ES2844874T3 - Complejo de proteína de leche y ácido graso - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende (a) leche o un extracto de la misma que contiene proteína bruta; (b) un ácido graso insaturado que tiene 18 átomos de carbono o una sal del mismo; y (c) un agente acidificante en una cantidad suficiente para reducir el pH de la composición a menos de 4; en el que la composición ha sido tratada térmicamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Complejo de proteína de leche y ácido graso

La presente invención se refiere a nuevas composiciones nutracéuticas. Estas composiciones se pueden utilizar en particular para la prevención pero también para el tratamiento terapéutico de enfermedades proliferativas, tales como cáncer, además de tener aplicaciones antibacterianas y antivíricas. Los procedimientos para preparar estas composiciones y su uso en terapia, incluida la profilaxis y como nutracéuticos, forman aspectos adicionales de la invención.

Los cánceres de colon siguen siendo un desafío terapéutico importante y el cáncer de colon es una de las principales causas de muerte relacionadas con el cáncer. Si bien la tasa de supervivencia a 5 años es extremadamente favorable después de la detección precoz y el tratamiento de tumores localizados, la mayoría de los cánceres colorrectales son invasivos local o distalmente en el momento del diagnóstico, lo que limita las opciones de tratamiento y reduce la supervivencia. Más del 80 % de todos los tumores colorrectales esporádicos y hereditarios muestran una pérdida de la función APC (poliposis adenomatosa coli), debido a menudo a mutaciones de truncamiento en el gen (Vogelstein, y col. (1988) N Engl J Med 319: 525-532). La APC actúa como un supresor de tumores al operar como una proteína estructural junto con Axina para la caseína quinasa 1 (CK1) y la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3), que fosforilan la p-catenina para la ubiquitinación posterior y la degradación proteasómica. La formación del tumor se inicia con una segunda mutación somática del alelo de APC de tipo salvaje, que estimula la expresión génica dependiente de p-catenina, incluidos genes como Ciclina D1, VEGF y Cox-2 (Bienz M y col. (2000) Cell 103: 311-320). Con tiempo, los tumores acumulan mutaciones adicionales, que afectan, por ejemplo, a KRAS y genes apoptóticos como p53 (Vogelstein y col. citado anteriormente). Sin embargo, la mutación puntual APC es suficiente para la iniciación del tumor y los ratones que portan el alelo ApcMin/+ con una mutación puntual sin sentido en el nucleótido 2549 desarrollan espontáneamente múltiples adenomas intestinales y, por lo tanto, se han utilizado ampliamente como modelo de poliposis adenomatosa coli familiar y cáncer colorrectal humano (Moser AR y col. (1990) Science 247: 322-324).

HAMLET (alfa-lactoalbúmina humana letal para las células tumorales) es el primer miembro de una nueva familia de complejos de proteína desplegada-lípido tumoricidas, que consiste en a-lactoalbúmina parcialmente desplegada y ácido oleico. Inicialmente aislada en forma de una fracción obtenida pasando una fracción que contiene caseína de leche humana por una columna de intercambio iónico en condiciones de alta salinidad (documento WO96/004929), se descubrió que era biológicamente activa y en particular tenía una actividad antibacteriana. Posteriormente, se han obtenido otros procedimientos para preparar complejos activos, incluidos procedimientos en los que la alactoalbúmina de diversas fuentes y el ácido oleico se calientan juntos en solución. Además, sin embargo, HAMLET y complejos relacionados, tales como BAMLET, derivados de alfa-lactoalbúmina bovina, se ha descubierto que destruye las células transformadas, tales como células tumorales o células de papiloma, además de tener actividad antivírica. HAMLET destruye muchos tipos de células tumorales in vitro y esta actividad tumoricida se mantiene in vivo, como se muestra en modelos animales de xenoinjertos de glioblastoma humano y cáncer de vejiga, así como en estudios clínicos. La aplicación tópica de HAMLET eliminó o redujo los papilomas cutáneos y las instilaciones locales de HAMLET destruyeron las células cancerosas de la vejiga pero no las células sanas de los tejidos circundantes y provocaron una reducción del tamaño del tumor. La sensibilidad de las células tumorales a HAMLET refleja la transformación oncogénica y se ve modificada por el estado glucolítico de la célula (Storm P, y col. (2011).Oncogene). El silenciamiento de ARNsh de los miembros de la ruta de c-Myc o Ras confirió resistencia a HAMLET y el nivel de expresión de c-Myc fue paralelo al de la sensibilidad a HAMLET. Adicionalmente, la privación de glucosa sensibilizó a las células tumorales a HAMLET y la sensibilidad a HAMLET fue modificada por ARNhc dirigidos a enzimas glucolíticas. Adicionalmente, se demostró que HAMLET tiene efectos pronunciados sobre el metabolismo global con una parálisis metabólica rápida en las células tumorales y una posible desviación del flujo glucolítico hacia la ruta de las pentosas fosfato.

Los solicitantes consideraron si HAMLET o las entidades terapéuticas relacionadas pueden usarse para la terapia del cáncer de colon. Los componentes de HAMLET están presentes en la leche materna, donde el complejo se forma después del desplegamiento de la proteína y la hidrólisis del ácido oleico de los triglicéridos de la leche. A pH bajo, HAMLET puede montarse, para el paso a través del tracto gastrointestinal del niño lactante. Los estudios in vitro han demostrado que HAMLEt es resistente a la proteasa, lo que sugiere que al sobrevivir al duro ambiente gastrointestinal, HAMLET puede alcanzar y destruir células sensibles a sus efectos, incluyendo progenitores de cáncer de colon. Los solicitantes investigaron si HAMLET actúa como terapéutico contra el cáncer de colon, usando administración por vía oral en el modelo de ratón APCmin.

En vista del desarrollo gradual del tumor, que tiene lugar en este modelo, los solicitantes también exploraron si HAMLET actúa de forma profiláctica en ratones genéticamente susceptibles. Los resultados demuestran claramente los efectos profilácticos y terapéuticos de HAMLET, así como dianas en la ruta de señalización Wnt/p-catenina. Si bien se ha demostrado previamente que el uso de complejos tales como HAMLET es terapéutico en el tratamiento de una serie de cánceres preexistentes, incluidos cánceres de mucosas (documento WO2005/082406), y para el tratamiento profiláctico de infecciones bacterianas, no se ha demostrado previamente que sea útil en la prevención del cáncer. Por lo tanto, este hallazgo abre un nuevo enfoque para la profilaxis de la enfermedad proliferativa.

En el presente documento se describe un complejo biológicamente activo que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de una proteína de origen natural o una variante de la misma, en el que dicho polipéptido se despliega al menos parcialmente en comparación con dicha proteína de origen natural, por ejemplo, como resultado de una modificación de al menos un resto de cisteína; o un péptido de hasta 50 aminoácidos; y un ácido graso o lípido o una sal del mismo, para su uso en el tratamiento profiláctico del cáncer, en particular del tracto gastrointestinal.

Este descubrimiento significa que los complejos pueden usarse en la prevención de cánceres y, en particular, cáncer de colon. Puede usarse en cualquier individuo, pero puede encontrar una utilidad particular en individuos que tienen una predisposición genética al cáncer de colon, en particular como resultado de una mutación, tal como un truncamiento del gen APC.

El complejo puede administrarse en forma de un producto farmacéutico, en cuyo caso el complejo se proporciona en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, o, como alternativa, el complejo puede combinarse con un producto alimentario, tal como un producto lácteo, tal como yogur, para su uso como nutracéutico.

El complejo o composición que lo contiene se administra de manera adecuada por vía oral para que pueda acceder directamente al tracto gastrointestinal.

El polipéptido presente en el complejo puede tener la secuencia de una a-lactoalbúmina o una variante de la misma o una lisozima o una variante de la misma.

Como se utilizan en el presente documento, la expresión "biológicamente activo" significa que el complejo tiene una actividad biológica, que es diferente, o más fuerte, que los componentes individuales. En particular, el complejo es capaz de inducir la muerte celular en particular de forma selectiva en células tumorales y/o tiene un efecto bactericida o antivírico no visto con la proteína nativa, incluyendo, por ejemplo, formas monoméricas de alactoalbúmina, aunque pueden estar disponibles otros efectos terapéuticos.

Los péptidos adecuados para su uso en el complejo pueden ser un fragmento del polipéptido o de la proteína de origen natural. El término "fragmento", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier porción de la secuencia de aminoácidos dada que formará un complejo con la actividad similar a los complejos que incluyen la secuencia de proteína completa, tal como una secuencia de aminoácidos de a-lactoalbúmina o lisozima. Los fragmentos pueden comprender más de una porción dentro de la proteína de longitud completa, unidos. Las porciones comprenderán adecuadamente al menos 5 y, preferentemente, al menos 10 aminoácidos consecutivos de la secuencia básica.

Los fragmentos adecuados incluirán mutantes de deleción que comprenden al menos 10 aminoácidos, por ejemplo al menos 20, más adecuadamente, al menos 50 aminoácidos de longitud o péptidos sintéticos análogos con estructuras similares. Incluyen pequeñas regiones de la proteína o combinaciones de estas.

También se describe un complejo biológicamente activo que comprende un péptido de no más de 50 aminoácidos y una sal farmacéuticamente aceptable de un ácido graso o lípido. El péptido no tiene más de 50 aminoácidos y, en particular, puede tener de 10-45 aminoácidos. Tales complejos son más fáciles de preparar y los materiales de partida son menos costosos. Por ejemplo, los péptidos se pueden preparar usando procedimientos convencionales para la producción de péptidos. Los complejos formados pueden ser más fáciles de manipular y formular para su administración, debido al menor peso molecular.

Cualquier péptido se deriva adecuadamente de una proteína de origen natural o una variante de la misma. Las proteínas adecuadas son aquellas identificadas como activas en tales complejos, tal como alfa-lactoalbúmina, betalactoglobulina o lisozima. En particular, el péptido es un fragmento de alfa-lactoalbúmina y específicamente un fragmento del dominio alfa de alfa-lactoalbúmina. El péptido puede comprender aminoácidos de alfa 1 (restos 1-40) o Alfa 2 (restos 81-123) de alfa-lactoalbúmina humana, o regiones análogas de otras alfa-lactoalbúmina, tal como alfa-lactoalbúmina bovina.

