ES2843675T3 - Polipéptidos y anticuerpos para el tratamiento de la infección por VHB y enfermedades relacionadas - Google Patents

Polipéptidos y anticuerpos para el tratamiento de la infección por VHB y enfermedades relacionadas Download PDF

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Abstract

Una proteína recombinante, para su uso en el tratamiento de un sujeto infectado con VHB reduciendo el nivel sérico de ADN del VHB y/o HBsAg en el sujeto, en donde la proteína recombinante comprende un polipéptido y una proteína portadora, ligados opcionalmente mediante un ligante, en donde la proteína recombinante no es una proteína de origen natural o un fragmento de la misma; en donde: el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos y anticuerpos para el tratamiento de la infección por VHB y enfermedades relacionadas
Campo Técnico
La invención se relaciona con el campo de la virología molecular y la inmunología, particularmente con el campo referente al tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis B (VHB). En particular, la invención se relaciona con proteínas recombinantes que comprenden un polipéptido específico y proteínas portadoras para su uso en el tratamiento de la infección por VHB. La invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas para tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con la infección por VHB, que comprende las proteínas recombinantes.
Antecedentes
La infección por VHB, en particular la infección crónica por VHB, es uno de los problemas de salud pública más importantes a nivel mundial (Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2 de oct. 2008;359(14):1486-1500). La infección crónica por VHB puede causar una serie de enfermedades hepáticas tales como hepatitis B crónica (HBC), cirrosis hepática (CH) y carcinoma hepatocelular (CHC) (Liaw YF, Chu cm. Hepatitis B virus infection. Lancet 14 de feb. 2009;373(9663): 582-592). Se informa que hay aproximadamente 2 mil millones de personas infectadas por el VHB, y hay aproximadamente 350 millones de personas infectadas con el VHB crónico en todo el mundo en la actualidad. Entre estas personas infectadas, el riesgo de finalmente morir de enfermedades hepáticas asociadas con la infección por VHB alcanza hasta el 15%-25%, y más de 1 millón de personas mueren de estas enfermedades cada año en todo el mundo (Dienstag JL., vide supra ; y Liaw YF et al., vide supra).
Los agentes terapéuticos para la infección crónica por VHB ahora pueden dividirse principalmente en interferones (IFN) y análogos de nucleósidos o nucleótidos (AN) (Dienstag JL., vide supra; Kwon H, Lok AS. Hepatitis B therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol mayo 2011; 8(5): 275-284; y Liaw YF et al., vide supra). Los interferones incluyen el interferón común (IFN) y el interferón Peg (Peg-IFN), los cuales logran el efecto de inhibir el VHB y tratar la HBC principalmente mediante el aumento de la inmunocompetencia general en los pacientes; Los análogos de nucleósidos o nucleótidos incluyen principalmente lamivudina (LMV), adefovir dipivoxil (ADV), Entecavir (ETV), Telbivudina (LDT) y Tenofovir, los cuales inhiben la replicación del VHB principalmente mediante la inhibición directa de la actividad de la polimerasa del VHB. Para las personas infectadas por el VHB (por ejemplo, pacientes con HBC), dichos agentes solos o en combinación ya han inhibido eficazmente la replicación del virus in vivo, y han reducido considerablemente el nivel de ADN del VHB; en particular, después de un tratamiento de este tipo durante 52 semanas o más, la tasa de respuesta de que el nivel de ADN del VHB fue inferior al límite de detección (respuesta virológica) en los pacientes alcanzó el 40-80% (Kwon H et al., vide supra). Sin embargo, el tratamiento con dichos agentes solos o en combinación no puede eliminar completamente los virus VHB en personas infectadas, y la tasa de respuesta de la relación de conversión negativa de HBsAg o la conversión serológica de HBsAg (un marcador indicativo de la eliminación completa de los virus VHB en pacientes) es generalmente inferior al 5% (Kwon H et al., vide supra). Por lo tanto, es urgente y necesario desarrollar nuevos métodos terapéuticos y agentes capaces de eliminar de forma más eficaz los virus v Hb , en particular la eliminación de HBsAg para los pacientes infectados por el VHB.
Una de las direcciones de investigación importantes en este campo consiste en desarrollar nuevos agentes para el tratamiento de la infección crónica por VHB basado en medios inmunológicos. La inmunoterapia de la infección crónica por VHB se realiza generalmente de dos maneras, es decir, la inmunoterapia pasiva (correspondiente a medicamentos en forma de anticuerpos, etc.) y la inmunoterapia activa (correspondiente a medicamentos en forma de vacunas, etc.). La inmunoterapia pasiva (con anticuerpo como ejemplo) se refiere al proceso de administración de un anticuerpo terapéutico a un paciente infectado por el VHB y de prevención de hepatocitos naíve (que no hayan recibido tratamiento alguno) de la infección por el VHB en virtud de la neutralización vírica mediada por anticuerpos, o la eliminación de virus y hepatocitos infectados in vivo en virtud de la eliminación inmunitaria mediada por anticuerpos, logrando así un efecto terapéutico. En la actualidad, se han aplicado ampliamente anticuerpos policlonales anti-HBs, obtenidos a partir de suero/plasma de una persona que responde al tratamiento inmunizada con la vacuna contra la hepatitis B o de una persona en rehabilitación por la infección por VHB, es decir, inmunoglobulina contra la hepatitis B de alto título (HBIG), al bloqueo de la transmisión vertical madre-lactante del VHB, la prevención del paciente infectado por VHB crónico de la reinfección por el VHB después del trasplante de hígado, y para evitar que personas expuestas accidentalmente al VHB se infecten. Sin embargo, la terapia relativa a la administración directa de HBIG a pacientes infectados por el VHB (por ejemplo, pacientes con h Bc ) no tiene ningún efecto terapéutico significativo, y la HBIG está restringida en muchos aspectos, como relativamente pocas fuentes de plasma de alto título, alto costo, propiedad inestable y problemas potenciales de seguridad. La inmunoterapia activa se refiere al proceso de administración de vacunas terapéuticas (incluyendo vacunas de proteínas, vacunas de polipéptidos, vacunas de ácidos nucleicos, etc.), estimulación del organismo infectado por el VHB cróni
Por lo tanto, es urgente y necesario desarrollar nuevos métodos y agentes terapéuticos capaces de tratar de forma más eficaz la infección por VHB para los pacientes infectados por el VHB.
Qiu et al. en J. Immunology, 1996, 156, págs. 3350-3356 desvelan la identificación del motivo C(R/K)TC en péptidos HBsAg como posible inductor de una respuesta inmunitaria de neutralización general a VHB.
Cheng-Hao Huang et al. en J. Hepatology 2012, 57, págs. 720-729 desvela anticuerpos que se unen a epítopos HBsAg que comprenden los restos de aminoácidos 119-125 de HBsAg.
El documento US 2009/311283 A1 desvela péptidos y composiciones de ácido nucleico para inducir una respuesta inmunitaria al virus de la hepatitis B y proporcionar de este modo una vacuna con la infección por VHB. Los péptidos epitópicos para inclusión en una vacuna a base de epítopo en el documento US 2009/311283 A1 se seleccionan de regiones conservadas de antígenos víricos o asociados a tumores, lo que reduce la probabilidad de mutantes de escape.
Contenido de la invención
Aunque hay múltiples epítopos de respuesta de células B (respuesta de anticuerpos) en diversas proteínas del virus VHB, un anticuerpo contra un epítopo arbitrario no es necesariamente útil en el tratamiento de la infección por VHB. Por lo tanto, la clave del desarrollo de agentes/métodos inmunoterapéuticos eficaces en el tratamiento de la infección por VHB radica en la identificación de objetivos (epítopos) capaces de inducir una eliminación eficaz de virus y células infectadas por virus in vivo y la obtención de anticuerpos contra los objetivos (epítopos).
La invención identifica tales objetivos (epítopos), y por lo tanto proporciona proteínas recombinantes que comprenden un polipéptido específico y proteínas portadoras para su uso en el tratamiento de la infección por VHB como se define en la reivindicación 1. La invención proporciona además composiciones farmacéuticas útiles para tratar o aliviar uno o más síntomas asociados con la infección por VHB, como se define en la reivindicación 13, que comprenden la proteína recombinante de acuerdo con la invención.
En la siguiente divulgación, a menos que se especifique lo contrario, los términos científicos y técnicos utilizados en la presente invención tienen los significados que generalmente entiende un experto en la técnica. Además, las operaciones de laboratorio de cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos e inmunología utilizadas en la presente invención son las operaciones de rutina ampliamente utilizadas en los campos correspondientes. Mientras tanto, para comprender mejor la invención, las definiciones y explicaciones de los términos relevantes se proporcionan de la siguiente manera.
En el presente contexto, el término "HBsAg" se refiere a la proteína del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (VHB), que es bien conocida por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, el número de acceso a la base de datos de NCBI GENBANK: AAF24729.1).
En el presente contexto, cuando se menciona la secuencia de aminoácidos de HBsAg, se describe por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 39. Por ejemplo, la expresión "residuos de aminoácidos de las posiciones 119 a 125 de HBsAg" se refiere a los residuos de aminoácidos de las posiciones 119 a 125 del polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 39. Sin embargo, un experto en la técnica entiende que pueden ocurrir naturalmente mutaciones o variaciones (incluyendo, meramente a título enunciativo, sustitución, deleción y/o adición, por ejemplo, HBsAg de un genotipo diferente o un subtipo genético diferente) en la secuencia de aminoácidos de HBsAg o ser introducidas artificialmente en dicha secuencia sin afectar sus propiedades biológicas. Por lo tanto, en la invención, el término "HBsAg" pretende abarcar todos estos polipéptidos, por ejemplo, incluyendo el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 39 y sus mutantes naturales o artificiales. Adicionalmente, cuando se describen fragmentos de secuencia de HBsAg, no solo incluyen los fragmentos de secuencia de SEQ ID NO: 39, sino además los fragmentos de secuencia correspondientes de sus mutantes naturales o artificiales. Por ejemplo, la expresión "residuos de aminoácidos de las posiciones 119 a 125 de HBsAg" comprende residuos de aminoácidos de las posiciones 119 a 125 de SEQ ID NO: 39 y los fragmentos correspondientes de sus mutantes (mutantes naturales o artificiales). De acuerdo con la invención, la expresión "fragmentos de secuencias correspondientes" o "fragmentos correspondientes" se refiere a fragmentos que se encuentran en posiciones iguales de secuencias cuando las secuencias están sujetas a una alineación optimizada, es decir, las secuencias son alineadas para obtener un porcentaje más alto de identidad. En el presente contexto, el término "HBcAg" se refiere a la proteína del antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B (VHB), que es bien conocida por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, el número de acceso a la base de datos de NCBI GENBANK: AAO63517.1).
En el presente contexto, cuando se menciona la secuencia de aminoácidos de HBcAg, es descrita por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 40. Por ejemplo, la expresión "residuos de aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de HBcAg" se refiere a los residuos de aminoácidos de las posiciones 79 a 81 del polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 40. Sin embargo, un experto en la técnica entiende que pueden ocurrir naturalmente mutaciones o variaciones (incluyendo, meramente a título enunciativo, sustitución, deleción y/o adición, por ejemplo, HBcAg de un genotipo diferente o un subtipo genético diferente) en la secuencia de aminoácidos de HBcAg o ser introducidas artificialmente en dicha secuencia sin afectar sus propiedades biológicas. Por lo tanto, en la invención, el término "HBcAg" pretende abarcar todos estos polipéptidos, por ejemplo, incluyendo el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 40 y sus mutantes naturales o artificiales. Adicionalmente, cuando se describen fragmentos de secuencias de HBcAg, no solo incluyen los fragmentos de secuencias de SEQ ID NO: 40, sino además los fragmentos de secuencias correspondientes de sus mutantes naturales o artificiales. Por ejemplo, la expresión "residuos de aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de HBcAg" comprende residuos de aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de SEQ ID NO: 40 y los fragmentos correspondientes de sus mutantes (mutantes naturales o artificiales). De acuerdo con la invención, la expresión "fragmentos de secuencias correspondientes" o "fragmentos correspondientes" se refiere a fragmentos que se encuentran en posiciones iguales de secuencias cuando las secuencias están sujetas a una alineación optimizada, es decir, las secuencias son alineadas para obtener un porcentaje más alto de identidad.
En el presente contexto, el término "WHcAg" se refiere al antígeno del núcleo del virus de la hepatitis en marmotas, que es bien conocido por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, el número de acceso a la base de datos de NCBI GENBANK: ADE19018.1).
En el presente contexto, cuando se menciona la secuencia de aminoácidos de WHcAg, es descrita por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 41. Por ejemplo, la expresión "residuos de aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de WHcAg" se refiere a los residuos de aminoácidos de las posiciones 79 a 81 del polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 41. Sin embargo, un experto en la técnica entiende que pueden ocurrir naturalmente mutaciones o variaciones (incluyendo, meramente a título enunciativo, sustitución, deleción y/o adición, por ejemplo, WHcAg de un genotipo diferente o un subtipo genético diferente) en la secuencia de aminoácidos de WHcAg o ser introducidas artificialmente en dicha secuencia sin afectar sus propiedades biológicas. Por lo tanto, en la invención, el término "WHcAg" pretende abarcar todos estos polipéptidos, por ejemplo, incluyendo el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 41 y sus mutantes naturales o artificiales. Adicionalmente, cuando se describen fragmentos de secuencias de WHcAg, no solo incluyen los fragmentos de secuencias de SEQ ID NO: 41, sino además los fragmentos de secuencias correspondientes de sus mutantes naturales o artificiales. Por ejemplo, la expresión "residuos de aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de WHcAg" comprende residuos de aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de SEQ ID NO: 41 y los fragmentos correspondientes de sus mutantes (mutantes naturales o artificiales). De acuerdo con la invención, la expresión "fragmentos de secuencias correspondientes" o "fragmentos correspondientes" se refiere a fragmentos que se encuentran en posiciones iguales de secuencias cuando las secuencias están sujetas a una alineación optimizada, es decir, las secuencias son alineadas para obtener un porcentaje más alto de identidad.
En el presente contexto, el término "CRM197 (Materiales de Reacción Cruzada 197)" se refiere a un mutante no tóxico de la toxina difteria (TD), que difiere de una toxina difteria de tipo salvaje por un residuo de aminoácido en la posición 52, que se cambia de Gly a Glu (G. Giannini, R.Rappuoli, G. Ratti et al., Nucleic Acids Research. 1984. 12: 4063-4070). La toxina difteria es bien conocida por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Choe S, Bennett M, Fujii G, et al., Nature. 1992. 357:216-222), cuya secuencia de aminoácidos puede encontrarse, por ejemplo, por referencia al número de acceso a la base de datos de GenBank AAV70486.1.
