ES2834916T3 - Agente terapéutico dirigido de dendrímero de polilisina - Google Patents

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Abstract

Una macromolécula que comprende: (1) un dendrímero que comprende; (i) un grupo funcional de núcleo triamino o tetraamino que tiene un primer átomo de nitrógeno para la unión a un primer grupo funcional y la menos dos átomos de nitrógeno adicionales para la unión a unidades de construcción de lisina o de análogos de lisina; y (ii) una o más capas de unidades de construcción de lisina o de análogos de lisina, donde cada unidad de construcción en una primera de las capas está unida al grupo funcional de núcleo mediante un enlace amida, a través de al menos dos átomos de nitrógeno adicionales del grupo funcional de núcleo, y las unidades de construcción en capas subsiguientes están unidas a una capa previa a través de un enlace amida, donde la capa más externa de una o más unidades de construcción de lisina o de análogos de lisina presenta al menos una amina superficial para la unión a uno o más segundos grupos funcionales; (2) un primer grupo funcional unido al grupo funcional de núcleo a través del primer átomo de nitrógeno, donde el primer grupo funcional es un agente seleccionado del grupo que consiste en agentes farmacéuticamente activos y agentes dirigidos a receptores de superficie celular o a tejidos, y donde el primer grupo funcional no son unidades de construcción de lisina o de análogos de lisina; (3) uno o más segundos grupos funcionales unidos a las aminas de la capa más externa de unidades de construcción de lisina o de análogos de lisina, y donde el segundo grupo funcional es un agente modificador de la farmacocinética seleccionado del grupo que consiste en polifluorohidrocarburos, ácidos grasos, lípidos, ácidos desoxicólicos, polietilén glicol (PEG), polipropilén glicol (PPG), formas modificadas con alquilo de PEG y PPG, y estructura de polietiloxazolina; y donde las unidades de construcción se seleccionan del grupo que consiste en: Lisina* 1 que tiene la estructura: **(Ver fórmula)** Glicil-Lisina* 2 que tiene la estructura: **(Ver fórmula)** Análogo 3, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 1 o 2; y b y c son de forma independiente números enteros 1, 2, 3 o 4: **(Ver fórmula)** , Análogo 4, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1 o 2; y b y c son de forma independiente números enteros 2, 3, 4, 5 o 6: **(Ver fórmula)** , Análogo 5, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4 o 5: **(Ver fórmula)** Análogo 6, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 0, 1, 2, 3, 4 o 5: **(Ver fórmula)** Análogo 7, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y 5 b y c son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4 o 5: **(Ver fórmula)** , Análogo 8, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4 o 5: **(Ver fórmula)** donde cada denota el residuo carbonilo del grupo carboxilo de cúspide que forma un enlace amida con un átomo de nitrógeno del núcleo o un átomo de nitrógeno de una generación previa de unidades de construcción; donde cada grupo metileno de las unidades de construcción puede ser reemplazado por un grupo metilenoxi (CH2-O) o etilenoxi (CH2-CH2-O), siempre que esto no dé como resultado la formación de un grupo funcional carbonato (-O-C(O)-O-) o carbamato (-O-C(O)-N-) en la unidad de construcción.

Description

DESCRIPCIÓN
Agente terapéutico dirigido de dendrímero de polilisina
Campo de la invención
La presente invención se refiere de forma general a macromoléculas ramificadas. En particular, la invención se refiere a dendrímeros, derivados de lisina o análogos de lisina, que portan una pluralidad de grupos funcionales. La invención se refiere además a composiciones que los comprenden. Dichas macromoléculas son útiles en aplicaciones terapéuticas.
Antecedentes de la invención
La identificación de nuevos compuestos para uso en preparaciones farmacéuticas constituye una parte importante de la búsqueda de más terapias fiables y efectivas. Sin embargo, igual de importante es el desarrollo y la modificación de compuestos conocidos, que reducen los riesgos asociados a nuevos candidatos a fármaco y que reducen significativamente el desarrollo y el coste de llevar el fármaco a desarrollo clínico.
Muchos fármacos no superan los ensayos clínicos, bien sea porque sus propiedades físicas (en particular, la solubilidad) los hacen difíciles de formular, o bien porque presentan un bajo índice terapéutico que conduce a efectos tóxicos a las elevadas concentraciones de fármaco que se producen justo después de la dosificación. Otros defectos incluyen una baja absorción, una baja biodisponibilidad, inestabilidad, efectos secundarios sistémicos debidos a la incapacidad de dirigir los fármacos a sus dianas, y la incapacidad de controlar su biodistribución, metabolismo y eliminación renal o hepática una vez administrados. De forma similar, algunos productos actuales del mercado pueden ser mejorados en relación a dichas cuestiones.
Se han probado una serie de estrategias para mejorar el perfil de un compuesto farmacéutico, que incluyen la formulación del agente farmacéutico en una formulación de liposomas, micelar o de micelas poliméricas, así como la unión covalente del agente farmacéutico a una cadena principal de polímero hidrofílica.
Las características de un agente modificador de perfil ideal incluyen que tenga una estructura bien definida, que permita un control preciso de las características de absorción, distribución, metabolismo o excreción (ADME) (también conocido como farmacocinética) del compuesto en cuestión y que sea capaz, de forma ventajosa, de portar múltiples compuestos por agente o construcción. La toxicidad de un compuesto en cuestión puede modularse mediante su liberación controlada desde dicho agente o construcción, estando expuesto el cuerpo solo a las concentraciones en plasma terapéuticas del compuesto.
En los últimos años, las macromoléculas dendríticas, o dendrímeros, han demostrado un número creciente de aplicaciones en biotecnología y en aplicaciones farmacéuticas. Las macromoléculas dendríticas son una clase especial de polímeros con estructuras densamente ramificadas que se caracterizan por unas mayores concentraciones de grupos funcionales por unidad de volumen molecular que los polímeros ordinarios. Existen tres subclases de macromoléculas dendríticas: polímeros hiperramificados aleatorios; polímeros dendrinjerto y dendrímeros (que incluyen dendronas), clasificadas en base al grado relativo de control estructural presente en cada una de las arquitecturas dendríticas (Fréchet y Tomalia "Dendrimers andother Dendritic Polymers", Wiley and Sons, Nueva York, 2002). Las propiedades únicas de los dendrímeros en particular, tal como su elevado grado de ramificación, multivalencia, arquitectura globular y peso molecular bien definido, los convierten en prometedoras nuevas estructuras para aplicaciones farmacéuticas. En la última década, se ha producido un aumento de la investigación en el diseño y la síntesis de dendrímeros biocompatibles, y de su aplicación en muchas áreas de la biociencia, que incluyen fármacos macromoleculares, administración de fármacos, imágenes biomédicas y dispositivos médicos.
La utilidad potencial de los polímeros dendríticos, como vectores de administración de fármacos y como activos farmacéuticos, ha recibido un interés creciente en los últimos años. Sin embargo, aunque la bibliografía está repleta de informes, por ejemplo, de esquemas de síntesis para el montaje de dendrímeros, descripciones de interacciones dendrímero-fármaco y eficiencias de carga de fármaco y, de forma creciente, evaluaciones in vitro de interacciones de dendrímeros con líneas celulares, hay muy poca información que describa los fundamentos farmacocinéticos y el destino metabólico de los dendrímeros.
Adicionalmente, sigue suponiendo un reto la preparación de dendrímeros que circulen en la sangre durante un tiempo suficiente para acumularse en los sitios diana, pero que también puedan ser eliminados del cuerpo a una velocidad razonable para evitar una acumulación a largo plazo. Además, todavía es difícil predecir la localización de los dendrímeros en los tejidos de forma anticipada, y se requieren más estudios para determinar el efecto de los grupos dendríticos periféricos sobre dichas propiedades. Un área adicional que requiere de investigación es la liberación de fármacos desde los dendrímeros. Los impedimentos estéricos asociados a la densa arquitectura dendrítica globular dificultan el diseño de enlaces enzimáticamente eliminables.
Sorprendentemente, se ha descubierto que al introducir uno o más grupos funcionales, tal como se describe en la presente memoria, se puede mejorar significativamente la eficacia de la macromolécula, pero sin un impacto adverso significativo en, o interferencia con, otros grupos funcionales que pueda haber presentes.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a dendrímeros que tienen un primer grupo funcional unido a su grupo funcional nuclear y al menos un segundo grupo funcional unido a la superficie de la capa más exterior de las unidades de construcción (unidades de construcción superficiales) del dendrímero. En particular, la invención se refiere a un dendrímero que comprende un núcleo triamino o tetraamino y una o más capas de unidades de construcción de lisina o análogos de lisina, donde el dendrímero tiene un primer grupo funcional unido a un átomo de nitrógeno del grupo funcional nuclear y uno o más grupos funcionales secundarios unidos a los átomos de nitrógeno amino superficiales de la capa más exterior de las unidades de construcción.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una macromolécula que comprende:
(i) un grupo funcional nuclear triamino o tetraamino que tiene un primer átomo de nitrógeno amino para la unión a un primer grupo funcional y al menos dos átomos de nitrógeno amino adicionales para la unión a unidades de construcción de lisina o de análogo de lisina, tal como se define en las reivindicaciones;
(ii) un primer grupo funcional unido al grupo funcional nuclear a través del primer átomo de nitrógeno, donde el primer grupo funcional es un agente seleccionado del grupo que consiste en agentes farmacéuticamente activos y agentes dirigidos a receptores de la superficie celular o a tejidos;
(iii) al menos una capa de unidades de construcción de lisina o de análogo de lisian, presentando la capa más externa átomos de nitrógeno amino superficiales para la unión a uno o más grupos funcionales secundarios, estando dichas capas unidas al grupo funcional nuclear a través de al menos dos átomos de nitrógeno amino adicionales del grupo funcional nuclear; y
(iv) uno o más grupos funcionales secundarios unidos a los átomos de nitrógeno amino superficiales de la capa más externa de unidades de construcción de lisina o análogo de lisina, donde el segundo grupo funcional es un agente modificador de la farmacocinética seleccionado del grupo que consiste en polifluorohidrocarburos, ácidos grasos, lípidos, ácidos desoxicólicos, polietilén glicol (PEG), polipropilén glicol (PPG), formas modificadas con alquilo de PEG y PPG, y estructuras de polietiloxazolina.
La incorporación de un agente farmacéuticamente activo en una macromolécula de la invención puede proporcionar un perfil de liberación extendida al agente, o extender su tiempo de residencia en plasma durante el uso. La incorporación de un agente modificador de la farmacocinética a dicha macromolécula también puede potenciar el perfil de liberación del agente farmacéuticamente activo, o extender adicionalmente su tiempo de residencia en plasma durante el uso. La incorporación de un agente dirigido a diana en una macromolécula de la invención puede proporcionar un aumento de la concentración de la macromolécula en los tipos de célula diana o de tejido diana, y de forma ventajosa un aumento de la captación de la macromolécula en los tipos de célula diana o de tejido diana, o dirigir la macromolécula a una diana de proteína, ADN o ARN en uso, o un medio más eficiente y reproducible para la unión de la macromolécula a la superficie de un componente de un dispositivo diagnóstico o médico en uso.
A su vez, se pueden incorporar dos o más de los tipos diferentes de grupos funcionales descritos anteriormente en la macromolécula para proporcionar una macromolécula que tenga múltiples funcionalidades complementarias.
El segundo grupo funcional es tal como se describe en las reivindicaciones. Se puede unir un segundo grupo funcional a solo uno, varios o todos los átomos de nitrógeno amino superficiales. La macromolécula puede contener solo un primer y un segundo grupos funcionales, o puede incluir uno o más grupos funcionales terceros (y opcionalmente cuartos y quintos) como se define en la presente memoria, que opcionalmente pueden estar unidos a grupos amino superficiales para proporcionar una macromolécula con un primer grupo funcional en el núcleo y al menos uno de cada uno de los grupos funcionales segundo y tercero (y opcionalmente cuarto y quinto) en la superficie de la macromolécula. Los grupos funcionales terceros (y opcionalmente cuartos y quintos) se pueden seleccionar a partir de agentes farmacéuticamente activos, agentes modificadores de la farmacocinética y agentes de interacción.
Los grupos funcionales pueden unirse directamente de forma independiente al átomo de nitrógeno apropiado, o pueden unirse a través de un ligando eliminable o no eliminable.
Las macromoléculas según este aspecto de la presente invención son particularmente adecuadas para la preparación de un agente farmacéuticamente activo. De este modo, en una realización de la invención, al menos el primer grupo funcional comprende un agente farmacéuticamente activo. La macromolécula puede incluir un único agente farmacéuticamente activo unido al núcleo y/o a las unidades de construcción superficiales, o una pluralidad de agentes farmacéuticamente activos (que pueden ser iguales o diferentes), en el núcleo y/o en puntos seleccionados de la superficie de la macromolécula.
En un ejemplo particular de esta realización, un agente farmacéuticamente activo es unido al grupo funcional nuclear de la macromolécula. En ejemplos adicionales de la misma, el agente farmacéuticamente activo es una proteína o un polipéptido.
En la presente invención, al menos el segundo grupo funcional comprende un agente modificador de la farmacocinética tal como se define en las reivindicaciones. La macromolécula puede incluir un único agente modificador de la farmacocinética en las unidades de construcción de la superficie, o una pluralidad de agentes modificadores de la farmacocinética (que pueden ser iguales o diferentes) en puntos seleccionados de la superficie de la macromolécula.
La presentación de la macromolécula que incluye un primer grupo funcional, que comprende un agente farmacéuticamente activo, y al menos un segundo grupo funcional, que comprende un agente modificador de la farmacocinética, puede dar como resultado de forma ventajosa unas mejores prestaciones de la macromolécula.
También se describe, aunque no forma parte de la invención, una macromolécula en la que el primer grupo funcional comprende un agente dirigido a diana, tal como un anticuerpo, y al menos un segundo grupo funcional comprende un agente farmacéuticamente activo.
También se describe, aunque no forma parte de la invención, un proceso para preparar una macromolécula, que incluye las etapas de:
(i) proporcionar
(a) un dendrímero que comprende:
(i) un grupo funcional nuclear que tiene un primer átomo de nitrógeno amino para la unión a un primer grupo funcional y al menos dos átomos de nitrógeno amino adicionales para la unión a unidades de construcción de lisina o de análogo de lisina;
(ii) un primer grupo protector en el primer átomo de nitrógeno amino;
(iii) al menos una capa de unidades de construcción de lisina o de análogo de lisina, presentando la capa más externa átomos de nitrógeno amino superficiales para la unión al uno o más grupos funcionales secundarios, dichas capas unidas al grupo funcional nuclear a través de al menos dos átomos de nitrógeno amino adicionales del grupo funcional nuclear; y
(iv) un segundo grupo protector en uno o más de los átomos de nitrógeno amino superficiales de la capa más externa de unidades de construcción de lisina o de análogo de lisina;
(b) un primer grupo funcional; y
(c) al menos un segundo grupo funcional;
(ii) eliminar de forma selectiva el(los) segundo(s) grupo(s) protector(es) usando condiciones de reacción para las cuales el primer grupo protector es inerte;
(iii) unir el al menos un segundo grupo funcional a el(los) átomo(s) de nitrógeno amino desprotegido(s);
(iv) eliminar el primer grupo protector;
(v) unir el primer grupo funcional al primer átomo de nitrógeno amino desprotegido o al grupo ligando.
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que incluye una macromolécula según la invención y un excipiente, vehículo o adyuvante, farmacéuticamente aceptables, para la misma.
También se describe, aunque no forma parte de la invención, una macromolécula como la descrita en la presente memoria para uso en terapia.
La macromolécula y las composiciones farmacéuticas que contienen la macromolécula según la presente invención pueden utilizarse en diversas aplicaciones, tal como se discute en la presente memoria, donde la capacidad para dirigir o unir el agente farmacéuticamente activo a un sitio particular de acción, o a un tipo particular de célula o tejido, o a una diana de proteína, ADN o ARN, o a un sustrato, o para modificar su farmacocinética.
Descripción detallada de las realizaciones
El término “anticuerpo” tal como se usa en la presente memoria en la especificación y reivindicaciones incluye el anticuerpo completo, o un derivado o un fragmento, tal como derivado de la ruptura enzimática o química, u obtenido recombinantemente, o una imitación de la región de unión de un anticuerpo producido mediante técnicas de expresión de proteínas o a través de síntesis química, que retiene la actividad de unión específica. El término incluye anticuerpos monoclonales y todas las diversas formas derivadas de anticuerpos monoclonales, que incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos de longitud completa (p.ej., que tienen una región Fc intacta), fragmentos de unión a antígeno, que incluyen, por ejemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab’ y F(ab’)2 ; y polipéptidos derivados de anticuerpos producidos usando métodos recombinantes tales como anticuerpos de cadena individual. Los términos “anticuerpo” y “anticuerpos” tal como se usan en la presente memoria también se refieren a anticuerpos humanos producidos por ejemplo en animales transgénicos o a través de presentación a fagos, así como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados.
El término “unido” tal como se usa en la presente memoria en la especificación y en las reivindicaciones se refiere a una conexión entre componentes químicos de la macromolécula mediante unión covalente, puentes de hidrógeno, adsorción, enlace metálico, fuerzas de Van der Waals, enlace iónico, enlaces quelato-metal-quelato, enlaces ligandoreceptor, duplos o triplos formados a partir de cadenas complementarias de ADN, ARN o análogos peptídicos de los mismos, o cualquier combinación de los anteriores. Una forma particular contemplada en la presente memoria es el enlace covalente. La unión puede ser directa, o indirecta a través de un grupo o grupos funcionales intervinientes, tal como un grupo o grupos de puente, espaciador, o enlace, términos que pueden usarse de forma intercambiable en la presente memoria. Adicionalmente, un grupo de enlace o grupo funcional o amina puede estar modificado adicionalmente con un modificador para facilitar la unión.
El término “punto seleccionado de unión” tal como se usa en la presente memoria en la especificación y en las reivindicaciones se refiere a un grupo amina o grupos amina del polímero dendrímero que se diferencian de otros grupos amina del polímero dendrímero por reaccionar de forma única en una etapa definida de la síntesis del polímero dendrímero, permitiendo con ello la unión de un grupo funcional o estructura dendrítica. Esto permite de forma ventajosa conocer la posición y la distribución en la superficie de un grupo funcional. El punto seleccionado de unión puede, por tanto, ser el primer átomo de nitrógeno del grupo funcional nuclear o de la superficie del dendrímero.
El término “unión” tal como se usa en la presente memoria en la especificación y reivindicaciones se refiere a la capacidad de una molécula dada para ser capturada (unida) y mantenida por otra, por ejemplo, un ligando para interactuar con una diana de tal modo que la interacción entre el ligando y su diana es relativamente específica. Los ejemplos incluyen la interacción específica entre un anticuerpo, o derivados y fragmentos del mismo y el anticuerpo diana (receptor); o la interacción entre una molécula pequeña, tal como biotina, folato o digoxina, y sus respectivas dianas (receptores o anticuerpos).
El término “derivados” y “fragmentos” tal como se usan en la presente memoria en la especificación y reivindicaciones, y cuando se usan en relación a polipéptidos, particularmente anticuerpos, se refiere a equivalentes funcionales que tienen una secuencia de aminoácidos similar, digamos de al menos 80, 85, 90 o 95% de homología, y que retienen, al menos en cierto grado, las actividades del polipéptido.
El término “análogo de lisina” tal como se usa en la presente memoria en la especificación y reivindicaciones se refiere a una molécula que tiene un único grupo carboxilo de cúspide y dos o tres grupos amina primarios. Las unidades de análogo de lisina de la invención se definen en las reivindicaciones.
En un ejemplo, pueden ser asimétricos, como en la Lisina 1 de partida, cuyo significado se define como que los enlaces y átomos que unen las aminas primarias al carboxilato de cúspide son diferentes. En un segundo ejemplo, los análogos de lisina pueden ser simétricos, cuyo significado se define como que los enlaces y átomos que unen cada amina primaria con el carboxilato son idénticos, y que ignora la asimetría introducida potencialmente cuando cada amina primaria sigue reaccionando.
El término “estructura dendrítica” tal como se usa en la presente memoria en la especificación y reivindicaciones se refiere a una unidad discreta de la macromolécula. Cuando una de las ramas de la macromolécula es cortada en el enlace que conecta una de las aminas reaccionables de la unidad de construcción o del núcleo al grupo carboxilato de cúspide de la unidad de construcción unida, la estructura dendrítica será “expulsada”. El grupo carboxilato de cúspide de la estructura dendrítica representa el punto en el que la estructura dendrítica se uniría a un núcleo de macromolécula en crecimiento durante el proceso de síntesis de una macromolécula de la invención.
El término “unidad de construcción” tal como se usa en la presente memoria en la especificación y reivindicaciones se refiere a lisina o análogos de lisina usados en el montaje de las estructuras dendríticas. La unidad de construcción puede ser una unidad de construcción sub-superficial, formando parte de la capa, o generación, de unidades de construcción que portan aminas que pueden reaccionar adicionalmente con el grupo carboxilato de cúspide de una unidad de construcción adicional. A su vez, las capas pueden describirse como la capa de superficie-excepto-una, lo que significa la primera sub-superficie inmediatamente adyacente a la capa superficial; la capa superficie-excepto-dos es la segunda capa por debajo de la capa superficial; la capa superficie-excepto-tres es la tercera capa por debajo de la capa superficial; etcétera.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “capa” o “generación” se refiere a una pluralidad de unidades de construcción que tienen el mismo grado de conectividad con el grupo funcional de núcleo, es decir, que tienen el mismo número de unidades de construcción que unen la unidad de construcción en cuestión a los átomos de nitrógeno del núcleo. Por ejemplo, las unidades de construcción que están unidas, bien directamente o bien a través de un grupo de enlace, a los átomos de nitrógeno del grupo funcional nuclear se refieren a la primera capa o generación. Las unidades de construcción que tienen una unidad de construcción entre ellas y los átomos de nitrógeno del grupo funcional nuclear se refieren a la segunda capa o generación. Una capa o generación de unidades de construcción debe contener al menos dos unidades de construcción. Cada capa de unidades de construcción es homogénea con respecto a la unidad de construcción usada, sin embargo, se pueden usar diferentes unidades de construcción para preparar diferentes capas. Por tanto, en determinadas realizaciones de la invención, la macromolécula está compuesta por una o más capas de un único tipo de unidad de construcción, p.ej., lisina. En otras realizaciones, la macromolécula comprende al menos dos capas de unidades de construcción donde al menos dos capas están compuestas por diferentes unidades de construcción.