El péptido no contiene adecuadamente elementos que dan lugar a plegamiento y, por tanto, carece adecuadamente aminoácidos que dan lugar a enlaces intramoleculares, tal como restos de cisteína. En particular, cuando el péptido deriva de una proteína de origen natural, cualquier resto de cisteína es sustituido por otros aminoácidos, tal como alanina.

Por lo tanto, el complejo puede comprender aminoácidos de Alfa 1 (restos 1-40) o Alfa 2 (restos 81-123) de alfalactoalbúmina humana en la que las cisteínas son sustituidas por otros aminoácidos, tal como alanina, para evitar cualquier enlace intramolecular.

Por tanto, el péptido puede ser de SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4

KQFTKXELSQLLKDIDGYGGIALPELIXTMFHTSGYDTQA (SEQ ID NO 3)

LDDDITDDIMXAKKILDIKGIDYWLAHKALXTEKLEQWLXEKL (SEQ ID NO 4) donde X es un resto de aminoácido distinto a cisteína.

Un ejemplo particular de dichas secuencias son las de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

KQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQA (SEQ ID NO 5)

LDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYWLAHKALATEKLEQWLAEKL (SEQ ID NO 6).

En el complejo también se pueden usar otros péptidos y la idoneidad se puede analizar determinando si los complejos con una sal de ácido graso son activos, por ejemplo, para abrir canales de iones de potasio y/o matar células usando procedimientos como se describe a continuación en el presente documento.

Por ejemplo, los fragmentos adecuados de a-lactoalbúmina son aquellos descritos anteriormente que derivan únicamente de los dominios alfa, pero otros que pueden seleccionarse incluyen la región, que forma los dominios alfa o beta o la interfaz entre los dominios alfa y beta, en la a-lactoalbúmina humana, definida por los aminoácidos 34-38 y 82-86 en la estructura. Por tanto, los fragmentos adecuados incluirán estas regiones y, preferentemente, la región completa del aminoácido 40-105 de la proteína nativa. Sin embargo, pueden encontrarse otros fragmentos activos.

La expresión "variante" se refiere a proteínas o polipéptidos que tienen una función biológica similar pero en la que la secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de bases de la que se deriva en que uno o más aminoácidos dentro de la secuencia se sustituyen por otros aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden considerarse "conservadoras" cuando un aminoácido se reemplaza con un aminoácido diferente con propiedades ampliamente similares. Las sustituciones no conservadoras son aquellas en las que los aminoácidos se reemplazan con aminoácidos de un tipo diferente.

Por "sustitución conservadora" se entiende la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido de la misma clase, en el que las clases se definen de la siguiente manera:

Clase Ejemplos de aminoácidos

No polares: A, V, L, I, P, M, F, W

polares no cargados: G, S, T, C, Y, N, Q

ácidos: D, E

básicos: K, R, H

Como saben bien los expertos en la materia, la alteración de la estructura primaria de un péptido mediante una sustitución conservadora puede no alterar significativamente la actividad de ese péptido porque la cadena lateral del aminoácido que se inserta en la secuencia puede formar enlaces y contactos similares a los de la cadena lateral del aminoácido que ha sido sustituido. Esto es así incluso cuando la sustitución se encuentra en una región que es crítica para determinar la conformación del péptido.

Son posibles sustituciones no conservadoras siempre que no interrumpan la función de los polipéptidos del dominio de unión al ADN. En términos generales, serán posibles menos sustituciones no conservadoras sin alterar la actividad biológica de los polipéptidos.

La determinación del efecto de cualquier sustitución (y, de hecho, de cualquier deleción o inserción de aminoácidos) está completamente dentro de las capacidades rutinarias del experto en la materia, que puede determinar fácilmente si un polipéptido variante conserva las propiedades fundamentales y la actividad de la proteína básica. Por ejemplo, el experto en la materia puede determinar si los complejos que comprenden la variante retienen la actividad biológica (por ejemplo, muerte de células tumorales) de los complejos formados con formas desplegadas de la proteína nativa y el polipéptido tiene al menos un 60 %, preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 %, aún más preferentemente un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de la proteína nativa.

Las variantes del polipéptido pueden comprender o consistir esencialmente en una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 % de identidad, por ejemplo al menos del 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad con una secuencia de proteína nativa, tal como una secuencia de alfa-lactoalbúmina o lisozima.

El nivel de identidad de secuencia se determina adecuadamente usando el programa informático BLASTP con las secuencias de proteínas nativas como la secuencia de bases. Esto significa que las secuencias de proteínas nativas forman la secuencia contra la que se determina el porcentaje de identidad. El software BLAST está disponible públicamente en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (accesible el 12 de marzo de 2009).

La proteína puede comprender lisozima y, en particular, lisozima equina.

El polipéptido puede ser una a-lactoalbúmina, tal como a-lactoalbúmina humana, bovina u ovina. Si bien las variantes de estos como se ha descrito anteriormente pueden ser útiles en la invención, para uso nutracéutico en particular, puede ser preferible utilizar las proteínas nativas en los productos. Una realización particular utilizó alactoalbúmina humana. En otra realización, la a-lactoalbúmina es la a-lactoalbúmina bovina. La secuencia de una amplia gama de a-lactoalbúminas se conoce en la literatura, por ejemplo, como se muestra en Watanabe y col., J. Vet Med Sci, (2000) 62(11); 1217-1219.

El polipéptido puede comprender una proteína recombinante que tiene la secuencia de a-lactoalbúmina o un fragmento de la misma pero que carece de enlaces disulfuro intramoleculares o reticulaciones. Asegurándose de que la proteína recombinante carece de enlaces cruzados de disulfuro intramoleculares, la molécula será tridimensionalmente no nativa y completamente inactiva en términos de su actividad biológica endógena original. Esto se puede lograr, por ejemplo, cambiando los restos de cisteína en la a-lactoalbúmina nativa por otros restos, en particular restos de alanina, aunque se pueden considerar otros medios, por ejemplo, la adición de compuestos de tiol o la alteración del pH de la proteína. Preferentemente, todos los restos de cisteína se cambiarán por otros restos, tales como restos de alanina. En particular, la proteína recombinante se basa en la secuencia de a-lactoalbúmina humana pero a-lactoalbúmina de otras fuentes, incluida la a-lactoalbúmina bovina u ovina puede usarse para derivar la proteína recombinante.

El polipéptido puede ser una proteína recombinante que tiene la secuencia de a-lactoalbúmina madura nativa pero que tiene todas las cisteínas encontradas en las posiciones 6, 28, 61, 73, 77, 91, 111 y 120 en la secuencia de longitud completa de a-lactoalbúmina humana madura mutada a otros aminoácidos, tal como alanina, que no dan lugar a puentes disulfuro. Por tanto, una proteína particular que se puede utilizar comprende una proteína de SEQ ID NO 1.

KQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKLWA

K S SQ VPQ SRNIADIS ADKFLDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYWLAHKALATEKLEQWLAE

KL (SEQ ID NO 1)

donde el tipo en negrita indica las posiciones de mutaciones de cisteínas en a-lactoalbúmina humana nativa.

Como se informa en el documento WO2010079362, restos de aminoácidos adicionales, por ejemplo hasta 20 aminoácidos, pueden estar unidos al terminal N y/o C de la proteína, si es conveniente, por ejemplo, con fines de expresión. Por tanto, en particular, se ha usado una proteína recombinante como se muestra en la SEQ ID NO. 1 pero con una metionina adicional en el extremo N-terminal (SEQ ID NO 2 mostrada más adelante).

MKQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKL

W A K S SQ VPQ SRNIADIS ADKFLDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYWLAHKALATEKLEQWL

AEKL (SEQ ID NO 2)

Los ácidos grasos o lípidos adecuados incluyen aquellos que se sabe que proporcionan complejos biológicamente activos. Estos incluyen ácidos grasos, por ejemplo, como se describe en el documento WO2008058547. Cuando se usan sales, estas son adecuadamente sales solubles en agua. Los ejemplos particulares de sales adecuadas pueden incluir sales de metales alcalinos o alcalinotérreos. En una realización particular, la sal es una sal de metal alcalino, tal como una sal de sodio o potasio. Cuando se utilizan en productos farmacéuticos, las sales serán farmacéuticamente aceptables y serán adecuadas para uso alimentario cuando se utilizan en nutracéuticos.

El ácido graso de la invención tiene 18 átomos de carbono y está insaturado.

En particular, sin embargo, los complejos de la invención utilizan sales de ácidos que tienen 18 átomos de carbono. Un ejemplo específico es una sal de ácido oleico, en particular una sal de ácido oleico C18:1 de fórmula CH3(CH2)yCH=CH(CH2)yCOOH o CH3(CH2)yCH=CH(CH2)yCOO-.

Los solicitantes han descubierto que las composiciones que tienen una actividad biológica útil se pueden preparar directamente a partir de leche o de extractos crudos de leche. Se cree que la actividad de tales composiciones se debe a la presencia de complejos tales como HAMLET o BAMLET, pero pueden estar presentes otros componentes activos.

Por tanto, un primer aspecto de la invención proporciona una composición que comprende:

(a) leche o un extracto de la misma que contenga proteína bruta;

(b) un ácido graso insaturado que tiene 18 átomos de carbono o una sal del mismo; y

(c) un agente acidificante en una cantidad suficiente para reducir el pH de la composición a menos de 4; en el que la composición ha sido tratada térmicamente.

Se ha descubierto que las composiciones de este tipo son biológicamente activas y, en particular, parecen tener como objetivo y destruir células tumorales, con preferencia de células sanas de una manera similar a HAMLET. El nivel de actividad no puede explicarse por completo por la presencia de algún complejo HAMLET en la composición. Por tanto, parece que, de forma sorprendente, otros componentes de la leche o del extracto de leche cruda no interfieren con la actividad similar a HAMLET, y esos otros componentes contenidos en la composición pueden mejorar la eficacia de la composición. Al utilizar leche o extractos crudos en la preparación de composiciones activas en lugar de proteínas puras, se reduce el coste de los materiales de partida.

