ES2835716T3 - Procedimientos y composiciones para la generación y el uso de anticuerpos específicos de conformación - Google Patents

Abstract

Anticuerpo aislado específico de conformación o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la conformación cis de la proteína fosforilada treonina-231-tau (pT231-tau) para su uso como medicamento, en el que: (a) dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR-H) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y una región determinante de complementariedad de cadena ligera (CDR-L) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR-H) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y una región determinante de complementariedad de cadena ligera (CDR-L) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (c) dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una secuencia de proteína de cadena pesada de SEQ ID NO: 22 y una secuencia de proteína de cadena ligera de SEQ ID NO: 23, o (d) dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una secuencia de proteína de cadena pesada de SEQ ID NO: 24 y una secuencia de proteína de cadena ligera de SEQ ID NO: 25.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos y composiciones para la generación y el uso de anticuerpos específicos de conformación

Antecedentes de la invención

[0001] En general, la invención se refiere a procedimientos y composiciones para la generación y el uso de anticuerpos específicos de conformación o fragmentos de los mismos.

[0002] La fosforilación de proteínas es un mecanismo clave de señalización celular que induce cambios en la conformación de proteínas. Por ejemplo, la fosforilación de residuos específicos de serina o treonina que preceden inmediatamente a un residuo de prolina (motivo Ser/Thr-Pro) es un mecanismo regulador central en la célula. La estereoquímica única del residuo de prolina significa que el enlace peptidil-prolilo del motivo Ser/Thr-Pro puede adoptar dos estados conformacionales diferentes (es decir, una conformación cis o una conformación trans). Las peptidil-prolil cis/trans isomerasas (PPlasas) catalizan específicamente la isomerización cis/trans de los motivos Ser/Thr-Pro y, por lo tanto, regulan la estructura de estas proteínas entre las dos conformaciones distintas.

[0003] Pin1 es una PPlasa que cataliza específicamente la isomerización cis/trans de determinados motivos Ser/Thr-Pro fosforilados (pSer/Thr-Pro). La identificación de Pin1 como una PPlasa específica de fosforilación condujo a la comprensión de un nuevo mecanismo de señalización, mediante el cual Pin1 regula catalíticamente la conformación de sus sustratos después de su fosforilación para controlar adicionalmente la función proteica. Además, Pin1 está estrictamente regulado por múltiples mecanismos, y la desregulación de Pin1 juega un papel fundamental en algunas enfermedades humanas.

[0004] La prevalencia de la enfermedad de Alzheimer (EA) puede cuadruplicarse en todo el mundo para 2050, pero actualmente no hay un tratamiento efectivo. Las lesiones de EA distintivas en el cerebro son placas seniles hechas de péptidos Ap y enredos neurofibrilares de tau fosforilado (p-tau). La patología relacionada con tau (tauopatía) se correlaciona bien con la pérdida progresiva de neuronas y memoria en la EA y también es una característica definitoria de muchas otras tauopatías sin patología Ap . Si bien la inmunización activa y pasiva contra los péptidos Ap ha llegado a ensayos clínicos, la inmunoterapia contra p-tau se ha quedado muy rezagada. Los hallazgos recientes de que la inmunización activa o pasiva contra los epítopos p-tau que contienen enredos reduce los agregados tau y mejora los déficits de memoria en los modelos de ratones y que la tauopatía puede propagar la enfermedad de neurona a neurona sugieren que la inmunoterapia p-tau es una nueva estrategia prometedora para tratar la EA. Sin embargo, dado que la disfunción neuronal se produce mucho antes de la formación de enredos, un desafío importante es el desarrollo de inmunoterapia dirigida solo a los eventos patógenos tempranos que conducen a tauopatía y pérdida de memoria en EA.

[0005] Un acontecimiento muy temprano en tauopatía de EA es la hiperfosforilación de tau, especialmente en motivos Ser/Thr-Pro, que causa interrupción de los microtúbulos y neurotoxicidad. Se ha descubierto que el motivo Thr231-Pro fosforilado en tau (pT231-tau) existe en las dos conformaciones cis y trans distintas, y la prolil isomerasa Pin1 acelera su conversión para inhibir la tauopatía. Los ratones sin Pin1 mostraron tauopatía dependiente de la edad, mientras que la sobreexpresión de Pin1 inhibe la tauopatía en un modelo de ratón de eA. En las neuronas DCL y EA humanas, Pin1 se inhibe por múltiples mecanismos, mientras que el Pin1 PNU, que evita su regulación descendente, se asocia con el inicio tardío de EA. También se ha descubierto que el Pin1 humano ubicado en 19p13.2 está asociado con EA de inicio tardío, que pT231-tau se encuentra al comienzo de epítopos p-tau secuenciales en neuronas preenredadas, y que el pT231-tau en LCR es un biomarcador temprano que se correlaciona con la pérdida de memoria y rastrea la conversión de DCL a EA, y distingue EA de la demencia frontotemporal (DFT). Por lo tanto, pT231-tau es un evento muy temprano que inicia la enfermedad en EA.

[0006] Los soldados veteranos que regresan de la guerra experimentan características distintivas de lesión cerebral traumática (LCT) que son las mismas que la enfermedad neurodegenerativa diagnosticada anteriormente en atletas que han sufrido múltiples conmociones cerebrales. Parece que la LCT en estas personas puede desencadenar el desarrollo de encefalopatía traumática crónica (ETC), un trastorno neurodegenerativo devastador, para el que no hay tratamiento conocido. El sello neuropatológico de ETC es la acumulación anormal generalizada de tau hiperfosforilada (p-tau) como enredos neurofibrilares (tauopatía), similar a la lesión característica observada en la enfermedad de Alzheimer (EA) y otras tauopatías. Por lo tanto, la inmunoterapia contra p-tau está demostrando ser una nueva opción para tratar tauopatías. Más específicamente, existe una necesidad en la técnica de anticuerpos específicos de conformación que se unan específicamente a una conformación cis o trans de p-tau para dirigirse a las modificaciones tempranas patógenas de tau con preenredos que conducen a tauopatía. Los anticuerpos policlonalesantifosforilados de conejo treonina231-tau (pT132-tau) que reconocen específicamente la conformación cis y trans de p-tau se han descrito en Nakamura y col., Cell 149 (2012), 232-244; el documento US 2013/028900 A1; y la solicitud de patente internacional WO 2012/149334 A2.

Resumen de la invención

[0007] La invención se refiere a las realizaciones tal como se caracterizan en las reivindicaciones y presenta un anticuerpo específico de conformación aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la conformación cis de la proteína fosforilada de treonina231-tau (pT132-tau) para su uso como medicamento, donde

(a) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una CDR-H1 de regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR-H, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y una CDR-L1 de región determinante de complementariedad de cadena ligera (CDR-L, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(b) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una CDR-H1 de región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR-H) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y una CDR-L1 de región determinante de complementariedad de cadena ligera (CDR-L) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;

(c) el anticuerpo comprende una secuencia de proteína de cadena pesada de SEQ ID NO: 22 y una secuencia de proteína de cadena ligera de SEQ ID NO: 23; o

(d) el anticuerpo comprende una secuencia de proteína de cadena pesada de SEQ ID NO: 24 y una secuencia de proteína de cadena ligera de SEQ ID NO:25

[0008] Según la invención, el anticuerpo aislado descrito anteriormente se une específicamente a la conformación cis de la proteína treonina231-tau fosforilada (pT231-tau). En otra realización de la invención, los anticuerpos monoclonales aislados descritos anteriormente son anticuerpos de cadena simple o fragmentos de anticuerpos de los mismos. La solicitud también describe que los anticuerpos monoclonales aislados son anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. En todos los aspectos de la invención, los restos de unión aislados se utilizan como un medicamento, es decir, se formulan en una composición farmacéutica que incluye un portador farmacéuticamente aceptable.

[0009] En otra realización, la invención también presenta el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para su uso en un procedimiento para tratar la enfermedad de Alzheimer, encefalopatía traumática crónica (ETC), lesión cerebral traumática (LCT) o accidente cerebrovascular, incluyendo el procedimiento administrar a un sujeto que lo necesita, los restos de unión descritos anteriormente, en una cantidad suficiente para tratar la tauopatía, LCT o accidente cerebrovascular, donde el anticuerpo monoclonal se une específicamente a la conformación cis de pT231-tau.

[0010] La invención presenta, además, un procedimiento para controlar una respuesta terapéutica en un sujeto tratado con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en esta invención, incluyendo el procedimiento: a.) determinar el nivel de cis pT231-tau o relación cis: trans pT231-tau en una muestra obtenida del sujeto, y opcionalmente b.) determinar los niveles de t-tau, pT181-tau, Ap42 o ApoE4 en LCR, donde una disminución en el nivel de cis pT231-tau o relación cis: trans pT231-tau da como resultado una respuesta terapéutica eficaz a los restos de unión, y/o donde los niveles de t-tau, pT181-tau, Ap42 o ApoE4 en LCR disminuyen.

[0011] La solicitud también describe un procedimiento para diagnosticar que un sujeto tiene, o tiene una predisposición a, una tauopatía, incluyendo el procedimiento: a.) determinar el nivel de cis pT231-tau o relación cis: trans pT231-tau en una muestra obtenida del sujeto, b.) comparar el nivel de cis pT231-tau o relación cis: trans pT231-tau en la muestra con una muestra de referencia normal, donde un nivel elevado de cis pT231-tau o un aumento en la relación cis: trans pT231-tau en comparación con la muestra de referencia normal resulta en diagnosticar que el sujeto tiene o tiene una predisposición a la tauopatía, y administrar al sujeto los anticuerpos de la invención, donde los anticuerpos se unen específicamente al cis pT231-tau en una cantidad suficiente para tratar la tauopatía.

[0012] En todos los aspectos de la invención, la tauopatía se selecciona del grupo que consiste en: parálisis supranuclear progresiva, encefalopatía traumática crónica (ETC), demencia frontotemporal, degeneración lobular frontotemporal, enfermedad de Lytico-Bodig, demencia predominantemente por enredos, meningioangiomatosis, panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Pick, degeneración corticobasal y enfermedad de Alzheimer. En determinados aspectos, el sujeto está predispuesto a, o se encuentra en una etapa temprana de, la tauopatía, donde la predisposición o etapa temprana de la tauopatía se determina por un nivel elevado de cis pT231-tau o un aumento en la relación cis: trans pT231-tau en una muestra obtenida del sujeto. En otros aspectos, la predisposición o etapa temprana de la tauopatía también se determina por los niveles de t-tau, pT181-tau, Ap42 o niveles de ApoE4 en LCR. En otro aspecto más, el sujeto está predispuesto por un historial de traumatismo cerebral repetido. En todos los aspectos de la invención, la muestra se selecciona del grupo que consiste en: orina, sangre, suero, plasma, saliva, líquido amniótico y líquido cefalorraquídeo (LCR).

[0013] La solicitud describe, además, un resto de unión específico de conformación aislado, opcionalmente un anticuerpo o un anticuerpo monoclonal, donde el resto de unión incluye una o más regiones variables de cadena pesada con SEQ ID NO: 13-15, o variantes de las mismas y una o más variables de cadena ligera con SEQ ID NO: 16-18, o variantes de las mismas. El resto de unión aislado puede incluir dos o más regiones variables de cadena pesada con SEQ ID NO: 13-15, o variantes de las mismas y dos o más variables de cadena ligera con SEQ ID NO: 16-18, o variantes de las mismas. El resto de unión aislado puede incluir regiones variables de cadena pesada con SEQ ID NO: 13-15, o variantes de las mismas y variable de cadena ligera con SEQ ID NO: 16-18, o variantes de las mismas. El anticuerpo monoclonal aislado puede incluir una secuencia de proteína de cadena pesada de SEQ ID NO: 26 y una secuencia de proteína de cadena ligera de SEQ ID NO: 27.

[0014] La solicitud también describe un resto de unión específico de conformación aislado, opcionalmente un anticuerpo o un anticuerpo monoclonal, donde el resto de unión incluye una o más regiones variables de cadena ligera con SEQ ID NO: 19-21, o variantes de las mismas. El resto de unión aislado incluye dos o más regiones variables de cadena ligera con SEQ ID NO: 19-21, o variantes de las mismas. El resto de unión aislado incluye regiones variables de cadena ligera con SEQ ID NO: 19-21, o variantes de las mismas. El anticuerpo monoclonal aislado incluye una secuencia de proteína de cadena ligera de SEQ ID NO: 28.

[0015] Los restos de unión aislados descritos anteriormente se pueden unir específicamente a la conformación trans de pT231-tau. Los anticuerpos monoclonales aislados pueden ser anticuerpos de cadena simple o fragmentos de anticuerpos de los mismos. Los anticuerpos monoclonales aislados pueden ser anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Los restos de unión descritos anteriormente se pueden formular como composiciones farmacéuticas que incluyen un portador farmacéuticamente aceptable.

[0016] Finalmente, la solicitud también describe un kit para diagnosticar que un sujeto tiene, o tiene una predisposición a, una tauopatía que incluye: los restos de unión descritos en esta invención que se unen específicamente a la conformación cis de pT231-tau, los restos de unión descritos en esta invención que se unen específicamente a la conformación trans de pT231-tau e instrucciones para el uso de los restos de unión para diagnosticar que el sujeto tiene o tiene una predisposición a la tauopatía.

[0017] Por «adyuvante» se entiende una o más sustancias que causan la estimulación del sistema inmunitario. En este contexto, se usa un adyuvante para mejorar una respuesta inmunitaria a uno o más antígenos o anticuerpos de vacuna. Se puede administrar un adyuvante a un sujeto antes, en combinación con o después de la administración de la vacuna. Los ejemplos de compuestos químicos utilizados como adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, compuestos de aluminio, aceites, polímeros en bloque, complejos inmunoestimulantes, vitaminas y minerales (por ejemplo, vitamina E, vitamina A, selenio y vitamina B12), Quil A (saponinas), componentes de pared celular bacteriana y fúngica (por ejemplo, lipopolisacáridos, lipoproteínas y glicoproteínas), hormonas, citocinas y factores coestimulantes.

[0018] Por «cantidad suficiente» se entiende una cantidad que, cuando se administra a un sujeto que padece un trastorno (por ejemplo, una tauopatía, lesión cerebral traumática (LCT), accidente cerebrovascular u otro trastorno neurológico), es suficiente para causar una reducción cualitativa o cuantitativa en los síntomas asociados con el trastorno.

