ES2844048T3

ES2844048T3 - Péptido para reparar cartílago y tratar la osteoartritis

Info

Publication number: ES2844048T3
Application number: ES17888703T
Authority: ES
Inventors: Yan Song; Yuansheng Xu; Xiaoyu Lu
Original assignee: Guangzhou Link Health Pharma Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Link Health Pharma Co Ltd
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2021-07-21
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: US20190314453A1; WO2018121235A1; EP3553077A4; EP3553077A1; CN106749606B; CN106749606A; EP3553077B1; US10525105B2

Abstract

Péptido, que comprende 23 aminoácidos, caracterizado porque la secuencia del péptido es GlnLeuLysHisArgAsnHarHisArgIleLysThrGlySerThrAsnHisGlyLeuValGlnSerLeu (SEC ID nº 1), en la que el 1º aminoácido es D-glutamina, el 7º aminoácido es homoarginina y el 23º aminoácido es leucina amidada.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido para reparar cartílago y tratar la osteoartritis

Campo técnico

La presente invención se refiere de manera general al campo de los péptidos, y más particularmente a un péptido para reparar cartílago y/o tratar la osteoartritis, y a un medicamento que contiene el péptido.

Antecedentes

La osteoartritis (OA9 es una enfermedad articular común, caracterizada por dolor y rigidez articular, y el daño al cartílago es la causa principal de la osteoartritis. La osteoartritis se produce más frecuentemente en personas después de la mediana edad y más frecuentemente en mujeres que en hombres. La prevalencia de la osteoartritis es de 10% a 17% en personas de 40 años, de 50% en personas de 60 años o más y de hasta 80% en personas de 75 o más años. La osteoartritis presenta una determinada tasa de discapacidad. Con el envejecimiento de la población, la osteoartritis se convertirá en un problema importante que afecta a la calidad de vida de las personas, y la demanda en el mercado para fármacos para la osteoartritis continuará creciendo.

Actualmente, los fármacos terapéuticos para la osteoartritis en la práctica clínica se clasifican en fármacos terapéuticos específicos y fármacos terapéuticos no específicos. Los fármacos terapéuticos no específicos, tales como fármacos antiinflamatorios no esteroideos, se utilizan principalmente para analgesia y control de los síntomas, pero no presentan un efecto protector del cartílago. Los fármacos terapéuticos específicos, tales como la glucosamina, el condroitínsulfato, el difosfonato, etc., pueden proteger el cartílago articular y retrasar el avance de la osteoartritis. Sin embargo, los fármacos terapéuticos específicos generalmente presentan un efecto de acción relativamente lenta, requiriendo varias semanas de tratamiento. Además, los fármacos terapéuticos específicos no presentan ningún efecto sobre la regeneración del cartílago dañado. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos fármacos para la osteoartritis de buena seguridad y eficacia excelente se ha convertido en un objetivo importante en el campo médico.

El daño al cartílago es la causa principal de la osteoartritis. El cartílago articular está compuesto de matriz extracelular (MEC) abundante y un número limitado de condrocitos incluido en la MEC. El metabolismo de los condrocitos está regulado por muchas citoquinas, entre ellas, la proteína morfogenética ósea (BMP, por sus siglas en inglés) desempeña un papel importante en la síntesis y metabolismo de hueso y cartílago.

La proteína morfogenética ósea, también conocida como proteína de formación ósea, es un polipéptido ácido capaz de inducir la formación ósea y la condrogénesis en un sitio ectópico exterior al hueso. La BMP es una glucoproteína ácida hidrofóbica con un peso molecular de 18000 D y está compuesta por más de diez tipos de aminoácido. La BMP presenta un rendimiento estable bajo condiciones ácidas y presenta una solubilidad determinada en una solución a pH 7,2. En el caso de que el pH de la solución sea superior a 8,5, la BMP es completamente inactiva.

Las BMP son un grupo de factores de crecimiento multifuncionales pertenecientes a la superfamilia de TGF-p y se han identificado y descrito más de 20 miembros de la familia. Un gran número de referencias en la literatura indica que la BMP puede inducir que las células mesenquimales proliferen y se diferencian en osteoblastos o condrocitos. La BMP desempeña un papel clave en la aparición, inducción y reparación del hueso, y puede afectar al crecimiento, diferenciación y apoptosis de las células. La BMP puede estimular significativamente el crecimiento y la maduración de los condrocitos en cultivo y desempeña un papel calve en el nacimiento y desarrollo de diversos tejidos.

