ES2840323T3 - Variantes de péptidos dirigidos a tumores - Google Patents

Abstract

Un péptido que se une selectivamente a la integrina αvβ6, teniendo el péptido una secuencia de aminoácidos que comprende el motivo X1BnRGDLX2X3X4ZmX5 (SEQ ID NO: 3), en donde X1 es D-Asn, Bn es una secuencia de cualquier número n de aminoácidos, que pueden ser naturales o no naturales, D- o L-, y pueden ser iguales o diferentes, en donde n es un número entre 1 y 10, X2 y X3 se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido, X4 es Leu o Ile, Zm es una secuencia de cualquier número m de aminoácidos, que pueden ser naturales o no naturales, D- o L-, y pueden ser iguales o diferentes, en donde m es un número entre 1 y 10 y en donde X5 es cualquier L- o D-aminoácido.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de péptidos dirigidos a tumores

Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes de péptidos, conjugados y composiciones farmacéuticas de los mismos y a su uso en medicina, incluyendo el tratamiento de cáncer y la obtención de imágenes de tumores.

Antecedentes de la invención

Las integrinas son moléculas heterodiméricas ap que abarcan una gran familia de receptores de superficie celular implicados en varios procesos clave, incluida la adhesión, invasión, proliferación y apoptosis celular [23]. En los seres humanos hay 24 miembros de los cuales 8 clases reconocen sustratos a través de un motivo tripeptídico altamente conservado Arg-Gly-Asp, presente en ligandos extracelulares tales como fibronectina y vitronectina [27]. La integrina avp6 se expresa a niveles altos en numerosos cánceres [4-9] tales como el oral, de cabeza y cuello, pancreático, de ovario y de mama y el aumento del nivel de expresión de la integrina avp6 se ha correlacionado con la progresión tumoral. La integrina avp6 también puede promover la fibrosis [11] y algunas infecciones víricas, incluida la fiebre aftosa [28]. Como tal, la integrina avp6 es una diana importante [29-30] para la obtención de imágenes, diagnósticos y terapia en el campo de la oncología y más allá.

A20FMDV2 (H2N-1NAVPNLRGDLQVLAQKVAR20T-OH) (SEQ ID NO: 1) es un péptido lineal de 20 restos derivado de la proteína vírica del virus de la fiebre aftosa [1-3, 10]. Se ha demostrado que este péptido muestra una alta selectividad y afinidad por avp6, un receptor transmembrana de integrina que está altamente expresado en las células cancerosas [4-9]. A20FMDV2 se une a avp6 a través del tripéptido RGD del fragmento 7RGDLQV13L (SEQ ID NO: 2) y los dos restos de leucina presentes en el fragmento RGD^lQ^v L potencian la unión del péptido al receptor a través de interacciones hidrófobas [10] y también se estabiliza mediante una hélice a generada a partir del motivo peptídico carboxiterminal 10Leu-20Thr [1]. Además, A20FMDV2 es un agente de obtención de imágenes eficaz para avp6 en fibrosis pulmonar cuando se combina con indio radiactivo (111In) [24]. El péptido marcado con [18F]fluorobenzoilo, [18F]FBA-A20FMDV2, ha encontrado uso como radiotrazador PET en ensayos clínicos en seres humanos [25].

A20FMDV2 se ha utilizado en tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés) para aplicaciones de diagnóstico por imagen [31] mediante la conjugación con ácido 4-[18F] fluorobenzoico (FBA) (o derivados) [32-34], y el marcado con 64Cu usando péptido A20FMDV2 que incorpora un quelante de metales tal como DOTA [35-37]. Recientemente, [18F]-FBA-A20FMDV2 ha avanzado a un entorno clínico [25] en el régimen de tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática [24] mientras que se ha demostrado que un derivado de A20FMDV2 marcado con 111In es altamente específico para la obtención de imágenes de cáncer de mama que expresa la integrina avp6 usando tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT, por sus siglas en inglés) [9]. Estos estudios describen la importancia de A20FMDV2 para las herramientas de diagnóstico en curso dirigidas a la integrina avp6 y respalda avp6 como una diana terapéutica válida.

El documento WO2007/039723 describe ligandos peptídicos de avp6, variantes funcionales de los mismos y ácidos nucleicos que los codifican, así como su uso en el tratamiento y la obtención de imágenes de enfermedades mediadas por avp6, incluyendo cáncer.

Desafortunadamente, el valor terapéutico de A20FMDV2 está limitado por su corta semivida en sangre causada, en parte, por su alta susceptibilidad a las proteasas séricas, tal como las endo y exopeptidasas, según se determina en estudios de plasma en ratones [13].

Un método indicado para mejorar las semividas de péptidos (y proteínas) susceptibles es la introducción de polietilenglicol (PEG) [38]. Hausner et al. prepararon versiones pEGiladas de 4-[18F]-FBA-A20FMDV2, mediante la colocación de uno o dos restos PEG28 en el extremo N [13] o un único PEG28 en los extremos tanto N como C [39] y concluyeron que un derivado de A20FMDV2 biPEGilado terminal, [18F]-FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28 mostraba la farmacocinética más favorable. La ciclación de cabeza a cola de los péptidos lineales es también un método bien establecido para minimizar la degradación por exopeptidasas [40]; sin embargo, se requiere una experimentación cuidadosa para evitar reacciones secundarias no deseadas teles como la polimerización o la racemización.

Sin embargo, sigue existiendo una necesidad insatisfecha de péptidos dirigidos a tumores con una potente actividad de unión, captación celular y semividas plasmáticas prolongadas. La presente invención aborda estas y otras necesidades.

Breve descripción de la invención

En términos generales, la presente invención se refiere a variantes del péptido A20FMDV2 que se ha encontrado inesperadamente que muestran una actividad de unión a avp6 potenciada en estudios celulares y, en algunos casos, una captación celular potenciada en comparación con el péptido A20FMDV2. En particular, como se describe con más detalle en el presente documento, se ha descubierto que tales variantes del péptido muestran una biodistribución potenciada en tumores de xenoinjerto que expresan avp6 (en relación con los tumores de xenoinjerto de control que carecen de expresión de avp6) en comparación con un péptido A20FMDV2 de control, según se evalúa por versiones de los péptidos correspondientes marcadas con 111In. Por lo tanto, dichas variantes de péptidos tienen un gran potencial como agentes quimioterapéuticas de suministro dirigidos a tumores y agentes para obtención de imágenes de tumores.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un péptido que se une selectivamente a la integrina avp6, teniendo el péptido una secuencia de aminoácidos que comprende el motivo XiBnRGDLX2X3X4ZmX5 (SEQ ID D-Asn NO: 3), en donde Xi es D-Asn Bn es una secuencia de n aminoácidos cualquiera, que pueden ser naturales o no naturales, D- o L-, y pueden ser iguales o diferentes, en donde n es un número entre 1 y 10, X2 y X3 se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido, X4 es Leu o Ile, Zm es una secuencia de m aminoácidos cualquiera, que pueden ser naturales o no naturales, D- o L-, y pueden ser iguales o diferentes, en donde m es un número entre 1 y 10, X5 es cualquier L- o D-aminoácido.

En algunas realizaciones, la longitud del péptido es de al menos 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, la longitud del péptido no es más de 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 o no más de 20 aminoácidos. En determinadas realizaciones la longitud del péptido es entre 17 y 25 aminoácidos, p. ej., entre 19 y 21 aminoácidos. En realizaciones particulares, la longitud del péptido es de 20 aminoácidos.

En la presente invención X1 es D-Asn. Como se muestra en las tablas 2 y 3 y en las Figuras 3 y 4 en el presente documento, los péptidos ilustrativos en donde X1 es D-Asn (péptidos 19, 21, 25 y 26) mostraron una actividad relativa superior (tabla 2), alta biodistribución en un tumor que expresa avp6 (tabla 3 y figura 4) y buena estabilidad en plasma (figura 3).

En algunos casos X5 es L-Thr o D-Thr.

En algunos casos X4 es L-Leu.

En algunos casos, n es 5. En algunos casos m es 6. En determinados casos, n es 5 y m es 6.

En algunos casos Bn es AVPNL (SEQ ID NO: 4), KVPNL (SEQ ID NO: 5) o K (biotina) VPNL. Cuando Bm es K (biotina) VPNL, la biotina puede ser D-biotina fijada a la cadena lateral de lisina.

En algunos casos Zm es AQKVAR (SEQ ID NO: 6).

En determinados casos, la secuencia de aminoácidos del péptido se selecciona del grupo que consiste en:

H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (SEQ ID NO: 7);

H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (SEQ ID NO: 8);

H2N-[D-Asn]-K(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (SEQ ID NO: 8);

H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (SEQ ID NO: 9);

H2N-[D-Asn]-K(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (SEQ ID NO: 9); y

H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (SEQ ID NO: 10).

En particular, el péptido puede ser:

H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (SEQ ID NO: 7).

En determinados casos, el péptido puede estar modificado terminalmente en el extremo N o C. Por ejemplo, el péptido puede estar N-acetilado y/o C-amidado.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un conjugado que comprende un péptido del primer aspecto de la invención conjugado directamente, o mediante un enlazador, a un resto terapéutico, un polímero, un polipéptido y/o un resto detectable.

En algunas realizaciones, el péptido está conjugado con un resto terapéutico que comprende un agente anticanceroso.

En algunas realizaciones, el agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en: una auristatina, un maitansinoide, una tubulisina, duocarmicina, caliqueamicina, alfa-amanitina, una pirrolobenzodiazepina (PBD), irinotecán y una indolcarboxamida, o un análogo, derivado, profármacos o metabolitos activos de los mismos. En particular, el agente anticanceroso puede comprender: monometil auristatina E (MMAE), mertansina (DM1), ravtansina (DM4) o centanamicina.

En algunos casos, el resto terapéutico puede comprender un isótopo terapéutico. Por ejemplo, el resto terapéutico puede comprender un isótopo seleccionado del grupo que consiste en: ¹⁷⁷ Lu, ⁹⁰ Y, ²¹¹ At, ²¹³ Bi, ²¹² Pb, ²²⁵ Ac, ²²³ Ra, 44Sc, 67Ga, 131I, 188Re, 186Re y 67Cu.

En algunos casos, el péptido se conjuga con un resto detectable que es detectable por obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés), espectroscopia de resonancia magnética (MRS, por sus siglas en inglés), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), tomografía por emisión de positrones (PET) u obtención de imágenes ópticas. En particular, el resto detectable puede comprender un fluoróforo, un radionúclido o un marcador de spin. En determinados casos, el resto detectable puede comprender: 68Ga IRDye® 700, IRDye® 800, isotiocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés), 89Zr, 124I, 64Cu, 62Cu, 18F, 86Y, 111In, I I, Ga o Tc.

En particular, el resto detectable puede comprender 111In acoplado al péptido a través de un enlazador que comprende un quelato. En particular, el quelato puede seleccionarse del grupo que consiste en: ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA, por sus siglas en inglés), ácido tetrazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA, por sus siglas en inglés), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés). El quelato (p. ej., DTPA, DOTA o EDTA) puede estar unido al extremo N o extremo C del péptido (p. ej., puede estar unido a D-Asn en el extremo N).

