ES2835899T3 - Cebador para PCR unido a secuencia complementaria de nucleótidos o secuencia complementaria de nucleótidos que incluye nucleótidos mal apareados y método para amplificar ácido nucleico mediante el uso del mismo - Google Patents

Cebador para PCR unido a secuencia complementaria de nucleótidos o secuencia complementaria de nucleótidos que incluye nucleótidos mal apareados y método para amplificar ácido nucleico mediante el uso del mismo Download PDF

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Abstract

Un cebador para amplificación génica que se representa por la siguiente Fórmula Estructural 1, el cebador comprende cadenas dobles complementarias de nucleótidos con una estructura de burbuja al incluir una secuencia de nucleótidos mal apareados unida por un enlazador de inosina al extremo 5' de un cebador para una secuencia correspondiente para amplificar una secuencia génica específica: **(Ver fórmula)** [Fórmula Estructural 1], en donde Xa es una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia génica específica a amplificar, X'a es complementaria a Xa con la excepción de la secuencia de nucleótidos mal apareados, y Ya es una secuencia de bases universales o no discriminatorias.

Description

DESCRIPCIÓN
Cebador para PCR unido a secuencia complementaria de nucleótidos o secuencia complementaria de nucleótidos que incluye nucleótidos mal apareados y método para amplificar ácido nucleico mediante el uso del mismo [Campo técnico]
La presente invención se refiere a un cebador para una reacción en cadena de la polimerasa de ácido nucleico (en adelante, denominado "PCR"), en la cual el cebador incluye una secuencia complementaria de nucleótidos o una secuencia complementaria de nucleótidos que incluye una secuencia de nucleótidos mal apareados ligada a la posición 5' de un cebador a través de un enlazador y un uso del mismo, y más específicamente a un cebador para PCR que se obtiene a través de inosina como enlazador, al unir una secuencia complementaria de nucleótidos o una secuencia complementaria de nucleótidos que incluye una secuencia de nucleótidos mal apareados con el extremo 5' de un cebador directo o inverso, un método de PCR que incluye una etapa de mezclar un molde de ácido nucleico en una composición de PCR que incluye el cebador y luego realizar la PCR en la mezcla, un cebador complementario (CP) y un uso del mismo.
[Antecedentes técnicos]
Se requieren ADN polimerasa, par de cebadores, dNTP, Mg + y otros tampones para los componentes de la PCR que son esenciales para la prueba de diagnóstico molecular o la prueba de diagnóstico de ácido nucleico. Se requiere la amplificación del gen diana de interés que tenga alta especificidad y precisión para usar ampliamente tal reacción.
El rendimiento robusto de la PCR requiere una PCR analítica altamente sensible, tal como la detección de moléculas de ADN de copia única (Wabuyele, MB y otros, Single Mol., 2001, 2: 13-21), infección de transmisión sanguínea (Elnifro, EM y otros, Clin. Microbiol. Rev., 2000, 13: 559-570), o similares.
Generalmente, con el fin de llevar a cabo la PCR, se obtiene la información sobre el gen diana a detectar y se realiza el diseño de cebador y sonda. En este momento, a menudo se produce una amplificación fuera del objetivo, aunque la secuencia del cebador y la longitud que se diseñan están diseñadas para hibridar bien solo con el ADN/a Rn molde a temperaturas de hibridación. Se considera que la razón de esto se debe a las condiciones de baja temperatura durante la preparación de la mezcla maestra de PCR y al aumento gradual del termociclador hasta la temperatura inicial de desnaturalización (Chou, Q y otros, Nucleic Acids Res., 1992, 20: 1717-1723). En tal condición, los cebadores están presentes en una concentración más alta que la diana y los cebadores reaccionan de forma no específica con sitios parcialmente complementarios, o los cebadores reaccionan entre sí. Estos complejos de cebadores no específicos reaccionan de manera competitiva a la reacción deseada del sitio diana, lo que deteriora la sensibilidad para servir como causa de un fondo elevado. En particular, los dímeros de cebadores pueden formar mezclas complejas con artefactos de cebadores durante la PCR.
Se usan ampliamente varios métodos para aumentar la especificidad de la PCR, y uno de ellos emplea una técnica de inicio en caliente. Esta técnica aumenta la temperatura para mantener la especificidad de la reacción de hibridación cebador/diana de manera que el ADN polimerasa interfiera con la extensión prematura al preparar la mezcla pre-PCR (Alexandre VL y otros, Lebedev AV y otros, Nucleic Acids Res., 2008, 36: e131.). Se usan otros métodos en los cuales los componentes de la reacción se separan físicamente para no provocar una reacción de PCR (Quin chou y otros, Nucleic Acids Res., 1992, 20: 1717-1723), se usan proteínas accesorias (Clark, DR y otros, Patente de Estados Unidos núm. 2006057617), se usa un anticuerpo contra un ADN polimerasa, y se forma un complejo de Mg++ - pirofosfato para prevenir una reacción inespecífica a baja temperatura (Bioneer).
Además de aumentar la especificidad mediante el control de los componentes de la reacción, se han informado varios métodos para modificar el cebador para aumentar la especificidad. Entre ellos, hay un método de uso para incluir la secuencia competidora, un método de uso de una estructura secundaria de un cebador, un método para aumentar la selectividad de hibridación y un método con oligo cebadores dobles que usa dos tipos de cebadores que se unen entre sí (por ejemplo, Seegene). Además, como método de modificación 3', se ha informado de un método para bloquear la extensión del cebador hasta que se haya eliminado la exonucleasa 3'-> 5', un método para bloquearlo mediante la eliminación mediante irradiación UV y un método de desprotección térmica.
Estos métodos tienen el efecto de reducir la reacción inespecífica, pero tienen las desventajas de usar enzimas adicionales, agregar condiciones de activación adicionales, modificación específica de nucleósidos, dificultad en la cobertura de variantes del gen diana correspondiente debido a un diseño de cebador estructuralmente complejo y a una disminución de la sensibilidad.
[Documento de patente anterior]
Publicación de patente coreana núm. 10-2004-0005426
El documento US2011269192 se refiere al diseño y aplicación de la amplificación de ácido nucleico de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), más particularmente, a la aplicación de PCR en tiempo real y a la aplicación para la detección de mutaciones y mutaciones raras.
Takei y otros, (2014, 24(1):394-6) describe un sistema de detección de virus de un solo paso que usa la molécula fluorescente con un cebador de horquilla en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con transcripción inversa (RT). Los cebadores que son específicos del virus de la hepatitis C (HCV) que tienen una etiqueta en horquilla en el extremo 5' se usaron para RT y PCR.
Hazbón & Aland (2004, 42(3): 1236-42) describe un método simple, rápido y altamente sensible para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (n) en Mycobacterium tuberculosis y otros organismos. Los ensayos SNP de mutación refractaria de amplificación (ARMS) se modificaron al convertir los cebadores lineales de detección de SNP en el ensayo ARMS en cebadores en forma de horquilla (HP) mediante la adición de una cola 5 'complementaria al extremo 3' del cebador lineal.
