ES2843954T3 - Método y dispositivo para detectar enterobacterias productoras de carbapenemasa - Google Patents
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Abstract
Un método para la detección de una o varias carbapenemasas de tipo OXA procedentes de enterobacterias productoras de carbapenemasa (CPE) posiblemente presentes en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de: - proporcionar un soporte (3), - inmovilizar sobre dicho soporte (3) uno o varios reactivos de captura (5) que interactúan con una o varias primeras regiones epitópicas de una o varias de las dichas carbapenemasas (10), - proporcionar uno o varios reactivos de detección (7) que interactúan con una o varias segundas regiones epitópicas de dicha o dichas carbapenemasas (10), estando dicho reactivo o reactivos de detección (7) enlazados, directa o indirectamente, a un marcador (9) para formar uno o varios conjugados de detección (11), - proporcionar una muestra a analizar que comprende, o no, dicha o dichas carbapenemasas (10) a detectar, - poner dicha muestra en contacto con el o los reactivos de captura (5), - revelar una unión específica entre la carbapenemasa o carbapenemasas (10) presentes en dicha muestra mediante el o los reactivos de detección (7), y en el que el o los reactivos de captura (5), y posiblemente el o los reactivos de detección (7), son específicos y se unen - a la siguiente secuencia de aminoácidos o un fragmento de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 aminoácidos de la secuencia: SEQ.ID.N03: IRAKTGYSTRIEPKIGWW.
Description
DESCRIPCIÓN
Método y dispositivo para detectar enterobacterias productoras de carbapenemasa
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, y en particular a un método y un dispositivo para detectar, y/o identificar, una o varias enterobacterias productoras de carbapenemasa de tipo OXA (CPE), especialmente seleccionadas del grupo que consiste en CPE de tipo OXA, CPE de tipo KPC, CPE de tipo VIM, y CPE de tipo NDM, más preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en CPE de tipo OXA y CPE de tipo KPC, en particular CPE OXA-48 y CPE similar a OXA-48.
Antecedentes de la invención
Las enterobacterias productoras de carbapenemasa (CPE) constituyen un problema importante de salud pública. De hecho, los antibióticos carbapenemasa-lactamina, en particular el carbapenem, se consideran la última línea de terapia eficaz para tratar infecciones relacionadas con bacterias gramnegativas multirresistentes, y debido a que las carbapenemasas, expresadas por tales bacterias, a menudo están relacionadas con mecanismos de resistencia frente a otras clases diferentes de antibióticos.
Habitualmente, los métodos conocidos para la detección o identificación de enterobacterias productoras de carbapenemasa (CPE) son relativamente largos de implementar, entre 48 y 72 horas, incluyendo las etapas de cultivo y el análisis fenotípico (crecimiento comparativo de las bacterias ensayadas en presencia de antibióticos y/o ensayos de identificación molecular, y requieren numerosos ensayos comparativos.
Las principales carbapenemasas presentes en las enterobacterias son del tipo OXA, KPC, VIM, NDM e IMP, mientras que otras carbapenemasas, tales como SME o IMI, presentan un menor interés clínico.
Así, existe una clara necesidad clínica de desarrollar nuevos métodos y medios, ensayos, que permitan una identificación rápida y eficaz, preferiblemente en un retraso menor a quince minutos, de las principales carbapenemasas, especialmente la carbapenemasa de tipo OXA-48, que presenta una alta prevalencia en los países noreuropeos, y carbapenemasas de tipo KPC que son endémicas al menos en los Estados Unidos de América y en Grecia; especialmente métodos y medios que podrían ser complementarios, o incluso reemplazar, a los métodos y ensayos fenotípicos y de detección moleculares actuales.
Estado de la técnica
Se han propuesto diversos métodos y ensayos para la detección de carbapenemasas como se describe, por ejemplo, en la publicación científica Nordmann et al., Emerg. Infect. Dis., 2012, o en la solicitud de patente internacional WO2013072494, que describe un método enzimático, denominado ensayo Carba NP (Carbapenemase Nordmann-Poirel), que usa la acidificación del medio de reacción, generado a través de la hidrólisis enzimática del antibiótico imipenem, para detectar carbapenemasas. Sin embargo, dicho ensayo y método requieren el uso de medios reactivos inestables, una manipulación cuidadosa para realizar el ensayo, y una habilidad y experiencia considerables para evitar detecciones de falsos negativos o falsos positivos.