El término “molécula pequeña” se refiere a cualquier molécula no peptídica que tiene un peso molecular de hasta aproximadamente 1500 Daltons, tal como entre aproximadamente 200 y aproximadamente 600, o entre aproximadamente 600 y aproximadamente 1000, o entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 1500 Daltons. El término “superficie” tal como se usa en la presente memoria, se usa en referencia a la capa más externa de unidades de construcción del dendrímero.
El término “unidad de construcción superficial” tal como se usa en la presente memoria en la especificación y en las reivindicaciones se refiere a la capa más externa de unidades de construcción de la macromolécula, es decir, no hay más unidades de construcción unidas a las aminas superficiales de una unidad de construcción superficial.
El término “amina superficial” o “amino superficial” o “átomo de nitrógeno amino superficial” tal como se usa en la presente memoria en la especificación y en las reivindicaciones se refiere a cualquiera de los nitrógenos más externos de la estructura dendrítica que derivan de unidades de construcción superficiales. Dichas aminas superficiales representan puntos de unión para nuevas unidades de construcción, grupos de enlace o grupos funcionales.
El término “grupo funcional” tal como se usa en la presente memoria en la especificación y en las reivindicaciones se refiere a cualquier grupo, tal como se define en la presente memoria, que puede unirse, directa o indirectamente, a un primer nitrógeno amino del núcleo o a una amina superficial con el propósito de servir a una función establecida. La naturaleza y el número de grupos funcionales pueden determinarse mediante técnicas analíticas estándar que incluyen RMN de protón/carbono, espectrometría de masas ESI o MALDI.
El término “grupos protectores de amina”, tal como se usa en la presente memoria en la especificación y en las reivindicaciones, se refiere a grupos para los cuales existe un orden de eliminación, de tal modo que los grupos que no están destinados a eliminación son inertes en las condiciones de eliminación. Cuando los grupos protectores se definen como “resolubles”, esto significa que las condiciones para la eliminación de un grupo pueden afectar a la integridad del segundo grupo, y esto requiere que el segundo grupo sea eliminado en primer lugar si la integridad del primer grupo debe mantenerse. Cuando los grupos protectores se definen adicionalmente como “ortogonales”, esto significa que cada grupo es inerte en las condiciones de eliminación requeridas para eliminar cada uno de los otros grupos del conjunto ortogonal. Es importante destacar que los grupos protectores son resolubles u ortogonales solo cuando se usan las condiciones de reacción apropiadas. Existen métodos generales descritos en la técnica para la mono-protección selectiva de moléculas de poliamina. Dichos métodos se describen en Krapcho y Kuell, Synthetic Commun. (1990) 20: 2559.
Las macromoléculas de la presente invención están construidas a partir de al menos una capa de unidades de construcción de lisina o de análogo de lisina. Los ejemplos de unidades de construcción de la invención incluyen las siguientes (donde # indica el residuo de carbonilo del grupo carboxilo cúspide):
Lisina* 1 que tiene la estructura:
Figure imgf000006_0001
Glicil-Lisina* 2 que tiene la estructura:
Figure imgf000006_0002
Análogo 3, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 1 o 2; y b y c son de forma independiente números enteros 1,2, 3 o 4
Figure imgf000006_0003
Análogo 4, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1 o 2; y b y c son de forma independiente números enteros 2, 3, 4, 5 o 6
Figure imgf000007_0001
Análogo 5, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 1,2, 3, 4 o 5
Figure imgf000007_0002
Análogo 6, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 0, 1, 2, 3, 4 o 5
Figure imgf000007_0003
Análogo 7, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4 o 5
Figure imgf000007_0004
Análogo 8, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4 o 5
Figure imgf000007_0005
Análogo 9, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4 o 5
Figure imgf000008_0001
Adicionalmente, cualquier grupo metileno de las unidades de construcción puede ser reemplazado por un grupo metilenoxi (CH2-O) o etilenoxi (CH2-CH2-O), siempre que esto no dé como resultado la formación de un grupo funcional carbonato (-O-C(O)-O-) o carbamato (-O-C(O)-N-) en la unidad de construcción.
En determinadas realizaciones de la invención, las unidades de construcción se seleccionan entre Lisina 1, Glicil-Lisina 2 o Análogo de lisina 5 :
Figure imgf000008_0002
donde a es un número entero 0, 1 o 2 y adicionalmente cualquier grupo metileno de 1, 2 o 5 puede estar reemplazado por un grupo metilenoxi o etilenoxi siempre que esto no dé como resultado la formación de un grupo funcional carbonato o carbamato en la unidad de construcción.
Tanto el grupo carboxilato como los grupos amina de las unidades de construcción pueden derivatizarse para potenciar o disminuir la reactividad de dichos grupos. Los grupos amina reaccionables pueden protegerse (desactivarse) usando grupos protectores de amina tales como los grupos Boc, CBz, 4-nitrobenziloxicarbamato (4-NO2-CBz) Fmoc, Dde, CF3CO2 , 2-halo-CBz, Alloc, Me3SiEtSO2, Troc, o-NO-2PhSO2 y 2,4-dinitrobenceno-sulfonilo.
En general, un grupo carboxilo libre no es suficientemente reactivo para reaccionar con una amina para formar el enlace amida, por lo que preferiblemente se proporcionan algunos medios que faciliten la deshidratación y así llevar a la reacción a completarse. Esto puede lograrse, por ejemplo, “activando” el grupo carboxilo como un derivado de haluro de acilo o un derivado de éster activado (The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology Vol. 1 Major Methods of Peptide Bond Formation; Academic Press Nueva York 1979, editores Gross, E. y Meienhofer, J., Peptides: Chemistry and Biology. Wiley-VCH Weinheim 2002, Sewald, N. y Jakubke, H-D., The Chemical Synthesis of Peptides Clarendon Press, Oxford 1994, Jones, J.).
En el primer método de activación, el reactivo que contiene el ácido carboxílico se hace reaccionar con un segundo reactivo que contiene un grupo hidroxilo en presencia de un reactivo deshidratante y, cuando se requiere, con otros agentes activantes, para proporcionar un producto en el que el grupo funcional que contiene ácido y el grupo funcional que contiene hidroxilo se unen a través de un enlace éster. Este producto se conoce como “éster activo”. El reactivo que contiene el grupo hidroxilo se elige de tal modo que el éster producto reaccione fácilmente con aminas primarias para formar amidas con la liberación del reactivo mencionado anteriormente que contiene el grupo hidroxilo. En algunos casos, el éster activado es suficientemente estable para permitir su aislamiento, purificación y almacenamiento antes de su uso.
En un segundo método de activación, el reactivo que contiene el grupo carboxilo puede hacerse reaccionar “in s itu con un agente activante para formar una especie de acilo que reacciona a continuación con las aminas primarias también presentes “in situ” o añadidas después de un tiempo de activación previo apropiado para conducir a la formación del enlace de amida requerido.
Ambos métodos de activación se describen más detalladamente en el documento PCT/AU2006/001591.
Las unidades de construcción de lisina o de análogo de lisina de las estructuras dendríticas se hacen reaccionar con un compuesto de núcleo. Un núcleo puede ser cualquier compuesto que contenga tres o más nitrógenos reactivos (amino), uno de los cuales acaba convirtiéndose en el punto de unión para el primer grupo funcional (primer átomo de nitrógeno amino). Cabe destacar que dicho átomo de nitrógeno puede ser protegido mediante un grupo protector adecuado durante la construcción del dendrímero.
En determinadas realizaciones de la invención, el núcleo puede prepararse haciendo reaccionar un átomo de nitrógeno de un compuesto diamino con lisina o con un análogo de lisina para formar un compuesto de núcleo triamino. El grupo amino no reaccionado del compuesto diamino se convierte entonces en el grupo amino para la unión del primer grupo funcional, mientras que al menos dos grupos amino de la lisina o del análogo de lisina se convierten en los puntos de unión de las unidades de construcción.
Los compuestos diamino adecuados para reacción con lisina o análogos de lisina, tal como los incluidos en la presente memoria a modo de ejemplo, para preparar los grupos funcionales de núcleo incluyen:
Figure imgf000009_0001
donde a es un número entero de 1 a 9, por ejemplo 1,2, 3, 4 o 5;
Figure imgf000009_0002
donde a, b y c son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4 o 5, tal como 2 o 3; y d es un número entero entre 0-100, tal como 1 -30; particularmente 1 -5, 6-10, 11-15, 16-20, 21 -25 o 26-30;
Figure imgf000009_0003
donde a y b son de forma independiente números enteros 0, 1,2, 3, 4 o 5;
Figure imgf000009_0004
donde a y c son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y donde c es un número entero entre 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
Figure imgf000009_0005
donde a y d son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y donde b y c son de forma independiente números enteros 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Los compuestos triamino pueden emplearse sin ninguna modificación adicional (es decir, reacción con lisina o un análogo de lisina), o pueden hacerse reaccionar con una lisina o un análogo de lisina para formar un núcleo tetraamino. Los ejemplos de compuestos triamino incluyen:
Figure imgf000009_0006
donde a, b y c, son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
Figure imgf000010_0001
donde a, b y c, son de forma independiente números enteros 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
Figure imgf000010_0002
donde a, b y c, son de forma independiente números enteros 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
Figure imgf000010_0003
donde a, b y c, son de forma independiente números enteros 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y d, e y f, son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Se pueden emplear compuestos tetraamino sin ninguna modificación adicional (es decir, reacción con lisina o un análogo de lisina) o pueden hacerse reaccionar con lisina o un análogo de lisina para formar un núcleo pentaamino. Los ejemplos de compuestos tetraamino incluyen:
Figure imgf000011_0001
donde a, b y c, son de forma independiente números enteros 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6
Figure imgf000011_0002
donde a, b y c, son de forma independiente números enteros 1,2, 3, 4, 5 o 6
Figure imgf000011_0003
donde a, b y c, son de forma independiente números enteros 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6; y e, f, g y h, son de forma independiente números enteros 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
También se describen, aunque no forman parte de la invención reivindicada, macromoléculas en las que cualquier grupo metileno del núcleo puede ser reemplazado por un grupo metilenoxi o etilenoxi, siempre que esto no dé como resultado la formación de un grupo carbonato o carbamato dentro del núcleo.
En determinadas realizaciones, el núcleo es un compuesto triamino que resulta de la reacción de lisina, o de un análogo de lisina, y un compuesto diamino seleccionado entre los siguientes:
Figure imgf000012_0001
donde a es un número entero 1,2, 3, 4 o 5;
Figure imgf000012_0002
donde a, b y c, son de forma independiente números enteros de 2 o 3 y d es un número entero entre 1 -30;
Figure imgf000012_0003
donde a y d, son de forma independiente números enteros de 1 o 2, y donde b y c, son de forma independiente números enteros entre 0, 1 o 2.
En ejemplos particulares, el núcleo está constituido por un compuesto diamino, tal como el compuesto 11 donde cada uno de a, b, c y d son 1 (NEOEOEN) y lisina o un análogo de lisina, por ejemplo, el análogo 5 , donde cada uno de a, b y c son 2 (Su(NPN)2).
En otras realizaciones, el núcleo es un compuesto triamino o tetraamino seleccionado entre los siguientes, solo o como producto de reacción con lisina o un análogo de lisina:
Figure imgf000012_0004
donde a, b y c, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 1 a 2;
Figure imgf000012_0005
donde a, b y c, son de forma independiente números enteros 0, 1 o 2; y d, e y f, son de forma independiente números enteros 1 o 2.
o un grupo tetraamino
Figure imgf000013_0001
donde a, b, c y d, son de forma independiente números enteros 0 o 1
Figure imgf000013_0002
donde a, b, c y d, son de forma independiente números enteros 1 o 2;
Figure imgf000013_0003
donde a, b, c y d, son de forma independiente números enteros 0, 1 o 2; y e, f, g y h, son de forma independiente números enteros 1 o 2.
La preparación de polímeros dendrímeros de lisina y análogos de lisina es bien conocida y se describe, a modo de ejemplo, en las Patentes de EE.UU. n° 4.289.872 y 4.410.688.
En general, el dendrímero tiene un núcleo que retiene un único sitio reactivo que es preservado (mediante un grupo protector apropiado) mientras que el resto de sitios amino del núcleo son utilizados para la adición de unidades de construcción. El sitio reactivo protegido del núcleo se usa al final para unir una única entidad (primer grupo funcional) al núcleo de la macromolécula.
Al construir el dendrímero, es posible, a través del uso de grupos protectores de amina, hacer que reaccionen solo algunos de los grupos amina superficiales de las unidades de construcción de una capa o generación, por ejemplo haciendo reaccionar solo uno de dos grupos amino disponibles en una unidad de construcción, o solo uno o dos de tres grupos amino disponibles en una unidad de construcción, o alternativamente, haciendo reaccionar todos los grupos amino de solo algunas de las unidades de construcción superficiales, por ejemplo una de cada dos o tres unidades de construcción, o dos de cada tres unidades de construcción. Sin embargo, en determinadas realizaciones de la invención, cada grupo amino de una unidad de construcción de una capa o generación particular se hace reaccionar adicionalmente con una unidad de construcción de lisina o de análogo de lisina hasta que se ha construido el número deseado de capas o generaciones. De este modo, por ejemplo, cuando se usan unidades de construcción que tienen dos grupos amino, el número de unidades de construcción en una capa es el doble que el de la sub-capa inmediata y cuando se usan unidades de construcción que tienen tres grupos amino, el número de unidades de construcción de una capa es tres veces el de la sub-capa inmediata.
Los grupos funcionales comprenden residuos de un agente farmacéuticamente activo, un agente modificador de la farmacocinética, o un agente dirigido a diana. El primer y segundo grupos funcionales son como se define en las reivindicaciones, y opcionalmente la superficie del dendrímero también puede portar uno o más grupos funcionales adicionales diferentes, p.ej., tercero, cuarto o quinto grupos funcionales. Un grupo funcional puede ser el residuo de un único tipo de agente, p.ej., un agente farmacéuticamente activo, o puede comprender dos agentes como una única entidad, p.ej., dos agentes farmacéuticamente activos unidos o enlazados o un agente farmacéuticamente activo unido o enlazado a un agente modificador de la farmacocinética o un agente farmacéuticamente activo unido o enlazado a un agente dirigido a diana. Un grupo funcional, cuando se refiere, por ejemplo, a un segundo grupo funcional, se considera que se refiere a un único tipo de grupo funcional, p.ej., cada uno de los más de un segundo grupo funcional son iguales.
En algunas realizaciones de la invención, un único tipo, o dos, tres o cuatro tipos de grupo funcional se unen a todos los grupos amino superficiales. En otras realizaciones, solo una porción de grupos amino superficiales, por ejemplo, los de unidades de construcción alternas o uno de cada dos grupos superficiales por unidad de construcción, o 1 o dos de cada tres grupos superficiales por unidad de construcción, tienen un grupo funcional unido.
Tal como se usa en la presente memoria, un agente farmacéuticamente activo incluye cualquier molécula o precursor de la misma, o residuo de la misma, que es capaz de conferir un efecto fisiológico o reacción tras la administración a un sujeto, tanto solo como en combinación con otro agente farmacéuticamente activo. El término también abarca agentes o residuos de los mismos que por sí mismos no confieren un efecto fisiológico o el nivel deseado del mismo, pero en combinación o uno o más agentes farmacéuticos adicionales, o cuando se unen al dendrímero, proporcionan la actividad fisiológica deseada. Los agentes farmacéuticamente activos contemplados en la presente memoria pueden ser naturales, incluyendo modificaciones y derivados de moléculas naturales, o pueden ser sintéticos, y los ejemplos contemplados en la presente memoria incluyen moléculas pequeñas, polímeros (no dendríticos y dendríticos, donde el grupo funcional dendrítico puede tener el mismo número de generaciones o un número diferente de generaciones respecto a la macromolécula), sacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, aminoácidos, péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, glicoproteínas, ácidos nucleicos y nucleótidos. Los agentes farmacéuticamente activos particulares contemplados están destinados a aplicaciones terapéuticas o profilácticas. Los ejemplos de efectos fisiológicos o reactividad conferidos por los agentes farmacéuticamente activos incluyen represión o estimulación de reacciones biológicas, por ejemplo, a través de la unión a un sustrato, sustitución o adición de sustancias, eliminación de sustancias perjudiciales y muerte celular.
Se han desarrollado fármacos basados en proteínas que proporcionan un beneficio clínico significativo al paciente, pero en muchos casos dichos fármacos requieren una dosificación frecuente y tamaños de dosis grandes. Esto es debido a que las propiedades fisio-químicas de los fármacos de proteínas conducen a una rápida excreción renal o eliminación metabólica. De forma ventajosa, cuando se unen a un dendrímero tal como se describe en la presente memoria, las propiedades farmacocinéticas de la proteína pueden alterarse de forma beneficiosa.
De esta manera, en determinados ejemplos de la invención, el agente(s) farmacéuticamente activo(s) de la macromolécula pueden tener base de aminoácido tal como una proteína, una glicoproteína, un péptido, oligopéptido, polipéptido o una enzima o derivados de los mismos.
Las enzimas pueden seleccionarse a partir de enzimas específicas de carbohidratos, enzimas proteolíticas, oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Los ejemplos de enzimas incluyen asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa, adenosina desaminasa, superóxido dismutasa, endotoxinasas, catalasas, quimotripsina, lipasas, uricasas, adenosina difosfatasa, tirosinasas y bilirrubina oxidasa. Las enzimas específicas de carbohidratos de interés incluyen glucosa oxidasas, glicosidasas, glucocerebrosidasas, glucuronidasas, etc.
Los péptidos y proteínas que no contienen grupos funcionales de tipo glicano pueden ser glicosilados enzimáticamente usando glicosiltransferasas, o pueden sintetizarse químicamente, por ejemplo, usando química de péptidos estándar y componentes de aminoácido glicosilados tal como asparagina N-galactosilada. Alternativamente, se pueden diseñar sitios de glicosilación dentro las proteínas o péptidos, que se producen normalmente in vivo en su forma no glicosilada.
Los ejemplos de proteínas y péptidos incluyen hemoglobina, proteínas de suero tales como factores sanguíneos que incluyen los Factores VII, Fx , FiI, FV, proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, factor tisular, FXI, FXII y FXIII, así como secuencia FVIII, variantes FIX del mismo; inmunoglobulinas, citocinas tales como interleucinas, alfa-, beta- y gammainterferones, factores estimulantes de colonia que incluyen factores estimulantes de colonia de granulocitos, factores de crecimiento derivados de plaqueta y proteína activante de fosfolipasa (PUP). Otras proteínas y péptidos incluyen insulina, proteínas vegetales tales como lectinas y ricinas, factores de necrosis tumoral y alelos relacionados, formas solubles de receptores de factor de necrosis tumoral, receptores de interleucina y formas solubles de receptores de interleucina, factores de crecimiento tales como factores de crecimiento tisular, tal como TGFa’s o TGFps y factores de crecimiento epidérmicos, hormonas, somatomedinas, eritropoyetina, hormonas pigmentarias, factores de liberación hipotalámicos, hormonas antidiuréticas, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona estimulante de folículos, hormona estimulante de tiroides, activador de plasminógeno de tejido, y similares. Las inmunoglobulinas de interés incluyen IgG, IgE, IgM, IgA, IgD y fragmentos de las mismas.
El agente farmacéuticamente activo de la macromolécula puede incluir alternativamente, o adicionalmente, un compuesto farmacéutico insoluble en agua, un compuesto farmacéutico soluble en agua, un compuesto farmacéutico lipofílico, o mezclas de los mismos.
El agente farmacéuticamente activo puede ejemplificarse a través de uno o más tipos seleccionados de los grupos de la Tabla 1.
Tabla 1. Agentes farmacéuticamente activos
Preparaciones de acetonemia Agentes anabólicos
Anestésicos Analgésicos
Agentes anti-ácido Agentes anti-artríticos
Anticuerpos Anti-convulsivos
Anti-fúngicos Anti-histamínicos
Anti-infectivos Anti-inflamatorios
Anti-metabolitos Anti-microbianos
Anti-mitóticos Agentes anti-parasitarios
Anti-protozoos Agentes anti-ulcerativos
Compuestos farmacéuticos antivirales Fármacos modificadores del comportamiento
Compuestos biológicos Sangre y sustitutos sanguíneos
Broncodilatadores y expectorantes Compuestos farmacéuticos de terapia de cáncer y relacionados Compuestos farmacéuticos cardiovasculares Compuestos farmacéuticos del sistema nervioso central Diuréticos Anticonceptivos
Hormonas del crecimiento Terapias para la diabetes
Hematínicos Compuestos farmacéuticos para la fertilidad
Terapias de sustitución hormonal Promotores del crecimiento
Inmunosupresores Hemostáticos
Hormonas y análogos Inmunoestimulantes
Minerales Relajantes musculares
Nutracéuticos y nutricionales Productos naturales
Compuestos farmacéuticos oftalmológicos Agentes terapéuticos para la obesidad
Agentes terapéuticos para el dolor Fármacos para la osteoporosis
Proteínas Péptidos y polipéptidos
Retinoides Compuestos farmacéuticos respiratorios
Sedantes y tranquilizantes Productos de trasplante
Acidificadores urinarios Esteroides
Vitaminas Vacunas y adyuvantes
La presente invención es particularmente apropiada para compuestos farmacéuticos que sean muy activos incluso en cantidades extremadamente pequeñas, y que se pretenda su administración sostenida a largo plazo, particularmente para evitar problemas de toxicidad con dosis estándar. Los ejemplos incluyen paclitaxel y doxorrubicina.
