ES2845560T3

ES2845560T3 - Diagnóstico farmacéutico

Info

Publication number: ES2845560T3
Application number: ES13715169T
Authority: ES
Inventors: Pascal Furet; Christine Fritsch; Sauveur-Michel Maira
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2012-03-29
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2033-03-27
Also published as: AU2013241752B2; SG10201608001RA; PH12014502168A1; NZ628596A; EP2830621A1; HK1200723A1; SG11201405169SA; CA2866127A1; KR20140138771A; ZA201405938B; US9795596B2; US20150111927A1; IN2014DN08970A; AR090544A1; JP2015514080A; ECSP14025016A; BR112014023530A2; AU2013241752A1; MX2014011682A; CL2014002576A1

Abstract

1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del acido (S)-pirrolidin-1,2- dicarboxilico, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene cancer, en el que el sujeto tiene una glutamina en la posicion 859 de la subunidad catalitica p110α de PI3K, o en el que el sujeto tiene una secuencia de acido nucleico que codifica una glutamina en la posicion 859 de la subunidad catalitica p110α de PI3K.

Description

DESCRIPCIÓN

Diagnóstico farmacéutico

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un compuesto para su uso en el tratamiento de pacientes que tienen cáncer.

Antecedentes de la invención

Las fosfatidilinositol 3-cinasas (PI3K) comprenden una familia de cinasas de lípidos que catalizan la transferencia de fosfato a la posición D-3' de lípidos inositol para producir fosfoinositol-3-fosfato (PIP), fosfoinositol-3,4-difosfato (PIP2) y fosfoinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) que, a su vez, actúan como segundos mensajeros en las cascadas de señalización acoplando proteínas que contienen dominios de homología de pleckstrina, FYVE, Phox y otros dominios de unión a fosfolípidos en una diversidad de complejos de señalización a menudo en la membrana plasmática (Vanhaesebroeck et al., Annu. Rev. Biochem 70:535 (2001); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615 (2001)). De las dos PI3K de clase 1, las PI3K de clase 1A son heterodímeros compuestos de una subunidad catalítica p110 (isoformas a, p, 5) asociadas constitutivamente con una subunidad reguladora que puede ser p85a, p55a, p50a, p85p o p55Y. La subclase clase 1B tiene un miembro en la familia, un heterodímero compuesto de una subunidad catalítica p110y asociada con uno cualquiera de p101 o p84 de dos subunidades reguladoras (Fruman et al., Annu Rev. Biochem. 67:481 (1998); Suire et al., Curr. Biol. 15:566 (2005)). Los dominios modulares de las subunidades p85/55/50 incluyen dominios de homología de Src (SH2) que se unen a residuos de fosfotirosina en un contexto de secuencia específico en tirosina cinasas receptoras activadas o citoplasmáticas, provocando la activación y localización de las PI3K de clase 1A. La clase 1B, así como p110p en algunas circunstancias, se activa directamente por receptores acoplados a proteína G que se unen a un repertorio diverso de ligandos peptídicos y no peptídicos (Stephens et al., Cell 89:105 (1997)); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615-675 (2001)). Por consiguiente, los productos fosfolipídicos resultantes de PI3K de clase I se ligan a receptores anteriores con actividades celulares posteriores incluyendo proliferación, supervivencia, quimiotaxis, tráfico celular, motilidad, metabolismo, respuestas inflamatorias y alérgicas, transcripción y traducción (Cantley et al., Cell 64:281 (1991); Escobedo y Williams, Nature 335:85 (1988); Fantl et al., Cell 69:413 (1992)).