La solicitud de patente internacional WO 2012/003955 describe un método de detección de carbapenemasas mediante el uso de antibióticos fluorescentes que pueden ser hidrolizados por estas enzimas. Sin embargo, si dicho método es relativamente rápido, es decir, entre 30 minutos y varias horas, requiere el uso de medios complejos y costosos, como microscopía de epifluorescencia y cofoncal, y personas capacitadas para realizar este ensayo.
La solicitud de patente internacional WO 2012/143535 describe la detección de carbapenemasas por espectrometría de masas (MS). Sin embargo, este método es complejo, y requiere de personas altamente cualificadas para llevar a cabo las diferentes etapas del método y proporcionar un análisis de los resultados así obtenidos.
Por lo tanto, existe una necesidad importante de detección rápida y sencilla de carbapenemasas, especialmente carbapenemasas de tipo OXA-48 y de tipo KPC, para la detección de enterobacterias resistentes que constituyen un importante problema de salud pública.
Objetivos de la invención
La presente invención proporciona un nuevo método y medios para la detección y/o identificación de carbapenemasas, especialmente de carbapenemasas de tipo OXA, especialmente OXA-48, KPC, VIM y/o NDM, que no presentan los inconvenientes de la técnica anterior.
La presente invención proporciona métodos y medios que son simples, rápidos, y que permiten la detección y/o identificación de carbapenemasas, preferiblemente en menos de una hora, más preferiblemente en menos de treinta minutos, y más preferiblemente en menos de quince minutos.
La presente invención también proporciona medios, especialmente un ensayo de detección y/o un dispositivo, que son altamente estables a temperatura ambiente y, por lo tanto, podrían mantenerse durante mucho tiempo, por ejemplo seis meses, preferiblemente más de un año, y más preferiblemente, más de dos años, y podrían usarse en los principales laboratorios microbiológicos clínicos, sin ningún medio de detección especializado específico para la detección y la codificación de resultados.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método y medios que permitan, posiblemente de manera simultánea, la detección de múltiples carbapenemasas implicadas en la resistencia a antibióticos de diversas bacterias, especialmente enterobacterias, preferiblemente con los mismos medios de detección, más preferiblemente en el mismo soporte de detección.
Sumario de la invención
La invención se refiere a un método para la detección de una o varias carbapenemasas a partir de enterobacterias productoras de carbapenemasa (CPE) posiblemente presentes en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de proporcionar un soporte, inmovilizar sobre el soporte uno o varios reactivos de captura que interactúan con una o varias primeras regiones epitópicas de una o varias carbapenemasas, seleccionadas del grupo que consiste en carbapenemasas OXA, especialmente OXA-48, KPC, VIM y/o NDM, proporcionar uno o varios reactivos de detección que interactúan con una o varias segundas regiones epitópicas de una o varias carbapenemasas, seleccionadas del grupo que consiste en carbapenemasas OXA, especialmente OXA-48, KPC, VIM y/o NDM, estando el o los reactivos de detección enlazados, directa o indirectamente, a un marcador para formar uno o varios conjugados de detección, proporcionar una muestra a analizar que comprende, o no, carbapenemasa o carbapenemasas a detectar, poner la muestra en contacto con el o los reactivos de captura, revelar una unión específica entre la o las carbapenemasas presentes en esta muestra por el o los reactivos de detección.
