ES2843058T3

ES2843058T3 - Oligonucleótidos y métodos para su preparación

Info

Publication number: ES2843058T3
Application number: ES17708753T
Authority: ES
Inventors: Shuji Ikeda; Shozo Fujita; Tsuyoshi Fujihara
Original assignee: Aptamer Group Ltd
Current assignee: Aptamer Group Ltd
Priority date: 2016-03-04
Filing date: 2017-03-02
Publication date: 2021-07-15
Anticipated expiration: 2037-03-02
Also published as: US11987904B2; PL3423594T3; US20230132627A1; WO2017149097A1; GB201603789D0; DK3423594T3; EP3423594B1; EP3423594A1

Abstract

Un constructo de oligonucleótido que comprende un elemento funcional y un elemento de codificación, en el que el elemento funcional comprende una secuencia funcional, comprendiendo la secuencia funcional una secuencia de nucleótidos en la que uno o más, o cada, nucleótido está modificado y el elemento de codificación comprende una secuencia de codificación, comprendiendo la secuencia de codificación una secuencia de nucleótidos que no contiene las modificaciones de la secuencia funcional, en la que la secuencia de codificación codifica la estructura de secuencia de la secuencia funcional y en la que la secuencia de codificación es un polímero de oligonucleótido de n mers, o una pluralidad de n mers diferentes, en el que n es un número entero de 2 o mayor y cada n mer corresponde a un solo nucleótido en la secuencia funcional y la secuencia de codificación tiene n veces el número de nucleótidos que secuencia funcional.

Description

DESCRIPCIÓN

Oligonucleótidos y métodos para su preparación

Campo de la invención

La presente invención se refiere a constructos de oligonucleótidos y su uso en la selección e identificación de oligonucleótidos que tienen una propiedad de interés.

Antecedentes de la invención

Los aptámeros, también llamados ligandos de ácido nucleico, son una clase de molécula de ácido nucleico identificada por el proceso SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) y caracterizada por la capacidad de unirse a una molécula objetivo con alta especificidad y alta afinidad. La interacción de unión se basa en la estructura tridimensional del ácido nucleico en lugar de la unión complementaria de bases (hibridación). Los aptámeros y SELEX se describen en Tuerk y Gold (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 3 de agosto de 1990; 249 (4968): 505-10) y en el documento WO91/19813. SELEX es un proceso iterativo en el que se criba una biblioteca de ácidos nucleicos candidatos para determinar su capacidad para unirse a una molécula objetivo, los ácidos nucleicos de unión se separan de los ácidos nucleicos que no son de unión, se amplifican (por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)) y luego se vuelven a cribar hasta que se pueda identificar un pequeño número de ácidos nucleicos que tienen alta afinidad por la molécula objetivo.

Aunque SELEX se puede realizar con algunos nucleótidos modificados, el alcance de las modificaciones útiles puede estar limitado por la capacidad de las enzimas polimerasas para aceptar el nucleótido modificado como sustrato. En este contexto, una técnica alternativa para identificar oligonucleótidos modificados, los denominados aptámeros X, se describe en el documento US 2014/0100120 A1. En esta técnica se prepara una biblioteca combinatoria basada en perlas de aptámeros X en la que cada perla de la biblioteca comprende más de una copia de un oligonucleótido único (secuencia de bases y modificaciones). La biblioteca se puede cribar frente a una molécula objetivo y seleccionar perlas individuales (y por lo tanto, aptámeros X). Una desventaja continua de este enfoque es que la amplificación basada en polimerasa utilizada para determinar la secuencia del aptámero X aún requiere el uso de una copia no modificada (proxy) del aptámero X a la cual se debe aplicar la información de codificación para indicar cuáles de los nucleótidos no modificados en el proxy están modificados en el aptámero X seleccionado. A su vez, esto limita el intervalo de modificaciones químicas que pueden usarse a aquellas que pueden ser leídas por la polimerasa usada en la etapa de amplificación.

La formación basada en perlas de una biblioteca aleatoria, es decir, la metodología de división y mezcla, y la determinación de la estructura después de identificar una molécula funcional de la biblioteca, son informadas por Lik Hang Yuen et al., J. Amer. Chem. Soc., 136, páginas 14576-14582 (2014) y Michae1H. J. Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, páginas 10922-10926 (1993). El primero describe una biblioteca de oligonucleótidos tetrámeros compuesta por 9 nucleótidos modificados. Utiliza espectroscopia de masas MALDI-TOF de la molécula para identificar su estructura. El último describe una biblioteca de péptidos hexámeros con una molécula etiqueta que es adecuada para la cromatografía de gases después de la irradiación UV. Ninguno de los métodos es razonablemente aplicable a oligonucleótidos más largos.

El documento US 7.517.646B2 describe una molécula de oligonucleótido funcional no derivada de SELEX que puede seleccionarse para que tenga alta afinidad y especificidad por una molécula objetivo. El oligonucleótido funcional comprende una cadena contigua de n mers de nucleótidos, en la que n es siempre 2 o más. Por ejemplo, cuando n = 2, el oligonucleótido comprende una cadena contigua de dinucleótidos. Un nucleótido en cada n mers es un nucleótido modificado, no estando modificado el nucleótido o nucleótidos restantes. La secuencia de bases única de cada n mer codifica por lo tanto el tipo de modificación contenida en el nucleótido modificado. La secuencia de bases (o secuencia n mer) del oligonucleótido codifica por lo tanto el patrón de modificaciones presentes y leyendo la secuencia de bases en una dirección 5' a 3' en unidades de n, se puede determinar el patrón de modificación.

Las modificaciones contempladas en el documento US 7.517.646B2 incluyen la modificación en la posición 5 de pirimidina o la modificación en la posición 7 u 8 de la purina mediante la unión de una fracción de aminoácido a la base de pirimidina o purina, teniendo cada n mer único una cadena lateral diferente de aminoácidos. En el documento US 8.940.879B2 se describen otras modificaciones en las que el grupo amina de la base del nucleósido en la posición 6 de la adenina, la posición 2 de la guanina o la posición 4 de la citosina se usa para la unión. También se describen ejemplos de nucleótidos modificados en los documentos US 7.910.726B2 y US 8.759.502B2.

Como tales, los oligonucleótidos funcionales descritos en los documentos US 7.517.646B2, US 8.940.879B2, US 7.910.726B2 y US 8.759.502B2 proporcionan una estructura de oligonucleótidos modificada para contener una serie de fracciones de aminoácidos disponibles para interactuar con un objetivo dado, por ejemplo, una proteína. Por lo tanto, el oligonucleótido presenta una serie de aminoácidos, en particular cadenas laterales de aminoácidos, que están disponibles para unir objetivos candidatos. La interacción del oligonucleótido y el objetivo imita la de los agentes de unión peptídicos o proteicos, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, en los que los aminoácidos y sus cadenas laterales forman el sitio de unión/interfaz. Mediante la preparación de una biblioteca de oligonucleótidos que difieren en el orden y la composición de las unidades n mer, se puede preparar un gran número (4n) de moléculas de oligonucleótidos que difieren en la composición y secuencia de las cadenas laterales de aminoácidos y cribarse para la unión al objetivo.

Al igual que con la situación descrita en el documento US 2014/0100120 A1, para determinar la secuencia de n mers en un oligonucleótido funcional seleccionado y, por lo tanto, determinar la secuencia de la cadena lateral de aminoácidos del oligonucleótido, se requiere que las modificaciones sean eliminadas de cada base para permitir el uso de técnicas de amplificación basadas en polimerasa (por ejemplo, PCR). Por ejemplo, el método de desprotección de dos etapas descrito en el documento US 2015/0167055A1 implica la eliminación de todas las cadenas laterales modificadas, por ejemplo, por tratamiento con amoniaco acuoso, hidróxido de sodio o ácido fluorhídrico y fluoruro. Como resultado, el oligonucleótido funcional se destruye durante la decodificación de su patrón de modificación y requiere de nueva síntesis a partir de entonces. Esta característica de los oligonucleótidos funcionales descritos en el documento US 7.517.646B2 es también la razón por la que no son aptámeros identificables por SELEX, confiando el proceso SELEX en la amplificación fiel de las secuencias de ácido nucleico entre rondas de unión al objetivo.

Con el fin de proporcionar suficiente espacio de secuencia para acomodar un número útil de modificaciones de bases diferentes, el documento US 7.517.646B2 describe que el valor mínimo de n para cada n mer es 2. Esto tiene el efecto de que una fracción de aminoácido solo es presentada por un mínimo de un nucleótido sí y otro no, lo que requiere cadenas largas de oligonucleótidos para presentar un número dado de fracciones de aminoácidos, aumentando el espacio entre las cadenas laterales de aminoácidos y reduciendo la densidad de las fracciones de aminoácidos; estos factores son relevantes para la presentación y accesibilidad de las fracciones de la cadena lateral de aminoácidos a las moléculas objetivo candidatas. Cuando n = 2, el número máximo de dinucleótidos es solo 16, lo que significa que para generar bibliotecas de diversidad estructural significativa, a menudo se requieren nuevas tablas de codificación (por ejemplo, véase las Figuras 11B y 12B) y se requiere a menudo una nueva síntesis de dinucleótidos, que es un proceso que requiere mucho tiempo.

El documento US2014/100120A1 describe un método para aislar un aptámero X específico del objetivo que incluye las etapas de generar una biblioteca de oligonucleótidos que contiene una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos diferentes usando síntesis de división y agrupamiento basada en perlas en la que al menos un nucleótido derivado del enlazador químico es pseudoinsertado aleatoriamente en las secuencias de oligonucleótidos y en el que el enlazador químico proporciona la unión de un ligando X en las secuencias de oligonucleótidos formando así una biblioteca de aptámeros X e identificando una secuencia de aptámeros X específicos del objetivo mediante unión al objetivo y determinación de la secuencia.

El documento WO2009/012410A1 describe métodos SELEX mejorados para generar ligandos de ácido nucleico que son capaces de unirse a moléculas objetivo y métodos fotoSELEX mejorados para generar ligandos de ácido nucleico fotorreactivos que son capaces de unirse y entrecruzarse covalentemente a moléculas objetivo.

El documento WO2004/083427A2 describe métodos para la síntesis de moléculas tales como moléculas codificadas resultantes de la síntesis dirigida por molde que implica una pluralidad de bloques de constructo.

El documento WO93/06121A1 describe un método estocástico para sintetizar bibliotecas de oligómeros aleatorios sobre soportes sólidos o partículas. Los oligómeros están compuestos por una secuencia de monómeros que se pueden unir para formar un oligómero o polímero. La biblioteca se puede cribar para aislar oligómeros individuales.

El documento WO93/20242A1 describe un método en el que se realizan dos síntesis combinatorias paralelas alternas de modo que una etiqueta genética se une químicamente a una estructura química que se va a sintetizar. La adición de una unidad química a la estructura es seguida por la adición de una secuencia de oligonucleótidos que define el código para esa unidad química. Se puede construir una biblioteca mediante la repetición del proceso después de agrupar y dividir.

Sumario de la invención

Los inventores han abordado estos problemas proporcionando un constructo de oligonucleótido que comprende dos elementos de secuencia de oligonucleótidos: un elemento funcional que contiene los nucleótidos modificados y un elemento de codificación que puede amplificarse mediante técnicas de amplificación enzimática. Los dos elementos de la secuencia están conectados, ya sea por una matriz de soporte o directamente para formar una sola molécula. De este modo, el elemento de codificación permanece asociado con el elemento funcional, que puede usarse para seleccionar secuencias de oligonucleótidos que tengan una propiedad deseada.

La amplificación y secuenciación del elemento de codificación permite la determinación de la estructura de secuencia, incluidas modificaciones, del elemento funcional que puede sintetizarse de acuerdo con la estructura de secuencia determinada. El constructo de oligonucleótido puede usarse para formar una biblioteca aleatoria de oligonucleótidos modificados, permitiendo la selección de un elemento funcional que tenga afinidad por una molécula objetivo o funciones biológicas deseadas y permitiendo la identificación de la estructura de secuencia del elemento funcional.

En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un constructo de oligonucleótido, comprendiendo el constructo de oligonucleótido un elemento funcional y un elemento de codificación, en el que el elemento funcional comprende una secuencia funcional que comprende una secuencia de nucleótidos en la que uno o más, o cada nucleótido se modifica y el elemento de codificación comprende una secuencia de codificación que comprende una secuencia de nucleótidos que no contiene las modificaciones de la secuencia funcional, en la que la secuencia de codificación codifica la estructura de secuencia de la secuencia funcional.

Los nucleótidos modificados pueden, en principio, ser de cualquier tipo. La modificación puede estar en cualquier parte del nucleótido, por ejemplo, fosfato, azúcar o base. En realizaciones preferidas, los nucleótidos modificados incorporan modificaciones en la base.

En algunas realizaciones, el o los nucleótidos modificados de la secuencia funcional se seleccionan independientemente para comprender la estructura B-L-Func en la que B se selecciona independientemente entre una base de pirimidina o purina; L se selecciona independientemente de un enlace o un enlazador; y Func es un sustituyente funcional.

En algunas realizaciones, el elemento funcional y el elemento de codificación son parte de un único oligonucleótido lineal o ramificado. En otras realizaciones, cada uno de los elementos funcionales y de codificación están unidos a una matriz de soporte.

En algunas realizaciones, la secuencia de codificación es un polímero oligonucleotídico de n mers, preferiblemente una pluralidad de n mers diferentes, en las que n es un número entero de 1 o mayor (preferiblemente 2 o mayor) y cada n mer corresponde a un nucleótido único en la secuencia funcional. Como tal, la secuencia de codificación tiene preferiblemente n veces el número de nucleótidos que la secuencia funcional.

En algunas realizaciones, el elemento funcional comprende la secuencia funcional flanqueada por dos o más secuencias de oligonucleótidos que tienen complementariedad parcial o completa entre sí.

En algunas realizaciones, el elemento de codificación comprende la secuencia de codificación flanqueada por dos secuencias de oligonucleótidos.

En algunas realizaciones, el elemento funcional y el elemento de codificación son monocatenarios.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para producir una molécula de oligonucleótido, comprendiendo el método sintetizar una molécula de oligonucleótido basada en la estructura de secuencia de una secuencia funcional de un constructo de oligonucleótido identificada o identificable por un método que comprende poner en contacto una mezcla de diferentes constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la presente divulgación con una molécula objetivo en condiciones que permitan que el constructo de oligonucleótido y la molécula objetivo se unan y formen un complejo de constructo de oligonucleótido:molécula objetivo, dividiendo los complejos de oligonucleótidos no unidos y/o molécula objetivo no unida, identificando un constructo de oligonucleótido capaz de unirse a la molécula objetivo, preferiblemente con alta afinidad, y determinando la estructura de secuencia de la secuencia funcional.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para preparar un constructo de oligonucleótido, comprendiendo el método sintetizar un constructo de oligonucleótido como se describe en el presente documento.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona una biblioteca de constructos de oligonucleótidos como se describe en el presente documento, en el que la biblioteca comprende una pluralidad de constructos de oligonucleótidos que tienen una estructura de secuencia diferente de la secuencia funcional. En algunas realizaciones, los constructos de oligonucleótidos difieren en la secuencia de bases de la secuencia funcional.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para preparar una biblioteca de constructos de oligonucleótidos, comprendiendo el método sintetizar una pluralidad de constructos de oligonucleótidos, cada una como se describe en el presente documento, en el que los constructos de oligonucleótidos tienen una estructura de secuencia diferente de la secuencia funcional.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para preparar un constructo de oligonucleótido, comprendiendo el constructo de oligonucleótido un elemento funcional y un elemento de codificación, comprendiendo el método:

(i) extensión de un elemento funcional mediante la adición de un solo nucleótido modificado para formar una secuencia funcional,

(ii) extensión de un elemento de codificación mediante la adición de un nucleótido de n mer para formar una secuencia de codificación, seleccionando n mer para codificar la estructura de dicho nucleótido modificado de la etapa (i), en la que n es un número entero de 1 o más (preferiblemente 2 o más) y el n mer no contiene la modificación de dicho nucleótido modificado de la etapa (i),

en el que la etapa (i) o (ii) puede realizarse primero y las etapas (i) y (ii) son realizadas secuencialmente.

En algunas realizaciones, las etapas (i) y (ii) pueden repetirse según sea necesario para producir una secuencia de codificación que tenga una longitud n veces la longitud de la secuencia funcional.

En algunas realizaciones, la extensión del elemento de codificación puede comprender la adición de n monómeros nucleotídicos.

En algunas realizaciones, el número de etapas de extensión realizadas (para cada uno de (i) y (ii)) puede ser una de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30.

En algunas realizaciones, el constructo de oligonucleótido puede ser un oligonucleótido ramificado, en el que la extensión en (i) comprende la adición de un solo nucleótido modificado a una fracción ramificada para formar una primera ramificación, y la extensión en (ii) comprende la adición de un nucleótido de n mer a la fracción ramificada para formar una segunda ramificación.

En algunas realizaciones, cada constructo de oligonucleótido se une a un soporte sólido y la preparación de los constructos de oligonucleótidos se realiza de acuerdo con una tabla de codificación que describe la relación entre cada nucleótido agregado a la secuencia funcional y el n mer agregado a la secuencia de codificación en una posición correspondiente, en la que cada realización de las etapas (i) y (ii) forma una ronda de extensión, y en la que entre las rondas de extensión los soportes sólidos se mezclan y luego se dividen en 2x partes y al menos una o cada una de las 2x partes se somete a una nueva ronda de extensión, en la que x es el número de n mers en la tabla de codificación.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para preparar una biblioteca de constructos de oligonucleótidos, cada constructo de oligonucleótido unido a un soporte sólido y cada constructo de oligonucleótido que comprende un elemento funcional y un elemento de codificación, comprendiendo el método:

proporcionar una pluralidad de soportes sólidos, cada uno unido a una resto ramificado, opcionalmente mediante un resto espaciador o enlazador, a partir del cual se puede sintetizar un oligonucleótido ramificado por extensión de cada ramificación,

(i) extensión de una ramificación para formar un elemento funcional mediante la adición de un solo nucleótido modificado para formar una secuencia funcional,

(ii) extensión de otra ramificación para formar un elemento de codificación mediante la adición de un nucleótido de n mer para formar una secuencia de codificación, el n mer seleccionado para codificar la estructura de dicho nucleótido modificado de la etapa (i), en la que n es un número entero de 1 o más, preferiblemente 2 o más, y el n mer no contiene la modificación de dicho nucleótido modificado de la etapa (i),

en el que la etapa (i) o (ii) se puede realizar primero y las etapas (i) y (ii) se realizan secuencialmente.

En algunas realizaciones, la preparación de los constructos de oligonucleótidos se lleva a cabo de acuerdo con una tabla de codificación que describe la relación entre cada nucleótido agregado a la secuencia funcional y el n mer agregado a la secuencia de codificación en una posición correspondiente, en la que cada realización de las etapas (i) y (ii) forman una ronda de extensión, y en la que entre las rondas de extensión los soportes sólidos se mezclan y luego se dividen en 2x partes y al menos una o cada una de las 2x partes se somete a una nueva ronda de extensión, en la que x es el número de n mers en la tabla de codificación.

En algunas realizaciones, las etapas (i) y (ii) pueden repetirse según sea necesario para producir una secuencia de codificación que tiene una longitud n veces la longitud de la secuencia funcional.

En algunas realizaciones, el número de etapas de extensión realizadas (para cada una de (i) y (ii)) puede ser una de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un oligonucleótido, comprendiendo el oligonucleótido una secuencia funcional que comprende una secuencia de nucleótidos en la que dos o más, o cada, nucleótido se modifica mediante la incorporación de un sustituyente funcional, y en el que al menos dos de los nucleótidos adyacentes se modifican de esta manera, en la que cada sustituyente funcional se selecciona independientemente de una cadena lateral de un aminoácido natural o no natural, opcionalmente no de la cadena lateral de glicina (H).

En realizaciones preferidas, al menos tres o al menos cuatro nucleótidos adyacentes están así modificados.

En algunas realizaciones, el o los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente para comprender la estructura B-L-Func en la que B se selecciona independientemente entre una base de pirimidina o purina; L se selecciona independientemente de un enlace o un enlazador; y Func es un sustituyente funcional seleccionado de una cadena lateral de una de Alanina (Ala), Arginina (Arg), Asparagina (Asn), Ácido aspártico (Asp), Cisteína (Cys), Ácido glutámico (Glu), Glutamina (Gln), Histidina (His), Isoleucina (Ile), Leucina (Leu), Lisina (Lys), Metionina (Met), Fenilalanina (Phe), Prolina (Pro), Serina (Ser), Treonina (Thr), Triptófano (Trp), Tirosina (Tyr), valina (Val), selenocisteína (Sec) y pirrolisina (Pyl).

En algunas realizaciones, el o los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente para comprender la estructura B-L-Func en la que B se selecciona independientemente de una base de pirimidina o purina; L se selecciona independientemente de un enlace o un enlazador; y Func es un sustituyente funcional seleccionado de una cadena lateral de una de histidina, serina, leucina, ácido glutámico, lisina, fenilalanina, tirosina y triptófano.

En algunas realizaciones, el o los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente para comprender la estructura B-L-Func en la que B se selecciona independientemente de una base de pirimidina o purina; L se selecciona independientemente de un enlace o un enlazador; y Func es un sustituyente funcional seleccionado de una cadena lateral de una de Cit (citrulina), L-DOPA (L-3,4-dihidroxi-fenilalanina), homoarginina, homocisteína, homoleucina, homofenilalanina, homoserina, Nle (norleucina), Nva (norvalina), Orn (ornitina) y fenilglicina.

