Un experto en la técnica puede examinar si una secuencia con codones optimizados inducirá una mejora en la producción de proteínas sobre la secuencia no optimizada.
La optimización de codones evita el uso de codones raros para un anfitrión deseado, ya que los codones raros pueden bloquear o reducir la expresión de la proteína codificada. Asimismo, preferiblemente se evitan las sustituciones que pueden introducir señales de ácido nucleico para el anfitrión deseado. Tales señales incluyen, pero no se limitan a, señales de corte y empalme, señales de terminación y señales de iniciación. Preferiblemente, se evitan los siguientes motivos de secuencia dependiendo del tipo de vector utilizado, p. ej., la señal de terminación de la transcripción temprana del virus vaccinia no necesita evitarse en muchos otros vectores, las cajas TATA internas, los sitios chi y los sitios de entrada al ribosoma; tramos de secuencia ricos en AT y ricos en GC; elementos de secuencia ARE, INS y CRS; secuencias repetidas y estructuras secundarias de ARN; sitios donadores y aceptores de empalme (crípticos) y puntos de ramificación; y señales de terminación de la transcripción temprana de vaccinia: (TTTTTNT).
Los mecanismos para la optimización de codones se conocen en la técnica. La sustitución de nucleótidos por diferentes nucleótidos se refiere al remplazo técnico o artificial de nucleótidos por otros nucleótidos. Preferiblemente, los nucleótidos sustituidos no alteran la secuencia de aminoácidos codificada. La sustitución se puede realizar identificando codones en las dos secuencias de nucleótidos homólogas que codifican los mismos aminoácidos y alterando los codones en una de las dos secuencias de nucleótidos homólogas de modo que los codones todavía codifiquen los mismos aminoácidos. Las alteraciones se pueden realizar en una, ambas o todas las secuencias de nucleótidos homólogas.
La invención prevé que todos los antígenos del HBV se traduzcan preferiblemente como una única cadena polipeptídica que comprenda varios antígenos. En la cadena polipeptídica, las secuencias de antígenos están preferiblemente separadas por secuencias de sitios de autoescisión. Por tanto, la cadena polipeptídica que comprende varios antígenos se escindirá postraduccionalmente en múltiples cadenas polipeptídicas, en donde cada una de las múltiples cadenas polipeptídicas puede comprender un único antígeno de1HBV. Este enfoque tiene la ventaja de que todos los antígenos del HBV se expresan a niveles aproximadamente equimolares. Una disposición preferida para la cadena polipeptídica que comprende varios antígenos es, desde el extremo N al extremo C - una proteína de la envoltura de HBV A/adw, un sitio P2A, una proteína central de HBV D/ayw, un sitio P2A, un dominio RT inmunogénico de una polimerasa del virus de la hepatitis B como se describe en la presente memoria, un sitio T2A, una proteína de la envoltura inmunogénica (antígeno HBs) de la hepatitis B como se describe en la presente memoria, un sitio T2A, una proteína central inmunogénica (antígeno HBs) de la hepatitis B como se describe en la presente memoria. En una realización preferida, la cadena polipeptídica que comprende varios antígenos comprende una secuencia estableicda en SEQ ID NO: 07. Como se muestra en la Figura 16B, las dos proteínas de la envoltura diferentes se ubicarán en una membrana celular y se pueden secretar como partículas subvirales. Estas partículas subvirales pueden comprender ambas proteínas de la envoltura que son de diferentes genotipos de HBV y pueden ser captadas por células presentadoras de antígenos, lo que puede aumentar la respuesta inmunitaria inducida. Las partículas de la proteína central pueden formar cápsides vacías, en donde las cápsides vacías pueden comprender de manera similar las proteínas centrales que son de diferentes genotipos de1HBV. Tal cápside desencadenará una respuesta inmunitaria contra múltiples genotipos del HBV. La polimerasa se degradará en el proteasoma y se presentará en un contexto de HLA. La disposición descrita en la presente memoria tiene además la ventaja de que la mayoría de las proteínas sólo parcialmente procesadas, es decir, las proteínas en las que no se ha escindido un sitio de autoescisión, se incorporarán a partículas secretadas similares a virus que supuestamente aumentarán la respuesta inmunitaria, en particular mejorarán y ampliarán la respuesta inmunitaria adaptativa (véase la Fig. 18).
La invención abarca un MVA recombinante que comprende genes del HBV incorporados en una variedad de sitios de inserción en el genoma del MVA. "Variedad de sitios de inserción" significa que los genes de HBV que codifican antígenos de HBV, respectivamente, se pueden insertar en el mismo o en uno o más sitios de inserción diferentes en el genoma de MVA, prefiriéndose el mismo sitio de inserción. Diferente significa que, por ejemplo, un primer sitio de inserción no es lo mismo que un segundo sitio de inserción.
Como ejemplo ilustrativo, los genes de HBV se pueden insertar en regiones intergénicas (IGR) del MVA. Tal IGR se puede seleccionar entre IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 e IGR 148/149. Sin embargo, se prefiere que los genes del HBV se inserten en los sitios de deleción natural I, II, III, IV, V o VI del MVA, en donde se prefiere que al menos uno o preferiblemente todos los genes del HBV estén insertados en el sitio de deleción de origen natural III. Como ejemplo ilustrativo, todos los genes del HBV pueden estar comprendidos en un único casete de expresión en un único marco de lectura abierto como se describe en la presente memoria, en donde el único casete de expresión se inserta en el sitio de deleción III de origen natural.
El virus MVA recombinante se puede generar mediante métodos de rutina conocidos en la técnica. Los métodos para obtener poxvirus recombinantes o para insertar secuencias codificantes exógenas en un genoma de poxvirus son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los métodos se describen en las siguientes referencias: Molecular Cloning, A laboratory Manual. Segunda Edición. De J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2003: describe mecanismos para técnicas convencionales de biología molecular tales como clonación de ADN, aislamiento de ADN y ARN, análisis de transferencia Western, RT-PCR y técnicas de amplificación por PCR. Virology Methods Manual. Editado por Brian W J Mahy y Hillar O Kangro. Academic Press. 1996: describe mecanismos para el manejo y manipulación de virus. Molecular Virology: A Practical Approach. Editado por AJ Davison y RM Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press en Oxford University Press. Oxford 1993. Capítulo 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors. Current Protocols in Molecular Biology. Editor: John Wiley and Son Inc. 1998. Capítulo 16, sección IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector: describe mecanismos y conocimientos para el manejo, manipulación y modificación genética de MVA.
Para la generación de poxvirus recombinantes según la presente invención, pueden ser aplicables diferentes métodos. La secuencia de ADN que se va a insertar en el virus se puede colocar en una construcción de plásmido de E. coli en la que se ha insertado ADN homólogo a una sección de ADN del poxvirus. Por separado, la secuencia de ADN que se va a insertar se puede ligar a un promotor. La conexión promotor-gen se puede colocar en la construcción de plásmido de modo que la conexión promotor-gen esté flanqueada en ambos extremos por ADN homólogo a una secuencia de ADN que flanquea una región de ADN poxviral que contiene un locus no esencial. La construcción de plásmido resultante se puede amplificar mediante propagación dentro bacterias E. coli y aislar. El plásmido aislado que contiene la secuencia del gen de ADN que se va a insertar se puede transfectar en un cultivo celular, p. ej., fibroblastos de embrión de pollo (CEF), junto con la infección de este cultivo por el poxvirus. La recombinación entre el ADN poxviral homólogo en el plásmido y el genoma viral, respectivamente, puede generar un poxvirus modificado por la presencia de secuencias de ADN foráneas.
Una célula de un cultivo celular adecuado como, p. ej., células CEF, se puede infectar con un poxvirus. Posteriormente, la célula infectada se puede transfectar con un primer vector plasmídico que comprende un gen o genes foráneos, preferiblemente bajo el control transcripcional de un elemento de control de la expresión de poxvirus. Como se explicó anteriormente, el vector plasmídico también comprende secuencias capaces de dirigir la inserción de la secuencia exógena en una parte seleccionada del genoma poxviral. Opcionalmente, el vector plasmídico también contiene un casete que comprende un marcador y/o un gen de selección conectado operablemente a un promotor poxviral. Los genes marcadores o de selección adecuados son, p. ej., los genes que codifican la proteína verde fluorescente, p-galactosidasa, neomicina-fosforribosiltransferasa u otros marcadores. El uso de casetes de selección o marcadores simplifica la identificación y el aislamiento del poxvirus recombinante generado. Sin embargo, también se puede identificar un poxvirus recombinante mediante tecnología de PCR. Posteriormente, se puede infectar una célula adicional con el poxvirus recombinante obtenido como se describió anteriormente y transfectar con un segundo vector que comprende un segundo gen o genes foráneos. En caso de que este gen se pueda introducir en un sitio de inserción diferente del genoma del poxvirus, el segundo vector también difiere en las secuencias homólogas de poxvirus que dirigen la integración del segundo gen o genes foráneos en el genoma del poxvirus. Una vez que se ha producido la recombinación homóloga, se puede aislar el virus recombinante que comprende dos o más genes foráneos. Para introducir genes foráneos adicionales en el virus recombinante, se pueden repetir las etapas de infección y transfección utilizando el virus recombinante aislado en etapas previas para la infección y utilizando un vector adicional que comprenda un gen o genes foráneos adicionales para la transfección.
Alternativamente, las etapas de infección y transfección descritas anteriormente son intercambiables, es decir, una célula adecuada puede primero ser transfectada por el vector plasmídico que comprende el gen foráneo y después infectada con el poxvirus. Como alternativa adicional, también es posible introducir cada gen foráneo en diferentes virus, coinfectar una célula con todos los virus recombinantes obtenidos y escrutar un recombinante que incluya todos los genes foráneos. Una tercera alternativa es la ligación del genoma del ADN y las secuencias foráneas in vitro y la reconstitución del genoma del ADN del virus vaccinia recombinado utilizando un virus auxiliar. Una cuarta alternativa es la recombinación homóloga en E. coli u otra especie bacteriana entre un genoma del virus vaccinia clonado como un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y una secuencia foránea lineal flanqueada por secuencias de ADN homólogas a las secuencias que flanquean el sitio de integración deseado en el genoma del virus vaccinia.
Dado que el virus MVA recombinante de acuerdo con la invención tiene una replicación muy restringida y, por lo tanto, está muy atenuado, es un candidato ideal para el tratamiento de una amplia gama de mamíferos, incluidos seres humanos e incluso seres humanos inmunodeprimidos. Por otra parte, la producción de vacunas basadas en MVA es más o menos independiente de la capacidad de producción existente para vacunas convencionales, ya que el MVA se puede cultivar convenientemente en células CEF. Por tanto, la vacuna basada en MVA de la presente invención se puede producir en grandes cantidades en un corto período de tiempo. Además, las vacunas del vector MVA de la presente invención pueden administrar múltiples antígenos del HBV y, por tanto, permiten la inducción simultánea de inmunidad celular y humoral de alto nivel. Por tanto, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica y también una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria en el organismo de un animal vivo, incluido un ser humano.
La vacuna preferiblemente comprende virus MVA en un intervalo de concentración de 104 a 109 DICT50/ ml, preferiblemente en un intervalo de concentración de 105 a 5x108 DICT5ü/ml, más preferiblemente en un intervalo de concentración de 106 a 108 DICT50/ml, y más preferiblemente en un intervalo de concentración de 107 a 108 DICT50/ml.
Una dosis de vacunación preferida para seres humanos comprende 106 a 109 DICT50, más preferiblemente una dosis de 106 DICT50 o 107 DICT50 o 108 DICT50.
La composición farmacéutica generalmente puede incluir uno o más aditivos farmacéuticamente aceptables y/o aprobados como portadores, antibióticos, conservantes, coadyuvantes, diluyentes y/o estabilizadores. Tales sustancias auxiliares pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH o similares. Los portadores adecuados son típicamente moléculas grandes de metabolización lenta, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos o similares.
El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere en la eficacia de la actividad biológica del MVA según la presente invención. Las características del portador dependerán de la vía de administración. La composición farmacéutica puede contener adicionalmente otros agentes que mejoran la actividad o la utilización en el tratamiento. Tales factores y/o agentes adicionales se pueden incluir en la composición farmacéutica que se aplicará al método de inmunización de acuerdo con la presente invención para producir un efecto sinérgico o minimizar los efectos secundarios. Las técnicas para la formulación y administración del MVA según la invención se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", (Mack Publishing Company, Easton, PA, última edición).
Para la preparación de vacunas, el MVA recombinante según la invención se puede convertir en una forma fisiológicamente aceptable. Esto se puede llevar a cabo basándose en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus utilizadas para la vacunación contra la viruela (como describen Stickl, H. et al. en Dtsch. med. Wschr.
99, 2386-2392).
Por ejemplo, el virus purificado se puede almacenar a -80°C con un título de 5x108 DICT50/ ml formulado en Tris aproximadamente 10 mM, NaCl 140 mM pH 7,4. Para la preparación de inyecciones de vacunas, p. ej., se pueden liofilizar 102-108 partículas del virus en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de peptona al 2% y albúmina humana al 1% en una ampolla, preferiblemente una ampolla de vidrio. Alternativamente, las inyecciones de la vacuna se pueden producir mediante liofilización escalonada del virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros agentes auxiliares tales como antioxidantes o gas inerte, estabilizantes o proteínas recombinantes (p. ej., albúmina de suero humano) adecuados para la administración in vivo. A continuación se sella la ampolla de vidrio y se puede almacenar entre 4°C y temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, mientras no exista la necesidad, la ampolla se almacena preferiblemente a temperaturas por debajo de -20°C.