PIP3 recluta Akt, el producto del homólogo humano del oncogén vírico v-Akt, a la membrana plasmática donde actúa como un punto de unión para muchas rutas de señalización intracelular importantes para el crecimiento y la supervivencia (Fantl et al., Cell 69:413-423(1992); Bader et al., Nature Rev. Cancer 5:921 (2005); Vivanco y Sawyer, Nature Rev. Cancer 2:489 (2002)). La regulación aberrante de PI3K, que a menudo aumenta la supervivencia a través de la activación de Akt, es uno de los acontecimientos más frecuentes en cáncer humano y se ha demostrado que se produce a múltiple niveles. El gen supresor tumoral PTEN, que desfosforila los fosfoinosítidos en la posición 3' del anillo inositol y al hacerlo antagoniza la actividad de PI3K, se elimina funcionalmente en una diversidad de tumores. En otros tumores, los genes para la isoforma p110a, PIK3CA, y para Akt se amplifican y se ha demostrado la expresión proteínica aumentada de sus productos génicos en varios cánceres humanos. Además, se han descrito mutaciones y translocaciones de p85a que sirven para regular por incremento el complejo de p85-p110 en cánceres humanos. Finalmente, se han descrito mutaciones somáticas de aminoácido en PIK3CA que activan las rutas de señalización posteriores a frecuencias importantes en una amplia diversidad de cánceres humanos (Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:802 (2005); Samuels et al., Science 304:554 (2004); Samuels et al., Cancer Cell 7:561-573 (2005)). Estas observaciones muestran que la desregulación de la fosfoinositol-3 cinasa y los componentes anteriores y posteriores de esta ruta de señalización es una de las desregulaciones más comunes asociadas con cánceres humanos y enfermedades proliferativas (Parsons et al., Nature 436:792 (2005); Hennessey et al., Nature Rev. Drug Disc. 4:988-1004 (2005)).

Hay un grupo creciente de evidencias que sugiere que el perfil genético de un paciente puede ser determinante para la sensibilidad de un paciente a un tratamiento terapéutico. Dados los numerosos tratamientos disponibles para un individuo que tiene cáncer, una determinación de los factores genéticos que influyen, por ejemplo, en la respuesta a un fármaco particular, podría usarse para proporcionar al paciente una pauta de tratamiento personalizada. Dichas pautas de tratamiento personalizadas ofrecen la posibilidad de maximizar el beneficio terapéutico para el paciente, mientras que minimizan los efectos secundarios relacionados que pueden asociarse con pautas de tratamiento alternativas y menos eficaces. Por tanto, hay una necesidad de identificar factores que puedan usarse para predecir si un paciente probablemente responderá a un tratamiento terapéutico particular.

El documento WO2012016970A1 divulga formas en estado sólido de 1 -(4-metiI-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il)-amida de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, (I).

SABBAH DIMA A ET AL., BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 22, n.° 2, enero de 2012 (01 2012), páginas 876-880, XP002697245, divulga un estudio de modelo de farmacóforo basado en seis compuestos selectivos de PI3Ka.

FRAZZETTO MARK ET AL., BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 414, n.° Parte 3, septiembre de 2008, páginas 383-390, XP002697246, investigan la función de residuos no conservados en el bolsillo catalítico evaluando la potencia de inhibidores de PI3K seleccionados.

El documento EP2377933A1 divulga sondas, chips líquidos y métodos para detectar mutaciones del gen de PIK3CA.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el hallazgo de que la identidad del ácido nucleico que codifica un aminoácido en la posición 859 en la subunidad catalítica p110a de PI3K puede usarse para seleccionar individuos que tengan cáncer que probablemente responderán a tratamiento con una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de PI3K específico de la isoforma alfa tal como 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S/)-pirrol¡d¡n-1,2-d¡carboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Específicamente, se descubrió que una alteración del residuo de glutamina (también denominado en este documento Q o Gln) en la posición 859 en la subunidad catalítica p110a de PI3K en una muestra de un individuo que tiene cáncer, puede usarse para seleccionar si ese individuo responderá a tratamiento con un compuesto inhibidor de PI3K específico de la isoforma alfa tal como 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-l ,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La etapa de determinación puede realizarse ensayando directamente una muestra biológica del individuo para la materia en cuestión (por ejemplo, ARNm, ADNc, proteína, etc.) de interés.

La presente invención proporciona un compuesto para su uso como se describe en las reivindicaciones.

En un aspecto, la invención incluye 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-l ,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer,

en el que se basa en que el sujeto tiene una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K, o en el que el sujeto tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K.

La invención incluye 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-l ,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, que incluye:

a) ensayar una muestra biológica del sujeto para la presencia o ausencia de una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K; y

b) administrar selectivamente una cantidad terapéuticamente eficaz de 1 -({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetiletil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto basándose en que la muestra tiene una glutamina en la posición 859.