Las macromoléculas según la presente invención pueden ser particularmente útiles para facilitar dirigir de forma pasiva los fármacos a sitios de inflamación. Esta dirección es posible debido al aumento de permeabilidad de la vasculatura asociada a la inflamación, a las macromoléculas y debido a un drenaje linfático limitado. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, el agente farmacéuticamente activo es un agente anti-inflamatorio.
En una realización, la macromolécula según la presente invención incluye dos o más agentes farmacéuticamente activos diferentes, derivados de los mismos, precursores de los mismos, o residuos de los mismos, como grupos funcionales, tanto como grupos funcionales separados o juntos en una única entidad. Las macromoléculas según este aspecto de la presente invención pueden, por tanto, tener aplicación en terapias de combinación.
El agente farmacéuticamente activo puede ser un agente antitumoral seleccionado entre uno o más de los siguientes: rituximab, oxaliplatino, docetaxel, gemcitabina, trastuzumab, irinotecan, paclitaxel, bevacizumab, carboplatino, cetuximab, doxorrubicina, pemetrexed, epirrubicina, bortezomib, topotecan, azacitidina, vinorrelbina, mitoxantrona, fludarabina, doxorrubicina, alemtuzumab, carmustina, ifosfamide, idarrubicina, mitomicina, fluorouracilo, cisplatino, metotrexato, melfalan, arsénico, denileukina diftitox, citarabina, levofolinato cálcico, ciclofosfamida, etoposide, viscum album, mesna, gemtuzumab, ozogamicina, busulfan, pentostatina, cladribina, bleomicina, daunorrubicina, bendamustina, dacarbacina, raltitrexed, vincristina, fotemustina, fosfato de etoposide, porfimer sódico y vinblastina.
Los agentes farmacéuticamente activos pueden ser una combinación de cualesquier dos o más de las categorías ejemplificadas en la Tabla 1 y/o de los agentes antitumorales enumerados anteriormente, tanto en la forma de entidad individual cuando se apropiado, como en forma de grupos funcionales separados.
Los ejemplos de combinaciones incluyen combinaciones de:
compuestos farmacéuticos quimioterapéuticos; compuestos farmacéuticos antiinflamatorios y compuestos farmacéuticos antiartríticos; agentes terapéuticos para la obesidad y agentes terapéuticos para la diabetes; hormonas del crecimiento y promotores del crecimiento; relajantes musculares y antiinflamatorios; compuestos farmacéuticos respiratorios y broncodilatadores o antimicrobianos; agentes quimioterapéuticos y vitaminas, y otros similares.
Otro grupo de agentes farmacéuticamente activos contemplados en la presente memoria son moléculas o residuos de los mismos que en sí mismas no proporcionan necesariamente ninguna actividad fisiológica deseada o significativa, pero cuando se unen a la superficie o al núcleo del dendrímero, o cuando se administran en combinación (tanto de forma separada, como secuencia o como en una composición íntima) con uno o más agentes farmacéuticamente activos adicionales, confieren un efecto fisiológico.
La solicitud de Patente Internacional N° PCT/AU95/00350 (WO 95/34595) describe una clase de compuestos antivirales que comprenden un polímero dendrímero que tiene una pluralidad de grupos superficiales, donde al menos uno de los grupos superficiales tiene un grupo funcional (o grupo terminal) que contiene aniones o cationes enlazados o ligados al mismo, particularmente un grupo funcional que contiene ácido sulfónico, que contiene ácido carboxílico o que contiene trimetilamonio. La solicitud de Patente Internacional N° PCT/AU97/00447 (WO 98/03573) describe el uso de polímeros dendrímeros que contienen aniones o cationes para la inhibición profiláctica o terapéutica de la angiogénesis en un paciente animal, humano o no humano. El grupo funcional (o grupo terminal) que contiene aniones o cationes, que está enlazado o ligado a los grupos superficiales del polímero dendrímero incluyen grupos funcionales que contienen ácido sulfónico, grupos funcionales que contienen ácido carboxílico, grupos funcionales que contienen ácido fosfórico o fosfónico, grupos funcionales que contienen ácido borónico, grupos funcionales que contienen ácido neuramínico o siálico o grupos funcionales que contienen ácido neuramínico o siálico modificado en la posición 4 del mismo, o en otra posición.
Dichos grupos funcionales aniónicos o catiónicos (y sus sales farmacéuticamente aceptables) son contemplados en la presente memoria a modo de ejemplos de agentes farmacéuticamente activos. Dos ejemplos particulares de dichos agentes incluyen -CO-3,5,-Ph(SO3Na)2, COCH2O-3,6-Naph(SO3Na)2.
En algunos ejemplos de la invención, el primer grupo funcional comprende un agente farmacéuticamente activo. En otros ejemplos, los terceros grupos funcionales comprenden agentes farmacéuticamente activos.
Un agente modificador de la farmacocinética incluye cualquier molécula o residuo de la misma que puede modificar o modular el perfil farmacocinético de un agente farmacéuticamente activo o del dendrímero que porta el agente farmacéuticamente activo, incluyendo el de absorción, distribución, metabolismo y/o excreción. En una realización particular, el agente modificador de la farmacocinética se selecciona para prolongar la vida media en plasma del agente o macromolécula farmacéuticamente activa.
En determinadas realizaciones de la invención, al menos un grupo funcional es un agente farmacéuticamente activo y otro grupo funcional es un grupo farmacocinético.
El agente modificador de la farmacocinética de la invención se selecciona del grupo que consiste en polifluorohidrocarburos, ácidos grasos, lípidos, ácidos desoxicólicos (ácidos biliares) o un polietilén glicol (PEG), o polipropilén glicol, y las formas modificadas con alquilo terminal de los mismos, o una estructura de polietiloxazolina (p.ej., PEOX).
Se contempla que las macromoléculas de la invención son particularmente útiles cuando un agente farmacéuticamente activo (tal como un polipéptido o un fármaco de molécula pequeña) es presentado en combinación con al menos un agente modificador de la farmacocinética tal como un PEG.
Los grupos PEG pueden incluir cadenas de etilén glicol relativamente cortas, por ejemplo, grupos PEG que incluyen uno o más de los siguientes
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El porcentaje de PEG, grupos polietiloxazolina y/o el tamaño del PEG o del grupo polietiloxazolina pueden modificarse y ajustarse para adecuarse a diferentes agentes farmacéuticamente activos.
Estudios previos han sugerido que después de la administración intravenosa, macromoléculas de poli-L-lisina marcadas con 3H sin modificar terminales son metabolizadas rápidamente para liberar lisina. Sin embargo, sorprendentemente se ha establecido que la PEGilación de la macromolécula reduce el reconocimiento del dendrímero por parte de las enzimas proteolíticas, así como de las proteínas de suero, y suprime la eliminación fagocítica, prolongando con ello los tiempos de circulación en plasma. Adicionalmente, la PEGilación puede aumentar el volumen hidrodinámico de la macromolécula, reduciendo así la tasa de eliminación renal.
Por ejemplo, los presentes inventores han descubierto que la vida media en plasma y el grado de eliminación urinaria de macromoléculas de lisina PEGiladas marcadas con 3H depende del peso molecular. Las macromoléculas PEGiladas más grandes (es decir, >30kD) eran eliminadas de forma relativamente lenta del plasma a la orina en comparación con los dendrímeros más pequeños (esto es, <20kD). Esto a pesar del hecho de que los complejos de macromoléculas más pequeños mostraron signos de interacción con los componentes del plasma, conduciendo a la creación de una especie de mayor peso molecular. La eliminación de estos complejos fue rápida y solo se recuperó macromolécula intacta en la orina. Por lo tanto, es evidente que incrementar el tamaño de cualquier forma no necesariamente da como resultado un aumento de la vida media en plasma de las macromoléculas. Se observó que las macromoléculas más grandes se acumulaban en el hígado y el bazo. Sin embargo, esto se producía en periodos de tiempo extendidos y la cantidad acumulada fue inferior al 10 % de la dosis.
En una realización adicional preferida, en la que un primer grupo funcional se une a la macromolécula, el PEG o PEOX, como segundos grupos funcionales, pueden constituir diferentes cantidades respecto al primero. Preferiblemente, las ratios de grupos PEG o PEOX respecto a otros grupos funcionales está en el rango de 128:1 a 2:1, tal como 64:1 a 4:1, y particularmente de 32:1 a 8:1.
En una realización en la que los grupos funcionales de PEG o PEOX están unidos en un punto de unión seleccionado, las ratios de grupos PEG o PEOX respecto a otros grupos funcionales está preferiblemente en el rango de 1:2 a 1:128, más preferiblemente de 1:4 a 1:64, y lo más preferiblemente de 1:8 a 1:32.
El tamaño relativo de los grupos PEG o PEOX individuales se puede reducir para reducir o eliminar interferencias con el agente farmacéuticamente activo.
En una realización preferida, los grupos PEG están relativamente monodispersos y se eligen de entre un rango de pesos moleculares de 200 a 10.000 Daltons, más preferiblemente los grupos Pe G se eligen de entre un rango de pesos moleculares de 300 a 5.000 Daltons, y lo más preferiblemente de un rango de pesos moleculares de 500 a 3.500 Dalton.
La PEGilación también puede mejorar la solubilidad de los compuestos, y por tanto puede ayudar a la solubilidad de un fármaco de por sí insoluble unido a la superficie de la macromolécula.
Adicionalmente, se puede incorporar un grupo funcional modificador de la farmacocinética a la macromolécula, para reducir la unión no específica. Esto se puede realizar a través de un grupo funcional interaccionante que aumenta la especificidad de unión de un candidato al grupo funcional, o mediante un grupo funcional que habitualmente se dice que tiene propiedades de “anti-ensuciamiento”, en tanto en cuanto que minimiza la unión no deseada o inespecífica. PEG es un grupo funcional de este tipo, como se ha descrito en la presente memoria, que puede, por ejemplo, disminuir el reconocimiento de la macromolécula por parte de proteínas de suero inespecíficas.
Por tanto, la presente invención proporciona un medio mediante el cual los fármacos con una elevada toxicidad, o una baja solubilidad, o ambas, se pueden modificar para proporcionar un vehículo que proporcione una liberación controlada del fármaco para mantener una concentración a largo plazo de los niveles en plasma del agente terapéutico, que no sea tóxica.
Las macromoléculas según la presente invención pueden contener de forma ventajosa uno o más grupos funcionales que pueden interaccionar de forma selectiva, tal como mediante unión u otra asociación, con otras moléculas (“interaccionantes”). La presencia de dicho grupo funcional puede, por tanto, permitir que la macromolécula sea dirigida o concentrada a un tipo celular o tipo de tejido en particular, o a una proteína (p.ej., un receptor o una enzima), un polisacárido o una diana de ADN o ARN, tanto in vivo como in vitro, o que sea capturada por otra molécula para facilitar la unión de la macromolécula a una superficie. Los ejemplos particulares incluyen lectinas y anticuerpos y otros ligandos (que incluyen moléculas pequeñas) para receptores de superficie celular. La interacción se puede producir mediante cualquier tipo de enlace o asociación, que incluyen covalente, iónico y puente de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals.
En una realización, el agente interaccionante es un péptido o polipéptido de anticuerpo. De forma ventajosa, a través de su unión selectiva al sustrato, el anticuerpo preferentemente dirige o concentra la macromolécula a una diana apropiada in vivo o in vitro, tal como un receptor de superficie celular o un polisacárido, mediante la unión a dicha diana. Dicho anticuerpo de unión se refiere adicionalmente en la presente memoria como “agente dirigido”.
En otra realización, el grupo funcional interaccionante es una molécula pequeña no peptídica. De forma ventajosa, la molécula pequeña preferentemente dirige o concentra la macromolécula a una diana apropiada in vivo o in vitro, tal como un receptor, u otra molécula pequeña, mediante la interacción con dicha diana. Dicha molécula pequeña se refiere adicionalmente en la presente memoria como “agente de captura”.
La presente invención es particularmente apropiada para el uso dirigido de agentes farmacéuticamente activos, donde el agente farmacéuticamente activo es una molécula de fármaco pequeña.
También se describe en la presente memoria, aunque no forma parte de la invención, un caso en el que el grupo funcional interaccionante puede estar unido al núcleo a través del primer átomo de nitrógeno amino, y el segundo grupo funcional puede ser una combinación de un fármaco de molécula pequeña y un grupo que modifique la farmacocinética del fármaco de molécula pequeña y/o la macromolécula, tal como PEG, PEOX o ácido poli-glutámico, como grupos funcionales discretos o como un único tipo combinado de grupo funcional. Una serie de receptores de superficie celular diferentes son útiles como dianas para la unión y, preferiblemente, la captación potenciada de macromoléculas. En particular, los receptores y sus ligandos relacionados que son útiles en la presente invención incluyen el receptor de folato, el receptor adrenérgico, el receptor de hormona del crecimiento, el receptor de la hormona luteinizante, el receptor de estrógeno, el receptor de factor de crecimiento epidérmico, el receptor de factor de crecimiento de fibroblasto (p.ej., FGFR2), el receptor de IL-2, CFTR y el receptor de factor de crecimiento epitelial vascular (VEGF).
El folato es una vitamina que es esencial para la biosíntesis de bases de nucleótido y, por tanto, es requerido en grandes cantidades en las células en proliferación. En las células cancerosas, este aumento de requerimiento de ácido fólico se refleja frecuentemente en una sobreexpresión del receptor de folato, que es responsable del transporte de folato a través de la membrana celular. El receptor de folato está regulado al alza en muchos cánceres humanos, que incluyen malignidades del ovario, cerebro, riñón, mama, células mieloides y el pulmón, y la densidad de receptores de folato sobre la superficie celular parece aumentar según se desarrolla el cáncer.
La especificidad relativa del receptor de folato por las células tumorales, y en particular por células tumorales de estadios avanzados, significa que el ligando de receptor de folato, folato, puede ser un candidato útil para una acción dirigida de fármacos quimioterapéuticos a tumores. La especificidad de la interacción del receptor de folato con un conjugado de ligando de receptor de folato-fármaco quimioterapéutico se ve potenciada adicionalmente por la diferencia en el patrón de expresión de superficie celular del receptor de folato entre determinadas células no transformadas y las células epiteliales transformadas malignamente. En las células no transformadas, el receptor de folato se expresa preferentemente sobre la superficie de la membrana apical de las células, que está enfrentada a la cavidad corporal y es inaccesible a reactivos presentes en la sangre. Sin embargo, tras la transformación, la célula pierde su polaridad y el receptor se puede hacer accesible a los fármacos del sistema circulatorio que están dirigidos al receptor de folato. Por consiguiente, el folato o un derivado de folato pueden constituir un grupo funcional de unión (captura) útil de la macromolécula de la presente invención.
En algunas realizaciones de la invención, el grupo funcional interaccionante es un péptido o polipéptido en la forma de un anticuerpo (agente dirigido), y se sintetiza para presentar múltiples residuos de histidina adyacentes (estructura de poli-histidina) en cualquiera de los extremos, N o C, una etiqueta de cisteína, o una combinación de ambos, para facilitar la reacción con el dendrímero desprotegido.
Los péptidos y anticuerpos dirigidos pueden expresarse fusionados a un extremo N o C, preferiblemente una estructura de poli-histidina N-terminal. La estructura de poli-histidina terminal puede utilizarse para conjugar el péptido dirigido al dendrímero del agente de contraste de la invención a través de un complejo de níquel, donde los iones de níquel están presentes como grupos superficiales sobre el dendrímero, o en los extremos de los ligandos que se extienden desde el dendrímero, formando un complejo con grupos de ácido nitriloacético. Alternativamente, la estructura de polihistidina puede utilizarse para una purificación de una etapa usando resinas de afinidad de níquel y eliminarse opcionalmente de la molécula purificada mediante la inclusión de un sitio de reconocimiento de ruptura de enteroquinasa o endopeptidasa. Dichos métodos de purificación serán conocidos por el especialista en la técnica.
Más preferiblemente, el polipéptido o anticuerpo dirigido puede expresarse fusionado a una cola de cisteína N terminal o C terminal, preferiblemente N terminal. La cisteína contiene un grupo tiol altamente nucleofílico que puede utilizarse en presencia de grupos específicos reactivos a tiol, tal como grupos de cloro, bromo o yodoacetamida, o del grupo maleimida, para formar un enlace tioéter; o en reacciones de intercambio de disulfuro con grupos funcionales reactivos con disulfuro tales como el grupo 2-piridinditio para formar puentes de disulfuro; en cualquier caso, que conducen a la ligación del polipéptido o anticuerpo dirigido al dendrímero.
Estos grupos reactivos de tiol se proporcionarían en el material dendrimérico a través de la reacción de agentes derivatizantes apropiados, tales como ácidos haloacéticos activados o derivados de maleimida de ácido 3-aminopropiónico, o ácido 3-(2-piridinditio)propiónico activado, con una o más aminas superficiales desprotegidas de forma selectiva de la macromolécula.
El polipéptido o anticuerpo dirigido también puede expresarse con una combinación de colas de cisteína e histidina. La cola de cisteína e histidina pueden estar expresadas cada una en extremos opuestos (p.ej., cola de cisteína N-terminal y cola de histidina C-terminal), o ambas en el extremo N o C.
La macromolécula puede utilizarse adicionalmente en varias aplicaciones para modificar la superficie de un dispositivo en el que la capacidad del dispositivo modificado para capturar o unirse a una molécula, célula o tipo de tejido en particular, o una proteína, diana de ARN o ARN, o para modificar las interacciones biológicas no específicas de las mismas, es ventajosa. La presentación de un agente interaccionante apropiado puede proporcionar un medio más reproducible y eficiente para unir la macromolécula a la superficie de un componente de un dispositivo diagnóstico o médico, en uso. A su vez, el componente del dispositivo tendrá más propiedades reproducibles debido a la naturaleza definida y controlada de la macromolécula.
Los agentes interaccionantes descritos en la presente memoria pueden ser uno de: un grupo funcional químico reactivo, un quelato para una metal de transición o una pareja de ligando de un par ligando-receptor de alta afinidad, ejemplificado por biotina-estreptavidina o digoxina-“anticuerpo anti-digoxina” (Mudgett-Hunter M, Margolies M N, Ju A, Haber E. J Immunol. 1982; 129: 1165-1172). Los agentes dirigidos de la invención se describen en las reivindicaciones.
Los ejemplos de dendrímeros y macromoléculas contemplados en la presente invención pueden representarse de forma conveniente según la siguiente fórmula:
[Primer Grupo Funcional] Núcleo [Unidad de Construcción]m [Segundo Grupo Funcional]p [Tercer Grupo Funcional]q
donde:
el núcleo, las unidades de construcción y los grupos funcionales son como se describe en las reivindicaciones;
m representa la suma de las unidades de construcción (que incluyen las capas sub-superficiales y superficiales) de la macromolécula. A modo de ejemplo, cuando cada capa comprende unidades de construcción que tienen 2 grupos amino, m es un número entero entre 2 y 32, por ejemplo 2, 4, 8, 16 o 32;
p representa el número de grupos funcionales secundarios unidos a los átomos de nitrógeno amino en la capa superficial (más externa) de unidades de construcción. A modo de ejemplo, cuando cada capa comprende unidades de construcción que tienen 2 grupo amino, p puede ser un número entero entre 1 y 64 (por ejemplo, 2, 4, 8, 16, 32 o 64); y
q representa el número de grupos funcionales terceros unidos a los átomos de nitrógeno en la capa superficial (más externa) de unidades de construcción. A modo de ejemplo, cuando cada capa comprende unidades de construcción que tienen 2 grupos amino, q puede ser un número entero entre 0 y 63, de tal forma que p y q no sean superiores a 64.
En la siguiente tabla se presentan las combinaciones particulares de grupos funcionales descritas en la presente memoria. Las combinaciones que forman parte de la invención están marcadas con un asterisco *.
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Tal como se ha descrito antes, los grupos funcionales pueden estar unidos a la macromolécula en un sitio de unión seleccionado tanto directamente como a través de un ligando eliminable o no eliminable.
El término “ligando” se refiere en la presente memoria a cualquier entidad química que sirve para unir los grupos funcionales al átomo amino superficial o de núcleo. Los ejemplos de ligandos contemplados en la presente invención incluyen polímeros tales como polietilén glicol (PEG), polipropilén glicol, poliarilos, péptidos, cadenas de alquilo y alquenilo, y sacáridos (mono, oligo y poli).
En realizaciones particulares, el ligando comprende una cadena de PEG, tal como entre 1 -100 unidades de repetición de etilenoxi, por ejemplo, entre 2-20 o 20-40 unidades de repetición.
Como grupos ligando se pueden utilizar grupos basados en PEG de cadena larga. Por ejemplo, se pueden usar PEG-péptidos de un modo similar a los péptidos convencionales, excepto en que el grupo funcional de PEG proporciona una estabilidad in vivo adicional y masa para el vehículo. Típicamente, se usa para conjugar fármacos a vehículos de anticuerpos y presenta la ventaja de aumentar la distancia entre el anticuerpo y el fármaco a la vez que expone el sitio de ruptura enzimática, disminuye la inmunogenicidad del conjugado, aumenta los tiempos de circulación en sangre y aumenta la solubilidad del complejo. Después de una internalización del conjugado y de la liberación enzimática del fármaco activo (que no necesariamente se libera como fármaco libre) se han observado efectos antiproliferativos para adriamicina y un derivado de duocarmicina.
Cuando se usan grupos funcionales de ligando para conectar grupos funcionales a la amina del núcleo o de la superficie de las macromoléculas, la reacción entre el ligando y el grupo funcional puede llevarse a cabo tanto antes, como después de que el grupo ligando reaccione con la amina apropiada del dendrímero.
Por tanto, se puede usar un ligando de una serie de formas para unir un primer grupo funcional al núcleo. En un primer método, el ligando puede unirse al núcleo y el primer grupo funcional se une al ligando. Alternativamente, el ligando puede unirse en primer lugar al grupo funcional y a continuación unirse al núcleo. En un tercer método, tanto el núcleo como el grupo funcional pueden unirse a un ligando o un componente de ligando, y los dos grupos ligando se pueden hacer reaccionar posteriormente para proporcionar un grupo ligando entre el núcleo y el primer grupo funcional.