La BMP-2 es un polipéptido ácido y presenta la capacidad más potente de inducción de que células madre mesenquimales de la médula ósea se diferencien en osteoblastos de entre la superfamilia de BMP. Sin embargo, la semivida de la BMP-2 es relativamente corta, la concentración terapéutica de b MP-2 resulta difícil de mantener y la BMP-2 no puede actuar sobre más células diana en un tiempo efectivo, por lo que la actividad de inducción de la b MP-2 no puede ejercerse por completo y la aplicación clínica de BMP-2 se ha visto muy limitada. Actualmente, la BMP-2 recombinante es el fármaco de BMP-2 más comúnmente estudiado. Tal como se ha mencionado anteriormente, la BMP-2 presenta una estabilidad baja y una corta semivida, por lo que hay una necesidad urgente de desarrollo de un fármaco nuevo que supere los defectos de la BMP-2 recombinante.

Los documentos a continuación se consideran documentos de la técnica anterior.

Da: Database Geneseq [en línea], 5 de octubre de 2017, "Osteoarthritis treatment related BM23 peptide, SEC ID n° 1."

Db: CN 106749606 A (Guangzhou link health medical technology Co., Ltd.), 31 de mayo de 2017.

Descripción resumida

La presente invención presenta el objetivo de desarrollar un nuevo péptido estable que pueda utilizarse para reparar cartílago y/o tratar la osteoartritis mediante la utilización de la secuencia de aminoácidos de BMP-2 como una fuente. El objetivo de la presente invención se consigue mediante las soluciones técnicas siguientes:

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido (denominado péptido BM23) para reparar cartílago y/o tratar la osteoartritis. El péptido se obtiene mediante mutación y modificación del fragmento polipeptídico de la BMP-2 natural. El péptido contiene 23 aminoácidos, presentando la secuencia de aminoácidos siguiente:

GlnLeuLysHisArgAsnHarHisArglleLysThrGlySerThrAsnHisGlyLeuValGlnSerLeu (SEC ID n° 1), en la que el 1° aminoácido es D-glutamina, el 7° aminoácido es homoarginina y el 23° aminoácido es leucina amidada.

Preferentemente, el péptido puede utilizarse para reparar cartílago y/o para tratar la osteoartritis.

Preferentemente, el extremo carboxilo-terminal del péptido puede someterse a una modificación, incluyendo la amidación.

Preferentemente, una dosis eficaz del péptido para el tratamiento de daño en el cartílago y/o osteoartritis es 1 a 10 mg.

Preferentemente, el péptido puede modificarse para formar una molécula quimérica y la molécula quimérica incluye una proteína d efusión formada mediante una fusión del péptido con una región constante de inmunoglobulina (Fc) o albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés).

Preferentemente, el péptido se utiliza para tratar la osteoartritis en combinación con otros fármacos de la osteoartritis, incluyendo el ácido hialurónico, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, etc.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una sal farmacéuticamente aceptable del péptido BM23, incluyendo acetatos, hidrocloruros, fosfatos o acetatos, preferentemente a los acetatos.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un fármaco, caracterizado porque el fármaco contiene el péptido BM23 a una dosis terapéuticamente eficaz y un portador farmacéuticamente aceptable.

Preferentemente, el portador farmacéuticamente aceptable es una solución salina y el fármaco es inyectable.

Preferentemente, el portador farmacéuticamente aceptable es una solución coloidal, incluyendo un gel de ácido hialurónico y el fármaco es inyectable.

Preferentemente, el fármaco se administra mediante inyección, incluyendo una inyección en la cavidad articular de una rodilla o una inyección subcutánea.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a aplicaciones del péptido BM23 en la preparación de fármacos para reparar el cartílago y/o para tratar la osteoartritis.

En comparación con la técnica anterior, la presente invención presenta las ventajas siguientes: el péptido BM23 de la presente invención supera las desventajas de inestabilidad y corta semivida de los fármacos de b MP-2, presenta una estabilidad y duración de la eficacia in vivo significativamente mejoradas y presenta la actividad de estimular la diferenciación de las células madre mesenquimales en condrocitos y de estimular la proliferación de los condrocitos, facilitando de esta manera la reparación del cartílago dañado y aliviando los síntomas de la osteoartritis.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra una detección mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de un péptido BM23 obtenido mediante un método de síntesis en fase sólida.

La FIG. 2 son fotomicrografías que muestran células madre mesenquimales de la médula ósea (BMSC) de rata en cultivo aislada, en las que A) muestra un cultivo P0 aislado primario de BMSC de rata (ampliación 10x10), y B) muestra un cultivo P1 de primer pase tras un aislamiento primario de BMSC de rata (ampliación 10x10).

La FIG. 3 muestra el efecto de un péptido BM23 sobre la expresión del ARNm del colágeno de tipo II (COL2A1); el nivel de expresión relativo de ARNm de COL2A1 se detectó mediante una PCR cuantitativa. Se utilizó PBS como control negativo y se utilizó factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1) humana como control positivo.