[Descripción]
[Problema técnico]
La presente invención se ha realizado para superar los problemas mencionados anteriormente y en vista de la necesidad mencionada anteriormente, y un objeto de la presente invención es proporcionar un cebador que reduzca la sensibilidad aumentada y la reacción no específica debido a un aumento de los productos de amplificación en PCR.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para reducir la sensibilidad aumentada y la reacción no específica debido a un aumento de los productos de amplificación en la PCR.
[Solución técnica]
Para lograr los objetivos, la presente invención proporciona un cebador para la amplificación de genes como la siguiente Fórmula Estructural 1, en la cual el cebador incluye cadenas dobles complementarias de nucleótidos con una estructura de burbuja al incluir una secuencia de nucleótidos mal apareados unida por un enlazador de inosina, al extremo 5' de un cebador para una secuencia correspondiente para amplificar una secuencia génica específica:
Figure imgf000003_0001
[Fórmula Estructural 1]
en donde Xa es una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia génica específica a amplificar, X'a es complementaria a Xa con la excepción de la secuencia de nucleótidos mal apareada, e Ya es una secuencia de bases universales o no discriminatorias.
El cebador puede ser un cebador en el cual la estructura de burbuja de la secuencia de nucleótidos mal apareada está unida con al menos una secuencia de doble cadena, y el cebador, con mayor preferencia, puede ser un cebador en el cual la estructura de burbuja de la secuencia de nucleótidos mal apareada está enlazada con una a cuatro secuencias bicatenarias, pero no se limita a ellas.
El cebador tiene preferentemente una estructura en la cual al menos una burbuja está incluida en la doble cadena de X'a y Xa del cebador, y con mayor preferencia tiene una estructura en la cual se incluyen de una a tres burbujas en la doble cadena de X'a y Xa del cebador, pero no se limita a ellos.
En otra modalidad de la presente invención, el cebador es preferentemente un cebador en el cual el número de nucleótidos mal apareados en la secuencia de nucleótidos complementaria (X'a) incluye de 3 a 12 secuencias de nucleótidos, pero no se limita a ellas.
El cebador puede ser preferentemente un cebador que tiene una estructura de burbujas que incluye al menos 0 base universal o base no discriminatoria en Ya, y el cebador es preferentemente un cebador que tiene una estructura de burbujas que incluye de 0 a 9 bases universales o bases no discriminatorias en Ya, pero no se limita a ello.
En una modalidad de la presente invención, el cebador es preferentemente, pero no se limita a, uno o más cebadores seleccionados del grupo que consiste en los cebadores como se establece en SEQ ID NOS: 4 a 15, SEQ ID NOS: 18 y 19, y SEQ ID NOS: 22 a 29.
En otra modalidad de la presente invención, el cebador se usa en cada una de las posiciones directa e inversa para la amplificación de genes o se usa en ambas.
La presente invención proporciona, además, un método para amplificar una secuencia génica específica a partir de ARN, en la cual el ADNc se sintetiza con una polimerasa de transcripción inversa para la transcripción inversa mediante el uso del cebador de la presente invención, y el gen específico se amplifica con el ADNc como molde mediante el uso del cebador de la presente invención.
En una modalidad de la presente invención, el método es tal que la reacción de amplificación génica específica después de realizar la transcripción inversa de un molde de ARN mediante el uso del cebador de la presente invención se lleva a cabo preferentemente en un proceso de una sola etapa.
Además, la presente invención proporciona una composición para amplificar un gen, que se usa en un método de reacción en cadena de la polimerasa, un método de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o un método de amplificación isotérmica para la amplificación génica de ADN y ARN, que incluye el cebador de la presente invención como ingrediente activo.
En una modalidad de la presente invención, la composición incluye preferentemente, además, una o más polimerasas seleccionadas del grupo que consiste en polimerasa Taq que tiene actividad exonucleasa 5'^3', polimerasa Taq de inicio en caliente, polimerasa PFU y polimerasa Klenow que tiene actividad exonucleasa (-) 5 '^3 ' y exonucleasa (-) 3 '^5 ', pero no se limita a las mismas.
Además, la presente invención proporciona un kit para amplificar un gen específico para ADN y ARN de una enfermedad infecciosa, una enfermedad hereditaria, tolerancia a fármacos, resistencia a fármacos y una muestra susceptible de prueba, que incluye el cebador de la presente invención como ingrediente activo.
El cebador de acuerdo con la presente invención puede incluir, además, una secuencia de bases en la cual se eliminan, sustituyen o añaden una o más bases a la secuencia de bases de cada cebador y un conjunto de cebadores.
El cebador y el conjunto de cebadores de acuerdo con la presente invención pueden incluir modificaciones tales como metilación, protección, sustitución de uno o más homólogos de un nucleótido y modificación de un nucleótido con un enlace no cargado tal como fosfonato, fosfotriéster, fosforamidato o carbamato, o enlace cargado tal como fosforotioato o fosforoditioato. Además, el ácido nucleico puede tener uno o más residuos, que además están unidos covalentemente, tal como una proteína como una nucleasa, una toxina, un anticuerpo, un péptido señal, una poli-L-lisina, un agente intercalante como acridina y psoraleno, un agente quelante tal como un metal, un metal radiactivo y un metal oxidante de hierro, y agente de alquilación.
Además, la secuencia de bases del cebador y el conjunto de cebadores de acuerdo con la presente invención puede modificarse mediante el uso de un marcador capaz de proporcionar una señal detectable directa o indirectamente. El cebador y el conjunto de cebadores pueden incluir un marcador que puede detectarse mediante el uso de medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Los marcadores útiles incluyen 32P, colorantes fluorescentes, reactivos electrondensos, enzimas (que se usan comúnmente en ELISA), biotina o hapteno y proteínas que están disponibles para antisueros o anticuerpos monoclonales.
El cebador y el conjunto de cebadores de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse químicamente mediante el uso de cualquier otro método bien conocido que incluya un método de fosfotriéster tal como clonación y digestión con enzimas de restricción de secuencias apropiadas y Narang (1979, Meth, Enzymol. 68: 90-99), un método de dietilfosforamidato tal como Beaucage (1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), y los métodos de síntesis química directa tales como los métodos de soporte sólido de la patente de EE.UU. núm. 4,458,066.
A continuación, se describirá la presente invención.
La presente invención tiene como objetivo reducir la sensibilidad aumentada y la reacción que se produce de forma inespecífica debido a un aumento de los productos de amplificación en la PCR por una secuencia complementaria de nucleótidos o una secuencia complementaria de nucleótidos que incluye una secuencia de nucleótidos mal apareada unida al extremo 5' del cebador para PCR a través de un enlazador.
La presente invención se refiere a un cebador de PCR que incluye una secuencia complementaria de nucleótidos o una secuencia complementaria de nucleótidos que incluye una secuencia de nucleótidos mal apareada unida al extremo 5' del cebador a través de un enlazador, y más específicamente a un cebador para PCR que se obtiene mediante inosina como un enlazador, que une una secuencia complementaria de nucleótidos o una secuencia complementaria de nucleótidos que incluye una secuencia de nucleótidos mal apareada con el extremo 5' de un cebador directo o inverso, un método de PCR que incluye una etapa de mezclar un molde de ácido nucleico en una composición de PCR que incluye el cebador y luego realizar PCR en la mezcla. El cebador de PCR de la presente invención incluye una secuencia complementaria de nucleótidos o una secuencia complementaria de nucleótidos que incluye una secuencia de nucleótidos mal apareada, de modo que existe la ventaja de que puede reducirse la reacción inespecífica que se produce en la reacción de amplificación.