En algunas realizaciones, la secuencia funcional está flanqueada por dos o más secuencias de oligonucleótidos que tienen complementariedad parcial o completa entre sí. En algunas realizaciones, el oligonucleótido es monocatenario.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para preparar un oligonucleótido, comprendiendo el método sintetizar un oligonucleótido de acuerdo con la presente invención.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para preparar un oligonucleótido de acuerdo con la presente divulgación, comprendiendo el método sintetizar una molécula de oligonucleótido basada en la estructura de secuencia de una secuencia funcional de un constructo de oligonucleótido identificado por, o identificable por, un método que comprende poner en contacto una mezcla de diferentes constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la presente divulgación con una molécula objetivo en condiciones que permitan que el constructo de oligonucleótido y la molécula objetivo se unan y formen un complejo de constructo de oligonucleótido: molécula objetivo, dividiendo los complejos de oligonucleótidos no unidos y/o molécula objetivo no unida, identificando un constructo de oligonucleótido capaz de unirse a la molécula objetivo, preferiblemente con alta afinidad, y determinando la estructura de secuencia de la secuencia funcional.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para detectar una molécula objetivo, comprendiendo el método poner en contacto un oligonucleótido de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación, en el que el oligonucleótido es capaz de unirse a la molécula objetivo, con una muestra que contiene, o se sospecha que contiene, dicha molécula objetivo, y detectar la formación de un complejo oligonucleótido: molécula objetivo.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona una composición que comprende un oligonucleótido de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación. El oligonucleótido se puede proporcionar en forma aislada y/o purificada y/o estéril.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona una composición farmacéutica, comprendiendo la composición farmacéutica un oligonucleótido de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición de diagnóstico que comprende un oligonucleótido de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método, opcionalmente un método in vitro, comprendiendo el método poner en contacto un oligonucleótido de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación con una molécula objetivo y formar un complejo de dicho oligonucleótido y molécula objetivo.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un complejo no covalente, preferiblemente in vitro, comprendiendo el complejo un oligonucleótido de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación y una molécula objetivo.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un oligonucleótido de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia o en un método de diagnóstico practicado en el cuerpo de un ser humano o animal.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un oligonucleótido de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación para su uso en un método de tratamiento o diagnóstico.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona el uso de un oligonucleótido de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación en la fabricación de una composición farmacéutica o medicamento para su uso en un método de tratamiento.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para tratar una enfermedad, comprendiendo el método administrar un oligonucleótido de acuerdo con cualquier aspecto de la presente divulgación a un sujeto que necesita tratamiento.

Descripción

Los inventores han diseñado un constructo de oligonucleótido que contiene un elemento funcional que comprende al menos una secuencia funcional que incorpora una modificación o modificaciones estructurales, y un elemento de codificación que comprende al menos una secuencia de codificación que preferiblemente no está modificada. Las secuencias funcionales y de codificación pueden ser cada una de ellas secuencias de nucleótidos contiguas. En algunas realizaciones, pueden contener una secuencia fija, espaciador o enlazador dentro de una o cada una de las respectivas secuencias de codificación y funcionales. Cuando el espaciador o enlazador no es un nucleótido u oligonucleótido, la secuencia funcional o de codificación puede considerarse no contigua. La secuencia de codificación es un elemento de secuencia distinto de la secuencia funcional y preferiblemente las secuencias de codificación y funcionales no se solapan. La secuencia de codificación no está modificada o contiene modificaciones que permiten la amplificación, por ejemplo, amplificación basada en enzimas (por ejemplo, polimerasa). Por lo tanto, la estructura de la secuencia, incluida la secuencia de modificación, de la secuencia funcional puede determinarse secuenciando la secuencia de codificación sin destrucción o alteración (por ejemplo, eliminación o alteración de las modificaciones) de la secuencia funcional, o la necesidad de volver a sintetizar la secuencia funcional después de la determinación de la secuencia.

La secuencia funcional puede representar una región de secuencia aleatoria, que varía entre constructos de oligonucleótidos. Cada secuencia funcional se sintetiza preferiblemente de manera que la naturaleza de cada base (por ejemplo, tipo de base y tipo de modificación) esté codificada por un nucleótido de n mer en la secuencia de codificación, y de acuerdo con un código predeterminado que se almacena en una tabla de codificación.

Se puede proporcionar una biblioteca de constructos de oligonucleótidos que contenga una pluralidad de constructos de oligonucleótidos únicas, que difieren en la estructura de la secuencia, incluidas las modificaciones de nucleótidos, y/o en la tabla de codificación asociada, de sus secuencias funcionales (y en la correspondiente secuencia de bases de la secuencia de codificación). La biblioteca puede contener uno de 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, o más, diferentes constructos de oligonucleótidos. Pueden cribarse bibliotecas de constructos de oligonucleótidos para identificar constructos de oligonucleótidos, en particular secuencias de secuencias funcionales, que tienen una función o propiedad química o física particular. En algunas realizaciones, los constructos de oligonucleótidos se pueden cribar para identificar los constructos de oligonucleótidos, en particular secuencias funcionales, que se unen a una molécula objetivo con alta afinidad y/o especificidad.

Un constructo de oligonucleótido puede formarse como una única molécula que tiene al menos dos componentes: un elemento funcional y un elemento de codificación.

En algunas realizaciones, el constructo de oligonucleótido puede comprender un único oligonucleótido lineal o ramificado en el que el elemento funcional y el elemento de codificación están presentes como dominios de secuencia distintos, preferiblemente no superpuestos, que opcionalmente pueden estar separados por elementos de secuencia de nucleótidos adicionales. En algunas realizaciones, pueden estar presentes enlazadores que no son de ácido nucleico entre los elementos funcionales y de codificación.

En algunas realizaciones, el constructo de oligonucleótido puede comprender al menos dos moléculas de oligonucleótidos, una formando el elemento funcional y otra formando el elemento de codificación, cada una unida a una matriz de soporte, por ejemplo, una perla.

Después de la identificación de un constructo de oligonucleótido que tiene una secuencia funcional de interés, la estructura de secuencia de la secuencia funcional puede determinarse secuenciando la secuencia de codificación y haciendo referencia a la tabla de codificación para decodificar la estructura de secuencia de la secuencia funcional.

En algunas realizaciones, tras la identificación de un constructo de oligonucleótido que tiene una secuencia funcional de interés, la secuencia de la secuencia de codificación puede determinarse y, con referencia a una tabla de codificación, decodificarse para revelar la estructura de secuencia de la secuencia funcional.

Las moléculas de oligonucleótidos que comprenden al menos la secuencia de la secuencia funcional, sin la secuencia de codificación o el elemento de codificación, pueden entonces sintetizarse nuevamente.

Los constructos de oligonucleótidos y las moléculas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente divulgación pueden proporcionarse en forma aislada o purificada. Preferiblemente, son moléculas de origen no natural y pueden incluir modificaciones de origen no natural. Las secuencias funcionales preferiblemente comprenden o consisten en secuencias de bases o estructuras de secuencias de origen no natural (es decir, que incluyen modificaciones).

Los oligonucleótidos pueden ser de ADN, ARN, monocatenarios o bicatenarios. Los oligonucleótidos son preferiblemente monocatenarios. Los oligonucleótidos son preferiblemente ADN.

Los constructos de oligonucleótidos, moléculas de oligonucleótidos y secuencias funcionales de acuerdo con la presente divulgación pueden ser útiles en prácticamente cualquier situación en la que se requiera la unión al objetivo, incluido el uso en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación (por ejemplo, herramientas de investigación), in vitro o in vivo.

Constructo de oligonucleótidos

Los constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la presente divulgación comprenden un elemento funcional que comprende al menos una secuencia de oligonucleótidos funcional (denominada en el presente documento "secuencia funcional") y un elemento de codificación que comprende al menos una secuencia de oligonucleótidos de codificación (denominada en el presente documento como 'secuencia de codificación').

El elemento funcional comprende una secuencia funcional destinada a contener modificaciones en la estructura de nucleótidos, nucleósidos o bases. La secuencia funcional forma el núcleo de un oligonucleótido candidato que puede cribarse en busca de propiedades físicas, químicas o funcionales, tales como la unión al objetivo.

Se pretende que el elemento funcional proporcione una secuencia funcional compuesta por nucleótidos modificados y, opcionalmente, algunos nucleótidos no modificados. Ciertas secuencias funcionales (y/o elementos funcionales) pueden plegarse y formar una estructura tridimensional que permite la interacción complementaria y, preferiblemente, la unión a una molécula objetivo. Estas secuencias se pueden seleccionar mediante un cribado apropiado.

El elemento de codificación comprende una secuencia de codificación destinada a codificar la estructura de la secuencia (secuencia de nucleótidos/bases y las modificaciones específicas) de la secuencia funcional, y está destinada a permitir una fácil amplificación y secuenciación de la secuencia de codificación para permitir una traducción simple y rápida de la secuencia codificada de la secuencia funcional. Las modificaciones de nucleótidos, nucleósidos y bases presentes en la secuencia funcional están preferiblemente ausentes de la parte correspondiente de la secuencia de codificación y preferiblemente están completamente ausentes de la secuencia de codificación.

El elemento funcional y el elemento de codificación pueden unirse covalentemente para formar una única molécula de oligonucleótido contigua, por ejemplo, una molécula de oligonucleótido lineal o ramificada. Las secuencias de nucleótidos contiguas están típicamente unidas covalentemente por enlaces fosfodiéster o enlaces similares tales como fosforotioato. En algunas realizaciones, pueden estar presentes enlazadores que no son de ácido nucleico entre elementos de secuencia de nucleótidos, por ejemplo, entre las secuencias funcionales y de codificación. Los enlazadores o espaciadores pueden proporcionar unión covalente o no covalente de elementos de secuencia de nucleótidos. Los ejemplos de enlazadores o espaciadores incluyen moléculas de polietilenglicol, o el uso de pares de elementos de captura y etiqueta tales como biotina y avidina.

Los constructos de oligonucleótidos de molécula única pueden ser moléculas de oligonucleótidos lineales. Estos pueden sintetizarse químicamente como un oligonucleótido lineal, por ejemplo, por el método de la fosforamidita. La química de la fosforamidita es un método atractivo de síntesis química de oligonucleótidos que emplea una reacción de condensación de nucleósido fosforamidita al nucleósido usando tetrazol como potenciador. El ciclo asociado con la química de oligonucleótidos basada en la química de la fosforamidita es conocido en la técnica. En resumen, un nucleótido soportado sólido se destritila, luego se acopla con un nucleósido de fosforamidita activado adecuadamente para formar un enlace triéster de fosfito. Entonces puede ocurrir una protección, seguido de oxidación del triéster de fosfito con un oxidante, típicamente yodo. Luego, el ciclo se repite para ensamblar la cadena [por ejemplo, véase Sinha, N. D.; Biernat, J.; McManus, J.; Koster, H. Nucleic Acids Res. 1984, 12, 4539; y Beaucage, S. L.; lyer, R. P. (1992). Tetrahedron 48 (12): 2223].

En algunas realizaciones, los constructos de oligonucleótidos de molécula única pueden tomar la forma de oligonucleótidos ramificados (preferiblemente que tienen dos ramificaciones), en los que el elemento funcional forma una ramificación y el elemento de codificación forma otra ramificación. Los oligonucleótidos ramificados también se pueden sintetizar químicamente, por ejemplo, utilizando una bisfosforamidita de ribonucleósido como el sintón de introducción de ramificación que permite la creación de moléculas en forma de Y y V; véase Sandra Carriero y Masad J. Damha., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (2002) 4.14.1-4.14.32; o Masad J. Damha, Steve Zabarylo, Tetrahedron Letters, Volumen 30, Edición 46, 1989, páginas 6295-6298. La extensión de dos oligonucleótidos simultáneamente también se puede lograr a partir de una fracción ramificada indicada por la fórmula (A) a continuación que comprende un glicerol sustituido con un grupo DMTr en un OH, grupo 2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita en otro OH y un grupo levulinilo en el grupo OH residual.

Fórmula (A)

Puede incorporarse una fracción espadadora más largo entre los grupos DMTr, fosforamidita y levulinilo para evitar el impedimento estérico.

Cada ramificación se puede sintetizar en cualquier dirección elegida, por ejemplo, 3' a 5' (5' distal a la fracción ramificada) o 5' a 3' (3' distal a la fracción ramificada). En realizaciones preferidas, el elemento funcional y el elemento de codificación se sintetizan cada uno en una orientación 3' a 5' con el extremo 5' distal a la fracción ramificada. Un oligonucleótido enlazador, por ejemplo, utilizado para unir el constructo de oligonucleótido a una matriz de soporte, puede formar una tercera ramificación y puede sintetizarse en cualquier orientación. En una realización, el oligonucleótido enlazador se forma de modo que el extremo 5' esté próximo a la fracción ramificada.

Preferiblemente, el elemento funcional y el elemento de codificación no se superponen y/o la secuencia funcional y la secuencia de codificación no se superponen.

En algunas realizaciones se proporciona una biblioteca de constructos de oligonucleótidos, teniendo la biblioteca una pluralidad de constructos de oligonucleótidos que difieren en la estructura de secuencia del elemento funcional o secuencia funcional, que difieren opcionalmente en la secuencia de bases del elemento funcional o secuencia funcional y opcionalmente que difieren en el elemento de codificación o secuencia de codificación correspondiente. En algunas realizaciones, un constructo o biblioteca de oligonucleótidos puede ir acompañada de una o más tablas de codificación, lo que permite determinar la estructura de secuencia de la secuencia funcional a partir de la secuencia de la secuencia de codificación.

En algunas realizaciones, el constructo o constructos de oligonucleótidos pueden incorporar una secuencia de ID de la tabla de codificación, opcionalmente colocada entre secuencias fijas que flanquean la secuencia de codificación y permiten la amplificación basada en enzimas. La secuencia de ID de la tabla de codificación indica la identidad de la tabla de codificación correcta y permite la selección de la tabla de codificación correcta con el fin de determinar la estructura de secuencia de la secuencia funcional con base en la secuencia de la secuencia de codificación. En tales realizaciones, la tabla de codificación puede tener un código o identificador que corresponda a una secuencia de ID de la tabla de codificación.

Elemento funcional

Un elemento funcional puede comprender o consistir en una secuencia funcional. Opcionalmente, el elemento funcional puede comprender además una, dos o más secuencias funcionales fijas, como se describe a continuación. Un elemento funcional es preferiblemente una molécula de oligonucleótido, aunque puede comprender componentes no nucleotídicos, por ejemplo, moléculas espaciadoras o enlazadoras.

La secuencia funcional puede ser una secuencia contigua de nucleótidos en la que uno o más, o todos, los nucleótidos están modificados, comprendiendo la modificación preferiblemente un nucleósido modificado (por ejemplo, para ARN: adenosina, guanosina, 5-metiluridina, uridina, citidina modificadas, y para ADN: desoxiadenosina, desoxiguanosina, timidina, desoxiuridina, desoxicitidina) modificadas o base (por ejemplo, adenina, uracilo, guanina, timina, citosina). La secuencia de bases primaria de la secuencia funcional normalmente variará entre constructos de oligonucleótidos. La secuencia funcional puede tener una, dos o más secuencias de oligonucleótidos adyacentes, por ejemplo, una en el extremo 5' y otra en el extremo 3' de la secuencia funcional, flanqueando así la secuencia funcional. Estas secuencias, cada una de las cuales se denomina en el presente documento "secuencia funcional fija", preferiblemente tienen una secuencia predeterminada y preferiblemente no son aleatorias. La secuencia funcional y la secuencia o secuencias funcionales fijas forman preferiblemente un único oligonucleótido contiguo, denominado en el presente documento "elemento funcional". Como tal, el elemento funcional puede comprender, o consistir en, una secuencia funcional y una o más, preferiblemente dos o más de dos, secuencias funcionales fijas. En algunas realizaciones, la secuencia funcional puede estar flanqueada por dos secuencias funcionales fijas que forman cada una, una molécula de oligonucleótido contigua con la secuencia funcional. En algunas realizaciones, la secuencia funcional también puede tener una o más secuencias funcionales fijas insertadas en una posición prefijada dentro de la secuencia funcional. Esto puede proporcionar la formación de estructuras terciarias deseadas, por ejemplo, véase la Figura 15. Las secuencias funcionales fijas pueden tener cualquier longitud conveniente, habitualmente 10 o más, o 15 o más, nucleótidos, por ejemplo, entre 10 y 40 nucleótidos, entre 15 y 40 nucleótidos o entre 15 y 30 nucleótidos.

Las secuencias funcionales fijas pueden diseñarse para que sean parcial o completamente complementarias entre sí, promoviendo así la formación de doble cadena. Esto puede permitir que el elemento funcional forme una estructura de tallo-bucle en la que la secuencia funcional forma parte o todo el bucle. Las secuencias funcionales fijas también pueden diseñarse para que se hibriden con cebadores para la amplificación de la secuencia funcional, por ejemplo, durante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Las secuencias complementarias son secuencias que pueden formar pares de bases (emparejamiento de bases de Watson-Crick) para formar una molécula de ácido nucleico bicatenario (dúplex) sobre la región de complementariedad. La complementariedad parcial o completa de secuencias se refiere al grado en el que dos secuencias alineadas formarán pares de bases. Después del alineamiento, puede existir complementariedad en al menos el 70% de las secuencias alineadas. Alternativamente, esta puede ser una de 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%. La alineación se puede lograr de diversas formas conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, usando software de ordenador disponible públicamente tal como Software ClustalW 1.82., T-coffee o Megalign (DNASTAR).

En algunas realizaciones, el elemento funcional puede tener tres o más secuencias funcionales fijas, por ejemplo, una en el extremo 5', una insertada en una posición prefijada en la secuencia funcional y una en el extremo 3' de la secuencia funcional, las secuencias funcionales fijas 3' y 5' flanqueando así la secuencia funcional. La secuencia funcional y las secuencias funcionales fijas forman preferiblemente un único elemento funcional contiguo. Las secuencias funcionales fijas pueden diseñarse para que sean parcial o completamente complementarias entre sí, promoviendo por lo tanto la formación de doble cadena. Esto puede permitir que el elemento funcional forme una o una pluralidad de estructuras de bucle en las que la secuencia funcional forma parte o todas las estructuras de bucle, por ejemplo, véase la Figura 15. Al menos dos de las secuencias funcionales fijas (preferiblemente las que flanquean la secuencia funcional) también pueden diseñarse para que se hibriden con cebadores para la amplificación de la secuencia funcional, por ejemplo, durante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La hibridación de ácidos nucleicos se refiere al proceso en el que una secuencia de oligonucleótidos monocatenaria se hibrida con otra secuencia de oligonucleótidos monocatenaria (opcionalmente ambas secuencias son elementos que forman parte de un oligonucleótido sencillo) para formar un elemento bicatenario (dúplex). La determinación de la hibridación proporciona un medio alternativo de evaluar la capacidad de formar regiones bicatenarias sobre el análisis de la secuencia para la complementariedad. Las secuencias de ácido nucleico complementarias se hibridarán entre sí a través de interacciones de unión de Watson-Crick. Las secuencias que no son 100% complementarias también pueden hibridarse, pero la fuerza de la hibridación normalmente disminuye con la disminución de la complementariedad. Por lo tanto, la fuerza de la hibridación puede usarse para distinguir el grado de complementariedad de las secuencias capaces de unirse entre sí.

La "rigurosidad" de una reacción de hibridación puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica. La rigurosidad de una reacción determinada puede depender de factores tales como la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. Generalmente se requieren temperaturas más altas para la hibridación adecuada de sondas largas, mientras que las sondas más cortas se pueden hibridar a temperaturas más bajas. Cuanto mayor sea el grado de complementariedad deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas más altas tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que las temperaturas más bajas lo harían menos.

Por ejemplo, se pueden realizar hibridaciones, de acuerdo con el método de Sambrook et al., ("Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) usando una solución de hibridación que comprende: SSC 5X, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0,5-1,0%, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, pirofosfato de sodio al 0,05% y formamida hasta 50%. La hibridación se lleva a cabo a 37-42 °C durante al menos seis horas. Después de la hibridación, los filtros se lavan de la siguiente manera: (1) 5 minutos a temperatura ambiente en SSC 2X y SDS al 1%; (2) 15 minutos a temperatura ambiente en SSC 2Xy Sd S al 0,1%; (3) 30 minutos-1 hora a 37 °C en Ss C 1X y SDS al 1%; (4) 2 horas a 42-65 °C en SSC 1X y SDS al 1%, cambiando la solución cada 30 minutos.

La secuencia funcional en un elemento funcional puede tener cualquier longitud. Sin embargo, se prefieren secuencias cortas de nucleótidos de 100 nucleótidos o menos. La secuencia funcional puede tener una longitud en el intervalo de uno de 3-100 nucleótidos, 3-90 nucleótidos, 3-80 nucleótidos, 3-70 nucleótidos, 3-60 nucleótidos, 3-50 nucleótidos, 3 40 nucleótidos, 3-30 nucleótidos, 3-15 nucleótidos. En realizaciones preferidas, la secuencia funcional tiene una longitud en el intervalo de 5-30 nucleótidos o 5-15 nucleótidos.

La secuencia funcional puede tener una longitud mínima seleccionada de una de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos y una longitud máxima seleccionada de una de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 nucleótidos. En realizaciones preferidas, la secuencia funcional puede tener una longitud de una de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 nucleótidos. En realizaciones particularmente preferidas, la secuencia funcional tiene una longitud de una u 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En una realización preferida, la secuencia funcional tiene 13 nucleótidos.

La secuencia funcional comprende un elemento de secuencia en el que se modifica uno o más, o cada uno de los nucleótidos. La secuencia funcional puede contener una de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos modificados. En algunas realizaciones preferidas, se modifican al menos dos nucleótidos adyacentes. En algunas realizaciones preferidas se modifican al menos tres o al menos cuatro nucleótidos adyacentes. Opcionalmente, se modifican 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos adyacentes. Un nucleótido adyacente se refiere al siguiente nucleótido en una sola cadena de la secuencia funcional, en la dirección 3' a 5' o 5' a 3'.

Por consiguiente, en algunas realizaciones un nucleótido modificado del elemento funcional comprende un nucleótido en el que la base tiene la estructura

B-L-Func

en la que, B se selecciona independientemente de una base de pirimidina o purina; L se selecciona independientemente de un enlace o un enlazador; y Func es un sustituyente funcional.

La base B está unida a un azúcar, estructura cíclica o acíclica, formando así un nucleósido o análogo de nucleósido, y el nucleósido o análogo de nucleósido se une a un grupo fosfato, formando así el nucleótido.

Fos B L-Func

AZÚCAR

Fos

El sustituyente funcional puede ser de cualquier tipo. En algunas realizaciones, el sustituyente funcional se selecciona independientemente de:

hidrógeno;

alquilo C^1-10opcionalmente sustituido;

alquenilo C^2-10opcionalmente sustituido;

alquinilo C^2-10opcionalmente sustituido;

cicloalquilo C^3-10opcionalmente sustituido;

arilo C^6-10opcionalmente sustituido;

heteroarilo C^5-10opcionalmente sustituido;

heterociclilo C^3-10opcionalmente sustituido;

alquil C^{-M 0}-arilo C^6-10opcionalmente sustituido;

alquil C^1-10-heteroarilo C^5-10opcionalmente sustituido;

alquil C^1-10-cicloalquilo C^5-10opcionalmente sustituido; o

alquil C^1-10-heterociclilo C^5-10opcionalmente sustituido.

En algunos casos, el sustituyente funcional se selecciona entre: hidrógeno; alquilo C^1-5opcionalmente sustituido; fenilo opcionalmente sustituido; heteroarilo C^5-10opcionalmente sustituido; heterociclilo C^5-10opcionalmente sustituido; alquil-C^1-3-fenilo opcionalmente sustituido; alquil C^1-3-heteroarilo C^5-10opcionalmente sustituido; alquil C^1-3-cicloalquilo C^5-6opcionalmente sustituido; o alquil C^1-3-heterociclilo C^5-6opcionalmente sustituido.