En algunos casos, el péptido está conjugado con un polímero que potencia la semivida en plasma y/o la biodistribución. En particular, el péptido puede estar conjugado con uno o más (p. ej., uno o dos, tal como en cada uno del extremo N y del extremo C) grupos de polietilenglicol (PEG). En determinados casos, el péptido puede estar conjugado con un resto que comprende -(OCH2CH2V, en donde n > 1. En particular, n puede ser de 1 a 100, de 1 a 50, de 10 a 40 o de 20 a 30. Por ejemplo, n puede ser 1 o 2. En determinados casos, el péptido puede tener dos grupos etilenglicol presentes en el extremo N o en el extremo C.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende:

un péptido del primer aspecto de la invención o un conjugado del segundo aspecto de la invención; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un péptido del primer aspecto de la invención, un conjugado del segundo aspecto de la invención o una composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención para su uso en medicina.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un péptido del primer aspecto de la invención, un conjugado del segundo aspecto de la invención o una composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención para su uso en un método de tratamiento de un tumor que expresa avp6 en un sujeto mamífero. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor de cuello de útero, un tumor de cabeza o cuello, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de piel, un tumor de colon, un tumor de ovario o un tumor de páncreas. En casos particulares, el conjugado o composición farmacéutica del mismo es un conjugado que comprende uno o más de dichos agentes anticancerosos. En determinados casos, el método de tratamiento puede comprender una etapa para determinar si el tumor en el sujeto mamífero expresa avp6, en donde dicho tratamiento se administra si se determina que el tumor expresa avp6. La presente descripción proporciona un método para tratar a un sujeto mamífero que tiene un tumor que expresa avp6, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido del primer aspecto de la invención, un conjugado del segundo aspecto de la invención o una composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención al sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor de cuello de útero, un tumor de cabeza o cuello, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de piel, un tumor de colon, un tumor de ovario o un tumor de páncreas. En casos particulares, el conjugado o composición farmacéutica del mismo es un conjugado que comprende uno o más de dichos agentes anticancerosos. En determinados casos, el método de tratamiento puede comprender una etapa para determinar si el tumor en el sujeto mamífero expresa avp6, en donde dicho tratamiento se administra si se determina que el tumor expresa avp6.

La presente descripción proporciona el uso de un péptido del primer aspecto de la invención, un conjugado del segundo aspecto de la invención o una composición farmacéutica del tercer aspecto de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor que expresa avp6 en un sujeto mamífero. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor de cuello de útero, un tumor de cabeza o cuello, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de piel, un tumor de colon, un tumor de ovario o un tumor de páncreas. En casos particulares, el conjugado o composición farmacéutica del mismo es un conjugado que comprende uno o más de dichos agentes anticancerosos. En determinados casos, el método de tratamiento puede comprender una etapa para determinar si el tumor en el sujeto mamífero expresa avp6, en donde dicho tratamiento se administra si se determina que el tumor expresa avp6.

De acuerdo con el cuarto o quinto aspecto de la presente invención, el péptido, conjugado o composición farmacéutica se puede administrar o es para la administración con otro agente anticanceroso y/o con radioterapia o cirugía. En particular, se contemplan de manera específica la terapia de combinación con un segundo agente quimioterapéutico (simultánea, secuencial, por separado o concurrente) y/o con radioterapia y/o preo o postoperatoria. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría en particular, los presentes inventores creen que la combinación del péptido dirigido a avp6 o la terapia basada en conjugados de la presente invención con el bloqueo de uno o más receptores de tirosina cinasas (RTK, por sus siglas en inglés) puede potenciar la eficacia terapéutica anticancerosa en comparación con la monoterapia. Los estudios preliminares de anticuerpos indican que avp6 regula y puede potenciar la señalización de RTK. Por otra parte, el direccionamiento de los RTK (p. ej., receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o erbB-2 (también conocido como receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano o HER2/neu) en modelos tumorales en combinación con un anticuerpo anti-avp6 potencia la terapia sobre la monoterapia. Por consiguiente, se contempla específicamente en el presente documento que la terapia con péptido dirigido a avp6 o basada en conjugados de la presente invención se puede combinar con, en particular, uno o más de: Trastuzumab (Herceptin®), Gefitinib (Iressa®), Erlotinib (Tarceva®), Lapatinib (Tykerb®), Cetuximab (Erbitux®) y Panitumumab (Vectibix®).

La presente descripción es un método de obtención de imágenes de un tumor que expresa avp6 en un sujeto mamífero que comprende administrar un conjugado del segundo aspecto de la invención o una composición del mismo, comprendiendo dicho conjugado dicho resto detectable, al sujeto portador del tumor y detectar dicho resto detectable formando así una imagen de dicho tumor. Normalmente, la imagen se formará en una pantalla (p. ej., una pantalla de visualización digital), pero la obtención de imágenes directas sobre o en el cuerpo del sujeto se contempla de manera específica en el presente documento. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor de cuello de útero, un tumor de cabeza o cuello, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de piel, un tumor de colon, un tumor de ovario o un tumor de páncreas.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un conjugado del segundo aspecto de la invención o una composición del mismo, comprendiendo dicho conjugado dicho resto detectable, para su uso en un método de diagnóstico de cáncer in vivo en un sujeto mamífero, en donde el método comprende administrar dicho conjugado o dicha composición del mismo al sujeto y detectar dicho resto detectable, diagnosticando así la presencia de un tumor que expresa avp6 en el sujeto. En algunos casos, detectar dicho resto detectable comprende medir la cantidad, concentración, nivel, intensidad y/o ubicación de dicho resto detectable y correlacionar o interpretar la medición (p. ej., comparando la medición con un nivel de referencia, fondo o control) para determinar si la medición indica o no la presencia de un tumor que expresa avp6 en el sujeto y/o en una ubicación particular en el cuerpo del sujeto. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor de cuello de útero, un tumor de cabeza o cuello, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de piel, un tumor de colon, un tumor de ovario o un tumor de páncreas.

La presente descripción proporciona un método de diagnóstico de cáncer que comprende administrar un conjugado del segundo aspecto de la invención o una composición del mismo, comprendiendo dicho conjugado dicho resto detectable, a un sujeto mamífero sospechoso de tener un tumor que expresa avp6 y detectar dicho resto detectable diagnosticando así la presencia de un tumor que expresa avp6 en el sujeto. En algunos casos, detectar dicho resto detectable comprende medir la cantidad, concentración, nivel, intensidad y/o ubicación de dicho resto detectable y correlacionar o interpretar la medición (p. ej., comparando la medición con un nivel de referencia, fondo o control) para determinar si la medición indica o no la presencia de un tumor que expresa avp6 en el sujeto y/o en una ubicación particular en el cuerpo del sujeto. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor de cuello de útero, un tumor de cabeza o cuello, un tumor de mama, un tumor de pulmón un tumor de piel, un tumor de colon, un tumor de ovario o un tumor de páncreas.

De acuerdo con la presente invención, el sujeto puede ser un ser humano, un animal de compañía (p. ej., un perro o un gato), un animal de laboratorio (p. ej., un ratón, rata, conejo, cerdo o primate no humano), un animal doméstico o de granja (p. ej., un cerdo, vaca, caballo u oveja). Preferentemente, el sujeto es un ser humano. El sujeto puede, en determinados casos, ser un ser humano que padece, se le ha diagnosticado o se sospecha que tiene un tumor que expresa avp6.

La presente invención incluye la combinación de los aspectos y características preferidas descritas, excepto cuando dicha combinación sea claramente inaceptable o se indique expresamente que tenga que evitarse. Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención se describen con más detalle a continuación y con referencia a los ejemplos y figuras adjuntos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra las estructuras de los aminoácidos no proteinogénicos utilizados para la síntesis de los péptidos 2-15.

La figura 2 muestra una comparación del péptido 22 al péptido 25 en pruebas in vitro. Todas las variantes de A20FMDV2 se examinaron para determinar su especificidad, actividad e internalización. A) La especificidad es la ausencia de unión a A375Puro a 1000 nM (histogramas superiores) y la unión solamente a A375Pp6 (histogramas inferiores) y el desplazamiento del histograma muestra la media geométrica (GM, por sus siglas en inglés) de la intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) mediante citometría de flujo en la misma concentración de 100 nM mostrada por Ai) el péptido 22 (histogramas de la izquierda) y Aii) el péptido 25 (histogramas de la derecha). B) La afinidad se determinó midiendo el nivel de unión a A375Pp6 a 0,1, 1, 10, 100 y 1000 nM mediante citometría de flujo. Los resultados muestran la unión de los péptidos en relación con A20FMDV2 biotinilado de control de origen comercial. Los datos de un único experimento representativo muestran que Bii) el péptido 25 (gráfico de la derecha) se une mejor a A375Pp6 a concentraciones similares en comparación con Bi) el péptido 22 (gráfico de la izquierda). C) La internalización muestra la internalización dependiente de avp6 por las células A375Pp6 usando Imagestream®. Los datos muestran el péptido en la superficie de la célula (verde, imágenes del lado derecho en cada panel) a los 0 minutos y después de 45 minutos. Ci) el péptido 22 y Cii) el péptido 25 se han internalizado y tienen una tasa similar de internalización (véanse los gráficos a continuación de las imágenes; péptido 22 gráfico de la izquierda, péptido 25 gráfico de la derecha).

La figura 3 muestra la estabilidad de péptidos en plasma humano (n = 2) y PBS (control) después de 24 h. Los péptidos 22, 25 y 26 son más del 75 % estables en plasma, en comparación con los péptidos 23 y 24 que son menos del 50 % estables. Los niveles de péptidos se cuantificaron mediante cromatografía de líquidosespectrometría de masas (LC-MS, por sus siglas en inglés). La estabilidad de los péptidos en el plasma humano (marcados como "sangre", barras de la derecha para cada péptido) y PBS (barras de la izquierda para cada péptido) se determinó después de 24 horas. En este experimento, se usó PBS como control.

La Figura 4 muestra la captación de péptidos acoplados a 111In-DTPA en un tumor que expresa avp6 positivo y un tumor de control negativo (A375Puro). Los péptidos se introducen específicamente en el tumor que expresa avp6 (azul; barras de la derecha para cada péptido) en comparación con el tumor negativo (rojo; barras de la izquierda para cada péptido). La captación relativa se muestra mediante la relación A375Puro:A375p6. Los datos muestran que 25 es casi 10 veces más específico para el tumor que expresa avp6 en comparación con el tumor negativo. Los datos se representan como la dosis inyectada (ID, por sus siglas en inglés) media por gramo de tejido ± Error estándar de la media (SEM, por sus siglas en inglés) para cada uno de los péptidos 22-26.

Descripción detallada de la invención

Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende que se definan como se indica a continuación.

Variantes de péptidos y aminoácidos no naturales

Como se define en el presente documento, los péptidos de la presente invención son variantes del péptido A20FMDV2 precursor y pueden comprender uno o más aminoácidos no naturales, siempre que el péptido sea como se define en las reivindicaciones. Los aminoácidos no naturales adecuados incluyen, por ejemplo, D-aminoácidos, ornitina, ácido diaminobutírico ornitina, norleucina ornitina, pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina, fenilglicina, aminoácidos alfa y alfa-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, derivados de haluros de aminoácidos naturales, tal como trifluorotirosina, p-Cl-fenilalanina, p-Br-fenilalanina, pl-fenilalanina, L-alil-glicina, b-alanina, ácido la-amino butírico, ácido l-g-amino butírico, ácido l-a-amino isobutírico, ácido l-e-amino caproico, ácido 7-amino heptanoico, L metionina sulfona, L-norleucina, L-norvalina, p-nitro-L-fenilalanina, L-hidroxiprolina, L-tioprolina, derivados metílicos de fenilalanina, tal como 1-metil-Phe, pentametil-Phe, L-Phe (4-amino), L-Tyr(metilo), L-Phe(4-isopropilo), L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico), ácido L-diaminopropiónico y L-Phe(4-bencilo). Los péptidos pueden modificarse adicionalmente. Por ejemplo, uno o más enlaces amida pueden reemplazarse por enlaces éster o alquilo de la cadena principal. Puede haber sustituyentes N o C alquilo, modificaciones o limitaciones de la cadena lateral, tal como puentes de disulfuro, enlaces amida o éster de cadena lateral.

