ES2838687T3

ES2838687T3 - Purificación de partículas de virus adenoasociados recombinantes con cromatografía de intercambio aniónico de múltiples etapas

Info

Publication number: ES2838687T3
Application number: ES16704575T
Authority: ES
Inventors: Nicole Brument
Original assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Association Francaise Contre les Myopathies
Current assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Association Francaise Contre les Myopathies
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2016-02-09
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2036-02-09
Also published as: JP2018518164A; WO2016128407A1; US20180163183A1; US20220098618A1; US11203740B2; EP3256573A1; CA2975427A1; US12351832B2; EP3256573B1; US20240060054A9; PT3256573T; WO2016128407A8; EP3054006A1; JP6837009B2; SI3256573T1

Abstract

Un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas, que comprende las etapas de: a) realizar una filtración profunda de un material de partida obtenido previamente a partir de células que producen partículas de rAAV, dicho material de partida comprende un lisado celular y/o un sobrenadante de cultivo, de manera que se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV; b) ajustar el pH de la composición clarificada que contiene rAAV a un pH básico para asegurar una retención óptima de las partículas de rAAV en el soporte cromatográfico usado en la etapa c); c) someter la composición clarificada que contiene rAAV de la etapa b) a una primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico, en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV, de manera que se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV; d) someter la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV, de manera que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV; e) someter la segunda composición enriquecida con rAAV a una etapa de filtración de flujo tangencial, de manera que se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas, en donde dicho método no comprende ni una etapa de cromatografía de apatita ni una etapa de cromatografía de intercambio catiónico, y en donde dichas partículas de rAAV pertenecen a un serotipo de cápside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV5, AAV8, AAV9 y AAV2.

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación de partículas de virus adenoasociados recombinantes con cromatografía de intercambio aniónico de múltiples etapas

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la purificación de partículas de virus adenoasociados (rAAV). En particular, se refiere a métodos para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV).

Antecedentes de la invención

El suministro de genes es un método prometedor para el tratamiento de enfermedades adquiridas y heredadas. Se han descrito varios sistemas basados en virus para fines de transferencia de genes, que incluye los sistemas basados en virus adenoasociados (AAV). El AAV es un parvovirus de ADN dependiente de ayudantes que pertenece al género Dependovirus. AAV requiere coinfección con un virus auxiliar no relacionado, por ejemplo, adenovirus, virus del herpes o vaccinia, para que se produzca una infección productiva. En ausencia de un virus auxiliar, el AAV establece una etapa latente que inserta su genoma en un cromosoma de la célula huésped. La infección subsecuente por un virus auxiliar rescata el genoma viral integrado, que luego puede replicarse para producir una progenie viral infecciosa.

El VAA tiene una amplia gama de hospedadores y es capaz de replicarse en células de cualquier especie en presencia de un virus auxiliar adecuado. Por ejemplo, el AAV humano se replicará en células caninas coinfectadas con un adenovirus canino. El AAV no se ha asociado con ninguna enfermedad humana o animal y no parece alterar las propiedades biológicas de la célula huésped tras la integración. Para una revisión de AAV, consulte, por ejemplo, Berns y Bohenzky (1987) Avances en la Investigación de Virus (Academic Press, Inc.) 32:243-307.

Le Meur y otros ("Restauración de la visión en perros Briard deficientes en RPE65 mediante el uso de un vector de serotipo 4 de AAV que se dirige específicamente al epitelio pigmentado de la retina"; Terapia genética; Vol. 14, 292-303; 2007) enseña el uso de un rAAV para restaurar la visión en un perro con deficiencia de RPE65.

Petit y otros ("Restauración de la visión en el perro con deficiencia de pde6p, un modelo animal grande de distrofia de cono de varilla"; Terapia molecular"; Vol. 20, no. 11, 2019-2030"; 2012) enseña el uso de un rAAV para restaurar la visión en un perro con deficiencia de PDE6p.

Por todas estas razones, se ha propuesto el uso de Virus Adenoasociados para la terapia génica. Sin embargo, todavía se carece de solicitudes debido al requisito de preparaciones que tengan suficiente pureza y/o infectividad para uso clínico. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de nuevos métodos para purificar partículas de virus adenoasociado (rAAV). En particular, sigue existiendo la necesidad de métodos escalables que estén bien definidos, reproducibles y dentro de condiciones ambientales controladas de acuerdo con las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP).

En particular, sigue existiendo la necesidad de métodos para purificar partículas de virus adenoasociados (rAAV) que requieren un número limitado de etapas.

También persiste la necesidad de métodos para purificar partículas de virus adenoasociados (rAAV) que sean adecuadas para su uso como medicamento y/o terapia génica.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de métodos escalables para purificar partículas de rAAV y sus composiciones, con alta pureza e infectividad.

En la técnica anterior se han descrito métodos para purificar partículas de virus adenoasociados. Sin embargo, esos métodos no son necesariamente satisfactorios para producir partículas de rAAV que sean directamente adecuadas para su uso como medicamento y/o para terapia génica.

WO2010/148143 enseña un método para aislar partículas de AAV de contaminantes, tales como contaminantes de cultivo de producción o contaminantes en proceso, mediante captura y elución de resinas de apatita.

WO2011/094198 enseña un método para purificar partículas de AAV, que incluye una etapa de cromatografía en columna de intercambio iónico y una etapa de filtración de flujo tangencial.

WO03/097797 enseña un método para purificar partículas de virus con niveles reducidos de ADN contaminante, que puede incluir etapas de lisis celular, filtración profunda y/o centrifugación, ultracentrifugación, tratamiento con nucleasas, cromatografía de intercambio aniónico y filtración de flujo tangencial.

Por otro lado, muchas de las técnicas disponibles tienen la desventaja de requerir un tratamiento extensivo previo de los extractos celulares, que incluye gradiente de densidad, tratamiento con nucleasas y detergentes antes de la etapa de cromatografía. Estos tratamientos adicionales hacen que todo el proceso sea menos satisfactorio a escala industrial.

Brument y otros ("Un proceso de cromatografía de intercambio iónico de dos etapas versátil y escalable para la purificación de los serotipos 2 y 5 del virus adenoasociado recombinante"; Molecular Therapy; Vol. 6, No. 5; 2002) enseña un proceso de cromatografía de dos etapas para la purificación de rAAV2 o rAAV5, que incluye una etapa de cromatografía de intercambio catiónico seguida de una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.

Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de métodos novedosos que puedan escalarse con respecto a cuestiones de buenas prácticas de fabricación, que sigan siendo aceptables desde un punto de vista económico y adecuados para su uso como medicamento o para terapia génica.

También existe la necesidad de nuevas partículas purificadas de rAAV y sus composiciones, tales como y/o para su uso como medicamento o para terapia génica, que puedan purificarse adicionalmente mediante dichos procesos y que sigan siendo adecuadas para producir partículas de rAAV en una célula huésped dada.

Resumen de la invención

La presente descripción se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

a) realizar una filtración profunda de un material de partida obtenido previamente de células que producen partículas de rAAV, dicho material de partida se seleccionó en un grupo que comprende un lisado celular y un sobrenadante de cultivo, de manera que se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV;

b) someter la composición clarificada que contiene rAAV a una primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico en un soporte cromatográfico en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV, de manera se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV; c) someter la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV, de manera que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV;

d) someter la segunda composición enriquecida con rAAV a una etapa de filtración de flujo tangencial, de manera que se proporcionen partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV).

En particular, la invención tal como se define en las reivindicaciones se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas, que comprende las etapas de:

a) realizar una filtración profunda de un material de partida obtenido previamente a partir de células que producen partículas de rAAV, dicho material de partida comprende un lisado celular y/o un sobrenadante de cultivo, de manera que se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV;

b) ajustar el pH de la composición clarificada que contiene rAAV a un pH básico para asegurar una retención óptima de las partículas de rAAV en el soporte cromatográfico usado en la etapa c);

c) someter la composición clarificada que contiene rAAV de la etapa b) a una primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico, en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV, de manera que se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV;

d) someter la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV, de manera que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV;

e) someter la segunda composición enriquecida con rAAV a una etapa de filtración de flujo tangencial, de manera que se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas,

en donde dicho método no comprende ni una etapa de cromatografía de apatita ni una etapa de cromatografía de intercambio catiónico, y

en donde dichas partículas de rAAV pertenecen a un serotipo de cápside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV5, AAV8, AAV9 y AAV2.

También se describen en la presente descripción partículas de rAAV purificadas que se obtienen mediante la realización del método descrito anteriormente; y una composición de partículas de rAAV purificada que comprende al menos una partícula de rAAV purificada como se definió anteriormente.

También se describen en la presente descripción dichas partículas de rAAV purificadas y sus composiciones, para el uso en la terapia génica y/o para la preparación de un medicamento para uso en la terapia génica.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1A: Cartografía del casete de expresión de un plásmido de AAV que codifica PDE6p humana. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína PDE6p humana está asociada en su extremo 5' a un promotor de la rodopsina quinasa humana (RK) y en su extremo 3' a un sitio de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (bGHpA), flanqueado por las secuencias de Repetición Terminal Invertida (ITR).

Figura 1B: Cartografía del casete de expresión de un plásmido de AAV que codifica RPE65 humano. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína RPE65 humana está asociada en su extremo 5'a un promotor RPE65 humano y en su extremo 3' a un sitio de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (bGHpA), flanqueado por secuencias de Repetición Terminal Invertida (ITR).

Figura 2: Cartografía del plásmido AAV completo que comprende el casete de expresión que codifica la PDE6p humana. El casete de expresión está delimitado por secuencias iTr como se define en la figura 1. Los sitios de restricción se definen como EcoRV, Spel y HindlIl. El plásmido incluye un marcador de resistencia adicional a Kanamicina (Kan/neoR) y un origen Col1. La direccionalidad de las secuencias se indica con flechas de acuerdo con la nomenclatura estándar.