[0019] Por «anticuerpo» se entiende anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos recombinantes, anticuerpos multiespecíficos y fragmentos de anticuerpo. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico de conformación (por ejemplo, un anticuerpo que se une a la conformación cis o trans de un motivo Xaa-Pro, donde Xaa es un aminoácido). Un anticuerpo se une específicamente a un antígeno. El anticuerpo también puede ser un polipéptido que no se une a inmunoglobulina.

[0020] Por «antígeno» se entiende una molécula a la que un anticuerpo puede unirse selectivamente. El antígeno diana puede ser una proteína (por ejemplo, un péptido antigénico), carbohidrato, ácido nucleico, lípido, hapteno u otro compuesto sintético o de origen natural. El antígeno diana puede ser un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido que contiene un motivo Xaa-Pro (por ejemplo, un motivo Ser/Thr-Pro fosforilado o no fosforilado)) o imitaciones de péptidos (por ejemplo, un polipéptido que contiene un motivo Xaa-homoprolina (por ejemplo, un motivo Ser/Thr- homoprolina fosforilado o no fosforilado)). También se puede administrar un antígeno a un animal para generar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0021] Por «afinidad de unión» se entiende la fuerza de las interacciones no covalentes totales entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno o péptido antigénico). A menos que se indique lo contrario, como se usa en esta invención, «afinidad de unión» se refiere a afinidad de unión intrínseca, que refleja una interacción específica entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y generalmente puede estar representada por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica, incluidos los descritos en esta invención. Un complejo de baja afinidad contiene un anticuerpo que generalmente tiende a disociarse fácilmente del antígeno, mientras que un complejo de alta afinidad contiene un anticuerpo que generalmente tiende a permanecer unido al antígeno durante más tiempo.

[0022] Por «resto de unión» se entiende un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico), un anticuerpo humano, fragmento de anticuerpo, receptor, ligando, un polipéptido que no se une a inmunoglobulina o una porción de molécula pequeña de un agente que se une específicamente a una molécula diana (por ejemplo, un polipéptido, proteína (por ejemplo, cis pT231-tau o trans pT231-tau) o conjugado que lo incluye) o a una célula o tejido que porta la molécula diana (por ejemplo, un antígeno de superficie celular, por ejemplo, un receptor o ligando).

[0023] Por «muestra biológica» o «muestra» se entienden muestras sólidas y fluidas. Las muestras biológicas pueden incluir células, proteína o extractos de membrana de células, sangre o fluidos biológicos que incluyen, por ejemplo, líquido de ascitis o fluido cerebral (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo (LCR)). Los ejemplos de muestras biológicas sólidas incluyen muestras tomadas de heces, recto, sistema nervioso central, hueso, tejido mamario, tejido renal, cuello uterino, endometrio, cabeza o cuello, vesícula biliar, tejido parótido, próstata, cerebro, glándula pituitaria, tejido renal, músculo, esófago, estómago, intestino delgado, colon, hígado, bazo, páncreas, tejido tiroideo, tejido cardíaco, tejido pulmonar, vejiga, tejido adiposo, tejido de los ganglios linfáticos, útero, tejido ovárico, tejido suprarrenal, tejido testicular, amígdalas y del timo. Los ejemplos de muestras de fluido biológico incluyen muestras tomadas de la sangre, suero, LCR, semen, fluido prostático, fluido seminal, orina, saliva, esputo, moco, médula ósea, linfa y lágrimas. Las muestras se pueden obtener mediante procedimientos estándar que incluyen, por ejemplo, punción venosa y biopsia quirúrgica. En determinadas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de tejido de mama, pulmón, colon o próstata obtenida mediante biopsia con aguja.

[0024] Por «anticuerpo específico de conformación» se entiende un anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce y se une específicamente a una conformación particular (por ejemplo, un isómero conformacional o conformador) de su antígeno complementario. Por ejemplo, tal como se describe en esta invención, el anticuerpo específico de conformación puede unirse específicamente a la conformación cis de un motivo Xaa-Pro (por ejemplo, cis pT231-tau), pero no se unirá específicamente a la conformación trans del motivo Xaa-Pro (por ejemplo, trans pT231-tau), donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido (por ejemplo, serina o treonina). En este caso, el anticuerpo específico de conformación tendrá, por ejemplo, al menos 10 a 100 veces mayor afinidad con la conformación cis que con la conformación trans de un motivo Xaa-Pro. Por el contrario, el anticuerpo específico de conformación puede unirse específicamente a la conformación trans de un motivo Xaa- Pro, pero no se unirá específicamente a la conformación cis del motivo Xaa-Pro, donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido (por ejemplo, serina o treonina). En determinadas realizaciones, el motivo Ser/Thr-Pro puede fosforilarse (es decir, pSer/Thr-Pro).

[0025] Por «trastorno» se entiende cualquier afección que pueda tratarse, inhibirse, diagnosticarse o analizarse según los procedimientos descritos en esta invención.

[0026] Por «fragmento» se entiende una porción de un ácido nucleico o polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que contiene al menos, por ejemplo, el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. Un fragmento de ácido nucleico puede contener, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 4500 o 5000 nucleótidos o más nucleótidos, hasta la longitud completa del ácido nucleico. Un fragmento de polipéptido puede contener, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 aminoácidos o más aminoácidos, hasta la longitud completa del polipéptido. Los fragmentos de la invención útiles en los procedimientos terapéuticos incluyen, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos específicos de conformación que conservan actividad biológica (por ejemplo, fragmentos que se unen a un estado conformacional específico). Los fragmentos pueden modificarse como se describe en esta invención y como se conoce en la técnica.

[0027] Por «anticuerpo humanizado» se entiende una variante de secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina o fragmento de la misma que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado. El anticuerpo puede contener tanto la cadena ligera como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 o CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado comprende una región de estructura (FR, por sus siglas en inglés) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana.

[0028] Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. En general, el anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente la totalidad de, al menos uno, y típicamente dos, dominios variables (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, o Fv), en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Por «región determinante de complementariedad (CDR)» se entienden las tres secuencias hipervariables en las regiones variables dentro de cada una de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina. Por «región de estructura» se entienden las secuencias de aminoácidos ubicadas en cada lado de las tres secuencias hipervariables de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Jones y col. Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann y col. Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992) y las patentes estadounidenses n .° 4.816.567 y 5.530.101.

[0029] El término «anticuerpo monoclonal» como se usa en esta invención, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos (es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones de origen natural que puedan estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, al contrario que los preparados de anticuerpos convencionales (por ejemplo, policlonales), que típicamente incluyen anticuerpos distintos dirigidos contra diferentes determinantes (por ejemplo, epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante sobre el antígeno. El modificador «monoclonal» indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán conforme a la presente invención pueden producirse mediante el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col. (véase, por ejemplo, Nature 256: 495, 1975) o pueden producirse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n .° 4.816.567). Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson y col. (Nature 352: 624-628, 1991 y Marks y col. (J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991), por ejemplo.

[0030] Por «trastorno neurológico» se entiende una alteración en la estructura o función del sistema nervioso resultante de una anormalidad del desarrollo, trastorno, lesión o toxina. Los trastornos neurológicos ejemplares incluyen enfermedad de Alzheimer (EA), deterioro cognitivo leve (DCL), enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis múltiple (EM), distrofia muscular, degeneración corticobasal, demencia pugilística, síndrome de Down, demencias frontotemporales, distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Pick, enfermedad priónica, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, trastornos convulsivos (por ejemplo, epilepsia), demencia vascular, demencia relacionada con la edad, traumatismo craneal, accidente cerebrovascular, neurofibromatosis, enfermedad del cuerpo de Lewy, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), neuropatías periféricas y degeneración macular.

[0031] Por «portador farmacéuticamente aceptable» se entiende un portador que es fisiológicamente aceptable para el sujeto tratado mientras conserva las propiedades terapéuticas de la composición (por ejemplo, el anticuerpo específico de conformación) con el que se administra. Una sustancia portadora farmacéuticamente aceptable ejemplar es solución salina fisiológica. Otros portadores fisiológicamente aceptables y sus formulaciones son conocidos por un experto en la materia y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (20a edición, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, PA).

[0032] Por «proteína», «polipéptido», «fragmento de polipéptido» o «péptido» se entiende cualquier cadena de más de dos residuos de aminoácidos, independientemente de la modificación postraduccional (por ejemplo, glicosilación o fosforilación), que constituye todo o parte de un polipéptido o péptido de origen natural o que constituye un polipéptido o péptido de origen no natural. Se puede decir que un polipéptido o péptido es «aislado» o «sustancialmente puro» cuando se han empleado procedimientos físicos, mecánicos o químicos para eliminar el polipéptido de los constituyentes celulares. Un «polipéptido aislado» (por ejemplo, un anticuerpo aislado), «polipéptido sustancialmente puro» o «polipéptido sustancialmente puro y aislado» se considera típicamente eliminado de constituyentes celulares y sustancialmente puro cuando está al menos un 60 % en peso libre de las proteínas y moléculas orgánicas de origen natural con las que está asociado naturalmente. El polipéptido puede ser al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % en peso puro. Un polipéptido sustancialmente puro (por ejemplo, un anticuerpo sustancialmente puro o fragmento del mismo) se puede obtener mediante técnicas estándar, por ejemplo, mediante extracción de una fuente natural (por ejemplo, líneas celulares o fluidos biológicos), mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido o mediante la síntesis química del polipéptido. La pureza se puede medir mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, mediante cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis de HPLC. De manera alternativa, un polipéptido se considera aislado si ha sido alterado por intervención humana, colocado en un lugar que no es su sitio natural, o si se introduce en una o más células.

[0033] Los péptidos y polipéptidos de la invención, como se definió anteriormente, incluyen todas las formas «miméticas» y «peptidomiméticas». Los términos «mimético» y «peptidomimético» se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los péptidos (por ejemplo, péptidos antigénicos) o polipéptidos de la invención. El mimético puede estar compuesto completamente por análogos sintéticos no naturales de aminoácidos o puede ser una molécula quimérica de aminoácidos naturales y análogos no naturales de aminoácidos. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservadoras, siempre y cuando dichas sustituciones no alteren sustancialmente la estructura o actividad del mimético.

[0034] Por «disminución» se entiende la capacidad de causar una reducción general del 20 % o más, del 50 % o más, o del 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más. Para aplicaciones terapéuticas, «disminuir» puede referirse a la reducción en el nivel de polipéptidos o proteínas asociadas con el trastorno (por ejemplo, una tauopatía, LCT o accidente cerebrovascular). Para aplicaciones de diagnóstico o monitoreo, «disminuir» puede referirse a una disminución en el nivel de proteína o ácido nucleico detectado por los ensayos de diagnóstico o monitoreo.

[0035] Por «elevado o aumento» se entiende un aumento en la expresión génica o la expresión de proteínas, en comparación con un control de una muestra normal o de referencia (por ejemplo, un aumento de al menos 2 veces, por ejemplo, de aproximadamente 2 veces a aproximadamente 150 veces, por ejemplo, de 5 veces a 150 veces, de 5 veces a 100 veces, de 10 veces a 150 veces, de 10 veces a 100 veces, de 50 veces a 150 veces, de 50 veces a 100 veces, de 75 veces a 150 veces, o de 75 veces a 100 veces, en comparación con un control o una muestra de referencia normal). Un aumento o disminución en la expresión génica o expresión de proteínas se puede determinar usando cualquier procedimiento útil conocido en la técnica o descrito en esta invención (por ejemplo, según lo determinado por PCR, electroforesis en gel, ELISA).

[0036] Por «referencia» se entiende cualquier muestra, estándar o nivel que se utiliza para fines de comparación. Una «muestra de referencia normal» puede ser una muestra previa tomada del mismo sujeto antes del inicio de un trastorno (por ejemplo, una tauopatía, lesión cerebral traumática (LCT), accidente cerebrovascular u otro trastorno neurológico), una muestra de un sujeto que no tiene el trastorno, un sujeto que ha sido tratado con éxito para el trastorno, o una muestra de un polipéptido de referencia purificado a una concentración normal conocida. Por «estándar o nivel de referencia» se entiende un valor o número derivado de una muestra de referencia. Un estándar o nivel de referencia normal puede ser un valor o número derivado de un sujeto normal que se ajusta a una muestra de un sujeto en al menos uno de los siguientes criterios: edad, peso, etapa de la enfermedad y salud general. En un ejemplo, un nivel de referencia normal de, por ejemplo, un polipéptido que indica un trastorno o una conformación de un polipéptido que indica un trastorno, es inferior a 5 ng/ml en una muestra de suero, inferior a 4 ng/ml, inferior a 3 ng/ml, inferior a 2 ng/ml o inferior a 1 ng/ml en una muestra de suero. Una muestra, estándar o valor de «referencia positiva» es una muestra, estándar, valor o número derivado de un sujeto que se sabe que tiene un trastorno (por ejemplo, una tauopatía, LCT, accidente cerebrovascular u otro trastorno neurológico) que se ajusta a una muestra de un sujeto en al menos uno de los siguientes criterios: edad, peso, etapa de enfermedad y salud general. Por ejemplo, un valor de referencia positivo para, por ejemplo, un polipéptido que indica un trastorno, es mayor que 5 ng/ml de suero, mayor que 10 ng/ml de suero, mayor que 20 ng/ml, mayor que 30 ng/ml, mayor que 40 ng/ml o mayor que 50 ng/ml de suero.

[0037] Por «se une específicamente» se entiende una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que reconoce y se une a otra molécula (por ejemplo, un antígeno), pero que no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas. En un ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a la conformación cis de pT231-tau no se une específicamente a la conformación trans de pT231-tau. El término «unión específica», «se une específicamente a» o es «específico para» una molécula particular (por ejemplo, un polipéptido, un epítopo de un polipéptido o una conformación de un polipéptido), tal como se usa en esta invención, se puede mostrar, por ejemplo, mediante una molécula que tiene una Kd para la molécula a la que se une de al menos aproximadamente 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10­ 7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-1° M, 10-11 M, 10-12 M o más.

[0038] El término «se une específicamente» también puede hacer referencia a la unión donde una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) se une a un polipéptido particular (por ejemplo, un polipéptido que contiene un motivo Xaa-Pro, donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido (por ejemplo, serina o treonina)), un epítopo en un polipéptido particular o una conformación de un polipéptido particular (por ejemplo, una conformación cis de un motivo Xaa-Pro, por ejemplo, cis pT231-tau) sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido, epítopo de polipéptido o conformación de polipéptido (por ejemplo, la conformación trans de un motivo Xaa-Pro, por ejemplo, trans pT231-tau). Por ejemplo, el anticuerpo específico de conformación puede tener, por ejemplo, al menos 10 a 100 veces mayor afinidad (por ejemplo, 101-, 102-, 103-, 104-, 105-, 106-, 107-, 108-, 109- o 101°veces mayor afinidad) con una conformación (por ejemplo, la conformación cis) que con otra conformación (por ejemplo, la conformación trans) de, por ejemplo, un motivo Ser/Thr-Pro.

