ES2843486T3

ES2843486T3 - Aceites con alto contenido en ácido oleico

Info

Publication number: ES2843486T3
Application number: ES13782495T
Authority: ES
Inventors: Craig Wood; Qing Liu; Xue-Rong Zhou; Allan Green; Surinder Pal Singh; Shijiang Cao
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2021-07-19
Anticipated expiration: 2033-04-24

Abstract

Una semilla de cártamo cuyo contenido de aceite comprende, y/o que es capaz de producir una planta que produce semillas cuyo contenido de aceite comprende, triacilgliceroles (TAG) que consisten en ácidos grasos esterificados a glicerol, y en donde i) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico, ii) al menos el 95 % en peso del contenido de aceite de la semilla es TAG, iii) del 90 % al 95 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico, iv) menos del 3,1 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico, y v) el contenido de aceite de la semilla tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de 0,037 y/o un valor palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de 0,063; en donde la semilla de cártamo comprende a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un primer ARN de silenciamiento que es capaz de reducir la expresión de un gen de Δ12 desaturasa (FAD2) en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece del primer polinucleótido exógeno, y en donde el primer polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo, y b) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un segundo ARN de silenciamiento que es capaz de reducir la expresión de un gen de palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece del segundo polinucleótido exógeno, y en donde el segundo polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo.

Description

DESCRIPCIÓN

Aceites con alto contenido en ácido oleico

Campo de la invención

La presente invención se refiere a lípidos extraídos con altos niveles, por ejemplo, del 90 % al 95 % en peso, de ácido oleico. La presente invención también proporción plantas modificadas genéticamente, particularmente semillas oleaginosas, tales como cártamo, que pueden usarse para producir el lípido. Además, se proporcionan métodos para genotipificar y seleccionar plantas que pueden usarse para producir el lípido.

Antecedentes de la invención

Los aceites de plantas son una fuente importante de grasa dietética para los seres humanos, representando aproximadamente el 25 % de la ingesta calórica en los países desarrollados (Broun et al., 1999). La producción mundial de aceites de plantas es al menos de aproximadamente 110 millones de toneladas anuales, de las cuales el 86 % se usa para consumo humano. Casi todos estos aceites se obtienen de cultivos de semillas oleaginosas tales como soja, canola, cártamo, girasol, semilla de algodón y cacahuete, o árboles de plantaciones tales como palma, olivo y coco (Gunstone, 2001: Oil World Annual, 2004). El reconocimiento comunitario y la comprensión científica creciente del impacto de los componentes de ácidos grasos individuales de aceites comestibles sobre varios aspectos de la salud humana está motivando el desarrollo de aceites de plantas modificados que tienen un valor nutricional mejorado, mientras retienen la funcionalidad requerida para varias aplicaciones alimenticias. Estas modificaciones requieren conocimientos acerca de las rutas metabólicas para la síntesis de ácidos grasos de plantas y de los genes que codifican las enzimas para estas rutas (Liu et al., 2002a; Thelen y Ohlrogge, 2002).

Se está prestando una atención considerable al impacto nutricional de varias grasas y aceites, en particular a la influencia de los constituyentes de grasas y aceites sobre enfermedades cardiovasculares, cáncer y varias afecciones inflamatorias. Se piensa que altos niveles de colesterol y ácidos grasos saturados en la dieta incrementan el riesgo de enfermedades cardíacas y esto ha conducido a la recomendación nutricional de reducir el consumo de grasas animales saturadas ricas en colesterol a favor de aceites de plantas insaturados libres de colesterol (Liu et al., 2002a).

Mientras que la ingesta dietética de colesterol presente en grasas animales puede incrementar significativamente los niveles de colesterol total en la sangre, se ha encontrado también que los ácidos grasos que comprenden las grasas y aceites pueden por si mismos tener efectos significativos sobre los niveles de colesterol del suero sanguíneo. Tiene un interés particular el efecto de los ácidos grasos dietéticos sobre las formas de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) indeseables y de lipoproteínas de alta densidad (HDL) deseables en la sangre. En general, los ácidos grasos saturados, particularmente el ácido mirístico (14:0) y el ácido palmítico (16:0), los principales saturados presentes en aceites de plantas, tienen la propiedad indeseable de elevar los niveles de colesterol de LDL del suero e incrementar consecuentemente el riego de enfermedades cardiovasculares (Zock et al., 1994; Hu et al., 1997). Sin embargo, está bien establecido que el ácido esteárico (18:0), el otro saturado principal presente en los aceites de plantas, no eleva el colesterol de LDL, y realmente puede disminuir el colesterol total (Bonanone y Grundy, 1988; Dougherty et al., 1995). Por lo tanto, el ácido esteárico es considerado generalmente, al menos neutro con respecto al riesgo de enfermedades cardiovasculares (Tholstrup, et al., 1994). Por otra parte, los ácidos grasos insaturados, tales como el ácido oleico monoinsaturado (18:1), tiene la propiedad beneficiosa de disminuir el colesterol de LDL (Mensink y Katan, 1989; Roche y Gibney, 2000), reduciendo así el riesgo de enfermedades cardiovasculares.

El aceite con alto contenido en ácido oleico también tiene muchos usos industriales tales como, pero no limitados a, lubricantes, a menudo en la forma de ésteres de ácido graso, biocombustibles, materiales en bruto para alcoholes grasos, plastificantes, ceras, estearatos metálicos, emulsificantes, productos para el cuidado personal, jabones y detergentes, tensioactivos, productos farmacéuticos, aditivos para trabajar metales, materiales en bruto para suavizantes de telas, tintas, jabones transparentes, estabilizantes de PVC, resinas alquílicas, e intermedios para muchos otros tipos de derivados oleoquímicos aguas abajo.

Los procesadores de aceites y los fabricantes de alimentos se han basado tradicionalmente en la hidrogenación para reducir el nivel de ácidos grasos insaturados en los aceites, incrementando así su estabilidad oxidativa en aplicaciones de frituras y proporcionando también grasas sólidas para su uso en margarinas y mantecas. La hidrogenación es un proceso químico que reduce el grado de insaturación de los aceites convirtiendo dobles enlaces carbono-carbono en enlaces simples carbono-carbono. La hidrogenación completa produce una grasa totalmente saturada. Sin embargo, el proceso de hidrogenación parcial da como resultado niveles incrementados tanto de ácidos grasos saturados como de ácidos grasos monoinsaturados. Algunos de los monoinsaturados formados durante la hidrogenación parcial están en la forma de isómeros trans (tal como ácido elaídico, un isómero trans del ácido oleico) en lugar del isómero cis natural (Sebedio et al., 1994; Fernández San Juan, 1995). A diferencia de los ácidos grasos insaturados en cis, los ácidos grasos trans son conocidos actualmente por ser tan potentes como el ácido palmítico en la elevación de los niveles de colesterol de LDL en el suero (Mensink, y Katan, 1990; Noakes y Clifton, 1998) y en la disminución del colesterol de HDL en el suero (Zock y Katan, 1992), y contribuir así al riesgo incrementado de enfermedades cardiovasculares (Ascherio y Willett, 1997). Como resultado de la concienciación creciente de los efectos antinutricionales de los ácidos grasos trans, existe actualmente una tendencia creciente de alejarse del uso de aceites hidrogenados en la industria alimentaria, a favor de grasas y aceites que son beneficiosos nutricionalmente y pueden proporcionar la funcionalidad requerida sin hidrogenación, en particular aquellos que son ricos ya sea en ácido oleico, cuando se requieren aceites líquidos, o ácido esteárico, cuando se prefiere una grasa sólida o semisólida.

Existe una necesidad de lípidos y aceites adicionales con alto contenido en ácido oleico y fuentes de los mismos.

Resumen de la invención

Los presentes inventores han producido nuevas composiciones de lípidos y métodos para producir estos lípidos. La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En un primer aspecto, la presente descripción proporciona lípido extraído de una semilla oleaginosa, lípido que comprende triacilgliceroles (TAG) que consisten en ácidos grasos esterificados a glicerol, en donde

i) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico,

ii) al menos el 95 % en peso del lípido es TAG,

iii) aproximadamente del 90 % a aproximadamente el 95 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido oleico,

iv) menos de aproximadamente el 3,1 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido palmítico, y v) el lípido tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de aproximadamente 0,037 y/o un valor palmíticolinoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente 0,063.

En una realización, el lípido tiene una o más o todas de las siguientes características,

a) de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 94 %, o de aproximadamente el 91 % a aproximadamente el 94 %, o de aproximadamente el 91 % a aproximadamente el 92 %, o aproximadamente el 92 %, o aproximadamente el 93 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido oleico,

b) menos de aproximadamente el 3 %, o menos de aproximadamente el 2,75 %, o menos de aproximadamente el 2,5 %, o aproximadamente el 3 %, o aproximadamente el 2,75 %, o aproximadamente el 2,5 %, o aproximadamente el 2,3 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido palmítico.

c) de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 3 %, o de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 3 %, o aproximadamente el 3 %, o aproximadamente el 2 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácidos grasos poliinsaturados (PUFA),

d) menos de aproximadamente el 3 %, o menos de aproximadamente el 2,5 %, o menos de aproximadamente el 2,25 %, o aproximadamente el 3 %, o aproximadamente el 2,5 %, o aproximadamente el 2,25 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido linoleico,

e) menos de aproximadamente el 1 %, o menos de aproximadamente el 0,5 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido a-linolénico (ALA),

f) de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 1 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es 18:1A11,

g) la ODP del contenido de ácidos grasos del lípido es de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,016, o de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,023, o es aproximadamente 0,03, o aproximadamente 0,02, o aproximadamente 0,01,

h) el valor de PLO del contenido de ácidos grasos del lípido es de aproximadamente 0,020 a aproximadamente 0,063, o de aproximadamente 0,020 a aproximadamente 0,055, o de aproximadamente 0,020 a aproximadamente 0,050, o de aproximadamente 0,050 a aproximadamente 0,055, o aproximadamente 0,063, o aproximadamente 0,055, o aproximadamente 0,050, o aproximadamente 0,040, o aproximadamente 0,030, o aproximadamente 0,020, i) de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 96 %, o de aproximadamente el 92 % a aproximadamente el 96 %, o aproximadamente el 93 %, o aproximadamente el 94 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácidos grasos monoinsaturados,

j) el lípido tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de aproximadamente 0,02, o menos de aproximadamente 0,015, o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,002,

k) el lípido está en la forma de un aceite purificado, y

l) el lípido no está hidrogenado.

En una realización,

1) de aproximadamente el 91 % a aproximadamente el 94 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido oleico,

2) menos de aproximadamente el 2,75 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido palmítico, 3) menos de aproximadamente el 3 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido linoleico, 4) el ácido a -linolénico es indetectable en el contenido de ácidos grasos del lípido,

5) la ODP del contenido de ácidos grasos del lípido es de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,023, o de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,018,

6) el valor de PLO del contenido de ácidos grasos del lípido es de aproximadamente 0,020 a aproximadamente 0,063, 7) aproximadamente el 96 %, o aproximadamente el 93 %, o aproximadamente el 94 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácidos grasos monoinsaturados, y

8) el lípido tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de aproximadamente 0,02, o menos de aproximadamente 0,015, o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,02.

En una realización adicional,

5) aproximadamente el 96 %, o aproximadamente el 93 %, o aproximadamente el 94 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácidos grasos monoinsaturados, y

6) el lípido tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de aproximadamente 0,02, o menos de aproximadamente 0,015, o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,02.

En una realización, el PUFA es ácido linoleico.

En una realización, el ácido a -linolénico es indetectable en el contenido de ácidos grasos del lípido.

En una realización adicional, de aproximadamente el 55 % a aproximadamente el 80 %, o de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 80 %, o de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 %, o al menos aproximadamente el 60 %, o al menos aproximadamente el 70 %, o aproximadamente el 60 %, o aproximadamente el 70 %, o aproximadamente el 80 %, del contenido de TAG del lípido es trioleina.

En otra realización, menos de aproximadamente el 5 %, o menos de aproximadamente el 2 %, o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 5 %, del contenido de ácido oleico del lípido está en la forma de diacilgliceroles (DAG). En una realización adicional, el lípido está en la forma de un aceite, en donde al menos el 90 %, o al menos el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 98 %, en peso del aceite es el lípido.

En una realización preferida, la semilla oleaginosa es una semilla oleaginosa no fotosintética. Los ejemplos de semillas oleaginosas no fotosintéticas incluyen, pero están necesariamente limitadas a, semilla de cártamo, girasol, algodón o ricino. En una realización preferida, la semilla oleaginosa no fotosintética es semilla de cártamo.

En una realización, el lípido comprende además uno o más esteroles.

En una realización adicional, el lípido está en la forma de un aceite, y que comprende menos de aproximadamente 5 mg de esteroles/g de aceite, o de aproximadamente 1,5 mg de esteroles/g de aceite a aproximadamente 5 mg de esteroles/g de aceite.

En una realización, el lípido comprende uno o más o todos de

a) de aproximadamente el 1,5 % a aproximadamente el 4,5 %, o de aproximadamente el 2,3 % a aproximadamente el 4,5 %, del contenido total de esteroles es ergost-7-en-3IJ-ol,

b) de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 3 %, o de aproximadamente el 1,5 % a aproximadamente el 3 %, del contenido total de esteroles es alcohol triterpenoide,

c) de aproximadamente el 8,9 % a aproximadamente el 20 %, del contenido total de esteróles es A7-estigmaesterol/estigma-7- en-313-ol, y

d) de aproximadamente el 1,7 % a aproximadamente el 6,1 % del contenido total de esteroles es A7-avenaesterol. En una realización adicional, el lípido tiene un volumen de al menos 1 litro y/o un peso de al menos 1 kg, y/o que se extrajo de semillas oleaginosas obtenidas de plantas cultivadas en campo.

En una realización, el lípido ha sido extraído de una semilla oleaginosa por trituración y comprende menos de aproximadamente el 7 % en peso de agua. En otra realización, el lípido es lípido purificado (extraído con disolvente y refinado) y comprende menos de aproximadamente el 0,1 %, o menos de aproximadamente el 0,05 % en peso de agua. En otro aspecto, la presente descripción proporciona una composición que comprende un primer componente que es lípido de la descripción, y un segundo componente, preferiblemente donde la composición se produjo mezclando el lípido con el segundo componente.

Como apreciará el experto en la técnica, el segundo componente puede seleccionarse de un amplio rango de diferentes composiciones/compuestos. En un ejemplo, el segundo componente es una sustancia no lipídica tal como una enzima, un catalizador no proteico (no enzimático) o producto químico (por ejemplo, hidróxido de sodio, metanol o un metal), o uno o más ingredientes de un alimento.

La presente descripción también proporciona un proceso para producir aceite, proceso que comprende

i) obtener una semilla oleaginosa que comprende, y/o que es capaz de producir una planta que produce semilla oleaginosa que comprende, aceite, en donde el contenido de aceite de la semilla oleaginosa es un lípido como se define en la presente memoria, y

ii) extraer aceite a partir de la semilla oleaginosa para producir así el aceite.

En una realización preferida, la semilla oleaginosa comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un primer ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de un gen de A12 desaturasa (FAD2) en una semilla oleaginosa en desarrollo en relación con una semilla oleaginosa correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, y en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleaginosa en desarrollo.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un proceso para producir aceite, proceso que comprende i) obtener semilla de cártamo cuyo contenido de aceite comprende, y/o que es capaz de producir una planta que produce semillas cuyo contenido de aceite comprende, triacilgliceroles (tAg ) que consisten en ácidos grasos esterificados a glicerol, y en donde

a) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico,

b) al menos el 95 % en peso del contenido de aceite de la semilla es TAG,

c) de aproximadamente el 75 % a aproximadamente el 95 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico,

d) menos de aproximadamente el 5,1 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico, y

e) el contenido de aceite de la semilla tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de aproximadamente 0,17 y/o un valor palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente 0,26, y

ii) extraer el aceite de la semilla de cártamo para producir así el aceite,

en donde la semilla de cártamo comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un primer ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de un gen de A12 desaturasa (FAD2) en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, y en donde el polinucleótido está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo.

En una realización, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo comprende un segundo polinucleótido exógeno que codifica un segundo ARN silenciador, que es capaz de reducir la expresión de un gen de palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) en una semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleaginosa o semilla de cártamo correspondiente que carece del segundo polinucleótido exógeno, y en donde el segundo polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo.

En otra realización, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo comprende un tercer polinucleótido exógeno que codifica un tercer ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de un gen de ácido graso ®6 desaturasa (FAD6) plastidial en una semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleaginosa o semilla de cártamo correspondiente que carece del tercer polinucleótido exógeno, y en donde el tercer polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo.

En una realización,

1) el gen FAD2 es uno o más o cada uno de gen CtFAD2-1, un gen CtFAD2-2, y un gen CtFAD2-10, preferiblemente un gen CtFAD2-1 y/o un gen CtFAD2-2, y/o

2) el gen FATB es un gen CtFATB-3, y/o

3) el gen FAD6 es un gen CtFAD6.

En una realización, el contenido de aceite de la semilla de cártamo tiene uno o más o todos de las siguientes características,

a) de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 94 %, o de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 94 %, o de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 94 %, o de aproximadamente el 91 % a aproximadamente el 94 %, o de aproximadamente el 91 % a aproximadamente el 92 %, o aproximadamente el 92 %, o aproximadamente el 93 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico,

b) menos de aproximadamente el 5 %, o menos de aproximadamente el 4 %, o menos de aproximadamente el 3 %, o menos de aproximadamente el 2,75 %, o menos de aproximadamente el 2,5 %, o aproximadamente el 3 %, o aproximadamente el 2,75 %, o aproximadamente el 2,5 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico,

c) de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 15 %, o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 %, o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 7,5 %, o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 5 %, o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 3 %, o de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 3 %, o aproximadamente el 3%, o aproximadamente el 2 %, en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla son ácidos grasos poliinsaturados (PUFA),

d) menos de aproximadamente el 15 %, o menos de aproximadamente el 10 %, o menos de aproximadamente el 5 %, o menos de aproximadamente el 3 %, o menos de aproximadamente el 2,5 %, o menos de aproximadamente el 2,25 %, o aproximadamente el 3 %, o aproximadamente el 2,5 %, o aproximadamente el 2,25 %, en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido linoleico (LA),

e) de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 96 %, o de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 96 %, de o aproximadamente el 92 % a aproximadamente el 96 %, o aproximadamente el 93 %, o aproximadamente el 94 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido son ácidos grasos monoinsaturados,

f) el lípido tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de aproximadamente 0,05, o menos de aproximadamente 0,02, o menos de aproximadamente 0,015, o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,05, o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,02,

g) la ODP del contenido de aceite de la semilla es de aproximadamente 0,17 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,075 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,050 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,016, o de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,023, o es aproximadamente 0,03, o aproximadamente 0,02, o aproximadamente 0,01, y

h) el valor de PLO del contenido de aceite de la semilla es de aproximadamente 0,20 a aproximadamente 0,026, o de aproximadamente 0,020 a aproximadamente 0,2, o de aproximadamente 0,020 a aproximadamente 0,15, o de aproximadamente 0,020 a aproximadamente 0,1, o aproximadamente 0,020 y aproximadamente 0,075, o aproximadamente 0,050 y aproximadamente 0,055, o es aproximadamente 0,05, o aproximadamente 0,040, o aproximadamente 0,030, o aproximadamente 0,020.

En una realización, la etapa de extraer el aceite comprende triturar la semilla oleaginosa o la semilla de cártamo.

En otra realización más, el proceso comprende además una etapa de purificación del aceite extraído de la semilla oleaginosa o la semilla de cártamo, en donde la etapa de purificación comprende uno o más o todos del grupo que consiste en: desgomado, desodorización, decoloración, secado y/o fraccionamiento del aceite extraído, y/o eliminación de al menos algunas, preferiblemente sustancialmente todas, las ceras y/o ésteres de ceras del aceite extraído.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona una semilla oleaginosa cuyo contenido de aceite comprende, y/o que es capaz de producir una planta que produce semillas oleaginosas cuyo contenido de aceite comprende, triacilgliceroles (TAG), que consisten en ácidos grasos esterificados a glicerol, y en donde

i) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico,

ii) al menos el 95 % en peso del contenido de aceite de la semilla oleaginosa es TAG,

iii) de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 95 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla oleaginosa es ácido oleico,

iv) menos de aproximadamente el 3,1 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla oleaginosa es ácido palmítico, y

v) el contenido de aceite de la semilla oleaginosa tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de aproximadamente 0,037 y/o un valor palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente 0,063.

En una realización, la semilla oleaginosa es una semilla oleaginosa no fotosintética, preferiblemente semilla de cártamo, girasol, algodón o ricino.

En otra realización, la semilla oleaginosa comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un primer ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de un gen de A12 desaturasa (FAD2) en una semilla oleaginosa en desarrollo en relación con una semilla oleaginosa correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, y en donde el primer polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleaginosa en desarrollo.

En un aspecto adicional más, la presente descripción proporciona una semilla de cártamo cuyo contenido de aceite comprende, y/o que es capaz de producir una planta que produce semillas cuyo contenido de aceite comprende, triacilgliceroles (TAG) que consisten en ácidos grasos esterificados a glicerol, y en donde

i) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico,

ii) al menos el 95 % en peso del contenido de aceite de la semilla es TAG,

iii) de aproximadamente el 75 % a aproximadamente el 95 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico,

iv) menos de aproximadamente el 5,1 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico, y

v) el contenido de aceite de la semilla tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de aproximadamente 0,17 y/o un valor palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de aproximadamente 0,26, y

en donde la semilla de cártamo comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un primer ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de un gen de A12 desaturasa (FAD2) en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, y en donde el primer polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo.

En una realización, el contenido de aceite de la semilla de cártamo tiene una o más de las características siguientes,

b) menos de aproximadamente el 5 %, o menos de aproximadamente el 4 %, o menos de aproximadamente el 3 %, o menos de aproximadamente el 2,75 %, o menos de aproximadamente el 2,5 %, o aproximadamente el 3 %, o aproximadamente el 2,75 %, o aproximadamente el 2,5 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico.

c) de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 15 %, o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 %, o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 7,5 %, o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 5 %, o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 3 %, o de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 3 %, o aproximadamente el 3 %, o aproximadamente el 2 % en peso del peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla son ácidos grasos poliinsaturados (PUFA),

e) de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 96 %, o de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 96 %, o de aproximadamente el 92 % a aproximadamente el 96 %, o aproximadamente el 93 %, o aproximadamente el 94 %, en peso del contenido total de ácidos grasos de lípido son ácidos grasos monoinsaturados,

g) la ODP del contenido de aceite de la semilla es de aproximadamente de 0,17 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,075 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,050 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,01, o de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,016, o de aproximadamente 0,033 a aproximadamente 0,023, o es aproximadamente 0,03, o aproximadamente 0,02, o aproximadamente 0,01, y

En una realización adicional, el contenido de aceite de la semilla oleaginosa o semilla de cártamo es lípido, que se caracteriza adicionalmente por una o más de las características mencionadas anteriormente.

En otra realización, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo comprende un segundo polinucleótido exógeno que codifica un segundo ARN silenciador, que es capaz de reducir la expresión de un gen de palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) en una semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleaginosa o semilla de cártamo correspondiente que carece del segundo polinucleótido exógeno, y en donde el segundo polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo.

En una realización adicional, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo comprende un tercer polinucleótido exógeno que es capaz de reducir la expresión de un gen de ácido graso w6 desaturasa (FAD6) plastidial en una semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleaginosa o semilla de cártamo correspondiente que carece del tercer polinucleótido exógeno, y en donde el tercer polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo.

En otra realización, el primer ARN silenciador reduce la expresión de más de un gen endógeno que codifica FAD2 en una semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo y/o en donde el segundo ARN silenciador reduce la expresión de más de un gen endógeno que codifica FATB en una semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo.

En una realización adicional más, el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno están unidos covalentemente en una única molécula de ADN, opcionalmente con secuencias de ADN conectoras entre el primer, segundo y/o tercer polinucleótidos exógenos.

En otra realización, el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno están bajo el control de un único promotor de modo que, cuando el primer polinucleótido exógeno y el segundo polinucleótido exógeno y/o el tercer polinucleótido exógeno se transcriben en la semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo, el primer ARN silenciador y el segundo ARN silenciador y/o el tercer ARN silenciador están unidos covalentemente como partes de un único transcrito de ARN.

En otra realización, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo comprende un único ADN de transferencia integrado en el genoma de la semilla oleaginosa o semilla de cártamo, y en donde el único ADN de transferencia comprende el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno. Preferiblemente, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo es homocigótica para el ADN de transferencia.

En una realización, el primer ARN silenciador, el segundo ARN silenciador, y el tercer ARN silenciador se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en: un polinucleótido antisentido, un polinucleótido con sentido, un polinucleótido catalítico, un microARN y un ARN bicatenario.

En una realización adicional, uno cualquiera o más, preferiblemente todos, los promotores son específicos de semilla, y preferiblemente se expresan en el embrión de las semillas oleaginosas o semillas de cártamo en desarrollo.

En otra realización, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo comprende una o más mutaciones en uno o más genes FAD2, en donde la o las mutaciones reducen la actividad de uno o más genes FAD2 en semillas oleaginosas o semillas de cártamo en desarrollo en relación con una semilla oleaginosa o semilla de cártamo correspondiente que carece de la o las mutaciones.

En otra realización, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo comprende una mutación de un gen FAD2 en relación a un gen FAD2 de tipo salvaje en una semilla oleaginosa o semilla de cártamo correspondiente, mutación que es una deleción, una inserción, una inversión, un desplazamiento de marco, un codón de parada prematura de la traducción, o una o más sustituciones de aminoácidos no conservadoras.

En una realización adicional, la mutación es una mutación nula en el gen FAD2.

En otra realización, al menos una de las mutaciones es en un gen FAD2 que codifica más actividad de FAD2 en la semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo que carece de la o las mutaciones que cualquier otro gen FAD2 en la semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo.

En otra realización, la semilla es semilla de cártamo y el gen FAD2 es el gen CtFAD2-1. En esta realización, se prefiere también que el primer ARN silenciador sea al menos capaz de reducir la expresión de un gen CtFAD2-2.

En otra realización, la semilla es una semilla de cártamo que comprende un alelo ol del gen CtFAD2-1 o un alelo ol1 del gen CtFAD2-1, o ambos alelos. En una realización, el alelo ol o el alelo ol 1 del gen CtFAD2-1 está presente en el estado homocigoto.

En otra realización, la proteína FAD2 es indetectable en la semilla oleaginosa o semilla de cártamo.

En otra realización, la semilla es una semilla de cártamo y el primer ARN silenciador reduce la expresión de ambos genes CtFAD2-1 y CtFAD2-2.

En otra realización, la semilla es una semilla de cártamo donde

1) el gen FAD2 es uno o más de un gen CtFAD2-1, un gen CtFAD2-2, y un gen CtFAD2-10, preferiblemente un gen CtFAD2-1 y/o un gen CtFAD2-2, y/o

2) el gen FATB es un gen CtFATB-3, y/o

3) el gen FAD6 es un gen CtFAD6.

También se proporciona una planta de semilla oleaginosa o una planta de cártamo capaz de producir la semilla de la descripción.

En una realización, la planta es transgénica y homocigota para cada polinucleótido exógeno, y/o comprende el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno o el tercer polinucleótido exógeno. En otro aspecto, la presente descripción proporciona un polipéptido recombinante y/o sustancialmente purificado que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en una cualquiera de las SEQ ID NO: 27 a 37, 44, 45 o 48, un fragmento biológicamente activo de las mismas, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 27 a 37, 44, 45 o 48.

En una realización, el polipéptido que es una enzima modificadora de ácidos grasos, preferiblemente una oleato A12 desaturasa, M 2-acetilenasa, una palmitoleato A12 desaturasa o una palmitoil-ACP tioestearasa (FATB).

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado y/o exógeno que comprende uno o más de

i) nucleótidos que tienen una secuencia como se proporciona en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 25, 40 a 43, 46 o 47,

ii) nucleótidos que tienen una secuencia que codifica un polipéptido de la descripción,

iii) nucleótidos que hibridan con una secuencia como se proporciona en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 25, 40 a 43, 46 o 47, y

iv) nucleótidos que tienen una secuencia tal que cuando se expresa en una semilla de una planta de semillas oleaginosas reduce la expresión de un gen que codifica al menos un polipéptido de la descripción.

En una realización particularmente preferida, el polinucleótido comprende nucleótidos que tienen una secuencia tal que cuando se expresa en una semilla de una planta de semillas oleaginosas reduce la expresión de un gen que codifica al menos un polipéptido de la descripción.

En una realización, el polinucleótido de la parte iv) comprende una secuencia de nucleótidos proporcionada en una cualquiera de las SEQ ID NO: 49 a 51 (donde la timina (T) es uracilo (U)).

En una realización, el polinucleótidos de la parte iv) se selecciona de: un polinucleótido antisentido, un polinucleótido con sentido, un polinucleótido catalítico, un microARN, una molécula de ARN bicatenaria (ARNds) o un producto de ARN procesado de los mismos.

En una realización adicional, el polinucleótido es una molécula de ARNds, o un producto de ARN procesado de la misma, que comprende al menos 19 nucleótidos consecutivos que son al menos un 95 % idénticos al complemento de una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 1 a 25, 40 a 43, 46, 47 o 49 a 51 (donde la timina (T) es uracilo (U)).

En otra realización, la molécula de ARNds es un precursor de microARN (miARN) y/o en donde el producto de ARN procesado de la misma es un miARN.

En una realización adicional más, el polinucleótido se transcribe en una semilla oleaginosa o semilla de cártamo en desarrollo bajo el control de un único promotor, en donde la molécula de ARNds comprende secuencias complementarias con sentido y antisentido que son capaces de hibridar entre sí, unidas por una única región de ARN monocatenaria. En una realización adicional más, el polinucleótido, cuando está presente en una semilla de cártamo en desarrollo, i) reduce la expresión de un gen endógeno que codifica oleato A12 desaturasa (FAD2) en la semilla en desarrollo, FAD2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se proporciona en una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 27, 28 o 36, preferiblemente al menos una o ambas de las SEQ ID NO: 27 y 28;

ii) reduce la expresión de un gen endógeno que codifica palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) en la semilla en desarrollo, FATB que tiene una secuencia de aminoácidos como se proporciona en la SEQ ID NO: 45; y/o

iii) reduce la expresión de un gen que codifica una ácido graso ®6 desaturasa (FAD6) en la semilla en desarrollo, FAD6 que tiene una secuencia de aminoácidos como se proporciona en la SEQ ID NO: 48.

También se proporciona un vector quimérico que comprende el polinucleótido de la descripción, unido operativamente a un promotor.

En una realización, el promotor es funcional en una semilla oleaginosa, o es un promotor especifico de semilla, preferiblemente se expresada preferentemente en un embrión de una semilla oleaginosa en desarrollo.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona una célula recombinante que comprende un polinucleótido exógeno de la descripción, y/o un vector de la descripción.

La célula puede ser cualquier tipo de célula tal como, pero no se limita a, célula bacteriana, célula de levadura o célula vegetal.

Preferiblemente, la célula es una célula vegetal, preferiblemente una célula de semilla vegetal. Más preferiblemente, la célula vegetal es una célula vegetal de semilla oleaginosa. Aún más preferiblemente, la célula vegetal es una célula de semilla no fotosintética, preferiblemente una célula de semilla de cártamo, girasol, algodón o ricino.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un organismo no humano transgénico que comprende uno o más de los polinucleótidos de la descripción, un vector de la descripción, y una célula de la descripción.

Preferiblemente, el organismo no humano transgénico es una planta. Más preferiblemente, una planta de semilla oleaginosa.

En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un método para producir la célula de la descripción, método que comprende la etapa de introducir el polinucleótido de la descripción, y/o un vector de la descripción, en una célula.

También se proporciona el uso del polinucleótido de la descripción y/o un vector de la descripción para producir una célula recombinante.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para producir una planta de semilla oleaginosa transgénica que produce una semilla de la descripción, o semilla de la misma, método que comprende

i) introducir al menos un polinucleótido de la descripción y/o al menos un vector de la descripción, en una célula de una planta de semilla oleaginosa,

ii) regenerar una planta transgénica a partir de la célula, y

iii) opcionalmente, producir una o más plantas descendientes o semilla de las mismas a partir de la planta transgénica, produciendo así la planta de semilla oleaginosa transgénica o semilla de las mismas.

En una realización, la semilla es semilla de cártamo de la descripción.

En una realización adicional, la una o más plantas descendientes o semillas de las mismas comprenden

i) el primer polinucleótido exógeno, y/o

ii) el segundo polinucleótido exógeno, y/o

iii) el tercer polinucleótido exógeno,

preferiblemente, los tres polinucleótidos exógenos.

En una realización adicional, la una o más plantas descendientes o semillas de las mismas comprenden una o más mutaciones como se ha definido anteriormente.

En un aspecto adicional más, la presente descripción proporciona un método para obtener una planta de semilla oleaginosa, método que comprende

i) cruzar una primera planta de semilla oleaginosa parental que comprende un primer polinucleótido de la descripción, o un primer vector de la descripción, con una segunda planta de semilla oleaginosa parental que comprende un segundo polinucleótido de la descripción, o un primer vector de la descripción,

ii) cribar las plantas descendientes del cruce para detectar la presencia de ambos polinucleótidos o ambos vectores; y iii) seleccionar una planta descendiente que comprende ambos (a) el primer polinucleótido o el primer vector y (b) el segundo polinucleótido o el segundo vector, y que tiene adicionalmente una proporción incrementada de ácido oleico y una proporción disminuida de ácido palmítico en el contenido de aceite de la semilla de la planta.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para genotipificar una planta de cártamo, método que comprende detectar una molécula de ácido nucleico de la planta, en donde la molécula de ácido nucleico está unida a, y/o comprende al menos parte de, uno o más de los genes CtFAD2-1, CtFAD2-2 o CtFAD2-10, preferiblemente al menos uno o ambos de los genes CtFAD2-1 y CtFAD2-2, o al menos el gen CtFAD2-1, de una planta de cártamo.

En una realización, el método comprende determinar el nivel de expresión, y/o la secuencia, de uno o más de los genes CtFAD2-1, CtFAD2-2 o CtFAD2-10 de la planta.

En una realización, el método comprende:

i) hibridar una segunda molécula de ácido nucleico con dicha molécula de ácido nucleico de la planta.

ii) opcionalmente, hibridar al menos otra molécula de ácido nucleico con dicha molécula de ácido nucleico de la planta; y iii) detectar un producto de dichas etapas de hibridación o la ausencia de un producto de dichas etapas de hibridación. En una realización adicional más, la segunda molécula de ácido nucleico se usa como un cebador para la transcripción inversa o para la replicación de al menos una parte de la molécula de ácido nucleico de la planta.

El ácido nucleico puede ser detectado usando una variedad de técnicas conocidas tales como, pero no limitadas a, análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción, análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de amplificación, amplificación por microsatélite, secuenciación del ácido nucleico, y/o amplificación del ácido nucleico. En una realización, el método detecta la ausencia o presencia de un alelo del gen CtFAD2-1, preferiblemente el alelo ol. En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para seleccionar una planta de cártamo a partir de una población de plantas de cártamo, método que comprende:

i) genotipificar dicha población de plantas usando un método de la descripción, en donde dicha población de plantas se obtuvo a partir de un cruce entre dos plantas de las cuales al menos una planta comprende un alelo de un gen CtFAD2-1, CtFAD2-2 o CtFAD2-10, preferiblemente al menos uno o ambos de los genes CtFAD2-1 y CtFAD2-2, o al menos el gen CtFAD2-1, que confiere después del desarrollo de la semilla de dicha planta un nivel reducido de actividad A12 desaturasa, en relación a una semilla de una planta de cártamo correspondiente que carece de dicho alelo, y

ii) seleccionar la planta de cártamo en base a la presencia o ausencia de dicho alelo.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para introducir un alelo del gen CtFAD2-1, CtFAD2-2 o CtFAD2-10 en una planta de cártamo que carece del alelo, método que comprende;

i) cruzar una primera planta de cártamo parental con una segunda planta de cártamo parental, en donde la segunda planta comprende dicho alelo de un gen CtFAD2-1, CtFAD2-2 o CtFAD2-10, y

ii) retrocruzar la progenie del cruce de la etapa i) con plantas del mismo genotipo que la primera planta parental un número suficiente de veces como para producir una planta con una mayoría del genotipo de la primera parental pero que comprende dicho alelo,

en donde el alelo confiere después del desarrollo de la semilla de dicha planta un nivel reducido de actividad A12 desaturasa, en relación con una semilla de una planta de cártamo correspondiente que carece de dicho alelo, y en donde las plantas descendientes se genotipifican para detectar la presencia o ausencia de dicho alelo usando un método de la descripción.

También se proporciona una planta transgénica, o plantas descendientes de la misma, o semillas de la misma, producida usando el método de la descripción.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para producir semillas, método que comprende, a) crecer una planta de la descripción, preferiblemente en un campo como parte de una población de al menos 1.000 de dichas plantas, y

b) cosechar la semilla.

En un aspecto adicional más, la presente descripción proporciona aceite obtenido u obtenible mediante uno o más de los procesos de la descripción, a partir de las semillas oleaginosas o semillas de cártamo de la descripción, a partir de la planta o parte de la misma de la descripción, a partir de la célula de la descripción, y/o de los organismos no humanos transgénicos o parte de los mismos de la descripción.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona una composición que comprende uno o más de los lípidos de la descripción, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo de la descripción, el polipéptido de la descripción, el polinucleótido de la descripción, el vector de la descripción, la célula huésped de la descripción, o aceite de la descripción, y uno o más vehículos aceptables.

También se proporciona el uso de uno o más de los lípidos de la descripción, la composición de la descripción, el proceso de la descripción, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo de la descripción, la planta o parte de la misma de la descripción, la célula huésped de la descripción, el organismo no humano transgénico o parte del mismo de la descripción, o aceite de la descripción, para la fabricación de un producto industrial.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un proceso para producir un producto industrial, proceso que comprende las etapas de:

i) obtener uno o más de los lípidos de la descripción, la composición de la descripción, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo de la descripción, la planta o parte de la misma de la descripción, la célula huésped de la descripción, el organismo no humano transgénico o parte del mismo de la descripción, o aceite de la descripción,

ii) opcionalmente, procesar físicamente el uno o más de los lípidos de la descripción, la composición de la descripción, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo de la descripción, la planta o parte de la misma de la descripción, la célula huésped de la descripción, el organismo no humano transgénico o parte del mismo de la descripción, o aceite de la descripción, de la etapa i),

ii) convertir al menos parte del lípido de la descripción, o lípido en una o más de las composiciones de la descripción, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo de la descripción, la planta o parte de la misma de la descripción, la célula huésped de la descripción, el organismo no humano transgénico o parte del mismo de la descripción, o aceite de la descripción, o el producto procesado físicamente de la etapa ii), en el producto industrial aplicando calor, medios químicos, o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lípido, y

iii) recuperar el producto industrial,

produciendo así el producto industrial.

En un aspecto adicional más, la presente descripción proporciona un método para producir combustible, método que comprende

i) hacer reaccionar uno o más de los lípidos de la descripción, o el lípido en una o más de la descripción, la semilla oleaginosa o semilla de cártamo de la descripción, la planta o parte de la misma de la descripción, la célula huésped de la descripción, el organismo no humano transgénico o parte del mismo de la descripción, o aceite de la descripción, con un alcohol, opcionalmente en la presencia de un catalizador, para producir ésteres de alquilo, y

ii) opcionalmente, combinar los ésteres de alquilo con combustible basado en petróleo.

En una realización, los ésteres de alquilo son ésteres de metilo.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para producir un producto alimenticio, método que comprende mezclar uno o más de los lípidos de la descripción, la composición de la descripción, las semillas oleaginosas o semillas de cártamo de la descripción, la planta o parte de la misma de la descripción, la célula huésped según la descripción, el organismo no humano transgénico o parte del mismo de la descripción, o aceite de la descripción, con al menos otro ingrediente alimenticio.

También se proporcionan productos alimenticios, cosméticos o productos químicos que comprenden uno o más de los lípidos de la descripción, la composición de la descripción, las semillas oleaginosas o semillas de cártamo de la descripción, la planta o parte de la misma de la descripción, la célula huésped según la descripción, el organismo no humano transgénico o parte del mismo de la descripción, o aceite de la descripción.

En un aspecto adicional más, se proporciona un producto producido a partir de o usando uno o más de los lípidos de la descripción, o lípido en una o más de la composición de la descripción, el proceso de la descripción, las semillas oleaginosas o semillas de cártamo de la descripción, la planta o parte de la misma de la descripción, la célula huésped de la descripción, el organismo no humano transgénico o parte del mismo de la descripción, o aceite de la descripción.

Cualquier realización en la presente memoria se considerará para su aplicación mutatis mutandis a cualquier otra realización a no ser que se afirme específicamente otra cosa.

La presente descripción no está limitada en el alcance por las realizaciones especificas descritas en la presente memoria, que solo se pretenden con el propósito de ejemplificación. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes, están claramente en el alcance de la descripción, como se describe en la presente memoria.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a no ser que se afirme específicamente otra cosa o el contexto requiera otra cosa, se considerará que la referencia a una única etapa, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia engloba una y una pluralidad (es decir, una o más) de esas etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupo de composiciones de materia.

La descripción, de aquí en adelante en la presente memoria, se describirá mediante los siguientes Ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos adjuntos

Figura 1. Comparación filogenética de secuencias de aminoácidos codificadas por la familia de genes similares a FAD2 de cártamo y enzimas similares a FAD2 divergentes de otras plantas. El árbol filogenético mostrado fue generado usando el Vector NTI (Invitrogen). En el alineamiento, se incluyeron FAD2 desaturasas (DES), hidroxilasas (OH), epoxigenasas (EPOX) acetilenasas (ACET), y conjugasas (CONJ). Los números de acceso de GeneBank de las secuencias de aminoácidos representadas en el árbol filogenético son: coCONJ. AAK26632.1; caACET. ABC00769.1; cpEPOX, CAA76156.1; haACET, ABC59684.1; dsACET, AAO38036.1; dcACET, AAO38033.1; hhACET, AA038031.1; haDES-2, AAL68982,1; haDES-3, AAL68983.1; luDES, ACF49507; haDES-1, AAL68982.1; ntDES, AAT72296.2; oeDES, AAW63040; siDES, AAF80560.1; ghDES-1, CAA65744.1; rcOH, AAC49010.1; atDES, AAM61113.1; pfOH:DES, AAC32755.1; plOH, ABQ01458.1; ghDES-4, AAQ16653.1; ghDES-2, CAA71199.1. (co, Calendula officinalis; ca, Crepis alpine; cp, Crepis palaestina; ha, Helianthus annuus; ds, Dimorphotheca sinuate; dc, Daucus carota; hh, Hedera helix; lu, Linum usitatissimum; nt, Nícotiana tabacum; oe, Olea europaea; si, Sesamum indicum; re, Ricinus communis; at, Arabidopsís thalíana; pf, Physaria fendleri; pl, Physaría lindheimeri.

Figura 2. Análisis de hibridación por transferencia Southern de la estructura genómica similar a CtFAD2 en el genotipo SU de cártamo. El ADN genómico se digirió con ocho enzimas de restricción diferentes antes de la separación en un gel de agarosa. Estas enzimas fueron Accl (carril 1), BgIII (2), BamHI (3), EcoRI (4), EcoRV (5), HindIII (6), Xbal (7) y Xhol (8). La transferencia se ensayó con la región codificadora entera radiomarcada de CtFAD2-6 y se lavó en condiciones de baja astringencia.

Figura 3. Análisis de ácidos grasos por GC-MS de la composición de ácidos grasos a partir de levadura que expresa CtFAD2-1 (B), CtFAD2-2 (C), CtFAD2-9 (D), CtFAD2-10 (E) y CtFAD2-11 (F). Vector vacío (A) y trazas por GC de la mezcla de isómeros C18:2 (G).

Figura 4. Análisis de ácidos grasos por GC-MS de la composición de ácidos grasos después de que CtFAD2-11 se expresó transitoriamente en hojas de N. benthamiana.

Figura 5. Análisis de la expresión por RT-qPCR de genes CtFAD2 de cártamo.

Figura 6. Comparación de nucleótidos de una región de los alelos de CtFAD2-1 de SU de tipo salvaje y tres genotipos con alto contenido en oleico, concretamente S-317, CW99-OL, y Lesaf496, que mostró una deleción de nucleótidos en la parte media de la región codificadora de CtFAD2-1 en los mutantes.

Figura 7. Comparación de la secuencia de ADN de los intrones 5'UTR de CtFAD2-1 en la variedad SU de tipo salvaje y el genotipo S-317 con alto contenido en oleico. Se usaron secuencias de ADN en cajas para designar marcadores de PCR perfectos para productos de PCR específicos de alto contenido en oleico y de tipo salvaje.

Figura 8. Análisis por q-PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de CtFAD2-1 y CtFAD2-2 en embriones en desarrollo de tres estadios de desarrollo, temprano (7 DPA), medio (15 DPA) y tardío (20 DPA). Las variedades de cártamo incluyen SU de tipo salvaje, y tres variedades con alto contenido en oleico: S-317, CW99-OL y Lesaf496.

Figura 9. Análisis por qPCR en tiempo real de genes CtFatB en hoja, raíz, y embriones en desarrollo de la variedad SU de cártamo. Em-1 (estadio temprano), Em-2 (estadio medio), y Em-3 (estadio tardío).

Figura 10. Un dendrograma que muestra la relación filogenética entre las secuencias de FAD6 de cártamo y FAD6 de A12 desaturasa plastidial representativa identificada en plantas superiores. Jatropha curcas (EU106889); Olea europaea (AY733075); Populus trichocarpa (EF147523); Arabidopsis thaliana (AY079039); Descuriana sophia (EF524189); Glycine max (AK243928); Brassíca napus (L29214); Portulaca oleracea (EU376530); Arachis hypogaea (FJ768730); Ginkgo biloba (HQ694563).

Figura 11. Composición de diacilglicerol (DAG) (% en moles) en S317 frente a S317 603.9 por análisis por LS-MS de la semilla individual.

Figura 12. Composición de triacilglicerol (TAG) (% en moles) en S317 frente a S317 603.9 por análisis por LC-MS de semilla individual.

Figura 13. Contenido de ácido oleico de variedades de cártamo bajo condiciones de campo en Narrabri en el verano australiano de 2011/2012.

Figura 14. (A) estructura básica de fitoesterol con numeración de cadena lateral y anillo. (B) Estructuras químicas de algunos de los fitoesteroles.

Clave para el listado de secuencias

SEQ ID NO: 1-ADNc que codifica FAD2-1 de cártamo.

SEQ ID NO: 2-ADNc que codifica FAD2-2 de cártamo.

SEQ ID NO: 3-ADNc que codifica FAD2-3 de cártamo.

SEQ ID NO: 4 - ADNc que codifica FAD2-4 de cártamo.

SEQ ID NO: 5-ADNc que codifica FAD2-5 de cártamo.

SEQ ID NO: 6-ADNc que codifica FAD2-6 de cártamo.

SEQ ID NO: 7-ADNc que codifica FAD2-7 de cártamo.