Figura 3A: Perfil cromatográfico de la fase de elución correspondiente al 1ro Etapa de cromatografía de intercambio aniónico de una preparación que contiene rAAV5. Las curvas representan la absorbancia (eje izquierdo en mAU) a 280 nm (línea A) y 260 nm (línea B). La línea C representa la conductividad en mS/cm. Los cuadrados vacíos muestran dónde se eluyen los AAV.

Figura 3B: Perfil cromatográfico de la fase de elución correspondiente a la 2da etapa de cromatografía de intercambio aniónico de una preparación que contiene rAAV5. Las curvas representan la absorbancia (eje izquierdo en mAU) a 280 nm (línea A) y 260 nm (línea B). La línea C representa la conductividad en mS/cm (eje derecho). Los cuadrados vacíos muestran dónde se eluyen las fracciones que contienen AAV.

Descripción detallada de la invención

La invención se dirige a las necesidades mencionadas anteriormente.

La presente invención proporciona un método de purificación de partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que incluye dos características únicas que lo distinguen del actual "estándar en la industria" Procesos escalables de purificación de partículas de AAV: 1) un proceso de plataforma modular que puede usarse para la purificación de diferentes serotipos de AAV/variantes de cápside con alta pureza, y que es adecuado para producir preparaciones directamente adecuadas para aplicaciones clínicas; y 2) una secuencia única de etapas del proceso, que incluyen al menos dos etapas de cromatografía de intercambio aniónico, que se realizan mediante el uso de un gradiente de sal lineal. Sorprendentemente, estas características confieren una escalabilidad inesperada para purificar un material de partida, como un lisado celular o un sobrenadante de cultivo. En particular, este proceso tiene la ventaja de ser adecuado para la optimización del pH, con el fin de preparar partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas que tengan una infecciosidad óptima y que sean adecuadas para la terapia génica.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría en particular, los inventores opinan que la selectividad de un soporte de cromatografía de intercambio aniónico dado para las preparaciones de rAAV depende de la calidad del producto que se transmite: por lo tanto, un producto más limpio dará como resultado una mejor separación de compuestos sobre el soporte. Por tanto, el uso de dos o más etapas de cromatografía aniónica, preferentemente consecutivos, conducirá a una separación óptima de los compuestos sobre dicho soporte y, por tanto, es adecuado para aislar partículas de rAAV de una manera mejorada.

Ventajosamente, la composición se eluye sobre el soporte de cromatografía de intercambio aniónico mediante el uso de un gradiente de sal lineal. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, los inventores también opinan que el gradiente de sal lineal proporciona una separación más eficiente de las especies eluidas, en comparación con los gradientes de sal escalonada. La diferencia radica en la pendiente más baja del gradiente, que permite la formación de un lento aumento de la concentración de sal y, por tanto, una separación óptima de las partículas de rAAV dentro del soporte cromatográfico.

De acuerdo con el leal saber y entender de los inventores, es el primer método "estándar en la industria" descrito para purificar partículas de rAAV de grado clínico, en particular partículas de rAAV que pertenecen al serotipo AAV5, que implica una cromatografía de intercambio aniónico en dos etapas mediante el uso de un gradiente de sal lineal.

Además, el ADN residual al final del proceso está de acuerdo con los estándares clínicos, incluso en ausencia de tratamiento con detergentes y nucleasas, incluidas las ADNasas.

Por tanto, la presente descripción se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes (rAAV) purificadas y es particularmente adecuado para purificar partículas de rAAV que pertenecen a un serotipo de AAV seleccionado en un grupo que comprende, o consiste en, AAV1, AAV2, AAV3, a Av 4, AAV5, AAV8, AAV9, AAV10 y serotipos derivados del macaco rhesus que incluyen AAVrh10 y sus mezclas; preferentemente AAV5.

De acuerdo con una primera modalidad, la presente descripción se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

El material de partida puede comprender partículas de rAAV que pertenecen a un serotipo o que pertenecen a una pluralidad de serotipos, que incluye partículas de rAAV que pertenecen al serotipo AAV5.

De acuerdo con una modalidad alternativa, la presente descripción se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) del serotipo AAV5, que comprende las etapas de:

a) realizar una filtración profunda de un material de partida obtenido previamente a partir de células que producen partículas de rAAV, dicho material de partida se selecciona en un grupo que comprende un lisado celular y un sobrenadante de cultivo, de manera que se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV5;

b) someter la composición clarificada que contiene rAAV5 a una primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico en un soporte cromatográfico en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV5, de manera que se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV5; c) someter la primera composición enriquecida en rAAV5 al menos una vez a una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV5, de manera que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV5;

d) someter la segunda composición enriquecida con rAAV5 a una etapa de filtración de flujo tangencial, mediante la cual se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) del serotipo AAV5.

Las partículas de rAAV purificadas descritas en la presente descripción comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico deseable. Dichos productos incluyen, sin limitación, ARNip, moléculas no codificante, miARN, ribozimas y similares. Otros productos incluyen ácidos nucleicos que codifican hormonas, receptores de crecimiento, ligandos y proteínas útiles para la terapia génica. De acuerdo con la invención, la expresión "que comprende", como en "que comprende las etapas de", también se entiende como "que consiste en", como en "que consta de las etapas de".

Métodos para obtener partículas de virus adenoasociados recombinantes purificadas

De acuerdo con algunas modalidades, el método no incluye una etapa de tratamiento con detergentes y/o nucleasas, incluidas las ADNasas.

De acuerdo con algunas otras modalidades, el método incluye una etapa de tratamiento con detergentes y/o nucleasas, incluidas las ADNasas.

De acuerdo con una modalidad, las partículas de rAAV pertenecen a un serotipo de AAV seleccionado en un grupo que comprende AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9, AAV10 y macaco rhesus-serotipos derivados que incluyen AAVrh10 y sus mezclas; preferentemente AAV5.

De acuerdo con una modalidad, las partículas de rAAV consisten en partículas de rAAV que contienen ADN que comprende un casete de expresión que codifica PDE6-beta humana o RPE65 humana. A continuación, se describen con más detalle ejemplos de casetes de expresión que son adecuados para la invención.

De acuerdo con una modalidad particular, las partículas de rAAV consisten en partículas de rAAV5 que contienen ADN que comprende un casete de expresión que codifica PDE6-beta humana. De acuerdo con dicha modalidad, dicho casete de expresión es de SEQ ID NO:1.

De acuerdo con una modalidad, las partículas de rAAV5 contienen un ADN que comprende la SEQ ID NO:2.

Los términos "virión AAVrecombinante", "virón rAAV", "partícula AAV", "cápsides completas"y "partículas completas" se definen en la presente descripción como un virus infeccioso de replicación defectuosa que incluye una cubierta de proteína AAV, que encapsula una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés que está flanqueada en ambos lados por ITR de AAV. Se produce un virión de rAAV en una célula huésped adecuada que ha tenido secuencias que especifican un plásmido de AAV, funciones auxiliares de AAV y funciones accesorias introducidas en la presente. De esta manera, la célula huésped se vuelve capaz de codificar polipéptidos de AAV que se requieren para empaquetar el plásmido de AAV (que contiene una secuencia de nucleótidos recombinante de interés) en partículas de virión recombinante infecciosas para el suministro de genes subsecuente.

Por "virus recombinante" se entiende que un virus que ha sido alterado genéticamente, por ejemplo, mediante la adición o inserción de una construcción de ácido nucleico heterólogo en la partícula.

Por "Virión AAV" se entiende que una partícula de virus completa, tal como una partícula de virus de AAV de tipo silvestre (wt) (que comprende un genoma de ácido nucleico de AAV monocatenario lineal asociado con una cubierta de proteína de la cápside de AAV). Con respecto a esto, las moléculas de ácido nucleico de AAV monocatenarias complementarias, por ejemplo, hebras "codificantes" o "no codificantes", pueden empaquetar en cualquier virión AAV y ambas hebras son igualmente infecciosas.'

El término "célula huésped" denota, por ejemplo, microorganismos, células de levadura, células de insectos y células de mamíferos, que pueden ser, o han sido, usadas como líneas celulares productoras estables transitorias o permanentes receptoras de una construcción auxiliar de AAV, un plásmido de AAV, un plásmido de función accesoria, u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Así, una "célula huésped" como se usa en la presente se refiere generalmente a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógena. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento genómico o de ADN total como la célula parental original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada.

El término "Composición clarificada que contiene rAAV" abarca cualquier composición que incluya partículas de rAAV, que se obtiene después de una etapa de filtración profunda de un material de partida como un lisado celular o un sobrenadante de cultivo. Una "Composición clarificada que contiene rAAV" es distinta de un "composición enriquecida con rAAV"y/o partículas de rAAV purificadas.

Así, un "Composición clarificada que contiene rAAV" puede abarcar cualquier composición que incluya partículas de rAAV que se deriven directamente de un material de partida filtrado profundidad, como un lisado celular o un sobrenadante de cultivo, y que no se haya sometido a una etapa de enriquecimiento y/o purificación, incluida la que no se ha sometido a una etapa de cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, catiónico).

De acuerdo con dicha modalidad, la presente descripción se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

a) realizar una filtración profunda de un lisado celular y/o un sobrenadante de cultivo, de manera que se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV;

De acuerdo con otra modalidad, la invención se refiere a un método para la obtención de partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), en donde la composición clarificada que contiene rAAV que se somete a la primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico, es la composición obtenida directamente en la etapa final a). Así, de acuerdo con dicha modalidad, las etapas a) y b) son etapas consecutivas.