De forma similar, se puede usar un ligando de varias formas para unir un segundo (o un tercero o un cuarto) grupo funcional a la superficie del dendrímero. El ligando se puede unir al átomo de nitrógeno amino de la superficie del dendrímero y el segundo (o tercero o cuarto) grupo funcional se puede unir entonces al ligando. Alternativamente, se puede unir primero el ligando al grupo funcional, y a continuación unirlo al átomo de nitrógeno amino de la superficie. Como antes, se puede unir un grupo ligando o un componente del mismo tanto al átomo de nitrógeno amino superficial como al segundo (o tercero o cuarto) grupo funcional, y a continuación hacer reaccionar los dos ligandos o componentes para proporcionar un grupo ligando entre la superficie y el grupo funcional.
Adicionalmente, se pueden incorporar grupos ligando en la síntesis de la macromolécula según la presente invención, por ejemplo, entre unidades de construcción. Tal como se ha descrito antes, el ligando se pueden unir bien a los átomos de nitrógeno amino superficiales, bien a la unidad de construcción que conforma la siguiente capa, o bien a ambos, para proporcionar en definitiva un ligando entre las unidades de construcción.
Se lleva a cabo una reacción usada para introducir uno o más grupos ligando en un dendrímero o en una estructura dendrítica (tanto en la superficie como en el núcleo) para asegurar la reacción completa de todas las aminas superficiales desprotegidas de una macromolécula con los grupos ligando. Típicamente, esto se realiza usando un exceso del grupo ligando elegido.
El ligando se puede hacer reaccionar con la estructura dendrítica o macromolécula desprotegida antes de la reacción del ligando con el grupo funcional. En una realización adicional, el ligando unido a la macromolécula puede a su vez portar un grupo protector que requiere desprotección para permitir la reacción con el grupo funcional.
Preferiblemente, los grupos protectores de amina se selecciona del grupo que incluye los grupos Boc, CBz, 4-nitrobenciloxicarbamato (4-NO2-CBz), Fmoc, Dde, CF3CO2 , 2-halo-CBz, Alloc, Me3SiEtSO2, T roc, o-NO-2 PhSO2 y 2,4-dinitrobenceno-sulfonilo, y preferiblemente Boc, CBz, 4-nitrobenciloxicarbamato (4-NO2-CBz), Fmoc 2-halo-CBz, Aloc y Me3SiEtSO2.
El ligando puede ser eliminable o no eliminable, dependiendo de los requerimientos del grupo(s) funcional(es) unido(s). Los ligandos eliminables pueden diseñarse para ser eliminados enzimáticamente, y por ejemplo pueden usarse en macromoléculas dirigidas a tejidos que expresan dichas enzimas. Alternativamente, puede preferirse un ligando lábil en ácido, de tal modo que el compuesto unido a él es liberado en condiciones ácidas, tal como en tejido hipóxico.
El grupo ligando puede incluir unidades de repetición seleccionadas para aportar rigidez a su cadena principal, o puede estar parcialmente reticulado para aportar rigidez a la cadena principal.
El ligando se hace eliminable o no eliminable mediante la presencia de un grupo estable o lábil apropiado en el ligando. Los ejemplos de grupos eliminables y no eliminables adecuados en un ligando incluyen:
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i) Ligandos de amida
La naturaleza de un enlace de amida es importante para determinar si el fármaco libre se liberará desde un conjugado. Por ejemplo, la conjugación de un fármaco (p.ej., doxorrubicina) a un vehículo a través de un enlace de amida produce un conjugado que es hidrolíticamente estable y que no ejerce ningún efecto anticancerígeno in vitro. Un fármaco ligado directamente a un vehículo a través de un enlace de amida tampoco será fácilmente liberado como fármaco libre, sino más bien como un fármaco-aminoácido si el propio vehículo es degradable. La liberación del fármaco libre desde los vehículos a través de un ligando de amida directo solo se podrá conseguir en circunstancias excepcionales, donde el propio fármaco sea una molécula de tipo peptídico y el enlace entre el fármaco y el vehículo sea eliminable enzimáticamente.
ii) Ligandos de hidrazona, oxima e imina.
Los enlaces de hidrazona, oxima e imina no requieren la presencia de enzimas para permitir la liberación del fármaco del vehículo. Son capaces de romperse hidrolíticamente en el enlace C=N en entornos de pH bajo, tal como en el espacio extravascular tumoral o dentro de lisosomas. Los ligandos de hidrazona, oxima e imina usados habitualmente surgen de la reacción de grupos funcionales hidracina, alcoxiamina o amina, respectivamente, de un ligando con un carbonilo (cetona o aldehído) de un resto farmacéuticamente activo. El enlace también puede modificarse para frenar la tasa de hidrólisis a través de la modificación del número de grupos alquilo que rodean al grupo del enlace C=N, o mediante la sustitución con grupos atractores de electrones (para aumentar la labilidad en ácido) o donantes de electrones (para disminuir la labilidad en ácido).
iii) Ligandos de éster
Se pueden preparar ligandos de éster que sean tanto lábiles en ácido como metabolizables. Se han usado ortoésteres para conjugar PEG a lípidos que se unen a vehículos de membrana aniónicos. La estabilidad del conjugado en condiciones ácidas (pH 4-6) depende de la estructura del ligando de éster o de ortoéster. En general, el a-metoxi-w-{N-(2-octadeciloxi-[1,3]dioxolan-4-il)metilamido}-polietilenglicoln0 muestra una buena estabilidad tanto a pH 4 como a pH 5, el a-metoxi-w-{N-(2-colesteriloxi-[1,3]dioxolan-4-il)metilamido}-polietilenglicol110 es muy estable a pH 5 pero moderadamente menos estable a pH 4, el a-metoxi-w-{N-(2-metil-s-octadeciloxi-[1,3]dioxan-5-il)-amido}-polietilenglicoln0 y el a-metoxi-w-{N-2-(3-hidroxipropil-colesterilcarbamato)-2-metil-[1,3]dioxan-5-il-amido}-polietilenglicoln0 no son estables. En términos de conjugación de éster sencilla a moléculas pequeñas, las funcionalidades de diéster proporcionan más sitios para la ruptura metabólica en comparación con los monoésteres que son más estables que los puentes de disulfuro, pero menos estables que los enlaces de amida.
iv) Ligandos peptídicos
Los ligandos peptídicos son con diferencia los más versátiles entre los ligandos eliminables dado que se pueden utilizar muchas combinaciones diferentes de aminoácidos para controlar la velocidad de eliminación y la enzima de eliminación. Sin embargo, dichos ligandos tienen dos problemas asociados a su uso como conjugados para fármaco y vehículo, 1) generalmente son eliminables mediante peptidasas no específicas por todo el cuerpo y por tanto pueden dar como resultado una toxicidad de fármaco no específica en los sitios de distribución no tumorales, y 2) la ruptura se puede producir en un sitio del ligando que dé como resultado un aminoácido sobrante ligado a la molécula de fármaco. Esto puede dificultar el efecto quimioterapéutico de la molécula de fármaco. Alternativamente, el aminoácido ligado puede no alterar los efectos farmacológicos del fármaco, pero puede afectar a su farmacocinética. Sin embargo, estos efectos de la ruptura pueden controlarse eligiendo un aminoácido apropiado en el ligando peptídico que se una directamente a la molécula de fármaco, p.ej., prolina.
Generalmente, se han diseñado ligandos eliminables de catepsina B para ser eliminados después de la endocitosis del conjugado de fármaco a través del sistema de lisosomas, ya que la catepsina se localiza en los lisosomas y no está libre en el citosol. La endocitosis generalmente se inicia después de la unión del vehículo (que habitualmente es un anticuerpo dirigido contra un receptor de superficie celular específico de cáncer o un ligando de un receptor de superficie celular específico de cáncer) a la membrana celular.
Las proteasas no específicas (esto es, las proteasas que no son específicas de una secuencia peptídica particular) pueden liberar un fármaco de una macromolécula PEGilada después de que se haya sometido a una extravasación y acumulación suficientes en el tejido tumoral.
Se aplican las siguientes líneas generales sobre la velocidad de la ruptura del péptido, donde a > b indica que la velocidad de la ruptura de a es mayor que la velocidad de ruptura de b. Para las secuencias de péptidos usadas como ligandos entre un compuesto farmacéutico activo y los nitrógenos terminales del dendrímero: Cys terminal > Cys Gly no terminal > Gly germinal = terminal, Gly Phe Gly > GlyGlyGly terminal y GlyGlyGlyPhe terminal = GlyProGly terminal.
Nota: los enlaces CysGly son reducidos por GSH. Los enlaces GlyGlyGly generalmente son muy estables respecto a otros enlaces peptídicos. La ruptura de dipéptidos generalmente es específica para proteasas particulares y puede controlarse en base a la expresión de varias proteasas contenidas dentro de las células tumorales.
v) Ligandos de disulfuro
Los ligandos de disulfuro son los ligandos más inestables usados actualmente y se ven sometidos a una rápida ruptura reductiva in vitro. Su estabilidad in vivo generalmente es mayor, sin embargo, que su estabilidad in vitro. Pueden formarse mediante enlaces de disulfuro entre aminoácidos que contienen azufre o en enlaces de disulfuro no basados en péptidos. También muestran una mayor reactividad con otros tioles nucleofílicos del cuerpo y por tanto muestran una rápida eliminación en plasma.
Sumario general de la capacidad de ruptura de ligandos
En circulación, el orden de capacidades de ruptura de ligando es el que se indica a continuación:
Disulfuro > péptidos de cadena larga > ésteres > hidrazonas > tetrapéptidos (GlyGlyGlyPhe) = tripéptidos (GlyPheGly > GlyGlyGly = GlyProGly) = o > dipéptidos (AlaVal, AlaPro, GlyPro, PheLeu, Val-Cys) > glutaraldehído = amida.
La estabilidad de varios ligandos se basa en los grupos a los cuales están conjugados (es decir, en la accesibilidad de las enzimas al ligando), el comportamiento del conjugado en el sitio de actividad requerida (es decir, la captación celular o la acumulación extracelular) y la naturaleza del conjugado (es decir, éster frente a amida). Es de esperar que el comportamiento in vivo de los conjugados de disulfuro con el sistema actual sea relativamente impredecible. Aunque los péptidos de cadena larga son evaluados de forma más fácil mediante proteasas para una ruptura rápida, pueden ser sometidos a ruptura de una forma demasiado rápida y en sitios no específicos, dando como resultado la liberación de una especie de péptido/aminoácido farmacéuticamente activa que puede no ser biológicamente activa.
La ruptura de un ligando basado en C=N (hidrazona, oxima o imina), conjugados de éster o péptido, se producirá al menos a lo largo de varios días, lo que permite que los conjugados se acumulen en el tejido tumoral. Cada uno tiene sus ventajas, pero los ligandos de éster o hidrazona pueden ser preferidos. Un enlace de éster que une un compuesto farmacéutico activo a la macromolécula proporciona un enlace que se puede romper rápidamente, y aunque puede no ser específico del sitio diana, la ruptura da como resultado la liberación de compuesto farmacéutico activo libre. Los enlaces de hidrazona producen conjugados que son más estables en la circulación general que los ésteres, y se rompen con mayor especificidad en el sitio del tumor por hidrólisis del enlace C=N. Sin embargo, la molécula farmacéuticamente activa puede necesitar ser modificada para permitir la formación de una hidrazona, por incorporación de un grupo carbonilo o de una hidracina.
En algunas realizaciones, el grupo ligando puede incluir dos grupos reactivos, F’ e Y’, que están conectados por uno o más carbonos o heteroátomos, preferiblemente mediante una cadena principal hidrocarbonada. El grupo reactivo F’ puede ser activado para reaccionar con grupos amina reactivos como los del núcleo, o la capa superficial o sub­ superficial de la estructura dendrítica. Típicamente, el grupo reactivo F’ es un grupo carboxilato o un residuo del mismo. El otro grupo funcional, Y’, es una amina que comprende un grupo protector, o se selecciona de tal modo que tenga una reactividad específica que es complementaria a un grupo reactivo de un grupo funcional deseado que debe estar unido al núcleo, o a la capa superficial o sub-superficial de una estructura dendrítica. Los ejemplos típicos de Y’ incluyen grupos amina, hidroxilo, tiol, alquenilo o alquinilo, nitrilo, haluro, carboxilato o azido.
Además de los ligandos descritos anteriormente, se pueden usar ligandos fotoeliminables con la presente invención. Por ejemplo, se pueden usar ligandos fotoeliminables heterobifuncionales. Los ligandos fotoeliminables heterobifuncionales pueden ser solubles en agua o en disolventes orgánicos. Contienen un éster activado que puede reaccionar con aminas o alcoholes y un epóxido que puede reaccionar con un grupo tiol. Entre los grupos éster y epóxido hay un grupo de fotoisomerización de 3,4-dimetoxi-6-nitrofenilo, que, cuando es expuesto a luz de ultravioleta cercano (365 nm), libera la amina o el alcohol en forma intacta. De esta manera, el componente farmacéuticamente activo, cuando está unido a la macromolécula usando tales ligandos, puede ser liberado en forma biológicamente activa o en forma activable mediante la exposición del área diana a luz de ultravioleta cercano.
En realizaciones adicionales, la preparación de la macromolécula puede incluir además la etapa de modificar el grupo amina y/o el ligando y/o el grupo funcional para facilitar la ligación del grupo funcional a la amina, tanto directamente como a través de un ligando eliminable o no eliminable.
Por tanto, el grupo amina de la superficie o del núcleo de la macromolécula puede ser modificado con un grupo modificador para facilitar la unión al ligando o grupo funcional. Alternativamente, o adicionalmente, el ligando puede ser modificado para facilitar la unión al grupo amina de la superficie o del núcleo.
El extremo del ligando para la unión al grupo funcional puede ser modificado mediante un grupo modificador para facilitar la unión al grupo funcional. Alternativamente, o adicionalmente, el grupo funcional puede ser modificado con un grupo modificador para facilitar la unión del ligando o directamente al grupo amina de la superficie o del núcleo.
En una realización particular, el primer átomo de nitrógeno amino del núcleo y/o un ligando usado para unir el primer grupo funcional y/o el primer grupo funcional es modificado adicionalmente para facilitar la unión del primer grupo funcional al núcleo.
El grupo amino (superficial o de núcleo) y/o el ligando y/o el grupo funcional pueden modificarse para permitir la ligación del grupo funcional al átomo amino, a través del ligando por derivatización con un grupo que incluya un resto químico seleccionado entre: una haloacetamida, una maleimida u otro grupo reactivo de tiol, un tiol reaccionable o un grupo disulfuro intercambiable, un aldehído alifático o aromático, una cetona, una alcoxiamina, una hidracina, una azida, un sistema de oligohistidina y cualquier sistema de péptidos, un grupo ácido nitrilotriacético, cualquier carboxilato o residuo reactivo del mismo (tal como ésteres activados); cualquier resto químico capaz de reaccionar con un haluro orgánico tal como un grupo de organoestannilo, un acrilato, un ácido borónico (o un éster borónico) y alquinos orgánicos mediante reacciones de acoplamiento catalizadas por metales, a saber, Stille, Heck, Suzuki y Sonogashira, respectivamente, cualquier grupo funcional capaz de ligación enzimática (p.ej., a través del uso de un transglutaminasa), cualquier grupo funcional capaz de ligación química nativa. Los métodos para derivatización para incorporar el modificador son conocidos en la técnica.
Más preferiblemente, el modificador químico se puede seleccionar entre los siguientes
(i) Maleimida
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(ii) Haloacetamida (X = Cl, Br, I)
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(iii) Hidracida
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(iv) Alcoxiamina
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(v) 3-(2-Piridilditiotio)propionato
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En determinadas realizaciones, la amina de la superficie o del núcleo puede modificarse para permitir la ligación del grupo funcional por derivatización con un grupo que incluye un resto químico seleccionado entre: haloacetamida, maleimida u otro grupo reactivo de tiol, un tiol reaccionable o un grupo disulfuro intercambiable, aldehído, cetona, un grupo alcoxiamina, hidracina, azida, alquina, sistema de oligohistidina, estructura de ácido nitrilotriacético.
En un método preferido, el grupo protector de la amina seleccionada, tal como la amina de núcleo, es eliminado, y la amina se hace reaccionar con un derivado de ácido haloacético, o un derivado de maleimida tal como ácido 3-maleimidopropiónico o ácido 4-maleimidobutírico en las condiciones en las que se forma el enlace amida. Los métodos generales para el acoplamiento de péptidos y proteínas que contienen tiol a dichos grupos activos para tiol se describen en Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques (Academic Press 1996), y en las referencias citadas en el mismo.
Los métodos generales para el acoplamiento covalente de macromoléculas a moléculas tales como péptidos y anticuerpos se encuentran dentro del nivel de habilidad de la técnica. Dichos métodos se describen en Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques (Academic Press 1996), y en las referencias citadas en el mismo; en Blatter et al, Biochem., 24: 1517 (1985) y en Jue et al, Biochem., 17: 5399 (1978). Los métodos para la ligación de péptidos o proteínas que contienen residuos de histidina adyacentes con macromoléculas o soportes sólidos que contienen la estructura de ácido nitrilotriacético mediante complejación con níquel se describen en Hochuli et al J. Chromatogr.
1987411 177, Sigal et al Anal. Chem. 1996 68490 y Gershon et al J. Immunol. Meth. 1995 183 65. Las anteriores referencias son incorporadas a la presente memoria a modo de referencia en su plenitud.
Las macromoléculas de la invención pueden prepararse mediante una síntesis de dendrímeros divergente o convergente. Los métodos para síntesis divergente y convergente son conocidos en la técnica. En una realización, la macromolécula se construye mediante síntesis divergente, donde la última capa (superficie) de unidades de construcción añadida puede presentar opcionalmente grupos amino protegidos y/o portar grupos amino que tienen grupos funcionales ya unidos, o que están modificados con un modificador y/o que portan un grupo ligando para una unión posterior de un grupo funcional.
Alternativamente, en una síntesis convergente, se pueden unir estructuras dendríticas, o cuñas, que comprenden más de una única unidad de construcción, a los grupos amino de núcleo o de superficie de un dendrímero. Nuevamente, los grupos amino superficiales de una estructura dendrítica pueden estar protegidos opcionalmente y/o pueden presentar ya uno o más grupos funcionales unidos, y/o están modificados con un modificador y/o portan un grupo ligando para el grupo funcional.
En otro aspecto, la invención también contempla composiciones que comprenden una macromolécula como la descrita en la presente memoria, junto con un excipiente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptables del mismo.
También se describe en la presente memoria el uso de macromoléculas como las descritas en la presente memoria para terapia.
Los sujetos a tratar incluyen sujetos mamíferos: humanos, primates, animales de ganadería (que incluyen vacas, caballos, ovejas, cerdos y cabras), animales de compañía (que incluyen perros, gatos, conejos, cobayas), y animales salvajes cautivos. También se contemplan los animales de laboratorio tales como conejos, ratones, ratas, cobayas y hámsteres, ya que pueden proporcionar un sistema de ensayo conveniente. También puede haber especies no mamíferas, tal como aves, anfibios y peces. En ciertas realizaciones, las macromoléculas según la invención, cuando se administran según el régimen de dosis deseado, retienen al menos parcialmente un efecto terapéutico o profiláctico deseado, que incluye uno o más de: aliviar los síntomas, prevenir o retrasar el inicio, inhibir la progresión, o detener o revertir tanto el inicio como la progresión, del trastorno o afección particular que esté en tratamiento.
El ingrediente activo puede administrarse en una única dosis o en una serie de dosis. Aunque es posible que el ingrediente activo se administre solo, es preferible presentarlo como una composición, preferiblemente como una composición farmacéutica, con uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
La formulación de dichas composiciones es bien conocida por los especialistas en la técnica, véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing, 1990. La composición puede contener cualesquier vehículos, diluyentes o excipientes adecuados. Estos incluyen todos los disolventes convencionales, medios de dispersión, rellenos, vehículos sólidos, recubrimientos, agentes antifúngicos y antibacterianos, agentes de penetración dérmica, tensioactivos, agentes isotónicos y de absorción, y similares. Debe entenderse que las composiciones de la invención también pueden incluir otros agentes suplementarios fisiológicamente activos.
El vehículo debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición y no perjudicial para el sujeto. Las composiciones incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (que incluye dérmica, bucal y sublingual), vaginal o parenteral (que incluye subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las composiciones pueden presentarse de forma conveniente en formas de dosis unitarias y pueden prepararse mediante cualesquier métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Dichos métodos incluyen la etapa de poner en asociación el ingrediente activo con el vehículo, que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan poniendo en asociación de forma uniforme e íntima el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y a continuación, si es necesario, conformando el producto.
Las composiciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, sobres o comprimidos que contienen cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como polvo o gránulos; como disolución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como emulsión líquida de aceite-en-agua o como emulsión líquida de agua-en-aceite.
Un comprimido puede prepararse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos preparados por compresión pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma que fluya libremente, tal como polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglomerante (p.ej., diluyente inerte), desintegrante conservante (p.ej., glicolato de almidón sódico, polivinil pirrolidona reticulada, carboximetil celulosa sódica reticulada), agente tensioactivo o dispersante. Los comprimidos preparados por moldeo pueden fabricarse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos opcionalmente pueden recubrirse o marcarse, y pueden formularse de tal modo que proporcionen una liberación lenta o controlada del ingrediente activo de su interior, usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado. Los comprimidos pueden proporcionarse opcionalmente con un recubrimiento entérico, para proporcionar la liberación en partes del intestino diferentes al estómago.
Las composiciones adecuadas para administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base aromatizada, normalmente de sacarosa y goma arábiga o de tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga, y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.