Para la vacunación o terapia, el producto liofilizado se puede disolver en una solución acuosa, preferiblemente solución salina fisiológica o tampón Tris, y administrar sistémica o localmente, es decir, por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular o cualquier otra vía de administración conocida por el médico experto. Los expertos en la técnica pueden optimizar el modo de administración, la dosis y el número de administraciones de una manera conocida.
Se entiende que una vacuna o composición farmacéutica preferida comprende el MVA recombinante de la invención como se describe en la presente memoria. También se entiende que el MVA recombinante de la invención se puede utilizar en terapia o vacunación, preferiblemente vacunación terapéutica, preferiblemente contra HBV.
El MVA recombinante de la presente invención se puede utilizar ventajosamente para fabricar un medicamento o vacuna que sea útil para tratar y/o prevenir una afección patológica tal como una enfermedad infecciosa o hepatitis B.
La presente invención prevé adicionalmente un método de vacunación contra la hepatitis B. El método de vacunación puede ser un método de vacunación terapéutica, es decir, para el tratamiento de una enfermedad. En el método de vacunación de la invención, se administran a un sujeto un virus MVA que expresa una proteína de la envoltura de HBV adw como se describe en la presente memoria y un virus MVA que expresa una proteína central de HBV ayw como se describe en la presente memoria. El sujeto puede ser cualquier sujeto como se define en la presente memoria, preferiblemente un sujeto humano. Preferiblemente, el sujeto necesita la administración. En el método de vacunación de la presente invención, la proteína de la envoltura de HBV adw y la proteína central de HBV ayw pueden ser expresadas por dos MVA diferentes, en donde cada uno de los MVA expresa la proteína de la envoltura o la proteína central. En este caso, ambos MVA se deben administrar al sujeto. Sin embargo, la proteína de la envoltura de HBV adw y la proteína central de HBV ayw también pueden ser expresadas por el mismo MVA. En este caso, solo se debe administrar un MVA al sujeto. Se entiende que se prefiere la última realización.
Adicionalmente, la presente invención abarca un virus MVA que expresa una proteína de la envoltura de HBV adw como se describe en la presente memoria que adicionalmente expresa una molécula de CD70 y un virus MVA que expresa una proteína central de HBV ayw como se describe en la presente memoria, que adicionalmente expresa una molécula de CD70 que se administra a un sujeto. El sujeto puede ser cualquier sujeto como se define en la presente memoria, preferiblemente un sujeto humano. Preferiblemente, el sujeto necesita la administración. Adicionalmente, el sujeto es preferiblemente un paciente con hepatitis B crónica que necesita un tratamiento curativo. En el método de vacunación de la presente invención, la proteína de la envoltura de1HBV adw y la molécula CD70 y la proteína central del HBV ayw y la molécula CD70 pueden ser expresadas por dos MVA diferentes, en donde cada uno de los MVA expresa la proteína de la envoltura y CD70 o la proteína central y CD70. En este caso, ambos MVA se deben administrar al sujeto. Sin embargo, la proteína de la envoltura de HBV adw y la proteína central de HBV ayw y la molécula CD70 también pueden ser expresadas por el mismo MVA. En este caso, solo se debe administrar un MVA al sujeto. Se entiende que se prefiere la última realización.
Se entiende adicionalmente que el método de vacunación de la invención comprende la administración de un MVA de la invención a un sujeto y que el MVA está preferiblemente en una dosis eficaz.
El método de vacunación de la presente invención puede comprender al menos dos etapas de vacunación. Aquí, la respuesta inmunitaria es inducida por regímenes de cebado/refuerzo en los que se utilizan proteínas "libres", tales como una proteína de la envoltura de HBV a/adw y/o una proteína central de HBV D/ayw, para la vacunación de cebado, en donde se utilizan uno o más MVA recombinantes de la invención para al menos una vacunación de refuerzo.
Por tanto, en una primera etapa (cebado), se puede administrar al sujeto una "vacuna de proteína". El término "vacuna de proteína" como se emplea en la presente memoria se refiere a una composición que comprende proteína de la envoltura de HBV A/adw y/o proteína central de HBV D/ayw, preferiblemente la proteína de la envoltura y la proteína central. Tanto la proteína de la envoltura como la proteína central son preferiblemente proteínas "libres", lo que significa que preferiblemente no están comprendidas en partículas virales. La proteína de la envoltura y la proteína central pueden estar presentes en dos composiciones que se administran solas o combinadas entre sí. La proteína de la envoltura y la proteína central también pueden estar incluidas en una sola composición. La proteína de la envoltura o la proteína central comprendidas en la "vacuna de proteína" pueden ser producidas de manera recombinante por un microorganismo, por ejemplo por una célula bacteriana o fúngica.
Se entiende que la "vacuna de proteína" preferiblemente está esencialmente libre de partículas virales, en particular esencialmente libre de MVA. "Esencialmente libre" en este contexto significa que la vacuna de proteína comprende menos de 103 DICT50/ml, preferiblemente menos de 102 DICT50/ml, preferiblemente menos de 101 DICT50/ml, preferiblemente menos de 10° DICT5ü/ml, preferiblemente menos de 10-1 DICT5ü/ml, preferiblemente menos de 10-2 DICT5ü/ml. La vacuna de proteína puede comprender adicionalmente un coadyuvante adecuado. Como se emplea en la presente memoria, un "coadyuvante" se refiere a una sustancia que intensifica, aumenta o potencia la respuesta inmunitaria del anfitrión (mediada por anticuerpos y/o células) a un antígeno o fragmento del mismo. El experto en la técnica conoce los coadyuvantes adecuados. Un coadyuvante preferido se selecciona del grupo formado por poli[di(carboxilato-etilfenoxi)]fosfaceno (PCEP), un oligonucleótido inmunoestimulador, un agonista del receptor tipo toll (TLR), una saponina o combinaciones de los mismos, en donde el agonista de TLR es preferiblemente un agonista de TLR 3, un agonista de TLR 4, un agonista de TLR 7, un agonista de TLR 8 o un agonista de TLR 9, y en donde el oligonucleótido inmunoestimulador es preferiblemente poli I/C, poli ICLC (una forma estabilizada de poli I/C) CpG, un ligando Rig-I, un ligando de de STING, di-AMP cíclico, di-CMP cíclico, di-GMP cíclico, un agonista de TLR 7, un agonista de TLR8, CTA1DD o dmLT, o combinaciones de los mismos. Sin embargo, los autores de la presente invención han descubierto que si la vacuna de proteína comprende un coadyuvante sin aluminio, tal como por ejemplo un coadyuvante CpG o PCEP, se inducirá una respuesta de células T más fuerte mediante el método de vacunación de la presente invención. Este hallazgo es sorprendente ya que las vacunas convencionales que comprenden antígenos de HBV, tales como Engerix-B, comprenden típicamente un coadyuvante que contiene aluminio tal como hidróxido de aluminio. En consecuencia, la vacuna de proteína descrita en la presente memoria comprende preferiblemente un coadyuvante CpG o PCEP o ambos. La presente invención proporciona adicionalmente un vector de virus, preferiblemente un vector de virus MVA, en donde el coadyuvante es di-AMP cíclico.
En una etapa adicional (refuerzo), se administran al sujeto uno o más MVA recombinantes como se describe en la presente memoria. Los uno o más MVA recombinantes pueden estar comprendidos en una composición farmacéutica o vacuna como se describe en la presente memoria.
Normalmente, el MVA recombinante se administra al menos aproximadamente 1 día después de la primera vacunación, preferiblemente al menos aproximadamente 5 días, preferiblemente al menos aproximadamente 1 semana, preferiblemente de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 8 semanas, preferiblemente de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 5 semanas, preferiblemente de aproximadamente de 3 semanas a aproximadamente 4 semanas.
También está abarcado por la invención que el régimen de vacunación comprenda dos o más vacunaciones de refuerzo después de las vacunaciones de cebado. En una realización preferida, se utiliza una vacuna de proteína para la vacunación de cebado y para la primera vacunación de refuerzo. La invención también prevé que se pueda realizar una segunda, tercera o más etapas de vacunación de refuerzo utilizando la vacuna de proteína. Después de la vacunación de refuerzo con vacunas de proteínas, se lleva a cabo una vacuna de refuerzo mediante la administración de uno o más MVA recombinantes como se describe en la presente memoria. La invención también incluye que la primera administración de MVA recombinante puede ir seguida de una segunda, tercera o más administraciones (vacunaciones de refuerzo adicionales).
En tal caso, la primera vacunación de refuerzo con la vacuna de proteína se lleva a cabo al menos aproximadamente 1 día después de la etapa de vacunación anterior, preferiblemente al menos aproximadamente 5 días, preferiblemente al menos aproximadamente 1 semana, preferiblemente de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 8 semanas, preferiblemente de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 5 semanas, preferiblemente de aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 4 semanas. Cualquier vacunación de refuerzo posterior, ya sea con MVA recombinante o con una vacuna de proteína, se realiza al menos aproximadamente 1 día después de la vacunación anterior, preferiblemente al menos aproximadamente 5 días, preferiblemente al menos aproximadamente 1 semana, preferiblemente de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 8 semanas, preferiblemente de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 5 semanas, preferiblemente de aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 4 semanas.
El método de vacunación de la invención puede comprender adicionalmente un tratamiento del sujeto con ARNip y/o ARNhc antes de la vacunación de refuerzo y cebado. Se prevé que tales ARNip o ARNhc se dirijan a genes de1HBV y, por tanto, reduzcan la expresión de los genes del HBV dirigidos en un sujeto infectado con e1HBV. Preferiblemente, los ARNip y/o ARNhc se dirigen a las regiones 3' de los ARN que codifican los genes de1HBV elegidos como diana. En una realización preferida, las regiones diana 3' de los ARN que codifican los genes de1HBV diana se localizan aguas arriba de las colas poli A de los ARN (es decir, la región diana se encuentra 5' respecto a la cola poli A, o en otras palabras, en una dirección 5' a 3', la región diana es la primera, seguida de la cola poli A). Si se utilizan ARNip, se prevé que se elija como diana al menos un gen del HBV. Sin embargo, en una realización preferida se eligen como diana todos los genes del HBV. Se puede utilizar un ARNip o ARNhc para elegir como diana un gen del HBV. Sin embargo, también se puede utilizar más de un ARNip y/o ARNhc para elegir como diana un gen del HBV. Se prevé que tal tratamiento con ARNip y/o ARNhc reduzca la expresión (es decir, la traducción) de los genes diana en al menos aproximadamente 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%. Tal tratamiento del sujeto con ARNip y/o ARNhc se puede realizar entre 1 día y 20 semanas, 1 semana y 19 semanas, 2 semanas y 18 semanas, 3 semanas y 17 semanas, 4 semanas y 16 semanas, 5 semanas y 15 semanas, 6 semanas y 14 semanas, 7 semanas y 13 semanas, preferiblemente aproximadamente 8 semanas antes de comenzar con la vacunación de cebado-refuerzo. Los autores de la presente invención descubrieron sorprendentemente que tal tratamiento con ARNip y/o ARNhc antes de comenzar con la vacunación de refuerzo y cebado aumenta la respuesta de células T generada después de la vacunación de refuerzo-cebado.
El método de inmunización de acuerdo con la presente invención hará uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna de proteína o del MVA recombinante. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere adicionalmente a la cantidad de compuesto/ingrediente suficiente para dar como resultado la mejora de los síntomas, p. ej. tratamiento, curación, prevención o mejora de tales afecciones. En una realización preferida, la inmunización puede ser tanto profiláctica como terapéutica. Las dosis eficaces de la presente invención para afectar a la respuesta inmunitaria varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo el tipo de antígeno o vacuna, los medios de administración, el sitio diana, si los sujetos son seres humanos o animales, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosis preferidas de MVA recombinante se describen en la presente memoria.
La invención proporciona métodos para inmunizar un animal sujeto, incluidas las aves. Preferiblemente, el animal es un mamífero, que incluye ratas, conejos, cerdos, ratones y seres humanos, que comprende administrar una dosis de un MVA a un sujeto. Lo más preferiblemente, el sujeto es un ser humano. En una realización, el sujeto es un adulto. La administración se puede realizar mediante cualquier ruta de administración según lo determine un experto. Preferiblemente, la administración es parenteral, entérica, mucosa, preferiblemente intramuscular, intravenosa, subcutánea (p. ej., por rascado o inyección), nasal (p. ej., por inhalación) u oral. Los modos de administración preferidos son parenteral o mucosa.
Adicionalmente, la invención proporciona una administración que es intramuscular y en donde la administración comprende la administración de un coadyuvante. Preferiblemente, el coadyuvante comprende di-AMP cíclico.
Adicionalmente, la presente invención también abarca una administración que es subcutánea o intramuscular, y en donde la administración comprende la administración de un coadyuvante. Preferiblemente, el coadyuvante comprende poli I/C o ligando de Rig-I.
La invención también contempla métodos de vacunación como se describió anteriormente, en donde el vector de vacunación no es un MVA sino uno o más cepas de Salmonella que expresan los mismos antígenos que el MVA. Por lo tanto, el método de vacunación descrito en la presente memoria se aplica mutatis mutandis a los métodos de vacunación que utilizan una cepa de Salmonella. Un método de vacunación de este tipo es preferiblemente un método de vacunación en la mucosa, en el que la vacuna de proteína se coadyuva preferiblemente con CTA1DD o dmLT.
La presente invención también abarca cualquier compuesto descrito en los métodos de la presente memoria para su uso en estos métodos. Por ejemplo, la presente invención abarca el MVA recombinante para su uso en un método de vacunación como se describe en la presente memoria.