[0039] Por «sujeto» se entiende un mamífero, que incluye, pero no se limita a, un mamífero humano o no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino o felino.

[0040] Por «tratar» se entiende administrar una composición farmacéutica con fines terapéuticos o administrar tratamiento a un sujeto que ya padece un trastorno para mejorar la afección del sujeto. Por «tratar una tauopatía, LCT o accidente cerebrovascular» se entiende que los síntomas asociados con la tauopatía, LCT o accidente cerebrovascular se alivian, reducen, curan o colocan en un estado de remisión.

[0041] Por «CDR variantes» se entiende que las CDR pueden variar en posiciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más sustituciones de aminoácidos) o combinarse con diferentes CDR de cadena pesada y cadena ligera (por ejemplo, combinaciones de CDR1 y 3 en la cadena pesada con CDR1 y 2 en la cadena ligera).

Tales variantes pueden tener sustituciones (ya sea ejemplares o preferidas) como se describe en esta invención. Las CDR variantes preferentemente retendrían residuos conservados entre los anticuerpos descritos en esta invención mientras que tienen cambios en los residuos que muestran variar entre anticuerpos. Los restos de unión que contienen CDR variantes conservarán su capacidad de unirse específicamente a una conformación cis (o trans) del epítopo p-Tau como se describe en esta invención.

[0042] Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

[0043]

La figura 1 es un gráfico que muestra que el cis catalizado por Pin1 para la isomerización trans de pT231-tau protege contra tauopatía en la enfermedad de Alzheimer (EA), como se muestra al manipular Pin1 in vitro, en modelos celulares, modelos ex vivo y de ratón, y analizar la asociación de PNU con EA.

La figura 2 es un gráfico que muestra que el desarrollo de anticuerpos cis y trans específicos revela que cis, pero no trans pT231-tau pierde la función tau normal y gana función tóxica, y es la conformación patógena temprana que conduce a tauopatía y pérdida de memoria en deterioro cognitivo leve (DCL) y EA. Pin1 evita la acumulación de cis pT231-tau al convertirlo en el trans no patológico.

Las figuras 3A-3E muestran datos relacionados con el desarrollo de anticuerpos monoclonales de ratón cis y trans pT231-tau (mAb). Se obtuvieron dos clones de hibridoma cada uno de los mAb de ratón cis (figuras 3A, 3B) y trans (figura 3C) pT231-tau usando un péptido tau pT231-Pip como antígeno para inmunizar ratones. La figura 3D muestra la capacidad de cis y mAb trans para reconocer pT231-tau en inmunotransferencias confirmadas usando moléculas pequeñas que indujeron la degradación de Pin1 (Cpd1 es más potente que Cpd1E, con el análogo inactivo de Cpd1A utilizado como control). La figura 3E muestra los isotipos de inmunoglobulina de mAb según lo determinado usando un kit ELISA de isotipado.

Las figuras 4A-4I son resultados de inmunotinción que muestran cis prominentes pero no p-tau trans, especialmente en neuritis durante la progresión de la EA humana y ETC. Las mismas secciones cerebrales humanas se inmunotiñeron doblemente con cis y mAb trans con diferentes subtipos de IgG. Mientras que trans ptau se localizó en el soma de un número muy limitado de neuronas (B y C) incluso en controles normales, cis ptau apareció temprano y se acumuló y localizó a neuritis (paneles B, C, E, F, H e I) durante la progresión de EA y ETC.

Las figuras 5A-5E son resultados que muestran que los mAb cis y trans localizados en los compartimentos neuronales esperados y el mAb cis redujeron los niveles de tau de una manera dependiente de pT231 in vitro y ex vivo. En las figuras 5A y 5B, las células SY5Y se transfectaron con tau y p25/Ckd5, seguido de la adición de mAb al medio antes de someterse a tinción con anticuerpos anti-ratón (frotis de luz que rodean los círculos). Se demostró que los mAb cis alcanzan la neuritis (figura 5A) y los mAb trans alcanzan el cuerpo celular (figura 5B). La figura 5C es una transferencia que muestra que el mAb cis redujo los niveles de tau de tau endógeno y exógeno, pero no T231A, solo cuando p25/Cdk5 se transfectó conjuntamente en células SY5Y. La figura 5D es una transferencia que muestra que los mAb cis redujeron tau en cortes cerebrales de ratón Tau-Tg ex vivo. La figura 5E es una transferencia que muestra células SY5Y agotadas en suero con o sin cis o mAb trans. El mAb cis redujo potentemente el pT231-tau cis, mientras que el mAb trans redujo el trans pT231-tau. Las cadenas pesada y ligera de IgG mostraron que cis y mAb trans entraron en células y actina como control de carga.

Las figuras 6A-6E son resultados que muestran que cis pero no mAb trans suprimió potentemente la interrupción de microtúbulos y la neurotoxicidad inducida por p-tau y agotamiento sérico. La figura 6A muestra células SY5Y transfectadas con p25, Cdk5 y tau+GFP y las figuras 6B y 6C muestran células SY5Y transfectadas con GFP-tau o mutante de tau T231A seguido de la adición de mAb cis o trans pT231-tau antes de someterse a inmunotinción para microtúbulos (MT) y núcleos para la interrupción de microtúbulos (figura 6A) y neurotoxicidad (figura 6B). Los resultados de la inmunotinción se confirmaron mediante imágenes confocales de células vivas en lapso de tiempo en la figura 6C. La figura 6D son imágenes de inmunotinción para MT de células SY5Y sometidas a agotamiento sérico en presencia de cis o mAb trans durante 72 horas. La figura 6E son imágenes de inmunotinción de morfología celular que muestran neurotoxicidad de células SY5Y sometidas a agotamiento sérico en presencia de cis o mAb trans durante 72 horas.

Las figuras 7A-7B muestran la presencia prominente de cis pT231-tau en LCR con relaciones cis/trans constantemente elevadas en pacientes con EA. La figura 7A muestra cis y pT231-tau trans en líquido cefalorraquídeo (LCR) de 8 controles sanos y cinco pacientes con EA avanzada evaluados por ELISA usando anticuerpos cis y trans. La figura 7B muestra las relaciones cis/trans (nd: no detectable, na: no aplicable).

La figura 8 muestra una alineación de las cadenas ligeras de los dos mAb cis (#113, #74) (SEQ ID NO: 23 y 25, respectivamente) y dos mAb trans (#25, #69) (SEQ ID NO: 27 y 28, respectivamente) generados a partir de experimentos donde los ratones se inmunizan con péptido cis pT231-Pip tau al 74% como se describió anteriormente en Nakamura y col., Cell 149: 232-244, 2012. CDR 1-3 se indican con cajas etiquetadas CDR 1-3. Las cajas sombreadas indican residuos similares y las cajas abiertas indican residuos idénticos.

La figura 9 muestra una alineación de las cadenas pesadas de los dos mAb cis (#113, #74) (SEQ ID NO: 22 y 24, respectivamente) y un mAb trans (#25) (SEQ ID NO: 26) generado a partir de experimentos donde los ratones se inmunizan con péptido cis pT231-Pip tau al 74 % como se describió anteriormente en Nakamura y col., Cell 149: 232-244, 2012. CDR 1-3 se indican con cajas etiquetadas CDR 1-3. Las cajas sombreadas indican residuos similares y las cajas abiertas indican residuos idénticos.

La figura 10 es una serie de resultados de inmunotinción que muestran cis prominentes pero no p-tau trans en neuronas en el área cerebral dañada después de un accidente cerebrovascular. Las mismas secciones cerebrales de ratón se inmunotiñeron doblemente con cis y mAb trans con diferentes subtipos de IgG. Cis p-tau (color más claro) apareció temprano solo en el área dañada, pero no en el área no dañada. La figura 11 es un gráfico que muestra cómo se puede usar el mAb cis pT231-tau para el diagnóstico temprano y el tratamiento de tauopatías en LCT/ETC y DCL/EA.

Las figuras 12A-12E son resultados que muestran que cis, pero no mAb trans neutralizó eficazmente la capacidad de p-tau para inducir la interrupción de microtúbulos, muerte neuronal y apoptosis después del estrés neuronal, tal como agotamiento nutricional. El agotamiento de la nutrición indujo cis, pero no trans pT231-tau, pero ambos isómeros se eliminaron efectivamente mediante su respectivo tratamiento con mAb (figura 12A). cis mAb inhibió eficazmente la interrupción de microtúbulos inducida por el estrés (figura 12B), la muerte de neuronas por tinción de colorante de células vivas y muertas (figura 12C) y la apoptosis por escisión de PARP (figura 12D) o FCA de anexina V (figura 12E), mientras que el mAb trans mejoró los fenotipos.

La figura 13A y 13B son resultados que muestran que cis, pero no mAb trans bloqueó completamente la secreción de cis p-tau para inducir neurotoxicidad en las neuronas receptoras. cis, pero no trans p-tau se secretó en medios de cultivo a las 48 horas después del agotamiento de nutrientes (figura 13A). Los medios de cultivo celular recolectados a las 48 horas se incubaron con cis o mAb trans o control, seguido de la eliminación del mAb usando proteína G antes de agregarse a las neuronas receptoras durante 3 días (figura 13B).

La figura 14 es una serie de resultados de inmunotinción que muestran que cis, pero no mAb trans bloqueó completamente los lisados cerebrales de EA humana para inducir neurotoxicidad en las neuronas receptoras. Los lisados cerebrales de EA humana se incubaron con cis o mAb trans, seguido de la eliminación del mAb usando proteína G antes de agregarse a las neuronas receptoras durante 3 días.

La figura 15A-15D son resultados que muestran que cis p-tau aumenta con la gravedad de LCT y aparece mucho antes que otros epítopos de tau en cerebros de ratones LCT. La figura 15A es una transferencia que muestra que cis p-tau aumenta con la gravedad de LCT, como se muestra mediante inmunotransferencia de muestras cerebrales 2 semanas después de LCT con diferentes alturas de caída de peso. Las figuras 15B y 15C son resultados de inmunotinción que muestran que el cis robusto, pero no trans p-tau apareció después de LCT de una manera dependiente del tiempo, como se muestra mediante inmunotinción para cis o trans p-tau y ADN. La figura 15D muestra la presencia de cis p-tau robusto, pero no AT8, TG3, AT100 o PHF1 en el cerebro 2 semanas después de la LCT.

La figura 16A-16C son resultados que muestran que el mAb cis eliminó eficazmente la inducción de cis pT231-tau e inhibió la muerte celular después de una sola LCT grave en cerebros de ratón. 72 horas después de la inyección IP o IV de mAb de biotin-cis, se tiñeron secciones cerebrales de ratón para mAb de biotin-cis (figura 16A). Tres ratones se sometieron a LCT grave única y se trataron con mAb cis o IgG de control cada cuatro días durante tres veces, seguido de inmunotransferencia para cis p-tau y tau total (figura 16B) o PARP escindida como marcador de apoptosis (figura 16C) dos semanas después de LCT.

Las figuras 17A y 17B son resultados que muestran que el mAb cis restauró efectivamente la interrupción del microtúbulo, la destrucción mitocondrial y los defectos de comportamiento compulsivos después de una sola LCT grave. Los ratones se sometieron a LCT grave única y se trataron con mAb cis o IgG de control cada cuatro días durante tres veces durante dos semanas para microscopía electrónica (figura 17A), y a continuación semanalmente durante dos meses para pruebas de comportamiento (figura 17B).

Descripción detallada

[0044] La invención se refiere a las realizaciones tal como se caracterizan en las reivindicaciones. En general, la invención se refiere a anticuerpos específicos de conformación o fragmentos de los mismos para su uso como un medicamento y procedimientos que los usan. Los inventores han descubierto que cis pero no trans pT231-tau es una conformación patógena extremadamente temprana que conduce a tauopatía y pérdida de memoria en EA. Los inventores han desarrollado un ensayo ELISA cuantitativo para mostrar que el cis p-tau era indetectable en el líquido cefalorraquídeo de control (LCR), que tanto el cis como el trans p-tau estaban elevados en EA, con niveles de cis mucho más altos que el trans, y las relaciones cis: trans aumentaron y fueron similares en pacientes con EA. Estos resultados junto con la generación de anticuerpos específicos de conformación descritos en esta invención proporcionan una estrategia novedosa para diagnosticar y tratar la EA y otras tauopatías en una etapa patógena temprana mediante la detección del cis pT231-tau con el trans pT231-tau como control interno.

PPlasas y la conformación cis/trans de los sustratos de PPlasa

[0045] La prolina es un residuo de aminoácidos único en su capacidad para adoptar la conformación cis o trans. Debido a la barrera de energía relativamente grande de su isomerización (£u = 14 a 24 kcal mol'1), la isomerización no catalizada es un procedimiento lento, pero puede acelerarse mediante PPlasas. Las PPlasas facilitan el plegamiento de proteínas e incluyen, por ejemplo, ciclofilinas (Cyps), proteínas de unión a FK506 (FKBP) y PPlasas similares a parvulina (por ejemplo, Ess1 y Pin1).

[0046] Pin1 (proteína que interactúa con NIMA (nunca en la mitosis A)-1) isomeriza específicamente motivos de Ser/Thr-Pro fosforilados (pSer/Thr-Pro) de determinados polipéptidos, lo cual es importante porque las cinasas dirigidas por prolina (por ejemplo, proteínas cinasas que fosforilan determinados residuos de Ser/Thr que preceden a un residuo de prolina) y las fosfatasas son específicas de la conformación y generalmente actúan solo en la conformación trans. Pin1 tiene una estructura de dos dominios que incluye un dominio WW N-terminal y un dominio PPlasa C-terminal, y los análisis de estructura-función han demostrado que la especificidad de sustrato única de Pin1 hacia motivos pSer/Thr-Pro específicos resulta de las interacciones proporcionadas tanto por el dominio WW como por el dominio PPlasa. La actividad PPlasa de Pin1 facilita la regulación de, por ejemplo, respuestas de señal de crecimiento, progresión del ciclo celular, respuestas de estrés celular, función neuronal y respuestas inmunitarias.

