ES2841904T3 - Anticuerpos antiacetaminofén y aductos acetaminofén-proteína - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado, en el que el anticuerpo enlaza específicamente un aducto acetaminofén-proteína pero no enlaza específicamente acetaminofén libre y reconoce el inmunógeno: proteína portadora-2-iminotiolano-APAP, en el que el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3; (d) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4; (e) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5; y (f) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos antiacetaminofén y aductos acetaminofén-proteína

Derechos gubernamentales

La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno de Estados Unidos bajo R42 DK079387-03 otorgado por los NIH. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos número 62/086,923, presentada el 3 de diciembre de 2015.

Campo de la invención

La presente divulgación proporciona anticuerpos aislados que se enlazan a aductos acetaminofén-proteína que son útiles en la detección y diagnóstico de toxicidad inducida por acetaminofén.

Antecedentes de la invención

El acetaminofén (APAP) es el producto farmacéutico más común asociado con toxicidad de fármacos. En casos graves, la sobredosis de APAP puede provocar insuficiencia hepática aguda (ALF) y la muerte. Más de 100.000 llamadas telefónicas relacionadas con la sobredosis de APAP se realizan anualmente a los centros de control de intoxicaciones en los Estados Unidos. La FDA estima que aproximadamente 450 muertes están relacionadas con la sobredosis de APAP anualmente. Para los pacientes que buscan tratamiento dentro de las 24 horas posteriores a una sobredosis de APAP y pueden proporcionar información precisa sobre la hora y cantidad de APAP ingerida, la sobredosis de APAP es relativamente fácil de diagnosticar y tratar. Sin embargo, los procedimientos actuales para diagnosticar la sobredosis de APAP, como el nomograma de Rumack, no son muy útiles para diagnosticar a los pacientes después de 24 horas con una sobredosis de APAP, cuando no se dispone de información sobre la hora y dosis de APAP ingerida, o los pacientes que consumen alcohol, los que ingieren dosis supraterapéuticas de APAP de manera crónica, o los que usan formulaciones de APAP de liberación sostenida. Otras pruebas de laboratorio, como la alanina aminotransferasa sérica (ALT) y la aspartato aminotransferasa sérica (AST), indican la aparición de daño hepático, pero ninguno de los bioindicadores es específico de una sobredosis de APAP.

Previamente, se han generado anticuerpos de conejos que se enlazan específicamente a aductos acetaminofénproteína (Roberts et al., J Pharmacol Exp Ther. 1987 May; 241 (2):527-33). Los dispositivos y procedimientos para detectar y medir la cantidad de aductos acetaminofén-proteína se han descrito previamente en el documento US2012/301,897 (del cual el documento WO2009/131998 es una solicitud correspondiente). Existe una necesidad en la técnica de un procedimiento para diagnosticar con precisión la toxicidad por APAP, incluida la intoxicación por APAP oculta, incluso 24 horas o más después de la sobredosis.

Sumario de la invención

En un aspecto de la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado, en el que el anticuerpo enlaza específicamente un aducto acetaminofén-proteína pero no enlaza específicamente acetaminofén libre y reconoce el inmunógeno: proteína portadora-2-iminotiolano-APAP. El anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3; (d) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4; (e) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5; y (f) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6. Las realizaciones se proporcionan en las reivindicaciones dependientes. También se describe en la presente memoria un anticuerpo aislado que enlaza específicamente un aducto acetaminofén-proteína pero no enlaza específicamente acetaminofén libre y reconoce el inmunógeno: proteína portadora-2-iminotiolano-APAP.

También se describe en la presente memoria un anticuerpo aislado que enlaza específicamente un aducto acetaminofén-proteína pero no enlaza específicamente al acetaminofén libre y comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6 con cero a dos sustituciones de aminoácidos o la SEQ ID NO:12 con sustituciones de cero a dos aminoácidos.

También se describe en la presente memoria un anticuerpo aislado que enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína pero no enlaza específicamente al acetaminofén libre y comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3 con cero a dos sustituciones de aminoácidos o la SEQ ID NO:9 con sustituciones de cero a dos aminoácidos.

También se describe en la presente memoria un anticuerpo aislado que enlaza específicamente un aducto acetaminofén-proteína pero no enlaza específicamente al acetaminofén libre y comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de Leu-Gly-h y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24, en la que h es un aminoácido hidrófobo seleccionado del grupo que consiste en alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina y triptófano.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para medir la cantidad de aducto acetaminofénproteína en una muestra biológica. El procedimiento comprende medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto por inmunoensayo que comprende al menos un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína pero no se enlaza específicamente al acetaminofén libre, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1-12 con cero a dos sustituciones de aminoácidos o en el que el anticuerpo se enlaza específicamente a un aducto acetaminofén-proteína aproximadamente 2.000 veces más eficazmente que el acetaminofén libre.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para detectar la toxicidad inducida por acetaminofén en un sujeto, el procedimiento comprende (i) medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto mediante inmunoensayo usando al menos un anticuerpo aislado que enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína pero no se enlaza específicamente al acetaminofén libre. El anticuerpo se enlaza específicamente a un aducto acetaminofén-proteína 8.000 veces más eficazmente que el acetaminofén libre, en el que el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3; (d) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4; (e) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5; y (f) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6. El procedimiento comprende (ii) comparar la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra con un valor de referencia, en el que una mayor cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra comparado con el valor de referencia indica toxicidad inducida por acetaminofén en el sujeto. Las realizaciones se proporcionan en las reivindicaciones dependientes. También se describe en la presente memoria un procedimiento para detectar la toxicidad inducida por acetaminofén en un sujeto. El procedimiento comprende (i) medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto mediante inmunoensayo usando al menos un anticuerpo aislado que enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína pero no enlaza específicamente al acetaminofén libre, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1-12 con cero a dos sustituciones de aminoácidos o en la que el anticuerpo se enlaza específicamente a un aducto acetaminofénproteína aproximadamente 2.000 veces más eficazmente que el acetaminofén libre. El procedimiento comprende (ii) comparar la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra con un valor de referencia, en el que una mayor cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra en comparación con el valor de referencia indica toxicidad inducida por acetaminofén en el sujeto.

En otros aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para determinar si la hepatotoxicidad en un sujeto se debe a la toxicidad inducida por acetaminofén. El procedimiento comprende (i) medir la presencia y/o cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto mediante inmunoensayo usando al menos un anticuerpo aislado que enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína pero que no enlaza específicamente al acetaminofén libre, en el que el anticuerpo se enlaza específicamente a un aducto acetaminofénproteína 8.000 veces más eficazmente que el acetaminofén libre. El anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3; (d) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4; (e) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5; y (f) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6. El procedimiento comprende (ii) determinar si está presente un aducto acetaminofén-proteína, en el que si no está presente un aducto acetaminofén-proteína, la hepatotoxicidad en el sujeto no se debe a la toxicidad inducida por acetaminofén y en la que, si está presente un aducto acetaminofén-proteína, comparar la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra con un valor de referencia, en el que una mayor cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra en comparación con el valor de referencia indica que la hepatotoxicidad en el sujeto se debe a la toxicidad inducida por acetaminofén.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para determinar si la hepatotoxicidad en un sujeto se debe a la toxicidad inducida por acetaminofén. El procedimiento comprende (i) medir la presencia y/o la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto mediante inmunoensayo usando al menos un anticuerpo aislado que enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína pero que no enlaza específicamente al acetaminofén libre, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1-12 con cero a dos sustituciones de aminoácidos o en el que el anticuerpo se enlaza específicamente a un aducto acetaminofén-proteína aproximadamente 2.000 veces más eficazmente que el acetaminofén libre; y (ii) determinar si está presente el aducto acetaminofén-proteína, en el que si no está presente el aducto acetaminofén-proteína, la hepatotoxicidad en el sujeto no se debe a la toxicidad inducida por acetaminofén y en el que si está presente el aducto acetaminofén-proteína, comparar la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra a un valor de referencia, en el que una mayor cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra en comparación con el valor de referencia indica que la hepatotoxicidad en el sujeto se debe a la toxicidad inducida por acetaminofén.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal con especificidad por un aducto acetaminofén-proteína. El procedimiento comprende inmunizar a un sujeto con un inmunógeno que comprende la proteína portadora-2-iminotiolano-APAP. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un inmunoensayo que comprende al menos un anticuerpo aislado de acuerdo con la invención.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 representa un ensayo ELISA que muestra el enlace del anticuerpo 14-12 al antígeno ATD-1.

La Figura 2 representa un ELISA competitivo que muestra la especificidad del anticuerpo 14-12 para aductos APAP-proteína frente a APAP libre no enlazado.

La Figura 3 representa un ELISA competitivo de los clones 14-12 y 22-8 de RMAb. El gráfico muestra la potencia relativa del fármaco original (APAP) frente al aducto (APAP-proteína) como inhibidor.

La Figura 4 representa el enlace de 14-12 y 22-8 de RMAb al aducto acetaminofén-proteína inmovilizado en la banda de prueba en ensayos de flujo lateral.

La Figura 5 representa un ensayo de flujo lateral competitivo con 14-12 y 22-8 de RMAb. El gráfico muestra la potencia relativa del fármaco original (APAP) frente al aducto (APAP-proteína) como inhibidor.

La Figura 6 representa la inhibición de los aductos APAP-proteína y APAP en un ensayo de flujo lateral competitivo en base a RMAb. El aducto APAP-proteína es un aducto APAP-proteína formado fisiológicamente a partir del suero de un paciente con toxicidad por APAP.

Descripción detallada de la invención

La divulgación proporciona anticuerpos que reaccionan específicamente con aductos acetaminofén-proteína que se forman fisiológicamente durante la patogénesis de la toxicidad mediada por acetaminofén. Los anticuerpos de la invención no reaccionan específicamente con acetaminofén libre.

La divulgación también proporciona procedimientos de uso de los anticuerpos de la invención. Los anticuerpos de la invención se pueden usar para detectar aductos acetaminofén-proteína en una muestra biológica o diagnosticar la toxicidad mediada por acetaminofén en un sujeto.