La FIG. 4 muestra el efecto de un péptido BM23 sobre la expresión de ARNm de agrecano (ACAN); el nivel de expresión relativa de ARNm de ACAn se detectó mediante una PCR cuantitativa. Se utilizó PBS como un control negativo e IGF-1 como un control positivo.

La FIG. 5 muestra los resultados inmunohistoquímicos para COL2A1 en células madre mesenquimales tratadas con un péptido de grupo de control y péptido BM23, en el que A) muestra el resultado de una tinción inmunohistoquímica para COL2A1 del grupo de tratamiento de PBS, y B) muestra el resultado de una tinción inmunohistoquímica para COL2A1 tratado con péptido BM23 1 pM.

La FIG. 6 muestra el efecto de un péptido BM23 sobre la proliferación de un condrocito e rata; se midió la proliferación celular mediante un método MTS; se utilizó PBS como un control negativo e IGF-1 como un control positivo.

La FIG. 7 muestra los resultados inmunohistoquímicos para COL2A1 de condrocitos tratados con un péptido de grupo de control y péptido BM23, en el que A) muestra el resultado de una tinción inmunohistoquímica de COL2A1 en el grupo de tratamiento de PBS, y B) muestra el resultado de una tinción inmunohistoquímica de COL2A1 en el grupo de tratamiento con péptido b M23 1 pM.

La FIG. 8 muestra los resultados de observación generales de n grupo de control y un grupo de dosis alta de péptido BM23, en el que A) muestra una situación de reparación de cartílago 90 días después de una primera administración en un grupo de tratamiento con PBS, y B) muestra una situación de reparación de cartílago 90 días después de una primera administración en un grupo de tratamiento con péptido BM23.

La FIG. 9 muestra las puntuaciones de observación general de un grupo de control y de un grupo de péptido BM23 a diferentes dosis.

La FIG. 10 muestra secciones histopatológicas de un grupo de control y de un grupo de dosis alta de péptido BM23, en el que A) muestra una sección histopatológica de cartílago 90 días después de una primera administración en un grupo de tratamiento con PBS, y B) muestra una sección histopatológica de cartílago 90 días después de una primera administración en un grupo de tratamiento con péptido b M23.

La FIG. 11 muestra las puntuaciones histopatológicas de un grupo de control y de un grupo de péptido BM23 a diferentes dosis.

La FIG. 12 muestra un resultado comparativo de estabilidades de un péptido BM23 y un BMP-2 en plasma sanguíneo.

La FIG. 13 muestra un resultado comparativo de semivida de eliminación de plasma sanguíneo de un péptido BM23 y un BMP-2.

Descripción detallada de las realizaciones

A continuación, se describe la presente invención en detalle junto con realizaciones específicas. Las realizaciones siguientes pretenden facilitar una mejor comprensión de la presente invención por el experto en la materia, pero no pretenden limitar la invención en modo alguno.

Realización 1. Síntesis en fase sólida de péptido BM23.

Se confió la síntesis del péptido BM23 (SEC ID n° 1, en la que el 1°, 7° y 23° aminoácido son D-glutamina, homoarginina y leucina amidada, respectivamente) a ABbiochem Co., Ltd., para la síntesis mediante la utilización de un procedimiento convencional en fase sólida y una pureza del péptido sintetizado superior a 98%, tal como se muestra en la fig. 1.

Realización 2. Aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales (BMSC).

Se sacrificaron tres ratas SD de 8 semanas de edad mediante un método de dislocación y se desinfectaron con etanol al 70% durante 5 minutos. A continuación, se cortaron con tijeras las capas de la pared abdominal de las tres ratas SD, se llevó la incisión de cada rata SD a un fémur y se separaron cuidadosamente los músculos sobre el fémur. Se cortó un segmento intermedio del fémur y una cavidad en la médula ósea se lavó repetidamente con medio DMEM bajo en azúcares (que contenía 1 ml/l de heparina) que se aspiró con una jeringa para eliminar por enjuague la médula ósea.

La médula ósea se lavó repetidamente con la jeringa y se preparó en forma de suspensión de células individuales pasándola sucesivamente por una aguja del n° 7 y una aguja del n° 4.

La suspensión de células individuales se centrifugó (1500 r/min, 10 min) y se descartó el sobrenadante; se añadió medio completo DMEM-F12 que contenía FBS al 10% y después se llevó a cabo una inoculación en un matraz de cultivo a una densidad de 107 células/ml y se introdujo el matraz de cultivo en un incubador que presentaba 5% de CO2 a 37°C, para el cultivo.

Las células se purificaron mediante un cultivo adherente diferencial. La solución de cultivo se cambió 48 horas después de la inoculación y posteriormente se cambió la solución de cultivo cada 3 días para eliminar las células hematopoyéticas no adherentes.