SEQ ID NO: 8-ADNc que codifica FAD2-8 de cártamo.

SEQ ID NO: 9-ADNc que codifica FAD2-9 de cártamo.

SEQ ID NO: 10-ADNc que codifica FAD2-10 de cártamo.

SEQ ID NO: 11-ADNc que codifica FAD2-11 de cártamo.

SEQ ID NO: 12-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-1 de cártamo.

SEQ ID NO: 13-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-2 de cártamo.

SEQ ID NO: 14-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-3 de cártamo.

SEQ ID NO: 15-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-4 de cártamo.

SEQ ID NO: 16-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-5 de cártamo.

SEQ ID NO: 17-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-6 de cártamo.

SEQ ID NO: 18-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-7 de cártamo.

SEQ ID NO: 19-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-8 de cártamo.

SEQ ID NO: 20-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-9 de cártamo.

SEQ ID NO: 21-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-10 de cártamo.

SEQ ID NO: 22-Marco de lectura abierto que codifica FAD2-11 de cártamo.

SEQ ID NO: 23-Secuencia intrónica del gen FAD2-1 de cártamo.

SEQ ID NO: 24-Secuencia intrónica del gen FAD2-2 de cártamo.

SEQ ID NO: 25-Secuencia intrónica del gen FAD2-10 de cártamo.

SEQ ID NO: 26-ADNc que codifica FAD2-1 de cártamo truncado (mutante HO).

SEQ ID NO: 27-FAD2-1 de cártamo.

SEQ ID NO: 28-FAD2-2 de cártamo.

SEQ ID NO: 29-FAD2-3 de cártamo.

SEO ID NO: 30-FAD2-4 de cártamo.

SEQ ID NO: 31-FAD2-5 de cártamo.

SEQ ID NO: 32-FAD2-6 de cártamo.

SEQ ID NO: 33-FAD2-7 de cártamo.

SEQ ID NO: 34-FAD2-8 de cártamo.

SEQ ID NO: 35-FAD2-9 de cártamo.

SEQ ID NO: 36-FAD2-10 de cártamo.

SEQ ID NO: 37-FAD2-11 de cártamo.

SEQ ID NO: 38-FAD2-1 de cártamo truncado (mutante HO).

SEQ ID NO: 39-ADNc de FATB-1 de cártamo.

SEQ ID NO: 40-ADNc que codifica FATB-2 de cártamo.

SEQ ID NO: 41-ADNc que codifica FATB-3 de cártamo.

SEQ ID NO: 42-Marco de lectura abierto que codifica FATB-2 de cártamo.

SEQ ID NO: 43-Marco de lectura abierto que codifica FATB-3 de cártamo.

SEQ ID NO: 44-FATB-2 de cártamo.

SEQ ID NO: 45-FATB-3 de cártamo.

SEQ ID NO: 46-ADNc que codifica FAD6 de cártamo.

SEQ ID NO: 47-Marco de lectura abierto que codifica FAD6 de cártamo.

SEQ ID NO: 48-FAD6 de cártamo.

SEQ ID NO: 49 -Secuencia de CtFAD2-2 usada en la construcción silenciadora de ARN.

SEQ ID NO: 50-Secuencia de CtFATB-3 usada en la construcción silenciadora de ARN.

SEQ ID NO: 51-Secuencia de CtFAD6 usada en la construcción silenciadora de ARN.

SEQ ID NO: 52-Promotor de oleosina de Arabidopsis thaliana.

SEQ ID NO: 53-Promotor de linina de lino.

SEQ ID NO. 54-Señal de poliadenilación de Nos.

SEQ ID NO: 55-Señal de poliadenilación de Ocs.

SEQ ID NO: 56-Secuencia de CtFAD2-1 de tipo salvaje correspondiente a la región del alelo ol.

SEQ ID NO: 57-Secuencia del alelo ol de CtFAD2-1 con desplazamiento de marco (los mismo para S-317, CW99-OL y LeSaf496).

SEQ ID NO: 58 a 158-Cebadores oligonucleotídicos.

SEQ ID NO: 159 a 169-Restos de enzimas CtFAD2.

SEQ ID NO: 170-Intrón 5'UTR de CtFAD2-1 de la variedad SU de cártamo de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 171-Intrón 5'UTR de CtFAD2-1 de la variedad S-317 de cártamo con alto contenido en ácido oleico.

Descripción detallada de la descripción

Definiciones y Técnicas Generales

A no ser que se defina específicamente otra cosa, se considerará que todos los términos científicos y técnicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica (p. ej., en cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas, y bioquímica).

A no ser que se indique otra cosa, las técnicas de proteína recombinante, cultivo celular, e inmunológicas utilizadas en la presente descripción son procedimientos estándar, bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican en la bibliografía en fuentes tales como J. Perbal; A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Sprinq Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores). DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL, Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta la fecha), Ed Harlow and David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta la fecha).

El término "y/o", p. ej., "X y/o Y" debe entenderse que significa ya sea "X e Y" o "X o Y" y se considerará que proporciona apoyo explícito para ambos significados o para uno u otro significado.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente", a menos que se afirme lo contrario, se refiere a /- 10 %, más preferiblemente /- 5 %, más preferiblemente /- 4 %, más preferiblemente /- 3 %, más preferiblemente /- 2 %, más preferiblemente /- 1,5 %, más preferiblemente /- 1 %, aún más preferiblemente /- 0,5 %, del valor designado.

A lo largo de esta memoria descriptiva, la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa afirmada, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "lípido extraído" se refiere a una composición lipídica que comprende al menos un 60 % (p/p) de lípido y que ha sido extraído, por ejemplo, por trituración, de un organismo transgénico o parte del mismo. Además, tal y como se usa en la presente memoria, el término "aceite extraído" se refiere a una composición de aceite que comprende al menos un 60 % (p/p) de aceite y que ha sido extraído de un organismo transgénico o parte del mismo.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "purificado" cuando se usa en conexión con lípido o aceite de la descripción, típicamente significa que el lípido o aceite extraído ha sido sometido a una o más etapas de procesamiento para incrementar la pureza del componente de lípido/aceite. Por ejemplo, una etapa de purificación puede comprender uno o más o todos del grupo que consiste en: desgomado, desodorización, decoloración, secado y/o fraccionamiento del aceite extraído. Sin embargo, tal y como se usa en la presente memoria, el término "purificado" no incluye un proceso de transesterificación u otro proceso que altere la composición de ácidos grasos del lípido o aceite de la descripción para así incrementar el contenido de ácido oleico como un porcentaje del contenido total de ácidos grasos. Expresado en otras palabras, la composición de ácidos grasos del lípido o aceite purificado es esencialmente la misma que la del aceite o lípido sin purificar. La composición de ácidos grasos del aceite o lípido extraído, tal como, por ejemplo, los contenidos de ácido oleico, linoleico y palmítico, es esencialmente la misma que la composición de ácidos grasos del lípido o aceite en la semilla de la planta de que se obtiene. En este contexto, "esencialmente la misma" significa /- 1 %, o, preferiblemente, /- 0,5 %.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "proporción de desaturación oleica" u "ODP" se refiere a un cálculo que implica dividir la cantidad relativa de ácido linoleico y ácido a-linolénico expresada como un porcentaje de la composición de ácidos grasos del lípido por la suma de las cantidades relativas de ácido oleico, ácidos linoleico y alinolénico, expresado cada uno como porcentajes. La fórmula es:

ODP = (% de linoleico % de a -linolénico) / (% de oleico % de linoleico % de a -linolénico)

Por ejemplo, TG603.12(5) del Ejemplo 15 tiene un contenido total de ácido linoleico y ácido a -linolénico del 2,15 % y un contenido de ácido linoleico, ácido a -linolénico, ácido oleico del 93,88 % haciendo que la ODP sea 0,0229.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "valor palmítico-linoleico-oleico" o "PLO", se refiere a un cálculo que implica dividir la cantidad relativa de ácido linoleico y ácido palmítico expresada como un porcentaje de la composición de ácidos grasos del lípido por la cantidad relativa de ácido oleico expresada como un porcentaje. La fórmula es:

PLO = (% de palmítico % de linoleico) / % de oleico

Por ejemplo, TG603.12(5) del Ejemplo 15 tiene un contenido total de ácido linoleico y ácido palmítico del 4,71 % y un contenido de ácido oleico del 91,73 % haciendo que la PLO sea 0,0513.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "proporción de monoinsaturación oleica" u "OMP" se refiere a un cálculo que implica dividir la cantidad relativa de ácidos grasos monoinsaturados no oleicos expresada como un porcentaje de la composición de ácidos grasos del lípido por la cantidad relativa de ácido oleico expresada como un porcentaje. La fórmula es:

OMP = (% de ácidos grasos monoinsaturados-% de oleico) / % de oleico

Por ejemplo, TG603.12(5) del Ejemplo 15 tiene un contenido total de ácidos grasos monoinsaturados excluyendo el ácido oleico (0,84 % de C18:1A11 0,29 % de C20:1) del 1,13 % y un contenido de ácido oleico del 91,73 % haciendo que la OMP sea 0,0123.

El término "correspondiente" se refiere a una célula, o planta o parte de la misma (tal como una semilla) que tiene el mismo o similar fondo genético que una célula, o planta o parte de la misma (semilla) de la descripción pero que no ha sido modificada como se describe en la presente memoria (por ejemplo, la célula, o planta o parte de la misma carece de un polinucleótido exógeno de la descripción). Una célula o planta o parte de la misma (semilla) correspondiente puede usarse como un control para comparar, por ejemplo, una o más de la cantidad de ácido oleico producido, actividad FAD2, actividad FATB o actividad FAD6 con una célula, o planta o parte de la misma (semilla) modificada como se describe en la presente memoria. Un experto en la técnica es capaz de determinar fácilmente una célula, planta o parte de la misma (semilla) "correspondiente" apropiada para dicha comparación.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aceite de semilla" se refiere a una composición obtenida a partir de la semilla de una planta que comprende al menos un 60 % (p/p) de lípido, u obtenible a partir de la semilla si el aceite de semilla está aún presente en la semilla. Esto es, aceite de semilla de, u obtenido usando, la descripción incluye el aceite de semilla que está presente en la semilla o parte de la misma tal como cotiledones o embriones, a no ser que se refiera como "aceite de semilla extraído" o términos similares en cuyo caso es aceite que ha sido extraído de la semilla. El aceite de semilla es preferiblemente aceite de semilla extraído. El aceite de semilla es típicamente un líquido a temperatura ambiente. Preferiblemente, el contenido total de ácidos grasos (TFA) en el aceite de semilla es > 70 % de ácidos grasos C18, preferiblemente >90 % de ácido oleico (C18:1A9). Los ácidos grasos están típicamente en una forma esterificada tal como, por ejemplo, TAG, DAG, acil-CoA o fosfolípidos. A no ser que se afirme otra cosa, los ácidos grasos pueden ser ácidos grasos libres y/o en una forma esterificada. En una realización, al menos el 50 %, más preferiblemente al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 91 %, más preferiblemente al menos el 92 %, más preferiblemente al menos el 93 %, más preferiblemente al menos el 94 %, más preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 96 %, más preferiblemente al menos el 97 %, más preferiblemente al menos el 98 %, más preferiblemente al menos el 99 % de los ácidos grasos en el aceite de semilla de la descripción se puede encontrar como TAG. En una realización, el aceite de semilla de la descripción es aceite "sustancialmente purificado" o "purificado" que ha sido separado de uno o más de otros lípidos, ácidos nucleicos, polipéptidos u otras moléculas contaminantes con las cuales está asociado en la semilla o en un extracto crudo. Se prefiere que el aceite de semilla sustancialmente purificado esté al menos un 60 % libre, más preferiblemente al menos un 75 % libre, y más preferiblemente, al menos un 90 % libre de otros componentes con los cuales está asociado en la semilla o extracto. El aceite de semilla de la descripción puede comprender adicionalmente moléculas que no son ácidos grasos tales como, pero no limitadas a, esteroles (véase el Ejemplo 17). En una realización, el aceite de semilla es aceite de cártamo (Carthamus tinctorius), aceite de girasol (Helianthus annus), aceite de algodón (Gossypium hirsutum), aceite de ricino (Ricinus communis), aceite de canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), aceite de mostaza (Brassica juncea), otros aceites de Brassica (p. ej., Brassica napobrassica, Brassica camelina), aceite de semilla de lino (Linum usitatissimum), aceite de soja (Glycine max), aceite de maíz (Zea mays), aceite de tabaco (Nicotiana tabacum), aceite de cacahuete (Arachis hypogaea), aceite de palma (Elaeis guineensis), aceite de coco (Cocos nucifera), aceite de aguacate (Persea americana), aceite de oliva (Olea europaea), aceite de anacardo (Anacardium occidentale), aceite de macadamia (Macadamia intergrifolia), aceite de almendra (Prunus amygdalus), aceite de semilla de avena (Avena sativa), aceite de arroz (Oryza sativa u Oryza glaberrima), aceite de camelina (Camelina sativa), aceite de crambe (Crambe abyssinica) o aceite de semilla de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). El aceite de semilla puede extraerse de la semilla por cualquier método conocido en la técnica. Esto implica típicamente la extracción con disolventes no polares tales como hexano, éter dietílico, éter de petróleo, mezclas de cloroformo/metanol o butanol, generalmente asociados con triturar o amasar en primer lugar las semillas. Lípidos asociados con el almidón en el grano pueden extraerse con butanol saturado de agua. El aceite de la semilla puede ser "desgomado" por métodos conocidos en la técnica para eliminar polisacáridos y/o fosfolípidos o tratado de otras maneras para eliminar contaminantes o mejorar la pureza, estabilidad, o color. Los TAG y otros ésteres en el aceite de semilla pueden hidrolizarse para liberar los ácidos grasos libres tal como por tratamiento ácido o alcalino o mediante la acción de lipasas, o el aceite de semilla se puede hidrogenar, tratar químicamente, o enzimáticamente como se conoce en la técnica. Sin embargo, una vez que el aceite de la semilla es procesado de modo que no comprenda más el TAG, no se considera más aceite de semilla como se refiere en la presente memoria.

Las concentraciones de esterol libre y esterificado (por ejemplo, sitoesterol, campesterol, estigmaesterol, brassicaesterol, A5-avenaesterol, sitostanol, campestanol, y colesterol) en el aceite o lípido extraído y/o purificado puede ser como se describe en Phillips et al. (2002) y/o como se proporciona en el Ejemplo 17. Los esteroles en aceites de plantas están presentes como alcoholes libres, ésteres con ácidos grasos (esteroles esterificados), glicósidos y glicósidos acilados de esteroles. Las concentraciones de esterol en aceites de plantas naturales (aceites de semillas) varían hasta un máximo de aproximadamente 1.100 mg/100 g. El aceite de palma hidrogenado tiene una de las concentraciones más bajas de aceites de plantas naturales a aproximadamente 60 mg/100 g. Los aceites de semillas de la descripción extraídos o recuperados preferiblemente tienen entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1.000 mg de esterol total/100 g de aceite. Para su uso como alimento o pienso, se prefiere que los esteroles estén presentes principalmente como formas esterificadas o libres en lugar de formas glicosiladas. En los aceites de semillas de la presente descripción, preferiblemente al menos un 50 % de los esteroles en los aceites están presentes como esteroles esterificados, excepto para el aceite de semilla de soja, que tiene aproximadamente un 25 % de los esteroles esterificados. El aceite de semilla de cártamo de la descripción preferiblemente tiene entre aproximadamente 150 y aproximadamente 400 mg de esterol total/100 g, típicamente aproximadamente 300 mg de esterol total/100 g de aceite de semilla, con el sitoesterol como el esterol principal. El aceite de semilla de canola y el aceite de semilla de colza de la descripción, preferiblemente tienen entre aproximadamente 500 y aproximadamente 800 mg de esterol total/100 g, con el sitoesterol como el esterol principal y el campesterol como el siguiente más abundante. El aceite de semilla de maíz de la descripción preferiblemente tiene entre aproximadamente 600 y aproximadamente 800 mg de esterol total/100 g, con el sitoesterol como el esterol principal. El aceite de semilla de soja de la descripción, preferiblemente tiene entre aproximadamente 150 y aproximadamente 350 mg de esterol total/100 g, con el sitoesterol como el esterol principal y el estigmaesterol como el siguiente más abundante, y con más esterol libre que esterol esterificado. El aceite de semilla de algodón de la descripción preferiblemente tiene entre aproximadamente 200 y aproximadamente 350 mg de esterol total /100 g, con el sitoesterol como el esterol principal. El aceite de coco y el aceite de palma de la descripción preferiblemente tienen entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 mg de esterol total/100 g, con el sitoesterol como el esterol principal. El aceite de semilla de cacahuate de la descripción, preferiblemente tiene entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 mg de esterol total/100 g, con el sitoesterol como el esterol principal. El aceite de semilla de sésamo de la descripción, preferiblemente tiene entre aproximadamente 400 y aproximadamente 600 mg de esterol total/100g, con el sitoesterol como el esterol principal. El aceite de semilla de girasol de la descripción, preferiblemente tiene entre aproximadamente 200 y 400 mg de esterol total/100 g, con el sitoesterol como el esterol principal.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "ácido graso" se refiere a un ácido carboxílico con una cola alifática larga de al menos 8 átomos de carbono de longitud, ya sea saturada o insaturada. Típicamente, los ácidos grasos tienen una cadena unida carbono-carbono de al menos 12 carbonos de longitud. La mayoría de los ácidos grasos naturales tiene un número par de átomos de carbono, porque su biosíntesis implica acetato que tiene dos átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden estar en un estado libre (no esterificado) o en una forma esterificada tal como parte de un TAG, DAG, MAG, acil-CoA (tio-éster) unido, u otra forma unida covalentemente. Cuando está unido covalentemente en una forma esterificada, el ácido graso se refiere en la presente memoria como un grupo "acilo". El ácido graso puede estar esterificado como un fosfolípido tal como una fosfati di l col i na (PC), fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, o difosfatidilglicerol. Los ácidos grasos saturados no contienen ningún enlace doble u otros grupos funcionales a lo largo de la cadena. El término "saturado" se refiere a hidrógeno, en que todos los carbonos (aparte del grupo ácido carboxílico [-COOH]) contienen tantos hidrógenos como sea posible. En otras palabras, el extremo omega (w) contiene 3 hidrógenos (CH3-) y cada carbono en la cadena contiene 2 hidrógenos (-CH2-). Los ácidos grasos insaturados tienen una forma similar a los ácidos grasos saturados, excepto que uno o más grupos funcionales alqueno existen a lo largo de la cadena, con cada alqueno que sustituye a una parte "-CH2-CH2-" con enlace sencillo de la cadena con una parte "-CH=CH-" con enlace doble (esto es, un carbono unido con enlace doble a otro carbono). Los dos átomos de carbono siguientes en la cadena que están unidos a cada lado del doble enlace pueden aparecer en una configuración cis o trans.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "ácido graso poliinsaturado" o "PUFA" se refieren a un ácido graso que comprende al menos 12 átomos de carbono en su cadena carbonada y al menos dos grupos alqueno (enlace dobles carbono-carbono).

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "ácidos grasos monoinsaturados" se refiere a ácidos grasos que tienen un único enlace doble en su cadena acilo, tal como ácido oleico (C18:1A9), C18:1D11 y C20:1.

"Triacilglicérido" o "TAG" es glicérido en que el glicerol está esterificado con tres ácidos grasos. En la ruta de Kennedy de la síntesis de TAG, el DAG se forma como se ha descrito anteriormente, y después se esterifica un tercer grupo acilo a la estructura principal de glicerol mediante la actividad de DGAT. Las rutas alternativas para la formación de tAg incluyen una catalizada por la enzima PDAT y la ruta de MGAT (PCT/AU2011/000794).

"Diacilglicérido" o "DAG" es glicérido en el que el glicerol está esterificado con dos ácidos grasos. Tal y como se usa en la presente memoria, DAG comprende un grupo hidroxilo en una posición sn-1,3 o sn-1,2/2,3, y por consiguiente DAG no incluye moléculas fosforiladas tales como PA o PC. DAG es así un componente de los lípidos neutros en una célula. En la ruta de Kennedy de la síntesis de DAG, el precursor sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P) se esterifica a dos grupos acilo, cada uno procedente de un éster de coenzima A de ácido graso, en una primera reacción catalizada por una glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT) en la posición sn-1 para formar LisoPA, seguido por una segunda acilación en la posición sn-2 catalizada por una ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT) para formar ácido fosfatídico (PA). Este intermedio se desfosforila entonces para formar DAG. En una ruta anabólica alternativa, se puede formar DAG por la acilación ya sea de sn-1 MAG o bien preferiblemente sn-2 MAG, catalizada por MGAT. DAG también se puede formar a partir de tAg por la eliminación de un grupo acilo mediante una lipasa, o a partir de PC, esencialmente por la eliminación de un grupo de cabeza colina mediante cualquiera de las enzimas CPT, PDCT o PLC.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "desaturasa" se refiere a una enzima que es capaz de introducir un enlace doble carbono-carbono en el grupo acilo de un sustrato de ácido graso, que está típicamente en una forma esterificada tal como, por ejemplo, ésteres de CoA de ácido graso. El grupo acilo puede esterificarse a un fosfolípido tal como fosfatidilcolina (PC), o a una proteína portadora de acilo (ACP), a CoA, o en una realización preferida a Pc . Por consiguiente, las desaturasas, generalmente, pueden ser categorizadas en tres grupos. En una realización, la desaturasa es una desaturasa de partida.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "A12 desaturasa" y "FAD2" se refieren a una ácido graso A12 desaturasa unida a membrana que efectúa una reacción desaturasa que convierte ácido oleico (18:1A9) a ácido linoleico (C18:2A912). Por consiguiente, el término "actividad A12 desaturasa" se refiere a la conversión de ácido oleico a ácido linoleico. Estos ácidos grasos pueden estar en una forma esterificada, tal como, por ejemplo, como parte de un fosfolípido, preferiblemente en la forma de PC. En una realización, una enzima FAD2 como se define en la presente memoria comprende tres restos ricos en histidina (cajas de His) (véase la Tabla 5 para ejemplos de cajas de His de enzimas de la descripción). Dichos restos ricos en His están altamente conservados en enzimas FAD2 y han sido implicados en la formación del complejo dihierro-oxígeno usado en catálisis bioquímica (Shanklin et al., 1998).

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "FAD2-1" y "CtFAD2-1" y variaciones de los mismos se refieren a un polipéptido FAD2 de cártamo cuya secuencia de aminoácidos se proporciona como SEQ ID NO: 27, tal como un polipéptido codificado por nucleótidos que tienen una secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 12. Tal y como se usa en la presente memoria, un gen FAD2-1 es un gen que codifica dicho polipéptido o un alelo mutante del mismo. Estos términos también incluyen variantes naturales o producidas o inducidas artificialmente de las secuencias proporcionadas. En una realización, FAD2-1 de la descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica, más preferiblemente al menos un 99 % idéntica, a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 27. Los genes CtFAD2-1 incluyen alelos que son mutantes, esto es, que codifican polipéptidos con actividad desaturasa alterada tal como actividad reducida, o no codifican polipéptidos funcionales (alelos nulos). Dichos alelos pueden ser naturales o ser inducidos por mutagénesis artificial. Un ejemplo de dicho alelo es el alelo ol de FAD2-1 descrito en la presente memoria.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "FAD2-2" y CtFAD2-2" y variaciones de los mismos se refieren a un polipéptido FAD2 de cártamo cuya secuencia de aminoácidos se proporciona como SEQ ID NO: 28, tal como un polipéptido codificado por nucleótidos que tienen una secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 13. Tal y como se usa en la presente memoria, un gen FAD2-2 es un gen que codifica dicho polipéptido o un alelo mutante del mismo. Estos términos también incluyen variantes naturales o producidas o inducidas artificialmente de las secuencias proporcionadas. En una realización, FAD2-2 de la descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica, más preferiblemente al menos un 99 % idéntica, a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 28. Los genes CtFAD2-2 incluyen alelos que son mutantes, esto es, que codifican polipéptidos con actividad desaturasa alterada tal como actividad reducida, o no codifican polipéptidos funcionales (alelos nulos). Dichos alelos pueden ser naturales o ser inducidos por mutagénesis artificial.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "FAD2-10" y CtFAD2-10" y variaciones de los mismos se refieren a un polipéptido FAD2 de cártamo cuya secuencia de aminoácidos se proporciona como SEQ ID NO: 36, tal como un polipéptido codificado por nucleótidos que tienen una secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 21. Tal y como se usa en la presente memoria, un gen FAD2-10 es un gen que codifica dicho polipéptido o un alelo mutante del mismo. Estos términos también incluyen variantes naturales o producidas o inducidas artificialmente de las secuencias proporcionadas. En una realización, FAD2-10 de la descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica, más preferiblemente al menos un 99 % idéntica, a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 36. Los genes CtFAD2-10 incluyen alelos que son mutantes, esto es, que codifican polipéptidos con actividad desaturasa alterada tal como actividad reducida, o no codifican polipéptidos funcionales (alelos nulos). Dichos alelos pueden ser naturales o ser inducidos por mutagénesis artificial.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "palmitoil-ACP tioestearasa" y "FATB" se refiere a una proteína que hidroliza palmitoil-ACP para producir ácido palmítico libre. Por consiguiente, el término "actividad palmitoil-ACP tioestearasa" se refiere a la hidrólisis de palmitoil-ACP para producir ácido palmítico libre.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "FATB-3" y CtFATB-3" y variaciones de los mismos se refieren a un polipéptido FATB de cártamo, cuya secuencia de aminoácidos se proporciona como SEQ ID NO: 45, tal como un polipéptido codificado por nucleótidos que tienen una secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 43. Tal y como se usa en la presente memoria, un gen FATB-3 es un gen que codifica dicho polipéptido o un alelo mutante del mismo. Estos términos también incluyen variantes naturales o producidas o inducidas artificialmente de las secuencias proporcionadas. En una realización, FATB-3 de la descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica, más preferiblemente al menos un 99 % idéntica, a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 45. Los genes CtFATB-3 incluyen alelos que son mutantes, esto es, que codifican polipéptidos con actividad palmitoil-ACP tioestearasa alterada tal como actividad reducida, o no codifican polipéptidos funcionales (alelos nulos). Dichos alelos pueden ser naturales o ser inducidos por mutagénesis artificial.

Tal y como se usa en la presente memoria, "ácido graso w6 desaturasa plastidial", variaciones de la misma, y "FAD6", se refiere a una enzima de cloroplasto que desatura ácidos grasos 16:1 y 18:1 a 16:2 y 18:2, respectivamente, en todos los lípidos de membrana cloroplástica que contienen 16:1 o 18:1 incluyendo fosfatidilglicerol, monogalactosildiacilglicerol, digalactosildiacilglicerol, y sulfoguinovosildiacilglicerol.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "FAD6" y CtFAD6" y variaciones de los mismos se refieren a un polipéptido FAD6 de cártamo cuya secuencia de aminoácidos se proporciona como SEQ ID NO: 48, tal como un polipéptido codificado por nucleótidos que tienen una secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 47. Tal y como se usa en la presente memoria, un gen FAD6 es un gen que codifica dicho polipéptido o un alelo mutante del mismo. Estos términos también incluyen variantes naturales o producidas o inducidas artificialmente de las secuencias proporcionadas. En una realización, FAD6 de la descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica, más preferiblemente al menos un 99 % idéntica, a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 48. Los genes CtFAD6 incluyen alelos que son mutantes, esto es, que codifican polipéptidos con actividad desaturasa alterada tal como actividad reducida, o no codifican polipéptidos funcionales (alelos nulos). Dichos alelos pueden ser naturales o ser inducidos por mutagénesis artificial.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "acetilenasa" o "ácido graso acetilenasa", se refiere a una enzima que introduce un enlace triple en un ácido graso, dando como resultado la producción de un ácido graso acetilénico.

El término "Ct" se usa en la presente memoria antes de términos tales como FAD2, FATB y FAD6 para indicar que la enzima/gen es de cártamo.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "ARN silenciador que es capaz de reducir la expresión de" y variantes del mismo, se refiere a un polinucleótido que codifica una molécula de ARN que reduce (regula a la baja) la producción y/o actividad (por ejemplo, que codifica un ARNsi, hpARNi), o él mismo regula a la baja la producción y/o actividad (por ejemplo, es un ARNsi que puede ser administrado directamente a, por ejemplo, una célula) de una enzima endógena, por ejemplo, una A12 desaturasa, una palmitoil-ACP tioestearasa, una ácido graso ®6 desaturasa plastidial, o una combinación de dos o más o las tres de las mismas. En una realización, el ARN silenciador es un ARN exógeno que se produce a partir de un transgén en la célula y que reduce transcripcional y/o postranscripcionalmente la cantidad de la enzima endógena que se produce en la célula, tal como reduciendo la cantidad de ARNm que codifica la enzima endógena o reduciendo su traducción. El ARN silenciador es típicamente un ARN de 21-24 nucleótidos de longitud, que es complementario al ARNm endógeno y que puede estar asociado con un complejo silenciador conocido como RISC en la célula.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "mutación o mutaciones reducen la actividad de", se refiere a mutantes naturales o hechos por el hombre (tales como los producidos por mutagénesis química o mutagénesis específica de sitio) que tienen niveles más bajos de la actividad enzimática definida (por ejemplo, actividad enzimática FAD2 en la semilla) en comparación con las semillas fenotípicamente normales (por ejemplo, semillas que producen enzimas FAD2 que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas como SEQ ID NO: 27, 28 y 36). Los ejemplos de variedades de cártamo fenotípicamente normales incluyen, pero no están limitadas a, Centennial, Finch, Nutrasaff y Cardinal. El primer rasgo de alto contenido en oleico identificado en cártamo, encontrado en una introducción de cártamo procedente de la India, estaba controlado mediante un alelo parcialmente recesivo designado ol en un único locus OL (Knowles y Hill, 1964). Como se describe en la presente memoria, el locus OL corresponde al gen CtFAD2-1. El contenido de ácido oleico del aceite de semilla en genotipos olol fue usualmente el 71-75 % para plantas cultivadas en invernadero (Knowles, 1989). Knowles (1968), incorporó el alelo ol en un programa de reproducción de cártamo y se lanzó la primera variedad de cártamo con alto contenido en oleico (HO) "UC-1" en 1966 en los EE. UU., que fue seguida por el lanzamiento de variedades mejoradas "Oleic Leed" y la serie Saffola que incluyen Saffola 317 (S-317), S-517 y S-518. Los genotipos con alto contenido de oleico (olol) fueron relativamente estables en el nivel de oleico cuando se cultivaron a diferentes temperaturas en el campo (Bartholomew, 1971). Además, Knowles (1972) también describió un alelo oh diferente; en el mismo locus, que produjo en condiciones homocigotas entre el 35 y el 50 % de ácido oleico. A diferencia del genotipo olol, el genotipo ohoh mostró una fuerte respuesta a la temperatura (Knowles, 1972). Como se determina en la presente memoria, el alelo de la mutación ol que confiere actividad FAD2-1 reducida (y actividad FAD2 total) en semilla de cártamo, es un gen FAD2-1 mutante que comprende la mutación de desplazamiento de marco (debida a la deleción de un único nucleótido) presentado en la Figura 6 (véase también el Ejemplo 7 y las SEQ ID NO 26 y 38).

Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "que es capaz de producir una planta que produce semillas cuyo contenido de aceite comprende" o "que es capaz de producir una planta que produce semillas oleaginosas cuyo contenido de aceite" o variaciones de las mismas significa que la planta producida a partir de la semilla, preferiblemente una planta de semilla oleaginosa y más preferiblemente una planta de cártamo, tiene la capacidad de producir el aceite con los componentes definidos cuando se cultiva bajo condiciones óptimas, por ejemplo, en condiciones de invernadero tal como las mencionadas en los Ejemplos. Cuando se está en posesión de una semilla procedente de una planta, es rutinario cultivar una planta descendiente a partir de al menos una de las semillas bajo condiciones de invernadero adecuadas y ensayar el contenido de aceite y composición de ácidos grasos en el aceite de la semilla procedente de la planta descendiente usando procedimientos estándar tales como los descritos en la presente memoria. Por consiguiente, como entenderá el experto, mientras que el cultivo de semillas en un campo no puede satisfacer todos los requerimientos definidos en la presente memoria debido a condiciones desfavorables en un año particular tales como estés por calor, frío, sequías, inundaciones, heladas, plagas, etc, no obstante, dichas semillas están englobadas por la presente descripción porque la semilla es capaz de producir una planta descendiente que produce el contenido de aceite o la composición de ácidos grasos definidos cuando se cultivan bajo condiciones más favorables.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "en peso" se refiere al peso de una sustancia (por ejemplo, ácido oleico, ácido palmítico o PUFA tal como ácido linoleico o ácido linolénico) como un porcentaje del peso de la composición que comprende la sustancia o un componente en la composición. Por ejemplo, el peso de un ácido graso particular tal como ácido oleico puede ser determinado como un porcentaje del peso del contenido total de ácidos grasos del lípido o aceite de la semilla, o la semilla.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "biocombustible" se refiere a cualquier tipo de combustible, típicamente como se usa para maquinaria de energía tales como automóviles, camiones o motores impulsados por petróleo, cuya energía se deriva de la fijación de carbón biológico en lugar de combustibles fósiles. Los biocombustibles incluyen combustibles derivados de la conversión de biomasa, así como también biomasa sólida, combustibles líquidos y biogases. Los ejemplos de biocombustibles incluyen bioalcoholes, biodiésel, diésel sintético, aceite vegetal, bioéteres, biogás, gas de síntesis, biocombustibles sólidos, combustible derivado de algas, biohidrógeno, biometanol, 2,5-dimetilfurano (DMF), éter biodimetílico (bioDME), diésel de Fischer-Tropsch, diésel biohidrogenado, alcoholes mixtos y diésel de madera.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "producto industrial" se refiere a un producto hidrocarbonado que está compuesto predominantemente de carbono e hidrógeno tal como ésteres metílicos y/o etílicos de ácidos grasos tales como metano, mezclas de alcanos de cadena más larga, que son típicamente líquidos a temperatura ambiente, un biocombustible, monóxido de carbono y/o hidrógeno o un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, o biocarbón. El término "producto industrial" se pretende que incluya productos intermedios que pueden ser convertidos en otros productos industriales, por ejemplo, el singás se considera en sí un producto industrial que puede ser usado para sintetizar un producto hidrocarbonado que también se considera un producto industrial. El 'término producto industrial tal y como se usa en la presente memoria incluye tanto formas puras de los compuestos anteriores, o más comúnmente una mezcla de varios compuestos y componentes, por ejemplo, el producto hidrocarbonado puede contener un rango de longitudes de cadenas carbonadas, como se entiende bien en la técnica.

Polinucleótidos

Los términos "polinucleótido, y "ácido nucleico" se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos. Un polinucleótido de la descripción puede ser de origen genómico ADNc, semisintético, o sintético, bicatenario o monocatenario y en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido diferente a aquel al cual está unido en la naturaleza o (3) no es natural. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definido a partir del análisis de ligamiento, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosómico (ARNr), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, ADN quimérico de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Los polinucleótidos preferidos de la descripción incluyen moléculas de ADN bicatenarias que son capaces de ser transcritas en células de plantas y moléculas de ARN silenciador.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "gen" debe considerarse en su contexto más amplio e incluye las secuencias de desoxirribonucleótido que comprenden la región transcrita y, si es traducido, la región codificadora de la proteína, de un gen estructural y que incluye secuencias localizadas adyacentes a la región codificadora en ambos extremos 5' y 3' para una distancia de al menos aproximadamente 2 kb en un extremo u otro y que están implicados en la expresión del gen. A este respecto, el gen incluye señales control tales como promotores, potenciadores, señales de terminación y/o de poliadenilación que naturalmente están asociadas con un gen dado, o señales de control heterólogas, en cuyo caso, el gen se refiere como un "gen quimérico". Las secuencias que están localizadas en 5' de la región codificadora de la proteína y que están presentes en el ARNm se refieren como secuencias no traducidas en 5'. Las secuencias que está localizadas en 3' o después del extremo 3' de la región codificadora de la proteína y que están presentes en el ARNm se refieren como secuencias no traducidas en 3'. El término "gen" engloba ambas formas ADNc y genómica de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificadora que puede estar interrumpida con secuencias no codificadoras denominadas "intrones", "regiones intervinientes" o "secuencias intervinientes". Los intrones son segmentos de un gen, que se transcriben en ARN nuclear (ARNn). Los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. Los intrones se eliminan o se "eliminan por corte y empalme " del trascripto primario o nuclear; por lo tanto, los intrones están ausentes en el transcrito de ARN. El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia u orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente. El término "gen" incluye una molécula sintética o de fusión que codifica todas o parte de las proteínas de la descripción descritas en la presente memoria y una secuencia de nucleótidos complementaria a una cualquiera de las anteriores.

Un "alelo" se refiere a una forma específica de una secuencia genética (tal como un gen) en una célula, una planta individual o en una población, forma específica que difiere de otras formas del mismo gen en la secuencia de al menos uno, y frecuentemente más de uno, sitios variantes en la secuencia del gen. Las secuencias de estos sitios variantes que difieren entre diferentes alelos se denominan "varianzas", "polimorfismos", o "mutaciones".

Tal y como se usa en la presente memoria, "ADN quimérico" se refiere a cualquier molécula de ADN que no es natural en la naturaleza; también referido en la presente memoria como una "construcción de ADN". Típicamente, el ADN quimérico comprende secuencias reguladoras y transcritas o que codifican una proteína que de manera natural no se encuentran juntas. Por consiguiente, el ADN quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que son derivadas de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero organizadas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. El marco de lectura abierto puede estar o no unido a sus elementos reguladores naturales en 5' y 3'. El marco de lectura abierto puede incorporarse, por ejemplo, en el genoma de la planta, en una localización no natural, o en un replicón o vector donde no se encuentra de manera natural tal como un plásmido bacteriano o un vector viral. El término "ADN quimérico" no se limita a moléculas de ADN que son replicables en un huésped, sino que incluye ADN capaz de ser ligado a un replicón, por ejemplo, por secuencias adaptadoras específicas.

Un "transgén" es un gen que ha sido introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. El transgén puede estar en una planta transformada inicial producida por regeneración a partir de una célula vegetal transformada o en plantas descendientes producidas por autofertilización o cruce a partir del transformante inicial o en partes de planta tales como semillas. El término "modificado genéticamente" y variaciones del mismo incluye introducir un gen en una célula por transformación o transducción, mutar un gen en una célula y alterar o modular genéticamente la regulación de un gen en una célula, o la descendencia de cualquier célula modificada como se ha descrito anteriormente.

Una "región genómica" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una posición en el genoma donde un transgén, o grupo de transgenes (también referidos en la presente memoria como una agrupación), ha sido insertado en una célula, o predecesor de la misma, de modo que son coheredados en las células descendientes después de la meiosis.

Un "polinucleótido recombinante" o "polinucleótido exógeno" de la descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido construida o modificada por métodos recombinantes artificiales. El polinucleótido recombinante puede estar presente en una célula en una cantidad alterada o expresarse a una velocidad alterada (p. ej., en el caso de ARNm) en comparación con su estado nativo. Un polinucleótido exógeno es un polinucleótido que ha sido introducido en una célula que no comprende naturalmente el polinucleótido. Típicamente, un ADN exógeno se usa como un molde para la transcripción de ARNm, que se traduce entonces en una secuencia continua de residuos de aminoácidos que codifican un polipéptido de la descripción en la célula transformada. En otra realización, parte del polinucleótido exógeno es endógeno para la célula y su expresión es alterada por medios recombinantes, por ejemplo, se introduce una secuencia control exógena en 5' de un polinucleótido endógeno para facilitar a la célula transformada expresar al polipéptido codificado por el polinucleótido. Por ejemplo, un polinucleótido exógeno puede expresar un ARN antisentido para un polinucleótido endógeno.

Un polinucleótido recombinante de la descripción incluye polinucleótidos que no han sido separados de otros componentes del sistema de expresión libre de células o basado en células en el cual está presente, y polinucleótidos producidos en dichos sistemas libres de células o basados en células que son subsecuentemente purificados de al menos algunos otros componentes. El polinucleótido puede ser una cadena de nucleótidos contiguos que existen en la naturaleza, o comprender dos o más cadenas de nucleótidos contiguos procedentes de diferentes fuentes (que se encuentran naturalmente y/o sintéticas) unidas para formar un único polinucleótido. Típicamente, dichos polinucleótidos quiméricos comprenden al menos un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de la descripción unido operativamente a un promotor adecuado para dirigir la transcripción del marco de lectura abierto en una célula de interés.

Con respecto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que las cifras del % de identidad mayores que las proporcionados anteriormente englobarán realizaciones preferidas. Por lo tanto, cuando sea aplicable, a la vista de cifras de % de identidad mínimas, se prefiere que el polinucleótido comprenda una secuencia de polinucleótido que sea al menos un 50 %, más preferiblemente al menos un 60 %, más preferiblemente al menos un 65 %, más preferiblemente al menos un 70 %, más preferiblemente al menos un 75 %, más preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, más preferiblemente al menos un 93 %, más preferiblemente al menos un 94 %, más preferiblemente al menos un 95 %, más preferiblemente al menos un 96 %, más preferiblemente al menos un 97 %, más preferiblemente al menos un 98 %, más preferiblemente al menos un 99 %, más preferiblemente al menos un 99,1 %, más preferiblemente al menos un 99,2 %, más preferiblemente al menos un 99,3 %, más preferiblemente al menos un 99,4 %, más preferiblemente al menos un 99,5 %, más preferiblemente al menos un 99,6 %, más preferiblemente al menos un 99,7 %, más preferiblemente al menos un 99,8 %, y aún más preferiblemente al menos un 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO: nominada relevante.

Un polinucleótido de, o útil para, la presente descripción puede hibridar selectivamente, bajo condiciones astringentes, con un polinucleótido definido en la presente memoria. Tal y como se usa en la presente memoria, condiciones astringentes son aquellas que: (1) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1 % (p/v), Ficoll al 0,1 %, polivinilpirrolidona al 0,1 %, tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (2) emplea formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1 %, 5 x disolución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml) , SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C en 0,2 x SSC y SDS al 0,1 %, y/o (3) emplea baja fuerza iónica y alta temperatura para lavar, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/SDS al 0,1 % a 50 °C.

Los polinucleótidos de la descripción pueden poseer, cuando se comparan con moléculas naturales, una o más mutaciones, que son deleciones, inserciones, o sustituciones de residuos de nucleótidos Los polinucleótidos que tienen mutaciones en relación con una secuencia de referencia pueden ser naturales (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, efectuando mutagénesis dirigida a sitio o intercambio de cadenas de ADN en el ácido nucleico como se ha descrito anteriormente).

Polinucleótido para reducir los niveles de expresión de proteínas endógenas

En una realización, la célula/semilla/planta/organismo de la descripción comprende una mutación o un polinucleótido exógeno introducidos, que regula a la baja la producción y/o actividad de una enzima endógena, que da lugar, típicamente, a una producción incrementada de ácido oleico, y preferiblemente a una producción disminuida de ácido palmítico y PUFA tal como ácido linoleico, en comparación con una célula correspondiente que carece de la mutación o polinucleótido exógeno introducidos. Los ejemplos de dichos polinucleótidos incluyen un polinucleótido antisentido, un polinucleótido con sentido, un polinucleótido catalítico, un microARN, un polinucleótido que codifica un polipéptido que se une a la enzima endógena y un ARN bicatenario.

Interferencia de ARN

La interferencia de ARN (ARNi) es particularmente útil para inhibir específicamente la producción de una proteína particular. Esta tecnología se basa en la presencia de moléculas de ARNds que contienen una secuencia que es esencialmente idéntica al ARNm del gen de interés o parte del mismo y una secuencia que es complementaria a la misma. Convenientemente, el ARNds puede producirse a partir de un único promotor en un vector o célula huésped recombinante, donde las secuencias con sentido y antisentido están unidas covalentemente mediante una secuencia, preferiblemente una secuencia no relacionada, que permite que la secuencia con sentido y antisentido en el transcrito correspondiente hibriden para formar la molécula de ARNds con la secuencia de unión formando una estructura en bucle, aunque una secuencia con identidad con el ARN diana o su complemento pueden formar la estructura en bucle. Típicamente, el ARNds está codificado por una construcción de ADN bicatenaria que tiene secuencias con sentido y antisentido en una estructura de repetición invertida, organizadas como un palíndromo interrumpido, donde las secuencias repetidas se transcriben para producir las secuencias que hibridan en la molécula de ARNds, y la secuencia interrumpida se transcribe para formar un bucle en la molécula de ARNds. El diseño y la producción de moléculas de ARNds adecuadas está en la capacidad de un experto en la técnica, considerando particularmente Waterhouse et al. (1998), Smith et al. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029 y WO 01/34815.

En un ejemplo, se introduce un ADN que dirige la síntesis de un producto o productos de ARN al menos parcialmente bicatenario con homología, preferiblemente al menos 19 nucleótidos consecutivos complementarios a una región de, un ARN diana, que se quiere inactivar. Por lo tanto, el ADN comprende tanto secuencias con sentido como antisentido que, cuando se transcriben en ARN, pueden hibridar para formar la región de ARN bicatenaria. En una realización de la descripción, las secuencias con sentido y antisentido están separadas por una región espaciadora que comprende un intrón que, cuando se transcribe en ARN, se elimina por corte y empalme. Se ha mostrado que esta disposición da como resultado una eficiencia más alta del silenciamiento génico. La región de ARN bicatenaria puede comprender una o dos moléculas de ARN, transcritas a partir de una o dos regiones de ADN. Se piensa que la presencia de la molécula bicatenaria desencadena una respuesta a partir de un sistema endógeno que destruye tanto el ARN bicatenario como también el ARN homólogo transcrito a partir del gen diana, reduciendo eficientemente o eliminando la actividad del gen diana.

La longitud de las secuencias con sentido y antisentido que hibridan debería ser cada una de al menos 19 nucleótidos contiguos, correspondientes a parte del ARNm diana. Se puede usar la secuencia de longitud completa correspondiente al transcripto del gen completo. El grado de identidad de las secuencias con sentido y antisentido con el transcrito diana debería ser de al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos de un 95 % a un 100 %. Por supuesto, la molécula de ARN puede comprender secuencias no relacionadas que pueden funcionar para estabilizar la molécula. La molécula de ARN puede ser expresada bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II o ARN polimerasa III. Los ejemplos de los últimos incluyen promotores de ARNt o ARNsn.

Las pequeñas moléculas de ARN de interferencia ("ARNsi") preferidas comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica a aproximadamente 19-21 nucleótidos contiguos del ARNm diana. Preferiblemente, la secuencia de ARNsi comienza con el dinucleótido AA, comprende un contenido de G-C de aproximadamente un 30-70 % (preferiblemente, un 30-60 %, más preferiblemente un 40-60 % y más preferiblemente aproximadamente un 45 %-55 %), y no tiene un alto porcentaje de identidad con cualquier secuencia de nucleótidos diferente de la diana en el genoma del organismo en el que se va a introducir, por ejemplo, como se determina mediante la búsqueda por BLAST estándar.