En el presente contexto, cuando se menciona la secuencia de aminoácidos CRM197, es descrita por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 42. Por ejemplo, la expresión "residuos de aminoácidos de las posiciones 1 a 190 de CRM197" se refiere a los residuos de aminoácidos de las posiciones 1 a 190 de SEQ ID NO: 42. Sin embargo, un experto en la técnica entiende que pueden ocurrir naturalmente mutaciones o variaciones (incluyendo, meramente a título enunciativo, sustitución, deleción y/o adición) en o ser introducidas artificialmente en SEQ ID NO: 42 sin afectar las propiedades biológicas de CRM197. Por lo tanto, en la invención, el término "CRM197" pretende abarcar todos estos polipéptidos, por ejemplo, incluyendo el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 42 y sus mutantes naturales o artificiales. Adicionalmente, cuando se describen fragmentos de secuencias de CRM197, no solo incluyen los fragmentos de secuencias de SEQ ID NO: 42, sino además los fragmentos de secuencias correspondientes de sus mutantes naturales o artificiales. Por ejemplo, la expresión "residuos de aminoácidos de las posiciones 1 a 190 de CRM197" comprende residuos de aminoácidos de las posiciones 1 a 190 de SEQ ID NO: 42 y los fragmentos correspondientes de sus mutantes (naturales o artificiales). De acuerdo con la invención, la expresión "fragmentos de secuencias correspondientes" o "fragmentos correspondientes" se refiere a fragmentos que se encuentran en posiciones iguales de secuencias cuando las secuencias están sujetas a una alineación optimizada, es decir, las secuencias son alineadas para obtener un porcentaje más alto de identidad.
En el presente contexto, el término "anticuerpo" generalmente se refiere a una molécula de inmunoglobulina que consiste en dos pares de cadenas polipeptídicas (cada una tiene una cadena ligera (L) y una cadena pesada (H)). Las cadenas ligeras de un anticuerpo pueden ser clasificadas en cadena ligera k y X. Las cadenas pesadas pueden ser clasificadas en |j, 8, y, a y s, que definen los isotipos de un anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. En una cadena ligera y una cadena pesada, una región variable está ligada a una región constante a través de una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, y una cadena pesada comprende además una región "D" de aproximadamente 3 o más aminoácidos. Cada cadena pesada consiste en una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). Una región constante de cadena pesada consiste en 3 dominios (CH1, CH2 y CH3).
Cada cadena ligera consiste en una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Una región constante de cadena ligera consiste en un dominio CL. La región constante de un anticuerpo puede mediar en la unión de una inmunoglobulina a un tejido o factor huésped, incluyendo diversas células (por ejemplo, células efectoras) de un sistema inmunitario y un primer componente (C1q) del sistema de complemento clásico. La región VH y VL también pueden dividirse en regiones hipervariables (denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR)), intercaladas por regiones relativamente conservadoras (denominadas región de estructura (FR)). Cada VH y VL consiste en 3 CDR y 4 FR en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 de extremo N-terminal a C-terminal. La región variable (VH y VL) de cada par de cadenas pesadas/ligeras forma sitios de unión al antígeno, respectivamente. La distribución de aminoácidos en diversas regiones o dominios sigue la definición de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:878-883. El término "anticuerpo" no está restringido por ningún método específico para producir anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos incluyen particularmente, anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales. Los anticuerpos pueden ser de diferentes isotipos de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpo IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM.
En el presente contexto, el término "fragmento de unión al antígeno" se refiere a polipéptidos que comprenden fragmentos de un anticuerpo de longitud completa, que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno al que se une específicamente el anticuerpo de longitud completa, y/o que compiten con el anticuerpo de longitud completa por la unión al mismo antígeno, también conocido como "porción de unión al antígeno". Generalmente, véase Fundamental Immunology, Capítulo 7 (Paul, W., ed., la segunda edición, Raven Press, N.Y. (1989), que se incorpora a la presente por referencia para todos los fines. Los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo pueden ser producidos mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de un anticuerpo intacto. En algunas condiciones, los fragmentos de unión al antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb y fragmentos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpo de cadena única (por ejemplo scFv), anticuerpo quimérico, diacuerpo y tales polipéptidos que comprenden al menos una parte del anticuerpo suficiente para conferir la capacidad específica de unión al antígeno a los polipéptidos.
En el presente contexto, el término "fragmento Fd" se refiere al fragmento de anticuerpo que consiste en el dominio Vh y Ch1; el término "fragmento Fv" se refiere al fragmento de anticuerpo que consiste en el dominio Vl y Vh de un solo brazo; el término "fragmento dAb" se refiere al fragmento de anticuerpo que consiste en el dominio Vh (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)); el término "fragmento Fab" se refiere al fragmento de anticuerpo que consiste en el dominio Vl, Vh, Cl y Ch1; el término "fragmento F(ab')2" se refiere al fragmento de anticuerpo que comprende dos fragmentos Fab ligados entre sí a través de puente(s) disulfuro en la región bisagra.
En algunas condiciones, los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo son anticuerpos de cadena única (por ejemplo, scFv), donde los dominios Vl y Vh son apareados para formar una molécula monovalente a través de un ligante que les permite producir una sola cadena de polipéptido (véase, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-426 (1988) y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879- 5883 (1988)). Tales moléculas de scFv generalmente tienen una estructura común: NH2-VL-ligante-VH-COOH o NH2-VH-ligante-VL-COOH. Los ligantes adecuados en el estado de la técnica consisten en la secuencia de aminoácidos GGGGS repetida o sus variantes. Por ejemplo, se puede usar un ligante que tiene una secuencia de aminoácidos (GGGGS)4, y también se pueden usar sus variantes (Holliger et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Otros ligantes que se pueden utilizar en la invención son descritos por Alfthan et al., (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al., (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94­ 106, Hu et al., (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al., (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 y Roovers et al., (2001), Cancer Immunol.
En algunas condiciones, los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo pueden ser diacuerpos, es decir, anticuerpos divalentes, donde los dominios Vh y Vl son expresados en una sola cadena polipeptídica, sin embargo, el ligante utilizado es demasiado corto para permitir el apareamiento de los dos dominios en la misma cadena, los dominios tienen que ser apareados con los dominios complementarios en otra cadena para producir dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), y Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994)).
Los fragmentos de unión al antígeno (por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos descritos anteriormente) de un anticuerpo pueden obtenerse a partir de un anticuerpo dado (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal E6F6 proporcionado en la divulgación) mediante técnicas convencionales conocidas por un experto en la técnica (por ejemplo, técnica de ADN recombinante o métodos de escisión enzimática o química), y pueden ser seleccionados para determinar la especificidad de la misma manera por la cual los anticuerpos intactos son seleccionados.
En la divulgación, a menos que se especifique definitivamente, cuando se menciona el término "anticuerpo", el mismo incluye no solamente anticuerpos intactos, sino también fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos.
En el presente contexto, los términos "MAb" y "anticuerpo monoclonal" se refieren a un anticuerpo o fragmento de un anticuerpo de una población de moléculas de anticuerpos altamente homólogas, es decir, una población de moléculas de anticuerpos completamente idénticas, excepto por la mutación natural que puede ocurrir espontáneamente. Un anticuerpo monoclonal tiene una elevada especificidad para un único epítopo de un antígeno. El anticuerpo policlonal, relativo al anticuerpo monoclonal, generalmente comprende al menos dos o más anticuerpos diferentes que generalmente reconocen diferentes epítopos en un antígeno. Los anticuerpos monoclonales generalmente se obtienen por la técnica de hibridoma reportada, por primera vez, por Kohler et al. (Nature, 256:495, 1975), y también se pueden obtener por la técnica de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567).
En el presente contexto, los anticuerpos monoclonales mencionados con sus números son idénticos a los anticuerpos monoclonales obtenidos de los hibridomas con los mismos números. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales HBs-E6F6 (E6F6, en forma abreviada), HBs-E7G11 (E7G11, en forma abreviada), HBs-G12f5 (G12F5, en forma abreviada) y HBs-E13C5 (E13C5, en forma abreviada) son idénticos a los anticuerpos obtenidos de la línea celular de hibridoma HBs-E6F6 (E6F6, en forma abreviada) o su subclón o célula progenie, HBs-E7G11 (E7G11, en forma abreviada) o su subclon o célula progenie, HBs-G12F5 (G12F5, en forma abreviada) o su subclon o célula progenie, y HBs-E13C5 (E13C5, en forma abreviada) o su subclon o célula progenie, respectivamente.
En el presente contexto, el término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo tal, en el que una parte de su cadena ligera y/o pesada es derivada de un anticuerpo (que puede originarse de una especie específica o pertenece a un tipo o subtipo de anticuerpo específico), y la otra parte de su cadena ligera y/o pesada es derivada de otro anticuerpo (que puede originarse de una especie idéntica o diferente o pertenece a un tipo o subtipo de anticuerpo idéntico o diferente), siempre que el anticuerpo todavía conserve la actividad de unión al antígeno de interés (Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567 concedida a Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).
En el presente contexto, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo en el que todas las regiones CDR o una parte de las regiones CDR de la inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) están reemplazadas por las regiones CDR de un anticuerpo no humano (anticuerpo donante), donde el anticuerpo donante puede ser un anticuerpo no humano (por ejemplo, ratón, rata o conejo) que tenga la especificidad, afinidad o reactividad esperada. Además, algunos aminoácidos de las regiones de estructura (FR) de un anticuerpo receptor también pueden ser reemplazados por los correspondientes residuos de aminoácidos de un anticuerpo no humano, o residuos de aminoácidos de otro anticuerpo, con el fin de mejorar u optimizar aún más las propiedades del anticuerpo. Con respecto a los contenidos más detallados relacionados con los anticuerpos humanizados, véase, por ejemplo, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); y Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000).
En el presente contexto, el término "anticuerpo de neutralización" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que puede eliminar o reducir significativamente la virulencia (por ejemplo, la capacidad de infectar células) de los virus de interés.
En el presente contexto, el término "epítopo" se refiere a una porción del antígeno a la que se une específicamente una inmunoglobulina o un anticuerpo. "Epítopo" también se conoce como "determinante antigénico". Epítopo o determinante antigénico generalmente consiste en grupos de superficie químicamente activos de una molécula tales como aminoácidos, carbohidratos o cadenas laterales de azúcar, y generalmente tiene una estructura tridimensional específica y una característica de carga específica. Por ejemplo, un epítopo generalmente comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos consecutivos o no consecutivos en una conformación estérica única, que puede ser "lineal" o "conformacional". Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). En un epítopo lineal, todos los sitios de interacción entre una proteína y una molécula de interacción (por ejemplo, un anticuerpo) están presentes linealmente a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína. En un epítopo conformacional, los sitios de interacción se extienden sobre los residuos de aminoácidos que están separados entre sí en una proteína.
En el presente contexto, el término "péptido epítopo" se refiere al fragmento de péptido en el antígeno que actúa como epítopo. En algunas condiciones, el péptido epítopo solo puede ser reconocido/unido específicamente por un anticuerpo contra el epítopo. En las proteínas recombinantes de la invención, el péptido epítopo es un polipéptido que se fusiona a una proteína portadora para facilitar que el epítopo sea reconocido específicamente por un anticuerpo. En el presente contexto, el término "proteína portadora" se refiere a una proteína que puede actuar como portadora del péptido epítopo, es decir, el péptido epítopo puede ser insertado en la proteína en una posición específica (por ejemplo, interna, extremo N-terminal o extremo C-terminal de la proteína), para que el péptido epítopo pueda ser presentado y por lo tanto pueda ser reconocido por un anticuerpo o sistema inmunitario. Estas proteínas portadoras son bien conocidas por un experto en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la proteína L1 del VPH (en la que el péptido epítopo puede estar insertado entre los aminoácidos de las posiciones 130 a 131 o los aminoácidos de las posiciones 426 a 427 de la proteína, véase Slupetzky, K. et al., partículas similares al virus del papiloma quimérico que expresan un epítopo extraño en los bucles superficiales de la cápside[J]. J Gen Virol, 2001, 82: 2799-2804 ; Varsani, A. et al., Chimeric human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minor capsid protein of HPV-6 and HPV-16[J]. J Virol,2003, 77: 8386-8393), el antígeno del núcleo del VHB (los aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de la proteína pueden ser reemplazados por el péptido epítopo, véase, Koletzki, D., et al. HBV core particles allow the insertion and surface exposure of the entire potentially protective region of Puumala hantavirus nucleocapsid protein [J]. Biol Chem,1999, 380: 325-333), la proteína del núcleo del virus de la hepatitis en marmotas (los aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de la proteína pueden ser reemplazados por el péptido epítopo, véase, Sabine Konig, Gertrud Beterams y Michael Nassal, J. Virol.
1998, 72(6):4997), y proteína CRM197 (el péptido epítopo puede estar ligado al extremo terminal N o al extremo terminal C de la proteína o a un fragmento de la misma). Opcionalmente, se puede utilizar un ligante (por ejemplo, un ligante rígido o flexible) entre un péptido epítopo y una proteína portadora para promover sus pliegues, respectivamente.
Los anticuerpos pueden ser seleccionados en función de la competitividad de la unión al mismo epítopo mediante técnicas convencionales conocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un estudio sobre la competencia o la competencia cruzada para obtener anticuerpos que compitan o compitan en forma cruzada entre sí para unirse a antígenos (por ejemplo la proteína HBsAg). Los métodos de alto rendimiento para la obtención de anticuerpos de unión al mismo epítopo, que se basan en su competencia cruzada, se describen en una solicitud de patente internacional WO 03/48731. Por lo tanto, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno (es decir, las porciones de unión al antígeno) de los mismos, que compiten con los anticuerpos monoclonales como se desvelan a continuación en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo monoclonal E6F6) por la unión a los mismos epítopos en la proteína HBsAg, pueden obtenerse mediante técnicas convencionales conocidas por un experto en la técnica.
En el presente contexto, el término "aislado" se refiere a un estado obtenido del estado natural por medios artificiales. Si una determinada sustancia o componente "aislado" está presente en la naturaleza, es posible porque su entorno natural cambia, o la sustancia está aislada del entorno natural, o ambos. Por ejemplo, un cierto polinucleótido o polipéptido no aislado existe naturalmente en un cierto cuerpo animal vivo, y el mismo polinucleótido o polipéptido con una alta pureza aislado de tal estado natural se llama polinucleótido o polipéptido aislado. El término "aislado" no excluye la sustancia artificial mixta o sintetizada ni otras sustancias no puras que no afectan a la actividad de la sustancia aislada.
En el presente contexto, el término "sistema de expresión de E. coli" se refiere a un sistema de expresión que consiste en E. coli (cepa) y un vector, en el que la E. coli (cepa) se deriva de las cepas disponibles comercialmente, incluidas, entre otras: GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), y BLR (DE3).
En el presente contexto, el término "vector" se refiere a un vehículo de ácido nucleico que puede tener un polinucleótido insertado en el mismo. Cuando el vector permite la expresión de la proteína codificada por el polinucleótido insertado en el mismo, el vector se denomina vector de expresión. El vector puede tener los elementos de material genético transportados expresados en una célula huésped por transformación, transducción o transfección en la célula huésped. Los vectores son bien conocidos por un experto en la técnica, incluyendo, meramente a título enunciativo, a plásmidos, fagos, cósmidos, cromosomas artificiales tal como el cromosoma artificial de levadura (YAC), el cromosoma artificial bacteriano (BAC) o el cromosoma artificial derivado de P1 (PAC); fago tal como A fago o fago M13 y virus animal. Los virus animales que pueden usarse como vectores incluyen, entre otros, retrovirus (incluyendo lentivirus), adenovius, virus adeno-asociado, virus del herpes (tal como el virus del herpes simple), virus de la varicela, baculovirus, virus del papiloma, papovavirus (tal como SV40). Un vector puede comprender múltiples elementos para controlar la expresión, incluyendo, meramente a título enunciativo, una secuencia promotora, una secuencia de iniciación de la transcripción, una secuencia potenciadora, un elemento de selección y un gen reportero. Además, un vector puede comprender el origen de la replicación.