[0047] Los sustratos ejemplares del Pin1, cada uno con motivos que pueden ser isomerizados, se enumeran en la tabla 1. También se enumeran las consecuencias funcionales de la isomerización de los sustratos.

Tabla 1. Sustratos Pin1

continuación

continuación

[0048] También se ha documentado la importancia de la isomerización prolílica independiente de la fosforilación. Por ejemplo, la PPlasa CypA cataliza la isomerización cis-trans del enlace prolilo en la posición Gly237-Pro238 de la proteína Crk. Otros sustratos de PPlasa isomerizados de manera independiente de la fosforilación incluyen, sin limitación, receptores de esteroides, c-Myb, H3P30, H3P38, Itk, receptores de 5-hidroxitriptamina tipo 3 (5-HT3), la proteína de punta de fago G3P, la poliproteína Gag del virión del virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), canal de liberación de calcio intracelular, proteínas CrkII/CrkL, proteína de centrosoma 55 kDa (Cep55), las proteínas Rel retrovirales, PKB/Akt, oncoproteína Tax del virus de la leucemia de células T humano tipo 1 (HTLV-1), Stat3, HER2/Neu, Notch, FAK, FOXO, PML, C/EBP y SMRT. La desregulación de la actividad de PPlasa (por ejemplo, la regulación ascendente o descendente de la actividad de PPlasa (por ejemplo, un aumento o disminución de la actividad de PPlasa)) puede, por ejemplo, dar como resultado un mayor contenido cis o trans de motivos Ser/Thr-Pro presentes en sustratos de PPlasa, que pueden afectar la función del sustrato de PPlasa y dar como resultado el desarrollo de, por ejemplo, trastornos de proliferación celular, trastornos neurológicos, asma, trastornos asociados con el envejecimiento y tauopatías (véase, por ejemplo, las figuras 1 y 2).

Anticuerpos específicos de conformación

[0049] La presente invención se refiere a los anticuerpos específicos de conformación o fragmentos de los mismos para su uso como medicamento tal como se caracteriza en las reivindicaciones. Los anticuerpos específicos de conformación pueden, por ejemplo, unirse específicamente a la conformación cis o trans de un polipéptido. Según la invención, el anticuerpo específico de conformación de la invención se une a la conformación cis de un pT231-tau fosforilado. La unión de un anticuerpo específico de conformación a su antígeno (pT231-tau) puede ser útil en el tratamiento, diagnóstico o monitoreo de un trastorno o la progresión de un trastorno.

[0050] Los procedimientos para la preparación y el uso de anticuerpos con fines terapéuticos se describen en esta invención y, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n .° 6.054.297; 5.821.337; 6.365.157; y 6.165.464, la solicitud internacional n .° PCT/US2012/035473 y la solicitud de patente estadounidense n .°: 13/504.700.

Antígenos

[0051] Los anticuerpos específicos de conformación pueden generarse usando antígenos inmunogénicos (por ejemplo, péptidos antigénicos) que contienen, por ejemplo, un motivo Xaa-Pro fosforilado o no fosforilado, donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido (por ejemplo, serina o treonina) fijado en una conformación particular (por ejemplo, la conformación cis o trans) o en conformaciones cis y trans mixtas o cualquier otro motivo o secuencia de aminoácidos que sea capaz de isomerización cis/trans. Por ejemplo, el contenido cis o trans de péptidos antigénicos que contienen Ser/Thr-Pro fosforilados o no fosforilados puede fijarse mediante síntesis estereoselectiva de imitaciones de alqueno (Z) y (E) mediante reordenamientos Still-Wittig e Ireland-Claisen (J. Org. Chem., 68: 2343-2349, 2003). De manera alternativa, el contenido cis o trans de péptidos antigénicos que contienen Ser/Thr-pro fosforilados o no fosforilados puede aumentarse o fijarse sustituyendo un residuo de aminoácido de prolina con un análogo de prolina. Los análogos de prolina incluyen, sin limitación, homoprolina, ácido pipecólico (Pip), dimetilprolina (DMP), ácido azetidina-2-carboxílico (Aze), terc-butil-L-prolina (TBP), trans-4-fluoro-L-prolina (t-4F-Pro) y cis-4-fluoro-L-prolina (c-4F-Pro). El contenido cis o trans de un antígeno dado se puede analizar, por ejemplo, mediante análisis de resonancia magnética nuclear (RMN).

[0052] Los péptidos antigénicos pueden contener un motivo Xaa-Pro fosforilado o no fosforilado, donde Xaa es cualquier residuo de aminoácido (por ejemplo, serina o treonina), que es capaz de isomerización cis/trans. El péptido antigénico puede contener los residuos de aminoácidos del motivo Xaa-Pro de un sustrato Pin1 (cuyos ejemplos se proporcionan en la tabla 1), con el residuo de prolina sustituido por un análogo de prolina. El péptido antigénico también puede contener los residuos de aminoácidos del motivo Xaa-Pro de un polipéptido de longitud completa. El péptido antigénico puede incluir además residuos adicionales que rodean el motivo Xaa-Pro del polipéptido de longitud completa. Por ejemplo, el péptido antigénico puede incluir los residuos de aminoácidos 3-10 N-terminales al residuo Xaa de un polipéptido de longitud completa y los residuos de aminoácidos 3-10 C-terminales a la prolina de un polipéptido de longitud completa. El péptido antigénico puede tener, por ejemplo, al menos 4, 5, 6, 7 u 8 residuos de aminoácidos de longitud. El péptido antigénico puede tener entre 8 y 20 residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 residuos de aminoácidos de longitud) o puede tener más de 20 residuos de aminoácidos de longitud.

[0053] Dichos antígenos pueden producirse y purificarse mediante cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos por un experto en la materia. Los péptidos antigénicos pueden producirse y purificarse, por ejemplo, mediante síntesis química en fase sólida, transcripción/traducción in vitro o mediante tecnología recombinante. Opcionalmente, los péptidos antigénicos pueden acoplarse químicamente a una proteína portadora o los péptidos pueden generarse como proteínas de fusión para aumentar la antigenicidad. Los péptidos antigénicos se pueden analizar en función de su capacidad para inducir la producción de anticuerpos específicos de conformación. En este sentido, dichas técnicas de detección pueden incluir, pero no se limitan a, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), inmunoprecipitación u otros inmunoensayos.

[0054] Los antígenos ejemplares útiles en la producción de anticuerpos específicos de conformación incluyen antígenos que contienen un motivo Ser/Thr-homoprolina fosforilada o no fosforilada, Ser/Thr-Pip, Ser/Thr-DMP, Ser/Thr-Aze, Ser/Thr-TBP, Ser/Thr-t-4F-Pro, Ser/Thr-c-4F-Pro. Los ejemplos específicos de dichos antígenos incluyen, por ejemplo, péptido APP pT668-Pip y pT668-DMP (VDAAV-pT668-Pro-EERHLSK), péptido tau pT231-Pip y péptido tau pT231-DMP (KVAVVR-pT231- Pro-PKSPS). Otros antígenos ejemplares también se describen en la publicación de solicitud de patente estadounidense n .° 2008/0058276. Dichos péptidos se pueden utilizar como antígenos para generar, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de conejo o ratón).

[0055] Según la invención, los antígenos se unirán a regiones variables con las siguientes secuencias:

Cis mAb-#113

CDR de cadena pesada

CDR1: SYWIH (SEQ ID NO: 1)

CDR2: VIDPSDSYTRYNQKFKG (SEQ ID NO: 2)

CDR3: WEVDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 3)

Cis mAb-#113

CDR de cadena ligera

CDR1: RSSQSLVHSDGNTYLH (SEQ ID NO: 4)

CDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 5)

CDR3: SQSTHVPWT (SEQ ID NO: 6)

Cis mAb-#74

CDR de cadena pesada

CDR1: SGYYWN (SEQ ID NO: 7)

CDR2: YISYDGSNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 8)

CDR3: LRRDAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 9)

Cis mAb-#74

CDR de cadena ligera

CDR1: RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 10)

CDR2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 11)

CDR3: QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 12)

[0056] La solicitud también describe que los antígenos pueden unirse a las regiones variables con las siguientes secuencias:

Trans mAb-#25

CDR de cadena pesada

CDR1: DTYMH (SEQ ID NO: 13)

CDR2: RIDPANGNTRYDPKFQG (SEW ID NO: 14)

CDR3: RVGYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 15)

Trans mAb-#25

CDR de cadena ligera

CDR1: KSSQSVLYSSDLKNYLA (SEQ ID NO: 16)

CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 17)

CDR3: HQYLSSYT (SEQ ID NO: 18)

Trans mAb-#69

CDR de cadena ligera

CDR1: KSSQSLLYTGNQKNYLA (SEQ ID NO: 19)

CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 20)

CDR3: QQYYSYPWT (SEQ ID NO: 21)

Generación y purificación de anticuerpos específicos de conformación

[0057] Los antígenos se pueden usar para generar, por ejemplo, anticuerpos específicos de conformación monoclonales, policlonales, quiméricos, humanizados o recombinantes mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Estos procedimientos incluyen los procedimientos inmunológicos descritos por Kohler y Milstein (Nature 256: 495-497, 1975 y Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976) y Campbell (Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas, en Burdon y col., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, volumen 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985), así como por el procedimiento de ADN recombinante descrito por Huse y col. (Science 246: 1275-1281, 1989).

[0058] En resumen, los antígenos pueden administrarse, en combinación con un adyuvante, a un animal hospedador (por ejemplo, un conejo, ratón, cabra, oveja o pollo). La administración de dichos antígenos se puede lograr mediante cualquiera de una variedad de procedimientos, que incluyen, pero no se limitan a, inyección subcutánea o intramuscular. Una vez administrados, se monitorean los resultados de las titulaciones de anticuerpos producidas en el animal hospedador, que pueden llevarse a cabo mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, hemorragias de rutina), con el antisuero aislado (por ejemplo, mediante centrifugación) y posteriormente analizarse para detectar la presencia de anticuerpos que tienen una afinidad de unión por, por ejemplo, la conformación cis o trans de un polipéptido o fragmento de polipéptido. La detección del anticuerpo deseado se puede lograr mediante técnicas que incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayos, ELISA, inmunoensayos sándwich, ensayos inmunodiométricos, reacciones de precipitación por difusión en gel, inmunoensayos in situ (por ejemplo, usando etiquetas coloidales de oro, enzimáticas o radioisótopos), transferencias Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel o ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis.

[0059] Los antisueros resultantes derivados del animal hospedador pueden purificarse por afinidad para derivar los anticuerpos para la presente invención. Los antisueros se pueden purificar mediante técnicas convencionales, tal como la introducción de los antisueros en una columna de separación. Los antígenos se pueden inmovilizar en la columna para aislar y purificar anticuerpos específicos de conformación. Por ejemplo, un péptido antigénico que contiene un motivo Ser/Thr-DMP que se usa para generar un anticuerpo específico de cis puede inmovilizarse en una columna y usarse para purificar el anticuerpo específico de cis resultante de, por ejemplo, anticuerpos en la conformación trans. A continuación, la columna puede lavarse para eliminar anticuerpos que no tienen especificidad para el antígeno inmovilizado en la columna, con el anticuerpo específico de conformación restante eluido en última instancia de la columna. El anticuerpo específico de conformación aislado se puede almacenar a continuación según las prácticas convencionales conocidas por los expertos en la materia.

[0060] De manera alternativa, las bibliotecas de anticuerpos (por ejemplo, bibliotecas de anticuerpos sin tratamiento previo, bibliotecas de anticuerpos sintéticos, bibliotecas de anticuerpos semisintéticos o bibliotecas combinatorias) pueden analizarse para la identificación de anticuerpos específicos de conformación. Dichas bibliotecas están disponibles comercialmente de varias fuentes (por ejemplo, Cambridge Antibody, Cambridge, Reino Unido, Genetastix Corporation, Pacific Northwest Laboratory, Richland, Washington y MorphoSys AG, Munich, Alemania (por ejemplo, HuCal GOLD)). Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n .° 6.696.248; 6.706.484; 6.828.422; y 7.264.963.

[0061] El análisis de una biblioteca de anticuerpos se puede realizar mediante el uso de uno de los procedimientos conocidos por un experto en la materia que incluye, por ejemplo, visualización de fagos, fago selectivamente infeccioso, tecnología de polisoma y sistemas de ensayo para la actividad enzimática o estabilidad de proteínas. Los anticuerpos que tienen la propiedad deseada se pueden identificar, por ejemplo, mediante secuenciación de la secuencia de ácido nucleico correspondiente, mediante secuenciación de aminoácidos o mediante espectrometría de masas. La optimización se realiza reemplazando subsecuencias con diferentes secuencias (por ejemplo, secuencias aleatorias) y a continuación repitiendo la etapa de selección una o más veces. Los anticuerpos pueden analizarse para, por ejemplo, afinidad o especificidad optimizadas para una molécula diana (por ejemplo, la conformación cis o trans de una molécula diana), rendimientos de expresión optimizados, estabilidad optimizada o solubilidad optimizada.

[0062] Los anticuerpos específicos de conformación de la presente invención reconocen y se unen específicamente a la conformación cis de la proteína treonina231-tau fosforilada (pT231-tau) En este caso, la Kd entre el anticuerpo específico de conformación y su antígeno es, por ejemplo, al menos aproximadamente 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-1° M, 10-11 M o 10-12 M o mayor. Además de la especificidad de unión, el anticuerpo específico de conformación tendrá, por ejemplo, al menos 10 a 100 veces mayor afinidad con una conformación (por ejemplo, la conformación cis) que con otra conformación (por ejemplo, la conformación trans) del motivo Xaa-Pro. El anticuerpo específico de conformación puede tener, por ejemplo, al menos 103-, 104-, 105-, 106-, 107-, 108-, 109- o 101°veces mayor afinidad con una conformación (por ejemplo, la conformación cis) que otra conformación (por ejemplo, la conformación trans).

[0063] Las secuencias de los anticuerpos de la invención, y sus regiones determinantes de complementariedad (CDR), se establecen a continuación.