Las composiciones adecuadas para administración tópica a la piel pueden comprender los compuestos disueltos o suspendidos en cualquier vehículo o base adecuados y pueden adoptar la forma de lociones, geles, cremas, pastas, pomadas y similares. Los vehículos adecuados incluyen aceite mineral, propilén glicol, polioxietileno, polioxipropileno, cera emulsionante, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, alcoholo cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua. También pueden usarse para administrar los compuestos de la invención dispositivos para administración transdérmica, tal como parches.
Las composiciones para administración rectal se pueden presentar como supositorios con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao, glicerina, gelatina o polietilén glicol.
Las composiciones adecuadas para administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de espray que contienen además del ingrediente activo vehículos tales como los conocidos en la técnica por ser apropiados.
Las composiciones adecuadas para administración parenteral incluyen disoluciones para inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas que pueden contener anti-oxidantes, tampones, bactericidas y solutos que hacen la composición isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las composiciones se pueden presentar en recipientes mono-dosis o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y viales, y se pueden almacenar en una condición secada por congelación (liofilizada) que solo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, antes de su uso. Las disoluciones y suspensiones de inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos de tipo descrito previamente.
Las composiciones de dosis unitarias preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad diaria, una sub-dosis diaria, tal como se ha descrito previamente en la presente memoria, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente activo.
Cabe destacar que además de los ingredientes activos particularmente mencionados, las composiciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica que tengan relación con el tipo de composición en cuestión, por ejemplo, aquellos adecuados para administración oral pueden incluir agentes adicionales tales como aglomerantes, edulcorantes, espesantes, agentes aromatizantes, agentes desintegrantes, agentes de recubrimiento, conservantes, lubricantes y/o agentes retardantes. Los edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, glucosa, aspartame o sacarina. Los agentes desintegrantes adecuados incluyen almidón de maíz, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, goma xantana, bentonita, ácido algínico o agar. Los agentes aromatizantes adecuados incluyen aceite de menta, aceite de gaulteria, aroma de cereza, naranja o frambuesa. Los agentes de recubrimiento adecuados incluyen polímeros o copolímeros de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o sus ésteres, ceras, alcoholes grasos, zein, goma laca o gluten. Los conservantes adecuados incluyen benzoato sódico, vitamina E, alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metil parabeno, propil parabeno o bisulfito sódico. Los lubricantes adecuados incluyen estearato magnésico, ácido esteárico, oleato sódico, cloruro sódico o talco. Los agentes retardantes adecuados incluyen gliceril monoestearato o gliceril diestearato.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse a mamíferos que incluyen humanos de un modo similar a otros agentes terapéuticos en cantidades efectivas para el tratamiento. Una cantidad efectiva para el tratamiento pretende incluir una cantidad que, cuando se administra de acuerdo al régimen de dosis deseado, retiene al menos parcialmente el efecto terapéutico o profiláctico deseado, como se ha indicado antes. La dosis a administrar, y el modo de administración, dependerán de una variedad de factores que incluyen la edad, peso, género, condición del paciente y factores genéticos, y será decidida finalmente por personal médico tras las determinaciones experimentales de dosis variables seguidas de análisis de imágenes, tal como se describe en la presente memoria. En general, la dosis requerida para la sensibilidad diagnóstica o la eficacia terapéutica oscilará entre aproximadamente 0,001 y 50.000 pg/kg, preferiblemente entre 0,01 y 25,0 pg/kg de masa corporal del hospedante. La dosis óptima será determinada empíricamente siguiendo la descripción de la presente memoria.
Cabe destacar que los grupos funcionales, particularmente los agentes farmacéuticamente activos, pueden estar presentes como sales o profármacos farmacéuticamente aceptables. El término “profármaco” se usa en su sentido más amplio y abarca los derivados que son convertidos in vivo, tanto enzimáticamente como hidrolíticamente, en los compuestos de la invención. Dichos derivados se les ocurrirán fácilmente a los especialistas en la técnica, e incluyen, por ejemplo, compuestos en los que un grupo tiol o hidroxi libre es convertido en un éster, tal como un acetato, o tioéster o donde un grupo amino libre es convertido en una amida. Los procedimientos para acilar los compuestos de la invención, por ejemplo, para preparar profármacos de éster y amida, son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el tratamiento del compuesto con un ácido carboxílico, anhídrido o cloruro apropiados, en presencia de un catalizador o base adecuados. También se contemplan los ésteres de grupos de ácido carboxílico (carboxi). Los ésteres adecuados son ésteres de alquilo-C1-6; ésteres de alcoxi-C1-6-metilo, por ejemplo, metoximetilo o etoximetilo; ésteres de alcanoiloxi-C1-6-metilo, por ejemplo, pivaloiloximetilo; ésteres de ftalidilo; ésteres de ciclo-C3-8-alcoxicarbonil-alquilo-C1-6, por ejemplo, 1-ciclohexilcarboniloxietilo; ésteres de 1,3-dioxolen-2-onilmetilo, por ejemplo, 5-metil-1,3-dioxolen-2-onilmetilo; y ésteres de alcoxi-C1-6-carboniloxietilo, por ejemplo, 1-metoxicarboniloxietilo. Los profármacos de grupos funcionales amino incluyen amidas (véase, por ejemplo, Adv. BioSci., 1979, 20, 369, Kyncl, J. et al), enaminas (véase, por ejemplo, J. Pharm. Sci., 1971, 60, 1810, Caldwell, H. et al), bases de Schiff (véase, por ejemplo, la Patente de Ee .u U. n° 2.923.661 y Antimicrob. Agents Chemother., 1981, 19, 1004, Smyth, R. et al), oxazolidinas (véase, por ejemplo, J. Pharm. Sci, 1983, 72, 1294, Johansen, M. et al), bases de Mannich (véase, por ejemplo, J. Pharm. Sci. 1980, 69, 44, Bundgaard, H. et al y J. Am. Chem. Soc., 1959, 81, 1198, Gottstein, W. et al), derivados de hidroximetilo (véase, por ejemplo, J. Pharm. Sci, 1981, 70, 855, Bansal, P. et al) y derivados de N-(aciloxi)alquilo y carbamatos (véase, por ejemplo, J. Med. Chem., 1980, 23, 469, Bodor, N. et al, J. Med. Chem., 1984, 27, 1037, Firestone, R. et al, J. Med. Chem., 1967, 10, 960, Kreiger, M. et al, Patente de EE.UU. n° 5.684.018 y J. Med. Chem., 1988, 31, 318-322, Alexander, J. et al). En la técnica se conocen otros procedimientos convencionales para la selección y preparación de fármacos adecuado, y se describen, por ejemplo, en el documento WO 00/23419; Design of Prodrugs, H. Bundgaard, Ed., Elsevier Science Publishers, 1985; Methods in Enzymology, 42: 309-396, K. Widder, Ed, Academic Press, 1985; A Textbookof Drug Design and Development, Krogsgaard-Larsen y H. Bundgaard, Eds, Capítulo 5, p. 113-191 (1991); Advanced Drug Delivery Reviews, 8; 1-38 (1992); Journal of Pharmaceutical Sciences, 77; 285 (1988), H. Bundgaard, et al; Chem Pharm Bull, 32692 (1984), N. Kakeya et al y The Organic Chemistry of Drug Desig and Drug Action, Capítulo 8, p. 352-401, Academic press, Inc., 1992.
Las sales aceptables farmacéuticamente adecuadas incluyen sales de ácidos inorgánicos farmacéuticamente aceptables tales como los ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbónico, bórico, sulfámico y bromhídrico, o sales de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables tales como los ácidos acético, propiónico, butírico, tartárico, maleico, hidroximaleico, fumárico, maleico, cítrico, láctico, múcico, glucónico, benzoico, succínico, oxálico, fenilacético, metanosulfónico, toluenosulfónico, bencenosulfónico, salicílico, sulfanílico, aspártico, glutámico, edético, esteárico, palmítico, oleico, láurico, pantoténico, tánnico, ascórbico, fendizoico, 4,4’-metilenbis-3-hidroxi-2-naftoico, o-(phidroxibenzoil)benzoico, ácido 4'-4"-dihidroxitrifenilmetano-2-carboxílico y ácidos valéricos. Las sales básicas incluyen, aunque sin limitación, aquellas formadas con cationes farmacéuticamente aceptables, tal como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, amonio y alquilamonio. Los grupos básicos que contienen nitrógeno pueden hacerse cuaternarios con agentes tales como haluros de alquilo inferior, tal como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo, o dialquil sulfatos tales como dimetil y dietil sulfato.
La presente invención se describirá a continuación más completamente en referencia a los ejemplos acompañantes. EJEMPLOS
La invención se describirá ahora en referencia a los siguientes ejemplos y figuras ilustrativos.
Se ha desarrollado un sistema de nomenclatura con el fin de identificar los compuestos individuales descritos en esta patente. Dicha nomenclatura se usa para simplificar la descripción de los compuestos y se usa en lugar de que lo sería un complejo nombre IUPAC, cuyo uso puede ser susceptible de error y dificultad en la interpretación.
La nomenclatura de macromoléculas hace uso de las siguientes abreviaturas:
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Otras abreviaturas adicionales son las siguientes:
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Detalle de los equipos de HPLC y MS:
HPLC - Waters 2795 con un Detector de Sistema de Diodos (DAD) 2996.
MS - Waters ZQ4000 con sonda ESI, split de flujo de entrada para proporcionar aproximadamente 50 pL/min al MS.
Los datos de espectros de masas se adquirieron en modo de ionización de electropulverización positiva o negativa, según se indica. Los datos en bruto fueron deconvolucionados usando un algoritmo de máxima entropía (MaxEnt), implementado en el software MassLynx v4.0, suministrado por Waters Corporation. Los datos presentados en los detalles experimentales corresponden con los valores observados después de la deconvolución hasta un estado de carga cero teórico. Todos los reactivos PEG fueron obtenidos de fuentes comerciales y se usaron tal cual se recibieron.
Ejemplo 1
p-Lactoglobulina-MAL-(CH 2 ) 2 CONH-PEGiioo-CO-NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lysjia [PEG57o]32
i. Benciloxicarbonilamino-3,6-oxa-8-aminooctano: [CBz] NEOEOEN
A una disolución de 2,2’-(etilendioxi)dietilamina (4,45 g, 30 mmol) y TEA (0,7 mL, 50 mmol) en MeCN (50 mL) se añadió gota a gota a lo largo de 20 minutos una disolución de N-(benciloxicarboniloxi)succinimida (1,2 g, 5,0 mmol) en MeCN (10 mL). Una vez completada la adición, la disolución se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El MeCN fue eliminado a vacío y el residuo incoloro resultante se redisolvió en agua (50 mL). La disolución acuosa se lavó con DCM (3 x 25 mL) y los extractos orgánicos combinados fueron reducidos a vacío. El residuo se disolvió en HCl 2M (25 mL) y se lavó con dietil éter (3 x 25 mL). A continuación, la capa acuosa fue neutralizada hasta pH 7 con NaOH y se evaporó hasta sequedad a vacío. El residuo resultante se añadió a EtOAc (25 mL), se filtró y se secó sobre Na2SÜ4. La eliminación del disolvente a vacío proporcionó un aceite incoloro (840 mg, 2,9 mmol, 60%). ESI MS (+ve) 283 [M+H]+; m/z calculada para C14H22N2O4 [M+H]+: 283,34.
ii. ferc-Butil 2-({2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]propil}amino)propilcarbamato
Se añadió una disolución de dipropilentriamina (171 g, 1,32 mol) en THF (200 mL) gota a gota a lo largo de 1h a una disolución de terc-butil-1H-imidazol-1-carboxilato (444 g, 2,64 mol) en THF (1,2 L) a temperatura ambiente. La disolución resultante se sometió a reflujo durante 4h y a continuación se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El THF fue eliminado a vacío y el residuo se disolvió en DCM (2 L). La disolución de DCM se lavó primero con NaOH (2M, 2 x 1 L) y después con ácido cítrico 10 % p/v (2 x 1 L). La disolución acuosa de ácido cítrico fue basificada con NaOH (4 M, hasta pH 14), extraída con DCM (3 x 600 mL) y los extractos de DCM combinados concentrados a vacío para producir un aceite transparente, que se solidificó al enfriar para dar lugar a un sólido blanco (346 g, 80 %).
iii. HO-Su(NPN) 2 [Boc] 2
Un recipiente de 3 L acoplado a un agitador de cabeza se cargó con ferc-Butil 2-({2-[(terc-butoxicarbonil)amino]propil}amino)propilcarbamato (208,5 g, 0,63 mol) y tolueno (900 mL). Se añadió anhídrido succínico (63 g, 0,63 mol) en una porción y la disolución resultante se calentó a 60 °C durante una noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se añadió dietil éter (1 x 200 mL) y se filtró el sólido. El sólido se lavó con dietil éter (2 x 200 mL) y se secó para dar lugar a un sólido blanco (230 g, 91%).
iv. [CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Boc] 2
A una disolución de [CBz] NEOEOEN (Ejemplo 1 i) (440 mg, 1,6 mmol) en DMF (4 mL), se añadió TEA (0,22 mL, 1,6 mmol) y PNPO-Su(NPN)2-Boc2 (950 mg, 1,8 mmol). La disolución se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El disolvente se eliminó a vacío y el residuo se disolvió en EtOAc (250 mL). Esta disolución se lavó con salmuera (125 mL), Na2CO31M (3 x 50 mL), agua (125 mL), KHSO4 1M y un segundo lavado de salmuera (125 mL) antes de secar sobre Na2SO4. La disolución se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía de gel de sílice (gradiente de MeOH / DCM) para proporcionar un aceite viscoso transparente (165 mg, 0,23 mmol, 15%). ESI MS (+ve) 496 [M+H]+; m/z calculada para C24H41N5O6 [M+H]+: 496,61.
v. [CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [NH 2 -TFA] 2
Se disolvió [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Boc]2 (13,89 g, 20,0 mmol) en ácido acético (50 mL) y la disolución agitada se enfrió en un baño de hielo. Se añadió TFA enfriado en hielo (50 mL, 0,73 mol) a una velocidad que mantuviera la temperatura de la disolución a 5° C o menos. Se retiró el baño de hielo y la disolución se agitó a temperatura ambiente durante 5h. A continuación se enfrió y se añadió agua enfriada con hielo (100 mL) a una velocidad que mantuviera la mezcla por debajo de 5° C. Se evaporaron los compuestos volátiles a vacío y se añadió agua (100 mL) al residuo aceitoso. La disolución se concentró entonces a vacío y se repitió el proceso con más agua (2 x 100 mL). El aceite se disolvió en agua (50 mL), la disolución se filtró y se secó por congelación para proporcionar [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [NH2 -TFA]2 (17,1 g) en forma de un sólido vítreo incoloro. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,90 (quinteto aparente, J = 6,6 Hz, 2H); 1,99 (m, 2H); 2,57 (m, 2H); 2,65 (m, 2H); 2,89 (t, J = 6,6 Hz, 2H); 3,00 (t, J = 7,5 Hz, 2H); 3,30-3,38 (complejo, 6H); 3,42-3,58 (complejo, 6H); 3,61 (s, 4H); 5,08 (s, 2H); 7,25-7,40 (complejo, 5H); HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 8,0 min; eS i Ms (+ve) 496,2 [M+H]+; m/z calculado para C24H42N5O6+ [m H]+: 496,3.
vi. [CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 2 [Boc]4
Se añadió una disolución de DBL-OPNP (12,8 g, 17,7 mmol) en DMF (80 mL) a una disolución de [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [NH2 -TFA]2 (19,5 g, 35,4 mmol) y TEA (17,9 g, 0,177 mol) en Dm F (80 mL) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 16 h, se añadió una disolución de glicina (1,50 g, 29,0 mmol) en agua (50 mL) y se mantuvo la agitación durante 16 h. Los compuestos volátiles fueron eliminados a vacío, el residuo se disolvió en EtOAc (200 mL) y la disolución se lavó secuencialmente con 5% p/v de Na2CO3 (10 x 50 mL), salmuera (50 mL), HCl 1M (2 x 50 mL) y nuevamente con salmuera (50 mL). La disolución de EtOAc se secó (Na2SO4), se filtró y el disolvente se eliminó a vacío para producir el producto en forma de aceite incoloro (20,74 g). r Mn de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,15­ 1,95 (complejo, 16H); 1,43 (s, 18H); 1,44 (s, 18H); 2,51 (m, 2H); 2,64 (m, 2H); 3,02 (t, J = 6,6 Hz, 4H); 3,17 (m, 2H); 3,25-3,45 (complejo, 8H); 3,48-3,58 (complejo, 4H); 3,61 (s, 4H); 5,08 (s, 2H); 7,25-7,40 (complejo, 5H), HPLC (Hidrofóbico/TFA) Rt = 8,6 min; eS i m S (+ve) 1153,0 [M+H]+; m/z calculado para C56H98N9O16+ [M+H]+: 1152,7.
vii. [CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 2 [NH2-TFA]4
Se disolvió [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]2 [Boc]4 (20,74 g, 18,0 mmol) en ácido acético (50 mL) y la disolución agitada se enfrió en un baño de hielo. Se añadió TFA enfriado en hielo (50 mL, 0,73 mol) a una velocidad que permitiera mantener la temperatura de la disolución a 5° C o menos. Se retiró el baño de hielo y la disolución se agitó a temperatura ambiente durante 5 h. La disolución se enfrió entonces a 5° C y se añadió a agua enfriada en hielo (100 mL) a una velocidad que mantuviera la mezcla por debajo de 5° C. Los compuestos volátiles fueron evaporados a vacío y se añadió agua (100 mL) al aceite residual. La disolución resultante se concentró entonces a vacío y el proceso se repitió con más agua (2 x 100 mL). El aceite se disolvió en agua (50 mL), la disolución se filtró y se secó por congelación para dar lugar a [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]2 [NH2.TfA]4 (25,1 g) en la forma de un sólido vítreo amarillo pálido. RMN de 1H (300 MHz, D2O) 5 (ppm) 1,44 (m, 4H); 1,70 (m, 6H); 1,86 (m, 6H); 2,50 (m, 2H); 2,64 (m, 2H); 2,99 (t, J = 7,2 Hz, 2H); 3,12-3,47 (complejo, 12H); 3,52-3,63 (complejo, 12H); 3,95 (m, 2H); 5,12 (s, 2H); 7,32­ 7,50 (complejo, 5H); Hp lC (Hidrofílico/TFA) Rt = 10,4 min; ESI m S (+ve) 752,4 [M+H]+; m/z calculado para C36H66N9O8+ [M+H]+: 752,5.
viii. [CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys]4 [Boc]8
Se añadió una disolución de DBL-OPNP (16,8 g, 13,9 mmol) en DMF (100 mL) a una disolución de [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]2 [NH2-TFA]4 (33,98 g, 61,3 mmol) y TEA (13,5 g, 0,134 mol) en DMF (100 mL) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 11h, se añadió una disolución acuosa 1M de glicina (10 mL); se volvió a añadir la misma cantidad de disolución de glicina después de 1h y nuevamente 1,5h después. Se continuó con la agitación durante otras 2h y a continuación se eliminaron los compuestos volátiles por evaporación a vacío. El residuo se disolvió en EtOAc (200 mL) y la disolución se lavó secuencialmente con HCl 0,5 M (2 x 50 mL), 10% p/v de Na2CO3 (6 x 50 mL) y salmuera (50 mL). La disolución de EtOAc se secó (Na2SO4), se filtró y se eliminó el disolvente a vacío para dar lugar al producto deseado en forma de aceite incoloro (26,26 g, 91%). RMN de 1H (300 MHz, cfe-DMSO) 5 (ppm) 1,00­ 1,75 (complejo, 112H); 2,32 (m, 2H); 2,47 (m, 2H); 2,75-3,50 (complejo, 32H); 3,75-3,90 (complejo, 4H); 4,10-4,25 (complejo, 2H); 5,01 (s, 2H); 6,38 (br, m, 1H); 6,60-6,95 (complejo, 8H); 7,25 (m, 1H); 7,28-7,39 (complejo, 5H); 7,60­ 8,05 (complejo, 7H), HPLC (hidrofóbico/TFA) Rt = 15,2 min; ESI MS (+ve) 1033,8 [M+2H]2+/2; m/z calculado para C100H179N17O282+ [M+2H]2+/2: 1033,7.
ix. [CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys]4 [NH 2 -TFA] 8
Se disolvió [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]4 [Boc]s (24,52 g, 11,9 mmol) en ácido acético (108 mL) y la disolución agitada se enfrió en un baño de hielo hasta que el ácido acético comenzó a congelarse. Se añadió entonces TFA (108 mL, 1,40 mol) a una velocidad que mantuviera la temperatura de la disolución a 10° C o menos. A continuación, se retiró el baño de hielo y la disolución se agitó a temperatura ambiente durante 15h. El ácido acético y el TFA se evaporaron a vacío y se añadió agua (100 mL) al aceite residual. La disolución se concentró entonces a vacío y el proceso se repitió con más agua (3 x 100 mL). El aceite resultante se disolvió en agua (100 mL), la disolución se filtró y a continuación se secó por congelación para dar lugar a [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]4 [NH2 -TFA]8 (29,2 g) en forma de un sólido vítreo incoloro. RMN de 1H-NMR (300 MHz, D2O) 5 (ppm) 1,25-2,05 (complejo, 40H); 2,53 (m, 2h ); 2,65 (m, 2H); 2,95-3,10 (complejo, 8H); 3,10-3,45 (complejo, 16H); 3,55-3,75 (complejo, 8H); 3,95 (t, J = 6,6 Hz, 2H); 4,06 (t, J = 6,6 Hz, 2H); 4,20-4,30 (complejo, 2H); 5,15 (s, 2H); 7,35-7,55 (complejo, 5 H); HPLC (hidrofílico/formiato) Rt = 8,4 min; ESI Ms (+ve) 1265,1 [M+H]+, 633,0 [m 2H]2+/2; m/z calculado para C60H114N17O12+ [M+H]+: 1264,9, m/z calculado para C60Hn5N17O122+ [M+2H]2+: 633,0.