En una realización particular en la composición del primer aspecto de la invención, el componente (a) es un extracto de leche que contiene proteína cruda. La expresión "extracto que contiene proteína bruta" se refiere a composiciones obtenidas de la leche mediante procedimientos físicos o químicos simples o combinaciones de estos, sin la necesidad de una purificación significativa utilizando procedimientos tales como purificación o columnas de intercambio iónico. Por ejemplo, se puede obtener un extracto que contiene proteína cruda desgrasando la leche, por ejemplo, usando un procedimiento de centrifugación en el que las grasas pesadas se hunden en la base de un tubo de centrifugación y así se pueden separar de los componentes más ligeros, tales como las proteínas que permanecen en el sobrenadante.

Alternativa o adicionalmente, se puede obtener un extracto que contiene proteína cruda sometiendo la leche a una precipitación tal como una precipitación con sulfato de amonio, por ejemplo, usando una solución de sulfato de amonio que tiene una concentración de 30-70 %, por ejemplo, aproximadamente 50 % de una solución saturada. Esto tiene el efecto de eliminar las proteínas de la leche sustancialmente insolubles, dejando más proteínas solubles en solución en el sobrenadante. En este caso, el sobrenadante forma un extracto que contiene proteína cruda adecuado para su uso en la composición de la invención.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, el extracto que contiene proteína cruda usado en la composición es uno que se ha desgrasado y luego se ha sometido a una precipitación con sulfato de amonio como se ha descrito anteriormente. Los ácidos grasos o lípidos adecuados usados como componente (b) anterior incluyen aquellos que se sabe que proporcionan complejos biológicamente activos y son como se ha descrito anteriormente. La cantidad de componente (b) presente en la composición está adecuadamente en un exceso molar de la proteína o proteínas presentes en el componente (a) que es capaz de formar un complejo con dicho componente. La identificación de tales proteínas puede realizarse mediante el conocimiento o la información sobre el contenido proteico de las proteínas en el componente de la leche utilizado y, luego, mediante la investigación de si las proteínas individuales forman complejos con el componente (b). Tal información puede estar disponible en la literatura o puede determinarse usando experimentación de rutina.

Sin embargo, si dicha información no está disponible o no se puede obtener, luego, la cantidad de componente (b) presente en la composición puede añadirse en un exceso molar del contenido de proteína total. Por ejemplo, el exceso molar del componente (b) en comparación con la cantidad de proteína presente en el componente (a) es al menos 70 veces, y en una realización particular es aproximadamente 100 veces. Esto se puede determinar usando cálculos basados en la cantidad de proteína presente en el extracto que puede formar complejos, incluidos aquellos que son biológicamente activos con el componente (b) y como se ilustra a continuación.

La leche utilizada en la composición o como material de partida para el extracto que contiene proteína cruda puede ser cualquier leche, tal como leche humana, bovina, caprina u ovina. En muchos países, una fuente de leche más conveniente serán vacas, cabras u ovejas, pero en otros, una fuente conveniente de leche puede ser búfalo, incluido búfalo de agua, camellos, yaks o yeguas. Si bien la leche materna humana parece proporcionar composiciones altamente activas que pueden usarse en aplicaciones farmacéuticas, para otros usos y, en particular, aplicaciones nutracéuticas, la leche de bovino, ovino o caprino es más adecuada para producir productos a gran escala. En una realización particular, la leche es leche bovina y, en particular, leche de vaca.

La leche humana, por ejemplo, contiene generalmente aproximadamente un 1 % p/v de proteína, por ejemplo, de 0,9 a 1,1 % p/v de proteína mientras que la leche de vaca contiene un mayor porcentaje de proteínas (hasta 4 % p/v de proteína), pero esto es variable dependiendo de factores tales como la raza de la vaca y la dieta con la que se alimenta y los niveles de proteínas de entre 3,1 y 3,9% p/v pueden ser típicos entre las vacas europeas.

Por lo tanto, la cantidad de componente (b) añadido a una composición puede ser mayor cuando la composición de la leche se deriva de la leche de vaca en comparación con la utilizada para la leche humana como se ha tratado anteriormente. Sin embargo, se puede tener en cuenta cualquier pretratamiento al que haya sido sometida la leche. Por ejemplo, un procedimiento de precipitación con sulfato de amonio como se ha descrito anteriormente eliminará ciertas proteínas, tales como caseína. Por tanto, este material restante carecerá de este componente proteico que no tiene que incluirse en el cálculo para determinar qué es un exceso del componente (b). Puede ser posible reducir aún más esta cantidad si se lleva a cabo un análisis detallado de las proteínas. Si se conocen o comprenden los componentes proteicos individuales y sus cantidades, entonces puede que solo sea necesario tener en cuenta aquellas proteínas que pueden formar complejos con el componente (b) como se ha analizado anteriormente.

Las proteínas que quedan en la leche materna después de dicho tratamiento que pueden formar complejos con el componente (b) incluyen a-lactoalbúmina, lactoferrina, lisozima, seroalbúmina y b-lactoglobulina. La leche de otras fuentes, tal como la leche de vaca, puede contener diferentes componentes y en diferentes cantidades.

El agente acidificante usado en la composición es adecuadamente un ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico siempre que sea adecuado para su uso farmacéutico o alimentario. Se incluye suficiente agente acidificante para asegurar que el pH de la composición sea inferior a 4, por ejemplo de 1-4, tal como 2 o 3 y, en particular, aproximadamente 2.

Se sabe que los complejos obtenidos utilizando a-lactoalbúmina de fuentes distintas a la leche materna, y, en particular, BAMLET, obtenido usando a-lactoalbúmina bovina, muestra efectos cualitativamente similares en las células y en particular en las células tumorales como HAMLET (véase, por ejemplo, Rammer y col., (2010) Mol. Cancer Ther. 9(1) 24-32). Los solicitantes han descubierto que este es también el caso de diversos tipos de células, incluidas las células DLD-1 y HT29, que son células de cáncer de colon (véase el Ejemplo 2 más adelante). Por lo tanto, los efectos profilácticos demostrados en lo sucesivo usando HAMLET se observarían de manera similar si se usaran BAMLET o composiciones basadas en BAMLET en lugar de HAMLET. La fácil disponibilidad de la leche bovina y la eficacia conocida de BAMLET significan que la leche bovina puede ser una fuente particularmente preferida de componente (a) para el uso profiláctico o nutracéutico descrito en el presente documento.

De acuerdo con un segundo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar una composición de acuerdo con el primer aspecto, comprendiendo dicho procedimiento obtener leche o un extracto de la misma que contenga proteína cruda, añadir un exceso molar de un ácido graso insaturado que tiene 18 átomos de carbono o una sal del mismo y, en particular, ácido oleico o una sal del mismo, acidificar a un pH de menos de 4 y tratar térmicamente la mezcla resultante. El tratamiento térmico se lleva a cabo adecuadamente a una temperatura de 35­ 70 °C, por ejemplo a aproximadamente 50 °C. Una mezcla de los componentes se incuba adecuadamente a esta temperatura durante un período suficiente para asegurar que la composición adquiera la actividad biológica requerida, por ejemplo, como resultado de la formación de complejos entre los componentes (a) y (b). Esto dependerá de varios factores, incluida la naturaleza de los componentes y los volúmenes, pero generalmente estará en la región de 20 a 60 minutos, por ejemplo durante 30 minutos.

A continuación, la muestra puede someterse opcionalmente a una técnica de purificación tal como la diálisis, por ejemplo, contra solución salina tamponada con fosfato y/o agua durante la noche para eliminar las impurezas. Esto puede ser particularmente útil si la composición está destinada a una aplicación farmacéutica. Sin embargo, para aplicaciones nutracéuticas, puede que no haya necesidad de una purificación adicional, en particular si todos los componentes usados en la preparación de la composición son adecuados para uso alimentario.

La composición resultante se puede usar directamente o se puede secar, liofilizar o desecarse por congelación para almacenamiento. La forma en polvo resultante de la composición puede ser particularmente útil para su uso como aditivo alimentario en la preparación de productos nutracéuticos. Puede, por ejemplo, añadirse en forma desecada a composiciones alimentarias adecuadas tales como productos lácteos, en particular productos tales como yogur, leche, leche en polvo, incluida la leche de fórmula, tal como la leche de fórmula infantil, leche condensada, leche evaporada, crema fresca, khoa, queso, queso cottage, ricota, mantequilla o manteca.

Como se ha analizado anteriormente, en una realización particular, el componente (a) de la composición es un extracto de leche que contiene proteína cruda. La preparación de tal extracto crudo puede constituir una etapa preliminar en el procedimiento de la invención. Por lo tanto, el procedimiento del segundo aspecto de la invención puede comprender además las etapas preliminares de (i) desgrasar la leche, por ejemplo mediante centrifugación, y/o (ii) eliminar las proteínas de la leche usando un procedimiento de precipitación tal como un procedimiento de precipitación con sulfato de amonio como se ha descrito anteriormente. A continuación, el extracto que contiene proteína cruda para su uso en la composición se obtiene (iii) recolectando el sobrenadante, por ejemplo, mediante centrifugación.

Las composiciones de este tipo pueden usarse en la prevención del cáncer del tracto gastrointestinal como se ha tratado anteriormente. Sin embargo, también pueden tener usos adicionales en el tratamiento terapéutico o preventivo de diversas afecciones, incluidas las que se notificaron anteriormente como tratadas usando complejos como HAMLET. Esto incluye infecciones bacterianas, infecciones víricas, papilomas y diversas formas de cáncer, incluyendo glioblastoma y cánceres de las mucosas como cáncer de vejiga y cáncer de colon. En una realización particular, las composiciones se utilizan para el tratamiento del cáncer. Para tales aplicaciones, las composiciones pueden aplicarse tópicamente cuando sea apropiado, u oralmente.

De manera alternativa, tal como se ha descrito anteriormente, las composiciones de la invención se pueden usar como nutracéutico para administración oral como parte de una dieta normal. Estos proporcionarán beneficios nutricionales y pueden proteger aún más contra enfermedades tales como cánceres gastrointestinales, así como infecciones bacterianas y víricas.

Por tanto, un tercer aspecto de la invención proporciona una composición según el primer aspecto para prevenir o tratar una enfermedad proliferativa, tal como cáncer.

La composición se administra adecuadamente por vía oral cuando sea apropiado, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de cáncer gastrointestinal, tal como cáncer de colon. Sin embargo, en otras aplicaciones, por ejemplo, para el tratamiento de papilomas cutáneos o cánceres, tal como cáncer de vejiga, que no se encuentran en el tracto gastrointestinal, la composición se administra de forma adecuada por vía tópica.