El método según la invención puede comprender además una cualquiera, o cualquier combinación adecuada, de las siguientes características:
- el o los reactivos de captura son de la misma naturaleza y se unen o no a la misma primera región o regiones epitópicas de la carbapenemasa o carbapenemasas que la o las (segunda región o regiones epitópicas) del reactivo o reactivos de detección,
- el método comprende además las etapas de inmovilizar sobre el soporte uno o varios reactivos de control para interactuar con el o los reactivos de detección, proporcionando uno o varios reactivos de detección de control para interactuar y unirse al reactivo o reactivos de control, estando el o los reactivos de detección enlazados, directa o indirectamente, a un marcador para formar uno o varios conjugados de detección de control,
- el o los reactivos de captura, el o los reactivos de detección y/o el o los reactivos de control se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, porción o porciones de anticuerpos, nanocuerpos, alfacuerpos, microanticuerpos, afilinas, afímeros, fimómeros, afitinas, o una mezcla de los mismos,
- el marcador del reactivo o reactivos de detección, y/o del reactivo o reactivos de detección de control, se selecciona del grupo que consiste en coloides metálicos, partículas de látex o partículas coloreadas,
- la carbapenemasa de una enterobacteria productora de carbapenemasa (CPE) es una carbapenemasa de tipo OXA, preferiblemente una OXA-48, y en la que el o los reactivos de captura, o posiblemente el o los reactivos de captura, son específicos y se unen a la secuencia de aminoácidos o fragmentos de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 aminoácidos, preferiblemente consecutivos, de la siguiente secuencia: SEQ.ID.NO3: IRAKTGYSTRIEPKIGWW,
- el método comprende además la etapa de discriminar entre una carbapenemasa de tipo OXA-163 y otras carbapenemasas de tipo OXA, especialmente OXA-48,
- el o los reactivos de captura y/o el reactivo de detección se unen a las siguientes secuencias de aminoácidos o fragmentos de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos, preferiblemente consecutivos, de las siguientes secuencias: SEQ.ID.N01: TAMKYSVVPVY o SEQ.ID.N02: SFLRKLYHNKLHV,
- la carbapenemasa de una enterobacteria productora de carbapenemasa (CPE) es una carbapenemasa de tipo KPC, y en la que el o los reactivos de captura y el o los reactivos de detección son específicos y se unen a la secuencia de aminoácidos o fragmentos de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, o 33 aminoácidos, preferiblemente consecutivos, de la siguiente secuencia: SEQ.ID.N08: GDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTR,
- el soporte se selecciona del grupo que consiste en una tira reactiva o dispositivos de flujo lateral.
La invención se refiere también a un dispositivo de detección inmunocromatográfico para llevar a cabo las etapas del método según la invención, comprendiendo este dispositivo un soporte que comprende uno o varios reactivos de captura que interactúan con una o varias primeras regiones epitópicas de una o varias carbapenemasas, y que
comprende una o varios reactivos de detección que interactúan con una o varias segundas regiones epitópicas de la o las carbapenemasas, estando el o los reactivos de detección enlazados, directa o indirectamente, a un marcador para formar uno o varios conjugados de detección.
El dispositivo según la invención puede comprender adicionalmente, además de las características mencionadas anteriormente, una cualquiera o cualquier combinación adecuada de las siguientes características:
- el dispositivo comprende además uno o varios reactivos de control para interactuar con y unirse a uno o varios reactivos de detección de control, y uno o varios reactivos de detección de control para interactuar con y unirse al reactivo o reactivos de detección, estando los reactivos de detección enlazados, directa o indirectamente, a un marcador para formar uno o varios conjugados de control,
- el marcador del reactivo o reactivos de detección, y/o del reactivo o reactivos de detección de control, se selecciona del grupo que consiste en coloides metálicos, partículas de látex o partículas coloreadas,
- el dispositivo es una tira reactiva o un dispositivo de flujo lateral,
- la carbapemenasa de una enterobacteria productora de carbapemenasa (CPE) es una carbapemenasa de tipo OXA, preferiblemente OXA-48, y el o los agentes de captura son específicos y se unen a la siguiente secuencia de aminoácidos o un fragmento de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 aminoácidos de la siguiente secuencia: SEQ.ID.NO3: IRAKTGYSTRIEPKIGWW,
- el o los reactivos de captura y/o el o los reactivos de detección se unen a una de las siguientes secuencias de aminoácidos o un fragmento de al menos 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos de las siguientes secuencias: SEQ.ID.N01: TAMKYSVVPVY, SEQ.ID.N02: SFLRKLYHNKLHV,
- la carbapemenasa de una enterobacteria productora de carbapemenasa (CPE) es una carbapemenasa de tipo KPC, y el o los reactivos de captura y el o los reactivos de detección son específicos y se unen a la siguiente secuencia de aminoácidos o un fragmento de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 1516, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 aminoácidos de la siguiente secuencia: SEQ.ID.N08: GDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTR.
La invención se refiere también al uso del dispositivo de detección según la invención para la detección y/o identificación de carbapenemasas de tipo OXA, preferiblemente OXA-48, y/o de tipo KPC de una enterobacteria productora de carbapenemasa (CPE) en una muestra biológica.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa esquemáticamente las diferentes etapas del método según la invención, en el que la detección se realiza en un dispositivo inmunocromatográfico en forma de lámina según la invención.