Los péptidos de la presente invención pueden incluir tanto péptidos modificados como análogos de péptidos sintéticos. Los péptidos pueden modificarse, p. ej., para mejorar las propiedades de formulación y almacenamiento, o para proteger enlaces peptídicos lábiles incorporando estructuras no peptídicas.

Los péptidos de la presente invención pueden incluir una modificación aminoterminal y/o carboxiterminal. Por ejemplo, acetilación aminoterminal y/o amidación carboxiterminal.

Los péptidos de la presente invención se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los péptidos pueden producirse por síntesis química, p. ej., técnicas en fase sólida y sintetizadores de péptidos automatizados, o por medios recombinantes (usando ácidos nucleicos tal como los descritos en el presente documento). Por ejemplo, los péptidos se pueden sintetizar usando estrategias en fase sólida en un sintetizador de péptidos múltiples automatizado (Abimed AMS 422) usando la química del 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). A continuación, los péptidos pueden purificarse mediante HPLC de fase inversa y liofilizarse. En los ejemplos a continuación se describen métodos de síntesis particulares para preparar péptidos de la invención.

En algunos casos X2 y X3 son restos promotores de hélice. En algunos casos, los aminoácidos Zm son restos promotores de hélice. Como se usan en el presente documento, los restos promotores de hélice pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en Glu, Ala, Leu, Met, Gln, Lys, Arg, Val, Ile, Trp, Phe y Asp. Los restos que promotores de hélice pueden incluir uno o más aminoácidos artificiales o modificados.

Resto detectable

Como se usan en el presente documento, el péptido de la presente invención puede conjugarse con un resto detectable. La expresión "resto detectable" se refiere a un resto que, cuando se localiza en el sitio diana después de la administración de los conjugados de la invención a un paciente, puede detectarse, normalmente de forma no invasiva desde fuera del cuerpo y del sitio de la diana localizado. Por lo tanto, los conjugados de esta realización de la invención son útiles para la obtención de imágenes y el diagnóstico. Los restos fácilmente detectables son entidades que son detectables mediante técnicas de obtención de imágenes tal como la obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), espectroscopia de resonancia magnética (MRS, por sus siglas en inglés), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y tomografía por emisión de positrones (PET) y obtención de imágenes ópticas. Preferentemente, los restos para obtención de imágenes son entidades estables, no tóxicas que conservan sus propiedades en condiciones in vitro e in vivo. Los ejemplos de dichos restos incluyen, pero sin limitación, restos radiactivos, por ejemplo, isótopos radiactivos. Los átomos radiactivos adecuados incluyen indio-111, tecnecio-99m o yodo-123 para estudios escintigráficos. Otros restos fácilmente detectables incluyen, por ejemplo, marcadores de spin para MRI, tal como yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-18, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro y restos ópticos que incluyen Cy5.5 y puntos cuánticos. Otros ejemplos de restos detectables incluyen 68Ga, IRDye® 700, IRDye® 800, isotiocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés), 89Zr, 124I, 64Cu, 62Cu, 18F, 86Y, 111In, 131I 123I, 67Ga y 99mTc.

La expresión "resto terapéutico" abarca un resto que tiene propiedades beneficiosas, profilácticas y/o terapéuticas. Los agentes quimioterapéuticos citotóxicos son bien conocidos en la técnica e incluyen agentes anticancerosos tales como:

agentes alquilantes que incluyen mostazas de nitrógeno tales como mecloretamina (HN2), ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán (L-sarcolisina) y clorambucilo; 10 etileniminas y metilmelaminas tales como hexametilmelamina, tiotepa; sulfonatos de alquilo tales como busulfán; nitrosoureas tales como carmustina (BCNU), lomustina (CCNLj ), semustina (metil-CCN-U) y estreptozoína (estreptozotocina); y

triazenos tales como decarbazina (DTIC;

dimetiltriazenoimidazolcarboxamida);

antimetabolitos que incluyen análogos de ácido fólico tales como metotrexato (ametopterina); análogos de pirimidina tales como fluorouracilo (5-fluorouracilo; 5-FU), floxuridina (fluorodesoxiuridina; FUdR) y citarabina (arabinósido de citosina); y análogos de purina e inhibidores relacionados tales como mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), tioguanina (6-tioguanina; TG) y pentostatina (2'-desoxicofonicina). Productos naturales que incluyen alcaloides de la vinca tales como vinblastina (VLB) y vincristina; epipodofilotoxinas tales como etopósido y tenipósido; antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorrubicina (daunomicina; rubidomicina), doxorrubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina Q); enzimas tales como L-asparaginasa; y modificadores de la respuesta biológica, tales como alfenomas de interferón.

Agentes diversos que incluyen complejos de coordinación de platino, tales como cisplatino (cis-DDP) y carboplatino; antracenodiona tal como mitoxantrona y antbraciclina; urea sustituida tal como hidroxiurea; derivado de metilhidrazina tal como procarbazina (N-metilhidrazina, MIH); y supresor adrenocortical, tal como mitotano (o, p'-DDD) y aminoglutetimida; taxol y análogos/derivados; y agonistas/antagonistas de hormonas tales como flutamida y tamoxifeno.

En particular, el péptido de la invención puede conjugarse con un agente anticanceroso seleccionado de una auristatina, un maitansinoide, una tubulisina, duocarmicina, caliqueamicina, alfa-amanitina, una pirrolobenzodiazepina (PBD), irinotecán y una indolcarboxamida, o un análogo, derivados, profármacos o metabolitos activos de los mismos. Los ejemplos específicos incluyen: monometil auristatina E (MMA^e ), mertansina (DM1), ravtansina (DM4) y centanamicina.

En determinados casos, el agente anticanceroso puede ser un resto de péptido o polipéptido citotóxico mediante el cual se incluye cualquier resto que conduzca a la muerte celular.

Los restos de péptidos y polipéptidos citotóxicos son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ricina, abrina, exotoxina de Pseudomonas, factor tisular y similares.

El uso de ricina como agente citotóxico se describe en Burrows & Thorpe, P.N.A.S. USA 90: 8996-9000, 1993, y el uso de factor tisular, que conduce a la coagulación sanguínea localizada y al infarto de un tumor, se ha descrito por Ran et al, Cancer Res. 58: 4646-4653, 1998 y Huang et al, Science 275: 25 547-550, 1997. Tsai et al, Dis. Colon Rectum 38: 1067-1074, 1995 describe la cadena A de abrina conjugada con un anticuerpo monoclonal. Otras proteínas inactivadoras de ribosomas se describen como agentes citotóxicos en el documento WO 96/06641. La exotoxina de Pseudomonas también se puede utilizar como resto polipeptídico citotóxico (véase, por ejemplo, Aiello et al, P.N.A.S. USA 92: 10457-10461, 1995.

Determinados átomos radiactivos también pueden ser citotóxicos si se suministran en dosis suficientes. Por lo tanto, el agente anticanceroso puede comprender un átomo radiactivo que, en uso, suministra una cantidad suficiente de radiactividad al sitio diana para que sea citotóxico. Los átomos radiactivos adecuados incluyen fósforo-32, yodo-125, yodo-131, indio-111, renio-186, renio-188, astatina-211 o itrio-90, o cualquier otro isótopo que emita suficiente energía para destruir células, orgánulos o ácidos nucleicos vecinos. En particular, el isótopo radioactivo terapéutico se puede seleccionar del grupo que consiste en: 177Lu, 90Y, 211At, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 223Ra, 44Sc, 67Ga, 131I, 188Re, 186Re y 67Cu. Preferentemente, los isótopos y la densidad de los átomos radiactivos en el compuesto de la invención son tales que se suministra una dosis de más de 4000 cGy, y más preferentemente de al menos 6000, 8000 o 10000 cGy, al sitio diana y, preferentemente, a las células en el sitio diana y a sus orgánulos, particularmente el núcleo. El átomo radiactivo puede unirse al resto de unión de formas conocidas. Por ejemplo, EDTA, DTPA, DOTA u otro a A 'lg ' íente CO quel Qa|-|nte pueden unirse al péptido de la invención y usarse para unir radionúclidos metálicos que incluyen In, Ga, Y o átomos radiactivos como se describe anteriormente. Los restos de tirosina pueden introducirse en el péptido de la invención y pueden marcarse con 125I o I311.

Los métodos para conjugar péptidos con agentes terapéuticos son bien conocidos en la técnica. Estos pueden incluir el uso de enlazadores, por ejemplo, enlazadores escindibles.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" generalmente incluye componentes que son compatibles con el péptido o conjugado del mismo y no son perjudiciales para los receptores del mismo. Normalmente, los vehículos serán agua o solución salina que serán estériles y sin pirógenos; sin embargo, se pueden utilizar otros vehículos aceptables. Normalmente, las composiciones o formulaciones farmacéuticas de la invención son para administración parenteral, más particularmente para administración intravenosa.

El medicamento o la composición farmacéutica de la presente invención, tal como se define anteriormente, se puede administrar de manera útil a un paciente al que también se le administran otros medicamentos, tal como conocerán los expertos en la materia. Por ejemplo, en el caso del cáncer, el medicamento o composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a un paciente antes, después o durante la administración del otro o de los otros agentes antitumorales, por ejemplo antes, después o durante la quimioterapia. El tratamiento con el péptido después de la quimioterapia puede ser particularmente útil para reducir o prevenir la reaparición del tumor o la metástasis. Por ejemplo, el agente antitumoral se puede unir covalentemente directa o indirectamente a un péptido de la invención.

Determinación de la expresión de ov¡36

El experto en la materia conocerá numerosas técnicas para determinar si una muestra (tal como una muestra tumoral) expresa la integrina avp6. En realizaciones particulares, el sujeto a tratar puede tener un tumor que tenga una o más células que expresen la integrina avp6. En determinados casos, el hallazgo de que el tumor expresa la integrina avp6 (es decir, que es un cáncer avp6 positivo) puede haberse realizado previamente o puede inferirse del tipo de cáncer. Por ejemplo, se sabe que varios tipos de tumores expresan la integrina avp6, incluyendo un tumor de cáncer de útero, un tumor de cabeza o cuello, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de piel, un tumor de colon, un tumor de ovario o un tumor de páncreas. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría en particular, los presentes inventores creen que los cánceres del tracto gastrointestinal (GI) y los carcinomas que se desarrollan a partir de muchos tejidos epiteliales pueden beneficiarse de la terapia dirigida a avp6 usando un péptido o conjugado de la presente invención. A medida que se amplía la gama de cánceres que expresan avp6 mediante un esfuerzo de investigación adicional, se espera que crezca la gama de cánceres que pueden mostrar un beneficio terapéutico de la terapia dirigida a avp6 usando un péptido o conjugado de la presente invención.

De forma adicional o alternativa, en determinados casos, el tratamiento puede implicar una etapa activa para determinar si el tumor expresa la integrina avp6. Dicha etapa puede, por ejemplo, llevarse a cabo antes de iniciar el tratamiento con un péptido o conjugado dirigido a avp6 de la presente invención con el fin de predecir la probable idoneidad del sujeto para la terapia usando un péptido o conjugado dirigido a avp6 de la presente invención. La determinación de la expresión de avp6 puede implicar medir la expresión y/o el nivel de proteínas en una muestra tumoral mediante inmunohistoquímica, medir los niveles de proteína en un lisado celular mediante ELISA o transferencia Western, y/o usar un agente aglutinante capaz de unirse específicamente a avp6 o un fragmento o subunidad de la misma.