En el presente contexto, el término "célula huésped" se refiere a una célula en la que se puede introducir un vector, incluyendo, entre otras, la célula procariota tal como E. coli o Bacillus subtilis, y una célula fúngica tal como la célula de levadura o Aspergillus, célula de insectos tal como la célula S2 Drosophila o Sf9, o célula animal tal como fibroblasto, célula CHO, célula COS, célula NSO, célula HeLa, célula BHK, célula HEK 293 o célula humana.
En el presente contexto, el término "identidad" se refiere al grado de coincidencia entre dos polipéptidos o entre dos ácidos nucleicos. Cuando dos secuencias para la comparación tienen la misma subunidad monomérica de base o aminoácido en un sitio determinado (por ejemplo, cada una de las dos moléculas de ADN tiene una adenina en un sitio determinado, o cada uno de los dos polipéptidos tiene una lisina en un sitio determinado), las dos moléculas son idénticas en el sitio. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de sitios idénticos compartidos por las dos secuencias sobre el número total de sitios para la comparación x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 sitios de dos secuencias coinciden, estas dos secuencias tienen una identidad del 60%. Por ejemplo, las secuencias de ADN: CTGACT y CAGGTT comparten una identidad del 50% (3 de los 6 sitios coinciden). Por lo general, la comparación de dos secuencias se lleva a cabo de manera que se produzca la máxima identidad. Tal alineación puede ser llevarse a cabo usando un programa informático tal como el programa Align (DNAstar, Inc.) que se basa en el método de Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de brecha de 12 y una penalización por brecha de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
En el presente contexto, el término "sustitución conservadora" se refiere a las sustituciones de aminoácidos que no afectarían negativamente o cambiarían las propiedades esenciales de una proteína/polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, una sustitución conservadora puede ser introducida por técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen sustituciones en las que un residuo de aminoácido es sustituido con otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar, por ejemplo, un residuo física o funcionalmente similar (tal como, que tiene un tamaño, forma, carga, propiedad química similares incluyendo la capacidad de formar enlace covalente o enlace de hidrógeno, etc.) al residuo de aminoácidos correspondiente. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales alcalinas (por ejemplo, lisina, arginina e histidina), aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), aminoácidos que tienen cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), aminoácidos con cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), aminoácidos con cadenas laterales D-ramificadas (tales como treonina, valina, isoleucina) y aminoácidos con cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un residuo de aminoácidos correspondiente es sustituido preferentemente con otro residuo de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales. Los métodos para identificar las sustituciones conservadoras de aminoácidos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng.
12(10): 879-884 (1999); y Burks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997),
En el presente contexto, el término "inmunogenicidad" se refiere a la capacidad de estimular la formación de anticuerpos específicos o linfocitos sensibilizados en organismos. No solo se refiere a la propiedad de un antígeno de estimular a un inmunocito específico para que se active, prolifere y se diferencie a fin de generar finalmente una sustancia efectora inmunológica tal como el anticuerpo y el linfocito sensibilizado, sino que también se refiere a la respuesta inmunológica específica que el anticuerpo o el linfocito T sensibilizado puede formarse en el sistema inmunitario de un organismo después de estimularlo con un antígeno. La inmunogenicidad es la propiedad más importante de un antígeno. El hecho de que un antígeno pueda inducir satisfactoriamente la generación de una respuesta inmunológica en un huésped depende de tres factores, las propiedades de un antígeno, la reactividad de un huésped y los medios de inmunización.
En el presente contexto, el término "unión específica" se refiere a la unión de dos moléculas de una manera no aleatoria, tal como la reacción entre un anticuerpo y el antígeno al que se dirige. En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno (o un anticuerpo específico para un antígeno) se refiere a un anticuerpo que se une al antígeno con una afinidad (Kd) inferior a aproximadamente 10'5 M, por ejemplo, inferior a aproximadamente 10'6 M, 10'7 M, 10'8 M, 10'9 M o 10'1° M o inferior.
En el presente contexto, el término "Kd" se refiere a una constante de disociación de una interacción anticuerpoantígeno específica, que se utiliza para describir la afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno. Generalmente, un anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal E6F6) se une a un antígeno (por ejemplo, HBsAg) con una Kd inferior a aproximadamente 10'5 M, por ejemplo, inferior a aproximadamente 10'6 M, 10'7 M, 10'8 M,10'9 M o 10'10 M o inferior, determinada por, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) en el dispositivo BIACORE.
En el presente contexto, el término "anticuerpo monoclonal" y el término "MAb" tienen los mismos significados y se utilizan indistintamente; el término "anticuerpo policlonal" y el término "PAb" tienen los mismos significados y se utilizan indistintamente; el término "polipéptido" y "proteína" tienen los mismos significados y se utilizan indistintamente. Además, en la invención, los aminoácidos son representados por códigos de una sola letra o por códigos de tres letras. Por ejemplo, la alanina puede estar representada por A o Ala.
En el presente contexto, el término "hibridoma" y el término "línea celular de hibridoma" pueden utilizarse indistintamente. Cuando se mencionan el término "hibridoma" y el término "línea celular de hibridoma", también se incluyen las células subclones y progenie de hibridoma. Por ejemplo, cuando se menciona la línea celular E6F6 del hibridoma, también se refiere a la célula subclon y progenie de la línea celular E6F6 del hibridoma.
En el presente contexto, el término "un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador y/o excipiente farmacológicamente y/o fisiológicamente compatible con un sujeto y un agente activo, que es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. Editado por Gennaro AR, edición número 19 Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), e incluye, entre otros, un regulador del pH, tensioactivo, adyuvante y potenciador de la fuerza iónica. Por ejemplo, el regulador del pH incluye, entre otros, un tampón de fosfato; el tensioactivo incluye, entre otros, tensioactivo catiónico, aniónico o no iónico, por ejemplo, Tween-80; el potenciador de la fuerza iónica incluye, entre otros, cloruro sódico.
En el presente contexto, el término "adyuvante" se refiere a un inmunopotenciador no específico, que puede aumentar la respuesta inmunitaria a un antígeno o cambiar el tipo de respuesta inmunitaria en un organismo cuando se administra junto con el antígeno al organismo o se administra al organismo por adelantado. Existen diversos adyuvantes, incluidos, entre otros, los adyuvantes de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio), los adyuvantes de Freund (por ejemplo, el adyuvante completo de Freund y el adyuvante incompleto de Freund), la bacteria coryne parvum, el lipopolisacárido, las citocinas y similares. El adyuvante de Freund es el adyuvante más comúnmente utilizado en experimentos con animales en la actualidad. El adyuvante de hidróxido de aluminio se usa más comúnmente en ensayos clínicos.
En el presente contexto, el término "vacuna de proteínas" se refiere a una vacuna basada en polipéptido, que opcionalmente comprende un adyuvante. Los polipéptidos en las vacunas pueden obtenerse mediante técnicas de ingeniería genética o mediante métodos de síntesis química. En el presente contexto, el término "vacuna de ácido nucleico" se refiere a una vacuna basada en ADN o ARN (tal como el plásmido, por ejemplo, el plásmido de expresión), que opcionalmente comprende un adyuvante.
En el presente contexto, el término "una cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que es suficiente para lograr o al menos parcialmente lograr el efecto esperado. Por ejemplo, una cantidad eficaz para prevenir una enfermedad (tal como la infección por el VHB o las enfermedades asociadas con la infección por el v Hb ) se refiere a una cantidad eficaz para prevenir, suprimir o retrasar la aparición de una enfermedad (tal como la infección por el VHB o las enfermedades asociadas con la infección por el VHB). Una cantidad eficaz para tratar una enfermedad se refiere a una cantidad eficaz para curar o al menos bloquear parcialmente una enfermedad y su complicación en un paciente que tiene la enfermedad. La determinación de tal cantidad eficaz está dentro de la capacidad de un experto en la técnica. Por ejemplo, una cantidad eficaz para un uso terapéutico depende de la gravedad de una enfermedad que se va a tratar, el estado general del sistema inmunitario en un paciente, las condiciones generales de un paciente, tales como la edad, el peso y el sexo, los medios de administración de fármacos, las terapias adicionales utilizadas simultáneamente, y similares.
En el presente contexto, la función biológica de las proteínas recombinantes según la invención incluye, meramente a título enunciativo, uno o más de:
1) unión específica al anticuerpo E6F6, E7G11, G12F5 o E13C5;
2) capacidad de reducir el nivel sérico de ADN del VHB y/o HBsAg en un sujeto;
3) capacidad de inducir una respuesta de anticuerpos de eliminación eficaz de HBV y de las células infectadas por el VHB in vivo; y
4) capacidad de tratar la infección por VHB o las enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, hepatitis B) en un sujeto.
Se desvela en lo sucesivo en el presente documento un péptido epítopo aislado que consiste en los residuos de aminoácidos de las posiciones 119-125 de la proteína HBsAg, o un mutante del mismo, donde el mutante difiere del péptido epítopo simplemente por la sustitución conservadora de uno o varios (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) residuos de aminoácidos y retiene la función biológica del péptido epítopo. Los residuos de aminoácidos de las posiciones 119­ 125 de la proteína HBsAg se muestran en SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos del mutante se muestra en SEQ ID NO: 2.
Se desvela además un péptido epítopo aislado que consiste en los residuos de aminoácidos de las posiciones 113­ 135 de la proteína HBsAg, o un mutante del mismo, donde el mutante difiere del péptido epítopo simplemente por la sustitución conservadora de uno o varios (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9) residuos de aminoácidos y retiene la función biológica del péptido epítopo. Los residuos de aminoácidos de las posiciones 113-135 de la proteína HBsAg se muestran en SEQ ID NO: 6.
Se desvela además un péptido epítopo aislado que consiste en 4-38 residuos de aminoácidos consecutivos de la proteína HBsAg y que comprende los residuos de aminoácidos de las posiciones 121-124 de la proteína HBsAg o un mutante del mismo, donde el mutante difiere del péptido epítopo simplemente por la sustitución conservadora de uno o varios (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9) residuos de aminoácidos y retiene la función biológica del péptido epítopo. Los residuos de aminoácidos de las posiciones 121-124 de la proteína HBsAg se muestran en SEQ ID NO: 10.
Se desvela además un péptido epítopo que consiste en no más de 38, por ejemplo, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 residuos de aminoácidos consecutivos de la proteína HBsAg. Por ejemplo, el péptido epítopo o el mutante del mismo puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-7 y 10.
En la invención, el polipéptido como se expone en la SEQ ID NO: 6 está fusionado a una proteína portadora para aumentar la inmunogenicidad del polipéptido, de modo que el polipéptido pueda ser reconocido por el sistema inmunitario en los organismos e inducir una respuesta de anticuerpos de eliminación eficaz de los virus y células infectadas por virus in vivo.
Por lo tanto, la invención proporciona una proteína recombinante que comprende el polipéptido como se expone en la SEQ ID NO: 6 y una proteína portadora para su uso en el tratamiento de un sujeto infectado con VHB al reducir el nivel en suero de ADN de VHB y/o HBsAg en el sujeto, donde la proteína recombinante no es una proteína natural o un fragmento de la misma. En la proteína recombinante, el polipéptido del mismo puede estar ligado al extremo terminal N o al extremo terminal C de la proteína portadora, puede estar insertado en la proteína portadora o puede ser utilizado para reemplazar una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína portadora, dependiendo de la proteína portadora utilizada. Además, opcionalmente, el péptido epítopo o mutante del mismo puede estar ligado a la proteína portadora a través de un ligante (un ligante rígido o flexible, por ejemplo, (GGGGS)3). La proteína recombinante para su uso según la invención puede ser producida por cualquier método, por ejemplo, mediante un método de ingeniería genética (técnica recombinante) o mediante un método de síntesis química.
En una realización preferida, dicha proteína portadora se selecciona de un grupo que consiste en la proteína CRM197 o un fragmento de la misma, HBcAg y WHcAg.
En una realización preferida, la proteína portadora es la proteína CRM197 o un fragmento de la misma, y el polipéptido como se expone en la SEQ ID NO: 6 está ligado al extremo terminal N o al extremo terminal C de la proteína CRM197 o un fragmento de la misma, opcionalmente a través de un ligante. En una realización preferida, el fragmento de la proteína CRM197 comprende aa 1-190 (aa representa aminoácido; cuando aa se coloca antes de n, indica el aminoácido en la posición n (por ejemplo, aa 1-190 representa los aminoácidos en las posiciones 1-190); cuando aa se coloca después de n, indica que un polipéptido tiene una longitud de n aminoácidos (los mismos que aparecen más adelante)) de CRM197, por ejemplo, que comprende aa 1-389 de CRM197. En otra realización preferida, el fragmento de la proteína CRM197 consiste en aa 1-190 o aa 1-389 de CRM197 (que se designa como CRM A y CRM 389 en la invención, respectivamente).
En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos del ligante es expuesta en SEQ ID NO: 46. En una realización, la proteína recombinante según la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 79, 87 y 95.
En una realización preferida, la proteína portadora es HBcAg o un fragmento de la misma, y los aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de HBcAg son reemplazados por el polipéptido como se expone en la SEQ ID NO: 6. En una realización preferida, el polipéptido está ligado a HBcAg o a su fragmento a través de un ligante. En una realización preferida, el fragmento de HBcAg comprende o consiste en aa 1-149 de HBcAg. En una realización preferida, la proteína recombinante según la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 52 y 63.
En una realización preferida, la proteína portadora es WHcAg o un fragmento de la misma, y los aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de WHcAg son reemplazados por el polipéptido como se expone en la SEQ ID NO: 6. En una realización preferida, el polipéptido está ligado a WHcAg o a su fragmento a través de un ligante. En una realización preferida, el fragmento de WHcAg comprende o consiste en aa 1-149 de WHcAg. En una realización preferida, la proteína recombinante según la invención tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 71.
Se desvela además en el presente documento una molécula de ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o la proteína recombinante como se ha especificado anteriormente. Se desvela además un vector, que comprende dicha molécula de ácido nucleico aislado. El vector acorde puede ser un vector de clonación o un vector de expresión. En una realización preferida, el vector puede ser, por ejemplo, plásmido, cósmido, fago, y similares. El vector puede expresar el polipéptido o la proteína recombinante como se ha especificado anteriormente en un sujeto (por ejemplo, mamífero, por ejemplo humano).
Se desvela además una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico aislado o vector como se ha especificado anteriormente. Estas células huéspedes incluyen, entre otras, células procariotas tales como la célula de E. coli, y células eucariotas tales como la célula de levadura, la célula de insecto, la célula vegetal y la célula animal (tal como la célula de mamífero, por ejemplo, la célula de ratón, la célula humana, etc.). La célula puede ser una línea celular, tal como la célula 293T.
Se desvela además un método para preparar la proteína recombinante según la invención, que comprende el cultivo de la célula huésped según la invención en condiciones adecuadas, y la recuperación de la proteína recombinante según la invención del cultivo celular.
Se desvela además una vacuna de proteína, que comprende el polipéptido o la proteína recombinante como se ha especificado anteriormente, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, adyuvante). En una realización preferida, la vacuna de proteína comprende uno o más péptidos epítopos como se ha especificado anteriormente, donde dichos péptidos epítopos pueden estar separados o en tándem, modificados o no modificados, acoplados a otra proteína o no.
Se desvela además un método para tratar la infección por el VHB o las enfermedades asociadas con la infección por el VHB (por ejemplo, la hepatitis B) en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido, la proteína recombinante o la vacuna de proteína como se ha especificado anteriormente a un sujeto que lo necesite.