x. [CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys]8 [Boc]ia
Se añadió una disolución de DBL-OPNP (48,2 g, 87,2 mmol) en DMF (120 mL) a una disolución de [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]4 [NH2 TFA]s (25,83 g, 11,87 mmol) y TeA (23,1 g, 0,228 mol) en DMF (150 mL) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 19h, se añadió una disolución de glicina (3,27 g, 43,6 mmol) en agua (80 mL). La agitación continuó durante 2h y después se evaporaron los compuestos volátiles a vacío. El residuo se disolvió en EtOAc (200 mL) y la disolución se lavó secuencialmente con un 5% p/v de Na2CO3 (1 x 100 mL; 4 x 50 mL), HCl 1M (2 x 50 mL) y nuevamente con salmuera (50 mL). La disolución de EtOAc se secó (Na2SO4), se filtró en caliente y el disolvente se eliminó a vacío para dar lugar al producto deseado en forma de sólido vítreo amarillo (27,12 g, 59%). Algo del producto precipitó en el papel de filtro estriado; la disolución de este material en metanol, la filtración y la eliminación del metanol a vacío dio lugar a producto adicional (9,02 g, 20%) en forma de una espuma amarilla. El análisis de ambas porciones del producto dio lugar a conjuntos idénticos de datos de RMN de 1H y ESI MS. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,00-1,75 (complejo, 232H); 2,51 (m, 2H); 2,65 (m, 2H); 2,75-3,50 (complejo, 40H); 3,50-3,65 (complejo, 8H); 3,90-4,50 (complejo, 14H); 5,08 (s, 2H); 7,25-7,40 (complejo, 5H), Hp Lc (hidrofóbico/TFA) Rt = 19,7 min; ESI Ms (+ve) 1947,3 [M+2H]2+/2, 1298,3 [M+3H]3+/3; m/z calculado para C188H33gN33O522+ [M+2H]2+/2: 1946,8, m/z calculado para C188H34üN33O523+ [M+3H]3+/3: 1298,2.
xi. [CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys]a [NH 2 .TFA]i 6
Se disolvió [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]8 [Boc]16 (25,75 g, 6,62 mmol) en ácido acético (122 mL) y la disolución agitada se enfrió en un baño de hielo hasta que el ácido acético comenzó a congelarse. Entonces se retire el baño de hielo y se añadió cuidadosamente TFA hasta que el ácido acético comenzó a fundirse. La disolución agitada se colocó nuevamente en un baño de hielo y entonces se añadió el resto del TFA (la cantidad total de TFA usada fue de 108 mL, 1,40 mol) a una velocidad que mantuviera la temperatura de la disolución a 10° C o menos. El baño de hielo se retiró entonces y la disolución se agitó a temperatura ambiente durante 17h. La disolución se enfrió en hielo y entonces se añadió a agua enfriada con hielo (400 mL) asegurándose de que la temperatura de la disolución resultante permaneciera por debajo de 10° C. Los componentes volátiles fueron evaporados a vacío y se añadió agua (250 mL) al residuo aceitoso. La disolución se concentró entonces a vacío y se repitió el proceso con más agua (2 x 250 mL). El aceite final se disolvió en agua (200 mL), la disolución se filtró y se secó por congelación para dar lugar a [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]8 [NH2 -TFA]16 (27.6 g) en forma de un sólido vitreo incoloro. RMN de 1H (300 MHz, D2O) 5 (ppm) 1,25-1,65 (complejo, 40H); 1,65-2,05 (complejo, 48H); 2,50 (m, 2H); 2,62 (m, 2H); 2,95-3,05 (complejo, 16H); 3,05-3,45 (complejo, 24H); 3,55-3,70 (complejo, 8H); 3,94 (t, J = 6,6 Hz, 4H); 4,05 (t, J = 6,6 Hz, 4H); 4,15-4,30 (complejo, 4H); 4,30-4,40 (complejo, 2 H); 5,13 (s, 2H); 7,35-7,50 (complejo, 5H); HPLC (hidrofílico/TFA) Rt = 8,9 min; ESI Ms (+ve) 763,9 [M+3H]3+/3, 573,4 [M+4H]4+/4; m/z calculado para C108H212N33O203+ [M+3H]3+: 764,2, m/z calculado para C108H213N33O204+ [M+4h ]4+: 573,4.
xii. [CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [Boc]32
Se añadió DBL-OPNP (27,66 g, 59,2 mmol) en porciones de aproximadamente 2-3 g a una disolución de [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]8 [NH2 -TFA]1s (13,83 g, 3,36 mmol) y TEA (13,1 g, 0,129 mol) en DMF (150 mL) a temperatura ambiente. Tras agitar durante 17h, se añadió una disolución de glicina (2,22 g, 29,6 mmol) en agua (50 mL). La agitación continuó durante 3h y a continuación la disolución se añadió a agua en rápida agitación (400 mL). El líquido sobrenadante se decantó a partir de la goma precipitada resultante. El material gomoso se disolvió en DMF (100 mL) y la disolución se añadió lentamente a una mezcla bien agitada de hielo en copos (500 g) y agua (500 mL). El sólido blanco precipitado se recogió por filtración, se resuspendió en 5% de p/v Na2CO3 , se sometió a ultrasonidos y se volvió a filtrar. El sólido se lavó intensamente con agua (4 x 100 mL) y se secó para dar lugar al producto deseado (22,10 g, 87%) en la forma de un polvo beige. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,10-1,95 (complejo, 472H); 2,52 (m, 2H); 2,65 (m, 2H); 2,95-3,10 (complejo, 30H); 3,10-3,30 (complejo, 30H); 3,30-3,45 (complejo, 12H); 3,45­ 3,65 (complejo, 8H); 3,80-4,15 (complejo, 16H); 4,20-4,45 (complejo, 14H); 5,09 (s, 2H); 7,25-7,40 (complejo, 5H). Debido a la insolubilidad en la fase móvil de HPLC, no se pudo obtener datos de HPLC y ESI para este producto. En su lugar, se eliminaron los grupos BOC y dichos datos se obtuvieron a partir de la sal de trifluoroacetato.
xiii. [NH 2 ] EOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [Boc]32
Se añadió formiato amónico (6 mg, 95 mol) y paladio al 10% p/p sobre carbón activado (28 mg) a una disolución de [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [Boc]32 (348 mg, 46,13 mol) en DMF (4,5 mL) y agua (0,5 mL). La mezcla se agitó en atmósfera de nitrógeno durante 16h y a continuación se hizo pasar a través de un filtro de 0,54 pm. La disolución se concentró a vacío y a continuación se disolvió en metanol y se concentró nuevamente a vacío para dar lugar a [NH2] EOEOEN [Su(NpN)-2] [Lys]16 [Boc]32 en la forma de un sólido vítreo (433 mg). RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,10-1,90 (complejo, 474H); 2,52 (m, 4H); 2,67 (m, 4H); 2,95-3,45 (complejo, 80H); 3,55 (m, 8H); 3,63 (s, 8H); 3,85-4,50 (complejo, 28H). HPLC (muestra no soluble en disolventes compatibles con LC). La ausencia de señales de CBz en RMN de 1H confirmó la formación del producto.
xiv. [p-NO 2 -CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [Boc]32
A una disolución de [NH2] EOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [Boc]32 (287 mg, 0,038 mmol) en DMF (3 mL) se añadió DIPEA (20 pL, 0,116 mmol) seguido de 4-nitrobencil cloroformiato (12 mg) con agitación. La disolución se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno durante 16h. Los compuestos volátiles fueron eliminados a vacío para dar lugar al producto deseado (294 mg). La TLC (10% MeOH/DCM) confirmó que la reacción se había completado. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,10-1,90 (complejo, 474H); 2,52 (m, 4H); 2,67 (m, 4H); 2,95-3,45 (complejo, 80H); 3,55 (m, 8H); 3,63 (s, 8H); 3,85-4,50 (complejo, 28H); 7,55 (d, 2H); 8,25 (d, 2 H). Hp Lc (muestra no soluble en disolventes compatibles con LC).
xv. [p-NO 2 -CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys]i6 [NH2-TFA]32
A una disolución agitada de [p-NO2-CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [Boc]32 (294 mg, 0,038 mmol) en DCM (4 mL) se le añadió TFA (1 mL) a temperatura ambiente. La disolución se agitó a temperatura ambiente durante 16h. Los compuestos volátiles fueron eliminados a vacío y el residuo se disolvió en MeCN/H2O 1:1 (5 mL). Los disolventes fueron eliminados a vacío. Este proceso se repitió dos veces. El residuo se trituró con dietil éter (20 mL) y el disolvente se retiró por decantación. El residuo se secó a vacío para dar lugar al producto en la forma de una espuma blanca (354 mg). HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 5,59 min; ESI MS (+ve) 4386 [M+H+]; m/z calculado para C204H399N66O38+ [M]+: 4384,77.
xvi. [p-NO 2 -CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lysjia [PEG57o]32
A una disolución agitada de m-dPEG570-NHS (1,24 g, 1,805 mmol) en DMF (0,5 mL) se añadió una disolución de [p-NO2-CBZ] EOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [NH2-TfA]32 (410,4 mg, 0,052 mmol) y TEA (572 pL, 4,103 mmol) en DMF (0,5 mL) gota a gota. La disolución se agitó a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno durante 16h. Los compuestos volátiles fueron eliminados a vacío y el residuo fue procesado en 50 mL de agua y se llevó a cabo una purificación mediante filtración de flujo tangencial en un Centramate (membrana de 10 KDa, 100 mL de reservorio de muestra). El retentato fue reducido hasta sequedad para dar lugar al producto deseado en la forma de un residuo aceitoso (906 mg, 78%). HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 10,76 min. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,10-1,90 (complejo, Lys(3 x CH2), 184H); 2,20-2,70 (complejo, Lys(N-CH2), 64H); 3,0-3,20 (complejo, 58H); 3,35 (s, PEG-oMe, 96H); 3,40-3,90 (complejo, PEG-CH2 , 1536H); 4,10-4,40 (s ancho, 36H); 7,60 (d, J = 8,38 Hz, ArH, 2H); 8,20 (d, J = 8,33 Hz, ArH, 2H).
xvii. [NH 2 ] EOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [PEG570]32
Esta reacción se llevó a cabo del mismo modo que en el Ejemplo 1 xiii; usando [p-NO2-CBz] EOEOEN [Su(NPN)2] [Lys] 16 [PEG57ü]32 (347 mg, 0,0153 mmol) con formiato amónico (68 mg, 1,08 mmol), paladio al 10% p/p sobre carbón activado (320 mg) en DMF (6,4 mL) y agua (0,6 mL). Después de procesar, esto dio lugar al producto en forma de un sólido vítreo (310 mg, 90%). Rm N de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,10-1,90 (complejo, Lys(3 x CH2), 184H); 2,20­ 2,70 (complejo, Lys(N-CH2), 64H); 3,0-3,20 (complejo, 58H); 3,35 (s, PEG-OMe, 96H); 3,40-3,90 (complejo, PEG-CH2 , 1536H); 4,10-4,4Ü (s ancho, 36H). HPLC (hidrofílico/TFA) Rt = 10,69 min; ESI MS (+ve) 22,472 [M+4H+]; m/z calculado para C1028H1995N65O450+ [M]+: 22, 468,01.
xviii. MAL-(CH 2 ) 2 CONH-PEG 1100 -CO-NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [PEG570]32
A una disolución agitada de MAL-PEG1100-NHS (1,25 mg, 0,895 pmol) en DCM (0,5 mL) se añadió una disolución de [NH2] EOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [PEG57ü]32 (20,1 mg, 0,895 pmol) y TEA (5 pL) en DCM (0,5 mL), gota a gota. La disolución se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 16h. Los compuestos volátiles fueron eliminados a presión reducida y el producto se usó sin ninguna purificación adicional (21 mg). RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,10-1,90 (complejo, Lys(3 x CH2), 184H); 2,20-2,70 (complejo, Lys(N-CH2), 64H); 3,0-3,20 (complejo, 58H); 3,35 (s, PEG-OMe, 96H); 3,40-3,90 (complejo, PEG-CH2 , 1628H); 4,10-4,40 (s ancho, 36H); 6,82 (br s, MAL, 2H). HPLC (hidrofílico/TFA) Rt = 10,72 min.
xix. P-Lactoglobulin-MAL-(CH 2 ) 2 CONH-PEG 1100 -CO-NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [PEG570]32
Se añadió una disolución de MAL-(CH2)2CONH-PEGhoo-CO-NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [PEG57ü]32 (13,0 mg, 10 equiv.) en tampón PBS (pH 7,64, 250 mL) a p-lactoglobulina B bovina (1 mg, pH 7,64, 25ü mL) en tampón PBS. La mezcla se agitó entonces durante 16h (600 rpm, 26 °C) y se analizó mediante SDS-PAGE (12% de gel de Tris-Glicina, 200 mV, 60 min), tinción con azul de coomassie y Bal2. La construcción dendrímero-proteína deseada se visualizó mediante tinción de SDS-PAGE con azul de coomassie, y apareció en el PM apropiado respecto a los marcadores de PM proteínicos.
Ejemplo 2
P-Lactoglobulin-NHCO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [PEG570]32
i HO 2 C-(CH 2 ) 2 CO-NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [PEG570]32
A una disolución agitada de anhídrido succínico (5 mg, 0,047 mmol) en DMF (0,5 mL) se añadió una disolución de [NH2] EOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [PEG57ü]32 (Ejemplo 1 xvii) (53 mg, 2,36 pmol) y TeA (14 pL) en DMF (0,5 mL), la disolución se agitó a temperatura ambiente durante 16h. Los compuestos volátiles fueron eliminados a vacío y el residuo se procesó en agua, se llevó a cabo la purificación mediante filtración de flujo tangencial en un Centramate (membrana de 10 KDa). El retentato se redujo hasta sequedad para dar lugar al producto deseado en la forma de un residuo aceitoso (69 mg). HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 10,83 min. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,10-1,90 (complejo, Lys(3 x CH2), 184H); 2,20-2,70 (complejo, Lys(N-CH2) succinil (CH2)2 , 68H); 3,0-3,2ü (complejo, 58H); 3,35 (s, PEG-OMe, 96H); 3,40-3,90 (complejo, PEG-CH2 , 1536H); 4,10-4,40 (s ancho, 36H).
ii f-BuO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [PEG570]32
A una disolución agitada de HO2C-(CH2)2CO-NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [PEG57ü]32 (30,6 mg, 1,36 pmol), H2N-PEG570-CO2Í-Bu (22 mg, 0,033 mmol) y Te a (8 pL) en DCM (0,5 mL) a 0 °C, se añadió una disolución de d Cc (6,2 mg, 0,03 mmol) y HOBt (4,6 mg, 0,034 mmol) en DMF (0,5 mL). La disolución se agitó a 0 °C durante 10 minutos, a continuación de dejó que alcanzara temperatura ambiente y se agitó otras 16h en atmósfera de nitrógeno. Los compuestos volátiles fueron evaporados a vacío y el residuo se procesó en agua, la purificación se llevó a cabo mediante filtración de flujo tangencial en un Centramate (membrana de 10 KDa). El retentato se redujo hasta sequedad para dar lugar al producto deseado en forma de un residuo aceitoso (29,5 mg). RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,10-1,90 (complejo, Lys(3 x CH2) tBu, 193H); 2,20-2,70 (complejo, Lys(N-CH2) succinil (CH2K 68H); 3,0-3,20 (complejo, 58H); 3,35 (s, PEG-OMe, 96H); 3,40-3,90 (complejo, PEG-CH2 , 1582H); 4,10-4,40 (s ancho, 36H).
iii HO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lysjia [PEG57o]32
A una disolución agitada de f-BuO2C-PEG57ü-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [PEG57ü]32 (29,5 mg, 1,27 pmol) en DCM (2 mL) a temperatura ambiente, se añadió TFA (0,5 mL); esta disolución se agitó a temperatura ambiente durante 2h. La mezcla de reacción se redujo hasta sequedad y el residuo se procesó en 5 mL de MeCN/H2O 1:1, los disolventes se eliminaron entonces a vacío. Esta disolución en MeCN/H2O 1:1, seguida de la eliminación completa de los disolventes, se repitió dos veces más (33,2 mg). RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,10-1,90 (complejo, Lys(3 x CH2), 184H); 2,20-2,70 (complejo, Lys(N-CH2) succinil (CH2)2 , 68H); 3,0-3,20 (complejo, 58H); 3,35 (s, PEG-OMe, 96H); 3,40-3,90 (complejo, PEG-CH2 , 1582H); 4,10-4,40 (s ancho, 36H).
iv NHS-CO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [PEG570]32
A una disolución agitada de HO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [PEG570]32 (33,2 mg, 1,43 pmol) y DIPEA (11 pL, 0,063mmol) en DCM (2 mL) se añadió DCC (12,2 mg, 0,059 mmol) en forma de sólido, la disolución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadió NHS (5,2 mg, 0,045 mmol) en DCM (0,5 mL) y la disolución se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 16h. Los compuestos volátiles fueron evaporados a vacío, y se añadió DCM (2 mL) al residuo, la suspensión se filtró a través de un filtro de 4,5 pm, el disolvente se evaporó a vacío (31,7 mg). Este material se usó sin ninguna purificación adicional.
v. p-Lactoglobulin-NHCO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [PEG570]32
NHS-CO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [PEG570]32 (10 eq. respecto a la proteína) en tampón PBS (pH 7,64, 250 mL) se hizo reaccionar con p-lactoglobulina B bovina (pH 7,64). La mezcla se agitó durante 16h (600 rpm, 26 °C) y se analizó mediante SDS-PAGE (gel de Tris-glicina al 12%, 200 mV, 60 min), tinción con azul de coomassie y Bal2. La construcción de dendrímero-proteína deseada se visualizó mediante tinción de SDS-PAGE con azul de coomassie, y apareció en el PM apropiado respecto a los marcadores proteicos de PM.
Ejemplo 3
HSA-MAL-(CH 2 ) 2 CONH-PEG 1100 -CO-NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [PEG570]32
MAL-(CH2)2CONH-PEGm0-CO-NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [PEG570I32 (Ejemplo 1 xviii) (10 eq. respecto a la proteína) en tampón de PBS (pH 7,64, 250 mL) se hizo reaccionar con albúmina de suero humano (pH 7,64). La mezcla se agitó durante 16h (600 rpm, 26 °C) y se analizó mediante SDS-PAGE (gel de Tris-glicina al 12%, 200 mV, 60 min), tinción con azul de coomassie y Bal2. La construcción de dendrímero-proteína deseada se visualizó mediante tinción de SDS-PAGE con azul de coomassie, y apareció en el PM apropiado con respecto a los marcadores proteicos de PM.
Ejemplo 4
NDP-a-MSH-CH 2 CO NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [GlyLys] 2 [e-CBz] 2 [Lys] 2 [PEG570]4
i. HO-Su(NPN) 2 [CBz] 2
Se calentó una mezcla de (NPN)2 [CBz]2 (20,0 g, 0,05 mol) y anhídrido succínico (6,0 g, 0,06 mol, 1,2 equivalentes) en tolueno (180 mL) a 65 °C durante 16 h. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y el sólido blanco se filtró y se lavó con metil-f-butil éter (3 x 100 mL) para dar lugar al producto con un buen rendimiento, 23,54 g (94%).
ii. PNPO-Su(NPN) 2 [CBz] 2
A una disolución agitada de 4-nitrofenol (1,91 g, 13,7 mmol) y HO-Su(NPN)2 [CBz]2 (13,7 mmol) en EtOAc (150 mL) se añadió a una disolución de DCC (2,97 g, 14,4 mmol) en EtOAc (50 mL) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche, se filtró y se lavó con K2CO3 (1,0 M), salmuera 1:1 (3 x 300 mL), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró, proporcionando 7,80 g de PNPO-Su(NPN)2 [CBz]2.
iii. [Boc] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [CBz] 2
A una disolución de [Boc] NEOEOEN (3 g, 12 mmol) en DMF/DMSO 1:1 (60 mL) se añadió TEA (3,4 mL, 240 mmol) y una disolución de Pn p O-Su(NPN)2 [CBz]2 (7,5 g, 12 mmol) en DMSO (30 mL). La disolución se filtró a temperatura ambiente durante 15h. La disolución se concentró a vacío y se redisolvió en agua (300 mL). La disolución acuosa se lavó con EtOAc (3 x 300 mL) y los lavados orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4. Los disolventes se eliminaron a vacío y el aceite sin purificar se purificó mediante cromatografía de gel de sílice (MeOH/DCM al 3%) para proporcionar [Boc] NEOEOEN [Su(NPN)2] [CBz]2 en la forma de un aceite viscoso incoloro (8,2 g, 93%). HPLC (hidrofílico/TFA) Rt = 9,20 min; ESI MS (+ve) 730,3 [M+1H]; m/z calculado para C37H55N5O10): 729,9.
iv. [Boc] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [NH 2 ] 2
A una disolución de [Boc] NEOEOEN [Su(NPN)2] [CBz]2 (500 mg, 0,68 mmol) en trifluoroetanol (13 mL) se añadió paladio al 10% p/p sobre carbono (723 mg, 34 mmol). La suspensión se agitó en atmósfera de hidrógeno a presión atmosférica durante 15h. A continuación, la suspensión se filtró a través de un filtro de 0,2 gm y el filtrado se concentró a vacío para proporcionar [Boc] NEOEOEN [Su(NPN)2] [NH2]2 en forma de aceite transparente (250 mg, 80%). HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 4,50 min. ESI MS (+ve) 4 6 2 , 5 [M+H+]; m/z calculado para C21H43N5O6 : 461,6.