En determinadas realizaciones, la determinación de si el sujeto tiene un cáncer avp6 positivo se puede realizar sobre un ácido nucleico extraído de una muestra de células obtenidas del cáncer, de una muestra de células cancerosas que circulan en sangre y/o de ADN tumoral circulante (ADNtc) en sangre o plasma.

En determinados casos, determinar la expresión de avp6 comprende extraer ARN de una muestra de células cancerosas y medir la expresión mediante PCR en tiempo real y/o usando una sonda capaz de hibridar con el ARN que codifica avp6 o un fragmento del mismo. La presencia o cantidad de integrina avp6 se puede determinar directamente usando un agente aglutinante, tal como un anticuerpo o un péptido o conjugado de la presente invención, que es capaz de unirse específicamente a avp6, o un fragmento de la misma. El agente aglutinante se puede marcar para permitir que se detecte o sea capaz de detectarse después de la reacción con una o más especies adicionales, por ejemplo, usando un anticuerpo secundario que está marcado o es capaz de producir un resultado detectable, p. ej., en un ensayo de tipo ELISA.

Muestras

Una "muestra de prueba", como se usa en el presente documento, puede ser una muestra de células o tejidos (p. ej., una biopsia), un fluido biológico, un extracto (p. ej., una proteína o un extracto de ADN obtenidos del sujeto). En particular, la muestra puede ser una muestra tumoral, una muestra de sangre (incluida la muestra de plasma o suero), una muestra de líquido cefalorraquídeo o una muestra de tejido no tumoral. La muestra puede ser una que se haya obtenido recientemente del sujeto o puede ser una que se haya procesado y/o almacenado antes de tomar una determinación (p. ej., congelado fijado sometido a una o más etapas de purificación, enriquecimiento o de extracción). Se han descrito técnicas para enriquecer una muestra de sangre o plasma para determinar el ADN tumoral circulante (p. ej., basándose en el tamaño del fragmento). Por otra parte, se han descrito técnicas de secuenciación para identificar mutaciones asociadas a cáncer en el ADNtc (p. ej., basadas en PCR digital, secuenciación profunda dirigida, PCR anidada en tiempo real, y similares).

"Y/o", cuando se usa en el presente documento, debe considerarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" debe considerarse como una divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno de ellos se estableciera de manera individual en el presente documento.

Las características divulgadas en la descripción anterior, o en las siguientes reivindicaciones, o en los dibujos adjuntos, expresadas en sus formas específicas o en términos de un medio para realizar la función divulgada, o un método o proceso para obtener los resultados divulgados, según sea apropiado, pueden utilizarse, por separado, o en cualquier combinación de dichas características, para realizar la invención en diversas formas de la misma. Si bien la invención se ha descrito junto con las realizaciones ilustrativas descritas anteriormente, muchas modificaciones y variaciones equivalentes serán aparentes para los expertos en la materia cuando reciban la presente divulgación. Por consiguiente, las realizaciones ilustrativas de la invención expuestas se consideran como ilustrativas y no limitantes. Para evitar cualquier duda, cualquier explicación teórica proporcionada en el presente documento se proporciona con el propósito de mejorar la comprensión del lector. Los presentes inventores no desean quedar ligados a ninguna de estas explicaciones teóricas.

Cualquier encabezado de sección utilizado en el presente documento tiene fines solamente organizativos y no deben considerarse como limitantes de la materia objeto descrita.

En toda la presente memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden" e "incluyen", y variaciones como "comprende", "que comprende" y "que incluye" se entenderá que implican la inclusión de un entero o medida, o grupo de enteros o de medidas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro entero o medida, o grupo de enteros o de medidas.

Cabe señalar que, como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/una", y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En el presente documento los intervalos se pueden expresar como desde "aproximadamente" un valor particular y/o hasta "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa dicho intervalo, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular constituye otra realización. El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico es opcional y significa, por ejemplo, /-10 %. Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo y no debe interpretarse como una limitación del alcance de las reivindicaciones.

Ejemplos

Para permitir que se mida la actividad de unión a la integrina avp6 mediante citometría de flujo, todos los péptidos se sintetizaron incorporando un resto 2Lys (D-biotina) en lugar de Ala natural (es decir, A20FMDV2, como se divulga en el documento WO2007/039728, tiene Ala en la posición 2). A modo de comparación, se compararon los péptidos propios de los presentes inventores sintetizados por SPPS con A20FMDV2 biotinilado sintetizado comercialmente (denominado A20FMDV2-A biotinilado en la tabla 2 a continuación). Después de los estudios de actividad, se seleccionaron, a continuación, péptidos biotinilados que mostraban una potente actividad de unión y se incorporó el quelante de metales, ácido dietilentriamina pentaacético (DTPA) [17] para facilitar el acoplamiento de 111In para estudios de estabilidad en plasma y estudios de biodistribución in vivo. La síntesis, los estudios de unión y la estabilidad en plasma de A20FMDV2 biotinilado, sus derivados no proteinogénicos y análogos biotinilados y con DPTA incorporado, se describen en detalle a continuación.

Parte experimental

Información general

Todos los reactivos se adquirieron como grado reactivo y se usaron sin purificación adicional. Los disolventes de HPLC se adquirieron como grado HPLC y se usaron sin purificación adicional. Se adquirió FmocNH-L-Thr(‘Bu)-O-CH2-phi-OCH2-CH2-CO2H de PolyPeptide (Estrasburgo, Francia). Se adquirieron hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N-tetrametiluronio (HbTU), hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N-tetrametiluronio (HATU), amida Rink, ácido 4-(hidroximetil)fenoxiacético (HMP), anhídrido de boc y N,N- diisopropilcarbodiimida (DIC) de GL Biochem (Shanghai, China). Se adquirieron N,N-dimetilformamida (DMF) (grado AR) y acetonitrilo (CH3CN) (grado de HPLC) de Scharlau (Barcelona, España). Se adquirieron diisopropiletilamina ('Pr2NEt), 4-dimetilaminopiridina (DMAP), piperidina, N-metil-2-pirrolidona (NMP), colidina, 1,8-diazabicicloundec-7-eno (DBU), 2-mercaptoetanol, triisopropilsilano (TIPS) y 3,6-dioxa-1,8-octanoditiol (DODT) de Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Se obtuvieron cloruro de 2-nitrobencenosulfonilo (2-NBS-Cl) y dimetilsulfato (DMS) de AK Scientific (Union City, CA). Se adquirió ácido trifluoroacético (TFA) de Oakwood Chemicals (River Edge City, CA). La resina de aminometil poliestireno y DTPA se sintetizaron de acuerdo con los procedimientos publicados [21, 22]. Los Fmocaminoácidos se adquirieron de GL Biochem con la siguiente protección de cadena lateral: Fmoc-Arg(Pbf)-OH (Pbf = 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo), Fmoc-Asn(Trt)-OH (Trt = trifenilmetilo), Fmoc-Asp(‘Bu)-OH (‘Bu = terc-butilo), Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu (‘B^u) -OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH, Fmoc-D-Thr (‘Bu) -OH y Fmoc-D-Asn(Trt)-OH.

Los espectros de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS, por sus siglas en inglés) se registraron en un LC 1120 Compact de Agilent Technologies (Santa Clara, CA) conectado a un espectrómetro 1100MSD en línea de Hewlett Packard (Palo Alto, CA). Las muestras se introdujeron mediante inyección de flujo directo a 0,2 ml/min en una fuente ESI en modo positivo, utilizando ácido fórmico/^O al 0,1 % y ácido fórmico /CH3CN al 0,1 % (1:1, v/v).

Los fragmentos principales y significativos se estimaron en la forma x m/z (relación masa a carga). La RP-HPLC analítica se realizó en un sistema Ultimate 3000 usando una columna C18 Waters XTerra® (5 pm, 4,6 x 150 mm) a un caudal de 1 ml/min. Se utilizó un gradiente lineal de TFA/H2O (disolvente A) al 0,1 % y TFA al/CH3CN al 0,1% (disolvente B) con detección a 210 nm. La RP-HPLC preparativa se realizó en un sistema Waters 600 con un detector de absorbancia de longitud de onda dual Waters 2487 usando una columna C18 Waters XTerra® Prep MS (10 pm, 19 x 300 mm) a un caudal de 10 ml/min. Los sistemas de gradiente se ajustaron de acuerdo con los perfiles de elución y los perfiles de máximos obtenidos de los cromatogramas analíticos de RP-HPLC.

Proced'm'ento general de síntes's de pépt'dos

La síntesis de péptidos en fase sólida (escala de 0,1 mmol) se realizó en resina de aminometil poliestireno (0,8 mmol/g) según la estrategia química Fmoc. FmocNH-L-Thr (‘Bu) -O-CH2-phi-OCH2-CH2-CO2H se fijó a la resina usando el método general A (véase a continuación), la amida Rink se fijó a la resina utilizando el método general B, y el HMP se acopló a la resina utilizando el método general C [20]. El acoplamiento de Fmoc-D-Thr (‘Bu) -OH se logró usando el método general D. Las secuencias de péptidos deseadas se sintetizaron manualmente o en un sintetizador de péptidos Tribute™ (Tucson, AZ) usando el método general E, se llevó a cabo la N-metilación del enlace peptídico utilizando el método general F, [19] y el acoplamiento de Fmoc-Gln(Trt)-OH a la lisina N-metilada se llevó a cabo usando el método general G. La acetilación aminoterminal se llevó a cabo usando el método genera1H, y se acopló DTPA protegido con terc-butilo a los péptidos usando el método general I. Se fijó D-biotina a los péptidos usando el método general J. Los péptidos lineales se escindieron de la resina usando el método general K, y los productos brutos se purificaron de acuerdo con el método general L.

Método general A: fijación de FmocNH-L-Thr (Bu) -O-CH ² -PN-OCH ² -CH ² -CO ² H a resina de aminometil poliestireno

Se engrosó resina de aminometil poliestireno (0,1 mmol) en CH2Ch/DMF (1:1, v/v) durante 20 minutos y el disolvente se eliminó por filtración. A la resina se le añadió una solución de FmocNH-L-Thr (‘Bu) -O-CH2-phi-OCH2-CH2-CO2H (2 eq.) en DMF/CH2Cl2 al 10% (1 ml, v/v) seguido de DIC (2 eq.), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se enjuagó y la resina se lavó con DMF (3 x 5 ml), CH2O2 (3 x 5 ml) y se secó al aire para dar 16. Una prueba de Kaiser negativa [41] indicó una reacción completa.

Método general B: fijación de amida Rink a la resina de aminometil poliestireno

Se engrosó resina de aminometil poliestireno (0,1 mmol) en CH2Ch/DMF (1:1, v/v) durante 20 minutos y el disolvente se eliminó por filtración. A la resina se le añadió una solución de amida Rink (2 eq.) en DMF/CH2Cl2 al 10 % (1 ml, v/v) seguido de DIC (2 eq.) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se enjuagó y la resina se lavó con DMF (3 x 5 ml), CH2Ch (3 x 5 ml) y se secó al aire. Una prueba de Kaiser negativa indicó una reacción completa.

Método general C: fijación de ácido 4-(hidroximetil)fenoxiacético (HMP) a la resina de aminometil poliestireno (síntesis de la resina 27)

Se engrosó resina de aminometil poliestireno (0,1 mmol) en CH2Ch/DMF (1:1, v/v) durante 20 minutos y el disolvente se eliminó por filtración. A la resina se le añadió una solución de HMP (2 eq.) en DMF/CH2Cl2 al 10 % (1 ml, v/v) seguido de DIC (2 eq.) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se enjuagó y la resina se lavó con DMF (3 x 5 ml), CH2Cl2 (3 x 5 ml) y se secó al aire para dar 27. Una prueba de Kaiser negativa indicó una reacción completa.