La Figura 2 representa esquemáticamente el dispositivo de detección según la invención antes de que haya decaído la muestra, y los resultados visuales relacionados con ensayos positivos, negativos y no válidos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un método inmunocromatográfico para detectar y/o identificar carbapenemasa o carbapenemasas, en particular seleccionadas del grupo que consiste en carbapenemasa o carbapenemasas de tipo OXA, KPC, VIM y/o NDM, más preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en carbapenemasa o carbapenemasas de tipo OXA, especialmente OXA-48 u OXA-163, y/o KPC, de una enterobacteria productora de carbapenemasa (CPE) posiblemente presente en una muestra biológica, tal como una muestra clínica o un cultivo bacteriano o hemocultivo.
Ventajosamente, el método según la invención comprende las etapas de:
- proporcionar un soporte 3,
- inmovilizar sobre este soporte 3 uno o varios reactivos de captura 5 que interactúan con una o varias primeras regiones epitópicas de la o las carbapenemasas 10 a detectar, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en carbapenemasa o carbapenemasas OXA, especialmente OXA-48, KPC, VIM y/o NDM,
- proporcionar uno o varios reactivos de detección 7 que interactúan con una o varias segundas regiones epitópicas de la o las carbapenemasas, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en carbapenemasas OXA, especialmente OXA-48, KPC, VIM y/o NDM, estando dicho reactivo o reactivos de detección 7 enlazados, directa o indirectamente, a un marcador 9 para formar uno o varios conjugados de detección 11,
- proporcionar una muestra a analizar que comprende, o no, una o varias carbapenemasas 10 a detectar, - poner esta muestra en contacto con el o los reactivos de captura 5,
- revelar una unión específica entre la una o varias carbapenemasas 10 presentes en la muestra mediante el o los reactivos de detección 7, preferiblemente marcados.
En la presente descripción de la invención, los términos “interactuar” o “que interactúa” pueden interpretarse como sinónimos de “unir” o “que se une”.
Preferiblemente, un reactivo de captura 5 interactúa con una primera región epitópica de una carbapenemasa. Sin embargo, un reactivo de captura 5 puede interactuar con varias primeras regiones epitópicas de una carbapenemasa.
Preferiblemente, se pueden usar múltiples reactivos de captura 5, que interactúan con una o varias primeras regiones epitópicas de una carbapenemasa específica, para interactuar con múltiples carbapenemasas, posiblemente de forma simultánea, presentes en la muestra.
Según una realización preferida de la invención, el o los reactivos de captura interactúan con la misma región o regiones epitópicas de la o las carbapenemasas que la o las del reactivo o reactivos de detección.
El método según la invención puede comprender además las etapas de:
- inmovilizar sobre el soporte uno o varios reactivos de control 6 que interactúan con uno o varios reactivos de detección de control 8,
- proporcionar uno o varios reactivos de detección de control 8 para que interactúen y se unan a dicho uno o varios reactivos de control 6, estando dichos reactivos de detección de control 8 enlazados, directa o indirectamente, a un marcador 9 para formar uno o varios conjugados de detección de control 12.
Preferiblemente, el o los complejos formados por el o los reactivos de captura 5 y el o los conjugados de detección 11, y/o el o los formados por el o los reactivos de control 6 y el o los conjugados de detección de control 12, generan una señal detectable, preferiblemente una señal visual o colorimétrica.
Preferiblemente, la muestra es una muestra biológica que comprende una colonia de enterobacterias productoras de carbapenemasa (CPE).
Preferiblemente, la etapa de poner la muestra a analizar en contacto con el o los reactivos de captura 5 se lleva a cabo usando una disolución amortiguadora que contiene una colonia bacteriana resuspendida, por difusión pasiva. Si la muestra analizada contiene la carbapenemasa 10 a detectar, el complejo formado por la carbapenemasa y el o los reactivos de detección 7 permanecerá unido al reactivo o reactivos de captura 5 anticarbapenemasa adsorbidos sobre el soporte. El resultado de esta unión específica tiene la ventaja de ser visible en quince minutos en forma de al menos una línea roja que se desarrolla sobre el soporte. La disolución amortiguadora continúa migrando para encontrar el o los reactivos de control 6 que se unen a uno o varios conjugados de control 12, produciendo así al menos una segunda línea roja.