La cantidad de composición administrada a un individuo dependerá de diversos factores, incluyendo la naturaleza de la composición así como el factor de riesgo. Sin embargo, como regla general, para cada administración se usa de 1 |jg a 100 miligramos/dosis del complejo biológicamente activo, que se administra adecuadamente a diario.

No obstante, cabe destacar que la composición del primer aspecto de la invención puede usarse en la prevención de cánceres del tracto gastrointestinal. Por tanto, un uso preferido es prevenir la formación de cáncer del tracto gastrointestinal, utilizando una composición derivada de la leche como se ha descrito anteriormente. La cantidad de complejo administrado a un individuo dependerá de diversos factores, incluyendo la naturaleza de la composición así como el factor de riesgo. Sin embargo, como regla general, para cada administración se usan de 1 jg a 200 mg/dosis, por ejemplo, de 2 a 200 mg/dosis o de 1 jg a 100 miligramos/dosis del complejo biológicamente activo, que se administra adecuadamente a diario.

Un número significativo de personas hereda la susceptibilidad al cáncer de colon, pero a pesar de repetidos procedimientos terapéuticos y diagnósticos, a menudo invasivos, muchos desarrollan cáncer de colon. Los tumores primarios localizados se someten principalmente a extirpación quirúrgica y el desarrollo de fármacos se dirige a la enfermedad metastásica. Aunque los individuos susceptibles pueden identificarse mediante la detección de mutaciones en APC, no se dispone de fármacos profilácticos que prevengan enfermedades familiares. Los efectos profilácticos y terapéuticos de HAMLET demostrados en los ejemplos siguientes son, por tanto, de gran importancia potencial. Se utilizaron ratones APCMin/+ portadores de la mutación humana como modelo y su desarrollo espontáneo de tumor relacionado con la edad se redujo drásticamente con la profilaxis HAMLET por vía oral. Adicionalmente, en ratones con tumores establecidos, HAMLET redujo el número de tumores, el tamaño y la mortalidad. Estos efectos se acompañaron de niveles reducidos de p-catenina y proteínas dependientes de p-catenina y el análisis de expresión génica sugirió que las células tumorales supervivientes se habían encaminado a un fenotipo más benigno con señalización de Wnt reducida y glucólisis aeróbica aumentada. Los efectos sobre la p-catenina se explicaron por mecanismos dependientes de canales iónicos y de la caspasa. HAMLET ofrece así un nuevo enfoque para la terapia del cáncer de colon, purgando las células tumorales establecidas y emergentes de la mucosa intestinal. Se espera que la administración oral de HAMLET tenga beneficios clínicos, especialmente en familias FAP que portan el gen APC mutado.

La activación aberrante de la señalización de Wnt/p-catenina es fundamental para la patogenia del cáncer de colon y el control molecular de esta vía se ha convertido en un enfoque terapéutico importante. En células normales, la degradación de la p-catenina proteasómica procede a través de la formación de un complejo de destrucción, lo que limita la transcripción de genes dependientes de p-catenina. En células de cáncer de colon, la degradación de la pcatenina se ve afectada y la translocación nuclear aumenta, dejando la ruta de señalización de Wnt hiperactiva y las células propensas a tumores. Los inhibidores extracelulares de Wnt, incluidas las proteínas secretadas relacionadas con Frizzled (SFRP), se han buscado como posibles agentes terapéuticos y los antagonistas moleculares pequeños de la interacción proteína-proteína entre la p-catenina y los factores de transcripción de Tcf han mostrado resultados preclínicos alentadores. Además, numerosos estudios epidemiológicos han detectado beneficios de los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) con un mecanismo molecular vinculado recientemente a la inhibición de la acumulación nuclear de p-catenina. En respuesta a HAMLET, la p-catenina se escindió proteolíticamente y el contenido de p-catenina nuclear se redujo notablemente. El tejido poliposo restante de los ratones tratados con HAMLET mostró una reducción de la tinción de p-catenina-, VEGF-, Cox-2 y marcadores de proliferación. Estos hallazgos identifican a HAMLET como un nuevo modificador de la ruta Wnt, que también añade la activación de vías de muerte no relacionadas con Wnt.

HAMLET activa los flujos iónicos y los inhibidores de los canales iónicos que bloquean dichos flujos rescatan las células tumorales de la muerte inducida por HAMLET (Storm y col., Plos one (2013), 8, 3, e58578). Esta dependencia de los canales iónicos se confirmó aquí cuando los inhibidores del flujo iónico rescataron a las células de cáncer de colon de la muerte. Además, la activación de la caspasa-3 y la fragmentación de la p-catenina requirieron la activación de los canales iónicos, lo que sugiere que los canales iónicos se activan corriente arriba de los otros puntos finales. Anteriormente se ha descrito un patrón similar de fragmentación de p-catenina en el cáncer de colon, pero la mayoría de los estudios se han centrado en la destrucción proteasómica de p-catenina, resultante de la fosforilación de GSK3. El tratamiento con HAMLET no alteró los niveles de GSK3 fosforilada o totales, sin embargo. se ha demostrado previamente que HAMLET desencadena la activación de la caspasa y una respuesta apoptótica en las células tumorales, con formación de ampollas, despolarización mitocondrial y liberación de citocromo C y exposición a anexina. La importancia funcional de esta respuesta no ha sido clara, sin embargo, ya que la inhibición de la caspasa no previene la muerte celular. Adicionalmente, las mutaciones de p53 y la variación del genotipo Bcl2 o B^cI^xl no alteran la sensibilidad a HAMLET de las células de carcinoma, enfatizando aún más la apoptosis como una respuesta no implicada en la muerte celular. Este estudio sugirió una función para la caspasa-3 como un mecanismo de la fragmentación de p-catenina en lugar de muerte celular.

La falta de selectividad para el tejido tumoral es una preocupación importante en la terapia actual del cáncer de colon y los efectos secundarios pueden ser espectaculares. En el presente estudio, HAMLET fue captado por el tejido tumoral pero no por los tejidos sanos adyacentes, lo que sugiere que HAMLET alcanza los pólipos intestinales en ratones APCmin después de la administración por vía oral, interactuando así con los tejidos tumorales y matando las células tumorales. Además, HAMLET se detectó en el contenido intestinal hasta seis horas después de la administración, lo que refleja la resistencia relativa de la forma unida a ácidos grasos de la a-lactoalbúmina a las proteasas intestinales. Adicionalmente, los autores no han encontrado evidencia de toxicidad para el tejido intestinal, lo que es consistente con el hecho de que HAMLET es un componente de la leche materna. Anteriormente, los animales portadores de tumores con glioblastoma o cáncer de vejiga no mostraron respuestas tóxicas a HAMLET y no se registraron efectos adversos sobre el comportamiento animal. Los estudios en humanos de papilomas cutáneos y cáncer de vejiga también sugirieron que la baja toxicidad se mantiene in vivo.

La administración por vía oral de HAMLET presenta un enfoque terapéutico conceptualmente nuevo en el cáncer de colon, de modo que se destruyen potencialmente las células tumorales y cambian las células supervivientes a un fenotipo más benigno. Basado en este espectro de actividad, el uso de HAMLET y sus variantes como profiláctico oral sería de gran valor, especialmente en familias genéticamente propensas al cáncer de colon.

La invención se describirá ahora en particular a modo de ejemplo con referencia a las figuras adjuntas que se resumen a continuación:

Figura 1. El tratamiento con HAMLET reduce el desarrollo de tumores intestinales y aumenta la supervivencia. Los ratones APCmin fueron tratados con 10 mg de HAMLET, dos veces al día durante 10 días y fueron sacrificados 5 semanas después del final del tratamiento o se observaron para el análisis de supervivencia hasta las 40 semanas de edad. (A) Microfotografías de disección de segmentos del intestino delgado que muestran una disminución en el número de tumores (punta de flecha) en ratones tratados con HAMLET. (B) Cuantificación del efecto de HAMLET sobre el número y tamaño del tumor (**, P <0,01) (C) Los montajes completos de segmentos intestinales teñidos con azul de metileno muestran un número reducido de tumores (punta de flecha) en ratones tratados con HAMLET. (D) Rollos suizos intestinales teñidos con H y E que muestran pólipos más pequeños y menos en ratones APCmin tratados con HAMLET. (E) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. El criterio de valoración se alcanzó cuando los ratones estaban moribundos o a las 40 semanas. Los ratones tratados con HAMLET (n = 15) mostraron una supervivencia mejorada en comparación con los ratones tratados de forma simulada (n = 15) (**, P<0,01)

Figura 2. El tratamiento con HAMLET reduce los niveles de proteínas de la ruta WNT/p-catenina, suprime la proliferación y es resistente a la digestión por enzimas gástricas. (A) Inmunohistoquímica que demuestra tinción reducida para p-catenina, ciclina D1, VEGF, Cox-2 y Ki-67 en tumores tratados con HAMLET, en comparación con tumores tratados de forma simulada. (B) Transferencias Western que muestran niveles reducidos de p-catenina, ciclina D1, VEGF y Cox-2 en tumores tratados con HAMLET en comparación con tumores tratados de forma simulada. Los histogramas muestran los valores medios de densitometría para las transferencias de cada proteína (*, P<0,05; **, P<0,01). (C-D) Cuantificación de Ki-67, VEGF y Cox-2 en lisados tumorales. (F) Inmunotinción, usando anticuerpos anti-a-lactoalbúmina muestra una tinción intensa en los pólipos intestinales (punta de flecha) que representa una alta captación de HAMLET por el tejido tumoral (4 horas). El tejido sano adyacente (flecha) muestra una tinción débil que sugiere una baja captación de HAMLET. (G) Transferencia Western que detecta la captación tisular de HAMLET (4 horas). El intestino delgado se lavó con PBS, se obtuvieron los tumores y los tejidos normales por separado para la transferencia Western. Los tumores contenían mayores cantidades de HAMLET que los tejidos sanos adyacentes. La p-actina fue el control de carga. USI, intestino delgado superior; DSI, intestino delgado distal. (H) Estabilidad de HAMLET en el intestino. Después de la sonda oral con HAMLET (2, 4 y 6 horas), se recogieron los contenidos luminales del estómago y los segmentos del intestino delgado para transferencia Western usando anticuerpo anti-a-lactoalbúmina. La p-actina fue el control de carga.