Se desvela además el uso del polipéptido o la proteína recombinante como se ha especificado anteriormente en la fabricación de una vacuna de proteína para tratar la infección por VHB o las enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, hepatitis B) en un sujeto.
Se desvela además el polipéptido o la proteína recombinante como se ha especificado anteriormente para tratar la infección por VHB o las enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, hepatitis B) en un sujeto. Se desvela además una vacuna genética que comprende la molécula de ácido nucleico aislado o el vector como se ha especificado anteriormente, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, adyuvante). En una realización preferida, la vacuna genética comprende ADN o ARN. En tales realizaciones, el ADN o ARN puede estar desnudo o encapsulado en una envoltura que tiene una función de entrega y/o protectora. En una realización preferida adicional, la envoltura puede ser la envoltura de adenovius, virus adeno-asociado, lentivirus, retrovirus, etc., o puede ser otro material que se sintetiza por métodos químicos y es capaz de ejercer una función similar.
Se desvela además un método para tratar la infección por VHB o las enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, la hepatitis B) en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna genética o molécula de ácido nucleico aislado o vector como se ha especificado anteriormente a un sujeto que lo necesite.
Se desvela además el uso de la molécula de ácido nucleico aislado o vector como se ha especificado anteriormente en la fabricación de una vacuna genética para tratar la infección por VHB o las enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, hepatitis B) en un sujeto.
Se desvela además la molécula de ácido nucleico aislado o vector como se ha especificado anteriormente para tratar la infección por VHB o las enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, hepatitis B) en un sujeto.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende la proteína recombinante según la invención, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, adyuvante).
Se desvela además un método para reducir el nivel sérico de ADN del VHB y/o HBsAg en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, péptido epítopo (o mutante del mismo), proteína recombinante, molécula de ácido nucleico aislado, o vector como se ha descrito anteriormente a un sujeto que lo necesite.
Se desvela además el uso del péptido epítopo (o mutante del mismo), proteína recombinante, molécula de ácido nucleico aislado, o vector como se ha descrito anteriormente, en la fabricación de una composición farmacéutica para reducir el nivel sérico de ADN del VHB y/o HBsAg en un sujeto.
La invención proporciona la proteína recombinante según la invención, para su uso en el tratamiento de un sujeto infectado con VHB al reducir el nivel sérico de ADN del VHB y/o HBsAg en un sujeto.
Se desvela además un anticuerpo monoclonal y un fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo monoclonal puede unirse específicamente al péptido epítopo como se ha especificado anteriormente.
El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo puede seleccionarse de un grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, fragmento de región determinante de complementariedad, anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv), anticuerpo de ratón, anticuerpo de conejo, anticuerpo humanizado, anticuerpo completamente humano, anticuerpo quimérico (por ejemplo, anticuerpo quimérico de ratón y ser humano) o anticuerpo biespecífico o poliespecífico.
El anticuerpo monoclonal puede unirse al péptido epítopo como se ha descrito anteriormente o proteína HBsAg con una Kd inferior a aproximadamente 10-5 M, por ejemplo, inferior a aproximadamente 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M,10-9 M o 10-10 M o inferior.
El anticuerpo monoclonal puede comprender una región distinta de CDR y la región distinta de CDR es de una especie distinta de especie murina, por ejemplo, es de anticuerpo humano.
El anticuerpo monoclonal puede reducir el nivel sérico de ADN del VHB y/o HBsAg en un sujeto.
El anticuerpo monoclonal puede obtenerse de los siguientes anticuerpos monoclonales o se selecciona de los siguientes anticuerpos:
1) el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular del hibridoma HBs-E6F6, en donde la línea celular del hibridoma HBs-E6F6 está depositada en el Centro Chino de Colección de Cultivos Tipo (CCTCC), con un número de depósito del CCTCC n.° C201270;
2) el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular del hibridoma HBs-E7G11, en donde la línea celular del hibridoma HBs-E7G11 está depositada en el Centro Chino de Colección de Cultivos Tipo (CCTCC), con un número de depósito del CCTCC n.° C201271;
3) el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular del hibridoma HBs-G12F5, en donde la línea celular del hibridoma HBs-G12F5 está depositada en el Centro Chino de Colección de Cultivos Tipo (CCTCC), con un número de depósito del CCTCC n.° C201272;
4) el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular del hibridoma HBs-E13C5, en donde la línea celular del hibridoma HBs-E13C5 está depositada en el Centro Chino de Colección de Cultivos Tipo (CCTCC), con un número de depósito del CCTCC n.° C201273.
Se desvela además en el presente documento un anticuerpo monoclonal y un fragmento de unión al antígeno del mismo, capaz de bloquear la unión del péptido epítopo según lo especificado anteriormente o la proteína HBsAg al anticuerpo producido por la línea celular del hibridoma HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5 o HBs-E13C5 en al menos un 50%, preferentemente al menos un 60%, Preferentemente al menos el 70%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90%, preferentemente al menos el 95% o preferentemente al menos el 99%, en donde la línea celular del hibridoma HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5 y HBs-E13C5 se depositan en el Centro Chino de Colección de Cultivos Tipo (CCTCC), con un número de depósito de CCTCC NO.C201270, CCTCC NO.C201271, CCTCC NO.C201272 y CCTCC NO.C201273, respectivamente.
Los epítopos reconocidos por tales anticuerpos monoclonales son idénticos o se superponen espacialmente con los epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales E6F6, E7G11, G12F5 o E13C5, de modo que dichos anticuerpos monoclonales pueden reducir la unión del anticuerpo monoclonal E6F6, E7G11, G12F5 o E13C5 al péptido epítopo según la invención o proteína HBsAg en al menos 50%, preferentemente al menos 60%, preferentemente al menos 70%, preferentemente al menos 80%, preferentemente al menos 90%, preferentemente al menos 95% o preferentemente al menos 99%.
Se puede determinar la capacidad de un anticuerpo monoclonal que se va a analizar de reducir la unión de un anticuerpo monoclonal conocido a la proteína HBsAg mediante métodos convencionales, tales como los métodos descritos en Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Un método ejemplar comprende: recubrir previamente un antígeno a una placa de micropocillos, agregar una serie de anticuerpos diluidos sin marcar que serán analizados junto con una concentración dada de un anticuerpo monoclonal marcado conocido a la placa de micropocillos recubierta previamente y llevar a cabo la incubación, y luego determinar el número de anticuerpos conocidos unidos a la placa en presencia del anticuerpo diluido de manera diferente que será analizado, después del lavado. Cuanto más fuerte sea la capacidad de un anticuerpo que será analizado de competir con un anticuerpo conocido por la unión a un antígeno al que se une el anticuerpo conocido, más débil será la capacidad del anticuerpo conocido de unirse al antígeno, y menos serán los anticuerpos conocidos que están unidos a la placa. Por lo general, los antígenos son recubiertos en una placa de micropocillos de 96 pocillos, y un anticuerpo monoclonal que se va a analizar puede ser analizado para determinar su capacidad de bloquear un anticuerpo monoclonal marcado conocido mediante un método de marcado radiactivo o un método de marcado enzimático.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante métodos para preparar hibridomas reportados por Kohler et al. (Nature 256: 495 (1975)). En primer lugar, se inmunizan ratones u otros animales huéspedes adecuados mediante inyección de inmunógeno (si es necesario, se agregan adyuvantes). Los medios de inyección de inmunógenos o adyuvantes generalmente son inyección subcutánea multipunto o inyección intraperitoneal. La preconjugación de inmunógenos con algunas proteínas conocidas (por ejemplo, albúmina sérica) puede promover la inmunogenicidad de los antígenos en un huésped. Los adyuvantes pueden ser adyuvante de Freund o MPL-TDM, etc. Después de la inmunización del animal, los linfocitos que secretan anticuerpos que se unen específicamente al inmunógeno se producen en el animal. Se recogen los linfocitos de interés y se fusionan con las células de mieloma mediante un agente de fusión adecuado (tal como el PEG), obteniendo así células de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996).
Las células de hibridoma preparadas anteriormente se siembran en un medio de cultivo adecuado y crecen en el medio, y el medio de cultivo comprende una o más sustancias capaces de inhibir el crecimiento de células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, en el caso de las células de mieloma parentales deficientes en hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el crecimiento de células deficientes en HGPRT se inhibe por la adición de sustancias tales como hipoxantina, aminopterina y timina (medio de cultivo HAT) al medio de cultivo.
Las células de mieloma preferidas deben tener una elevada velocidad de fusión, capacidad estable de secretar anticuerpos, ser sensibles al medio de cultivo HAT, y similares. La primera elección de las células de mieloma es el mieloma murino, tal como la línea celular derivada del tumor de ratón MOP-21 y MC-11 (el Centro de Distribución de Células del Instituto Salk, San Diego, California, EE. UU.), y la línea celular SP-2/0 o X63-Ag8-653 (Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection), Rockville, Maryland. EE. UU.). Además, se pueden utilizar líneas celulares del mieloma humano y del mieloma heterogéneo humano-ratón para preparar anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987).
Se utilizan medios de cultivo para el cultivo de células de hibridoma para detectar la generación de anticuerpos monoclonales contra antígenos específicos. Se pueden utilizar los siguientes métodos para determinar la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos en células de hibridoma, inmunoprecipitación o ensayos de unión in vitro, tales como radioinmunoensayo (RIA) y ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Por ejemplo, se puede utilizar el ensayo Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980) para determinar la afinidad de los anticuerpos monoclonales.
Después de determinar la especificidad, afinidad y reactividad de los anticuerpos producidos en los hibridomas, se pueden subclonar líneas celulares de interés mediante el método de dilución limitante descrito en Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1996. Un medio de cultivo adecuado puede ser DMEM o RPMI-1640, etc. Además, las células de hibridoma pueden crecer en forma de tumor de ascitis en cuerpos animales.
Mediante el uso de métodos tradicionales para la purificación de inmunoglobulinas, tales como gel de agarosa de proteína A, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, los anticuerpos monoclonales secretados por las células subclónicas pueden aislarse del cultivo celular, ascitis o suero.
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante técnicas recombinantes de ingeniería genética. Los cebadores de ácido nucleico que se unen específicamente al gen de cadena pesada y cadena ligera del MAb están sujetos a la amplificación por PCR, aislando así las moléculas de ADN que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de MAb de las células de hibridoma. Las moléculas de ADN obtenidas se insertan en un vector de expresión, se transfectan células huésped (por ejemplo células de E. coli, células COS, células CHO u otras células de mieloma que no producen inmunoglobulina) con las mismas y se cultivan en condiciones adecuadas para obtener anticuerpos de interés por expresión recombinante.
Se describe también una molécula de ácido nucleico aislado, que codifica al anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo como se ha descrito anteriormente. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden aislarse de células de hibridoma, o pueden obtenerse mediante técnicas recombinantes de ingeniería genética o métodos de síntesis química.
Se desvela además una molécula de ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anterior.
Se desvela además una molécula de ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal anterior.
Se desvela además un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislado anterior. El vector puede ser un vector de clonación o un vector de expresión.
El vector puede ser un plásmido, un cósmido, un fago, etc.
Se desvela además una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico aislado o vector como se ha descrito anteriormente. Estas células huéspedes incluyen, entre otras, células procariotas tales como la célula de E. coli, y células eucariotas tales como la célula de levadura, la célula de insecto, la célula vegetal y la célula animal (tal como la célula de mamífero, por ejemplo, la célula de ratón, la célula humana, etc.). La célula puede ser una línea celular, tal como la célula 293T.
Se desvela además un método para preparar el anticuerpo monoclonal anterior o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende el cultivo de la célula huésped según la invención en condiciones adecuadas, y la recuperación del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo según la invención del cultivo celular.
Se desvela además una línea celular de hibridoma seleccionada de
1) línea celular de hibridoma HBs-E6F6, depositada en el Centro Chino de Colección de Cultivos Tipo (CCTCC), con un número de depósito de CCTCC n.° C201270;
2) línea celular de hibridoma HBs-E7G11, depositada en el Centro Chino de Colección de Cultivos Tipo (CCTCC), con un número de depósito de CCTCC n.° C201271;
3) línea celular de hibridoma HBs-G12F5, depositada en el Centro Chino de Colección de Cultivos Tipo (CCTCC), con un número de depósito de CCTCC n.° C201272; y
4) línea celular de hibridoma HBs-E13C5, depositada en el Centro Chino de Colección de Cultivos Tipo (CCTCC), con un número de depósito de CCTCC n.° C201273.
Las secuencias de aminoácidos y/o las secuencias de nucleótidos de la región variable de cadena pesada, la región variable de cadena ligera, la región variable de cadena pesada CDR y la región variable de cadena ligera CDR comprendidas en diversos anticuerpos pueden determinarse a partir de los anticuerpos monoclonales E6F6, E7G11, G12F5 y E13C5 mediante métodos convencionales.
Se desvela además un kit que comprende el anticuerpo monoclonal anterior o fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo también puede comprender un marcador detectable. El kit puede comprender además un segundo anticuerpo que se une específicamente al anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo. Preferentemente, el segundo anticuerpo comprende además un marcador detectable. Tales marcadores detectables, los cuales son bien conocidos por un experto en la técnica, incluyen, entre otros, radioisótopo, sustancia fluorescente, sustancia luminiscente, sustancia cromófora y enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante), etc.
Se desvela además un método para detectar la presencia o el nivel de proteína HBsAg en una muestra, que comprende el uso del anticuerpo monoclonal anterior o fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además un marcador detectable. El método puede comprender además el uso de un segundo anticuerpo que tiene un marcador detectable para detectar el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo. El método puede utilizarse con fines diagnósticos o no diagnósticos (por ejemplo, dicha muestra es una muestra celular, en lugar de una muestra de un paciente).
Se desvela además un método para diagnosticar si un sujeto está infectado por VHB, que comprende el uso del anticuerpo monoclonal anterior o fragmento de unión a antígeno del mismo para detectar la presencia de proteína HBsAg en una muestra del sujeto. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender además un marcador detectable. El método puede comprender además el uso de un segundo anticuerpo que tiene un marcador detectable para detectar el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo.
Se desvela además el uso del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo en la fabricación de un kit para detectar la presencia o nivel de HBsAg en una muestra o para diagnosticar si un sujeto está infectado por el VHB.
Se desvela además una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal anterior o fragmento de unión a antígeno del mismo, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Se desvela además un método la prevención o el tratamiento de la infección por VHB o enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, hepatitis B) en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad profilácticamente o terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal anterior o fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición farmacéutica en un sujeto que lo necesita.
Se desvela además el uso del anticuerpo monoclonal anterior o fragmento de unión a antígeno del mismo en la fabricación de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la infección por VHB o enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, hepatitis B) en un sujeto.
Se desvela además el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para la prevención o el tratamiento de la infección por VHB o enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, hepatitis B) en un sujeto.
Se desvela además un método para la reducción del nivel sérico del ADN del VHB y/o HBsAg en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal anterior o fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto que lo necesita. Se desvela además el uso del anticuerpo monoclonal anterior o fragmento de unión a antígeno del mismo en la fabricación de un medicamento para reducir el nivel sérico de ADN del VHB y/o HBsAg en un sujeto.
La vacuna (vacuna proteica y vacuna génica), el medicamento y la composición farmacéutica proporcionados en lo anterior pueden usarse solos o en combinación, o pueden usarse en combinación con otro agente farmacéuticamente activo (por ejemplo, agentes de interferón, tal como interferón o interferón pegilado).