La presente invención también contempla una composición farmacéutica o una vacuna que comprende uno o más de los vectores de vacunación recombinantes de la invención. Como ya se mencionó, la "vacuna" se puede utilizar para prevenir o tratar una condición patológica en un sujeto. El término abarca tanto vacunas de subunidades, es decir, composiciones de vacuna que contienen antígenos que están separados y diferenciados de un organismo completo con el que el antígeno está asociado en la naturaleza, así como composiciones que contienen el poxvirus recombinante de la presente invención que portan, entre otros, el antígeno y/o un epítopo del mismo. La vacuna puede incluir o no uno o más componentes adicionales que mejoran la actividad inmunológica del componente activo. Una vacuna puede comprender adicionalmente otros componentes típicos de las composiciones farmacéuticas. La vacuna de la presente invención es, preferiblemente, para uso humano y/o veterinario.
La vacuna o la composición de la invención, p. ej. una vacuna que comprende el virus MVA, generalmente puede incluir uno o más portadores, aditivos, antibióticos, conservantes, coadyuvantes, diluyentes y/o estabilizadores farmacéuticamente aceptables. Tales sustancias auxiliares pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH o similares. Los portadores adecuados son típicamente moléculas grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos o similares. También se pueden añadir a la composición otros portadores como se describe en el documento US 2011/0052627 Col. 7.
La presente invención también incluye un kit que comprende al menos dos viales/recipientes para inmunización de cebado/refuerzo en donde al menos un vial/recipiente comprende una vacuna de proteína descrita en la presente memoria, una primera inoculación (inoculación de cebado) y, opcionalmente, viales adicionales para inoculaciones adicionales (inoculaciones de refuerzo), en donde el vial adicional comprende preferiblemente un vector de vacunación recombinante de la invención. El kit también comprende al menos un vial/recipiente adicional que comprende el vector de vacunación recombinante como se describe en la presente memoria para al menos una inoculación adicional ("inoculación de refuerzo"). El kit puede comprender adicionalmente instrucciones para la administración del vector de vacunación recombinante a un sujeto.
La invención contempla que el sujeto preferido sea un ser humano. Las instrucciones pueden indicar que la vacuna de proteína como se define en la presente memoria yo el vector de vacunación recombinante se administran al sujeto en múltiples dosificaciones (es decir, 2, 3, 4, 5, 6, etc.) en puntos de tiempo específicos (p. ej., Al menos 4 semanas, al menos 6 semanas, al menos 8 semanas después de la administración anterior). Preferiblemente, las instrucciones indican que la vacuna de proteína y/o el vector de vacunación recombinante deben administrarse en al menos 3 o al menos 4 dosificaciones.
La invención contempla un kit descrito en la presente memoria, en donde la vacuna o las vacunas comprendidas en el kit son adecuadas para la administración parenteral. En un kit de este tipo, la vacuna de proteína se puede coadyuvar preferiblemente con PCEP y/o una vacuna de CpG, y el vector de vacunación recombinante puede ser preferiblemente un MVA de la invención.
La invención también contempla un kit descrito en la presente memoria, en donde la vacuna o las vacunas comprendidas en el kit son adecuadas para la administración por las mucosas. En tal kit, la vacuna de proteína se puede coadyuvar preferiblemente con CTA1DD, dmLT, PCEP, c-di-AMP, c-di-CMP, c-diGMP o combinaciones de los mismos, y el vector de vacunación recombinante puede ser preferiblemente una cepa de Salmonella, un vector basado en CMV, VSV, un vector adenoviral o un vector del sarampión, preferiblemente una cepa de Salmonella de la invención.
Adicionalmente, también se contempla en la invención un kit descrito en la presente memoria, en donde la vacuna o las vacunas comprendidas en el kit son adecuadas para la administración a través de las mucosas. En tal kit, la vacuna de proteína se puede coadyuvar preferiblemente con CTA1DD, dmLT, PCEP, poli I/C, ligando Rig-I, c-di-AMP, c-di-CMP, c-diGMP o combinaciones de los mismos, y el vector de vacunación recombinante puede ser preferiblemente una cepa de Salmonella de la invención, o preferiblemente una cepa de Salmonella, un vector basado en CMV, VSV, un vector adenoviral o un vector del Sarampión.
La presente invención proporciona adicionalmente un kit, en donde la composición de proteína es adecuada para administración intramuscular. Preferiblemente, la composición comprende al menos un coadyuvante que es di-AMP cíclico.
La presente también contempla un kit, en donde la composición de proteínas es adecuada para administración subcutánea o intramuscular. Preferiblemente, la composición comprende al menos un coadyuvante que es poli I/C. La presente invención también proporciona una célula (anfitrión) que comprende el MVA recombinante descrito en la presente memoria. Los ejemplos de células que son permisivas para los poxvirus incluyen, pero no se limitan a, células COS, HEK-293, BHK, CHO, TM4, CVI, VERO-76, HELA, MDCK, BRL 3A y NIH/3T3. Para MVA, las células preferidas son las células CEF y BHK. Los expertos en la técnica conocen líneas celulares adicionales. La introducción de la construcción de poxvirus en una célula se puede efectuar mediante transfección de fosfato cálcico, electroporación, infección y otros métodos conocidos en la técnica y descritos en manuales de laboratorio convencionales, tales como Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc. Nueva York.
La presente invención también proporciona células (anfitriones) infectadas con el poxvirus recombinante. En consecuencia, la célula (anfitrión) se puede infectar con un vector viral MVA y transfectar con un vector adicional, p. ej., un vector de plásmido, que comprende el gen que se va a insertar, preferiblemente bajo el control transcripcional de un elemento de control de la expresión o promotor de MVA o poxvirus, tal como el promotor sintético de PrS. Como se explicó anteriormente, el vector de plásmido comprende secuencias capaces de dirigir la inserción de la secuencia heteróloga en una parte seleccionada del genoma del poxvirus, tales como las que flanquean uno de los sitios de deleción o regiones intergénicas de origen natural.
El término "aproximadamente" o "de manera aproximada" como se emplea en la presente memoria significa dentro de una desviación de 20%, tal como dentro de una desviación de 10% o dentro de 5% de un valor o intervalo dados.
Breve descripción de las Figuras
Fig. 1: La vacunación con cebado con proteína/refuerzo con MVA es altamente inmunogénica. (A) Se insertaron los marcos de lectura abiertos S y central del subtipo ayw de HBV en la deleción III (del III) del genoma de MVA bajo el control de los promotores poxvirales P7.5 y PH5, respectivamente. (B) Se vacunaron ratones de tipo salvaje (n = 3) una vez (día 0; barras rellenas) o dos veces (día 0 y 21; barras rayadas) con MVA-S (1x108 u.i.), MVA-central (1x108 u.i.) o MVAwt (1x108 u.i.). El día 8 (post cebado) o 27 (post refuerzo), los esplenocitos se estimularon con péptidos derivados de HBsAg (S190 y S208) o HBcAg (C93) y se analizaron para determinar la expresión de IFNy mediante tinción de citocinas intracelulares. (C) Se vacunaron ratones C57BL/6 con 12 pg de HBsAg o HBcAg recombinante. Se utilizó CpG como coadyuvante. El día 8, los esplenocitos se estimularon con péptidos derivados de HBsAg o HBcAg y se analizaron para determinar la expresión de IFNy mediante ICS. (D) Los ratones C57BL/6 se vacunaron con 12 pg de HBcAg o HBsAg coadyuvados con CpG recombinante y, el día 21, se reforzaron con MVA-central (1x108 u.i.) o MVA-S (1x108 u.i.). El día 27, los esplenocitos se estimularon con péptidos derivados de HBsAg o HBcAg y se analizaron para determinar la expresión de IFNy mediante ICS. Los sueros se analizaron en busca de anti-HBs mediante inmunoensayo (panel central) o anti-HBc mediante ELISA competitivo (panel derecho). A las frecuencias de las células T productoras de IFNy mostradas se les resta el fondo. S/CO señal con respecto a corte; u. i. unidades infecciosas.
Fig. 2: Las respuestas de linfocitos T CD4+ y anticuerpos específicos contra e1HBV inducidas por la vacunación se correlacionan inversamente con la antigenemia. (A-D) Se inmunizaron ratones HBVtg de antigenemia baja, media y alta (n = 4) con HBsAg o HBcAg coadyuvados con CpG. El día 21, los ratones recibieron un refuerzo con MVA-S (1x108 u. i.) o MVA-central (1x108 u. i.), respectivamente. El día 27 (día 6 después del refuerzo), se analizaron los sueros para determinar (A) anticuerpos anti-HBs y (B) anti-HBc. (C) Los esplenocitos y (D) los linfocitos asociados al hígado de los ratones HBVtg de baja antigenemia se estimularon con HBsAg y se analizaron para determinar las células T CD4+ que expresaban IFNy mediante tinción de citocinas intracelulares. A las frecuencias de las células T productoras de IFNy que se muestran se les resta el fondo. S/CO señal con respecto a corte; neg. = negativo; u. i. unidades infecciosas.
Fig. 3: Las frecuencias de células T CD8+ específicas de HBV inducidas por la vacunación se correlacionan inversamente con la antigenemia. Se inmunizaron ratones HBVtg de antigenemia baja, media y alta (n = 4) con 12 pg de HBsAg o HBcAg coadyuvados con CpG. El día 21, los ratones recibieron un refuerzo con MVA-S (1x108 u. i.) o MVA-central (1x108 u. i.). El día 27 posterior al refuerzo, los esplenocitos (A) y los linfocitos asociados al hígado (B) se estimularon con péptidos específicos de HBsAg (S109 y S208) o HBcAg (C93) y se analizaron para determinar la expresión de IFNy mediante tinción de citocinas intracelulares. Los paneles superior e intermedio muestran animales ilustrativos, el panel inferior proporciona frecuencias de células T productoras de IFNy después de restar el fondo. u. i. unidades infecciosas.
Fig. 4: Funcionalidad de las células T CD8+ específicas de HBV inducidas por la vacunación. Se inmunizaron ratones de tipo salvaje, así como ratones HBVtg de antigenemia baja y media, con HBsAg coadyuvado con CpG. El día 21, los ratones fueron reforzados con MVA-S (1x108 u. i.). El día 6 posterior al refuerzo, se analizaron (A) las células T CD8+ derivadas del bazo específicas de S para determinar la expresión de CD107a e IFNy. (B) Las células T CD8+ derivadas de hígado o bazo específicas de S se analizaron para determinar la expresión de IFNy, IL-2 y TNFa después de la estimulación con péptido S190. (C) Tinción con multímeros de células T CD8+ específicas de S190 y tinción conjunta para la expresión de superficie de CD127 y KLRG-1. u. i. unidades infecciosas.
Fig. 5: La vacunación heteróloga rompe la tolerancia de las células T en ratones HBVtg de alta antigenemia.
(A) Los marcos de lectura abiertos del subtipo S ayw y adw se colocaron en la deleción III (del III) del genoma de MVA bajo el control del promotor fuerte de poxvirus PH5. (B) a (D) Se vacunaron ratones HBVtg altamente antigenémicos (n> 4) con 16 pg de HBsAg (subtipo ayw o adw) y 16 pg de HBcAg (subtipo ayw) junto con los coadyuvantes indicados los días 0 y 14. El día 28, los ratones recibieron un refuerzo con MVA-PH5-S (5x107 u. i.; subtipo ayw o adw) y MVA-central (5x107 u. i.). El día 6 después del refuerzo se aislaron (B) esplenocitos (panel izquierdo) y linfocitos asociados al hígado (LAL, panel derecho) y se estimularon con péptidos S109 y S208 (subtipo adw si se indica) o C93 y se analizó la expresión de IFNy mediante tinción de citocinas intracelulares. (C) Los esplenocitos y LAL se estimularon con una reserva C-terminal de péptidos de 15 unidades específicos de HBsAg (que abarcaban los aminoácidos 145 a 226, subtipo ayw) y se analizaron para determinar las células T CD4+ que expresaban IFNy mediante ICS. (D) La representación gráfica FACS de células T CD8+ específicas de S208 que expresaban IFNy se analizaron para determinar la expresión de TNFa e IL-2. Se muestra la resta del fondo de la media ± ETM de las frecuencias de células T que producen IFNy. ns: no significativo. * p <0,05, ** p <0,01 prueba t de Student; u. i. unidades infecciosas.
Fig. 6: La vacunación heteróloga induce la seroconversión en ratones HBVtg de alta antigenemia. (A) a (D) Se vacunaron ratones HBVtg de alta antigenemia (n> 4) con 16 pg de HBcAg (subtipo ayw) y 16 pg de HBsAg (subtipo ayw o adw como se indica) coadyuvados con CpG y PCEP los días 0 y 14. El día 28, los ratones fueron reforzados con MVA-PH5-S (5x107 u. i...; subtipo ayw o adw) y MVA-central (5x107 u. i.). Como control, se vacunaron 5 ratones HBVtg de alta antigenemia con coadyuvantes CpG y PCEP los días 0 y 14 seguido de un refuerzo con 1x108 MVA-wt. El día 6 después del refuerzo, se analizaron los sueros para determinar la presencia de anticuerpos (A) anti-HBs o (B) anti-HBc. (C) Se analizaron sueros positivos para anti-HBs de ratones HBVtg para determinar la capacidad de neutralización del subtipo ayw HBsAg. (D) muestra los niveles séricos de HBsAg antes y después de la vacunación. Se muestra la media ± ETM. ns: no significativo; S/CO señal con respecto a corte. ** p <0,01 prueba t de Student.