Como un ejemplo, un ARNds de la descripción comprende una secuencia de nucleótidos proporcionada como una cualquiera de las SEQ ID NO: 49 a 51 (donde cada T es un U).

microARN

Los microARN (abreviado miARN) son generalmente moléculas de ARN no codificadoras de 19-25 nucleótidos (comúnmente aproximadamente 20-24 nucleótidos en plantas) que se derivan de precursores más grandes que forman estructuras tallo-bucle imperfectas.

Los miARN se unen a secuencias complementarias en los transcritos de ARN mensajeros diana (ARNm), usualmente dando lugar a la represión de la traducción o degradación de la diana y silenciamiento génico.

En las células de plantas, se cree que las moléculas precursoras de miARN son procesadas inicialmente en el núcleo. El pri-miARN (que contiene una o más regiones locales bicatenarias o en "horquilla", así como también la habitual "caperuza" en 5' y cola poliadenilada de un ARNm) se procesa en una molécula precursora de miARN más corta que también incluye una estructura tallo-bucle o retroplegada y se denomina el "pre-miARN". En plantas, los pre-miARN son escindidos por enzimas similares a DICER (DCL) diferentes, en particular DCL-1, dando lugar a dúplex miARN:miARN* Antes del transporte afuera del núcleo, estos dúplex son metilados. En contraste, moléculas de ARN en horquilla que tienen regiones de dsARN más largas son procesadas en particular por DCL-3 y DCL-4.

En el citoplasma, la cadena de miARN del dúplex miARN:miARN es incorporada selectivamente en un complejo silenciador inducido por ARN activo (RISC) para el reconocimiento de la diana. Los complejos RISC contienen un subconjunto particular de proteínas Argonauta que ejercen una represión génica especifica de secuencia después de la trascripción (véase, por ejemplo, Millar y Waterhouse, 2005; Pasquinelli et al., 2005; Almeida y Allshire, 2005).

Cosupresión

Los genes pueden suprimir la expresión de genes endógenos relacionados y/o transgenes ya presentes en el genoma, un fenómeno denominado silenciamiento génico dependiente de homología. La mayoría de los casos de silenciamiento génico dependiente de homología se encuentran en dos clases-aquellos que funcionan al nivel de la transcripción del transgén, y aquellos que operan después de la transcripción.

El silenciamiento génico dependiente de homología posterior a la transcripción (es decir, cosupresión) describe la pérdida de expresión de un transgén y genes virales o endógenos relacionados en plantas transgénicas. A menudo, pero no siempre, la cosupresión tiene lugar cuando los transcritos de transgenes son abundantes, y generalmente, se piensa que se desencadena al nivel de procesamiento, localización, y/o degradación del ARNm. Existen varios modelos para explicar cómo funciona la cosupresión (véase en Taylor, 1997).

La cosupresión implica introducir una copia extra de un gen o un fragmento del mismo en una planta en la orientación con sentido con respecto a un promotor para su expresión. Un experto deberá apreciar que el tamaño del fragmento con sentido, su correspondencia con regiones génicas diana, y su grado de identidad de secuencia con el gen diana pueden variar. En algunos casos, la copia adicional de la secuencia del gen interfiere con la expresión del gen vegetal diana. Se hace referencia a WO 97/20936 y EP 0465572 para métodos para implementar estrategias de cosupresión.

Vector de Expresión

Tal y como se usa en la presente memoria, un "vector de expresión" es un vector de ADN o ARN que es capaz de transformar una célula huésped y de efectuar la expresión de uno o más polinucleótidos específicos. Preferiblemente, el vector de expresión también es capaz de replicarse en la célula huésped o de ser integrado en el genoma de la célula huésped. Típicamente, los vectores de expresión son virus o plásmidos. Los vectores de expresión de la presente descripción incluyen cualquiera de los vectores que funcionan (es decir, dirigen la expresión génica) en células huésped de la presente descripción, incluyendo células de hongos, algas, y plantas.

"Unido operativamente" tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácidos nucleicos (p. ej., ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de elemento regulador transcripcional (promotor) con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificadora de un polinucleótido definido en la presente memoria, si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificadora en una célula apropiada. Generalmente, los elementos reguladores transcripcionales promotores que están unidos operativamente a una secuencia transcrita son físicamente contiguos a la secuencia transcrita, es decir, que actúan en cis. Sin embargo, algunos elementos reguladores transcripcionales tales como potenciadores, no necesitan ser físicamente contiguos o localizados en proximidad estrecha con las secuencias codificadoras cuya transcripción potencian.

Los vectores de expresión de la presente descripción contienen secuencias reguladoras tales como secuencias de control de la transcripción, secuencias de control de la traducción, orígenes de replicación, y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula huésped y que controlan la expresión de polinucleótidos de la presente descripción. En particular, los vectores de expresión de la presente descripción incluyen secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan el inicio, elongación, y terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la transcripción tales como secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que puede funcionar en al menos una de las células recombinantes de la presente descripción. La elección de las secuencias reguladoras usadas depende del organismo diana tal como una planta y/o tejido u órgano diana de interés. Dichas secuencias reguladoras pueden obtenerse de cualquier organismo eucariota tal como plantas o virus de plantas, o pueden sintetizarse químicamente. El experto en la técnica conoce una variedad de dichas secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente preferidas son promotores activos en la dirección de la transcripción en plantas, ya sea constitutivamente, o específicos de estadio y/o tejido, dependiendo del uso de la planta o parte(s) de la misma.

Se han descrito numerosos vectores adecuados para la transfección estable de células de plantas o para el establecimiento de plantas transgénicas, por ejemplo, en Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, sup. 1987. Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989, y Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, los vectores de expresión en plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes de plantas clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras en 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de expresión en plantas también pueden contener una región reguladora promotora (p. ej., una región reguladora que controla la expresión inducible o constitutiva, regulada por el ambiente o el desarrollo, o específica de célula o de tejido), un sitio de comienzo del inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosomas, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de terminación de la transcripción, y/o una señal de poliadenilación.

Se han descrito numerosos promotores constitutivos que son activos en células de plantas. Los promotores adecuados para expresión constitutiva en plantas incluyen, pero no están limitados a, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el 35S del virus del mosaico de la escrofularia (FMV), el promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar, el promotor del virus jaspeado amarillo de camelina, el promotor inducible por la luz de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bis-fosfato carboxilasa, el promotor de la triosafosfato isomerasa citosólica del arroz, el promotor de la adenina fosforibosiltransferasa de Arabidopsis, el promotor del gen de actina 1 de arroz, los promotores de la manopina sintasa y octopina sintasa, el promotor de Adh, el promotor de la sacarosa sintasa, el promotor del complejo génico R, y el promotor del gen de la proteína de unión a/p de clorofila. Estos promotores han sido usados para crear vectores de ADN que han sido expresados en plantas, véase, por ejemplo, WO 84/02913. Todos estos promotores han sido usados para crear varios tipos de vectores de ADN recombinantes expresables en plantas.

Para el propósito de la expresión en tejidos fuente de la planta tales como hoja, semilla, raíz o tallo, se prefiere que los promotores utilizados en la presente descripción tengan una expresión relativamente alta en estos tejidos específicos. Para este propósito, se pueden seleccionar numerosos promotores para genes con expresión específica de célula o de tejido, o potenciada. Los ejemplos de dichos promotores reportados en la bibliografía incluyen, el promotor GS2 de la glutamina sintasa del cloroplasto del guisante, el promotor de la fructosa-1,6-bifosfatasa de cloroplasto de trigo, el promotor ST-LS1 nuclear fotosintético de patata, el promotor de la serina/treonina quinasa y el promotor de la glucoamilasa (CHS) de Arabidopsis thaliana.

También puede usarse una variedad de promotores de genes de plantas, que son regulados en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas, y/o de desarrollo, para la expresión de genes de proteínas de unión a ARN en células de plantas, incluyendo promotores regulados por (1) calor, (2) luz (p. ej., promotor RbcS-3A de guisante, promotor RbcS de maíz), (3) hormonas tales como ácido abscísico, (4) heridas (p. ej., WunI), o (5) productos químicos tales como jasmonato de metilo, ácido salicílico, hormonas esteroides, alcohol, sustancias protectoras (WO 97/06269) o también puede ser ventajoso emplear (6) promotores específicos de órganos.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "promotor específico de órganos de almacenamiento de plantas" se refiere a un promotor que preferentemente, cuando se compara con otros tejidos de plantas, dirige la transcripción génica en un órgano de almacenamiento de una planta. El órgano de almacenamiento de plantas es preferiblemente una semilla. Preferiblemente, el promotor solamente dirige la expresión de un gen de interés en el órgano de almacenamiento, y/o la expresión del gen de interés en otras partes de la planta tales como hojas, no es detectable por análisis de transferencia Northern y/o RT/PCR. Típicamente, el promotor dirige la expresión de genes durante el crecimiento y desarrollo del órgano de almacenamiento, en particular, durante la fase de síntesis y acumulación de compuestos almacenados en el órgano de almacenamiento. Dichos promotores pueden dirigir la expresión génica en el órgano de almacenamiento de la planta entero o solamente parte del mismo tal como el recubrimiento de la semilla, embrión, o cotiledón(es) en semillas de plantas dicotiledóneas o el endosperma o capa de aleurona de semillas de plantas monocotiledóneas.

También se pueden usar promotores para expresar una proteína en tejidos específicos tales como semillas o frutos. Puede usarse el promotor para 13-conglicinina u otros promotores específicos de semilla tales como los promotores de napina, zeína, linina y faseolina. En una realización, el promotor dirige la expresión en tejidos y órganos en los cuales tiene lugar la biosíntesis de lípidos. Dichos promotores actúan en el desarrollo de semillas en un momento adecuado para modificar la composición de lípidos en las semillas. En una realización, el promotor específico del órgano de almacenamiento vegetal es un promotor especifico de semillas. En una realización más preferida, el promotor preferentemente dirige la expresión en el embrión y/o cotiledones de una planta dicotiledónea o en el endosperma de una planta monocotiledónea, en relación con la expresión en otros órganos en la planta, tales como las hojas. Los promotores preferidos para la expresión especifica en semillas incluyen: 1) promotores de genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis y acumulación de lípidos en semillas tales como desaturasas y elongasas, 2) promotores de genes que codifican proteínas de almacenamiento de semillas, y 3) promotores de genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis y acumulación de carbohidratos en semillas. Los promotores específicos de semillas que son adecuados son, un promotor de linina de lino (p. ej., promotores Cnl1, Cnl2), el promotor del gen de napina de colza de semillas oleaginosas (US 5.608.152), el promotor u Sp de Vicia faba (Baumlein et al., 1991), el promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980), o el promotor B4 de legumina (Baumlein et al., 1992), y promotores que conducen a la expresión especifica de semillas en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y similares. Los promotores notables que son adecuados son los promotores de los genes lpt2 o lpt1 de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230), o los promotores descritos en WO 99/16890 (promotores del gen de hordeína de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen de orizina de arroz, el gen de prolamina de arroz, el gen de gliadina de trigo, el gen de glutelina de trigo, el gen de zeína de maíz, el gen de glutelina de avena, el gen de kasirina de sorgo, el gen de secalina de centeno). Otros promotores incluyen aquellos descritos por Broun et al. (1998), Potenza et al. (2004), US 20070192902 y US 20030159173. En una realización, el promotor específico de semilla se expresa preferentemente en partes definidas de la semilla tales como el embrión, cotiledón(es) o el endosperma. Los ejemplos de promotores específicos de cotiledón incluyen, pero no están limitados a, el promotor FP1 (Ellerstrom et al., 1996), el promotor de legumina de guisante (Perrin et al., 2000), y el promotor de fitohemaglutinina de judía (Perrin et al., 2000). En una realización adicional, el promotor específico de semilla no se expresa, o solo se expresa a un nivel bajo, en el embrión y/o después de la germinación de las semillas.

Cuando hay múltiples promotores presentes, cada promotor puede ser independientemente el mismo o diferente.

La secuencia líder no traducida en 5' puede derivarse del promotor seleccionado para expresar la secuencia génica heteróloga del polinucleótido, o puede ser heteróloga con respecto a la región codificadora de la enzima que se va a producir, y puede modificarse específicamente si se desea para incrementar así la traducción del ARNm.

La terminación de la transcripción se logra mediante una secuencia de ADN no traducida en 3' unida operativamente en el vector de expresión al polinucleótido de interés. La región no traducida en 3' de una molécula de ADN recombinante contiene una señal de poliadenilación que funciona en plantas para causar la adición de nucleótidos adenilados en el extremo 3' del ARN. La región no traducida en 3' puede obtenerse a partir de varios genes que son expresados en, por ejemplo, células de plantas. La región no traducida en 3' de la nopalina sintasa, la región no traducida en 3' del gen de la subunidad Rubisco pequeña de guisante, la región no traducida en 3' del gen de la proteína de almacenamiento de semilla 7S de soja se usan comúnmente en esta capacidad. También son adecuadas las regiones transcritas no traducidas en 3' que contienen la señal de poliadenilación de genes de plásmidos inductores de tumor (Ti) de Agrobacterium.

Las tecnologías de ADN recombinante se pueden usar para mejorar la expresión de un polinucleótido transformado, manipulando, por ejemplo, el número de copias del polinucleótido en una célula huésped, la eficiencia con la cual los polinucleótidos se trascriben, la eficiencia con la cual los transcritos resultantes se traducen, y la eficiencia de las modificaciones posteriores a la traducción.

Para facilitar la identificación de los transformantes, el vector recombinante comprende deseablemente un gen que se puede seleccionar o cribar como, o además de, la secuencia de ácido nucleico de un polinucleótido definido en la presente memoria. Por "gen marcador" se quiere decir un gen que imparte un fenotipo distinto a las células que expresan el gen marcador y por lo tanto, permite a dichas células transformadas diferenciarse de las células que no tienen el marcador. Un gen marcador seleccionable confiere un rasgo por el cual se puede "seleccionar" en base a la resistencia a un agente selectivo (p. ej., un herbicida, antibiótico, radiación, calor, u otro tratamiento que dañe a las células no transformadas). Un gen marcador que se puede cribar (o gen informador) confiere un rasgo que se puede identificar a través de la observación o ensayo, esto es, por "cribado" (p. ej., 13-glucuronidasa, luciferasa, GFP u otra actividad enzimática no presente en las células no transformadas). El gen marcador y la secuencia de nucleótidos de interés no tienen que estar ligados, ya que la cotransformación de genes no ligados como, por ejemplo, se describe en US 4.399.216, es también un proceso eficiente, por ejemplo, en la transformación de plantas. La elección real de un marcador no es crucial mientras que sea funcional (es decir, selectivo) en combinación con las células elegidas tal como una célula vegetal.

Los marcadores seleccionables ejemplares para la selección de transformantes de plantas incluyen, pero no están limitados a, un gen hyg que codifica la resistencia a higromicina B; un gen de neomicina fosfotransferasa (nptll) que confiere resistencia a kanamicina, paramomicina, G418; un gen de glutatión-S-transferasa procedente de hígado de rata que confiere resistencia a herbicidas derivados de glutatión como se describe, por ejemplo, en EP 256223; un gen de glutamina sintetasa que confiere, después de la sobreexpresión, resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa tal como fosfinotricina como se describe, por ejemplo, en WO 87/05327; un gen de acetiltransferasa de Streptomyces viridochromogenes que confiere resistencia al agente selectivo fosfinotricina como se describe, por ejemplo, en EP 275957; un gen que codifica 5-enolsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere tolerancia a N-fosfonometilglicina, como se describe, por ejemplo, en Hinchee et al. (1988); un gen bar que confiere resistencia contra bialafos, como se describe, por ejemplo, en WO91/02071; un gen de nitrilasa tal como bxn procedente de Klebsiella ozaenae, que confiere resistencia a bromoxinilo (Stalker et al., 1988); un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) que confiere resistencia a metotrexato (Thillet et al., 1988); un gen de acetolactato sintasa (ALS) mutante, que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea, u otros productos químicos inhibidores de ALS (EP 154.204); un gen de antranilato sintasa mutado que confiere resistencia a 5-metil triptófano; o un gen de dalapón deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida.

Los marcadores que se pueden cribar preferidos incluyen, pero no están limitados a, un gen uidA que codifica una enzima 13-glucuronidasa (GUS) para la que se conocen varios sustratos cromogénicos; un gen de 13-galactosidasa que codifica una enzima para la que se conocen sustratos cromogénicos; un gen de aecuorina (Prasher et al., 1985) que puede emplearse en la detección por bioluminiscencia sensible al calcio; un gen de proteína verde fluorescente (Niedz et al., 1995) o derivados del mismo; o un gen de luciferasa (luc) (Ow et al., 1986) que permite la detección por bioluminiscencia. Por "molécula informadora" se quiere decir una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal identificable analíticamente que facilita la determinación de la actividad promotora por referencia al producto proteico.

Preferiblemente, el vector recombinante se incorpora establemente en el genoma de la célula tal como la célula vegetal. Por consiguiente, el vector recombinante puede comprender elementos apropiados que permiten que el vector se incorpore en el genoma, o en un cromosoma de la célula.

Ácidos nucleicos de transferencia

Se pueden usar ácidos nucleicos de transferencia para administrar un polinucleótido exógeno a una célula y comprenden una, preferiblemente dos, secuencias limitantes y un polinucleótido de interés. El ácido nucleico de transferencia puede codificar o no un marcador seleccionable. Preferiblemente, el ácido nucleico de transferencia forma parte de un vector binario en una bacteria, donde el vector binario comprende adicionalmente elementos que permiten la replicación del vector en la bacteria, la selección o el mantenimiento de células bacterianas que contienen el vector binario. Después de la transferencia a una célula eucariota, el componente de ácido nucleico de transferencia del vector binario es capaz de integrarse en el genoma de la célula eucariota.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "ácido nucleico de transferencia extracromosómico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de ser transferida desde una bacteria tal como Agrobacterium sp., a una célula eucariota tal como una célula vegetal. Un ácido nucleico de transferencia extracromosómico es un elemento genético que es bien conocido como un elemento capaz de ser transferido, con la integración subsecuente de una secuencia de nucleótidos contenida en sus límites, al genoma de la célula receptora. Con respecto a esto, un ácido nucleico de transferencia está flanqueado, típicamente, por dos secuencias "limitantes", aunque en algunos casos se puede usar un único límite en un extremo y el segundo extremo del ácido nucleico transferido se genera aleatoriamente en el proceso de transferencia. Un polinucleótido de interés se posiciona típicamente entre la secuencia similar al límite izquierdo y la secuencia similar al límite derecho de un ácido nucleico de transferencia. El polinucleótido contenido en el ácido nucleico de transferencia puede estar unido operativamente a una variedad de elementos reguladores terminadores y promotores diferentes que facilitan su expresión, esto es, transcripción y/o traducción del polinucleótido. Los ADN de transferencia (T-ADN) procedentes de Agrobacterium sp. tales como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes, y las variantes/mutantes de los mismos preparados por el hombre, son probablemente los ejemplos mejor caracterizados de ácidos nucleicos de transferencia. Otro ejemplo es P-ADN ("ADN de planta") que comprende secuencias similares al límite de T-ADN de plantas.

Tal y como se usa en la presente memoria, "T-ADN" se refiere a, por ejemplo, T-ADN de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o de un plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes, o variantes de los mismos preparados por el hombre, que funcionan como T-ADN. El T-ADN puede comprender un T-ADN entero que incluye ambas secuencias limitantes izquierda y derecha, pero solo necesitan comprender las secuencias mínimas requeridas en cis para la transferencia, esto es, la secuencia limitante de T-ADN y derecha. Los T-ADN de la descripción tienen insertada en ellos, en cualquier parte entre las secuencias limitantes derecha e izquierda (si están presentes), el polinucleótido de interés. Las secuencias que codifican factores requeridos en trans para la transferencia del T-ADN en una célula vegetal tal como los genes vir, pueden insertarse en el T-ADN, o pueden estar presentes en el mismo replicón que el T-ADN, o preferiblemente están en trans en un replicón compatible en el huésped Agrobacterium. Dichos "sistemas de vector binarios" son bien conocidos en la técnica.

Tal y como se usa en la presente memoria, "P-ADN" se refiere a un ácido nucleico de transferencia aislado a partir del genoma de una planta, o variantes/mutantes del mismo, preparados por el hombre, y comprende en cada extremo, o solamente en un extremo, una secuencia similar al límite de T-ADN. La secuencia similar al límite comparte preferiblemente al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 %, pero menos de un 100 % de identidad de secuencia, con una secuencia limitante de T-ADN procedente de una Agrobacterium sp., tal como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Por lo tanto, los P-ADN pueden usarse en lugar de los T-ADN para transferir una secuencia de nucleótidos contenida en el P-ADN procedente, por ejemplo, de Agrobacterium, a otra célula. El P-ADN, antes de la inserción del polinucleótido exógeno que se va a transferir, puede ser modificado para facilitar la clonación y preferiblemente no deberá codificar ninguna proteína. El P-ADN se caracteriza porque contiene, al menos una secuencia limitante derecha y preferiblemente también una secuencia limitante izquierda.

Tal y como se usa en la presente memoria, una secuencia "limitante" de un ácido nucleico de transferencia puede aislarse a partir de un organismo seleccionado tal como una bacteria o planta, o ser una variante/mutante de los mismos, preparada por el hombre. La secuencia limitante promueve y facilita la transferencia del polinucleótido al cual está ligado y puede facilitar su integración en el genoma de la célula receptora. En una realización, una secuencia limitante tiene entre 5-100 pares de bases (pb) de longitud, 10-80 pb de longitud, 15-75 pb de longitud, 15-60 pb de longitud, 15-50 pb de longitud, 15-40 pb de longitud, 15-30 pb de longitud, 16-30 pb de longitud, 20-30 pb de longitud, 21-30 pb de longitud, 22-30 pb de longitud, 23-30 pb de longitud, 24-30 pb de longitud, 25-30 pb de longitud, o 26-30 pb de longitud. Las secuencias limitantes procedentes de T-ADN de Agrobacterium sp. son bien conocidas en la técnica e incluyen las descritas en Lacroix et al. (2008), Tzfira y Citosky (2006) y Glevin (2003).

Aunque tradicionalmente solamente se han usado Agrobacterium sp. para transferir genes a células de plantas, actualmente hay numerosos sistemas que han sido identificados/desarrollados que actúan de una manera similar a Agrobacterium sp. Varias especies diferentes de Agrobacterium han sido modificadas genéticamente recientemente para ser competentes para transferencia génica (Chung et al., 2006; Broothaerts et al., 2005). Estas incluyen Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti y Mezorhizobium loti. Las bacterias se hacen competentes para la transferencia génica proporcionando a las bacterias la maquinaria necesaria para el proceso de la transformación, esto es, un conjunto de genes de virulencia codificados por un plásmido Ti de Agrobacterium y el segmento de T-ADN que reside en un pequeño plásmido binario separado. Las bacterias diseñadas por ingeniería de esta manera son capaces de transformar diferentes tejidos de plantas (discos de hojas, callos y tejido oval), monocotiledóneas o dicotiledóneas, y varias especies de plantas diferentes (p. ej., tabaco, arroz).

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "transfección", "transformación" y variaciones de los mismos generalmente se usan indistintamente. Las células "transfectadas" o "transformadas" pueden haber sido manipuladas para introducir el o los polinucleótidos de interés, o pueden ser células descendientes derivadas de las mismas.

Células recombinantes

La descripción también proporciona una célula recombinante, por ejemplo, una célula vegetal recombinante, que es una célula huésped transformada con una o más polinucleótidos o vectores definidos en la presente memoria, o combinaciones de las mismas. El término "célula recombinante" se usa indistintamente con el término "célula transgénica" en la presente memoria. Las células adecuadas de la descripción incluyen cualquier célula que pueda ser transformada con un polinucleótido o vector recombinante de la descripción, que codifica, por ejemplo, un polipéptido o enzima descritos en la presente memoria. La célula es preferiblemente una célula que es consecuentemente capaz de ser usada para producir lípidos. La célula recombinante puede ser una célula en cultivo, una célula in vitro, o en un organismo tal como, por ejemplo, una planta, o en un órgano tal como, por ejemplo, una semilla o una hoja. Preferiblemente, la célula está en una planta, más preferiblemente en la semilla de una planta, más preferiblemente en la semilla de una planta de semilla oleaginosa tal como cártamo. En una realización, la célula vegetal comprende lípido o aceite que tiene la composición de ácidos grasos como se describe en la presente memoria.

Las células huésped en las que se introducen el o los polinucleótidos pueden ser células no transformadas o células que están ya transformadas con al menos un ácido nucleico. Dichos ácidos nucleicos pueden estar relacionados o no con la síntesis de lípidos. Las células huésped de la presente descripción pueden ser capaces de producir ya sea endógenamente (es decir, naturalmente) el o los polipéptidos definidos en la presente memoria, en cuyo caso la célula recombinante derivada de la misma tiene una capacidad mejorada de producir el o los polipéptidos, o puede ser capaz de producir dicho o dichos polipéptidos solamente después de ser transformada con al menos un polinucleótido de la descripción. En una realización, una célula recombinante de la descripción tiene una capacidad mejorada para producir lípidos no polares. Las células pueden ser procariotas o eucariotas. Las células huésped preferidas son células de levaduras, algas y plantas. En una realización preferida, la célula vegetal es una célula de semilla, en particular, una célula en un cotiledón o endosperma de una semilla. Los ejemplos de células de algas útiles como células huésped de la presente descripción incluyen, por ejemplo, Chlamydomonas sp. (por ejemplo, Chlamydomonas reinhardtii), Dunaliella sp., Haematococcus sp., Chlorella sp., Thraustochystrium sp., Schizochytrium sp. y Volvox sp.

Las células huésped pueden ser de un organismo adecuado para un proceso de fermentación, tal como, por ejemplo, Yarrowia lipolytica u otras levaduras.

Plantas transgénicas

La descripción también proporciona una planta que comprende un polinucleótido o polipéptido exógeno de la descripción, una célula de la descripción, un vector de la descripción, o una combinación de los mismos. El término "planta" se refiere a plantas enteras, mientras que el término "parte de la misma" se refiere a órganos de plantas (p. ej., hojas, tallos, raíces, flores, frutos), células individuales (p. ej., polen), semillas, partes de semillas tales como embrión, endosperma, escutelo, o recubrimiento de la semilla, tejidos de plantas tales como tejido vascular, células de plantas y progenie de las mismas. Tal y como se usa en la presente memoria, partes de plantas comprenden células de plantas.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "planta" se usa en su sentido más amplio. Incluye, pero no se limita a, cualquiera de las especies de céspedes, plantas ornamentales o decorativas, cultivos o cereales (p. ej., plantas de semillas oleaginosas, maíz, soja), o forraje, plantas de vegetales o frutales, plantas herbáceas, plantas boscosas; plantas de flores, o árboles. No se quiere limitar una planta a cualquier estructura particular. También se refiere a una planta unicelular (p. ej., microalga). El término "parte de la misma" con referencia a una planta, se refiere a una célula vegetal y progenie de la misma, una pluralidad de células de plantas que se diferencian ampliamente en una colonia (p. ej., volvox), una estructura que está presente en cualquier estadio del desarrollo de una planta, o un tejido vegetal. Dichas estructuras incluyen, pero no están limitadas a, hojas, tallos, flores, frutos, nueces, raíces, semilla, recubrimiento de semillas, embriones. El término "tejido vegetal" incluye tejidos diferenciados y no diferenciados de plantas que incluyen los presentes en hojas, tallos, flores, frutos, nueces, raíces, semilla, por ejemplo, tejido embrionario, endosperma, tejido dérmico (p. ej., epidermis, periderma), tejido vascular (p. ej., xilema, floema), o tejido a nivel del suelo (que comprende células de parénquima, colénquima, y/o esclerénquima), así como también células en cultivo (p. ej., células individuales, protoplastos, callos, embriones, etc.). El tejido vegetal puede estar en una planta, en cultivo de órganos, cultivo tisular, o cultivo celular.

Una "planta transgénica", "planta modificada genéticamente" o variaciones de las mismas se refiere a una planta que contiene un transgén no encontrado en una planta de tipo salvaje de la misma especie, variedad o cultivar. Las plantas transgénicas como se definen en el contexto de la presente descripción incluyen plantas y su progenie las cuales han sido modificadas genéticamente usando técnicas recombinantes para causar la producción de al menos un polipéptido definido en la presente memoria en la planta deseada o parte de la misma. "Partes de planta transgénica" tiene un significado correspondiente.

Los términos "semilla" y "grano" son términos relacionados que se usan en la presente memoria, y tienen significados superpuestos. "Grano" se refiere a grano maduro tal como grano cosechado o grano que está aún en la planta, pero ya está listo para cosechar, pero también se puede referir a grano después de imbibición o germinación, según el contexto. El grano maduro tiene comúnmente un contenido de humedad de menos de aproximadamente el 18-20 %. "Semilla" incluye "semilla en desarrollo" así como también "grano", el cual es grano maduro, pero no grano después de imbibición o germinación. "Semilla en desarrollo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una semilla antes de la madurez, típicamente encontrada en las estructuras reproductoras de la planta después de fertilización o antesis, pero también se puede referir a dichas semillas antes de la madurez, las cuales son aisladas de una planta. El desarrollo de la semilla en la planta, típicamente se divide en las fases temprana, media, y tardía de desarrollo.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "órgano de almacenamiento de la planta" se refiere a una parte de una planta especializada en almacenar energía en la forma, por ejemplo, de proteínas, carbohidratos, lípidos. Los ejemplos de órganos de almacenamiento de la planta son las semillas, frutos, raíces tuberosas, y tubérculos. Un órgano de almacenamiento de la planta preferido de la descripción es la semilla.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "tejido vegetativo" o "parte vegetativa de la planta" o variantes de las mismas es cualquier tejido, órgano o parte de la planta que no incluye los órganos para la reproducción sexual de plantas o los órganos que poseen semillas o los tejidos u órganos estrechamente asociados tales como flores, frutos y semillas. Los tejidos y partes vegetativas incluyen al menos hojas de plantas, tallos (incluyendo espigas y brotes, pero excluyendo las cabezas), tubérculos y raíces, pero excluye flores, polen, semillas que incluyen el recubrimiento de la semilla, embrión y endosperma, fruto incluyendo el tejido del mesocarpo, vainas que poseen semillas y cabezas que poseen semillas. En una realización, la parte vegetativa de la planta es una parte aérea de la planta. En otra realización o realización adicional, la parte vegetativa de la planta es una parte verde tal como una hoja o tallo. Las partes vegetativas incluyen aquellas partes implicadas principalmente en proporcionar o apoyar la capacidad fotosintética de la planta o función relacionada, o de anclaje de la planta.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "fenotípicamente normal" se refiere a una planta o parte de la misma modificada genéticamente, particularmente un órgano de almacenamiento tal como una semilla de la descripción que no tiene una capacidad significativamente reducida para crecer y reproducirse en comparación con una planta o parte de la misma no modificada. En una realización, la planta o parte de la misma modificada genéticamente que es fenotípicamente normal comprende al menos un polinucleótido exógeno como se define en la presente memoria y tiene una capacidad para crecer o reproducirse, que es esencialmente igual que una planta o parte de la misma correspondientes que no comprenden dicho o dichos polinucleótidos. Preferiblemente, la biomasa, velocidad de crecimiento, velocidad de germinación, tamaño del órgano de almacenamiento, tamaño de la semilla y/o el número de semillas viables producidas no es menor del 90 % de la de una planta que carece de dicho polinucleótido exógeno cuando se cultivan bajo condiciones idénticas. El término no engloba características de la planta que pueden ser diferentes respecto a la planta de tipo salvaje pero que no afectan la utilidad de la planta para propósitos comerciales.

Las plantas proporcionadas por o contempladas para su uso en la práctica de la presente descripción incluyen tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. En realizaciones preferidas, las plantas de la presente descripción son plantas cultivadas (por ejemplo, cereales y legumbres, maíz, trigo, patatas, tapioca, arroz, sorgo, mijo, mandioca, cebada, o guisantes), u otras legumbres. Las plantas pueden ser cultivadas para la producción de raíces, tubérculos, hojas, tallos, flores o frutos comestibles. Las plantas pueden ser plantas vegetales u ornamentales. Las plantas de la descripción pueden ser: cártamo (Carthamus tinctorius), maíz (Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp. ), otras Brassicas tales como, por ejemplo, colinabo (Brassica napobrassica), mostaza (Brassica juncea), mostaza etíope (Brassica carinata), cramba (Crambe abyssinica), camelina (Camelina sativa), remolacha (Beta vulgaris), trébol (Trifolium sp.), lino (Linum usitatissimum), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cerale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annus), trigo (Tritium aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuates (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), batata (Lopmoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Anana comosus), árbol cítrico (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia senensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifer indica), aceituna (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia intergrifolia), almendra (Prunus amygdalus), jatrofa (Jatropha curcas), altramuz, eucalipto, palma, nuez de sauce, pongamia, avena, o cebada.

Otras plantas preferidas incluyen céspedes C4 tales como Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula, B. gracilis, Buchloe dactyloides, Panicum virgatum, Schizachyrium scoparium, especies de Miscanthus por ejemplo, Miscanthus x giganteus y Miscanthus sinensis, Sorghastrum nutans, Sporobolus cryptandrus, pasto varilla (Panicum virgatum), caña de azúcar (Saccharum officinarum), Brachyaria; céspedes C3 tales como Elymus canadensis, las legumbres Lespedeza capitata y Petalostemum villosum, la hierba silvestre Aster azureus; y plantas leñosas tales como Quercus ellipsoidalis y Q. macrocarpa.

En una realización preferida, la planta es una angiosperma.

En una realización preferida, la planta es una planta de semilla oleaginosa, preferiblemente una planta cultivada de semilla oleaginosa. Tal y como se usa en la presente memoria, una "planta de semilla oleaginosa" es una especie de planta usada para la producción comercial de lípidos procedentes de las semillas de la planta. "Producción comercial" en la presente memoria significa la producción de lípidos, preferiblemente aceite, para vender a cambio de dinero. La planta de semilla oleaginosa puede ser colza (tal como canola), maíz, girasol, cártamo, soja, sorgo, lino (semilla de lino), o remolacha de semilla oleaginosa. Además, la planta de semilla oleaginosa puede ser diferente de Brassicas, algodón, cacahuate, amapola, colinabo, mostaza, semilla de ricino, sésamo, cártamo, o plantas productoras de nueces. La planta puede producir altos niveles de lípidos en su fruto tal como aceituna, palma oleosa o coco. Las plantas de horticultura a las cuales se puede aplicar la presente descripción son lechuga, endivia, o Brassicas vegetales incluyendo col, brócoli, o coliflor. La presente descripción puede ser aplicada al tabaco, cucurbitáceas, zanahoria, fresa, tomate, o pimiento. Las plantas más preferidas son plantas de semilla oleaginosa cuyas semillas en desarrollo son no fotosintéticas, también referidas como plantas de "semillas blancas", tales como cártamo, girasol, algodón y ricino.

En una realización preferida, la planta transgénica es homocigota para cada uno y cada gen que ha sido introducido (transgén) de modo que su progenie no se segrega para el fenotipo deseado. La planta transgénica también puede ser heterocigota para el o los transgenes introducidos, preferiblemente heterocigota uniformemente para el transgén tal como, por ejemplo, en la progenie F 1, la cual ha sido cultivada de semillas híbridas. Dichas plantas pueden proporcionar ventajas tales como vigor híbrido, bien conocido en la técnica.

Transformación de plantas

Las plantas transgénicas se pueden producir usando técnicas conocidas en la técnica, tales como las descritas de manera general en Slater et al., Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), y Christou y Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley & Sons (2004).

Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "que transforma establemente", "transformado establemente" y variaciones de los mismos se refieren a la integración del polinucleótido en el genoma de la célula de modo que se transfieren a células de la progenie durante la división celular sin la necesidad de seleccionar positivamente su presencia. Los transformantes estables, o progenie de los mismos, pueden seleccionarse y/o identificarse por cualquier medio conocido en la técnica tal como transferencias Southern sobre ADN cromosómico, o hibridación in situ de ADN genómico.

La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células de plantas porque el ADN puede ser introducido en células en tejidos de plantas completos, órganos de plantas, o explantes en cultivo tisular, ya sea para expresión transitoria, o bien para la integración estable del ADN en el genoma de la célula de la planta. El uso de vectores de integración en plantas mediada por Agrobacterium para introducir ADN en células de plantas es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, US 5177010, US 5104310, US 5004863, o US 5159135). La región de ADN a ser transferida está definida por las secuencias limitantes, y el ADN que interviene (T-ADN) se inserta usualmente en el genoma de la planta. Adicionalmente, la integración del T-ADn es un proceso relativamente preciso que da como resultado pocas reorganizaciones. En aquellas variedades de plantas donde la transformación mediada por Agrobacterium es eficiente, es el método de elección a causa de la naturaleza fácil y definida de la transferencia génica. Los vectores de transformación de Agrobacterium preferidos son capaces de replicación en E. coli, así como también Agrobacterium, lo que permite manipulaciones convenientes como se describe (Klee et al., En: Plant DNA Infectious Agents, Hohn y Schell, eds., Springer- Verlag, Nueva York, p. 179-203 (1985)).

Los métodos de aceleración que pueden usarse incluyen, por ejemplo, bombardeo con microproyectiles y similares. Un ejemplo de un método para administrar moléculas de ácido nucleico transformantes a células de plantas es el bombardeo con microproyectiles. Este método ha sido revisado por Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994). Partículas no biológicas (microproyectiles) que pueden estar recubiertas con ácidos nucleicos y administradas en células mediante una fuerza propelente. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica. En otra realización, los plástidos pueden ser transformados establemente. Los métodos descritos para la transformación de plástidos en plantas superiores incluyen administración por pistola de partículas de ADN que contienen un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN hacia el genoma del plástido a través de recombinación homologa (US 5.451.513, US 5.545.818, US 5.877.402, US 5.932.479, y WO 99/05265).

La transformación de protoplastos de plantas puede lograrse usando métodos basados en la precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con polietilen glicol, electroporación, y combinaciones de estos tratamientos. La aplicación de estos sistemas a diferentes variedades de plantas depende de la capacidad para regenerar esa cepa de planta particular a partir de protoplastos. Se describen métodos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986).

También se pueden usar otros métodos de transformación celular e incluyen, pero no están limitados a, la introducción de ADN en plantas por transferencia directa de ADN en polen, por inyección directa de ADN en órganos reproductores de una planta, o por inyección directa de ADN en las células de embriones inmaduros seguido por la rehidratación de los embriones desecados.

La regeneración, desarrollo, y cultivo de plantas procedentes de transformantes de protoplastos de plantas individuales o de diversos explantes transformados son bien conocidas en la técnica (Weissbach et al., En: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)). Esta regeneración y proceso de crecimiento incluye típicamente las etapas de selección de células transformadas, cultivo de esas células individualizadas a través de las etapas usuales de desarrollo embrionario a través del estadio de plántulas enraizadas. Los embriones y semillas transgénicas se regeneran de manera similar. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan posteriormente en un medio de crecimiento de plantas apropiado tal como tierra.

El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen exógeno extraño es bien conocido en la técnica. Preferiblemente, las plantas regeneradas son autopolinizadas para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. De otra manera, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas que crecen de semillas de líneas importantes agronómicamente. A la inversa, el polen de plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente descripción que contiene un polinucleótido deseado se cultiva usando métodos bien conocidos por un experto en la técnica.

Los métodos para la transformación de dicotiledóneas, principalmente mediante el uso de Agrobacterium tumefaciens, y la obtención de plantas transgénicas se han publicado para algodón (US 5.004.863, US 5.159.135, US 5.518.908), soja (US 5.569.834, Us 5.416.011), Brassica (US 5.463.174), cacahuete (Cheng et al., 1996), y guisante (Grant et al., 1995).

Los métodos para la transformación de plantas de cereales tales como trigo y cebada para introducir variaciones genéticas en la planta, por introducción de un ácido nucleico exógeno y por regeneración de plantas a partir de protoplastos o embriones de plantas inmaduros son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, CA 2.092.588, AU 61781/94, AU 667939, US 6.100.447, PCT/US97/10621, US 5.589.617, US 6.541.257. Las células de trigo regenerables son preferiblemente del escutelo de embriones inmaduros, embriones maduros, callos derivados de los mismos, o el tejido meristemático.

Para confirmar la presencia de los transgenes en células y plantas transgénicas, puede realizarse una amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o análisis por transferencia Southern, usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Una vez que se han obtenido las plantas transgénicas, pueden cultivarse para producir tejidos o partes de la planta que tengan el fenotipo deseado. El tejido de la planta o partes de la planta, pueden cosecharse, y/o recogerse la semilla. La semilla puede servir como una fuente para crecer plantas adicionales con tejidos o partes que tengan las características deseadas.

Una planta transgénica formada usando Agrobacterium u otros métodos de transformación contiene típicamente un único locus transgénico en un cromosoma. Dichas plantas transgénicas pueden referirse como homocigotas para el o los genes añadidos. Se prefiere más una planta transgénica que es homocigota para el o los genes añadidos, esto es, una planta transgénica que contiene dos genes añadidos, un gen en el mismo locus en cada cromosoma de un par de cromosomas. Una planta transgénica homocigota puede obtenerse autofertilizando una planta transgénica hemicigota, germinando algunas de las semillas producidas y analizando las plantas resultantes para detectar el gen de interés.

También debe entenderse que dos plantas transgénicas diferentes que contienen dos loci o genes exógenos que se segregan independientemente también se pueden cruzar (emparejar) para producir descendencia que contiene ambos conjuntos de genes o loci. La autofecundación de una progenie F1 apropiada puede producir plantas que son homocigotas para ambos genes o loci exógenos. Se contempla también el retrocruzamiento a una planta parental y el cruzamiento exogámico con una planta no transgénica, como lo es la propagación vegetativa. Las descripciones de otros métodos de reproducción que se usan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en Fehr, En: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

Para la transformación de cártamo, se describen métodos particularmente útiles en Belide et al. (2011).

TILLING

En una realización, se puede usar el TILLING (Localización en Genomas de Lesiones Locales Inducidas) para producir plantas en las que se inactivan genes endógenos, por ejemplo, genes que codifican a una A12 desaturasa, una palmitoil-ACP tioestearasa, una actividad w6 o A6 desaturasa, o una combinación de dos o más de las mismas.

En una primera etapa, se inducen mutaciones introducidas, tales como nuevos cambios de un único par de bases, en una población de plantas tratando las semillas (o polen) con un mutágeno químico, y promoviendo entonces a las plantas a una generación donde las mutaciones serán heredadas establemente. Se extrae el ADN, y se almacenan las semillas de todos los miembros de la población para crear un recurso al que se puede acceder repetidamente a lo largo del tiempo.

Para un ensayo de TILLING, se diseñan cebadores de PCR para amplificar específicamente un único gen diana de interés. La especificidad es especialmente importante si una diana es un miembro de una familia de genes o parte de un genoma poliploide. Después, se pueden usar cebadores marcados con tinción para amplificar los productos de PCR de ADN combinado de múltiples individuos. Estos productos de PCR se desnaturalizan y rehibridan para permitir la formación de pares de bases no concordantes. La falta de concordancia, o heterodúplex, representa tanto polimorfismos de un solo nucleótido naturales (SNP) (es decir, varias plantas de la población probablemente son portadoras del mismo polimorfismo) como SNP inducidos (es decir, solamente plantas individuales raras probablemente presentan la mutación). Después de la formación de los heterodúplex, el uso de una endonucleasa, tal como Cell, que reconoce y escinde el ADN con emparejamientos erróneos es la clave para descubrir nuevos SNP en una población de TILLING.

Usando esta estrategia, se pueden cribar muchos miles de plantas para identificar cualquier individuo con un único cambio de base, así como también pequeñas inserciones o deleciones (1-30 pb) en cualquier gen o región específica del genoma. Los fragmentos genómicos que se ensayan pueden variar de tamaño desde 0,3 a 1,6 kb. En una combinación de 8 veces, los fragmentos de 1,4 kb (descontando los extremos de fragmentos donde la detección de SNP es problemática debido al ruido) y 96 carriles por ensayo, esta combinación permite cribar hasta un millón de pares de bases de ADN genómico por ensayo individual, haciendo que TILLING sea una técnica de alto rendimiento. TILLING se describe adicionalmente en Slade y Knauf (2005), y Henikoff et al. (2004).

Además de permitir la detección eficiente de mutaciones, la tecnología de TILLING de alto rendimiento es ideal para la detección de polimorfismos naturales. Por lo tanto, el examen de un ADN homólogo desconocido por la formación de heterodúplex con una secuencia conocida revela el número y posición de los sitios polimórficos. Se identifican tanto los cambios de nucleótidos como pequeñas inserciones y deleciones, incluyendo al menos algunos polimorfismos de número repetido. Esto se ha llamado Ecotilling (Comai et al., 2004).

Cada SNP se registra por su posición aproximada en unos cuantos nucleótidos. Por lo tanto, cada haplotipo puede ser archivado sobre la base de su movilidad. Los datos de secuencia pueden obtenerse con un esfuerzo gradual relativamente pequeño usando partes alícuotas del mismo ADN amplificado que el usado para el ensayo de escisión de emparejamientos erróneos. El cebador de secuenciación izquierdo o derecho para una única reacción se selecciona por su proximidad al polimorfismo. El software Sequencher realiza una alineación múltiple y descubre el cambio de base, que en cada caso confirmó la banda del gel.

El Ecotilling puede efectuarse de manera más barata que la secuenciación total, el método normalmente usado para la mayoría de los descubrimientos de SNP. Las placas que contienen ADN ecotípico en matrices pueden cribarse en lugar de combinaciones de ADN procedentes de plantas mutagenizadas. Debido a que la detección es en geles con escasa resolución de pares de bases y los patrones de fondo son uniformes a través de los carriles, las bandas que tinen un tamaño idéntico pueden emparejarse, descubriendo y genotipificando así SNP en una única etapa. De esta manera, la secuenciación final de SNP es simple y eficiente, tanto más, por el hecho de que las partes alícuotas de los mismos productos de PCR usados para el cribado pueden ser sometidas a secuenciación de ADN.

Procedimientos de mutagénesis

Las técnicas para generar líneas de plantas mutantes son conocidas en la técnica. Los ejemplos de mutágenos que pueden usarse para generar plantas mutantes incluyen irradiación y mutagénesis química. También se pueden producir mutantes mediante técnicas tales como mutagénesis inducida por transposón e inserción de T-ADN. Las mutaciones en cualquier gen deseado en una planta, se pueden introducir de una manera específica de sitio por nucleasa de dedo de cinc artificial (ZFN), efector TAL (TALEN) o tecnologías de CRISPR (usando una nucleasa de tipo Cas9) como se sabe en la técnica. El procedimiento de mutagénesis puede realizarse sobre cualquier célula parental de una planta, por ejemplo, una semilla o una célula parental en cultivo de tejido.

Los mutágenos químicos se pueden clasificar por sus propiedades químicas, p. ej., agentes alquilantes, agentes reticuladores, etc. Los mutágenos químicos útiles incluyen, pero no están limitados a, N-etil-N-nitrosourea (ENU); N-metil-N-nitrosourea (MNU); hidrocloruro de procarbazina; clorambucilo; ciclofosfamida; metanosulfonato de metilo (MMS); metanosulfonato de etilo (EMS), sulfato de dietilo; monómero de acrilamida; trietilen melamina (TEM); melfalán; mostaza de nitrógeno; vincristina; dimetilnitrosamina; N-metil-N'-nitro-Nitrosoguanidina (MNNG); 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA); óxido de etileno; hexametilfosforamida; y bisulfán.