Método general D: fijación de Fmoc-D-Thr (Bu) -OH a la resina con HMP 27

A la resina se le añadió una solución de Fmoc-D-Thr (‘Bu) -OH (2 eq.) en DMF (1 ml) y DIC (2 eq.) seguido de la adición gota a gota de DMAP (10 % eq.) en DMF (100 jl). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de enjuagar la solución y lavar la resina con DMF (3 x 5 ml), se repitió la esterificación durante 2 horas adicionales. A la resina se le añadió anhídrido acético/DMF al 20% (1 ml) y una solución de DMAP (10 % eq.) en DMF (100 jl) gota a gota, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual la solución se enjuagó y la resina se lavó con DMF (3 x 5 ml).

Método general E: SPPS con Fmoc manual y automatizada

A una solución de aminoácido protegido con Fmoc (5 eq.) en DMF (1 ml) se le añadió HBTU (4,75 eq.) y 'Pr2NEt (10 eq.) y la solución se añadió a la resina. Después de agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, se enjuagó la solución y se lavó la resina con DMF (3 x 5 ml). El grupo protector Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina/DMF al 20 % (5 ml, v/v) a temperatura ambiente durante 5 minutos y después 10 minutos.

Método general F: N-metilación del enlace peptídico

Protecc'ón con NBS: A una solución de 2-NBS-Cl (4 eq.) en NMP (1 ml) se le añadió colidina (10 eq.) y la solución se añadió a la resina y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de enjuagar la solución y lavar la resina con NMP (3 x 5 ml), se repitió la reacción durante 10 minutos adicionales. N-met'lac'ón: A la resina se le añadió una solución de DBU (3 eq.) en NMP (1 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 minutos. A continuación, se añadió a la mezcla de reacción una solución de DMS (10 eq.) en NMP (1 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 minutos. Después de enjuagar la solución y lavar la resina con NMP (3 x 5 ml), se repitió la reacción durante 2 minutos adicionales.

Desprotecc'ón de NBS: A la resina se le añadió una solución de 2-mercaptoetanol (10 eq.) y DBU (5 eq.) en NMP (2 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de enjuagar la solución y lavar la resina con NMP (3 x 5 ml), se repitió la reacción durante 5 minutos adicionales.

Método general G: acoplamiento de Fmoc-Gln (Trt) -OH a Lys N-metilada

A una solución de Fmoc-Gln (Trt)-OH (5 eq.) en DMF (1 ml) se le añadió HATU (4,75 eq.) y 'Pr2NEt (10 eq.), y la solución se añadió a la resina y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de enjuagar la solución y lavar la resina con DMF (3 x 5 ml), se repitió la reacción durante 3 horas adicionales.

Método general H: acetilación aminoterminal

A la resina se le añadió una solución de anhídrido acético/DMF al 20 % (1 ml), seguido de la adición gota a gota de una solución de DMAP (10 % eq.) en DMF (100 jl). Después la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, se enjuagó la solución y se lavó la resina con DMF (3 x 5 ml).

Método general I: fijación de DTPA protegido con terc-butilo

A una solución de 42 (5 eq.) en DMF (1 ml) se añadió HBTU (4,75 eq.) y 'Pr2NEt (10 eq.) y la solución se añadió a la resina. Después de agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, se enjuagó la solución y se lavó la resina con DMF (3 x 5 ml).

Método general J: fijación de D-biotina

Para la síntesis de los péptidos 1-15, y de los péptidos 17, 19, 20 y 21, el grupo Fmoc aminoterminal se eliminó mediante tratamiento con piperidina/DMF al 20 % (5 ml, v/v) a temperatura ambiente durante 5 minutos y después 10 minutos. Después de lavar con DMF (3 x 5 ml), se añadió una solución de (Boc)2O (5 eq.) en DMF (1 ml) a la resina y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se lavó con DMF (3 x 5 ml). El grupo Dde se eliminó usando hidrazina/DMF al 2 % (5 ml, v/v) a temperatura ambiente durante 5 minutos y se repitió con reactivos nuevos durante 10 minutos. Después de lavar con DMF (3 x 5 ml), una solución de D-biotina (5 eq.), HBTU (4,75 eq.) y 'Pr2NEt (10 eq.) en DMF (1 ml) se añadió a la resina y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se lavó con DMF (3 x 5 ml).

Para la síntesis de los péptidos 16 y 18 y de los péptidos 22-26, el grupo Dde se eliminó usando hidrazina/DMF al 2 % (5 ml, v/v) a temperatura ambiente durante 5 minutos y se repitió con reactivos nuevos durante 10 minutos. Después de lavar con DMF (3 x 5 ml), una solución de D-biotina (5 eq.), HBTU (4,75 eq.) y 'Pr2NEt (10 eq.) en DMF (1 ml) se añadió a la resina y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se lavó con DMF (3 x 5 ml).

Método general K: escisión del péptido de la resina

La resina que contiene el péptido lineal deseado se agitó en una mezcla de TFA/H2O/DODT/TIPS (94:2,5:2.5:1,0, 5 ml, v/v/v/v) durante 3 horas. Al filtrado se le añadió éter dietílico frío (30 ml) y la mezcla de producto se centrifugó durante 10 minutos antes de descartar el sobrenadante. Este procedimiento se repitió dos veces. El sólido resultante se disolvió en una solución de H2O/CH3CN TFA al 0,1 % (15 ml) y se liofilizó.

Método general L: purificación

El péptido bruto se disolvió en una solución de H2O/TFA al 0,1 % y se purificó por HPLC de fase inversa (RP) preparativa en una columna C18 XTerra® usando un gradiente de 5-20 % de B a 0,5 % de B/min y después 0,2 % de B/min hasta 35 % de B, a un caudal de 10 ml/min. La pureza del péptido se determinó mediante inyección de flujo (ESI+, 100V) y RP-HPLC analítica (columna C18 XTerra®, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1 ml/min).

Estudios de biología

Preparación de péptido

Téngase en cuenta que, para comparar el péptido DOTA-A20FMDV2 biotinilado de origen comercial, (95 % de pureza) se adquirió de PPR (Cambridge, Reino Unido). Los péptidos se resuspendieron en TFA al 0,1 % (diluido en agua) para preparar una concentración 1 mM de soluciones madre que se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20 °C.

Líneas celulares

Las líneas celulares utilizadas in vitro e in vivo son las líneas de melanoma transducidas A375Ppuro y A375Pp6 (cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/suero bovino fetal (FBS) al 10 % [9].

Especificidad y nivel de unión de péptidos-método de citometría de flujo

Las células se tripsinizaron y se resuspendieron en DMEM/azida sódica al 0,1 % (p/v)/BSA al 0,1 % (p/v) (medio de flujo) para preparar una suspensión celular de 4 x 106 células/ml. A partir de este momento todo se mantuvo en hielo, se dividió en alícuotas de 50 pl de suspensión celular en cada tubo de flujo (Falcon 2054 - Millipore). Los péptidos se diluyeron en serie en el medio de flujo a una concentración 2x, por lo tanto, cuando se añadieron 50 pl de cada concentración a los 50 pl de células, se obtuvieron concentraciones finales de 1000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0,1 nM y 0 nM. Para las células A375Ppuro, sólo se añadió a las células la concentración superior de 1000 nM. A continuación, los péptidos se dejaron en hielo durante 15 minutos. A continuación, las células se lavaron dos veces mediante resuspensión en medio de flujo y centrifugación durante 3 minutos a 1200 rpm.

Se añadió anti-biotina de ratón (50 pl a 1:200; Jackson Immunoresearch). 200-002-211) a cada muestra durante 15 minutos, después se repitieron los etapas de lavado. Se añadió anti-IgG de ratón de cabra conjugado con Alexa 488 (1:250) (50 pl) a cada muestra y se dejó durante 15 minutos en hielo en la oscuridad. Se repitió la etapa de lavado y se resuspendieron las células en 380 pl de medio de flujo. Se utilizó un citómetro FACSCalibur (Becton-Dickinson) para adquirir los datos; se registró la media geométrica de la intensidad de fluorescencia para cada muestra.

Método de ensayo de internalización - Imagestream y citometría de flujo

Las células se tripsinizaron y se resuspendieron en DMEM (medio sin suero) para preparar una suspensión celular de 4 x 106 células/ml. A partir de ese momento, todo se mantuvo en hielo. Se dividieron alícuotas de 50 pl de suspensión celular en cada tubo de flujo. Los péptidos se diluyeron en medio sin suero enfriado con hielo hasta 200 nM alcanzando la concentración final de 100 nM cuando se añadieron 50 pl a las muestras de células. Los péptidos se dejaron en hielo durante 15 minutos, después se lavaron dos veces con medio de flujo y se centrifugaron durante 3 minutos a 1200 rpm entre cada etapa de lavado. Se añadió anti-biotina de ratón (50 pl a 1:200) a cada muestra durante 15 minutos, después se repitieron los etapas de lavado. Aparte del punto temporal 0, cada una de las muestras de los puntos temporales se colocaron en la incubadora a 37 °C y a los 15, 30 y 45 minutos las células se fijaron en formaldehído al 4 % en PBS durante 10 minutos, se lavaron una vez en PBS y se añadió detergente Triton X-100 al 0,1 % durante 5 minutos, antes de lavar de nuevo en PBS. Se añadió anti-IgG de ratón de cabra conjugado con AlexaFLUOR 488 (1:250) (50 pl) a cada muestra y se dejó durante 15 minutos en hielo en la oscuridad. Las muestras se lavaron como anteriormente y se resuspendieron a 30 pl. Las muestras se examinaron en un Imagestream X Mark II (Amnis, Merck) Se evaluaron las imágenes de Imagestream para determinar la internalización en comparación con las muestras de 0 minutos utilizando un software integrado.

Método de ensayo de internalización - Citometría de flujo

Las células se prepararon como anteriormente, excepto que no se añadió detergente antes de detectar la biotina con anticuerpos. Las muestras se analizaron en un citómetro FACScalibur (Bekton-Dickinson). La reducción de la señal de fluorescencia medida a lo largo del tiempo se asoció con la internalización del péptido unido como se confirmó visualmente usando Imagestream (datos no mostrados).

Estabilidad en plasma

A 15 |jg de péptido conjugado con DTPA se añadieron 15 MBq de indio-111 (Covidien - Petten, Países Bajos) (volumen final 20 jl) seguido de 5 j l de acetato de amonio (1 M). Las muestras se mezclaron y se dejaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 2 j l de esta mezcla a 100 j l de agua destilada y después la mezcla se inyectó en el gradiente de HPLC de fase inversa (Beckman). La muestra se hizo pasar a través de una columna Agilent Eclipse XDB-C18 en TFA al 0,1 % en agua destilada. Esto fue para comprobar la eficacia del marcado radiactivo, que normalmente fue > 95 %. Se extrajo sangre humana en tubos de heparina sódica y se centrifugó a 2000 g durante 10 minutos. Se incubó plasma (300 jl) con 7,5 MBq de péptido variante e inmediatamente se retiraron 150 j l y se colocaron a 37 °C y los otros 150 j l se usaron como muestra de tiempo de 0 minutos. A esto se le añadió un volumen igual de acetonitrilo enfriado con hielo (1:1) y las muestras se mezclaron y centrifugaron a 14000 rpm durante 5 minutos. Los sobrenadantes se recogieron y se secaron al vacío durante 10 minutos para eliminar el acetonitrilo. El residuo se filtró a través de un filtro de 0,22 jm (para eliminar las partículas) y se inyectaron 100 j l en la máquina de Radio-HPLC. Las muestras de 24 horas se procesaron de manera similar. Las muestras de control se incubaron con PBS. (Nota: el control con PBS no requirió este proceso de filtración o adición de acetonitrilo). Las muestras se realizaron por duplicado con resultados similares.