Fig. 7: Expresión de antígenos de HBV por vectores MVA. (A) y (B) Se infectaron células NIH-3T3 murinas con MVA-S, MVA-central o MVAwt (MOI de 10). Dieciséis horas después de la infección (A) se analizaron los productos lisados celulares totales para determinar la expresión de HBsAg y HBcAg mediante transferencia Western. (B) El HBsAg secretado en el sobrenadante se determinó mediante ELISA específico de HBsAg. S/CO: señal con respecto a corte.
Fig. 8: Vacunación con HBsAg coadyuvado con CpG. Se inmunizaron ratones HBVtg de alta antigenemia con 12 pg de HBsAg que contenía CpG como coadyuvante. El día 21, los ratones recibieron un refuerzo con MVA-S. Los días 0, 27, 35, 42, 49 y 56 después de la inmunización de cebado, se analizaron los niveles de HBsAg y anti-HBs en los sueros. S/CO: señal con respecto a corte.
Fig. 9: Comparación de coadyuvantes para la vacunación con proteína-cebado. (A) a (C) Se vacunaron ratones de tipo salvaje con 16 gg de HBsAg (subtipo ayw) y 16 gg de HBcAg (subtipo ayw) junto con los coadyuvantes indicados los días 0. El día 28, los ratones recibieron un refuerzo co MVA-PH5-S (5 x 107 u. i.; subtipo ayw) y MVA-central (5x107 u. i.). El día 6 después del refuerzo, se analizó la presencia de (A) anti-HBs y (B) anti-HBc en los sueros. (C) El día 6 después del refuerzo, los esplenocitos fueron analizados por ICS después de la estimulación con péptidos específicos de HBsAg (S190 y S208adw) o HBcAg (C93). Las barras muestran el porcentaje (media ± ETM) de células CD8+ que se tiñeron positivamente para IFNy después de restar el fondo. u. i. Unidades infecciosas. Fig. 10: Agrupamiento de ratones HBVtg
Los ratones se agruparon de acuerdo con sus niveles de antígeno que se correlaciona estrechamente, en el caso de ratones HBVtg, con los títulos de virus determinados en suero.
Fig. 11: Péptidos utilizados para estimular las células T
La tabla proporciona secuencias de péptidos utilizados para determinar las respuestas de las células T CD8+ restringidas por los alelos de MHS-I Kb/Kd murinos. La reserva S se utilizó para determinar ampliamente las respuestas de las células T CD4+ y CD8+ de ratones y seres humanos.
Fig. 12: Resumen gráfico del esquema de vacunación del Ejemplo 4. Se vacunaron ratones HBVtg de alta antigenemia (>4) con 16 gg de HBsAg (subtipo ayw o adw) y 16 gg de HBcAg (subtipo ayw) junto con los coadyuvantes indicados los días 0 y 14. El día 28, los ratones recibieron un refuerzo con MVA-PH5-S (5x10e7 u. i.; subtipo ayw o adw) y MVA-central (5x10e7 u. i.). El día 6 posterior al refuerzo, se aislaron (B) esplenocitos (panel izquierdo) y linfocitos asociados al hígado (LAL, panel derecho) y estimularon con los péptidos S109 y S208 (subtipo adw como se indica) o C93 y se analizaron para determinar la expresión de IFNy mediante tinción de citocina intracelular (ICS).
Fig. 13: Correlación de tinciones sw multímeros y citocinas intracelulares de células T CD8+ específicas de HBV. Se inmunizaron ratones HBVtg con 12 gg de HBsAg que contenía CpG como coadyuvante. El día 21, los ratones se reforzaron con MVA-S. Las respuestas de células T específicas de HBV se detectaron el día 28 mediante tinción de multímero S190 o ICS después de la reestimulación ex vivo con el péptido S190.
Fig. 14: Detección de inmunocomplejos séricos. Se inmunizaron ratones HBVtg con HBsAg coadyuvado con CpG. El día 21, los ratones recibieron un refuerzo con MVA-S (1x108 u. i.). El día 6 después del refuerzo, se analizaron los sueros para detectar anti-HBs, HBsAg y HBsAg en inmunocomplejos precipitados. u. i.; unidades infecciosas; nd; no detectable
Fig. 15: Comparación de diferentes coadyuvantes de vacunas. Se inmunizaron ratones CH57BI/6 de tipo salvaje con HBcAg y HBsAg complejados en diferentes formulaciones de coadyuvantes. 1: CpG más hidróxido de alúmina; 2: polifosfaceno PCEP más alumbre; 3: PCEP más CpG más alumbre; 4: solo CpG; 5: solo PCEP; 6: CpG más PCEP. El día 28, todos los animales recibieron un refuerzo con MVA que expresaba la proteína central y S subtipo adw. La Fig. 15A-B muestra las respuestas de anticuerpos anti-HBs (Fig. 15A) y anti-HBc (Fig 15B) después de 28 (solo cebado con proteína) y 34 días (cebado con proteína más refuerzo con MVA). La Fig. 15C-D muestra las respuestas de las células T CD8+ contra los epítopos S y central después del cebado (Fig. 15C) y después del refuerzo con MVA (Fig. 15D). La Fig. 15E muestra un ensayo de neutralización en el que el subtipo ayw de HBV se incubó con las diluciones de suero indicadas antes de la infección y se midió la secreción de HBsAg por las células infectadas después de 4, 7 y 10 días.
Fig. 16: Marco de lectura abierto multiantigénico. La Fig. 16A representa la estructura de la cadena polipeptídica multiantigénica representada por SEQ ID NO: 07. La Fig. 16B representa esquemáticamente la formación de partículas subvirales que comprenden antígenos HBs A/adw y C/ayw. La Fig. 16C representa esquemáticamente la formación de cápsides vacías que comprenden antígenos HBc D/ayw y C/ayw.
Fig. 17: Ilustración esquemática de proteínas completamente procesadas derivadas de la cadena polipeptídica multiantigénica representada por SEQ ID NO: 07 y su destino.
Fig. 18: Ilustración esquemática de proteínas parcialmente no procesadas derivadas de la cadena polipeptídica multiantigénica representada por SEQ ID NO: 07 y su destino esperado. Se supone que la mayor parte de las parcialmente no procesadas aumentan la respuesta inmunitaria (especialmente mejoran y amplían la respuesta inmunitaria adaptativa) debido a la incorporación a partículas/filamentos similares a virus secretados: Fig. 19: Secuencia de aminoácidos de la proteína de envoltura pequeña de HBV A2/adw2 que incluye el saliente C-terminal (SEQ ID NO: 10). La secuencia subrayada corresponde a la secuencia de aminoácidos de la proteína de la envoltura pequeña de HBV A2/adw2 sin saliente C-terminal (SEQ ID NO: 08). El saliente C-terminal es un fragmento de escisión P2A que corresponde a SEQ ID NO: 09.
Fig. 20: Secuencia de aminoácidos del fragmento de la proteína central 1-149 de HBV D/ayw que incluye salientes N- y C-terminales (SEQ ID NO: 12). La secuencia subrayada corresponde a la secuencia de aminoácidos del fragmento de la proteína central 1-149 de HBV D/ayw sin salientes N- y C-terminales (SEQ ID NO: 11). El saliente C-terminal es un fragmento de escisión P2A que corresponde a SEQ ID NO: 09.
Fig. 21: Secuencia de aminoácidos del dominio RT de la polimerasa de HBV que incluye salientes N- y C-terminales (SEQ ID NO: 16). La secuencia subrayada corresponde a la secuencia de aminoácidos del dominio RT de la polimerasa de HBV sin salientes N- y C-terminales (SEQ ID NO: 06). El saliente C-terminal es un fragmento de escisión T2A que corresponde a SEQ ID NO: 13.
Fig. 22: Secuencia de aminoácidos de la proteína de la envoltura grande de HBV C/ayw que incluye salientes N- y C-terminales (SEQ ID NO: 14). La secuencia subrayada corresponde a la secuencia de aminoácidos de la proteína de la envoltura grande de HBV C/ayw sin salientes N-y C-terminales (SEQ ID NO: 04). El saliente C-terminal es un fragmento de escisión de T2A que corresponde a s Eq ID NO: 13.
Fig. 23: Secuencia de aminoácidos de la proteína central de HBV C/ayw que incluye el saliente N-terminal (SEQ ID NO: 15). La secuencia subrayada corresponde a la secuencia de aminoácidos de la proteína central de HBV C/ayw sin salientes N-terminales (SEQ ID NO: 05).
Fig. 24: Secuencia de aminoácidos de la secuencia consenso del dominio RT de la polimerasa de HBV (SEQ ID NO: 03)
Figura 25: Secuencia de aminoácidos de la secuencia consenso de proteínas de la envoltura grandes de cepas de HBV de genotipo C (SEQ ID NO: 01).
Figura 26: Secuencia de aminoácidos de la secuencia consenso de la proteína central de las cepas de HBV de genotipo C (SEQ ID NO: 02).
Figura 27: Combinación de ARNi y vacunación terapéutica. (A) Montaje experimental. Los ratones transgénicos HBVxfs recibieron ARNip específico de HBV (HBVip), un ARNip irrelevante (NEGip) o se dejaron sin tratar. Ocho semanas más tarde, todos los ratones recibieron inmunización terapéutica de cebado con proteína - refuerzo de MVA con antígenos central y de superficie del HBV (HBcAg y HBsAg). (B) Ilustración esquemática del diseño de ARNip/ARNhc específico de HBV.
Figura 28: Niveles de antígeno de HBV y respuesta de anticuerpos y respuestas de linfocitos T CD8+. (A) Cinética de los niveles séricos de HBeAg y HBeAg. (B) Anticuerpos anti-HBs en el suero de ratones en el momento del sacrificio (día 91, semana (W) 13). (C) Respuestas de células T CD8+ medidas en hígado y bazo después de la vacunación de refuerzo.
Figura 29: Estimación de la dosis óptima de MVA.
Los ratones HBVtg de antigenemia baja y media se agruparon de acuerdo con los niveles séricos de HBeAg. (A) Se inmunizaron grupos de ratones HBVtg (n = 3-4) dos veces a intervalos de dos semanas con 15 pg de HBcAg particulado coadyuvado con c-di-AMP. El día 28, los ratones recibieron un refuerzo con 4 dosis diferentes de MVA-central (3x106, 1x107, 3x107, 1x108 UFP, respectivamente). Se analizaron los sueros de los ratones de los días 0 y 35 (día 7 después del refuerzo) para detectar HBsAg, HBeAg, anticuerpos anti-HBs y anti-HBc (B) y niveles de ALT (C). (D) El día 35 se aislaron esplenocitos y linfocitos asociados al hígado de ratones HBVtg, se estimularon con péptido B8R derivado de MVA o péptido c93 derivado de HBcAg y se analizaron para determinar las células T CD8+ que expresaban IFNy mediante tinción de citocinas intracelulares. A las frecuencias de las células T productoras de IFNy que se muestran se les resta el fondo. i. m. - inmunización intramuscular; S/CO - señal con respecto a corte; UFP - unidades formadoras de placas; U - Unidades; UI - Unidades internacionales.
Fig. 30: Evaluación de c-di-AMP como coadyuvante para el cebado de proteínas.
Los ratones HBVtg de antigenemia media y alta se agruparon según los niveles séricos de HBeAg. (A) Se inmunizaron grupos de ratones HBVtg (n = 7) a intervalos de dos semanas con una mezcla de 15 pg de HBsAg particulado y 15 pg de HBcAg coadyuvado con c-di-AMP, o una combinación de CpG/PCEP. El día 28, los ratones recibieron un refuerzo con 108 MVA-S/central. Se utilizaron como controles ratones HBVtg (n = 4) a los que se inyectó dos veces c-di-AMP y un refuerzo con MVA "vacío" (MVAwt). Se analizaron los sueros de los ratones de los días 0 y 34 (día 6 después del refuerzo) para determinar los niveles de ALT (B), HBsAg, HBeAg, anticuerpos anti-HBs y anti-HBc (C-D). (E) El día 34 se aislaron esplenocitos y linfocitos asociados al hígado de ratones HBVtg (n = 4), se estimularon con el péptido c93 derivado de HBcAg o el péptido s208 derivado de HBsAg y se analizaron para detectar las células T CD8+ que expresaban IFNy mediante tinción de citocinas intracelulares. A las frecuencias de las células T productoras de IFNy que se muestran se les resta el fondo. i.m. - inmunización intramuscular; S/CO -señal con respecto a corte; UFP - unidades formadoras de placas; UI - Unidades internacionales.
Fig. 31: Estimación de la ruta de suministro óptima para varios coadyuvantes: c-di-AMP, poli-IC y ligando de RIG-I.
Los ratones HBVtg de antigenemia baja y media se agruparon de acuerdo con los niveles séricos de HBeAg. (A) Se inmunizaron grupos de ratones HBVtg (n = 5) a intervalos de dos semanas con una mezcla de 15 gg de HBsAg particulado y 15 gg de HBcAg coadyuvado con c-di-AMP, poli-IC o ligando de RIG-I. El día 28, los ratones recibieron un refuerzo con 6x107 MVA-S/central. Las inmunizaciones se realizaron exclusivamente por vía intramuscular, o se administró un cebado de proteína por vía subcutánea seguido de refuerzo intraperitoneal. Se analizaron los sueros de los ratones de los días 0 y 34 (día 6 después del refuerzo) para detectar HBsAg, HBeAg, anticuerpos anti-HBs y anti-HBc (A). El peso de los ratones HBVtg se controló semanalmente durante el experimento (B). (C) El día 34 se aislaron esplenocitos y linfocitos asociados al hígado de ratones HBVtg y se estimularon con péptido B8R derivado de MVA, péptido s208 derivado de HBsAg o péptido c93 derivado de HBcAg. A continuación, se analizaron las células para determinar las células T CD8+ que expresaban IFNy mediante tinción de citocinas intracelulares. A las frecuencias de las células T productoras de IFNy mostradas se les resta el fondo. i.m., s.c., i.p. - inmunización intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, respectivamente; S/CO - señal con respecto al corte; UFP - unidades formadoras de placas; UI - unidades internacionales.