P o r"etapa consecutiva" se entiende que cualquier etapa que viene después de una primera etapa, para la cual se excluye cualquier etapa intermedia de la etapa de cromatografía, en particular cromatografía de intercambio iónico (catiónico). Por otro lado, y salvo que se indique lo contrario, "etapas consecutivas" no excluye el intercambio de tampón y/o las etapas de dilución, con el fin de modificar las condiciones del tampón (es decir, concentración de sal; pH) de dichas composiciones.

De acuerdo con una modalidad, el método de la invención no comprende una etapa de cromatografía de intercambio catiónico.

De acuerdo con una modalidad, el método de la invención no comprende una etapa de cromatografía de apatita.

De acuerdo con una modalidad preferida, la invención se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), en donde las etapas de cromatografía de intercambio aniónico son etapas consecutivas. Así, De acuerdo con dicha modalidad, las etapas b) y c) son etapas consecutivas.

De acuerdo con otra modalidad, las etapas c) y d) son consecutivos.

De acuerdo con otra modalidad, las etapas b) y c) y d) son consecutivos.

De acuerdo con otra modalidad, las etapas a) y b) y c) son consecutivos.

De acuerdo con otra modalidad, las etapas a) y b) y c) y d) son consecutivos. De acuerdo con dicha modalidad, la presente descripción se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

b) someter la composición clarificada que contiene rAAV obtenida en la etapa a) a una primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV, de manera que se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV;

c) someter la primera composición enriquecida con rAAV obtenida en la etapa b) al menos una vez a una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico en un soporte cromatográfico en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recolecta la fracción que contiene rAAV, de manera que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV;

d) someter la segunda composición enriquecida con rAAV obtenida en la etapa c) a una etapa de filtración de flujo tangencial, mediante la cual se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV).

De acuerdo con otra modalidad, las etapas a) y b) y c) y d) son consecutivos y el material de partida de la etapa a) se obtiene directamente de un lisado celular o de un sobrenadante de cultivo. De acuerdo con dicha modalidad, la presente descripción se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

Todos los métodos mencionados anteriormente incluyen al menos: 1) una etapa de filtración profunda de un material de partida; 2) una primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico; 3) una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico; y 4) una etapa de filtración de flujo tangencial. Cada etapa individual se definirá con más detalle a continuación.

Los inventores también opinan que cada etapa adicional contribuye a la escalabilidad y alta pureza de las partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas.

Filtración profunda

La etapa de filtración profunda permite descartar una gran parte del ADN y las proteínas contaminantes. Esta etapa hace posible la purificación de partículas de rAAV mediante cromatografía de intercambio aniónico directamente a partir de una composición clarificada que contiene rAAV.

De acuerdo con una modalidad, el material de partida usado en la etapa a) es un lisado celular obtenido poniendo en contacto un cultivo de células que producen partículas de rAAV con una composición que comprende al menos un detergente o un surfactante y preferentemente un detergente.

De acuerdo con una modalidad, el material de partida usado en la etapa a) es un lisado celular obtenido al poner en contacto un cultivo de células que producen partículas de rAAV con una composición que puede comprender o no un detergente o un surfactante pero que no se trata con una nucleasa. como una ADNasa.

Los ejemplos de detergentes adecuados para la lisis celular incluyen Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Brij-35, Brij-58, Tween 20, Tween 80, octil glucósido, octil tioglucósido, SDS, CHAPS y CHAPSO.

De acuerdo con una modalidad preferida, la etapa a) se realiza mediante el uso de una membrana de filtro en profundidad que comprende una capa de microfibras de vidrio de borosilicato y una capa de ésteres mixtos de celulosa.

De acuerdo con una modalidad ilustrativo, la etapa a) se realiza mediante el uso de un filtro Polysep™ II (Millipore®).

Cromatografía de intercambio aniónico

Se conocen varios intercambiadores de aniones adecuados para su uso con la presente invención e incluyen, sin limitación, MACRO PREP Q (intercambiador de aniones fuerte disponible en BioRad, Hercules, CA); UNOSp He RE Q (intercambiador de aniones fuerte disponible de BioRad, Hercules, CA); POROS 50HQ (intercambiador de aniones fuerte disponible en Applied Biosystems, Foster City, California); POROS 50D (intercambiador de aniones débil disponible en Applied Biosystems, Foster City, California); POROS 50PI (intercambiador de aniones débil disponible en Applied Biosystems, Foster City, California); FUENTE 30Q (intercambiador de aniones fuerte disponible en GE Healthcare, NJ); DEAE SEPHAROSE (intercambiador de aniones débil disponible de GE Healthcare, Piscataway, NJ); Q SEPHAROSE (intercambiador de aniones fuerte disponible en GE Healthcare, Piscataway, NJ), Capto Q y Capto Adhere (GE Healthcare, NJ).

De acuerdo con algunas modalidades, el método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) comprende más de dos etapas de cromatografía de intercambio aniónico, que incluyen en particular tres o incluso cuatro etapas de cromatografía aniónica. Cuando el método comprende más de dos etapas de cromatografía de intercambio aniónico, las etapas antes mencionados pueden lograr sobre el mismo tipo de soporte o sobre diferentes soportes.

De acuerdo con una modalidad preferida, el soporte cromatográfico usado en la etapa b) es el mismo que el soporte cromatográfico usado en la etapa c).

De acuerdo con una modalidad ilustrativa, el soporte cromatográfico de la etapa b) y/o de la etapa c) es un soporte cromatográfico monolítico.

Se conocen en la técnica ejemplos de soportes cromatográficos monolíticos adecuados, e incluyen de manera no limitativa la columna monolítica CIMmultus® QA, CIM® QA, CIM DEAE y CIMmultus® DEAE (Bia Separations).

Los monolitos de cromatografía son sólidos porosos de una pieza hechos de glóbulos de sílice fundidos del tamaño de un micrómetro o un polímero orgánico que puede sintetizar directamente dentro de un tubo de cromatografía. Esto hace que este soporte sea muy resistente y listo para usar, sin variabilidad de los parámetros del paquete.

Los monolitos son columnas homogéneas con una matriz de lecho poroso continuo, que consta de canales de perfusión interconectados. Estos canales son relativamente grandes (1-5 pm) en comparación con los tamaños de poro típicos de la cromatografía basada en partículas de lecho empacado (5-100 nm). Un beneficio de esto es que aumenta la capacidad de unión potencial de macromoléculas como virus debido a la alta superficie de accesibilidad. Estos soportes generan una contrapresión baja incluso a velocidades de flujo altas y una velocidad de corte baja.

En comparación con las columnas de lecho compacto, el transporte de masa mejorado de los soportes monolíticos da como resultado una separación eficiente de las macromoléculas.

Desde un punto de vista práctico, el uso de estas columnas permite trabajar con un producto viral (incluso cuando se trata de un lisado celular) a alto caudal en comparación con las columnas de lecho empacado, con una alta capacidad de unión y una buena resolución, independiente del caudal. La alta resolución de estos soportes contribuye a la reducción de las etapas de depuración y a la escalabilidad de todo el proceso.

De acuerdo con algunas modalidades, el método para obtener partículas de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) purificadas, tales como partículas de rAAV pertenecientes a los serotipos 4 o 5, comprende dos o tres etapas de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico monolítico, seguido de una etapa de filtración de flujo tangencial (TFF) como se describe más adelante.

La columna de intercambio aniónico se equilibra primero mediante el uso de tampones estándar y de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Por ejemplo, la columna puede equilibrarse con, por ejemplo, un tampón Tris de 5 a 50 mM, preferentemente de 7-20 mM, tal como 20 mM. A continuación, se carga la muestra y se usan dos tampones de elución, uno con bajo contenido de sal y otro con alto contenido de sal.

Las fracciones se recogen siguiendo una mezcla progresiva de tampones de bajo contenido de sal y alto contenido de sal, generando un gradiente de sal, y el material eluido se detecta en las fracciones mediante el uso de técnicas estándar, como el seguimiento de la absorción de UV a 260 y 280 nm. Mediante el uso de un intercambiador de aniones, los picos de proteína del eluato de sal inferior contienen cápsides vacías de AAV y las fracciones de sal superior contienen partículas de AAV.

En particular, en la columna de intercambio aniónico, las partículas de AAV pueden purificar adicionalmente mediante el uso de un tampón apropiado a un pH de aproximadamente pH 5 a pH 12, preferentemente pH 6 a pH 10, e incluso más preferentemente pH 7 a pH 9,5, tal como pH 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 - 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5 - 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, o cualquier pH entre los intervalos establecidos.

Los tampones apropiados para usar con las columnas de intercambio aniónico son bien conocidos en la técnica y generalmente son de naturaleza catiónica o bipolar. Dichos tampones incluyen, sin limitación, tampones con los siguientes iones tampón: N-metilpiperazina; piperazina; Bis-Tris; Propano Bis-Tris; Trietanolamina; Tris; N-metildietanolamina; 1,3-diaminopropano; etanolamina; ácido acético y similares. Para eluir la muestra, se aumenta la fuerza iónica del tampón de partida mediante el uso de una sal, como NaCl, KCl, sulfato, formiato o acetato, a un pH apropiado.

Ventajosamente, todos los tampones usados durante, antes o después de la cromatografía de intercambio aniónico comprenden un surfactante no iónico, por ejemplo, Pluronic® F-68 (Gibco), en una cantidad que varía de 0,0001 % a 0,1 % (v/v) del volumen total de la composición tampón; que incluye una cantidad que varía de 0,0005 % a 0,005 % (v/v) del volumen total de la composición tampón; que incluye aproximadamente el 0,001 % (v/v) del volumen total de la composición tampón.

El uso de un tensioactivo no iónico, como se definió anteriormente, y en las otras etapas, contribuye además a la eficiencia y escalabilidad del método. En particular, el uso de un tensioactivo no iónico, como se define anteriormente, evita la agregación o adherencia de las partículas de rAAV, antes, durante y después de la purificación.