Preferiblemente, la o las carbapenemasas en cuestión se seleccionan del grupo que consiste en carbapenemasas de tipo OXA, preferiblemente OXA-48, KPC, VIM y/o NDM, más preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en carbapenemasas de tipo OXA, especialmente OXA-48, KPC, VIM y NDM, incluso más preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en carbapenemasas de tipo OXA, especialmente OXA-48, KPC y VIM, o aún más preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en carbapenemasas de tipo OXA, especialmente OXA-48, y KPC.
Preferiblemente, el o los reactivos de captura 5 son reactivos capaces de unirse y fijarse específicamente o no a una primera región, una secuencia de aminoácidos, de una estructura o estructuras antigénicas de una o varias carbapenemasas a detectar en la muestra. Preferiblemente, el reactivo de captura es un anticuerpo monoclonal o policlonal, o una porción del mismo, dirigido contra una o varias regiones epitópicas de la o las carbapenemasas en cuestión. Preferiblemente, es cualquier inmunoglobulina (Ig) adecuada.
Preferiblemente, el o los reactivos de captura 5 pueden ser un anticuerpo o anticuerpos de dominio (sdAb), también llamado nanocuerpo o nanocuerpos, nanofitina o nanofitinas, alfacuerpo o alfacuerpos, microanticuerpo o microanticuerpos (es decir, cadena corta artificial de aminoácidos copiada a partir de un anticuerpo o anticuerpos naturales completamente funcionales), afilina o afilinas, afímero o afímeros, afitina o afitinas, fimómero o fimómeros, aptámero o aptámeros, somámero o somámeros, o cualquier molécula o moléculas de captura específicas que pueden reconocer específicamente la o las estructuras de carbapenemasa o carbapenemasas a detectar, o una porción de la o las estructuras, mediante regiones complementarias adecuadas.
Preferiblemente, el o los reactivos de captura 5 se producen mediante ingeniería genética o mediante síntesis, y se identifican y se seleccionan según su afinidad de unión a la estructura o estructuras de carbapenemasa o carbapenemasas.
La unión del reactivo o reactivos de captura 5 y el soporte, por ejemplo nitrocelulosa, se puede obtener mediante una unión covalente directa o indirecta.
Preferiblemente, el o los reactivos de detección 7 son reactivos capaces de unirse y fijarse específicamente a una segunda región, una secuencia de aminoácidos, de una estructura o estructuras antigénicas de una o varias carbapenemasas a detectar en la muestra. Preferiblemente, es un anticuerpo o anticuerpos monoclonales o policlonales, o una porción de los mismos, dirigidos contra la segunda región o regiones epitópicas de la carbapenemasa o carbapenemasas en cuestión. Preferiblemente, es cualquier inmunoglobulina (Ig) adecuada.
Preferiblemente, el o los reactivos de detección 7 son un anticuerpo o anticuerpos monoclonales dirigidos contra una segunda región epitópica de la carbapenemasa, siendo dicha segunda región epitópica diferente o no de la primera región epitópica de la carbapenemasa unida por el reactivo o reactivos de captura 5.
El o los reactivos de detección 7 se enlazan, directa o indirectamente, a un marcador 9 para formar el conjugado o conjugados de detección 11.
Preferiblemente, el o los reactivos de control 6 son reactivos adecuados para unirse al reactivo o reactivos de detección de control 8. Por ejemplo, podría ser un anticuerpo o anticuerpos monoclonales o policlonales, o una porción de los mismos. Más preferiblemente, es un anticuerpo o anticuerpos de cabra anti-pollo, más preferiblemente anti-IgY.
Preferiblemente, el o los reactivos de detección de control 8 son reactivos capaces de unirse y fijarse al reactivo o reactivos de control 6, más preferiblemente es un anticuerpo o anticuerpos monoclonales o policlonales, por ejemplo anticuerpo o anticuerpos de pollo, preferiblemente IgY.
Preferiblemente, el o los reactivos de detección de control 8 se enlazan, directa o indirectamente, a un marcador 9 para formar el conjugado o conjugados de control 12.