Tras crecer las células hasta 80%-90%, se llevó a cabo un pase de cultivo. Se eliminó la solución de cultivo y las células se lavaron con PBS para eliminar el suero residual y se eliminó el PBS.

Se añadieron jugos digestivos de BMSC (que contenían tripsina al 0,25% y solución EDTA al 0,02%) bajo agitación suave hasta que los jugos digestivos de BMSC apenas cubrieran el fondo del matraz de cultivo; el tiempo de digestión fue de aproximadamente 5 minutos. A continuación, se llevó a cabo el pase de cultivo.

Las células se transfirieron a un tubo de centrífuga, se centrifugaron a 1500 r/min durante 10 minutos; se eliminó el sobrenadante y se añadió medio de cultivo completo de células madre mesenquimales para resuspender las células. Los resultados se muestran en las figs. 2A y 2B.

Realización 3. Efecto del péptido BM23 sobre la diferenciación de las células madre mesenquimales in vitro.

Inducción condrogénica.

Se disolvió el péptido BM23 en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Las células se resuspendieron en un medio condrogénico completo (adquirido de Guangzhou Cyagen Biosicences Inc., ítem n° RASMX-90011) que contenía diferentes concentraciones de péptidos BM23 (0,1 pM, 0,3 pM y 1 j M), de manera que la concentración de BMSC fuese de 5,0 * 105 células por ml. Se utilizó PBS como control negativo y factor de crecimiento similar a la insulina 1 pM (IGF-1, adquirido de Beijing Yiqiao Shenzhou Biotechnology Co., Ltd.) como un control positivo.

Las BMSC tratadas se incubaron a 37°C bajo humedad de saturación con 5% de CO2. Se cambió el medio cada 2-3 días y se añadieron a cada tubo 0,5 ml de medio condrogénico completo fresco.

Generalmente, las muestras pueden recogerse tras 28 días de inducción continua y las bolas de cartílago pueden someterse a fijación con formalina, inclusión en parafina, realización de secciones y tinción con azul alcián.

Detección mediante PCR cuantitativa

Extracción del ARN total: se recogieron células, se extrajo el ARN total mediante un método de Trizol y se obtuvo el ADNc mediante transcripción inversa. Las condiciones de reacción fueron: incubación a 30°C durante 10 minutos; incubación a 42°C durante 60 minutos e incubación a 85°C durante 10 minutos.

PCR:

Se llevó a cabo una PCR cuantitativa utilizando ADNc como molde y los cebadores siguientes:

(1) COL2A1-F1 de rata: 5' GCGGAGACTACTGGATTGAT 3'

(2) COL2A1-R1 de rata: 5' CGTTCATGGTCTCTCCAAAC 3'

(3) ACAN-F1 de rata: 5' GAGTTCCCAGATCTGCATGG 3'

(4) ACAN-R1 de rata: 5' TGGTGCTGACGGTAACATTC 3'

Condiciones de reacción: 50°C durante 2 minutos; 95°C durante 2 minutos; 95°C durante 15 segundos; 60°C durante 32 segundos, 40 ciclos.

Análisis de la curva de fusión: temperatura: 60°C-95°C. El análisis se repitió 3 veces para cada muestra.

Inclusión en parafina de tejidos:

Los especímenes se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 24 a 36 horas.

Se sacaron los especímenes para eliminar el fijador y se cortó material en un tamaño adecuado (aproximadamente 0,2 cm de grosor) para la inclusión.

Los especímenes se trataron una vez con etanol al 70%, 80%, 90% y 95%, respectivamente, 60 minutos en cada tratamiento. Los especímenes se trataron dos veces con etanol al 100%; 50 minutos cada vez.

Los especímenes se trataron una vez con 1/2 xileno-1/2 etanol absoluto durante 15 minutos. Los especímenes se trataron dos veces con xileno; 15 minutos cada vez. Los especímenes se incluyeron en cera de parafina (60°C) dos veces; 60 minutos cada vez. Finalmente, se llevó a cabo la inclusión en parafina.

Detección inmunohistoquímica:

Las secciones de tejido incluidas en parafina se desparafinaron dos veces con xileno; 10 minutos cada vez. Las secciones de tejido incluidas en parafina se trataron una vez respectivamente con etanol al 100%, 95%, 85%, 75% y 50% y agua pura, sucesivamente; 5 minutos para cada tratamiento.

Las secciones se lavaron con PBS durante 5 minutos y se incubaron en una caja húmeda con peróxido de hidrógeno a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se lavaron con PBS 3 veces; 5 minutos cada vez.

Las secciones se introdujeron en un horno de microondas y se calentaron bajo calor fuerte hasta la ebullición y se mantuvieron bajo calor suave hasta la ebullición durante 8 minutos (las secciones se sumergieron en solución de reparación de antígeno de ácido cítrico) y tras bajar naturalmente la temperatura de la solución hasta la temperatura ambiente, las secciones se lavaron con PBS durante 5 minutos.