A continuación, se describirá la presente invención.
La presente invención proporciona un cebador de PCR en el cual una secuencia complementaria de nucleótidos o una secuencia complementaria de nucleótidos que incluye una secuencia de nucleótidos mal apareada se une al extremo 5' de un cebador directo o inverso a través de un enlazador de inosina.
En la presente especificación, el término "nucleótido complementario" se refiere a un nucleótido que tiene una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos del cebador directo o inverso, y la dirección del nucleótido correspondiente está ubicada en el extremo 5 'del cebador directo o inverso. Una "secuencia de nucleótidos mal apareada" incluida en un nucleótido complementario se refiere a una secuencia de nucleótidos que está mal apareada con una secuencia de nucleótidos de cebador directo o inverso. La base del ADN puede ser una adenina, guanina, citosina, timina y uridina. Cuando el número de nucleótidos mal apareados en el cebador complementario está ausente, el valor de Tm para la hibridación del cebador se vuelve alto, de modo que la hibridación de la secuencia de bases de ADN molde no se realiza bien y, así, no se realiza la reacción de amplificación. Además, si el número de nucleótidos mal apareados en el cebador complementario supera los 13, el valor de Tm del cebador se reducirá significativamente y el número de nucleótidos mal apareados aumentará, lo que dará como resultado una reacción no específica durante la ejecución de la PCR. Por lo tanto, el cebador (CP) de la presente invención genera burbujas de acuerdo con el número de nucleótidos mal apareados, y la Tm de fusión disminuye a medida que aumenta el número de nucleótidos mal apareados. Por consiguiente, se forman de una a tres burbujas en la porción de nucleótidos mal apareados, la porción de burbuja, dentro de la secuencia complementaria.
Se usa un enlazador entre un cebador y el cebador complementario. La base que se usa es inosina, y el número de la base de inosina está preferentemente en el intervalo de 1 a 9, aunque no está particularmente limitado. Además, la presente invención proporciona una composición para amplificación por PCR que incluye un ADN polimerasa, dNTP, una solución tampón para la reacción y el cebador de PCR.
Como solución tampón de reacción, puede modificarse y usarse adecuadamente una solución tampón de PCR convencional que incluya componentes tales como Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4 y MgCl2. Los dNTP se refieren a dATP, dTTP, dUTP, dGTP y dCTP, y el ADN polimerasa que puede usarse no se limita a una enzima específica o un efecto de inicio en caliente. En una modalidad preferida de la presente invención, el ADN polimerasa Taq (5'-> 3' exo ), ADN polimerasa Taq de inicio en caliente (5'-> 3' exo ), ADN polimerasa Vent (5'-> 3' exo -) y el ADN polimerasa Pfu (3'-> 5' exo ) se usan para realizar la PCR. Además, el cebador para la amplificación por PCR puede usar se a una concentración que varía de 0,2 pM a 1 pM, y los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las concentraciones adecuadas de cebador.
La presente invención se refiere a un método de amplificación por PCR que incluye mezclar el ácido nucleico molde con una composición de PCR que incluye un cebador y luego realizar una PCR en la mezcla, en la cual el cebador se usa como cebador de PCR que incluye una secuencia complementaria de nucleótidos o una secuencia complementaria de nucleótidos enlazada una secuencia de nucleótidos mal apareados en una secuencia complementaria de nucleótidos unida mediante un enlazador a la región extremo 5 'de un cebador que se va a amplificar.
La PCR se lleva a cabo mediante repetición de las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión, y este principio de PCR es claro para las partes. La desnaturalización, la hibridación y el alargamiento, respectivamente, se realizan preferentemente de 85 °C a 95 °C durante 1 segundo a 60 segundos, de 40 °C a 70 °C durante 1 segundo a 60 segundos y de 50 °C a 75 °C durante 1 segundo a 60 segundos, pero puede ajustarse apropiadamente según las condiciones de reacción. Por ejemplo, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, cuando se sustituyen de 2 a 3 nucleótidos mal apareados en el cebador, la temperatura de fusión (en adelante, denominada "Tm") se reduce en aproximadamente 5 °C a 10 °C, cuando se sustituyen de 4 a 6 nucleótidos mal apareados en el cebador, la temperatura de fusión (en adelante, denominada "Tm") se reduce en aproximadamente 10 °C a 20 °C, y cuando se sustituyen de 7 a 12 nucleótidos mal apareados en el cebador, la temperatura de fusión (en lo sucesivo, denominada "Tm") se reduce en aproximadamente 20 °C a 30 °C. Tal cambio de temperatura de Tm puede cambiarse algo en dependencia del tipo de ADN polimerasa que se usa, la longitud del cebador, el tipo de base en el cebador, las condiciones de reacción y similares. Basado en el grado de cambio en Tm como se describió anteriormente, es posible establecer una condición de producción de cebador para impartir equivalencia de temperatura cuando se diseña un cebador que incluye una secuencia de nucleótidos mal apareados en una secuencia de nucleótidos complementaria, e introducir un número apropiado de nucleótidos mal apareados, lo que aumenta la especificidad de la PCR.
Mediante el uso de los resultados de las siguientes modalidades, es posible establecer una condición de producción del cebador que dé equivalencia de temperatura en el momento de diseñar un cebador para una posición del cebador y preparar una secuencia de nucleótidos con una diferencia mínima en los valores de Tm que se producirá al introducir un enlazador y una secuencia de nucleótidos mal apareados en una posición adecuada en una secuencia complementaria de nucleótidos, y aumentar así la especificidad de la reacción de PCR. Además, la especificidad y sensibilidad de la PCR pueden mantenerse con o sin la función exonucleasa (5'-> 3, 3' -> 5') del ADN polimerasa que se usa.
[Efectos ventajosos]
Como se describió anteriormente, al incluir la secuencia de nucleótidos mal apareados o la secuencia complementaria de nucleótidos a través de un enlazador de inosina unido a la posición 5 'de un cebador, los productos de amplificación aumentan en la reacción de amplificación de ácido nucleico mediante el uso de ADN o ARN como molde, de modo que es eficaz para mejorar la sensibilidad y reducir la reacción inespecífica que se produce. Todos estos efectos están activos independientemente del tipo de ADN polimerasa.
[Descripción de los dibujos]
La Figura 1 es una ilustración secuencial de un método para amplificar ADN bicatenario mediante el uso de un cebador (CP) de la presente invención.
La Figura 2 es una ilustración secuencial de un método para amplificar ARN monocatenario mediante el uso de un cebador (CP) de la presente invención.
La Figura 3 ilustra un resultado de acuerdo con el número de desoxiinosina incluida en una porción de burbuja 1 ubicada en el extremo 5' de una región diana de un cebador (CP) de la presente invención en un método de uso del cebador (CP) de la presente invención como uno de los dos cebadores necesarios para la amplificación de ácidos nucleicos.