Un ejemplo de irradiación adecuada para inducir mutaciones es por radiación gama, tal como la suministrada mediante una fuente de Cesio 137. La radiación gama, preferiblemente se suministra a las células de plantas en una dosificación de aproximadamente 60 a 200 Krad., y más preferiblemente en una dosificación de aproximadamente 60 a 90 Krad.

Las plantas se exponen típicamente a un mutágeno durante una duración suficiente como para lograr la modificación genética deseada pero insuficiente para destruir completamente la viabilidad de las células y su capacidad para ser regeneradas en una planta.

Los procedimientos de mutagénesis descritos anteriormente dan como resultado típicamente la generación de mutantes en un gen de interés a una frecuencia de al menos 1 en 1.000 plantas, lo que significa que el cribado de poblaciones de las plantas mutagenizadas es un medio practicable para identificar mutantes en cualquier gen de interés. La identificación de mutantes también puede lograrse mediante tecnologías de secuenciación de nucleótidos paralelas masivamente.

Selección asistida por marcadores

La selección asistida por marcadores es un método bien reconocido para seleccionar plantas heterocigotas requerido cuando se produce el retrocruzamiento con un parental recurrente en un programa de reproducción clásico. La población de plantas en cada generación retrocruzada será heterocigota para el gen de interés normalmente presente en una relación de 1:1 en una población retrocruzada, y el marcador molecular puede ser usado para distinguir los dos alelos del gen. Mediante la extracción del ADN, por ejemplo, de brotes jóvenes y el ensayo con un marcador específico para el rasgo deseado ingresado, se hace la selección temprana de plantas para retrocruzamiento adicional, aunque la energía y recursos se concentren sobre menos plantas. Para acelerar adicionalmente el programa de retrocruzamiento, el embrión de semillas inmaduras (25 días después de la antesis) puede escindirse y crecerse sobre medio nutriente bajo condiciones estériles, en lugar de permitir la madurez total de la semilla. Este proceso, denominado "rescate del embrión", usado en combinación con extracción de ADN en el tercer estadio de la hoja y el análisis para el genotipo deseado permite la rápida selección de plantas que portan el rasgo deseado, que pueden nutrirse hasta la madurez en el invernadero o campo para el retrocruzamiento posterior adicional con el parental recurrente.

Se puede usar cualquier técnica de biología molecular conocida en la técnica que sea capaz de detectar un gen FAD2, FATb o FAD6 en los métodos de la presente descripción. Dichos métodos incluyen, pero no están limitados a, el uso de amplificación de ácido nucleico, secuenciación de ácido nucleico, hibridación de ácido nucleico con sondas marcadas adecuadamente, análisis conformacional de una sola cadena (SSCA), electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE), análisis de heterodúplex (HET), análisis de escisión química (CCM), escisión catalítica de ácido nucleico o una combinación de las mismas (véase, por ejemplo, Lemieux, 2000; Langridge et al., 2001). La descripción también incluye el uso de técnicas de marcadores moleculares para detectar polimorfismos vinculados a alelos de (por ejemplo) un gen FAD2, FATB o FAD6 que confiere el fenotipo deseado. Dichos métodos incluyen la detección o análisis de polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), RAPD, polimorfismos de longitud del fragmento amplificado (AFLP) y polimorfismos de microsatélite (repetición de secuencia simple, SSR). Los marcadores ligados estrechamente se pueden obtener fácilmente por métodos bien conocidos en la técnica, tales como análisis de segregantes agrupados, según se revisa por Langridge et al., (2001).

La "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") es una reacción en la cual se hacen copias replicadas de un polinucleótido diana usando un "par de cebadores" o "conjunto de cebadores" que consisten en un cebador "en 5'" y un cebador "en 3'" y un catalizador de la polimerización, tal como una ADN polimerasa, y típicamente, una enzima polimerasa térmicamente estable. En la técnica se conocen los métodos para PCR, y se enseñan, por ejemplo, en "PCR" (Ed. M. J. Me Pherson y S.G. Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd. Oxford). La PCR se puede efectuar sobre ADNc obtenido a partir de la transcripción inversa de ARNm aislado de células de plantas. Sin embargo, generalmente, será más fácil si la PCR se efectúa sobre ADN genómico aislado de una planta.

Un cebador es una secuencia de oligonucleótido que es capaz de hibridar de una forma específica de secuencia con la secuencia diana y que se extiende durante la PCR. Los amplicones o productos de PCR o fragmentos de PCR o productos de amplificación son productos de extensión que comprenden el cebador y las copias recién sintetizadas de las secuencias diana. Los sistemas de PCR multiplex contienen múltiples conjuntos de cebadores que dan como resultado la producción simultánea de más de un amplicón. Los cebadores pueden emparejarse perfectamente con la secuencia diana o pueden contener bases no emparejadas internas que pueden dar como resultado la introducción de sitios de reconocimiento/escisión de enzimas de restricción o ácido nucleico catalítico en secuencias diana específicas. Los cebadores también pueden contener secuencias adicionales y/o contener nucleótidos marcados o modificados para facilitar la captura o detección de amplicones. Los ciclos repetidos de desnaturalización térmica del ADN, la hibridación de los cebadores a sus secuencias complementarias y la extensión de los cebadores hibridados con polimerasa da como resultado la amplificación exponencial de la secuencia diana. Los términos diana o secuencia diana o molde se refieren a secuencias de ácidos nucleicos que son amplificadas.

Los métodos para la secuenciación directa de secuencias de nucleótidos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Ausubel et al. (supra) y Sambrook et al. (supra). La secuenciación puede llevarse a cabo por cualquier método adecuado, por ejemplo, secuenciación de didesoxi, secuenciación química o variaciones de las mismas. La secuenciación directa tiene la ventaja de determinar variaciones en cualquier par de bases de una secuencia particular.

Los sistemas de detección basados en hibridación incluyen, pero no están limitados a, el ensayo TaqMan y ensayos de baliza molecular (US 5.925.517). El ensayo TaqMan (US 5.962.233) usa sondas específicas de alelo (ASO) con un tinte donador en un extremo y un tinte receptor en el otro extremo de modo que el par de tinte interacciona vía transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET).

En una realización, el método descrito en el Ejemplo 7 se usa en los programas de selección y reproducción para identificar y seleccionar plantas de cártamo con la mutación ol. Por ejemplo, el método comprende efectuar una reacción de amplificación sobre el ADN genómico obtenido de la planta usando uno o ambos de los siguientes conjuntos de cebadores;

i) 5'-ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT-3' (SEQ ID NO: 140) y 5'-GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT-3' (SEQ ID NO: 141), y

ii) 5-AGTTATGGTTCGATGATCGACG-3' (SEQ ID NO: 142) y 5-TTGCTATACATATTGAAGGCACT-3' (SEQ ID NO: 143).

Polipéptidos

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan generalmente indistintamente.

Un polipéptido o clase de polipéptidos puede definirse por el grado de identidad (% de identidad) de su secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia, o por tener un % de identidad mayor con respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia que con otra. El % de identidad de un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de referencia se determina típicamente por análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970; programa GCG) con parámetros de una penalización por creación de hueco = 5, y una penalización por extensión de hueco = 0,3. La secuencia de consulta tiene una longitud de al menos 100 aminoácidos y el análisis gAp alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 aminoácidos. Aún más preferiblemente, la secuencia de consulta tiene una longitud de al menos 250 aminoácidos y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 250 aminoácidos. Aún más preferiblemente, el análisis GAP alinea dos secuencias sobre su longitud total. El polipéptido o clase de polipéptidos puede tener la misma actividad enzimática que, o una actividad diferente de, o carecer de la actividad de, el polipéptido de referencia. Preferiblemente, el polipéptido tiene una actividad enzimática de al menos el 10 % de la actividad del polipéptido de referencia.

Tal y como se usa en la presente memoria, un "fragmento biológicamente activo" es una porción de un polipéptido de la descripción que mantiene una actividad definida de un polipéptido de referencia de longitud completa, por ejemplo, actividad A12 desaturasa, palmitoil-ACP tioestearasa o A6 desaturasa. Los fragmentos biológicamente activos, tal y como se usa en la presente memoria, excluyen el polipéptido de longitud completa. Los fragmentos biológicamente activos pueden ser cualquier una porción de cualquier tamaño siempre que mantengan la actividad definida. Preferiblemente, el fragmento biológicamente activo mantiene al menos el 10 % de la actividad del polipéptido de longitud completa.

Con respecto a un polipéptido o enzima definido, se apreciará que cifras del % de identidad más altas que las proporcionadas en la presente memoria englobarán realizaciones preferidas. Por lo tanto, cuando sea aplicable, a la vista de las cifras del % de identidad mínimo, se prefiere que el polipéptido/enzima comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 50 %, más preferiblemente al menos un 60 %, más preferiblemente al menos un 65 %, más preferiblemente al menos un 70 %, más preferiblemente al menos un 75 %, más preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, más preferiblemente al menos un 93 %, más preferiblemente al menos un 94 %, más preferiblemente al menos un 95 %, más preferiblemente al menos un 96 %, más preferiblemente al menos un 97 %, más preferiblemente al menos un 98 %, más preferiblemente al menos un 99 %, más preferiblemente al menos un 99,1 %, más preferiblemente al menos un 99,2 %, más preferiblemente al menos un 99,3 %, más preferiblemente al menos un 99,4 %, más preferiblemente al menos un 99,5 %, más preferiblemente al menos un 99,6 %, más preferiblemente al menos un 99,7 %, más preferiblemente al menos un 99,8 %, y aún más preferiblemente al menos un 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO: nombrada relevante.

Se pueden preparar mutantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos definidos en la presente memoria introduciendo cambios apropiados de nucleótidos en un ácido nucleico definido en la presente memoria, o por síntesis in vitro del polipéptido deseado. Dichos mutantes incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones, o sustituciones de residuos en la secuencia de aminoácidos. Se puede hacer una combinación de deleciones, inserciones y sustituciones para llegar a la construcción final, siempre que el producto del polipéptido final posea las características deseadas.

Se pueden preparar polipéptidos mutantes (alterados) usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, usando estrategias de evolución dirigida o de diseño racional (véase a continuación). Los productos derivados de ADN mutado/alterado pueden cribarse fácilmente usando técnicas descritas en la presente memoria para determinar si poseen, o carecen de, actividad A12 desaturasa, palmitoil-ACP tioestearasa o w6 A6 desaturasa.

Al diseñar mutantes de secuencias de aminoácidos, la localización del sitio de la mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la o las características a ser modificadas. Los sitios para mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por ejemplo, (1) sustituyendo primero con elecciones de aminoácidos conservadores y luego con selecciones más radicales dependiendo de los resultados logrados, (2) eliminando el residuo diana, o (3) insertando otros residuos adyacentes al sitio localizado. Como apreciará el experto en la técnica, el uso de sustituciones no conservadoras puede usarse cuando se produzca un mutante con actividad enzimática reducida.

Las deleciones de secuencias de aminoácidos generalmente varían de aproximadamente 1 a 15 residuos, más preferiblemente aproximadamente 1 a 10 residuos y típicamente aproximadamente 1 a 5 residuos contiguos, pero pueden ser mucho más largas, particularmente cuando el mutante se diseña para reducir la actividad enzimática.

Los mutantes por sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en el polipéptido eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de máximo interés para mutagénesis sustitucional para inactivar una enzima incluyen sitios identificados como el o los sitios activos. Otros sitios de interés son aquellos en los cuales residuos particulares obtenidos de varias cepas o especies son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1, mientras que las sustituciones no conservadoras son sustituciones que no son sustituciones conservadoras.

En una realización, un polipéptido de la descripción es una A12 desaturasa y que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en una cualquiera de las SEQ ID NO: 27 a 34, 36 o 37, un fragmento biológicamente activo de las mismas, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 27 a 34, 36 o 37.

En otra realización, un polipéptido de la descripción es oleato de A12 desaturasa presente en la semilla (semilla oleaginosa) de una planta de semilla oleaginosa que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en una cualquiera de las SEQ ID NO: 27, 28 o 36, un fragmento de biológicamente activo de las mismas, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 27, 28 o 36.

En otra realización, un polipéptido de la descripción es una A12-acetilenasa que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en la SEQ ID NO: 37, un fragmento biológicamente activo de la misma, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a la SEQ ID NO: 37.

En otra realización, un polipéptido de la descripción es una palmitoleato de A12 desaturasa que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en la SEQ ID NO: 35, un fragmento biológicamente activo de la misma, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a la SEQ ID NO: 35.

En otra realización, un polipéptido de la descripción es una palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) que comprende aminoácidos que tienen una secuencia como se proporciona en una cualquiera de las SEQ ID NO: 44 o 45, un fragmento biológicamente activo de las mismas, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 44 o 45.

Tabla 1. Sustituciones conservadoras.

En otra realización, un polipéptido de la descripción e s una palmitoil-ACP tioes tearasa (FATB) presen te en la semilla de una planta de semilla oleaginosa que com prende aminoácidos que tienen una secuenc ia como s e proporciona en la SEQ ID NO: 45, un fragmento biológicamente activo de la misma, o una secuenc ia de aminoácidos que e s al m enos un 40 % idéntica a la S E Q ID NO: 45.

En otra realización, un polipéptido de la descripción e s una A6 desaturasa , la cual com prende aminoácidos que tienen una secu en c ia como s e proporciona en la SEQ ID NO: 48, un fragmento biológicamente activo de la misma, o una secuenc ia de aminoácidos que e s al m enos un 40 % idéntica a la SEQ ID NO: 48.

En la sección de Ejemplos s e proporcionan características preferidas de las enzim as de la descripción, en particular en el Ejemplo 2 en relación a FAD2 de cártamo.

Los polipéptidos como los descritos en la p resen te memoria s e pueden expresar como una fusión con al m enos otro polipéptido. En una realización preferida, el al m enos otro polipéptido s e selecciona del grupo que consiste en: un polipéptido que mejora la estabilidad de la proteína de fusión, y un polipéptido que auxilia en la purificación de la proteína de fusión.

Producción de lípidos y/o aceites con alto contenido en ácido oleico

S e pueden usar técnicas que se practican rutinariamente en la técnica para extraer, procesar, purificar y analizar los lípidos producidos por las plantas, en particular, las semillas, de la presente descripción. Dichas técnicas se describen y explican en toda la bibliografía en fuentes tales como, Fereidoon Shahidi, Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc. (2001) D1.1.1-D1.1.11, y Perez-Vich et al. (1998).

Producción de aceite de semillas

Típicamente, las semillas de las plantas s e cuecen, comprimen, y/o extraen para producir aceite de semilla crudo, el cual e s en tonces desgom ado, refinado, blanqueado, y desodorizado. Generalmente, las técnicas para triturar la semilla son conocidas en la técnica. Por ejemplo, las semillas o leaginosas pueden se r tem pladas rociándolas con agua para aumentar el contenido de hum edad a, por ejemplo, el 8,5 %, y laminadas usando un laminador de rodillos lisos con un ajuste de hueco de 0,23 a 0,27 mm. Dependiendo del tipo de semilla, el ag u a puede no se r añad ida an tes del triturado. La aplicación de calor inactiva las enzimas, facilita la ruptura celular adicional, coalesce las gotitas de líquido, y aglomera las partículas de proteínas, todo lo cual facilita el proceso de extracción.

En una realización, la mayor parte del aceite de la semilla s e libera por su paso a través de una prensa de tornillo. Las tortas expulsadas de la prensa de tornillo son entonces extraídas con disolvente, por ejemplo, con hexano, usando una columna con trazado de calor. Alternativamente, el aceite de semilla crudo producido mediante la operación de prensado puede pasarse a través de un tanque de sedimentación con una línea de drenaje superior para eliminar los sólidos que son exprimidos con el aceite de semilla durante la operación de prensado. El residuo sólido del prensado y extracción, después de la eliminación del hexano, es lo comestible de la semilla, que se usa típicamente como pienso animal. El aceite de la semilla clarificado pasarse a través de una placa y filtro de marco para eliminar cualquier partícula sólida fina remanente. Si se desea, el aceite de semilla recuperado del proceso de extracción puede combinarse con el aceite de semilla clarificado para producir un aceite de semilla crudo mezclado.

Una vez que el disolvente se elimina del aceite de semilla crudo, las porciones prensadas y extraídas se combinan y se someten a procedimientos de procesamiento de lípidos normales tales como, por ejemplo, desgomado, refinación cáustica, blanqueo y desodorización. Algunas o todas las etapas se pueden omitir, dependiendo de la naturaleza de la ruta del producto, p. ej., para aceite de grado alimenticio, puede ser necesario el tratamiento limitado mientras que para aplicaciones oleoquímicas, se requieren más etapas de purificación.

Desgomado

El desgomado es una etapa previa en la refinación de aceites y su propósito principal es la eliminación de la mayor parte de los fosfolípidos del aceite, los cuales pueden estar presentes como aproximadamente el 1-2 % del lípido total extraído. La adición de-2 % de agua, que contiene típicamente ácido fosfórico, a 70-80 °C al aceite crudo da como resultado la separación de la mayor parte de los fosfolípidos acompañados por metales en trazas y pigmentos. El material insoluble que se elimina es principalmente una mezcla de fosfolípidos y triacilgliceroles y es también conocido como lecitina. El desgomado se puede efectuar por adición de ácido fosfórico concentrado al aceite de semilla crudo para convertir los fosfátidos no hidratables a una forma hidratable, y para quelar metales menores que están presentes. La goma se separa del aceite de semilla por centrifugación.

Refinación con álcali

La refinación con álcali es uno de los procesos de refinación para tratar el aceite crudo, algunas veces referida como neutralización. Usualmente sigue al desgomado y precede al blanqueo. Después del desgomado, el aceite de semilla puede tratarse por la adición de una cantidad suficiente de una disolución alcalina para titular todos los ácidos grasos y ácidos fosfóricos, y eliminar los jabones así formados. Los materiales alcalinos adecuados incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, hidróxido de litio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio e hidróxido de amonio. Este proceso se lleva a cabo típicamente a temperatura ambiente y elimina la fracción de ácidos grasos libres. El jabón se elimina por centrifugación o por extracción en un disolvente para el jabón, y el aceite neutralizado se lava con agua. Si se requiere, cualquier exceso de álcali en el aceite puede neutralizarse con un ácido adecuado tal como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico.

Blanqueo

El blanqueo es un proceso de refinación en el cual los aceites se calientan a 90-120 °C durante 10-30 minutos en presencia de una tierra blanqueadora (0,2-2,0 %) y en ausencia de oxígeno operando con nitrógeno o vapor o al vacío. Esta etapa en el procesamiento de aceite se diseña para eliminar pigmentos no deseados (carotenoides, clorofila, gosipol, etc) y el proceso también elimina productos de oxidación, metales en trazas, compuestos de azufre y trazas de jabón.

Desodorización

La desodorización es un tratamiento de aceites y grasas a una temperatura alta (200-260 °C) y una presión baja (0,1-1 mm de Hg). Esto se logra, típicamente, introduciendo vapor en el aceite de semilla a una velocidad de aproximadamente 0,1 ml/minuto/100 ml de aceite de semilla. Después de aproximadamente 30 minutos de rociado, el aceite de la semilla se deja enfriar al vacío. El aceite de semilla se transfiere típicamente a un contenedor de vidrio y se purga con argón antes de ser almacenado bajo refrigeración. Este tratamiento mejora el color del aceite de semilla y elimina una mayoría de las sustancias volátiles o compuestos olorosos incluyendo cualquier ácido graso libre, monoacilgliceroles y productos de oxidación remanentes.

Winterización

La winterización es un proceso usado algunas veces en la producción comercial de aceites para la separación de aceites y grasas en fracciones sólidas (estearina) y liquidas (oleína) por cristalización a temperaturas subambientales. Se aplicó originalmente a aceite de semilla de algodón para producir un producto libre de sólidos. Típicamente, se usa para disminuir el contenido de ácidos grasos saturados de los aceites.

Transesterificación

La transesterificación es un proceso que intercambia los ácidos grasos en y entre TAG, inicialmente liberando ácidos grasos de los TAG ya sea como ácidos grasos libres o bien como ésteres de ácidos grasos, usualmente ésteres etílicos de ácidos grasos. Cuando se combina con un proceso de fraccionamiento, la transesterificación puede usarse para modificar la composición de ácidos grasos de lípidos (Marangoni et al., 1995). La transesterificación puede usar medios químicos o enzimáticos, usando el último lipasas las cuales pueden ser específicos de la posición (específicas de sn-1/3 o sn-2) para el ácido graso en el TAG, o tener una preferencia por algunos ácidos grasos sobre otros (Speranza et al., 2012). El fraccionamiento de ácidos grasos para incrementar la concentración de LC-PUFA en un aceite se puede lograr por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cristalización por congelación, formación de complejos usando urea, destilación molecular, extracción fluida supercrítica y formación de complejos con iones de plata. La formación de complejos con urea es un método preferido por su simplicidad y eficiencia en la reducción del nivel de ácidos grasos monoinsaturados y saturados en el aceite (Gamez et al., 2003). Inicialmente, los TAG del aceite son separados en sus ácidos grasos constituyentes, a menudo en la forma de ésteres de ácidos grasos, por hidrólisis o por lipasas y estos ácidos grasos libres o ésteres de ácidos grasos se mezclan entonces con una disolución etanólica de urea para la formación de complejos. Los ácidos grasos saturados y monoinsaturados forman complejos con urea fácilmente y se separan por cristalización por enfriamiento y subsecuentemente pueden ser eliminados por filtración. La fracción que no forma complejos con urea se enriquece de esta manera con LC-PUFA.

Hidrogenación

La hidrogenación de ácidos grasos implica el tratamiento con hidrógeno, típicamente en presencia de un catalizador. La hidrogenación no catalítica tiene lugar solamente a muy altas temperaturas.

La hidrogenación se usa comúnmente en el procesamiento de aceites de plantas. La hidrogenación convierte ácidos grasos insaturados en ácidos grasos saturados, y en algunos casos, en grasas trans. La hidrogenación da como resultado la conversión de aceites de plantas líquidos en grasas sólidas o semisólidas, tales como aquellas presentes en la margarina. El cambio del grado de saturación de la grasa cambia algunas propiedades físicas importantes tales como el rango de fusión, que es la razón por la que los aceites líquidos se vuelven semisólidos. Se prefieren grasas sólidas o semisólidas para hornear porque la manera en la que la grasa se mezcla con la harina produce una textura más deseable en el producto horneado. Como los aceites de plantas parcialmente hidrogenados son más baratos que las grasas de origen animal, están disponibles en un amplio rango de consistencias, y tienen otras características deseables (p. ej., estabilidad oxidativa incrementada/vida útil más larga), son las grasas predominantes usadas como mantecas en la mayoría de los artículos horneados comerciales.

En una realización, el lípido/aceite de la descripción no ha sido hidrogenado. Una indicación de que el lípido o aceite no ha sido hidrogenado es la ausencia de cualquier ácido graso trans en su TAG.

Usos de lípidos

Los lípidos tales como el aceite de semillas, preferiblemente el aceite de semilla de cártamo, producidos por los métodos descritos en la presente memoria tienen una variedad de usos. En algunas realizaciones, los lípidos se usan como aceites de alimentos. En otras realizaciones, los lípidos son refinados y se usan como lubricantes o para otros usos industriales tales como la síntesis de plásticos. Se pueden usar en la fabricación de cosméticos, jabones, suavizantes de telas, aislamiento eléctrico o detergentes. Se pueden usar para producir productos químicos agrícolas tales como tensioactivos o emulsificantes. En algunas realizaciones, los lípidos son refinados para producir biodiésel. El aceite de la descripción puede usarse ventajosamente en pinturas y barnices ya que la ausencia de ácido linolénico significa que no se decolora fácilmente.

Un producto industrial producido usando un método de la descripción puede ser un producto hidrocarbonado tal como ésteres de ácidos grasos, preferiblemente ésteres metílicos de ácidos grasos y/o ésteres etílicos de ácidos grasos, un alcano tal como metano, etano o alcano de cadena más larga, una mezcla de alcanos de cadena más larga, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o hidrógeno gas, un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, biocarbón, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbón. El producto industrial puede ser una mezcla de cualquiera de estos componentes, tal como una mezcla de alcanos, o alcanos y alquenos, preferiblemente una mezcla que sea predominantemente (>50 %) alcanos C4-C8, o predominantemente alcanos de C6 a C10, o predominantemente alcanos C6 a C8. El producto industrial no es dióxido de carbono ni agua, aunque estas moléculas pueden ser producidas en combinación con el producto industrial. El producto industrial puede ser un gas a temperatura ambiente/presión atmosférica, o preferiblemente, un líquido, o un sólido tal como biocarbón, o el proceso puede producir una combinación de un componente gas, un componente líquido y un componente sólido tal como monóxido de carbono, gas hidrógeno, alcanos y biocarbón, los cuales se pueden separar subsecuentemente. En una realización, el producto hidrocarbonado es predominantemente ésteres metílicos de ácidos grasos. En una realización alternativa, el producto hidrocarbonado es un producto diferente a ésteres metílicos de ácidos grasos.

Se puede aplicar calor en el proceso, tal como por pirólisis, combustión, gasificación, o junto con digestión enzimática (incluyendo digestión anaeróbica, compostaje, fermentación). La gasificación a temperaturas más bajas tiene lugar a, por ejemplo, entre aproximadamente 700 °C a aproximadamente 1.000 °C. La gasificación a temperaturas más altas tiene lugar a, por ejemplo, entre aproximadamente 1.200 °C a aproximadamente 1.600 °C. La pirólisis a temperaturas más bajas (pirólisis más lenta), tiene lugar a aproximadamente 400 °C, mientras que la pirólisis a temperaturas más altas tiene lugar a aproximadamente 500 °C. La digestión mesofílica tiene lugar entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C. La digestión termofílica tiene lugar de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 65 °C.

Los medios químicos incluyen, pero no están limitados a, craqueo catalítico, digestión anaeróbica, fermentación, compostaje y transesterificación. En una realización, un medio químico usa un catalizador o mezcla de catalizadores, que se pueden aplicar junto con calor. El proceso puede usar un catalizador homogéneo, un catalizador heterogéneo y/o un catalizador enzimático. En una realización, el catalizador es un catalizador de metal de transición, un catalizador del tipo tamiz molecular, un catalizador de alúmina activada o carbonato de sodio como un catalizador. Los catalizadores incluyen catalizadores ácidos tales como ácido sulfúrico, o catalizadores alcalinos tales como hidróxido de sodio o potasio u otros hidróxidos. Los medios químicos pueden comprender la transesterificación de ácidos grasos en el lípido, proceso que puede usar un catalizador homogéneo, un catalizador heterogéneo y/o un catalizador enzimático. La conversión puede comprender pirólisis, que aplica calor y puede aplicar medios químicos, y puede usar un catalizador de metal de transición, un catalizador del tipo tamiz molecular, un catalizador de alúmina activada y/o carbonato de sodio como un catalizador.

Los medios enzimáticos incluyen, pero no están limitados a, digestión por microorganismo en, por ejemplo, digestión anaeróbica, fermentación o compostaje, o por proteínas enzimáticas recombinantes.

Biocombustible

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "biocombustible" incluye biodiésel y bioalcohol. El biodiésel puede prepararse a partir de aceites derivados de plantas, algas y hongos. El bioalcohol se produce a partir de la fermentación del azúcar. Este azúcar puede extraerse directamente de plantas (p. ej., caña de azúcar), derivarse del almidón vegetal (p. ej., maíz o trigo) o prepararse a partir de celulosa (p. ej., madera, hojas o tallos).

Actualmente, los biocombustibles son más costosos de producir que los combustibles de petróleo. Además, de los costes de procesamiento, el cultivo de biocombustibles requiere plantar, fertilizar, aplicaciones de pesticidas y herbicidas, cosechar y transportar. Las plantas, algas y hongos de la presente descripción pueden reducir los costes de producción de los biocombustibles.

Los métodos generales, para la producción de biocombustible pueden encontrarse en, por ejemplo, Maher y Bressler (2006), Maher y Bressler (2007), Greenwall et al. (2011), Karmakar et al. (2010), Alonso et al. (2010), Lee y Mohamed (2010), Liu et al. (2010), Gong y Jiang (2011), Endalew et al. (2011) y Semwal et al. (2011).

Biodiésel

La producción de biodiésel, o ésteres alquílicos, es bien conocida. Existen tres rutas básicas para la producción de ésteres de lípidos: 1) Transesterificación del lípido con alcohol, catalizada por base; 2) Esterificación del lípido con metanol, catalizada por ácido directa; y 3) Conversión del lípido en ácidos grasos, y luego a ésteres de alquilo con catálisis ácida.

Se puede usar cualquier método para preparar ésteres alquílicos de ácidos grasos y éteres de glicerilo (en el cual uno, dos o tres de los grupos hidroxi en el glicerol son eterificados). Por ejemplo, se pueden preparar ácidos grasos, por ejemplo, hidrolizando o saponificando triglicéridos con catalizadores ácidos o básicos, respectivamente, o usando una enzima tal como una lipasa o una esterasa. Se pueden preparar ésteres alquílicos de ácidos grasos haciendo reaccionar un ácido graso con un alcohol en presencia de un catalizador ácido. También se pueden preparar ésteres alquílicos de ácidos grasos haciendo reaccionar un triglicérido con un alcohol en presencia de un catalizador ácido o básico. Se pueden preparar los éteres de glicerol, por ejemplo, haciendo reaccionar glicerol con un haluro de alquilo en presencia de base, o con una olefina o alcohol en presencia de un catalizador ácido.

En algunas realizaciones preferidas, los lípidos son transesterificados para producir ésteres metílicos y glicerol. En algunas realizaciones preferidas, los lípidos se hacen reaccionar con un alcohol (tal como metanol o etanol) en presencia de un catalizador (por ejemplo, hidróxido de sodio o potasio) para producir ésteres de alquilo. Los ésteres de alquilo se pueden usar para biodiésel o mezclarse con combustibles basados en petróleo.

Los ésteres de alquilo pueden mezclarse directamente con combustible diésel, o lavarse con agua u otras disoluciones acuosas para eliminar varias impurezas, incluyendo los catalizadores, antes del mezclado. Es posible neutralizar los catalizadores ácidos con base. Sin embargo, este proceso produce sal. Para evitar la corrosión del motor, es preferible minimizar la concentración de sal en la composición de aditivo de combustible. Las sales pueden ser eliminadas sustancialmente de la composición, por ejemplo, lavando la composición con agua.

En otra realización, la composición se seca después de ser lavada, por ejemplo, pasando la composición a través de un agente secante tal como sulfato de calcio.

En otra realización más, se obtiene un aditivo para combustible neutro sin producir sales o usando una etapa de lavado, usando un ácido polimérico, tal como Dowex 50^TM, que es una resina que contiene grupos ácido sulfónico. El catalizador se elimina fácilmente por filtración después de que se completen las reacciones de esterificación y eterificación.

Triacilgliceroles de plantas como una fuente de biocombustible

El uso de triacilgliceroles de plantas para la producción de biocombustible se revisa en Durrett et al. (2008). Brevemente, los aceites de plantas se componen principalmente de varios triacilgliceroles (TAG), moléculas que consisten en tres cadenas de ácidos grasos (usualmente con una longitud de 18 o 16 carbonos) esterificadas con glicerol. Las cadenas de acilo grasas son químicamente similares a los hidrocarburos alifáticos que representan la mayor parte de las moléculas encontradas en petróleo y diésel. Los hidrocarburos en petróleo contienen entre 5 y 12 átomos de carbono por molécula, y este combustible volátil se mezcla con aire y se enciende con una chispa en un motor convencional. En contraste, los componentes del combustible diésel típicamente tienen 10-15 átomos de carbono por molécula y se encienden por la muy alta compresión obtenida en un motor diésel. Sin embargo, la mayoría de los TAG de plantas tienen un rango de viscosidad que es mucho más alto que el del diésel convencional: 17,3-32,9 mm²s^-1en comparación con 1,9-4,1²s^-1, respectivamente (ASTM D975; Knothe y Steidley, 2005). Esta viscosidad más alta da como resultado una escasa atomización de combustible en motores diésel modernos, lo que provoca problemas derivados de la combustión incompleta tales como depósitos de carbono y coquización (Ryan et al., 1984). Para superar este problema, los TAG son convertidos a ésteres de ácidos grasos menos viscosos por esterificación con un alcohol primario, más comúnmente metanol. Este combustible resultante es comúnmente referido como biodiésel y tiene un rango de viscosidad dinámica de 1,9 a 6,0 mm²s^-1(ASTM D6751). Los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) encontrados en el biodiésel tienen una alta densidad energética como se refleja por su alto calor de combustión, que es similar, si no mayor, que el del diésel convencional (Knothe, 2005). De manera similar, el número de cetano (una medida de la calidad de ignición del diésel) de los FAME encontrados en el biodiésel excede el del diésel convencional (Knothe, 2005).

Los aceites de plantas se componen mayormente de cinco ácidos grasos comunes, concretamente palmitato (16:0), estearato (18:0), oleato (18:1), linoleato (18:2), y linolenato (18:3), aunque, dependiendo de la especie particular, también pueden ser constituyentes importantes los ácidos grasos más cortos o más largos. Estos ácidos grasos difieren entre sí en términos de la longitud de la cadena acilo y del número de enlaces dobles, conduciendo a diferentes propiedades físicas. Consecuentemente, las propiedades del combustible de biodiésel derivado de una mezcla de ácidos grasos son dependientes de esa composición. La alteración del perfil de ácidos grasos puede, por lo tanto, mejorar las propiedades del combustible de biodiésel tales como las características de flujo a temperatura fría, estabilidad oxidativa y emisiones de NO^x. La alteración de la composición de ácidos grasos de los tAg puede reducir la viscosidad de los aceites de plantas, eliminando la necesidad de una modificación química, mejorando así la rentabilidad de los biocombustibles.

Productos alimenticios

El lípido/aceite de la descripción tiene ventajas en aplicaciones alimenticias a causa de su muy alto contenido de ácido oleico y los bajos niveles de ácido linoleico (<3,2 %) y ácidos grasos saturados tales como ácido palmítico, y el nivel esencialmente cero de ácido linolénico. Esto proporciona al aceite una alta estabilidad oxidativa, produciendo menos rancidez y haciéndolo ideal para aplicaciones alimenticias donde se requiere calor, tales como en aplicaciones de frituras, por ejemplo, patatas fritas. El aceite tiene un OSI (índice de estabilidad oxidativa) alto, que se mide como la duración del tiempo que un aceite puede mantenerse a 110 °C, tal como más de 20 o 25 horas, preferiblemente más de 30 horas o más de 50 horas. Los niveles bajos de ácidos grasos saturados en relación con otros aceites de plantas proporcionan beneficios para la salud ya que los ácidos grasos saturados se han asociado con efectos nocivos sobre la salud. Los aceites también tienen un contenido de ácidos grasos trans esencialmente cero, lo que es deseable en algunos mercados ya que los ácidos grasos trans han sido también asociados con efectos negativos sobre la salud del corazón o la elevación de colesterol LDL. Además, debido a su muy bajo nivel de ácidos grasos poliinsaturados, el aceite no requiere hidrogenación para disminuir los niveles de PUFA-dicha hidrogenación produce ácidos grasos trans. Los aceites son también ventajosos para reducir la incidencia o gravedad de la obesidad y de la diabetes. Son también deseables para aplicaciones alimenticias porque contienen solamente ácidos grasos naturales (Scarth y Tang, 2006).

Para los propósitos de la presente descripción, los "productos alimenticios" incluyen cualquier preparación o alimento para consumo animal o humano (incluyendo para consumo enteral y/o parenteral) que cuando se capta en el cuerpo: (1) sirve para nutrir o construir tejidos o suministrar energía, y/o (2) mantener, restaurar o apoyar el estado nutricional o función metabólica adecuados. Los productos alimenticios de la descripción incluyen composiciones nutricionales para bebés y/o niños pequeños.

Los productos alimenticios de la descripción comprenden, por ejemplo, una célula de la descripción, una planta de la descripción, la parte de planta de la descripción. la semilla de la descripción, un extracto de la descripción, el producto de un método de la descripción, o una composición junto con vehículo(s) adecuado(s). El término "vehículo" se usa en su sentido más amplio para englobar cualquier componente que pueda tener o no valor nutricional. Como apreciará un experto en la técnica, el vehículo debe ser adecuado para su uso (o usarse en una concentración lo suficientemente baja) en un producto alimenticio, de modo que no tenga efectos perjudiciales sobre un organismo que consuma el producto alimenticio.

El producto alimenticio de la presente descripción comprende un lípido producido directa o indirectamente mediante el uso de métodos, células u organismos descritos en la presente memoria. La composición puede estar ya sea en forma líquida o sólida. Adicionalmente, la composición puede incluir macronutrientes, vitaminas, y/o minerales comestibles en cantidades deseadas para un uso particular. Las cantidades de estos u otros ingredientes variarán dependiendo de si la composición está prevista para su uso con individuos normales o para su uso con individuos que tengan necesidades especiales tales como individuos que sufren de trastornos metabólicos y similares.

Los alimentos pueden ser producidos mezclando el aceite con uno o más ingredientes de modo que el alimento comprenda el aceite, o mezclado con uno o más ingredientes diferentes para elaborar un aditivo alimenticio tal como aderezos para ensaladas o mayonesas. El alimento o aditivo alimenticio puede comprender el 1 %-10 % en peso o más del aceite. El aceite puede mezclarse con otros aceites de plantas para proporcionar una composición óptima o con grasas sólidas o con aceite de palma para proporcionar mantecas semisólidas. Los alimentos o aditivos alimenticios producidos a partir del aceite incluyen aderezos para ensaladas, mayonesa, margarina, pan, pasteles, galletas dulces (galletas), cruasán, productos horneados, tortitas o mezclas de tortitas, natillas, postres congelados, alimentos no lácteos.

Los ejemplos de vehículos deseados con valor nutricional incluyen, pero no están limitados a, macronutrientes tales como grasas comestibles, carbohidratos y proteínas. Los ejemplos de dichas grasas comestibles incluyen, pero no están limitadas a, aceite de coco, aceite de borraja, aceite de hongos, aceite grosella negra, aceite de soja, y mono y diglicéridos. Los ejemplos de dichos carbohidratos incluyen, pero no están limitados a, glucosa, lactosa comestible, y almidón hidrolizado. Adicionalmente, los ejemplos de proteínas que pueden ser utilizadas en la composición nutricional de la descripción incluyen, pero no están limitadas a, proteínas de soja, suero electrodializado, leche desnatada electrodializada, suero de leche, o los hidrolizados de estas proteínas.

Con respecto a vitaminas y minerales, los siguientes pueden ser añadidos a las composiciones de productos alimenticios de la presente descripción, calcio, fósforo, potasio, sodio, cloruro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, selenio, yodo, y vitaminas A, E, D, C, y el complejo B. También se pueden añadir otras vitaminas y minerales.

Los componentes utilizados en las composiciones de productos alimenticios de la presente descripción pueden ser de origen purificado o semipurificado. Por purificado o semi-purificado se quiere decir un material que ha sido preparado por la purificación de un material natural.

Una composición de productos alimenticios de la presente descripción también se puede añadir a los alimentos incluso cuando no se requiera la suplementación de la dieta. Por ejemplo, la composición puede añadirse a alimento de cualquier tipo, incluyendo, pero no limitado a, margarina, mantequilla modificada, quesos, leche, yogurt, chocolate, dulces, bocadillos, aceites para ensaladas, aceites de cocina, grasas de cocina, carnes, pescados y bebidas.

Adicionalmente, también se pueden usar los lípidos producidos según la presente descripción o células huésped transformadas para contener y expresar los genes objeto como suplementos para la alimentación animal para alterar un tejido de animal o composición de ácidos grasos de leche o composición de ácidos grasos de huevos, para uno o más consumos animal o humano deseables, o para el bienestar y salud animal. Los ejemplos de dichos animales incluyen ovejas, vacas, caballos, aves de corral, mascotas tales como perros y gatos y similares.

Además, los productos alimenticios de la descripción pueden usarse en acuacultura para incrementar los niveles de ácidos grasos en peces para consumo humano o animal.

Los productos alimenticios preferidos de la descripción son las plantas, semillas y otras partes de las plantas tales como hojas, frutos y tallos que pueden usarse directamente como alimento o pienso para los seres humanos u otros animales. Por ejemplo, los animales pueden pastar directamente sobre dichas plantas en el campo, o ser alimentados con cantidades medidas en alimentación controlada.

Composiciones

La presente descripción también engloba composiciones, particularmente composiciones farmacéuticas, que comprenden uno o más lípidos o aceites producidos usando los métodos de la descripción.

Una composición farmacéutica puede comprender uno o más de los lípidos, en combinación con un vehículo, adyuvante o portador estándar, bien conocido, no tóxico farmacéuticamente aceptable tal como disolución salina tamponada con fosfato, agua, etanol, polioles, aceites de plantas, un agente humectante o una emulsión tal como una emulsión agua/aceite. La composición puede estar bien en forma sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de un comprimido, cápsula, líquido ingerible, polvo, ungüento o crema tópica. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y por el uso de tensioactivos. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio, y similares. Además de dichos diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, emulsificantes y agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saporíferos y agentes aromatizantes.

Además de los compuestos activos, las suspensiones pueden comprender agentes de suspensión tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, y goma de tragacanto, o mezclas de estas sustancias.

Las formas de dosificación sólida tales como comprimidos y cápsulas se pueden preparar usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los lípidos producidos según la presente descripción pueden ser comprimidos con bases para comprimidos convencionales tales como lactosa, sacarosa, y almidón de maíz en combinación con aglutinantes tales como goma arábiga, almidón de maíz, o gelatina, agentes disgregantes tales como almidón de patata o ácido algínico, y un lubricante tal como ácido esteárico o estearato de magnesio. Se pueden preparar cápsulas incorporando estos excipientes en una cápsula de gelatina junto con antioxidantes y el o los lípidos relevantes.

Para la administración intravenosa, los lípidos producidos según la presente descripción o derivados de los mismos pueden incorporarse en formulaciones comerciales.

Una dosificación típica de un ácido graso particular es de 0,1 mg a 20 g, tomados de una a cinco veces al día (hasta 100 g diariamente) y está preferiblemente en el rango de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1, 2, 5, o 10 g diariamente (tomados en una o múltiples dosis). Como se sabe en la técnica, es deseable un mínimo de aproximadamente 300 mg/día de ácidos grasos. Sin embargo, se apreciará que cualquier cantidad de ácidos grasos será beneficiosa para el sujeto.

Las rutas de administración posibles de las composiciones farmacéuticas de la presente descripción incluyen, por ejemplo, enteral y parenteral. Por ejemplo, una preparación líquida puede ser administrada oralmente. Adicionalmente, una mezcla homogénea puede dispersarse completamente en agua, mezclada bajo condiciones estériles con diluyentes, conservantes, tampones o propelentes fisiológicamente aceptables, para formar una pulverización o inhalante.

La dosificación de la composición a ser administrada al sujeto puede determinarla un experto en la técnica y depende de varios factores tales como peso, edad, salud general, historial pasado, estado inmune, etc., del sujeto.

Adicionalmente, las composiciones de la presente descripción pueden utilizarse para propósitos cosméticos. Las composiciones pueden añadirse a composiciones cosméticas preexistentes, de modo que se forma una mezcla, o puede usarse un ácido graso producido según la descripción como el único ingrediente "activo" en una composición cosmética.

Ejemplos

Ejemplo 1. Materiales y métodos generales

Materiales vegetales y condiciones de crecimiento

Los genotipos SU, S-317, S-517, LeSaf496, CW99-OL, y Ciano-OL de plantas de cártamo (Carthamus tinctorius) se crecieron a partir de semillas en el invernadero en una mezcla para macetas de limo arenoso y perlita bajo un ciclo de día/noche de 16 horas (25 °C)/8 horas (22 °C). La variedad SU de tipo salvaje, que es una variedad con alto contenido en linoleico, se obtuvo de Hefferman Seeds en NSW. Las semillas de PI 603208 (LeSaf496, ATC 120562) y CW 99-OL (ATC 120561) se obtuvieron de la Australian Temperate Field Crops Collection.

Los tejidos de las plantas para la extracción de ADN y ARN que incluyen hojas raíces, cotiledones e hipocótilos se recogieron a partir de plántulas de cártamo 10 días después de la germinación. Se obtuvieron inflorescencias en el primer día de abertura de la flor y los embriones en desarrollo se recogieron en tres estadios de desarrollo en los días 7 (temprana), 15 (media) y 20 (tardía) después de la antesis (DPA). Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta que se llevó a cabo la extracción de ADN y ARN.

Los flósculos de cártamo son tubulares y ampliamente autopolinizantes generalmente con menos del 10 % de cruzamiento exogámico (Knowles 1969). Los insectos, pero no el viento, pueden incrementar los niveles de cruzamiento exogámico en el campo. El estigma no polinizado puede permanecer receptivo durante varios días. Cada capítulo (cabeza de cártamo) contiene aproximadamente 15-30 aquenios. La masa de la semilla de la semilla en desarrollo en la planta incrementa rápidamente durante los primeros 15 días después de la floración. El contenido de aceite incrementa 5 a 10 veces durante el periodo de 10-15 DAP y alcanza un nivel máximo a aproximadamente 28 DPA (Hill y Knowles 1968). Las plantas y semillas de cártamo son fisiológicamente maduras aproximadamente 5 semanas después de floración y la semilla está lista para cosechar cuando la mayoría de las hojas se han vuelto marrones y solamente un tinte de verde permanece sobre las brácteas de las últimas inflorescencias. Las semillas se cosecharon fácilmente frotando las cabezas con la mano.

Análisis de lípidos

Aislamiento de muestras de lípidos procedentes de semillas individuales para el análisis rápido de la composición de ácidos grasos

Después de ser cosechadas en la madurez de la planta, las semillas de cártamo se secaron almacenando las semillas durante 3 días a 37 °C y posteriormente a temperatura ambiente si no se analizaron inmediatamente. Las semillas individuales o semillas combinadas se trituraron entre pequeños papeles de filtro y las muestras de aceite de semilla exudadas que humedecieron los papeles se analizaron para determinar la composición de ácidos grasos mediante métodos de GC que se describen a continuación.

Aislamiento de lípidos totales de mitades de cotiledones después de la germinación

Para propósitos de cribado, por ejemplo, para semillas descendientes de plantas transgénicas, las semillas de cártamo e germinaron sobre un papel de filtro húmedo en una placa de Petri durante 1 día. Se retiró un cotiledón cuidadosamente de cada una de las semillas germinadas para el análisis de lípidos. El resto de cada plántula se transfirió al suelo y las plantas resultantes fueron cultivadas hasta la madurez seguido de la cosecha de las semillas para mantener la línea transgénica.