Cis mAb-#113

CDR de cadena pesada

CDR1: SYWIH (SEQ ID NO: 1)

CDR2: VIDPSDSYTRYNQKFKG (SEQ ID NO: 2)

CDR3: WEVDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 3)

SEQ ID NO: 22 (secuencia de proteína completa de cadena pesada)

MGVSLQLLGT QDLTMRWSCI ILFLVATATG VNSQVQLQQP GAELVKPGAS VKMSCKASGY TFTSYW1HWV KQRPGQGLEW IGVIDPSDSY TRYNQKFKGK ATLTVDTSSS TAYMQLSSLT SEDSAVYYCT TWEVDYWGQG TTLTVSSAKT TPPSVYPLAP GSL SEQ ID NO: 29 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena pesada) ATGGGGGTCTCTCTACAGTTACTAGGCACACAGGATCTCACCATGAGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCT TGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCAACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCC TGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATACACTGGGTG AAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGGTACA ATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACGTTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAG CAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAACATGGGAGGTTGACTACTGGGGCCAAGGC ACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCCCTGGCCCCTGGAAGCTTGG G

Cis mAb-#113

CDR de cadena ligera

CDR1: RSSQSLVHSDGNTYLH (SEQ ID NO: 4)

CDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 5)

CDR3: SQSTHVPWT (SEQ ID NO: 6)

SEQ ID NO: 23 (secuencia de proteína completa de cadena ligera)

MGTDQSPQAV SSGCLLKMKL PVRLLVLMFW IPASNSDWM TQTPLSLPVS LGDQASISCR SSQSLVHSDG NTYLHWYLQK PGQSPKLLIY KVSNRFSGVP DRFSGSGSGT DFTLKISRLE AEDLGVYFCS QSTHVPWTFG GGTKLEIKRA DAAPTVSIFP PSSKLG

SEQ ID NO: 30 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena ligera) ATGGGGACTGATCAGTCTCCTCAGGCTGTCTCCTCAGGTTGCCTCCTCAAAATGAAGTTGCCTGTTAGGC TGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAACAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCT GCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTCCACAGTGATGGA AACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCA ACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAG CAGACTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGT GGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTA AGCTTGGG

Cis mAb-#74

CDR de cadena pesada

CDR1: SGYYWN (SEQ ID NO: 7)

CDR2: YISYDGSNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 8)

CDR3: LRRDAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 9)

SEQ ID NO: 24 (secuencia de proteína completa de cadena pesada)

MKVLSLLYLL TAIPGILSDV QLQESGPGLV KPSQSLSLTC SVTGYSITSG YYWNWIRQFP GNKLEWMGYI SYDGSNNYNP SLKNRISITR DTSKNQFFLK LNSVTTEDTA TYYCAGLRRD AYWGQGTLVT VSAAKTTPPS VYPLAPGSL

SEQ ID NO: 31 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena pesada)

ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGG

AGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCAT

CACCAGTGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATA

AGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTA

AGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCGGGGTT

ACGACGTGATGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACACCCCCATCA

GTCTATCCACTGGCCCCTGGAAGCTTGGG

Cis mAb-#74

CDR de cadena ligera

CDR1: RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 10)

CDR2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 11)

CDR3: QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 12)

SEQ ID NO: 25 (secuencia de proteína completa de cadena ligera)

MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPWTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSKLG

SEQ ID NO: 32 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena ligera) ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGA TGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCA GGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTAC ACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCA CCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGAC GTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCA TC CAGTAAGCTTGGGG

[0064] La solicitud describe además las secuencias de los siguientes anticuerpos de referencia y sus CDR.

Trans mAb-#25

CDR de cadena pesada

CDR1: DTYMH (SEQ ID NO: 13)

CDR2: RIDPANGNTRYDPKFQG (SEW ID NO: 14)

CDR3: RVGYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 15)

SEQ ID NO: 26 (secuencia de proteína completa de cadena pesada)

MKCSWVIFFL MAWTGVTSE VQLQQSGAEL VKPGASVKLS CTASGFNIKD TYMHWVKQRP EQGLEWIGRI DPANGNTRYD PKFQGKATIT SDTSSNTAYL QLSSLTSEDT AVYYCARRVG YYFDYWGQGT TLTVSSAKTT PPSVYPLVPG SL

SEQ ID NO: 33 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena pesada)

ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCACTTCAGAGGTTCAGCTGC AGCAGTCTGGGGCAGAACTTGTGAAACCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAA CATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATT GATCCTGCGAATGGTAATACTAGATATGACCCAAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACATCAGACACAT CCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAG GCGGGTGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACA CCCCCATCTGTCTATCCCCTGGTCCCTGGAAGCTTGGG

Trans mAb-#25

CDR de cadena ligera

CDR1: KSSQSVLYSSDLKNYLA (SEQ ID NO: 16)

CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 17)

CDR3: HQYLSSYT (SEQ ID NO: 18)

SEQ ID NO: 27 (secuencia de proteína completa de cadena ligera)

MESQTQVFLS LLLWVSGTCG NIMMTQSPSS LAVSAGEKVT MSCKSSQSVL YSSDLKNYLA WYQQKPGQSP TLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVQAEDLA VYYCHQYLSS YTFGGGTKLE IKRADAAPTV SIFPPSSK

SEQ ID NO: 34 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena ligera) ATGGAATCACAGACTCAGGTCTTCCTCTCCCTGCTGCTCTGGGTATCTGGTACCTGTGGGAACATTATGA TGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCA AAGTGTTTTATACAGTTCAGATCTGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCT ACACTGCTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATA CCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTA TCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGC

Trans mAb-#69

CDR de cadena ligera

CDR1: KSSQSLLYTGNQKNYLA (SEQ ID NO: 19)

CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 20)

CDR3: QQYYSYPWT (SEQ ID NO: 21)

SEQ ID NO: 28 (secuencia de proteína completa de cadena ligera)

MDSQAQVLML LLLWVSGTCG DIVMSQSPSS LAVSVGEKVT MSCKSSQSLL YTGNQKNYLA WYQQKPGQSP KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVKAEDLA VYYCQQYYSY PWTFGGGTKL EIKRADAAPT VSIFPPSSKL G

SEQ ID NO: 35: (secuencia de ácido nucleico completo de cadena ligera) ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGA TGTCACAATCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCA GAGCCTTTTATATACTGGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCT AAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATA TTATAGCTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACT GTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG

Por lo tanto, la invención presenta el uso de los anticuerpos específicos de cis enumerados anteriormente (o anticuerpos derivados de los mismos) como un medicamento, en procedimientos terapéuticos. Según la invención, los anticuerpos monoclonales (por ejemplo, humanizados o humanos) tienen las tres c Dr de la cadena pesada y ligera de cada uno de los anticuerpos específicos de cis anteriores. Estas CDR pueden incorporarse en regiones de estructura (por ejemplo, estructuras humanas) como se describe en esta invención. La solicitud describe que estas CDR pueden variar (por ejemplo, contener 1, 2, 3, 4, 5 o más) sustituciones de aminoácidos. Tales variantes pueden tener sustituciones (ya sea ejemplares o preferidas) como se indica en la tabla 2 a continuación:

Tabla 2. Sustituciones de aminoácidos

[0065] De manera adicional o alternativa, las variantes pueden contener sustituciones como se indica en las figuras 8 y 9. Dichas variantes preferentemente retendrían residuos conservados entre los anticuerpos representados mientras que tienen cambios en los residuos que muestran variar entre anticuerpos (por ejemplo, el residuo puede sustituirse según la tabla anterior o con un residuo alternativo representado en las figuras). Las variantes también pueden incluir combinaciones de las CDR de la cadena pesada y la cadena ligera. Por ejemplo, las variantes pueden incluir: CDR 1 y 3 de la cadena pesada y CDR 1 y 3 o Cd R 1 y 2, o CDR 2 y 3 de la cadena ligera; CDR 1 y 2 de la cadena pesada y CDR 1 y 3 o CDR 1 y 2, o CDR 2 y 3 de la cadena ligera; C^d R 2 y 3 de la cadena pesada y CDR 1 y 3 o CDR 1 y 2, o CDR 2 y 3 de la cadena ligera; c Dr 1 y 3 de la cadena ligera y CDR 1 y 3 o CDR 1 y 2, y/o CDR 2 y 3 de la cadena pesada; CDR 1 y 2 de la cadena ligera y CDR 1 y 3 o CDR 1 y 2, o CDR 2 y 3 de la cadena pesada; CDR 2 y 3 de la cadena ligera y CDR 1 y 3 o CDR 1 y 2 o CDR 2 y 3 de la cadena pesada, o combinaciones de los mismos. En todos los casos, las variantes de los anticuerpos anteriores conservarán su capacidad de unirse específicamente a una conformación cis (o trans) del epítopo pTau como se describe en esta invención.

Anticuerpos humanizados

[0066] La solicitud describe anticuerpos humanizados. En la técnica se conocen diversos procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan residuos de «importación», que típicamente se toman de un dominio variable de «importación». La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature 321: 522-5, 1986; Riechmann y col., Nature 332: 323-7, 1988; Verhoeyen y col., Science 239: 1534-6, 1988), sustituyendo las secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos «humanizados» son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense n.° 4.816.567), donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que al menos algunos residuos de región hipervariable, así como otros residuos de región variable, están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

[0067] La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizarán para producir los anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad. Según el llamado procedimiento de «mejor ajuste», la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana más cercana a la del roedor es a continuación aceptada como la estructura humana para el anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, Sims y col., J. Immunol. 151: 2296-308,1993; Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901-17, 1987. Otro procedimiento utiliza una estructura particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes. Véase, por ejemplo, Carter y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-9, 1992; Presta y col., J. Immunol. 151: 2623-32, 1993.

[0068] Además, es generalmente deseable que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un procedimiento, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos conceptuales humanizados utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la materia. Hay programas informáticos disponibles que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas pantallas permite el análisis de la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir del receptor y las secuencias de importación de modo que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como una mayor afinidad por el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de región hipervariable están directa y más sustancialmente involucrados en influir en la unión al antígeno.

Anticuerpos humanos

[0069] Los anticuerpos humanos se pueden construir combinando secuencia o secuencias de dominio variable de clon Fv seleccionada(s) de bibliotecas de visualización de fagos derivadas de humanos con secuencia o secuencias de dominio constante humana(s) conocidas (Hoogenboom y col., J. Mol. Biol. 227: 381-8, 1992; Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 581-97, 1991). De manera alternativa, los anticuerpos monoclonales humanos se pueden producir mediante el procedimiento de hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano de ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos han sido descritas, por ejemplo, por Kozbor, J. Immunol. 133: 3001­ 5, 1984; Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner y col., J. Immunol. 147: 86-95, 1991.

[0070] Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-5, 1993; Jakobovits y col., Nature 362: 255-8, 1993; Bruggemann y col., Year Immunol. 7: 33-40, 1993.

[0071] La mezcla génica también puede usarse para derivar anticuerpos humanos de anticuerpos no humanos, por ejemplo, roedores, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano inicial. Según este procedimiento, que también se denomina «impresión de epítopo», la región variable de cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido mediante técnicas de visualización de fagos como se describe en esta invención se reemplaza con un repertorio de genes de dominio V humano, creando una población de scFv de cadena no humana/cadena humana o quimeras Fab. La selección con antígeno da como resultado el aislamiento de un scFv quimérico de cadena no humana/cadena humana o Fab donde la cadena humana restaura el sitio de unión al antígeno destruido al retirar la cadena no humana correspondiente en el clon de visualización de fago primario, es decir, el epítopo gobierna (imprime) la elección del compañero de cadena humano.

Cuando se repite el procedimiento para reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase la publicación PCT WO 93/06213). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos no humanos mediante injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos de FR o CDR de origen no humano.

Fragmentos de anticuerpos

[0072] La invención también presenta fragmentos de anticuerpo que comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión al antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

[0073] La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos «Fab», cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento «Fc» residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión al antígeno y sigue siendo capaz de reticular antígeno.

[0074] Fv es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión al antígeno completo. En una realización, una especie Fv de dos cadenas consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y una cadena ligera en asociación estrecha y no covalente. En una especie Fv de cadena simple (scFv), un dominio variable de cadena pesada y una cadena ligera puede enlazarse covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en una estructura «dimérica» análoga a la de una especie Fv de cadena doble. Es esta configuración, las tres regiones hipervariables (HVR, por sus siglas en inglés) de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis HVR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir el antígeno, aunque con una afinidad inferior que el sitio de unión completo.

[0075] El fragmento Fab contiene los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en esta invención para Fab' en los que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes llevan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab') 2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

[0076] Los fragmentos de anticuerpo Fv o scFv de cadena simple comprenden los dominios V^h y V^l del anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido simple. Generalmente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios Vh y Vl que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), págs. 269-315.

[0077] Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V^h) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V^l) en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más detalladamente, por ejemplo, en la patente europea n .° 404.097; la publicación PCT WO 1993/01161; Hudson y col., Nat. Med. 9: 129-34, 2003; y Hollinger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8, 1993. Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson y col. Nat. Med. 9: 129-34, 2003.

[0078] Los fragmentos de anticuerpo pueden generarse por medios tradicionales, tales como digestión enzimática, o mediante técnicas recombinantes. En determinadas circunstancias, hay ventajas de usar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos enteros. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite un aclaramiento rápido y puede conducir a un mejor acceso a tumores sólidos. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpos, véase Hudson y col. Nat. Med. 9: 129-134, 2003.

[0079] Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y col. J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-17, 1992; y Brennan y col., Science 229: 81-3, 1985). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden ser producidos directamente por células hospedadoras recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli, permitiendo así la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpos. De manera alternativa, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter y col., Bio/Technology 10: 163-7, 1992). En otra estrategia, los fragmentos F(ab')2 se aíslan directamente del cultivo de células hospedadoras recombinantes. El fragmento Fab y F(ab')2 con vida media in vivo aumentada que comprende residuos de epítopos de unión al receptor de rescate se describen en la patente estadounidense n.° 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el profesional experto.

Formulaciones terapéuticas

[0080] Los anticuerpos específicos de conformación de la presente invención se pueden usar en el tratamiento, inhibición o prevención de una tauopatía, LCT o accidente cerebrovascular. Los anticuerpos específicos de conformación también se pueden usar para mejorar los síntomas de una tauopatía, LCT o accidente cerebrovascular.

[0081] Los anticuerpos específicos de conformación de la presente invención se pueden formular y administrar de diversas maneras (por ejemplo, vías conocidas por indicaciones específicas, que incluyen, pero no se limitan a, inyección bronquial tópica, oral, subcutánea, intravenosa, intracerebral, intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraarterial, intralesional, parenteral, intraventricular en el cerebro o intraocular). Por ejemplo, la composición farmacéutica que contiene el anticuerpo específico de conformación puede tener la forma de una píldora, comprimido, cápsula, líquido o comprimido de liberación sostenida para administración oral; un líquido para administración intravenosa o subcutánea; un polímero u otro vehículo de liberación sostenida para administración local; o un ungüento, crema, gel, líquido o parche para administración tópica.