Las Figura 4 y 5 ilustran un resultado de acuerdo con el número de nucleótidos mal apareados (0, 3, 7 y 12) en una porción de burbuja 2 ubicados en una porción complementaria de un cebador (CP) de la presente invención. Las Figura 4 y 5 ilustran los resultados de acuerdo con un método de uso del cebador (CP) de la presente invención como uno de los dos cebadores necesarios para la amplificación de ácidos nucleicos.
La Figura 6 ilustra un resultado mediante el uso de un cebador (CP) de la presente invención en el cual el número total de burbujas es 2, 3 y 4, respectivamente, al incluir una porción de burbuja 1 y una porción de burbuja 2 de un cebador (CP) de la presente invención en un método de uso del cebador (CP) de la presente invención como uno de los dos cebadores necesarios para la amplificación de ácidos nucleicos.
Las Figura 7 a 10 ilustran un método de uso del cebador (CP) de la presente invención como uno de los dos cebadores necesarios para la amplificación de ácidos nucleicos. La Figura 7 ilustra un resultado del uso del ADN Taq polimerasa, la Figura 8 ilustra un resultado del uso del ADN polimerasa Taq de inicio en caliente, la Figura 9 ilustra un resultado del uso del ADN polimerasa Pfu, y la Figura 10 ilustra un resultado del uso del ADN polimerasa Vent.
La Figura 11 ilustra un resultado de una reacción, como un cebador directo y un cebador inverso, mediante el uso de cada uno de los dos cebadores necesarios para la amplificación del ácido nucleico de un gen de beta-actina en ADNg humano como cebador (CP) de la presente invención y un resultado de una reacción de amplificación mediante el uso de los dos cebadores necesarios para la amplificación de ácido nucleico de un gen de beta-actina en ADNg humano como cebador (CP) de la presente invención. La Figura 12 ilustra un resultado de una reacción de amplificación mediante el uso del cebador (CP) de la presente invención como dos cebadores necesarios para la amplificación del ácido nucleico del gen GAPD en ADNg de rata.
Las Figuras 13 a 15 ilustran los resultados de RT-PCR en dependencia de la temperatura de síntesis de ADNc de acuerdo con el número de nucleótidos mal apareados en una porción de burbuja 2 ubicada en una región complementaria de un cebador (CP) de la presente invención.
[Modos de la invención]
A continuación, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Ejemplo 1: Análisis de los efectos del enlazador de la porción de burbuja 1 del cebador (CP) de la presente invención
Se preparó un molde de ADN para la amplificación tat de HIV en el cual se preparó ADN de plásmido tat de HIV mediante una síntesis génica del HIV-1 10Br_PE064 aislado (GI: 672918720, 5281-5700 bp) a Ad N de plásmido. En el cebador (CP) de la presente invención, el cebador directo y el cebador inverso para el gen tat de1HIV del método convencional (Nucleic Acids Research, 36:20, 2008) se diseñaron como regiones diana, la secuencia complementaria a los mismos se colocó en el extremo 5' del mismo, y la secuencia complementaria incluía de 7 a 8 secuencias mal apareadas. El enlazador de inosina se diseñó como SEQ ID NOS: 3 a 10 en la porción de burbuja 1 entre la región diana y la secuencia complementaria. SEQ ID NO: 3 era un cebador que no incluía enlazador en la porción de burbuja 1 (fuera del alcance de la invención) y SEQ ID NOS: 4 a 10, respectivamente, se diseñaron para incluir 1 (Ix1a, Ix1b, Ix1c), 3 (Ix3), 5 (Ix5), 7 (Ix7) y 9 (Ix9) enlazadores de inosina.
En el grupo de control se usó una mezcla en la cual SEQ ID NO 1 se usó como cebador directo y SEQ ID NO 2 se usó como cebador inverso en el cebador preparado. El grupo experimental se preparó en una mezcla en la cual se usaron los cebadores (CP) de la presente invención de SEQ ID NOS: 3 a 10 como cebador directo y SEQ ID NO 2 se usó como cebador inverso.
La mezcla para la reacción de amplificación de ácido nucleico mediante el uso de los cebadores se preparó en una mezcla de reacción que incluía MgCh 3,0 mM, dNTP (NEB) 0,2 mM, ADN polimerasa Taq 1,75 U, ADN genómico humano 10 ng y conjunto de cebadores 0,5 pM. La reacción de amplificación de ácido nucleico se realizó al agregar 45 ul de la mezcla de reacción y 5 ul del ADN molde en 69, 6,9 y 0,69 fg/ul, respectivamente, y la etapa inicial de desnaturalización a 94 °C durante 10 minutos, la etapa de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, la etapa de hibridación a 55 °C durante 30 segundos, y la etapa de extensión a 72 °C durante 2 minutos se llevaron a cabo durante 40 ciclos y la etapa de extensión final se llevó a cabo a 72 °C durante 7 minutos. Se sometieron 5 ul del producto de amplificación a análisis de electroforesis en gel de agarosa al 2 % que incluía colorante verde de gel. Como resultado, como se ilustra en la Figura 3, se mostró que los productos de amplificación de los cebadores (CP) de la presente invención (carriles 3 de Ix9, Ix7, Ix5, Ix3, Ix1a, lx1 b, Ix1c e Ix0) aumentaron en comparación con el cebador convencional (carril 3 de Con) en los carriles 3 en los cuales los moldes reaccionaron en una concentración de 345 fg. Se demostró que los productos de amplificación de los cebadores (CP) de la presente invención (carriles 2 de Ix7, Ix5, Ix3, Ixla, Ix1b, lxlc e Ix0) aumentaron en comparación con el cebador convencional (carril 2 de Con) en los carriles 2 en los cuales la concentración del molde fue de 34 fg. Como resultado de la reacción anterior, se confirmó que Ix1, Ix3, Ix5 e Ix7 del cebador (CP) de la presente invención mostraban un aumento en el producto de amplificación en comparación con Ix0. Por consiguiente, se confirmó que el producto de amplificación de la reacción de amplificación del ácido nucleico aumentaba a medida que se incluía la inosina en la porción de burbuja 1 del cebador (CP) de la presente invención.
Ejemplo 2: Análisis de efectos de acuerdo con el número de secuencias mal apareadas en una porción de burbuja 2 del cebador (CP) de la presente invención
Se utilizó ADN plasmídico tat de HIV como molde. El cebador (CP) de la presente invención incluyó una inosina en la porción de burbuja 1, y luego se incluyeron 0, 3, 8 y 12 números de secuencias mal apareadas en la porción de burbuja 2, y así se prepararon las SEQ ID NOS: 11, 12, 4 y 13.
En el grupo control se usó una mezcla en la cual SEQ ID NO: 1 se usó como cebador directo y SEQ ID NO: 2 se usó como cebador inverso en el cebador que se preparó. El grupo experimental se preparó en una mezcla en la cual los cebadores (CP) de la presente invención de SEQ ID NOS: 11, 12, 4 y 13 se usaron como cebador directo y SEQ ID NO: 2 como cebador inverso.