Biodistribución

Se inyectaron 2x 106 células en 100 j l por vía subcutánea en los hombros de ratones hembra CD1 Nu/Nu. Los tumores se hicieron crecer por vía subcutánea en el hombro izquierdo (A375Puro) y en el derecho (A375p6) durante dos semanas. Una vez que los tumores habían crecido hasta aproximadamente 5 mm de diámetro, los péptidos se marcaron radiactivamente con Indio-111 y se analizaron por Radio-HPLC para determinar la eficacia de marcado. Los péptidos marcados se diluyeron en PBS/BSA estéril y se dosificaron para dar 0,3 MBq por animal. Después, los ratones se inyectaron por vía intravenosa (vena de la cola) con el péptido marcado radiactivamente y se sacrificaron después de 1 hora. Se extrajeron la sangre, los órganos y los tumores, se pesaron y se midió la actividad residual en un contador gamma (LKB Compugamma) al día siguiente. Los datos se expresaron como % de dosis inyectada/g de tejido (% ID/g).

Datos de caracterización de péptidos

Péptido H2N-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (1) (SEQ ID NO: 11)

El péptido (1) (97,1 mg, 50 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 13,2 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1224,3; encontrado 1223,6.

Péptido H2N-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQkVART-OH (2) (SEQ ID NO: 12)

El péptido (2) (54,3 mg, 22 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 11,9 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1224,3; encontrado 1223,7.

Péptido H2N-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQ[ornitina]VART-OH (3) (SEQ ID NO: 13)

El péptido (3) (63,5 mg, 26 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,7 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1217,3; encontrado 1216,7.

Péptido N-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQ[ácido diaminobutírico]VART-OH (4) (SEQ ID NO: 14)

El péptido (4) (70,3 mg, 29 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,7 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1210,3; encontrado 1209,8.

Péptido H2N-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQ[ácido diaminopropiónico]VART-OH (5) (SEQ ID NO: 15)

El péptido (5) (59,9 mg, 25 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,9 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1203,2; encontrado 1203,1.

Péptido H2N-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQ-n-MeKVART-OH (6) (SEQ ID NO: 16)

El péptido (6) (72,7 mg, 30 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 11,5 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1231,3; encontrado 1230,7.

Péptido ^N-N^biotina^PNLRGDLQV^cido aminoisobutírico^AQKVART-OH (7) (SEQ ID NO: 17)

El péptido (7) (16,6 mg, 7 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 11,9 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1209,7; encontrado 1210,2.

Péptido H2N-NK(biotina)VPNLRGDLQV[norvalina]AQKVART-OH (8) (SEQ ID NO: 18)

El péptido (8) (19,5 mg, 8 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,2 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1216,8; encontrado 1217,2.

Péptido H2N-NK(biotina)VPNLRGDLQV[norleucina]AQKVART-OH (9) (SEQ ID NO: 19)

El péptido (9) (18,7 mg, 8 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,7 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1223,8; encontrado 1224,7.

Péptido ^N-N^biotina^PNLRGDLQV^Nlglidna^AQKVART-OH (10) (SEQ ID NO: 20)

El péptido (10) (5,5 mg, 2 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 11,7 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1215,7; encontrado 1215,8.

Péptido ^N-N^biotma^PNLRGDLQV^erc-butil-alamna^QKVART-OH (11) (SEQ ID NO: 21)

El péptido (11) (7,5 mg, 3 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,9 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1230,8; encontrado 1230,7.

Péptido H2N-NK(biotina)VPNLRGDLQV[homoleucina]AQKVART-OH (12) (SEQ ID NO: 22)

El péptido (12) (26,1 mg, 11 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 13,1 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1230,8; encontrado 1231,2.

Péptido ^N-N^biotina^PNLRGDLQV^cido 2-amino-3-etilpentanoico]AQKVART-OH (13) (SEQ ID NO: 23) El péptido (13) (10,1 mg, 4 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,9 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1230,8; encontrado 1230,8.

Péptido ^N-N^biotina^PNLRGDLQVfciclohexilalamna^AQKVART-OH (14) (SEQ ID NO: 24)

El péptido (14) (6,2 mg, 2 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 13,4 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1243,8; encontrado 1244,2.

Péptido ^N-N^biotina^PNLRGDLQV^damantilgNcina^AQKVART-OH (15) (SEQ ID NO: 25)

El péptido (15) (22,4 mg, 9 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 13,7 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1262,8; encontrado 1263,3.

El Péptido (16) Péptido AcHN-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (16) (SEQ ID NO: 11)

(con acetilación aminoterminal) (30,1 mg, 12 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con la RP-HPLC analítica. Rt = 13,9 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1244,8; encontrado 1245,2.

Péptido H2N-NK(biotina) VPNLRGDLQVLAQKVART-NH2 (17) (SEQ ID NO: 11) (con amidación carboxiterminal) El péptido (17) (13,4 mg, 5 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 95 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 13,5 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1223,8; encontrado 1223,3.

El Péptido (18) Péptido AcHN-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVART-NH (18) (SEQ ID NO: 11)

(con acetilación aminoterminal y amidación carboxiterminal) (12,5 mg, 5 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 95 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 13,9 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1244,3; encontrado 1244,6.

Péptido H2N-nK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (19) (SEQ ID NO: 8)

El péptido (19) (47,7 mg, 19 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 95 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,6 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1223,8; encontrado 1224,1.

Péptido H2N-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVARt-OH (20) (SEQ ID NO: 26)

El péptido (20) (45,3 mg, 19 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 95 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 13,0 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1223,8; encontrado 1224,2.

Péptido H2N-nK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVARt-OH (21) (SEQ ID NO: 9)

El péptido (21) (36,4 mg, 15 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 95 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,9 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1223,8; encontrado 1224,4.

Péptido DTPA-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (22) (SEQ ID NO: 11) (DTPA aminoterminal)

El péptido (22) (53,7 mg, 24 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 99 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 13,3 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1411,9; encontrado 1411,6.

Péptido DTPA-nK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (25) (SEQ ID NO: 8) (DTPA aminoterminal)

El péptido (25) (37,5 mg, 13 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 95 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,6 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1411,3; encontrado 1410,6.

Péptido DTPA-nK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVARt-OH (26) (SEQ ID NO: 9) (DTPA aminoterminal)

El péptido (26) (12,5 mg, 4 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 95 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,9 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1411,3; encontrado 1410,6.

Péptido DTPA-NK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVART-NH2 (24) (SEQ ID NO: 11) (DTPA aminoterminal y amidación carboxiterminal)

El péptido (24) (12,1 mg, 4 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 95 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 13,0 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc.

1410,8; encontrado 1410,1.

Péptido DTPA-GNK(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVART-OH (23) (SEQ ID NO: 27) (DTPA aminoterminal)

El péptido (23) (41,9 mg, 15 %) se obtuvo como un sólido de color blanco con una pureza > 95 % de acuerdo con RP-HPLC analítica. Rt = 12,6 min (XTerra® C18, 5-95 % de B, 3 % de B/min, 1,0 ml/min); m/z (ESI-MS): [M+2H]2+ Calc. 1439,9; encontrado 1439,2.

Ejemplo 1 - Síntesis de A20FMDV21 biotinilado, péptidos 2-15 modificados con Lys16 o Leu13 y biotinilados, péptidos 16-21 modificados en el extremo N y/o en el extremo C y péptidos 22-26 que contienen (DTPA). Para permitir la investigación de la introducción de aminoácidos no proteinogénicos (enumerados en la figura 1) sobre la actividad de unión de A20FMDV2, los péptidos biotinilados 1-15 (véase la tabla 1), excepto para el péptido 6, se sintetizaron mediante SPPS con Fmoc convencional en el enlazador de ácido hidroximetilfenoxipropiónico (HMPP) susceptible a ácidos que libera un ácido carboxílico carboxiterminal usando las condiciones representadas en el esquema 1. Las secuencias de péptidos deseadas se ensamblaron usando piperidina/DMF al 20 % para eliminar el grupo protector Fmoc y hexafluorofosfato de 0-(benzotriazol-1-il)-W,W,W'W-tetrametiluronio (HBTU)/DIPEA como reactivos de acoplamiento.

Dado que la unión específica a la integrina avp6 se estudiaría mediante citometría de flujo, la alanina natural en el segundo resto en A20FMDV2 (1) y todos los análogos del mismo, se sustituyeron por un resto de lisina biotinilado. Esta sustitución se ha demostrado previamente ser bien tolerada [24,25]. Se eligió instalar el resto D-biotina mediante la desprotección selectiva de un grupo 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo (Dde) [19] en la cadena lateral del grupo Afe-amino seguido de condensación con D-biotina usando HBTU/DIPEA. El ácido trifluoroacético (TFA)/H2O/3,6-dioxa-1,8-octaneditiol (DODT)/triisopropilsilano (TIPS) (94:2,5:2,5:1,0, v/v/v/v) efectuó la escisión de los péptidos sintetizados a partir de las correspondientes peptidil-resinas. Los péptidos 1-15 se obtuvieron con buenos rendimientos que oscilaban entre el 2 %-50 % y una pureza que excedía el 99 % (véanse los datos de caracterización de péptidos).

Para la síntesis del péptido 6 que contiene una modificación de N-L-metilisina, se empleó un protocolo de N-metilación sobre resina [22] que facilitó el péptido 6 con buen rendimiento (30 %) tras la escisión del péptido mediada por TFA y la purificación por RP-HPLC.

El péptido líder, A20FMDV2, que contiene todos los aminoácidos de origen natural sería susceptible de degradación por exopeptidasas que actúan sobre los extremos amino y carboxi. Para minimizar esto, se prepararon seis miméticos de A20FDMV2 biotinilados y modificados en el extremo N y/o C en donde se modificaron sistemáticamente los extremos amino y carboxi (péptidos 16-18) y los aminoácidos aminoterminales y carboxiterminales (Asn1 y Thr20, respectivamente, péptidos 19-21). Los péptidos modificados en el extremo amino y carboxi 16-18 se obtuvieron protegiendo con caperuza el extremo N con anhídrido acético (16) o empleando el enlazador de amida Rink para proporcionar la carboxamida carboxiterminal (17) o una combinación de ambos (péptido 18).

El péptido 19, que lleva el D-Asn1 no natural en lugar del Asn1 natural en el extremo aminoterminal de A20FMDV2 biotinilado (1) se obtuvo usando la vía sintética descrita en el esquema 1 excepto que el componente básico Fmoc-D-Asn (Trt) -OH se incorporó en la síntesis como el resto aminoterminal. Para la preparación de los péptidos 20 y 21, que contiene la D-Thr no natural en el extremo C, la resina anclada a HMP 27 (véase el esquema 1, HMP = ácido hidroximetilfenoxiacético) se esterificó primero con Fmoc-D-Thr(tBu)-OH usando DIC/DMAP y luego la secuencia se alargó mediante SPPS con Fmoc.

Tabla 1. Lista de péptidos sintéticos preparados [N-term] -X1K(biotina)VPNLRGDLQVX2AQX3VARX4-[C-term] que contiene sustituciones de Lys16 (péptidos 2-6) o Leu13 (péptidos 7-15) naturales, variantes carboxiterminal/aminoterminal (péptidos 16-21) y péptidos modificados con DTPA (22-26). NB: nomenclatura, en particular, la numeración de las posiciones X utilizada en esta tabla no es la misma que la utilizada en las reivindicaciones.