[0082] La infusión sistémica continua o la inyección periódica del anticuerpo específico de conformación se pueden usar para tratar o prevenir una tauopatía, LCT o accidente cerebrovascular. El tratamiento se puede continuar durante un período de tiempo que varía de un día a lo largo de la vida del sujeto, por ejemplo, de 1 a 100 días, de 1 a 60 días, o hasta que se reduzcan o eliminen los síntomas del trastorno. Las dosis varían dependiendo de la gravedad del trastorno o los síntomas del trastorno. Los sistemas de liberación sostenida y los dispositivos de membrana implantables semipermeables también son útiles como un medio para administrar la composición farmacéutica de la invención. En otra realización, la composición se administra localmente, por ejemplo, por inhalación, y esta administración se puede repetir periódicamente.

[0083] Las formulaciones terapéuticas se preparan usando procedimientos estándar conocidos en la técnica al mezclar el ingrediente activo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas (véase, por ejemplo, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 20a edición, Ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, PA). Los portadores aceptables incluyen, por ejemplo, solución salina; amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparaginas, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o PEG.

[0084] Opcionalmente, pero preferentemente, la formulación contiene una sal farmacéuticamente aceptable, preferentemente cloruro de sodio, y preferentemente a concentraciones fisiológicas. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden contener un conservante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la concentración de conservante varía del 0,1 al 2,0 % v/v. Los conservantes adecuados incluyen aquellos conocidos en las técnicas farmacéuticas. El alcohol bencílico, fenol, m-cresol, metilparabeno y propilparabeno son conservantes preferidos. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden incluir un tensioactivo farmacéuticamente aceptable. Los tensioactivos preferidos son detergentes no iónicos. Los tensioactivos preferidos incluyen Tween-20 y ácido plurónico (F68). Las concentraciones adecuadas de tensioactivo son, por ejemplo, del 0,005 al 0,02 %.

[0085] Los anticuerpos específicos de conformación de la invención se administran al sujeto en cantidades terapéuticamente eficaces. Preferentemente, los anticuerpos se administran por vía parenteral o intravenosa mediante infusión continua. La dosis y el régimen posológico dependen de la gravedad del trastorno y de la salud general del sujeto. La cantidad de anticuerpo administrado se encuentra típicamente en el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10 mg/kg de peso del sujeto, preferentemente de 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg de peso del sujeto.

[0086] Para la administración parenteral, los anticuerpos específicos de conformación se formulan en una forma inyectable de dosificación unitaria (por ejemplo, solución, suspensión o emulsión) en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de dichos vehículos incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5 %. También se pueden usar vehículos no acuosos, tales como aceites fijos y oleato de etilo. Los liposomas se pueden usar como portadores. El vehículo puede contener cantidades menores de aditivos, tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química (por ejemplo, amortiguadores y conservantes). Los anticuerpos típicamente se formulan en dichos vehículos a concentraciones de aproximadamente 1 mg/ml a 10 mg/ml.

[0087] La dosis requerida depende de la elección de la vía de administración; la naturaleza de la formulación; la naturaleza del trastorno del sujeto; el tamaño, peso, área superficial, edad y sexo del sujeto; otros fármacos que se administran; y el juicio del médico del sujeto. Se esperan amplias variaciones en la dosis necesaria en vista de la variedad de polipéptidos y fragmentos disponibles y las diferentes eficiencias de diversas vías de administración. Por ejemplo, se espera que la administración por vía oral requiera dosis más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas estándar para la optimización, como se entiende bien en la técnica. Las administraciones pueden ser únicas o múltiples (por ejemplo, 2-, 3-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150- o más administraciones). La composición se puede administrar en cualquier momento (por ejemplo, después del diagnóstico o detección de un trastorno o una afección asociada con el trastorno (por ejemplo, usando los procedimientos de diagnóstico conocidos en la técnica o descritos en esta invención) o antes del diagnóstico de un trastorno a un sujeto con riesgo de desarrollar el trastorno). La encapsulación del anticuerpo en un vehículo de administración adecuado (por ejemplo, micropartículas poliméricas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficiencia de la administración, particularmente para la administración por vía oral.

[0088] Cuando se desea la administración de liberación sostenida del anticuerpo específico de conformación en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier trastorno que requiera la administración del anticuerpo, se puede contemplar la microencapsulación del anticuerpo. La microencapsulación de polipéptidos para liberación sostenida se ha realizado con éxito con hormona de crecimiento humano (rhGH), interferón (rhIFN-), interleucina-2 y MN rgp120 (véase, por ejemplo, Johnson y col. Nat. Med. 2: 795-799, 1996; Yasuda, Biomed. Ther. 27: 1221-1223, 1993; Hora y col., Bio/Technology 8: 755-758 1990; Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, en «Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach,» Powell and Newman, Eds., Plenum Press: Nueva York, págs. 439-462, 1995; el documento WO 97/03692; el documento WO 96/40072; el documento WO 96/07399; y la patente estadounidense n.° 5.654.010).

[0089] Las formulaciones de liberación sostenida pueden incluir aquellas desarrolladas usando polímero de ácido poliláctico-glucólico (PLGA). Los productos de degradación de PLGA, ácidos lácticos y glicólicos, se pueden eliminar rápidamente del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero se puede ajustar de meses a años dependiendo de su peso molecular y composición (véase, por ejemplo, Lewis, Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer, en M. Chasin y Dr. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: Nueva York, págs. 1-41, 1990).

[0090] El anticuerpo para su uso en la presente invención también puede modificarse de una manera para formar una molécula quimérica que comprende un anticuerpo específico de conformación fusionado a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos, tal como una secuencia Fc o una molécula terapéutica adicional (por ejemplo, un agente quimioterapéutico).

[0091] El anticuerpo específico de conformación de la presente invención puede empaquetarse solo o en combinación con otros compuestos terapéuticos como un kit. Los ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, kits que contienen, por ejemplo, una píldora, dos píldoras, un polvo (opcionalmente en combinación con una píldora o comprimido), un supositorio y un líquido en un vial o dos cremas tópicas. El kit puede incluir componentes opcionales que ayudan en la administración de la dosis unitaria a los pacientes, tales como viales para reconstituir formas de polvo, jeringas para inyección, sistemas de administración intravenosa personalizados o inhaladores. Además, el kit de dosis unitaria puede contener instrucciones para la preparación y administración de las composiciones. El kit puede fabricarse como una dosis unitaria de un solo uso para un sujeto, múltiples dosis para un sujeto particular (por ejemplo, a una dosis constante o en la que los compuestos individuales pueden variar en potencia a medida que avanza la terapia), o el kit puede contener múltiples dosis adecuadas para la administración a múltiples sujetos (por ejemplo, «empaque a granel»). Los componentes del kit pueden ensamblarse en cajas de cartón, envases blíster, botellas, tubos o viales.

Indicaciones

[0092] Los anticuerpos de la invención son útiles para el tratamiento de trastornos caracterizados por niveles patológicamente altos de la conformación cis o trans de, por ejemplo, p-Tau. Dicho tratamiento se puede utilizar en pacientes identificados con niveles patológicamente altos de la conformación cis o trans de, por ejemplo, p-Tau (por ejemplo, aquellos diagnosticados por los procedimientos descritos en esta invención) o en pacientes diagnosticados con una enfermedad conocida por estar asociada con dichos niveles patológicos. Dichos trastornos incluyen trastornos neurológicos, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer (EA), deterioro cognitivo leve (DCL), enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis múltiple (EM), distrofia muscular, degeneración corticobasal, demencia pugilística, síndrome de Down, demencias frontotemporales, distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Pick, enfermedad priónica, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, trastornos convulsivos (por ejemplo, epilepsia), demencia vascular, demencia relacionada con la edad, traumatismo craneal, accidente cerebrovascular, neurofibromatosis, enfermedad del cuerpo de Lewy, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), neuropatías periféricas y degeneración macular. Otros trastornos que pueden ser tratados por los anticuerpos de la invención incluyen: lesión cerebral traumática (LCT), encefalopatía traumática crónica (ETC), parálisis supranuclear progresiva, degeneración lobular frontotemporal, enfermedad de Lytico-Bodig, demencia predominantemente por enredos, meningioangiomatosis, panencefalitis esclerosante subaguda.

Diagnóstico

[0093] La presente invención presenta procedimientos y composiciones para tratar y controlar la progresión de un trastorno descrito en esta invención (por ejemplo, una tauopatía, LCT o accidente cerebrovascular). Los procedimientos y composiciones pueden incluir la detección y medición de, por ejemplo, sustratos Pin1 (o cualquier fragmento o derivado de los mismos, por ejemplo, pT231-tau) que contienen un motivo Ser/Thr-Pro fosforilado en una conformación cis o trans (por ejemplo, cis pT231-tau y/o trans pT231-tau). Los procedimientos pueden incluir la medición de los niveles absolutos del pT231-tau en una conformación cis o trans en comparación con una referencia normal. Por ejemplo, un nivel sérico de pT231-tau en la conformación cis o trans que es menor que 5 ng/ml, 4 ng/ml, 3 ng/ml, 2 ng/ml o menor que 1 ng/ml de suero se considera predictivo de un buen resultado en un paciente diagnosticado con un trastorno (por ejemplo, una tauopatía). Un nivel sérico del sustrato en la conformación cis o trans que es mayor que 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml o 50 ng/ml se considera diagnóstico de un mal resultado en un sujeto ya diagnosticado con un trastorno.

[0094] Para diagnósticos basados en niveles relativos de sustrato en una conformación particular (por ejemplo, un pT231-tau en la conformación cis o trans), un sujeto con un trastorno (por ejemplo, una taupatía) mostrará una alteración (por ejemplo, un aumento del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más) en la cantidad del sustrato en, por ejemplo, la conformación cis o una alteración en la relación entre la conformación cis y trans. Una muestra de referencia normal puede ser, por ejemplo, una muestra previa tomada del mismo sujeto antes del desarrollo del trastorno o de síntomas que sugieren el trastorno, una muestra de un sujeto que no tiene el trastorno, una muestra de un sujeto que no tiene síntomas del trastorno o una muestra de un polipéptido de referencia purificado en una conformación dada a una concentración normal conocida (es decir, no indicativa del trastorno).

[0095] La solicitud también describe el diagnóstico temprano o la predisposición de un sujeto a un deterioro cognitivo leve (DCL), tauopatía (por ejemplo, EA, ETC) o LCT. Los procedimientos y composiciones incluyen detección y medición de cis pT231-tau y la relación cis: trans pT231-tau. Un nivel elevado de cis pT231 o relación cis: trans indicaría que un sujeto está en riesgo de EA y dicha población de sujetos se beneficiaría de una inmunoterapia dirigida a cis pT231-tau descrita en esta invención. Los procedimientos de monitoreo de la invención también son útiles para evaluar la respuesta terapéutica de un paciente en ensayos clínicos potenciales. Una disminución de la relación cis: trans pT231-tau indicaría que la terapia es eficaz para dirigirse a DCL, una tauopatía (por ejemplo, EA, ETC) o LCT. Dicho diagnóstico temprano se puede realizar antes de que se hayan presentado síntomas del trastorno neurológico (por ejemplo, en pacientes que se sabe o se sospecha que tienen traumatismo cerebral (por ejemplo, traumatismo cerebral repetido)) o antecedentes familiares de enfermedades neurológicas.

[0096] Se pueden usar procedimientos estándar para medir los niveles del sustrato en cualquier fluido corporal, que incluyen, pero no se limitan a, orina, sangre, suero, plasma, saliva, líquido amniótico o líquido cefalorraquídeo (LCR). Dichos procedimientos incluyen inmunoensayo, ELISA, transferencia Western y técnicas de inmunoensayo enzimático cuantitativo.

[0097] Para fines de diagnóstico, los anticuerpos específicos de conformación pueden etiquetarse. El etiquetado del anticuerpo pretende abarcar el etiquetado directo del anticuerpo mediante el acoplamiento (por ejemplo, unión física) de una sustancia detectable al anticuerpo, así como también el etiquetado indirecto del anticuerpo mediante la reacción del anticuerpo con otro reactivo que está etiquetado directamente. Por ejemplo, el anticuerpo puede etiquetarse con un marcador radiactivo o fluorescente cuya presencia y ubicación en un sujeto pueden detectarse mediante técnicas de imagenología estándar.

[0098] Los procedimientos de diagnóstico descritos en esta invención se pueden usar individualmente o en combinación con cualquier otro procedimiento de diagnóstico descrito en esta invención para un diagnóstico más preciso de la presencia o gravedad de un trastorno (por ejemplo, una tauopatía). Los ejemplos de procedimientos adicionales para diagnosticar dichos trastornos incluyen, por ejemplo, determinar los niveles de otros biomarcadores (por ejemplo, t-tau, pT181-tau, Ap42 o ApoE4 en LCR), examinar el historial de salud de un sujeto, tinción inmunohistoquímica de tejidos, tomografías computarizadas (TC) o crecimientos de cultivos.

Kits de diagnóstico

[0099] La solicitud también describe un kit de prueba de diagnóstico. Por ejemplo, un kit de prueba de diagnóstico puede incluir polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos específicos de conformación que se unen específicamente a cis pT231-tau o trans pT231-tau, fragmentos de los mismos) y componentes para detectar y/o evaluar la unión entre el polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) y p-Tau. De manera alternativa, el kit puede incluir un polipéptido cis pT231-tau o trans pT231-tau o fragmento cis pT231-tau o trans pT231-tau para la detección de cis pT231-tau o trans pT231-tau presentes en el suero, sangre o LCR de una muestra en cuestión. En otro ejemplo, se pueden usar kits de diagnóstico para identificar una alteración en el nivel de polipéptido cis pT231-tau o trans pT231-tau con respecto a una referencia, tal como el nivel presente en un control normal. Dicho kit puede incluir una muestra de referencia o una curva estándar que indique una referencia positiva o una referencia de control normal.

[0100] Para la detección, ya sea el anticuerpo o el polipéptido cis pT231-tau o trans pT231 está etiquetado, y ya sea el anticuerpo o el polipéptido cis pT231-tau o trans pT231 está unido al sustrato, de modo que la interacción polipéptido-anticuerpo puede establecerse determinando la cantidad de etiqueta unida al sustrato después de la unión entre el anticuerpo y el polipéptido cis pT231-tau o trans pT231. Los inmunoensayos convencionales (por ejemplo, ELISA) se pueden utilizar para detectar interacciones anticuerpo-sustrato y se pueden proporcionar con el kit. Los polipéptidos de la invención se pueden detectar en una muestra biológica, tal como sangre, plasma, LCR o suero.