La invención incluye 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, caracterizado por que:

a) se ensaya una muestra biológica del sujeto para la presencia o ausencia de una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K;

b) después de ello al sujeto se le selecciona para tratamiento con 1 -({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, basándose en que el sujeto tiene una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K; y

c) se administra 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto basándose en que el sujeto tiene una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K.

La invención incluye el compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K que es 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, en el que el método comprende:

a) determinar la presencia o ausencia de glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K en una muestra biológica del sujeto, en el que la presencia de glutamina en la posición 859 indica que hay una probabilidad aumentada de que el sujeto responda al tratamiento con dicho compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K; y

b) después de ello seleccionar al sujeto para tratamiento con dicho compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K basándose en que la muestra del sujeto tiene una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K.

La invención incluye 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S/)-pirrol¡din-1,2-d¡carboxíl¡co, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, en el que el método comprende:

a) ensayar una muestra biológica del sujeto para la presencia o ausencia de mutación en la secuencia de ácido nucleico en la subunidad catalítica p110a de PI3K, en el que la mutación provoca una sustitución aminoacídica de glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p llO a de PI3K; y

b) administrar 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto basándose en que la muestra de la secuencia de ácido nucleico no tiene mutación y codifica una glutamina en la posición 859.

La invención también incluye 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-l ,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, en el que el método comprende:

a) ensayar una muestra biológica del sujeto para la presencia o ausencia de mutación en la secuencia de ácido nucleico en la subunidad catalítica p110a de PI3K, en el que la mutación provoca una sustitución del aminoácido glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K;

b) después de ello seleccionar al sujeto para tratamiento con 1 -({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-l,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, basándose en que la muestra del sujeto carece de la mutación y codifica glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K; y

c) después de ello administrar 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ^S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto que carece de la mutación.

La invención también incluye 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidi n-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, en el que el método comprende:

a) ensayar una muestra biológica del sujeto para la presencia o ausencia de mutación en la secuencia de ácido nucleico en la subunidad catalítica p110a de PI3K, en el que la mutación provoca una sustitución aminoacídica de glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K, en el que la ausencia de una mutación en la secuencia de ácido nucleico indica que hay una probabilidad aumentada de que el sujeto responda a tratamiento con el compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

b) después de ello seleccionar al sujeto para tratamiento con dicho compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, basándose en que la muestra del sujeto carece de una mutación en la secuencia de ácido nucleico de modo que la secuencia de ácido nucleico codifica una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K.

Además, en los compuestos para uso de la invención como se describe en este documento, el cáncer puede ser cualquier cáncer incluyendo glioblastoma; melanoma; cáncer de ovario; cáncer de mama; cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC); cáncer de endometrio, cáncer de próstata; cáncer de colon; y mieloma. Típicamente, la muestra es una muestra tumoral y puede ser una muestra congelada fresca o una muestra de tejido incluida en parafina.

En los métodos usados en la invención como se describe en este documento, los métodos para detectar glutamina o un aminoácido variante pueden realizarse por cualquier método conocido en la técnica tales como inmunoensayos, inmunohistoquímica, ELISA, citometría de flujo, transferencia de Western, HPLC y espectrometría de masas. Además, en los métodos usados en la invención como se describe en este documento, los métodos para detectar una mutación en una molécula de ácido nucleico que codifica la subunidad catalítica p110a de la PI3K incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (RT-PCR), ensayos basados en TaqMan, secuenciación directa, hibridación dinámica específica de alelo, matrices de SNP de oligonucleótidos de alta densidad, ensayos de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), ensayos de prolongación de cebador, ensayos de ligasa de oligonucleótidos, análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria, electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE), cromatografía de líquidos de alto rendimiento desnaturalizante, análisis de fusión de alta resolución, ensayos de proteínas de unión a desemparejamientos de ADN, SNPLex® o electroforesis capilar.

La divulgación incluye un kit para determinar si un tumor es sensible a tratamiento con compuesto inhibidor de la subunidad alfa de Pl3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-l,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende proporcionar una o más sondas o cebadores para detectar la presencia de una mutación en el locus del gen de PI3K (ácido nucleico 2575-2577 de SEQ ID NO:2) e instrucciones de uso.