Las secciones se sellaron con suero de cabra normal al 10% en una caja húmeda a temperatura ambiente durante 30 minutos; se incubaron con un anticuerpo primario a 4°C durante la noche y se lavaron con PBS 3 veces; 5 minutos cada vez; las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario en la caja húmeda a temperatura ambiente durante 30 minutos y se lavaron con PBS 3 veces; 5 minutos cada vez. Las secciones se trataron con DAB (3,3'-diaminobencidina) para la coloración y se lavaron con BPS 3 veces, 5 minutos cada vez. Se llevó a cabo una tinción con rojo hematoxilina y las secciones se lavaron con agua para eliminar el exceso de tinte, se diferenciaron durante unos pocos segundos, y se lavaron con agua hasta que volvieron al color azul. Las secciones se sometieron a un gradiente de deshidratación con etanol al 50%, 75%, 85%, 95% y 100%, respectivamente; se trataron con xilenos dos veces para obtener la transparencia y 5 minutos cada vez, y se llevó a cabo el montaje en goma neutra.

Resultados

1. Efecto de inducción de péptido BM23 sobre la expresión génica de COL2A1 y ACAN.

Los niveles de expresión de ARNm de COL2A1 y ACAN inducidos por diferentes concentraciones de péptido BM23 cambiaron y mostraron evidentes relaciones de dosis-efecto y tiempo-efecto. Específicamente, los niveles de expresión de ARNm de COL2A1 y ACAN se incrementaron con el incremento de la concentración de péptido BM23; en comparación con el tratamiento de PBS, el tratamiento con péptido BM23 0,1 pM no presentó ningún efecto significativo y los efectos de tratamiento de péptidos BM23 0,3 pM y 1 pM fueron significativamente diferentes. Además, el efecto de estimulación del péptido BM23 sobre los niveles de expresión de ARNm de COL2A1 y ACAN se incrementaron con el tiempo y el nivel de expresión el día 21° fue más elevado que el nivel en el 7° día. Los resultados se muestran en las figs. 3 y 4.

2. Resultados inmunohistoquímicos de COL2A1.

Tal como se muestra en las figs. 5A y 5B, la tinción inmunohistoquímica para COL2A1 resultó más evidente en el grupo de tratamiento con péptido BM23 1 pM que en el grupo de tratamiento de PBS, indicando que el nivel de expresión de proteína COL2A1 se había incrementado significativamente.

Basándose en los resultados anteriores, los niveles de expresión de COL2A1 y ACAN que se utilizaron como genes marcadores de cartílago se incrementaron, indicando que el péptido BM23 estimula la diferenciación de las células madre mesenquimales en condrocitos.

Realización 4. Aislamiento y cultivo de condrocitos.

El cartílago articular de conejos blancos New Zealand de 2 meses de edad se cortó bajo condiciones estériles y se realizaron secciones de 1 mm de tamaño. El cartílago articular se dirigió a 37°C siguiendo el procedimiento siguiente: (1) digestión con 2 mg/ml de hialuronidasa durante 45 minutos,

(2) digestión con 2 mg/ml de tripsina durante 45 minutos, y

(3) digestión con 4 mg/ml de colagenasa de tipo II durante 3 horas y después centrifugación (1500 r/min) durante 5 minutos, y el precipitado se cultivó en un medio DMEM que contenía suero de feto bovino al 15%.

Realización 5. Efecto del péptido BM23 sobre la proliferación de condrocitos. Identificación in vitro de condrocitos: Se preparó un frotis con una pequeña cantidad de condrocitos primarios; se inmunodetectaron con el anticuerpo de colágeno de tipo I SABC y se tornaron de color amarillo parduzco, indicando que se había secretado el colágeno de tipo I, demostrando de esta manera que la muestra era de condrocitos.

Detección de la proliferación de condrocitos mediante ensayo de MTS.

Se inocularon condrocitos en una placa de 96 pocillos con 2x104 células/pocillo y se añadieron diferentes concentraciones de péptidos BM23 (0,1 pM, 0,3 pM y 1 pM); se fijó PBS como grupo de control negativo e IGF1 (1 pM) como grupo de control positivo.

La placa de 96 pocillos se introdujo en un incubador con atmósfera saturada en vapor de agua y 5% de CO2 para el cultivo a 37°C durante 5 días.

Se añadieron a cada pocillo 20 pl de mezcla de MTS y se continuó el cultivo durante 3 a 4 horas para la coloración.

Antes de los ensayos, la placa de cultivo se sometió a agitación durante 10 segundos para mezclar uniformemente los colores. Se midió la densidad óptica (DO) de cada pocillo a una longitud de onda de 570 nm en un medidor inmunométrico ligado a enzima.

Detección inmunohistoquímica de COL2A1.