Figura 3. El perfil del genoma completo identifica acontecimientos transcripcionales distintos en los tumores tratados con HAMLET. Cinco semanas después del tratamiento con HAMLET, los tumores existentes en los grupos tratados y simulados se escindieron y se extrajo el ARN total y se hibridó con matrices de genoma completo Affymetrix MG430. (A) Mapa de calor que muestra los 500 genes principales expresados diferencialmente entre HAMLET y los tratados de forma simulada, lo que indica que existen claras diferencias entre los dos grupos. (B) El análisis de la vía de genes expresados diferencialmente usando GSEA o Ingenuity Pathway Analysis destacó la señalización de WNT y la vía glucolítica como enriquecida en tumores tratados con HAMLET. (C-D) Los resultados de GSEA mostraron que la vía glucolítica y la ruta de señalización WNT están enriquecidas en tumores tratados con HAMLET. (E) Representación esquemática de metabolitos y enzimas que se regularon positivamente en tumores tratados con HAMLET.

Figura 4. Efectos de HAMLET sobre las proteínas de la ruta WNT/p-catenina in vitro. (A) Los cambios morfológicos en respuesta a HAMLET 35 pM se examinaron mediante microscopia holográfica de contraste de fase. HAMLET provocó un rápido redondeo y desprendimiento de células de cáncer de colon de forma dependiente del tiempo (B) Pérdida de viabilidad dependiente de la dosis en células de cáncer de colon humano (DLD1) después del tratamiento con HAMLET (3 horas), cuantificada mediante mediciones de ATP y Prestoblue. *p < 0,05, *** p < 0,001. (C) Disminución de los niveles proteicos de p-catenina, ciclina D1 y VEGF en células DLD1 después del tratamiento con HAMLET (3 horas, 0,5 mg/ml). La p-actina fue el control de carga. (C) Las células tratadas con HAMLET habían perdido la tinción con p-catenina nuclear (verde). La tinción citoplásmica uniforme se reemplazó por una tinción fuerte en la membrana citoplasmática. Las monocapas de células DLD1 se trataron con HAMLET (1 y 3 horas), se fijaron, se inmunotiñeron para p-catenina (verde) con contratinción nuclear DRAQ5 (rojo). HAMLET redujo significativamente la tinción con p-catenina nuclear en las células tratadas. ** p < 0,01 ** p < 0,01. (E) Degradación dependiente de la dosis de p-catenina HAMLET (F) IP durante 1 hora Células tratadas con HAMLET 35 pM (G) Desfosforilación de p-catenina en respuesta al tratamiento con HAMLET 35 pM de una manera dependiente del tiempo. (H) Escisión dependiente del tiempo de la caspasa 3 en células DLD-1 pero sin efecto sobre la fosforilación de GSK3.

Figura 5. Degradación dependiente de canales iónicos y translocación nuclear de p-catenina. (A) Se pretrataron células DLD-1 con inhibidores de los canales iónicos (amilorida y BaCh) o caspasas (zVAD y leupeptina) como se indica y posteriormente se trataron con HAMLET (35 pM, 1 hora). Los inhibidores de los canales iónicos, así como el zVAD anularon la escisión de la b-catenina pero no la leupeptina. (B) La pérdida inducida por HAMLET (35 pM, 1 hora) de la tinción de p-catenina nuclear (verde) se evitó mediante el pretratamiento con inhibidores de los canales iónicos. Los núcleos se tiñen de rojo con Draq5. (C) Se usó un ensayo indicador de luciferasa dual TOP-flash para cuantificar la actividad promotora dependiente de p-catenina en células tratadas con HAMLET frente a células de control. Se detectó una reducción dependiente de la dosis en la actividad luciferasa después de 3 horas de tratamiento con HAMLET.

Figura 6. La profilaxis con HAMLET reduce el desarrollo de tumores intestinales. Se proporcionó a los ratones APCmin 10 mg/día de HAMLET en el agua de bebida durante 10 semanas y fueron sacrificados a las 15 semanas de edad. (A) Microfotografías de disección de segmentos del intestino delgado que muestran la prevención del desarrollo de tumores (puntas de flecha) en ratones tratados con HAMLET. (B) Cuantificación del número y tamaño del tumor (**, P <0,01) (C) Rollos suizos intestinales teñidos con H y E que muestran pólipos más pequeños y menos en ratones APCmin que reciben profilaxis con HAMLET. Los ratones del grupo de HAMLET (n = 10) mostraron prevención del desarrollo de tumores en comparación con los ratones tratados de forma simulada (n = 10) (**, P<0,01)

Figura 7. Régimen de tratamiento para el uso de HAMLET como terapéutica oral. A los ratones macho de ocho a diez semanas de edad se les administró por vía oral 10 mg de HAMLET en 400 pl de PBS, dos veces al día durante diez días. Se sacrificó a los ratones 5 semanas después del final del tratamiento con HAMLET y se recogieron muestras de tejido intestinal para análisis adicionales.

Figura 8. Histología de secciones intestinales teñidas con H y E de ratones APCmin tratados con HAMLET y de control.

Se observó hiperplasia de las vellosidades intestinales en ratones no tratados, pero no en ratones tratados con HAMLET.

Figura 9. Vías enriquecidas en control en comparación con las muestras tratadas con HAMLET (A) El Ingenuity Pathway Analysis de los genes enriquecidos en ratones tratados de forma simulada en comparación con los tratados con HAMLET sugirió una mayor actividad de las vías de inmunidad. (B) Respuesta transcriptómica in vitro en células DLD-1. Para identificar las vías alteradas por el tratamiento con HAMLET, se empleó el análisis de impacto de la ruta de señalización (SPIA). Un bidimensional donde el eje X muestra la evidencia de sobrerrepresentación mientras que el eje Y muestra la evidencia de perturbación. (C) Las cinco rutas principales afectadas por el tratamiento con HAMLET mostraron una activación del procesamiento de proteínas en el RE y la interacción citocina-receptor e inhibición de dos rutas generales del cáncer, así como la inactivación de la vía de infección por HTLV-I.

La Figura 10 es un gráfico que muestra la actividad de una composición del primer aspecto de la invención cuando se prueba en células de carcinoma de colon (DLD1) usando un ensayo de viabilidad celular que mide el nivel de ATP a (A) 3 horas y (B) 24 horas. La Figura 11 es un gráfico que muestra la actividad de una composición del primer aspecto de la invención cuando se prueba en células de carcinoma de colon (DLD1) usando el ensayo de viabilidad celular PrestoBlue.

Las Figuras 12-14 son gráficos que muestran una comparación de la actividad celular de complejos derivados de alfa-lactoalbúmina humana (HAMLET) y alfa-lactoalbúmina bovina (BAMLET) cuando se prueban en diversas células de carcinoma usando un ensayo de viabilidad celular que mide el nivel de ATP a las 3 horas. y también usando el ensayo de viabilidad celular PrestoBlue.

La Figura 15 muestra los resultados de los experimentos de flujo de iones llevados a cabo usando HAMLET y BAMLET.

Ejemplo 1

Prevención del cáncer de colon

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Producción de HAMLET

El HAMLET se produjo como se ha descrito (Svensson M. y col. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 4221-4226. En resumen, la a-lactoalbúmina nativa se purificó de la leche humana mediante cromatografía de interacción hidrofóbica. La proteína se desplegó con EDTA, se sometió a cromatografía de intercambio iónico en una matriz preacondicionada con ácido oleico y se eluyó con alto contenido de sal. HAMLET se liofilizó después de la purificación y se mantuvo congelada hasta su uso.

Ensayos de cultivo celular y muerte celular

Células de carcinoma de colon (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en RPMI-1640 con aminoácidos no esenciales (1:100), piruvato de sodio 1 mM, 50 |jg/ml, gentamicina (todos de Gibco, Paisley, Reino Unido) y suero de ternero fetal (FCS) al 5 % (A549 y A498) o al 10 % (HeLa y Jurkat), respectivamente.

Tratamiento in vivo con HAMLET

Se obtuvieron ratones ApcMin/+ de Jackson Laboratories y se criaron en Biological Resource Center, Biopolis, Singapur o la instalación para animales, MIG, Universidad de Lund, Suecia. Para el protocolo de tratamiento detallado, véase la Figura 7. A los ratones macho de ocho a diez semanas de edad se les administró por vía oral 10 mg de HAMLET en 400 j l de PBS, dos veces al día durante diez días. No se administró a los ratones ni agua ni alimento 5 horas antes de la administración de HAMLET. Se les proporcionó alimento y agua 30 minutos después de la administración oral de HAMLET. Se sacrificó a los ratones 5 semanas después del final del tratamiento con HAMLET y se recogieron muestras de tejido intestinal para análisis adicionales. Se utilizó un tratamiento similar en los grupos de estudio de supervivencia en los que se observó a los ratones hasta las 40 semanas de edad. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del Comité Institucional de Uso y Cuidado Animal.

Recuento de tumores y recolección de muestras

Se sacrificó a los ratones mediante inhalación de CO2; se recogieron sangre y los bazos para su análisis. Se extrajo todo el tracto gastrointestinal y se mantuvo en PBS helado para su disección. El estómago y el ciego no se incluyeron en el análisis debido a la baja incidencia de tumores. El intestino delgado se cortó en 3 segmentos de igual longitud. Para eliminar el contenido intestinal, cada segmento se lavó abundantemente con PBS helado con la ayuda de una aguja de sonda unida a una jeringa. Cada segmento se mantuvo en un papel de filtro y se abrió longitudinalmente. El número y el tamaño de los tumores se determinaron usando un microscopio de disección Olympus.

Tinción con azul de metileno

Los segmentos intestinales abiertos se extendieron planos entre hojas de papel de filtro y se fijaron durante la noche en formalina tamponada neutra al 10 %. Las secciones fijadas con formalina se transfirieron a etanol al 70 % y se tiñeron con azul de metileno al 0,2 %. Las secciones teñidas se enjuagaron en agua desionizada y se obtuvieron imágenes mediante microscopia de disección.