Uno o más grupos CH²en sustituyentes alquilo se pueden reemplazar con -O-.

Los grupos alquilo que tienen un número de carbonos que varía de 1 a 10 pueden incluir, por ejemplo, un grupo metilo, grupo etilo, grupo propilo, grupo isopropilo, grupo butilo, grupo isobutilo, grupo terc-butilo, grupo pentilo, grupo neopentilo, grupo hexilo, grupo ciclohexilo, grupo octilo, grupo nonilo, grupo decilo.

En algunos casos, el sustituyente funcional se selecciona entre: tiofeno, coenzimas tales como, sin limitarse a, NAD, NADH, FAD, FADH, ácido pantoténico, ácido fólico, cianocobalamina, derivados de quinona, ciclotiazida, memantina, buprenorfina, complejos metálicos, por ejemplo, un ligando coordinado con un ion metálico, que incluye, por ejemplo, complejo de Ru-bipiridilo, complejo de ferroceno, complejo de níquel imidazol, tintes fluorescentes, por ejemplo, tintes de fluoresceína, tintes de rodamina, tintes de eosina, tintes de NBD, tintes de cianina, pigmentos de oxidaciónreducción, por ejemplo, pigmentos leuco tales como leucoanilina, leucoantocianina, etiquetas giratorias, por ejemplo, N-(ditiocarboxi)sarcosina de hierro, derivados de TEMPO (tetrametilpiperidina).

HS /

)j ^{— O}

S' ''— ^ N-(ditiocarbox¡)sarcos¡na

OH

TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-piperidin-1il)oxilo

En algunas realizaciones, el sustituyente funcional es un sustituyente químico mimético de aminoácidos. Por ejemplo, puede comprender un aminoácido o una cadena lateral de aminoácidos. El aminoácido o la cadena lateral de aminoácidos puede ser, o de, un aminoácido natural o un aminoácido no natural. En algunos casos, el aminoácido es un aminoácido proteinogénico. Se apreciará que cuando Func es H, el sustituyente funcional imita la glicina. Opcionalmente, en algunos casos, Func no es H.

Los sustituyentes opcionales pueden ser como se describen en este documento. Se apreciará que, cuando el sustituyente funcional es un mimético de aminoácidos, los sustituyentes opcionales se seleccionan adecuadamente de sustituyentes que se encuentran comúnmente en los aminoácidos naturales y no naturales utilizados en secuencias proteínicas biológicamente activas.

Por ejemplo, los sustituyentes opcionales pueden incluir -OH, -OMe, -SH, -SMe, -NH2, -COOH, -CONH2, -NHCNNH2 e imidazol.

En algunas realizaciones, B-L-Func se selecciona entre:

Por ejemplo, (1) = B-L-CH³y (13) = B-L-CH²Phe

En algunos casos, L es un enlace. Preferiblemente, L es un enlazador. El enlazador puede seleccionarse entre Lⁱy LⁱL².

L¹puede ser alquileno C^1-4, alquenileno C^2-4, alquinileno C^2-4, alquil C^{1 -4}fenilo alquileno C^1-4opcionalmente sustituidos. Los sustituyentes opcionales preferidos para L¹incluyen =O.

Preferiblemente, L¹es metileno o etileno (que opcionalmente está sustituido con =O de manera que L¹es, por ejemplo, -C=O-), etenileno (-C=C-), etinileno (-C=C-) o propargileno (-CH²-C=C-), o CH²fenilCH²(que opcionalmente está sustituido con =O de manera que L¹es, por ejemplo, -C=O-fenil-CH²).

L²puede ser -NH-.

L²puede ser -NH-CO-.

L²puede ser -NCH---CO²R^E, en el que --- representa el punto de unión a Func y R^Eindica H o un sustituyente éster tal como alquilo C^1-4. Por ejemplo, R^Epuede seleccionarse entre H, grupos alquilo C^1-10opcionalmente sustituidos, alquenilo C^2-10, alquinilo C^2-10y cicloalquilo C^3-10, grupos arilo C^6-10opcionalmente sustituido, heteroarilo C^5-10y heterocíclico C^{3 -10}. Preferiblemente, R^Ees H o alquilo C^1-4, por ejemplo, H o Me. En otras palabras, el enlazador puede comprender una estructura de aminoácidos, en la que Func corresponde a la cadena lateral de aminoácidos. Por ejemplo, L¹L²puede ser o puede comprender -CONCH --- CO²R^E.

En algunos casos, L se selecciona entre:

en las que B = base y Func = elemento funcional, RE es H, grupos alquilo C^1-10opcionalmente sustituidos, alquenilo C^2-10, alquinilo C^2-10y cicloalquilo C^3-10, grupos arilo C^6-10opcionalmente sustituido, heteroarilo C^5-10y heterocíclico C³-10.

En algunas realizaciones, L es preferiblemente uno de (24), (29), (30), (32), (33), (34), (35), (36) o una estructura de aminoácidos como se describió anteriormente, por ejemplo, -CONCH---CO²RE o -NCH---CO²RE.

Cadena lateral de aminoácidos

En algunas realizaciones preferidas, el sustituyente funcional Func es R, en el que R es una cadena lateral de aminoácidos. El enlazador puede ser opcionalmente uno de (24), (29), (30), (32), (33), (34), (35), (36) o una estructura de aminoácidos como se describió anteriormente, por ejemplo, c On CH---c O²Re o -n Ch---CO²Re.

De forma adecuada, R es hidrógeno o una cadena lateral de aminoácidos natural o no natural. Por ejemplo, las cadenas laterales de aminoácidos naturales incluyen las cadenas laterales de los 23 aminoácidos proteinogénicos: Alanina (Ala), Arginina (Arg), Asparagina (Asn), Ácido aspártico (Asp), Cisteína (Cys), Ácido glutámico (Glu), Glutamina (Gln), Glicina (Gly) (en otras palabras, R es H), Histidina (His), Isoleucina (Ile), Leucina (Leu), Lisina (Lys), Metionina (Met), Fenilalanina (Phe), Prolina (Pro), Serina (Ser), Treonina (Thr), Triptófano (Trp), Tirosina (Tyr), Valina (Val), Selenocisteína (Sec) y Pirrolisina (Pyl).

Por ejemplo, la fracción puede ser:

Se prefieren especialmente histidina, serina, leucina, ácido glutámico, lisina, fenilalanina, tirosina y triptófano. La cadena lateral de aminoácidos opcionalmente no es hidrógeno (glicina).

Se conocen en la técnica cadenas laterales de aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales también pueden denominarse aminoácidos no proteinogénicos e incluyen: Cit (citrulina), L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina), homoarginina, homocisteína, homoleucina, homofenilalanina, homoserina, Nle (norleucina), Nva (norvalina), Orn (ornitina) y fenilglicina.

En algunas realizaciones, una secuencia funcional puede tener al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más (por ejemplo, uno de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15), nucleótidos adyacentes que tienen cada uno un sustituyente funcional que es una cadena lateral de aminoácidos (R). Cada cadena lateral de aminoácidos puede seleccionarse independientemente de una cadena lateral de aminoácidos naturales o no naturales, como se describió anteriormente.

En algunas realizaciones, la cadena lateral de aminoácidos de nucleótidos adyacentes, opcionalmente nucleótidos de pirimidina adyacentes o nucleótidos de purina adyacentes, en la secuencia funcional no es la misma. En algunas realizaciones, la cadena lateral de aminoácidos de nucleótidos adyacentes, opcionalmente nucleótidos de pirimidina adyacentes o nucleótidos de purina adyacentes, dentro de una secuencia contigua de 3, 4 o 5 nucleótidos (opcionalmente una secuencia contigua de 3, 4 o 5 nucleótidos de pirimidina o purina respectivamente) de la secuencia funcional no es la misma.

En algunas realizaciones, la secuencia funcional comprende cadenas laterales de aminoácidos de al menos tres de entre histidina, serina, leucina, ácido glutámico, lisina, fenilalanina, tirosina y triptófano.

En algunas realizaciones, la secuencia funcional comprende dos o más nucleótidos adyacentes que tienen cadenas laterales de aminoácidos que son diferentes. En algunas realizaciones, la secuencia funcional comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más nucleótidos adyacentes que tienen cadenas laterales de aminoácidos que son diferentes.

En algunas realizaciones, la secuencia funcional comprende dos o más nucleótidos adyacentes que tienen cadenas laterales de aminoácidos que son diferentes y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: histidina, serina, leucina, ácido glutámico, lisina, fenilalanina, tirosina y triptófano.

En algunas realizaciones, la secuencia funcional comprende tres o más nucleótidos adyacentes que tienen cadenas laterales de aminoácidos que son diferentes y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: histidina, serina, leucina, ácido glutámico, lisina, fenilalanina, tirosina y triptófano.

En algunas realizaciones, la secuencia funcional comprende cuatro o más nucleótidos adyacentes que tienen cadenas laterales de aminoácidos que son diferentes y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: histidina, serina, leucina, ácido glutámico, lisina, fenilalanina, tirosina y triptófano.

En algunas realizaciones, la secuencia funcional comprende cinco o más nucleótidos adyacentes que tienen cadenas laterales de aminoácidos que son diferentes y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: histidina, serina, leucina, ácido glutámico, lisina, fenilalanina, tirosina y triptófano.

Sustituyentes opcionales

Como se usa en el presente documento, el término "opcionalmente sustituido” se refiere a un sustituyente que puede estar sustituido con uno o más (hasta el número máximo de valencias libres en ese sustituyente) sustituyentes. Los sustituyentes se pueden seleccionar entre:

-Alquilo C^1-4,

-F, -CI, -Br, -I

-CF³, -OCF³, -SCF³,

-OH, -X-OH, -O-X-OH, -NH-X-OH, -NR^S-X-OH,

-O-alquilo C^1-4, -X-O-alquilo C^1-4, -O-X-O-alquilo C^1-4, -NH-X-O-alquilo C^1-4, -NR^S-X-O-alquilo C^1-4,

-SH, -S-alquilo C^1-4,

-CN,

-NH², -NH-alquilo C^1-4, -N(alquilo C^{i- 4})²,

-X-NH², -X-NH-alquilo C^1-4, -X-N(alquilo C ^i-4)²,

-OC(O)alquilo C^1-4,

-C(O)OH, -C(O)O-alquilo C^1-4,

-C(O)alquilo C^1-4,

-C(O)NH², -C(O)NH-alquilo C^1-4, -C(O)N(alquilo C^1-4)²,

-NHC(O)alquilo C^1-4, -N(alquilo C^1-4)C(O)alquilo C^1-4;

-NHCONH², -NH(CNH)NH²y

=O;

en los que cada -X- es un enlace o un alquileno C^1-4y R^Ses -alquilo C^1-10, -alquenilo C^2-10, -alquinilo C^2-10, -arilo C^6-10o -heteroarilo C^5-10.

En algunas realizaciones, estos sustituyentes opcionales se seleccionan entre -alquilo C^1-4, -F, -CI, -CF³, -OH, O alquilo C^1-4, -NH², -NH(alquilo C^1-4) y -N(alquilo ^ ^{- 4})².

Unión del sustituyente funcional

La unión del sustituyente puede ser en la posición 5 de la pirimidina (por ejemplo, C, T, U) o en la posición 7 u 8 de la purina (por ejemplo, A, G), o puede ser por sustitución de una amina fuera de un anillo, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-halo pirimidina, sustitución de 5-bromo uracilo, sustitución de 5-yodo uracilo. Puede ser preferible la unión en la posición 5 de la pirimidina. Las técnicas para introducir un sustituyente en estas posiciones son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, véase Bioconjugate Techniques por Greg T. Hermanson Academic Press, julio de 2013, página 158; Spiridoula Matsika., Top Curr Chem (2015) 355: 209-244. Las técnicas para la unión en la posición 7 u 8 de la purina también son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, véase los documentos US 8759502 B2 y US 8299225 B2. Otras sustituciones se describen en el documento US 7759473 B2. Las secuencias funcionales de acuerdo con la presente divulgación pueden acomodar una amplia gama de fracciones de sustituyentes en una amplia gama de posiciones de unión porque no se requiere compatibilidad con polimerasa en la secuencia funcional.

En algunas realizaciones, al menos dos, o al menos tres o cuatro, nucleótidos adyacentes en un elemento de secuencia contigua de la secuencia funcional se modifican mediante la incorporación de tal sustituyente. En algunas realizaciones, una de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 nucleótidos adyacentes en un elemento de secuencia contigua de la secuencia funcional se modifican mediante la incorporación de tal sustituyente. En algunas realizaciones, cada nucleótido de la secuencia funcional se modifica mediante la incorporación de dicho sustituyente. En algunas realizaciones, cada nucleótido de la secuencia funcional se modifica mediante la incorporación de dicho sustituyente, excepto para uno de 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos.

Por ejemplo, en algunos casos, el elemento funcional comprende al menos dos nucleótidos modificados adyacentes, de manera que el elemento funcional comprende un dinucleótido de la siguiente fórmula:

en la que X representa el enlace, por ejemplo, enlace fosfodiéster o diéster de fosforotioato, entre nucleótidos. El residuo de azúcar ilustrado puede modificarse o reemplazarse con residuos de azúcar alternativos, estructuras cíclicas o acíclicas como se describe en este documento.

En algunos casos, el elemento funcional comprende tres nucleótidos adyacentes, de manera que el elemento funcional comprende un trinucleótido de la siguiente fórmula:

Cada grupo etiquetado como 1, 2, 3 se selecciona independientemente de las opciones y opciones preferidas para X, B, L y Func.

En algunas realizaciones, dos, tres o más o cada nucleótido de pirimidina se modifica mediante la incorporación de dicho sustituyente. En algunas realizaciones, dos, tres o más o cada nucleótido de purina se modifica mediante la incorporación de dicho sustituyente.

En algunas realizaciones, dos, tres o más o cada nucleótido de pirimidina se modifica mediante la incorporación de dicho sustituyente, y los nucleótidos de purina no se modifican mediante la incorporación de dicho sustituyente.

En algunas realizaciones, dos, tres o más o cada nucleótido de purina se modifica mediante la incorporación de dicho sustituyente, y los nucleótidos de pirimidina no se modifican mediante la incorporación de dicho sustituyente.

En otras realizaciones, uno o más nucleótidos (pirimidina o purina) en la secuencia funcional no se modifican mediante la incorporación de tal sustituyente.

En algunas realizaciones, los nucleótidos de pirimidina se modifican mediante la incorporación del sustituyente, no los nucleótidos de purina. Esto puede implicar la modificación de todas las pirimidinas o pirimidinas seleccionadas. En algunas realizaciones, los nucleótidos de purina se modifican mediante la incorporación del sustituyente, no los nucleótidos de pirimidina. Esto puede implicar la modificación de todas las purinas o purinas seleccionadas. En algunas realizaciones, los nucleótidos tanto de pirimidina como de purina se modifican mediante la incorporación del sustituyente. Esto puede implicar la modificación de todas las pirimidinas y purinas o pirimidinas y purinas seleccionadas.

Por lo tanto, se pueden preparar secuencias funcionales que tengan cada una, una estructura de secuencia diferente, siendo la estructura de secuencia una combinación de secuencia de bases y sustituyente funcional específico asociado con cada base.

Solamente a modo de ejemplo, una secuencia funcional puede tener la siguiente secuencia:

(1) A^AlaG^GluC^PheU^ThrG^TrpC^AspC^SerA^ValU^LysU^HisG^GluC^GlyU^Tyr[SEQ ID NO: 1] o

(2) A^AlaG^GluCUGC^AspC^serA^ValU^LysU^HisG^GluC^GlyU^Tyr[SEQ ID N° : 2]

En cada uno de (1) y (2) R es la cadena lateral respectiva de un aminoácido indicado por el código de tres letras en el subíndice. En (1) 13 nucleótidos adyacentes están modificados con una cadena lateral de aminoácidos. En (2) hay un triplete CUG sin modificar en las posiciones 3-5.

El grado de diversidad funcional de sustituyentes es variable según se desee y puede ser un producto de cómo se diseñan, seleccionan y sintetizan la tabla de codificación y, por lo tanto, los nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, cada nucleótido de una secuencia funcional puede contener un sustituyente funcional diferente mientras que en otras realizaciones el mismo nucleótido modificado puede aparecer más de una vez en una secuencia funcional, o diferentes nucleótidos dentro de una secuencia funcional pueden modificarse con el mismo sustituyente funcional.

Proporcionando secuencias funcionales en las que cada uno de los nucleótidos adyacentes porta un sustituyente funcional, la secuencia funcional puede presentar una alta densidad de sustituyentes funcionales (tales como cadenas laterales de aminoácidos) disponibles para la interacción con una molécula objetivo.

Los nucleótidos de la secuencia funcional pueden contener otras modificaciones químicas que no alteran el sustituyente funcional, cuando está presente, ni introducen tal sustituyente. Estos pueden incluir sustitución química en una posición de azúcar, una posición de fosfato y/o una posición de base del ácido nucleico que incluye, por ejemplo, la incorporación de un nucleótido modificado, la conjugación con un compuesto no inmunogénico de alto peso molecular (por ejemplo, polietilenglicol (PEG)), conjugación con un compuesto lipofílico, incorporación de una fracción de protección (por ejemplo, protección de 3', protección de 5', protección 3'-3' dT invertido), sustituciones o modificaciones en la cadena principal de fosfato, por ejemplo monotioato, ditioato, metilfosfonato, alquilfosfonato. Las modificaciones de bases pueden incluir modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo-uracilo o 5-yodo-uracilo, modificaciones de la cadena principal. Las modificaciones del azúcar pueden incluir (desoxi)ribosa, nucleótidos 2'-amina (²-NH²), nucleótidos 2'-fluoro (2'-F) y nucleótidos 2'-O-metilo (2'-OlVle).

Elemento de codificación

Un elemento de codificación puede comprender, o consistir en, una secuencia de codificación. Opcionalmente, el elemento de codificación puede comprender además una, dos o más secuencias de oligonucleótidos fijas, como se describe a continuación. Un elemento de codificación es preferiblemente una molécula de oligonucleótido, aunque puede comprender componentes no nucleotídicos, por ejemplo, moléculas espaciadoras o enlazadoras.

La secuencia de codificación puede ser una secuencia contigua de nucleótidos que no contiene las modificaciones presentes en la secuencia funcional; preferiblemente, estos son nucleótidos que comprenden nucleósidos naturales sin modificar (por ejemplo, para ARN: adenosina, guanosina, 5-metiluridina, uridina, citidina, y para ADN: desoxiadenosina, desoxiguanosina, timidina, desoxiuridina, desoxicitidina) o que contienen modificaciones que permiten el uso de técnicas de amplificación basadas en polimerasa. Las modificaciones ausentes de la secuencia de codificación son preferiblemente sustituyentes funcionales presentes en nucleótidos modificados de la secuencia funcional. Pueden ser modificaciones de la base, por ejemplo, inclusión de sustituyentes funcionales como se describe con respecto a la fórmula B-L-Func.

Preferiblemente, la secuencia de codificación no contiene las modificaciones presentes en la secuencia funcional en el sentido de que, y opcionalmente en la medida en que, las modificaciones ausentes de la secuencia de codificación son aquellas que interferirían con la amplificación enzimática.

La secuencia de bases de la secuencia de codificación codifica la estructura de la secuencia, es decir, codifica la secuencia de bases y las modificaciones específicas presentes en cada nucleótido/nucleósido correspondiente respectivo de la secuencia funcional.

La secuencia de codificación es amplificable mediante técnicas de rutina tales como PCR, preferiblemente sin necesidad de identificar y usar transcriptasa inversa o enzimas polimerasa capaces de reconocer o incorporar nucleótidos modificados o no naturales, y sin necesidad de eliminar modificaciones de nucleótidos o de otra manera, tratar o modificar químicamente la secuencia de codificación antes de la amplificación.

El elemento de codificación puede tener una o dos secuencias de oligonucleótidos adyacentes, por ejemplo, una en el extremo 5' y otra en el extremo 3' de la secuencia de codificación, flanqueando así la secuencia de codificación. Estas secuencias, cada una de las cuales se denomina en el presente documento "secuencia de codificación fija", tienen preferiblemente una secuencia predeterminada (preferiblemente no aleatoria) que permite el diseño y la hibridación de cebadores adecuados para la amplificación de la secuencia de codificación, por ejemplo, durante la PCR. La secuencia de codificación y la secuencia de codificación fija preferiblemente forman un único oligonucleótido contiguo, denominado en este documento elemento de codificación. Como tal, el elemento de codificación puede comprender, o consistir en, una secuencia de codificación y una o más, preferiblemente dos, secuencias fijas. Por lo tanto, la secuencia de codificación puede estar flanqueada por dos secuencias fijas, cada una de las cuales forma una molécula de oligonucleótido contigua con la secuencia de codificación. Las secuencias de codificación fijas pueden tener cualquier longitud conveniente, normalmente 10 o más, o 15 o más, nucleótidos, por ejemplo, entre 10 y 40 nucleótidos, entre 15 y 40 nucleótidos o entre 20 y 30 nucleótidos.

La secuencia de codificación es un oligómero de nucleótidos de n mers, preferiblemente una pluralidad de n mers diferentes o una secuencia aleatoria desde el principio de n mers, en la que n es un número entero de 1 o más, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 o más. Por ejemplo, un 2 mer es un dinucleótido, por ejemplo, AG, y un 3 mer es un trinucleótido, por ejemplo, AGC. Cada n mer corresponde a un solo nucleótido en la secuencia funcional, es decir, existe una correspondencia n: 1 entre el número de nucleótidos o bases en la secuencia de codificación y la secuencia funcional. Por lo tanto, la secuencia (es decir, la secuencia de bases primaria o de orden lineal) de bases en la secuencia de codificación puede leerse y traducirse utilizando una tabla de codificación para determinar la secuencia (es decir, el orden lineal) de nucleótidos, incluidas las modificaciones incorporadas en esos nucleótidos, presentes en la secuencia funcional.

Como tal, la secuencia de codificación tiene n veces el número de nucleótidos que la secuencia funcional y la longitud de la secuencia de codificación será normalmente n veces la de la secuencia funcional. Por ejemplo, la secuencia de codificación puede tener el mismo número de nucleótidos o bases que la secuencia funcional (n = 1), o puede tener el doble (n = 2), tres veces más (n = 3), cuatro veces más (n = 4) o cinco veces (n = 5), etc.

En realizaciones preferidas, el valor de n es al menos 2, por ejemplo, uno de 2, 3, 4 o 5.