Extracción del aceite de semillas usando el aparato Soxhlet

Para la extracción cuantitativa del aceite de las semillas, las semillas de cártamo cosechadas se secaron en un horno a 105 °C toda la noche y luego se trituraron en un Molino Puck durante 1 minuto. El material de la semilla triturada (~ 250 gramos) se recogió en un cartucho de extracción prepesado y se pesó antes de la extracción del aceite. Después de añadir una capa de lana de algodón en la parte superior de la harina, se extrajo el aceite en un equipo de extracción Soxhlet con disolvente (Alcoholes de Petróleo 40-60 °C), inicialmente a 70-80 °C. La mezcla se puso a reflujo entonces toda la noche con el disolvente desviándose al matraz de extracción cada 15-20 minutos. El aceite extraído, disuelto se recuperó retirando el disolvente por evaporación usando un evaporador rotatorio en vacío. Se midió el peso del aceite extraído y se determinó el contenido de aceite. Para determinar la composición de ácidos grasos del aceite extraído, se diluyeron pequeñas partes alícuotas en cloroformo y se analizaron por cromatografía de gases.

Aislamiento de lípidos totales a partir del material de las hojas

Se secaron por congelamiento muestras de tejido de hojas, se pesaron y se extrajeron los lípidos totales de las muestras de aproximadamente 10 g de peso seco como se describe en Bligh y Dyer (1959).

Fraccionamiento de lípidos

Cuando se requirió, las fracciones de TAG se separaron de otros componentes lipídicos usando un sistema de cromatografía en capa fina (TLC) de 2 fases sobre placas de gel de sílice prerecubiertas (gel de sílice 60, Merck). Una muestra de lípido extraído equivalente a 10 mg de peso seco de tejido de hojas se cromatografió en una primera fase con hexano/éter dietílico (98/2 v/v) para eliminar ceras no polares y luego en una segunda fase usando hexano/éter dietílico/ácido acético (70/30/1 v/v/v). Cuando se requirió, los lípidos polares se separaron de los lípidos no polares en muestras de lípidos extraídos de un equivalente de 5 mg de peso seco de hojas usando TLC bidimensional (gel de sílice 60, Merck), usando cloroformo/metanol/agua (65/25/4 v/v/v) para la primera dirección y cloroformo/metanol/NH4OH/etilpropilamina (130/70/10/1 v/v/v/v) para la segunda dirección. Las manchas de lípido, y los estándares apropiados operados en las mismas placas de TLC, se visualizaron una por breve exposición a vapor de yodo, se recogieron en viales y se transmetilaron para producir FAME para análisis por GC como sigue.

Preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) y análisis por cromatografía de gases (GC)

Para el análisis de la composición de ácidos grasos por GC, las muestras de lípidos extraídos, preparadas como se ha descrito anteriormente se transfirieron a un tubo de vidrio y se transmetilaron en 2 mL de HC1 1M en metanol (Supelco) a 80 °C durante 3 horas. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se añadieron 1,3 mL de NaCl al 0,9 % y 800 |jL de hexano a cada tubo y se extrajeron los FAME en la fase de hexano. Para determinar la composición de ácidos grasos, los FAME se separaron por cromatografía de gases (GC) usando un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 7890A (Palo Alto, California, EE. UU.) equipado con una columna BPX70 de 30-m esencialmente como se describe en Zhou et al. (2011) excepto que el programa de variación gradual de temperatura se cambió a temperatura inicial a 150 °C, reteniendo durante 1 min, subiendo 3 °C/min hasta 210 °C, luego 50 °C/min hasta 240 °C para una retención final de 2 min. Los picos fueron cuantificados con el software Agilent Technologies ChemStation (Rev B.03.01 (317), Palo Alto, California, EE. UU.). Las respuestas de los picos fueron similares para los ácidos grasos del estándar 411 de Nu-Check GLC auténtico (Nu-Check Prep Inc. MN, EE. UU.) que contenía proporciones iguales de 31 ésteres metílicos de ácidos grasos diferentes, incluyendo 18:1, 18:0, 20:0 y 22:0 se usó para la calibración. La proporción de cada ácido graso en las muestras se calculó en base a las áreas de los picos individuales y totales para los ácidos grasos.

Análisis de los FAME por cromatografía de gases-espectrometría de masa

La confirmación de las posiciones de los enlaces dobles en el FAME mediante la modificación con 2,4-dimetiloxazolina (DMOX) y análisis por GC-MS se llevó a cabo como se ha descrito previamente (Zhou et al., 2011), excepto con un Shimadzu GC-MS QP2010 Plus equipado con una columna BPX70 de 30-m. La temperatura de la columna se programó para una temperatura inicial a 150 °C durante 1 min, subida a 5 °C/min hasta 200 °C, luego 10 °C/min hasta 240 °C con retención durante 5 min. Se adquirieron los espectros de masa y se procesaron con el software GCMSsolution (Shimadzu, Versión 2.61). Los ácidos grasos libres y los estándares de FAME se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).

Análisis de especies lipídicas por LC-MS

Las semillas individuales de individuos maduros se sometieron a análisis lipidómico usando LC-MS en la Escuela de Botánica, Universidad de Melbourne. Se extrajeron los lípidos totales como han descrito Bligh y Dyer (1959) y se disolvieron en CHCl³. Se secaron partes alícuotas de un mg de lípido con N², se disolvieron en 1 mL de hidroxitolueno butilado 10 mM en butanol:metanol (1:1 v/v), y se analizaron usando LC Agilent serie 1200 y LC-MS de triple cuadrupolo de ionización por electropulverización 6410B. Los lípidos fueron separados cromatográficamente usando una columna Ascentis Express RP-Amida (5 cm x 2,1 mm, Supelco) y un gradiente binario con una tasa de flujo de 0,2 mL/min. Las fases móviles fueron: A, formato de amonio 10 mM en H²O:metanol:tatrahidrofurano (50:20:30, v/v/v); B, formato de amonio 10 mM en H²O:metanol:tetrahidrofurano (5:20:75, v/v/v). Los lípidos neutros seleccionados (TAG y DAG) y fosfocolina (PC) con ácidos grasos 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3 fueron analizados por monitorización de reacción múltiple (MRM) usando una energía de colisión de 25 V y fragmentador de 135 V. Se identificaron los TAG y DAG de MRM individuales en base al ion precursor amoniado y el ion producto de la pérdida neutra de ácidos grasos. Los TAG y DAG se cuantificaron usando estándar externo de triestearina 10uM.

Análisis del contenido de esterol de muestras de aceite

Se saponificaron muestras de aproximadamente 10 mg de aceite junto con una parte alícuota añadida de C24:0 monol como un estándar interno, usando 4 mL de KOH al 5 % en MeOH al 80 % y se calentaron durante 2 h a 80 °C en un tubo de vidrio con tapón de rosca revestido de teflón. Después de que la mezcla de reacción se enfriara, se añadieron 2 mL de agua Milli-Q y se extrajeron los esteroles en 2 mL de hexano:diclorometano (4:1 v/v) por agitación y agitación con vórtex. La mezcla se centrifugó y el extracto de esteroles se retiró y se lavó con 2 mL de agua Milli-Q. El extracto de esteroles se retiró entonces después de agitación y centrifugación. El extracto se evaporó usando una corriente de gas nitrógeno y los esteroles se sililaron usando 200 mL de BSTFA y se calentaron durante 2 h a 80 °C.

Para el análisis por GC/GC-MS de los esteroles, se secaron derivados OTMSi de esteroles bajo una corriente de gas nitrógeno sobre un bloque térmico a 40 °C y luego se redisolvieron en cloroformo o hexano inmediatamente antes del análisis por GC/GC-MS. Se analizaron los derivados OTMS de esteroles por cromatografía de gases (GC) usando un Agilent Technologies 6890A GC (Palo Alto, California, EE. UU.) equipado con una columna capilar de sílice fusionada (15 m x 0,1 mm d.i., espesor de película de 0,1 |jm) Supelco Equity^TM-1, un FID, un inyector split/splitless y un automuestreador e inyector Agilent Technologies Serie 7683B. El gas portador fue helio. Las muestras se inyectaron en modo splitless a una temperatura del horno de 120 °C. Después de la inyección, la temperatura del horno se elevó hasta 270°C a 10 °C min^_1y finalmente hasta 300 °C a 5 °C min^{' 1}. Se cuantificaron los picos con el software Agilent Technologies ChemStation (Palo Alto, California, EE. UU.). Los resultados de GC están sometidos a un error de ± 5 % de las áreas de componentes individuales.

Se efectuaron análisis espectrométricos de masa-GC (GC-MS) en un GC-MS Finnigan Thermoquest GCQ y un GC-MS Finnigan Thermo Electron Corporation; ambos sistemas estaban equipados con un inyector sobre columna y el software Thermoquest Xcalibur (Austin, Tejas, EE. UU.). Cada GC estaba equipado con una columna capilar de polaridad similar a la descrita anteriormente. Se identificaron los componentes individuales usando datos espectrales de masa y comparando los datos del tiempo de retención con los obtenidos para estándares de laboratorio y auténticos. Se efectuó un análisis del blanco del procedimiento total concurrentemente con el lote de muestra.

Cuantificación de TAG vía latroscan

Se cargó un |jl de cada extracto de planta en un Chromarod-Sll para TLC-FID latroscan™ (Mitsubishi Chemical Medience Corporation-Japón). La repisa de Chromarod se transfirió entonces a un tangue de desarrollo equilibrado que contenía 70 ml de un sistema de disolvente de Hexano/CHCl3/2-Propanol/Ácido fórmico (85/10,716/0,567/0,0567 v/v/v/v). Después de 30 min de incubación, la repisa de Chromarod se seca entonces durante 3 min a 100 °C e inmediatamente se escanea en un analizador de TLC-FID MK-6s para latroscan (Mitsubishi Chemical Medience Corporation-Japón). Las áreas de los picos de un estándar interno DAGE y el TAG se integran usando el software de integración SIC-480ll (Versión: 7.0-E SIC System Instruments Co., LTD-Japón).

La cuantificación de TAG se llevó a cabo en dos etapas. En primer lugar, el estándar interno de DAGE se escanea en todas las muestras para corregir los rendimientos de extracción después de lo cual se seleccionaron muestras de TAG concentradas y se diluyeron. Después, la cantidad de TAG se cuantifica en muestras diluidas con un segundo escaneo según la calibración externa usando trilinoleato de glicerilo como estándar externo (Sigma-Aldrich).

Expresión de genes FAD2 candidatos en Saccharomyces cerevisiae

Los fragmentos de ADN que contienen los marcos de lectura abiertos enteros de ADNc de FAD2 candidatos fueron escindidos del vector pGEMT-easy como fragmentos EcoRI y se insertaron en el sitio correspondiente del vector pENTR11 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Los insertos se clonaron entonces en el vector de expresión de destino pYES2-DEST52, para poner los marcos de lectura abiertos bajo el control del promotor GAL1 para la expresión génica inducible en células de levaduras, usando la tecnología de recombinación Gateway® Cloning (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.). Las secuencias génicas en los plásmidos resultantes se verificaron por secuenciación del ADN. Los plásmidos resultantes y el vector pYES2-DEST52 que carece de cualquier inserto de ADNc como un control se introdujeron en células de levaduras de la cepa YPH499 de Saccharomyces cerevisiae por transformación mediada por acetato de litio. La expresión de estos genes fAD2 candidatos en células de levaduras con o sin alimentación de sustrato de ácido graso exógeno fue esencialmente como se ha descrito previamente por Zhou et al. (2006). Cada experimento se llevó a cabo en triplicado.

Expresión de genes en células de plantas en un sistema de expresión transitoria

Los genes se expresaron en células de hojas de Nicotiana benthamiana usando un sistema de expresión transitoria esencialmente como se ha descrito por Voinnet et al. (2003) y Wood et al., (2009). Un vector para la expresión constitutiva de la proteína supresora de silenciamiento viral P19, bajo el control del promotor CaMV 35S, se obtuvo del laboratorio de Peter Waterhouse, CSIRO Plant Industry, Canberra, Australia. El vector binario quimérico 35S:P19 se introdujo en la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens. Todos los demás vectores binarios que contenían una región codificadora a ser expresada en las células de plantas a partir de un promotor, a menudo el promotor 35S, también se introdujeron en la cepa AGL1 de A. tumefaciens. Las células recombinantes se crecieron hasta la fase estacionaria a 28°C en 5 mL de caldo Lb suplementado con 50 mg/L de rifampicina y ya sea 50 mg/L de kanamicina u 80 mg/L de espectinomicina según el gen marcador seleccionable en el vector binario. Las bacterias de cada cultivo se sedimentaron por centrifugación a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente antes de ser resuspendidas en 1,0 ml de tampón de infiltración que contenía MES 5 mM, pH 5,7, MgSO4 5 mM y acetosiringona 100 ^M. Los cultivos celulares resuspendidos se incubaron entonces a 28 °C con agitación durante otras 3 horas. Se mezcló entonces una dilución de 10 veces de cada cultivo en tampón de infiltración con un volumen igual del cultivo de 35S:P19, diluido de la misma manera, y las mezclas se infiltraron en el lado inferior de las hojas de N. benthamiana totalmente expandidas. Los cultivos mezclados que comprendían genes a ser expresados incluyeron la construcción 35S:P19 en Agrobacterium a no ser que se afirme otra cosa. El control de las infiltraciones incluyó solamente la construcción 35S:P19 en Agrobacterium.

Las hojas se infiltraron con las mezclas de células de Agrobacterium y las plantas se crecieron típicamente durante cinco días adicionales después de la infiltración antes de que los discos de las hojas se recuperaran para el aislamiento de lípidos totales y análisis de ácidos grasos. Las plantas de N. benthamiana se crecieron en cabinas de cultivo bajo una temperatura constante de 24 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 horas con una intensidad de luz de aproximadamente 200 lux usando iluminación fluorescente Osram 'Blanco Tenue'' colocada directamente sobre las plantas. Típicamente, se usaron plantas de 6 semanas de edad para los experimentos y se infiltraron hojas verdaderas que estaban casi totalmente expandidas. Todas las hojas no infiltradas se retiraron después de la infiltración para evitar la sombra.

PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

El análisis de la expresión génica se efectuó por RT-PCR cuantitativa usando un sistema de detección de PCR en Tiempo Real BIORAD CFX96TM y Supermezcla iQRM SYBR® Green (BioRad, Hercules, CA, EE. UU.). Se diseñaron cebadores con una longitud de 19-23 nucleótidos y que tenían una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 65 °C para amplificaciones específicas de gen que darían como resultado productos de amplificación de aproximadamente 100-200 pb. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos. Todas las reacciones de RT-PCR se efectuaron en triplicado. La mezcla de reacción contenía 1 x Supermezcla iQRM SYBR® Green (BioRad, Hercules, CA, EE. UU.), cebadores directos e inversos 5 ^M y 400 ng de ADNc y se usó a un volumen de 10 ^L por pocillo. Las condiciones de ciclado térmico fueron 95 °C durante 3 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 a y 68 °C durante 30 s. La especificidad de la amplificación por PCR fue monitorizada por análisis de la curva de fusión después de la etapa final de la PCR de 60 °C hasta 95 °C a 0,1 °C/seg. Adicionalmente, los productos de PCR también fueron verificados para determinar su pureza por electroforesis en gel de agarosa y se confirmó por secuenciación. Se usó el gen KASll expresado constitutivamente como una referencia endógena para normalizar los niveles de expresión. Los datos fueron calibrados en relación al nivel de expresión génica correspondiente siguiendo el método de 2-AA^Ctpara la cuantificación relativa (Schmittgen, 2008). Los datos se presentaron como medias ± SD de tres reacciones efectuadas en placas de 96 pocillos independientes.

Aislamiento de ADN y análisis por transferencia Southern

Se aisló el ADN genómico de plántulas de cártamo, genotipo "SU", de hojas totalmente expandidas usando tampón CTAB y siguiendo el método descrito por Paterson et al. (1993). Se llevó a cabo una purificación adicional usando gradientes de CsCl como se ha descrito previamente (Liu et al., 1999). Se digirieron partes alícuotas de 10 ^g de ADN genómico de cártamo separadamente con ocho enzimas de restricción diferentes, concretamente, AccI, BglII, BamHI, EcoRI, EcoRV, HindIII, XbaI y XhoI. El ADN genómico digerido con cada una de las enzimas de restricción se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 1 %. El gel se empapó con NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M durante 30 minutos y el ADN se transfirió a una membrana de nailon Hybond-N⁺(Amersham, Reino Unido). Los filtros se ensayaron con un fragmento de ADN marcado con dCTP a-P³²correspondiente a la región codificadora entera del gen CtFAD2-6 de cártamo como uno representativo de la familia de genes CtFAD2 en condiciones de hibridación de baja astringencia. Las hibridaciones se realizaron toda la noche a 65 °C en una disolución que contenía 6x SSPE, disolución de Denhardt al 10 %, SDS al 0,5 % y 100 ^g/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Después de la hibridación y después de un breve lavado en 2x SSC/SDS al 0,1 % a 50 °C, los filtros se lavaron tres veces, durante 20 minutos cada vez, en 0,2 x SSC/SDS al 0,1 % a 50 °C antes de la autorradiografía.

Transformación de cártamo y Arabidopsis thaliana

Se introdujeron vectores quiméricos que comprendían genes a ser usados para transformar Arabidopsis en la cepa AGL1 de A. tumefaciens y las células de cultivos del Agrobacterium transformado se usaron para tratar plantas de A. thaliana (ecotipo Columbia) usando el método de inmersión floral para la transformación (Clough y Bent, 1998). Se produjeron plantas de cártamo transformadas como se describe en Belide et al. (2011) usando los cultivos Agrobacterianos transformados.

Ejemplo 2. Aislamiento de los ADNc de cártamo que son candidatos para codificar FAD2

Extracción de ARN total y síntesis de ADNc

Con el fin de producir ADNc de cártamo, se aisló el ARN total de muestras de 100 mg de tejidos de cártamo congelados incluyendo embriones en desarrollo, hojas, raíces e hipocótilos. Esto se hizo separadamente para cada tejido usando un kit de ARN total de planta RNeasy® (Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del proveedor. La concentración de ARN en las preparaciones se determinó con un espectrofotómetro ND1000 de NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia) y se igualaron las concentraciones de ARN antes del análisis. La calidad y cantidades relativas del ARN en cada preparación se visualizaron por electroforesis en gel de muestras a través de geles de agarosa al 1 % (p/v) que contenían formaldehido. Las preparaciones de ARN se trataron con ADNasa libre de ARNasa RQ1 (Qiagen, Hilden, Alemania) para eliminar el ADN genómico contaminante. Se sintetizó ADNc de primera cadena a partir de 400 ng de cada preparación de ARN libre de ADN usando el Sistema de Síntesis de Primera Cadena SuperScript III (Qiagen, Hilden, Alemania) con el cebador oligo(dT)²⁰, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de ADNc de FAD2 expresados en semillas de una biblioteca de ADNc de semillas en desarrollo

Inicialmente, los ADNc de FAD2 de cártamo expresados en semillas se obtuvieron por el cribado de una biblioteca de ADNc derivada de embriones en desarrollo del genotipo "SU" de cártamo (tipo salvaje, niveles altos de ácido linoleico). La construcción de la biblioteca comenzó con la extracción del ARN a partir de una mezcla de embriones inmaduros en diferentes estadios de desarrollo, que se recogieron y trituraron hasta polvo en nitrógeno líquido y se llevó a cabo la extracción del ARN usando TRIzol siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se aisló ARN que contenía poli(A), usando un kit de purificación de ARNm Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemania).

Se sintetizó ADNc cebado con oligo(dT) de primera cadena y se convirtió en ADN bicatenario usando un kit de síntesis de ADNc de Stratagene, según las instrucciones del fabricante (Stratagen, La Jolla, CA, EE. UU.). El ADNc de extremos romos se ligó con adaptadores de EcoRI, se fosforiló, y se fraccionó por tamaño por filtración en gel en una columna Chroma spin+TE-400 (Clontech, CA, EE. UU.). Los ADNc recombinantes se propagaron en la cepa de E. coli, XL-1 Azul MRF' usando un kit de clonación ZAP ll Lambda/EcoRI/CIAP predigerido de Stratagene.

Para identificar los clones de FAD2, la biblioteca se cribó usando un fragmento de ADN que corresponde a la región codificadora de FAD2 de Arabidopsis (No. de acceso de GenBank L26296), siguiendo el protocolo descrito previamente (Liu et al., 1999). Las placas positivas se purificaron a través de dos rondas sucesivas de cribado y los fagémidos purificados que contenían posibles ADNc de FAD2 se escindieron como se indica en el manual de instrucciones del kit de síntesis de ADNc de Stratagene AZAPII. Los análisis de secuencia de las secuencias de FAD2 se hicieron mediante el programa Blast de NCBI (www.ncbi.nlm.gov/BLAST/). Se predijo el marco de lectura abierto usando el VectorNTI. Se aislaron dos ADNc de longitud completa diferentes a partir de la biblioteca de ADNc de semillas en desarrollo y se denominaron CtFAD2-1 y CtFAD2-2, respectivamente.

Identificación de EST para genes FAD2 candidatos

Para identificar ADNc de FAD2 candidatos adicionales, se interrogó la base de datos de etiqueta de secuencia expresada (EST) de Compositae Genome Project (CGP) de cártamo (cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2.) usando el programa BLAST para EST que codificaban polipéptidos que tienen similitud con Fa D2 de A. thaliana (No. de acceso de GeneBank L26296). Se identificaron al menos siete cóntigos de secuencias de ADNc de FAD2 distintos, entre las cuales dos cóntigos mostraron secuencias idénticas con CtFAD2-1 y CtFAD2-2 aislados de la biblioteca de ADNc de semilla de cártamo. Además, se identificaron nueve ADNc diferentes y se designaron como CtFAD2-3 a CtFAD2-11, respectivamente.

RACE 3' y 5'

Se seleccionó el clon de EST de máxima longitud de cada uno de los 9 cóntigos (CtFAD2-3 a CtFAD2-11) como el punto de partida para el aislamiento de las secuencias de ADNc de longitud completa correspondientes. El proceso usó la amplificación rápida de extremos de ADNc 3' y 5' (RACE), usando ADNc producidos a partir de ARN obtenidos de varios tejidos de cártamo incluyendo embriones en desarrollo, hojas, raíces, hipocótilos y flores. Se diseñaron cebadores específicos de gen (GSP) a partir del clon más largo de EST de cada cóntigo. Se efectuó 3'-RACE, usando el kit de RT-PCR de una etapa siguiendo las instrucciones del fabricante (Bioline, Londres, Reino Unido). Se usó un cebador específico de gen (GSP) en una primera ronda de amplificación por PCR para cada uno de los EST seleccionados en combinación con un cebador poli(dT) con un sitio Notl en su extremo 3'. Se efectuó una segunda ronda de PCR sobre el producto de la primera ronda usando un GSP anidado en combinación con el cebador poli(dT). Los GSP para 3'-RACE se listan en la Tabla 2.

Se efectuó la clonación del extremo 5' del ADNc de CtFAD2-6 con el kit de sistema 5'-RACE (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Solamente el ARNm de CtFAD2-6 se transcribió de forma inversa a ADNc usando un cebador especifico de gen GSP1, 5'-ACCTAACGACAGTCATGAACAAG-3' (SEQ ID NO: 76). Se usó un cebador específico de gen anidado GSP2 5'-GTGAGGAAAGCGGAGTGGACAAC- 3' (SEQ ID NO: 77) en la primera amplificación por PCR. Las condiciones de reacción usaron un arranque en caliente de 95 °C durante 4 min antes de añadir la polimerasa, 33 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 45 seg, hibridación a 55 °C durante 1 min y extensión a 72°C durante 2 min.

Los fragmentos 3' y 5' amplificados se subclonaron en el vector pGEM-Teasy y se secuenciaron desde ambas direcciones. Las comparaciones de las secuencias de los extremos 3' y 5' de los fragmentos clonados con las EST correspondientes mostraron regiones superpuestas que se emparejaban entre sí, proporcionando así las secuencias 3' y 5' para cada gen y permitiendo el ensamblaje de una posible secuencia de longitud completa para cada uno de los 11 ADNc.

Aislamiento de secuencias de ADNc de longitud completa para los genes CtFAD2 candidatos

Para aislar las regiones codificadoras de la proteína de longitud completa para los nueve genes CtFAD2, se amplificaron los ORF usando el kit de RT-PCR en una etapa usando los ARN totales derivados de varios tejidos de cártamo incluyendo embriones en desarrollo, hojas, raíces, hipocótilos y flores (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.). Los cebadores (Tabla 3) usados para amplificar los ORF se basaron en las secuencias de ADN localizadas en las UTR en 5' y 3' de cada ADNc. Los productos de PCR amplificados fueron clonados en el vector pGEM-Teasy®, y sus secuencias de nucleótidos se obtuvieron mediante secuenciación del ADN.

Características de las secuencias del FAD2 candidato de cártamo

Las características de los 11 ADNc se resumen en la Tabla 4 y las de los polipéptidos en la Tabla 5.

Las secuencias de aminoácidos predichas de los polipéptidos CtFAD2-1 a CtFAD2-11 codificados compartieron una gran identidad de secuencia, de aproximadamente el 44 % al 86 % de identidad entre sí. Mostraron un 53 % a 62 % de identidad de secuencia con FAD2 de Arabidopsis. Los tamaños de los polipéptidos predichos estuvieron en el rango de 372 a 388 aminoácidos, esto es, todos tenían una longitud de aproximadamente 380 residuos de aa. Los ADNc tuvieron secuencias únicas de regiones no traducidas en 5' y 3' (UTR), por lo tanto, los genes endógenos pudieron ser reconocidos fácilmente por sus secuencias de UTR. La amplificación de las regiones codificadoras de la proteína del ADN genómico de cártamo dio como resultado secuencias de ADN idénticas con el ADNc correspondiente para cada uno de los 11 genes, indicando que no había intrones que interrumpieran sus regiones codificadoras de proteína.

Tabla 2. Cebadores oligonucleotídicos usados en 3'RACE de múltiples genes FAD2 en cártamo.

Gen cebador Secuencia con sentido Secuencia antisentido

CtFAD2-3 5'- 5'-CTTCAGCGAGTACCAATGGCTCGAC-3' GGTTTCATCGTCCACTCCTTGA-3'

(SEQ ID NO: 58) (SEQ ID NO: 59)

CtFAD2-4 5'- 5' -CTTCAGCGAGTACCAATGGCTCGAC-3' GGTTTCATCGTCCACTCCTTGA-3'

(SEQ ID NO: 60) (SEQ ID NO: 61)

CtFAD2-5 5'- 5'-ATGACACCATTGGCTTCATCTGCCA-3' CTTTCTGCTCACTCCATACTTC-3'

(SEQ ID NO: 62) (SEQ ID NO: 63)

CtFAD2-6 5'- 5'-AGCGAATATCAGTGGCTTGACGATG-3' ACTCCGCTTTCCTCACTCCGTAC-3'

(SEQ ID NO: 64) (SEQ ID NO: 65)

CtFAD2-7 5'- 5'-CATGAATGTGGTCATCATGCCTTTAG-3' CTTCTTCATCCATTCGGTTTGC-3'

(SEQ ID NO: 66) (SEQ ID NO: 67)

CtFAD2-8 5'- 5'-CGTGGTTGAATGACACCATTGGTTAC-3' ACCTTCTACACACCGGTATGCCT-3'

(SEQ ID NO: 68) (SEQ ID NO: 69)

CtFAD2-9 5'- 5'-CATGGAAGATAAGCCACCGTCGACATC- AACACGGGTTCGCTTGAGCACGA-3'

3' (SEQ ID NO: 70) (SEQ ID NO: 71)

CtFAD2-10 5'- 5'-TGCATACCCGCAAGCAAAACCG-3' (SEQ CCATCTCTCGAGAGTTCCTTAC-3'

ID NO: 72) (SEQ ID NO: 73)

CtFAD2-11 5'- 5'-ATGTGGTCACCATGCCTTTAGTGAG-3' TGGAATGGTCCTCCATTCCGCTC-3'

(SEQ ID NO: 74) (SEQ ID NO: 75)

Tabla 3. Cebadores oligonucleotídicos usados para la amplificación de la región codificadora completa de los genes FAD2 en cártamo.

Gen cebador Secuencia con sentido Secuencia antisentido

CtFAD2-1 5'- 5'-TGAAAGCAAGATGGGAGGAGG-3' TCACAACTTTACTTATTCTTGT-3' (SEQ ID (SEQ ID NO: 78) NO: 79)

CtFAD2-2 5'- 5'-ATTGAACAATGGGTGCAGGC-3' (SEQ CATCATCTTCAAATCTTATTC-3' (SEQ ID ID NO: 80) NO: 81)

CtFAD2-3 5'- 5' -AATCAGCAGCAGCACAAGC-3' (SEQ ID CAAACATACCACCAAATGCTACT-3' (SEQ NO: 82) ID NO: 83)

CtFAD2-4 5'- 5' -CTCAGTAACCAGCCTCAAAACTTG-3' GCGGATTGATCAAATACTTGTG-3' (SEQ ID (SEQ ID NO: 84) NO: 85)

CtFAD2-5 5'- 5'-ATCACAGGAAGCTCAAAGCATCT-3' GTAGGTTATGTAACAATCGTG-3' (SEQ ID (SEQ ID NO: 86) NO: 87)

CtFAD2-6 5'- 5'-TGAAGACGTTAAGATGGGAGCTG-3' GTAGGTTATGTAACAATCGTG-3' (SEQ ID (SEQ ID NO: 88) NO: 89)

CtFAD2-7 5'- 5'-CAGATCCAACACTTCACCACCAG-3' AGATCTAAAGAATTTCCATGGTG-3' (SEQ (SEQ ID NO: 90) ID NO: 91)

CtFAD2-8 5'- 5'-CTGCTCTCTACGACACTAAATTCAC-3' TCTATCTAATGAGTATCAAGGAAC-3' (SEQ (SEQ ID NO: 92) ID NO: 93)

CtFAD2-9 5'- 5'-CTGAATTCACACCCACAGATAGCTAG- ACATCCCTTCTTAGCTTTAACTA-3' (SEQ 3' (SEQ ID NO: 94) ID NO: 95)

CtFAD2-10 5'- 5'-ACTTCGCCCTCTGTTATCTGG-3' (SEQ CCATACACATACATCCTACACGAT-3' (SEQ ID NO: 96) ID NO: 97)

CtFAD2-11 5'- 5'-ACTCACAATAACTTCATCTCTCTC-3' CTACTAGCCATACAATGTCTTCG-3' (SEQ (SEQ ID NO: 98) ID NO: 99)

Tabla 4. Características de los ADNc de FAD2 candidatos de cártamo.

Designación Longitud del Región Tamaño de Tamaño de Posición del Tamaño del SEQ ID NO. del gen ADNc (nt) codificadora 5'UTR 3'UTR intrón intrón de nucleótido de proteína de ORF CtFAD2-1 1.422 124-1.266 123 156 -13 1.144 12 CtFAD2-2 1.486 81-1.233 80 253 -12 3.090 13 CtFAD2-3 1.333 51-1.197 50 136 -11 114 14 CtFAD2-4 1.403 52-1.227 51 176 -11 124 15 CtFAD2-5 1.380 66-1.194 65 186 -33 122 16 CtFAD2-6 1.263 15-1.146 14 117 ^{* *}17 CtFAD2-7 1.375 66-1.185 65 190 -29 253 18 CtFAD2-8 1.345 58-1.207 57 138 ^{* *}19 CtFAD2-9 1.326 108-1.172 107 154 ^{* *}20 CtFAD2-10 1.358 56-1.199 55 159 -38 2.247 21 CtFAD2-11 1.229 58-1.092 57 137 -22 104 22

Tabla 5. Características de los polipéptidos CtFAD2 candidatos.

Designación del Longitud del Posición (y Posición (y Posición (y SEQ ID NO. de gen polipéptido (No. secuencia) de la secuencia) de la secuencia) de la aminoácidos de aminoácidos) primera caja de segunda caja de tercera caja de

His His His

CtFAD2-1 380 105 HECGH* 141 HRRHH 315 HVVHH 27 CtFAD2-2 384 106 HECGH 142 HRRHH 316 HVTHH 28 CtFAD2-3 381 104 HECGH 140 HRTHH 314 HAVHH 29 CtFAD2-4 380 103 HECGH 139 HRTHH 313 HAVHH 30 CtFAD2-5 375 102 HDCGH 138 HRTHH 311 HVVHH 31 CtFAD2-6 376 101 HDLGH 137 HRSHH 310 HVVHH 32 CtFAD2-7 372 99 HECGH 135 HRTHH 308 HAVHH 33 CtFAD2-8 382 103 HECGH 139 HRTHH 313 HAVHH 34 CtFAD2-9 387 107 HECGH 143 HRTHH 318 HAVHH 35 CtFAD2-10 380 104 HECGH 140 HRRHH 314 HVVHH 36 CtFAD2-11 377 100 HECGH 136 HRNHH 310 HVLHH 37

* HECGH (SEQ ID NO: 159), HDCGH (SEQ ID NO: 160), HDLGH (SEQ ID NO: 161), HRRHH (SEQ ID NO: 162),

HRTHH (SEQ ID NO: 163), HRSHH (SEQ ID NO: 164), HRNHH (SEQ ID NO: 165), HVVHH (SEQ ID NO: 166),

HVTHH (SEQ ID NO: 167), HAVHH (SEQ ID NO: 168), y HVLHH (SEQ ID NO: 169).

Para investigar la relación de los polipéptidos FAD2 candidatos de cártamo con enzimas FAD2 conocidas, se alinearon las 11 secuencias de polipéptidos deducidas con secuencias de FAD2 de plantas y se construyó un árbol de unión de vecinos usando el vector NTI (Figura 1). Como se muestra en la Figura 1, las secuencias de aminoácidos de CtFAD2-1 y CtFAD2-10 fueron las que estuvieron más estrechamente relacionadas, primero que todo entre ellas y luego con las FAD2 expresadas en semillas de otras especies. CtFAD2-2 estuvo más estrechamente relacionada con genes expresados constitutivamente de otras especies que con otros FAD2 candidatos en cártamo. CtFAD2-3, -4, -5, -6 y -7 formaron una nueva rama en el árbol de unión de vecinos, más probablemente como el resultado evolutivo de un gen divergido recientemente que se multiplicó en cártamo. De manera interesante, en relación con otras especies, estos estuvieron más estrechamente relacionados con una FAD2 conjugasa divergente funcionalmente de Calendula officinalis. FAD2-11 estuvo más estrechamente relacionado con acetilenasas de varias especies de plantas, incluyendo vFAD2 de cártamo, que se indujo por estimulantes fúngicos (Cahoon et al., 2003). Pareció que CtFAD2-8 y -9 fueron más divergentes que los otros FAD2 candidatos de cártamo. Sin embargo, estos análisis también mostraron que las comparaciones de secuencias, aunque dieron algunas pistas acerca de la posible función, no pudieron por sí mismas proporcionar conclusiones fiables acerca de la función de los diferentes FAD2 candidatos. Por lo tanto, se requirió un análisis funcional para legar a conclusiones acerca de la función de cada gen/polipéptido.

Las comparaciones de secuencias mostraron que los polipéptidos FAD2 candidatos de cártamo compartían aproximadamente un 50 %-60 % de identidad de secuencia y un 52 %-65 % de similitud con enzimas FAD2 conocidas de otras especies. El grado de divergencia de la secuencia de ADN entre los genes CtFAD2 de cártamo reflejó su relación filogenética, porque CtFAD2-3, -4, y -5 son todos más similares entre sí que a CtFAD2-1, o CtFAD2-10, y viceversa. Estos números tienen un paralelismo cercano en la matriz de identidad de aminoácidos (Tabla 6).

Tabla 6. Identidad de secuencia del ADN de la región codificadora y aminoácidos deducidos en genes FAD2 de cártamo.

Identidad de aminoácidos deducidos (%)

CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA D2-1 D2-2 D2-3 D2-4 D2-5 D2-6 D2-7 D2-8 D2-9 D2-10 D2-11

CtFA

D2-1 - 70,3 53,2 52,5 53,5 50,9 54,1 59,7 59,5 80,1 56,4

CtFA

D2-2 70,0 - 54,5 55,0 54,2 51,7 57,8 60,6 62,5 69,5 58,6

CtFA

D2-3 62,0 62,0 - 97,1 62,0 61,8 63,1 52,7 50,9 51,2 56,8

CtFA

D2-4 62,7 63,3 95,1 - 61,4 61,4 63,3 53,1 50,9 50,9 56,9

CtFA

D2-5 61,9 60,3 69,7 70,6 - 63,2 62,0 51,4 51,3 51,7 53,9

CtFA

D2-6 60,6 59,9 68,8 69,6 72,0 - 63,1 49,3 50,8 50,1 56,2

CtFA

D2-7 62,2 65,8 69,4 69,3 66,6 68,2 - 51,7 49,2 51,4 60,7

CtFA

D2-8 65,2 66,2 63,1 62,8 60,8 61,7 61,2 - 58,8 58,1 56,40

CtFA

D2-9 64,9 66,2 59,5 59,5 58,3 59,2 59,5 63,5 - 59,3 55,9

CtFA

D2-10 78,9 72,0 60,7 62,0 59,8 61,0 60,7 64,3 64,1 - 57,2

CtFA

D2-11 60,0 62,9 64,1 64,4 62,4 64,1 62,7 63,9 60,9 61,7 Características de los polipéptidos CtFAD2 candidatos

Los polipéptidos predichos de los 11 CtFAD2 candidatos contenían cada uno un resto rico en aminoácidos aromáticos en el extremo del extremo C. Dichos restos han sido identificados en otros polipéptidos FAD2 de plantas, y se piensa que es necesario mantener la localización en el RE (McCartney et al., 2004). Consistente con otras enzimas desaturasas de ácidos grasos unidas a membranas de plantas, los polipéptidos CtFAD2 predichos contenían cada uno tres restos ricos en histidina (cajas de His). Dichos restos ricos en His están altamente conservados en enzimas FAD2 y han sido implicados en la formación del complejo dihierro-oxígeno usado en catálisis bioquímica (Shanklin et al., 1998). En la mayoría de las secuencias de polipéptidos de CtFAD2 candidatos, el primer resto de histidina fue HECGHH, exceptuándose CtFAD2-5 y -6 que tenían HDCGHH y HDLGHH, respectivamente. El último aminoácido de la primera caja de His en CtFAD2-8 (HECGHQ) fue una Q en vez de una H. Los inventores buscaron este resto en 55 enzimas FAD2 de plantas conocidas y la sustitución de H a Q está también presente en un homólogo de FAD2 divergido de Lesquerella lindheimeri predominantemente con actividad de ácido graso hidroxilasa (No. de acceso a Genebank EF432246; Dauk et al., 2007). El segundo resto de histidina estaba altamente conservado, como la secuencia de aminoácidos HRRHH, en varios FAD2 de cártamo candidatos, incluyendo CtFAD2-1,-2, -8, -9 y -10. Cabe destacar que se encontró el aminoácido N en CtFAD2-11 en la posición 3 del resto, que también se ha visto en numerosas enzimas de tipo FAD2 de funcionalidad divergentes incluyendo CREP1 de Crepis alpina, CpaI2 de Crepis palaestina y vFAD2 de girasol (AY166773.1), FAC2 de Calendula officinalis (AF343064.1), acetilenasa de Rudbeckia hirta (AY166776.1). El aminoácido en esta posición en CtFAD2-3, -4, -5, -6 y -7 fue bien S o T.

En cada uno de los polipéptidos CtFAD2-1, -2, -9, y -10, el aminoácido que precede inmediatamente a la primera caja de histidina fue una alanina, el mismo que para otras enzimas ácido grasos A12 desaturasa de plantas. El aminoácido valina (V) en vez de alanina estaba presente en esa posición en CtFAD2-5, mientras que los otros seis polipéptidos CtFAD2 tenían una glicina en esa posición. Cahoon et al. (2003), propusieron que una sustitución de glicina por alanina en esa posición se encontró en enzimas FAD2 funcionalmente divergente, excepto la ácido graso A12-hidroxilasa. Como se describe en los siguientes Ejemplos, los experimentos de expresión heteróloga posteriores que ensayan la función de los candidatos demostraron que cada uno de los polipéptidos CtFAD2-1, -2 y -10 fueron oleato A12-desaturasas, mientras que CtFAD2-9 mostró especificidad desaturasa para palmitoleato (C16:1) en lugar de oleato.

Se observó que de los 11 CtFAD2 candidatos, solamente el polipéptido CtFAD2-11 tenía una secuencia DVTH en las posiciones -5 a -2 de la tercera caja de Histidina, lo que era consistente con la proposición de que el resto (D/N)VX(H/N) se encuentra en todas las acetilenasas de plantas (Blacklock et al., 2010). Los cinco aminoácidos inmediatamente posteriores a la tercera caja de histidina de los polipéptidos CtFAD2-1, -2 y -10 fueron LFSTM, como para otras oleato desaturasas FAD2 de plantas conocidas. En contraste, CtFAD2-9, la ácido graso desaturasa específica de palmitoleato, tenía un resto LFSY1 en esa posición con dos sustituciones de aminoácidos en las posiciones 4 y 5. En los polipéptidos CtFAD2-3, -4 y -5, el S en la posición 3 fue sustituido por P, que también estaba presente exclusivamente en otras conjugasas de ácido graso de FAD2 incluyendo aquellas de Calendula officinalis (FAC2, acceso AAK26632) y Trichosanthes kirilowii (acceso AA037751).

Se ha mostrado que la serina-185 de la enzima de FAD2-1 de soja se fosforila durante el desarrollo de la semilla como un mecanismo regulador de su actividad enzimática (Tang et al., 2005). Entre los 11 polipéptidos CtFAD2 candidatos, solamente CtFAD2-1 tenía una serina en la posición correspondiente (Serina-181) en relación a FAD2-1 de soja. Se concluyó que el mismo mecanismo regulador posterior a la traducción podría operar durante el desarrollo de la semilla de cártamo y la acumulación de aceite a través de la fosforilación de la serina-185, para modular la desaturación A12 de oleato microsomal en la semilla en desarrollo.

Ejemplo 3. Aislamiento de secuencias genómicas para los FAD2 candidatos

Aislamiento de intrones 5'UTR de los genes CtFAD2 candidatos

Las estructuras intrón-exón de los genes FAD2 están conservadas en muchas plantas con flores. Todos los genes FAD2 estudiados hasta ahora contienen solamente un intrón, que está localizado en la 5'UTR, con una excepción que es FAD2-1 de soja para el que el intrón está localizado en la región codificadora inmediatamente después del primer ATG, el codón de iniciación de la traducción (Liu et al., 2001; Kim et al., 2006; Mroczka et al., 2010). La divergencia de la secuencia del intrón podría usarse como una medida de la distancia evolutiva entre especies estrechamente relacionadas taxonómicamente (Liu et al., 2001).

Con el fin de aislar las secuencias de ADN de posibles intrones situados en las 5'-UTR de los genes CtFAD2 candidatos, se predijeron los sitios de corte y empalme de intrón típicos (AG:GT) en la 5'UTR de cada una de las secuencias de ADNc de CtFAD2 y se diseñaron cebadores de PCR en base a las secuencias flanqueantes de los sitios de corte y empalme predichos. Los cebadores se listan en la Tabla 7. Se usó ADN genómico aislado a partir del genotipo SU de cártamo como molde en reacciones de PCR para amplificar las regiones genómicas correspondientes a las 5'UTR. Las amplificaciones se consiguieron en reacciones de 50 |jL con 100 ng de ADN genómico, 20 pmoles de cada cebador y un Hotstar (Qiagen, Hilden, Alemania) suministrado por el fabricante. El ciclado de la temperatura de PCR se efectuó como sigue: 94 °C durante 15 min durante un ciclo, 94 °C durante 30 seg, 55 °C durante 1 min, 72 °C durante 2 min durante 35 ciclos; 72 °C durante 10 min usando el superciclador de Kyratec SC200 (Kyratec, Queensland, Australia). Los productos de PCR se clonaron en pGEM-T Easy y luego se secuenciaron.

Los inventores fueron capaces de obtener el intrón 5' predicho a partir de 8 de los 11 genes CtFAD2 candidatos, concretamente CtFAD2-1, -2, -3, -4, -5, -7, -10, y -11. Las principales características de los intrones se proporcionan en la Tabla 8. El intrón no se amplificó exitosamente a partir de CtFAD2-6, -8 y -9, probablemente debido a una longitud insuficiente de la 5'UTR en la que estaban presentes los intrones. Parece que no se ha reportado un FAD2 sin intrón, aunque comúnmente se ha observado la pérdida de intrones de genes nucleares en plantas superiores (Loguercio et al., 1998; Small et al., 2000a:b).

Tabla 7. Cebadores oligonucleotídicos usados para la amplificación de regiones 5'UTR de genes FAD2 candidatos en cártamo.

Gen cebador Secuencia con sentido Secuencia antisentido

CtFAD2-1 5'- 5 '-GAGATTTTCAGAGAGCAAGCGCTT- CTTTGGTCTCGGAGGCAGACATA-3' (SEQ ID NO: 100) 3' (SEQ ID NO: 101)

CtFAD2-2 5'- 5'-CAAAAGGAGTTTCAGAAAGCCTCC- ACTCGTTGGATGCCTTCGAGTTC-3' (SEQ ID NO: 102) 31 (SEQ ID NO: 103)

CtFAD2-3 5'- 5'-AATCAGCAGCAGCACAAGC-3' AAGGCGGTGACAATTATGATATC-3' (SEQ ID NO: 104) (SEQ ID NO: 105)

CtFAD2-4 5'- 5'-AAGGCGGAGACGATTATGATATC-CTCAGTAACCAGCCTCAAAACTTG- 3' (SEQ ID NO: 107)

3' (SEQ ID NO: 106)

CtFAD2-5 5'- 5'-

ATCACAGGAAGCTCAAAGCATCT-3'

(SEQ ID NO: 108) ATCATCTCTTCGGTAGGTTATG-3' (SEQ ID NO: 109)

CtFAD2-7 5'- 5'-CTAAAGAATTTCCATGGTGTTAC-CAGATCCAACACTTCACCACCAG- 3' (SEQ ID NO: 111)

3' (SEQ ID NO: 110)

CtFAD2-10 5'- 5'-ACTTCGCCCTCTGTTATCTGG-3' GAGAGAC GGT GGAAGTAGGTG-3' (SEQ ID NO: 112) (SEQ ID NO: 113)

CtFAD2-11 5'- 5'-CTCACAATAACTTCATCTCTCTC-3' AAAGACATAGGCAACAACGAGATC-(SEQ ID NO: 114) 3' (SEQ ID NO: 115)

Tabla 8. La característica de los intrones del gen FAD2 candidato.