En los métodos de la invención, el inhibidor de PI3K es 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-l,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; mostrado también a continuación como fórmula (A)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 representa un gráfico que muestra curvas cinéticas de activación de ATP para PI3K de tipo silvestre (wt) (constante de Michaelis (Km) = 60 ± 6 ^M) y para PI3Ka mutante Q859A (Km = 72 ± 8 ^M).

La Fig. 2 muestra un gráfico que muestra las curvas de inhibición para PI3K de tipo silvestre (wt) y para PI3Ka mutante Q859A.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el hallazgo de que la presencia o ausencia de una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K puede usarse para determinar la probabilidad de respuesta de un paciente a tratamiento con un compuesto inhibidor de PI3K específico de la isoforma alfa tal como 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Específicamente, se descubrió que una secuencia de ácido nucleico de la muestra de un paciente que codifica la subunidad catalítica p110a de PI3K de tipo silvestre, es decir, tiene una glutamina en la posición 859, tiene más probabilidad de responder a tratamiento con el compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1 -({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-l,2-dicarboxílico. Por el contrario, una secuencia de ácido nucleico de la muestra de un paciente que tiene una mutación que codifica una variante en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K, es decir, codifica un aminoácido distinto de una glutamina en la posición 859, tal como una alanina, tiene menor probabilidad de responder a tratamiento con el compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico. Dicho paciente debe tratarse con un tratamiento antineoplásico alternativo tal como un inhibidor de PI3K diferente (como se usa en este documento el tipo diferente de inhibidor de PI3K debe ser un inhibidor que no sea 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, y puede ser, aunque sin limitación, tratamiento con un agente quimioterápico o un tratamiento con inhibidor de Pl3K alternativo tal como un inhibidor que puede inhibir selectivamente una isoforma distinta de la forma alfa de la subunidad de PI3K o un inhibidor que puede inhibir más de una isoforma de la subunidad de PI3K.

En algunas realizaciones de los métodos de la invención, la presencia o ausencia de una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica glutamina en la posición 859 en la subunidad catalítica p110a de PI3K, puede detectarse ensayando la muestra biológica para una secuencia genómica, un producto de ácido nucleico, un producto polipeptídico o un marcador genético equivalente.

En un ejemplo, la invención incluye el genotipado de una muestra de un individuo. Para el genotipado, se determinan los caracteres nucleotídicos que codifican glutamina en la posición 859 en uno de los dos alelos o en los dos alelos del gen de la subunidad catalítica p110a de PI3K. Con respecto al gen de la subunidad catalítica p110a de PI3K, la mutación se produce en el nucleótido 2575-2577 del gen de la subunidad catalítica p110a de PI3K en uno o los dos alelos. Un genotipo puede ser homocigótico o heterocigótico. En los métodos usados en la invención, la determinación de la identidad de la secuencia de ácido nucleico, o proteína, en la posición 859 puede compararse con la secuencia proteínica de tipo silvestre (GeneID: 5290; que codifica, por ejemplo, una proteína con número de acceso de NCBI NP_006209.2; SEQ ID NO:1) o secuencia de ADN (SeQ ID NO:2) o secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre (ARNm; número de secuencia de referencia de NCBI NM_006218.2) o ADN genómico (número de secuencia de referencia de NCBI NG_012113.1), según lo apropiado. Una variante en la posición 859 (es decir, un aminoácido distinto de glutamina) de la subunidad catalítica p110a de PI3K se usa para hacer referencia a un cambio en la secuencia proteínica de referencia (de tipo silvestre) en la posición 859 resultante de una mutación genética en la secuencia génica de la subunidad catalítica p110a de PI3K que codifica la proteína. En una realización, la variante puede ser una alanina en la posición 859.

La presente divulgación, por tanto, proporciona métodos para predecir la probabilidad de que un paciente que tiene un cáncer que expresa PI3K muestre una respuesta beneficiosa a un tratamiento con el compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S/)-pirrol¡d¡n-1,2-d¡carboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Los pacientes sujetos a dicha evaluación: 1) pacientes que tienen un cáncer que expresa PI3K y que no han experimentado aún ningún tratamiento para el cáncer; 2) pacientes que tienen un cáncer que expresa PI3K y que han experimentado resección completa o parcial del cáncer, por ejemplo, que han experimentado eliminación quirúrgica de tejidos cancerosos en le medida clínicamente posible; y 3) pacientes que tienen un cáncer que expresa PI3K y que se han tratado con una pauta de tratamiento distinta de una pauta de tratamiento con inhibidor de Pl3K.