Además, la divulgación proporciona un inmunógeno novedoso con el fin de preparar anticuerpos con especificidad para aductos acetaminofén-proteína. Específicamente, el inmunógeno es la proteína portadora-2-iminotiolano unido a acetaminofén. El nuevo inmunógeno se preparó modificando una proteína portadora inmunogénica (CP) con 2-iminotiolano (2-IT) para proporcionar una CP altamente sustituida con numerosas moléculas enlazadoras de 5 carbonos con grupos sulfhidrilo terminales. Esta CP modificada con 2-IT se modificó luego covalentemente en los grupos sulfhidrilo terminales mediante reacción con imina de N-acetil-p-benzoquinona preparada sintéticamente. I. Anticuerpos

La toxicidad inducida por acetaminofén (APAP) está mediada por el enlace covalente del metabolito reactivo N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI) a proteínas esenciales en el hígado. En dosis terapéuticas, el metabolito se desintoxica eficazmente por conjugación con glutatión para formar un conjugado de 3-(glutatión-S-il)acetaminofén. Después de una sobredosis, esta reacción agota el glutatión del hígado y el metabolito se enlaza covalentemente a las proteínas hepáticas. El principal aducto formado en este escenario es el aducto acetaminofén-cisteína, 3-(cisteína-S-il)acetaminofén. Los anticuerpos antiaducto acetaminofén-proteína de la divulgación incluyen anticuerpos que enlazan aductos proteicos de acetaminofén.

Como se señaló anteriormente, el acetaminofén puede formar aductos de proteínas por conjugación con aminoácidos. Los anticuerpos antiaducto acetaminofén-proteína de la divulgación incluyen anticuerpos que se enlazan a uno o más aductos acetaminofén-proteína. Específicamente, un anticuerpo de aducto acetaminofénproteína de la divulgación se enlaza a una cisteína modificada con acetaminofén en la cadena polipeptídica de cualquier proteína en aducto. En algunas realizaciones, un anticuerpo antiaducto acetaminofén-proteína enlaza a un aducto 3-(cisteína-S-il)acetaminofén-proteína. En otras realizaciones, un anticuerpo de antiaducto acetaminofénproteína enlaza a un aducto 3-(glutatión-S-il)acetaminofén-proteína. En diferentes realizaciones, un anticuerpo de antiaducto acetaminofén-proteína enlaza mercapturato de acetaminofén. En otras realizaciones, un anticuerpo antiaducto acetaminofén-proteína se enlaza a un aducto acetaminofén-proteína en una proteína modificada por NAPQI. Cualquier proteína con una cisteína sulfhidrilo expuesta es una candidata para la reacción con NAPQI y la formación resultante del aducto 3-(cisteína-S-il)acetaminofén-proteína. Ejemplos no limitantes de proteínas modificadas por NAPQI incluyen betaína-homocisteína S-metiltransferasa 1 (BHMT), aspartato aminotransferasa citoplasmática (cAspAT), enzima ramificadora 1,4-alfa-glucano, formimidoiltransferasa-ciclodesaminasa (FTCD), distrofina, aldehído deshidrogenasa, ATP sintasa de cadena alfa mitocondrial, calregulina, carbamoilfosfato sintetasa I, carbonato deshidratasa III (CA-III), aldehído deshidrogenasa (AHD-M1), glutamato deshidrogenasa (GDH), glutamato-amoniaco ligasa, glutatión peroxidasa celular, glutatión transferasa (GST), glutatión S-transferasa P 1, GAPDH, AdoMet sintetasa 1, proteína de estrés de 23 kDa de macrófagos, elF-4A-I, proteína enlazadora de acetaminofén de 56 kDa, L-iditol 2-deshidrogenasa, amina N-metiltransferasa, proteína antioxidante 1, tropomiosina 3, urato oxidasa, 10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa, hemoglobina, proteína enlazadora de selenio de 56 kDa, lamina A, proteína enlazadora de hormona tiroidea celular, proteína microsomal de 58 kDa, embrión de ratón Life Tech 8 5dpc 10664019 Clon de ADNc de Mus musculus, pirofosfatasa inorgánica, NML Clon de ADNc de Mus musculus, 2-4-dienoil-CoA reductasa mitocondrial, 3-HAI, 3-hidroxiantranilato 3-4-dioxigenasa, proteína regulada por glucosa de 94 kDa, inhibidor citosólico de Nrf2, albúmina sérica y proteína de respuesta temprana retardada 6.

En todos los casos, un anticuerpo de la divulgación enlaza específicamente a uno o más aductos acetaminofénproteína pero no enlaza específicamente al acetaminofén libre. Por consiguiente, un anticuerpo de la divulgación enlaza el aducto acetaminofén-proteína de manera más eficaz que acetaminofén libre. También se describe en la presente memoria donde un anticuerpo aducto acetaminofén-proteína se enlaza a una proteína de acetaminofén aproximadamente 100, aproximadamente 250, aproximadamente 500, aproximadamente 1.000, aproximadamente 1.500, aproximadamente 2.000, aproximadamente 2.500, aproximadamente 3.000, aproximadamente 3.500, aproximadamente 4.000, aproximadamente 4.500, aproximadamente 5.000, aproximadamente 5.500, aproximadamente 6.000, aproximadamente 6.500, aproximadamente 7.000, aproximadamente 7.500, aproximadamente 8.000, aproximadamente 8.500, aproximadamente 9.000, aproximadamente 9.500 o aproximadamente 10.000 veces más eficazmente que acetaminofén libre. También se describe donde un anticuerpo aducto acetaminofén-proteína se enlaza a un aducto acetaminofén-proteína aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.000, aproximadamente 2.000 a aproximadamente 3.000, aproximadamente 3.000 a aproximadamente 4.000, aproximadamente 4.000 a aproximadamente 5.000, aproximadamente 5.000 a aproximadamente 6.000, aproximadamente 6.000 a aproximadamente 7.000, aproximadamente 7.000 a aproximadamente 8.000, o aproximadamente 8.000 a aproximadamente 9.000 veces más eficazmente que el acetaminofén libre. También se describe dónde un anticuerpo aducto acetaminofén-proteína se enlaza a una proteína de acetaminofén aproximadamente 2.000 veces más eficazmente que acetaminofén libre. En una realización, un anticuerpo aducto acetaminofén-proteína se enlaza a una proteína de acetaminofén aproximadamente 8.000 veces más eficazmente que acetaminofén libre. La frase "enlaza específicamente" en la presente memoria significa que los anticuerpos se enlazan al aducto acetaminofén-proteína con una constante de afinidad o afinidad de interacción (KD) en el intervalo de 0,1 pM a 10 nM, siendo un intervalo preferido de 0,1 pM a 1 nM. Se conocen en la técnica procedimientos para determinar si un anticuerpo se enlaza a aductos acetaminofénproteína. En determinadas realizaciones, los anticuerpos específicos pueden reconocer una cisteína modificada con acetaminofén en la cadena polipeptídica de cualquier proteína en aducto. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos pueden reconocer un aducto 3-(cisteína-S-il)acetaminofén- proteína. En otras realizaciones, los anticuerpos específicos pueden reconocer un aducto 3-(glutatión-S-il)acetaminofén-proteína. En otras realizaciones más, los anticuerpos pueden reconocer un mercapturato de acetaminofén.

Los anticuerpos antiaducto acetaminofén-proteína útiles en la presente memoria también incluyen todos los anticuerpos que enlazan específicamente aductos acetaminofén-proteína en una muestra biológica. En una realización ejemplar, los anticuerpos antiaducto acetaminofén-proteína útiles en la presente memoria incluyen todos los anticuerpos que enlazan específicamente 3-(cisteína-S-il)acetaminofén presente en una muestra biológica.

En un aspecto, los anticuerpos útiles en la presente memoria incluyen aquellos anticuerpos que se han aislado, caracterizado, purificado, son funcionales y se han recuperado (obtenido) para su uso en un ensayo para detectar el aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto vivo y predecir el desarrollo de toxicidad por acetaminofén en el sujeto. En otro aspecto, los anticuerpos útiles en la presente memoria incluyen aquellos anticuerpos que se han aislado, caracterizado, purificado, son funcionales y se han recuperado (obtenido) para su uso en un ensayo para detectar el aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto vivo y diagnosticar el desarrollo de toxicidad por acetaminofén en el sujeto. En otro aspecto, los anticuerpos útiles en la presente memoria incluyen aquellos anticuerpos que se han aislado, caracterizado, purificado, son funcionales y se han recuperado (obtenido) o para su uso en un ensayo para detectar el aducto acetaminofénproteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto vivo y clasificar al sujeto como de mayor riesgo de desarrollar toxicidad por acetaminofén en la vida del sujeto. Los anticuerpos útiles en la presente memoria incluyen aquellos anticuerpos que se han aislado, caracterizado, purificado, son funcionales y se han recuperado (obtenido) para su uso y se enumeran en la Tabla A, así como variantes de los mismos (por ejemplo, formas humanizadas, formas quiméricas y fragmentos inmunológicos).