Característica CtFAD2-1 CtFAD2-2 CtFAD2-3 CtFAD2-4 CtFAD2-5 CtFAD2-7 CtFAD2-10 CtFAD2-11

Posición -13 -12 -11 -11 -33 -29 -38 -22

Longitud 1.144 3.090 114 124 122 253 2.247 104

Contenido ^dd^ee64,5 %

AT 65,8 % 73,7 % 75,0 % 67,2 % 62,1 % 68,9 % 75 %

Contenido ^dd^ee35,5 %

CG 34,2 % 26,3 % 25,0 % 32,8 % 37,9 % 31,1 % 25 %

, . .. , AG:GTGCA A_ . AG:GTATG AG:GTAAG AG:GTGAA AG:GTATA TG:GTTCG AG:GTTTC Limite de 5'E/I t AG:GTGAGA a T G C T T

, . .. , 0,.„- TTGCAG:G ATGCAG:G GCGCAG:GTTTCAG:G TTGCAG:G ATATAG:G TTGCAG:G Límite de 3'I/E t TTGCAG:GT t T T T T T

La secuencia del intrón en cada uno de los ocho genes se localizó en la 5'UTR de cada gen, en posiciones que variaron de 11 a 38 pb en 5' del posible codón de inicio de la traducción, el primer ATG en cada marco de lectura abierto. La longitud del intrón varió de 104 pb (CtFAD2-11) a 3.090 pb (CtFAD2-2) (Tabla 8). Para CtFAD2-1, el tamaño del intrón fue de 1.144 pb, similar en tamaño a los intrones identificados en genes FAD2 procedentes de Arabidopsis (The Arabidopsis Information Resource, http://www.arabidopsis.org). algodón (Liu et al., 2001) y sésamo (Sesamun indicum) (Kim et al., 2006). Los dinucleótidos en los posibles sitios de corte y empalme, AG y GT, estaban conservados en los ocho genes CtFAD2 examinados, pero de otra manera las secuencias de intrón fueron rodas divergentes en secuencia sin ninguna homología significativa entre ellos. Las secuencias de intrón fueron todas ricas en A/T con un contenido de A/T de entre el 61 % y el 75 %, lo que fue consistente con muchas otras secuencias de intrones de plantas dicotiledóneas. En genes de otras plantas dicotiledóneas, el gen FDA2 de Arabidopsis tenía un intrón de 1.134 pb justo 5 pb en 5' de su codón de inicio de la traducción, ATG. El tamaño del intrón 5'UTR del gen FAD2-1 de Gossypium fue de 1.133 pb, localizado 9 pb aguas arriba del codón de inicio de la traducción. En contraste, los genes FAD2-3 y FAD2-4 de algodón tenían intrones 5'UTR más grandes de 2.780 pb y 2.967 pb, respectivamente, localizados 12 pb aguas arriba del codón de inicio de la traducción. Cada gen CtFAD2 candidato podía distinguirse por las diferencias en la posición y tamaño del intrón 5'-UTR en cada gen. Las diferencias también podrían ser importantes proporcionando la expresión diferencial de los genes. Se ha reportado que dichos intrones tienen efectos positivos sobre la expresión de los genes informadores en sésamo (Kim et al., 2006). Se mostró que un intrón correspondiente es una diana efectiva para el silenciamiento génico posterior a la transcripción de FAD2 en soja (Mroczka et al., 2010).

Se sabe que los intrones pueden tener efectos dramáticos sobre los perfiles de expresión génica. El análisis de secuencias de intrones, mediante el programa PLACE (www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) identificó varios posibles elementos reguladores en cis. Por ejemplo, unos cuantos restos tales como ABRE y SEF4, comúnmente presentes en promotores específicos de semilla han sido localizados en CtFAD2-1 especifico de semilla. Un resto AG, que se encuentra normalmente en el promotor de genes relacionados con la defensa inducidos por varios estreses tales como por heridas o tratamientos estimulantes se localizó en CtFAD2-3 que se expresa específicamente en los hipocótilos y cotiledones de plántulas jóvenes de cártamo.

Ejemplo 4. Análisis de hibridación por transferencia Southern de los genes FAD2 de cártamo candidatos

Se examinó la complejidad de la familia de genes similares a FAD2 en cártamo mediante el análisis de hibridación por transferencia Southern. El análisis de hibridación de baja astringencia mostró que, en cártamo, FAD2 estaba codificado por una familia compleja con múltiples genes (Figura 2). Contando los fragmentos de hibridación obtenidos usando varias enzimas de restricción para escindir el ADN genómico, se estimó que había más de 10 genes FAD2 o similares a FAD2 en cártamo. Las diferencias observadas en la intensidad de la hibridación para los diferentes fragmentos estaban presumiblemente correlacionadas con los niveles relativos de identidad de secuencia respecto al ADN de la sonda que se usó. El cártamo es una especie diploide y se piensa que tiene una única especie progenitora salvaje, C. palaestinus (Chapman y Burke, 2007). Los inventores especulan que la familia de genes FAD2 inusualmente grande en cártamo es, deriva quizá de algunas duplicaciones génicas antiguas, que dan lugar a una actividad diferencial y a la especialización de los diferentes miembros de la familia del gen.

Ejemplo 5. Análisis funcional de genes candidatos en células de levaduras y de plantas

Expresión de genes CtFAD2 candidatos en levaduras- Análisis funcional

Como una célula huésped conveniente, se ha usado la levadura S. cerevisiae para estudiar la expresión funcional de varias FAD2 A12 oleato desaturasas de ácidos grasos de plantas (Covello y Reed 1996; Dyer et al., 2002; Hernández et al., 2005). S. cerevisiae tiene un perfil de ácidos grasos relativamente simple y contiene ácido oleico abundante en sus fosfolípidos que puede usarse como un sustrato para las enzimas FAD2, También carece de una actividad FAD2 endógena. Por lo tanto, se ensayaron los 11 genes CtFAD2 candidatos en la cepa de levadura YPH499 usando construcciones derivadas de pYES2, cada marco de lectura abierto bajo el control del promotor GAL1, como se describe en el Ejemplo 1.

Como se muestra en la Figura 3, cuando se analizó la composición de ácidos grasos de células de levaduras que contienen un "vector vacío" pYES2, no se detectó ácido linoleico (18:2) o ácido hexadecadienoico (16:2), como se esperaba, ya que la levadura carece de FAD2 endógeno. En contraste, el cromatograma de gases para ácidos grasos obtenidos a partir de células de levaduras que expresan los marcos de lectura abiertos de CtFAD2-1, CtFAD2-2 y CtFAD2-10 mostró cada uno un pico de ácido graso con un tiempo de retención de 11,293 min, correspondiente a ácido linoleico (C18:2), y los cromatogramas de gases para CtFAD2-9 y CtFAD2-10 mostraron un pico de ácido graso con un tiempo de retención de 8,513 min, correspondiente a C16:2. Estos datos indicaron que CtFAD2-1, CtFAD2-2 y CtFAD2-10 fueron capaces de convertir ácido oleico a ácido linoleico y, por lo tanto, eran A12 desaturasas. Sin embargo, el nivel de 18:2 producido fue inferior que para la construcción AtFAD2 de Arabidopsis el cual fue usado como control positivo. CtFAD2-10 produjo ambos ácido linoleico (C18:2) y ácido hexadecadienoico (C16:2) usando ácido oleico (C18:1) y ácido palmitoleico (C16:1) como sustratos, respectivamente, mientras que CtFAD2-9 desaturó el ácido palmitoleico y, por lo tanto, era una A12 palmitoleato desaturasa. Dos picos nuevos menores que aparecieron en los cromatogramas de los FAME de células de levaduras que expresaban a CtFAD2-11 fueron identificados como acido linoleico (18:2A9(Z),12(Z)) y su isómero trans (18:2A9(Z),12(E)) por g C-MS de sus aductos de pirrolidida, y DMOX (Figura 3H). La Tabla 9 resume la composición de ácidos grasos de células de levaduras que expresan regiones codificadoras de CtFAD2. No se detectaron picos nuevos en células de levaduras que expresaban CtFAD2-3, -4, -5, -6, -7 y -8.

Para examinar si cualquiera de los polipéptidos CtFAD2 candidatos tenía actividad de ácido graso hidroxilasa, los FAME preparados a partir de células de levaduras que expresaban cada uno de los marcos de lectura abiertos de CtFAD2 se hicieron reaccionar con un reactivo sililante que convierte residuos hidroxilo en derivados de éter de TMS cuyo espectro de masa pudo ser examinado. Sin embargo, no se detectó ningún derivado hidroxilo de los ácidos grasos comunes tales como ácido oleico en ninguna de las líneas celulares de levaduras que expresaban los marcos de lectura abiertos del CtFAD2 candidato. Esto indico que ninguno de los 11 genes CtFAD2 codificaba polipéptidos que tienen actividad de ácido graso hidroxilasa en levaduras.

Se llevaron a cabo experimentos adicionales para detectar actividad A12-epoxigenasa y A12-acetilenasa, ambas de las cuales usan ácido linoleico como el sustrato de ácido graso, suplementando el medio de crecimiento de las mismas líneas celulares de levaduras con ácido linoleico libre y posteriormente analizando después la composición de ácidos grasos. Se hizo la suplementación después de la adición de galactosa a los cultivos para expresar las construcciones. No se detectaron picos nuevos de ácidos grasos en los cromatogramas de gases, incluyendo los que representan derivados de ácidos grasos epoxi y acetilénico. La expresión heteróloga de estos nuevos ácidos grasos en levaduras, con suplementación de ácidos grasos libres exógenos, ha encontrado algunas dificultades para demostrar actividad (Lee et al., 1998; Cahoon et al., 2003). Por lo tanto, se llevaron a cabo análisis funcionales en células de plantas, como sigue

Tabla 9. Composición de ácidos grasos de células de levaduras que expresan genes CtFAD2 seleccionados.

Expresión transitoria de genes CtFAD2 candidatos en N. benthamiana

Para expresar los genes de una forma constitutiva en células de plantas, en particular en hojas de plantas, cada uno de los ORF de CtFAD2 se insertaron en la orientación con sentido en un vector binario pORE04 modificado entre el promotor CaMV-35S potenciado y el terminador nos3' que contenía una secuencia de señal de poliadenilación (Coutu et al., 2007) (SEQ ID NO: 54). La investigación previa indicó que la expresión de transgenes podía potenciarse significativamente por la coexpresión de la proteína supresora silenciadora viral, P19, para reducir el silenciamiento del transgén del huésped en un ensayo transitorio basado en hojas de N. benthamiana (Voinnet et al., 2003; Wood et al., 2009; Petrie et al., 2010). Estos experimentos se efectuaron como se describe en el Ejemplo 1.

Como se ha descrito anteriormente, la función de CtFAD2-11 se evaluó inicialmente por la expresión en S. cerevisiae y se identificaron dos nuevos ácidos grasos mediante GC-MS como 18:2A9(Z)'12(Z) y 18:2A9(Z)'12(E), respectivamente. Consistente con los resultados obtenidos de levaduras, la expresión de CtFAD2-11 en hojas de N. benthamiana produjo un nuevo isómero trans 18:2. El éster metílico de este isómero presentó un tiempo de retención por GC que fue idéntico al de un metil 18:2A9(Z)12(E) (Figura 4B). El nuevo 18:2A9(Z)12(E) representó el 0,35 % de los ácidos grasos en hojas después de expresar transitoriamente CtFAD2-11 (Tabla 10). Además, se detectó otro nuevo pico que no fue observado en los cultivos de levaduras. El cromatograma de ion total y el espectro de masa de este nuevo ácido graso fue consistente con el del ácido crepenínico (18:2A9(Z)12(C)) (Figura 4B y C), lo que demuestra que el polipéptido CtFAD2-11 tenía actividad A12-acetilenasa. Como se muestra en la Tabla 10, el ácido crepenínico representó el 0,51 % de los ácidos grasos totales.

Se observó que la expresión de CtFAD2-11 transitoriamente en las células de N. benthamiana dio como resultado una reducción en el contenido del 18:2A9(Z)12(z) en relación con el control sin transformar (Tabla 10). Esto fue probablemente debido a la competición de CtFAD2-11 con la cis-A12 oleato desaturasa endógena en las células de N. benthamiana para el conjunto disponible de ácido oleico, el sustrato para ambas enzimas. Globalmente, los resultados de los experimentos de expresión en levaduras y N. benthamiana indicaron que CtFAD2-11 funcionaba principalmente como una oleato A12-desaturasa que carece de estéreo-especificidad, produciendo tanto ácido linoleico como sus isómeros trans-A12. Además, también podría desaturar adicionalmente el doble enlace A12 del ácido linoleico para formar el enlace acetilénico del ácido crepenínico.

Los otros diez polipéptidos CtFAD2 candidatos también se expresaron transitoriamente en hojas de N. benthamiana de la misma manera, pero no observamos ningún ácido graso nuevo que no estuviera presente endógenamente en hojas de N. benthamiana, que ya tenían altos niveles de FAD2.

Tabla 10. Composición de ácidos grasos de hojas de N. benthamiana que expresan transitoriamente a CtFAD2-11.

Discusión

Los 11 genes CtFAD2 candidatos descritos anteriormente que fueron identificados en cártamo representan la mayor familia de genes FAD2 observada en cualquier especie de planta que haya sido examinada hasta la fecha. Aunque solamente un único gen FAD2 fue identificado en Arabidopsis (Okuley et al., 1994). FAD2 parece estar codificado por múltiples genes en la mayoría de los genomas de otras plantas estudiados hasta la fecha. Se han descrito dos genes FAD2 distintos en soja (Heppard et al., 1996), lino (Fofana et al., 2004; Khadake et al., 2009) y olivo (Hernanze et al., 2005); tres genes en girasol (Martinez-Rivas et al., 2001) y Camelina sativa (Kang et al., 2011); y cinco genes en algodón (Liu et al., 1998). En la especie anfitetraploide Brassica napus, se han identificado 4-6 genes de FAD2 diferentes en cada subgenoma diploide (Scheffler et al., 1997). Todos los genes CtFAD2 candidatos se expresaban en plantas de cártamo, ya que las secuencias fueron aisladas a partir de ADNc. Esto se examinó adicionalmente como se describe en el Ejemplo 6.

Aunque han faltado estudios comparables, está claro que el cártamo es inusual con respecto a la evolución de la familia de genes FAD2. El cártamo es una especie vegetal diploide autopolinizante, que está más estrechamente relacionado con una especie diploide salvaje Carthamus palaestinus y no se sabe que tenga duplicación o reorganización extensiva del genoma (Chapman y Burke, 2007). Los múltiples ADNc de FAD2 que fueron identificados no pudieron atribuirse a corte y empalme alternativo ya que los genes FAD2 candidatos no contenían intrones en la secuencia de la región codificadora. Más bien, la duplicación génica fue responsable más probablemente de crear la complejidad de la familia de FAD2 en cártamo. La topología del árbol filogenético mostró que pueden haber ocurrido duplicaciones génicas a varios nieles jerárquicos. Por ejemplo, los polipéptidos CtFAD2-3, -4 y -5 se relacionaron más estrechamente con los otros en ese grupo que con las otras secuencias de fAD2 de cártamo, indicando que las duplicaciones génicas más recientes pueden haber sido las responsables del surgimiento de este clado.

Ejemplo 6. Nivel de expresión de genes FAD2 candidatos en cártamo

Perfil de expresión de genes FAD2 en diferentes tejidos

Para determinar los patrones de expresión tisular de los diversos genes CtFAD2 candidatos, se llevaron a cabo análisis por RT-PCR como se describe en el Ejemplo 1. Se extrajo el ARN total de tejidos de cotiledones, hipocótilos, raíces y hojas derivados de plántulas de cártamo de 10 DAG del genotipo SU con alto contenido de linoleico, y de tejidos de flores y embriones en desarrollo de plantas con flor, y se usó en los ensayos. Los cebadores oligonucleotídicos usados para los análisis se listan en la Tabla 11.

Tabla 11. Cebadores oligonucleótidos usados para RT-qPCR en el estudio del perfil de expresión de genes FAD2 de cártamo.

Gen cebador Secuencia con sentido Secuencia Antisentido

CtFAD2-1 5'-GTGTATGTCTGCCTCCGAGA-3' (SEQ 5'-GCAAG GTAG TAGAG GAC GAAG-3 ’

ID NO: 116) (SEQ ID NO: 117)

CtFAD2-2 5'-GCCTCCAAAGATTCATTCAGGTC-3' 5'-CAAGATGGATGCGATGGTAAGG-3’

(SEQ ID NO: 118) (SEQ ID NO: 119)

Gen cebador Secuencia con sentido Secuencia Antisentido

CtFAD2-3 5'-ACGTGGCGGTCTCAGGTT-3' (SEQ ID 5'-AGGCGGTGACAATTATGATATC-3'

NO: 120) (SEQ ID NO: 121)

CtFAD2-4 5'-AAGGCAG GCCGT GATGCCGAT -3' 5'-AGTATTTGATCAATCCGCTGG-3'

(SEQ ID NO: 122) (SEQ ID NO: 123)

CtFAD2-5 5'-CAATACGGTAGAGGCCACACAG-3' 5'-ATCATCTCTTCGGTAGGTTATG-3'

(SEQ ID NO: 124) (SEQ ID NO: 125)

CtFAD2-6 5'-GACATGTGCTCACGTGGTGCAT-3' 5'-GTTGCTAATATCCACACCCTA-3'

(SEQ ID NO: 126) (SEQ ID NO: 127)

CtFAD2-7 5'-CGAATCACACCCACGGGATC-3' (SEQ 5'-CTAAAGAATTTCCATGGTGTTAC-3'

ID NO: 128) (SEQ ID NO: 129)

CtFAD2-8 5'-GAGCAACGGAGAGAAGTAACC-3' 5'-GAGGGATGATAGAAAGAGGTCC-3'

(SEQ ID NO: 130) (SEQ ID NO: 131)

CtFAD2-9 5'-CATGTGTGGCTGGAGGATTCGA-3' 5'-GCACCGAGTTTAGCCTTTGTCT-3'

(SEQ ID NO: 132) (SEQ ID NO: 133)

CtFAD2-10 5'-CCAACAAACAAACCATCTCTCG-3' 5'-GAGAGACGGTGGAAGTAGGTG-3'

(SEQ ID NO: 134) (SEQ ID NO: 135)

CtFAD2-11 5'-CCATTGATCCACCCTTCACCTTA-3' 5'-AAAGACATAGGCAACAACGAGATC-(SEQ ID NO: 136) 3' (SEQ ID NO: 137)

KASII 5'-CT GAACT GCAATTAT CTAGG-3' 5'-GGTATTGGTATTGGATGGGCG-3'

(SEQ ID NO: 138) (SEQ ID NO: 139)

El patrón de expresión espacial y temporal de los 11 genes CtFAD2 se muestra en la Figura 5. Los ensayos por RT-gPCR mostraron que CtFAD2-1 se expresaba exclusivamente en semillas en desarrollo. En contraste, CtFAD2-2 se expresaba a bajos niveles en semillas, así como también otros tejidos examinados. Adicionalmente, no se observó ninguna expresión de CtFAD2-4, -5, -6, -7, -8, -9 en embriones en desarrollo. Se observaron bajos niveles de expresión, aún detectables, de CtFAD2-10 y -11 en semillas en desarrollo, más en el estadio de desarrollo tardío al aproximarse las semillas de cártamo a la madurez. CtFAD2-4, -6, -7, -9 y -11 mostraron todos altos niveles de expresión en los tejidos de plántulas jóvenes incluyendo en cotiledones e hipocótilos. CtFAD2-5 y -8 parecieron ser específicos de raíz y CtFAD2-10 se expresó preferentemente en tejidos de flores, con niveles relativamente bajos detectados en otros diversos tejidos examinados, incluyendo semillas en desarrollo, y tejidos de plántulas de diez días de edad.

No se detectaron productos de amplificación después de 40 ciclos de amplificación en las reacciones de control con molde de ARN total, pero sin transcriptasa inversa, lo que indica la ausencia de ADN genómico contaminante en las preparaciones de ARN.

Ejemplo 7. Demostración de la mutación genética en la línea S317 de cártamo

El primer rasgo de alto contenido de oleico identificado en cártamo, encontrado en una introducción de cártamo procedente de la India, fue controlado mediante un alelo parcialmente recesivo designado ol en un único locus OL (Knowles y Hill, 1964). El contenido de ácido oleico de los genotipos olol era usualmente el 71- 75 % para plantas cultivadas en invernadero (Knowles (1989). Knowles (1968) incorporo el alelo ol en un programa de reproducción de cártamo y se lanzó la primera variedad "UC-1" de cártamo con alto contenido de oleico (HO), en 1966 en los EE. UU., que fue seguido del lanzamiento de variedades mejoradas "Oleic LEED" y la serie Saffola que incluye Saffola 317 (S-317), S-517 y S-518. Los genotipos con alto contenido de oleico (olol) fueron relativamente estables a diferentes temperaturas (Bartholomew, 1971). Además, Knowles (1972) también describió un alelo oh diferente, en el mismo locus, que produjo en una condición homocigota entre el 35 y el 50 % de ácido oleico. En contraste con el genotipo olol, el genotipo ohoh mostró una fuerte respuesta a la temperatura (Knowles, 1972).

Se ha reportado germoplasma adicional con mayor contenido de ácido oleico (>85 %) (Fernandez Martinez et al., 1993; Bergman et al., 2006). Fernandez-Martinez et al. (1993) reportaron un contenido de ácido oleico hasta del 89 % en cártamo en el acceso de germoplasma PI401472 originalmente procedente de Bangladesh. La serie Montola desarrollada por Bergman et al. (2006) contiene más del 80 % de ácido oleico, claramente más allá del nivel más alto de ácido oleico en la variedad "UC-1" que contiene el alelo olol como se describe por Knowles y Hill (1964). El análisis genético a través de cruces y análisis de segregación, las líneas con alto contenido de oleico y muy alto contenido de oleico sugirieron que estas dos líneas comparten los mismos alelos en el locus OL. El contenido de ácido oleico muy alto (85 %) se generó por la combinación de los alelos ol y genes modificadores con un pequeño efecto positivo sobre el ácido oleico (Hamdam et al. 2009).

Caracterización bioquímica in vitro de la línea mutante con alto contenido de oleico S-317

Se prepararon recientemente microsomas de cártamo a partir de semillas en desarrollo de genotipo S-317 con alto contenido de oleico en un estadio medio de la madurez, aproximadamente 15 días después de la antesis (DPA), como se describe por Stymne y Appelqvist (1978). Una mezcla de reacción estándar de 90 |jL contenía 40 |jg de proteína microsomal, 2 mmoles de [14C] oleil-CoA en tampón de fosfato de potasio 0,1 mM pH 7,2. Después, se añadieron 10 jiL de NADH 50 mM y la incubación continuó durante 5, 10 o 20 min adicionales. Las reacciones se pararon añadiendo 90 jiL de ácido acético 0,15 M y se extrajeron los lípidos con 500 jⁱL de CHCb:MeOH (1:1). Se recuperó la fase inferior de CHCl3 y se separaron de esta los lípidos polares por cromatografía en capa fina (TLC) usando el sistema de disolventes CHCl3/MeOH/HAc/H2O (90:15:10:3 v/v/v/v). Se rasparon de la placa las manchas correspondientes a PC y se transmetilaron los grupos acilo grasos asociados en 2 ml de ácido sulfúrico al 2 % en MeOH a 90 °C durante 30 min. Los FAME resultantes se separaron en placas de TLC tratadas con AgNO3 con hexano:DEE:HAc (85:15:1 v/v/v). Se pusieron estándares de ésteres metílicos de oleato y linoleato marcados con 14C como referencias. Las placas se expusieron y analizaron por un phosphorimager Fujifilm FLA-5000. La radioactividad de cada muestra se cuantificó con el software Fujifilm Multi Gauge.

Después de la adición de NADH a las reacciones con los microsomas de tipo salvaje, se observó que el [14C]oleoil-CoA añadido desapareció rápidamente, en 10 min, al mismo tiempo que la aparición de [14C]linoleato, indicando la conversión eficiente de oleato a linoleato en los microsomas de cártamo de tipo salvaje. En contraste, para el genotipo S-317 con alto contenido de oleico, se encontró una relación significativamente más alta de [14C]oleato respecto a [14C]linoleato en las reacciones in vitro en todo el tiempo transcurrido (Tabla 12), indicando que la biosíntesis de ácido linoleico a través de la desaturación de oleato por los microsomas estaba reducida drásticamente en este genotipo.

Tabla 12. Porcentaje de producto C18:2 derivado de C18:1 en microsomas de cártamo.

Tiempo (min) WT HO

C18:1 C18:2 C18:1 C18:2

0 99,2±1,1 0,8±1,1 100,0±0,0 0,0±0,0

5 79,6±1,2 20,4±1,2 99,4±0,3 0,6±0,3

10 69,6±0,4 30,4±0,4 95,4±1,6 4,6±1,6

20 60,6±0,6 39,4±0,6 95,1±1,5 4,9±1,5

n=2

Caracterización molecular del alelo ol de alto contenido de oleico

Para entender la base molecular del genotipo {olol) de alto contenido de oleico en cártamo, los dos ADNc de FAD2 expresado en semilla, concretamente CtFAD2-1 y CtFAD2-2, se amplificaron por PCR a partir de tres variedades de alto contenido de oleico: S-317, LeSaf 496 y CW99-OL y se secuenciaron. Los ADNc que abarcan las regiones codificadoras enteras de los genes CtFAD2-1 de las tres variedades de alto contenido de oleico fueron idénticas entre sí en la secuencia de nucleótidos, y compartieron aproximadamente un 98 % de identidad de secuencia con el ADNc de CtFAD2-1 derivado de la variedad SU de tipo salvaje, incluyendo una deleción de nucleótido y 22 sustituciones de nucleótidos en el genotipo HO en relación con el tipo salvaje. Se encontró la deleción de un único par de bases en el nucleótido 606 contando desde el primer ATG, en aproximadamente el medio de la región codificadora de CtFAD2-1. Esta deleción causó un desplazamiento en el marco de lectura de la traducción que creó un codón de parada inmediatamente después de la deleción, de modo que el gen mutante en las tres variedades olol codificaban un polipéptido truncado predicho sin la tercera caja de histidina presente en la proteína de tipo salvaje (Figura 6). Cabe destacar que habla un nivel relativamente alto de variación de secuencia en las secuencias de ADN cerca del sitio del único nucleótido delecionado del alelo ol, sugiriendo que se hablan acumulado mutaciones adicionales en el gen mutante.

Las regiones de ADN incluyendo los intrones 5' UTR de CtFAD2-1 y CtFAD2-2 también se aislaron del mutante olol de S-317 y se compararon con los intrones de tipo salvaje. El intrón de CtFAD2-1 de S-317 tenía una longitud de 1.144 pb, 61 pb más largo que el intrón de SU de tipo salvaje que tenía una longitud de 1.083 pb. La comparación de las secuencias de nucleótidos de los intrones de CtFAD2-1 mostró una identidad de secuencia global del 76,8 %, difiriendo los intrones en 27 inserciones o deleciones (indels) y 95 sustituciones de nucleótidos únicos (Figura 7).

De manera interesante, las sustituciones de nucleótidos en el gen mutante no se distribuyeron uniformemente en toda la región de 1.142 pb de longitud correspondiendo a la región codificadora del CtFAD2-1 defectuoso, en que 14 de las 22 (63,6 %) sustituciones estaban presentes cerca de la deleción del nucleótido, mayormente en 123 pb justo en 5' de la deleción del único nucleótido. En contraste, los intrones de CtFAD2-2 en los genotipos de tipo salvaje y mutante compartieron una identidad de secuencia global del 99,5 %, solamente con 12 sustituciones de nucleótidos y una inserción o eliminación de 2-nt (indel). Esto indica que bien había ocurrido alguna presión de selección en el gen CtFAD2-1 defectuoso en el mutante HO, o, tal vez, lo más probablemente, la mutación de CtFAD2-1 era de origen antiguo y se podría haber originado a partir de una especie progenitora de cártamo tal como C. palaestinus.

Se ha descrito un mutante EMS (S-901) derivado de la variedad comercial de alto contenido de oleico S-518 en US 5.912.416. Aunque los estudios genéticos indicaron que el alelo denominado oh en este nuevo genotipo era distinto de los alelos ol y oh en el locus OL, su naturaleza molecular no fue determinada por Weisker (US 5.912.416). El genotipo S-901 se caracterizó por un incremento del nivel de ácido oleico hasta el 89,5-91,5 % de los ácidos grasos totales en semillas maduras. Hubo una reducción de ácidos grasos saturados, es decir, el ácido palmítico disminuyó hasta aproximadamente el 4 % y el ácido esteárico disminuyó hasta aproximadamente el 2,5 %. Sin embargo, S-901 no presentó un fenotipo de planta normal y padeció algo de crecimiento y rendimiento compuesto. Morfológicamente, era más bajo y los capítulos fueron más pequeños en comparación con su línea parental S-518. También floreció tarde y contenía menos aceite en las semillas.

Diseño de marcadores perfectos para PCR para la reproducción alto contenido de oleico

El polimorfismo de la secuencia de deleción de nucleótido único en el alelo de CtFAD2-1 mutante, que se concluyó que era la mutación causante responsable del fenotipo HO, se desarrolló como la base molecular de un marcador molecular altamente eficiente para rastrear el alelo ol mutante. Los inventores desarrollaron así un ensayo de marcador molecular que permitió la identificación y selección del alelo ol mutante para propósitos de reproducción o propósitos de identificación de variedades, incluso cuando estaba presente en el estado heterocigoto. La selección asistida por el marcador molecular elimina así la necesidad de producir una generación extra de plantas que deben ser cribadas para determinar el fenotipo de ácidos grasos. La genética simple combinada con ensayos de marcador molecular perfecto hará posible que los reproductores de cártamo incorporen rápidamente el rasgo de alto contenido de oleico en su programa de reproducción.

Parecía que había una variación de secuencia insuficiente en los exones de CtFAD2-1 entre SU de tipo salvaje y el genotipo S-317 de alto contenido de oleico como para generar fácilmente un marcador diferencial basado en reacciones de PCR. Sin embargo, los inventores pudieron aprovechar la divergencia de secuencia relativamente alta en el intrón 5' UTR de CtFAD2-1 entre los alelos OL, y ol. Hubo cadenas de secuencias altamente variables entre estos dos alelos que facilitaron el diseño de cebadores de pCr únicos. Los siguientes cebadores ilustrativos fueron diseñados para amplificar un producto específico de 315 pb de longitud a partir de los genotipos de alto contenido de oleico, portando el alelo mutante olol, pero no el SU de tipo salvaje. HO-con sentido: 5'-ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT-3' (SEQ ID NO: 140); y HO-antisentido: 5'-GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT-3' (SEQ ID NO: 141) (Figura 7). Otro par de cebadores ilustrativos específicos para el gen de tipo salvaje en la variedad SU que dieron lugar a un producto de PCR de 603 pb son como sigue: HL-con sentido: 5'-AGTTAT GGTTCGAT GATCGACG-3' (SEQ ID NO: 142); y HL-antisentido: 5'-TTGCTATACATATTGAAGGCACT-3' (SEQ ID NO: 143) (Figura 7). Se usó un par de cebadores derivados del gen KASII de cártamo, ctkasII-con sentido: 5'-CTGAACTGCAATTATCTAGG-3' (SEQ ID NO: 144) y ctkasII-antisentido 5'-GGTATTGGTATTGGATGGGCG-3' (SEQ ID NO: 145) como el control positivo para asegurar la misma carga y el buen rendimiento de PCR del ADN molde.

Las condiciones de la reacción de PCR fueron 94°C durante 2 min, seguido por 40 ciclos de 94 °C durante 30 seg, 58 °C durante 30 seg y 72 °C durante 30 seg. Los productos de la reacción fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se visualizaron bajo luz UV después de la tinción con bromuro de etidio del gel. En las reacciones de amplificación se observó un fragmento de aproximadamente 300 pb en los cinco genotipos de alto contenido de oleico examinados, concretamente, S-317, S-517, CW99-OL, LeSaf496 y Ciano-OL, mientras que dicho fragmento estaba ausente para el genotipo SU de tipo salvaje. A la inversa, un fragmento de aproximadamente 600 pb estaba presente en las amplificaciones para el SU de cártamo de tipo salvaje, pero no en ninguna de las variedades de alto contenido de oleico ensayadas. Como un control positivo, se amplificó una banda de 198 pb derivada del gen KASII en las reacciones para todas las líneas ensayadas. Las identidades del amplicón se verificaron por secuenciación de ADN.

La divergencia de secuencia en la región del intrón 5'UTR del gen CtFAD2-1 entre los alelos de cártamo de tipo salvaje y de alto contenido de oleico, facilitó así el desarrollo de un marcador de PCR que sirvió de diagnóstico para la presencia o ausencia de la mutación CtFAD2-1. Estaba completamente ligado al alelo ol independientemente del fondo genético, esto es, era un marcador perfectamente ligado. Sin embargo, el marcador molecular era un marcador dominante y consecuentemente el uso de ese marcador solo no permitiría la distinción entre genotipos homocigotos y heterocigotos para el alelo ol. Para superar esto, se diseñó otro par de cebadores de PCR que amplificó solamente el alelo Ol de tipo salvaje. Consecuentemente, el uso de dichos cebadores específicos de tipo salvaje en combinación con cebadores de PCR específicos de alto contenido de oleico permitió la distinción entre genotipos homocigotos y heterocigotos en el locus de CtFAD2-1.

La expresión de CtFAD2-1 está reducida drásticamente en genotipos de alto contenido de oleico

En las secciones anteriores, se mostró que CtFAD2-1 se expresaba solamente en los embriones en desarrollo de las semillas en desarrollo y no detectablemente en otros diversos tejidos examinados, incluyendo en hojas, raíces, flores, cotiledones e hipocótilos derivados de plántulas jóvenes de cártamo. CtFAD2-1 se expresaba altamente en semillas en desarrollo donde la velocidad del metabolismo de los ácidos grasos era alta, y condujo a la acumulación de aceite activo que tenía mayormente C18:2 en un periodo de tiempo relativamente corto. CtFAD2-1 tuvo su nivel de expresión más alto hasta aproximadamente el punto medio en el desarrollo de la semilla, con un nivel de expresión más moderado tanto en estadios tempranos como tardíos del desarrollo de la semilla.

Usando el método de ensayo de RT-qPCR, se midió el nivel de expresión del gen normalizado del gen CtFAD2-1 en tres variedades de alto contenido de oleico, concretamente, S-317, Lesaff496 y CW99-OL, y se comparó con el de semillas en desarrollo del genotipo SU de tipo salvaje. Como puede verse en la Figura 8, se detectó la expresión de CtFAD2-1 en los tres estadios de embriones en desarrollo en el genotipo SU de cártamo de tipo salvaje, con el nivel máximo de expresión observado en el estadio medio de madurez, consistente con los resultados previos y verificando el patrón de transcripción temporal para este gen FAD2 clave. Sin embargo, los transcritos de CtFAD2-1 fueron apenas detectables en las tres variedades de alto contenido de oleico S-317, Lesaff496 y CW99-OL (Figura 8), indicando un nivel alto de inestabilidad de los transcritos de ARN procedentes de este gen en los embriones mutantes.

En contraste, los niveles de los transcritos procedentes de CtFAD2-2 fueron similares para los genotipos de alto contenido de oleico y de tipo salvaje, mostrando que la expresión de CtFAD2-2 no estaba afectada en los embriones HO, así como demostrando que las preparaciones de ARN eran adecuadamente puras para los ensayos. Por lo tanto, se concluyó que la expresión de CtFAD2-2 podía también contribuir a la A12-desaturación de ácidos grasos para almacenar lípidos en semillas de cártamo en desarrollo, pero a un nivel mucho más bajo que para CtFAD2-1 en las semillas de tipo salvaje, así como que estaba implicado en la A12-desaturación de ácidos grasos para lípidos de membrana en raíz, hoja y tallo. No hubo evidencia de que la expresión de CtFAD2-2 era elevada en el mutante de alto contenido de oleico en respuesta a, o como compensación por, la pérdida de actividad de CtFAD2-1 en las semillas de cártamo en desarrollo del mutante CtFAD2-1.

Los transcritos de CtFAD2-1 reducidos drásticamente en líneas de HO están causados por la degradación de ARN mediada por sin sentido (NMD)

El nivel reducido drásticamente de transcritos de CtFAD2-1 en los embriones HO podría haber sido causado por degradación de ARNm mediada por sin sentido (NMD) de los ARNm de CtFAD2-1, ya que se encontró un codón de parada prematura en la parte media de la secuencia codificadora inmediatamente después de la deleción del nucleótido único. El sistema NMD se considera que es un mecanismo implicado en la degradación de ARNm aberrantes que contienen un codón de terminación prematuro (PTC) que resulta de errores inesperados tales como mutaciones genómicas, errores transcripcionales, y corte y empalme erróneo. Es un mecanismo que está presente universalmente en eucariotas y, en particular, se ha estudiado exhaustivamente en levaduras y mamíferos. Está muy poco estudiado en plantas superiores, pero hay unas cuantas publicaciones que incluyen el gen inhibidor de tripsina Kunitz de soja (Kti3), gen de fitohemaglutinina (PHA) de judía común (Jofuku et al., 1989; Voelker et al., 1990), gen de ferredoxina de guisante (FED1) (Dickey et al., 1994) y gen ceroso de arroz (Isshiki et al., 2001).

En estos experimentos se mostró que la mutación ol que da lugar el rasgo de alto contenido de ácido oleico en aceite de semilla de cártamo se correlacionaba con bajos niveles de acumulación de ARNm de CtFAD2-1 en las semillas en desarrollo. Las investigaciones previas indicaron que el alelo ol era semi recesivo, lo que no era consistente con un mecanismo de silenciamiento génico posterior a la transcripción mediado por ARN pequeños. El silenciamiento génico implica ARNsi de 21 a 24 nt producido a partir de ARN bicatenario, dando lugar a la transcripción de ARN en horquilla o antisentido y puede actuar genéticamente como un locus dominante o semi dominante (Brodersen y Voinnet, 2006). Para confirmar que el mecanismo de la mutación ol era distinto del silenciamiento génico relacionado con ARNi, se llevó a cabo una secuenciación de ARN pequeño, como sigue.

Se generaron dos bibliotecas de ARN pequeños, derivados de los genotipos S-317 de alto contenido de oleico y SU de tipo salvaje, usando ARN aislados combinados procedentes de embriones en desarrollo a media madurez. La secuenciación en volumen de las bibliotecas de ARN pequeños se efectuó con la tecnología Solexa (Hafner et al., 2008). La secuenciación de estas dos bibliotecas se efectuó en el Secuenciador Solexa de Illumina y las muestras de operaron en paralelo. La secuenciación de bibliotecas de ARN pequeños de SU y S-317 generó un total de 23.160.261 y 21.696.852 lecturas brutas, respectivamente. El análisis de estas lecturas dio como resultado la identificación de 22.860.098 y 21.427.392 secuencias que variaban en longitud de 18 a 30 nucleótidos (nt), respectivamente. Se determinaron la presencia y distribución de ARN pequeños correspondientes a CtFAD2-1 en las bibliotecas de SU y S-317. Solamente se detectaron niveles bajos, apenas detectables, de ARN pequeños correspondientes a CtFAD2-1 a partir de ambas bibliotecas de ARN pequeños y se distribuyeron casi uniformemente sobre las regiones codificadoras de los genes CtFAD2-1. No hubo una diferencia clara entre las bibliotecas de alto contenido de oleico y de tipo salvaje.

A partir de estos datos, se concluyó que el silenciamiento génico posterior a la transcripción mediado por ARN pequeños no era el principal mecanismo mediante el cual se evitaba la acumulación de los transcritos de CtFAD2-1 mutante.

Estudios de expresión transitoria en hojas de N. benthamiana

Para investigar el fenómeno de NMD adicionalmente, los inventores efectuaron experimentos para la expresión transitoria de CtFAD2-1 derivado de genotipos tanto de tipo salvaje como de alto contenido de oleico en hojas de N. benthamiana.

Cada uno de los ORF de CtFAD2-1 se insertó en orientación con sentido en un vector binario pORE04 modificado bajo el control del promotor CaMV-35S. Se infiltró la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens que porta ya sea al 35S:CtFAD2-1 o su forma mutante 35S:CtFAD2-1A en la parte inferior de las hojas totalmente expandidas de N. benthamiana junto con 35S:P19, como se describe en el Ejemplo 5. Después de un periodo de 5 días de crecimiento adicional a 24 °C, las regiones infiltradas se escindieron y se obtuvieron los ARN totales a partir de las muestras usando un Mini Kit RNeasy (Qiagen). Para medir los niveles de ARN de CtFAD2-1, se llevaron a cabo ensayos de qPCR en tiempo real en triplicado usando la Supermezcla-UDG para qPCR Platinum SYBR Green (Invitrogen) y se operó en el sistema de detección de secuencia ABI 7900HT como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se llevó a cabo la PCR bajo las condiciones siguientes: un ciclo inicial a 48 °C durante 30 min, luego 95 °C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 60 s. Los cebadores para el gen CtFAD2-1 exógeno fueron: con sentido: 5-GTGTATGTCTGCCTCCGAGA-3' (SEQ ID NO: 146); antisentido: 5-GCAAGGTAGTAGAGGACGAAG-3' (SEQ ID NO: 147). Se usó un gen de referencia, CtKASII de cártamo, para normalizar los niveles de expresión; sus cebadores específicos fueron: con sentido: 5'-CTGAACTGCAATTATCTAGG-3' (SEQ ID NO: 144); y antisentido: 5-GGTATTGGTATTGGATGGGCG-3' (SEQ ID NO: 145). Se observaron altos niveles de expresión de CtFAD2-1 en las hojas de N. benthamiana procedentes del gen 35S-CtFAD2-1 derivado de la variedad SU de tipo salvaje. En comparación, se observaron niveles de expresión mucho más bajos para el gen 35S-CtFAD2-1A derivado del genotipo de alto contenido de oleico.

Se transformaron plantas del ecotipo Col-0 de A. thaliana con la cepa AGL1 de A. tumefaciens que porta un vector binario que alberga un promotor Fp1 específico de semilla que dirige la región codificadora de CtFAD2-1 o de CtFAD2-1A, según el método de Clough y Bent (1998). Se aisló el ARN total de silicuas que contenían embriones en el estadio de madurez media de progenie de las plantas transformadas resultantes usando un Mini Kit RNeasy (Quiagen). Se hicieron estudios de la expresión genética usando las preparaciones de ARN en los ensayos de RT-qPCR en tiempo real, que se llevaron a cabo en triplicado como se ha descrito anteriormente. Se observaron altos niveles de expresión de CtFAD2-1 en las silicuas de Arabidopsis que expresaban Fp1-CtFAD2-1 derivado de SU, sin embargo, la expresión de Fp1-CtFAD2-1A derivado del genotipo de alto contenido de oleico se redujo drásticamente en comparación.

Se demostró que los ARN pequeños específicos de CtFAD2-1 no se produjeron a niveles significativamente mayores en las semillas de cártamo en desarrollo de alto contenido de oleico en comparación con los ARN pequeños procedentes del gen de tipo salvaje, aunque el transcrito del CtFAD2-1 mutante se redujo drásticamente en cantidad. Por lo tanto, se concluyó que la reducción en el ARN de CtFAD2-1 en el genotipo de alto contenido de oleico se debió a NMD, distinto del mecanismo de silenciamiento génico posterior a la traducción mediado por ARN pequeños. El fenómeno NMD también se observó cuando la región codificadora mutante se expresó exógenamente ya sea en las hojas de N. benthamiana o las silicuas de Arabidopsis.

Ejemplo 8. Aislamiento de ADNc de cártamo que son candidatos para codificar FATB

Aislamiento de secuencias de ADNc de FATB de cártamo

El aceite de semilla de cártamo contiene aproximadamente un 7 % de ácido palmítico. Este ácido graso se sintetiza en los plástidos de las células de la semilla en desarrollo, desde donde es exportado hacia el citosol de las células para su incorporación en triacilgliceroles. La enzima clave para exportar el ácido palmítico es la palmitoil-ACP tioestearasa, que hidroliza el enlace tioéster entre el resto palmitoílo y la proteína portadora de acilo (ACP) a la que se une el grupo acilo covalentemente mientras es sintetizado en el plástido. La enzima palmitoil-ACP tioestearasa pertenece a un grupo de enzimas dirigidas hacia el plástido solubles designado FATB. En las plantas de semillas oleaginosas, esta enzima presenta especificidad hacia acil-ACP saturado de cadena corta como sustrato. Inicialmente, se aisló un gen que codifica la enzima FATB a partir de especies de plantas que acumulan ácidos grasos saturados con una longitud de la cadena media, tales como ácido láurico (C12:0) del árbol de la bahía de California (Umbellularia californica). Los estudios subsecuentes demostraron que estaban presentes ortólogos de FATB en todos los tejidos de plantas, predominantemente en semillas, con una especificidad de sustrato que varía de C8:0-ACP a C18:0-ACP. En Arabidopsis y cultivos de semillas oleaginosas más templados que incluyen cártamo, el ácido palmítico es el principal ácido graso saturado en el aceite de la semilla.

Para aislar los ADNc de cártamo que codifican candidatos para FATB, se cribó la biblioteca de ADNc de semillas de cártamo en desarrollo usando una sonda heteróloga que consistía en un fragmento de ADNc de FATB de algodón (Gossypium hirsutum) como se ha descrito en el Ejemplo 1. Un ADNc de longitud completa, denominado CtFATB-T12, se aisló de la biblioteca de ADNc de semilla de cártamo. Este ADNc contenía un marco de lectura abierto de 1.029 nucleótidos de longitud, que codifica un polipéptido de 343 aminoácidos. Sus UTR en 5' y 3' tenían una longitud de 236 nt y 336 nt, respectivamente. Se predijo que el polipéptido CtFATB-T12 tenía un péptido de tránsito predicho de aproximadamente 60 aminoácidos y un núcleo de 210 residuos de aminoácidos que contenía dos repeticiones de una hélice y plegamiento de hoja de múltiples cadenas común a las denominadas proteínas plegadas en forma de perrito caliente.

A partir del Compositae Genome Project (CGP), la base de datos de etiqueta de secuencias expresadas (EST) para cártamo (cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2), se identificaron tres EST diferentes con homología con CtFATB-T12, concretamente, EL379517, EL389827, y EL396749. Cada una de longitud parcial. Los genes correspondientes fueron designados CtFATB-A, CtFATB-B y CtFATB-C, respectivamente. El ADNc de CtFATB-T12 de longitud completa aislado de la biblioteca de ADNc de semilla de cártamo fue idéntico en la secuencia de nucleótidos a la EST de CtFATB-C en su región superpuesta. Pareció que CtFATB-A era más divergente en su secuencia de nucleótidos en comparación con las otras dos secuencias de CtFATB.

Perfil de expresión de genes CtFATB por análisis por qPCR en tiempo real

El perfil de expresión génica de los tres genes CtFATB se estudió con qPCR en tiempo real como se ha indicado el Ejemplo 1. Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos correspondientes a la única región de cada uno de los tres genes, incluyendo CtFATB-A, cebador con sentido: 5'-AGAGATCATTGGAGACTAGAGTG-3' (SEQ ID NO: 148); cebador antisentido: 5'-CCCATCAAGCACAATTCTTCTTAG-3' (SEQ ID NO: 149); CtFATB-B, cebador con sentido: 5'-CTACACAATCGGACTCTGGTGCT-3' (SEQ ID NO: 150); cebador antisentido: 5'-GCCATCCATGACACCTATTCTA-3' (SEQ ID NO: 151); CtFATB-C, cebador con sentido: 5'-CCTCACTCTGGGACCAAGAAAT-3' (SEQ ID NO: 152) ; cebador antisentido: 5'-TTCTTGGGACATGTGACGTAGAA-3' (SEQ ID NO: 153). Las reacciones de p Cr se realizaron en triplicado como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Como se muestra en la Figura 9, CtFATB-A mostró bajos niveles de expresión en hojas, raíces y en los tres estadios de embriones en desarrollo que fueron examinados. CtFATB-B fue activo en hojas y raíces, pero mostró una expresión más baja en embriones en desarrollo que en hojas y raíces. Esto sugirió que este gen podría desempeñar solamente un papel menor, si desempeña alguno, en la biosíntesis de ácidos grasos en semillas en desarrollo. En contraste, CtFATB-C demostró altos niveles de expresión en todos los tejidos examinados, particularmente en los embriones en desarrollo. Esto indicó que CtFATB-C era el gen clave que codifica FATB para la producción de ácido palmítico en aceite de semilla de cártamo. Esto fue consistente con nuestra recuperación de solamente un clon de ADNc de FATB procedente de la biblioteca de embrión de semilla, concretamente CtFATB-T12 que fue idéntico en secuencia a CtFATB-C. Tomando como base estos datos, se eligió un fragmento de ADN de aproximadamente 300 pb derivado de CtFATB-T12 (CtFATB-C) como la secuencia génica a ser usada en la preparación de construcciones de ARNhp para la regulación a la baja de FATB en semillas de cártamo, como se describe en los siguientes Ejemplos.