Compuesto

X4

C-term. 1 NH2 Asn Leu Lys Thr CO2H

2 NH2 Asn Leu D-Lys Thr CO2H

3 NH2 Asn Leu L-Orn Thr CO2H

4 NH2 Asn Leu ácido 1-2,4- Thr CO2H diaminobutírico

5 NH2 Asn Leu ácido 1-2,3- Thr CO2H diaminopropiónico

6 NH2 Asn Leu A-L-metilisina Thr CO2H

7 NH2 Asn Ácido L-2- Lys Thr CO2H aminoisobutírico

8 NH2 Asn L-norvalina Lys Thr CO2H

9 NH2 Asn L-norleucina Lys Thr CO2H 10 NH2 Asn L-alilglicina Lys Thr CO2H (continuación)

Compuesto N-term. X1 X2 X3 X4 C-term.

11 NH2 Asn L-íercbutilalanina Lys Thr CO2H 12 NH2 Asn L-homoleucina Lys Thr CO2H 13 NH2 Asn Ácido L-2-amino-3- Lys Thr CO2H etilpentanoico

14 NH2 Asn L-ciclohexilalanina Lys Thr CO2H 15 NH2 Asn L-adamantilglicina Lys Thr CO2H 16 Ac-NH Asn Leu Lys Thr CO2H 17 NH2 Asn Leu Lys Thr CONH2 18 Ac-NH Asn Leu Lys Thr CONH2 19 NH2 D-Asn Leu Lys Thr CO2H 20 NH2 Asn Leu Lys D-Thr CO2H 21 NH2 D-Asn Leu Lys D-Thr CO2H 22 DTPA-NH Asn Leu Lys Thr CO2H 23 DTPA-Gly- Asn Leu Lys Thr CO2H

NH

24 DTPA-NH Asn Leu Lys Thr CONH2 25 DTPA-NH D-Asn Leu Lys Thr CO2H 26 DTPA-NH D-Asn Leu Lys D-Thr CO2H

Reactivos y condiciones: (a) piperidina/DMF al 20 % (v/v), ta 1 x 5 min, 1 x 10 min; (b) Fmoc-aminoacido-OH, FIBTU, DIPEA, DMF, ta, 30 min repetir (a) y (b); (c) (BocfeO, DMF, ta, 30 min; (d) hidrazina/DMF al 2 % (v/v), 1 x 5 min, 1 x 10 min; (e) D-biotina, FIBTU, DIPEA, DMF, ta, 30 min; (f) (tBu)DTPA, FIBTU, DIPEA, DMF, ta, 30 min; (g) TFA/H20/DODT/TIPS (94:2,5:2,5:1, v/v/v/v), ta, 3 h

Esquema 1. Protocolo sintético para la preparación de las vanantes del peptido A20FMDV2 biotinilado

Los resultados obtenidos de los ensayos de unión (Tabla 2, véase más adelante) mostraron que la modificación de los extremos N y C de 1 (péptidos 16 y 17 respectivamente) o la sustitución del Asn1 natural, y los restos Asn1 y Thr20 de A20FMDV2 (1) para sus homólogos D (péptidos 19 y 21, respectivamente) dieron como resultado péptidos que mostraron una actividad biológica mejorada en comparación con 1. Cuatro análogos de los mismos modificados en los extremos N y C (16, 18, 19 y 21) se seleccionaron, por lo tanto, para la incorporación del agente quelante DTPA para permitir la realización de estudios de internalización celular y ensayos de degradación en plasma humano. El péptido A20FMDV2 biotilinado que contiene DTPA (22) también se preparó como control [25].

Como se representa en el esquema 1, el péptido A20FMDV2 biotilinado que contiene DTPA 22 y los análogos 23­ 25) se sintetizaron usando condiciones de SPPS con Fmoc (piperidina/DMF al 20 % para la eliminación del grupo protector Fmoc y HBTU/DIPEA como reactivo de acoplamiento). Para fijar DTPA en el extremo N de A20FMDV2 y D-biotina en la cadena lateral de Lys2, el grupo protector Fmoc aminoterminal se eliminó primero usando piperidina/DMF al 20 %, y se acopló DTPA protegido con ferc-butilo [21] al grupo Wor-amino resultante usando HBTU/DIPEA. Como los cuatro ácidos carboxílicos de DTPA estaban protegidos como ácido-lábil ferc-butil ésteres, el grupo protector Dde podría eliminarse selectivamente usando hidrazina/DMF al 2 %y D-biotina acoplada al amino lisilo de cadena lateral usando HBTU/DIPEA. En el caso de los péptidos 23 y 24 para permitir la incorporación del ligando DTPA se empleó un espaciador de glicina para imitar el grupo acetilo de los péptidos 16 y 18 y permitir la fijación fácil de DTPA mediante la formación de enlaces amida.

Ejemplo 2 - Actividad biológica de variantes de péptidos

Para probar cuál de las variantes de péptidos, si la hubiera, es superior al A20FMDV2 original se diseñó una serie de pruebas usando dos líneas celulares (A375Ppuro y A375Pp6) que eran genéticamente idénticas excepto para la expresión de la integrina avp6 en las líneas celulares A375Pp6 [9]. Debido a que A375Ppuro expresa cuatro integrinas (avp3, avp5, avp8 y a5p1) que también se unen a motivos RGD en sus ligandos, comparar la actividad de unión en estas dos líneas celulares se considera un ensayo muy riguroso.

Como ejemplo de los ensayos utilizados para caracterizar el comportamiento de los péptidos modificados 1-15, 16­ 21 y 22-25, la figura 2 muestra una comparación entre los péptidos 22 y 25. A20FMDV2 se une a avp6 > 1000 veces más selectivamente que a otras integrinas [9]. Para confirmar que los péptidos modificados conservaban la especificidad, se determinó cuánto péptido se unió a las células A375Ppuro frente a las células A375Pp6 usando citometría de flujo. La figura 2A muestra que a 1000 nM ninguno del péptido 22 (Ai) ni el péptido 25 (Aii) se unieron a A375Ppuro (histogramas rojos; paneles superiores superior). Por el contrario, ambos péptidos se unieron bien a A375Pp6 (histogramas azules; paneles inferiores) a 100 nM. Estos datos muestran que la especificidad de unión de avp6 se conserva en estas variantes de péptidos. Por otra parte, ninguna variante de péptido se unió a A375Ppuro a 1000 nM (datos no mostrados), lo que muestra que todos los péptidos conservaron la especificidad.

Para determinar si los péptidos modificados se unían tan bien o mejor que el péptido A20FMDV2 biotinilado precursor a 100 nM, se probó la actividad de unión de las variantes a 0, 0,1, 1, 10, 100 y 1000 nM a A375Pp6.

Como ejemplo, la figura 2B muestra que el péptido 22, es mejor que el A20FMDV2 biotinilado obtenido comercialmente, ya que se une un 16 % más a 100 nM. De forma similar, el péptido 25 es incluso mejor ya que a 100 nM la unión es al 150 % del A20FMDV2 biotinilado obtenido comercialmente. Estos datos proceden de experimentos individuales. La tabla 2 muestra la media de hasta cuatro experimentos para todos los péptidos estudiados y muestra en general, que péptido 22 tenía en promedio un 5 % más de actividad que el precursor (es decir, A20FMDV2 biotinilado obtenido comercialmente) y el péptido 25 fue un 36% más alto que el precursor.

Para evaluar la capacidad de que las células los internalicen a 37 °C (y por lo tanto los posibles vectores para las terapias) se utilizó citometría Imagestream® y citometría de flujo. Imagestream® toma una imagen de fluorescencia de cada célula (figura 2C) que permite el análisis de imágenes de la fluorescencia en la superficie frente al compartimento intracelular. Los histogramas de la figura 2C representan gráficamente la internalización en relación con el punto temporal de 0 minutos. Para la citometría de flujo, se monitorizó la pérdida de expresión superficial a medida que se internalizaban los péptidos.

La tabla 2 resume los datos de actividad e internalización de todos los péptidos utilizados en este estudio en relación con el A20FMDV2 biotinilado de origen comercial (el A20FMDV2 biotinilado (1), el sintetizado en este estudio, difiere del A20FMDV2 biotilinado obtenido comercialmente en que el péptido (1) comprende la mutación Ala2Lys utilizada para acoplar D-biotina).

La tabla 2 también proporciona un valor arbitrario para el potencial de cada péptido para el suministro intracelular de fármacos multiplicando el valor de afinidad de unión por la cantidad internalizada para dar un valor de Actividad Relativa. Puede verse que la mayoría de las modificaciones 16Lys y 13Leu redujeron la actividad relativa; con la excepción de los péptidos (7) y (9) cuya actividad relativa fue menor que la del A20FMDV2 biotinilado de control. Por el contrario, la mayoría de los péptidos modificados en los extremos N y C (16-19 y 21) tenía una mejor afinidad de unión y había mejorado la actividad relativa en comparación con el A20FMDV2 biotinilado (1). Por ejemplo, el péptido 19 que tiene una modificación no proteinogénica en el extremo N del aminoácido D-Asn se unió en promedio un 43 % mejor a avp6 celular que el compuesto precursor (tabla 2). En relación con el A20FMDV no modificado, que tiene un valor de 1,0, los péptidos 16 (N-acetilado), 17 (C-amidado), 18 (N-acetilado y C-amidado), 19 (Sustitución D-Asn) y 21 (sustitución tanto D-Asn como D-Thr), tienen valores de actividad relativa del 55 %, 31 %, 9 %, 27 % y 37 % más alto que el péptido de control 1.

Tabla 2. Comparación de datos de internalización para los péptidos sintéticos8 con Lys16 (1-6) o Leu13 (7-15) o _________________ modificajos en el extremo C o N (16-21) y acoplados con DTPA (22-26)._________________ Compuesto A) Afinidad” B) Internalización0 Actividad relativa (AxB)

A20FMDV2a 1,00 1,00 1,00

1e 1,11 ± 0,15 0,84 ± 0,14 0,93

2 1,11 ± 0,15 0,78 ± 0,15 0,87

3 1,12 ± 0,16 0,86 ± 0,29 0,96

4 1,00 ± 0,07 0,86 ± 0,29 0,86

5 0,79 ± 0,14 0,96 ± 0,31 0,76

6 0,37 ± 0,12 0,89 ± 0,32 0,32

7 1,07 ± 0,37 1,11 ± 0,3 1,19

8 0,77 ± 0,52 1,09 ± 0,17 0,84

9 1,16 ± 0,29 1,15 ± 0,04 1,33

10 0,58 ± 0,25 0,82 ± 0,25 0,48

11 0,60 ± 0,23 1,03 ± 0,14 0,62

12 0,45 ± 0,22 0,66 ± 0,14 0,27

(continuación)

Compuesto A) Afinidad” B) Internalizaciónc Actividad relativa (AxB)

13 0,70 ± 0,33 0,52 ± 0,23 0,37

14 0,62 ± 0,06 1,01 ± 0,32 0,62

15 0,51 ± 0,28 1,07 ± 0,18 0,55

16 1,48 ± 0,49 1,05 ± 0,24 1,55

17 1,23 ± 0,25 1,07 ± 0,40 1,31

18 1,25 ± 0,26 0,12 1,09

19 1,43 ± 0,51 0,12 1,27

20 0,53 ± 0,44 0,99 ± 0,25 0,53

21 1,57 ± 0,55 0,27 1,37

22 1,01 ± 0,21 1,05 ± 0,07 1,06

23 1,28 ± 0,23 0,97 ± 0,11 1,24

24 1,19 ± 0,30 0,98 ± 0,12 1,17

25 1,36 ± 0,42 0,99 ± 0,10 1,34

26 1,19 ± 0,40 1,04 ± 0,16 1,24

aLos péptidos específicos (1, 16, 17, 19, 21) estaban acoplados con DTPA.

* Actividad relativa media en relación con A20FMDV2 biotilinado (100 nM).

cMedia del % de internalización a los 45 min en relación con A20FMDV2 biotinilado (100 nM) usando citometría de flujo.

dDOTA-A20FMDV2 biotinilado obtenido comercialmente. 0A20FMDV2 biotinilado sintetizado en el presente trabajo.