Tabla A. Anticuerpos de la invención

El término "anticuerpo" incluye el término "anticuerpo monoclonal". "Anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de una única copia o clon, que incluye, por ejemplo, cualquier clon eucariota, procariota o fago. El "anticuerpo monoclonal" no se limita a los anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridomas. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando, por ejemplo, técnicas de hibridomas bien conocidas en la técnica, así como tecnologías recombinantes, tecnologías de despliegue de fago, tecnologías sintéticas o combinaciones de dichas tecnologías y otras tecnologías fácilmente conocidas en la técnica. Además, el anticuerpo monoclonal puede marcarse con un marcador detectable, inmovilizarse en una fase sólida y/o conjugarse con un compuesto heterólogo (por ejemplo, una enzima o toxina) de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Además, por "anticuerpo" se entiende un anticuerpo monoclonal funcional, o un fragmento inmunológicamente eficaz del mismo; tal como un fragmento Fab, Fab' o F(ab')2 del mismo. En algunos contextos en la presente memoria, los fragmentos se mencionarán específicamente para enfatizar; no obstante, se entenderá que independientemente de si se especifican los fragmentos, el término "anticuerpo" incluye tales fragmentos, así como formas de cadena sencilla. Siempre que la proteína conserve la capacidad de enlazar específicamente su objetivo pretendido, se incluye dentro del término "anticuerpo". También se incluyen dentro de la definición "anticuerpo", por ejemplo, formas de cadena sencilla, generalmente designadas regiones Fv, de anticuerpos con esta especificidad. Opcionalmente, los anticuerpos útiles en el descubrimiento se producen de manera recombinante, ya que se requiere la manipulación de los anticuerpos típicamente de conejo u otros anticuerpos no humanos con la especificidad apropiada para convertirlos a la forma humanizada. Los anticuerpos pueden estar glicosilados o no. Los anticuerpos se entrecruzan adecuadamente mediante enlaces disulfuro, como se sabe.

La unidad básica de anticuerpo de un anticuerpo útil en la presente memoria comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.

Los anticuerpos antiaducto acetaminofén-proteína útiles en la presente memoria incluyen aquellos que se aíslan, caracterizan, purifican, funcionan y se han recuperado (obtenido) de un proceso para su preparación y, por lo tanto, están disponibles para su uso en la presente memoria en una forma útil en una cantidad suficiente para diagnóstico. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más.

Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas forman el sitio de enlace del anticuerpo. Por tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de enlace. Las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad (en lo sucesivo denominadas "CDR"). Las CDR de las dos cadenas están alineadas por las regiones marco, lo que permite enlace a un epítopo específico. Desde el terminal N al terminal C, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 respectivamente. La asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza de acuerdo con convenciones conocidas (ver, Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest" National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991; Chothia, et al, J. Mol. Bio. (1987) 196:901-917; Chothia, et al., Nature (1989) 342:878-883).

Pueden generarse anticuerpos monoclonales antiaducto acetaminofén-proteína con la especificidad apropiada mediante técnicas estándar de inmunización de mamíferos, formando hibridomas a partir de las células productoras de anticuerpos de dichos mamíferos o inmortalizándolos de otra manera, y cultivando los hibridomas o células inmortalizadas para evaluar su especificidad apropiada. Dichos anticuerpos podrían generarse inmunizando a un ser humano, conejo, rata o ratón, por ejemplo, con un inmunógeno como se describe en la Sección III. Los materiales para la manipulación recombinante pueden obtenerse recuperando las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo deseado del hibridoma u otra célula que lo produzca. Estas secuencias de nucleótidos pueden luego manipularse y aislarse, caracterizarse, purificarse y recuperarse para su uso en la presente memoria.

En una realización, se puede humanizar un anticuerpo de la invención. Como se usa en la presente memoria, "anticuerpo humanizado" incluye un anticuerpo anti acetaminofén que está compuesto parcial o totalmente de secuencias de aminoácidos derivadas de una línea germinal de anticuerpo humano alterando la secuencia de un anticuerpo que tiene regiones determinantes de complementariedad no humanas ("CDR"). La alteración más simple de este tipo puede consistir simplemente en sustituir la región constante de un anticuerpo humano por la región constante murina o de conejo, dando así como resultado una quimera humana/murina o de conejo que puede tener una inmunogenicidad suficientemente baja para ser aceptable para uso farmacéutico. Sin embargo, preferiblemente, la región variable del anticuerpo también se humaniza mediante técnicas que ahora son bien conocidas en la técnica. Las regiones marco de las regiones variables se sustituyen por las regiones marco humanas correspondientes dejando la CDR no humana sustancialmente intacta. Los marcos sustancialmente humanos tienen al menos un 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia estructural humana conocida. También se pueden producir anticuerpos humanos totalmente útiles en ratones modificados genéticamente cuyos sistemas inmunitarios se han alterado para corresponder con los sistemas inmunitarios humanos. Como se mencionó anteriormente, es suficiente para su uso en los procedimientos de este descubrimiento, emplear un fragmento inmunológicamente específico del anticuerpo, incluidos los fragmentos que representan formas de cadena sencilla.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse como proteínas de fusión conocidas como fragmentos variables de cadena sencilla (scFv). Estos scFv están compuestos por regiones variables de cadena pesada y ligera conectadas por un conector. En la mayoría de los casos, pero no en todos, el conector puede ser un péptido. Un péptido conector tiene preferiblemente de aproximadamente 10 a 25 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, un péptido conector es rico en glicina, así como en serina o treonina. Los scFv pueden usarse para facilitar el despliegue de fagos o pueden usarse para citometría de flujo, inmunohistoquímica o como dominios de direccionamiento. Se conocen en la técnica procedimientos para preparar y usar scFv.

En una realización preferida, los scFv de la presente invención se conjugan con un dominio constante humano. En algunas realizaciones, el dominio constante pesado se deriva de un dominio IgG, como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otras realizaciones, el dominio constante de la cadena pesada puede derivarse de IgA, IgM o IgE.

En la presente memoria se divulga un anticuerpo de conejo derivado de un hibridoma designado 14-12, 14-7 o 22-8. Tal como se usa en la presente memoria, el término "derivado de" significa que el anticuerpo "derivado" comprende al menos una región CDR del anticuerpo producido por 14-12, 14-7 o 22-8. Dicho de otra manera, el "anticuerpo derivado" comprende al menos una región CDR que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12.

Un anticuerpo de la divulgación puede derivarse del hibridoma 14-12 o 14-7, y puede estar codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO:17, o puede estar codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:18. Un anticuerpo de la divulgación puede derivarse del hibridoma 14-12 o 14-7, y puede estar codificado por una secuencia de aminoácidos que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO:13, o puede estar codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:14.

Un anticuerpo de la divulgación puede derivarse del hibridoma 22-8 y puede estar codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad a la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO:19, o puede estar codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:20. Un anticuerpo de la divulgación puede derivarse del hibridoma 22-8, y puede estar codificado por una secuencia de aminoácidos que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la región variable de cadena ligera de la s Eq ID NO:15, o puede estar codificada por una secuencia de aminoácidos que comprende 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la región variable de cadena pesada de la SEQ NO ID:16.

En una realización ejemplar de un anticuerpo de la invención que se enlaza a un aducto acetaminofén-proteína, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO:13 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO:14 [es decir, el anticuerpo monoclonal denominado en la presente memoria 14-12 o 14-7]. También se divulga un anticuerpo que se enlaza a un aducto acetaminofén-proteína, comprendiendo el anticuerpo la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO:15 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO:16 [es decir, el anticuerpo monoclonal al que se hace referencia en la presente memoria como 22-8]. También se divulga un anticuerpo que se enlaza a un aducto acetaminofénproteína, el anticuerpo comprende la secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de la SEQ ID NO:17 y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO:18 [es decir, el anticuerpo monoclonal denominado aquí mAb 14-12 o 14-7]. También se divulga un anticuerpo que se enlaza a un aducto acetaminofén-proteína, comprendiendo el anticuerpo la secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de la SEQ ID NO:19 y la secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de la SEQ ID NO:20 [es decir, el anticuerpo monoclonal al que se hace referencia en la presente memoria como 22-8].

Un anticuerpo divulgado en la presente memoria puede comprender una CDR1 de cadena ligera, como los anticuerpos 1, 49 y 97 de la Tabla B. Un anticuerpo divulgado en la presente memoria puede comprender una CDR2 de cadena ligera, como los anticuerpos 4, 52 y 100 de la Tabla B. Un anticuerpo divulgado en la presente memoria puede comprender una CDR3 de cadena ligera, como los anticuerpos 6, 54 y 102 de la Tabla B. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una combinación de dos o tres CDR de cadena ligera, como los anticuerpos 2, 3, 5, 50, 51, 53, 98, 99 y 101 de la Tabla B.

De manera similar, un anticuerpo de la divulgación puede comprender una CDR1 de cadena pesada, como los anticuerpos 7, 55 y 103 de la Tabla B. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una CDR2 de cadena pesada, como los anticuerpos 10, 58 y 106 de la Tabla B. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una CDR3 de cadena pesada, como los anticuerpos 12, 60 y 108 de la Tabla B. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una combinación de dos o tres CDR de cadena pesada, como los anticuerpos 8, 9, 11, 56, 57, 59, 104, 105 y 107 de la Tabla B.

Alternativamente, un anticuerpo de la divulgación puede comprender una o más CDR de cadena ligera y una o más CDR de cadena pesada, tales como los anticuerpos 13-48, 61-96 y 109-144 de la Tabla B.

Tabla B

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Un anticuerpo divulgado en la presente memoria puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, o puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:4 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:5 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 con cero a dos sustituciones de aminoácidos. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3, una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:4 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:5 con de cero a dos sustituciones de aminoácidos y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:6 con cero a dos sustituciones de aminoácidos. Un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3, una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:4, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:5 y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6. También se divulgan las correspondientes secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 y 6, que puede ser determinada fácilmente por una persona experimentada en la técnica, y puede incorporarse en un vector u otra molécula de ADN grande, como un cromosoma, con el fin de expresar un anticuerpo de la invención.

Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:8 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, o puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:10 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:11 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:12 con cero a dos sustituciones de aminoácidos. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:8 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:10 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:11 con cero a dos sustituciones de aminoácidos, y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:12 con cero a dos sustituciones de aminoácidos. Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:7, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:8, una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9, una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:10, una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:11 y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:12. La divulgación también abarca las secuencias del ácido nucleico correspondiente SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 y 12, que pueden ser determinadas fácilmente por una persona experimentada en la técnica, y pueden incorporarse en un vector u otra molécula de ADN grande, como un cromosoma, para expresar un anticuerpo de la invención.

Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:21 (QXSQphXR, en la que X es cualquier aminoácido, p es un aminoácido polar y h es un aminoácido hidrófobo), una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:22 (XhXpLXS, en la que X es cualquier aminoácido, p es un aminoácido polar y h es un aminoácido hidrófobo), y/o una CDR3 de la secuencia de aminoácidos Leu-Gly-h (en la que h es un residuo hidrófobo), o puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de secuencia de aminoácidos Tyr-X-IIe (en la que X es cualquier aminoácido), una CDR2 de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:23 (AXYAXWXKG , en la que X es cualquier aminoácido) y/o una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:24 (hXXGGhhXX, en la que X es cualquier aminoácido y h es un aminoácido hidrófobo). Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:21 (QXSQphXR, en la que X es cualquier aminoácido, p es un aminoácido polar y h es un aminoácido hidrófobo), una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:22 (XhXpLXS, en la que X es cualquier aminoácido, p es un aminoácido polar y h es un aminoácido hidrófobo), y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos Leu-Gly-h (en la que h es un residuo hidrófobo), y puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la secuencia de aminoácidos Tyr-X-IIe (en la que X es cualquier aminoácido), una CDR2 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:23 (AXYAXWXKG, en la que X es cualquier aminoácido) y una CDR3 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:24 (hXXGGhhXX, en la que X es cualquier aminoácido y h es un aminoácido hidrófobo). Un anticuerpo de la divulgación puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una CDR3 de secuencia de aminoácidos Leu-Gly-h (en la que h es un residuo hidrófobo) y/o puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una CDR3 de secuencia de aminoácidos SEQ ID nO:24 (hXXGGhhXX, en la que X es cualquier aminoácido y h es un aminoácido hidrófobo). En cada una de las divulgaciones anteriores, la SEQ ID NO:21 puede comprender además 1, 2, 3 o 4 aminoácidos en el terminal C; Leu-Gly-h puede comprender además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos en el terminal C; Tyr-X-IIe puede comprender además 1 aminoácido en el terminal C y/o 1 aminoácido en el terminal N; la SEQ ID NO:23 puede comprender además 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos en el terminal N; la SEQ ID NO:24 puede comprender además 1 aminoácido en el terminal C.

Como se usa en la presente memoria, un aminoácido polar se selecciona del grupo que consiste en serina, treonina, asparagina y glutamina y un aminoácido hidrófobo se selecciona del grupo que consiste en alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina y triptófano.

Tabla C. Listado de secuencias

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II. Procedimientos de uso de anticuerpos antiaducto acetaminofén-proteína

La presente divulgación proporciona anticuerpos para detectar aductos acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto. La presente divulgación también proporciona anticuerpos para medir la cantidad de aductos acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto. La cantidad de aductos acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto puede usarse para clasificar a un sujeto como que tiene cantidades altas o bajas de aductos acetaminofén-proteína, y puede usarse además para identificar en el sujeto exposición y/o toxicidad asociada con acetaminofén. En una realización específica, el aducto acetaminofén-proteína es un aducto 3-(cisteína-S-il)acetaminofén-proteína.

(a) Procedimientos para detectar y medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica

La divulgación proporciona medios para detectar el aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto. La divulgación proporciona medios para medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto. El procedimiento generalmente comprende detectar y/o medir la cantidad de uno o más aductos acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto usando un anticuerpo que se enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína. Además, el procedimiento puede comprender (i) obtener una muestra biológica de un sujeto, y (ii) detectar y/o medir la cantidad de uno o más aductos acetaminofénproteína en la muestra usando un anticuerpo que se enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína. Los anticuerpos adecuados se describen anteriormente en la Sección I.

Como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a un organismo vivo al que se le puede administrar acetaminofén. Los sujetos adecuados incluyen, pero no se limitan a, un humano, un animal de ganado, un animal de compañía, un animal de laboratorio y un animal zoológico. En una realización, el sujeto puede ser un roedor, por ejemplo, un ratón, una rata, una cobaya, etc. En otra realización, el sujeto puede ser un animal de ganado. Los ejemplos no limitantes de animales de ganado adecuados pueden incluir cerdos, vacas, caballos, cabras, ovejas, llamas y alpacas. En otra realización más, el sujeto puede ser un animal de compañía. Los ejemplos no limitantes de animales de compañía pueden incluir mascotas como perros, gatos, conejos y pájaros. En otra realización más, el sujeto puede ser un animal zoológico. Como se usa en la presente memoria, un "animal zoológico" se refiere a un animal que se puede encontrar en un zoológico. Estos animales pueden incluir primates no humanos, grandes felinos, lobos y osos. En realizaciones específicas, el animal es un animal de laboratorio. Los ejemplos no limitantes de un animal de laboratorio pueden incluir roedores, caninos, felinos y primates no humanos. En ciertas realizaciones, el animal es un roedor. Los ejemplos no limitantes de roedores pueden incluir ratones, ratas, cobayas, etc. En una realización preferida, el sujeto es humano. Los sujetos pueden ser de cualquier edad, incluidos recién nacidos, adolescentes, adultos, de mediana edad o ancianos.

Un sujeto puede tener o no un síntoma asociado con toxicidad inducida por acetaminofén. Específicamente, la toxicidad inducida por acetaminofén puede ser hepatotoxicidad. Una persona experimentada en la técnica apreciará que la toxicidad patológica inducida por acetaminofén probablemente comienza antes del diagnóstico o la aparición de síntomas asociados con toxicidad inducida por acetaminofén. En algunas realizaciones, un sujeto tiene un síntoma asociado con toxicidad inducida por acetaminofén. En otras realizaciones, un sujeto no tiene un síntoma asociado con toxicidad inducida por acetaminofén. En otras realizaciones más, un sujeto tiene toxicidad inducida por acetaminofén detectable pero no tiene ningún otro síntoma asociado con toxicidad inducida por acetaminofén. En otras realizaciones más, un sujeto ha recibido acetaminofén. En diferentes realizaciones, un sujeto ha recibido una dosis supraterapéutica de acetaminofén. En realizaciones alternativas, se sospecha que un sujeto ha recibido una dosis supraterapéutica de acetaminofén. Por ejemplo, un sujeto puede tener insuficiencia hepática de etiología poco clara que puede haberse desarrollado como resultado de recibir una dosis supraterapéutica de acetaminofén. El diagnóstico precoz de toxicidad inducida por acetaminofén en el sujeto puede reducir el desarrollo y/o progresión de síntomas asociados con la toxicidad patológica inducida por acetaminofén.

Los síntomas ejemplares asociados con hepatotoxicidad inducida por acetaminofén pueden incluir, pero no se limitan a, anorexia, náusea, vómito, dolor abdominal en el cuadrante superior derecho, elevación de AST, ALT, bilirrubina y PT (INR), insuficiencia renal, pancreatitis, múltiples fallas de órganos. La intoxicación leve por acetaminofén puede no causar síntomas y, cuando están presentes, los síntomas suelen ser leves hasta > 48 horas después de la ingestión. En algunas realizaciones, la gravedad de los síntomas de toxicidad por acetaminofén se cuantifica usando 4 etapas como se muestra en la Tabla D.

Como se usa en la presente memoria, el término "muestra biológica" se refiere a una muestra obtenida de un sujeto. Es adecuada cualquier muestra biológica que comprenda un aducto acetaminofén-proteína. Se conocen en la técnica numerosos tipos de muestras biológicas. Las muestras biológicas adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, pelo, muestras de tejido o fluidos corporales. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de tejido, como una biopsia de tejido. La biopsia de tejido puede ser una biopsia de tejido hepático. El tejido de la biopsia puede fijarse, incrustarse en parafina o plástico y seccionarse, o el tejido de la biopsia puede congelarse y crioseccionarse. Alternativamente, el tejido de la biopsia puede procesarse en células individuales o un explante, o procesarse en un homogeneizado, un extracto celular, una fracción membranosa o un extracto de proteína. En otras realizaciones, la muestra puede ser un fluido corporal. Los ejemplos no limitantes de fluidos corporales adecuados incluyen sangre, plasma, suero, orina, saliva, semen, sudor, lágrimas, moco, esputo, lisados tisulares u otros excrementos (por ejemplo, heces). En una realización específica, el fluido corporal es orina. En otra realización específica, el fluido corporal es plasma. En otra realización específica más, el fluido corporal es suero. En otra realización específica más, el fluido corporal es saliva. El fluido se puede usar "tal cual", los componentes celulares se pueden aislar del fluido o se puede aislar una fracción de proteína del fluido utilizando técnicas estándar. En una realización diferente, la muestra biológica es pelo.

Como apreciará una persona experimentada en la técnica, el procedimiento de recolección de una muestra biológica puede variar y variará dependiendo de la naturaleza de la muestra biológica y del tipo de análisis a realizar. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de procedimientos generalmente conocidos en la técnica para recolectar una muestra biológica. En términos generales, el procedimiento preferiblemente mantiene la integridad de la muestra de manera que se pueda detectar con precisión un aducto acetaminofén-proteína y medir la cantidad de acuerdo con la invención.

Puede obtenerse una sola muestra de un sujeto para detectar un aducto acetaminofén-proteína en la muestra. Alternativamente, se puede detectar un aducto acetaminofén-proteína en muestras obtenidas a lo largo del tiempo de un sujeto. Como tal, se puede recolectar más de una muestra de un sujeto a lo largo del tiempo. Por ejemplo, se pueden recolectar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o más muestras de un sujeto a lo largo del tiempo. Se pueden recolectar 2, 3, 4, 5 o 6 muestras de un sujeto a lo largo del tiempo. Se pueden recolectar 6, 7, 8, 9 o 10 muestras de un sujeto a lo largo del tiempo. Se pueden recolectar 10, 11, 12, 13 o 14 muestras de un sujeto a lo largo del tiempo. Se pueden recolectar 14, 15, 16 o más muestras de un sujeto a lo largo del tiempo.