Se inocularon condrocitos en una placa de cultivo de 6 pocillos con cubreobjetos a razón de 3,5x105 células/ml y se añadieron diferentes concentraciones de péptidos BM23; se fijó PBS como grupo de control negativo e IGF-1 como grupo de control positivo.

La placa de cultivo de 6 pocillos se introdujo en un incubador con atmósfera saturada en vapor de agua y 5% de CO2 para el cultivo a 37°C durante 5 días.

La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo tal como en la realización 3.

Resultados

Efecto de estimulación del péptido BM23 sobre la proliferación de los condrocitos.

Tras 5 días de tratamiento con diferentes concentraciones de péptidos BM23, los condrocitos mostraron diferencias significativas de proliferación. En comparación con el grupo de PBS, la proliferación de los condrocitos se estimuló significativamente tanto el grupo de péptido BM23 como el grupo de control positivo, tal como se muestra en la fig. 6. Efecto de estimulación del péptido BM23 sobre la expresión de COL2A1.

En comparación con el grupo de tratamiento de PBS, la tinción inmunohistoquímica de COL2A1 resultó más evidente en el grupo de tratamiento de péptido BM23 1 j M, indicando que el nivel de expresión de proteína COL2A1 se encontraba significativamente incrementando, tal como se muestra en las figs. 7A y 7B.

Basándose en los resultados anteriores, el péptido BM23 puede estimular la proliferación de los condrocitos in vitro. Realización 6. Modelo de reparación de cartílago de conejo.

Animales: conejos New Zealand, 2 meses de edad, la mitad machos y la mitad hembras.

Construcción de modelos: se anestesiaron conejos New Zealand con pentobarbital sódico al 6% (0,7 ml/kg) por las venas marginales del oído. Tras la anestesia, se realizó una incisión longitudinal de aproximadamente 3 cm de longitud en el lado medial de la articulación de la rodilla de la pata trasera izquierda; la piel, tejido subcutáneo y cápsula articular se cortaron sucesivamente manteniendo la integridad del ligamento rotuliano y la rótula se volvió hacia el exterior para exponer el cóndilo femoral. Con la articulación de la rodilla flexionada 90°, se realizó un defecto en el cartílago articular mediante perforación con un diámetro de 4,2 mm y una profundidad de 3 mm en el fémur y en la parte media de las superficies articulares intercondilares laterales correspondientes a la rótula mediante la utilización de una broca de 4,2 mm de diámetro (según el sangrado visible en el hueso subcondral). Se lavó el defecto con solución salina normal sin ningún otro tratamiento. Tras fijar nuevamente el húmero, las incisiones en músculo y piel se suturaron secuencialmente. Tras fijar nuevamente la rótula, las incisiones en músculo y piel se suturaron secuencialmente. Tras la operación, inmediatamente los animales recibieron una inyección intramuscular de solución de penicilina una vez al día durante 3 días consecutivos para prevenir la infección.

Administración: los conejos New Zealand con defectos en el cartílago articular de la rodilla se dividieron en cuatro grupos: grupo de control negativo, grupo de dosis baja (1 mg/conejo), grupo de dosis media (3 mg/conejo) y grupo de dosis elevada (10 mg/conejo); 12 conejos en cada grupo, la mitad machos y la mitad hembras en cada grupo. Al 6° día de iniciar la construcción de los modelos, se realizó la administración intraarticular en cada grupo de conejos. Es decir, se administró 1 mg/conejo, 3 mg/conejo y 10 mg/conejo en los conejos de ensayo, respectivamente, y el volumen de administración era de 0,2 ml.

Sacrificio y observación: a los 90 días de iniciar la primera administración, se seleccionaron 6 conejos (la mitad machos y la mitad hembras) de cada grupo y se sacrificaron, y se observó mediante disección la situación de reparación del cartílago articular de la rodilla en cada conejo.

(1) Observación general: durante la necropsia, se abrió la cavidad articular, se expuso la superficie articular de la rótula y se observó la reparación del borde de relleno del defecto, la lisura de la superficie del cartílago, el color del nuevo cartílago, etc.

Después, se llevó a cabo la puntuación según los criterios siguientes:

0 puntos: la superficie articular es lisa y el color es normal;

1 punto: la superficie articular es rugosa, con pequeñas fisuras y color oscuro;

2 puntos: el defecto del cartílago ha alcanzado la capa intermedia del cartílago;

3 puntos: se ha formado úlcera en la superficie articular y el defecto del cartílago ha alcanzado la capa profunda del cartílago, y

4 puntos: el cartílago está exfoliado y los huesos subcondrales están expuestos.