Fig. 32: Evaluación de la nueva construcción de MVA (MVA HBVvac) en ratones C57BL/6.
(A) Representación esquemática de MVA-S/central y MVA-HBWac. B) El análisis de transferencia Western de los productos lisados de las células que producían indicaba clones de MVA. Tinción para S no glicosilado y glicosilado utilizando anticuerpos policlonales. (C) Se cebaron una vez grupos de ratones C57BL/6 (n = 5) con una mezcla de 20 gg de HBsAg particulado y 20 gg de HBcAg adyuvante con c-di-AMP. Dos semanas después, los ratones recibieron un refuerzo con 6x107 MVA-S/central, o con 6x107 MVA-HBVvac, que expresaban HBsAg, HBcAg y dominio RT de la polimerasa del HBV. (D) Se analizaron los sueros de los ratones desde el día 21 (día 7 después del refuerzo) en busca de anticuerpos anti-HBs y anti-HBc. (E) El día 21, los esplenocitos se aislaron y estimularon con péptido B8R derivado de MVA, péptidos específicos de HBsAg, HBcAg y RT de HBV y reservas de péptidos. El péptido SIINFEKL derivado de ovoalbúmina sirvió como control negativo. A continuación, se analizaron las células para determinar las células T CD8+ que expresaban IFNy mediante tinción de citocinas intracelulares. Las flechas de color rojo indican respuestas positivas de células T CD8+ específicas de RT. i.m. - inmunización intramuscular, respectivamente; S/CO - señal con respecto a corte; UFP - unidades formadoras de placas; UI - unidades internacionales.
Fig. 33: Secuencia de nucleótidos de la construcción del vector de vacunación recombinante (rMVA) que expresa adicionalmente CD70 (SEQ ID NO: 27).
Los diferentes dominios de dicha construcción se describen a continuación: Del III-secuencia flanqueante 1, promotor mH5, proteína HBcentral. P2A, molécula CD70 humana, IRES (EMCV), eGFP, Del III-Secuencia flanqueante 2.
Fig. 34: Evaluación de MVA que expresa CD70 en ratones C57BL/6.
(A) Representación esquemática de MVAcentral y MVAcentral-CD70. Ambos vectores expresan la secuencia del genotipo D de la proteína central del HBV y GFP para permitir una purificación más fácil. MVAcentral-CD70 expresa además un gen de CD70. (B) Se cebaron una vez por vía intramuscular grupos de ratones C57BL/6 (n = 6-7) con 20 gg de HBcAg particulado coadyuvado con PCEP y CpG. Tres semanas después, los ratones recibieron un refuerzo con 108 u. i. de MVAcentral o 108 de MVAcentral-CD70 o 108 de MVA-tipo salvaje (MVAwt) inyectado por vía intraperitoneal. (C) El día 35 se aislaron los esplenocitos y se estimularon con el péptido B8R derivado de MVA o el péptido central C93. El péptido SIINFEKL derivado de ovoalbúmina sirvió como control negativo. A continuación, se analizaron las células para determinar las células T CD8+ que expresaban IFNy mediante tinción de citocinas intracelulares. Los datos se proporcionan como media ± DT por grupo. Los puntos indican valores determinados en ratones individuales. u. i.-unidades infecciosas.
Fig. 35: Evaluación de MVA que expresa CD70 en ratones transgénicos para HBV. (A) Representación esquemática de MVAcentral y MVAcentral-CD70. Ambos vectores expresan la secuencia del genotipo D de la proteína central del HBV y GFP para permitir una purificación más fácil. MVAcentral-CD70 expresa además un gen de CD70. (B) Se cebaron una vez por vía intramuscular grupos de ratones transgénicos que portaban un genoma de longitud 1,3 veces superior (n = 5-6) con 20 gg de HBcAg particulado coadyuvado con PCEP y CpG y tres semanas después, se les aplicó un refuerzo con 108 u. i. de MVAcentral o 108 de MVAcentral-CD70 inyectado por vía intraperitoneal. Dos ratones tratados en consecuencia con 108 de MVA de tipo salvaje (MVAwt) sirvieron como control. (C) El día 35 se aislaron linfocitos asociados al hígado (LAL) y se estimularon con el péptido B8R derivado de MVA o el péptido central C93. Las células no estimuladas sirvieron como control negativo. Las células se analizaron mediante citometría de flujo después de la tinción de citocinas intracelulares para IFNy (rojo) e IL-2 (azul). Se muestran gráficos FACS para tres animales representativos.
Ejemplos
Ratones y vacunas
Se obtuvieron ratones C57BL/6 de tipo salvaje (wt) y ratones transgénicos para HBV (Cepa HBV1.3.32 (Guidotti et al., J Virol 1995; 69: 6158-69) (Genotipo D de HBV, subtipo ayw), proporcionados amablemente por F. Chisari, The Scripps Institute, La Jolla, CA, EE.UU.) de la reproducción en las propias Instalaciones en condiciones específicas libres de patógenos siguiendo las pautas institucionales. Para las vacunaciones con proteína, los ratones se inmunizaron por vía subcutánea con HBsAg de levadura recombinante o HBcAg de E. coli (APP Latvijas BiomedicT nas, Riga, Letonia) mezclado con 31,91 pg de CpG ODN 1668 fosforotioato sintético y/o 25 o 50 pg de poli[di(sodiocarboxilatoetil-fenoxi)fosfaceno] (PCEP) en 50 pl de PBS. Para la vacunación con MVA, los ratones se vacunaron por vía intraperitoneal con 1x108 unidades infecciosas del respectivo MVA recombinante en 500 pl de PBS.
Ensayo de tinción de citocinas intracelulares, tinción de multímeros y desgranulación
Se aislaron esplenocitos y linfocitos asociados al hígado (LAL) como se describió anteriormente (Stross et al., Hepatology 2012; 56:873-83) y se estimularon con péptidos restringidos a H2-kb o H-2Db (Figura 10) (jpt Peptide Technologies, Berlín, Alemania) o HBsAg recombinante (amablemente proporcionado por Rheinbiotech-Dynavax, Dusseldorf, Alemania) durante 5 h en presencia de 1 mg/ml de Brefeldin A (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania). Las células se tiñeron vivas/muertas con bromuro de monoazida de etidio (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se bloquearon con anti-CD16/CD32-Fc-Block (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Los marcadores de superficie se tiñeron con anti-CD8a conjugado con PB y anti-CD4 conjugado con PE (eBiosciences, Eching, Alemania). La tinción de citocinas intracelulares (ICS) se realizó con anti-IFNY con FITC (XMG1.2), anti-TNFa con PE-Cy7 y anti-IL-2 con APC (eBiosciences, Eching, Alemania) utilizando el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) según las recomendaciones del fabricante.
Para el ensayo de desgranulación, se estimularon los esplenocitos con péptido en presencia de Monensina, Brefeldin A, anticuerpo anti-CD107a conjugado con FITC y anticuerpo anti-CD107b conjugado con APC durante 5 h seguido de tinción de superficie de CD8a Pacific Blue e ICS con IFNy PerCP-Cy5.5 (eBiosciences, Eching, Alemania) utilizando el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Para la tinción de multímeros, los esplenocitos y LAL se tiñeron con S190 conjugado con PE (VWLSVIWM, SEQ ID NO: 19) o MVA B8R (TSYKFESV, SEQ ID NO: 20) durante 20 minutos seguido de tinción de CD8a Pacific Blue, KLRG1 FITC y CD127 APC (eBiosciences, Eching, Alemania) en presencia de Anticuerpo anti-receptor de FC (clon 2.4G2) durante 20 minutos. Los datos se adquirieron mediante análisis FACS en aFACSCanto II (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) y se analizaron utilizando el soporte lógico FlowJo (Treestar, Ashland, EE.UU.).
Análisis serológico
Los niveles séricos de HBsAg, HBeAg, anti-HBs y anti-HBc se determinaron en diluciones 1:20 usando ensayos AXSYM™ (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, EE. UU.). La cuantificación de los títulos de HBV en suero mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real se realizó como se describió anteriormente (Untergasser et al., Hepatology 2006; 43: 539-47).
Ensayo de neutralización
Se infectaron células HepaRG diferenciadas y cultivadas como se ha descrito (Lucifora et al., J Hepatol 2011; 55: 996-1003) con 200 partículas/células de HBV con envoltura que contenían ADN (subtipo ayw) por duplicado en presencia de una dilución en serie de sueros de ratones vacunados (1:33, 1:100, 1:333 y 1:1000) . Como control positivo se utilizaron 0,8 unidades internacionales del anticuerpo Hepatect™ CP (Biotest Pharma GmbH, Dreieich, Alemania). Veinticuatro horas después de la infección, las células se lavaron tres veces con PBS y se añadió 1 ml de medio de diferenciación. Se recogieron los sobrenadantes los días 4, 7 y 10 después de la infección y se detectó HBsAg mediante inmunoensayo en diluciones 1:20.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el soporte lógico Prism5 (GraphPad, San Diego, EE.UU.). Los resultados se expresan como la media ± error típico de la media. Las diferencias entre los grupos se analizaron para determinar la significación estadística utilizando pruebas t de Student de dos colas.
Generación de vacunas MVA
Los MVA recombinantes se generaron mediante recombinación homóloga y selección de la gama de anfitriones como se describió anteriormente (Staib et al., Biotechniques 2003; 34:694-6, 698, 700). E1HBcAg completo (genotipo D, subtipo ayw) y los marcos de lectura abiertos de HBsAg (genotipo D, subtipo ayw o adw) se clonaron en los plásmidos de transferencia de MVA pIIIAHR-PH5 o pIIIAHR-P7.5, colocando de ese modo las proteínas de1HBV bajo el control de los promotores PH5 (HBcAg ayw/HBsAg ayw/HBsAg adw) o P7.5 (HBsAg ayw) tempranos/tardíos específicos del virus Vaccinia. Después de la construcción de cada virus, se verificaron la expresión génica, la secuencia del ADN insertado y la pureza viral. Para la generación de preparaciones de vacunas, los MVA se propagaron de forma rutinaria en CEF, se purificaron mediante ultracentrifugación a través de sacarosa, se reconstituyeron en Tris-HCL 1 mM pH 9,0 y se titularon siguiendo la metodología convencional (Staib et al., Methods Mol Biol 2004; 269: 77-100).
Inmunotransferencia
Se cultivaron fibroblastos de ratón NIH-3T3 (CRL-1658) en medio RPMI 1640 con un suplemento de FCS al 10%, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 pg/ml. Las células se recolectaron en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM [pH 8,0], NaCl 150 mM, Nonidet P-40 al 1%, NaN3 al 0,02% y 100 pg/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo) 16 h después de la infección, se disolvieron en electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio al 12% (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (0,45 pM; Bio-Rad, Munich, Alemania). Las membranas se incubaron a 4°C con anticuerpos anti-HBc (antisuero H800; amablemente proporcionado por H. Schaller), anti-HBs (Murex HBsAg versión 3; Abbott, Abbott Park, IL, EE.UU.) o anti-actina (Sigma, Munich, Alemania) a diluciones 1:10000, 1:50 y 1:10000, respectivamente. Se utilizaron anticuerpos secundarios de ratón y conejo marcados con peroxidasa de rábano picante (Dianova, Hamburgo, Alemania) a una dilución de 1:5000 durante 1 h a 21°C. Los anticuerpos se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato que contenía leche desnatada al 5%. Se utilizó quimioluminiscencia mejorada según las instrucciones (Roche, Mannheim, Alemania).
El HBsAg secretado en el sobrenadante de las células cultivadas se determinó utilizando el ensayo Abbott AxSYM HBsAg (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, EE.UU.).
Ejemplo 1: La vacunación por cebado con proteína/refuerzo con MVA induce una fuerte inmunidad anti-HBV Se generaron dos vacunas de MVA que expresaban HBs (MVA-S) o HBc (MVA-central) a partir del genotipo D de HBV, subtipo ayw (Fig. 1A). La transferencia Western y el ELISA de HBsAg confirmaron la expresión correcta de la proteína de cualquiera de los MVA (Figuras 7A, B).
Para examinar la inmunogenicidad, se inmunizaron ratones C57BL/6 (wt) con MVA-S, MVA-central o MVAwt (108 unidades infecciosas) i.p. y las frecuencias de células T CD8+ productoras de IFNy se determinaron mediante tinción de citocinas intracelulares (ICS) el día 8 después de la inmunización. Se utilizó la ruta i.p. porque se pretendía una distribución de MVA sistémica. La inmunización con MVA-S, MVA-central y MVAwt indujo respuestas de células T CD8+ comparables a las del péptido B8R inmunodominante derivado de MVA, que se reforzó después de una segunda inmunización (Fig. 1B). Por el contrario, no se detectaron respuestas de células T CD8+ específicas de HBV (Fig. 1B).