Ejemplo 9. Aislamiento y expresión de ADNc de cártamo que codifica FAD6

Aislamiento de la secuencia de ADNc de FAD6 de cártamo

Las distintas composiciones de ácidos grasos encontradas en lípidos de membrana cloroplástica y microsomal y aceites de almacenamiento en semillas son el resultado de una intricada red metabólica que opera para controlar esta composición regulando la biosíntesis de ácidos grasos y el flujo a través de ambas rutas denominadas procariota y eucariota. Está claro que la enzima FAD2 microsomal tiene un papel importante convirtiendo oleato a linoleato en el RE después de la exportación de ácido oleico procedente del plástido y la conversión a ésteres de CoA en el citoplasma. La enzima omega-6-desaturasa (FAD6) de los cloroplastos es una enzima que desatura los ácidos grasos 16:1 y 18:1 a 16:2 y 18:2, respectivamente, en todos los lípidos de membrana del cloroplasto que contienen 16:1 o 18:1, incluyendo fosfatidilglicerol, monogalactosildiacilglicerol, digalactosildiacilglicerol, y sulfoguinovosildiacilglicerol. Se reportó que un mutante de Arabidopsis fad6 era deficiente en la desaturación de 16:1 y 18:1 a 16:2 y 18:2, respectivamente, en todos los lípidos del cloroplasto (Browse et al., 1989). Cuando el mutante fad6 se creció a baja temperatura (5 °C), las hojas se volvieron cloróticas y la velocidad de crecimiento se redujo significativamente en comparación con el tipo salvaje (Hugly y Somerville, 1992). Una secuencia de ADNc que codifica fAD6 se aisló primero a partir de Arabidopsis por Falcone et al. (1994). Desde entonces, se han aislado ADNc que codifican a FAD6 y genes FAD6 a partir de varias especies de plantas incluyendo Brassíca napus, Portulaca oleracea, soja, y Ricinus communis.

Con el fin de aislar un clon de ADNc que codifica la w6 desaturasa de cloroplasto codificada por el gen FAD6 de cártamo, la base de datos CPG fue investigada para secuencias homologas. Se identificaron ocho secuencias EST, concretamente, EL378905, EL380564, EL383438, EL385474, EL389341, EL392036, EL393518, EL411275, y se ensamblaron en una única secuencia de cóntigo de 808 nt. Esta secuencia tenía un extremo 5' intacto, pero estaba incompleta en el extremo 3'. El ADNc de longitud completa se obtuvo subsecuentemente a través de amplificación por PCR de 3' RACE usando, como molde, el ADN extraído de una biblioteca de ADNc lambda elaborada a partir de semillas de cártamo en desarrollo (SU). Las condiciones de PCR fueron como se han descrito en el Ejemplo 2. Se usó un único cebador oligonucleotídico, designado ctFAD6-s2 en la reacción de amplificación en combinación con el cebador directo M13 ya que la secuencia para este cebador estaba presente en el vector de la biblioteca de ADNc. La secuencia del cebador de ctFAD6-s2 fue: 5'-CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG-3' (SEQ ID NO: 154). Se obtuvo un ADNc de 1545 pb que tenía un marco de lectura abierto de 1.305 pb que codificaba un polipéptido FAD6 candidato de 435 aminoácidos. Este polipéptido compartía entre el 60-74 % de identidad de secuencia de aminoácidos con otros polipéptidos FAD6 de plantas clonados. Se generó mediante el vector NTI (Figura 10), un dendograma que mostró la relación filogenética entre la secuencia de FAD6 de cártamo y la FAD6 plastidial A12 desaturasa representativa identificada en plantas superiores.

Perfil de expresión de CtFAD6 mediante análisis por qPCR en tiempo real

Se estudió el perfil de expresó de CtFAD6 por RT-qPCR en tiempo real, que se llevó a cabo usando Supermezcla-UDG Platinum SYBR Green para qPCR (Invitrogen) y se operó en un sistema de detección de secuencia ABI 7900HT con parámetros por defecto como se describe en el Ejemplo 1. Los cebadores usados fueron: ctFAD6-S2: 5'-CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG -3' (SEQ ID NO: 155) y ctFAD6-a2: 5'-GTTCCAACAATATCTTCCACCAGT-3' (SEQ ID NO: 156). Las reacciones se realizaron en triplicado en volúmenes totales de 10 pL que contenían 20 ng de ARN molde total, 800 mM de cada cebador, 0,25 pL de transcriptasa inversa y 5 pL de reactivos de mezcla maestra para RT-PCR en una etapa. Las condiciones para RT y las amplificaciones fueron 48 °C durante 30 min, luego 95 °C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 60 s. Se usó la expresión de un gen CtkasII de cártamo de referencia para normalizar los niveles de expresión de FAD6. Los cálculos se hicieron como se describe en el Ejemplo 1.

Los análisis mostraron que CtFAD6 se expresaba a niveles relativamente bajos en hojas, raíces y tres estadios consecutivos de embriones en desarrollo. Los niveles de expresión bajos observados en las semillas en desarrollo fueron consistentes con la noción de que FAD6 podría tener un papel relativamente menor en la desaturación de oleato en las semillas.

Ejemplo 10. Diseño y preparación de construcciones genéticas para silenciar genes de la biosíntesis de ácidos grasos en cártamo

Los ARN en horquilla (ARNhp) son un tipo de molécula de ARN que ha sido usada extensamente para reducir la expresión génica en plantas. Los ARN en horquilla se transcriben típicamente en células de plantas procedentes de una construcción de ADN que contiene una repetición invertida de una secuencia derivada de un gen que se quiere silenciar. El transcrito de ARNhp por consiguiente tiene secuencias con sentido y antisentido complementarias que hibridan para formar una región de ARN bicatenaria (ARNds) unida por una secuencia en bucle. Dichas estructuras de ARNds son procesadas mediante maquinarias de silenciamiento endógenas en las células de las plantas para formar moléculas de ARN pequeñas de aproximadamente 21 a 24 nucleótidos correspondientes en secuencia al gen cuya actividad se quiere reducir. Estos ARN pequeños pueden formar complejos con proteínas endógenas que silencian específicamente el gen de interés. Dicho silenciamiento puede tener lugar al nivel transcripcional, mediado por la metilación de ADN de partes del gen diana, al nivel posterior a la transcripción por degradación de ARNm diana, o por unión a los ARNm para inhibir su traducción y reducir así la síntesis de la proteína codificada por el gen. Cuando el ARNhp incluye una secuencia que es común entre miembros de una familia de genes, el ARNhp puede silenciar a cada uno de esos genes que tienen la secuencia.

El cártamo tiene una gran familia de genes FAD2, con al menos 11 miembros identificados como se describe en la presente memoria (Ejemplos 2 a 6). El cártamo también tiene múltiples genes que codifican polipéptidos FATB, con al menos tres miembros identificados (Ejemplo 8), y al menos un gen FAD6 (Ejemplo 9). De hecho, los experimentos descritos anteriormente pueden no haber identificado a todos los miembros de las familias de genes en cártamo. Para determinar qué miembros de las familias de genes FAD2 y FATB estaban implicados en la biosíntesis de ácido linoleico o de los ácidos grasos saturados encontrados en aceite de semilla de cártamo, particularmente ácido palmítico, y si FAD6 también estaba, se prepararon varias construcciones genéticas para expresar moléculas de ARNhp en semilla de cártamo, para silenciar varias combinaciones de los genes FAD2, FATB y FAD6. Cada una de estas construcciones se diseñó para expresarse específicamente en semillas de cártamo en desarrollo durante el período de la síntesis de aceites. Esto se hizo usando sea promotores extraños o promotores aislados de cártamo para expresar las construcciones, que se introdujeron en cártamo mediante la transformación de la planta.

Construcción de pCW600

Se diseñó un vector de expresión binario de plantas para la expresión de transgenes en semillas usando el promotor de un gen Oleosina 1 de Arabidopsis (anotación del gen del sitio web TAIR At4g25140) (SE ID NO: 52). El promotor aislado tenía una longitud de 1.192 pb empezando desde el nucleótido 12899298 en No. de Acceso NC003075.7, excepto que, en la secuencia de 1.198 pb, se omitieron 6 pb para evitar secuencias de digestión por restricción comunes para ayudar en las etapas de clonación posteriores. El promotor de AtOleosina ha sido usado previamente para la expresión fuerte, específica de semilla, de transgenes en cártamo y especies de Brassica (Nykiforuk et al., 1995; Vanrooijen y Moloney, 1995). Este promotor será probablemente un promotor bidireccional, que dirige la expresión fuerte específica de semilla de regiones codificadoras unidas a ambos extremos del fragmento del promotor. El promotor de oleosina de Arabidopsis comparte características con el promotor de oleosina de Brassica napus, caracterizado por tener una naturaleza bifuncional (Sadanandom et al., 1996). El promotor se sintetizó químicamente, se clonó en pGEMT-Easy y el fragmento EcoRI que contenía el promotor se hizo romo mediante la reacción de relleno de la enzima del fragmento de Klenow, y se ligó en el sitio HindIII romo de Klenow de pCW265 (Belide et al., 2011), generando pCW600 (AtOleosinP::vacío). Este vector tenía un gen marcador seleccionable que codificaba una higromicina fosfotransferasa (HPT), permitiendo así la selección para tolerancia a higromicina en cultivo de tejido durante el proceso de transformación. El vector también incluyó un gen 35S::GFP que permitió la selección de células o tejidos transformados por fluorescencia bajo iluminación de luz UV. Insertando el promotor AtOleosina, el vector se diseñó para la expresión de una región codificadora de interés que pudiera ser insertada en un sitio de clonación múltiple situado en aguas abajo del promotor y aguas arriba de una señal de poliadenilación nos (nos3'). Este vector sirvió como el vector del núcleo para las construcciones pCW602 y pCW603 descritas a continuación.

Construcción de pXZP410

Un promotor de linina de lino (US 7.642.346) (SEQ ID NO: 53) se insertó como un fragmento NotI-Xhol en el vector binario pT7-HELLSGATE12 (Wesley et al., 2001), generando el vector binario de silenciamiento Gateway pXZP410. El vector pXZP410 tenía un gen marcador seleccionable que confería resistencia a kanamicina durante el cultivo de tejido y que permitía la expresión específica en semilla de construcciones de ARN en horquilla bajo el control del promotor de linina. El vector tenía dos intrones, uno en la orientación con sentido y el otro en la dirección antisentido con respecto al promotor, y tenía los sitios de recombinación AttL1 y AttL2 flanqueando los intrones.

Para preparar una construcción de silenciamiento a partir de pXZP410, se insertaron dos copias de una secuencia del gen diana en el vector de entrada Gateway a ser silenciado en el vector, uno insertado en 5' y el otro en 3' de los dos intrones en orientación invertida uno respecto del otro para formar una repetición invertida. Los sitios de recombinación permitieron fácilmente la inserción de las dos copias usando los sistemas de clonación de recombinasa de Gateway (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.), como se ha descrito previamente (Wesley et al., 2001). Este vector pXZP410 se usó como un vector de núcleo para producir pCW631 y pCW632 como se describe a continuación.

Construcción de pCW571

Una secuencia de 300 pb (SEQ ID NO: 50) idéntica a una región del gen CtFATB-3 de cártamo correspondiente a los nucleótidos 485-784 del ADNc de CtFATB-3 se sintetizó químicamente y se insertó en pENTR/D topo (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante, generando un clon de entrada de Gateway designado pCW569. Un fragmento de 756 pb (SEQ ID NO: 49) del ADNc para CtFAD2-2, correspondiente a los nucleótidos 427-1182, se sintetizó y se amplificó por RT-PCR a partir de ARN aislado de semillas de cártamo en desarrollo. Los cebadores fueron D28-PstI-5 (5'-CCT GCAGGTACCAAT GGCT CGACGACACT G-3') (SEQ ID NO: 157) y D28-AscI-3 (5'-CGGCGCGCCTTCACCTCCTCATCTTTATCC-3') (SEQ ID NO: 158), respectivamente. Los cebadores incluyeron los sitios de las enzimas de restricción 5' PstI y 3' AscI, permitiendo así la inserción del fragmento amplificado en los sitios correspondientes de pCW569, generando pCW570. Este vector contenía las regiones fusionadas de los genes CtFATB y CtFAD2-2 como un fragmento de 1.080 pb flanqueado por sitios de recombinación, AttL1 y AttL2. Dos copias de este fragmento FATB-FAD2-2 se insertaron entonces en pXZP410, la segunda copia invertida con respecto a la primera, usando clonasa LR según las instrucciones del proveedor (Invitrogen, Carlsbad, e E. UU.). El plásmido resultante pCW571 tenía el promotor de linina de lino para transcribir la región de repetición invertida de manera específica de semilla, con el fin de producir un ARNhp para reducir la expresión de los genes CtFATB y CtFAD2-2 en semillas.

Construcción de pCW603

El fragmento de ADN procedente de pCW571 que contenía la repetición invertida de los fragmentos CtFATB-CtFAD2-2 con los dos intrones intervinientes se cortaron con Spel, se hicieron romos usando el fragmento Klenow I de ADN polimerasa y se ligaron en el sitio EcoRV de pCW600, generando pCW603. Esta construcción pCW603 fue capaz de expresar un ARNhp bajo el control del promotor AtOleosina en semillas de cártamo, para reducir la expresión de CtFATB y CtFAD2-2.

Construcción de pCW581

Un fragmento de 590 pb (SEQ ID NO: 51) de ADN preparado a partir de un fragmento de CtFAD6 de 290 pb, correspondiente a los nucleótidos 451 a 750 del ADNc para CtFAD6, y un fragmento de 300 pb de CtFATB, en cuanto a pCW571, se sintetizó químicamente y se insertó en pENTR/D topo, generando pCW579. Un fragmento de de 780 pb CtFAD2-2, como se ha descrito anteriormente para pCW570, se clonó en el sitio AscI de pCW579, generando pCW580. Esta construcción fue un vector clon de entrada que contenía las secuencias de los genes CtFATB, CtFAD6 y CtFAD2-2 unidos en ese orden como un fragmento de ADN de 1.370 pb con sitios de recombinación flanqueantes, AttLl y AttL2. Dos copias de este fragmento FATB-FAD6-FAD2-2 se insertaron entonces como una repetición invertida en pXZP410 usando clonasa LR, generando pCW581. Esta construcción pCW581 era un vector binario que tenía un promotor de linina de lino unido operativamente a la repetición invertida, que, después de transcripción en células de semilla de cártamo en desarrollo, fue capaz de expresar un ARNhp para reducir la expresión de los genes CtFATB, CtFAD6 y CtFAD2-2.

Construcción de pCW602

El fragmento de ADN que contenía la repetición invertida de las regiones unidas de CtFATB-CtFAD6-CtFAD2-2, con los dos intrones intervinientes, se cortó enzimáticamente de pCW571 con Notl, se hizo romo usando el fragmento de Klenow I y después de ligó en el sitio EcoRV de pCW600, generando pCW602. pCW602 tenía las secuencias de CtFATB-CtFAD6-CtFAD2-2 bajo el control del promotor de AtOleosina, en contraste con pCW581 que tenía el mismo diseño y fragmentos génicos, excepto con el promotor de linina.

Construcción de pCW631 y pCW632

Aunque el promotor de linina fue útil para expresar ARNhp en semillas, tanto pCW571 como pCW581 tenían el marcador seleccionable que confería tolerancia a kanamicina. En experimentos de transformación de cártamo preliminares, se observó que los explantes no fueron lo suficientemente susceptibles a kanamicina. Por lo tanto, el casete de resistencia a kanamicina de pCW571 y pCW581 se reemplazó por un casete de resistencia a higromicina como el gen marcador seleccionable. El gen de resistencia a higromicina compuesto por el promotor enCUP:higromicina:región de poliadenilación nos3' se cotó de pCW265 con digestión de restricción Spel-Avrll y se usó para remplazar el casete de resistencia a kanamicina en pCW571 y pCW581, generando así pCW631 y 632, respectivamente.

En resumen, las construcciones usadas en este primer conjunto de transformaciones de cártamo contenían los siguientes elementos principales:

Vector Promotor Fragmentos génicos en la repetición invertida

pCW631 linina CtFAD2-2 y CtFATB

pCW632 linina CtFAD2-2, CtFAD6 y CtFATB

pCW602 AtOleosina CtFAD2-2, CtFAD6 y CtFATB

pCW603 AtOleosina CtFAD2-2 y CtFATB

Estas construcciones se introdujeron en la cepa AGL1 de Agrobacterium y se usaron para transformar cártamo como se ha descrito en el Ejemplo 1, con los resultados que siguen.

Ejemplo 11. Transformación de cártamo con construcciones silenciadoras de genes

Las construcciones genéticas se usaron para transformar cotiledones e hipocótilos escindidos de la variedad S317 de cártamo, usando el método mediado por Agrobacterium con rescate de los brotes regenerados usando injertos (Belide et al. 2011). Más de 30 brotes transformados independientes que crecieron sobre reservas de raíces no transformadas (en lo sucesivo denominadas plantas T0) se regeneraron por el vector pCW603 y se crecieron hasta la madurez como se describe en el Ejemplo 1. La integración de los T-ADN en los vástagos de cártamo T0 se verificó por PCR usando cebadores específicos del vector T-ADN como se han descrito Belide et al. (2011). La mayoría de las plantas que se encontró que carecían del T-ADN usado en la transformación particular, que se presumió que eran "escapes" de la selección de higromicina durante la regeneración en cultivo de tejido, fueron descartadas. Sin embargo, algunas fueron mantenidas como plantas "nulas" o controles negativos para comparación con las plantas transformadas. Estas plantas control se trataron bajo las mismas condiciones que el material transformado en cultivo de tejido, injerto y condiciones de invernadero.

Ejemplo 12. Análisis de la composición de ácidos grasos de aceite de semillas de cártamo transgénico

Se realizaron los análisis de ácidos grasos sobre semillas T1 individuales obtenidas de las plantas de cártamo transformadas, como sigue. Se crecieron 30 plantas T0 independientes transformadas con pCW603 en el fondo genético de S317 en el invernadero y se autofertilizaron para producir semillas. Se analizaron hasta 10 semillas maduras procedentes de una única cabeza de semilla individual de cada planta T0 para determinar la composición de lípidos usando análisis por GC como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados del análisis de la composición de ácidos grasos de las semillas de cártamo S317 transformadas con pCW603 se resumen en la Tabla 13. Como se esperaba que cada planta de cártamo T0 transformada fuera heterocigota para el T-ADN y, por lo tanto, produjera una población segregadora de semillas T1, se esperaba que el análisis de 5-10 semillas de cada planta incluyera algunas semillas nulas (segregantes). Dichas semillas segregantes nulas eran buenos controles negativos en este experimento ya que habían crecido y desarrollado en la misma cabeza de semilla que las semillas transformadas procedentes de la misma planta. Como se puede observar a partir de los datos de la Tabla 13, se observaron niveles de ácido oleico superiores al 87 % (como % en peso del contenido total de ácidos grasos) en 6 líneas independientes (Líneas 9, 12, 14, 20, 34 y 36) de las 30 líneas generadas. Muchas de las semillas transformadas tuvieron contenidos de ácido oleico en el rango del 87-91,7 %, con niveles de ácido linoleico del 2,15 al 5,9 % y niveles de ácido palmítico del 2,32-3,45 %. Los niveles de otros ácidos grasos en las semillas no fueron significativamente diferentes respecto a los controles no transformados. El contenido máximo de ácido oleico observado en la semilla de cártamo T1 transformada con pCW603 fue el 91,7 %, en comparación con aproximadamente el 77 % en las semillas control S317 no transformadas y las semillas segregantes nulas. Notablemente, los lípidos de las semillas también se redujeron significativamente en los niveles de 16:0, disminuyendo desde el 4,5 % hasta tan bajo como el 2,3 %. Los perfiles de ácidos grasos de las fracciones TAG de los aceites de las semillas que se purificaron sobre placas de TLC, no fueron significativamente diferentes a las del lípido total extraído de las semillas.

Se calcularon dos parámetros de medición tomando como base la composición de ácidos grasos totales de las semillas de cártamo, representando los ácidos grasos más importantes en el aceite de la semilla. Estos fueron la proporción de desaturación de ácido oleico (ODP) y la proporción de palmítico+linoleico a oleico (PLO). Estos se calcularon para cada semilla y los datos se muestran en la Tabla 13. Las semillas de tipo salvaje (S317, no transformadas) y los segregantes nulos tuvieron una relación de ODP de aproximadamente 0,1500 y un valor de PLO de aproximadamente 0,2830. Las semillas transformadas con T-ADN de pCW603 exhibieron reducciones significativas en los valores de ODP y PLO. 13 semillas generadas a partir de 6 eventos independientes tuvieron un valor de PLO de menos de 0,1 y una ODP de menos de 0,06. Una línea transformada tuvo una ODP de 0,0229 y una PLO de 0,0514.

Las semillas individuales de individuos maduros de una línea de élite, S317 transformada con pCW603, línea 9, y la S317 parental no transformada se sometieron a análisis lipidómico por LC-MS. Estos análisis mostraron claramente que el aceite de las semillas transformadas con la construcción de ARNi en horquilla de AtOleosinp:CtFATB-CtFAD2-2 tenía composiciones de TAG y DAG alteradas dramáticamente (Figuras 11 y 12). Hubo un claro incremento en el nivel de TAG(54:3) y una disminución de TAG(54:5), que fueron predominantemente 18:1/18:1/18:1-TAG (trioleína) y 18:1/18:2/18:2-TAG, respectivamente. Entre las semillas analizadas por LC-MS, el contenido de trioleína (=54:3) en TAG fue tanto como el 64,6 % (% en moles) al nivel más alto ácido oleico (>90 %, Tabla 14) para semillas procedentes de la línea de silenciamiento de ARNi, en comparación con el parental no transformado (S-317) que tenía niveles de trioleína que variaban entre el 47 % y el 53 %. El segundo TAG que contenía oleato más abundante fue 18:0/18:1/18:1, seguido por 18:1/18:1/18:2. La diferencia más clara entre estos aceites de cártamo también pudo observarse en la clase de lípidos DAG. El nivel de DAG(36:1) se duplicó en el aceite de semilla procedente de la semilla transformada en comparación con la semilla parental, mientras que Da G(36:4) se redujo hasta el 10 %. DAG(36.1) es predominantemente 18:0/18:1-DAG y DAG(36:4) es 18:2/18:2-DAG (di-linoleato). Los DAG en los lípidos de la semilla fueron solamente un componente menor, ya que los niveles de TAG totales fueron aproximadamente 100 veces más altos que los DAG totales (Tabla 15).

Crecimiento y morfología de las plantas transgénicas

Los transformantes de cártamo T0 que contenían el T-ADN de pCW603 generaron semillas T1 que segregaron para el T-ADN rindiendo un conjunto de segregantes homocigotos, hemicigotos y nulos. La relación de estas subpoblaciones dependió del número y ligamiento de eventos de inserción de T-ADN en las plantas T0, como se esperaba según la genética Mendeliana. Por lo tanto, se analizaron individualmente las semillas T1 procedentes de cada planta T0. El análisis de los perfiles de lípidos procedentes de semillas individuales mostró claramente que una única cabeza de semilla individual contenía tanto eventos nulos como transgénicos.

Tabla 13. Composición de ácidos grasos de lípidos de semillas de cártamo T1 individuales transformadas con el T-ADN de pCW603 en el fondo de S-317. El nivel de cada ácido graso (%) se expresó como un porcentaje del contenido total de ácidos grasos.

Tabla 14. Composición de ácidos grasos en lípido total de semilla individual (% de ácidos grasos totales).

Muestra C16:0 C18:0 C18:1 C18:1d11 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 S317 Semilla 1 5,21 2,35 77,36 0,88 14,20 0,00 0,00 0,00 S317 Semilla 2 5,08 3,04 77,20 0,80 13,88 0,00 0,00 0,00 S317 Semilla 3 5,00 2,65 78,89 0,78 12,67 0,00 0,00 0,00 TS603.9 Semilla 1 3,76 3,07 87,93 0,91 4,34 0,00 0,00 0,00 TS603.9 Semilla 2 3,33 2,98 89,97 0,93 2,80 0,00 0,00 0,00 TS603.9 Semilla 4 3,61 4,28 88,20 0,87 3,05 0,00 0,00 0,00 TS603.9 Semilla 5 3,61 3,13 88,45 0,92 3,38 0,00 0,50 0,00 TS603.9 Semilla 6 4,45 3,04 85,50 0,90 5,62 0,00 0,51 0,00

Tabla 15. Cantidades relativas de TAG y DAG

Muestra Proporción de TAG/DAG

S317 Semilla 1 60,4

S317 Semilla 2 84,7

S317 Semilla 3 71,2

TS603.9 Semilla 1 117,5

TS603.9 Semilla 2 124,2

TS603.9 Semilla 4 97,8

TS603.9 Semilla 5 96,5

TS603.9 Semilla 6 95,9

Las semillas procedentes de algunas de las líneas transgénicas se crecieron bajo condiciones controladas (temperatura, suelo, riego y fertilización óptimos, pero bajo iluminación natural) en el invernadero para observar la morfología y velocidad de crecimiento de la planta. No se observaron diferencias fenotípicas entre las plantas Ti transformadas y sus hermanos segregantes nulos. Las semillas transformadas germinaron a la misma velocidad que las semillas no transformadas y produjeron plántulas que tenían la misma velocidad de crecimiento de plántulas tempranas (vigor). Todas las semillas sembradas se establecieron y crecieron en plantas totalmente fértiles. Se preparó el ADN de las puntas de hojas verdaderas de plantas individuales de la generación Ti y se realizó un análisis por PCR para determinar la relación de plantas transgénicas y nulas. Como se esperaba, se identificaron los segregantes nulos.

Este análisis fenotípico indicó que las plantas de cártamo transformadas con el T-ADN de pCW603 y que expresaban los transgenes no sufrieron efectos perjudiciales en comparación con los segregantes nulos.

Las semillas de cártamo de la generación T2 se ensayaron para determinar la composición del aceite. Las semillas de varias plantas que tenían altos niveles de ácido oleico (Tabla 13) se crecieron en plantas maduras que produjeron semillas de segunda generación (semillas T2). Estas semillas se recogieron cuando maduraron y se analizaron para determinar la composición de ácidos grasos de su aceite. Los datos se proporcionan en la Tabla 16. Aunque la semilla T i presentó hasta aproximadamente un 92 % de ácido oleico, la semilla T2 alcanzó el 94,6 % de ácido oleico. El incremento observado en la generación T2 en relación a la generación T1 puede haberse debido a la homocigosidad del transgén, o simplemente al gran número de líneas analizadas.

Se usó el análisis de hibridación por transferencia Southern para determinar el número de inserciones de T-ADN en cada línea transformada, y se seleccionaron las líneas con una única inserción de T-ADN. El contenido de aceite de las semillas T2 no es significativamente diferente al de las semillas no transformadas control del mismo fondo genético y crecidas bajo las mismas condiciones.

Análisis de semillas de cártamo transformadas con el T-ADN de pCW631

La semilla T i de la variedad S-317 de cártamo transformada con pCW631 se analizó de manera similar para determinar su composición de ácidos grasos. La Tabla 17 muestra los datos y los parámetros de medición de PLO y ODP para estas semillas. El contenido de ácido oleico en el lípido de estas semillas era de hasta el 94,19 %. El contenido de ácido palmítico de la semilla TS631-01 T1 (21) que tenía el nivel más alto de ácido oleico fue el 2,43 %, la ODP fue 0,0203 y la PLO fue 0,0423. Estos análisis demostraron que la construcción de ARN en horquilla en pCW631 produjo generalmente niveles de ácido oleico más altos que la construcción en pCW603 cuando se transformó cártamo del en un fondo genético S-317. Esta observación indicó que el promotor de linina usado en pCW631 expresó al ARN en horquilla más fuertemente o con un mejor esquema de tiempo de expresión, o una combinación de ambos, en relación con el promotor de AtOleosina usado en pCW603.

Las semillas T2 de la variedad S-317 de cártamo transformada con el T-ADN procedente de pCW631 se analizaron por GC. Se observaron niveles de ácido oleico de hasta el 94,95 % con una ODP de 0,01 y PLO de 0,035.

Las semillas y plantas de cártamo transformadas con los T-ADN procedentes de las construcciones pCW632 y pCW602 se analizan de la misma manera que para la semilla y plantas transformadas con pCW603 y pCW631. El análisis por GC de la semilla T1 de la variedad S-317 de cártamo transformada con pCW632 mostró un nivel de ácido oleico de hasta el 94,88 %, con ODP de 0,0102 y PLO de 0,0362. Sus semillas T2 mostraron hasta el 93,14 % de ácido oleico, con ODP de 0,0164 y PLO de 0,0452.

Extracción de volúmenes más grandes de aceite de semilla de cártamo

Se cosecharon semillas T4 procedentes de la línea transgénica homocigota designada TS603-22.6, y se extrajo el aceite total de la semilla usando el aparato Soxhlet como se describe en el Ejemplo 1. Se analizaron partes alícuotas del aceite extraído por GC (Tabla 18). Se recuperó un total de 643 gramos de aceite. Las extracciones de 2, 3, 5, y 6 se combinaron, mientras que las extracciones 4, 7 y 8 se combinaron en un lote separado. Las mezclas se analizaron adicionalmente para determinar la composición de ácidos grasos por GC. Los datos se muestran en la Tabla 18.

Ejemplo 13. Diseño y preparación de construcciones adicionales de silenciamiento génico

Tomando como base los resultados descritos en los Ejemplos 10-12, se prepararon otras construcciones de silenciamiento génico como sigue, para incrementar el contenido de ácido oleico del aceite de semilla de cártamo y disminuir las relaciones de ODP o PLO. Estas construcciones de silenciamiento génico incluyeron combinar promotores diferentes, procedentes de fuentes diferentes a cártamo, así como también procedentes de cártamo, para lograr la máxima reducción en la expresión de los genes de cártamo FAD2-2, FATB-3 y FAD6, y adicionalmente silenciar más de un gen FAD2 además del FAD2-2. Estas construcciones se usan para transformar variedades de cártamo que tienen versiones inactivadas del gen CtFAD2-1 endógeno, tal como S-317, Ciano-OL y Lesaff496.

Construcción de pCW700

Este vector de expresión binario de plantas tiene dos promotores extraños (no de cártamo) con diferentes patrones de expresión, pero superpuestos, en la semilla de cártamo, en vez de un promotor, para producir ARN en horquilla para reducir la expresión de los CtFATB y CtFAD2-2 endógenos. Los dos promotores son el promotor AtOleosina y el promotor de linina de lino y los dos casetes de expresión de ARNhp son de la misma molécula de T-ADN. Este vector se construye por digestión de restricción del casete de expresión génica de ARNhp procedente de pCW631, que tiene el promotor de linina y la región codificadora de ARNhp para silenciar CtFAD2-2 y CtFATB, e insertándolo en el T-ADN de pCW603, generando así una construcción que codifica un ARN en horquilla frente a estos dos genes de cártamo. Esta construcción se usa para transformar variedades de cártamo tales como Lesaff496, Ciano-OL y S-317.

Tabla 16. Composición de ácidos grasos de lípidos de semillas T2 de cártamo individuales transformadas con el T-ADN de pCW603 en el fondo S-317. El nivel de cada ácido graso (%) se expresó como un porcentaje del contenido total de ácidos grasos.

Muestra C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO

TS603-22.3 T2(4) 2,4 0,9 94.6 1.7 0,0 0,2 0,0 0,0181 0,043956

TS603-22.6(5) 2,5 1.0 94.5 2,0 0,0 0,0 0,0 0,0214 0,048069

TS603-22.6(2) 2,1 0,9 94.4 2,5 0,0 0,0 0,0 0,0266 0,04934

TS603-22.6(4) 2,4 1.0 94.3 2,3 0,0 0,0 0,0 0,0239 0,049028

TS603-22.4 T2(2) 2,2 1.5 94.3 1.8 0,0 0,0 0,1 0,0200 0,042739

TS603-22.6 T2(20) 2,2 1.1 94.2 2,4 0,0 0,0 0,0 0,0256 0,048622

TS603-22.05(4) T2 2,2 1.4 94.2 2,0 0,0 0,1 0,0 0,0212 0,044211

TS603-22.8 T2 (1) 2,1 1.1 93.9 2,5 0,2 0,1 0,0 0,0263 0,04839

TS603-22.6 T2 (10) 2,8 1.0 93.9 2,1 0,0 0,0 0,0 0,0223 0,052359

TS603-22.6 T2 (6) 2,9 1.1 93.9 2,0 0,0 0,0 0,0 0,0214 0,052318

TS603-22.05(1) T2 2,2 1.3 93.8 2,2 0,1 0,2 0,0 0,0240 0,04783

TS603-22.6 T2 (13) 2,9 1.2 93.8 1.7 0,0 0,2 0,0 0,0185 0,049564

TS603-22,6 T2 (16) 2,9 0,9 93,8 2,3 0,0 0,0 0,0 0,0249 0,055517

TS603-22.4 T2 (1) 2,5 1,5 93,7 1,9 0,1 0,1 0,0 0,0204 0,046933

TS603-22.6(1) 2,7 1,2 93,7 2,3 0,0 0,0 0,0 0,0241 0,052497

TS603-22.3 T2 (5) 2,5 1,1 93,6 2,6 0,0 0,0 0,0 0,0278 0,05449

TS603-08.2(4) 2,2 0,8 93,6 3,3 0,0 0,0 0,0 0,0355 0,05861

TS603-22.6 T2 (9) 2,9 1,2 93,5 2,2 0,0 0,2 0,0 0,0235 0,054815

TS603-22.6 T2 (19) 2,9 1,1 93,5 2,3 0,0 0,0 0,0 0,0245 0,055483

TS603-22.4 T2 (3) 2,4 1,0 93,5 2,8 0,1 0,0 0,0 0,0299 0,056044

TS603-22.1 T2 (2) 2,7 0,9 93,5 2,9 0,0 0,0 0,0 0,0306 0,059281

TS603-22.6 T2 (14) 3,1 1,5 93,4 2,1 0,0 0,0 0,0 0,0222 0,054943 Muestra C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO TS603-08.2(3) 2,7 0,9 93,4 2,9 0,0 0,0 0,0 0,0306 0,059851 TS603-22.05(5) T2 2,3 1,6 93,4 2,5 0,2 0,0 0,0 0,0267 0,051234 TS603-22.6 T2 (15) 3,0 1,2 93,3 2,4 0,0 0,0 0,0 0,0261 0,057723 TS603-22.5 T2 (11) 2,2 1,2 93,3 2,3 0,0 0,3 0,4 0,0285 0,048123 TS603-22.6 T2 (8) 2,9 1,2 93,3 2,5 0,0 0,0 0,0 0,0265 0,057514 TS603-22.5 T2 (12) 2,2 1,3 93,3 2,3 0,0 0,3 0,4 0,0289 0,047835 TS603-22.6 T2 (7) 3,1 1,3 93,2 2,5 0,0 0,0 0,0 0,0265 0,059228 TS603-22.4 T2 (8) 2,1 1,8 93,2 2,0 0,0 0,3 0,3 0,0254 0,044186 TS603-22.6 T2 (11) 2,9 1,2 93,1 2,5 0,0 0,1 0,0 0,0271 0,057755 TS603-22.3 T2 (1) 2,5 1,2 93,1 3,1 0,0 0,0 0,0 0,0335 0,060295 TS603-22.5 T2 (14) 2,1 1,3 93,1 2,6 0,0 0,2 0,4 0,0318 0,050656 TS603-22.5 T2 (16) 2,3 1,5 93,0 2,3 0,0 0,3 0,3 0,0283 0,049621 TS603-22.5 T2 (18) 2,3 1,0 93,0 2,8 0,0 0,2 0,4 0,0341 0,05407 TS603-22.5 T2 (15) 2,0 0,9 92,9 3,0 0,0 0,3 0,5 0,0381 0,054149 TS603-22.6 T2 (12) 3,0 1,2 92,9 2,7 0,0 0,0 0,0 0,0294 0,061518 TS603-22.05(3) T2 2,5 1,0 92,9 3,3 0,1 0,2 0,0 0,0350 0,061372 TS603-22.6 T2 (18) 2,9 0,8 92,9 3,2 0,0 0,0 0,0 0,0349 0,06593 TS603-22.6(3) 2,7 0,7 92,9 3,6 0,0 0,0 0,0 0,0383 0,067112 TS603-22.8 T2 (4) 2,6 1,2 92,9 3,3 0,0 0,0 0,0 0,0358 0,063416 TS603-22.6 T2 (17) 2,7 0,8 92,9 3,5 0,0 0,0 0,0 0,0375 0,067028 TS603-22.1 T2 (1) 2,7 1,1 92,8 3,1 0,2 0,0 0,0 0,0334 0,062312 TS603-22.4 T2 (11) 2,2 1,4 92,6 2,7 0,0 0,3 0,4 0,0340 0,053189 TS603-22.4 T2 (12) 2,1 1,4 92,6 2,9 0,0 0,3 0,4 0,0355 0,054077 TS603-22.1 T2 (4) 2,4 0,9 92,6 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0434 0,069653 TS603-44(2) T1 2,7 1,1 92,5 3,3 0,0 0,2 0,0 0,0358 0,065506 TS603-22.8 T2 (5) 2,9 1,1 92,4 3,5 0,0 0,0 0,0 0,0381 0,069194 TS603-22.5 T2 (6) 2,1 2,0 92,4 2,4 0,0 0,3 0,4 0,0305 0,049301 TS603-22.4 T2 (5) 2,8 1,7 92,4 2,9 0,0 0,0 0,0 0,0318 0,062593 TS603-22.4 T2 (13) 2,3 1,1 92,3 3,3 0,0 0,2 0,4 0,0406 0,060311 TS603-22.3 T2 (3) 2,7 1,4 92,3 3,4 0,1 0,1 0,0 0,0368 0,065979 TS603-34.3 T2 (1) 2,6 1,1 92,3 3,9 0,0 0,1 0,0 0,0421 0,070162 TS603-34.3 T2 (13) 2,4 1,7 92,2 2,7 0,0 0,3 0,3 0,0332 0,055508 Muestra C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO TS603-22.5 T2 (10) 2,4 1,6 92,1 3,0 0,0 0,3 0,3 0,0366 0,058947 TS603-19.02(3) T2 2,5 2,0 92,1 3,2 0,0 0,1 0,0 0,0345 0,061861 TS603-08.2(1) 2,6 1,0 92,1 4,1 0,0 0,0 0,0 0,0444 0,073162 TS603-22.1 T2 (3) 2,5 1,1 92,1 4,0 0,1 0,2 0,0 0,0435 0,070895 TS603-22.5 T2 (8) 2,2 1,6 92,1 3,1 0,0 0,3 0,4 0,0381 0,058128 TS603-19.2 T2 (11) 2,4 0,9 91,9 3,9 0,0 0,2 0,4 0,0463 0,067902 TS603-44(1) T1 3,0 0,9 91,9 4,0 0,0 0,1 0,0 0,0439 0,076059 TS603-19.02(1) T2 2,4 1,8 91,7 3,4 0,2 0,2 0,1 0,0384 0,063629 TS603-22.3 T2 (2) 3,0 1,1 91,7 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0434 0,076459 TS603-22.5 T2 (7) 2,3 1,7 91,7 3,2 0,0 0,3 0,4 0,0392 0,060643 TS603-22.4 T2 (9) 2,3 1,3 91,7 3,6 0,0 0,3 0,5 0,0442 0,064255 TS603-22.5 T2 (9) 2,4 1,6 91,6 3,4 0,0 0,3 0,4 0,0414 0,063679 TS603-22.4 T2 (7) 2,4 1,3 91,5 3,9 0,0 0,3 0,4 0,0462 0,068489 TS603-22.4 T2 (10) 2,4 1,4 91,5 3,7 0,0 0,3 0,5 0,0453 0,066056 TS603-34.3 T2 (2) 2,7 1,6 91,4 3,9 0,0 0,1 0,1 0,0442 0,072984 TS603-22.4 T2 (4) 2,7 1,3 91,4 4,2 0,1 0,1 0,0 0,0461 0,076004 TS603-19.02(5) T2 2,4 1,9 91,4 4,1 0,1 0,2 0,0 0,0445 0,070234 TS603-10.02(2) T2 2,7 1,5 91,2 4,4 0,1 0,1 0,0 0,0480 0,077276 TS603-22.5 T2 (13) 2,4 1,5 91,2 4,1 0,0 0,2 0,4 0,0489 0,071172 TS603-19.02(4) 2,6 1,8 91,1 4,3 0,2 0,1 0,0 0,0471 0,075467 TS603-22.4 T2 (6) 2,4 1,6 91,0 4,1 0,0 0,3 0,4 0,0488 0,07045 TS603-34.4 T2 (2) 2,7 1,7 90,8 4,4 0,1 0,1 0,0 0,0487 0,078563 TS603-27.5 T2 (1) 2,7 1,3 90,7 4,3 0,0 0,3 0,3 0,0511 0,076932 TS603-19.02(2) T2 2,7 1,7 90,6 4,8 0,0 0,2 0,0 0,0532 0,083056 TS603-22.5 T2 (17) 2,7 1,7 90,5 4,0 0,0 0,4 0,4 0,0480 0,074387 TS603-08.2(5) 3,0 1,1 90,5 5,3 0,0 0,0 0,0 0,0583 0,091395 TS603-19.2 T2 (17) 2,6 1,8 90,5 4,2 0,0 0,3 0,3 0,0504 0,074894 TS603-19.2 T2 (10) 2,5 2,2 90,4 3,9 0,0 0,4 0,3 0,0464 0,070963 TS603-34.3 T2 (3) 2,8 1,5 90,2 5,2 0,1 0,1 0,0 0,0575 0,088097 TS603-19.2 T2 (19) 2,5 2,3 90,2 4,0 0,0 0,3 0,3 0,0481 0,073009 TS603-09.8 T2 (1) 2,8 1,3 90,0 5,0 0,0 0,3 0,3 0,0589 0,086178 S317 (1) 5,57 2,93 78,10 11,96 0,00 0,51 0,00 0,1531 0,224455 Muestra C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 ODP PLO

S317 (2) 4,77 2,10 78,07 13,82 0,00 0,38 0,00 0,1770 0,23815

S317 (3) 4,55 1,51 77,90 14,28 0,00 0,33 0,25 0,1865 0,241763

S317 (4) 4,61 1,65 78,52 13,58 0,00 0,35 0,28 0,1764 0,231634

Tabla 17. Análisis de la composición de ácidos grasos de semillas de cártamo T2 individuales transformadas con el T-ADN de pCW631 en el fondo S-317. El nivel de cada ácido graso (%) se expresó como un porcentaje del contenido total de ácidos grasos.

No. ID Muestra C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C20:0 C20:1 C22:0 ODP PLO FAME

916 TS631-01 T1 (21) 2,43 0,13 1,06 94,19 1,56 0,24 0,39 0,27 0,0203 0,0423

912 TS631-01 T1 (17) 2,37 0,10 1,17 93,73 1,87 0,23 0,34 0,19 0,0230 0,0452

913 TS631-01 T1 (18) 2,57 0,11 0,97 93,27 2,56 0,22 0,38 0,19 0,0305 0,0550

897 TS631-01 T1 (16) 2,50 0,10 1,04 93,24 2,35 0,21 0,37 0,18 0,0247 0,0521

910 TS631-03 T1 (1) 2,42 0,11 1,60 93,00 2,01 0,30 0,34 0,23 0,0250 0,0476

921 TS631-04 T1 (1) 2,49 0,11 1,31 92,93 2,34 0,27 0,34 0,20 0,0275 0,0521

895 TS631-01 T1 (14) 2,54 0,11 1,07 92,82 2,56 0,25 0,37 0,20 0,0316 0,0549

917 TS631-01 T1 (22) 2,66 0,17 1,16 92,75 2,68 0,28 0,42 0,30 0,0334 0,0576

918 TS631-03 T1 (2) 2,36 0,11 2,02 92,64 1,92 0,36 0,32 0,25 0,0242 0,0463

914 TS631-01 T1 (19) 2,68 0,12 1,23 92,30 2,84 0,28 0,34 0,21 0,0345 0,0598

898 TS631-02 T1 (1) 2,99 0,12 1,21 90,79 4,06 0,26 0,32 0,26 0,0483 0,0777

915 TS631-01 T1 (20) 3,74 0,00 1,07 90,67 4,14 0,00 0,00 0,38 0,0456 0,0869

919 TS631-03 T1 (3) 4,23 0,10 1,50 81,70 11,92 0,30 0,29 0,27 0,1494 0,1976

899 TS631-02 T1 (2) 4,54 0,08 1,61 80,87 12,07 0,31 0,26 0,25 0,1525 0,2054

900 TS631-02 T1 (3) 4,47 0,08 2,07 80,64 11,90 0,37 0,24 0,23 0,1506 0,2030

901 TS631-02 T1 (4) 4,60 0,09 1,83 80,24 12,51 0,29 0,22 0,22 0,1586 0,2132

906 TS631-02 T1 (9) 4,44 0,09 1,74 80,20 12,76 0,31 0,23 0,24 0,1619 0,2144

903 TS631-02 T1 (6) 4,47 0,10 1,60 79,99 13,06 0,30 0,25 0,24 0,1664 0,2191

907 TS631-02 T1 (10) 4,39 0,09 1,82 79,90 12,98 0,33 0,24 0,24 0,1655 0,2174

909 TS631-02 T1 (12) 4,31 0,09 1,52 79,87 13,48 0,27 0,26 0,19 0,1720 0,2227

905 TS631-02 T1 (8) 4,46 0,09 1,57 79,58 13,47 0,30 0,30 0,23 0,1730 0,2254

902 TS631-02 T1 (5) 4,72 0,08 1,45 79,05 13,87 0,32 0,27 0,24 0,1789 0,2351 Tabla 18. Extracción Soxhlet de aceite y perfil de ácidos grasos del aceite.