En algunas realizaciones, el elemento de codificación comprende adicionalmente una secuencia de oligonucleótidos (preferiblemente una secuencia de nucleótidos no modificados) única para el elemento de codificación. Ésta puede ser una "secuencia de ID de la tabla de codificación" y puede colocarse entre una de las secuencias de codificación fija y la secuencia de codificación. La secuencia de ID de la tabla de codificación puede usarse para asignar una tabla de codificación usada en la síntesis de un constructo de oligonucleótido dado. Cuando se usan bibliotecas de constructos de oligonucleótidos, o se mezclan para su uso, la secuencia de ID de la tabla de codificación permite que se asigne la tabla de codificación correcta a los constructos de oligonucleótidos dentro de las bibliotecas o se seleccionen entre ellas, lo que permite decodificar la secuencia de la secuencia funcional. La longitud de la secuencia de ID de la tabla de codificación puede ser una cualquiera o 1, 2, 3, 4, 5 o más nucleótidos, preferiblemente de 1 a 3 o 1 o 2 nucleótidos.

Nucleósido, nucleótido

El término "nucleótido" se refiere a un compuesto que contiene un nucleósido o un nucleósido modificado y al menos un grupo fosfato o un grupo fosfato modificado unido a él por un enlace covalente. Los ejemplos de enlaces covalentes incluyen, sin limitación, un enlace éster entre el grupo hidroxilo 3', 2' o 5' de un nucleósido y un grupo fosfato.

El término "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que contiene dos o más nucleótidos unidos en una cadena polimérica. Los oligonucleótidos pueden ser ácidos desoxirribonucleicos o ácidos ribonucleicos. Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

Los nucleótidos y oligonucleótidos modificados de la presente divulgación pueden incluir modificaciones químicas como se describe en el presente documento, tales como una sustitución química en una posición de azúcar, una posición de fosfato y/o una posición de una base del ácido nucleico que incluye, por ejemplo, la incorporación de un nucleótido modificado, incorporación de una fracción de protección (por ejemplo, protección de 3'), conjugación con un compuesto no inmunogénico de alto peso molecular (por ejemplo, polietilenglicol (PEG)), conjugación con un compuesto de bajo peso molecular (por ejemplo, colesterol), conjugación con un péptido (por ejemplo, un péptido que penetra en las células), sustituciones en el grupo fosfato (por ejemplo, fosforotioato). Las modificaciones de bases pueden incluir modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo-uracilo o 5-yodo-uracilo, modificaciones de la cadena principal. Las modificaciones del azúcar pueden incluir nucleótidos 2'-amino (²-NH²), nucleótidos 2'-fluoro (2'-F), nucleótidos 2'-O-metilo (2'-OMe), nucleótidos 2'-O-alilo, nucleótidos 2'-O-p-metoxietilo, nucleótidos "bloqueados" (por ejemplo, LNA) o nucleótidos de triciclo-ADN. Los enlaces entre el átomo de fósforo central de un fosfato y el nucleósido, o cada uno de ellos, se realizan adecuadamente a través del oxígeno, es decir, el extremo 3' y/o 5' del nucleósido es un alcohol. Sin embargo, también se prevén análogos de nucleósidos en los que el extremo 3' y/o 5' del nucleósido no es un alcohol, sino más bien un análogo adecuado. Por ejemplo, el extremo 3' y/o 5' de un nucleósido puede ser un tiol, un selenol o una amina.

El término "nucleósido" se refiere a un compuesto que contiene una parte de azúcar y una nucleobase, por ejemplo, base de pirimidina o purina. Los ejemplos de azúcares incluyen, sin limitación, ribosa, 2-desoxirribosa, arabinosa y similares. Los ejemplos de nucleobases incluyen, sin limitación, timina, uracilo, citosina, adenina, guanina, purina, hipoxantina, xantina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina, 4-fluorouracilo, 5-clorouracilo, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo, 5-trifluorometiluracilo, 5-fluorocitosina, 5-clorocitosina, 5-bromocitosina, 5-yodocitosina, 5-propiniluracilo, 5-propinilcitosina, 7-deazaadenina, 7-deazaguanina, 7-deaza-8-azaadenina 7-deaza-8-azaguanina, isocitosina, isoguanina y similares.

El término "análogos de nucleósidos" como se usa en este documento se refiere a un nucleósido modificado en el que la parte de azúcar se reemplaza con cualquier otra estructura cíclica o acíclica. Los ejemplos de análogos de nucleósidos en los que la parte de azúcar se reemplaza con otra estructura cíclica incluyen, sin limitación, unidades monoméricas de morfolinos (PMO) y triciclo-ADN. Ejemplos de análogos de nucleósidos en los que la parte de azúcar se reemplaza con una estructura acíclica incluyen, sin limitación, unidades monoméricas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y ácidos nucleicos de glicerol (GNA). Se pueden sintetizar oligonucleótidos que tienen un elemento funcional o una secuencia funcional compuesta por ácidos nucleicos peptídicos en los que los nucleósidos están unidos por un enlace peptídico en lugar del enlace fosfodiéster convencional. El azúcar del nucleósido puede reemplazarse con unidades de N-(2-aminoetil)-glicina, que opcionalmente pueden estar unidas cada una a una base de pirimidina o purina mediante un puente de metileno y un grupo carbonilo (por ejemplo, véase Shakeel et al., Peptide Nucleic Acid (PNA), una revisión. Journal of Chemical Technology and Biotechnology (junio de 2006)).

El término "análogo de nudeósido" se refiere además a un nucleósido cualquiera de cuyas parte se reemplaza por un grupo químico de cualquier naturaleza. Ejemplos de análogos de nucleósidos incluyen, sin limitación, nucleósidos sustituidos en 2' tales como 2'-fluoro, 2-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-O-p-metoxietilo, 2'-O-alilribonucleósidos, 2'-amino, monómeros de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) y similares.

De forma adecuada, los análogos de nucleósidos pueden incluir análogos de nucleósidos en los que la parte de azúcar se reemplaza por un anillo de morfolina como se muestra a continuación.

En estructuras de este tipo, se apreciará que las etiquetas 3' y 5', aplicadas a la química convencional del azúcar, se aplican por analogía. Es decir, en la estructura representada, el sustituyente hidroxilmetilo del anillo se considera el extremo 5', mientras que la tercera valencia de nitrógeno se considera el extremo 3'.

El término "análogo de oligonucleótido", como se usa en este documento, se refiere a un oligonucleótido modificado, que se modifica químicamente en sus grupos fosfato o tiene sus nucleósidos reemplazados por análogos de nucleósidos. Los ejemplos de análogos de oligonucleótidos incluyen, sin limitación, oligonucleótidos de fosforotioato (PS), oligonucleótidos de fosforodiamidato morfolino (morfolinos, PMO), triciclo-ADN.

El término "grupo fosfato" como se usa en este documento se refiere al ácido fosfórico H³PO⁴en el que cualquier átomo de hidrógeno se reemplaza por uno, dos o tres radicales orgánicos para producir un fosfoéster, fosfodiéster o fosfotriéster, respectivamente. Los oligonucleótidos pueden estar unidos por enlaces fosfodiéster, fosforotioato o fosforoditioato.

Tabla de codificación

La preparación de un constructo de oligonucleótido dado se realiza de acuerdo con una tabla de codificación que describe la relación entre cada nucleótido añadido a la secuencia funcional y el n mer añadido a la secuencia de codificación en una posición correspondiente.

La tabla de codificación se puede proporcionar en forma de tabla, base de datos, hoja de datos, gráfico o similar. Puede proporcionarse en forma física, por ejemplo, en papel o en formato electrónica, por ejemplo, almacenados en un medio legible por ordenador, en un correo electrónico o accesible a través de Internet.

En principio, una tabla de codificación puede describir 4n n mers diferentes e indicará la estructura de secuencia (al menos la base y su sustituyente funcional) del nucleótido o nucleósido codificado por el n mer. En las Figuras 11A y 12A se muestran ejemplos de una tabla de codificación para constructos de acuerdo con la presente invención para n = 2 y n = 3 respectivamente.

En la Figura 11A, las bases de 4 tipos están dispuestas transversalmente (dirección 5') en el orden A, C, G y T y las bases de 4 tipos están dispuestas longitudinalmente (dirección 3') en el orden A, C, G y T proporcionando así 16 combinaciones (para n = 2) representadas por los cuadros mostrados. Se lee una base desde el lado 5’ y luego desde el lado 3' para formar el dinucleótido de secuencia de codificación. Por ejemplo, en la Figura 11A, el dinucleótido CA en la secuencia de codificación corresponde a Cphe (citosina modificada por inclusión de una cadena lateral de aminoácidos de fenilalanina) en la secuencia funcional.

Las tablas de codificación ilustradas en las Figuras 11A y 12A son puramente a modo de ejemplo, en principio, cualquier nucleótido modificado deseado puede ser codificado por un n mer seleccionado.

Mientras que los nucleótidos de la secuencia funcional contienen preferiblemente nucleótidos modificados para incorporar un sustituyente funcional, nucleótidos fuera de la secuencia funcional, por ejemplo, en la secuencia o secuencias funcionales fijas del elemento funcional y en las secuencias de nucleótidos de la secuencia de codificación, preferiblemente no se modifican para incorporar tal sustituyente funcional. Estas secuencias pueden contener nucleótidos no modificados, es decir, nucleótidos de origen natural o pueden contener otras modificaciones químicas, preferiblemente modificaciones que no impidan el uso de técnicas de amplificación de polimerasa. Tales modificaciones pueden incluir la sustitución química en una posición de azúcar, una posición de fosfato y/o una posición de base del ácido nucleico que incluye, por ejemplo, la incorporación de un nucleótido modificado, la incorporación de una fracción de protección (por ejemplo, protección de 3', protección de 5', protección 3'-3' dT invertido), sustituciones o modificaciones en la cadena principal de fosfato, por ejemplo, monotioato, ditioato, metilfosfonato, alquilfosfonato. Las modificaciones de base pueden incluir modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo-uracilo o 5-yodo-uracilo, modificaciones de la cadena principal. Las modificaciones del azúcar pueden incluir (desoxi)ribosa, nucleótidos 2'-amina (²-NH²), nucleótidos 2'-fluoro (2'-F) y nucleótidos 2'-O-metilo (2'-OMe).

Constructo de oligonucleótidos que comprende una matriz de soporte

En algunas realizaciones, cada uno de los elementos funcionales y de codificación están unidos a una matriz de soporte, respectivamente. En algunas realizaciones, la matriz de soporte puede tener unida un solo elemento de codificación y un solo elemento funcional. La secuencia de codificación del elemento de codificación proporciona una etiqueta para cada matriz de soporte, lo que permite determinar la estructura de secuencia de la secuencia o secuencias funcionales de los elementos funcionales unidos a la matriz de soporte de una manera 1 a 1.

En algunas realizaciones, el número de elementos de codificación unidos a la matriz de soporte es el mismo que el número de elementos funcionales unidos a la matriz de soporte. En algunas realizaciones, el número de elementos de codificación unidos es menor que el número de elementos funcionales unidos. Opcionalmente, solo se une un único elemento de codificación. En algunas realizaciones, la matriz de soporte puede comprender uno o una pluralidad de elementos funcionales y solo un elemento de codificación.

En algunas realizaciones, cada elemento funcional unido a una única matriz de soporte es idéntico o contiene la misma secuencia funcional, y preferiblemente cada elemento de codificación unido a una única matriz de soporte es idéntico o contiene la misma secuencia de codificación. La secuencia o secuencias de codificación unidas a la matriz de soporte codifica la secuencia o secuencias funcionales unidas a la misma matriz de soporte. Al proporcionar una pluralidad de matrices de soporte, cada una unida a un constructo de oligonucleótido diferente, se puede proporcionar una biblioteca de constructos de oligonucleótidos.

Una matriz de soporte puede comprender material que sea duro, rígido, maleable, sólido, poroso o no poroso. Puede comprender un material sólido o un material semisólido, gel, etc. Por ejemplo, el material del que está hecha la matriz de soporte puede comprender plástico, vidrio, metales biológicamente inertes tales como titanio, cerámica, silicona, gelatina, dextrano, celulosa, metacrilato hidroxilado, poliestireno o colágeno.

En algunas realizaciones, las matrices de soporte pueden ser partículas, microportadores o perlas a las que se puede unir un oligonucleótido. La partícula, el microportador o la perla pueden tener cualquier forma o configuración, pero preferiblemente pueden tener forma esférica o de varilla. En algunas realizaciones, una partícula puede comprender un microportador, como se describe en el Compendio de Terminología Química de la IUPAC (2a Edición, 1992, Vol.

64, página 160). Se conocen en la técnica partículas de diversas formas e incluyen, por ejemplo, perlas de varios tipos.

Las realizaciones de partículas incluyen microperlas, tales como perlas de agarosa, perlas de poliacrilamida, perlas de gel de sílice. Las partículas pueden comprender celulosa o un derivado, tal como DEAE-celulosa, perlas hidrófilas modificadas y microportadores a base de carbono. La partícula puede comprender una resina adecuada para su uso como matriz cromatográfica, tal como una resina de intercambio aniónico.

Las partículas, perlas o microportadores pueden comprender un microportador de celulosa (por ejemplo, DE-52 (Whatman), DE-53 (Whatman), QA-52 (Whatman)), un microportador hidrófilo, un microportador de matriz metacrílica hidroxilada o un microportador de perlas derivatizado hidrófilo, TSKgel Tresyl-5Pw (Tosoh), microportador macroporoso o microporoso Toyopearl AF-Tresyl-650 (Tosoh), SM1010 (Blue Membranes), SH1010 (Blue Membranes), microportador a base de dextrano, Cytodex 1 (GE Healthcare), Cytodex 3 (GE Healthcare), un microportador a base de poliestireno, por ejemplo, Hillex o Hillex II (SoloHill Engineering, Inc.).

Cytodex 1 se basa en una matriz de dextrano entrecruzada que está sustituida con grupos N,N-dietilaminoetilo cargados positivamente. Los grupos cargados se distribuyen por toda la matriz del microportador. Cytodex 3 consiste en una capa delgada de colágeno desnaturalizado acoplado químicamente a una matriz de dextrano entrecruzado. Hillex y Hillex II son microportadores de poliestireno modificado que tienen un recubrimiento catiónico de trimetilamonio.

Las perlas o microperlas adecuadas para su uso incluyen aquellas que se usan para cromatografía en gel, por ejemplo, medios de filtración en gel tales como Sephadex. Microperlas adecuadas de este tipo incluyen Sephadex G-10 que tiene un tamaño de perla de 40-120 pm (Sigma Aldrich catálogo número 27,103-9), Sephadex G-15 que tiene un tamaño de perla de 40-120 pm (Sigma Aldrich catálogo número 27,104-7), Sephadex G-25 con un tamaño de perlas de 20-50 pm (Sigma Aldrich catálogo número 27,106-3), Sephadex G-25 con un tamaño de perlas de 20-80 pm (Sigma Aldrich catálogo número 27,107-1), Sephadex G-25 con un tamaño de perla de 50-150 pm (Sigma Aldrich catálogo número 27,109-8), Sephadex G-25 con un tamaño de perla de 100-300 pm (Sigma Aldrich catálogo número 27,110 1), Sephadex G-50 con un tamaño de perla de 20-50 pm (Sigma Aldrich catálogo número 27,112-8), Sephadex G-50 con un tamaño de perla de 20-80 pm (Sigma Aldrich catálogo número 27,113-6), Sephadex G-50 con un tamaño de perla de 50-150 |jm (Sigma Aldrich catálogo número 27,114 -4), Sephadex G-50 con un tamaño de perlas de 100-300 |jm (Sigma Aldrich catálogo número 27,115-2), Sephadex G-75 con un tamaño de perlas de 20-50 jm (Sigma Aldrich catálogo número 27,11 6-0), Sephadex G-75 con un tamaño de perlas de 40-120 jm (Sigma Aldrich catálogo número 27,117-9), Sephadex G-100 con un tamaño de perlas de 20-50 jm (Sigma Aldrich catálogo número 27,118-7), Sephadex G-100 con un tamaño de perlas de 40-120 jm (Sigma Aldrich catálogo número 27,119-5), Sephadex G-150 con un tamaño de perlas de 40-120 jm (Sigma Aldrich catálogo número 27,121-7) y Sephadex G-200 con un tamaño de perla de 40-120 jm (Sigma Aldrich catálogo número 27,123-3).

También se pueden usar perlas de sefarosa, por ejemplo, como se usan en cromatografía líquida. Ejemplos son perlas de Q-Sefarosa, S-Sefarosa y SP-Sefarosa, disponibles por ejemplo a través de Amersham Biosciences Europe GmbH (Friburgo, Alemania) como Q Sefarosa XL (catálogo número 17-5072-01), Q Sefarosa XL (catálogo número 17- 5072 04), Q Sefarosa XL (catálogo número 17-5072-60), SP Sefarosa XL (catálogo número 17-5073-01), SP Sefarosa XL (catálogo número 17-5073-04) y SP Sefarosa XL (catálogo número I 17-5073-60).

En otras realizaciones, una matriz de soporte puede estar formada por un pozo o una dirección en una matriz.

Las matrices comprenden típicamente una pluralidad de ubicaciones o direcciones diferentes, conocidas y generalmente predeterminadas en las que se puede ubicar una molécula específica. Tales matrices, también descritas como "micromatrices", "chips" o "portaobjetos" se han descrito generalmente en la técnica, por ejemplo, en los documentos U.S. Serial No. 09/536.841, WO 00/58516, patentes de los Estados Unidos Nos 5.143.854, 5.445.934, 5.744.305, 5.677.195, 6.040.193, 5.424.186 y Fodor et al., Science, 251: 767-777 (1991).

Generalmente, las matrices se pueden producir usando métodos de síntesis mecánica o métodos de síntesis dirigida por luz que incorporan una combinación de métodos fotolitográficos y métodos de síntesis en fase sólida. Las técnicas para la síntesis de estas matrices usando métodos de síntesis mecánica se describen en, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.384.261, 6.121.048 y 6.040.193.

Aunque se puede preferir una superficie de matriz plana, la matriz se puede fabricar sobre una superficie de prácticamente cualquier forma o incluso una multiplicidad de superficies. Las matrices pueden ser oligonucleótidos en perlas, geles, superficies poliméricas, fibras, vidrio, plásticos, portaobjetos o cualquier otro sustrato apropiado, por ejemplo, véanse las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.770.358, 5.789.162, 5.708.153, 6.040.193 y 5.800.992.

Las ubicaciones o direcciones pueden formarse depositando o imprimiendo material en posiciones seleccionadas en la matriz. Las ubicaciones o matrices también se pueden formar mediante el diseño físico de la matriz, por ejemplo, en forma de pozos o micropozos.

Las matrices se pueden empaquetar de tal manera que permitan el diagnóstico o pueden ser un dispositivo que lo incluya todo; por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.856.174 y 5.922.591.

En algunas realizaciones, una matriz puede comprender un soporte, preferiblemente sólido, que tiene una pluralidad de direcciones. Cada dirección puede tener uno o una pluralidad de elementos funcionales unidos al soporte y uno o una pluralidad de elementos de codificación unidos al soporte (el elemento de codificación que codifica la estructura de secuencia de la secuencia funcional del elemento funcional) o puede tener unido una o una pluralidad de moléculas individuales que comprenden tanto el elemento funcional como el elemento de codificación. Cada dirección tiene preferiblemente un par diferente de elementos funcionales y codificadores unidos, o una molécula única diferente que comprende tanto el elemento funcional como el elemento de codificación, proporcionando así una biblioteca de diferentes secuencias funcionales a través de la pluralidad de direcciones. Como tal, una matriz puede tener 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, o más, constructos de oligonucleótidos diferentes unidos a ella en un número correspondiente de direcciones.

La unión de oligonucleótidos a una matriz de soporte puede ser directa o indirecta, covalente o no covalente. Por ejemplo, la unión puede ser mediante un enlazador escindible que no afecte al oligonucleótido o los grupos de protección usados durante la síntesis. Los ejemplos incluyen un enlazador de disulfuro (escindible por TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina)), un enlazador de sulfona (escindible por una base impedida tal como DBU (1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno)) o un enlazador fotoescindible (escindible mediante luz UV).

Biblioteca de constructos de oligonucleótidos

Puede prepararse una biblioteca de constructos de oligonucleótidos mediante un proceso de "síntesis dividida". La síntesis dividida es una técnica adecuada para la generación de bibliotecas de un oligonucleótido de una sola perla en la que cada perla presenta una o más copias de una única secuencia o especie de oligonucleótidos (vease Yang X, et al., Construction and selection of bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries designed for rapid PCR-based sequencing. Nucleic Acids Research 30 (2002) el23; Yang X, et al. Immunofluorescence assay and flow cytometry selection of bead-bound aptamers. Nucleic Acids Research 31(10) (2003) e54; Gorenstein D G, et al., Bead Bound Combinatorial Oligonucleoside Phosphorothioate and Phosphorodithioate Aptamer Libraries y la patente de Estados Unidos No. 7.338.762).

En una realización, se introducen copias de un único oligonucleótido en cada perla u otro soporte sólido capaz de soportar la síntesis de ADN (por ejemplo, hecho de vidrio de poros controlados (CPG) o un polímero) mediante un método de síntesis dividida de "mezcla y separación". Los oligonucleótidos se sintetizan mediante síntesis de fosforamidita convencional usando un sintetizador de ADN o ARN de manera escalonada en una fracción del enlazador, como se describió anteriormente, unido covalentemente a la matriz de soporte, por ejemplo, una perla de poliestireno y, opcionalmente, con un espaciador tal como hexaetilénglicol o poliT no escindible (por ejemplo, TTTT) unido a la primera fosforamidita. El uso de un enlazador permite que el oligonucleótido sintetizado permanezca unido covalentemente a la matriz de soporte después de la desprotección completa de la base y del éster de fosfato. Por lo tanto, la cadena de oligonucleótidos se extiende en una dirección de 3' a 5' lejos de la perla.

Por ejemplo, una "biblioteca de soporte" se puede preparar de la siguiente manera:

1. Preparar una resina de soporte sólida que tenga un residuo de hidróxido libre en su superficie.

2. Conjugar varias timidinas para liberar residuos de hidroxilo en el soporte sólido como espaciador, si es necesario.

3. Conjugar competitivamente timidina protegida con DMT y timidina protegida con Lev al soporte sólido o espaciador en el soporte sólido usando química de fosforamidita.

4. Iniciar la extensión de dos oligonucleótidos mediante la desprotección selectiva de los grupos DMT y Lev.

Se puede preparar una "biblioteca en solución" de la siguiente manera:

2. Conjugar la fracción de enlazador escindible al soporte sólido usando por ejemplo, química de fosforamidita. En algunas realizaciones, el espaciador no escindible, por ejemplo, se insertan cuatro repeticiones de timidina nativa entre el soporte sólido y la fracción de enlazador escindible para evitar el impedimento estérico del elemento funcional y la molécula objetivo.