Con el fin de inducir la inmunidad específica contra el HBV, los autores de la presente invención realizaron vacunaciones de cebado-refuerzo heterólogas. Los ratones recibieron 12 pg de HBsAg o HBcAg particulados recombinantes (subtipo ayw) con CpG como coadyuvante. Ocho días después de la vacunación con HBsAg, las frecuencias de células T CD8+ esplénicas que secretaban IFNy en respuesta a la estimulación con péptidos S190 y S208 fueron de alrededor de 0,6%, mientras que casi ninguna fueron detectables respuestas de células T CD8+ contra C93 después de la inmunización con HBcAg (Fig. 1C). Una vacunación de refuerzo el día 21 con MVA-S o MVA-central pudo inducir altas frecuencias de células T CD8+ específicas de HBsAg o HBcAg, así como títulos altos de anti-HBs o anti-HBc, respectivamente (Fig. 1D). Tomados en conjunto, esos datos indican que se necesitaba una vacunación de cebado-refuerzo heteróloga para inducir células T específicas de1HBV.
Ejemplo 2: La antigenemia alta evita la inducción de inmunidad anti-HBV
Para investigar el impacto de la carga de antígeno de HBV en la inducción de respuestas inmunitarias específicas de HBV, se clasificaron ratones transgénicos (HBVtg) HBV1.3.32 en grupos con antigenemia baja, media y alta según sus niveles séricos de HBeAg antes de la vacunación (Fig. 10). Seis días después del refuerzo, los títulos de anti-HBs en ratones que recibieron HBsAg/MVA-S fueron más altos en el grupo de antigenemia baja en comparación con los ratones del grupo de antigenemia media, y permanecieron indetectables en ratones de antigenemia alta (Fig. 2A). Incluso cuando se controló durante 35 días después del refuerzo con MVA-S, los ratones con alta antigenemia no desarrollaron títulos de anti-HBs detectables, y el HBsAg persistió a niveles bajos (Fig. 11). Para estudiar si los anti-HBs pueden formar complejos por las cantidades en exceso de HBsAg y así escapar a la detección, los autores de la presente invención disolvieron 131 complejos de proteínas precipitados con urea y repitieron el inmunoensayo. De este modo, encontraron complejos inmunitarios HBsAg-anti-HBs en ratones vacunados HBVtg con antigenemia alta e intermedia pero no baja (Fig. 14). Sin embargo, se detectaron anticuerpos específicos de HBcAg en sueros de ratones vacunados con HBcAg/MVA-central de todos los grupos, pero los títulos mostraron de nuevo la tendencia a correlacionarse inversamente con la antigenemia (Fig. 2B). Para analizar la respuesta de células T CD4+ inducida por la vacunación, los autores de la presente invención estimularon esplenocitos y linfocitos asociados al hígado (LAL) con HBsAg. Aunque encontraron altas frecuencias de células T CD4+ específicas de HBsAg en ratones wt, no detectaron células T CD4+ específicas de HBV en ratones HBVtg en ninguno de los grupos (Fig. 2C, D).
De manera similar a los títulos de anticuerpos, los autores de la presente invención observaron una correlación inversa entre la antigenemia y las respuestas de células T CD8+ específicas de HBV. En ratones con alta antigenemia, la inmunización con HBsAg/MVA-S y HBcAg/MVA-central no logró inducir células T CD8+ específicas de HBsAg o HBcAg detectables, ni en la periferia (bazo) ni en el hígado, el sitio de replicación de1HBV (Fig. 3A, B). Los ratones con una carga de HBeAg media o baja desarrollaron respuestas de células T CD8+ específicas de S190 y S208 a HBsAg/MVA-S y respuestas de células T específicas de C93 a la vacunación con HBcAg/MVA-C. Las frecuencias de células T CD8+ específicos de HBV detectadas en ratones con antigenemia baja fueron más altas que las encontradas en ratones con antigenemia media. Es importante destacar que las frecuencias de células T CD8+ específicas de MVA B8R eran independientes de la antigenemia y comparables entre todos los grupos, lo que indica la misma eficacia de vacunación (Fig. 3A, B).
Durante la infección crónica y la persistencia del antígeno, las células T CD8+ pueden desarrollar un fenotipo disfuncional agotado. En tales condiciones, el número de células T específicas de antígeno se subestima en gran medida mediante pruebas funcionales tales como la producción de IFNy. Por lo tanto eso se realizó tinción de multímeros específicos de S190, C93 y B8R, que no detectaron células T CD8+ específicas de HBV en bazos o hígados de ratones inmunizados con alta antigenemia, mientras que las células T CD8+ positivas para multímeros B8R fueron fácilmente detectables. Esto sugirió que la vacuna de hecho no pudo inducir células T específicas de HBV en este grupo. En los grupos con antigenemia baja y media, las respuestas específicas de HBV-S190 y específicas de MVA-B8R mostraron una proporción similar de células T CD8+ positivas para multímeros y positivas para IFNy (Fig. 13). Tomados en conjunto, los niveles de antígeno de HBV influyen en la eficacia con la que se pueden inducir los anticuerpos específicos de HBV, así como las respuestas de las células T, mediante la vacunación de cebado-refuerzo heteróloga.
Ejemplo 3: La antigenemia influye en la calidad de las respuestas inducidas por la vacunación
Las funciones efectoras importantes de las células T CD8+ incluyen la producción de IL-2 y TNFa además de IFNy, así como la capacidad de desgranulación en respuesta a la estimulación peptídica, que se puede analizar mediante la expresión superficial de CD107a. Tras la estimulación con péptido S190, las células T CD8+ esplénicas específicas de IFNy+S190 inducidas en ratones wt y ratones HBVtg de antigenemia baja mediante inmunización con HBsAg/MVA-S se desgranularon en proporciones similares (72,3% y 73,4%, respectivamente) (Fig. 4A) y mostraron una expresión comparable de IL-2 y TNFa en células T CD8+ de bazo e hígado derivadas de ratones con antigenemia media, que también fueron capaces de desgranularse tras la estimulación peptídica, aunque en menor grado (62%), pero carecían de expresión de IL-2 (Fig. 4B).
Para determinar el estado de diferenciación de las células que se unen a multímeros para proliferar, los autores de la presente invención tiñeron CD127 y KLRG-1. La vacunación de ratones HBVtg wt y de antigenemia baja indujo un alto porcentaje de células de unión a multímeros CD127+KLRG-1 específicas de S190 en el hígado y el bazo, que se consideran precursoras transitorias de células de larga vida con el potencial de proliferar y dar lugar a una nueva progenie de células efectoras (Fig. 4C). En ratones de antigenemia media, estas células, sin embargo, apenas eran detectables (Fig. 4C). Estos datos indican que la expresión del antígeno de HBV disminuye la polifuncionalidad de las células T CD8+ y, en particular, la capacidad de secreción y proliferación de IL-2 de las células efectoras.
Ejemplo 4: Comparación de coadyuvantes para la vacunación con proteína primaria
Con el fin de investigar el coadyuvante de polifosfaceno, PCEP mejorará el efecto inmunoestimulador de CpG, se utilizó PCEP en lugar de CpG o se añadió a CpG para la formulación de la vacuna de proteína y HBsAg y HBcAg combinados.
Los ratones de tipo salvaje se vacunaron con 16 gg de HBsAg (subtipo ayw) y 16 gg de HBcAg (subtipo ayw) junto con los coadyuvantes respectivos los días 0. El día 28, los ratones recibieron un refuerzo con MVA-PH5-S (5x107 u. i.; subtipo ayw) y MVA-central (5x107 u. i.). El día 6 después del refuerzo, se analizaron los sueros para determinar la presencia de anti-HBs (Fig. 9A) y anti-HBc (Fig. 9B). El día 6 posterior al refuerzo, los esplenocitos se analizaron mediante ICS después de la estimulación con péptidos específicos de HBsAg (S190 y S208adw) - o HBcAg (C93) (Fig. 9C). Las barras muestran el porcentaje (media ± ETM) de células CD8+ que se tiñen positivamente para IFNy después de restar el fondo. u. i. unidades infecciosas.
El uso de PCEP (solo o combinado con CpG) fue superior en la inducción de respuestas de anticuerpos anti-HBs y anti-HBc a CpG solo después de la vacunación con cebado con proteína/refuerzo con MVA en ratones wt, mientras que las respuestas de células T CD8+ fueron comparables (Fig. 9A-C).
Ejemplo 5: Comparación de combinaciones de coadyuvantes
A continuación, el propósito fue determinar el efecto de diferentes coadyuvantes sobre las respuestas inmunitarias humorales y celulares. Por tanto, se cebaron ratones CH57BI/6 de tipo salvaje con HBcAg particulado y HBsAg complejado en diferentes formulaciones de coadyuvantes. En los grupos 1 a 3 (n = 3) HBsAg se complejó con hidróxido de alúmina y se combinó con HBcAg, CpG o coadyuvante de polifosfaceno o ambos. Los grupos 4 a 6 (n = 3) se vacunaron utilizando HBcAg particulado y HBsAg coadyuvado con CpG o polifosfaceno o ambos pero sin alumbre. El día 28, todos los animales recibieron refuerzo con MVA que expresaba la proteína central y S de subtipo adw.
Las respuestas de los anticuerpos contra HBs y HBc se determinaron después de 28 días (solamente cebado con proteína) y después de 34 días (cebado con proteína más refuerzo con MVA). Las Fig. 15A y 15B muestran que las respuestas de anticuerpos, en particular contra HBs, fueron inesperadamente mucho más pronunciadas cuando se evitó el alumbre. La Fig. 15C-D muestra las respuestas de las células T CD8+ contra los epítopos S y proteína central después del cebado (Fig. 15C) y después del refuerzo con MVA (Fig. 15D).
Las respuestas de las células T ya eran detectables después del cebado cuando las formulaciones de la vacuna no contenían alumbre. Curiosamente, después del refuerzo con MVA con igual eficacia en todos los grupos (indicado por respuestas específicas a B8R), todos los ratones desarrollaron respuestas de células T específicas de la proteína central, mientras que nuevamente los animales vacunados sin alumbre desarrollaron respuestas de células T CD8+ específicas de S mucho más pronunciadas.
Ejemplo 6: La vacunación con el subtipo HBsAg heterólogo rompe la tolerancia de las células T e induce una fuerte producción de anticuerpos en ratones HBVtg con alta antigenemia
Se analizaron los sueros de ratón para determinar su capacidad de neutralización después de la vacunación. Los ratones vacunados con HBsAg subtipo adw fueron capaces de neutralizar de forma cruzada e1HBV subtipo ayw incluso en altas diluciones de hasta 1:1000 (Fig. 15E).
A continuación, el propósito fue mejorar la inmunogenicidad de la vacunación con cebado de proteína/refuerzo con MVA heteróloga d para romper la tolerancia en presencia de una mayor carga de antígeno de HBV.
Para someter a prueba si un desencadenante de antígeno más fuerte mejoraría la eficacia de la vacunación, se diseñaron nuevos MVA que expresaban HBsAg también bajo el control del promotor más fuerte PH5 (Fig. 5A) y se realizó una segunda vacunación con proteínas el día 14 (Fig. 12). Además, se compararon HBsAg de subtipo ayw (idéntico a los ratones HBVtg) y adw. Además, se añadió PCEP a CpG para la formulación de la vacuna de proteína y se combinaron HBsAg y HBcAg durante el cebado y el refuerzo para lograr respuestas inmunitarias a múltiples antígenos de HBV. Cuando se aplicó este régimen de vacunación modificado (cebado con HBsAg/HBcAg combinados coadyuvados con CpG y PCEP los días 0 y 14 seguido de refuerzo el día 28 utilizando MVA-S/MVA-central que expresaban los antígenos bajo el promotor PH5 más fuerte), hubo la capacidad para romper la tolerancia en ratones HBVtg de alta antigenemia y se indujeron células T CD8+ y CD4+ específicas de HBsAg y HBcAg (Figuras 5B, C).
A continuación, se investigó si un desajuste parcial entre la vacuna y el antígeno diana mejoraría la eficacia de la vacuna (Schirmbeck et al., Eur J Immunol 2003; 33: 3342-52). Cualquiera de los antígenos de la vacuna, Sayw o Sadw, indujo células T CD8+ contra ambos subtipos (Fig. 5B) según se determina con el péptido S208 específico del subtipo (Fig. 11). Sin embargo, la vacuna que contenía Sadw heterólogo indujo respuestas de células T CD8+ más fuertes y CD4+ detectables (Figuras 5B, C). De manera similar a lo que habían observado los autores de la presente invención con las células T CD8+ específicas de S derivadas de ratones con antigenemia media (Fig. 4B), se encontró que las células T CD8+ específicas de S208 esplénicas secretaban IFNy y hasta cierto punto TNFa, pero mostraban sólo una expresión marginal de IL-2 (Fig. 5D).
En particular, solamente la formulación de vacuna que contenía Sadw, pero no Sayw fue capaz de inducir respuestas de anticuerpos anti-HBs detectables en ratones de alta antigenemia (Fig. 6A), mientras que los anticuerpos anti-HBc fueron inducidos por ambas formulaciones (Fig. 6B). Es importante destacar que los anticuerpos anti-HBs generados por Sadw fueron capaces de neutralizar las partículas de HBV del subtipo ayw (Fig. 6C). Concomitantemente con la inducción de anti-HBs neutralizantes en grupo de vacunación de Sadw, los niveles de HBsAg cayeron significativamente a niveles bajos (Fig. 6D). Tomado en conjunto, esto indicó que el esquema de vacunación modificado permitió romper la tolerancia de las células B y T en ratones HBVtg.
Ejemplo 7: Respuesta inmunitaria amplia inducida por MVA multiantigénico
A continuación, el propósito fue comparar la inducción de respuestas inmunes contra uno, dos y varios antígenos de HBV utilizando un MVA multiantigénico. Inesperadamente, las respuestas inmunes tanto humorales como celulares contra S o S y Pol mejoraron cuando la proteína central fue expresada conjuntamente por el vector de vacuna MVA.