De manera alentadora, la conjugación de DTPA a péptidos líderes (16, 17, 19, 21) para crear los péptidos 23-26, respectivamente, tuvo muy poco efecto sobre la afinidad de unión o internalización y, por tanto, mantuvieron su actividad relativa aumentada.

Ejemplo 3 - Estudios de estabilidad en plasma y biodistribución

La figura 3 muestra la estabilidad de los péptidos conjugados con DTPA (22-26) en plasma (barras rojas; barra de la derecha para cada péptido) frente a ^p B^s (barras negras; barra de la izquierda para cada péptido) a 37 °C, en relación con un punto temporal de 0 minutos. Los datos muestran que después de 24 ha 37 °C en PBS solamente se ha degradado aproximadamente el 10 % del péptido. Por el contrario, mientras que los péptidos (22, 25, 26) muestran niveles similares (77 % -80 %) permaneciendo en plasma después de 24 horas, hay una gran degradación del péptido (23) (permaneciendo el 60 %) y péptido (24) (permaneciendo el 52 %). Por lo tanto, las modificaciones de los péptidos 24 y 23 (amidación carboxiterminal y acetilación aminoterminal, respectivamente) tienen una mayor susceptibilidad a la degradación en plasma en relación con el péptido precursor de control (1). La modificación de péptidos mediante manipulación química utilizando D aminoácidos (D-Asn, compuesto 25, y D-Asn/D-Thr, compuesto 26) fue óptima para mejorar la susceptibilidad a las proteasas plasmáticas humanas.

A los ratones inmunodeprimidos (n = 3-5) que portaban tumores A375Ppuro y A375Pp6 en hombros opuestos se les administraron inyecciones intravenosas (iv) de 300 Bq de los péptidos marcados radiactivamente 22-26 a continuación, se les sacrificó 1 h después. Los principales órganos y sangre se recogieron de inmediato, se pesaron y se determinó la radiactividad. Los datos de la tabla 3 muestran el comportamiento de los cinco péptidos conjugados con DTPA probados; los datos se expresan como la media del % de dosis inyectada/g de tejido.

T l . D i i ri i n m i ID ± EM r l i m r n 111In- DTPA 22-2

(continuación)

Al igual que con los estudios anteriores de los presentes inventores, existe una retención significativa en el tracto gastrointestinal (estómago e intestinos) y también en los pulmones [9, 24]. La retención renal, que se indicó que es independiente de avp6 [9], es muy variada para los cinco péptidos mostrando los péptidos 25 y 26 la menor retención y mostrando los péptidos 23 y 24 una retención mucho mayor que el péptido 22, que es el A20FMDV2 biotinilado precursor. Hay una fuerte captación selectiva de cada péptido por el tumor avp6 positivo en comparación con el tumor de control avp6 negativo. La figura 4 destaca estas diferencias en un histograma. Si bien no existe un aumento estadístico de la captación de los péptidos 23-26 frente al péptido precursor marcado con DTPA 22, todas las variantes tienen una relación media de retención ligeramente superior en el tumor avp6 positivo frente al tumor avp6 negativo en comparación con el péptido de control. 22. La relación más alta de retención en el tumor avp6 positivo frente al tumor avp6 negativo en comparación con el péptido de control 22 se observó con el péptido 25. Análisis

El péptido lineal de 20 restos A20FMDV2 muestra alta especificidad y afinidad por la integrina avp6 relacionada con tumores, y también muestra internalización dependiente de avp6 en las células. Por lo tanto, A20FMDV2 se considera un compuesto líder prometedor para suministrar cargas terapéuticas (p. ej., cargas quimioterapéuticas útiles) a las células cancerosas que expresan avp6. En los ejemplos anteriores, se han investigado los impactos de los sustitutos no proteinogénicos de los restos de aminoácidos naturales de A20FMDV2 sobre el comportamiento in vitro, la estabilidad en plasma y la biodistribución in vivo.

Todos los péptidos descritos en el presente documento se sintetizaron con buen rendimiento y excelente pureza mediante SPPS con Fmoc. Los estudios de unión a la integrina avp6 mostraron que todos los análogos de A20FMDV2 se unían solamente a las células A375Pp6 pero no a las células A375Ppuro, lo que demuestra que la especificidad no se había visto afectada por las modificaciones. Por otra parte, los péptidos que incorporan un extremo N acetilado y un extremo C amidado o la versión D no natural de los restos 1Asn y 20Thr naturales mostraron una actividad de unión a avp6 más potente que el péptido precursor (A20FMDV2) y también fueron más potentes que la mayoría de los péptidos que contenían sustitutos no proteinogénicos de los restos 16Lys y 13Leu naturales. Por ejemplo, el péptido 19 que tiene una modificación no proteinogénica en el extremo N del aminoácido D-Asn se unió en promedio un 43 % mejor a avp6 celular que el compuesto precursor (tabla 2).

Se ha evaluado la estabilidad en el plasma sanguíneo humano y se ha demostrado que los péptidos permanecieron intactos durante mucho más tiempo que los estudios previos de los presentes inventores en suero de ratón, lo que sugiere que el plasma humano es menos degradante que el suero de ratón para estos péptidos. Aunque más del 90 % de todos los péptidos marcados radiactivamente permanecieron intactos en PBS después de 24 h a 37 °C, solamente A20FMDV2 que contiene D aminoácidos 25 y 26 permaneció casi intacto (76-80 %) después de 24 h en plasma humano a 37 °C.

Las modificaciones solamente tuvieron efectos moderados sobre el grado de internalización en las células que expresan avp6. Por lo tanto, la tabla 2 muestra que para todos los péptidos probados, la internalización varió de 0,78 a 1,11 veces en relación con el A20FMDV2 biotinilado comercial. Debido a que es necesario considerar tanto la afinidad de unión como la internalización del péptido para el suministro de un agente citotóxico intracelular, la tabla 2 también muestra un valor arbitrario para la actividad relativa de cada péptido. El péptido de control tiene un valor de 1.0 mientras que los péptidos 16, 19, 17, 18, y 21, tienen valores de actividad relativa del 55 %, 27 %, 31 %, 9 % y 37 % más alto que el péptido de control, respectivamente.

Para que los péptidos que se dirigen a avp6 administren terapias, deben retenerse selectivamente en tumores que expresan avp6. En estudios de biodistribución, se encontró que los cinco péptidos líder probados (22-26) se retuvieron selectivamente en los tumores avp6 positivos al menos a niveles de seis a diez veces más altos que en los tumores avp6 negativos. Es alentador que todos los péptidos modificados fueran ligeramente mejores que el péptido marcado con DTPA biotinilado 22. Los presentes resultados muestran que la modificación química de A20FMDV2 ha mejorado su capacidad para localizar selectivamente cánceres que expresan avp6.

Bibliografía

Se citan anteriormente varias publicaciones con el fin de describir y divulgar de manera más completa la invención y el estado de la técnica al que pertenece la invención. Las citas completas de estas referencias se proporcionan a continuación.

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Las realizaciones específicas descritas en el presente documento se ofrecen a modo de ejemplo, no a modo de limitación. Todos los subtítulos en el presente documento se incluyen solo por comodidad, y no deben interpretarse como que limitan la divulgación de ninguna manera.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que se une selectivamente a la integrina avp6, teniendo el péptido una secuencia de aminoácidos que comprende el motivo X-iBnRGDLX2X3X4ZmX5 (SEQ ID NO: 3), en donde X1 es D-Asn, Bn es una secuencia de cualquier número n de aminoácidos, que pueden ser naturales o no naturales, D- o L-, y pueden ser iguales o diferentes, en donde n es un número entre 1 y 10, X2 y X3 se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido, X4 es Leu o Ile, Zm es una secuencia de cualquier número m de aminoácidos, que pueden ser naturales o no naturales, D- o L-, y pueden ser iguales o diferentes, en donde m es un número entre 1 y 10 y en donde X5 es cualquier L- o D-aminoácido.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la longitud del péptido es de entre 17 y 25 aminoácidos, opcionalmente, en donde la longitud del péptido es de 20 aminoácidos y/o en donde X5 es L-Thr o D-Thr y/o en donde X4 es Leu.

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde n es 5 y/o m es 6 y/o en donde Bn es AVPNL (SEQ ID NO: 4), KVPNL (SEQ ID NO: 5) o K(biotina)VPNL y/o en donde Zm es AQKVAR (SEQ ID NO: 6).

4. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de aminoácidos del péptido se selecciona del grupo que consiste en:

H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (SEQ ID NO: 7);

H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (SEQ ID NO: 8);

H2N-[D-Asn]-K(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVART-COOH (SEQ ID NO: 8);

H2N-[D-Asn]-KVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (SEQ ID NO: 9);

H2N-[D-Asn]-K(biotina)VPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (SEQ ID NO: 9); y

H2N-[D-Asn]-AVPNLRGDLQVLAQKVAR[D-Thr]-COOH (SEQ ID NO: 10).

5. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el péptido está N-acetilado y/o C-amidado.

6. Un conjugado que comprende un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 conjugado directamente o mediante un enlazador a un resto terapéutico, un polímero, un polipéptido y/o un resto detectable.

7. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el resto terapéutico comprende un agente anticanceroso y opcionalmente, en donde el agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en: una auristatina, un maitansinoide, una tubulisina, duocarmicina, caliqueamicina, alfa-amanitina, una pirrolobenzodiazepina, irinotecán y una indolcarboxamida, o un profármaco o un metabolito activo de los mismos y, opcionalmente, en donde el agente anticanceroso comprende: monometil auristatina E (MMAE), mertansina (DM1), ravtansina (DM4) o centanamicina.

8. El conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en donde el resto terapéutico comprende un isótopo radiactivo seleccionado del grupo que consiste en: 177Lu, 90Y, 211At, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 223Ra, 44Sc, 67Ga, 131I, 188Re, 186Re y 67Cu.

9. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el resto detectable se puede detectar mediante obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), espectroscopia de resonancia magnética (MRS), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), tomografía de emisión de positrones (PET) u obtención de imágenes ópticas y, opcionalmente, en donde el resto detectable comprende un fluoróforo, un radionúclido o un marcador de spin y, opcionalmente, en donde el resto detectable comprende: 68Ga, IRDye® 700, IRDye® 800, isotiocianato de fluoresceína (FITC), 89Zr, 124I, 64Cu, 62Cu, 18F, 86Y, 111In, 131I, 123I, 67Ga o 99mTc.

10. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde el resto detectable comprende 111In acoplado al péptido mediante un enlazador que comprende un quelante, opcionalmente en donde el quelante comprende ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido tetrazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y/o, en donde el polímero comprende uno o más, preferentemente uno o dos, grupos etilenglicol o una o más, preferentemente una o dos, cadenas de polietilenglicol (PEG) y opcionalmente, en donde la una o más, preferentemente una o dos, cadenas de PEG tienen entre 1 y 50 unidades de etilenglicol de longitud.

11. Una composición farmacéutica que comprende:

un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10; y

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 o una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 11 para su uso en medicina.

13. Un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 o una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 11 para su uso en un método de tratamiento de un tumor que expresa avp6 en un sujeto mamífero.

14. El péptido, el conjugado o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el tumor es un tumor de cuello de útero, un tumor de cabeza o cuello, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor de piel, un tumor de colon, un tumor de ovario o un tumor de páncreas.

15. Un conjugado como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 para su uso en un método de diagnóstico de cáncer in vivo en un sujeto mamífero, en donde el método comprende administrar el conjugado al sujeto y detectar dicho resto detectable diagnosticando así la presencia de un tumor que expresa avp6 en el sujeto.