Inmunohistoquímica

Se fijaron rollos suizos de segmentos intestinales abiertos longitudinalmente durante la noche en formalina tamponada neutra al 10%. Las muestras se incrustaron en parafina y las secciones de 5 jm de espesor se procesaron adicionalmente para inmunohistoquímica. Para la inmunocitoquímica, las células se cultivaron en portaobjetos de vidrio de 8 cámaras (Lab-Tek, Chamber Slide, Thermo Fisher Scientific) a una concentración de 5 x 104 células por pocillo durante la noche a 37 °C. Todas las células se permeabilizaron (Triton X-100 al 0,1 % disuelto en FCS-PBS al 5 %, 10 min), se bloquearon (FCS al 10 %, 1 h) y se tiñeron con anticuerpo anti-p-catenina anti-ratón (dilución 1:50, BD Bioscience) durante la noche a 4 °C seguido de un anticuerpo secundario marcado con Alexa-Fluor 448 (1:200, Molecular Probes) durante 1 hora. DRAQ-5 (Bioscience, San Diego, CA) se usó como tinción nuclear (1:500, 5 min). Las células se montaron con medio de montaje (Fluoromount, Sigma) y se detectó fluorescencia en un microscopio confocal LSM 510 DUO (Carl Zeiss). Para imágenes holográficas de fase, se usó un microscopio holográfico digital HoloMonitor™ M2 (Phase Holographic Imaging AB, Lund, Suecia), que registra la estructura 3D de las células mediante su exposición a un láser de HeNe de 0,8 mW (633 nm) mediante la inducción de frentes de onda interferentes.

Captación de HAMLET in vivo

Después de 5 horas de inanición, se alimentó a los ratones por sonda oral con 10 mg de HAMLET en 400 j l de PBS. Después de 2, 4 y 6 horas de la administración de HAMLET, se sacrificó a los ratones mediante inhalación de CO2. Para detectar HAMLET en la luz intestinal, se recogieron segmentos intestinales de 5 cm del intestino delgado superior o inferior y se lavaron con 500 j l de PBS helado. Se añadió tampón de lisis SDS (2 %) y se calentó el lavado intestinal (5 min, 95 °C), se agitó en vórtex, se calentó de nuevo y se centrifugó a velocidad alta durante 10 minutos. Se recogió el sobrenadante y se utilizó para transferencias Western para la detección de HAMLET.

Para la detección de HAMLET en tejido tumoral, los segmentos intestinales se lavaron abundantemente (5 ml de PBS, 3X) para eliminar el contenido luminal. Los segmentos se abrieron longitudinalmente y se lavaron de nuevo en PBS (5 ml de PBS, 3X).

Transferencias Western

Los tumores y el tejido intestinal sano se recogieron y se mantuvieron a -80 °C. Los lisados de tejido en tampón SDS al 2 % se sometieron a SDS-PAGE y se sometieron a electrotransferencia a una membrana de PVDF. A continuación, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios, incluyendo p-catenina (1:4000, BD Biosciences), p-p-catenina (1:1000, Cell Signaling), actina (1:2000, Sigma), GAPd H (1:4o0o, Novus Biologics) y se visualizaron usando ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

Medición de la actividad COX-2 y VEGF

La actividad de COX-2 se midió de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cayman Chemicals). En resumen, las muestras intestinales se homogeneizaron en tampón de lisis helado (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, se suplementaron con una mezcla inhibidora de proteasa (Sigma-Aldrich)) durante 20 segundos. Los homogeneizados se centrifugaron (10.000 x g, 15 min, 4 °C), se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -80 °C para su análisis posterior. Los resultados se corrigieron por el contenido de ADN de la muestra de tejido y se expresaron como aumento de veces sobre el control. El VEGF se cuantificó mediante ELISA en tejido tumoral intestinal después de enjuagar con PBS, homogeneización y almacenamiento durante la noche a -20 °C. Se realizaron dos ciclos de congelacióndescongelación para romper las membranas celulares y se centrifugaron los homogeneizados (5000 x g, 5 min, 4 °C) y se almacenaron a -80 °C para su posterior análisis. El ELISA se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Quantikine Mouse VEGf , R&D Systems), punto de corte > 3,0 pg/ml.

Prueba de función hepática

La actividad de ALT y AST en suero se determinó con el reactivo Infinity ALT y el reactivo Infinity AST (ambos de Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Microscopía confocal

Las células se cultivaron durante la noche en RPMI-1640 con aminoácidos no esenciales (1:100), piruvato de sodio 1 mM, 50 pg/ml de gentamicina (todos de PAA, Pasching, Austria) y suero bovino fetal (FCS) al 10% en portaobjetos de cámara de 8 pocillos (Nalge Nunc, Rochester, Nueva York). Las células se incubaron con HAMLET (0,3 o 0,5 mg/ml, 1 y 3 horas) en RPMI-1640 sin suero (se añadió FCS después de 1 hora) y se fijó con formaldehído al 3,7%. Las células desprendidas se centrifugaron en portaobjetos de microscopio (portaobjetos de polisina Menzel-Glaser, Thermo Scientific, Braunschwieg, Alemania) usando un Cytospin (500 rpm, 5 min), se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,25 %/FCS al 5 %/PBS durante 10 minutos y se tiñeron con anticuerpos anti-pcatenina (1:20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-ciclina D1 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-Ki-67 (1:50, BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA) o anti-Cox-2 (1:50, BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA) seguidos del anticuerpo secundario marcado con Alexa-Fluor 488 (anti-ratón, 1:100, Molecular Probes, Eugene, Or , EE. UU.). Para tinción nuclear se usó DRAQ5 (1:500, eBioscience, San Diego, CA). Las imágenes se capturaron en un microscopio confocal (LSM510 META, Carl Zeiss, Jena, Alemania) con ajustes de orificios iguales a 1 unidad aireada para la detección de fluorescencia.

Análisis transcriptómico

Para el análisis transcriptómico in vivo, los tumores se recogieron 5 semanas después del final del tratamiento y se almacenaron en RNAlater (Ambion). Se homogeneizaron aproximadamente 5 mg de tejido usando un Tissuelyser (Qiagen) y se extrajo el ARN total usando RNeasy (Qiagen). Para el análisis transcriptómico, se convirtieron 300 ng de ARN total en ARNc usando el kit Affymetrix 3 'IVT Express según las instrucciones del fabricante. Se hibridaron 10 pg de ARNc marcado con tiras de matriz Affymetrix MG-430 PM. Después de la hibridación y el lavado, la intensidad de la fluorescencia se midió en el sistema Affymetrix Gene Atlas. Los datos de la matriz se normalizaron utilizando el promedio robusto multichip (RMA) y se filtraron para valores de expresión inferiores a 25. Se identificaron genes expresados diferencialmente, ajustando los datos normalizados a un modelo lineal y los 500 genes que muestran valores p más bajos se consideraron expresados diferencialmente. Para identificar alteraciones funcionalmente relevantes, la lista de genes se envió a Ingenuity Pathway Analysis. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) se realizó mediante el uso de la colección Canonical Pathways Geneset v. 2.5 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp). El conjunto de datos de microarrays que se informa en el presente documento se ha depositado en el Ómnibus de expresión genética de NCBI y estará accesible en el momento de la publicación.

Análisis estadístico

Los datos se expresan como medias ± SEM. Los grupos tratados y de control se compararon con el uso de la prueba t de Student bilateral y la prueba de chi-cuadrado con corrección de Yates y 1 grado de libertad. Las diferencias en la supervivencia se evaluaron mediante análisis de Kaplan-Meier con una prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon.

RESULTADOS HAMLET reduce la carga tumoral y aumenta la supervivencia

HAMLET se administró por vía oral a ratones APCMin/+ portadores de tumores (10-12 semanas de edad) y se evaluó el desarrollo del tumor, cinco semanas después del final del tratamiento (Figura 7). La administración de HAMLET por vía oral provocó una reducción significativa en el número de tumores y en el tamaño del tumor en comparación con los ratones no tratados (Figura 1A-E). La cuantificación mediante microscopia óptica de bajo aumento de los segmentos intestinales abiertos longitudinalmente mostró que el número total de pólipos se redujo en aproximadamente un 60% en el grupo tratado con HAMLET (Figura 1B, p <0,01). También fue evidente una reducción en el número y tamaño de pólipos en las secciones teñidas con azul de metileno de los segmentos intestinales (Figura 1C). La tinción con H y E de las secciones de "rollo suizo" de los segmentos intestinales mostró diferencias significativas en comparación con los ratones no tratados, ya que se observaron menos tumores y más pequeños (Figura 1D). Se observó hiperplasia de las vellosidades intestinales en los ratones no tratados, pero los ratones tratados mostraron vellosidades normales (Figura 8). Adicionalmente, el régimen HAMLET oral también protegió a los ratones contra la mortalidad asociada al tumor, se muestra como una curva de Kaplan-Meyer hasta las 40 semanas de seguimiento Figura 1E (p <0,01).

Niveles reducidos de proteínas de la ruta de la p-catenina en tumores tratados

Para examinar si los efectos de HAMLET podrían explicarse mediante la modulación de la ruta de señalización Wnt, las proteínas dependientes de p-catenina y p-catenina se cuantificaron en biopsias de tumores cinco semanas después del inicio del tratamiento con HAMLET. Las secciones de tejido obtenidas de tumores tratados con HAMLET o de control se tiñeron con anticuerpos específicos y anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa (Figura 2A). La tinción con p-catenina se redujo notablemente en el tejido tumoral tratado con HAMLET, en comparación con los controles no tratados. Esta diferencia en los niveles de p-catenina se confirmó mediante transferencias Western en homogeneizados de tejido tumoral (Figura 2B), lo que sugiere que HAMLET provoca una reducción en los niveles de la proteína p-catenina.

Para examinar si HAMLET modifica la expresión de proteínas corriente abajo de la p-catenina, se tiñeron secciones de tejido obtenidas de tumores tratados con HAMLET o de control con Ciclina D1, anticuerpos específicos de Cox-2 y VEGF (Figura 2A). La tinción de ciclina D1 se redujo en tumores de ratones tratados con Ha MLEt en comparación con los ratones no tratados y la tinción de VEGF y Cox-2 mostró un patrón similar (Figura 2B). Esta reducción en los niveles de la proteína ciclina D1 se confirmó mediante transferencias Western (p <0,01) y la reducción en la actividad de VEGF y Cox-2 mediante ELISA de extractos de tejido (Figura 2D y 2E, p <0,01). Finalmente, una marcada reducción en la frecuencia de células positivas para Ki-67 (Figura 2C) sugirió que la proliferación se reduce en los tumores tratados con HAMLET en comparación con los tumores no tratados.