Cuando se recolecta más de una muestra de un sujeto a lo largo del tiempo, se pueden recolectar muestras cada 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más horas. Las muestras se pueden recolectar cada 0,5, 1, 2, 3 o 4 horas. Las muestras se pueden recolectar cada 4, 5, 6 o 7 horas. Las muestras se pueden recolectar cada 7, 8, 9 o 10 horas. Las muestras se pueden recolectar cada 10, 11, 12 o más horas. Además, las muestras se pueden recolectar cada 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más días. Se puede recolectar una muestra aproximadamente cada 6 días. Las muestras se pueden recolectar cada 1, 2, 3, 4 o 5 días. Las muestras se pueden recolectar cada 5, 6, 7, 8 o 9 días. Las muestras se pueden recolectar cada 9, 10, 11, 12 o más días.

Una vez que se obtiene una muestra, se procesa in vitro para detectar y medir la cantidad de uno o más aductos acetaminofén-proteína usando un anticuerpo antiaducto acetaminofén-proteína. Todos los procedimientos adecuados para detectar y medir una cantidad de proteína usando un anticuerpo conocido por una persona experimentada en la técnica se contemplan dentro del alcance de la invención. Los procedimientos para detectar y medir una cantidad de proteína usando un anticuerpo (es decir, "procedimientos en base a anticuerpos") son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes incluyen un ELISA, un ensayo de flujo lateral, un inmunoensayo en sándwich, un radioinmunoensayo, una inmunoprecipitación o inmunoprecipitación Western, citometría de flujo, inmunohistoquímica y una matriz. Un ensayo de flujo lateral puede ser un dispositivo destinado a detectar la presencia (o ausencia) de un analito diana en la muestra.

En general, un procedimiento en base a anticuerpos para detectar y medir una cantidad de un aducto acetaminofénproteína comprende poner en contacto parte o toda la muestra que comprende un aducto acetaminofén-proteína con un anticuerpo antiaducto acetaminofén-proteína bajo condiciones efectivas para permitir la formación de un complejo entre el anticuerpo y el aducto acetaminofén-proteína. Normalmente, no se necesita toda la muestra, lo que permite a una persona experimentada en la técnica detectar y medir repetidamente la cantidad de un aducto acetaminofénproteína en la muestra a lo largo del tiempo. El procedimiento puede ocurrir en solución, o el anticuerpo o el aducto acetaminofén-proteína puede inmovilizarse sobre una superficie sólida. Los ejemplos no limitantes de superficies adecuadas incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, perlas, resinas y otros polímeros. La fijación al sustrato puede ocurrir de una amplia variedad de formas, como apreciarán las personas experimentadas en la técnica. Por ejemplo, el sustrato y el anticuerpo pueden derivatizarse con grupos funcionales químicos para la posterior unión de los dos. Por ejemplo, el sustrato puede derivatizarse con un grupo funcional químico que incluye, pero no se limita a, grupos amino, grupos carboxilo, grupos oxo o grupos tiol. Usando estos grupos funcionales, el anticuerpo puede unirse directamente usando los grupos funcionales o indirectamente usando enlazadores. Un anticuerpo antiaducto acetaminofén-proteína también puede unirse al sustrato de forma no covalente. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo antiaducto acetaminofén-proteína biotinilado, que puede enlazarse a superficies recubiertas covalentemente con estreptavidina, dando como resultado la unión. Alternativamente, se puede sintetizar un anticuerpo en la superficie usando técnicas tales como fotopolimerización y fotolitografía.

Poner en contacto la muestra con un anticuerpo bajo condiciones efectivas durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo generalmente implica agregar la composición de anticuerpo antiaducto acetaminofén-proteína a la muestra e incubar la mezcla durante un período de tiempo suficientemente largo para que el anticuerpo antiaducto acetaminofén-proteína se enlace a cualquier antígeno presente. Después de este tiempo, el complejo se puede lavar y luego se detecta el complejo y se mide la cantidad mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica. Los procedimientos para detectar y medir una cantidad de un complejo anticuerpo-polipéptido se basan generalmente en la detección de una etiqueta o marcador. El término "etiqueta", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier sustancia unida a un anticuerpo u otro material de sustrato, en el que la sustancia es detectable mediante un procedimiento de detección. Los ejemplos no limitantes de etiquetas adecuadas incluyen moléculas luminiscentes, moléculas quimioluminiscentes, fluorocromos, agentes extintores fluorescentes, moléculas coloreadas, radioisótopos, centelleantes, biotina, avidina, estreptavidina, proteína A, proteína G, anticuerpos o fragmentos de los mismos, polihistidina, Ni2+, marcadores Flag, marcadores myc, metales pesados y enzimas (incluidas fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa y luciferasa). Los procedimientos para detectar y medir una cantidad de un complejo anticuerpo-polipéptido en base a la detección de una etiqueta o marcador son bien conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, un procedimiento en base a anticuerpos es un inmunoensayo. Los inmunoensayos se pueden ejecutar en varios formatos diferentes. En términos generales, los inmunoensayos se pueden dividir en dos categorías: inmunoensayos competitivos e inmunoensayos no competitivos. En un inmunoensayo competitivo, un analito no marcado en una muestra compite con el analito marcado para enlazar un anticuerpo. El analito no enlazado se elimina por lavado y se mide el analito enlazado. En un inmunoensayo no competitivo, se etiqueta el anticuerpo, no el analito. Los inmunoensayos no competitivos pueden usar un anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo de captura es etiquetado) o más de un anticuerpo (por ejemplo, al menos un anticuerpo de captura que no está etiquetado y al menos un anticuerpo de "protección" o de detección que está etiquetado). Las etiquetas adecuadas se describen anteriormente.

En otras realizaciones, un procedimiento en base a anticuerpos es una inmunoprecipitación o inmunoprecipitación Western. En otras realizaciones más, un procedimiento en base a anticuerpos es citometría de flujo. En diferentes realizaciones, un procedimiento en base a anticuerpos es inmunohistoquímica (IHC). La IHC utiliza un anticuerpo para detectar y cuantificar antígenos en muestras de tejido intacto. Las muestras de tejido pueden ser bloques de tejido recién congelados y/o fijados con formalina, incrustados en parafina (o incrustados en plástico) preparados para estudio por IHC. Los procedimientos para preparar bloques de tejido para su estudio por IHC, así como los procedimientos para realizar IHC, son bien conocidos en la técnica.

En realizaciones alternativas, un procedimiento en base a anticuerpos es una matriz. Una matriz comprende al menos una dirección, en la que al menos una dirección de la matriz tiene dispuesto sobre ella un anticuerpo antiaducto acetaminofén-proteína. Las matrices pueden comprender desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente varios cientos de miles de direcciones. Se conocen en la técnica varios sustratos adecuados para la construcción de matrices, y una persona experimentada en la técnica apreciará que pueden estar disponibles otros sustratos a medida que avanza la técnica. Los sustratos adecuados también se describen anteriormente. En algunas realizaciones, la matriz comprende al menos un anticuerpo antiaducto acetaminofén-proteína unido al sustrato que está ubicado en una o más direcciones de la matriz definidas espacialmente. Por ejemplo, una matriz puede comprender al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco anticuerpos antiaducto acetaminofén-proteína, cada anticuerpo reconoce los mismos o diferentes aductos acetaminofénproteína, y cada anticuerpo puede estar en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más direcciones definidas espacialmente.

Para cada una de las realizaciones anteriores, primero se puede aislar o enriquecer un aducto acetaminofénproteína antes de la detección. Por ejemplo, un aducto acetaminofén-proteína puede enriquecerse o aislarse usando cromatografía líquida, mediante precipitación, electroforesis o purificación por afinidad. En algunas realizaciones, un aducto acetaminofén-proteína se puede enriquecer o purificar usando cromatografía líquida. En otras realizaciones, un aducto acetaminofén-proteína se puede enriquecer o purificar usando electroforesis.

En una realización, un aducto acetaminofén-proteína puede enriquecerse o purificarse mediante purificación por afinidad antes de la detección. En otra realización, un aducto acetaminofén-proteína puede enriquecerse o purificarse mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo de la invención. Se conocen en la técnica procedimientos para enriquecer una muestra para una proteína o purificar una proteína usando purificación por afinidad. En resumen, la purificación por afinidad comprende incubar una muestra con un soporte sólido, como perlas, una placa de cultivo o una membrana, que facilite las etapas posteriores. Se puede recubrir un soporte sólido con un anticuerpo de la invención, haciendo que un aducto acetaminofén-proteína se una al soporte sólido. Alternativamente, se puede incubar una muestra con un anticuerpo de la invención, y el complejo de aductoanticuerpo acetaminofén-proteína puede aislarse incubando con un soporte sólido recubierto con un segundo anticuerpo con especificidad para un anticuerpo de la invención, lo que provoca una complejo proteína-anticuerpo para unirse al soporte sólido. A continuación, se puede purificar o enriquecer un aducto acetaminofén-proteína lavando otro material en la muestra que no esté enlazado al soporte sólido o, si el soporte sólido son perlas superparamagnéticas, un aducto acetaminofén-proteína unido a las perlas (que expresa el antígeno) puede separarse de la muestra por atracción a un campo magnético fuerte. Tras el enriquecimiento o purificación, puede entonces detectarse un aducto acetaminofén-proteína en la muestra enriquecida o purificada usando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente.