Preferiblemente, el marcador 9 se selecciona del grupo que consiste en coloides metálicos, preferiblemente oro coloidal, azufre, selenio, sulfato de bario, sulfato de hierro, yodato, haluro de plata, óxido hidratado, sulfuro metálico, seleniuro de plomo, seleniuro de cadmio, fosfato metálico, ferrita metálica, sílice, liposomas o partículas, posiblemente recubiertas con capas orgánicas o inorgánicas, partículas de látex conjugado u orgánico, celulosa o poliestireno, y micropartículas coloreadas o fluorescentes para una detección colorimétrica o fluorimétrica eficiente y posiblemente discriminatoria de una o varias carbapenemasas (diferentes) u otras enzimas implicadas en la resistencia a los antibióticos en bacterias gramnegativas.
Preferiblemente, el marcador 9 comprende partículas de oro coloidal que tienen un diámetro medio comprendido entre alrededor de 5 nm y alrededor de 50 nm, preferiblemente partículas que tienen un diámetro entre alrededor de 20 nm y alrededor de 40 nm.
Preferiblemente, el marcador 9 comprende partículas de celulosa, poliéster y látex que comprenden una o varias funciones químicas adicionales, tales como, por ejemplo, una función carboxilo, amino, hidroxilo y/o sulfhidrilo. En una realización preferida, el marcador 9 comprende partículas de celulosa o látex carboxiladas con funciones sulfidrilo o amino.
También se pueden usar varios reactivos reticulados para el acoplamiento específico de grupos funcionales presentes en las micropartículas con la porción de aminoácidos del reactivo o reactivos de detección 7, o mediante el uso de otros reactivos de reticulación homo- o hetero-bifuncionales bien descritos en el estado de la técnica.
Preferiblemente, el soporte tiene forma de tira o de barrita. Es preferiblemente una estructura en forma de lámina, más preferiblemente una estructura de múltiples capas en la que una sustancia primaria se lamina sobre un polímero rígido o semirrígido, por ejemplo celulosa, nitrocelulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio, nailon, copolímeros acrílicos/nailon, polietersulfona y poliéster. En una realización preferida, una porción del soporte comprende una membrana hecha de fibras de vidrio con una almohadilla conjugada hecha de poliéster, otra región comprende una membrana hecha de nitrocelulosa, y otra región comprende una membrana hecha de celulosa.
El método según la invención es un método listo para uso, rápido y fácil de implementar.
El método según la invención se describirá ahora, como ejemplos, con respecto a carbapenemasas de tipo OXA, especialmente de tipo OXA-48, y de tipo KPC, pero las etapas del método también se pueden aplicar a carbapenemasas de tipo VIM y/o NDM usando el o los reactivos de captura 5 y el o los reactivos de detección 7 con respecto a las carbapenemasas a detectar.
El o los reactivos de captura 5 y el o los reactivos de detección 7 pueden reconocer específicamente cualquier región o regiones epitópicas adecuadas de carbapenemasas de tipo OXA-48, por ejemplo OXA-48 de Klebsiella pneumoniae como se describe en SEQ.ID.N04 y SEQ.ID.N05, o cualquier región o regiones epitópicas adecuadas de carbapenemasas de tipo KPC, por ejemplo KPC de Klebsiella pneumoniae como se describe en SEQ.ID.N06 y SEQ.ID.N07.
El cartografiado de epítopos realizado con doce anticuerpos monoclonales de ratón diferentes (MAT-8377, MAT-8378, MB6, 1B11, 1D12, 1G5, 2A2, 3B11, 3C1, 3G10, 4F9, 4F12) identificó, como regiones de unión, estas tres porciones particulares de la secuencia de aminoácidos de carbapenemasas de tipo OXA-48.
Así, en un ejemplo, el o los reactivos de captura 5, y posiblemente el o los reactivos de detección 7, reconocen específicamente, o no, todas o al menos un fragmento de estas tres porciones o epítopos siguientes de la secuencia de aminoácidos de carbapenemasas del tipo OXA, preferiblemente el tipo OXA-48 u OXA-163, o fragmentos de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 aminoácidos, preferiblemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 fragmentos lineales consecutivos de cualquiera de las siguientes secuencias:
- SEQ.ID.N01: TAMKYSVVPVY
- SEQ.ID.N02: SFLRKLYHNKLHV
- SEQ.ID.NO3: IRAKTGYSTRIEPKIGWW
Los inventores han descubierto inesperadamente que el reactivo de captura 5 dirigido contra la secuencia o fragmentos de la secuencia SEQ.ID.N0:3 es específico y puede incluso ser usado para discriminar entre carbapenemasas de tipo OXA, especialmente entre carbapennemasas de tipo OXA-48 y de tipo OXA-163. De hecho, el anticuerpo monoclonal de ratón MAT-8377 puede usarse como reactivo de captura 5, y proporciona especificidad de detección contra las variantes similares a OXA-163. La secuencia de aminoácidos de OXA-163 difiere (por una supresión de 4 aminoácidos) de la secuencia de aminoácidos de OXA-48 dentro de la región de SEQ.ID.N03 (IRAKTGYDT----KIGWW). Ventajosamente, la especificidad de unión de MAT-8377 (dirigido contra SEQ.ID.N03) permite detectar todas las variantes de carbapenemasas similares a OXA-48 y no las variantes no carbapenemasas similares a OXA-163.