3. Conjugar un compuesto químico que tenga tanto el grupo DMT como el grupo Lev para proporcionar una fracción ramificada (indicada en la Figura 3).

4. Iniciar la extensión de dos oligonucleótidos usando la desprotección selectiva de los grupos DMT y Lev.

En cualquier caso, la primer etapa puede implicar sintetizar la secuencia fija ubicada entre el soporte sólido y la secuencia funcional en el elemento funcional o secuencia de codificación en el elemento de codificación usando eliminación diferencial de DMT o Lev y extensión de oligonucleótidos de fosforamidita para constructos de oligonucleótidos relevantes. La secuencia de ID de la tabla de codificación puede formarse en el elemento de codificación en este momento.

La eliminación diferencial de DMT o Lev se logra usando diferentes reacciones de desbloqueo. Se consiguen ejemplos de tales reacciones de desbloqueo diferenciales, por ejemplo, pero sin limitarse a, ácido tricloroacético al 3% en diclorometano para desbloquear el grupo DMT y diamina 0,5 M en una mezcla de piridina/ácido acético (1:1) para desbloquear el grupo Lev. Para aplicar un esquema de eliminación diferencial a la síntesis de oligonucleótidos, también son importantes los grupos protectores de amina exocíclica adecuados seleccionados entre los grupos duraderos en dichas reacciones de desbloqueo diferencial. Los ejemplos de tal grupo de protección se indican a continuación, pero no se limitan a los mostrados.

Para formar las secuencias funcionales y de codificación, los soportes sólidos, que tienen secuencias fijas ya formadas, pueden dividirse en un volumen igual de 2^xpartes, en las que x es el número de n mers en la tabla de codificación. Cada lote dividido de soportes sólidos se trata por separado para extender la secuencia funcional en un nucleótido y extender la secuencia de codificación en n nucleótidos seleccionando el n mer apropiado de la tabla de codificación para que corresponda con el nucleótido agregado a la secuencia funcional. Los lotes divididos tratados para la extensión se mezclan luego y el proceso se repite hasta que se hayan completado todas las reacciones de extensión necesarias en la secuencia funcional y la secuencia de codificación, por ejemplo, véanse las Figuras 8 y 9.

Las secuencias fijas restantes se pueden sintetizar luego de acuerdo con el proceso descrito anteriormente para la primera etapa.

El proceso puede comenzar con la extensión de la secuencia funcional o de codificación y puede aplicar el mismo número de etapas de extensión a cada una de las secuencias funcionales y de codificación. La extensión escalonada se controla mediante el uso de diferentes grupos protectores para cada uno de los elementos funcionales y de codificación, respectivamente. Los grupos protectores adecuados incluyen levulinilo (ácido 4-oxopentanoico, Lev) o su éster y dimetoxitritilo (DMT).

Cuando se forma la secuencia de codificación, la adición del n mer puede implicar la adición de un dinucleótido, tri nucleótido, tetranucleótido o pentanucleótido preformado según sea apropiado, pero en realizaciones preferidas el n mer se puede agregar mediante la adición de n monómeros, cada uno seleccionado para formar el n mer deseado in situ en la secuencia de codificación. Esto puede requerir la realización de n reacciones de extensión de la secuencia de codificación para cada reacción de extensión de la secuencia funcional, reacciones que pueden controlarse adecuadamente mediante el control de las condiciones químicas de (des)protección.

La protección química se refiere a un compuesto o compuestos en los que uno o más grupos funcionales reactivos están protegidos de reacciones químicas indeseables en condiciones específicas (por ejemplo, reactivos, disolventes, pH, temperatura, radiación, disolvente y similares). En la práctica, se emplean métodos químicos bien conocidos para hacer que un grupo funcional no reaccione de forma reversible, que de otro modo sería reactivo, en condiciones específicas. En una forma químicamente protegida, uno o más grupos funcionales reactivos están en forma de grupo protegido o protector (también conocido como grupo enmascarado o de enmascaramiento o grupo bloqueado o bloqueante). Al proteger un grupo funcional reactivo, se pueden realizar reacciones que implican a otros grupos funcionales reactivos no protegidos, sin afectar al grupo protegido; el grupo protector puede eliminarse, normalmente en una etapa posterior, sin afectar sustancialmente al resto de la molécula. Véase, por ejemplo, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (P. Wuts; 5a Edición; John Wiley and Sons, 2014).

A menos que se especifique lo contrario, una referencia a un compuesto particular también incluye formas químicamente protegidas del mismo.

Una amplia variedad de tales métodos de "protección", "bloqueo" o "enmascaramiento" se utilizan ampliamente y son bien conocidos en la síntesis orgánica. Por ejemplo, un compuesto que tiene dos grupos funcionales reactivos no equivalentes, ambos de los cuales serían reactivos en condiciones especificadas, puede derivatizarse para hacer que uno de los grupos funcionales esté "protegido" y, por lo tanto, no reactivo, en las condiciones especificadas; así protegido, el compuesto se puede usar como un reactivo que tiene efectivamente sólo un grupo funcional reactivo. Una vez que se completa la reacción deseada (que implica el otro grupo funcional), el grupo protegido puede "desprotegerse" para devolverlo a su funcionalidad original.

Por ejemplo, un grupo hidroxi puede protegerse como un éter (-OR) o un éster (-OC(=O)R), por ejemplo, como: un tbutil éter; un bencilo, benzhidrilo (difenilmetilo) o tritil (trifenilmetil)éter; un trimetilsililo o t-butildimetilsilil éter; o un acetil éster (-OC(=O)CH^a, -OAc).

Por ejemplo, un grupo aldehído o cetona puede protegerse como un acetal (R-CH(OR)²) o cetal (R²C(OR)²), respectivamente, en el que el grupo carbonilo (>C=O) es convertido en un diéter (>C(OR)²), por reacción con, por ejemplo, un alcohol primario. El grupo aldehído o cetona se regenera fácilmente mediante hidrólisis utilizando un gran exceso de agua en presencia de ácido.

Por ejemplo, un grupo amina puede protegerse, por ejemplo, como una amida (-NRCO-R) o un uretano (-NRCO-OR), por ejemplo, como: una metil amida (-NHCO-CH³); una benciloxi amida (-NHCO-OCH²C⁶H⁵, -NH-Cbz); como t-butoxi amida (-NHCO-OC(CH³)³, -NH-Boc); una 2-bifenil-2-propoxi amida (-NHCO-OC(CH³)²C⁶H⁴C⁶H⁵, -NH-Bpoc), como una 9-fluorenilmetoxi amida (-NH-Fmoc), como una 6-nitroveratriloxi amida (-NH-Nvoc), como 2-trimetilsililetiloxi amida (-NH-Teoc), como una 2,2,2-tricloroetiloxi amida (-NH-Troc), como una aliloxi amida (-NH-Alloc), como 2(-fenilsulfonil)etiloxi amida (-NH-Psec); o, en casos adecuados (por ejemplo, aminas cíclicas), como un radical nitróxido (>N-O^).

Por ejemplo, un grupo ácido carboxílico puede protegerse como un éster, por ejemplo, como: un éster de alquilo C^1-7(por ejemplo, un éster metílico; un éster t-butílico); un éster haloalquilo C^1-7(por ejemplo, un éster tri-haloalquilo C^1-7); un éster de tri-alquilsilil C^1-7-alquilo C^1.7; o un éster de aril C^5-20-alquilo C^1-7(por ejemplo, un éster bencílico; un éster nitrobencílico); o como una amida, por ejemplo, como una metilamida.

Por ejemplo, un grupo tiol puede protegerse como un tioéter (-SR), por ejemplo, como: un bencil tioéter; un acetamidometil éter (-S-CH²NHC(=O)CH³).

La extensión de la secuencia funcional puede comenzar y opcionalmente terminar con la adición de nucleótidos que no contienen un sustituyente funcional, como se describe en el presente documento, en una secuencia definida, opcionalmente complementaria (por ejemplo, formando la secuencia funcional fija). Esto puede permitir que se utilicen como cebadores para la amplificación basada en polimerasa o para hibridar y formar una estructura de tallo-bucle que contribuya a la estabilidad conformacional de la secuencia funcional. Cuando se forma la secuencia funcional, uno o más, preferiblemente dos o más, nucleótidos modificados que incorporan un sustituyente funcional, como se describe en el presente documento, se incluyen en la secuencia funcional. La secuencia funcional resultante incluye preferiblemente al menos dos, o al menos tres, nucleótidos adyacentes, cada uno de los cuales incorpora un sustituyente funcional, como se describe en el presente documento.

Cuando se sintetiza la secuencia de codificación, para cada adición de 1 nucleótido a la secuencia funcional, la secuencia de codificación se extiende mediante la adición de un n mer, en el que n es al menos 1, preferiblemente al menos 2 (por ejemplo, uno de 2, 3, 4 o 5), para producir una secuencia de codificación que es n veces la longitud de la secuencia funcional. Cada n mer añadido a la secuencia de codificación se selecciona para codificar el nucleótido correspondiente en la secuencia funcional, por ejemplo, de acuerdo con una tabla de codificación. Como se describió anteriormente, la adición de un n mer puede lograrse no solo usando una fosforamidita de n mer sino también usando reacciones de fosforamidita de n-monómeros. Este enfoque es favorable porque proporciona la producción flexible de una biblioteca de constructos de oligonucleótidos que tiene una amplia gama de secuencias funcionales y secuencias de codificación correspondientes.

En alguna realización, se preparan por separado más de una biblioteca en soporte o biblioteca en solución, cada una basada en diferentes tablas de codificación, las bibliotecas se mezclan luego para formar una biblioteca mixta que tiene una mayor variedad de secuencias funcionales. Las secuencias de ID de la tabla de codificación insertadas en cada elemento de codificación se pueden usar para identificar y seleccionar la tabla de codificación correcta para traducir una secuencia de codificación dada en la estructura de secuencia de la secuencia funcional asociada.

Opcionalmente, una o más o cada una de la secuencia o secuencias funcionales fijas y secuencia o secuencias de codificación fijas se pueden agregar en bloque, mediante la adición de una secuencia respectiva previamente preparada y que no requiere la adición paso a paso para construir la secuencia el elemento de secuencia fija. Esto puede reflejar el hecho de que las secuencias fijas pueden ser las mismas entre constructos de oligonucleótidos, difiriendo los constructos en la secuencia de la secuencia funcional y la secuencia de codificación relacionada. Para realizar la adición de un oligonucleótido en bloque, los oligonucleótidos sintetizados de nuevo se desprotegen completamente y se hibridan con oligonucleótidos nativos sintetizados por separado complementarios con la secuencia fija relevante para formar extremos pegajosos o romos. Es preferible un oligonucleótido complementario de extremo adhesivo para permitir la ubicación adecuada de los oligonucleótidos añadidos. Luego se usa una ADN ligasa para hacer un enlace fosfodiéster entre los dos oligonucleótidos.

Cuando se sintetizan las secuencias funcionales y de codificación, la incorporación de nucleótidos que no contienen un sustituyente funcional puede incluir nucleótidos no modificados o nucleótidos modificados que permiten la amplificación basada en polimerasa, por ejemplo, por PCR.

Para generar una biblioteca combinatoria de constructos de oligonucleótidos se puede usar un proceso de "división y mezcla" (Figura 8) y, en particular, se puede aplicar durante la síntesis de la secuencia funcional y la secuencia de codificación. Una pluralidad de reacciones de síntesis, por ejemplo, 16, se realizan por separado para añadir un primer nucleótido a la secuencia funcional y el primer n mer a la secuencia de codificación para una pluralidad de constructos de oligonucleótidos diferentes, siendo el primer nucleótido y n mer diferentes entre cada constructo (Figura 8). Las matrices de soporte (que tienen constructos nacientes unidos) se mezclan luego (Figura 9A) y luego se dividen en una pluralidad de grupos (por ejemplo, 16) que son el tema de la siguiente etapa de síntesis, es decir, la adición del siguiente nucleótido a la secuencia funcional y el siguiente n mer a la secuencia de codificación. El ciclo de síntesis, mezcla y división se repite tantas veces como sea necesario para producir una secuencia funcional de la longitud requerida.

El proceso permite la generación de un gran número de constructos de oligonucleótidos diferentes del orden de ab en el que a es el número de grupos de reacciones de síntesis (por ejemplo, número de columnas en la Figura 9A) y b es el número de rondas de síntesis (o la longitud de la secuencia funcional). Cuando se utilizan 16 grupos, se puede crear una biblioteca de más de 1012 constructos de oligonucleótidos, una por matriz de soporte, cada una con una secuencia funcional diferente (de nucleótidos de longitud b) en sólo 10 ciclos.

En realizaciones preferidas, se puede preparar convenientemente una biblioteca de constructos de oligonucleótidos mediante síntesis de constructos de oligonucleótidos en partículas, microportadores o perlas, por ejemplo, perlas de poliestireno. La biblioteca puede usarse para la selección de secuencias funcionales efectivas contra una molécula objetivo. Debido a que cada partícula, microportador o perla de la biblioteca puede contener cientos o miles de copias de un único constructo de oligonucleótido (o secuencia funcional), puede capturar suficiente molécula objetivo para ser seleccionable en un solo ciclo. Tal captura se puede controlar mediante un equipo de clasificación de partículas, por ejemplo, controlando la intensidad de la fluorescencia de un tinte fluorescente conjugado con la molécula objetivo.

Dado que se pueden controlar cientos de miles de interacciones, la diferencia en la intensidad de fluorescencia entre partículas reflejará diferencias estadísticas de interacción entre la molécula objetivo y el constructo de oligonucleótido en cada partícula. Como tal, el enfoque descrito evita la necesidad de rondas iterativas de enriquecimiento en solución y amplificación de agentes de unión potenciales, tal como el requerido por SELEX, y así puede completarse mucho más rápido, a menudo en uno o dos ciclos.

Las constructos de oligonucleótidos de la presente divulgación también permiten la identificación de oligonucleótidos seleccionados como objetivo mediante técnicas de amplificación basadas en polimerasa, por ejemplo, PCR, porque la secuencia de codificación está diseñada para ser adecuada para tal amplificación y codifica la estructura de secuencia precisa de la secuencia funcional.

Por consiguiente, se proporciona un método para preparar un constructo de oligonucleótido, comprendiendo el constructo de oligonucleótido una secuencia funcional y una secuencia de codificación, comprendiendo el método:

(i) extensión de dicha secuencia funcional mediante la adición de un solo nucleótido modificado,

(ii) extensión de dicha secuencia de codificación mediante la adición de un nucleótido de n mer, el n mer seleccionado para codificar la estructura de dicho nucleótido modificado de la etapa (i), en el que n es un número entero de 1 o mayor y el n mer no contiene la (o a) modificación de dicho nucleótido modificado de la etapa (i),

en el que la etapa (i) o (ii) puede realizarse primero y las etapas (i) y (ii) se realizan secuencialmente.

Las etapas (i) y (ii) se pueden realizar una pluralidad de veces para generar una secuencia funcional de la longitud deseada, por ejemplo, una de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 nucleótidos, y una secuencia de codificación que tiene una lon veces la de la secuencia funcional, en la que n es preferiblemente una de 2, 3, 4 o 5.

Los constructos de oligonucleótidos pueden prepararse unidos a una pluralidad de soportes sólidos, por ejemplo, partículas, perlas o microportadores como se describe en el presente documento. Puede prepararse una biblioteca de diferentes constructos de oligonucleótidos unidos a soportes sólidos. La secuencia funcional puede formar parte de un elemento funcional oligonucleotídico y la secuencia de codificación puede formar parte de un elemento de codificación oligonucleotídico. El elemento funcional y el elemento de codificación se pueden unir por separado o a cada uno del soporte o soportes sólidos y se pueden extender a partir de fracciones enlazadoras de oligonucleótidos separados unidos al soporte o soportes sólidos. Alternativamente, el elemento funcional y el elemento de codificación pueden extenderse desde una fracción ramificada, en la que la fracción ramificada está unida al soporte sólido, por ejemplo, a través de una fracción enlazadora o espaciadora. La fracción ramificada puede ser adecuada para permitir la extensión de dos oligonucleótidos, es decir, los elementos funcionales y de codificación, para formar una estructura en V o en Y. Por lo tanto, el método puede comprender una extensión alternativa de cada ramificación.

La preparación de la biblioteca de soportes sólidos puede seguir una síntesis de división y mezcla y puede estar de acuerdo con una tabla de codificación que describe la relación entre cada nucleótido agregado a la secuencia funcional y el n mer agregado a la secuencia de codificación en una posición correspondiente. Cada realización de las etapas

(i) y (ii) [en cualquier orden] forma una ronda de extensión. Entre rondas de extensión, los soportes sólidos se mezclan y luego se dividen en 2x partes en las que x es el número de n mers en la tabla de codificación. A continuación, se utiliza al menos una, preferiblemente cada una de las 2x partes como base de una nueva ronda de extensión. Este proceso de división y mezcla puede repetirse hasta que se hayan completado todas las reacciones de extensión necesarias para formar las secuencias funcionales y de codificación. Pueden realizarse varias rondas de extensión, según se desee, para formar constructos de oligonucleótidos que tengan la longitud deseada de secuencias funcionales y de codificación.

Una vez que se completa la síntesis, los soportes sólidos se pueden recuperar y combinar para formar una biblioteca. La biblioteca puede someterse a cribado u otros ensayos, por ejemplo, como se describe en este documento.

Cribado funcional

Los constructos de oligonucleótidos se pueden cribar o ensayar para identificar o seleccionar uno o más constructos que tengan propiedades físicas, químicas o funcionales deseadas. Preferiblemente, tales métodos se realizan in vitro. En algunas realizaciones preferidas, pueden cribarse o ensayarse para identificar un constructo de oligonucleótido capaz de unirse a una molécula objetivo, preferiblemente con alta afinidad y/o con alta especificidad.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para identificar un constructo o constructos de oligonucleótidos (o secuencia funcional) que tengan afinidad por una molécula objetivo, comprendiendo el método poner en contacto una mezcla de diferentes constructos de oligonucleótidos con una molécula objetivo en condiciones que permitan al constructo de oligonucleótido y molécula objetivo unirse y formar un complejo constructo de oligonucleótido: molécula objetivo, y dividir los complejos de oligonucleótidos no unidos y/o molécula objetivo no unida.

En esta memoria descriptiva, el término "división" se refiere a la separación o eliminación de una o más especies moleculares, complejos o conjugados. La etapa de división puede separar complejos de constructo de oligonucleótido: moléculas objetivo de los constructos de oligonucleótidos libres. La división puede implicar la inmovilización de complejos del constructo de oligonucleótido:molécula objetivo sobre un soporte sólido separando y purificando así los complejos de especies moleculares no inmovilizadas. La división también puede implicar la separación de complejos de contaminantes no deseados.

Las condiciones en las que la mezcla de diferentes constructos de oligonucleótidos se pone en contacto con una molécula objetivo se pueden variar para promover la formación o disociación del complejo y, por lo tanto, seleccionar los constructos de oligonucleótidos que tienen menor o mayor afinidad por la molécula objetivo. De manera similar, la selección de constructos de oligonucleótidos que tienen una mayor selectividad relativa por la molécula objetivo puede mejorarse variando las condiciones de selección, por ejemplo, eliminando los oligonucleótidos que se unen a una molécula estructuralmente similar pero no idéntica a la molécula objetivo exponiendo la mezcla a dicha molécula. Pueden identificarse constructos de oligonucleótidos que tienen alta afinidad (Kd) por una molécula objetivo de 10 pM o menos, y preferiblemente una de 1 pM o menos, 500 nM o menos, 100 nM o menos, 50 nM o menos, 1 nM o menos, o 500 pM o menos.

Una molécula objetivo puede ser cualquier molécula, compuesto, ion o sal de interés, por ejemplo, una proteína, lipoproteína, glicoproteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polisacárido, lipopolisacárido, grasa, lípido, ácido nucleico, metabolito, molécula pequeña, fármaco o colorante. En algunas realizaciones, la molécula objetivo se puede reemplazar por una macromolécula, complejo de moléculas, célula, tejido o virus. A modo de ejemplo, una proteína o péptido objetivo puede ser un receptor, enzima, proteína quinasa, citocina, anticuerpo o factor de crecimiento. Las moléculas objetivo pueden aislarse o purificarse.

Una molécula objetivo se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Un soporte sólido se refiere a cualquier sustrato que tiene una superficie a la que se pueden unir moléculas, directa o indirectamente, a través de enlaces covalentes o no covalentes. El soporte sólido puede incluir cualquier material de sustrato que sea capaz de proporcionar soporte físico a las moléculas objetivo que están unidas a la superficie. El material generalmente es capaz de soportar condiciones relacionadas con la unión de las moléculas objetivo a la superficie y cualquier tratamiento, manipulación o procesamiento posterior que se encuentre durante el uso.

Los materiales pueden ser de origen natural, sintéticos o una modificación de un material de origen natural. Los materiales de soporte sólidos adecuados pueden incluir silicio, grafito, superficies reflejantes, laminados, cerámicas, plásticos (incluidos polímeros tales como, por ejemplo, poli(cloruro de vinilo), copolímeros de ciclo-olefina, geles de agarosa, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli (tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno (PTFE o Teflon®), nailon, poli(butirato de vinilo)), germanio, arseniuro de galio, oro, plata.

Se pueden considerar materiales rígidos adicionales, tales como el vidrio, que incluye sílice y además incluye, por ejemplo, vidrio que está disponible como Bioglass. Otros materiales que pueden emplearse incluyen materiales porosos, tales como, por ejemplo, perlas de vidrio de poro controlado, resinas de agarosa o sefarosa entrecruzadas con perlas, o copolímeros de bisacrilamida y azalactona entrecruzadas. También se contempla cualquier otro material conocido en la técnica que sea capaz de tener uno o más grupos funcionales, tales como cualquiera de un grupo funcional amino, carboxilo, tiol o hidroxilo, por ejemplo, incorporado en su superficie.

El material usado para un soporte sólido puede tomar cualquiera de una variedad de configuraciones que van desde simples a complejas. El soporte sólido puede tener cualquiera de varias formas, incluyendo una tira, placa, disco, varilla, partícula, perla, tubo, pozo o columna. El soporte sólido puede ser poroso o no poroso, magnético, paramagnético o no magnético, polidisperso o monodisperso, hidrófilo o hidrófobo. El soporte sólido también puede estar en forma de gel o suspensión de partículas compactas (como en una matriz de columna) o sueltas.