En otra realización, pueden usarse anticuerpos específicos de proteína para capturar y aislar proteína o proteínas en aductos, y luego puede usarse un anticuerpo aducto acetaminofén-proteína de la divulgación para detectar la proteína en aducto. Los anticuerpos específicos de proteína adecuados pueden ser anticuerpos que enlazan específicamente una proteína que se sabe que se modifica con NAPQI. Ejemplos no limitantes de proteínas modificadas por NAPQⁱ incluyen betaína-homocisteína S-metiltransferasa 1 (BHM^t ), aspartato aminotransferasa citoplasmática (cAspAT), enzima ramificadora 1,4-alfa-glucano, formimidoiltransferasa-ciclodesaminasa (FTCD), distrofina, aldehído deshidrogenasa, ATP sintasa de cadena alfa mitocondrial, calregulina, carbamoilfosfato sintetasa I, carbonato deshidratasa III (CA-III), aldehído deshidrogenasa (AHD-M1), glutamato deshidrogenasa (GDH), glutamato-amoniaco ligasa, glutatión peroxidasa celular, glutatión transferasas (GST), glutatión S-transferasa P 1, GAPDH, AdoMet sintetasa 1, proteína de estrés de 23 kDa de macrófagos, eIF-4A-I, proteína enlazadora acetaminofén de 56 kDa, L-iditol 2-deshidrogenasa, amina N-metiltransferasa, proteína antioxidante 1, tropomiosina 3, urato oxidasa, 10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa, hemoglobina, proteína enlazadora de selenio de 56 kDa, lamina A, proteína enlazadora a hormona tiroidea celular, proteína microsomal de 58 kDa, embrión de ratón Life Tech 8 5dpc 10664019 Clon de ADNc de Mus musculus, pirofosfatasa inorgánica, NML Clon de ADNc de Mus musculus, 2-4-dienoil-CoA reductasa mitocondrial, 3-HAI,3-hidroxiantranilato 3-4-dioxigenasa, proteína regulada por glucosa de 94 kDa, inhibidor citosólico de Nrf2, albúmina sérica y proteína de respuesta temprana retardada 6. Pueden aislarse una o más proteínas en aducto y luego puede usarse un anticuerpo aducto acetaminofén-proteína de la divulgación para detectar la cantidad de proteína en aducto como se describió anteriormente.

(b) Procedimientos para detectar toxicidad inducida por acetaminofén en un sujeto

La divulgación proporciona medios para clasificar a un sujeto en base a la cantidad de aducto acetaminofén-proteína medida en una muestra biológica obtenida del sujeto. El procedimiento generalmente comprende (i) medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida del sujeto usando un anticuerpo que enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína, (ii) comparar la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra con un valor de referencia, y (iii) clasificar al sujeto por tener una cantidad alta o baja de aducto acetaminofén-proteína en base a la cantidad de aducto acetaminofén-proteína medida en la muestra. Opcionalmente, el procedimiento puede comprender (i) obtener una muestra biológica de un sujeto y medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra usando un anticuerpo que enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína, (ii) comparar la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra a un valor de referencia, y (iii) clasificar al sujeto por tener una cantidad alta o baja de aducto acetaminofén-proteína en base a la cantidad de aducto acetaminofén-proteína medida en la muestra. En las metodologías anteriores, se pueden medir uno o más aductos acetaminofén-proteína. Por ejemplo, se pueden medir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aductos acetaminofén-proteína. Los procedimientos para obtener una muestra biológica de un sujeto y medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra usando un anticuerpo que se enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína se detallan anteriormente. En una realización preferida, la muestra biológica es un fluido biológico seleccionado del grupo que consiste en sangre, plasma, suero, orina y saliva. En una realización específica, el aducto acetaminofén-proteína es un aducto 3-(cisteína-S-il)acetaminofén-proteína.

Puede usarse cualquier valor de referencia adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto o grupo de sujetos de la misma especie que tiene una función hepática normal. En otro ejemplo, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto, o grupo de sujetos, de la misma especie que no tiene toxicidad detectable inducida por acetaminofén. En otro ejemplo, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de aducto acetaminofénproteína en una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto o grupo de sujetos de la misma especie que tiene toxicidad inducida por acetaminofén medida por AST, ALT, bilirrubina, INR u otros biomarcadores inespecíficos de función hepática. Por ejemplo, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de aducto acetaminofénproteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto o grupo de sujetos de la misma especie que tiene toxicidad inducida por acetaminofén medida por niveles de ALT > 1.000 IU. En otro ejemplo, un valor de referencia adecuado puede ser la señal de fondo del ensayo según se determina mediante procedimientos conocidos en la técnica. En otro ejemplo, un valor de referencia adecuado puede ser una medida de la cantidad de aducto acetaminofénproteína en una muestra de referencia obtenida del mismo sujeto. La muestra de referencia comprende el mismo tipo de fluido biológico que la muestra de prueba, y puede obtenerse o no del sujeto cuando la función hepática era normal. Una persona experimentada en la técnica apreciará que no siempre es posible o deseable obtener una muestra de referencia de un sujeto cuando, por lo demás, el sujeto está sano. Por ejemplo, en un escenario agudo, una muestra de referencia puede ser la primera muestra obtenida del sujeto en la presentación. En otro ejemplo, al controlar la eficacia de una terapia, una muestra de referencia puede ser una muestra obtenida de un sujeto antes de que comenzara la terapia. En tal ejemplo, un sujeto puede tener sospecha de toxicidad inducida por acetaminofén, pero puede no tener otros síntomas de toxicidad inducida por acetaminofén o el sujeto puede tener sospecha de toxicidad inducida por acetaminofén y uno o más de otros síntomas de toxicidad inducida por acetaminofén. En una realización específica, un valor de referencia adecuado puede ser un umbral determinado previamente mediante otros procedimientos. Por ejemplo, un valor de referencia adecuado puede ser un valor correspondiente a 1 nmol/ml de aducto acetaminofén-proteína medido por cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica (HPLC-EC).

De acuerdo con la divulgación, un sujeto puede clasificarse en base a la cantidad de aducto acetaminofén-proteína medido en la muestra. La clasificación de un sujeto en base a la cantidad de aducto acetaminofén-proteína medido en una muestra de fluido biológico obtenido del sujeto puede usarse para identificar sujetos con exposición y/o toxicidad inducida por acetaminofén. El término "toxicidad inducida por acetaminofén" se describe en detalle a continuación. En términos generales, un sujeto puede clasificarse por tener una cantidad alta o baja de aducto acetaminofén-proteína en comparación con un valor de referencia, en el que una cantidad alta de aducto acetaminofén-proteína es una cantidad superior al valor de referencia y una cantidad baja es una cantidad igual a o por debajo del valor de referencia. En realizaciones preferidas, para clasificar a un sujeto por tener una alta cantidad de aducto acetaminofén-proteína, la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra en comparación con el valor de referencia puede ser al menos un 5 % mayor. Por ejemplo, la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra puede ser al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 100 % mayor que el valor de referencia. En otras realizaciones, la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra de fluido biológico obtenida del sujeto en comparación con el valor de referencia puede incrementarse al menos 2 veces. Por ejemplo, la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra en comparación con el valor de referencia puede aumentarse al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 30 veces, al menos 35 veces, al menos 40 veces, al menos 45 veces o al menos 50 veces.

La divulgación también proporciona medios para detectar exposición y/o toxicidad inducida por acetaminofén en un sujeto. Como se usa en la presente memoria, el término "toxicidad inducida por acetaminofén" se refiere al daño o destrucción del hígado debido al acetaminofén. El acetaminofén, cuando se toma en sobredosis y, a veces, incluso cuando se introduce dentro de los intervalos terapéuticos, puede dañar el hígado. El daño al hígado no se debe al fármaco en sí, sino a un metabolito tóxico (N-acetil-p-benzoquinona imina NAPQI o NABQI) producido por las enzimas del citocromo P-450 en el hígado. En una sobredosis, se genera una gran cantidad de NAPQI, que abruma el proceso de desintoxicación y conduce al daño de las células hepáticas. El riesgo de daño hepático está influenciado por varios factores, incluida dosis ingerida, ingesta simultánea de alcohol u otros fármacos, intervalo entre la ingestión y el antídoto, etc. La dosis tóxica para el hígado es bastante variable de persona a persona y es menor en alcohólicos crónicos.

Las causas de hepatotoxicidad conocidas en la técnica son numerosas y pueden incluir, pero no se limitan a, trauma, enfermedad neoplásica, infección bacteriana o viral, exposición a toxinas, venenos, sustancias ambientales u otras. Los biomarcadores de la función hepática son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de biomarcadores de daño hepático incluyen ^a S^t , ALT, bilirrubina y PT (INR) elevados. Sin embargo, el aumento del aducto acetaminofén-proteína en un fluido biológico puede probar que el acetaminofén causó o contribuyó a la lesión hepática.

Además de la detección de la toxicidad inducida por acetaminofén, las personas experimentadas en la técnica también deben apreciar que puede usarse un procedimiento de la divulgación para diagnosticar diversas características del tratamiento con acetaminofén y toxicidad por acetaminofén. Puede usarse un procedimiento de la divulgación para determinar los niveles de ingesta de acetaminofén por un sujeto para determinar el cumplimiento del tratamiento. Alternativamente, se puede usar un procedimiento de la divulgación para determinar la gravedad de la toxicidad por acetaminofén. Por ejemplo, se puede usar un procedimiento de la divulgación para determinar niveles subtóxicos normales de acetaminofén, descartando así la toxicidad por acetaminofén. También se puede usar un procedimiento de la divulgación para diagnosticar toxicidad por acetaminofén con buen pronóstico que se resolverá. Alternativamente, se puede usar un procedimiento de la divulgación para diagnosticar toxicidad por acetaminofén con mal pronóstico que conducirá a la muerte o la necesidad de un trasplante de hígado. También puede usarse un procedimiento de la divulgación para determinar exposición crónica al acetaminofén. Como se usa en la presente memoria, el término "exposición crónica al acetaminofén" puede usarse para describir toxicidad por acetaminofén causada por la exposición repetida al acetaminofén supraterapéutico durante períodos de tiempo prolongados, como, por ejemplo, mediante la ingestión de dosis supraterapéuticas de acetaminofén, o el uso de formulaciones con acetaminofén de liberación sostenida. Además, se puede usar un procedimiento de la divulgación para determinar exposición aguda al acetaminofén. Como se usa en la presente memoria, el término "exposición aguda al acetaminofén" se puede usar para describir la toxicidad por acetaminofén causada por la ingestión de una sola dosis grande de acetaminofén.