(2) Observación histopatológica: se llevó a cabo la observación bajo el microscopio óptico y la puntuación se llevó a cabo de acuerdo con el estándar de puntuación patológica del ICRS:

grado 0: la superficie del cartílago es plana y el cartílago está intacto;

grado 1: se han formado fibras superficiales en la superficie del cartílago y son desiguales;

grado 2: la superficie del cartílago es discontinua, acompañada de proliferación celular y los materiales metacromáticos se encuentran incrementados o disminuidos en las capas M-MI;

grado 3: ragadía del cartílago ha alcanzado la capa III o se produce erosión;

grado 4: la erosión del cartílago es grave y el cartílago articular está dañado;

grado 5: el cartílago articular está exfoliado, y

grado 6: la articulación está deformada.

(3) Tinción de HE

Tras sacrificar los conejos mediante anestesia y exsanguinación, el tejido del cartílago articular se exfolió y se fijó con formalina neutra al 10%, seguido de deshidratación, inclusión convencional en parafina, seccionado, tinción de HE y montaje, y la detección se llevó a cabo mediante microscopia óptica.

Resultados

Noventa días después de la administración, se observó el defecto de la articulación de la rodilla en cada conejo. Grupo de control negativo:

La superficie del defecto del cartílago se encontraba evidentemente hundida y la superficie era plana y completa; se observó crecimiento rampante en los cartílagos periféricos, aunque el color era apagado, y la puntuación general de la observación fue de 4,3 puntos.

Grupo de dosis baja:

La superficie del defecto del cartílago se encontraba más evidentemente hundida; la superficie era relativamente plana; se observó crecimiento rampante en los cartílagos periféricos, aunque el color era apagado, y la puntuación general de la observación fue de 3,7 puntos.

Grupo de dosis intermedia:

La superficie del defecto del cartílago no se encontraba claramente hundida en comparación con la superficie normal y la superficie era plana y completa; los cartílagos periféricos se encontraban cubiertos y el color no era diferente del color del cartílago normal, y la puntuación general de la observación fue de 3,0 puntos.

Grupo de dosis elevada:

La superficie del defecto del cartílago no se encontraba claramente hundida en comparación con la superficie normal y la superficie era plana y completa; los cartílagos periféricos se encontraban cubiertos y el color no era diferente del color del cartílago normal, y la puntuación general de la observación fue de 2,1 puntos.

Los resultados generales de la observación se muestran en la fig. 8 y las puntuaciones se muestran en la fig. 9. Resultados del examen histopatológico:

Grupo de control negativo:

En 6/6 conejos, las cavidades articulares eran suaves y normales; la zona del defecto del cartílago estaba dominada por hiperplasia de tejido fibroso con una pequeña cantidad de condrocitos; había fisuras en la unión y una mala integración en ambos extremos. Las puntuaciones histopatológicas del cartílago articular en 6/6 conejos eran de 4,3 puntos.

Grupo de dosis baja:

En 6/6 conejos, las cavidades articulares eran suaves y normales; la zona del defecto del cartílago estaba dominada por hiperplasia de tejido fibroso con una pequeña cantidad de condrocitos; la capa superficial del defecto estaba cubierta por células, no había fisuras en la unión y los dos extremos estaban bien integrados. Entre ellos, en 1/6 conejos, se observó crecimiento rampante en los cartílagos periféricos y se había formado una pequeña cantidad de matriz del cartílago, y en 1/6 conejos, la superficie del defecto del cartílago se encontraba ligeramente hundida. Las puntuaciones histopatológicas del cartílago articular en 6/6 conejos eran de 3,7 puntos.

Grupo de dosis media:

En 6/6 conejos, las cavidades articulares eran suaves y normales; en la zona del defecto articular se observaba hiperplasia de tejido fibroso, y se había formado un gran número de condrocitos y matriz de cartílago; la capa superficial se encontraba cubierta continuamente por células; la capa superficial era irregular; no había fisuras en la unión y los dos extremos se encontraban bien integrados. Las puntuaciones histopatológicas del cartílago articular en 6/6 conejos eran de 3,0 puntos.

Grupo de dosis elevada:

En 6/6 conejos, las cavidades articulares eran suaves y normales; en la zona del defecto articular se observaba hiperplasia de tejido fibroso; se había formado un gran número de condrocitos y matriz de cartílago; la capa superficial se encontraba cubierta continuamente por células, no había fisuras en la unión y los dos extremos se encontraban bien integrados. Las puntuaciones histopatológicas del cartílago articular en 6/6 conejos eran de 2,1 puntos.

Las secciones histopatológicas se muestran en la fig. 10 y las puntuaciones se muestran en la fig. 11.

Los resultados anteriores indican que el péptido BM23 presenta un efecto de reparación significativo sobre el daño del cartílago in vivo, y que este efecto de reparación muestra una relación dependiente de la dosis.

Realización 7. Comparación entre estabilidades en plasma sanguíneo.