De acuerdo con la invención, una muestra puede ensayarse para la presencia o ausencia de una mutación que codifica una glutamina en la posición 859 del gen PIK3CA de la subunidad catalítica p110a de PI3K. En un ejemplo, la mutación provoca una sustitución/variante de una glutamina por una alanina en la posición 859 en la subunidad catalítica p110a humana del gen PIK3CA de PI3K (Q859A) [GeneID: 5290; que codifica, por ejemplo, una proteína con número de acceso de NCBI NP_006209.2 (SEQ ID NO: 1).

En un aspecto, la invención incluye 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, que incluye ensayar una muestra biológica del sujeto para la presencia o ausencia de una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K; y administrar selectivamente el compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1 -({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto basándose en que la muestra tiene una glutamina en la posición 859.

En otro aspecto más, la invención incluye un compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer, caracterizado por que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable al paciente basándose en que dicho paciente tiene una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K.

En otro aspecto más, la invención incluye un compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer, caracterizado por que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable al paciente basándose en que dicho paciente tiene una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K seleccionada de una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K y no tiene una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K.

En otro aspecto más, la invención incluye un compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer, caracterizado por que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable al paciente basándose en que dicho paciente tiene un ácido nucleico que codifica una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K.

En otro aspecto más, la invención incluye un compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer, caracterizado por que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable al paciente basándose en que dicho paciente tiene un ácido nucleico que codifica una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K seleccionado de un ácido nucleico que codifica una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K y ácido nucleico que no codifica una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K.

Inhibidores de PI3K

Un paciente que se evalúa usando el método divulgado en este documento es uno que se está considerando para tratamiento con un inhibidor de PI3K. De acuerdo con la presente divulgación, los pacientes que tienen tumores que expresan una forma de tipo silvestre de la subunidad catalítica p110a de PI3K tienen más probabilidad de responder a tratamiento con el compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Como se usa en este documento, la expresión "inhibidor de la subunidad alfa de PI3K" es una molécula que puede inhibir la subunidad catalítica p110a de Pl3K. Se entiende que un inhibidor de la subunidad alfa de PI3K puede inhibir selectivamente el subtipo alfa de PI3K en comparación con su capacidad de inhibir los otros subtipos incluyendo los subtipos beta y/o delta y/o gamma.

El documento WO2010/029082 describe derivados de 2-carboxamida cicloamino urea específicos, que se ha descubierto que tienen propiedades farmacológicas ventajosas y muestran una selectividad mejorada por el subtipo alfa de PI3-cinasa en comparación con otros tipos. Los derivados de 2-carboxamida cicloamino urea específicos que son adecuados para la presente invención, sus preparación y formulaciones adecuadas que contienen los mismos se describen en el documento WO2010/029082. En los compuestos para su uso y los métodos de la invención como se describe en este documento, el inhibidor de la subunidad alfa de PI3K puede ser un compuesto 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido fSJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El inhibidor de la subunidad alfa de PI3K usado en la presente invención es un compuesto de fórmula (A)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Este compuesto se describe específicamente en el documento WO2010/029082. La síntesis de este compuesto se describe en el documento WO2010/029082 como el ejemplo 15.

El compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K descrito en este documento puede ser el propio agente, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un éster farmacéuticamente aceptable del mismo, así como un estereoisómero, enantiómero, mezcla racémica y similares.

Preparación de muestras

La divulgación proporciona, entre otras cosas, un ensayo para la detección de la identidad de la secuencia del ácido nucleico que codifica el aminoácido 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K. Si el ácido nucleico codifica el aminoácido de tipo silvestre glutamina, esto es indicativo de que el sujeto debe seleccionarse y tratarse con un compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K (como anteriormente). Sin embargo, si el ácido nucleico tiene una mutación y codifica un aminoácido variante, es decir, codifica un aminoácido distinto de glutamina, entonces el sujeto no debe tratarse con un compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K (como anteriormente).