La mezcla para la reacción de amplificación de ácido nucleico mediante el uso de los cebadores se preparó en una mezcla de reacción que incluía MgCh 3,0 mM, dNTP 0,2 mM, ADN polimerasa Taq 1,75 U, ADN genómico humano 10 ng y conjunto de cebadores 0,5 pM. La reacción de amplificación de ácido nucleico se realizó en la que se añadieron 45 ul de la mezcla y 5 ul del ADN molde en 69, 6,9 y 0,69 fg/ul, respectivamente, y la etapa inicial de desnaturalización a 94 °C durante 10 minutos, la etapa de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, la etapa de hibridación a 55 °C durante 30 segundos y la etapa de extensión a 72 °C durante 2 minutos se llevaron a cabo durante 40 ciclos y la etapa de extensión final se llevó a cabo a 72 °C durante 7 minutos. Se sometieron 5 ul del producto de amplificación a análisis de electroforesis en gel de agarosa al 2 % que incluía colorante verde de gel. M0 que se ilustra en la Figura 4 fue el resultado de usar SEQ ID NO: 11 sin la secuencia mal apareada como cebador directo y no se generó producto de amplificación. M3 era la SEQ ID NO: 12 que incluía 3 secuencias mal apareadas, y el producto de amplificación del carril 3 de M3 aumentó en relación con el del carril 3 del Con, en los carriles 3 donde 345 fg de ADN molde reaccionaron en el cebador convencional (SEQ ID NO: 1). Sin embargo, en los carriles 2 en los cuales reaccionaron 34,5 fg, no se detectó el producto de amplificación en el carril 2 de M3. M8 que se ilustra en la Figura 5 era la SEQ ID NO: 4 que incluye 8 secuencias mal apareadas, y M12 era la SEQ ID NO: 13 que incluye 12 secuencias mal apareadas. Se confirmó que sus productos de amplificación se detectaron en los carriles 1 en los cuales el ADN molde reaccionó más en 3, 45 fg respecto al cebador convencional (SEQ ID NO: 1). En particular, se confirmó que el producto de amplificación en M8 fue el más aumentado. Como resultado, se confirmó que el aumento y la mejora de la sensibilidad del producto de amplificación dependían del número de secuencias mal apareadas en la porción de burbuja 2 del cebador (CP) de la presente invención.
Ejemplo 3: Análisis de efectos de acuerdo con el número de burbujas del cebador (CP) de la presente invención El cebador (CP) de la presente invención incluye inosina en una porción de burbuja 1 y una secuencia mal apareada en una porción de burbuja 2. La porción de burbuja 1 formó una burbuja y la porción de burbuja 2 formó tres burbujas.
La SEQ ID NO: 13 produjo un total de dos burbujas, una en la porción de burbuja 1 y otra en la porción de burbuja 2. La SEQ ID NO: 14 produjo una burbuja en la porción de burbuja 1 y dos burbujas en la porción de burbuja 2. La SEQ ID NO: 15 produjo una burbuja en la porción de burbuja 1 y tres burbujas en la porción de burbuja 2. Mediante el uso del cebador (CP) de la presente invención como cebador directo y mediante el uso de SEQ ID NO: 2 como cebador inverso, la mezcla para la reacción de amplificación de ácidos nucleicos se preparó en una mezcla de reacción que incluía MgCl2 3,0 mM, dNTP 0,2 mM, ADN polimerasa Taq 1,75 U, ADN genómico humano 10 ng y conjunto de cebadores 0,5 pM.
La reacción de amplificación de ácido nucleico se realizó al agregar 45 ul de la mezcla de reacción y 5 ul del ADN molde en 69, 6,9 y 0,69 fg/ul, respectivamente, y la etapa inicial de desnaturalización a 94 °C durante 10 minutos, la etapa de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, la etapa de hibridación a 45 °C durante 30 segundos, y la etapa de extensión a 72 °C durante 2 minutos se llevaron a cabo durante 40 ciclos y la etapa de extensión final se llevó a cabo a 72 °C durante 7 minutos. Se sometieron 5 ul del producto de amplificación a análisis de electroforesis en gel de agarosa al 2 % que incluía colorante verde de gel.
Como resultado del uso del cebador (CP) de la presente invención en el cual el número de burbujas es 2 en cada carril de A, el número de burbujas es 3 en cada carril de B y el número de burbujas es 4 en cada carril de C como se ilustra en la Figura 6, la reacción de amplificación se detectó en los carriles 2 en los cuales el ADN molde fue de hasta 34,5 fg, en los cuales el número de burbujas fue de 2 a 4, y se confirmó que el producto de amplificación aumentaba en relación con el carril 3 de Con en los carriles 3 mediante el uso de 345 fg.
Ejemplo 4: Análisis de la reacción de amplificación del cebador (CP) de la presente invención por tipo de ADN polimerasa
Con el fin de confirmar la reacción de amplificación del cebador (CP) de la presente invención de acuerdo con el ADN polimerasa usada en la reacción de amplificación del ácido nucleico, se usó el cebador (CP) de la presente invención de SEQ ID NO: 4 como un cebador directo, y SEQ ID NO: 2 se usó como cebador inverso. La reacción de amplificación se analizó mediante ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa Taq de inicio en caliente, ADN polimerasa Vent y ADN polimerasa Pfu.
En la reacción de amplificación de ácido nucleico como se ilustra en la Figura 7, la mezcla para la reacción de amplificación de ácidos nucleicos del ADN polimerasa Taq se preparó en una mezcla de reacción que incluía MgCh 3.0 mM, dNTP 0,2 mM, ADN polimerasa Taq 1,75 U, ADN genómico humano 10 ng y conjunto de cebadores 0,5 pM. En la reacción de amplificación de ácido nucleico como se ilustra en la Figura 8, la mezcla para la reacción de amplificación de ácidos nucleicos del ADN polimerasa Taq de inicio en caliente se preparó en una mezcla de reacción que incluía MgCl2 3,0 mM, dNTP 0,2 mM, ADN polimerasa Taq de inicio en caliente 1,75 U, de ADN genómico humano 10 ng y conjunto de cebadores 0,5 pM.
En la reacción de amplificación de ácido nucleico como se ilustra en la Figura 9, la mezcla para la reacción de amplificación de ácido nucleico del ADN polimerasa Pfu se preparó en una mezcla de reacción que incluía MgSO4 2.0 mM, dNTP 0,2 mM, ADN polimerasa Pfu 1,75 U, ADN genómico humano 10 ng y conjunto de cebadores 0,5 pM. En la reacción de amplificación de ácido nucleico como se ilustra en la Figura 10, la mezcla para la reacción de amplificación de ácido nucleico del ADN polimerasa Vent se preparó en una mezcla de reacción que incluía tampón 13 (Tris-HCl 20 mM, (NH4)2SO410 mM, KCl 10 mM, MgSO42 mM, TritonX-100 al 0,01 %, pH 8,8), dNTP 0,2 mM, ADN polimerasa Vent 1,75 U, ADN genómico humano 10 ng y conjunto de cebadores 0,5 pM.