La naturaleza de las resinas usadas (es decir, intercambiadores de iones fuertes o débiles) y las condiciones de concentración de sal, tampón usado y pH, variarán en la variante de cápside de AAV (es decir, serotipo o pseudotipo de cápside de AAV). Si bien todas las variantes de cápside de AAV conocidas comparten características como el tamaño y la forma, difieren en los detalles finos de la topología molecular y la distribución de carga superficial. Por lo tanto, si bien se espera que todas las variantes de cápside sean susceptibles de purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico, y los métodos relevantes pueden determinar de manera sistemática mediante el uso de resina de cromatografía y experimentos de selección de tampón, se requerirán diferentes condiciones para cada variante de cápside de AAV para lograr AAV eficiente purificación de partículas. La determinación de dichas condiciones es fácilmente evidente para el experto en la materia. Ventajosamente, al final de la etapa a), el pH de la composición clarificada que contiene rAAV se ajusta a un pH básico para asegurar una retención óptima de las partículas de rAAV en el soporte cromatográfico usado en la etapa b).

El pH usado en la etapa b) o c) para unirse al soporte cromatográfico está preferentemente por encima del pH usado durante la elución.

Preferentemente, el pH de elución en el soporte cromatográfico se ajusta en dependencia de la partícula de rAAV que se purifica. La elución a un pH óptimo tiene la ventaja de mantener la infectividad óptima de un vector dado.

De acuerdo con una modalidad particular, al final de la etapa a), el pH óptimo de una composición clarificada que contiene rAAV, se ajusta a pH 8.

De acuerdo con una modalidad particular, el pH óptimo para la unión de las partículas de rAAV al soporte cromatográfico en la etapa b) o c) está por encima del pH óptimo usado de elución. De acuerdo con modalidades ilustrativas, el pH óptimo para la unión es de aproximadamente 0,5 a 1 unidades de pH más alto que el pH usado para la elución.

La elución de partículas de rAAV del soporte cromatográfico en la etapa b) o c), en particular la elución de partículas de rAAV5, puede ajustarse así a pH 8.

De acuerdo con dicha modalidad, la unión de las partículas de rAAV al soporte cromatográfico puede ajustarse a pH 8,5.

En particular, la elución sobre el soporte cromatográfico se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal. La sal puede seleccionarse del grupo que consiste en: NaCl, KCl, sulfato, formiato y acetato; y preferentemente NaCl.

La cromatografía de intercambio aniónico puede incluir una primera etapa de tratamiento del soporte, o columna de intercambio aniónico, con una concentración de sal más baja que la que se usa generalmente para la etapa de elución. Dicho tratamiento también puede denominarse en la presente descripción como una "primera etapa de preelución".

Por tanto, en una modalidad de la invención, la columna de intercambio aniónico se trata primero con una baja concentración de sal, por ejemplo, 10-100 mM de sal, en particular 10-100 mM de NaCl, como 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 - 100 mM, o cualquier concentración dentro de estos intervalos. Por ejemplo, la concentración de sal en la "primera etapa de preelución" puede corresponder inicialmente a la concentración de sal del tampón usada para unir las partículas de rAAV a la columna después de la carga.

Después del tratamiento inicial, la columna se trata con una concentración de sal más alta para eluir las impurezas, como una concentración de NaCl más alta, o con otro tampón con una fuerza iónica mayor. Un ejemplo para usar como segundo tampón es un tampón de acetato de sodio o un tampón a base de Tris. Esta etapa adicional también puede denominarse en el presente descripción como una etapa de "segunda preelución". En ese caso, puede tener cuidado de que la concentración de sal permanezca lo suficientemente baja como para no eluir las partículas de AAV de la columna.

Después de que se eluyen más impurezas de la columna, las partículas de AAV pueden recuperarse mediante el uso de una concentración más alta de sal en la etapa de elución.

El término "pendiente del gradiente de sal lineal" se refiere a la pendiente entre dos puntos (A, B) del gradiente lineal, y depende tanto de la concentración de sal en el soporte cromatográfico como del volumen de columna (CV) que se eluye en el tiempo, de acuerdo con la siguiente fórmula:

Pendiente (A, B) = (concentración de la sal en B - concentración en la sal en A) /

volumen de columna en B - volumen de columna en A).

Por tanto, la pendiente del gradiente de sal lineal puede expresarse en M/CV o en mM/CV, y es preferentemente un gradiente de sal poco profundo de acuerdo con los protocolos estándar.

De acuerdo con una modalidad, la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa c) es igual o inferior a la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa b).

De acuerdo con una modalidad, la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa c) es aproximadamente la mitad de la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa b), o incluso menos. Por lo tanto, la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa c) puede variar del 1 al 70 % de la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa b), que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 % de la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa b).

De acuerdo con una modalidad, la pendiente en la etapa b) es igual o menor que 0,1 M/CV, en particular variando de 0,015 a 0,09 M/CV.

De acuerdo con una forma de modalidad, la pendiente en la etapa c) es igual o menor que 0,07 M/CV, en particular variando de 0,01 a 0,06 M/CV.

Dichos gradientes pueden combinarse ventajosamente en el mismo proceso.

Por lo tanto, de acuerdo con una modalidad, la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa c) es igual o inferior a la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa b), siendo la pendiente en la etapa b) igual o menor que 0,1 M/CV. y la pendiente en la etapa c) es igual o menor que 0,07 M/CV. De acuerdo con una modalidad, la pendiente del gradiente de sal lineal de una etapa de cromatografía de intercambio aniónico N 1° puede ser igual o inferior a la pendiente del gradiente de sal lineal de una etapa de cromatografía de intercambio aniónico N-ésimo, la pendiente del anión N-ésimo la etapa de cromatografía de intercambio es igual o menor que 0,1 M/CV y la pendiente de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico N 1° es igual o menor que 0,07 M/CV.

De acuerdo con un ilustrativo de modalidad, la elución en la etapa b) se realiza mediante el uso de un gradiente de sal de NaCl de NaCl 50 mM a NaCl 0,5 M sobre un volumen de gradiente que varía de 5 a 30 veces los volúmenes de la columna, y preferentemente de 10 a 20 veces el volumen de columna. De acuerdo con un ilustrativo de modalidad, la elución en la etapa c) se realiza mediante el uso de un gradiente de sal de NaCl de NaCl 50 mM a NaCl 0,35 M sobre un volumen de gradiente que varía de 5 a 30 veces los volúmenes de la columna, y preferentemente de 10 a 20 veces la volúmenes de columna. De acuerdo con una modalidad, en la etapa c), la primera composición enriquecida con rAAV se somete a al menos dos etapas de cromatografía de intercambio aniónico, que incluyen dos o más etapas de cromatografía de intercambio aniónico, que incluyen una pluralidad de etapas de cromatografía de intercambio aniónico. Por tanto, de acuerdo con una modalidad particular, en la etapa c), la primera composición enriquecida con rAAV puede someterse a dos etapas de cromatografía de intercambio aniónico, que incluyen dos, tres o cuatro o incluso más de cuatro etapas de cromatografía. Ventajosamente, el método puede incluir una etapa adicional de dilución de la composición enriquecida en rAAV antes o después de la al menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Una etapa de dilución puede ser, por ejemplo, en forma de una etapa de intercambio de tampón.

De acuerdo con dicha modalidad, cada etapa de cromatografía de intercambio aniónico que se realiza en la etapa c) puede ser idéntico o diferente. Preferentemente, cada etapa de cromatografía de intercambio aniónico que se realiza en la etapa c) se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal que tiene una pendiente igual o inferior a la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa b).

Si se realiza más de una etapa de cromatografía de intercambio aniónico en la etapa c), la pendiente del gradiente de sal lineal para cada etapa de cromatografía de intercambio aniónico individual puede ser idéntica o diferente.

Por tanto, de acuerdo con una modalidad, puede realizar una primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico mediante el uso de un gradiente de sal de NaCl de NaCl 50 mM a NaCl 0,35 M sobre un volumen de gradiente que varía de 5 a 30 veces los volúmenes de columna, y preferentemente de 10 a 20 veces el volumen de la columna. A continuación, se realiza una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico mediante el uso de un gradiente de sal de NaCl de NaCl 50 mM a NaCl 0,35 M sobre un volumen de gradiente que varía de 5 a 30 veces los volúmenes de columna, y preferentemente de 10 a 20 veces los volúmenes de columna.

De acuerdo con una modalidad preferida, al final de la etapa b), la primera composición enriquecida en rAAV se almacena en forma congelada hasta su uso para realizar la etapa c).

Filtración de flujo tangencial y etapas subsecuentes.

La filtración de flujo tangencial es una etapa de pulido que permite descartar impurezas relacionadas con partículas de pequeño tamaño mediante ciclos de concentración y diafiltración a través de los poros del filtro. Esta etapa de pulido tiene la otra ventaja de ser adecuada para cambiar el tampón de las fracciones eluidas y para concentrar los AAV.

La filtración de flujo tangencial se logra preferentemente mediante el uso de, como filtro, un filtro de fibra hueca. De acuerdo con una modalidad, la etapa d) se realiza mediante el uso de una membrana de filtro que tiene un valor de corte de peso molecular igual o inferior a 150 kDa, en particular que varía de 50 kDa a 150 kDa.

El experto en la materia reconocerá que el corte de peso molecular debe ajustarse en función del tipo de partícula de rAAV que se purifica, de las condiciones de elución y, en particular, del pH de elución.

De acuerdo con alguna modalidad, pueden añadir sales y/o detergentes y/o tensioactivo y/o nucleasas durante, antes o después de la filtración de flujo tangencial, en particular durante o antes de la filtración de flujo tangencial.

De acuerdo con una modalidad, el método puede incluir además una etapa de tratamiento con detergentes y/o nucleasas, incluidas las ADNasas, durante, antes o después de la filtración de flujo tangencial.