El cartografiado de epítopos realizado con tres anticuerpos monoclonales de ratón diferentes (PF7, NE7 y NA3) identificó, como región de unión, una porción particular de la secuencia de aminoácidos de las carbapenemasas de tipo KPC.
Así, en otro ejemplo, el o los reactivos de captura 5 y el o los reactivos de detección 7 reconocen específicamente toda o al menos una parte de la siguiente porción o epítopo de la secuencia de aminoácidos de carbapenemasas de tipo KPC, o fragmentos de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 o 33 aminoácidos de la siguiente secuencia: SEQ.ID.N08: GDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTR.
Con una proteína OXA-48 recombinante purificada, se ha demostrado que el límite de detección del ensayo basado en el método según la invención es 0,125 ng/ml, y con una proteína KPC recombinante purificada, se ha demostrado que el límite de detección del ensayo basado en el método según la invención es 0,625 ng/ml.
El método de los ejemplos se evaluó con respecto a una colección de cepas de referencia.
El OXA-48 K-SeT y KPC K-SeT se evaluaron en una colección de setenta y seis cepas clínicas completamente caracterizadas en el Laboratorio Nacional de Referencia para Bacterias Productoras de Carbapenemasas (Bélgica) (Tabla 1 y Tabla 3).
Tabla 1:
El OXA-48 K-SeT KPC K-SeT se validaron por comparación con métodos moleculares de referencia, incluyendo la secuenciación, en el Laboratorio Nacional de Referencia para Bacterias Productoras de Carbapenemasa (Bélgica) en un estudio prospectivo realizado en 342 aislados clínicos consecutivos sospechosos de CPE no duplicados (Tabla 2 y Tabla 4).
Tabla 2:
Tabla 3:
Tabla 4:
Para comprobar la precisión dentro del mismo lote, es decir, la repetibilidad del método según la invención, las mismas muestras positivas y una disolución amortiguadora se procesaron quince veces en kits del mismo lote de producción en las mismas condiciones experimentales. Todos los resultados observados se confirmaron como se esperaba.
Para comprobar la precisión entre lotes, es decir, la reproducibilidad del método según la invención, algunas muestras positivas y muestras de amortiguador se procesaron en kits de tres lotes de producción diferentes. Todos los resultados se confirmaron como se esperaba.
El dispositivo de detección 1 según la invención, para implementar el método según la invención, comprende un soporte, preferiblemente en forma de tira, que comprende reactivo o reactivos de captura 5, que interactúan con una o varias primeras regiones epitópicas de una o varias carbapenemasas 10 en la muestra a analizar, y destinadas a formar un complejo con reactivo o reactivos de detección 7 enlazados, directa o indirectamente, a un marcador 9 para formar uno o varios conjugados de detección 11, siendo dicho conjugado o conjugados de detección 11 detectables como una señal colorimétrica.
Preferiblemente, el dispositivo de detección 1 comprende además uno o varios reactivos de control 6, destinados a formar un complejo con uno o varios conjugados de control 12 formados por reactivo o reactivos de detección de control 8 enlazados, directa o indirectamente, a un marcador 9.
Preferiblemente, las carbapenemasas, las enterobacterias productoras de carbapemenasa (CPE), el o los reactivos de captura 5, el o los reactivos de detección 7, el marcador 9, el o los reactivos de control 6 y 8, y el o los conjugados de control 12, son los descritos con respecto al método según la invención.