Los resultados sugieren que el tratamiento con HAMLET reduce los niveles de p-catenina así como la expresión de proteínas dependientes de p-catenina en las células tumorales supervivientes.

HAMLET es captado por las células tumorales y es resistente a las enzimas gástricas

La captación de HAMLET desde la luz gastrointestinal hacia los tumores se visualizó en secciones de tejido fijadas con formalina, 6 horas después de la administración de HAMLET. Se demostró que HAMLET se acumulaba en los tumores (Figura 2F), con una fuerte tinción nuclear. Las células sanas más adyacentes eran negativas pero algunas células de la cripta mostraron una débil tinción nuclear con HAMLET, lo que sugiere un grado bajo de captación por estas células en proliferación rápida. Las diferencias en la captación de HAMLET entre pólipos o tejido sano de ratones individuales se confirmaron mediante transferencias Western de los extractos de tejido (Figura 2G).

Para examinar si HAMLET resiste la degradación proteolítica in vivo, el contenido gastrointestinal se recogió después de la administración de HAMLET con sonda y se sometió a transferencias Western, usando anticuerpos específicos de alfa-lactoalbúmina (Figura 2H). Se detectaron bandas de 14 kDa en el contenido del estómago y el intestino delgado distal, 6 horas después de la administración, lo que sugiere que parte del complejo HAMLET permanece intacto en el tracto gastrointestinal.

El perfil del genoma completo identifica acontecimientos transcripcionales distintos en los tumores tratados con HAMLET

La respuesta a largo plazo in vivo a HAMLET se caracterizó además por un perfil transcripcional genómico de los tumores escindidos de ratones tratados con HAMLET o de controles tratados de forma simulada. El ARN tumoral total de ocho animales (5 semanas después del tratamiento) se hibridó con matrices Affymetrix MG-430 PM y se identificaron cambios transcripcionales funcionalmente relevantes utilizando un enfoque bioinformático integral. Para tener en cuenta la variación experimental, se aplicaron pruebas estadísticas (modelos lineales empíricos moderados de Bayes) entre los grupos tratados de forma simulada y los tratados con HAMLET y las listas de genes resultantes se sometieron a Ingenuity Pathway Analysis. Adicionalmente, Las rutas importantes asociadas con los tumores tratados con HAMLET se identificaron usando Análisis de Enriquecimiento del Conjunto Génico (GSEA (Subramanian A, y col., Proc Natl Acad Sci U S A 102: 15545-15550). Los 500 genes que muestran los valores p ajustados más bajos se muestran en la Figura 3A.

Los genes con mayor expresión en los tumores tratados con HAMLET estaban implicados en el metabolismo de la glucosa (valor p de Ingenuity = 10'9 y valor q de GSEA FDR = 0,05) y los genes regulados por aumento incluían una gran fracción de enzimas clave responsables de los flujos glucolíticos. La fosfoglucomutasa 1, la fosfofructoquinasa, la enolasa, la piruvato quinasa M2 y la alcohol deshidrogenasa estaban todas reguladas por aumento (Figura 3C y E). El análisis GSEA confirmó la alta expresión de enzimas glucolíticas, pero ademas, los genes asociados con la ruta de señalización WNT se enriquecieron en los tumores tratados con HAMLET (valores de q 0,032). De acuerdo con la inhibición de p-catenina en tumores tratados con HAMLET (Figura 2B), los genes altamente expresados eran reguladores predominantemente negativos de esta ruta. El factor 1 inhibidor de WNT, una proteína secretada que contiene un dominio del factor inhibidor de WNT (WIF) y 5 dominios similares al factor 5 de crecimiento epidérmico (EGF) se reguló por aumento en los tumores tratados con HAMLET, al igual que SOXY17 (caja Y 17 de la región determinante del sexo), que modula la señalización de WNT a través de la unión a WNT3a . Otros genes se regularon por aumento en la ruta de señalización de WNT incluyeron JUN, lo que indica un posible papel de las MAP quinasas activadas por estrés en la respuesta de HAMLET. Resulta interesante que, el análisis de GSEA también indicó un aumento de la expresión de genes implicados en el metabolismo del retinol en tumores de ratones tratados con HAMLET. Se ha demostrado previamente que el retinol disminuye los niveles de proteína p-catenina y la pcatenina está dirigida al ARNm del gen, incluidos c-Myc y ciclina D1, lo que implica que el procesamiento del retinol puede influir en los efectos de HAMLET sobre la p-catenina.

En ratones tratados de forma simulada, GSEA detectó una mayor expresión de los genes relevantes para la inmunidad adquirida y, específicamente, para los linfocitos T, incluyendo CD96, CD3y en el complejo TCR y KLRD1 en la vía dependiente del receptor de tipo lectina de células asesinas (Figura 9). El análisis Ingenuity confirmó la mayor expresión de genes de inmunidad específica en tumores no tratados y un número seleccionado de conjuntos de genes estaban muy enriquecidos (FDR q-val <0,0001 y FWER p-val <0,001), los genes altamente enriquecidos incluían CD96 en el complejo MHC II, el receptor conservado CD3G y KLRD1. Las rutas de alta puntuación incluyeron la señalización de linfocitos T citotóxicos CTLA4, señalización ICOS en linfocitos T colaboradores, apoptosis de linfocitos T inducida por Ca2+, así como las rutas de presentación de antígenos y linfocitos T colaboradores y señalización de IL-4.

Efectos de HAMLET en las células de cáncer de colon, in vitro

Para entender mejor los efectos directos a corto plazo de HAMLET en lugar de los efectos a más largo plazo sobre los tejidos que sobreviven al tratamiento con HAMLET, los inventores usaron la línea celular de cáncer de colon humano DLD1, portadora de mutaciones inactivadoras homocigóticas del supresor tumoral APC (Ilyas M, y col. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94: 10330-10334). En primer lugar, la susceptibilidad de las células DLD1 a HAMLET se determinó mediante evaluación morfológica, utilizando imágenes holográficas en tiempo real. HAMLET provocó el redondeo celular de una manera dependiente del tiempo y una disminución en el área celular (p <0,0001 en comparación con el control, Figura 4A). En paralelo, hubo un aumento en el espesor máximo (p <0,001). HAMLET provocó una reducción en la adherencia celular (Figura 4A), compatible con el inicio del desprendimiento y la muerte celular. Se observó una pérdida de viabilidad dependiente de la dosis y del tiempo mediante cuantificaciones de los niveles de ATP y PrestoBlue (Figura 4B).

El efecto de HAMLET sobre la expresión de p-catenina se examinó mediante microscopia confocal sobre células fijadas, teñidas con anticuerpos específicos de p-catenina. HAMLET provocó un cambio rápido en la distribución de la p-catenina. En las células control, la tinción fue difusa en todo el citoplasma y los núcleos, pero después de la exposición a HAMLET, se perdió la tinción con p-catenina nuclear y se redujo la tinción citoplásmica. En paralelo, la p-catenina se estaba acumulando en la membrana citoplasmática (Figura 4D). Mediante análisis de transferencia Western, se detectó fragmentación de p-catenina dependiente del tiempo y de la dosis (110 y 80 kDa) en células DLD1 tratadas con HAMLET (Figura 4E, F, G). Anteriormente, se ha demostrado que la fragmentación de p-catenina es dependiente de caspasa. La activación por HAMLET de la caspasa-3 se detectó en células DLD1 (Figura 4H), lo que confirma la activación de caspasa efectora por HAMLET en células tumorales. Para abordar el papel de las caspasas en la fragmentación de p-catenina inducida por HAMLET, se utilizó el inhibidor de pan-caspasa zVAD, con el inhibidor de cisteína proteasa leupeptina como control (Figura 5A). zVAD inhibió la fragmentación de p-catenina en respuesta a HAMLET, pero la leupeptina no tuvo efecto. La pérdida de tinción de p-catenina nuclear en respuesta a HAMLET se invirtió parcialmente con zVAD, en aproximadamente el 20 % de las células, pero no en las células restantes. HAMLET también redujo la fosforilación de p-catenina (Figura 4G), de manera dependiente del tiempo. GSK3a/p fosforila la b-catenina para la degradación proteasómica. Se excluyó la activación de GSK3a/p por HAMLET, ya que no se detectó ningún cambio en la fosforilación de GSK3a/p mediante transferencias Western (Figura 4H), lo que indica que HAMLET no está modulando la ruta Wnt por este mecanismo.

Se ha descubierto que los canales iónicos soportan la transformación oncogénica y los tumores en ratones APCMin/+ muestran una mayor expresión de los canales de Na+ epiteliales sensibles a amilorida (ENaC). Recientemente, se ha demostrado que HAMLET activa flujos de iones específicos a través de las membranas de las células tumorales y tales flujos explican muchos aspectos de la respuesta de muerte celular (Storm y col., Manuscript). Para abordar si los flujos de iones están implicados en los efectos de HAMLET sobre la homeostasis de la p-catenina, las células tumorales se pretrataron con los inhibidores de los canales iónicos amilorida y cloruro de bario. Mediante microscopio confocal, se demostró que estos inhibidores invertían la reducción inducida por HAMLET de los niveles de p-catenina nuclear (Figura 5B). Adicionalmente, los inhibidores de los canales iónicos bloquearon tanto la fragmentación de la p-catenina como la activación de la caspasa-3 (Figura 5A).

Los niveles proteicos de ciclina D1 y VEGF se redujeron en biopsias de tejido de ratones tratados con HAMLET, lo que sugiere que la expresión génica dependiente de p-catenina podría verse afectada. Se utilizó el ensayo indicador de luciferasa dual TOP-flash para cuantificar la actividad promotora dependiente de p-catenina en células tratadas con HAMLET frente a las células de control. Se detectó una reducción dependiente de la dosis en la actividad luciferasa después de 3 horas de tratamiento con HAMLET (Figura 5C).