Efectos ventajosos de la invención
En comparación con la técnica anterior, la proteína recombinante que comprende el polipéptido como se expone en la SEQ ID NO: 6 tiene ventajas significativas. En particular, la proteína recombinante según la invención puede inducir respuesta a anticuerpo con respecto a la eliminación eficaz de VHB y células infectadas por VHB, y, de este modo, puede reducir el nivel sérico de ADN de VHB y/o HBsAg en un sujeto y puede ser útil en el tratamiento de infección por VHB o enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, hepatitis B) en un sujeto.
Además, la divulgación también proporciona anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que pueden reconocer específicamente y/o unirse a los péptidos epitópicos según la invención. Dichos anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de unión al antígeno pueden reducir el nivel sérico del ADN del VHB y/o HBsAg en un sujeto, pueden eliminar eficazmente las células infectadas por el VHB y el VHB in vivo, y, por lo tanto, son útiles para tratar la infección por VHB o las enfermedades asociadas con la infección por VHB (por ejemplo, hepatitis B) en un sujeto.
Los péptidos epitópicos desvelados anteriormente en el presente documento también tienen la ventaja de que los anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales contra los péptidos epitópicos pueden reducir significativamente el nivel de HBsAg y el nivel de ADN de VHB en un sujeto (por ejemplo, ratón transgénico para VHB) y seguir siendo eficaces en terapia durante un periodo más largo en comparación con anticuerpos contra otros epítopos. Los péptidos epitópicos desvelados anteriormente en el presente documento también tienen la ventaja de que, tras la inmunización de un sujeto (por ejemplo, ratón transgénico para VHB) con una vacuna que comprende el mismo principio activo, se puede reducir el nivel de HBsAg y ADN de VHB durante un tiempo largo en el sujeto.
Las realizaciones de la invención se describen en detalle por referencia a los dibujos y ejemplos. Un experto en la técnica entendería que los siguientes dibujos y ejemplos están destinados a ilustrar la invención solamente.
Descripción de los dibujos
Figura 1: Evaluación de la eficacia de diferentes anticuerpos monoclonales de ratón en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB.
Figura 2: Evaluación de la eficacia de HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5, 0,9%NS y entecavir (ETV) en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB. Los valores que se muestran son los valores promedio de 4 ratones en cada grupo experimental. Figura 2A: Disminución del nivel de HBsAg en suero después de tratar ratones transgénicos con VHB con anticuerpos monoclonales de ratón y entecavir (ETV), respectivamente; Figura 2B: Disminución del nivel de ADN de VHB en suero después de tratar ratones transgénicos con VHB con anticuerpos monoclonales de ratón y entecavir (ETV), respectivamente; Figura 2C: Cambios en el nivel de alanina aminotransferasa (ALT) en suero después de tratar ratones transgénicos con VHB con anticuerpos monoclonales de ratón y entecavir (ETV), respectivamente.
Figura 3: Cambios dinámicos en el ADN del VHB y HBsAg después de la inyección de HBs-E6F6. Figura 3A: Disminución del nivel de HBsAg en suero después de inyectar ratones transgénicos con VHB con HBs-E6F6; Figura 3B: Disminución del nivel de ADN del VHB en suero después de inyectar ratones transgénicos con VHB con HBs-E6F6.
Figura 4: Evaluación de la eficacia de anticuerpos quiméricos en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB. Figura 5: Construcción, expresión, purificación y observación microscópica electrónica de 9 proteínas recombinantes.
Figura 5A: Esquema de construcción del clon pC149-SEQ; Figura 5B: Resultados de la detección por SDS-PAGE y la observación microscópica electrónica de 9 proteínas recombinantes.
Figura 6: Análisis de epítopos de HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, y HBs-E13C5.
Figura 7: Análisis de la sensibilidad de HBs-E6F6/HBs-E7G11 a las mutaciones de aminoácidos del péptido epítopo SEQ1, donde "Ref." significa que HBsAg se utiliza como antígeno de referencia que indica reactividad del anticuerpo, "-" significa que la reactividad es idéntica a la de HBsAg, "++" significa que la reactividad es menor que la de HBsAg en 2 órdenes de magnitud (log-io), "++++" significa que la reactividad es menor que la de HBsAg en 4 órdenes de magnitud (log-io).
Figura 8: La preparación de 5 proteínas recombinantes que comprenden péptidos epítopos y evaluación de su inmunogenicidad. Figura 8A: Resultados de la detección por SDS- pAg E y la observación microscópica electrónica de dichas 5 proteínas recombinantes. Figura 8B: Cambios en el título de anticuerpos en suero después de inmunizar ratones BALB/C con dichas 5 proteínas recombinantes.
Figura 9: Evaluación de los efectos terapéuticos de los anticuerpos policlonales derivados de la sangre de ratón. Figura 10: Evaluación de los efectos de dichas 5 proteínas recombinantes en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB.
Figura 11: La preparación de 3 proteínas recombinantes que comprenden péptidos epítopos y evaluación de sus efectos terapéuticos. Figura 11A: Resultados de la detección por SDS-PAGE y la observación microscópica electrónica de dichas 3 proteínas recombinantes. Figura 11B: Cambios en el nivel sérico de HBsAg, el nivel sérico de ADN del VHB, el nivel de anticuerpos anti-HBsAg y el nivel de anticuerpos anti-proteína portadora en ratones después de inmunizar ratones transgénicos con HBV con dichas 3 proteínas recombinantes.
Figura 12: Ilustración de las proteínas recombinantes CRM197-SEQ6, CRM389-SEQ6, CRMA-SEQ6.
Información de secuencia
La información sobre las secuencias implicadas en la invención se proporciona en la siguiente tabla 1
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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Descripción del depósito de materiales biológicos
Los siguientes materiales biológicos se han depositado en el Centro Chino de Colección de Cultivos Tipo (CCTCC, Universidad de Wuhan, Wuhan, China):
1) Línea celular de hibridoma HBs-E6F6, con un número de depósito de CCTCC NO.C201270, depositada el 7 de junio de 2012.
2) Línea celular de hibridoma HBs-E7G11, con un número de depósito de CCTCC NO.C201271, depositada el 7 de junio de 2012.
3) Línea celular de hibridoma HBs-G12G5, con un número de depósito de CCTCC NO.C201272, depositada el 7 de junio de 2012.
4) Línea celular de hibridoma HBs-E13C5, con un número de depósito de CCTCC NO.C201273, depositada el 7 de junio de 2012.
Modos específicos para llevar a cabo la invención
La presente invención es ilustrada mediante referencia a los siguientes ejemplos.
A menos que se indique lo contrario, los métodos experimentales de biología molecular y los ensayos inmunológicos utilizados en la presente invención se llevan a cabo sustancialmente de acuerdo con los métodos descritos en Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (segunda edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, tercera edición, John Wiley & Sons, Inc., 1995; las enzimas de restricción se utilizan en las condiciones recomendadas por los fabricantes de los productos. Los reactivos utilizados en la presente invención, cuyos fabricantes no están indicados, son productos convencionales en la técnica o están disponibles en el mercado. Los expertos en la materia entienden que los ejemplos se usan para ilustrar la presente invención, pero no se pretende que limiten el alcance de protección de la presente invención. Ejemplo 1: Preparación y análisis de propiedades de anticuerpos monoclonales de ratón (Referencia) Objetivo: obtención de anticuerpos monoclonales de ratón específicos para HBsAg
1.1 Preparación de anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg
1.1.1 Inmunización de ratones
1.1.1.1 Preparación del inmunógeno: el inmunógeno fue una proteína recombinante del antígeno de superficie del VHB expresada por CHO (HBsAg, adquirida en BEIJING WANTAI BIOLOGY PHARMACY CO., LTD.). Se diluyó la proteína recombinante a una concentración de 0,4 mg/ml, y se mezcló con un volumen equivalente de adyuvante de Freund, para formar una emulsión de agua en aceite (un método para determinar si la solución mixta fue completamente emulsionada: se tiró una gota de la solución mixta sobre la superficie líquida del agua limpia, si la solución mixta se agregaba y no se dispersaba, se puede creer que la solución se mezclaba sustancialmente de manera homogénea). Se utilizó adyuvante completo de Freund para la inmunización primaria, y se utilizó adyuvante incompleto de Freund para la inmunización de refuerzo posterior, no se agregó ningún adyuvante para la última inmunización de refuerzo que se llevó a cabo 72 h antes de la fusión.
1.1.1.2 Inmunización fundamental de ratones: Se inmunizaron ratones hembras BALB/c de 6-8 semanas de edad mediante inyección subcutánea multipunto de dicho inmunógeno a una cantidad de 400 pl por ratón por vez, y se recogieron 200 pl de sangre venosa de globo ocular antes de cada inmunización, para el ensayo de valoración. Se realizó una inmunización de refuerzo cada dos semanas. Se utilizó ELISA indirecto para determinar el título de suero, y cuando el título de suero de ratones estaba en fase meseta, se detuvo la inmunización de ratones y la fusión se realizó después de reposo durante 2 meses.
1.1.1.3 Refuerzo final 72 h antes de la fusión: el refuerzo final del bazo se realizó 72 h antes de la fusión de la célula del bazo de ratón y la célula del mieloma de ratón, el inmunógeno para este refuerzo no incluía adyuvantes, se realizó una inyección de 100 pl de 0,5 mg/ml de proteína recombinante. Antes de la inmunización del bazo, se anestesió a los ratones con éter, se abrió la cavidad abdominal cortando la piel de la pared abdominal para tomar el bazo, se inyectó el bazo con 100 pl de antígeno verticalmente, y el corte en la piel de la pared abdominal se suturó rápidamente quirúrgicamente.
1.1.2 Preparación y selección de hibridomas fusionados
Después del refuerzo final, que se realizó 72 h antes de la fusión, se tomó el bazo de los ratones y se preparó en suspensión celular y se sometió a la fusión celular con células de mieloma de ratón Sp2/0 para obtener células de hibridoma. Antes de esto, se prepararon células alimentadoras. Durante el cultivo de células de hibridoma, un gran número de células de mieloma y esplenocitos murieron una tras otra en el medio de cultivo 1640-HAT después de la fusión, una sola célula o unas pocas células dispersas no eran fáciles de sobrevivir, y había que añadir otras células para que sobrevivieran. Las células vivas agregadas se conocen como células alimentadoras. El laboratorio utilizó macrófagos peritoneales de ratón o timocitos de ratones de 13 días de edad como células alimentadoras.
1.1.2.1 La preparación de macrófagos de ratón comprendió las siguientes etapas. (i) Un ratón BALB/c de 6 semanas murió por una dislocación cervical. Se lavó el ratón con agua corriente y se bañó en una solución de etanol al 75% durante 5 minutos; se colocó el ratón en un banco súper limpio, con el abdomen hacia arriba; se levantó la piel del abdomen del ratón con un par de pinzas; se hizo un pequeño orificio; la piel se rasgó hacia arriba y hacia abajo con un par de pinzas más grandes para asegurar una exposición suficiente del abdomen. (ii) Se utilizó un par de pinzas oftálmicas asépticas para levantar el peritoneo, se cortó un pequeño orificio en el centro del peritoneo con otro par de tijeras, se utilizó una pipeta de 1 ml para inyectar una cantidad adecuada de medio de cultivo en la cavidad abdominal a través del orificio, se agitó la solución cuidadosamente con la pipeta en la cavidad abdominal, y se aspiró el medio de cultivo y se colocó en un tubo de centrifugación. (iii) Se disolvió la solución celular de la cavidad abdominal en medio de cultivo HAT o en medio de cultivo HT, para obtener células alimentadoras macrófagas a una concentración de 2 x 105 células/ml. (iv) Se agregó 0,1 ml de células alimentadoras a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos, y se cultivó en una incubadora; o se agregó a una placa de cultivo celular de 96 pocillos después de mezclarse con células de fusión.
1.1.2.2 La preparación de timocitos de ratón comprendió las siguientes etapas. (i) Un ratón BALB/c de 13 semanas murió por una dislocación cervical. Se lavó el ratón con agua corriente y se bañó en una solución de etanol al 75% durante 5 minutos; se colocó el ratón en un banco súper limpio, con el abdomen hacia arriba. (ii) Se levantó la piel del abdomen del ratón con un par de pinzas, y se cortó la piel externa del abdomen y el pecho. (iii) Se utilizó otro par de tijeras limpias para cortar la cavidad torácica, se sacó la glándula timo de color blanco marfil con un par de pinzas, después de moler, la mezcla resultante pasó a través de un tamiz celular de malla 200 para obtener una solución de células alimentadoras tímica.
1.1.2.3. La preparación de células de mieloma de ratón comprendía las siguientes etapas. (i) La línea celular de mieloma de ratón Sp2/0-Ag14 (Sp2/0) era la célula de fusión más ideal ahora, ya que la línea celular era fácil de cultivar y tiene una velocidad elevada de fusión; sin embargo, la línea celular de mieloma Sp2/0 fue más sensible a las condiciones de cultivo en comparación con NS-1, y no creció bien cuando estaba diluida en exceso (con una densidad inferior a 3x105/ml) y con un pH básico (pH superior a 7,3). (ii) Se eligieron las células en la fase de crecimiento logarítmico para la fusión. (iii) Antes de la fusión, se retiraron las células de mieloma del matraz de cultivo a un tubo de centrifugación y se lavaron tres veces con medio de cultivo RPMI-1640 (1000 rpmx5 min); las células se volvieron a suspender en medio de cultivo RPMI-1640 y se contaron las células. iv) En general, las células de mieloma de ratón se descongelaron 5 días antes de la fusión, y se necesitaron unos 6 frascos de células de 35 cm2 Sp2/0 para cada fusión.
1.1.2.4 La preparación de esplenocitos inmunológicos comprendió las siguientes etapas. (i) Se utilizaron ratones BALB/C para fusionarse, se les quitaron los globos oculares y los ratones se desangraron hasta morir, la sangre recogida se utilizó para preparar antisuero, que se utilizó como control positivo para la detección de anticuerpos. Se lavaron los ratones con agua corriente y se bañaron en una solución de etanol al 75% durante 5 minutos; se colocó a los ratones en un banco súper limpio, con el brazo derecho recostado. (ii) Se abrió la cavidad abdominal y se extrajo el bazo mediante una operación aséptica, se cortó el bazo en pequeños trozos, y los pequeños trozos se colocaron en un tamiz celular de malla 200 y se exprimieron y molieron con una varilla de molienda (émbolo) mientras se agregaba el medio de cultivo RPMI-1640 en forma de gota con un soplete. (iii) Se añadió una cantidad adecuada de medio de cultivo RPMI-1640, y la mezcla se mantuvo en reposo durante 3 a 5 minutos, los 2/3 superiores de la suspensión se trasladaron a un tubo de centrifugación de plástico de 50 ml; la operación se repitió 2 o 3 veces. (iv) las células se lavaron tres veces con medio de cultivo RPMI-1640 (1000 rpm310 min). (v) las células se volvieron a suspender en medio de cultivo RPMI-1640 y se contó el número de células.