[0101] El kit de diagnóstico puede incluir instrucciones para el uso del kit. En un ejemplo, el kit contiene instrucciones para el uso del kit para el diagnóstico de una tauopatía (por ejemplo, EA, ETC), lCt y/o DCL, o un riesgo de desarrollarla. En otro ejemplo más, el kit contiene instrucciones para el uso del kit para controlar el tratamiento terapéutico, regímenes posológicos o sujetos en riesgo de desarrollar una tauopatía (por ejemplo, EA, ETC), LCT y/o DCL.

Monitoreo del sujeto

[0102] Según la invención, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención también se puede utilizar para controlar la progresión de un trastorno (por ejemplo, DCL, LCT, una tauopatía, por ejemplo, EA, ETC) durante la terapia o para determinar las dosificaciones de compuestos terapéuticos. En una realización, los niveles de, por ejemplo, polipéptidos (por ejemplo, pT231-tau) con motivos pSer/Thr-Pro en la conformación cis se miden repetidamente como un procedimiento para diagnosticar el trastorno y controlar el tratamiento o manejo del trastorno. Con el fin de controlar la progresión del trastorno en un sujeto, se pueden obtener muestras del sujeto en varios puntos de tiempo y a continuación se pueden comparar. Por ejemplo, los procedimientos de monitoreo se pueden usar para controlar sujetos durante el tratamiento. En este ejemplo, el nivel de pT231-tau en la conformación cis en un sujeto se monitorea estrechamente usando los anticuerpos específicos de conformación de la invención y, si el nivel de pT231-tau en la conformación cis comienza a disminuir durante la terapia, el régimen terapéutico para el tratamiento del trastorno puede modificarse según lo determinado por el médico (por ejemplo, la dosificación de la terapia puede cambiarse o se puede administrar un tratamiento diferente). Los procedimientos de monitoreo de la invención también se pueden usar, por ejemplo, para evaluar la eficacia de un fármaco o terapia particular en un sujeto, determinar dosificaciones o evaluar la progresión, el estado o la etapa de la infección.

Ejemplos

Ejemplo 1: generación de anticuerpos monoclonales de ratón cis y trans pT231-tau (mAb) y determinación de sus secuencias de ADN

[0103] Para desarrollar mAb de ratón cis y trans pT231-tau, se utilizópéptido cis pT231-Pip tau al 74 % como se describió anteriormente en Nakamura y col., Cell 149: 232-244, 2012para inmunizar ratones. El procedimiento produjo 480 clones de hibridoma que, a continuación, se caracterizaron. De los primeros 96 sobrenadantes de cultivo de hibridoma analizados por ELISA usando péptidos pT231-tau que eran cis+trans de tipo salvaje (pT231-Pro), bloqueados en cis (pT231-Dmp) o trans (pT231-Ala) o no fosforilados (T231-Pro), descritos en Nakamura y col., Cell 149: 232-244, 2012, se identificaron dos clones de hibridoma cis, #113 y #74 que reconocieron péptidos pT231-tau de tipo salvaje y cis, pero ni trans ni no fosforilados (figuras 3A, 3B), y se identificaron dos clones de hibridoma trans, #25 y #69, que reconocieron péptidos pT231-tau de tipo salvaje y trans, pero ni cis ni no fosforilados (figura 3C). Las secuencias de ácido nucleico y proteína que incluyen las ^c D^r de la cadena pesada y cadena ligera de mAb se muestran a continuación. Además, cis fue estable y el trans disminuyó según lo detectado por cis mAb-#113 y trans mAb-#25, respectivamente, en células tratadas con inhibidores de Pin1, Cpd1 y 1E menos activo, con Cpd1A inactivo como control (figura 3D). La figura 3E muestra la subclase IgG de los mAb según se determinó usando el kit ELISA de isotipado (Eagle). Las secuencias de ADN de las cadenas pesada y ligera de los mAb se determinaron utilizando técnicas de Rt -PCR de RACE 5', como se describe en Bradbury y col., Neurobiol Aging 16: 465-475, 1995. La búsqueda BLAST mostró que estos cuatro clones de mAb son completamente novedosos. Las secuencias de proteínas predichas se conservan altamente en las regiones de estructura con claras diferencias en la región determinante de complementariedad (CDR) 1-3 (figuras 8 y 9). En particular, los dos clones de mAb cis contenían algunos residuos conservados que no están presentes en los dos mAb trans y viceversa (figuras 8 y 9).

Cis mAb-#113

CDR de cadena pesada

CDR1: SYWIH (SEQ ID NO: 1)

CDR2: VIDPSDSYTRYNQKFKG (SEQ ID NO: 2)

CDR3: WEVDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 3)

SEQ ID NO: 22 (secuencia de proteína completa de cadena pesada)

MGVSLQLLGT QDLTMRWSCI ILFLVATATG VNSQVQLQQP GAELVKPGAS VKMSCKASGY TFTSYW1HWV KQRPGQGLEW IGVIDPSDSY TRYNQKFKGK ATLTVDTSSS TAYMQLSSLT SEDSAVYYCT TWEVDYWGQG TTLTVSSAKT TPPSVYPLAP GSL

SEQ ID NO: 29 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena pesada) ATGGGGGTCTCTCTACAGTTACTAGGCACACAGGATCTCACCATGAGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCT TGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCAACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCC TGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATACACTGGGTG AAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGGTACA

ATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACGTTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAG CAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAACATGGGAGGTTGACTACTGGGGCCAAGGC ACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCCCTGGCCCCTGGAAGCTTGG G

Cis mAb-#113

CDR de cadena ligera

CDR1: RSSQSLVHSDGNTYLH (SEQ ID NO: 4)

CDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 5)

CDR3: SQSTHVPWT (SEQ ID NO: 6)

SEQ ID NO: 23 (secuencia de proteína completa de cadena ligera)

MGTDQSPQAV SSGCLLKMKL PVRLLVLMFW IPASNSDWM TQTPLSLPVS LGDQASISCR SSQSLVHSDG NTYLHWYLQK PGQSPKLLIY KVSNRFSGVP DRFSGSGSGT DFTLKISRLE AEDLGVYFCS QSTHVPWTFG GGTKLEIKRA DAAPTVSIFP PSSKLG

SEQ ID NO: 30 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena ligera) ATGGGGACTGATCAGTCTCCTCAGGCTGTCTCCTCAGGTTGCCTCCTCAAAATGAAGTTGCCTGTTAGGC TGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAACAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCT GCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTCCACAGTGATGGA AACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCA ACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAG CAGACTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGT GGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTA AGCTTGGG

Cis mAb-#74

CDR de cadena pesada

CDR1: SGYYWN (SEQ ID NO: 7)

CDR2: YISYDGSNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 8)

CDR3: LRRDAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 9)

SEQ ID NO: 24 (secuencia de proteína completa de cadena pesada)

MKVLSLLYLL TAIPGILSDV QLQESGPGLV KPSQSLSLTC SVTGYSITSG YYWNWIRQFP GNKLEWMGYI SYDGSNNYNP SLKNRISITR DTSKNQFFLK LNSVTTEDTA TYYCAGLRRD AYWGQGTLVT VSAAKTTPPS VYPLAPGSL

SEQ ID NO: 31 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena pesada) ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGG AGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCAT CACCAGTGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATA AGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTA AGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCGGGGTT ACGACGTGATGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACACCCCCATCA GTCTATCCACTGGCCCCTGGAAGCTTGGG

Cis mAb-#74

CDR de cadena ligera

CDR1: RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 10)

CDR2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 11)

CDR3: QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 12)

SEQ ID NO: 25 (secuencia de proteína completa de cadena ligera)

MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPWTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSKLG

SEQ ID NO: 32 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena ligera) ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGA TGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCA GGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTAC ACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCA CCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGAC GTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCA TCCAGTAAGCTTGGGG

Anticuerpos de referencia:

[0104]

Trans mAb-#25

CDR de cadena pesada

CDR1: DTYMH (SEQ ID NO: 13)

CDR2: RIDPANGNTRYDPKFQG (SEW ID NO: 14)

CDR3: RVGYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 15)

SEQ ID NO: 26 (secuencia de proteína completa de cadena pesada)

MKCSWVIFFL MAWTGVTSE VQLQQSGAEL VKPGASVKLS CTASGFNIKD TYMHWVKQRP EQGLEWIGRI DPANGNTRYD PKFQGKATIT SDTSSNTAYL QLSSLTSEDT AVYYCARRVG YYFDYWGQGT TLTVSSAKTT PPSVYPLVPG SL

SEQ ID NO: 33 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena pesada) ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCACTTCAGAGGTTCAGCTGC AGCAGTCTGGGGCAGAACTTGTGAAACCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAA CATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATT GATCCTGCGAATGGTAATACTAGATATGACCCAAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACATCAGACACAT CCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAG GCGGGTGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACA CCCCCATCTGTCTATCCCCTGGTCCCTGGAAGCTTGGG

Trans mAb-#25

CDR de cadena ligera

CDR1: KSSQSVLYSSDLKNYLA (SEQ ID NO: 16)

CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 17)

CDR3: HQYLSSYT (SEQ ID NO: 18)

SEQ ID NO: 27 (secuencia de proteína completa de cadena ligera)

MESQTQVFLS LLLWVSGTCG NIMMTQSPSS LAVSAGEKVT MSCKSSQSVL YSSDLKNYLA WYQQKPGQSP TLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVQAEDLA VYYCHQYLSS YTFGGGTKLE IKRADAAPTV SIFPPSSK

SEQ ID NO: 34 (secuencia de ácido nucleico completo de cadena ligera) ATGGAATCACAGACTCAGGTCTTCCTCTCCCTGCTGCTCTGGGTATCTGGTACCTGTGGGAACATTATGA TGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCA AAGTGTTTTATACAGTTCAGATCTGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCT ACACTGCTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTG

GGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATA CCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTA TCCATCTTCCCACCATC CAGTAAGC

Trans mAb-#69

CDR de cadena ligera

CDR1 KSSQSLLYTGNQKNYLA (SEQ ID NO: 19)

CDR2 WASTRES (SEQ ID NO: 20)

CDR3 QQYYSYPWT (SEQ ID NO: 21)

SEQ ID NO: 28 (secuencia de proteína completa de cadena ligera)

MDSQAQVLML LLLWVSGTCG DIVMSQSPSS LAVSVGEKVT MSCKSSQSLL YTGNQKNYLA WYQQKPGQSP KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVKAEDLA VYYCQQYYSY PWTFGGGTKL EIKRADAAPT VSIFPPSSKL G

SEQ ID NO: 35: (secuencia de ácido nucleico completo de cadena ligera) _ ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGA TGTCACAATCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCA GAGCCTTTTATATACTGGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCT AAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATA TTATAGCTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACT GTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG

Ejemplo 2: el cis robusto, pero no trans pT231-tau apareció temprano en los axones en los cerebros DCL/EA y ETC, y se acumuló aún más a medida que avanzaban las enfermedades

[0105] Para examinar cuándo y dónde aparece cis pT231-tau en los cerebros EA y ETC, los inventores realizaron una doble inmunotinción de las secciones cerebrales con cis y mAb trans, seguido de anticuerpos secundarios isotipos. mAb trans tiñó solo en el soma de unas pocas neuronas, incluso en cerebros normales, mAb cis no tiñó cerebros normales, sino que detectó señales sólidas en neuritas rectas de neuronas DCL, que se acumularon y localizaron adicionalmente en neuritas distorsionadas de neuronas EA (figuras 4A-4C). En particular, este patrón es similar al detectado por los anticuerpos policlonales cis y trans descritos en Nakamura y col. (Cell, 149: 232-244, 2012), confirmando no solo la especificidad de los mAb cis y trans, sino también indicando que los mAb cis, pero no trans, se dirigen a la conformación patógena temprana en DCL y EA humanas. Las manchas cerebrales de 8 ETC relacionados con deportes y 8 relacionados con veteranos proporcionadas por el Dr. McKee (Liliang y col., J Surg Res 160: 302­ 307 (2010); Chen y col., Clin Cancer Res 73: 3951-3962, 2013) mostraron que el cis robusto, pero no trans, p-tau se detectó fácilmente en neuritas en la etapa II y se acumuló adicionalmente en la etapa III (figuras 4D-4I). Se confirmó que estas neuritas cis positivas eran axones mediante tinción conjunta con el neurofilamento marcador axonal o el marcador de dendritas MAP2. En particular, las neuronas muy raras tenían cis y trans p-tau, lo que respalda que se interconvierten fácilmente in vivo. Por lo tanto, cis aparece muy pronto en EA y E^{t c} .

Ejemplo 3: los mAb cis y trans entraron en las neuronas y alcanzaron diferentes compartimentos neuronales y los mAb cis redujeron los niveles de tau de una manera dependiente de pT232 in vitro y ex vivo

[0106] Para determinar si los mAb cis y trans podían entrar en las neuronas y alcanzar los compartimentos neuronales esperados, las neuronas SY5Y humanas se transfectaron con tau y p25/Cdk5 (tau cinasa) o controles vectoriales, seguido de la adición de mAb al medio de cultivo durante 48 horas antes de someterse a inmunotinción solo con anticuerpos secundarios o inmunotransferencia. Tanto cis como trans mAb se detectaron fácilmente no solo en neuronas, sino también en diferentes compartimentos neuronales.

El mAb cis se detectó principalmente en neuritas, mientras que el mAb trans se detectó principalmente en el soma (figuras 5A y 5B), como se esperaba en cerebros DCL y EA (figura 4). Curiosamente, los mAb cis redujeron significativamente los niveles totales de tau endógeno y exógeno solo después de la sobreexpresión de p25/Cdk5, sin efectos obvios sobre el mutante tau T231A (figura 5C). La adición de mAb cis a medios de cultivo de cortes de hipocampo de ratón Tau-Tg de tipo salvaje humano también redujo drásticamente los niveles de tau (figura 5D). Además, cuando las neuronas SY5Y se sometieron a agotamiento sérico, una afección de estrés similar a lesión cerebral traumática (LCT), se encontró que cis pT231-tau en neuronas SY5Y aumentó notablemente de manera dependiente del tiempo por agotamiento sérico, pero dicho aumento fue anulado efectivamente por cis, pero no por mAb trans (figura 5E). Por lo tanto, el mAb cis redujo los niveles de tau in vitro y ex vivo.