De acuerdo con una modalidad, las partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) obtenidas en la etapa c) o d) se someten a un gradiente adicional, que incluye una etapa de centrifugación diferencial, que incluye gradientes de densidad, y en particular se selecciona de: cloruro de cesio (CsCl) centrifugación en gradiente; centrifugación en gradiente de iodixanol; centrifugación en gradiente de sacarosa.

De acuerdo con una modalidad preferida, el método puede incluir además una etapa adicional de filtración de flujo tangencial después de dicho gradiente adicional.

De acuerdo con una modalidad, las partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) obtenidas en la etapa d) se esterilizan.

De acuerdo con una modalidad, las partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) se someten a una etapa de filtración estéril sobre una membrana de filtro que tiene un tamaño de poro de 0,2 pm o menos.

Caracterización de las partículas de rAAV purificadas

De manera ventajosa, el método mencionado anteriormente puede usarse para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes (rAAV) purificadas que sean adecuadas para terapia génica y/o para preparar un medicamento para terapia génica.

De acuerdo con una modalidad preferida, dichas partículas de rAAV purificadas son adecuadas para su uso en terapia génica.

La pureza de las preparaciones de partículas de virus adenoasociado (AAV) también tiene implicaciones importantes tanto para la seguridad como para la eficacia de la transferencia genética clínica.

El método usado para purificar una partícula de rAAV puede influir drásticamente en la pureza de la preparación en términos de la cantidad de contaminación de la proteína de la célula huésped y de la proporción de partículas completas/totales.

La concentración de partículas de vector puede evaluar mediante PCR cuantitativa (partículas que contienen genoma) o mediante ELISA (partículas de vector totales), como se muestra en el Ejemplo 1.

La pureza de la preparación se evalúa más comúnmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), como se muestra en el Ejemplo 1.

Las bandas correspondientes a las proteínas estructurales virales (cápside), VP1, VP2 y VP3 pueden visualizarse después de la tinción y evaluar su tamaño e intensidad relativa con respecto a las proteínas contaminantes. Como referencia, los ácidos nucleicos que codifican VP1, VP2 y VP3 que pertenecen a los serotipos AAV4 y AAV5 son de secuencias SEQ ID NO: 10 a 15. Los ácidos nucleicos que codifican VP1, VP2 y VP3 que pertenecen al serotipo AAV4 pueden ser, respectivamente, de las secuencias SEQ ID NO: 10 a 12.

Los ácidos nucleicos que codifican VP1, VP2 y VP3 que pertenecen al serotipo AAV5 pueden ser, respectivamente, de las secuencias SEQ ID NO:13 a 15.

Las secuencias mencionadas anteriormente se dan como referencias.

Por tanto, el término "pureza" se refiere a la ausencia de impurezas generales. La pureza se expresa como un porcentaje y se relaciona con la cantidad total de proteínas VP1, VP2 y VP3, en comparación con la cantidad total de proteínas detectadas en un gel de poliacrilamida teñido con azul de Coomassie.

El término "impurezas generales" se refiere a impurezas que estaban presentes en el material de partida pero que no se consideran impurezas relacionadas con partículas. Por tanto, las impurezas generales comprenden impurezas que se derivan de las células huésped pero que no son partículas de AAV.

El término "impurezas relacionadas con las partículas" se refiere a todos los tipos de partículas de AAV distintas de las partículas de AAV recombinantes auténticas. Las impurezas relacionadas con partículas incluyen cápsides AAV vacías (también conocidas como "envases", o "partículas vacías", y partículas de AAV que contienen secuencias de polinucleótidos distintas del genoma de partículas pretendido (también denominado en el presente descripción "Impurezas de ácidos nucleicos encapsulados por AAV" o "Impurezas de ADN encapsulado por AAV"). El ADN residual o el ADN de la célula huésped pueden estar presentes como contaminantes en las preparaciones de rAAV. Dado que el ADN residual puede tener efectos negativos, los fabricantes deben asegurarse de que los productos finales derivados de las células huésped contengan niveles aceptables de ADN residual.

Las pruebas de ADN residual se pueden evaluar mediante PCR cuantitativa, incluida la PCR en tiempo real, mediante el uso del protocolo descrito en el Ejemplo 1. El ADN residual se expresa en ng por dosis. Preferentemente, el ADN residual se determina mediante qPCR determinando la cantidad relativa de un ADN de amplicón E1A en la composición, en comparación con una curva estándar establecida con una cantidad conocida de ADN de amplicón E1A.

Una «dosis» se define como el volumen de preparación que corresponde a 1 *1012 vector genoma (vg).

De manera ventajosa, las composiciones descritas en la presente descripción pueden caracterizar además por su relación de partículas de rAAV vacías/partículas de rAAV completas.

Los términos "cápside vacía"y "partícula vacía" se refiere a un virión de AAV que incluye una cubierta de proteína de AAV pero que carece total o parcialmente de la construcción polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés flanqueada en ambos lados por ITR de AAV. En consecuencia, la cápside vacía no funciona para transferir el gen de interés a la célula huésped.

La proporción de partículas vacías de rAAV/partículas de rAAV llenas se puede evaluar mediante SDS-PAGE Gel, mediante el uso del protocolo descrito en el Ejemplo 1.

La concentración de partículas infecciosas también se puede evaluar mediante el uso del protocolo de ICA descrito en el Ejemplo 1.

Partículas de rAAV para uso en terapia génica

La invención se refiere además a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), para uso en terapia génica.

De manera ventajosa, dichas partículas de rAAV y sus composiciones también son adecuadas, como tales, para uso en terapia génica y/o para uso en la preparación de un medicamento adecuado para terapia génica.

Por "terapia de genes" se refiere a la administración de una secuencia de ácido nucleico a un individuo, para tratar y/o prevenir y/o reducir la probabilidad de aparición de una enfermedad. Se han propuesto varios enfoques en el Art. En vista de lo anterior, las partículas de rAAV se usan como vehículos para suministrar dicha secuencia de ácido nucleico al individuo a tratar.

Puede reemplazar un gen mutado que causa una enfermedad por una copia sana del gen.

Uno puede inactivar ("noquear") un gen mutado que no funciona correctamente.

Se puede introducir un nuevo gen en el cuerpo para tratar y/o prevenir y/o reducir la probabilidad de aparición de una enfermedad.

Los métodos y plásmidos descritos son particularmente eficaces para su uso en la preparación de un medicamento para enfermedades oculares, incluida la pérdida de visión y, más particularmente, distrofias de cono-bastón debidas a defectos específicos de bastón.

En particular, dicha enfermedad puede seleccionarse entre enfermedades relacionadas con la fosfodiesterasa 6 (PDE6), incluidas las enfermedades relacionadas con la PDE6p y las enfermedades relacionadas con la proteína de 65 kDa específica del Epitelio Pigmentario de la Retina (RPE65).

Las enfermedades relacionadas con RPE65 incluyen amaurosis congénita de Leber y retinitis pigmentaria. Las enfermedades relacionadas con la PDE6 incluyen distrofia de cono de varilla y retinitis pigmentaria.

El individuo que se va a tratar incluye seres humanos y mamíferos no humanos.

Las partículas de AAV y sus composiciones pueden administrar por vía tópica o parenteral, lo que incluye la administración intraorbital e intraocular. La administración intraocular incluye además la administración intravítrea, subretiniana e intracorneal.

Por tanto, las composiciones que comprenden dichas partículas de AAV son preferentemente adecuadas para la administración tópica o parenteral, que incluye la administración intraocular (preferentemente intravítrea y subretiniana) e intracorneal.

Las partículas de rAAV descritas en la presente descripción incluyen preferentemente un casete de expresión que codifica el gen PDE6p humano o RPE65 humano, respectivamente, de las secuencias SEQ ID NO: 1 y 7, y como se describe adicionalmente a continuación.

De acuerdo con una modalidad preferida, puede obtenerse una partícula de rAAV purificada realizando cualquiera de los métodos descritos en esta descripción. Una composición de partículas de rAAV purificada comprende al menos una de dichas partículas de rAAV purificadas. Las partículas purificadas de rAAV y sus composiciones son adecuadas para su uso en terapia génica.

Plásmidos AAV

Se describen además plásmidos de AAV para producir dichas partículas de rAAV.

Se ha descrito la construcción de viriones de AAV recombinantes infecciosos (rAAV). Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Núms. 5,173,414 y 5,139,941; Números de Publicación Internacional WO 92/01070 (publicado el 23 de enero de 1992) y WO 93/03769 (publicado el 4 de marzo de 1993); Lebkowski y otros (1988) Molec. Cell. Biol. 8: 3988 3996; Vincent y otros (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, BJ (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol e Immunol. 158:97-129; y Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801.

Por un "Plásmido AAV" se refiere a un plásmido derivado de un serotipo de virus adenoasociado, que incluye, entre otros, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8 AAV9, AAV10 y macaco rhesus-serotipos derivados, incluido AAVrhIO. Los vectores de AAV pueden tener uno o más de los genes de tipo silvestre AAV eliminados en su totalidad o en parte, preferentemente los genes rep y/o cap, pero mantienen secuencias de ITR flanqueantes funcionales. Las secuencias de ITR funcionales son necesarias para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión AAV. Por lo tanto, un plásmido de AAV se define en la presente descripción como que incluye al menos las secuencias requeridas en cis para la replicación y el empaque (por ejemplo, las ITR funcionales) del virus. Las ITR no necesitan ser las secuencias nucleotídicas de tipo silvestre y pueden alterarse, por ejemplo, mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos, siempre que las secuencias proporcionen el rescate, la replicación y el empaque funcionales. También por un "Partícula AAV" se refiere a la cubierta o cápside de proteína, que proporciona un vehículo eficiente para el suministro de un ácido nucleico al núcleo de las células objetivo.