1.1.2.5 La preparación de hibridomas por fusión con el fusógeno PEG comprendió las siguientes etapas. (i) Antes de la fusión, 1 ml de PEG-1500 y 10 ml de medio de cultivo sin suero RPMI-1640 y 200 ml de medio completo se precalentaron a 37 °C. (ii) Las células de mieloma preparadas y los esplenocitos se mezclaron en un tubo de centrifugación de 50 ml (1x108 esplenocitos 1x107 células de mieloma, aproximadamente 10:1), y se centrifugaron a 1500 rpmx8 min; después de la centrifugación, el tubo se movió en la parte inferior para que las células se aflojaran y se pegaran. (iii) Se utilizó una pipeta de succión de 1 ml para extraer 0,8 ml (1x108 esplenocitos 0,8 ml de PEG) a un tubo de centrifugación con agitación leve, y la adición de PEG se terminó en 60 segundos, seguida de la adición de 10 ml de medio completo RPMI-1640 que se precalentó a 37 °C, con agitación leve. Finalmente, se agregó el medio de cultivo RPMI-1640 a 40 ml y se realizó centrifugación a 1000 rpm x 5 min. (iv) Se descartó el sobrenadante, y se utilizó una pequeña cantidad de medio de cultivo de HT para expulsar las células cuidadosamente, y se retiraron las células a un medio preparado de cultivo de HT y se agregaron a una placa de cultivo celular de 96 pocillos, a 0,1 ml por pocillo; y se cultivaron en una incubadora de CO2. (v) Después de 12 h, se preparó una cantidad adecuada de medio completo HAT, y se agregó 0,1 mL del medio a cada pozo; 5 días más tarde, se utilizó el medio completo HT para reemplazar entre el 50 y el 100% del sobrenadante celular en los pocillos; aproximadamente 9 a 14 días más tarde, se tomó el sobrenadante para su detección.
1.1.2.6 Selección de hibridomas: mediante selección por ELISA indirecto, se recubrió la placa con el antígeno recombinante HBsAg a 100 ng/pocillo, se agregó un sobrenadante celular de 50 uL y se escogieron pocillos con clones positivos.
1.1.2.7 Clonación de células de hibridoma: se utilizó un ensayo de dilución limitante, en primer lugar se diluyeron las células hasta un gradiente de concentración determinado y luego se sembraron a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos, con una célula crecida en cada pocillo en la medida de lo posible. La línea de células positivas monoclonales de hibridoma generalmente tuvo que clonarse repetidamente de 2 a 3 veces, y se consideró como una línea de clones estable hasta alcanzar un 100% de positividad.
1.1.3 Producción de ascitis de MAb
Se utilizaron 2-3 ratones BALB/c y se inyectaron 0,5 ml de saxol en la cavidad abdominal. Después de 1 semana, se centrifugaron las células de hibridoma en fase de crecimiento logarítmico a 1000 rpm durante 5 minutos, y se descartó el sobrenadante. Se suspendieron las células de hibridoma en medio de cultivo sin suero, y se ajustó la cantidad de células a (1-2)3106/mL, y se inyectaron 0,5 ml de la suspensión en la cavidad abdominal de cada ratón.
7-10 días más tarde, los ratones murieron por una dislocación cervical cuando la cavidad abdominal se infló, obviamente. Se lavaron los ratones con agua corriente, se sumergieron y se bañaron en etanol al 75% durante 5 min. El abdomen del ratón estaba hacia arriba, y se fijaron las cuatro extremidades en una mesa de disección con agujas de jeringa. Se levantó la piel del abdomen del ratón con un par de pinzas, se cortó un pequeño orificio, y luego se cortó la piel de ambos lados al dorso del ratón. Se rasgó la piel hacia arriba y hacia abajo con un par más grande de pinzas para asegurar suficiente exposición del abdomen. Se utilizó un par de pinzas oftálmicas asépticas para levantar el peritoneo, se cortó un pequeño orificio en el centro del peritoneo y luego se utilizó una pipeta de 1 ml para tomar todas las ascitis de la cavidad abdominal. Se mezclaron las ascitis recolectadas y se centrifugaron en un tubo de centrifugación a 3000 rpm durante 20 min. Se recolectó el sobrenadante después de la centrifugación.
1.1.4 Purificación de ascitis de MAb
Después de la precipitación con sulfato de amonio y la cromatografía de afinidad con empleo de proteína A (comprada a US GE Co.), se obtuvieron anticuerpos monoclonales purificados.
1.2 Análisis de las propiedades de los anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg
1.2.1 Síntesis de polipéptidos
Se utilizó la secuencia de VHB (ID de GenBank: AAF24729.1) como secuencia de referencia, y se sintetizaron 27 polipéptidos (sintetizados por XiaMen Jingju Biology Science Co., Ltd.). Dichos 27 polipéptidos (S1-S27) en conjunto cubrieron 226 aminoácidos de longitud completa de HBsAg. En la Tabla 2 se muestra la información sobre los polipéptidos S1-S27. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de HBsAg fue expuesta en SEQ ID NO: 42.
Tabla 2: Información sobre polipéptidos S1-S27
Nombre Posición de Secuencia de aminoácidos
aminoácidos
S1 HBsAg-aa1-aa15 MENIASGLLGPLLVL
S2 HBsAg-aa9-aa23 LGPLLVLQAGFFLLT
S3 HBsAg-aa17-aa31 AGFFLLTKILTIPQS
S4 HBsAg-aa25-aa39 ILTIPQSLDSWWTSL
S5 HBsAg-aa33-aa47 DSWWTSLNFLGGTPV
S6 HBsAg-aa41-aa55 FLGGTPVCLGQNSQS
S7 HBsAg-aa49-aa63 LGQNSQSQISSHSPT
S8 HBsAg-aa57-aa71 ISSHSPTCCPPICPG
S9 HBsAg-aa65-aa79 CPPICPGYRWMCLRR
S10 HBsAg-aa73-aa87 RWMCLRRFIIFLCIL
S11 HBsAg-aa81-aa95 IIFLCILLLCLIFLL
S12 HBsAg-aa89-aa103 LCLIFLLVLLDYQGM
S13 HBsAg-aa97-aa111 LLDYQGMLPVCPLIP
S14 HBsAg-aa105-aa119 PVCPLIPGSSTTSTG
S15 HBsAg-aa113-aa127 SSTTSTGPCKTCTTP
S16 HBsAg-aa121-aa135 CKTCTTPAQGTSMFP
S17 HBsAg-aa129-aa143 QGTSMFPSCCCTKPT
S18 HBsAg-aa137-aa151 CCCTKPTDGNCTCIP
S19 HBsAg-aa145-aa159 GNCTCIPIPSSWAFA
___________________ (continuación)__________________
Nombre Posición de Secuencia de aminoácidos
aminoácidos
520 HBsAg-aa153-aa167 PSSWAFAKYLWEWAS
521 HBsAg-aa161-aa175 YLWEWASVRFSWLSL
522 HBsAg-aa169-aa183 RFSWLSLLVPFVQWF
523 HBsAg-aa177-aa191 VPFVQWFVGLSPTVW
524 HBsAg-aa185-aa199 GLSPTVWLSVIWMMW
525 HBsAg-aa193-aa207 SVIWMMWFWGPSLYN
526 HBsAg-aa201-aa215 WGPSLYNILSPFMPL
527 HBsAg-aa209-aa226 LSPFMPLLPIFFCLWVYI
1.2.2 Ensayo sobre la reactividad de anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg con polipéptidos S1-S27 (1.2.2.1) Preparación de placas de reacción
Se diluyeron los polipéptidos con amortiguador CB de 50 mM a pH9,6 (amortiguador NaHCO3/Na2CO3, una concentración final de 50 mM, pH 9,6) hasta una concentración final de 1 pg/mL; a cada pocillo de una placa de ELISA de 96 pocillos, se agregaron 100 pL de solución de recubrimiento, se llevó a cabo el recubrimiento a 2 ~ 8°C durante 16 ~ 24 h, y luego se realizó a 37°C durante 2 h. Se lavó la placa con solución de PBST (PB7.4 20 mM, NaCl 150 mM , 0,1% Tween 20) una vez; luego se agregaron 200 pL de solución de bloqueo (amortiguador a pH 7,4, Na2HPO4/NaH2PO420 mM que contenía suero bovino fetal al 20% y caseína al 1%) a cada pocillo, y se llevó a cabo el bloqueo a 37°C durante 2 h; se descartó la solución de bloqueo. Después del secado, se empaquetó la placa en una bolsa de papel de aluminio y se almacenó a 2-8 °C para su uso posterior.
(1.2.2.2) ELISA de anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg
Se diluyeron 25 anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg obtenidos en 1.1 con solución de PBS que contenía suero de ternero recién nacido al 20% a una concentración de 1 pg/ml, para ELISA cualitativo.
Reacción de la muestra: Se agregó una muestra diluida de 100 pL a cada pocillo de 27 placas ELISA recubiertas con polipéptidos, y se colocaron las placas en una incubadora a 37°C durante 30 minutos.
Reacción de marcado enzimático: después de terminar la etapa de reacción de la muestra, se lavó la placa de ELISA con solución PBST (PB7.420 mM, NaCl 150 mM, 0,1%Tween20) 5 veces, se agregaron 100 pL de IgG anti­ ratón de cabra marcada con HRP (GAM) (comprada a BEIJING WANTAI BIOLOGY PHARMACY CO., LTD) a cada pocillo, y se colocó la placa en una incubadora a 37°C durante 30 minutos.
Reacción de desarrollo de color: Después de la reacción de marcado enzimático, se lavó la placa de ELISA con solución PBST (PB7.420 mM, NaCl 150 mM, 0,1% Tween20) 5 veces, se agregaron 50 pL de reactivo de desarrollo de color TMB (comprado en BEIJING WANTAI BIOLOGY PhAr MACY CO., LTD) a cada pocillo, y se colocó la placa en una incubadora a 37°C durante 15 minutos.
Detención de la reacción y lectura de valores: Después de terminar la etapa de reacción de desarrollo de color, se agregaron 50 pl de amortiguador de detención (comprado a BEIJING Wa NtAI BIOLOGY PHARMACY CO., LTD) a cada pocillo de la placa ELISA, y se leyó el valor OD450/630 con ELIASA para cada pocillo.
Determinación de la reactividad de anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg con 27 polipéptidos: se determinó la reactividad por los valores leídos. Si el valor de prueba/valor de fondo era superior a 5, la muestra se consideró positiva.
(1.2.2.3) Análisis de propiedades de reconocimiento de anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg
Los resultados se mostraron en la Tabla 3. Los tipos reconocidos por 25 anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg pueden dividirse en 5 grupos (dependiendo de las propiedades de reconocimiento), es decir, sA, sB, sC, sD, sE, donde los anticuerpos de los polipéptidos reconocidos del grupo sA S15 y S16; los anticuerpos de los polipéptidos reconocidos del grupo sB S16; los anticuerpos del grupo sC se mostraron negativos en la reacción con dichos 27 polipéptidos; los anticuerpos del grupo sD reconocieron al polipéptido S18; y los anticuerpos del grupo sE reconocieron al polipéptido S8.
Tabla 3: Análisis de propiedades de anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg Grupo Polipéptidos reconocidos Nombre de anticuerpos Subtipo de anticuerpos sA S15, S16 HBs-E7G11 IgG1
sA S15, S16 HBs-G12F5 IgG1
sA S15, S16 HBs-E6F6 IgG1
(continuación)
Grupo Polipéptidos reconocidos Nombre de anticuerpos Subtipo de anticuerpos sA S15, S16 HBs-E13C5 igG1
sA S15, S16 HBs-3E9 igG1
sA S15, S16 HBs-77D1 IgG2a
sA S15, S16 HBs-86H6 IgG2b
sA S15, S16 HBs-4D12 IgG2b
sA S15, S16 HBs-32H10 igG1
sA S15, S16 HBs-70A6 igG1
sA S15, S16 HBs-6C10 igM
sA S15, S16 HBs-61B1 igG1
sA S15, S16 HBs-37E12 IgG2b
sA S15, S16 HBs-85D12 igG1
sA S15, S16 HBs-H8D9 igG1
sA S15, S16 HBs-E11E4 igG2a
sA S15, S16 HBs-83H12 igG1
sB S16 HBs-127D7 igG1
sC no HBs-2C1 igG1
sC no HBs-S1A igG2a
sC no HBs-5F11 igG2a
sC no HBs-20A2 igG2b
sD S18 HBs-42B6 igG1
sD S18 HBs-A13A2 igG2b
sE S8 HBs-45E9 igG3
Ejemplo 2: Evaluación de la eficacia de anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB (referencia)
Objetivo: Evaluación de la eficacia de anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB
2.1 Establecimiento de ensayo cuantitativo de desnaturalización-quimioluminiscencia de HBsAg
Después del tratamiento, un gran número de anticuerpos estuvieron presentes en el suero, y por lo tanto la determinación de HBsAg podría ser alterada por complejos antígeno-anticuerpo. Por lo tanto, se necesita establecer un método para la determinación cuantitativa de HBsAg sin interferencia de anticuerpos. Los inventores hicieron lisar los complejos antígeno-anticuerpo en muestras por el método de desnaturalización para excluir la interferencia de los anticuerpos y llevar a cabo un ensayo cuantitativo preciso del HBsAg.
2.1.1 Preparación de placas de reacción
Se diluyó el anticuerpo monoclonal de ratón HBs-45E9 con amortiguador PB 4,20 mM a pH7,4 (amortiguador Na2HPO^NaH2PO4, una concentración final de 50 mM, pH 7,4) hasta una concentración final de 2 pg/mL; a cada pocillo de una placa de ELISA de 96 pocillos, se agregaron 100 pL de solución de recubrimiento, se llevó a cabo el recubrimiento a 2 ~ 8°C durante 16 ~ 24 h, y luego se realizó a 37°C durante 2 h. Se lavó la placa con solución de PBST (PB7.420 mM, NaCl 150 mM, 0,1% Tween 20) una vez; luego se agregaron 200 pL de solución de bloqueo (amortiguador a pH 7,4, Na2HPO4/NaH2PO420 mM que contenía suero bovino fetal al 20% y caseína al 1%) a cada pocillo, y se llevó a cabo el bloqueo a 37°C durante 2 h; se descartó la solución de bloqueo. Después del secado, se empaquetó la placa en una bolsa de papel de aluminio y se almacenó a 2-8 °C para su uso posterior.
2.1.2 Ensayo cuantitativo de desnaturalización-quimioluminiscencia de HBsAg
Dilución de la muestra: se diluyó el suero de ratón con una solución de PBS que contenía suero de ternero recién nacido al 20% a 2 concentraciones de gradiente, es decir, 1:30 y 1:150.
Desnaturalización de la muestra: Se mezclaron 15 pL de dicha muestra diluida con un amortiguador de desnaturalización de 7,5 pL (15% de SDS, disuelto en PB7.420 mM), se incubó la solución mixta a 37°C durante 1 h y luego se agregó a la solución mixta un amortiguador de neutralización de 90 pL (4% de CHAPS, disuelto en PB7.4 20 mM). y se mezcló la solución resultante de manera homogénea.
Reacción de la muestra: Se agregaron 100 pl de dicha muestra de solución mixta obtenida por el tratamiento de desnaturalización a la placa de reacción. Se colocó la placa en una incubadora a 37°C durante 60 minutos.
Reacción de marcado enzimático: después de terminar la etapa de reacción de la muestra, se lavó la placa de reacción quimioluminiscente con solución PBST (PB7.4 20 mM, NaCI 150 mM, 0,1%Tween20) 5 veces, se agregaron 100 pL de solución HBs-A6A7-HRP (suministrada por BEIJING WANTAI BIOLOGY PHARMACY CO., LTD) a cada pocilio, y se colocó la placa en una incubadora a 37°C durante 60 minutos.
Reacción luminosa y determinación: después de finalizar la etapa de reacción de marcado enzimático, se lavó la placa de reacción quimioluminiscente con solución PBST (PB7.420 mM, NaCl 150 mM, 0,1%Tween20) 5 veces, se añadió solución luminosa (suministrada por BEIJING WANTAI BIOLOGY PHARMACY CO., LTD) para determinar la intensidad de la luz.