La unión de moléculas objetivo a un soporte sólido se puede lograr marcando la molécula objetivo con una molécula marcadora que se une a una molécula de elemento de captura inmovilizada sobre el soporte sólido. A modo de ejemplo, la molécula marcadora puede ser una fracción de biotina y el elemento de captura puede ser avidina o estreptavidina. Como tal, el soporte sólido podría ser una perla o resina recubierta de estreptavidina tal como Dynabeads M-280 estreptavidina, Dynabeads MyOne estreptavidina, Dynabeads M-270 estreptavidina (Invitrogen), resina de agarosa estreptavidina (Pierce), resina de ultraenlace estreptavidina, perlas de MagnaBind estreptavidina (Thermo Scientific), BioMag estreptavidina, Pro Mag estreptavidina, sílice estreptavidina (Bangs Laboratories), sefarosa estreptavidina de alto rendimiento (GE Healthcare), microesferas de poliestireno estreptavidina (Microspheres Nanospheres), partículas de poliestireno recubiertas de estreptavidina u otras partículas de estreptavidina recubiertas de estreptavidina (Spherotech) o cualquier otra perla o resina recubierta con estreptavidina comúnmente utilizada por un experto en la técnica para capturar moléculas marcadas con biotina. Otros pares de elementos de captura y marcación adecuados incluyen etiquetas de polihistidina y anticuerpos anti-etiqueta de polihistidina, y anticuerpo de etiqueta FLAG (DYKXXD) y anti-FLAG.

Opcionalmente, el método puede comprender además la etapa de disociar el complejo del constructo de oligonucleótido:molécula objetivo y/o aislar el constructo de oligonucleótido del complejo de constructo de oligonucleótido:molécula objetivo y/o identificar un constructo de oligonucleótido.

El método puede comprender además la etapa de determinar la estructura de la secuencia (secuencia de bases y secuencia de modificación) de la secuencia funcional y, opcionalmente, de cualquier otro elemento de secuencia del constructo de oligonucleótido.

Para determinar la estructura de secuencia de la secuencia funcional, se puede determinar la secuencia de la secuencia de codificación, por ejemplo, mediante la amplificación de la secuencia de codificación utilizando las secuencias de codificación fijas para diseñar cebadores para la amplificación basada en enzimas (por ejemplo, polimerasa). Los ejemplos de técnicas de amplificación son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen PCR (reacción en cadena de polimerasa), LCR (reacción en cadena de ligasa), 3SR (replicación de secuencia autosostenida), SDA (amplificación por desplazamiento de cadena), RT-PCR, ICAN y LAMP (por ejemplo, véase DNA Amplification Techniques: An Overview. David H. Sorscher., Molecular Diagnostics. Pathology and Laboratory Medicine. 1997, páginas 89-101).

Usando una técnica de amplificación basada en polimerasa para leer la secuencia de codificación del constructo de oligonucleótido seleccionado, se puede usar una gama de modificaciones de ADN y ARN en la secuencia de codificación siempre que una polimerasa de ácido nucleico pueda leer la secuencia. Los expertos en la técnica conocen una amplia gama de polimerasas adecuadas (por ejemplo, véase Eckert y Kunkel., PCR Methods Appl., agosto de 1991; 1 (1): 17-24). Una de tales polimerasas es la A d N polimerasa KOD (ADN polimerasa KOD HiFi) que es una forma recombinante de la ADN polimerasa KOD1 de Thermococcus kodakaraensis (Nishioka, M., et al., 2001. J. Biotechnol. 88, 141. Takagi, M., et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63, 4504).

La determinación de la secuencia de bases de la secuencia de codificación amplificada también se puede realizar mediante una de varias técnicas bien conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, método de terminación de cadena, método de Sanger, usando un secuenciador de ADN (determinación automatizada de la secuencia de bases de ADN), o usando un método didesoxi.

La secuencia de la secuencia de codificación puede leerse en unidades de n, preferiblemente en la dirección 5' a 3', y traducirse, por ejemplo, utilizando la tabla de codificación correspondiente, para indicar la estructura de la secuencia, preferiblemente también en la dirección 5' a 3', de la secuencia funcional.

Una vez que se ha determinado la estructura de secuencia de la secuencia funcional, se puede preparar una molécula de oligonucleótido, por ejemplo, sintetizada, con base en, y preferiblemente que comprende o consiste en, la estructura de secuencia de la secuencia funcional, incluyendo opcionalmente elementos de secuencia adicionales en el extremo 3' o 5', o en ambos. La molécula de oligonucleótido nuevamente sintetizada puede ensayarse para comprobar la retención de la propiedad para la que se seleccionó, por ejemplo, afinidad de unión a una molécula objetivo.

En general, la capacidad de una secuencia funcional que contiene un oligonucleótido para modular la actividad funcional de una molécula objetivo puede evaluarse usando modelos in vitro e in vivo, dependiendo de la función biológica del objetivo. En algunas realizaciones, la secuencia funcional puede inhibir o estimular una función biológica conocida del objetivo.

Por consiguiente, se proporciona un método para producir una molécula de oligonucleótido, comprendiendo dicho método la etapa de sintetizar una molécula de oligonucleótido basada en la estructura de secuencia de una secuencia funcional de un constructo de oligonucleótido identificado o identificable por un método que comprende poner en contacto una mezcla de diferentes constructos de oligonucleótidos con una molécula objetivo en condiciones que permiten que el constructo de oligonucleótido y la molécula objetivo se unan y formen un complejo de constructo de oligonudeótido:molécula objetivo, y dividir los complejos de oligonucleótidos no unidos y/o molécula objetivo no unida, e identificar opcionalmente un constructo de oligonucleótido capaz de unirse a la molécula objetivo y, opcionalmente, determinar la estructura de la secuencia de la secuencia funcional.

Por ejemplo, tal síntesis puede basarse en información, por ejemplo, grabado en papel, en formato electrónico o disponible en Internet, que registra la estructura de la secuencia de una secuencia funcional.

Después de la identificación de un constructo de oligonucleótido o la determinación de una secuencia funcional, es posible producir una composición, por ejemplo, composición de diagnóstico o composición farmacéuticamente útil, con base en el constructo o secuencia así identificada. Además de las etapas de los métodos descritos en este documento, dichos métodos de producción pueden comprender además una o ambas de las siguientes etapas:

(a) identificar y/o caracterizar la estructura de un constructo de oligonucleótido, elemento funcional o secuencia funcional seleccionados;

(b) preparar, por ejemplo, sintetizar, un oligonucleótido con base en, que comprende o consiste en, la estructura de secuencia del constructo de oligonucleótido seleccionado, elemento funcional o secuencia funcional;

y opcionalmente una de las siguientes etapas:

(c) mezclar el oligonucleótido preparado con un vehículo, adyuvante o diluyente, o

(d) unir o adherir el oligonucleótido preparado a un producto de diagnóstico, por ejemplo, una matriz, chip, sensor, sonda, dispositivo de flujo lateral, dispositivo de microfluidos o tira reactiva, opcionalmente en una o más direcciones o ubicaciones predeterminadas.

Por ejemplo, un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un método para formular, preparar o producir una composición farmacéutica o de diagnóstico, comprendiendo el método preparar o sintetizar un oligonucleótido con base en, y preferiblemente que comprende o consiste en, la estructura de secuencia del constructo de oligonucleótido, elemento funcional o secuencia funcional seleccionados, y que comprende además la etapa de (i) formular una composición farmacéutica mezclando el oligonucleótido con un vehículo, adyuvante o diluyente farmacéuticamente aceptable o (ii) formular una composición de diagnóstico uniendo o adhiriendo el oligonucleótido preparado a un producto de diagnóstico, por ejemplo, una matriz, chip, sensor, sonda, dispositivo de flujo lateral, dispositivo de microfluidos o tira reactiva, opcionalmente en una o más direcciones o ubicaciones predeterminadas.

Las técnicas de selección adecuadas pueden incluir cromatografía de afinidad, ensayo de unión a filtro, división líquidolíquido, filtración, desplazamiento de gel, centrifugación en gradiente de densidad, por ejemplo, como se describe en el documento US 7.517.646 B2. La cromatografía de afinidad es un método de separación y purificación bien conocido en el que el objetivo se puede inmovilizar en una columna que se equilibra con una solución tampón. Se vierte en la columna una solución que contiene un conjunto o biblioteca de constructos de oligonucleótidos. Las secuencias de oligonucleótidos que tienen afinidad por la adsorción del objetivo a la columna. El lavado con la solución tampón permite eliminar los agentes no unidos. Los oligonucleótidos que se unen a la columna se pueden liberar y recolectar, por ejemplo, pasando una solución que contiene la molécula objetivo o una solución tampón diluida a través de la columna.

A modo de ejemplo de cómo se puede cribar una biblioteca de constructos de oligonucleótidos para identificar un constructo de oligonucleótido que tiene una propiedad particular, en algunas realizaciones se puede ensayar una biblioteca combinatoria de constructos de oligonucleótidos unidos a partículas/perlas/microportadores para determinar la afinidad de unión usando un ensayo de inmunofluorescencia. La biblioteca puede ponerse en contacto con una molécula objetivo purificada inmovilizada sobre un soporte sólido. El soporte puede lavarse para dividir los complejos de constructo de oligonucleótido: molécula objetivo de los constructos de oligonucleótidos no unidos. A continuación, los complejos pueden ponerse en contacto con un anticuerpo anti-molécula objetivo (anticuerpo primario) y luego ponerse en contacto con un anticuerpo antiprimario marcado con fluorescencia. A continuación, las perlas pueden visualizarse en busca de fluorescencia, seleccionarse y someterse a amplificación por PCR de la secuencia de codificación. En algunas realizaciones, la selección de perlas puede realizarse mediante citometría de flujo en la que las perlas marcadas con fluorescencia se detectan y separan de las perlas no marcadas o las perlas marcadas con una etiqueta fluorescente diferente (por ejemplo, véase Yang X, et al. Immunofluorescence assay and flow cytometry selection of bead-bound aptamers. Nucleic Acids Research 31(10) (2003) e54). Tales técnicas permiten el cribado e identificación de alto rendimiento de constructos de oligonucleótidos que se unen a la molécula objetivo.

Oligonucleótidos de secuencia funcional

En algunos aspectos de la presente divulgación se proporciona un constructo de oligonucleótido que permite la generación y el cribado de un gran número de secuencias funcionales diferentes, cada una de las cuales contiene al menos un nucleótido, preferiblemente al menos dos o al menos tres nucleótidos adyacentes, que tienen una función sustituyente. En algunas realizaciones preferidas, el sustituyente funcional es una cadena lateral de aminoácidos. Después de la identificación de un constructo de oligonucleótido, la estructura de secuencia de la secuencia funcional puede determinarse y registrarse como información que define la secuencia funcional. Puede prepararse una nueva molécula de oligonucleótido basándose en la información registrada, de qué molécula de oligonucleótido comprende toda o parte de la secuencia funcional (incluidos los sustituyentes funcionales).

El nuevo oligonucleótido puede comprender o consistir en la estructura de secuencia de la secuencia funcional, opcionalmente junto con las secuencias fijas. Más comúnmente, comprenderá la estructura de secuencia de la secuencia funcional, o una parte sustancial de ella, y puede comprender además uno o más elementos de secuencia de nucleótidos adicionales y/o derivatizarse por conjugación con una o más moléculas que pueden o no ser oligonucleótidos o ácidos nucleicos.

La secuencia funcional puede tener una longitud mínima seleccionada de uno de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos y una longitud máxima seleccionada de uno de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 5 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 nucleótidos. En realizaciones preferidas, la secuencia funcional puede tener una longitud de uno de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos. En realizaciones particularmente preferidas, la secuencia funcional tiene una longitud de uno de 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En una realización preferida, la secuencia funcional tiene 13 nucleótidos.

Preferiblemente, al menos dos, o al menos tres o cuatro, nucleótidos adyacentes en un elemento de secuencia contigua de la secuencia funcional se modifican mediante la incorporación de un sustituyente funcional, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, uno de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,

17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 4 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 7 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 nucleótidos adyacentes en un elemento de secuencia contigua de la secuencia funcional se modifican mediante la incorporación de tal sustituyente.

En algunas realizaciones, cada nucleótido de la secuencia funcional se modifica mediante la incorporación de dicho sustituyente. En otras realizaciones, uno o más nucleótidos de la secuencia funcional no se modifican mediante la incorporación de tal sustituyente.

En algunas realizaciones preferidas, la secuencia funcional consiste en una secuencia contigua de uno de 10, 11, 12,

13, 14 o 15 nucleótidos en la que cada uno o todos excepto uno de 1,2, 3, 4 o 5 nucleótidos se modifican mediante la incorporación de un sustituyente funcional, como se describe en el presente documento.

Una parte sustancial de la secuencia funcional puede ser una secuencia que tenga al menos un 70% de identidad con la estructura de secuencia de la secuencia funcional. Para la secuencia funcional, la identidad de la estructura de la secuencia puede calcularse alineando los elementos de la secuencia, pero también requiere que se considere la presencia/ausencia de sustituyentes funcionales (por ejemplo, sustituyentes de fracciones de aminoácidos) al determinar la identidad. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias formas conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, usando software de ordenador disponible públicamente tal como ClustalW 1.82. Software T-coffee o Megalign (DNASTAR). Al utilizar dicho software, se utilizan preferiblemente los parámetros predeterminados, por ejemplo, para penalización por hueco y penalización por extensión. Los parámetros predeterminados de ClustalW 1.82 son: penalización por apertura de hueco en proteína = 10.0, penalización por extensión de hueco en proteína = 0,2, matriz de proteína = Gonnet, hueco terminal en proteína/ADN = -1, distancia de hueco en proteína/ADN = 4.

Además, la nueva molécula de oligonucleótido puede comprender un elemento de secuencia en uno o ambos extremos 3' y 5', por ejemplo, elementos de secuencia que tienen una secuencia conocida y pueden diseñarse como cebadores para la amplificación de la polimerasa y/o como secuencias que se hibridarán para formar una estructura de tallo-bucle (por ejemplo, secuencias complementarias) o que de otro modo proporcionarán estabilidad estructural a la secuencia funcional. Estas secuencias preferiblemente no contienen sustituyentes funcionales, como se describe en este documento, aunque pueden incluir otras modificaciones químicas, tales como sustitución química en una posición de azúcar, una posición de fosfato y opcionalmente una posición de base del ácido nucleico que incluye, por ejemplo, la incorporación de un nucleótido modificado, incorporación de una fracción de protección (por ejemplo, protección de 3', protección de 5', protección de 3'-3' dT invertida), sustituciones o modificaciones en la cadena principal de fosfato, por ejemplo monotioato, ditioato, fosfonato de metilo, fosfonato de alquilo. Las modificaciones del azúcar pueden incluir (desoxi)ribosa, nucleótidos de 2'-amina (²-NH²), nucleótidos de 2'-fluoro (2'-F) y nucleótidos de

2'-O-metil (2'-OMe).

La nueva molécula de oligonucleótido también puede conjugarse con otras moléculas. Por ejemplo, la conjugación puede ser con moléculas que mejoran la resistencia a la degradación o la eliminación del cuerpo, tales como moléculas de alto peso molecular, opcionalmente no inmunogénicas, por ejemplo, polietilenglicol.

La derivatización de ácidos nucleicos con polímeros no inmunogénicos de alto peso molecular tiene el potencial de alterar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los ácidos nucleicos haciéndolos agentes terapéuticos más eficaces y/o más seguros. Los cambios en la actividad pueden incluir una mayor resistencia a la degradación por las nucleasas, menor tiempo de eliminación del cuerpo, una disminución de la exposición al sistema inmunológico y una distribución alterada del compuesto terapéutico a través del cuerpo.

Los oligonucleótidos de acuerdo con la presente divulgación, en particular moléculas de oligonucleótidos que comprenden una secuencia funcional, pueden derivatizarse con una o más fracciones de polialquilenglicol ("PAG"), por ejemplo, polietilenglicol ("PEG") y polipropilenglicol (incluido poliisopropilenglicol). Los copolímeros aleatorios o de bloques de diferentes óxidos de alquileno también se pueden usar en muchas aplicaciones. Los compuestos derivatizados con PAG conjugados con los oligonucleótidos de la divulgación tienen típicamente un tamaño de entre 5 y 80 kDa.

Los métodos para generar conjugados de PEG-oligonucleótido de alto peso molecular implican la formación de un PEG lineal activado, o un PEG ramificado activado en el que dos o más PEG se unen a un núcleo central que porta el grupo activado. Las porciones terminales de estas moléculas de PEG de alto peso molecular, es decir, las fracciones hidroxilo (-OH) relativamente no reactivas, se pueden activar o convertir en fracciones funcionales para la unión de uno o más de los PEG a otros compuestos en los sitios reactivos del compuesto. Los PEG ramificados activados tendrán más de dos terminales, y en los casos en los que se hayan activado dos o más terminales, puede ser deseable proteger la molécula de PEG en un extremo con una fracción esencialmente no reactiva para que la molécula de PEG sea monofuncional (o monoactiva). El otro terminal no protegido de la molécula de PEG se convierte típicamente en una fracción terminal reactiva que puede activarse para la unión en un sitio reactivo del oligonucleótido.

La conjugación también puede ser con agentes marcadores que pueden ayudar a visualizar el oligonucleótido que puede ser relevante para aplicaciones de investigación y diagnóstico. Los marcadores y medios adecuados para su detección son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, eosina y NDB, proteína fluorescente verde (GFP), quelatos de tierras raras tales como europio (Eu), terbio (Tb) y samario (Sm), tetrametil rodamina, rojo Texas, 4-metil umbeliferona, 7-amino-4-metilcumarina, Cy3, Cy5), marcadores isotópicos, radioisótopos (por ejemplo, ³²P, ³³P, ³⁵S), marcadores de quimioluminiscencia (por ejemplo, éster de acridinio, luminol, isoluminol), enzimas (por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, luciferasa), anticuerpos, ligandos y receptores. Los materiales de marcación adicionales incluyen biotina, un ligando, un ácido nucleico específico, una proteína o un hapteno.

La conjugación también puede ser con uno o más agentes activos, tal como con un agente terapéuticamente activo. Ejemplos de agentes terapéuticamente activos incluyen productos farmacéuticos de molécula pequeña (tales como antibióticos, intercaladores de ADN, inhibidores de proteína quinasa) y agentes biológicos (tales como un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero de ácido nucleico, aptámero de péptido, ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN), péptido, polipéptido o proteína).

En este contexto, se observa que en algunas realizaciones la molécula de oligonucleótido puede tener actividad independiente como agente terapéutico, es decir, tener un efecto terapéutico y ser un "agente activo" en el contexto de un tratamiento terapéutico real o potencial. Por ejemplo, puede actuar como agonista o antagonista de una molécula objetivo y de ese modo proporcionar o iniciar un efecto de tratamiento. En otras realizaciones, la molécula de oligonucleótido puede no tener un efecto terapéutico, es decir, puede no ser un "agente activo", pero puede actuar para dirigir un agente activo conjugado a la molécula objetivo, o células/tejidos que expresan la molécula objetivo.

La secuencia funcional se puede truncar opcionalmente para identificar una secuencia mínima que tenga la propiedad deseada, por ejemplo, unión de la molécula objetivo y/o característica funcional. Los experimentos de truncamiento pueden estar guiados por el uso de programas de plegado y análisis de secuencia, por ejemplo, analizar secuencias funcionales para identificar motivos conservados de sustituyentes de aminoácidos y/o cadena principal de nucleótidos y/o usar una covariación para guiar el diseño de secuencias truncadas. Los programas de plegado incluyen el programa de estructura de ARN (Mathews, DH; Disney, MD; Childs, JL; Schroeder, SJ; Zuker, M.; y Turner, DH, "Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure", 2004. Proceedings of the National Academy of Sciences, EE. UU., 101, 7287-7292). Las secuencias truncadas se pueden sintetizar químicamente y probar las características funcionales y de unión, en comparación con la secuencia no truncada de la que se derivaron. Las variantes de la secuencia funcional que contienen 5', 3' y/o eliminaciones internas también pueden sintetizarse químicamente y ensayarse para determinar las características funcionales y/o de unión, en comparación con la secuencia no modificada de la que se derivaron.

La nueva molécula de oligonucleótido también puede diseñarse para incluir modificaciones químicas que no están presentes en la secuencia funcional del constructo de oligonucleótido de la que se deriva. Preferiblemente, tales modificaciones no alteran la estructura o el orden de los sustituyentes funcionales (como se definen en el presente documento) presentes en la secuencia funcional y, opcionalmente, no alteran la estructura química de la base o bases correspondientes, y pueden incluirse para mejorar la resistencia a la degradación, por ejemplo, degradación por nucleasa, de la molécula. Las modificaciones adecuadas pueden seleccionarse del grupo que consiste en: una modificación química en una posición de azúcar; una modificación química en una posición de base y una modificación química en un enlace internucleotídico. Los ejemplos adecuados incluyen la inclusión de enlaces fosforotioato, fosfodiéster o fosforoditioato, la inclusión de modificaciones de azúcar 2'-desoxi, nucleótido 2'-OH, 2'-OMe, 2'-fluoro o 2'-NH²; y la adición de uno o más PEG u otros polímeros.

Las moléculas de oligonucleótidos que comprenden la secuencia funcional y se seleccionan para unirse a una molécula objetivo tienen una afinidad y especificidad comparables a las de un anticuerpo y se pueden usar en una gama correspondiente de aplicaciones.

Complejos

Las moléculas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente divulgación, en particular los oligonucleótidos que comprenden una secuencia funcional, se pueden proporcionar como un complejo con una molécula objetivo. Preferiblemente, el complejo es el producto de una interacción de unión de alta afinidad entre la secuencia funcional y la molécula objetivo. Aunque el complejo puede comprender un oligonucleótido unido covalentemente a la molécula objetivo, preferiblemente es un complejo no covalente. Los complejos no covalentes pueden mantenerse mediante enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals y, opcionalmente, interacción iónica.

Los complejos pueden proporcionarse en forma aislada o en forma purificada, o pueden estar presentes en una solución o mezcla con otras moléculas. Los complejos pueden proporcionarse ex vivo o in vitro o pueden formarse in vivo.

Por ejemplo, pueden formarse complejos durante la selección de oligonucleótidos que se unen a una molécula objetivo y pueden estar presentes antes y después de la división de otras moléculas. También se pueden formar complejos cuando se realizan ensayos diseñados para detectar la presencia de una molécula objetivo.

En algunas realizaciones, los complejos pueden formarse y/o aislarse en un soporte sólido o matriz de soporte, y pueden unirse, opcionalmente ligados de manera liberable, al soporte. La inmovilización del complejo sobre un soporte se puede lograr uniendo el oligonucleótido o la molécula objetivo al soporte, por ejemplo, utilizando un par de unión biotina: avidina en el que un componente del par se une al soporte y el otro al oligonucleótido o molécula objetivo.

Detección de molécula objetivo

Las moléculas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente divulgación que se unen a una molécula objetivo, en particular oligonucleótidos que comprenden una secuencia funcional, se pueden utilizar en un método para detectar la presencia de una molécula objetivo. Dichos métodos se pueden realizar preferiblemente in vitro o ex vivo, u opcionalmente in vivo.