La reacción de amplificación de ácido nucleico se realizó al agregar 45 ul de la mezcla de reacción y 5 ul del ADN molde en 69, 6,9 y 0,69 fg/ul, respectivamente, y la etapa inicial de desnaturalización a 94 °C durante 10 minutos, la etapa de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, la etapa de hibridación a 45 °C durante 30 segundos, y la etapa de extensión a 72 °C durante 2 minutos se llevaron a cabo durante 40 ciclos y la etapa de extensión final se llevó a cabo a 72 °C durante 7 minutos. Se sometieron 5 ul del producto de amplificación a análisis de electroforesis en gel de agarosa al 2 % que incluía colorante verde de gel.
Como resultado del ADN polimerasa Taq como se ilustra en la Figura 7, el producto de amplificación no se confirmó en el carril 1 de Con mediante el uso de ADN molde de 3,45 fg, pero el producto de amplificación se confirmó en el carril 1 del cebador (CP) de la presente invención.
Como resultado del ADN polimerasa Taq de inicio en caliente como se ilustra en la Figura 8, se confirmó que el producto amplificado en el carril 2 del cebador (CP) de la presente invención aumentaba en comparación con el del carril 2 de Con mediante el uso de ADN molde 34,5 fg.
Como resultado del ADN polimerasa Pfu como se ilustra en la Figura 9, el producto de amplificación no se confirmó en el carril 2 de Con mediante el uso de ADN molde 34,5 fg, pero el producto de amplificación se confirmó en el carril 2 del cebador (CP) de la presente invención. En el carril 1 de Con mediante el uso de ADN molde de 3,45 fg, se detectaron muchos productos amplificados de 100 pb o más. Sin embargo, en el carril 1 del cebador (CP) de la presente invención, no se pudo confirmar un producto de amplificación de 100 pb o más.
Como resultado del ADN polimerasa Vent como se ilustra en la Figura 10, se mostró que los productos de amplificación del carril 3 de Con mediante el uso del ADN molde 345 fg y el carril 3 del cebador (CP) de la presente invención exhibieron grosores de banda similares, pero todos los carriles 1, 2 y 3 exhibieron un fenómeno de arrastre, y los carriles 1, 2 y 3 del cebador (CP) de la presente invención no exhibieron fenómeno de arrastre.
Ejemplo 5: Análisis de la reacción de amplificación de acuerdo con la aplicación de cada uno o de un par de los cebadores directo e inverso del cebador (CP) de la presente invención
Como se ilustra en la Figura 11, se llevó a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico en la cual SEQ ID NO: 16 era un cebador directo y SEQ ID NO: 17 era un cebador inverso en el carril de Con, un cebador del método convencional (Nucleic Acids Research, 36:20, 2008) para la amplificación del gen de la beta-actina del ADN genómico humano.
El cebador (CP) de la presente invención incluye una inosina en la porción de burbuja 1 y cuatro secuencias mal apareadas en la porción de burbuja 2 para producir el cebador (CP) de la presente invención que tiene SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19 para SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
Mediante el uso del cebador (CP) de la presente invención, se llevó a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico en la cual SEQ ID NO: 18 del cebador (CP) de la presente invención se usó como cebador directo y un cebador convencional SEC ID NO: 17 se usó como cebador inverso en el carril de A_F como se ilustra en la Figura 11, y se llevó a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico en la cual SEQ ID NO: 16 del cebador convencional, se usó como cebador directo, y SEQ ID NO: 19 del cebador (CP) de la presente invención, se usó como un cebador inverso en el carril de A_R. En el carril de A_F&R, SEQ ID NO: 18 y SeQ ID NO: 19 del cebador (CP) de la presente invención, se usaron como cebadores directo e inverso, respectivamente.
La mezcla de la reacción de amplificación de ácido nucleico para el conjunto de cebadores se preparó en una mezcla de reacción que incluye MgCh 2,5 mM, dNTP 0,2 mM, ADN polimerasa Taq 1,25 U, y conjunto de cebadores 0,5 pM.
Se agregaron la mezcla de reacción y 100, 10 y 1 ng, respectivamente, de ADN genómico humano (Promega, G3041) y luego se sometió un total de 50 ul de producto de reacción a la reacción de amplificación de ácido nucleico en la cual la etapa inicial de desnaturalización a 94 °C durante 2 minutos, la etapa de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, la etapa de hibridación a 60 °C durante 30 segundos y la etapa de extensión a 72 °C durante 45 segundos se llevaron a cabo durante 40 ciclos y la etapa de extensión final se llevó a cabo a 72 °C durante 7 minutos. Se sometieron 5 ul del producto de amplificación a análisis de electroforesis en gel de agarosa al 2 % que incluía colorante verde de gel.
Como resultado, de acuerdo con la reacción de amplificación de ácido nucleico, se exhibieron productos de amplificación de banda única de los carriles de A_F, A_R y A_F & R mediante el uso del cebador (CP) de la presente invención, y allí o más bandas, como productos de amplificación, en el carril de Con mediante el uso del cebador convencional. El producto de amplificación para el gen de la beta-actina fue un producto de amplificación único correspondiente a 653 pb, y el resultado de acuerdo con el cebador (CP) de la presente invención de la Figura 11 se confirma que es superior a la especificidad del cebador convencional. Se confirmó que la especificidad del cebador (CP) de la presente invención aumentaba incluso cuando solo se aplicaba uno de los cebadores directo e inverso. El efecto de aumento del producto de amplificación se confirmó cuando el cebador (CP) de la presente invención se aplicó a solo uno de los dos cebadores, y el aumento del producto de amplificación se confirmó igualmente cuando se usó un par de cebadores.
Como se ilustra en la Figura 12, para amplificar el gen GAPD de ADN genómico de rata, se usó SEQ ID NO: 20 de (Nucleic Acids Research, 36:20, 2008) CP como cebador directo, y SEQ ID NO: 21 se usó como cebador inverso. SEQ ID NO: 22 de 6 secuencias mal apareadas en la porción de burbuja 2 y SEQ ID NO: 24 de 10 secuencias mal apareadas en la porción de burbuja 2 se usaron como cebador directo, y SEQ ID NO: 23 de 8 secuencias mal apareadas y SEQ ID NO: 25 de 10 secuencias mal apareadas se usaron como cebador inverso en el cebador (CP) de la presente invención.
La mezcla de la reacción de amplificación de ácido nucleico para el conjunto de cebadores se preparó en una mezcla de reacción que incluye MgCh 2,0 mM, dNTP 0,2 mM, a Dn polimerasa Taq 1 U, y conjunto de cebadores 0,5 pM.
Se añadieron la mezcla de reacción y 1000, 100, 10 y 1 pg, respectivamente, de ADN genómico de rata (Clonetech, Cat. No. 636404) y luego un total de 25 ul del producto de reacción se sometió a la reacción de amplificación de ácido nucleico en la cual la etapa inicial de desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos, la etapa de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, la etapa de hibridación a 55 °C durante 30 segundos, y la etapa de extensión a 72 °C durante 30 segundos se llevaron a cabo durante 35 ciclos y la etapa de extensión final se llevó a cabo a 72 °C durante 7 minutos. Se sometieron 5 ul del producto de amplificación a análisis de electroforesis en gel de agarosa al 2 % que incluía colorante verde de gel.