La obtención de la concentración de HBsAg en una muestra a ensayar: se utilizaron sustancias estándar para el mismo experimento, y se trazó una curva estándar con los resultados de las sustancias estándar (regresión lineal de los valores de intensidad de la luz y los valores de concentración); según la curva estándar, se obtuvo la concentración de HBsAg en una muestra a ensayar por cálculo.
2.2 Ensayo cuantitativo fluorescente en tiempo real del ADN del VHB
Se adquirió el kit de ensayo cuantitativo fluorescente en tiempo real del ADN del VHB de SHANGHAI KEHUA BIO-ENGINEERING CO.LTD., y se llevó a cabo el ensayo cuantitativo fluorescente en tiempo real del ADN del VHB de acuerdo con las instrucciones del kit.
2.3 Eficacia de los anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB
Se inyectaron 25 anticuerpos obtenidos en el ejemplo 1 en la vena caudal de ratones transgénicos con VHB a una dosis única de 20 mg/kg. Se utilizaron ratones transgénicos con VHB inyectados con solución salina normal (0,9% NS) como grupo control negativo. Cada grupo incluía 4 ratones transgénicos con VHB, dos machos y dos hembras. Se tomó sangre de los ratones del plexo venoso periorbitario y se monitorearon los niveles de HBsAg y del ADN del VHB en suero de los ratones.
Los resultados se mostraron en la Figura 1. Los resultados indicaron que después de que los ratones transgénicos con VHB fueran tratados con cinco grupos de anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBsAg contra diferentes epítopos, los anticuerpos de los grupos sA y sD mostraron el efecto de un aclaramiento viral significativo; los niveles de HBsAg y de ADN del VHB disminuyeron significativamente en el suero de los ratones del grupo de tratamiento utilizando los dos grupos de anticuerpos; después del tratamiento con los otros tres grupos de anticuerpos, los niveles de HBsAg y de ADN del VHB no disminuyeron significativamente en el suero de los ratones. Entre los anticuerpos de los grupos sA y sD, los niveles de HBsAg y de ADN del VHB en suero disminuyeron en mayor medida después del tratamiento con anticuerpos del grupo sA en relación con el tratamiento con anticuerpos del grupo sD, y los cuatro anticuerpos con mayor duración de inhibición pertenecían a anticuerpos del grupo sA, que eran HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5, respectivamente.
Ejemplo 3: Eficacia y efecto secundario de los anticuerpos monoclonales de ratón del grupo sA en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB (referencia)
Objetivo: evaluar la eficacia y el efecto secundario de los anticuerpos monoclonales de ratón del grupo sA en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB, controlar la duración de la inhibición eficaz de los virus después del tratamiento con una sola dosis de un anticuerpo y controlar la ALT.
Para el experimento se eligieron cuatro anticuerpos HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5 con el mejor efecto terapéutico, según la selección del ejemplo 2, y se inyectaron en la vena caudal de ratones transgénicos con VHB a una dosis única de 20 mg/kg. Se utilizaron ratones transgénicos con VHB tratados con solución salina normal (0,9% NS) como grupo de control negativo, y se utilizaron ratones transgénicos con VHB tratados con 3,2 mg/kg/d de entecavir (ETV) administrados por vía intragástrica como grupo de control del fármaco eficaz. Cada grupo incluía 4 ratones transgénicos con VHB, dos machos y dos hembras. Se tomó sangre de los ratones del plexo venoso periorbitario y se monitorearon los niveles de HBsAg, ADN del VHB, ALT en el suero de los ratones.
De acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 2, se determinaron los niveles de HBsAg y ADN del VHB, y se determinó la ALT mediante el kit de ensayo de alanina aminotransferasa (ALT) proporcionado por BEIJING WANTAI BIOLOGY PHARMACY CO., LTD.
Los resultados del tratamiento de ratones transgénicos con VHB con HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5, 0,9%NS o entecavir (ETV) se muestran en la Figura 2 (los valores mostrados fueron los valores promedio de cuatro ratones de cada grupo experimental). Los resultados indicaron que después del tratamiento con dosis única de anticuerpos monoclonales HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5 o HBs-E13C5, los niveles de HBsAg y ADN del VHB disminuyeron significativamente en suero de ratones transgénicos con VHB, en donde el grupo de tratamiento con anticuerpos fue comparable con el grupo de tratamiento con ETV con respecto a la disminución del nivel de ADN del VHB. Por el contrario, el nivel de HBsAg no disminuyó significativamente en el suero de ratones del grupo de tratamiento con ETV, mientras que el nivel de HBsAg disminuyó significativamente en el suero del grupo de tratamiento con anticuerpos. Además, durante el tratamiento con cualquiera de los anticuerpos, no se observó aumento de la ALT.
Ejemplo 4: Cambios dinámicos en el ADN del VHB y HBsAg después de la inyección de HBs-E6F6 (referencia) Objetivo: estudiar el tiempo más corto que tardan los anticuerpos monoclonales en ejercer la máxima eficacia Se seleccionó el anticuerpo monoclonal de ratón HBs-E6F6 con el mejor efecto de cuatro anticuerpos utilizados en el ejemplo 3, y se inyectó en la vena caudal de ratones transgénicos con VHB a una dosis única de 20 mg/kg. En el experimento se utilizaron 4 ratones machos y se monitorearon los cambios dinámicos en el ADN del VHB y HBsAg en el suero de los ratones.
De acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 2, se determinaron los niveles de HBsAg y de ADN del VHB en suero.
Los resultados se mostraron en la Figura 3. Los resultados indicaron que el nivel de HBsAg y de ADN del VHB en suero de ratón disminuyó hasta el nivel máximo de inhibición dentro de 1 a 24 h después de la inyección.
Ejemplo 5: Evaluación del efecto terapéutico del anticuerpo quimérico humano-ratón HBs-E6F6 y HBs-E7G11 (referencia)
Objetivo: evaluar el efecto terapéutico de los anticuerpos quiméricos
El gen Igv de los anticuerpos HBs-E6F6 y HBs-E7G11 se ligó al gen Igc que codifica la región constante de anticuerpo humano, y se obtuvieron el anticuerpo quimérico HBs-E6F6 y el anticuerpo quimérico HBs-E7G11 mediante la expresión recombinante en células CHO y la purificación. Se inyectaron los anticuerpos quiméricos en la vena caudal de ratones transgénicos con VHB a una dosis única de 10 mg/kg. Se monitorearon los cambios dinámicos en el ADN del VHB y HBsAg en suero de ratón. Los resultados se mostraron en la Figura 4. Los resultados indicaron que tanto el anticuerpo quimérico HBs-E6F6 como el anticuerpo quimérico HBs-E7G11 pueden eliminar eficazmente HBsAg y ADN del v Hb en ratones.
Ejemplo 6: Identificación de epítopos reconocidos por anticuerpos del grupo sA (referencia)
Objetivo: Identificación de epítopos reconocidos por anticuerpos del grupo sA y determinación de la secuencia de aminoácidos núcleo reconocida
6.1 Construcción del clon pC149-SEQ
Cuando se utilizó HBcAg como proteína portadora, se podría utilizar la proteína HBcAg de longitud completa o un fragmento de la misma (por ejemplo, aa 1-149 de extremo N-terminal de la proteína HBcAg) (véase Yang Haijie et al., Construction of Peptide Display Vector Based on HBV Core Protein, JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY (CIENCIAS NATURALES), 2004.05, Vol. 43, No. 4). En este experimento, se utilizó un fragmento de la proteína HBcAg (aa 1-149) como proteína portadora para construir una serie de clones.
Se eliminó la secuencia que codifica aa79-81 de HBcAg de la secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de la proteína HBcAg (aa 1-149) por mutagénesis dirigida al sitio, se introdujeron dos ligantes por separado en los dos extremos de la deleción, se diseñó el sitio de digestión BamH I/ECOR I entre los dos ligantes, y así la secuencia que codifica la proteína portadora C149/mut (la secuencia de aminoácidos de C149/mut fue expuesta en SEQ ID NO: 43, con una estructura de HBc (1-78)-G4SG4T-GS-G4SG4-HBc (82-149); en C149/mut, se reemplazaron 3 aminoácidos (aa 79-81) de HBcAg con el ligante flexible rico en Gly, se obtuvo G4SG4T-GS-G4SG4). Se clonó la secuencia que codifica C149/mut en el vector de expresión procariótica pTO-T7 (Luo Wenxin, et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57), para obtener el plásmido recombinante pC149/mut, el cual codificaba la proteína C149/mut. Posteriormente, utilizando el sitio de digestión BamH I/EcoR I, se clonó la secuencia que codifica el polipéptido de interés (representada por SEC en la figura 5A) entre los ligantes flexibles para obtener el vector recombinante pC149-SEQ, el cual codificaba la proteína recombinante C149-SEQ (que comprende la proteína portadora C149/mut y el polipéptido de interés SEC). El diseño y la estructura del clon del vector recombinante pC149-SEQ se muestran en la figura 5A.
Las secuencias genéticas de los 9 polipéptidos mostrados en la tabla 4 se ligaron por separado al plásmido recombinante pC149/mut, para obtener 9 vectores recombinantes de pC149-SEQ (pC149-SEQ1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11), que codificaron la proteína recombinante C149-SEQ1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, respectivamente.
___________ Tabla 4: Polipéptidos de interés presentados por C149/mut___________ Nombre del polipéptido Posición del polipéptido_____ Secuencia de aminoácidos
SEQ1 HBsAg-aa119-aa125 GPCKTCT
_____________________________ (continuación)________________________
Nombre del polipéptido Posición del polipéptido_____ Secuencia de aminoácidos
SEQ3 HBsAg-aa113-aa127 STTTSTGPCKTCTTP SEQ5 HBsAg-aa121-aa129 CKTCTTPAQ
SEQ6 HBsAg-aa113-aa135 STTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFP
SEQ8 HBsAg-aa113-aa121 STTTSTGPC
SEQ9 HBsAg-aa117-aa123 STGPCKT
SEQ10 HBsAg-aa121-aa124 CKTC
SEQ11 HBsAg-aa123-aa137 TCTTPAQGNSMFPAQ 6.2 Expresión y purificación de las proteínas C149-SEQ
Se describieron la expresión y purificación de una proteína recombinante utilizando como ejemplo C149-SEQ6. (6.2.1) Obtención de cepas de expresión de alta eficacia: según el método descrito en 6.1, se construyó el vector de interés pC149-SEQ6, tras su identificación con secuenciación de ADN, se transformó el vector de interés en la cepa de E. coli ER2566 (E.coli, ER2566), para obtener una cepa de expresión.
(6.2.2) expresión de la proteína C149-SEQ6: se sembró la cepa de expresión en un matraz triangular (500 ml), y se cultivó en una mesa agitadora a 37°C hasta que la DO fue de aproximadamente 1,0. Se agregó isopropil p-D-Tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM, se indujo la expresión con agitación a 25 °C durante 6 h.
(6.2.3) Purificación de la proteína C149-SEQ6:
(6.2.3.1) Exposición a ondas ultrasónicas de bacterias: Se recolectaron las bacterias en 6.2.2 por centrifugación; las bacterias se sometieron a ondas ultrasónicas, el amortiguador de la exposición a ondas ultrasónicas comprendía los componentes: amortiguador de fosfato 20 mM (PH6,0) NaCl 300 mM.
(6.2.3.2) Purificación primaria de proteínas de interés: dado que las proteínas de interés eran termotolerantes, la mezcla sometida a ondas ultrasónicas se colocó en baño de agua a 65°C durante 30 minutos, y se recolectó el sobrenadante después de la centrifugación. Se agregó el sobrenadante a una solución saturada de sulfato de amonio en una relación de volumen de 1:1 y se recolectó el precipitado después de la centrifugación. Se agregó un volumen apropiado de amortiguador para volver a suspender el precipitado para obtener proteínas purificadas primariamente de interés, donde el amortiguador comprendía amortiguador de fosfato 20 mM (pH=7,4) NaCl 150 mM.
(6.2.3.3) Purificación cromatográfica de proteínas de interés: se purificaron las proteínas obtenidas en 6.2.3.2 adicionalmente por cromatografía en columna de tamiz molecular Sepharose 4FF (GE) para obtener las proteínas purificadas de interés. Las proteínas purificadas de interés se sometieron a SDS-PAGE, y se observó el estado de ensamblaje de las partículas de las proteínas de interés por medio del microscopio electrónico de transmisión (TEM).
La figura 5B mostró los resultados de SDS-PAGE y TEM de dichas 9 proteínas recombinantes. Los resultados indicaron que dichas 9 proteínas recombinantes tenían una pureza superior al 95%, y podían ser ensambladas en partículas de proteínas de un tamaño uniforme.
6.2 Evaluación de la reactividad de dichas 9 proteínas recombinantes con anticuerpos del grupo sA
6.2.1 Preparación de placas de reacción
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1-1.2, se prepararon placas de reacción, y los antígenos de recubrimiento son dichas 9 proteínas recombinantes que presentan polipéptidos de interés.
6.2.2 Determinación de la reactividad de HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5 con dichas proteínas recombinantes mediante ELISA
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1-1.2, se determinó la reactividad de HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5 con dichas proteínas recombinantes.
6.2.3 Análisis de epítopos reconocidos por HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, y HBs-E13C5
Los resultados del ELISA en 6.2.2 se mostraron en la Figura 6. Los resultados indicaron que HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5 tenían buena reactividad con las proteínas recombinantes que presentaban polipéptidos SEQ1, SEQ3, SEQ4, SEQ5, SEQ6, SEQ10, pero no tenían reactividad con las proteínas recombinantes que presentaban polipéptidos SEQ8, SEQ9, SEQ11. El análisis de secuencia de estos polipéptidos mostró que la característica común de los polipéptidos SEQ1, SEQ3, SEQ4, SEQ5, SEQ6, SEQ10 reside en que comprenden aa121-aa124 de HBsAg, y la característica común de SEQ8, SEQ9, SEQ11 residía en no comprender aa121-124 de HBsAg intacto. Por lo tanto, podría concluirse que HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5 reconocían el mismo epítopo, y la secuencia de aminoácidos del epítopo más corto reconocida por los mismos era aa121-124 de HBsAg, es decir, CKTC. Los resultados de ELISA mostraron que las proteínas recombinantes C149-SEQ1 y 3-6 tenían una reactividad comparable con los anticuerpos y una reactividad superior a C149-SEQ10. Por lo tanto, los polipéptidos SEQ1 y 3-6 fueron los péptidos epítopos preferidos reconocidos por los anticuerpos HBs-E6F6, HBs-E7G11, HBs-G12F5, HBs-E13C5. Además, puesto que la secuencia de SEQ1 era más corta que SEQ3-6, se consideró que SEQ1 era el epítopo central preferido.
Ejemplo 7: Análisis de la sensibilidad de HBs-E6F6 y HBs-E7G11 a las mutaciones de aminoácidos del péptido epítopo SEQ1 (referencia)
Se sometió SEQ1 (GPCKTCT) a mutación puntual de aminoácidos y se prepararon 7 mutantes. Las secuencias de aminoácidos de dichos 7 polipéptidos mutantes se mostraron en la Tabla 5. De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 6, se prepararon proteínas recombinantes que comprendían los polipéptidos mutantes y C149/mut, y se evaluaron HBs-E6F6 y HBs-E7G11 para determinar su reactividad con dichos 7 polipéptidos mutantes.