Como tal, se puede proporcionar un método, comprendiendo el método poner en contacto una molécula de oligonucleótido de acuerdo con la presente divulgación con una muestra que contiene, o se sospecha que contiene, una molécula objetivo que el oligonucleótido es capaz de unir, por ejemplo, con alta afinidad, y detectando la formación de un complejo oligonucleótido: molécula objetivo.

En un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para detectar una molécula objetivo, comprendiendo el método poner en contacto una molécula de oligonucleótido de acuerdo con la presente divulgación que es capaz de unir una molécula objetivo con una muestra que contiene, o se sospecha que contiene, dicha molécula objetivo; permitir que se forme un complejo o complejos de oligonucleótido: molécula objetivo; detectar dicho complejo o complejos de oligonucleótido: molécula objetivo.

En algunas realizaciones, el oligonucleótido puede inmovilizarse sobre un soporte sólido o una matriz de soporte, por ejemplo, en un portaobjetos, tira, chip, columna de matriz, etc.

La muestra puede ser de cualquier tipo. Por ejemplo, puede comprender una mezcla de moléculas que incluyen, o se sospecha que incluyen, la molécula objetivo. En algunas realizaciones, la muestra puede ser una muestra biológica. En otras realizaciones, la muestra puede ser una muestra ambiental, por ejemplo, muestra de agua, tierra o aire. La muestra puede tratarse antes de ponerse en contacto con el oligonucleótido, por ejemplo, mezclado con un solvente o portador o procesado para eliminar o retener un componente sólido o fluido.

Las muestras biológicas pueden comprender o pueden derivarse de: una cantidad de sangre; una cantidad de suero derivado de la sangre de un individuo que puede comprender la porción fluida de la sangre obtenida después de la eliminación del coágulo de fibrina y las células sanguíneas; una cantidad de jugo pancreático; una muestra de tejido o una biopsia; o células aisladas de dicho individuo. Se puede tomar una muestra biológica de cualquier tejido o fluido corporal, por ejemplo, una muestra de sangre, muestra derivada de sangre, muestra de suero, muestra de linfa, muestra de semen, muestra de líquido sinovial, muestra de saliva. Una muestra derivada de sangre puede ser una fracción seleccionada de la sangre de un paciente, por ejemplo, una fracción seleccionada que contiene células o una fracción de plasma o suero.

Los ensayos pueden tener formatos conocidos, por ejemplo, ensayos en sándwich e inmunoensayos, en los que el oligonucleótido forma uno de los agentes de unión.

Composiciones

Pueden proporcionarse composiciones o preparaciones que comprendan una o más constructos de oligonucleótidos u oligonucleótidos de acuerdo con la presente divulgación. En algunas realizaciones, se pueden preparar composiciones o preparaciones para que sean adecuadas para su uso en aplicaciones de investigación, terapia o diagnóstico.

Normalmente, una composición comprenderá uno o más constructos de oligonucleótidos o moléculas de oligonucleótidos aisladas o purificadas, opcionalmente un constructo de oligonucleótido o una molécula de oligonucleótido sintetizada de nuevo, junto con un vehículo, excipiente, diluyente, disolvente, matriz de soporte o soporte sólido adecuados.

Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar y/o manipular una sal correspondiente del constructo de oligonucleótido u oligonucleótido, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable. Se analizan ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables en Berge et al., 1977, Pharmaceutically Acceptable Salts, J. Pharm. Sci., Vol. 66, páginas 1-19.

Por ejemplo, se puede formar una sal con un catión adecuado. Los ejemplos de cationes inorgánicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, iones de metales alcalinos tales como Na⁺y K⁺, cationes alcalinotérreos tales como Ca²⁺y Mg2 ⁺, y otros cationes tales como Al³⁺. Los ejemplos de cationes orgánicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, iones amonio (es decir, NH⁴⁺) y iones amonio sustituidos (por ejemplo, NH³R⁺, NH²R²⁺, NHR³⁺, NR⁴⁺). Ejemplos de iones amonio sustituidos adecuados son los derivados de: etilamina, dietilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, bencilamina, fenilbencilamina, colina, meglumina y trometamina, así como aminoácidos tales como lisinay arginina. Un ejemplo de un ión amonio cuaternario común es N(CH³)⁴⁺.

A menos que se especifique lo contrario, una referencia a un constructo de oligonucleótido u oligonucleótido también incluye formas de sal del mismo.

Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar y/o manipular un solvato correspondiente del constructo de oligonucleótido u oligonucleótido. El término "solvato" se usa en el presente documento en el sentido convencional para referirse a un complejo de soluto (por ejemplo, compuesto activo, sal de compuesto activo) y disolvente. Si el disolvente es agua, el solvato puede denominarse convenientemente un hidrato, por ejemplo, un monohidrato, un dihidrato, un trihidrato, etc.

A menos que se especifique lo contrario, una referencia a un constructo de oligonucleótido u oligonucleótido también incluye formas de solvato del mismo.

Las composiciones, preparaciones y formulaciones se pueden envasar para su uso en una variedad de recipientes farmacéuticamente aceptables utilizando cualquier cierre de recipiente farmacéuticamente aceptable, ya que las formulaciones son compatibles con recipientes y cierres de recipientes que contienen y no PVC. Ejemplos de recipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, ampolletas, jeringas precargadas, bolsas intravenosas, botellas intravenosas y bolsas de mezcla.

Preferiblemente, las formulaciones, composiciones y preparaciones son estériles. Una formulación "estéril" es una formulación que se ha llevado a un estado de esterilidad y no se ha expuesto posteriormente a contaminación microbiológica, es decir, el recipiente que contiene la composición estéril no se ha visto comprometido. Las composiciones estériles las preparan generalmente los fabricantes farmacéuticos de acuerdo con las regulaciones actuales de Buenas Prácticas de Fabricación ("cGMP").

Las composiciones, preparaciones y formulaciones también se pueden empaquetar en un kit. El kit contendrá la composición, formulación o preparación junto con instrucciones para su uso, por ejemplo, en diagnóstico, investigación o terapia. El kit también puede contener uno o más de los siguientes: una jeringa, una bolsa o frasco intravenoso, el mismo medicamento en una forma de dosificación diferente u otro medicamento. Un kit adecuado puede tener al menos un recipiente que tenga una cantidad o concentración predeterminada de oligonucleótido de acuerdo con la presente invención. El oligonucleótido puede formularse para que sea adecuado para la administración a un sujeto. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se puede proporcionar en forma de una composición de diagnóstico, como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, un kit comprende un constructo de oligonucleótido y una tabla de codificación que describe la relación entre n mers de la secuencia de codificación y nucleótidos en una posición correspondiente en la secuencia funcional. Cuando se proporciona una pluralidad de constructos de oligonucleótidos, también se puede proporcionar una pluralidad de tablas de codificación respectivas en el kit. De manera similar, se puede proporcionar una biblioteca de constructos de oligonucleótidos, por ejemplo, en forma de una biblioteca de perlas, y también se puede proporcionar una pluralidad de tablas de codificación respectivas con la biblioteca.

En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica (por ejemplo, formulación, preparación, medicamento) que comprende un constructo de oligonucleótido u oligonucleótido, como se describe en el presente documento, y un portador farmacéuticamente aceptable.

En una realización, la composición es una composición farmacéutica que comprende al menos un constructo de oligonucleótido u oligonucleótido, como se describe en el presente documento, junto con uno o más de otros ingredientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, vehículos, diluyentes, excipientes, adyuvantes, rellenos, tampones, conservantes, antioxidantes, lubricantes, estabilizadores, solubilizantes, tensioactivos (por ejemplo, agentes humectantes), agentes enmascarantes, agentes colorantes, agentes saborizantes y agentes edulcorantes farmacéuticamente aceptables.

En una realización, la composición puede comprender además otros agentes activos, por ejemplo, otros agentes terapéuticos o profilácticos.

Los vehículos, diluyentes, excipientes, etc. adecuados se pueden encontrar en los textos farmacéuticos estándar. Véase, por ejemplo, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2a edición (eds. M. Ash y I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, Nueva York, EE.UU.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edición, pub. Lippincott, Williams y Wilkins, 2000; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edición, 1994.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a métodos para preparar una composición farmacéutica que comprende mezclar al menos un constructo de oligonucleótido u oligonucleótido junto con uno o más de otros ingredientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, vehículos, diluyentes, excipientes, etc. Si se formulan como unidades discretas (por ejemplo, tabletas, etc.), cada unidad contiene una cantidad predeterminada (dosis) del compuesto activo.

El término "farmacéuticamente aceptable" como se usa en este documento se refiere a compuestos, ingredientes, materiales, composiciones, formas de dosificación, etc., que están, dentro del alcance de un juicio médico sólido, adecuados para su uso en contacto con los tejidos del sujeto en cuestión (por ejemplo, un ser humano) sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable. Cada vehículo, diluyente, excipiente, etc. también debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación.

Las formulaciones se pueden preparar mediante cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia. Dichos métodos incluyen la etapa de asociar el constructo de oligonucleótido o el oligonucleótido con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el compuesto activo con vehículos (por ejemplo, vehículos líquidos, vehículos sólidos finamente divididos, etc.) y luego dando forma al producto, si es necesario.

La formulación puede prepararse para proporcionar una liberación rápida o lenta; liberación inmediata, retrasada, programada o sostenida; o una combinación de los mismos.

Las formulaciones pueden estar adecuadamente en forma de líquidos, soluciones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), suspensiones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua, agua en aceite), elixires, jarabes, electuarios, enjuagues bucales, gotas, tabletas, geles, pastas, ungüentos, cremas, lociones, aceites, espumas, atomizadores, neblinas o aerosoles.

El compuesto activo puede disolverse, suspenderse o mezclarse con uno o más de otros ingredientes farmacéuticamente aceptables. El compuesto activo se puede presentar en un liposoma u otra micropartícula diseñada para dirigir el compuesto activo, por ejemplo, a componentes sanguíneos o uno o más órganos.

Los disolventes se pueden clasificar convenientemente de acuerdo con una o más de sus propiedades físicas o químicas.

Por ejemplo, los disolventes pueden clasificarse de acuerdo con su polaridad, es decir, su momento dipolar permanente. Los ejemplos de disolventes altamente polares incluyen dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida y acetonitrilo (ACN). Los ejemplos de disolventes moderadamente polares incluyen acetona, metanol, tetrahidrofurano (THF), acetato de etilo (AcOEt) y agua. Los ejemplos de disolventes relativamente no polares incluyen éter dietílico, cloroformo y diclorometano (DCM). Los ejemplos de disolventes no polares y prácticamente no polares incluyen alcanos, benceno, tolueno y tetracloruro de carbono.

Los disolventes también se pueden clasificar como "próticos" o "apróticos" de acuerdo con sus propiedades de intercambio de protones. Los solventes próticos aceptan y/o donan protones. Los ejemplos de disolventes próticos incluyen agua, alcoholes, ácidos carboxílicos (por ejemplo, ácido acético) y aminas (por ejemplo, amoniaco, piridina). Los disolventes apróticos no aceptan ni donan protones. Ejemplos de disolventes apróticos incluyen tetracloruro de carbono, cloroformo, diclorometano (DCM), acetonitrilo (ACN), acetato de etilo (AcOEt), dimetilacetamida, tetrahidrofurano (THF), dimetilformamida (DMF), tolueno, benceno, acetona, éteres (por ejemplo, éter dietílico), alcanos (por ejemplo, hexano), dimetilsulfóxido (DMSO), dióxido de azufre, hexametilfosforamida (HMPA) y tetrametilurea. Los disolventes anfóteros, como el agua, son capaces tanto de aceptar como de donar protones. Los disolventes también se pueden clasificar como "orgánicos" o "inorgánicos" de acuerdo con su composición química. Convencionalmente, los disolventes orgánicos comprenden, al menos, átomos de carbono, mientras que los disolventes inorgánicos no. Los ejemplos de disolventes inorgánicos incluyen agua, amoniaco y dióxido de azufre.

En algunos aspectos de la presente divulgación, se proporciona un constructo de oligonucleótido o una molécula de oligonucleótido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en terapia.

En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para tratar una enfermedad o afección, comprendiendo el método administrar un constructo de oligonucleótido o una molécula de oligonucleótido de acuerdo con la presente divulgación a un sujeto que requiere tratamiento.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un constructo de oligonucleótido o una molécula de oligonucleótido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en un método de tratamiento médico.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un constructo de oligonucleótido o molécula de oligonucleótido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia o en un método de diagnóstico practicado en el cuerpo de un ser humano o animal.

En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un constructo de oligonucleótido o una molécula de oligonucleótido de acuerdo con la presente divulgación para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona el uso de un constructo de oligonucleótido o una molécula de oligonucleótido de acuerdo con la presente divulgación en la fabricación de una composición farmacéutica o un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección.

El constructo de oligonucleótido o la molécula de oligonucleótido se puede formular como una composición farmacéutica, como se describió anteriormente. El efecto terapéutico puede proporcionarse mediante la unión del constructo de oligonucleótido o la molécula de oligonucleótido a una molécula objetivo en el cuerpo de un sujeto que requiera tratamiento. Como tal, el constructo de oligonucleótido u oligonucleótido puede ser uno que se una a una molécula objetivo asociada con, o que media, la enfermedad o condición a tratar.

El sujeto a tratar puede ser cualquier animal o ser humano. El sujeto es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. El sujeto puede ser un mamífero no humano, pero más preferiblemente es un ser humano. El sujeto puede ser macho o hembra. El sujeto puede ser un paciente.

Los medicamentos y las composiciones farmacéuticas de acuerdo con los aspectos de la presente divulgación pueden formularse para su administración por varias vías, que incluyen, pero no se limitan a, parenteral, intravenosa, intraarterial, intramuscular, oral y nasal. Los medicamentos y las composiciones se pueden formular en forma líquida, sólida o de otro tipo. Las formulaciones líquidas se pueden formular para la administración mediante inyección en una región seleccionada del cuerpo humano o animal.

La administración se realiza preferiblemente en una "cantidad terapéuticamente eficaz", que es suficiente para mostrar beneficio al individuo. La cantidad real administrada y la velocidad y el tiempo de administración dependerán de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se esté tratando. La prescripción de tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., son responsabilidad de los médicos generales y otros médicos, y generalmente tienen en cuenta el trastorno que se va a tratar, la condición del paciente individual, el sitio de suministro, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. Los ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edición, 2000, pub. Lippincott, Williams y Wilkins.

Se pueden usar constructos de oligonucleótidos o moléculas de oligonucleótidos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o afección mediada por una molécula objetivo, por ejemplo, una proteína objetivo. En principio, la enfermedad o afección precisa que se va a tratar, prevenir o mejorar puede ser de cualquier tipo en la que una molécula objetivo, particularmente una proteína objetivo, juega un papel y puede modularse, por ejemplo, inhibir o estimular, para afectar la progresión de la enfermedad o la aparición/continuación de algunos o todos sus síntomas. A modo de ejemplo, las enfermedades pueden incluir cáncer, enfermedades cardíacas, hipertensión, VIH/SIDA y diabetes.

En algunas realizaciones, la composición es adecuada para su uso en la detección de moléculas objetivo y puede formularse como una composición de investigación o de diagnóstico.

Dichas composiciones pueden comprender una o una pluralidad de constructos de oligonucleótidos u oligonucleótidos con un vehículo, excipiente, diluyente, disolvente, matriz de soporte o soporte sólido adecuados.

El constructo o constructos de oligonucleótidos u oligonucleótidos se pueden marcar con un agente que permita la detección del constructo de oligonucleótido u oligonucleótido, por ejemplo, cuando se une a una molécula objetivo. Los marcadores y medios adecuados para su detección son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, eosina y NDB, proteína fluorescente verde (GFP), quelatos de tierras raras como europio (Eu), terbio (Tb)) y samario (Sm), tetrametil rodamina, rojo Texas, 4-metil umbeliferona, 7-amino-4-metilcumarina, Cy3, Cy5), marcadores isotópicos, radioisótopos (por ejemplo, 32P, 33P, 35S), marcadores de quimioluminiscencia (por ejemplo, éster de acridinio, luminol, isoluminol), enzimas (por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, luciferasa), anticuerpos, ligandos y receptores. Los materiales de marcado adicionales incluyen biotina, un ligando, un ácido nucleico específico, una proteína o un hapteno.

Las constructos de oligonucleótidos u oligonucleótidos de la divulgación se pueden adaptar de forma rutinaria para fines de diagnóstico de acuerdo con cualquier número de técnicas empleadas por los expertos en la técnica. Los agentes de diagnóstico solo deben permitir al usuario identificar la presencia de un objetivo determinado en un lugar o concentración particular. La simple capacidad de formar pares de unión con el objetivo puede ser suficiente para activar una señal positiva con fines de diagnóstico. Los expertos en la técnica también podrían adaptar cualquier oligonucleótido mediante procedimientos conocidos en la técnica para incorporar una etiqueta de marcaje para rastrear la presencia de tal oligonucleótido. Una etiqueta de este tipo podría utilizarse en varios procedimientos de diagnóstico.

En algunas realizaciones, la composición es una composición de diagnóstico, que es adecuada para su uso en un método de diagnóstico de una enfermedad o afección, cuyo método puede realizarse in vitro, ex vivo u opcionalmente in vivo.

Un método de diagnóstico de una enfermedad o afección puede comprender poner en contacto un constructo de oligonucleótido o una molécula de oligonucleótido de acuerdo con la presente divulgación con una muestra que contiene una molécula objetivo que el oligonucleótido es capaz de unir, por ejemplo, con alta afinidad, y detectando la formación de un complejo de oligonucleótido: molécula objetivo. La formación del complejo puede producir una señal detectable, por ejemplo, un cambio de color.

Dichos métodos pueden implicar la detección de la presencia o ausencia de una molécula objetivo de una muestra, como se describió anteriormente. Opcionalmente, los métodos pueden comprender además la etapa de determinar un diagnóstico para un sujeto del que se tomó la muestra.

En algunas realizaciones se proporciona un producto de diagnóstico, por ejemplo, en forma de matriz, chip, sensor, sonda, dispositivo de flujo lateral, dispositivo de microfluidos o tira reactiva. El producto de diagnóstico puede tener una o una pluralidad de constructos de oligonucleótidos u oligonucleótidos inmovilizados en él en una o una pluralidad de ubicaciones o direcciones predeterminadas. Los constructos de oligonucleótidos u oligonucleótidos pueden ser del mismo tipo y/o capaces de detectar la misma molécula objetivo, o de diferentes tipos y/o capaces de detectar diferentes moléculas objetivo. Cuando se utilizan constructos de oligonucleótidos u oligonucleótidos de diferentes tipos o capaces de detectar diferentes moléculas objetivo, una única dirección o ubicación puede tener solo constructos de oligonucleótidos u oligonucleótidos del mismo tipo y/o capaces de detectar la misma molécula objetivo. La detección de una molécula objetivo puede desencadenar una señal, por ejemplo, cambio de color, lo que indica el resultado de una prueba de diagnóstico.

Pueden realizarse métodos de acuerdo con la presente divulgación, o pueden estar presentes productos, in vitro, ex vivo o in vivo. El término "in vitro" pretende abarcar experimentos con materiales, sustancias biológicas, células y/o tejidos en condiciones de laboratorio o en cultivo, mientras que el término "in vivo" pretende abarcar experimentos y procedimientos con organismos multicelulares intactos. "Ex vivo" se refiere a algo presente o que tiene lugar fuera de un organismo, por ejemplo, fuera del cuerpo humano o animal, que puede estar en tejidos (por ejemplo, órganos completos) o células extraídas del organismo.

Los encabezados de las secciones utilizados en este documento son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito.

A lo largo de esta memoria descriptiva, incluidas las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" y variaciones tales como "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un número entero o etapa establecida o grupo de números enteros o etapas pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

Debe tenerse en cuenta que, tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Los intervalos pueden expresarse en el presente documento desde "aproximadamente" un valor particular y/o hasta "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra realización.

Se ilustrarán ahora aspectos y realizaciones de la presente invención, a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas. Otros aspectos y realizaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

Breve descripción de las Figuras

Las formas de realización y los experimentos que ilustran los principios de la invención se discutirán ahora con referencia a las figuras adjuntas en las que:

Figura 1. Diagrama de un constructo de oligonucleótido unido a una matriz de soporte durante la síntesis de una biblioteca en una matriz de soporte (denominada en el presente documento "biblioteca sobre soporte"). El elemento funcional contiene la secuencia funcional (negra) y las secuencias fijas (blancas) y se adjunta a la matriz de soporte mediante una secuencia espaciadora. El elemento de codificación contiene la secuencia de codificación (sombreado de línea diagonal), la secuencia de ID de la tabla de codificación, las secuencias fijas y se adjunta a la matriz de soporte mediante una secuencia espaciadora.

Figuras 2A, 2B y 2C. (A) Diagrama de un constructo de oligonucleótido (biblioteca sobre soporte) unida a una matriz de soporte durante la síntesis del constructo de oligonucleótido. (B) Diagrama de un constructo de oligonucleótido (biblioteca sobre soporte) unida a una matriz de soporte durante la selección de un constructo de oligonucleótido eficaz. (C) Diagrama de un elemento funcional seleccionado.

Figura 3. Diagrama de un constructo de oligonucleótido unida a una matriz de soporte durante la síntesis de una biblioteca en solución. El elemento funcional contiene una secuencia funcional (negra), secuencias fijas (blancas) y está unido a una fracción ramificada mediante una secuencia espaciadora. El elemento de codificación contiene la secuencia de codificación (sombreado de línea diagonal), la secuencia de ID de la tabla de codificación y las secuencias fijas y está unido a la fracción ramificada a través de una secuencia espaciadora. El constructo de oligonucleótido se une a la matriz de soporte a través de un enlazador escindible unido a la fracción ramificada.

Figuras 4A, 4B y 4C. (A) Diagrama de un constructo de oligonucleótido (biblioteca en solución) unida a una matriz de soporte durante la síntesis del constructo de oligonucleótido. (B) Diagrama de un constructo de oligonucleótido (biblioteca en solución) liberada de la matriz de soporte durante la selección de un constructo de oligonucleótido eficaz. (C) Diagrama de un elemento funcional seleccionado.

Figura 5. Diagrama que muestra la orientación del elemento funcional, el elemento de codificación y la secuencia enlazadora para el constructo de oligonucleótido de acuerdo con la biblioteca en solución. Los elementos funcionales y de codificación se sintetizan cada uno en la dirección 3' a 5' lejos de la fracción ramificada. La secuencia del enlazador está en la dirección 3' a 5' hacia la fracción ramificada.

Figuras 6A y 6B. (A) Ilustración de un constructo de oligonucleótido que tiene elementos funcionales y de codificación separados unidos a una matriz de soporte. (B) Ilustración de un constructo de oligonucleótido que comprende un oligonucleótido ramificado unido a una matriz de soporte, comprendiendo el oligonucleótido ramificado elementos funcionales y de codificación.