Construcción de pCW701-pCW710

Los promotores derivados de cártamo, que se esperaba que tuvieran una actividad óptima en semillas de cártamo, se aíslan usando tecnologías de secuenciación de ADN que proporcionan información precisa de la secuencia para las regiones del ADN aguas arriba y aguas abajo de un gen expresado. Los resultados previos, como se describe en los Ejemplos 2 a 6, han mostrado que el gen CtFAD2-1 está altamente expresado durante el desarrollo de la semilla en cártamo. Por lo tanto, la región promotora de este gen es un excelente candidato para dirigir la expresión eficiente del transgén en semillas de cártamo. Como se muestra en el Ejemplo 6, CtFAD2-2 fue activo en fondos genéticos donde CtFAD2-1 estaba inactivado por mutación. Por lo tanto, el promotor de CtFAD2-2 se usa en cártamo para dirigir la expresión de ARN en horquilla que están dirigidos a la actividad de CtFAD2-2, entre otros genes. Otros elementos promotores útiles para la expresión de transgenes en semillas de cártamo incluyen elementos promotores endógenos (es decir, de cártamo) en las partes en 5' de genes para Oleosina (CtOleosina) y proteínas de almacenamiento de semillas, tales como las proteínas 2S y 11S (Ct2S y Ct11S). Los elementos promotores de CtFAD2-1, CtOleosina, Ct2S y Ct11S se aíslan usando técnicas estándar basadas en PCR, basadas en secuencias del genoma de cártamo, y se incorporan en vectores de expresión binaria de plantas. Estos elementos promotores se usan para expresar moléculas silenciadoras de ARNhp en las construcciones pCW701-pCW710 o conjuntamente con otros promotores no de cártamo que expresan los mismos genes de ARNhp o diferentes tal como en pCW602, pCW603, pCW631 o pCW632. También se producen combinaciones de los genes de ARNhp con diferentes promotores mediante el cruce de plantas transformadas con los genes individuales, típicamente donde los genes de ARNhp no están ligados.

Para aislar el promotor de CtFAD2-1, se aísla un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 3.000 pb aguas arriba del codón ATG de inicio de la traducción de CtFAD2-1 usando técnicas basadas en PCR y se usa para remplazar el promotor AtOleosina de pCW603 y pCW602, generando así las construcciones pCW701 y pCW702, respectivamente.

Para aislar el promotor de CtFAD2-2, se aísla un fragmento de ADN genómico de 3.000 pb aguas arriba del codón ATG de inicio de la traducción de CtFAD2-2 usando técnicas basadas en PCR y se usa para remplazar el promotor AtOleosina de pCW603 y pCW602, generando así las construcciones pCW703 y pCW704, respectivamente.

Para aislar el promotor de CtOleosina-1, se aísla un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 1.500 pares de base aguas arriba del codón ATG de inicio de la traducción de CtOleosina usando técnicas basadas en PCR y se usa para remplazar el promotor de AtOleosina de pCW603 y pCW602, generando así las construcciones pCW705 y pCW706, respectivamente.

Para aislar el promotor de Ct2S, se aísla un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 1.500 pares de bases aguas arriba del codón ATG de inicio de la traducción de Ct2S y se usa para remplazar el promotor de AtOleosina de pCW603 y pCW602, generando así los vectores pCW707 y pCW708, respectivamente.

Para aislar el promotor de Ct11S, se aísla un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 1.500 pares de bases aguas arriba del codón ATG de inicio de la traducción de Ct11S del ADN genómico de cártamo usando técnicas basadas en PCR y se usa para remplazar el promotor de AtOleosina de pCW603 y pCW602, generando así los vectores pCW709 y pCW710, respectivamente.

Cada uno de estos vectores se transforma en variedades de cártamo como se describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 14. Rendimiento en campo de variedades de cártamo

Una serie de accesos y variedades no transformadas de cártamo se creció en el verano de 2011-2012 en una estación de campo localizada en Narrabri, New South Wales. Las semillas se sembraron en parcelas del campo de 5 m x 3 m en suelo de arcilla pesada encontrado comúnmente en la región de Narrabri. Las plantas fueron expuestas a lluvia y luz natural excepto que se irrigaron una vez después de 4 semanas de crecimiento. La semilla madura se recogió y se analizaron muestras de aproximadamente 50 semillas para determinar el contenido de lípidos y la composición de ácidos grasos en el aceite de las semillas. El contenido de ácido oleico en el aceite de las semillas de las diversas variedades y accesos se expone en la Tabla 19 y en la Figura 13.

Los datos del ensayo de campo indicaron que hubo un rango de contenidos de ácido oleico de la semilla de cártamo, sorprendente en la medida del rango observado. Más notablemente, varios accesos descritos como "contenido alto de oleico" y reportados previamente por proporcionar aceite de semilla con al menos un 70 % de ácido oleico, tales como Ciano-OL, solamente produjeron aproximadamente un 42-46 % de ácido oleico. Los niveles de ácido linoleico fueron mucho más altos que lo esperado tomando como base reportes previos. En contraste, otros accesos que se reportó que proporcionaban contenidos altos de oleico realmente produjeron altos niveles de ácido oleico (60 %-76 %) en aceites de semilla bajo condiciones de campo, tales como los accesos PI-5601698 y PI-560169. La razón para los niveles de ácido oleico considerablemente más bajos a los esperados en algunos accesos, se cree que está relacionada con la presencia de alelos de CtFAD2-1 diferentes del alelo ol, tal como, por ejemplo, el alelo ol 1, que es sensible a la temperatura, y a las condiciones de crecimiento que fueron menos que las ideales en la estación de 2011-12. Se llevará a cabo un análisis adicional de ácidos grasos en la semilla obtenida del cártamo cultivado en campo para confirmar la variación observada en el contenido de ácido oleico de algunos accesos.

Tabla 19. Composición de ácidos grasos de lípidos de variedades de cártamo cultivadas en el campo.

ID C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1

PI 613463 5,3 < 0,1 5,5 9,1 78,8 0,1 0,6 0,2

PI 537677 6,3 0,2 2,3 10,3 79,9 0,1 0,3 0,2

PI 537645 7,8 0,2 2,2 10,5 78,0 0,1 0,4 0,2

PI 572433 6,4 0,1 2,5 10,7 78,7 0,2 0,4 0,2

PI 572472 6,3 0,2 2,4 11,1 78,7 0,2 0,4 0,2

Re 1002 L 6,8 0,2 2,7 11,5 77,3 0,2 0,4 0,2

PI 537701 6,7 0,2 2,3 11,6 77,8 0,2 0,4 0,2

CC1485-3-1-1-1-1 7,8 0,2 2,2 11,6 76,9 0,2 0,4 0,2

PI 560163 7,0 0,2 1,9 11,7 77,8 0,1 0,4 0,2

PI 451958 7,1 0,2 2,7 11,8 77,1 < 0,1 0,4 0,2

ID C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1

PI 306609 6,6 0,2 2,5 12,0 77,3 0,2 0,4 0,2

PI 451950 6,6 0,1 2,2 12,4 77,5 0,1 0,4 0,2

PI 537705 6,6 0,2 2,6 13,1 76,3 0,2 0,4 0,2

PI 413718 7,1 0,2 2,9 13,4 74,9 0,2 0,6 0,2

PI 560161 7,1 0,2 2,1 14,4 75,0 0,1 0,4 0,2

PI 560180 6,5 0,2 2,0 18,3 71,5 0,3 0,4 0,2

PI 401477 5,8 0,2 2,3 36,8 53,2 0,2 0,5 0,2

PI 537712 6,5 0,2 2,5 40,5 48,5 0,2 0,5 0,2

PI 537695 6,0 0,2 2,3 41,9 47,9 0,2 0,5 0,3

CIANO-OL 6,9 0,3 1,9 42,9 46,5 0,2 0,5 0,3

PI 538779 6,6 0,2 2,1 43,2 46,2 0,2 0,4 0,3

Sinonaria 6,0 0,2 2,1 43,5 46,6 0,2 0,4 0,2

PI 401479 5,9 0,2 2,1 48,2 41,7 0,3 0,5 0,4

PI 560166 5,7 0,2 2,3 55,0 35,0 0,1 0,5 0,3

PI 401474 5,5 0,3 1,9 59,3 30,6 0,4 0,6 0,6

PI 560177 5,1 0,2 1,9 60,7 30,3 0,2 0,4 0,3

PI 603207 5,6 0,2 2,0 65,2 25,0 0,2 0,5 0,3

PI 560167 5,8 0,2 1,6 65,9 24,8 0,2 0,4 0,3

PI 560174 5,9 0,3 1,8 67,6 22,6 0,3 0,5 0,3

PI 603208 5,4 0,2 2,3 68,3 21,7 0,2 0,6 0,3

PI 538025 5,3 0,2 2,3 68,5 21,6 0,3 0,4 0,3

PI 560168 5,9 0,2 1,8 68,5 21,8 0,3 0,5 0,3

PI 560169 5,6 0,2 1,9 71,8 18,6 0,2 0,5 0,3

PI 577808 5,3 0,2 2,0 75,0 15,5 0,3 0,5 0,3

PI 612967 5,4 0,2 1,8 76,3 14,5 0,2 0,4 0,3

Este experimento también mostró que el nivel de ácido oleico en el aceite de semillas, obtenido de plantas cultivadas en el campo fue típicamente aproximadamente un 5-10 % más bajo que el de plantas cultivadas en invernadero, incluso para los accesos con un mejor rendimiento en el campo. Se pensó que la razón para esto era que las condiciones de cultivo en el campo eran menos ideales que en el invernadero.

En un experimento adicional, se cultivaron plantas del cultivar S317 de cártamo bien en el campo o en el invernadero para comparar la composición de ácidos grasos del aceite de las semillas. Aunque las condiciones del campo fueron más favorables durante la estación de crecimiento en comparación con la estación 2011-12, el peso de 20 semillas de plantas cultivadas en el campo fue de 0,977 g en comparación con 1,202 g de plantas cultivadas en el invernadero. Se analizaron dieciocho a 20 semillas de cada grupo para determinar composición de ácidos grasos por análisis por GC. El nivel de ácido oleico en semillas cultivadas en campo varió de 74,83 a 80,65 con una media de (+/1 s.d.) de 78,52 1,53, en comparación con un rango en semillas cultivadas en invernadero de 75,15-78,44 con una media de 76,33 1,00. Estuvieron presentes otros ácidos grasos al nivel en la Tabla 20.

Tabla 20. Composición de ácidos grasos de aceite de semillas S317 crecidas bien en el campo o en el invernadero.

Ejemplo 15. Cruce de transgenes en otras variedades de cártamo

Se cruzan manualmente variedades de cártamo usando métodos bien establecidos, por ejemplo, como se describe en Mündel y Begman (2009). Se seleccionan las mejores de las líneas transformadas que contenían las construcciones descritas anteriormente, particularmente las líneas transformadas que contienen solamente una única inserción de T-ADN, y se cruzan con plantas e otras variedades de cártamo, no transformadas o ya transformadas con una construcción diferente, que tienen un rendimiento agronómico óptimo. Usando rondas repetidas de retrocruzamiento con el parental recurrente, por ejemplo, por 4 o 5 retrocruzamientos, y luego autofecundación, se producen plantas que son homocigotas para la o las construcciones deseadas en el fondo genético para el rendimiento agronómico óptimo. Se puede usar la selección asistida por marcador en el proceso de reproducción, tal como, por ejemplo, el uso de un marcador perfecto para el alelo ol como se describe en el Ejemplo 7.

Ejemplo 16. Modificación de la composición de aceite de las semillas mediante silenciamiento génico mediado por microARN artificial

Los microARN (miARN) son una clase de ARN pequeños (ARN) reguladores endógenos de 20-24 nucleótidos (nt) tanto para plantas como para animales, que regulan la actividad de genes endógenos. La expresión transgénica de ARN precursores de miARN modificados (precursores de miARN artificiales) representa una estrategia específica de secuencia y basada en ARN desarrollada recientemente para silenciar genes endógenos. Se ha demostrado que la sustitución de varios nucleótidos en la secuencia precursora de miARN para hacer un precursor de miARN artificial no afecta la biogénesis del miARN, siempre que las posiciones de concordancias y ausencia de concordancias en tallo bucle en el precursor, permanezcan inalteradas.

El paquete de software CSIRO MatchPoint (www.pi.csiro.au/RNAi) (Horn y Waterhouse, 2010) se usó para identificar secuencias 21-mer específicas en los genes FAD2, FATB y FAE1 de Arabidopsis que eran únicos en el genoma de Arabidopsis y, por lo tanto, era menos probable que causaran el silenciamiento de genes no diana (gen excluido como diana) cuando son expresados como miARN artificiales. Se seleccionó una secuencia de 21-mer única para cada uno de los 3 genes, siendo la 21-mer en cada caso totalmente complementaria (antisentido) a una región del transcrito del gen correspondiente. Se diseñó una molécula del precursor de miARN artificial para cada uno, en base a la secuencia del precursor ara-miR159b de A. thaliana. En cada caso, la secuencia del precursor miR159b fue modificada en su tallo para acomodar la secuencia 21-mer antisentido. Se prepararon tres construcciones, cada una que codifica uno de los ARN precursores, cada una bajo el control del promotor FP1 especifico de semilla, y se clonaron en un vector de expresión binario para generar las construcciones designadas pJP1106, pJP1109 y pJP1110.

Estas construcciones se transformaron separadamente en una cepa AGL1 de A tumefaciens por electroporación y las cepas transformadas se usaron para introducir la construcción genética en A. thaliana (ecotipo Columbia) por el método de inmersión floral (Ejemplo 1). Las semillas (semillas T¹) de las plantas tratadas se sembraron en placas sobre medio MS suplementado con 3,5 mg/L de PPT para seleccionar las plántulas transformadas, que se transfirieron al suelo para establecer platas transgénicas T¹confirmadas. Se esperaba que la mayoría de estas plantas T¹fueran heterocigotas para la construcción genética introducida. Las semillas T²de las plantas transgénicas se recogieron en la madurez y se analizaron para determinar su composición de ácidos grasos. Estas plantas T²incluyeron líneas que eran homocigotas para la construcción genética, así como también unas que eran heterocigotas. Las plantas T²homocigotas se autofertilizaron para producir semillas T³, y las plantas de la progenie T³obtenidas a partir de estas semillas se usaron a su vez para obtener plantas de la progenie T⁴. Por lo tanto, esto permitió el análisis de la estabilidad del silenciamiento génico durante tres generaciones de plantas de la progenie.

Los perfiles de ácidos grasos de aceite de semillas obtenido de los lotes de semillas T², T³y T⁴se analizaron por GC como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se observaron alteraciones en la actividad A12-desaturasa causadas por la acción del transgén basado en fAD2 como un incremento en la cantidad de ácido oleico en los perfiles de aceite de las semillas. Un método relacionado para evaluar los efectos acumulativos de la actividad A12-desaturasa durante la síntesis de ácidos grasos de la semilla fue a través del cálculo del parámetro proporción de desaturación oleica (ODP) para cada aceite de semilla, obtenido usando la siguiente fórmula: ODP = % de 18:2 % de 18:3 / % de 18:1 % de 18:2 % de 18:3. El aceite de semilla de Arabidopsis de tipo salvaje tiene típicamente un valor de ODP de alrededor de 0,70 a 0,79, lo que significa que del 70 % al 79 % de 18:1 formado durante la síntesis de ácidos grasos en la semilla fue convertido subsecuentemente en los ácidos grasos poliinsaturados C18, primero de todo por la acción de A12-desaturasa para producir 18:2 y luego por desaturación adicional a 18:3. Por lo tanto, el parámetro ODP fue útil para determinar el grado de silenciamiento del gen FAD2 sobre el nivel de actividad de A12-desaturasa endógena.

Los niveles de C18:1A9 (ácido oleico) en semillas T²transformadas con la construcción pJP1106 (diana FAD2) variaron del 32,9 % al 62,7 % en 30 eventos transgénicos en comparación con un nivel promedio de C18:1 de tipo salvaje del 14,0 % ± 0,2. Una línea altamente silenciada (planta ID-30) que tenía una única inserción de transgén, determinada por relaciones de segregación (3:1) del marcador seleccionable de la planta (PPT), se llevó a la siguiente generación (T³). De manera similar, se observaron altos niveles del 18:1A9 en las semillas T³que variaron del 46,0 % al 63,8 % con un promedio de 57,3 5,0 %. En la siguiente generación, las semillas T⁴también mostraron de manera similar altos niveles de 18:1a9 que variaron del 61 % al 65,8 % con un promedio de 63,3 1,06 %. El contenido total de PUFA (18:2 18:3) en el aceite de semillas transgénicas T²varió del 6,1 % al 38 %, pero en el aceite de semillas de la línea homocigota ID-30, el contenido total de PUFA se redujo adicionalmente y varió del 4,3 al 5,7 %. El aceite de semillas del ecotipo Columbia de Arabidopsis control tuvo un valor de ODP que varió de 0,75-0,79, lo que significa que más del 75 % del ácido oleico producido en la semilla en desarrollo fue convertido subsecuentemente a 18:2 o 18:3. En contraste, el aceite de la semilla del mutante fad2-1 de Arabidopsis tuvo un valor de ODP de 0,17, indicando aproximadamente una reducción del 75 % en la A12-desaturación debido a la mutación fad2-1. El valor de ODP varió de 0,08 a 0,48 en el aceite de semilla transgénica T², 0,07-0,32 en el aceite de semilla T³y 0,06-0,08 en el aceite de semilla T⁴, en contraste con el valor de 0,75 en el aceite de semilla de Arabidopsis control. La reducción drástica en los valores de ODP en las líneas transgénicas indicó claramente el silenciamiento eficiente del gen FAD2 endógeno usando la estrategia del microARN artificial. Este experimento también mostró la estabilidad del silenciamiento génico durante tres generaciones. Se observaron grados similares de silenciamiento génico con las otras dos construcciones para regular a la baja sus genes correspondientes.

El grado de silenciamiento del gen FAD2 y la cantidad de 18:1a9 (63,3 1,06 %) observado en este estudio usando microARN artificial fue más alta que en el FAD2-2 mutante bien caracterizado (59,4 %), la línea de FAD2 silenciado usando la estrategia de ARN en horquilla (56,9 3,6 %) y la estrategia antisentido en horquilla (61,7 2,0 %). El contenido medio de 18:2 18:3 % en el aceite de semilla de FAD2 silenciado usando miARN fue de 4,8 0,37 %, que fue más bajo que en el mutante FAD2-2 reportado previamente (7,5 1,1 %) y la línea de FAD2 silenciado usando la estrategia antisentido en horquilla (7,2 1,4 %). Por lo tanto, estos datos mostraron las ventajas del microARN artificial en el grado de silenciamiento, así como también la estabilidad del silenciamiento durante las generaciones de progenie.

Ejemplo 17. Evaluación del contenido de esterol y composición en aceites

Los fitoesteroles de 12 muestras de aceite vegetal adquiridos de fuentes comerciales en Australia se caracterizaron por análisis por GC y GC-MS como derivados de éter de O-trimetilsililo (éter de OTMSi) como se describe en el Ejemplo 1. Se identificaron los esteroles por datos de retención, interpretación de los espectros de masa y comparación con los datos espectrales de masa estándar de la bibliografía y el laboratorio. Los esteroles se cuantificaron mediante el uso de un estándar interno de 5P(H)-Colan 24-ol. La estructura básica del fitoesterol y las estructuras químicas de algunos de los esteroles identificados se muestran en la Figura 14 y en la Tabla 21.

Tabla 21. Nombres sistemáticos/lUPAC de esteróles identificados.

Los aceites de plantas analizados fueron de: sésamo {Sesamun indicum), aceituna (Olea europea), girasol (Helianthus annus), ricino (Ricinus communis), canola (Brassica napus), cártamo {Carthamus tinctorius), cacahuate (Arachis hypogaea). lino (Linum usitatissimum) y soja (Glycine max). En abundancia relativa decreciente, en todas las muestras de aceite, los principales fitoesteroles fueron: P- sitoesterol (rango del 28-55 % de contenido total de esterol), A5-avenaesterol (isofucoesterol) (3-24 %), campesterol (2-33 %),n5-estigmaesterol (0,7-18 %), A7-estigmaesterol (1-18 %) y A7-avenaesterol (0,1-5 %). Se identificaron varios otros esteroles menores, estos fueron: colesterol, brassicaesterol, calinaesterol, campestanol y eburicol. También se detectaron cuatro esteroles C29:2 y dos C30:2, pero se requiere una investigación adicional para completar la identificación de estos componentes menores. Además, estaban presentes varios otros esteroles no identificados en algunos de los aceites, pero debido a su abundancia muy baja, el espectro de masa no fue lo suficientemente intenso como para facilitar la identificación de sus estructuras.

Los contenidos de esteroles expresados como mg/g de aceite en cantidad decreciente fueron: aceite de canola (6,8 mg/g), aceite de sésamo (5,8 mg/g), aceite de lino (4,8-5,2 mg/g), aceite de girasol (3,7-4,1 mg/g), aceite de cacahuete (3,2 mg/g), aceite de cártamo (3,0 mg/g), aceite de soja (3,0 mg/g), aceite de oliva (2,4 mg/g), aceite de ricino (1,9 mg/g). Las composiciones de % de esterol y el contenido total de esterol se presentan en la Tabla 22.

Entre todas las muestras de aceite de semillas, el principal fitoesterol fue generalmente P-sitoesterol (rango del 30-57 % del contenido total de esterol). Hubo un amplio rango ente los aceites en las proporciones de los otros esteroles principales: campesterol (2-17 %), A5-estigmaesterol (0,7-18 %), A5-avenaesterol (4-23 %), A7-estigmaesterol (1-18 %). Los aceites de diferentes especies tuvieron un perfil de esteroles diferente teniendo algunos perfiles bastante distintivos. El aceite de canola tuvo la proporción más alta de campesterol (33,6 %), mientras que las muestras de otras especies tuvieron generalmente niveles más bajos, p. ej., hasta el 17 % en aceite de cacahuete. El aceite de cártamo tuvo una proporción relativamente alta de A7-estigmaesterol (18 %), mientras que este esterol fue usualmente bajo en los aceites de otras especies, hasta el 9 % en aceite de girasol. Por lo tanto, como fueron distintivos para cada especie, los perfiles de esteroles pueden ser usados para ayudar en la identificación de aceites de plantas o de plantas específicos y verificar así su condición de genuinos o adulteración con otros aceites.

Se compararon dos muestras, cada una de girasol y cártamo, en cada caso una se produjo por prensado en frío de semillas y sin refinar, mientras que la otra no fue prensada en frío y refinada. Aunque se observaron algunas diferencias, las dos fuentes de los aceites tuvieron una composición similar de esteroles y contenidos totales de esteroles, lo que sugiere que el procesamiento y la refinación tuvieron poco efecto sobre estos dos parámetros. El contenido de esteroles entre las muestras varió tres veces y en el intervalo de 1,9 mg/g a 6,8 mg/g. El aceite de canola tuvo el más alto y el aceite de ricino el más bajo contenido de esteroles.

Tabla 22. Composición y contenido de esteroles de aceites de plantas evaluados.

Númer Nombre Girasol Cártamo Lino Lino o del común Sésam Oliv Giraso Prensad Ricin Canol Cártam Prensad Cacahuet (semill (semill Soja esterol del esterol o a l

* o en frío o a o o en frío e a de a de lino) lino)

1 colesterol 0,2 0,8 0,2 0,0 0,1 0,3 0,2 0,1 0,2 0,4 0,4 0,2

2 brassicaesterol 0,1 0,0 0,0 0,0 0,3 0,1 0,0 0,0 0,0 0,2 0,2 0,0

3 calinaesterol/2 1,5 0,1 0,3 0,1 1,1 2,4 0,2 0,1 0,9 1,5 1,4 0,8 4-metilen

colesterol

4 campesterol/2 16,2 2,4 7,4 7,9 8,4 33,6 12,1 8,5 17,4 15,7 14,4 16,9 4-metilcolesterol

5 campestanol/2 0,7 0,3 0,3 0,1 0,9 0,2 0,8 0,8 0,3 0,2 0,2 0,7 4-metilcolestanol

6 C29:2* 0,0 0,0 0,1 0,2 0,0 0,1 0,5 0,5 0,0 1,2 1,3 0,1

7 ^A5- _{estigmaesterol}6,4 1,2 7,4 7,2 18,6 0,7 7,0 4,6 6,9 5,1 5,8 17,6

8 desconocido 0,5 1,3 0,7 0,6 0,8 0,7 0,7 1,3 0,4 0,7 0,6 1,3

9 ^{ergost-7-en-3}

_P-ol0,1 0,1 1,9 1,8 0,2 0,4 2,7 4,0 1,4 1,4 1,4 1,0

10 desconocido 0,0 1,3 0,9 0,8 1,2 0,9 1,8 0,7 1,2 0,7 0,5 0,7

11 eburicol 1,6 1,8 4,1 4,4 1,5 1,0 1,9 2,9 1,2 3,5 3,3 0,9

12 P- 55,3 45,6 43,9 43,6 37,7 50,8 40,2 35,1 57,2 29,9 28,4 40,2 sitoesterol/24-etilcolesterol

13 A5- 8,6 16,9 7,2 4,1 19,3 4,4 7,3 6,3 5,3 23,0 24,2 3,3 avenasterol/

isofucosterol

14 ^alcohol

_{triterpenoide 0,0 2,4 0,9 1,1 0,0 0,0 1,6 1,9 0,0 0,0 0,0 0,9}

15 ^alcohol

_{triterpenoide 0,0 0,0 0,7 0,6 0,0 0,0 2,8 1,8 0,0 0,0 0,3 0,0}

16 C29:2* 0,0 0,5 0,7 0,7 1,5 1,2 2,8 1,9 2,0 1,0 0,7 0,5 Númer Nombre

o del común Sésam Oliv Giraso Girasol m Cártamo Lino Lino Cacahuet (semill (semill esterol del esterol o a l Prensad Ricin Canol Cárta

o a o Prensad e a de a de Soja * o en frío o en frío lino) lino)

19 A7- 2,2 7,1 9,3 10,9 2,3 0,9 10,5 18,3 1,1 7,9 8,7 5,6 estigmasterol /

estigmast-7-en-30-ol

20 ^A7- _{avenaesterol 1,3 0,1 4,0 3,6 0,6 0,2 2,0 4,7 0,7 0,4 0,4 0,6}

21 desconocido 0,7 7,1 0,9 0,8 0,0 0,4 0,3 0,4 0,0 3,0 3,6 0,0

22 desconocido 0,3 0,0 0,3 0,9 0,0 0,0 1,2 1,3 0,2 0,1 0,0 0,3

23 desconocido 0,2 0,2 0,3 0,3 0,2 0,1 0,3 0,2 0,2 0,1 0,2 0,5

24 desconocido 0,0 3,1 0,9 1,3 0,6 0,4 0,2 0,4 0,7 1,7 1,9 0,8

25 desconocido 0,9 0,4 0,3 0,5 0,3 0,1 0,5 0,7 0,3 0,1 0,1 0,6

26 C30:2 2,2 6,0 4,6 5,7 1,4 0,6 1,0 1,2 1,2 1,2 1,1 5,2

27 desconocido 0,0 0,4 0,4 0,3 0,3 0,2 0,1 0,2 0,3 0,1 0,0 0,3

100, 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100, Suma 100,0 0 0

Esteroles 5,8 2,4 4,1 3,7 1,9 6,8 3,2 3,0 3,2 4,8 5,2 3,0 totales (mg/g

de aceite)

C29:2* y C30:2* indican un esterol C29 con dos enlaces dobles y un esterol C30 con dos enlaces dobles, respectivamente.

Se efectuó un análisis separado de aceites de cártamo de semillas control derivadas de invernadero (serie S), semillas genéticamente modificadas con alto contenido de ácido oleico (serie T) y dos aceites de cártamo comerciales. Se observaron varias características (Tabla 23). En primer lugar, hay un alto grado de similitud en el patrón de esteroles entre las semillas control y modificadas y en segundo lugar los aceites de cártamo comerciales están en un agrupamiento separado y, por lo tanto, se muestra que tienen un perfil de fitoesterol significativamente diferente. El examen adicional de los perfiles de fitoesterol también mostró la similitud de los perfiles de fitoesterol de las muestras de semillas de cártamo control y modificadas.

Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares que han sido incluidos en la presente memoria descriptiva son solamente para propósitos de proporcionar un contexto para la presente descripción. No debe tomarse como una admisión de que cualquiera o todos estos contenidos forman parte de la base de la técnica anterior o formaban parte del conocimiento general común en el campo relevante de la presente descripción tal como existía antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

Tabla 23. Composición (% de esteróles totales) y contenido (mg/g) de esteróles de muestras de aceite de semilla de cártamo

REFERENCIAS

Abdullah et al. (1986) Biotech. 4:1087.

Almeida y Allshire (2005) TRENDS Cell Biol 15: 251-258.

Alonso et al. (2010) Green Chem. 12:1493-1513.

Ascherio y Willett (1997) Am. J. Clin. Nutr. 66:1006S-1010S.

Bartholomew (1971) Temperature effects on the fatty acid composition of developing seeds in safflower, Carthamus tinctorius L.

Baumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225:459-467.

Baumlein et al. (1992) Plant J. 2:233-239.

Beclin et al. (2002) Current Biology 12:684-688.

Belide et al. (2011) Plant Methods 7:12.

Bergman et al. (2006) Crop Sci. 46:1818-1819.

Blacklock et al. (2010) J Biol Chem 285: 28442-28449.

Bligh y Dyer (1959) Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 37:911-7.

Bonanome y Grundy (1988). N. Engl. Med. 318: 1244-1248.

Brodersen y Voinnet (2006) Trends Genet. 22:268-280.

Broothaerts et al. (2005) Nature 433:629-633.

Broun et al. (1998) Plant J. 13:201-210.

Broun et al. (1999) Annu. Rev. Nutr. 19: 197-216.

Browse et al. (1989) Plant Physiol. 90:522-529.

Cahoon et al. (2003) Plant J. 34:671-683.

Chapman y Burke (2007) Evolution 61:1773-1780.

Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657.

Chung et al. (2006) BMC Genomics 7:120.

Clough y Bent (1998) Plant J. 16:735-743.

Comai et al. (2004) Plant J 37: 778-786.

Coutu et al. (2007) Transgenic Research 16:771-781.

Covello y Reed (1996) Plant Physiol. 111:223-226.

Dauk et al. (2007) Plant Science 173:43-49.

Dickey et al. (1994) Plant Cell 6:1171-1176.

Dougherty et al. (1995). Am. J. Clin. Nutr. 61:1120-1128.

Durrett et al. (2008) Plant J. 54:593-607.

Dyer et al. (2002) Plant Physiology 130:2027-2038.

E llerstrom et al. (1996) P lant Mol. Biol. 32 :1019-1027.

Endalew et al. (2011) Biomass and Bioenergy 35:3787-3809.

Falcone et al. (1994) Plant Physiol. 106:1453-1459.

Fenandez San Juan (1995). Alimentaria 33: 93-98.

Fernández-Martinez et al. (1993) Euphytica 69: 115-122.

Fofana et al. (2004) Plant Science 166:1487-1496.

Fujimura et al. (1985) Plant Tissue Culture Lett. 2:74.

Gamez et al. (2003) Food Res International 36: 721-727.

Glevin et al. (2003) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67:16-37.

Gong y Jiang (2011) Biotechnol. Lett. 33:1269-1284.

Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-258.

Greenwell et al. (2011) J. R. Soc. Interface 7:703-726.

Gunstone (2001) Inform 11: 1287-1289.

Hafner et al. (2008) Methods 44:3-12.

Hamdan et al. (2009) Euphytica 168: 61-69.

Henikoff et al. (2004) Plant Physiol 135: 630-636.

Heppard et al. (1996) Plant Physiology 110:311-319.

Hernández et al. (2005) Phytochemistry 66:1417-1426.

Hill y Knowles (1968) Crop Sci. 8:275-277.

Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-922.

Hu et al. (1997). N. Engl. J. Med. 337: 1491-1499.

Hugly y Somerville (1992) Plant Physiol. 99:197-202.

Isshiki et al. (2001) Plant Physiol. 125:1388-1395.

Jofuku et al. (1989) Plant Cell 1:427-435.

Kang et al. (2011) Plant Physiology and Biochemistry 49:223-229.

Karmakar et al. (2010) Bioresource Technology 101:7201-7210.

Khadake et al. (2009) Mol Biotechnol. 42: 168-174.

Kim et al. (2006) Molecular Genetics and Genomics 276:351-368.

Knothe (2005) Fuel Process. Technol. 86:1059-1070.

Knothe y Steidley (2005) Fuel 84:1059-1065.

Knowles (1968) Economic Botany 22: 195-200.

Knowles (1969) Economic Botany 23:324-329.

Knowles (1972) Journal of the American Oil Chemists' Society 49:27-29.

Knowles (1989) Oil crops of the world: their breeding and utilization / ed G. Robbelen, R. Keith Downey, A. Ashri. McGraw-Hill, Nueva York.

Knowles y Hill (1964) Crop Science 4:406-409.

Lacroix et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105: 15429-15434.

Langridge et al. (2001) Aust J Agric Res 52: 1043-1077.

Lee et al. (1998) Science 280:915-918.

Lemieux (2000) Current Genomics 1: 301-311.

Liu (1998) The isolation and characterisation of fatty acid desaturase genes in cotton. Tesis Doctoral Universidad de Sydney.

Liu et al. (1999) Functional Plant Biology 26:101-106.

Liu et al. (2001) American Journal of Botany 88:92-102.

Liu et al. (2002a). J. Am. Coll. Nutr. 21: 205S-211S.

Liu et al. (2002b). Plant Physiol. 129: 1732-1743.

Liu et al. (2010) Fuel 89:2735-2740.

Loguercio (1998) Current genetics 34:241-249.

Maher y Bressler (2007) Bioresource Technology 98:2351-2368.

Marangoni et al. (1995) Trends in Food Sci. Technol. 6: 329-335.

Martínez-Rivas et al. (2001) Molecular Breeding 8:159-168.

McCartney et al. (2004) Plant J 37: 156-173.

Mensink y Katan (1990). N. Engl. J. Med. 323: 439-445.

Millar y Waterhouse (2005) Funct Integr Genomics 5:129-135.

Mroczka et al. (2010) Plant Physiology 153:882-891.

Mundel y Bergman (2009) Safflower. Oil Crops: Handbook of Plant Breeding 4. Ed. J. Vollman e I. Rajcan. Springer Science. P 423-447.

Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453.

Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403.

Noakes y Clifton (1998) Am. J. Clin. Nutr. 98: 242-247.

Nykiforuk et al. (2011) Plant Biotechnology Journal 9:250-263.

Oil World Annual (2004) International Seed Testing Association (ISTA) Mielke GmbH, Hamburgo, Alemania Okuley et al. (1994) Plant Cell 6:147-158.

Ow et al. (1986) Science 234:856-859.

Pasquinelli et al. (2005) Curr Opin Genet Develop 15: 200-205.

Paterson et al. (1993) Plant Molecular Biology Reporter 11: 122-127.

Perez-Vich et al. (1998) JAOCS 75:547-555.

Perrin et al. (2000) Mol Breed 6:345-352.

Peterson et al. (1997) Plant Molecular Biology Reporter 15:148-153.

P etrie et al. (2010) P lan t M ethods 6:8-14.

Phillips et al. (2002) Journal of Food Composition and Analysis 12:123-142.

Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 40:1-22.

Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 127:31-36.

Roche y Gibney (2000) Am. J. Clin. Nutr. 71: 232S-237S.

Ryan et al. (1984) J. Am. Oil Chem. Soc. 61:1610-1619.

Sadanandom et al. (1996) Plant Journal 10:235-242.

Scarth y Tang (2006) Crop Science 46:1225-1236.

Scheffler et al. (1997) TAG Theoretical and Applied Genetics 94:583-591.

Schmittgen (2008) Nature Protocols 3: 1101-1108.

Sebedio et al. (1994) Fett. Wiss. Technol. 96: 235-239.

Semwal et al. (2011) Bioresource Technology 102:2151-2161.

Shanklin y Cahoon (1998) Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49:611-641. Slade y Knauf (2005) Transgenic Res 14: 109-115.

Small (2000a) Genetics 155: 1913-1926.

Small (2000b) Molecular phylogenetics and evolution 16:73-84.

Smith et al. (2000) Nature 407: 319-320.

Speranza et al. (2012) Process Biochemistry (En prensa).

Stalker et al. (1988) Science 242: 419-423.

Stymne y Appelqvist (1978) European Journal of Biochemistry 90:223-229.

Tang et al. (2005) The Plant Journal 44:433-446.

Taylor (1997) The Plant Cell 9:1245-1249.

Thelen y Ohlrogge (2002) Metabolic Engineering 4: 12-21.

Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem 263:12500-12508.

Tholstrup et al. (1994) Am. J. Clin. Nutr. 59: 371-377.

Toriyama et al. (1986) Theor. Appl. Genet. 205:34.

Tzfira y Citovsky (2006) Curr. Opin. Biotech. 17:147-154.

Vanrooijen y Moloney (1995) Bio-Technology 13:72-77.

Voinnet et al. (2003) Plant Journal 33:949-956.

Voinnet et al. (2003) Plant Journal 33: 949-956.

Voelker et al. (1990) Plant Cell 2:255-261.

Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964.

Wesley et al. (2001) Plant Journal 27: 581-590.

Wood (2009) Plant Biotechnology Journal 7: 914-924.

W o o d et al. (2009) P lan t B io techno logy Journa l 7 :914-924.

Zhou et al. (2006) Plant Science 170:665-673.

Zhou et al. (2011) Journal of Biological Chemistry 286:2877-2885. Zock y Katan (1992) J. Lipid Res. 33:399-410.

Zock et al. (1994) Arterioscler Thromb. 14:567-575.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una semilla de cártamo cuyo contenido de aceite comprende, y/o que es capaz de producir una planta que produce semillas cuyo contenido de aceite comprende, triacilgliceroles (TAG) que consisten en ácidos grasos esterificados a glicerol, y en donde

i) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico,

ii) al menos el 95 % en peso del contenido de aceite de la semilla es TAG,

iii) del 90 % al 95 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico, iv) menos del 3,1 % en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico, y v) el contenido de aceite de la semilla tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de 0,037 y/o un valor palmítico-linoleico-oleico (PLO) de menos de 0,063;

en donde la semilla de cártamo comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un primer ARN de silenciamiento que es capaz de reducir la expresión de un gen de A12 desaturasa (FAD2) en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece del primer polinucleótido exógeno, y en donde el primer polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo, y b) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un segundo ARN de silenciamiento que es capaz de reducir la expresión de un gen de palmitoil-ACP tioestearasa (FATB) en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece del segundo polinucleótido exógeno, y en donde el segundo polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo.

2. La semilla de cártamo de la reivindicación 1, en donde el contenido de aceite de la semilla tiene una o más de las siguientes características,

a) del 90 % al 94 %, o del 91 % al 94 %, o del 91 % al 92 %, en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido oleico,

b) menos del 3 %, o menos del 2,75 %, o menos del 2,5 %, en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla es ácido palmítico,

c) del 0,1 % al 3 % o del 2 % al 3 %, en peso de los ácidos grasos totales del contenido de aceite de la semilla son ácidos grasos poliinsaturados (PUFA),

d) menos del 2,5 %, menos del 2,25 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido linoleico (LA), e) del 90 % al 96 %, o del 92 % al 96 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del contenido de aceite son ácidos grasos monoinsaturados,

f) el contenido de aceite tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de 0,02, o menos de 0,015, o 0,005 a 0,05, o 0,005 a 0,02,

g) la ODP del contenido de aceite de la semilla es 0,033 a 0,01, o 0,033 a 0,016, o 0,033 a 0,023, y

h) el valor de PLO del contenido de aceite de la semilla es 0,063 a 0,020, o 0,055 a 0,020, o 0,050 a 0,020, o 0,055 a 0,050.

3. La semilla de cártamo de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el contenido de aceite de la semilla es lípido que se caracteriza además por una o más de las siguientes características:

a) el ácido a-linolénico es indetectable en el contenido de ácidos grasos del lípido, y

b) del 55 % al 80 %, o del 60 % al 80 %, o del 70 % al 80 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 %, del contenido de TAG del lípido es trioleína.

4. La semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende

c) un tercer polinucleótido exógeno que es capaz de reducir la expresión de un gen de desaturasa w6 de ácidos grasos (FAD6) plastidial en una semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece del tercer polinucleótido exógeno, y en donde el tercer polinucleótido exógeno está unido operativamente a un promotor que dirige la expresión del polinucleótido en la semilla de cártamo en desarrollo.

5. La semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que se caracteriza además por una o más de las siguientes características,

a) el primer ARN de silenciamiento reduce la expresión de más de un gen endógeno que codifica FAD2 en la semilla de cártamo en desarrollo y/o en donde el segundo ARN de silenciamiento reduce la expresión de más de un gen endógeno que codifica FATB en la semilla de cártamo en desarrollo,

b) el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno están unidos covalentemente en una única molécula de ADN, opcionalmente con secuencias de ADN de unión entre el primer, segundo y/o tercer polinucleótidos exógenos,

c) el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno están bajo el control de un único promotor de modo que, cuando el primer polinucleótido exógeno y el segundo polinucleótido exógeno y/o el tercer polinucleótido exógeno son transcritos en la semilla de cártamo en desarrollo, el primer ARN de silenciamiento y el segundo ARN de silenciamiento y/o el tercer ARN de silenciamiento están unidos covalentemente como partes de un único transcrito de ARN,

d) la semilla comprende un único ADN de transferencia integrado en el genoma de la semilla de cártamo, y en donde el único ADN de transferencia comprende el primer polinucleótido exógeno y ya sea uno u otro o ambos del segundo polinucleótido exógeno y el tercer polinucleótido exógeno,

e) la semilla es homocigota para el ADN de transferencia de la parte d),

f) el primer ARN de silenciamiento, el segundo ARN de silenciamiento y el tercer ARN de silenciamiento, se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en: un polinucleótido antisentido, un polinucleótido con sentido, un polinucleótido catalítico, un microARN y un ARN bicatenario,

g) uno cualquiera o más, preferiblemente todos, de los promotores son específicos de semilla, y preferiblemente se expresan preferentemente en el embrión de la semilla de cártamo en desarrollo,

h) la proteína FAD2 es indetectable en la semilla, e

i) el primer ARN de silenciamiento reduce la expresión de ambos genes CtFAD2-1 y CtFAD2-2, en donde el gen CtFAD2-1 codifica un polipéptido FAD2-1 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:27, y el gen CtFAD2-2 codifica un polipéptido FAD2-2 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:28.

6. La semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde

1) el gen FAD2 es uno o más de un gen CtFAD2-1, un gen CtFAD2-2, y un gen CtFAD2-10, y/o

2) el gen FATB es un gen CtFATB-3; y

en donde,

i) el gen CtFAD2-1 codifica un polipéptido FAD2-1 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:27,

ii) el gen CtFAD2-2 codifica un polipéptido FAD2-2 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:28,

iii) el gen CtFAD2-10 codifica un polipéptido FAD2-10 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:36, y

iv) el gen CtFATB-3 codifica un polipéptido FATB-3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:45.

7. La semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende un gen de A12 desaturasa (FAD2) que comprende una o más mutaciones que reducen la actividad del uno o más genes FAD2 en la semilla de cártamo en desarrollo en relación con una semilla de cártamo correspondiente que carece de la mutación;

8. Una planta de cártamo capaz de producir la semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la planta comprende el primer y segundo polinucleótidos exógenos.

9. Un proceso para producir aceite, proceso que comprende

i) obtener una semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y

ii) extraer aceite de la semilla de cártamo para producir de esta manera el aceite.

10. El proceso de la reivindicación 9, que comprende una etapa de purificación del aceite extraído de la semilla de cártamo, en donde la etapa de purificación comprende una o más o todas del grupo que consiste en: desgomado, desodorización, decoloración, secado y/o fraccionamiento del aceite extraído, y/o eliminación de al menos parte de, preferiblemente sustancialmente todas, las ceras y/o ésteres de ceras del aceite extraído.

11. Lípido extraído de una semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo el lípido triacilgliceroles (TAG) que consisten en ácidos grasos esterificados a glicerol, en donde

i) los ácidos grasos comprenden ácido palmítico y ácido oleico,

ii) al menos el 95 % en peso del lípido es TAG,

iii) del 90 % al 95 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido oleico,

iv) menos del 3,1 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido palmítico, y

v) el lípido tiene una proporción de desaturación oleica (ODP) de menos de 0,037 y/o un valor de palmítico-linoleico-oleico (PlO) de menos de 0,063.

12. El lípido de la reivindicación 11 que tiene un volumen de al menos 1 litro y/o un peso de al menos 1 kg.

13. El lípido de la reivindicación 11 o 12 que tiene una o más de las siguientes características,

a) del 90 % al 94 %, o del 91 % al 94 %, o del 91 % al 92 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido oleico,

b) menos del 3 %, o menos del 2,75 %, o menos del 2,5 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido palmítico,

c) del 0,1 % al 3 % o del 2 % al 3 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido son ácidos grasos poliinsaturados (PUFA),

d) menos del 3 %, o menos del 2,5 %, menos del 2,25 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido linoleico,

e) menos del 1 %, o menos del 0,5 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es ácido a-linolénico (ALA), f) del 0,5 % al 1 % en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido es 18:1A11,

g) la ODP del contenido de ácidos grasos del lípido es 0,033 a 0,01, o 0,033 a 0,016, o 0,033 a 0,023,

h) el valor de PLO del contenido de ácidos grasos del lípido es 0,063 a 0,020, o 0,055 a 0,020, o 0,050 a 0,020, o 0,055 a 0,050,

i) del 90 % al 96 %, o del 92 % al 96 %, en peso del contenido total de ácidos grasos del lípido son ácidos grasos monoinsaturados,

j) el lípido tiene una proporción de monoinsaturación oleica (OMP) de menos de 0,02, o menos de 0,015, o 0,005 a 0,02, k) el lípido está en la forma de un aceite purificado,

l) el lípido no está hidrogenado, y

m) que se extrajo de la semilla obtenida de plantas crecidas en el campo.

14. El lípido de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 que comprende además uno o más esteroles, y que está en la forma de un aceite, y que comprende menos de 5 mg de esteroles/g de aceite, o 1,5 mg de esteroles/g de aceite a 5 mg de esteroles/g de aceite, y que comprende uno o más o todos de

a) del 2,3 % al 4,5 % del contenido total de esteróles es ergost-7-en-3P-ol, y

b) del 1,5 % al 3 % del contenido total de esteroles es alcohol triterpenoide.

15. Harina de semillas extraída de la semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

16. Una composición que comprende un primer componente que es lípido según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, y un segundo componente, preferiblemente donde la composición se produjo mezclando el lípido con el segundo componente, en donde el segundo componente es una sustancia no lipídica tal como una enzima, un catalizador no proteico o producto químico, o uno o más ingredientes de un alimento.

17. Un proceso para producir un producto industrial, proceso que comprende las etapas de:

i) obtener el lípido según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, la composición de la reivindicación 16, o la semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

ii) opcionalmente, procesar físicamente el lípido según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, la composición de la reivindicación 16, o la semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, de la etapa i)

ii) convertir al menos parte del lípido según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, o el lípido en la composición de la reivindicación 15, o la semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el producto procesado físicamente de la etapa ii), en el producto industrial aplicando calor, medios químicos, o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lípido, y

iii) recuperar el producto industrial, produciendo así el producto industrial.

18. Un método para producir combustible, método que comprende

i) hacer reaccionar el lípido según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o el lípido en la composición de la reivindicación 15, o la semilla de cártamo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, con un alcohol, opcionalmente en presencia de un catalizador, para producir ésteres de alquilo, y

ii) opcionalmente, mezclar los ésteres de alquilo con combustible basado en petróleo.