Claims (13)
1. Un método para la detección de una o varias carbapenemasas de tipo OXA procedentes de enterobacterias productoras de carbapenemasa (CPE) posiblemente presentes en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:
- proporcionar un soporte (3),
- inmovilizar sobre dicho soporte (3) uno o varios reactivos de captura (5) que interactúan con una o varias primeras regiones epitópicas de una o varias de las dichas carbapenemasas (10),
- proporcionar uno o varios reactivos de detección (7) que interactúan con una o varias segundas regiones epitópicas de dicha o dichas carbapenemasas (10), estando dicho reactivo o reactivos de detección (7) enlazados, directa o indirectamente, a un marcador (9) para formar uno o varios conjugados de detección (11),
- proporcionar una muestra a analizar que comprende, o no, dicha o dichas carbapenemasas (10) a detectar,
- poner dicha muestra en contacto con el o los reactivos de captura (5),
- revelar una unión específica entre la carbapenemasa o carbapenemasas (10) presentes en dicha muestra mediante el o los reactivos de detección (7), y en el que el o los reactivos de captura (5), y posiblemente el o los reactivos de detección (7), son específicos y se unen
- a la siguiente secuencia de aminoácidos o un fragmento de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 aminoácidos de la secuencia: SEQ.ID.N03: IRAKTGYSTRIEPKIGWW.
2. El método según la reivindicación 1, en el que el o los reactivos de detección (7) son de la misma naturaleza y se unen a la o las mismas regiones epitópicas de la o las carbapenemasas que la o las del reactivo o reactivos de captura (5).
3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende las etapas de:
- inmovilizar sobre el soporte uno o varios reactivos de control (6) para que interactúen con uno o varios reactivos de detección de control (8),
- proporcionar uno o varios reactivos de detección de control (8) para que interactúen y se unan a dicho reactivo o reactivos de control (6), estando dicho reactivo o reactivos de detección de control (8) enlazados, directa o indirectamente, a un marcador (9) para formar uno o varios conjugados de detección de control (12).
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el o los reactivos de captura (5), el o los reactivos de detección (7) y/o el o los reactivos de control (6) se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, porción o porciones de anticuerpos, nanocuerpos, alfacuerpos, microanticuerpos, afilinas, afímeros, fimómeros, afitinas, o una mezcla de los mismos.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el o los reactivos de detección de control (6) son anticuerpo o anticuerpos monoclonales o policlonales.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcador (9) del reactivo o reactivos de detección (7) y/o del reactivo o reactivos de detección de control (6) se selecciona del grupo que consiste en coloides metálicos, partículas de látex o partículas coloreadas.
7. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de discriminar entre carbapenemasas de tipo OXA-163 y carbapenemasas de tipo OXA-48.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el soporte se selecciona del grupo que consiste en tiras reactivas o dispositivos de flujo lateral.
9. Dispositivo de detección inmunocromatográfico (1), que comprende un soporte (3) que comprende uno o varios reactivos de captura (5) que interactúan con una o varias primeras regiones epitópicas de una o varias carbapenemasas, uno o varios reactivos de detección (7) que interactúan con una o varias segundas regiones epitópicas de dicha o dichas carbapenemasas, estando dicho o dichos reactivos de detección (7) enlazados, directa o indirectamente, a un marcador (9) para formar uno o varios conjugados de detección (11), y en el que el o los reactivos de captura (5), y posiblemente el o los reactivos de detección (7), son específicos y se unen a la siguiente secuencia de aminoácidos o un fragmento de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 aminoácidos de la secuencia: SEQ.ID.NO3: IRAKTGYSTRIEPKIGWW.
10. El dispositivo de detección inmunocromatográfico (1) según la reivindicación 9, que comprende además uno o varios reactivos de control (6) para que interactúen y se unan a uno o varios reactivos de detección de control (8),
estando dicho o dichos reactivos de detección (8) enlazados, directa o indirectamente, a un marcador (9) para formar uno o varios conjugados de control (12).
11. El dispositivo de detección inmunocromatográfico (1) según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que el marcador (9) del reactivo o reactivos de detección (7) y/o del reactivo o reactivos de detección de control (8) se selecciona de grupo que consiste en coloides metálicos, partículas de látex o partículas coloreadas.
12. El dispositivo de detección inmunocromatográfico (1) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 9 a 11, que es una tira reactiva o dispositivo de flujo lateral.
13. El uso del dispositivo de detección inmunocromatográfico (1) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 9 a 12, para la detección y/o la identificación de una carbapenemasa de tipo OXA procedente de enterobacterias productoras de carbapenemasa (CPE) en una muestra biológica.
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