Se puede usar un procedimiento de la presente divulgación en combinación con otros procedimientos para diagnosticar la toxicidad por acetaminofén u otros procedimientos de diagnóstico clínico. Además, en la presente memoria también se describe un procedimiento que puede comprender además el tratamiento de un sujeto. Ejemplos no limitantes de tratamientos estándar para toxicidad por acetaminofén, administración de carbón activado, administración de N-acetilcisteína (oral o IV), trasplante de hígado y combinaciones de los mismos.

Para cada divulgación, el procedimiento generalmente comprende (i) medir la cantidad de aducto acetaminofénproteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto usando un anticuerpo que se enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína, y (ii) comparar la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra a un valor de referencia. Opcionalmente, el procedimiento puede comprender (i) obtener una muestra biológica de un sujeto, (ii) medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra usando un anticuerpo que se enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína, y (iii) comparar la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra a un valor de referencia. Una mayor cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra en comparación con el valor de referencia indica toxicidad inducida por acetaminofén. La cantidad de aducto acetaminofén-proteína puede ser una medida cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa. Los anticuerpos antiaducto acetaminofén-proteína adecuados se describen anteriormente, al igual que los procedimientos para medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica. En una realización preferida, la muestra biológica es un fluido biológico seleccionado del grupo que consiste en sangre, plasma, suero, orina y saliva.

III. Inmunógeno del aducto acetaminofén-proteína

También se divulga en la presente memoria un inmunógeno de aducto acetaminofén-proteína para la producción de anticuerpos con especificidad por aductos acetaminofén-proteína. El nuevo inmunógeno se preparó modificando una proteína portadora inmunogénica (CP) con 2-iminotiolano (2-IT) para proporcionar una CP altamente sustituida con numerosas moléculas enlazadoras de 5 carbonos con grupos sulfhidrilo terminales. Esta CP modificada en 2-IT se modificó luego covalentemente en los grupos sulfhidrilo terminales mediante reacción con N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI) preparada biosintéticamente. En un ejemplo específico, el inmunógeno es el inmunógeno de acetaminofén enlazado a la proteína portadora-2-iminotiolano. Por consiguiente, el inmunógeno puede denominarse CP-2-IT-APAP.

Como se usa en la presente memoria, una "proteína portadora" es cualquier proteína usada para acoplarse con péptidos u otros haptenos que no son lo suficientemente grandes o complejos por sí mismos para inducir una respuesta inmune y producir anticuerpos. La proteína portadora, debido a que es grande y compleja, confiere inmunogenicidad al hapteno conjugado, lo que da como resultado la producción de anticuerpos contra epítopos en el hapteno y portador. Se pueden usar muchas proteínas como portadores y se eligen en base a la inmunogenicidad, solubilidad y disponibilidad de grupos funcionales útiles a través de los cuales se puede lograr la conjugación con el hapteno. Ejemplos no limitantes de proteínas portadoras adecuadas incluyen hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH), albúmina de suero bovino (BSA), proteína portadora azul (hemocianina de Concholepas concholepas (CCH)) y ovoalbúmina (OVA).

El 2-iminotiolano también puede denominarse 2-IT o reactivo de Traut. El 2-iminotiolano es un pequeño compuesto de tiolación que reacciona con aminas primarias para agregar un pequeño brazo espaciador (8,1 angstroms) terminado por un grupo sulfhidrilo libre. El 2-iminotiolano es un compuesto de tioimidato cíclico para la tiolación (adición de sulfhidrilo). El 2-IT reacciona con aminas primarias (-NH² ) para introducir grupos sulfhidrilo (-SH) mientras mantiene propiedades de carga similares a las del grupo amino original. Se pueden usar otros enlazadores en lugar de 2-IT en un inmunógeno de la invención siempre que el enlazador contenga un azufre enlazado en la posición del carbono 3 de la estructura del anillo de acetaminofén. La presencia del azufre es esencial para formar un anticuerpo de la divulgación. El enlazador puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 carbonos. El enlazador puede ser de 3, 4, 5 o 6 carbonos. El enlazador puede tener 5 carbonos.

La proteína portadora conjugada con un enlazador se hace reaccionar con NAPQI mediante procedimientos comunes en la técnica. El CP-2-IT puede hacerse reaccionar con NAPQI mediante procedimientos comunes en la técnica. Es esencial que el grupo sulfhidrilo del enlazador unido a CP reaccione con NAPQI para obtener un inmunógeno de la divulgación. El grupo sulfhidrilo del 2-IT puede ser el objetivo de la reacción con NAPQI.

Los inventores han descubierto que inmunización con CP-2-IT-APAP puede producir anticuerpos monoclonales con especificidad para aductos acetaminofén-proteína. Específicamente, la inmunización con CP-2-IT-APAP puede producir anticuerpos monoclonales con especificidad para el aducto 3-(cisteína-S-il)acetaminofén-proteína. Los procedimientos para preparar un anticuerpo monoclonal usando un inmunógeno de la divulgación se describen en la Sección I. Utilizando un inmunógeno de la divulgación, un anticuerpo monoclonal puede enlazarse a un aducto acetaminofén-proteína aproximadamente 2.000 a 3.000 veces más eficazmente que el acetaminofén libre. En otra realización, un anticuerpo monoclonal puede enlazarse a un aducto acetaminofén-proteína aproximadamente 8.000 veces más eficazmente que el acetaminofén libre. También se describe en la presente memoria donde un anticuerpo monoclonal puede enlazarse a una proteína de acetaminofén aproximadamente 100, aproximadamente 250, aproximadamente 500, aproximadamente 1.000, aproximadamente 1.500, aproximadamente 2.000, aproximadamente 2.500, aproximadamente 3.000, aproximadamente 3.500, aproximadamente 4.000, aproximadamente 4.500, aproximadamente 5.000, aproximadamente 5.500, aproximadamente 6.000, aproximadamente 6.500, aproximadamente 7.000, aproximadamente 7.500, aproximadamente 8.000, aproximadamente 8.500, aproximadamente 9.000, aproximadamente 9.500, aproximadamente 10.000, aproximadamente 11.000, aproximadamente 12.000, aproximadamente 13.000, aproximadamente 14.000, aproximadamente 15.000, aproximadamente 16.000, aproximadamente 17.000, aproximadamente 18.000, aproximadamente 19.000 aproximadamente 20.000, aproximadamente 30.000, aproximadamente 40.000 o aproximadamente 50.000 veces más eficazmente que el acetaminofén libre.

Definiciones

Como se usa en la presente memoria, "anticuerpo" se refiere a una molécula derivada de inmunoglobulina que reconoce específicamente el aducto acetaminofén-proteína. Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo de longitud completa (IgM, IgG, IgA, IgE) o puede ser un fragmento de anticuerpo (Fab, F(ab')2, scFv). Un anticuerpo puede ser quimérico o puede ser humanizado.

Como se usa en la presente memoria, "CDR" significa "región determinante de complementariedad". Las CDR también pueden denominarse regiones hipervariables.

Como se usa en la presente memoria, "cadena ligera" es la subunidad polipeptídica pequeña del anticuerpo. Un anticuerpo típico comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas.

Como se usa en la presente memoria, la "cadena pesada" es la subunidad polipeptídica grande del anticuerpo. La cadena pesada de un anticuerpo contiene una serie de dominios de inmunoglobulina, con al menos un dominio variable y al menos un dominio constante.

"Humanizado", como se usa en la presente memoria, se refiere al proceso donde se producen anticuerpos monoclonales usando ADN recombinante para crear estructuras capaces de expresarse en cultivo de células humanas. Cualquier técnica conocida para producir estas estructuras funcionará para los propósitos de la presente invención.

Como se usa en la presente memoria, "fragmentos variables de cadena sencilla" o "scFv" o "scFvs", se refieren a proteínas de fusión de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas conectadas mediante un enlazador. En alguna realización, el enlazador es un péptido de aproximadamente 10 a 25 aminoácidos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Las personas experimentadas en la técnica deben apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas que los inventores han descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención y, por lo tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, las personas experimentadas en la técnica deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y todavía obtener el mismo tipo de resultado o similar sin apartarse del alcance de la invención.

Ejemplo 1. Producción de anticuerpos monoclonales específicos para el aducto acetaminofén-proteína. La hepatotoxicidad del acetaminofén (APAP) (también llamado paracetamol) está mediada por el metabolito reactivo N-acetil-p-benzoquinona imina que se enlaza covalentemente a la proteína como 3-(cisteína-S-il)acetaminofén. Estos aductos acetaminofén-proteína son biomarcadores específicos de exposición al acetaminofén y niveles elevados de estos aductos son un biomarcador específico de toxicidad por acetaminofén. Esta divulgación es para describir un inmunógeno nuevo y único para la preparación de anticuerpos monoclonales con especificidad para el aducto acetaminofén-proteína. Los anticuerpos resultantes reaccionan específicamente con los aductos acetaminofén-proteína que se forman fisiológicamente durante la patogénesis de la toxicidad mediada por acetaminofén.

Los inventores concibieron y sintetizaron un nuevo inmunógeno con el fin de preparar anticuerpos con especificidad para aductos acetaminofén-proteína. El nuevo inmunógeno se preparó modificando una proteína portadora inmunogénica (CP) con 2-iminotiolano (2-IT) para proporcionar una CP altamente sustituida con numerosas moléculas enlazadoras de 5 carbonos con grupos sulfhidrilo terminales. Esta CP modificada con 2-IT se modificó luego covalentemente en los grupos sulfhidrilo terminales mediante reacción con imina de N-acetil-p-benzoquinona preparada sintéticamente. Como referencia abreviada, el inmunógeno de acetaminofén unido a proteína portadora-2-iminotiolano se denomina CP-2-IT-APAP. La inmunización de conejos con CP-2-IT-APAP dio como resultado la producción de anticuerpos policlonales de conejo con especificidad para los aductos 3-(cisteína-S-il)acetaminofénproteína fisiológicamente formados y esto fue confirmado por ELISA e inmunoensayo de flujo lateral utilizando aductos acetaminofén-proteína como antígeno en fase sólida. Posteriormente, se usó el inmunógeno CP-2-IT-APAP para preparar anticuerpos monoclonales (mAb) de conejo con especificidad para aductos acetaminofén-proteína. Para confirmar el enlace de anticuerpos purificados a aductos acetaminofén-proteína, se realizó un ELISA. En el experimento ELISA, el antígeno se recubre durante la noche a 4 ° C. Las muestras se añaden en diluciones en serie a partir de 1:250 (sobrenadante y flujo de descarte) o 4 pg/ml (anticuerpo purificado) y se incuban a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Se añade anticuerpo de cabra secundario conjugado con fosfatasa alcalina anticonejo a temperatura ambiente durante 1 hora. Se agrega la solución de sustrato y se desarrolla durante 15 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia se mide a 405 nm. Los datos de la Figura 1 representan el promedio de repeticiones (rep) 1 y 2 para cada muestra.