Estos hallazgos muestran que la integridad y la actividad de la p-catenina se altera en las células de cáncer de colon tratadas con HAMLET. Este efecto estaba mediado por los canales iónicos, que desencadenó la fragmentación de pcatenina dependiente de caspasa-3, así como las rutas de muerte celular, coherente con los cambios in vivo en pcatenina y proteínas relacionadas.

HAMLET actúa como agente profiláctico contra el cáncer de colon

Para abordar si la administración oral de HAMLET puede prevenir la formación de tumores, a los ratones APCMin/+ se les proporcionó HAMLET en el agua de bebida (10 mg/ml) desde el momento del destete hasta la semana 17. Los controles recibieron únicamente agua de bebida. Se observó una marcada reducción en el desarrollo del tumor (Figura 1). La cuantificación de pólipos en los segmentos intestinales abiertos longitudinalmente mostró una reducción en el número de pólipos en el grupo tratado con HAMLET (Figura 1B, p <0,01). También fue evidente una reducción de tamaño en las secciones de segmentos intestinales teñidas con azul de metileno (Figura 1C). La tinción con H y E de las secciones de "rollo suizo" de los segmentos intestinales confirmó estas diferencias en comparación con los ratones de control, ya que se observaron menos tumores y más pequeños (Figura 1D).

Estos resultados muestran que además de sus efectos terapéuticos, HAMLET previene el desarrollo de cáncer de colon en ratones genéticamente susceptibles.

Ejemplo 2

Ensayo de actividad tumoricida a partir de extracto de leche cruda mezclado con oleato

Se obtuvo un extracto crudo de leche materna human utilizando los siguientes tratamientos

1. Desgrasar leche mediante centrifugación

2. Eliminación de la mayoría de las proteínas de la leche mediante precipitación con sulfato de amonio (264 g/l o ~ 50 % de una solución saturada) a 4 °C, durante la noche.

3. Recoger el extracto soluble mediante centrifugación

Se añadieron 120 mg de oleato de sodio a 10 ml de extracto de leche. Se calculó que esto representaba 100 veces el exceso molar de la proteína presente. Este cálculo se llevó a cabo utilizando el contenido de proteína del extracto de leche materna humana como se indica en Componentes de la leche humana, Centro Universitario de las Naciones Unidas, que se detallan en la siguiente tabla.

Se asumió que la cantidad total de proteína presente en el extracto de leche materna humana utilizado (menos la caseína que se elimina durante la precipitación con sulfato de amonio) = a-lactoalbúmina lactoferrina lisozima seroalbúmina p-lactoglobulina = 0,3 0,2 0,05 0,05 = ~ 0,7 g/100 ml = ~ 7 g/l

Otra posible formación de complejos de proteína-oleato que podría ocurrir durante las etapas de mezcla. Lisozima oleato (proteína:lípido=1:11-48)(K. Wilhelm, y col. (2009) FEBS J., 276, 3975-3989) seroalbúmina oleato (proteína:lípido = 1:6) (Zunszain P.A. y col. (2003) BMC Struct. Biol. 3, 6) b-lactoglobulina oleato (proteína:lípido = 1:7,5-10) (Kamila Liskova, y col. (2011) Eur. J. Lipid Sci. Technol.113, 1207-1218)

lactoferrina (desconocido)

Suponiendo que se necesita un exceso de oleato de 5 veces para formar un complejo activo con a-lactoalbúmina, se necesita un exceso molar de ~ 70X de oleato para formar complejos con todas estas proteínas. Se estimó que la concentración molar de proteína total en el extracto de leche era ~ 400 pM (usando PM = 14,2 kDa). Para tener en cuenta la desviación en la cantidad de diferentes proteínas de la leche y también que la formación de complejos se basa en el proceso de difusión en la solución, se utilizó un exceso molar de 100X de oleato. El pH de la mezcla se redujo hasta un pH de 2 con ácido clorhídrico 1M. Sin estar limitado por la teoría, es posible que el pH bajo libere los iones de Ca2+ presentes en proteínas, tales como la a-lactoalbúmina, presentes en el extracto de leche cruda, despliega la proteína y expone los parches hidrofóbicos para unirse a los iones oleato. Esto significa que la alteración estructural de la a-lactoalbúmina no se acompaña de la adición de elementos adicionales, por ejemplo, EDTA, que pueden hacer que la composición no sea adecuada para uso farmacéutico o nutracéutico.

La mezcla se calentó a 50 °C durante 30 minutos y luego se dializó contra solución salina tamponada con fosfato (1:100) durante 2 horas y se dializó doblemente contra agua (1:100) durante la noche. Las muestras dializadas se liofilizaron y utilizaron para pruebas de actividad.

Prueba de actividad

La actividad de la mezcla de leche-oleato se probó en células de carcinoma de colon (DLD1) midiendo el nivel de ATP y usando el ensayo de viabilidad celular PrestoBlue. En resumen, se sembraron 100.000 células/pocillo durante la noche en una placa de 96 pocillos. Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con las muestras respectivas durante 3 horas y 24 horas en placas separadas. Se añadió suero bovino fetal (FCS) al 5 % después de 1 hora de incubación. Los niveles de ATP y la medición de la viabilidad celular de Prestoblue se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los resultados de ATP a las 3 y 24 horas se muestran en la Figura 10 adjunta y los resultados de Prestoblue se muestran en la Figura 11. Estos resultados muestran que:

• Leche, pH 2: El extracto de leche, acidificado a pH 2, sin oleato, no mostró un alto nivel de actividad tumoricida.

• Leche oleato: El extracto de leche, mezclado con oleato, sin acidificación, no fue tan eficaz como HAMLET.

• Leche oleato, pH 2: El extracto de leche, acidificado a pH 2 y mezclado con oleato, mostró una actividad tumoricida comparable a la de HAMLET. Por lo tanto, este es el material activo.

**Rendimiento estimado usando este procedimiento de mezcla de leche oleato

Los inventores obtuvieron ~ 160 mg de materiales liofilizados a partir de 10 ml de extracto de leche. Para la prueba de viabilidad celular anterior, se disolvieron 22,3 mg de material liofilizado (extracto de leche, acidificado a pH 2 y mezclado con oleato) en 555 pl de PBS para formar una solución madre de 40 mg/ml. Se añadieron a las células 5 pl de esta solución madre.

Traducir este volumen en la perspectiva de HAMLET; con 10 ml de extracto de leche, los inventores pudieron obtener 160 mg de polvo. Esto nos daría 160 mg/(40 mg/ml) = 4 ml de solución activa, que equivale a 4 ml de 10 mg/ml de HAMLET o 40 mg de HAMLET a partir de 10 ml de leche. Traduciendo esta cantidad a la cantidad cruda de a-lactoalbúmina en la leche materna humana, es casi igual a una eficiencia de conversión del 100 %. Si este es el caso, entonces el procedimiento representa un procedimiento extremadamente eficaz para preparar HAMLET. Sin embargo, también es posible que también se hayan formado otros complejos que contribuyan a la actividad. También está claro que otros componentes de la composición no interfieren con la actividad sino que de hecho pueden mejorarla.

Ejemplo 3

Comparación de los efectos de HAMLET y BAMLET en células tumorales

Se realizó un experimento para confirmar que BAMLET produjo resultados generalmente similares a los de HAMLET, en particular en relación con una serie de células tumorales.

HAMLET y BAMLET se produjeron usando un procedimiento similar al descrito en el documento WO2010/131237. En resumen, se mezcló alfa-lactoalbúmina 350 pM humana o bovina (Davisco) con oleato de sodio 3,5 mM (relación proteína:lípido, 1:10) y la mezcla se incubó a 55 °C durante 10 minutos. A continuación, se dejó que la mezcla se equilibrara a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Varias concentraciones (0,1, 0,3 y 0,5 mg/ml) de BAMLET y HAMLET se probaron de forma directa para determinar la actividad en una serie de células tumorales usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Las células utilizadas incluyeron A498 (células de cáncer de riñón), HT29 (células de cáncer colorrectal), J82 (células de cáncer de vejiga), DLD-1 y variantes (células de cáncer colorrectal) y A549 (células de cáncer de pulmón). Los resultados de las pruebas de nivel de ATP y PrestoBlue se muestran en las Figuras 12-14. Estos muestran que, en comparación con un control, tanto HAMLET como BAMLET produjeron una reducción dependiente de la concentración en la viabilidad de las células tumorales y, por tanto, producen efectos biológicamente similares cualitativamente.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende

(a) leche o un extracto de la misma que contiene proteína bruta;

(b) un ácido graso insaturado que tiene 18 átomos de carbono o una sal del mismo; y

(c) un agente acidificante en una cantidad suficiente para reducir el pH de la composición a menos de 4; en el que la composición ha sido tratada térmicamente.

2. Una composición según la reivindicación 1, en la que el componente (a) es un extracto de leche que contiene proteína cruda.

3. Una composición según la reivindicación 2, en la que dicho extracto se ha desgrasado.

4. Una composición según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en la que el extracto comprende leche que se ha sometido a precipitación con sulfato de amonio para eliminar algunas proteínas de la leche.

5. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el componente (b) es ácido oleico o una sal del mismo.

6. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la cantidad de componente (b) está en un exceso molar de la proteína presente en el componente (a), en la que el exceso molar es de al menos 70 veces, por ejemplo de 100 veces.

7. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la leche o extracto de la misma que contiene proteína cruda es leche humana o leche bovina.

8. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el agente acidificante es un ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico.

9. Una combinación de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un producto alimentario o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una combinación según la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento terapéutico o preventivo del cáncer.

11. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una combinación según la reivindicación 9 para su uso como producto nutracéutico.

12. Un procedimiento de preparación de una composición de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento obtener leche o un extracto de la misma que contenga proteína cruda, añadir un exceso molar de un ácido graso insaturado que tiene 18 átomos de carbono o una sal del mismo, acidificar a un pH de menos de 4 y tratar térmicamente la mezcla resultante.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo a una temperatura de 35-70 °C y/o durante un período de 20 a 60 minutos.

14. Un procedimiento según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, que se lleva a cabo usando un extracto de leche que contiene proteína cruda.

15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que el extracto de leche que contiene proteína cruda se obtiene (i) desgrasando la leche, por ejemplo mediante centrifugación de la leche, (ii) eliminando las proteínas de la leche mediante un procedimiento de precipitación, tal como un procedimiento de precipitación con sulfato de amonio y (iii) recogiendo el sobrenadante.