Preferentemente, dicho vector de AAV se deriva de un virus AAV5 adenoasociado.

"Uniones auxiliares AAV" se refieren a secuencias codificantes derivadas de AAV que pueden expresarse para proporcionar productos génicos de AAV que, a su vez, funcionan en trans para la replicación productiva de AAV. Por lo tanto, las funciones auxiliares de AAV incluyen los dos marcos de lectura abiertos (ORF) principales de AAV, rep y cap. Se ha demostrado que los productos de expresión de Rep poseen muchas funciones, que incluyen, entre otras: reconocimiento, unión y corte del origen de replicación del ADN de AAV; actividad de ADN helicasa; y modulación de la transcripción de promotores AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión cap proporcionan las funciones de embalaje necesarias. Las funciones auxiliares de AAV se usan en la presente descripción para complementar las funciones de AAV en trans que faltan en los plásmidos de AAV.

El término "Construcción auxiliar de AAV" se refiere generalmente a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proporcionan funciones de AAV eliminadas de un plásmido de AAV que se va a usar para producir un plásmido de transducción para el suministro de una secuencia de nucleótidos de interés. Las construcciones auxiliares de AAV se usan comúnmente para proporcionar una expresión transitoria o estable de los genes rep y/o cap de AAV para complementar las funciones de AAV faltantes que son necesarias para la replicación de AAV; sin embargo, las construcciones auxiliares carecen de ITR AAV y no pueden replicarse ni empaquetarse por sí mismas. Las construcciones auxiliares de AAV pueden estar en forma de plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se han descrito varias construcciones auxiliares de AAV, tales como los plásmidos pAAV/Ad y pIM29 45 de uso común que codifican productos de expresión tanto Rep como Cap. Ver por ejemplo, Samulski y otros (1989) J. Virol. 63: 3822-3828; y McCarty y otros (1991) J. Virol. 65:2936-2945. Se han descrito varios otros plásmidos que codifican productos de expresión Rep y/o Cap. Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Núm. 5,139,941 y 6,376,237.

El término "transfección" se usa para referirse a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Generalmente se conocen en la técnica varias técnicas de transfección. Ver, por ejemplo, Graham y otros (1973) Virología, 52: 456, Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), Davis y otros (1986) Métodos básicos en biología molecular, Elseviery Chu y otros (1981) Gene 13:197. Dichas técnicas pueden usar para introducir uno o más porciones de ADN exógeno en las células huésped adecuadas.

Un "ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de polinucleótidos" se refiere a una secuencia de ADN o ARN. El término comprende secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin limitarse a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracil-, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido buracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

Una "secuencia codificante" o una secuencia que “codifica” un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo terminal 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo terminal 3' (carboxilo). Una secuencia de terminación de la transcripción puede ubicarse 3' a la secuencia codificante.

El término ADN "Secuencias de control" se refiere colectivamente a las regiones promotoras, las señales de poliadenilación, las secuencias de terminación de la transcripción, los dominios reguladores corriente arriba, los orígenes de replicación, los sitios internos de entrada de ribosomas ("IRES"), los potenciadores, y similares, que permiten colectivamente para la replicación, la transcripción y la traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No todas estas secuencias de control se requieren siempre que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula huésped adecuada. El término "promotor" se usa en la presente descripción en su sentido corriente para referirse a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, en donde la secuencia reguladora se deriva a partir de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante corriente abajo (dirección 3'). Los promotores pueden incluir "promotores induábles"(donde la expresión de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente al promotor se induce por un analito, cofactor, proteína reguladora, etcétera), "promotores reprimibles" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente al promotor se reprime por un analito, cofactor, proteína reguladora, etcétera) y "promotores constitutivos".

El término "heterólogo" indica secuencias que normalmente no están unidas entre sí y/o que normalmente no están asociadas con una célula en particular. Así, un "heterólogo" La región de una construcción de ácido nucleico o un plásmido es un segmento de ácido nucleico dentro o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra asociado con la otra molécula en la naturaleza. El transgén que compren del ácido nucleico heterólogo puede codificar varios productos útiles. Estos pueden incluir ARNip, moléculas no codificante y miARN, por ejemplo. Alternativamente, los transgenes pueden codificar hormonas y factores de crecimiento y diferenciación. Los plásmidos de AAV pueden diseñarse para que lleven una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés (por ejemplo, un gen seleccionado que codifica una proteína terapéutica, una molécula de ácido nucleico no codificante, una ribozima, un miARN o similares) eliminando, en su totalidad o en parte, la porción interna del genoma de AAV e insertando la secuencia de ADN de interés entre los ITR. Las ITR siguen siendo funcionales en dichos plásmidos, lo que permite la replicación y el empaquetamiento del rAAV que contiene la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. La secuencia de nucleótidos heteróloga también está típicamente ligada a una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión génica en las células objetivos del paciente en determinadas condiciones. Las señales de terminación, como los sitios de poliadenilación, también pueden incluirse en el plásmido.

El término "casete de expresión" se refiere a una secuencia de ácido nucleico de ADN que incluye al menos un gen de interés, un marco de lectura abierto y una región no traducida 3' que, en eucariotas, normalmente contiene un sitio de poliadenilación.

De acuerdo con una forma de modalidad general, un casete de expresión puede comprender, o consistir en, una secuencia de ácido nucleico de ADN que tiene la fórmula general:

[5'ITR] -[Gen de interés] -[PolyA]^z-[3'ITR] -donde [5'ITR] y [3'ITR] son repeticiones terminales invertidas (ITR),

en donde [Gen de interés] es cualquier gen que codifica una proteína de interés,

donde [PolyA] es una señal de poliadenilación con z siendo 0 o 1, y

en donde cada uno de [5'ITR], [Gen de interés], [PolyA] y [3'ITR], puede separarse opcionalmente por una secuencia de enlazador adicional.

En el sentido de la presente en la presente descripción, un "gen que codifica una proteína de interés" comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés, y preferentemente al menos un promotor.

Preferentemente, el gen de interés es un ácido nucleico que codifica PDE-6p humana o RPE65 humana. De acuerdo con una modalidad, el plásmido AAV comprende un casete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica PDE-6p humana, de SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con una modalidad alternativa, el plásmido AAV comprende un casete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica RPE65 humano, de SEQ ID NO: 7.

De acuerdo con una modalidad particular, el plásmido AAV comprende un ácido nucleico que codifica la PDE6-p humana, de SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con una modalidad particular, el plásmido AAV comprende un ácido nucleico que codifica RPE65 humano, ^{de SEQ ID NO: 7. De acuerdo con una modalidad, [5'ITR] y}[3'iTr] ^{son repeticiones terminales invertidas derivadas de}AAV-2, en particular repeticiones terminales invertidas, respectivamente, de las secuencias SEQ ID NO: 3 y 4.

Ventajosamente, el plásmido de AAV incluye un sitio de poliadenilación, una ITR derivada de AAV2 y un casete de expresión que codifica la PDE6-beta humana.

Preferentemente, la expresión del gen de la PDE6-beta humana está bajo el control del promotor de la rodopsina quinasa, preferentemente de la secuencia SEQ ID NO: 5.

De acuerdo con una modalidad alternativa, el plásmido AAV incluye un sitio de poliadenilación, un ITR derivado de AAV2 y un casete de expresión que codifica RPE65 humano. Preferentemente, la expresión del gen RPE65 humano está bajo el control del promotor RPE65, preferentemente de la secuencia SEQ ID NO: 8.

De acuerdo con una modalidad, la señal de poliadenilación se deriva de la hormona de crecimiento bovino (bGH), preferentemente de secuencia SEQ ID NO: 6.

Las modalidades mencionadas anteriormente pueden considerarse individualmente o en combinación. De acuerdo con una de las formas de modalidad más preferidas, el plásmido AAV comprende un casete de expresión que comprende una codificación nucleica para PDE6p como se describe anteriormente y como se ilustra en la figura 1A.

De acuerdo con una modalidad alternativa, el plásmido AAV comprende un casete de expresión que comprende una codificación nucleica para RPE65 como se describe anteriormente y como se ilustra en la figura IB.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Cromatografía de intercambio aniónico en dos etapas para purificar partículas de rAAV5.

A. Materiales y Métodos

A1. Cosecha del lisado celular.

Las células transfectadas se recolectan a las 96 /- 5 horas después de la transfección golpeando las CellStacks 10 (CS10) en todos los lados. La suspensión completa se transfiere a un contenedor de bioprocesos (BPC). La mayor parte de la partícula viral se libera en el sobrenadante.

A2. Clarificación del lisado celular.

La suspensión completa obtenida con 20 CS10 se filtra a través de un filtro de profundidad Millipore Polysep II 1/0,5 pm -30"- a un caudal de 1200 ml/min, para descartar los restos celulares. Al final de la etapa de filtración, la unidad de filtración se vacía presionando con aire. La unidad de filtración se enjuaga con 15 L de tampón Tris 20 mM, MgCh 2 mM, CaCl²1 mM, pH 9, que se combina con el lisado filtrado. Este es el lisado clarificado. Durante esta etapa también se descarta una gran parte del ADN y las proteínas solubles. Para ajustar los parámetros (pH y conductividad) a las condiciones de unión adecuadas, el lisado clarificado se diluye con 30 l de tampón Tris 20 mM, MgCl.²2 mM, CaCh 1 mM, pH 8,5. Los parámetros críticos (pH y conductividad) se controlan, en comparación con el tampón de inyección (pH 8,5, conductividad 6 /-1 mS).

Se determinó que estas condiciones eran óptimas para la unión del vector AAV5 a esta columna.

A3. 1^raetapa de purificación por cromatografía de intercambio aniónico.