Ejemplo 4: cis pero no trans mAb suprimió potentemente la interrupción de los microtúbulos y la neurotoxicidad inducida por p-tau en las neuronas

[0107] Para examinar si el mAb cis podría afectar la capacidad de p-tau para inducir la interrupción de microtúbulos y neurotoxicidad, se transfectaron conjuntamente células SY5Y con p25/Cdk5, tau y GFP y se añadió cis o mAb trans durante 48-72 horas, seguido de inmunotinción para tubulinas y ADN (figura 6A). Además, los inventores co-transfectaron neuronas SY5Y con Cdk5-p25 y GFP-tau o su mutante T231A, a continuación añadieron cis o mAb trans, seguido de imágenes confocales de células vivas para morfología celular y neurotoxicidad (figuras 6B y 6C). Ambos ensayos mostraron claramente que los mAb cis, pero no trans, suprimieron potentemente la interrupción de microtúbulos (figura 6A) y la neurotoxicidad (figuras 6B y 6C) inducida por p-tau en neuronas; la mayoría de las células GFP-tau- positivas estaban muertas en células tratadas con control y mAb trans, con la red de microtúbulos (MT) colapsando alrededor del núcleo (figura 6A). La mayoría de las células GFP-tau positivas tratadas con mAb cis sobrevivieron bien, incluso con la red MT en la neurita (figura 6B, flecha en la figura 6C). Cuando se agregó al medio de cultivo, cis pero no mAb trans también suprimió eficazmente la interrupción de los microtúbulos y la neurotoxicidad en las neuronas SY5TY inducidas por el agotamiento del suero (figuras 6^d y 6E).

Ejemplo 5: cis pT231-tau está prominentemente presente en el líquido cefalorraquídeo extracelular (LCR) en pacientes con E^a

[0108] pT231-tau en LCR es un biomarcador de EA temprano. Para evaluar las conformaciones pT231-tau del LCR, el cis y pT231-tau trans se midieron en LCR usando kit ELISA hTau INNOTEST (Innogenetics) con cis o Ab trans como anticuerpo de detección. En los 8 LCR de control, no hubo cis pT231-tau detectables, pero se detectaron pequeñas cantidades del trans pT231-tau en 3 de 8 casos (figura 7A), lo que podría esperarse porque el trans no está asociado con enredos neurofibrilares (NFT, por sus siglas en inglés). Sorprendentemente, en pacientes con EA avanzada, el pT231-tau trans y especialmente cis aumentaron notablemente (figura 7A), consistente con lo que se observa en los tejidos cerebrales (figura 4). Además, aunque hubo una amplia variación inter-individual en los niveles de cis o trans, las relaciones cis: trans fueron muy similares entre los pacientes con EA (figura 7B).

Ejemplo 6: evaluación del potencial del mAb cis tau para detener la lesión cerebral y su propagación en el modelo de ratón LCT y el potencial de los niveles séricos de cis pT231-tau para identificar pacientes con LCT significativa

[0109] Los inventores han desarrollado química peptídica innovadora para crear los primeros anticuerpos cis y trans pT231-tau para visualizar los cambios conformacionales catalizados por Pin1 (figura 11). En particular, cis, pero no trans, pT231-tau aparece temprano en las neuronas DCL y se acumula adicionalmente en axones de solo neuronas degenerativas a medida que avanza la EA, correlacionándose bien con déficits cognitivos. Además, cis, pero no trans pT231-tau pierde su capacidad normal de ensamblaje de microtúbulos y gana función tóxica, siendo resistente a la desfosforilación y degradación y propenso a la agregación (figura 11). Por lo tanto, cis pT231-tau es un evento temprano y patógeno en DCL y EA. Ahora los inventores han desarrollado anticuerpos monoclonales neutralizantes cis y trans pT231-tau (mAb) que fueron altamente efectivos para eliminar sus respectivos isómeros p-tau en neuronas e incluso en cerebros de LCT de ratón.

[0110] Dados los prometedores resultados de eficacia de los inventores utilizando mAb cis tau para tratar ratones LCT graves individuales, los inventores evaluarán sistemáticamente el potencial del mAb cis tau y sus requisitos de dosificación para detener la lesión cerebral y su propagación en modelos de ratones de LCT leve repetida en diferentes grados siguiendo cis pT231-tau en el cerebro, L^c R y suero, y sus relaciones con cambios conductuales y patológicos en diversos momentos después del tratamiento con mAb cis.

[0111] Dado que los niveles séricos de tau parecen correlacionarse con la gravedad de LCT 38-41 y que los resultados preliminares de los inventores sugieren que cis p-tau, con trans como control, puede ser un mejor biomarcador que el tau total, los inventores mejorarán aún más su ELISA para evaluar cis y trans p-tau y tau total en 30-50 pacientes agudamente después de LCT grave y controles emparejados. Esto podría eventualmente proporcionar un procedimiento sensible para identificar a los pacientes con LCT para la terapia con mAb cis tau.

[0112] Los resultados esperados constituirían un biomarcador e inmunoterapia innovadores específicos de la conformación contra el cis pT231-tau muy temprano, secretado y tóxico en tauopatía, lo que aumentaría la oportunidad única de detener o prevenir la tauopatía y la pérdida de memoria en pacientes con LCT, ETC y EA en etapas tempranas.

Ejemplo 7: el mAb cis no solo eliminó eficazmente la inducción de cis pT231-tau, sino que también neutralizó su capacidad para inducir la interrupción del microtúbulo axonal, defectos de transporte mitocondrial y, finalmente, apoptosis bajo diversas tensiones neuronales

[0113] Los inventores encontraron que diversas tensiones neuronales tales como hipoxia o agotamiento nutricional indujeron de manera robusta, de manera dependiente del tiempo, cis pT231-tau, a continuación interrupción de la red MT y, finalmente, muerte celular por apoptosis, como se muestra en el kit de ensayo de células vivas (verdes)/muertas (rojas) (Abcam) y anexina 5 FACS (figura 12A-12E). Las imágenes de vídeo de células vivas de los inventores también confirmaron colapso de MT dependiente del tiempo y defectos en el transporte axonal de mitocondrias (datos no mostrados). Sorprendentemente, el tratamiento con mAb cis eliminó casi por completo la inducción de cis p-tau, y también rescató de manera eficiente la interrupción de MT axonal, los defectos de transporte mitocondrial y la apoptosis, mientras que el mAb trans eliminó trans p-tau y aceleró los fenotipos, sin agotamiento cruzado (figura 12). La capacidad de cis p-tau para inducir apoptosis es consistente con la evidencia previa de que las caspasas y la apoptosis están presentes en las neuronas Ea humanas (Gervais y col., Cell 97: 395-406, 1999). Del mismo modo, la capacidad de cis mAb para eliminar cis p-tau y reducir el tau total es consistente con su hallazgo de que cis p-tau es más estable que trans (Nakamura y col., Cell 149: 232-244, 2012), y que el complejo de anticuerpos puede ser reconocido por TRIM21 para la degradación de proteínas (Mallery y col., PnAs 107: 19985-1998590, 2010; McEwan y col., Bioessays 33: 803-809, 2011).

Ejemplo 8: cis, pero no trans mAb evitó eficazmente que cis pT231-tau secretado de neuronas estresadas indujera neurotoxicidad en neuronas receptoras

[0114] Dado que el pT231-tau abundante está presente en el LCR de los pacientes con EA y las neuronas cultivadas secretan tau en los medios a través de un mecanismo no convencional, los inventores examinaron si las neuronas secretaron cis y p-tau trans bajo estrés. De hecho, las neuronas estresadas secretaron cis, pero no trans pT231-tau en medios a las 40 horas antes de la muerte celular a las 72 horas, cuando se liberaron cis y trans p-tau, así como actina (figura 13A). Más importante aún, cuando se añaden a las neuronas sanas durante 3 días, los medios que contienen cis matan las neuronas por apoptosis. El pretratamiento del medio con mAb cis, pero no trans, seguido de mAb de agotamiento con proteína G, rescató completamente la muerte neuronal (figura 13B).

Ejemplo 9: cis, pero no trans mAb evitó eficazmente que los lisados cerebrales de EA o ETC humanos indujeran neurotoxicidad en las neuronas receptoras

[0115] Para examinar si los cerebros EA humanos también contenían cis pT231-tau tóxico, los inventores añadieron lisados cerebrales EA humanos a las neuronas cultivadas y detectaron cis pT231-tau en las neuronas receptoras, pero no cis-tau cuando se utilizaron lisados cerebrales de control. Más importante aún, los lisados cerebrales de EA, pero no normales, inducen apoptosis en las neuronas receptoras, que se rescató completamente mediante el pretratamiento de lisados cerebrales de EA con cis, pero no trans, mAb (figura 14). También se obtuvieron resultados similares con lisados cerebrales ETC humanos.

Ejemplo 10: cis pT231-tau aumentó con la gravedad de LCT y apareció en axones mucho antes de epítopos relacionados con enredos en cerebros de ratones LCT

[0116] Para examinar la relación entre cis p-tau y la gravedad del LCT, los inventores probaron cis p-tau en el cerebro 48 horas después del LCT utilizando un dispositivo de caída de peso a diferentes máximos para inducir una gravedad diferente de lesión cerebral cerrada en ratones, imitando LCT relacionado con el deporte. cis y tau total aumentaron robustamente con el aumento de la gravedad del LCT 48 horas después del LCT (figura 15A), lo que es consistente con sus hallazgos de que cis p-tau es resistente a la degradación. También se encontró cis p-tau robusto 48 horas después de la LCT inducida por la explosión, imitando la LCT relacionada con el ejército. Los estudios del curso del tiempo mostraron que después de LCT grave, cis, pero no trans p-tau fue inducido sorprendentemente 12 horas más tarde y continuó aumentando con el tiempo, manteniéndose al menos durante 2 semanas (figuras 15B y 15C). Las neuritas cis-positivas fueron de nuevo axones, no dentritas. En particular, los inventores no pudieron encontrar epítopos relacionados con enredos usando mAb que han utilizado, incluyendo AT8, AT180, TG3, AT100, MC1, Alz50 o PHF1 (figura 15D), que tardan mucho tiempo en aparecer, si es que lo hacen, después de LCT en ratones WT.

Ejemplo 11: el mAb cis no solo eliminó el cis pT231-tau, sino que también restauró la interrupción de MT axonal, defectos de transporte mitocondrial, apoptosis e incluso la función cerebral después de LCTgrave en ratones

[0117] Para examinar si el mAb cis entró y eliminó el cis pT231-tau y su toxicidad en los cerebros de ratones LCT, primero administraron mAb cis biotinado i.p. o i.v. a ratones B6 y detectaron mAb cis 3 días después. El mAb inyectado se detectó fácilmente en el cerebro (figura 16A). Seguidamente trataron ratones con 250 mg de cis mAb I.P. cada 4 días durante 3 veces después de LCT grave y se analizaron los cerebros 14 días después. Sorprendentemente, el mAb cis evitó eficazmente la inducción de cis pT231-tau inducida por LCT y redujo el tau total en cerebros de ratón (figura 16B). Además, el tratamiento con mAb cis, pero no IgG de control, restauró eficazmente la interrupción de MT axonal y la destrucción mitocondrial (figura 17A) e incluso la apoptosis, según se evaluó mediante escisión de PARP (figura 16C).

[0118] Para examinar si el mAb cis restauró la función cerebral después de una LCT grave, utilizaron el laberinto elevado plus, que se ha utilizado ampliamente para evaluar el comportamiento compulsivo relacionado con la ansiedad en ratones. 2 meses después de LCT grave, los ratones tratados con IgG mostraron una disminución en la actividad del brazo cerrado y un aumento en la actividad del brazo abierto, lo que refleja un comportamiento compulsivo relacionado con la ansiedad, indicativo de disfunción relacionada con la corteza frontal, pero los ratones tratados con mAb cis y los ratones vergonzosos no tuvieron diferencias significativas (figura 17B), lo que indica que el mAb cis es capaz de restaurar la función cerebral inducida por LCT. Por lo tanto, el mAb cis fue altamente efectivo en la eliminación del cis p-tau y su neurotoxicidad, y en la restauración de la función cerebral en modelos de LCT de neuronas y ratones, consistente con trabajos previos que indican que los mAb tau pueden entrar en neuronas del cerebro (Yanamandra y col., Neuron 80(2): 402-414, 2013; Krishnamurthy y col., Front Psychiatry 2: 59, 2011; Mohamed y col., J Neurosci Res 69: 110-116, 2002) y que el mAb puede desencadenar la degradación diana en las células (Mallery y col., PNAS 107: 19985-1998590, 2010; McEwan y col., Bioessays 33: 803-809, 2011).

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo aislado específico de conformación o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la conformación cis de la proteína fosforilada treonina-231-tau (pT231-tau) para su uso como medicamento, en el que:

(a) dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR-H) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y una región determinante de complementariedad de cadena ligera (CDR-L) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(b) dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR-H) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y una región determinante de complementariedad de cadena ligera (CDR-L) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12;

(c) dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una secuencia de proteína de cadena pesada de SEQ ID NO: 22 y una secuencia de proteína de cadena ligera de SEQ ID NO: 23, o

(d) dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una secuencia de proteína de cadena pesada de SEQ ID NO: 24 y una secuencia de proteína de cadena ligera de SEQ ID NO: 25.

2. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un anticuerpo de cadena simple o un fragmento de unión al antígeno.

3. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 1 o 2 para su uso en un procedimiento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, encefalopatía traumática crónica (ETC), lesión cerebral traumática (LCT) o accidente cerebrovascular en un sujeto.

4. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 3, en el que dicho sujeto está predispuesto o se encuentra en una etapa temprana de dicha enfermedad de Alzheimer.

5. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 4, comprendiendo el procedimiento además determinar los niveles de t-tau, pT181-tau, Ap42 o ApoE4 en LCR.

6. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 5, en el que dicho sujeto está predispuesto por un historial de traumatismo cerebral repetido.

7. Procedimiento para controlar una respuesta terapéutica en un sujeto tratado con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento determinar el nivel de cis pT231-tau o relación cis: trans pT231-tau en una muestra obtenida de dicho sujeto, en el que una disminución en el nivel de cis pT231-tau o relación cis: trans pT231-tau da como resultado una respuesta terapéutica eficaz a dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, y opcionalmente determinar los niveles de t-tau, pT181-tau, Ap42 o ApoE4 en LCR.

8. Procedimiento de la reivindicación 7, en el que dichos niveles de t-tau, pT181-tau, Ap42, o ApoE4 en LCR disminuyen.