v. MeO-GlyLys [e-CBz] [a-Boc]
A una suspensión agitada de MeOGlyHCl (12,56 g, 0,11 mol) y DMF (200 mL) se añadió lentamente TEA (42 mL, 0,30 mol) a temperatura ambiente. El éster activo, PNPO-a-Boc-£-CBz-Lys (50,15 g, 0,10 mol) se añadió a la suspensión en porciones de 2-3 g. La mezcla de color amarillo brillante se agitó a temperatura ambiente durante 18h. Los compuestos volátiles fueron evaporados a vacío y el residuo resultante se particionó entre EtOAc (200 mL), Na2CO3 al 10% (100 mL) y agua (175 mL). La capa orgánica se lavó secuencialmente con Na2CO3 al 5% (4 x 200 mL), HCl 0,25 M (3 x 50 mL) y salmuera (1 x 50 mL), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para dar lugar al producto en forma de aceite incoloro (44,39 g, 98%). HPLC (hidrofóbico/Formiato) Rt = 5,22 min. ESI MS (+ve) 452,02 [M+H]+; m/z calculado para C22H33N3O7 : 451,52.
vi. MeO-GlyLys [e-CBz] [a-NH 2 -TFA]
A una disolución agitada y enfriada de MeO-GlyLys [£-CBz] [a-Boc] (43,4 g, 96,03 mmol) en ácido acético (150 mL) se añadió TFA puro en porciones (en total 170 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5h. Los compuestos volátiles fueron evaporados a presión reducida; se eliminó el TFA y el ácido acético residuales formando un azeótropo con metanol (5 x 200 mL). El producto se obtuvo en la forma de un aceite de color amarillo pálido (46,04 g). HPLC (Hidrofílico/Formiato) 12,33 min; ESI MS (+ve) 352 [M+H]+; m/z calculado para C17H25N3O5 : 351,40.
vii. MeO-GlyLys [e-CBz] [a-Lys] [Boc] 2
A una disolución agitada de MeO-GlyLys [£-CBz] [a-NH2 -TFA] (96 mmol) en DMF (200 mL) se añadió TEA (33,5 mL, 0,24 mol) seguido de DBL-OPNP (49,4 g, 0,106 mol). La disolución se agitó a temperatura ambiente durante 17h. Se añadió una disolución de glicina (3,98 g, 53 mmol) en agua (50 mL) a la mezcla de reacción sin purificar y se continuó con la agitación durante otras 18h. Se añadió agua (200 mL) y se recolectó el precipitado amarillo mediante filtración, a continuación se resuspendió en Na2CO3 al 5% (200 mL); y se agitó durante 1,5h. El producto sin purificar se recolectó por filtración y se resuspendió en agua (3 x 200 mL); los sólidos se recolectaron por filtración y se secaron al aire para dar lugar al producto en la forma de un polvo fino amarillo (61,07 g, 94%). HPLC (Hidrofóbico/Formiato) Rt = 7,90 min; ESI MS (+ve) 680.15 [M+H]+; m/z calculado para C33H53N5O10: 679,82.
viii. MeO-GlyLys [e-CBz] [a-Lys] [NH 2 -TFA] 2
A una disolución agitada de MeO-GlyLys [£-CBz] [a-Lys] [Boc]2 (4 g, 7,36 mmol) en ácido acético (15 mL) a 0 °C se añadió TFA (15 mL), gota a gota. La mezcla se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Los disolventes fueron eliminados y el residuo se disolvió en agua (100 mL) y se filtró. El filtrado se liofilizó para dar lugar a un aceite incoloro (4,4 g). HPLC/ (Hidrofílico/TFA) Rt = 5,03 min; ESI MS (+ve) = 480 [M+H+]; m/z calculado para C23H37N5O6 : 479,5.
ix. MeO-GlyLys [e-CBz] [a-Lys] [PEGs7o]2
A una suspensión agitada de MeO-GlyLys [£-CBz] [a-Lys] [NH2 -TFA]2 (735 mg, 1,04 mmol) en DMF (anhidro, 20 mL) se añadió TEA (1,5 mL, 5 equivalentes por amina) seguido de una disolución de m-dPEG570-NHS (1,5 g, 1,05 equivalentes por amina) en DMF (10 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Los disolventes fueron eliminados y el residuo se purificó en una columna de gel de sílice (0,063-0,04 mm, eluyentes 7% ~30% MeOH/DCM) para dar lugar al producto deseado en la forma de un aceite incoloro (1,0 g). HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 7,87 min; ESI MS (+ve) 828 [M+2xNH4]2+, 811 [M+2H]2+, 541 [M+3H]3+; m/z calculado para C75H137N5O32 : 1620,9.
x. HO-GlyLys [e-CBz] [a-Lys] [PEGs7o]2
A una disolución agitada de MeO-GlyLys [£-CBz] [a-Lys] [PEG57ü]2 (1,0 g, 0,62 mmol) en THF (20 mL) se añadió LiOH 1M (2 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3h; seguido de acidificación con HCl 1M hasta pH 6. Los disolventes fueron eliminados y el residuo se disolvió en agua y se liofilizó para dar lugar al producto en forma de sólido incoloro. HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 7,61 min; ESI MS (+ve) 821 [M+(2xNH4)]2+, 804 [M+2H]2+, 536 [M+3H]3+; m/z calculado para C74H135N5O32 : 16ü6,9.
xi. [Boc] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [GlyLys] 2 [e-CBz] 2 [Lys] 2 [PEGs7o]4
A una disolución agitada de [Boc] NEOEOEN [Su(NPN)2] [NH2]2 (Ejemplo 4iv) (100 mg, 0,22 mmol) y HO-GlyLys [£-CBz] [a-Lys] [PEG57ü]2 (700 mg, 0,44 mmol) en DMF (anhidra, 9 mL) a 0 °C, se añadió PyBop (250 mg) y DIp Ea (160 gL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Los compuestos volátiles fueron evaporados a vacío para dar lugar a un residuo que sometido a cromatografía en una columna de gel de sílice (0,063-0,04 mm, eluyentes 10%-30% MeOH/DCM) para producir 600 mg del producto en forma de aceite incoloro. HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 9,18 min; ESI MS (+ve) 886 [M-Boc+4H]4+, 729 [M+5H]5+, 709 [M-Boc+5H]5+; datos deconvolucionados usando cálculos de transformada para dar 3638,9 [M+H]+; m/z calculado para C169H309N15O68: 3639,3.
xii. [TFA NH 2 ] EOEOEN [Su(NPN) 2 ] [GlyLys] 2 [e-CBz] 2 [Lys] 2 [PEG57o]4
[Boc] NEOEOEN [Su(NPN)2] [GlyLys]2 [s-CBz]2 [Lys]2 [PEG57ü]4 pudo ser suspendido en 20% TFA/DCM y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La eliminación de los compuestos volátiles debería proporcionar el producto.
xiii. [ClCH 2 CO] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [GlyLys] 2 [e-CBz] 2 [Lys] 2 [PEG570]4
A una disolución de [TFANH2] EOEOEN [Su(NPN)2] [GlyLys]2 [£-CBz]2 [Lys]2 [PEG57ü]4 en tampón (100 mL Na2HPO4 0. 1 M; 100 mL de HCl 0,1 M, pH ~8,5) se podría añadir cloruro de cloroacetilo. Con agitación durante 2 h, debería poder detectarse el producto [ClCH2CO] NEOEOEN [Su(NPN)2] [GlyLys]2 [£-CBz]2 [Lys]2 [PEG57ü]4 mediante HPLC/MS.
xiv. NDP-a-MSH-CH 2 CO NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [GlyLys] 2 [e-CBz] 2 [Lys] 2 [PEG570]4
A un exceso de mercapto-NDP-a-MSH (mercapto-Ser-Tyr-Ser-Nle-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2) se podría añadir una disolución recién preparada de [ClCH2CO] NEOEOEN [Su(NPN)2] [GlyLys]2 [£-cBz]2 [Lys]2 [PEG57ü]4 en un tampón de hidrógeno ortofosfato sódico 0,1 M / HCl 0,1 M (pH 8,5). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16h, debería poder detectarse el producto conjugado en la mezcla de reacción mediante HPLC-MS.
Ejemplo 5 (No entra dentro del alcance de la invención reivindicada)
[Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [COCH2O-3,6-Naph (SO3Na)2]32
1. [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN) 2 ] [Lys] 16 [Boc]32
Se añadió PyBOP (20 mg, 0,04 mmol) a una disolución agitada de [NH2] EOEOEN [(Su(NPN)2] [Lys]16 [Boc]32 (Ejemplo lxiii) (109 mg, 0,015 mmol) en DMF/DMSO (1:1) (3 mL). Se añadió gradualmente una disolución de biotina-éster NHS (13 mg, 0,38 mmol) y DIPEA (40 pL, 0,23 mmol) en DMF/DMSO (1:1) (2 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16h. La mezcla de reacción se vertió en MeCN (300 mL) y se formó un precipitado. El precipitado se recogió por filtración y se secó a vacío para dar lugar a [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN)2] [Lys]16 [Boc]32 en forma de sólido blanco (119 mg, 106%). HPLC (Hidrofóbico/TFA) Rt = 10,9 min; ESI MS (+ve) m/z = 1910,ü2 (M-4H)4+; 1528,33 (M-5H)5+. Datos deconvolucionados usando cálculo de máxima entropía para dar lugar a PM=7638 [M+]; m/z calculado para C366H665N67O100S (forma H) [M+]: 7636,76.
ii. [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN) 2 ] [Lys]i6 [NH2-TFA]32
Una disolución de TFA y DCM (1:1) (2 mL) se añadió gota a gota a una suspensión agitada de [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN)2] [Lys]16 [Boc]32 (56 mg, 0,007 mmol) en DCM (3 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 14h. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se trituró con dietil éter (3 x 10 mL). El producto se secó a vacío para dar lugar a [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN)2] [Lys]16 [NH2-TFA]32 en la forma de un sólido blanco. HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 4,35 min; ESI MS (+ve) m/z = 1478,96 (M-3H)3+; 1109,38 (M-4H)4+; 887,70 (M-5H)5+; 739,84 (M-6H)6+. Datos deconvolucionados usando cálculo de máxima entropía para dar lugar a PM=4433 [M+], (forma H); m/z calculado para C206H409N67O36S (forma H) [M+]: 4433,01.
iii. [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN) 2 ] [Lys]i6 [COCH2O-3,6-Naph(SO3Na)2]32
Se añadió PyBOP (0,26 g, 0,50 mmol) a una disolución agitada de [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN)2] [Lys]16 [NH2-TFA]32 (56 mg, 0,007 mmol) en DMF/DMSO (1:1) (6 mL). Se añadió gradualmente una disolución de h Oc Oc H2O-3,6-Naph(SO3Na)2 (0,21 g, 0,53 mmol) y DIPeA (0,4 mL, 2,30 mmol) en DMF/DMSO (1:1) (5 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16h. La mezcla de reacción se vertió en agua (0,2 L) y se filtró. La purificación se llevó a cabo mediante filtración de flujo tangencial en un Centramate (membrana de 2K, reservorio de muestra de 0,5 L). Después de un lavado inicial con agua Milli-Q (5L), el retentato fue lavado con dos alícuotas de Na2SO41M (100 mL) separadas por un lavado con agua Milli-Q (1 L), después se continuó con la filtración hasta que el pH del filtrado era neutro (aprox. 5 L). El retentato se concentró a vacío y se secó por congelación para dar lugar a [Biotina] NEOEOEN [(Su(n Pn )2] [Lys]16 [COCH2O-3,6-Naph(SO3Na)2]32 en forma de sólido blanco (80 mg, 68%). HPLC/MS (Emparejamiento iónico) Rt = 8,74 min; ESI MS (-ve) m/z = 1544,32 (M-10H)10-; 1403,91 (M-11H)11-; 1286,51 (M-12H)12-; 1187,62 (M-13H)13-; 1102,86 (M-14H)14-; 1029,21 (M-15H)15-; 964,96 (M-16H)16-; 907,83 (M-17H)17-; 857,56 (M-18H)18-; 812,29 (M-19H)19-; 771,62 (M-20H)20-; 734,82 (M-21H)21-; 701,41 (M-22H)22-; 670,74 (M-23H)21-; 642,88 (M-24H)14-; 617,15 (M-25H)25-; 593,49 (M-26H)26-; 571,50 (M-27H)27-. Datos deconvolucionados usando cálculo de máxima entropía para dar lugar a PM=15453 [M-] (forma H); m/z calculado para C590H665N67O292S65 (forma H) [M-]:15451.
Ejemplo 6 (No entra dentro del alcance de la invención reivindicada)
[Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN) 2 ] [Lysjia [CO-3,5-Ph (SO3Na)2]32
Se añadió PyBOP (0,23 g, 0,44 mmol) a una disolución agitada de [biotina] [NEOEOEN(Su(NPN)2] [Lys]i6 [NH2-TFA]32 (Ejemplo 5ii) (48 mg, 0,006 mmol) en DMF/DMSO (1:1) ( 6 mL). Se añadió gradualmente una disolución de ácido 4-sulfobenzoico (0,12 g, 0,60 mmol) y DIPEA (0,3 mL, 1,72 mmol) en DMF/DMSO (1:1) (5 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16h. La mezcla de reacción se vertió en agua (0,2 L) y se filtró. La purificación se llevó a cabo mediante filtración de flujo tangencial en un Centramate (membrana de 1K, reservorio de muestra de 0,5 L). Después de un lavado inicial con agua Milli-Q (5 L) el retentato se lavó con dos alícuotas de Na2CO3 1M (100 mL) separadas por un lavado con agua Milli-Q (1 L), se continuó después con la filtración hasta que el pH del filtrado fue neutro (aprox. 5 L). El retentato se concentró a vacío y se secó por congelación para dar lugar a [biotina] NEOEOEN [(Su(n Pn )2] [Lys]16 [Ph-3 ,5 -(SO3Na)2]32 en la forma de un sólido blanco (103 mg, 123%). HPLC/MS (Emparejamiento iónico) Rt = 8,60 min; ESI MS (-ve) m/z = 919,70 (M-14H)14-; 858,30 (M-15H)15-; 804,56 (M-16H)16-; 757,08 (M-17H)17-; 715,01 (M-18H)18-; 677,48 (M-19H)19-; 643,61 (M-20H)20-. Datos deconvolucionados usando cálculo de máxima entropía para dar lugar a PM=12889 [M-] (forma H); m/z calculado para (C430H537N67O260S65) (forma H) [M-]: 12888.
Ejemplo 7 (No entra dentro del alcance de la invención reivindicada)
[Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN) 2 ] [Lys]8 [COCH2O-3,6-Naph(SO3Na)2]16
i. [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN) 2 ] [Lys]8 [Boc] 16
Se añadió PyBOP (20 mg, 0,04 mmol) a una disolución agitada de [NH2] EOEOEN [(Su(NPN)2] [Lys]s [Boc]16 (Ejemplo 7i) (55 mg, 0,015 mmol) en DMF (1:1) (3 mL). Se añadió gradualmente una disolución de biotina-éster de n Hs (13 mg, 0,38 mmol) y DIPEA (20 pL, 0,12 mmol) en DMF (1 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16h. La mezcla de reacción se vertió en MeCN (0,2 L) y se formó un precipitado. El precipitado se recolectó mediante filtración y se secó a vacío para dar lugar a [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN)2] [Lys]s [Boc]16 en forma de sólido blanco (34 mg, 58%). HPLC (Hidrofóbico/TFA) Rt = 8,27 min; ESI MS (+ve) m/z = 1328,87 [(M-3H)3+]; 996,98 [(M-4H)4+]. Datos deconvolucionados usando cálculo de transformada para dar lugar a PM=3984 [M+]; m/z calculado para C190H345N35O52S (forma H) [M+]: 3984,10.
ii. [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN) 2 ] [Lys]8 [NH 2 -TFA]i 6
Se añadió gota a gota una disolución de TFA y DCM (1:1) (2 mL) a una suspensión agitada de [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN)2] [Lys]8 [Boc]16 (34 mg, 0,009 mmol) en DCM (3 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 14h. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se trituró con dietil éter (3 x 10 mL). El producto se secó a vacío para dar lugar a [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN)2] [Lys]s [NH2 -TFA]16 en la forma de sólido blanco. HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 4,27 min; ESI MS (+ve) m/z = 1191,87 [(M-2H)2+]; 795,03 [(M-3H)3+]; 596,44 [(M-4H)4+]; 477,23 [(M-5H)5+]. Datos deconvolucionados usando cálculo de máxima entropía para dar lugar a PM=2382 [M+] (forma H); m/z calculado para C110H217N35O20S (forma H) [M+]: 2382,22.
iii. [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN) 2 ] [Lys]8 [COCH2O-3,6-Naph (SO3Na)2]i6
Se añadió PyBOP (0,16 g, 0,31 mmol) a una disolución agitada de [Biotina] NEOEOEN [(Su(NPN)2] [Lys]s [NH2 -TFA]16 (20 mg, 0,009 mmol) en DMF/DMSO (1:1) (4 mL). Se añadió gradualmente una disolución de HOCOCH2O-3 ,6 -Naph(SO3Na)2 (0 , 1 2 g, 0,28 mmol) y DIPeA (0 , 2 mL, 1,15 mmol) en DMF/DMSO (1 :1 ) ( 2 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16h. La mezcla de reacción se vertió en agua (0,25 L) y se filtró. La purificación se llevó a cabo mediante filtración de flujo tangencial en un Centramate (membrana de 2K, reservorio de muestra de 0,5 L). Después de un lavado inicial con agua Milli-Q (5 L) se lavó el retentato con dos alícuotas de Na2CO3 1M (100 mL) separadas por un lavado con agua Milli-Q (1 L), después se continuó con la filtración hasta que el pH del filtrado fue neutro (aprox. 5 L). El retentato se concentró a vacío y se secó por congelación para dar lugar a [Biotina] NEOEOEN [(Su(n Pn )2] [Lys]8 [COCH2O-3 ,6 -Naph (SO3Na)2]16 en la forma de un sólido blanco (69 mg, 94%). HPLC/MS (Emparejamiento iónico) Rt = 10,8 min; ESI MS (-ve) m/z = 1314,25 (M-6 H)6-; 1126,54 (M-7H)7-; 985,30 (M-8 H)8-; 875,91 (M-9H)9-; 787,96 (N4-10H)10-; 716,35 (M-11H)11-; 656,60 (M-12H)12-; 605,97 (M-13H)13-; 562,90 (M-14H)14-; 525,03 (M-15H)15-. Datos deconvolucionados usando cálculo de máxima entropía para dar lugar a PM=7891 [M-] (forma H); m/z calculado para C302H345N35O148S33 (forma H) [M-]: 7891,39. CE (pH 9); Rt = 8,00 min: 75,5% de pureza.
Ejemplo 8 (No entra dentro del alcance de la invención reivindicada)
[P-NO 2 -CBZ] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys] 2 [Su(NPN)2(PEGiioo)(MTX-a-OtBu)]4
A una mezcla agitada de Su(NPN)2(PEGn00)(MTX-a-OtBu) (75 mg, 41,2 pmol) y [p-NO2-CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]2 [NH2-TFA]4 (8,4 mg, 8,2 pmol) en DMF (3,0 mL) a 0 °C se añadió PyBop (23 mg, 44 pmol) y DIPEA (29 pL, 0,16 mmol). La mezcla se mantuvo a 0°C durante 30 minutos, a continuación, se dejó calentar hasta temperatura ambiente durante una noche. El disolvente se eliminó y el producto sin purificar fue purificado mediante HPLC PREP (Waters XTerra Prep RP18 10 pm, 19 x 250 mm, 5-45% ACN/H2O, 15-55 min después mantener, 0,1% TFA, Rt = 58 min) proporcionando 40 mg (74%) del producto deseado en la forma de un aceite amarillo viscoso. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,48 (s, OtBu, 36H), 1,54-1,95 (complejo, Lys(3 x CH2) NPN(2 x CH2), 32H); 2,05-2,32 (complejo, Glu(CH2), 8 H); 2,34-2,78 (complejo, succinil (CH2)2 + PEG-CH2 + Glu(CH2), 36H); 3,06-3,48 (complejo, Np N(4 x CH2) + PEG-Me N-Me Lys(N-CH2), 6 8 H); 3,50-4,06 (complejo, PEG-OCH2 , 388H); 4,20-4,28 (complejo, Lys(a-CH), 2H), 4,40-4,48 (complejo, Glu(a-CH), 4H); 4,94 (s, N-CH2 , 8 H); 5,20 (s, CBz-CH2 , 2H); 6,87 (d, 8,7 Hz, MTX, 8 H); 7,58 (d, 8,4 Hz, p-NO2-CBz, 2H); 7,78 (d, 8,7 Hz, MTX, 8 H); 8,20 (d, 8,4 Hz, p-NO2-CBz, 2H); 8 , 6 8 (s, MTX, 4H). HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 9,58 min; eS i Ms (+ve) 8,019 [M H+]; m/z calculado para C372H645N54O134 [M H+] 8,018,38.
Ejemplo 9 (No entra dentro del alcance de la invención reivindicada)
[CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys]4 [Su(NPN)2(PEG57o)(MTX-a-OtBu)]8
A una mezcla agitada de Su(NPN)2(PEG57ü)(MTX-a-OtBu) (36 mg, 27,8 pmol) y [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]4 [NH2 TFA]8 (6 , 0 mg, 2 , 8 pmol) en DMf (2 , 0 mL) a 0 °C se añadió PyBop (16 mg, 30,6 pmol) y DIPEA (16 pL, 89 pmol). La mezcla se mantuvo a 0 °C durante 30 min, y después de dejó calentar hasta temperatura ambiente a lo largo de una noche. El disolvente se eliminó y el producto sin purificar se purificó mediante HPLC PREP (Waters XTerra Prep RP1810 pm, 19 x 250 mm, 5-45% MeCN/H2O, 15-55 min después mantener, 0,1% TFA, Rt = 58 min) proporcionando 17 mg (53%) del producto deseado en la forma de un aceite amarillo viscoso. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) 5 (ppm) 1,16-1,56 (complejo, Lys(3 x CH2) NPN(2 x CH2) OtBu, 150H); 2,02-2,27 (complejo, Glu(CH2), 16H); 2,30-2,75 (complejo, succinil (CH2)2 + PEG-CH2 + Glu(CH2), 6 8 H); 3,00-3,42 (complejo, NPN(4 x CH2) PEG-Me N-Me Lys(N-CH2), 134H); 3,43-3,88 (complejo, PEG-OCH2 , 380H); 4,04-4,32 (complejo, Lys(a-CH), 7H), 4,34-4,50 (complejo, Glu(a-CH), 8 H); 4,91 (s, N-CH2 , 16H); 5,03 (s, CBz-CH2 , 2H); 6,83 (d, 8,7 Hz, MTX, 16H); 7,28 (br s, CBz, 5H); 7,75 (d, 8,7 Hz, MTX, 16H); 8,64 (s, MTX, 8 H). HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 9,41 min; ESI MS (+ve) 11,477,42 [M H+]; m/z calculado para C540H890N105O164 [M H+] 11,477,44.