Esta etapa se realiza con un Akta Pilot (GE Healthcare) controlado por un software Unicorn. Se inyectan 67 L de producto diluido en un BPC de 100 L a un caudal de 400 ml/min a través de un Monolith CIMmultus QA - 800 ml- equilibrado con tampón 1: Tris 20 mM, NaCl 50 mM, MgCl22 mM, CaCl2 1 mM, pH 8,5. Durante esta etapa, el AAV y algunas impurezas se unen a la columna. Una gran cantidad de impurezas no se une a la columna y se descarta en el flujo. Para lavar las partículas unidas inespecíficas, la columna se enjuaga con 15 CV (volumen de columna) de tampón 1. La etapa de elución es un gradiente de sal de NaCl con una pendiente muy poco profunda que es el resultado de la mezcla tampón2 (Tris 20 mM, NaCl 50 mM, MgCh 2 mM, CaCl²1 mM, pH 8,0) con tampón 3 (Tris 20 mM, NaCl 1 M, MgCh 2 mM, CaCl²1 mM, pH 8,0). La pendiente del gradiente es adecuada para obtener el 50 % del tampón 3 en 15 CV. El lento aumento de la sal permite eluir gradualmente el AAV y otras impurezas.

La elución de las especies unidas a la columna (incluido el AAV) se realiza a pH 8,0, en oposición a la unión a pH 8,5. Este pH se ajustó para mantener la infecciosidad del vector durante el almacenamiento por congelación entre las etapas de purificación (el pH 8,5 fue particularmente perjudicial para la infecciosidad de AAV5).

Las fracciones eluidas se recogen en botellas de polipropileno y se almacenan a <-65 °C, o incluso <-80 °C, hasta la siguiente etapa (normalmente alrededor de una semana). Durante este tiempo, las fracciones recogidas se examinan para detectar la presencia de partículas virales.

A4. 2^daetapa de purificación por cromatografía de intercambio aniónico.

El 2^dola etapa de cromatografía es similar al primero, excepto que el gradiente es menos profundo. El efecto de esta etapa es separar aún más el AAV de las impurezas.

Fracciones seleccionadas del 1^raetapa cromatográfica, que contiene partículas de AAV se reúnen (1,5 a 2 L). Para ajustar los parámetros (pH y conductividad) a las condiciones de unión adecuadas, el conjunto de fracciones se diluye con 4 l de Tris 20 mM, MgCl.²2 mM, CaCl²1 mM, pH 8,5 y 21 de Tris 20 mM, NaCl 50 mM, MgCh 2 mM, CaCl²1 mM, pH 8,5. Los parámetros se controlan en comparación con el tampón 1. Todas las etapas del 1^roSe repiten las separaciones cromatográficas con la misma columna monolito CIMmultus QA - 800 ml, excepto que la elución es un gradiente para obtener 30 % de tampón 3 en 15 CV. Las fracciones eluidas se recogen en botellas de polipropileno y se almacenan a < 65 °C, o incluso <-80 °C, hasta la siguiente etapa de purificación (generalmente alrededor de 2 semanas). Durante este tiempo, las fracciones recogidas se examinan para detectar la presencia de partículas virales.

A5. Filtración de flujo tangencial (TFF).

Fracciones seleccionadas de las 2do la etapa cromatográfica que contiene AAV se agrupa (alrededor de 1 l). El TFF se realiza mediante el uso de una fibra hueca mPES con un corte de 100 KDa. El AAV se diafiltra y se concentra frente a la solución salina ocular (SS0).

Las fracciones agrupadas se concentran primero ligeramente, se diafiltran frente a 10 volúmenes de tampón y finalmente se concentran para alcanzar la concentración esperada. TFF permite descartar las impurezas restantes de tamaño pequeño, así como formular el vector viral en el tampón adecuado para inyectar y concentrar al nivel adecuado. El vector viral filtrado, purificado y concentrado se almacena a < -65 °C, o incluso < -80 °C hasta la titulación.

A6. Filtración estéril.

El AAV se diluye con SOS (Solución Ocular Salina) para obtener la concentración precisa necesaria para la inyección a los pacientes y se esteriliza con un filtro PES de 0,2 pm antes de ser alícuotas en el recipiente final De acuerdo con el volumen esperado. Las dosis se almacenan a <- 65 °C, o incluso <-80 °C hasta la inyección.

A7. Concentración del genoma del vector por qPCR (vg/ml)

Este método consiste en la determinación de partículas que contienen genoma mediante PCR cuantitativa (qPCR) dirigida al casete de expresión del transgén (el transgén, el poli (A), el ITR o el promotor). Las muestras de rAAV se digieren primero con DNasa para eliminar el ADN no encapsulado. Posteriormente, un tratamiento con Proteinasa K degrada las cápsides de AAV y libera el ADN viral para la cuantificación subsecuente de qPCR.

El vector plásmido que contiene el amplicón objetivo se usa para generar la curva estándar para la qPCR. Este plásmido se linealiza mediante digestión con endonucleasas de restricción, se divide en alícuotas y se almacena a < -18 °C para asegurar la estabilidad y reproducibilidad de la curva estándar en cada ensayo.

El cálculo de 1a10 copias de amplicón se basan en la siguiente fórmula:

Cantidad de ADN (g) = (660 x tam año del plásmido (bp) x l e10 copias) / (6,02

x 10e23 ) '

La cantidad relativa de ADN del genoma del vector se asigna extrapolando el número de copias por reacción a partir de la curva estándar que contiene una cantidad conocida de ADN de amplicón.

Los resultados se informan en genoma de vector por ml.

A8. Concentración de partículas infecciosas por ICA (ip/ml)

El Ensayo del Centro Infeccioso (ICA) permite la cuantificación de partículas infecciosas en un lote de rAAV. Este ensayo implica la infección de una línea celular permisiva que porta de manera estable el AAV2 rep y cap secuencias (HeLaRC32, ATCC CRL-2972) con diluciones en serie crecientes del vector rAAV y con adenovirus de tipo silvestre (tipo 5). Por tanto, las partículas infecciosas de rAAV que entren en las células podrán replicarse. Los eventos de replicación luego se detectan por quimioluminiscencia y se cuantifican después de la hibridación con una sonda específica del transgén (Salvetti y otros, Hum Gene Ther, 1998).

Veintiséis horas después de la infección, las células se recogen, se lisan y se transfieren a una membrana de nailon. Se realiza una hibridación con una sonda transgénica específica marcada con fluoresceína. A continuación, la señal se amplifica con un anticuerpo anti-fluoresceína acoplado con fosfatasa alcalina y se detecta por quimioluminiscencia.

Finalmente, los eventos de replicación se cuantifican contando puntos después de la revelación en una película radiográfica.

A9. Concentración de partículas vectoriales por ELISA (vp/ml)

La concentración total de la cápside de AAV5 de rAAV se determina mediante un método ELISA tipo sándwich disponible comercialmente de Progen (Cat. # PRAAV5)

Se usa un inmunoensayo enzimático de placa de microvaloración único para la cuantificación de viriones AAV5 recombinantes o cápsides vacías ensambladas e intactas del virus Adenoasociado 5. El anticuerpo de captura detecta un epítopo conformacional que no está presente en las proteínas de la cápside no ensambladas.

El medicamento se diluye primero y se aplica a los pocillos recubiertos con el anticuerpo monoclonal. Las partículas de AAV5 capturadas se detectan luego mediante la adición de un anticuerpo monoclonal conjugado con biotina, seguido de un conjugado de estreptavidina peroxidasa y el sustrato cromogénico TMB (tetrametilbencidina). El producto de reacción de color resultante, que es proporcional a las partículas de la cápside intactas unidas específicamente, se mide fotométricamente a 450 nm.

La concentración de cápsides de AAV5 presentes en la muestra se extrapola de una curva estándar, se corrige para el factor de dilución apropiado y se informa en partículas de vector por ml.

A10. Pureza e identidad de la cápside del vector mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie.

El método SDS-PAGE es una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes que separa las proteínas y los demás componentes de la muestra en función de su peso molecular y sus cargas.

Después de la electroforesis, el gel se tiñe con azul de Coomassie (Imperial Protein Stain) para cuantificar solo las proteínas en las muestras. La identidad proteica del rAAV se confirma por la presencia de las tres proteínas de la cápside del AAV denominadas VP1, VP2 y VP3. La pureza proteica de rAAV se calcula como una cantidad relativa de proteínas de la cápside en comparación con la cantidad total de proteínas presentes en la muestra.

El gel de electroforesis se analiza después de la tinción con azul de Coomassie mediante un analizador de imágenes luminiscentes con una cámara CCD. Cada banda de proteína se detecta como un pico y el analizador integra la señal. Luego se calcula el área de cada pico; un producto 100 % puro contiene solo las tres bandas de proteínas VP1, VP2 y VP3.

A11. Cuantificación de partículas vectoriales mediante SDS-PAGE y tinción con plata

La tinción de plata, basada en la metodología de Heukeshoven y Dernick (Electroforesis de Heukeshoven y Dernick, 1985), permite la detección de proteínas y ácidos nucleicos separados por electroforesis en gel de poliacrilamida.

La muestra se carga en el mismo gel que el rAAV usado para la curva estándar. La curva estándar se genera mediante el uso de un lote rAAV de referencia, producido y caracterizado de la misma forma que el rAAV8RSM (Ayuso y otros, Hum Gene Ther. 2014) y contiene 100 % de partículas completas.

Después de la electroforesis, el gel se analiza mediante un analizador de imágenes con cámara CCD, y la señal de la banda correspondiente a VP3 se integra para cada carril. La cantidad de cápsides totales presentes en la muestra se extrapola de la curva estándar y se informa en partículas por ml.

La proporción de partículas completas/totales se basa en el siguiente cálculo: Título en el genoma del vector por ml/título en partículas por ml.