Tabla 5: Secuencias de aminoácidos de polipéptidos mutantes
Nombre Aminoácido mutado Secuencia de aminoácidos
M1 P120S GSCKTCT
M2 P120T GTCKTCT
M3 C121S GPSKTCT
M4 K122R GPCRTCT
M5 T123I GPCKICT
M6 C124S GPCKTST
M7 C121S/C124S GPSKTST
SEQ1 HBsAg aa119-aa125 GPCKTCT
Los resultados se mostraron en la Figura 7. Los resultados indicaron que el mutante M1 (P120S), el mutante M2 (P120T), el mutante M4 (K122R) eran comparables con el péptido epítopo SEQ1 con respecto a la unión al anticuerpo HBs-E6F6 y HBs-E7G11, mientras que la unión de los otros mutantes a los anticuerpos disminuyó significativamente. Indicó que la mutación P120S, P120T, K122R no tuvo ningún efecto en la reactividad de HBs-E6F6 y HBs-E7G11 con el epítopo SEQ1, mientras que la mutación C121S, C124S, C121S/C124S, T123I disminuyó significativamente la reactividad de HBs-E6F6 y HBs-E7G11 con el epítopo SEQ1.
Ejemplo 8: Preparación de proteínas recombinantes que comprenden péptidos epítopos y evaluación de su inmunogenicidad.
8.1 Preparación de proteínas recombinantes que comprenden péptidos epítopos
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 6, se utilizó C149/mut como proteína portadora para presentar péptidos epítopos SEQ1, SEQ3, SEQ4, SeQ6, SEQ7, donde SEQ3, SEQ4, SEQ6, SEQ7 eran polipéptidos obtenidos por extensión del extremo N y/o C-terminal del epítopo núcleo preferido SEQ1 (es decir, que comprende el epítopo núcleo SEQ1) a partir de los cuales se prepararon 5 proteínas recombinantes (utilizadas como antígenos para la inmunización) capaces de formar partículas similares a nucleocápside (CLP, por sus siglas en inglés).
Como se describe en el ejemplo 6, se prepararon 5 proteínas recombinantes C149-SEQ1, SEQ3, SEQ4, SEQ6, SEQ7, y dichas 5 proteínas recombinantes se sometieron a SDS-PAGE y se observaron mediante microscopio electrónico de transmisión. Los resultados se mostraron en la Figura 8A. Los resultados indicaron que dichas 5 proteínas recombinantes tenían una pureza superior al 95%, y podían ser ensambladas en partículas de proteínas de un tamaño uniforme.
8.2 Evaluación de inmunogenicidad de proteínas recombinantes que comprenden péptidos epítopos
8.2.1 Inmunización de ratones
Se inmunizaron ratones BALB/C con dichas 5 proteínas recombinantes y la proteína portadora C149/mut (como control), respectivamente. El inmunoadyuvante fue adyuvante de hidróxido de aluminio, la dosis inmunitaria fue de 3 mg/dosis, la vía de inmunización fue inyección intramuscular de muslo trasero lateral, y el procedimiento inmunitario fue el siguiente: se realizó una inmunización de refuerzo cada 2 semanas después de la inmunización primaria; se realizó la inmunización cuatro veces.
8.2.2 Determinación del título de anticuerpos anti-HBs en suero
8.2.2.1 Preparación de placa de reacción
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1-1.2, se preparó la placa de reacción, el antígeno de recubrimiento era la proteína del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) expresada recombinantemente en células CHO.
8.2.2.2 ELISA de título de anticuerpos anti-HBs en suero
Dilución de la muestra: se diluyó el suero de ratón con una solución de PBS que contenía suero de ternero recién nacido al 20% a 7 concentraciones de gradiente, es decir, 1: 100, 1: 500, 1:2500, 1: 12500, 1: 62500, 1: 312500, 1:1562500.
Reacción de la muestra: Se agregó una muestra diluida de 100 pL a cada pocillo de la placa de reacción recubierta, y se colocó la placa en una incubadora a 37°C durante 30 minutos.
Reacción de marcado enzimático: después de terminar la reacción de la muestra, se lavó la placa de ELISA con PBST (PB7.4 20mM, NaCl 150mM, 0,1%Tween20) 5 veces, se agregaron 100 mL de solución GAM-HRP a cada pocillo, y se colocó la placa en una incubadora a 37°C durante 30 minutos.
Reacción de desarrollo de color: Después de la reacción de marcado enzimático, se lavó la placa de ELISA con solución PBST (PB7.420 mM, NaCl 150 mM, 0,1% Tween20) 5 veces, se agregaron 50 pL de reactivo de desarrollo de color TMB (suministrado por BEIJING WANTAI BIOLOGY PHARMACY CO., LTD) a cada pocillo, y se colocó la placa en una incubadora a 37°C durante 15 minutos.
Detención de la reacción y lectura de valores: Después de terminar la etapa de reacción de desarrollo de color, se agregaron 50 pl de amortiguador de detención (suministrado por BEIJING WANTAI BIOLOGY PHARMACY CO., LTD) a cada pocillo de la placa de ELISA, y se leyó el valor OD450/630 con ELIASA para cada pocillo.
Cálculo del título de anticuerpos anti-HBsAg en suero: se trazó una curva de regresión con factores de dilución de muestras con un valor de lectura entre 0,2 y 2,0 y los valores de lectura, se calculó el factor de dilución de la muestra en el que el valor de lectura era el doble del valor de fondo, y se utilizó el factor de dilución como título de anticuerpos anti-HBsAg en suero.
8.2.3 Determinación del título de anticuerpos anti-C149/mut en suero
8.2.3.1 Preparación de placas de reacción
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1-1.2, se prepararon placas de reacción, y el antígeno de recubrimiento era la proteína portadora de fusión C149/mut.
8.2.3.2 Determinación del título de anticuerpos anti-C149/mut en suero mediante ELISA
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 8.2.2.2, se realizaron diluciones de muestras, reacciones de muestras, reacciones de marcado enzimático, reacciones de desarrollo de color, reacciones de detención y lectura de valores, y se calculó el título de anticuerpos anti-C149/mut en suero.
8.2.4 Análisis de inmunogenicidad de proteínas recombinantes que comprenden péptidos epítopos
Al llevar a cabo dichas etapas, se obtuvieron el título de anticuerpos anti-HBsAg y el título de anticuerpos anti-C149/mut en suero. Los resultados se mostraron en la Figura 8B. Los resultados indicaron que las proteínas recombinantes que comprenden los péptidos epítopos SEQ1, SEQ3, SEQ4, SEQ6, SEQ7 indujeron un título alto de Anti-HBsAg en ratones BALB/C, mientras que C149/mut solo no pudo inducir un título alto de Anti-HBsAg.
Ejemplo 9: Evaluación del efecto terapéutico de los anticuerpos policlonales anti-SEQ6 derivados de sangre de ratón 9.1 Preparación de anticuerpos policlonales anti-SEQ6 derivados de sangre de ratón.
9.1.1 Inmunización de ratones
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 8-8.2.1, se inmunizaron los ratones BALB/C con un inmunógeno que era una proteína recombinante que comprendía SEQ6 (C149-SEQ6).
9.1.2 Purificación de anticuerpos policlonales anti-SEQ6 derivados de sangre de ratón
Después de completar el procedimiento inmunitario, el título de anticuerpo anti-HBsAg en suero de ratones alcanzó un nivel alto, la sangre se tomó del plexo venoso periorbitario durante varias veces. Después de la purificación por precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de afinidad con empleo de proteína A, se obtuvieron anticuerpos policlonales purificados.
9.2 Evaluación del efecto terapéutico de los anticuerpos policlonales anti-SEQ6 derivados de sangre de ratón Se inyectaron anticuerpos policlonales anti-SEQ6 derivados de sangre de ratón en la vena caudal de ratones transgénicos con VHB, se monitorearon los cambios en el ADN del VHB y HBsAg en suero. Los resultados se mostraron en la Figura 9. Los resultados indicaron que los anticuerpos policlonales, obtenidos mediante la inmunización de ratones con C149-SEQ6, disminuyeron significativamente los niveles de ADN del VHB y HBsAg en ratones transgénicos con VHB, y fueron eficaces para eliminar el VHB.
Ejemplo 10: Efecto de proteínas recombinantes en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB
10.1 Inmunización de ratones
Se utilizó el modelo de ratón transgénico con VHB para evaluar el efecto terapéutico de dichas 5 proteínas recombinantes (C149-SEQ1, C149-SEQ3, C149-SEQ4, C149-SEQ6, C149-SEQ7) obtenidas en el ejemplo 8, y se utilizó como control la proteína portadora C149/mut. El inmunoadyuvante fue adyuvante de hidróxido de aluminio, la dosis inmunitaria fue de 12 pg/dosis, la vía de inmunización fue inyección intramuscular de muslo trasero lateral, y el procedimiento inmunitario fue el siguiente: se realizó una inmunización de refuerzo 2 semanas después de la inmunización primaria, seguida por una inmunización de refuerzo cada semana, es decir, la inmunización se realizó en las semanas 0, 2, 3, 4, 5, es decir, la inmunización se realizó cinco veces.
10.2 Determinación del título del anticuerpo en suero
De acuerdo con los métodos descritos en los ejemplos 8-8.2.2 y 8.2.3, se determinó el título de anticuerpos séricos de Anti-HBsAg y Anti-C149/mut, y se monitorearon los índices virológicos, los niveles de ADN del VHB y de HBsAg en suero de ratones.
10.3 Análisis del efecto terapéutico de las proteínas recombinantes
Los resultados se mostraron en la Figura 10. Los resultados indicaron que en los grupos que recibían inmunoterapia de proteínas recombinantes, se detectaron Anti-HBsAg y Anti-C149/mut en el suero de los ratones, y el nivel de ADN del VHB y de HBsAg en el suero de los ratones disminuyó en diferentes grados. Por el contrario, en el grupo control, no se produjo anti-HBsAg en suero de ratones, y el nivel de ADN del VHB y HBsAg en suero no disminuyó. El ejemplo muestra que los epítopos y los polipéptidos epítopos identificados por la invención son objetivos eficaces para el tratamiento de la infección por v Hb . Las proteínas recombinantes producidas basadas en estos epítopos y péptidos epítopos tienen potencial para tratar la infección crónica por el VHB. En particular, las proteínas recombinantes que comprenden el péptido epítopo SEQ1-SEQ7 pueden utilizarse como vacunas de proteínas para cambiar el estado de inmunotolerancia dirigido al VHB en ratones transgénicos con VHB e inducir una respuesta inmunitaria eficaz, específica y terapéutica contra el VHB.
Ejemplo 11: Construcción y evaluación de proteínas recombinantes basadas en diferentes proteínas portadoras y SEQ6
11.1 Construcción de 3 vectores de expresión de fusión
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 6, se construyeron 3 proteínas portadoras, las cuales eran C149/mut (SEQ ID NO: 43), C183/mut (SEQ ID NO: 44), WHC149/mut (SEQ ID NO: 45), respectivamente. C149/mut se obtuvo por ingeniería de 149 residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína del núcleo del VHB, C183/mut se obtuvo por ingeniería de 183 residuos de aminoácidos de la proteína del núcleo del VHB de longitud completa, y WHC149/mut se obtuvo por ingeniería de 149 residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis de la marmota (el método de ingeniería se describió en 6.1). SEQ6 se ligó a los tres vectores para obtener proteínas recombinantes C149-SEQ6, C183-SEQ6 y WHC149-SEQ6, respectivamente.
11.2 Expresión y purificación de 3 vacunas diferentes de proteínas recombinantes portadoras SEQ6
De acuerdo con el método descrito en 6.2, se expresaron y purificaron 3 proteínas recombinantes (C149-SEQ6, C183-SEQ6, WHC149-SEQ6). Las proteínas de interés obtenidas se sometieron a SDS-PAGE, y se identificó el estado de ensamblaje de las partículas de las proteínas por medio del microscopio electrónico de transmisión. Los resultados se mostraron en la Figura 11A. Los resultados indicaron que las 3 proteínas recombinantes obtenidas tenían una pureza superior al 95%, y podían ser ensambladas en partículas de proteínas de un tamaño uniforme. 11.3 Efectos de dichas 3 proteínas recombinantes en el tratamiento de ratones transgénicos con VHB.
Se utilizó el modelo de ratones transgénicos con VHB para evaluar el efecto terapéutico de dichas 3 proteínas recombinantes obtenidas en 11.2 como vacunas de proteínas. El inmunoadyuvante fue adyuvante de hidróxido de aluminio, la dosis inmunitaria fue de 12 mg/dosis, y el procedimiento inmunitario fue el siguiente: se realizó una inmunización de refuerzo 2 semanas después de la inmunización primaria, seguida por una inmunización de

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína recombinante, para su uso en el tratamiento de un sujeto infectado con VHB reduciendo el nivel sérico de ADN del VHB y/o HBsAg en el sujeto, en donde la proteína recombinante comprende un polipéptido y una proteína portadora, ligados opcionalmente mediante un ligante, en donde la proteína recombinante no es una proteína de origen natural o un fragmento de la misma; en donde:
el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 6.
2. La proteína recombinante para su uso según la reivindicación 1, en donde la proteína portadora es proteína CRM197 o un fragmento de la misma, en donde CRM197 tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 42; y en donde el fragmento de la proteína CRM197 comprende o consiste en aa 1-190 o aa 1-389 de CRM197.
3. La proteína recombinante para su uso según la reivindicación 2, en donde el polipéptido está ligado al extremo N o al extremo C de la proteína CRM197 o fragmento de la misma, opcionalmente mediante un ligante.
4. La proteína recombinante para su uso según la reivindicación 1, en donde la proteína portadora es HBcAg o un fragmento de la misma, en donde HBcAg tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 40.
5. La proteína recombinante para su uso según la reivindicación 4, en donde el fragmento de HBcAg comprende o consiste en aa 1-149 de HBcAg.
6. La proteína recombinante para su uso según la reivindicación 4 o 5, en donde los aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de HBcAg se reemplazan con el polipéptido y el polipéptido está ligado a1HBcAg o fragmento del mismo, opcionalmente mediante un ligante.
7. La proteína recombinante para su uso según la reivindicación 1, en donde la proteína portadora es el antígeno del núcleo del virus de la hepatitis en marmotas (WHcAg) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 41 o un fragmento del mismo.
8. La proteína recombinante para su uso según la reivindicación 7, en donde el fragmento de WHcAg comprende o consiste en aa 1-149 de WHcAg.
9. La proteína recombinante para su uso según la reivindicación 7 u 8, en donde los aminoácidos de las posiciones 79 a 81 de WHcAg se reemplazan con el polipéptido como se define en la reivindicación 1 y el polipéptido está ligado al WHcAg o fragmento del mismo, opcionalmente mediante un ligante.
10. La proteína recombinante para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el ligante es un ligante rígido o flexible.
11. La proteína recombinante para su uso según la reivindicación 10, en donde el ligante es (GGGGS)3.
12. La proteína recombinante para su uso según la reivindicación 1, en donde la proteína recombinante tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en las SEQ ID NO: 52, 63, 71, 79, 87 y 95.
13. Una composición farmacéutica, para su uso en el tratamiento de un sujeto infectado por VHB reduciendo el nivel sérico de ADN del VHB y/o HBsAg en un sujeto, en donde la composición farmacéutica comprende la proteína recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12,
y un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, en donde el vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable es adyuvante.
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