Figuras 7A, 7B, 7C y 7D. (A) Fosforamidita protegida con 4,4'-dimetoxitritilo (DMTr). (B) Fosforamidita protegida con levulinoilo (Lev). (C) Ilustración de una perla que tiene una pluralidad de elementos funcionales unidos cada uno protegido con un grupo 4,4'-dimetoxitritilo y que también tiene una pluralidad de elementos de codificación unidos cada uno protegido con un grupo ácido levulinoilo. (D) Ilustración de una perla que tiene una pluralidad de constructos de oligonucleótidos ramificados que tienen un elemento funcional protegido con un grupo 4,4'-dimetoxitritilo y un elemento de codificación protegido con un grupo levulinoilo.

Figura 8. Ilustración de la extensión escalonada de secuencias funcionales y de codificación y preparación de una biblioteca combinatoria. La extensión de la secuencia funcional con un monómero nucleotídico modificado va seguida de la extensión de la secuencia de codificación mediante la adición de un nucleótido de n mer no modificado para formar un constructo de oligonucleótido. Se utilizan dos grupos de protección (4,4'-dimetoxitritilo (DMTr) y levulinoilo (Lev)) para la síntesis del constructo de oligonucleótido en una matriz de soporte, uno se utiliza para proteger el elemento funcional en crecimiento y el otro para proteger el elemento de codificación en crecimiento. La desprotección y nueva protección en serie permite la extensión gradual de los elementos funcionales y de codificación. La mezcla y la nueva división de la matriz de soporte de diferentes constructos que se preparan simultáneamente pero por separado mediante el mismo proceso después de una extensión de cada una de las secuencias de codificación y funcionales proporciona la formación de una biblioteca combinatoria de constructos que tienen diferentes secuencias funcionales. El proceso ilustrado se puede repetir tantas veces como se desee.

Figuras 9A y 9B. (A) Ilustración de una ronda de reacciones de extensión separadas de una pluralidad de constructos de oligonucleótidos diferentes (fila superior), mezcla de constructos (fila central) y división de constructos para una nueva ronda de extensión (fila inferior). (B) Tabla de codificación para n = 2 que ilustra los nucleótidos modificados (F^x) que se pueden añadir a la secuencia funcional y el correspondiente dinucleótido de nucleótidos no modificados de la secuencia de codificación.

Figuras 10A, 10B y 10C. (A) Ilustración esquemática que muestra la síntesis del constructo de oligonucleótido lineal/ramificado en una matriz de soporte seguida de escisión para generar una biblioteca de constructos de oligonucleótidos en solución. (B) Ilustración esquemática que muestra la síntesis del constructo de oligonucleótido lineal/ramificado en una matriz de soporte en la que el elemento funcional y el elemento de codificación están unidos a una matriz de soporte a través de una fracción ramificada y un enlazador escindible/no escindible para generar una biblioteca en matrices de soporte, cada una de las cuales está unida a un constructo de oligonucleótido diferente. (C) Ilustración esquemática que muestra la síntesis del constructo de oligonucleótido en el que el elemento funcional y el elemento de codificación están unidos a una matriz de soporte para generar una biblioteca de matrices de soporte, cada una de ellas unida a un constructo de oligonucleótido diferente.

Figuras 11A y 11B. Tablas de codificación que muestran la relación entre la secuencia de codificación y la secuencia funcional, en la que n = 2. Los nucleótidos modificados se indican por referencia a la base (A, C, G, T) y al sustituyente de aminoácido mediante el cual se modifica (indicado en el subíndice utilizando el código de tres letras de aminoácidos). (A) Ejemplo de tabla de codificación para constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, el dinucleótido CA en la secuencia de codificación corresponde a CPhe (citosina modificada por inclusión de un residuo de aminoácido que tiene la cadena lateral de fenilalanina) en la secuencia funcional. (B) Ejemplo de referencia de tabla de codificación adaptada del documento US 7.517.646.

Figuras 12A y 12B. Tablas de codificación que muestran la relación entre la secuencia de codificación y la secuencia funcional, en la que n = 3. Los nucleótidos modificados se indican con referencia a la base (A, C, G, T) y al sustituyente funcional mediante el cual se modifica (indicado en el subíndice usando la abreviatura que aparece en esta invención). (A) Ejemplo de tabla de codificación para constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, el trinucleótido AAC en la secuencia de codificación corresponde a CPhe (citosina modificada por inclusión de un residuo de aminoácido que tiene la cadena lateral de fenilalanina) en la secuencia funcional. (B) Ejemplo de referencia de tabla de codificación adaptada del documento US 7.517.646.

Figura 13. Esquema de síntesis para la preparación de desoxiuridina y desoxicitosina modificados en la posición 5 con un sustituyente de fracción de aminoácido.

Figura 14. Tabla de codificación de ocho desoxiuridinas modificadas en posición 5 y ocho desoxicitosinas modificadas en posición 5, en la que n = 2.

Figura 15. Diagrama que ilustra configuraciones alternativas del elemento funcional. Una secuencia funcional flanqueada por secuencias fijas permite la formación de una estructura de bucle de horquilla. La inserción de secuencias fijas adicionales dentro de la secuencia funcional permite la formación de estructuras terciarias más complejas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se preparan ocho tipos de desoxicitidina (C i-8) y ocho tipos de desoxiuridina (Ui-8), cada una con un sustituyente funcional en la posición 5 de citosina o uracilo, respectivamente (Figura 13), en el que corresponde el sustituyente funcional a la cadena lateral de un aminoácido como sigue: 1 = Ala, 2 = Asp, 3 = Glu, 4 = Gly, 5 = Ile, 6 = Lys, 7 = Phe, 8 = Ser.

Cada uno de los 16 nucleósidos modificados está relacionado uno a uno con un dinucleótido para formar una tabla de codificación (Figura 14).

Ejemplo 2: preparación de biblioteca en solución

1. Una resina de soporte sólido de polímero que tiene un residuo amino libre en su superficie se conjuga con el derivado de timidina Fórmula (B) mediante síntesis por deshidratación usando HCTU (hexafluorofosfato de 2-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio) como se describe en la patente japonesa No. 5.365.005.

2. La resina de soporte sólido de polímero se empaqueta en un soporte de columna universal.

3. Usando un sintetizador de A d N convencional y el procedimiento de la fosforamidita, se conjuga una DMT-timidinafosforamidita con el grupo hidroxilo del soporte sólido.

4. El derivado de glicerol de Fórmula (C) se conjuga con el grupo hidroxilo de timidina sobre el soporte sólido mediante el método de fosforamidita convencional, (1) destritilación, (2) activación de fosforamidita, (3) acoplamiento y protección y (4) oxidación.

Fórmula (C)

5. Se utilizan DMT-desoxiadenina fosforamidita, DMT-desoxiguanina fosforamidita, DMT-desoxicitidina fosforamidita y DMT-timina fosforamidita para sintetizar una secuencia fija del elemento funcional en dirección desde el extremo 3' a 5' sobre el grupo hidroxilo protegido con DMT del derivado de glicerol.

6 Lev-desoxiadenina fosforamidita, Lev-desoxiguanina fosforamidita, Lev-desoxicitidina fosforamidita y Lev-timina fosforamidita se utilizan para sintetizar una secuencia fija del elemento de codificación en la dirección 3' a 5' en el grupo hidroxilo protegido con Lev del derivado de glicerol.

7. Los soportes sólidos resultantes se retiran de la columna de soporte universal y se empaquetan en 16 nuevas columnas de soporte universal.

8. Cada una de las 16 columnas está asignada para la adición de 3 nucleótidos relacionados con una celda de la tabla de codificación en la Figura 14, por ejemplo, "A, A, Uaib", "C, A, Caib", "A, C, Ugiu", "G, T, USer", etc., (subrayado = nucleótidos agregados a la secuencia de codificación; negrita = nucleótido modificado agregado a la secuencia funcional).

Por ejemplo, para agregar Caib a la secuencia funcional y el dinucleótido CA (5' a 3' *) de codificación a la secuencia de codificación (de acuerdo con la Figura 14): se agrega Caib fosforamidita a la secuencia funcional desbloqueando Lev con diamina 0,5M en piridina/AcOH (1:1); luego, A se conjuga con la secuencia de codificación desbloqueando DMT con TCA al 3% en diclorometano, y luego C se conjuga con la secuencia de codificación desbloqueando DMT con TCA al 3% en diclorometano. [* Téngase en cuenta que la síntesis por el método de la fosforamidita se realiza desde el extremo 3' hasta el extremo 5'].

9. Después de tratar las 16 columnas de la misma manera usando una combinación apropiada de nucleótidos de cada celda de la tabla de codificación, los soportes sólidos de las columnas de soporte universal se mezclaron completamente y se empaquetaron en 16 nuevas columnas de soporte universal. De esta manera, se prepara una biblioteca de constructos de oligonucleótidos, cada una de las cuales tiene una secuencia funcional aleatorizada y la secuencia de codificación correspondiente, de acuerdo con la tabla de codificación.

10. Las etapas 7 y 8 se repiten tantas veces como sea necesario para obtener la longitud deseada de secuencia funcional.

11. Cuando se van a incorporar una secuencia o secuencias fijas, DMT-desoxiadenina fosforamiditas (por ejemplo, DMT-desoxiguanina fosforamidita, DMT-desoxicitidina fosforamidita y DMT-timina fosforamidita) se utilizan para sintetizar las secuencias fijas del elemento funcional y las Lev-fosforamiditas se utilizan para la síntesis de la secuencia fija del elemento de codificación.

12. Todos los grupos de protección, que incluyen o excluyen los grupos DMT y Lev, se eliminan usando un reactivo de desprotección, tal como una base impedida o amoníaco acuoso, y se escinden del soporte sólido usando un reactivo de escisión apropiado, por ejemplo, TCEP o DTT para un enlazador disulfuro.

13. La purificación y desalación se realizan de acuerdo con métodos de purificación estándar.

Ejemplo 3: preparación de la biblioteca sobre soporte

1. Una resina de soporte sólido de polímero que tiene un residuo de hidróxido libre en su superficie se empaqueta en un soporte de columna universal.

2. Utilizando un sintetizador de ADN convencional y el procedimiento de la fosforamidita, se conjuga una DMT-timidinafosforamidita con un grupo hidroxilo del soporte sólido cuatro veces de modo que un tetranucleótido de timidina se une al soporte sólido.

3. Después de eliminar DMT con TCA al 3% en diclorometano, se conjugan una mezcla de DMT-timina fosforamidita y Lev-timina fosforamidita a dicho tetraoligonucleótido de timidina.

4. Siguiendo las etapas 4 a 10 del Ejemplo 2 (preparación de "biblioteca en solución"), se sintetizan las secuencias fijas, las secuencias funcionales y la secuencia de codificación.

5. Todos los grupos de protección, incluidos los grupos DMT y Lev, se eliminan usando reactivos de desprotección como se indica en el Ejemplo 2.

6. La "biblioteca de soporte" resultante se recupera de la columna de soporte universal.

Ejemplo 4: identificación de constructos de oligonucleótidos que se unen a una molécula objetivo de una biblioteca en solución

Usando la biblioteca en solución ("biblioteca") del ejemplo 2, se identifican los constructos de oligonucleótidos que se unen con alta afinidad a un objetivo de proteína.

Se inmoviliza una proteína de PSA (antígeno específico de próstata) marcada con His (la molécula objetivo) en una perla de His-Mag Sefarosa-Ni para inmovilizar la proteína. Se mezcla una suspensión de las perlas con la solución de la biblioteca.

Los componentes no unidos en la biblioteca se eliminan lavando suficientemente con una solución tampón que contiene una alta concentración de sal y/o baja concentración de detergente suave. Después del lavado, se eluye el complejo molécula objetivo: oligonucleótido de la resina His-Mag Sefarosa-Ni mediante una solución de imidazol 500 mM.

El complejo molécula objetivo: oligonucleótido recuperado se somete a amplificación por PCR de la secuencia de codificación utilizando dos oligonucleótidos cebadores complementarios a las secuencias fijas ubicadas en los extremos 5' y 3' de la secuencia de codificación, respectivamente. La fracción de ADN amplificada por PCR se somete a secuenciación de ADN convencional para obtener información de secuencia para el elemento de codificación, incluida la secuencia de codificación y la secuencia de ID de la tabla de codificación.

La secuencia de codificación se traduce usando la tabla de codificación para determinar la estructura de la secuencia (la secuencia de bases y las modificaciones de las fracciones de aminoácidos asociados) de la secuencia funcional.

Las moléculas de oligonucleótidos de secuencia funcional, con o sin nucleótidos adicionales que proporcionan otras funciones tales como sitio de unión específico de sitio, marcación con colorante fluorescente y biotinilación, se sintetizan mediante el método de fosforamidita de acuerdo con la estructura de secuencia determinada de la secuencia funcional. Los oligonucleótidos recién sintetizados se vuelven a ensayar para determinar su unión a PSA usando medición de resonancia de plasmón superficial, ensayo tipo sándwich y/o perfil de columna de afinidad. La variación de las condiciones para la unión del objetivo permite la selección de secuencias funcionales que exhiben la mayor afinidad por el PSA.

Después de la amplificación por PCR del complejo molécula objetivo: oligonucleotídico, la muestra se somete a condiciones básicas suaves para separar el complejo, la fracción oligonucleotídica se recupera mediante precipitación con etanol y se vuelve a aplicar para la selección por afinidad descrita anteriormente. Esto proporciona un segundo lote de producto de PCR para secuenciar.

Al comparar la aparición de secuencias entre el primer lote, el segundo lote y una nueva selección de productos de PCR, se verifica el proceso de enriquecimiento y permite la identificación de secuencias candidatas potentes.

Ejemplo 5: identificación de constructos de oligonucleótidos que se unen a una molécula objetivo de una biblioteca sobre soporte

Usando la "biblioteca sobre soporte" ("biblioteca") del Ejemplo 3, se identifican los constructos de oligonucleótidos que se unen con alta afinidad a una proteína objetivo.

La proteína de PSA (antígeno prostático específico) (la molécula objetivo) se conjuga con un colorante fluorescente tal como 7-cloro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol antes de iniciar el proceso de selección.

El PSA marcado se mezcla con una suspensión de biblioteca durante la noche. Después de recuperar y lavar la fracción de soporte sólido mediante filtración, la fracción de soporte sólido se diluye a la concentración óptima para el equipo de clasificación de células (o equipo de clasificación de perlas) y cada soporte sólido individual que tiene una intensidad fluorescente más fuerte que el umbral se fracciona para su recuperación.

Cada soporte sólido individual recuperado mediante el equipo de clasificación se aplica para la amplificación por PCR de la secuencia de codificación usando dos oligonucleótidos cebadores complementarios a las secuencias fijas ubicadas en los extremos 5' y 3' de la secuencia de codificación, respectivamente. La fracción de ADN amplificada por PCR se somete a secuenciación convencional de ADN para obtener información de secuencia para el elemento de codificación, la secuencia de codificación y la secuencia de ID de la tabla de codificación.

La secuencia de codificación resultante se traduce usando la tabla de codificación para determinar la estructura de la secuencia (la secuencia de bases y las modificaciones de las fracciones de aminoácidos asociados) de la secuencia funcional.

Las moléculas de oligonucleótidos de secuencia funcional, con o sin nucleótidos adicionales que proporcionan otras funciones tales como sitio de unión específico del sitio, marcación con colorante fluorescente y biotinilación, se sintetizan individualmente mediante el método de fosforamidita de acuerdo con la estructura de secuencia determinada de la secuencia funcional. Los oligonucleótidos recién sintetizados se vuelven a ensayar para determinar su unión a PSA usando medición de resonancia de plasmón superficial, ensayo tipo sándwich y/o perfil de columna de afinidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un constructo de oligonucleótido que comprende un elemento funcional y un elemento de codificación, en el que el elemento funcional comprende una secuencia funcional, comprendiendo la secuencia funcional una secuencia de nucleótidos en la que uno o más, o cada, nucleótido está modificado y el elemento de codificación comprende una secuencia de codificación, comprendiendo la secuencia de codificación una secuencia de nucleótidos que no contiene las modificaciones de la secuencia funcional, en la que la secuencia de codificación codifica la estructura de secuencia de la secuencia funcional y en la que la secuencia de codificación es un polímero de oligonucleótido de n mers, o una pluralidad de n mers diferentes, en el que n es un número entero de 2 o mayor y cada n mer corresponde a un solo nucleótido en la secuencia funcional y la secuencia de codificación tiene n veces el número de nucleótidos que secuencia funcional.

2. El constructo de oligonucleótido de la reivindicación 1, en la que el o los nucleótidos modificados de la secuencia funcional se seleccionan independientemente para comprender la estructura B-L-Func en la que B se selecciona independientemente de una base de pirimidina o purina; L se selecciona independientemente de un enlace o un enlazador; y Func es un sustituyente funcional.

3. El constructo de oligonucleótido de la reivindicación 1 o 2, en el que el elemento funcional y el elemento de codificación son parte de un oligonucleótido lineal o ramificado simple.

4. El constructo de oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada elemento funcional y elemento de codificación está unido a una matriz de soporte.

5. El constructo de oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el elemento funcional comprende la secuencia funcional flanqueada por dos o más secuencias de oligonucleótidos que tienen complementariedad parcial o completa entre sí.

6. El constructo de oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el elemento de codificación comprende la secuencia de codificación flanqueada por dos o más secuencias de oligonucleótidos.

7. El constructo de oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el elemento funcional y el elemento de codificación son monocatenarios.

8. Un método para producir una molécula de oligonucleótido, comprendiendo el método sintetizar una molécula de oligonucleótido basada en la estructura de secuencia de una secuencia funcional de un constructo de oligonucleótido identificada por, o identificable por, un método que comprende poner en contacto una mezcla de diferentes constructos de oligonucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con una molécula objetivo en condiciones que permitan que el constructo de oligonucleótido y la molécula objetivo se unan y formen un complejo de constructo de oligonucleótido: molécula objetivo, dividiendo los complejos de oligonucleótidos no unidos y/o molécula objetivo no unida, identificando un constructo de oligonucleótido capaz de unirse a la molécula objetivo y determinar la estructura de secuencia de la secuencia funcional.

9. Un método para preparar un constructo de oligonucleótido, comprendiendo el método sintetizar un constructo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Una biblioteca de constructos de oligonucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la biblioteca comprende una pluralidad de constructos de oligonucleótidos que tienen una estructura de secuencia diferente de la secuencia funcional.

11. Una biblioteca de constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 10, en la que los constructos de oligonucleótidos difieren en la secuencia de bases de la secuencia funcional.

12. Un método para preparar una biblioteca de constructos de oligonucleótidos, comprendiendo el método sintetizar una pluralidad de constructos de oligonucleótidos, cada uno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los constructos de oligonucleótidos tienen una estructura de secuencia diferente de la secuencia funcional.

13. Un método para preparar un constructo de oligonucleótido, comprendiendo el constructo de oligonucleótido un elemento funcional y un elemento de codificación, comprendiendo el método:

(ii) extensión de un elemento de codificación mediante la adición de un nucleótido de n mer para formar una secuencia de codificación, seleccionándose el n mer para codificar la estructura de dicho nucleótido modificado de la etapa (i),

en el que n es un número entero de 2 o mayor y el n mer no contiene la modificación de dicho nucleótido modificado de la etapa (i),

en el que la etapa (i) o (ii) se puede realizar primero y las etapas (i) y (ii) se realizan secuencialmente y en el que las etapas ( i) y (ii) se repiten según sea necesario para producir una secuencia de codificación que tiene una longitud n veces la longitud de la secuencia funcional.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la extensión del elemento de codificación comprende la adición de n monómeros de nucleótidos.

15. El método de la reivindicación 13 o 14, en el que el constructo de oligonucleótido es un oligonucleótido ramificado, en el que la extensión en (i) comprende la adición de un solo nucleótido modificado a una fracción ramificada para formar una primera ramificación, y la extensión en (ii) comprende la adición de un nucleótido de n mer a la fracción ramificada para formar una segunda ramificación.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que cada constructo de oligonucleótido se une a un soporte sólido y la preparación de los constructos de oligonucleótidos se realiza de acuerdo con una tabla de codificación que describe la relación entre cada nucleótido agregado a la secuencia funcional y el n mer se añade a la secuencia de codificación en la posición correspondiente, en la que cada realización de las etapas (i) y (ii) forma una ronda de extensión, y en la que entre las rondas de extensión los soportes sólidos se mezclan y luego se dividen en 2x partes y al menos una o cada una de las 2x partes se somete a una nueva ronda de extensión, en la que x es el número de n mers en la tabla de codificación.

17. Un método para preparar una biblioteca de constructos de oligonucleótidos, cada constructo de oligonucleótido unido a un soporte sólido y cada constructo de oligonucleótido que comprende un elemento funcional y un elemento de codificación, comprendiendo el método:

proporcionar una pluralidad de soportes sólidos, cada uno unido a una fracción ramificada a partir de la cual se puede sintetizar un oligonucleótido ramificado por extensión de cada ramificación,

(ii) extensión de otra ramificación para formar un elemento de codificación mediante la adición de un nucleótido de n mer para formar una secuencia de codificación, el n mer seleccionado para codificar la estructura de dicho nucleótido modificado de la etapa (i), en el que n es un número entero de 2 o más y el n mer no contiene la modificación de dicho nucleótido modificado de la etapa (i),

en el que la etapa (i) o (ii) se puede realizar primero y las etapas (i) y (ii) se realizan secuencialmente y en el que las etapas (i) y (ii) se repiten según sea necesario para producir una secuencia de codificación que tiene una longitud n veces la longitud de la secuencia funcional.

18. El método de la reivindicación 17, en el que la preparación de los constructos de oligonucleótidos se realiza de acuerdo con una tabla de codificación que describe la relación entre cada nucleótido agregado a la secuencia funcional y el n mer agregado a la secuencia de codificación en una posición correspondiente, en el que cada realización de las etapas (i) y (ii) forma una ronda de extensión, y en el que entre las rondas de extensión los soportes sólidos se mezclan y luego se dividen en 2x partes y al menos una o cada una de las 2x partes se somete a una nueva ronda de extensión, en el que x es el número de n mers en la tabla de codificación.

19. Un método para identificar un constructo o constructos de oligonucleótidos que tienen afinidad por una molécula objetivo, comprendiendo el método poner en contacto una mezcla de diferentes constructos de oligonucleótidos, cada una de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, con una molécula objetivo en condiciones que permiten que el constructo de oligonucleótido y la molécula objetivo se unan y formen un complejo de constructo de oligonucleótido:molécula objetivo, y dividir los complejos de los oligonucleótidos no unidos y/o molécula objetivo no unida.