Preparación de plasma sanguíneo: se muestrearon 10 ml de sangre completa con anticoagulante procedente de voluntarios sanos y se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 minutos; se separó el sobrenadante amarillo pálido, es decir, el plasma.

Los péptidos BM23 y BMP-2 (adquiridos de Beijing Yiqiao Shenzhou Biotechnology Co., Ltd.) se incubaron respectivamente con plasma humano a 37°C a una concentración final de 50 pg/ml.

Se extrajeron muestras de 20 pl a los 10, 30, 60, 120 y 240 minutos y el contenido de los péptidos BM23 y BMP-2 en el plasma sanguíneo se detectó mediante HPLC, expresado como superficie relativa de pico (%).

Resultados: tras incubar en plasma sanguíneo durante 4 horas, la concentración de péptido BM23 se mantuvo estable, mientras que la concentración de BMP-2 se redujo significativamente tras incubar BMP-2 en plasma sanguíneo durante 30 minutos (fig. 12), indicando que la estabilidad del péptido BM23 en plasma sanguíneo era superior a la de BMP-2.

Realización 8. Comparación de la semivida de eliminación in vivo en plasma sanguíneo.

Con el fin de confirmar que el péptido BM23 sintetizado presenta una semivida relativamente prolongada, se detectó la semivida de los péptidos BM23 y BMP-2 en conejos mediante el método de CL/EM/EM.

La metodología de CL/EM/EM está establecida; se dotó un CL/EM Finnigan TSQ Discovery Max con el sistema de HPLC Surveyor. El límite de detección era de 1-1000 ng/ml y la tasa de recuperación era superior a 80%.

Se asignaron aleatoriamente seis conejos New Zealand a dos grupos (tres conejos en cada grupo). En los dos grupos se inyectaron por vía intravenosa 0,5 mg/kg de péptido BM23 y 0,5 mg/kg de BMP-2, respectivamente; se extrajeron muestras de sangre de 0,5 ml a los 5, 10, 15, 30, 60, 120, 180 y 300 minutos y se introdujeron en tubos con anticoagulante, respectivamente, y se centrifugaron a 2000 rpm para separar el plasma sanguíneo y después se almacenaron a -20°C hasta las mediciones.

La concentración sanguínea se midió mediante el método de CL/EM/EM; se extrajeron 100 pl de plasma sanguíneo; se añadieron 500 pl de un solvente mixto que contenía IS 2000 ng/ml de solución de acetonitrilo y metanol en una proporción de 70:30; se agitó y se centrifugó a 12000 rpm durante 10 minutos. Se inyectaron 20 pl de sobrenadante para el análisis de CL/EM/EM. Se calcularon los parámetros farmacocinéticos principales mediante la utilización del software de farmacocinética 3P97.

Los resultados mostraron que la semivida del péptido BM23 era de 123±38 minutos; la semivida de BMP-2 era de 23±11 minutos; la semivida del péptido BM23 era significativamente más larga que la de BP-2 (fig. 13). La semivida más larga del péptido BM23 resulta beneficiosa para el efecto duradero del fármaco y reduce la frecuencia de administración.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Péptido, que comprende 23 aminoácidos, caracterizado porque la secuencia del péptido es GlnLeuLysHisArgAsnHarHisArglleLysThrGlySerThrAsnHisGlyLeuValGlnSerLeu (SEC ID n° 1), en la que el 1° aminoácido es D-glutamina, el 7° aminoácido es homoarginina y el 23° aminoácido es leucina amidada.
2. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido puede utilizarse para reparar cartílago y/o tratar la osteoartritis.
3. Péptido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el extremo carboxilo-terminal del péptido se somete a amidación.
4. Sal farmacéuticamente aceptable del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la sal farmacéuticamente aceptable comprende acetatos, hidrocloruros, fosfatos o acetatos, preferentemente acetatos.
5. Fármaco, caracterizado porque el fármaco comprende el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 a una dosis terapéuticamente eficaz y un portador farmacéuticamente aceptable.
6. Fármaco según la reivindicación 5, caracterizado porque el portador farmacéuticamente aceptable es una solución salina y el fármaco es inyectable.
7. Fármaco según la reivindicación 5, caracterizado porque el portador farmacéuticamente aceptable es una solución coloidal, incluyendo un gel de ácido hialurónico y el fármaco es inyectable.
8. Fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque el método de administración es un método de inyección, incluyendo una inyección en la cavidad articular de la rodilla o una inyección subcutánea.
9. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la utilización en el tratamiento del daño a cartílago y/o osteoartritis, caracterizado porque una dosis eficaz del péptido es 1 a 10 mg.
10. Péptido según la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido se administra en combinación con otros fármacos osteoartríticos y los otros fármacos para la osteoartritis comprenden ácido hialurónico y fármacos antiinflamatorios no esteroideos.