Ejemplo 2. ELISA competitivo para determinar la potencia inhibidora relativa de APAP enlazado a proteína como aducto APAP-proteína frente a APAP libre no enlazado.

Se mezclaron sobrenadantes de cultivo tisular del clon 14-12 de anticuerpo monoclonal de conejo a una dilución de 1:250 con diluciones seriadas de 4 veces del inhibidor (BSA-APAP o APAP) de modo que la dilución final de RmAb fue 1:500. Las concentraciones finales de APAP fueron 80, 20, 5, 1,25 y 0,31 nmoles por pocillo de ELISA. Las concentraciones finales de APAP-BSA (cuantificadas por HPLC-EC como APAP-Cys de la proteína hidrolizada) fueron 10, 2,5, 0,625, 0,156 y 0,04 pmoles por pocillo de ELISA.

La selección de clones de RmAb prometedores para uso futuro para detectar aductos acetaminofén-proteína se basó en la eficiencia de la producción de inmunoglobulina, afinidad para la detección de aducto APAP-proteína (3-(cisteína-S-il)acetaminofén) y relativa insensibilidad para la detección del fármaco libre APAP.

El aducto acetaminofén-proteína preparado sintéticamente (BSA-APAP) y el fármaco libre (APAP) se evaluaron en ELISA competitivo para determinar su capacidad relativa, sobre una base molar, para inhibir el enlace del anticuerpo monoclonal de conejo del clon 14-12 al aducto acetaminofén-proteína inmovilizado en fase sólida. Los datos se trazan como porcentaje de inhibición e indican que se necesitan aproximadamente 8.000 moléculas de APAP libres para producir la misma potencia inhibidora que una molécula de APAP-Cys como aducto de proteína (Figura 2). Se vuelve a declarar, el anticuerpo del clon 14-12 tiene aproximadamente 8.000 veces más afinidad por el aducto acetaminofén-proteína que por el APAP libre medido en este contexto ELISA.

Se repitió el ELISA competitivo con anticuerpo monoclonal de conejo (RMAb) 14-12 y anticuerpo monoclonal de conejo (RMAb) 22-8. Brevemente, las placas de ELISA se recubrieron con BSA-APAP, 200 ng (proteína)/pocillo. Se combinó el sobrenadante del clon RMAb (dilución 1:250) con un volumen igual de diluciones 4 veces seriadas de inhibidor para dar una dilución final de anticuerpo de 1:500 y las concentraciones finales indicadas de APAP-BSA y APAP. La BSA-APAP preparada haciendo reaccionar albúmina de suero bovino (BSA) con N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI) para formar aductos 3-(cisteína-S-il)acetaminofén-proteína en BSA (BSA-APAP). Después de incubación y lavado, se detectó RMAb enlazado usando IgG anticonejo de cabra conjugado con HRP seguido del sustrato TMB y se determinó el desarrollo del color usando un lector de placas ELISA. El tampón de dilución era proteína de leche desnatada al 0,025 % (p/v) en solución salina tamponada con fosfato que contenía NaCl 0,15 M, pH 7,4.

Como se demostró anteriormente, el anticuerpo del clon 14-12 tiene aproximadamente 8.000 veces más afinidad por el aducto acetaminofén-proteína que por el APAP libre según se mide en este contexto de ELISA. Además, el anticuerpo del clon 22-8 tiene aproximadamente 1.250 veces más afinidad por el aducto acetaminofén-proteína que por el APAP libre según se mide en este contexto de ELISA (Figura 3).

Ejemplo 3. Enlace de RMAb al aducto acetaminofén-proteína inmovilizado en la banda de prueba en ensayos de flujo lateral.

El enlace de RMAb al aducto acetaminofén-proteína inmovilizado en la banda de prueba de los ensayos de flujo lateral se determinó mediante la preparación de diluciones seriadas de RMAb en tampón de dilución (solución salina tamponada con fosfato que contiene NaN³ al 0,02 % y leche en polvo desnatada al 0,125 % (p/v)). El RMAb enlazado se detectó usando oro nanoparticulado de 40 nm adsorbido en IgG anticonejo de cabra. El gráfico logarítmico de RMAb (pg/ml de IgG) frente a la lectura de la banda de prueba (unidades de reflectancia arbitrarias) indica que 0,01 pg de RMAb da una reflectancia de la banda de prueba de aproximadamente 20.000 (Figura 4). Se calculó un valor de 0,01 pg en base a que se usaron 100 pl de una solución de 0,1 pg/ml. Los ensayos de inhibición competitiva posteriores en formato de flujo lateral utilizaron esta cantidad de RMAb. El antígeno de la banda de prueba fue ovoalbúmina modificada con NAPQI para producir aducto APAP-proteína.

Ejemplo 4. Inmunoensayo de flujo lateral competitivo con los clones 14-12 y 22-8 de RMAb: potencia relativa del fármaco original (APAP) frente al aducto (APAP-proteína) como inhibidor.

A continuación, se realizó un ensayo de inhibición competitiva usando RMAb en formato de flujo lateral. El RMAb se diluyó a 0,2 pg/ml y esta concentración de Ab se combinó con un volumen igual de inhibidor, ya sea BSA-APAP o APAP, de modo que la concentración final aplicada a cada ensayo de flujo lateral de 100 pl fue de 0,01 pg de RMAb y la concentración final indicada de inhibidor. Los datos indican que el ensayo de flujo lateral usando RMAb detectó aducto APAP-proteína en el intervalo de siete diluciones 2 veces en serie desde 1,19 a 0,0186 pM y detectó APAP en el intervalo de seis diluciones 2 veces en serie de 2.500 a 78 pM (concentraciones finales) (Figura 5). En conjunto, los datos indican que el ensayo es sensible para la detección de aductos APAP-proteína (APAP-Cys) y mucho menos sensible (> 8.000 veces) para la detección de APAP. Se vuelve a declarar: un mol de APAP-Cys es aproximadamente 8.000 veces más potente que un mol de APAP para la inhibición del enlace de RMAb al aducto APAP-proteína inmovilizado en la banda de prueba.

A continuación, se realizó el mismo ensayo competitivo, pero en su lugar el aducto APAP-proteína era un aducto APAP-proteína formado fisiológicamente a partir del suero de un paciente con toxicidad por APAP. La concentración de aducto APAP-proteína del inhibidor se determinó mediante HPLC-EC. El aducto APAP-proteína humano y APAP se diluyeron en suero humano de control. Los datos demostraron nuevamente que el ensayo es sensible para la detección de aductos APAP-proteína (APAP-Cys) y mucho menos sensible para la detección de APAP (Figura 6).

Ejemplo 5. Desarrollo de inmunoensayos para la toxicidad por acetaminofén.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado, en el que el anticuerpo enlaza específicamente un aducto acetaminofén-proteína pero no enlaza específicamente acetaminofén libre y reconoce el inmunógeno: proteína portadora-2-iminotiolano-APAP, en el que el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; (b) una ^c DR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3; (d) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4; (e) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5; y (f) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6.

2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:14.

3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:13.

4. Un anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

5. Un inmunoensayo que comprende al menos un anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

6. Un procedimiento para detectar la toxicidad inducida por acetaminofén en un sujeto, el procedimiento comprende (i) medir la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto mediante inmunoensayo usando al menos un anticuerpo aislado que enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína pero no enlaza específicamente al acetaminofén libre, en el que el anticuerpo enlaza específicamente a un aducto acetaminofén-proteína 8.000 veces más eficazmente que el acetaminofén libre, en el que el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 ; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; (d) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4; (e) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5; y (f) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6; y (ii) comparar la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra con un valor de referencia, en el que una mayor cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra en comparación con el valor de referencia indica toxicidad inducida por acetaminofén en el sujeto.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la toxicidad inducida por acetaminofén está directa o indirectamente asociada con una sobredosis de acetaminofén.

8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la muestra biológica es un fluido biológico seleccionado del grupo que consiste en sangre, plasma, suero, orina, saliva y pelo.

9. Un procedimiento para determinar si la hepatotoxicidad en un sujeto se debe a la toxicidad inducida por acetaminofén, comprendiendo el procedimiento (i) medir la presencia y/o cantidad de aducto acetaminofén-proteína en una muestra biológica obtenida de un sujeto mediante inmunoensayo usando al menos un anticuerpo aislado que enlaza específicamente al aducto acetaminofén-proteína pero no enlaza específicamente al acetaminofén libre, en el que el anticuerpo se enlaza específicamente a un aducto acetaminofén-proteína 8.000 veces más eficazmente que acetaminofén libre, en el que el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1; (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3; (d) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4; (e) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5; y (f) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6; y (ii) determinar si está presente el aducto acetaminofén-proteína, en el que si no está presente el aducto acetaminofén-proteína, la hepatotoxicidad en el sujeto no se debe a la toxicidad inducida por acetaminofén y en el que si está presente el aducto acetaminofénproteína, comparar la cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra a un valor de referencia, en el que una mayor cantidad de aducto acetaminofén-proteína en la muestra en comparación con el valor de referencia indica que la hepatotoxicidad en el sujeto se debe a la toxicidad inducida por acetaminofén.