Ejemplo 8: Combinación de ARNi y vacunación terapéutica
Se trataron ratones transgénicos de HBV, cepa HBVxfs, que expresaban antígenos de HBV de alto título con ARNip específicos de HBV dirigidos a la región 3' de todos los a Rn de HBV. El tratamiento con ARNip redujo los niveles de HBeAg y HBsAg en 90%. Después de 8 semanas, los animales se vacunaron con una vacuna de refuerzo de proteína - refuerzo de MVA-HBV para inducir anticuerpos anti-HBs y células T específicas de HBV (Fig. 27). Como vacuna de proteína, se coadyuvaron HBsAg y HBcAg particulados con CpG y PCEP. El vector de vacuna de MVA expresó el marco de lectura abierto completo de las proteínas S y central de HBV. Los controles fueron sin ARNip, sin vacunación y una combinación de los mismos.
Seis días después de la vacunación de refuerzo, se sacrificaron los ratones y se determinaron los niveles de HBeAg y HBsAg, así como los títulos de anti-HBs (Fig. 28A, B). A partir de hígados y bazo, se aislaron células T, se estimularon ex vivo con péptidos específicos de HBV, se tiñeron para determinar la expresión de interferón gamma mediante tinción de citocinas intracelulares y se analizaron mediante citometría de flujo (Fig. 28C).
Ejemplo 9: Estimación de la dosificación óptima de MVA
En los primeros conjuntos de experimentos, los autores de la presente invención se propusieron evaluar la dosificación más baja de MVA para la vacunación de cebado de proteína/refuerzo de MVA heteróloga que mostraría una inmunogenicidad satisfactoria y sería capaz de romper la tolerancia inmunitaria en ratones HBVtg. Por lo tanto, grupos de ratones HBVtg de antigenemia baja y media se inmunizaron dos veces a intervalos de dos semanas con 15 pg de HBcAg particulado coadyuvado con bis-(3',5')-adenosina monofosfato cíclico dimérico (c-di-AMP). El día 28, los ratones recibieron un refuerzo con 4 dosificaciones diferentes de MVA-central (3x106, 1x107, 3x107, 1x108 UFP, respectivamente) (Fig. 29A). Las respuestas inmunitarias humorales y celulares provocadas por regímenes de inmunización que empleaban varias dosificaciones de MVA se evaluaron 7 días después de la inmunización de refuerzo (día 35).
Se analizaron los sueros de los ratones del día 0 y 35 (día 7 después del refuerzo) para detectar HBsAg, HBeAg, anticuerpos anti-HBs y anti-HBc (Fig. 29B). Todos los regímenes de inmunización provocaron niveles similares de anticuerpos anti-HBc detectados en el suero de ratones HBVtg el día 35. Además, todos los grupos de ratones mostraron una reducción significativa de HBsAg en la sangre. Este efecto no fue mediado por anticuerpos anti-HBs ya que el régimen de inmunización no incluyó HBsAg, crucial para la seroconversión de HBsAg en el modelo HBVtg. Curiosamente, los ratones HBVtg de los grupos que recibieron dosis más altas de MVA-central (3x107 y 1x108 UFP) como refuerzo mostraron una disminución considerable de los niveles séricos de HBeAg (Fig. 29B). Por otra parte, también se observó una ligera elevación de la alanina transferasa hepática (ALT) en los grupos de ratones que recibieron dosis más altas de MVA-central (3x107 y 1x108 UFP) (Fig. 29C). Estos datos sugieren que los protocolos de inmunización en estos dos grupos de ratones dieron como resultado la supresión de la replicación de1HBV en el hígado, posiblemente debido a la mejor actividad de las células T específicas de HBcAg. De hecho, la tinción intracelular para determinar IFNy de linfocitos asociados al hígado (LAL) y esplenocitos mostró que los ratones HBVtg que fueron inmunizados con dosis más altas de MVA-central podrían generar respuestas de células T CD8+ específicas de HBV más eficaces, particularmente en el hígado (Fig. 29D). Simultáneamente, las respuestas de las células T CD8+ específicas de MVA no aumentaron significativamente con la dosificación más alta de MVA utilizada para la inmunización.
Se puede concluir a partir de estos resultados que la dosificación de MVA-central de 3x107 UFP para la vacunación con cebado con proteína/refuerzo con MVA heteróloga es suficiente para romper la tolerancia inmunitaria en ratones HBVtg de antigenemia baja y media.
Ejemplo 10: Evaluación de c-di-AMP como coadyuvante para el cebado de proteínas
La falta de un coadyuvante seguro y eficaz que induzca una respuesta equilibrada de las células T CD4+ Th1/Th2 puede ser un obstáculo para iniciar los ensayos clínicos. Por otra parte, la activación del receptor de reconocimiento de patrones citoplasmáticos recientemente identificado STING es una alternativa interesante para la vacunación terapéutica. Por lo tanto, los autores de la presente invención se propusieron investigar la eficacia de c-di-AMP como un posible nuevo coadyuvante para una vacuna terapéutica contra la hepatitis B. Con este fin, grupos de ratones HBVtg de antigenemia media y alta (n = 7) recibieron dos cebados de proteína y una inmunización de refuerzo con MVA. Se combinaron HBsAg y HBcAg particulados para el cebado de proteínas y se coadyuvaron con c-di-AMP o una combinación previamente establecida de CpG con polifosfacenos (PCEP). El día 28, los ratones recibieron un refuerzo con una mezcla de MVA-S/central (Fig. 30A). Se utilizaron como controles ratones HBVtg (n = 4) que recibieron una inyección de c-di-AMP y MVA "vacío" (MVAwt). La eficacia de las formulaciones de la vacuna para inducir respuestas inmunitarias humorales y celulares se comparó el día 34 (6 días después del refuerzo).
Ni el protocolo de inmunización con c-di-AMP ni con CpG/PCEP tuvieron un impacto sobre los niveles de HBeAg en suero en ratones HBVtg con antigenemia alta (Fig. 30C). Ambas formulaciones de vacuna sometidas a prueba indujeron respuestas anti-HBc significativas. Sin embargo, la inmunización con c-di-AMP indujo títulos significativamente más altos de anticuerpos anti-HBc, en comparación con el régimen con CpG/PCEP (p <0,05) (Fig. 30C). Curiosamente, ambos protocolos de inmunización dieron como resultado una seroconversión de HBsAg en anti-HBs en todos los ratones HBVtg examinados (Fig. 30D). Los niveles elevados de anticuerpos anti-HBs provocados por las vacunas con coadyuvante c-di-AMP o CpG/PCEP formaron complejos con e1HBsAg circulante y lo eliminaron del suero de los ratones. Por el contrario, los ratones HBVtg que recibieron c-di-AMP solo seguido de refuerzo con MVAwt no desarrollaron ningún anti-HBs, y los niveles de HBsAg en el suero de estos ratones permanecieron sin cambios. Es importante destacar que ambas formulaciones de vacunas indujeron respuestas significativas de células T CD8+ específicas de HBsAg (s208) y específicas de HBcAg (c93) detectables en el bazo (p <0,05) y, en particular, linfocitos asociados al hígado en los ratones HBVtg (p <0,05) (Fig. 30E), acompañadas de daño hepático leve inducido por células T debido a un aumento de ALT (Fig. 30B). No hubo diferencia estadísticamente significativa en la magnitud de las respuestas de células T CD8+ específicas de HBV provocadas por los regímenes con c-di-AMP o CpG/PCEP.
En vista de estos datos, se considera que c-di-AMP es un potente coadyuvante para la vacunación con cebado de proteína-refuerzo con MVA terapéutica, incluso en ratones HBVtg altamente antigenémicos.
Ejemplo 11: Estimación de la ruta de administración óptima para diversos coadyuvantes: c-di-AMP, poli-LCIC y ligando de RIG-I
Para un coadyuvante apropiado para el cebado de proteínas para la vacunación terapéutica con cebado con proteína/refuerzo con MVA heteróloga, se amplió el escrutinio. El objetivo de los autores de la presente invención fue comparar la eficacia de c-di-AMP con dos posibles nuevos coadyuvantes para una vacuna terapéutica contra la hepatitis B: poli-LCIC y ligando de RIG-I. Por otra parte, examinaron los distintos protocolos de inmunización para encontrar la vía de aplicación más eficaz. Con este fin, grupos de ratones HBVtg de antigenemia baja y media (n = 5) recibieron dos cebados con proteína y una inmunización de refuerzo con MVA (Fig. 30A). Se combinaron HBsAg y HBcAg particulados para el cebado con proteína y se coadyuvaron con c-di-AMP, poli-LCIC o ligando de RIG-I. El día 28, los ratones recibieron un refuerzo con una mezcla de MVA-sAg y MVA-central. Las inmunizaciones se realizaron exclusivamente por vía intramuscular (i.m.), o se administró un cebado con proteína por vía subcutánea (s.c.) seguido de refuerzo intraperitoneal (i.p.). Se comparó la eficacia de las diferentes formulaciones de vacuna y rutas de aplicación con respecto a la inducción de respuestas inmunitarias humorales y celulares el día 34 (6 días después del refuerzo).
Todos los protocolos de vacunación redujeron de forma potente los niveles de HBsAg en el suero de ratones HBVtg. Esto se debió al hecho de que todos los coadyuvantes y las rutas de suministro examinados podían provocar títulos altos de anticuerpos anti-HBs que formaban complejos con HBsAg en la sangre de los ratones. De manera similar, los niveles de anticuerpos anti-HBc inducidos fueron comparables entre los grupos de ratones, con una ligera tendencia a que la vía de inmunización intramuscular fuera más potente en la inducción anti-HBc. Sin embargo, se observó una menor replicación de HBV, detectada indirectamente por los niveles de HBeAg, solo en los grupos de ratones HBVtg que recibieron c-di-AMP por vía i.m. o s.c./i.p., o poli-LCIC por vía i.m. (Fig. 31A). Desafortunadamente, la inmunización con poli-LCIC de manera intramuscular fue el único protocolo examinado que dio como resultado una pérdida de peso corporal considerable en ratones HBVtg (Fig. 31B). También se puede considerar que c-di-AMP es superior en la inducción de respuestas de células T CD8+ específicas de HBcAg (c93) y específicas de HBsAg (s208) en el bazo y especialmente en el hígado de ratones HBVtg inmunizados, independientemente de la vía de administración utilizada (Fig. 31C). Curiosamente, el poli-LCIC dio como resultado una vigorosa respuesta intrahepática de células T CD8+ específicas de HBcAg cuando se suministró por vía intramuscular, mientras que cuando se administró por vía s.c./i.p. provocó predominantemente respuestas de células T CD8+ específicas de HBsAg (s208). El ligando de RIG-I fue capaz de inducir respuestas humorales específicas del HBV, pero no pudo inducir respuestas de células T CD8+ específicas de HBV tras el cebado. Las respuestas de células T CD8+ específicas de MVA, utilizadas como controles, fueron comparables en todos los grupos inmunizados en el bazo y el hígado, lo que indica la misma eficacia de vacunación.
Estos datos demuestran que c-di-AMP es un coadyuvante muy potente, poli-LCIC muestra una eficacia intermedia y el ligando de RIG-I no es lo suficientemente eficaz para la vacunación de cebado con proteína-refuerzo con MVA terapéutica. El c-di-AMP fue igualmente eficaz tanto por la vía de aplicación i.m. como s.c./i.p..
Ejemplo 12: Evaluación de la nueva construcción de MVA (MVA-HBVvac) en ratones C57BL/6.
Adicionalmente, se evaluó la inmunogenicidad in vivo del MVA policistrónico recién construido que expresaba HBsAg, HBcAg (secuencias que cubren los principales genotipos A, B, C, D de1HBV) y el dominio RT de la polimerasa de HBV (MVA-HBVvac). Se generó una representación esquemática de las dos construcciones de vacunación policistrónicas: HBWac que cubría la proteína central y S de HBV de todos los genotipos principales de HBV, así como el dominio RT de la polimerasa de HBV, y C/S (C/S) que expresaba la proteína central y S de HBV (Fig.32A ). La expresión de proteínas se confirmó mediante transferencia Western. La Fig. 32B muestra la expresión de S por diferentes clones de MVA recombinantes que expresaban HBVVAc o S/C.
Los grupos de ratones C57BL/6 (n = 5) se cebaron una vez con una mezcla de HBsAg y HBcAg particulados coadyuvados con c-di-AMP. Dos semanas más tarde, los ratones recibieron un refuerzo con una mezcla de MVA-S y MVA-central, o con una cantidad igual del nuevo MVA-HBVvac. Los ratones se sacrificaron el día 21 para evaluar las respuestas inmunitarias humorales y celulares específicas de HBV (Fig. 32C).
El nuevo MVA policistrónico provocó respuestas de anticuerpos anti-HBs y anti-HBc significativas, comparables a la mezcla de una combinación de construcciones de MVA-S y MVA-central (Fig. 32D). Por otra parte, la inmunización con MVA-HBVvac provocó respuestas vigorosas de células T CD8+ específicas de HBsAg (s190, s208 y reserva S) y específicas de HBcAg (c93, reserva C) (determinadas mediante el análisis de esplenocitos) que tenían una magnitud similar a las inducidas por la mezcla de MVA-S y MVA-central (Fig. 32E). Además, la inmunización con MVA-HBVvac dio como resultado la detección de respuestas de células T CD8+ específicas de RT para los péptidos RT61, RT333 y la reserva de péptido RT 2 (marcada con flechas) a niveles bajos, aunque no se utilizó proteína RT para el cebado.