El carril 1 ilustrado en la Figura 12 es el producto de amplificación de la reacción de amplificación de ácido nucleico mediante el uso de 1 pg de ADN genómico de rata. Se confirmó que los productos de amplificación de los carriles 1 de M6 y M8 para SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23, respectivamente, en los cuales se aplicaron 6 y 8 secuencias mal apareadas a la porción de burbuja 2 del cebador (CP) de la presente invención y los carriles 1 de M10 y M10 para SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25, respectivamente, en los cuales se aplicaron 10 y 10 secuencias mal apareadas a la porción de burbuja 2 del cebador (CP) de la presente invención aumentaron en comparación con el carril 1 de Con. Como resultado de los 11 y 12 mencionados anteriormente, se confirmó que cuando el cebador (CP) de la presente invención se aplica a solo uno o dos pares entre los pares de cebadores para la reacción de amplificación de ácidos nucleicos se produce un aumento de la especificidad y del producto de amplificación. El aumento en el producto de amplificación se confirmó, además, en la combinación de dos pares de cebadores (CP) de la presente invención que tienen diferentes números de secuencia mal apareadas del cebador (CP) de la presente invención.
Ejemplo 6: Verificación de la eficiencia de amplificación de RT-PCR mediante el uso del cebador (CP) de la presente invención
La RT-PCR se realizó mediante el uso de un cebador convencional (Nucleic Acids Research, 36:20, 2008) y el cebador (CP) de la presente invención para amplificar el gen de la beta-actina en el ARN total humano (Stratagene, Cat. No. 750500). Con el fin de sintetizar el ARN en ADNc como primera etapa de la RT-PCR, se usó la SEC ID NO: 17 correspondiente al cebador inverso del conjunto de cebadores convencionales, y el ADNc se sintetizó mediante el uso de la SEC ID NO: 19 con 4 secuencias mal apareadas, SEQ ID NO: 27 con 6 secuencias mal apareadas, y SEQ ID NO: 29 con 8 secuencias mal apareadas, respectivamente, en la porción de burbuja 2 del cebador (CP) de la presente invención.
Para la síntesis de ADNc, se preparó una mezcla para incluir tampón 13 (Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, MgCb 3 mM, DTT 10 mM, KCl 75 mM), dNTP 2 mM, cebador 1 pM, M-MLV RTasa 200 U y ARN total humano 40, 4, 0,4 ng.
La mezcla para la reacción de síntesis de ADNc reaccionó a 45 °C, 55 °C y 65 °C, respectivamente, durante 60 minutos, y luego la M-MLV RTasa se inactivó a 94 °C durante 5 minutos. Se llevó a cabo la reacción de amplificación de ácido nucleico, en la cual se usó la solución de reacción de ADNc como un molde, y SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 se usaron como conjunto de cebadores para la solución de reacción sintetizada en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19 se usaron como un conjunto de cebadores para la solución de reacción sintetizada en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27 se usaron como un conjunto de cebadores para la solución de reacción sintetizada en SEQ ID NO: 27, y SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 29 se usaron como un conjunto de cebadores para la solución de reacción sintetizada en SEQ ID NO: 29, respectivamente.
La mezcla de la reacción de amplificación de ácido nucleico para el conjunto de cebadores se preparó en una mezcla de reacción que incluye MgCb 2,5 mM, dNTP 0,2 mM, ADN polimerasa Taq 1,25 U, y conjunto de cebadores 0,5 pM.
La mezcla de reacción y cada 5 ul de solución de reacción de ADNc (2, 0,2 y 0,02 ng) de cada cebador para ARN total humano se agregaron y luego un total de 50 ul del producto de reacción se sometió a la reacción de amplificación de ácido nucleico en el cual la etapa inicial de desnaturalización fue a 94 °C durante 2 minutos, la etapa de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, la etapa de hibridación a 60 °C durante 30 segundos y la etapa de extensión a 72 °C durante 45 segundos se llevaron a cabo durante 40 ciclos y la etapa de extensión final se llevó a cabo a 72 °C durante 7 minutos. Se sometieron 5 ul del producto de amplificación a análisis de electroforesis en gel de agarosa al 2 % que incluía colorante verde de gel.
La Figura 13 ilustra el resultado de llevar a cabo la reacción de síntesis de ADNc a 65 °C, y los productos de amplificación de los carriles A, B y C, respectivamente, incluidas las secuencias mal apareadas 4, 6 y 8 en la porción de burbuja 2 del cebador (CP) de la presente invención, se confirmó que aumentaba en comparación con el cebador convencional en el carril de Con. La Figura 14 ilustra el resultado de llevar a cabo la reacción de síntesis de ADNc a 55 °C, y se confirmó que los productos de amplificación del cebador (CP) de la presente invención aumentan en comparación con el del cebador convencional, y que el producto de amplificación del carril 1 de C que incluyen 8 secuencias mal apareadas aumentó en comparación con las de los carriles 1 de Con, A y B. La Figura 15 ilustra el resultado de llevar a cabo la reacción de síntesis de ADNc a 45 °C, y se confirmó que los productos de amplificación del cebador (CP) de la presente invención aumentan en comparación con los del cebador convencional, y que los productos de amplificación del carril 1 de C que incluye 6 y 8 secuencias mal apareadas aumentaron en comparación con las de los carriles 1 de Con y A. Como resultado, se confirmó que la reactividad del cebador (CP) de la presente invención aumentaba en comparación con el conjunto convencional de cebadores de acuerdo con el intervalo de temperatura durante la síntesis de ADNc. Por lo tanto, se usó el cebador (CP) de la presente invención para confirmar la utilidad de una reacción de amplificación de un gen específico mediante RT-PCR en ARN monocatenario.
<110> BioNext Co., Ltd.