Intermedios alternativos / clave
Ejemplo 10
[CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] [Lys]ia [NH2-TFA]32
Se disolvió [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [Boc]32 (Ejemplo lxii) (389 mg, 51,6 pmol) en ácido acético (1,9 mL) y la disolución agitada se enfrió en un baño de hielo hasta que el ácido acético comenzó a congelarse. Se retiró el baño de hielo y se añadió cuidadosamente TFA hasta que el ácido acético comenzó a fundir. Se volvió a colocar la disolución agitada en un baño de hielo y se añadió el resto del TFA (la cantidad total de TFA usado fue de 1,9 mL, 24,8 mmol). Se retire el baño de hielo y la disolución se agitó a temperatura ambiente durante 21h. El TFA y el ácido acético fueron evaporados a vacío y se añadió agua (5 mL) al residuo aceitoso. A continuación, se concentró la disolución a vacío y el proceso se repitió con más agua (2 x 5 mL). El aceite final se disolvió en agua (5 mL), la disolución se filtró y se secó por congelación para dar lugar a [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Lys]16 [NH2-TfA]32 (397 mg, 96%) en la forma de un sólido blanco amorfo. RMN de 1H (300 MHz, D2O) 5 (ppm) 1,20-1,65 (complejo, 92H); 1,65-1,85 (complejo, 62H); 1,85-2,05 (complejo, 30H); 2,51 (m, 2H); 2,61 (m, 2H); 2,95-3,10 (complejo, 34H); 3,10-3,45 (complejo, 38H); 3,55­ 3,70 (complejo, 8 H); 3,94 (t, J = 6 , 6 Hz, 8 H); 4,05 (t, J = 6 , 6 Hz, 8 H); 4,15-4,28 (complejo, 8 H); 4,28-4,39 (complejo, 6 H); 5,00 (s, 2H); 7,32-7,49 (complejo, 5H); HPLC (Hidrofílico/TFA) Rt = 8 , 8 min; ESI MS (+ve) 1447,8 [M+3H]3+/3, 1086,1 [M+4H]4+/4, 868,9 [M+5H]5+/5, 724,3 [M+6 H]6+/6 ; m/z calculado para C204H404N65O363+ [M+3H]3+: 1447,1, m/z calculado para C204H405N65O364+ [M+4H]4+: 10 8 5 ,6 , m/z calculado para C204H406N65O365+ [M+5H]5+: 8 6 8 ,6 , m/z calculado para C204H407N65O366+ [M+6 H]6+: 724,0.
Ejemplo 11
[CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] 2 [Boc]4
A una disolución de [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2] [Boc]2 (11,8 g, 17 mmol) en ácido acético (25 mL), se añadió TFA (25 mL). La disolución se agitó durante 10h y entonces se detuvo mediante la adición de agua (100 mL). El disolvente se evaporó a vacío y el residuo aceitoso resultante se disolvió en agua (50 mL) y se filtró a través de un filtro de 4,5 pm antes de ser secado por congelación. El material secado por congelación se disolvió en DMF (100 mL) y a esta disolución se añadió TEA (19 mL) y una disolución de PNPO-Su(NPN)2-Boc2 (20,7 g, 21 mmol) en DMF ( 10 0 mL). La disolución se dejó agitar a temperatura ambiente durante una noche. Entonces se añadió a la disolución otra disolución de glicina (2 g) en agua (120 mL). La disolución combinada se agitó a temperatura ambiente durante 16h. El disolvente se evaporó a vacío y el precipitado amarillo resultante se redisolvió en EtOAc (200 mL). Esta disolución fue lavada entonces con agua (50 mL), HCl 0,5M (50 mL) y Na2CO3 1M (4 x 50 mL). La capa orgánica se secó a continuación sobre Na2SO4 y el disolvente se evaporó a vacío. El aceite amarillo resultante se purificó entonces mediante cromatografía de gel de sílice para proporcionar un aceite transparente viscoso (18,5 g, 14 mmol, 82%). ESI MS (+ve) 562 [(M+2 H+-2 Boc)/2 ]; m/z calculado para C64H111N11O18 [M+h ]: 1323,63.
Ejemplo 12
[CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ] 4 [Boc]8
A una disolución de [CBz] NEOEOEN [Su(NPN)2]2 [Boc]4 (12,8 g, 9,7 mmol) en ácido acético (50 mL), se añadió TFA (50 mL). Esta disolución se agitó durante una noche a temperatura ambiente, tras lo cual el disolvente fue evaporado a vacío para proporcionar un aceite viscoso transparente. El aceite se disolvió en DMF (75 mL) y a esta disolución se añadió una suspensión de TEA (28 mL) y PNPO-Su(NPN)2-[Boc]2 (25,7 g, 47 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la mezcla de reacción se añadió una disolución de glicina (2 g) en agua (60 mL). La disolución combinada se dejó agitar durante 16h. El disolvente se eliminó a vacío y el precipitado Amarillo resultante se redisolvió en EtOAc (400 mL). A continuación, esta disolución se lavó con agua (50 mL), HCl 0,5M (2 x 50 mL) y Na2CO31M (5 x 50 mL). La capa orgánica se secó entonces sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó a vacío para proporcionar una espuma amarilla (24 g, 9,3 mmol, 96%). Una porción de este material (22,5 g) se purificó entonces mediante cromatografía de gel de sílice (gradiente de MeOH/DCM) para proporcionar una espuma blanca (15 g, 5,8 mmol, 6 6 %). ESI MS (+ve) 1289 [(M+2H+)/2]; 760 [(M+3H+-3Boc)/3]; m/z calculado para C124H219N23O34 [M+H]: 2577,3.
Ejemplo 13
[CBz] NEOEOEN [Su(NPN) 2 ]a[Boc]i 6
A una disolución de ácido acético/TFA 1:1 (100 mL), se añadió [CBz] NEOEOEN [Su(NPN|2]4[Boc]8 (12 g, 4,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20h. El disolvente se evaporó a vacío y el residuo transparente se redisolvió en DMF (150 mL). A esta disolución se añadió una suspensión de TEA (42 mL) y PNPO-Su(NPN)2-Boc2 (24,9 g, 45 mmol) en DMF (75 mL). Se dejó agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante una noche. El disolvente se evaporó a vacío y el precipitado amarillo resultante se redisolvió en EtOAc (2 L). Esta disolución se lavó entonces con salmuera (2 x 50 mL), Na2CO31M (2 x 1 mL). El disolvente se evaporó a vacío para proporcionar un aceite amarillo. ESI MS (+ve) 1695 [(M+3H+)/3]; 1272 [(M+4H+)/4]; 1018 [(M+5H+)/5]; m/z calculado para C244H435N47O66 [M+H]: 5084,3.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una macromolécula que comprende:
    (1 ) un dendrímero que comprende;
    (i) un grupo funcional de núcleo triamino o tetraamino que tiene un primer átomo de nitrógeno para la unión a un primer grupo funcional y la menos dos átomos de nitrógeno adicionales para la unión a unidades de construcción de lisina o de análogos de lisina; y
    (ii) una o más capas de unidades de construcción de lisina o de análogos de lisina, donde cada unidad de construcción en una primera de las capas está unida al grupo funcional de núcleo mediante un enlace amida, a través de al menos dos átomos de nitrógeno adicionales del grupo funcional de núcleo, y las unidades de construcción en capas subsiguientes están unidas a una capa previa a través de un enlace amida, donde la capa más externa de una o más unidades de construcción de lisina o de análogos de lisina presenta al menos una amina superficial para la unión a uno o más segundos grupos funcionales;
    (2 ) un primer grupo funcional unido al grupo funcional de núcleo a través del primer átomo de nitrógeno, donde el primer grupo funcional es un agente seleccionado del grupo que consiste en agentes farmacéuticamente activos y agentes dirigidos a receptores de superficie celular o a tejidos, y donde el primer grupo funcional no son unidades de construcción de lisina o de análogos de lisina;
    (3) uno o más segundos grupos funcionales unidos a las aminas de la capa más externa de unidades de construcción de lisina o de análogos de lisina, y donde el segundo grupo funcional es un agente modificador de la farmacocinética seleccionado del grupo que consiste en polifluorohidrocarburos, ácidos grasos, lípidos, ácidos desoxicólicos, polietilén glicol (PEG), polipropilén glicol (PPG), formas modificadas con alquilo de PEG y PPG, y estructura de polietiloxazolina; y
    donde las unidades de construcción se seleccionan del grupo que consiste en:
    Lisina* 1 que tiene la estructura:
    Figure imgf000040_0001
    Glicil-Lisina* 2 que tiene la estructura:
    Figure imgf000040_0002
    Análogo 3, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 1 o 2; y b y c son de forma independiente números enteros 1,2, 3 o 4:
    Figure imgf000040_0003
    Análogo 4, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1 o 2; y b y c son de forma independiente números enteros 2, 3, 4, 5 o 6 :
    Figure imgf000040_0004
    Análogo 5, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1,2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 1,2, 3, 4 o 5:
    Figure imgf000041_0001
    Análogo 6 , que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1,2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 0, 1,2, 3, 4 o 5:
    Figure imgf000041_0002
    Análogo 7, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1,2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 1,2, 3, 4 o 5:
    Figure imgf000041_0003
    Análogo 8 , que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1,2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 1,2, 3, 4 o 5:
    Figure imgf000041_0004
    Análogo 9, que tiene la siguiente estructura, donde a es un número entero 0, 1,2, 3, 4 o 5; y b y c son de forma independiente números enteros 1,2, 3, 4 o 5:
    Figure imgf000041_0005
    de cúspide que forma un enlace amida con un átomo de nitrógeno del núcleo o un átomo de nitrógeno de una generación previa de unidades de construcción; y
    donde cada grupo metileno de las unidades de construcción puede ser reemplazado por un grupo metilenoxi (CH2-O) o etilenoxi (CH2-CH2-O), siempre que esto no dé como resultado la formación de un grupo funcional carbonato (-O-C(O)-O-) o carbamato (-O-C(O)-N-) en la unidad de construcción.
    2. La macromolécula según la reivindicación 1, donde las unidades de construcción se seleccionan del grupo que consiste en Lisina 1, Glicil-Lisina 2 o Análogo de lisina 5 :
    Figure imgf000042_0001
    donde a es un número entero 0, 1 o 2 para el Análogo 5, y donde cualquier grupo metileno de Lisina 1, Glicil-Lisina 2 o Análogo de lisina 5 puede estar reemplazado por un grupo metilenoxi o etilenoxi siempre que esto no dé como resultado la formación de un grupo funcional carbonato o carbamato en la unidad de construcción.
    3. La macromolécula según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el núcleo es un compuesto triamino seleccionado del grupo que consiste en:
    Figure imgf000042_0002
    donde a es un número entero de 1 a 9;
    Figure imgf000042_0003
    donde a, b y c, son de forma independiente los números enteros 1,2, 3, 4 o 5, y donde d es un número entero entre 0 -1 0 0 ;
    Figure imgf000042_0004
    donde a y b, son de forma independiente los números enteros 0, 1, 2, 3, 4 o 5;
    Figure imgf000042_0005
    donde a y c, son de forma independiente los números enteros 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 y donde b es un número entero entre 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6 ; y
    Figure imgf000042_0006
    donde a y d, son de forma independiente los números enteros 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 y donde b y c son de forma independiente los números enteros 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6 ; y
    donde X es una lisina o un análogo de lisina unido a través de su grupo carboxilo, y donde la lisina o el análogo de lisina se selecciona del grupo que consiste en Lisina* 1, Glicil-Lisina* 2 y los Análogos 3 a 9 según se define en la reivindicación 1.
    4. La macromolécula según la reivindicación 3, donde el núcleo se selecciona del grupo que consiste en:
    Figure imgf000043_0001
    donde a es un número entero 1,2, 3, 4 o 5;
    Figure imgf000043_0002
    donde a, b y c, son de forma independiente los números enteros 1,2 o 3 y d es un número entero entre 1-30; y
    Figure imgf000043_0003
    donde a y d, son de forma independiente los números enteros 1 o 2 , y donde b y c son de forma independiente los números enteros 0 , 1 o 2 ; y
    donde X es una lisina o un análogo de lisina unido a través de su grupo carboxilo, y donde la lisina o el análogo de lisina se selecciona del grupo que consiste en Lisina* 1, Glicil-Lisina* 2 y los Análogos 3 a 9 según se define en la reivindicación 1.
    5. La macromolécula según la reivindicación 3, donde el núcleo es un compuesto 10 que tiene la siguiente estructura:
    Figure imgf000043_0004
    donde a es un número entero 1 o 2, y X es una lisina o un análogo de lisina unido a través de su grupo carboxilo, y donde la lisina o el análogo de lisina se selecciona del grupo que consiste en Lisina* 1, Glicil-Lisina* 2 y los Análogos 3 a 9 según se define en la reivindicación 1.
    6. La macromolécula según la reivindicación 3, donde el núcleo es un compuesto 11 que tiene la siguiente estructura:
    Figure imgf000043_0005
    donde a, b y c son de forma independiente 1 o 2, y d es un número entero entre 16-20, 21-25 o 26-30, y X es una lisina o un análogo de lisina unido a través de su grupo carboxilo, y donde la lisina o el análogo de lisina se selecciona del grupo que consiste en Lisina* 1, Glicil-Lisina* 2 y los Análogos 3 a 9 según se define en la reivindicación 1.
    7. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el núcleo es un compuesto triamino o tetraamino, seleccionado del grupo que consiste en:
    Figure imgf000043_0006
    donde a, b y c, son de forma independiente los números enteros 1,2, 3, 4, 5 o 6 ;
    Figure imgf000044_0001
    donde a, b y c, son de forma independiente los números enteros 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6 ;
    Figure imgf000044_0002
    donde a, b y c, son de forma independiente los números enteros 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6 ;
    Figure imgf000044_0003
    donde a, b y c, son de forma independiente los números enteros 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ; y d, e y f, son de forma independiente los números enteros 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ;
    Figure imgf000045_0001
    donde a, b, c y d, son de forma independiente los números enteros 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6 ;
    Figure imgf000045_0002
    donde a, b, c y d, son de forma independiente los números enteros 1,2, 3, 4, 5 o 6 ; y
    Figure imgf000045_0003
    donde a, b, c y d, son de forma independiente los números enteros 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ; y e, f, g y h, son de forma independiente los números enteros 1,2, 3, 4, 5 o 6.
    8. La macromolécula según la reivindicación 7, donde el compuesto triamino o tetraamino se selecciona del grupo que consiste en:
    Figure imgf000046_0001
    donde a, b y c, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros 1 o 2 ; y
    Figure imgf000046_0002
    donde a, b y c, son de forma independiente los números enteros 0 , 1 o 2 ; y d, e y f, son de forma independiente los números enteros 1 o 2,
    o donde un compuesto tetraamino se selecciona del grupo que consiste en:
    Figure imgf000046_0003
    donde a, b, c y d, son de forma independiente los números enteros 1 o 2 ; y
    Figure imgf000047_0001
    donde a, b, c y d, son de forma independiente los números enteros 0 , 1 o 2 ; y e, f, g y h, son de forma independiente los números enteros 1 o 2.
    9. La macromolécula según la reivindicación 1, donde el núcleo es un compuesto tetraamino seleccionado del grupo que consiste en:
    Figure imgf000047_0002
    donde a, b, c y d, son de forma independiente los números enteros 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6 ;
    Figure imgf000047_0003
    donde a, b, c y d, son de forma independiente los números enteros 1,2, 3, 4, 5 y 6 ; y
    donde X es una lisina o un análogo de lisina unido a través de su grupo carboxilo, y donde la lisina o el análogo de lisina se selecciona del grupo que consiste en Lisina* 1, Glicil-Lisina* 2 y los Análogos 3 a 9 según se define en la reivindicación 1.
    10. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el dendrímero comprende 1,2, 3, 4 o 5 capas de unidades de construcción.
    11. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que además comprende al menos un tercer grupo funcional unido a la una o más aminas superficiales de la capa más externa de unidades de construcción de lisina o de análogo de lisina.
    12. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde cada amina superficial está unida a un grupo funcional.
    13. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el agente farmacéuticamente activo es un péptido o una hormona.
    14. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el primer grupo funcional es un agente dirigido a receptores de superficie celular o a tejidos.
    15. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que presente una combinación de grupos funcionales como se indica a continuación:
    Figure imgf000048_0001
    16. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde el primer grupo funcional está unido a la amina del núcleo a través de un ligando que comprende PEG que tiene 2-40 unidades de repetición.
    17. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde un primer átomo de nitrógeno de núcleo o amina superficial, y/o cualquier ligando y/o el grupo funcional está modificado con un grupo modificador para facilitar la unión.
    18. La macromolécula según la reivindicación 17, donde el grupo modificador se selecciona entre una haloacetamida, una maleimida o un grupo funcional reactivo con tiol, un tiol reaccionable o un grupo disulfuro intercambiable, un aldehído alifático o aromático, cetona, una alcoxiamina, una hidracina, una azida, un alquino, una hidracida, un sistema de oligohistidina o cualquier sistema peptídico, un grupo de ácido nitrilotriacético, un carboxilato o residuo reactivo del mismo, un compuesto químico capaz de reaccionar con un haluro orgánico a través de una reacción de acoplamiento catalizada por metales o un grupo funcional capaz de ligación enzimática.
    19. La macromolécula según la reivindicación 17 o la reivindicación 18, donde el grupo modificador se selecciona entre una maleimida, una haloacetamida, una hidracida, una alcoxiamina, 3-(2-piridilditio)propionato, una azida, un alquino, una hidracina, un aldehído alifático o aromático, o una cetona.
    20. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde el agente farmacéuticamente activo se selecciona del grupo que consiste en preparaciones de acetonemia, agentes anabólicos, anestésicos, analgésicos, agentes anti-ácido, agentes anti-artríticos, anticuerpos, anti-convulsivos, anti-fúngicos, anti-histaminas, anti-infectivos, anti-inflamatorios, anti-metabolitos, anti-microbianos, anti-mitóticos, agentes anti-parasitarios, anti-protozoos, agentes anti-úlcera, fármacos modificadores del comportamiento, compuestos biológicos, broncodilatadores y expectorantes relacionados, terapia de cáncer, compuestos farmacéuticos cardiovasculares, compuestos farmacéuticos de sistema nervioso central, diuréticos, anticonceptivos, hormonas de crecimiento, terapias para la diabetes, hematínicos, compuestos farmacéuticos para la fertilidad, terapias de sustitución hormonal, promotores del crecimiento, inmunosupresores, hemostáticos, hormonas y análogos, inmunoestimulantes, relajantes musculares, compuestos farmacéuticos oftalmológicos, agentes terapéuticos para la obesidad, agentes terapéuticos para el dolor, fármacos de osteoporosis, proteínas, péptidos, polipéptidos, retinoides, compuestos farmacéuticos respiratorios, sedantes, tranquilizantes, productos de trasplante, acidificadores urinarios y esteroides.
    21. La macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, donde el agente farmacéuticamente activo se selecciona entre un agente anti-tumoral seleccionado entre uno o más de rituximab, oxaliplatino, docetaxel, gemcitabina, trastuzumab, irinotecan, paclitaxel, bevacizumab, carboplatino, cetuximab, doxorrubicina, pemetrexed, epirrubicina, bortezomib, topotecan, azacitidina, vinorrelbina, mitoxantrona, fludarabina, doxorrubicina, alemtuzumab, carmustina, ifosfamide, idarrubicina, mitomicina, fluorouracilo, cisplatino, metotrexato, melfalan, denileukina diftitox, citarabina, levofolinato cálcico, ciclofosfamida, etoposide, viscum album, mesna, gemtuzumab, ozogamicina, busulfan, pentostatina, cladribina, bleomicina, daunorrubicina, bendamustina, dacarbacina, raltitrexed, vincristina, fotemustina, fosfato etoposide, porfimer sódico and vinblastina.
    22. La macromolécula según la reivindicación 20, donde el péptido o la proteína se selecciona entre hemoglobina, proteínas séricas, citocinas, factores estimulantes de colonia, factores de crecimiento derivados de plaquetas, proteína activante de fosfolipasa, insulina, proteínas vegetales, factores de necrosis tumoral y alelos relacionados, formas solubles de receptores de factor de necrosis tumoral, receptores de interleucina, formas solubles de receptores de interleucina, factores de crecimiento, hormonas, somatomedinas, eritropoyetina, hormonas pigmentarias, factores de liberación hipotalámicos, hormonas antidiuréticas, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona estimulante de folículo, hormona estimulante de tiroides, activador de plasminógeno tisular e inmunoglobulinas y fragmentos de los mismos.
    23. La macromolécula según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, donde el agente dirigido a receptores de superficie celular o tejidos es un anticuerpo.
    24. La macromolécula según la reivindicación 23, donde el anticuerpo está dirigido contra un receptor de superficie celular o polisacárido.
    25. La macromolécula según la reivindicación 24, donde el receptor de superficie celular se selecciona del grupo que consiste en receptor de folato, receptor adrenérgico, receptor de hormona del crecimiento, receptor de hormona luteinizante, receptor de estrógeno, receptor de factor de crecimiento epidérmico, receptor de factor de crecimiento de fibroblasto, receptor de IL-2, CFTR y receptor de factor de crecimiento epitelial vascular (VEGF).
    26. Una composición que comprende una macromolécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, y al menos un excipiente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable del mismo.
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