Estos datos mostraron que el MVA policistrónico (MVA-HBVvac) expresó todas las proteínas esperadas y mostró una excelente inmunogenicidad in vivo en ratones C57BL/6.
Ejemplo 13: Aumento de la inmunogenicidad de las construcciones de MVA mediante la coexpresión de CD70
Para mejorar la inmunogenicidad in vivo de vectores de vacuna basados en MVA, se construyó un vector MVA que expresaba CD70 de una manera bicistrónica (Fig. 34A).
Se cebaron una vez grupos de ratones C57BL/6 (n = 6-7) con HBcAg particulado coadyuvado con CpG y PCEP. Dos semanas más tarde, los ratones recibieron un refuerzo con MVA-central o con una cantidad igual de MVAcentral-CD70 que expresaba CD70 además o un MVA de tipo salvaje como control (Figura 34B). Los ratones se sacrificaron el día 35 para evaluar las respuestas inmunitarias humorales y celulares específicas de HBV. Si bien las respuestas inmunitarias humorales fueron idénticas después del refuerzo con MVAcentral y MVAcentral-CD70, las respuestas de las células T CD8+ contra la citocina específica de MVA (B8R) fueron leves y contra la citocina específica de HBV(C93) aumentaron significativamente en ratones que habían recibido un refuerzo con MVAcentral-CD70 (Fig. 34C). Un experimento repetido proporcionó resultados idénticos.
En un tercer experimento, se vacunaron grupos de ratones transgénicos para HBV sobre un fondo de C57BL/6 (n = 5-6). En estos animales, la tolerancia inmunitaria se puede romper tras la vacunación terapéutica. Después de cebar una vez con HBcAg particulado coadyuvado con CpG y PCEP, los ratones recibieron un refuerzo con MVA-central o con una cantidad igual de MVAcentral-CD70 que expresaba CD70 (Figura 35A y B). Los ratones vacunados con un MVA de tipo salvaje sirvieron como control. Los ratones se sacrificaron el día 35 para evaluar las respuestas de células T específicas de MVA y HBV. Las células T CD8+ seleccionadas sobre linfocitos asociados al hígado mostraron una secreción más pronunciada de IFNg e IL2 tras la reestimulación con péptidos específicos de MVA y HBVcentral, respectivamente, cuando los ratones habían sido vacunados con MVAcentral-CD70 en comparación con los ratones vacunados con MVAcentral. En ratones que habían recibido un refuerzo con MVAwt, se detectaron respuestas de células T específicas de MVA, pero no específicas de HBV (Fig. 35C).
Con respecto a los resultados anteriores, se puede concluir que la coexpresión de CD70 con un antígeno específico de HBV aumentó significativamente las respuestas de células T específicas tanto de MVA- como de HBV in vivo. La invención descrita ilustrativamente en la presente memoria se puede poner en práctica de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no descritos específicamente en la presente memoria. Así, por ejemplo, los términos "que comprende", "que incluye," que contiene, etc. se leerán de forma amplia y sin limitación.
La invención se ha descrito en la presente memoria de forma amplia y genérica. Cada una de las especies más restringidas y agrupaciones subgenéricas que entran dentro de la descripción genérica también forma parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa que elimina cualquier contenido del género, independientemente de si el material escindido se menciona específicamente en la presente memoria o no.
Otras realizaciones están dentro de las siguientes reivindicaciones. Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos de Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la invención también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un vector de vacunación recombinante que expresa
(a) una proteína de la envoltura (antígeno HBs) del serotipo adw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña o grande del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura pequeña o grande es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña; y
(b) una proteína central (antígeno HBc) del serotipo ayw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B;
y al menos uno de los siguientes:
(c) una proteína de la envoltura inmunogénica (antígeno HBs) del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos estableicda en SEQ ID NO: 1; y/o
(d) una proteína central inmunogénica (antígeno HBc) del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos estableicda en SEQ ID NO: 2; y/o
(e) un dominio RT inmunogénico de una polimerasa del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos estableicda en SEQ ID NO: 3.
2. El vector de vacunación recombinante de la reivindicación 1,
(I) en donde el antígeno HBs en (c) y/o el antígeno HBc en (d) es/son del genotipo C del virus de la hepatitis B;
(II) en donde el antígeno HBs inmunogénico en (c) tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4 y/o el antígeno HBc inmunogénico en (d) tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 5 y/o el dominio RT inmunogénico de una polimerasa en (e) tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6;
(III) en donde la proteína central del serotipo ayw del virus de la hepatitis B en (b) es una proteína central truncada en el extremo C que comprende o consiste en los aminoácidos 1-149 del antígeno HBc del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B;
(IV) que expresa adicionalmente
(f) un CD70, en donde CD70 es preferiblemente un CD70 humano o en donde CD70 tiene preferiblemente al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 26;
(V) en donde el vector de vacunación recombinante es un virus, una partícula similar a un virus o una bacteria; o
(VI) en donde el vector recombinante es una cepa de Salmonella atenuada, un vector basado en CMV, VSV, un vector Adenoviral o un vector del Sarampión.
3. El vector de vacunación recombinante de la reivindicación 1 o 2, en donde el vector de vacunación recombinante es un virus MVA,
(I) en donde preferiblemente al menos una, preferiblemente al menos dos, preferiblemente al menos tres, preferiblemente al menos cuatro, preferiblemente cinco secuencias de ácido nucleico que codifican (a), (b), (c), (d), y/o (e) está/están comprendidas preferiblemente en un casete de expresión, en donde el casete de expresión codifica preferiblemente una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 7;
(II) en donde al menos uno de los ácidos nucleicos que codifican (a), (b), (c), (d) y/o (e) está preferiblemente bajo el control de un promotor de poxvirus, en donde el promotor de poxvirus es preferiblemente P7.5 o PH5, en donde el casete de expresión codifica preferiblemente una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 7; o
(III) en donde una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de (a), (b), (c), (d) y/o (e) se inserta preferiblemente en la deleción I (del I), deleción II (del II), deleción III (del III), deleción IV (del IV), deleción V (del V) o deleción VI (del VI), preferiblemente la deleción III (del III) del genoma del MVA.
4. Un virus MVA que expresa
(a) una proteína de la envoltura (antígeno HBs) del serotipo adw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña o grande del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura pequeña o grande es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña;
y un virus MVA que expresa
(b) una proteína central (antígeno HBc) del serotipo ayw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B;
para su uso en un método de vacunación contra la hepatitis B, en donde el método comprende:
(i) administrar a un sujeto
(a') una proteína de la envoltura del serotipo adw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña o grande del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura pequeña o grande es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña; y/o
(b') una proteína central (antígeno HBc) del serotipo ayw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B; y (ii) administrar el virus MVA que expresa (a) y el virus MVA que expresa (b) al sujeto.
5. El virus MVA para su uso de la reivindicación 4, en donde el virus MVA que expresa (a) y/o el virus MVA que expresa (b) expresan adicionalmente CD70.
6. Un virus MVA que expresa
(a) una proteína de la envoltura (antígeno HBs) del serotipo adw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña o grande del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura pequeña o grande es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña; y
(b) una proteína central (antígeno HBc) del serotipo ayw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B;
para su uso en un método de vacunación contra la hepatitis B, en donde el método comprende:
(i) administrar a un sujeto
(a') una proteína de la envoltura del serotipo adw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña o grande del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura pequeña o grande es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña; y/o
(b') una proteína central (antígeno HBc) del serotipo ayw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B; y (ii) administrar el virus MVA al sujeto.
7. El virus MVA para su uso de la reivindicación 6, en donde el virus MVA expresa adicionalmente CD70.
8. Un vector de vacunación recombinante según la reivindicación 3, para su uso en terapia o vacunación.
9. El vector de vacunación recombinante para su uso según la reivindicación 8, en donde el uso consiste en un método de vacunación contra la hepatitis B, en donde el uso comprende
(i) administrar a un sujeto
(a') una proteína de la envoltura del serotipo adw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña o grande del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura pequeña o grande es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña; y/o
(b') una proteína central (antígeno HBc) del serotipo ayw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B; y (ii) administrar el virus MVA al sujeto.
10. El virus MVA o vector de vacunación recombinante para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9,
(I) en donde el método de vacunación es un método de vacunación terapéutica;
(II) en donde (i) del método de vacunación consiste en una etapa de cebado y (ii) del método de vacunación es una etapa de refuerzo;
(III) en donde la proteína de la envoltura y/o la proteína central en (i) se administran conjuntamente con al menos un coadyuvante, en donde el coadyuvante se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en poli[di(carboxilato-etilfenoxi)]fosfaceno (PCEP), un oligonucleótido inmunoestimulador, un agonista del receptor de tipo toll (TLR), una saponina o combinaciones de los mismos, en donde el agonista de TLR es preferiblemente un agonista de TLR 3, un agonista de TLR 4, un agonista de TLR 7, un agonista de TLR 8 o un agonista de TLR 9, y en donde el oligonucleótido inmunoestimulador es preferiblemente poli I/C, CpG, un ligando de RIG-I, un ligando de STING, di-AMP cíclico, di-CMP cíclico, di-GMP cíclico, un agonista de Tl R 7, un agonista de TLR 8, CTA1DD o dmLT, en donde el coadyuvante es preferiblemente PCEP y/o un coadyuvante CpG o en donde el coadyuvante es preferiblemente di-AMP cíclico;
(IV) en donde (i) se realiza al menos aproximadamente 1 día antes de realizar (ii), preferiblemente al menos aproximadamente 5 días, preferiblemente al menos aproximadamente 1 semana, preferiblemente de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 8 semanas, preferiblemente de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 5 semanas, preferiblemente de aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 4 semanas; o
(V) en donde el método de vacunación comprende adicionalmente después de (i) y antes de (ii):
(i') administrar a un sujeto
(a') una proteína de la envoltura del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña o grande del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura pequeña o grande es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña; y/o
(b') una proteína central (antígeno HBc) del genotipo D del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B, en donde (i') es preferiblemente una etapa de refuerzo, en donde (i) se realiza preferiblemente al menos aproximadamente 1 día antes de realizar (i'), preferiblemente al menos aproximadamente 5 días, preferiblemente al menos aproximadamente 1 semana, preferiblemente de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 8 semanas, preferiblemente de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 5 semanas, preferiblemente de aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 4 semanas, y en donde (i') se lleva a cabo preferiblemente al menos aproximadamente 1 día antes de realizar (ii), preferiblemente al menos aproximadamente 5 días, preferiblemente al menos aproximadamente 1 semana, preferiblemente de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 8 semanas, preferiblemente de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 5 semanas, preferiblemente de aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 4 semanas; o
11. El virus MVA para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en donde la administración es por vía parenteral o mucosa,
(I) en donde la administración es preferiblemente intramuscular, y en donde la etapa (i) y/o (i') comprenden la administración de un coadyuvante, en donde el coadyuvante comprende di-AMP cíclico; o
(II) en donde la administración es preferiblemente subcutánea o intramuscular, y en donde la etapa (i) y/o (i') comprenden la administración de un coadyuvante, en donde el coadyuvante comprende poli I/C o ligando de RIG-I.
12. Una vacuna o una composición farmacéutica que comprende el vector de vacunación recombinante o el virus MVA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
13. La vacuna de la reivindicación 12, en donde el vector de vacunación recombinante es un vector de vacunación recombinante de la reivindicación 3 o un vector de vacunación recombinante de la reivindicación 1 que es una cepa de Salmonella atenuada, o en donde la vacuna es una vacuna parenteral o mucosa.
14. Un kit que comprende:
(i) una composición proteica que comprende:
(a) una proteína de la envoltura del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña o grande del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura pequeña o grande es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña; y/o
(b) una proteína central (antígeno HBc) del genotipo D del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B;
(ii) una vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13.
15. El kit de la reivindicación 14,
(I) en donde la composición de proteína es adecuada para la administración parenteral, en donde la composición preferiblemente comprende al menos un coadyuvante que es PCEP y/o un coadyuvante CpG; (II) en donde la composición de proteína es adecuada para la administración a través de la mucosa, en donde la composición preferiblemente comprende un coadyuvante seleccionado del grupo que consiste en CTA1DD, dmLT, PCEP, poli I/C, ligando de RIG-I, c-di-AMP, c-di-CMP y c-diGMP o combinaciones de los mismos;
(III) en donde la composición de proteína es adecuada para la administración intramuscular, en donde la composición comprende preferiblemente al menos un coadyuvante que es di-AMP cíclico; o
(IV) en donde la composición de proteína es adecuada para la administración subcutánea o intramuscular, en donde la composición preferiblemente comprende al menos un coadyuvante que es poli I/C.
16. Un casete de expresión que comprende ácidos nucleicos que codifican:
(a) una proteína de la envoltura (antígeno HBs) del serotipo adw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña o grande del serotipo adw del genotipo A del virus de la hepatitis B, en donde la proteína de la envoltura pequeña o grande es preferiblemente una proteína de la envoltura pequeña; y
(b) una proteína central (antígeno HBc) del serotipo ayw del virus de la hepatitis B, en donde la proteína central es preferiblemente del serotipo ayw del genotipo D del virus de la hepatitis B;
y al menos una de los siguientes:
(c) una proteína de envoltura inmunogénica (antígeno HBs) del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1; y/o
(d) una proteína central inmunogénica (antígeno HBc) del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2; y/o
(e) un dominio RT inmunogénico de una polimerasa del virus de la hepatitis B que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3.
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