<120> CEBADOR PARA PCR UNIDO A SECUENCIA COMPLEMENTARIA DE NUCLEÓTIDOS O SECUENCIA COMPLEMENTARIA DE NUCLEÓTIDOS QUE INCLUYE NUCLEÓTIDOS MAL APAREADOS Y MÉTODO PARA AMPLIFICAR ACIDO NUCLEICO MEDIANTE EL USO DEL MISMO
<130> FC15210PCK
<150> KR 10-2015-0015276
<151> 2015-01-30
<160> 29
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
Tat F
<400> 1
gaattgggtg tcaacatagc agaat 25
<210> 2
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
Tat R
<400> 2
aatactatgg tccacacaac tattgct 27
<210> 3
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
Tat55 F-Ix0
<400> 3
attctgctta caactgaccc aattcgaatt gggtgtcaac atagcagaat 50
<210> 4
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
Tat55 F-Ix1
<220>
<221> base modificada
<222> (26)
<400> 4
attctgctta caactgaccc aattcngaat tgggtgtcaa catagcagaa t 51 <210> 5
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat55 F-Ix1_5
<220>
<221> base modificada
<222> (26)
<400> 5
attcacgata cttgacaccc aattcngaat tgggtgtcaa catagcagaa t 51 <210> 6
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat55 F-Ix1_3
<220>
<221> base_modificada
<222> (26)
<400> 6
attctgctta caactgaccc aattcngaat tgggtgtcaa catagcagaa t 51 <210> 7
<211> 53
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat55 F-Ix3
<220>
<221> base_modificada
<222> (26)..(28)
<400> 7
attctgctta caactgaccc aattcnnnga attgggtgtc aacatagcag aat 53 <210> 8
<211> 55
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat55 F-Ix5
<220>
<221> base_modificada
<222> (26)..(30)
<400> 8
attctgctta caactgaccc aattcnnnnn gaattgggtg tcaacatagc agaat 55 <210> 9
<211> 57
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat55 F-Ix7
<220>
<221> base modificada
<222> (26)..(32)
<400> 9
attctgctta caactgaccc aattcnnnnn nngaattggg tgtcaacata gcagaat 57 <210> 10
<211> 59
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat55 F-Ix9
<220>
<221> base_modificada
<222> (26)..(34)
<400> 10
attctgctta caactgaccc aattcnnnnn nnnngaattg ggtgtcaaca tagcagaat 59 <210> 11
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat F-Ix1
<220>
<221> base_modificada
<222> (26)
<400> 11
attctgctat gttgacaccc aattcngaat tgggtgtcaa catagcagaa t 51 <210> 12
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat65 F-Ix1
<220>
<221> base_modificada
<222> (26)
<400> 12
attctgctat caagacaccc aattcngaat tgggtgtcaa catagcagaa t 51 <210> 13
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat45 F-Ix1
<220>
<221> base_modificada
<222> (26)
<400> 13
attctggata caactgtgcc aattcngaat tgggtgtcaa catagcagaa t 51 <210> 14
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat45 F-Ix1_53
<220>
<221> base_modificada
<222> (26)
<400> 14
attcacgtat gttgactggc aattcngaat tgggtgtcaa catagcagaa t 51 <210> 15
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Tat45 F-Ix1_53-4
<220>
<221> base_modificada
<222> (26)
<400> 15
attctgctta caactgtggc aattcngaat tgggtgtcaa catagcagaa t 51 <210> 16
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Beta-actina_F
<400> 16
agagatggcc acggctgctt 20
<210> 17
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Beta-actina_R
<400> 17
atttgcggtg gacgatggag 20
<210> 18
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> B-actina65 F-Ix1
<220>
<221> base modificada
<222> (21)
<400> 18
aagcagccca ccccatctct nagagatggc cacggctgct t 41 <210> 19
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> B-actina65 R-Ix1
<220>
<221> base_modificada
<222> (21)
<400> 19
ctccatcgtg gtgcgcaaat natttgcggt ggacgatgga g 41 <210> 20
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> GAPD N_F
<400> 20
accacagtcc atgccatcac 20
<210> 21
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> GAPD N_R
<400> 21
tcccaccacc ctgttgctgt a 21
<210> 22
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> GAPD55 F-Ix1
<220>
<221> base_modificada
<222> (21)
<400> 22
gtgatgggta cctctgtggt naccacagtc catgccatca c 41 <210> 23
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> GAPD55 R-Ix1
<220>
<221> base modificada
<222> (22)
<400> 23
tacagcatgt cccacgtggg antcccacca ccctgttgct gta 43 <210> 24
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> GAPD45 F-Ix1-2
<220>
<221> base_modificada
<222> (21)
<400> 24
gtgatgcgta cctgactggt naccacagtc catgccatca c 41 <210> 25
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> GAPD45 R-Ix1-2
<220>
<221> base_modificada
<222> (22)
<400> 25
tacagcttgt cccacctggg antcccacca ccctgttgct gta 43 <210> 26
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> B-actina55 F-Ix1
<220>
<221> base_modificada
<222> (21)
<400> 26
aagcagcgca ccgcatctct nagagatggc cacggctgct t 41 <210> 27
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> B-actina55 R-Ix1
<220>
<221> base_modificada
<222> (21)
<400> 27
ctccatccag ctgcgcaaat natttgcggt ggacgatgga g 41 <210> 28
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> B-actina45 F-Ix1
<220>
<221> base_modificada
<222> (21)
<400> 28
aagcacggca ccggatctct nagagatggc cacggctgct t 41 <210> 29
<211> 41
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> B-actina45 R-Ix1
<220>
<221> base_modificada
<222> (21)
<400> 29
ctccatgtag ctgggcaaat natttgcggt ggacgatgga g 41

Claims (9)

    REIVINDICACIONESi. Un cebador para amplificación génica que se representa por la siguiente Fórmula Estructural 1, el cebador comprende cadenas dobles complementarias de nucleótidos con una estructura de burbuja al incluir una secuencia de nucleótidos mal apareados unida por un enlazador de inosina al extremo 5' de un cebador para una secuencia correspondiente para amplificar una secuencia génica específica:
  1. [Fórmula Estructural 1],
    en donde Xa es una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia génica específica a amplificar, X'a es complementaria a Xa con la excepción de la secuencia de nucleótidos mal apareados, y Ya es una secuencia de bases universales o no discriminatorias.
  2. 2. El cebador de conformidad con la reivindicación 1, en donde el número de nucleótidos mal apareados en la secuencia de nucleótidos complementaria (X'a) del cebador es de 3 a 12.
  3. 3. El cebador de conformidad con la reivindicación 1, en donde el cebador es uno o más de los cebadores seleccionados del grupo que consiste en los cebadores como se establecen en SEQ ID NOS: 4 a 15, SEQ ID NOS: 18 y 19, y SEQ ID NOS: 22 a 29.
  4. 4. El cebador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cebador se usa en cada una de las posiciones directa e inversa para la amplificación génica o en ambas.
  5. 5. Un método para amplificar una secuencia génica específica a partir de ARN, en donde se sintetiza ADNc con una polimerasa de transcripción inversa para la transcripción inversa mediante el uso del cebador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y el gen específico se amplifica con el ADNc como molde mediante el uso del cebador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el método es tal que una reacción de amplificación génica específica después de realizar una transcripción inversa de un molde de ARN mediante el uso del cebador de la reivindicación 1 se lleva a cabo en un proceso de una sola etapa.
  7. 7. Una composición para amplificar un gen que se usa en un método de reacción en cadena de la polimerasa, un método de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o un método de amplificación isotérmica para la amplificación génica de ADN y ARN, la composición comprende el cebador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como un ingrediente activo.
  8. 8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, que comprende además una o más polimerasas seleccionadas del grupo que consiste en polimerasa Taq que tiene actividad exonucleasa 5'^3', polimerasa Taq de inicio en caliente, polimerasa PFU y polimerasa Klenow que tiene actividad exonucleasa (-) 5 '^3 ' y de exonucleasa (-) 3'^5'.
  9. 9. Un kit para amplificar un gen específico para ADN y ARN de una enfermedad infecciosa, una enfermedad hereditaria, tolerancia a fármacos, resistencia a fármacos y una muestra susceptible de prueba, el kit comprende el cebador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como ingrediente activo.
ES16743613T 2015-01-30 2016-01-07 Cebador para PCR unido a secuencia complementaria de nucleótidos o secuencia complementaria de nucleótidos que incluye nucleótidos mal apareados y método para amplificar ácido nucleico mediante el uso del mismo Active ES2835899T3 (es)

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