Para referencia: Método simplificado para la tinción con plata de proteínas en geles de poliacrilamida y el mecanismo de tinción con plata. (Electroforesis 6 (1985) 103-112, Heukeshoven, J. y Dernick, R.) y Fabricación y caracterización de un material estándar de referencia de tipo 8 de virus asociado recombinante, Ayuso et al, (Hum Gene Ther. 2 de octubre de 2014).

A12. ADN residual de la célula huésped por qPCR (albúmina y E1A de células HEK 293)

El ADN de la célula huésped humana residual se determina mediante el uso de un método de PCR cuantitativa en tiempo real dirigido a los genes E1A de albúmina humana o adenovirus tipo 5.

Se usa un plásmido que contiene los amplicones específicos (albúmina y E1A) para generar la curva estándar para la qPCR. Este plásmido se linealiza mediante digestión con endonucleasas de restricción, se llena y se almacena a < -18 °C para asegurar la estabilidad y reproducibilidad de la curva estándar en cada ensayo. El cálculo de 1a10 copias de la secuencia del gen de la albúmina se basan en el siguiente cálculo:

Cantidad de ADN (g) = (660 x tamaño del plásmido (bp) x l e10 copias) /

(6,02 x 10e23)

La cantidad relativa de ADN de amplicón de albúmina o E1A se asigna por extrapolación del número de copias por reacción de la curva estándar que contiene una cantidad conocida de ADN de amplicón de albúmina o E1A.

Se realiza una segunda curva estándar con ADN genómico de la línea celular HEK293, de 50 pg a 5 ng por pocillo. Esta curva estándar indica la correlación entre la cantidad de albúmina o copia E1A y la cantidad correspondiente en ng de HEK293

ADN.

B. Resultados

B1. Desarrollo en lotes a gran escala

Cifras 3A y 3B ilustran el perfil de elución de un sobrenadante clarificado que contiene partículas de AAV5, respectivamente de una primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico (ver figura 3A) y de una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico (ver figura 3B).

El método de purificación se logra a gran escala (22 L). La titulación del genoma del vector en cada etapa y la caracterización del producto final se establecen de acuerdo con los protocolos antes mencionados y se resumen en las siguientes tablas:

T l 1: i l i n l n m l v r l r n l 22 L)

T l 2: r riz i n l r fin l

Conclusión: este protocolo es reproducible y eficiente para purificar preparaciones de AAV5 de grado clínico a partir de sobrenadantes clarificados a gran escala y con buenos rendimientos. Ventajosamente, el 2do La etapa consecutiva de cromatografía en columna de intercambio aniónico solo tiene un impacto moderado en el título del genoma del vector. B2. Solicitud a diferentes vectores virales AAV5

Este proceso se aplicó a diferentes vectores virales AAV5, que contienen diferentes transgenes. Se produjeron y purificaron dos lotes a pequeña escala de 2,2 litros para cada AAV5 (3 transgenes diferentes), en las mismas condiciones que las descritas anteriormente en la sección Material y métodos.

Los resultados se resumen en la Tabla 3 más abajo. Todos los vectores son puros en> 90 %.

T l : R l n m l v r ni 2 l ñ l r v r

Conclusión: la robustez del proceso lo hace aplicable a diferentes serotipos de AAV5 que contienen diferentes transgenes con la misma calidad de producto final.

Ejemplo 2: Cromatografía de intercambio aniónico en dos etapas para purificar partículas de rAAV4.

A. Materiales y Métodos

A1. Cosecha del lisado celular.

Las células transfectadas se recolectan a las 97 horas después de la transfección golpeando el CellStack (CS10) en todos los lados. Toda la suspensión se trata con Triton X-100 (1 % v/v final) durante una hora a temperatura ambiente para liberar partículas de las células (80 % de AAV en el sobrenadante antes del tratamiento, 98 % después del tratamiento) y para facilitar la etapa de filtración profunda (mejor recuperación de la etapa de filtración profunda).

A2. Clarificación del lisado celular.

La suspensión de células obtenida se filtra a través de un filtro de profundidad Millipore Polysep II 1/0,5 |jm - 2 ”- a un caudal de 90 ml/min, para descartar los restos celulares. Al final de la etapa de filtración, la unidad de filtración se vacía presionando con aire. La unidad de filtración se enjuaga con 600 ml de tampón Tris 20 mM, MgCh 2 mM, CaCl²1 mM, pH 8, que se combina con el lisado filtrado. Este es el lisado clarificado. Durante esta etapa también se descarta una gran parte del ADN y las proteínas solubles. Para ajustar los parámetros (pH y conductividad) a las condiciones de unión adecuadas, el lisado clarificado se diluye con 1,41 de tampón Tris 20 mM, MgCl.²2 mM, CaCl²1 mM, pH 8. Los parámetros críticos (pH y conductividad) se controlan, en comparación con el tampón de inyección (pH 8,0, conductividad 6 /-1 mS).

A3. 1^raetapa de purificación por cromatografía de intercambio aniónico.

Esta etapa se realiza con un Akta Pilot (GE Healthcare) controlado por un software Unicorn. Se inyectan 3 L de producto diluido a un caudal de 100 ml/min a través de un Monolith CIMmultus QA - 80 ml- equilibrado con tampón 1: Tris 20 mM, NaCl 50 mM, MgCl22 mM, CaCl2 1 mM, pH 8. Durante esta etapa, el AAV y algunas impurezas se unen a la columna. Una gran cantidad de impurezas no se une a la columna y se descarta en el flujo. Para lavar las partículas unidas inespecíficas, la columna se enjuaga luego con tampón 1 hasta un nivel estable de absorbancia. La etapa de elución es un gradiente de sal de NaCl con una pendiente muy poco profunda que es el resultado de mezclar tampón 1 con tampón2 (Tris 20 mM, NaCl 350 mM, MgCh 2 mM, CaCl²1 mM, pH 8). La elución se realiza para obtener el 100 % del tampón 2 en 10 CV. El lento aumento de la sal permite eluir gradualmente el AAV y otras impurezas.

Las fracciones eluidas se recogen en tubos de polipropileno y se almacenan a <-80 °C hasta la siguiente etapa. Las fracciones recogidas se analizan para detectar la presencia de partículas virales.

A4. 2^daetapa de purificación por cromatografía de intercambio aniónico.

Fracciones seleccionadas del 1^raetapa cromatográfica, que contiene las partículas de AAV se combinan (350 ml). Para ajustar los parámetros (pH y conductividad) a las condiciones de unión correctas, el conjunto de fracciones se diluye con 900 ml de Tris 20 mM, MgCl.²2 mM, CaCl²1 mM, pH 8. Los parámetros se controlan en comparación con el tampón 1. Todos las etapas del 1^roSe repiten las separaciones cromatográficas con la misma columna monolito CIMmultus QA - 80 ml, excepto que la elución es un gradiente para obtener el 100 % del tampón 2 en 40 CV. Las fracciones eluidas se recogen en botellas de polipropileno y se almacenan a <-80 °C hasta la siguiente etapa de purificación. Las fracciones recogidas se analizan para detectar la presencia de partículas virales.

A5. Filtración de flujo tangencial (TFF).

Fracciones seleccionadas de las 2^dola etapa cromatográfica que contiene AAV se agrupa (alrededor de 700 ml). El TFF se realiza mediante el uso de una fibra hueca de mPES con un corte de 50 KDa. El AAV se diafiltra y se concentra frente a la solución salina ocular (SOS).

Las fracciones agrupadas se concentran primero ligeramente, se diafiltran frente a 10 volúmenes de tampón y finalmente se concentran para alcanzar la concentración esperada. El vector viral filtrado, purificado y concentrado se almacena a < 80 °C hasta la titulación.

B. Resultados

Los resultados obtenidos para AAV4 de este ejemplo se resumen en la tabla 4 a continuación. La titulación del genoma del vector en cada etapa se establece de acuerdo con el protocolo mencionado anteriormente.

T l 4: i l i n l n m l v r

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas, que comprende las etapas de:

a) realizar una filtración profunda de un material de partida obtenido previamente a partir de células que producen partículas de rAAV, dicho material de partida comprende un lisado celular y/o un sobrenadante de cultivo, de manera que se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV;

b) ajustar el pH de la composición clarificada que contiene rAAV a un pH básico para asegurar una retención óptima de las partículas de rAAV en el soporte cromatográfico usado en la etapa c);

c) someter la composición clarificada que contiene rAAV de la etapa b) a una primera etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico, en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV, de manera que se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV;

d) someter la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico en donde la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal lineal y en donde se recoge la fracción que contiene rAAV, de manera que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV;

e) someter la segunda composición enriquecida con rAAV a una etapa de filtración de flujo tangencial, de manera que se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas,

en donde dicho método no comprende ni una etapa de cromatografía de apatita ni una etapa de cromatografía de intercambio catiónico, y

en donde dichas partículas de rAAV pertenecen a un serotipo de cápside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV5, AAV8, AAV9 y AAV2.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en la etapa c), la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal de NaCl de NaCl 50 mM a NaCl 0,5 M en un volumen de gradiente que varía de 5 a 30 veces el volumen de la columna, y preferentemente de 10 a 20 veces el volumen de la columna.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa d) es igual o inferior a la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa c).
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde en la etapa d), la elución se realiza mediante el uso de un gradiente de sal de NaCl de NaCl 50 mM a NaCl 0,35 M en un volumen de gradiente que varía de 5 a 30 veces el volumen de la columna.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde soporte cromatográfico en la etapa c) y/o en la etapa d) es un soporte cromatográfico monolítico.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la etapa e) se realiza mediante el uso de una membrana de filtro que tiene un valor de corte de peso molecular que varía de 50 kDa a 150 kDa.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las partículas de rAAV consisten en partículas de rAAV5 que contienen ADN que comprende un casete de expresión que codifica la PDE6-beta humana.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dichas partículas de rAAV purificadas son adecuadas para su uso en terapia génica.