El método puede incluir la detección de la mutación en un líquido corporal tal como sangre (por ejemplo, suero o plasma), médula ósea, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal/pleural, líquido linfático, líquido ascítico, líquido seroso, esputo, líquido lagrimal, deposiciones y orina, o en un tejido tal como un tejido tumoral. El tejido tumoral pude ser tejido fresco o tejido incluido en parafina.

Como se usa en este documento, un "sujeto" se refiere a un ser humano o animal, incluyendo todos los mamíferos tales como primates (particularmente primates superiores), ovejas, perros, roedores (por ejemplo, ratón o rata), cobayas, cabras, cerdos, gatos, conejos y vacas. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es un animal experimental o animal adecuado como modelo de enfermedad.

Las muestras de líquido corporal pueden obtenerse de un sujeto usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Los métodos para extraer ADN celular de muestras de líquido corporal son bien conocidos en la técnica. Típicamente, las células se lisan con detergentes. Después de la lisis celular, las proteínas se retiran del ADN usando diversas proteasas. El ADN entonces se extrae con fenol, se precipita en alcohol, y se disuelve en una solución acuosa. Los métodos para extraer ADN acelular de muestras de líquido corporal también son conocidos en la técnica. Normalmente, el ADN acelular en una muestra de líquido corporal se separa de las células, se precipita en alcohol, y se disuelve en una solución acuosa.

Generalmente, una muestra de tumor sólido puede ser una muestra de ensayo de células o tejido que se obtiene de un sujeto con cáncer por biopsia o resección quirúrgica. Una muestra de células o tejido puede retirarse por biopsia por aspiración con aguja. Para esto, se inserta una aguja fina fijada a una jeringa a través de la piel y en el tejido de interés. La aguja se guía típicamente a la región de interés usando ultrasonidos o imágenes de tomografía computarizada (CT). Una vez insertada la aguja en el tejido, se crea un vacío con la jeringa de modo que las células o el líquido puedan succionarse a través de la aguja y recogerse en la jeringa. Una muestra de células o tejido también puede retirarse por biopsia de incisión o central. Para esto, un cono, un cilindro o un poquito de tejido se retira de la región de interés. En general se usan imágenes de CT, ultrasonidos o un endoscopio para guiar este tipo de biopsia. Más particularmente, la lesión cancerosa completa puede retirarse por biopsia de escisión o resección quirúrgica. En la presente invención, la muestra de ensayo es típicamente una muestra de células retiradas como parte de resección quirúrgica.

La muestra de ensayo de, por ejemplo, tejido, también puede almacenarse en, por ejemplo, RNAlater (Ambion; Austin Tex.) o congelarse rápidamente y almacenarse a -80 °C para uso posterior. La muestra de tejido biopsiado también puede fijarse con un fijador, tal como formaldehído, paraformaldehído o ácido acético/etanol. La muestra de tejido fijada puede incluirse en cera (parafina) o una resina plástica. La muestra de tejido incluida (o muestra de tejido congelada) puede cortase en secciones delgadas. También puede extraerse el ARN o la proteína de una muestra de tejido fijada o incluida en cera.

Los cánceres que expresan PI3K que pueden tratarse mediante el compuesto para su uso de acuerdo con la presente invención incluyen cánceres o enfermedades proliferativas celulares tales como tumor y/o crecimiento de células cancerosas mediado por PI3K. Las enfermedades pueden incluir aquellas que muestran sobreexpresión o amplificación de PI3K alfa, mutación somática de PIK3CA o mutaciones de la línea germinal o mutación somática de PTEn o mutaciones y translocación de p85a que sirven para regular por incremento el complejo de p85-p110. En particular, el cáncer incluye, por ejemplo, sarcoma; cáncer de pulmón; bronquios; próstata; mama (incluyendo cánceres de mama esporádicos y los que padecen enfermedad de Cowden); páncreas; gastrointestinal; de colon; del recto; carcinoma de colon; adenoma colorrectal; de tiroides; hígado; conducto biliar intrahepático; hepatocelular; de la glándula suprarrenal; estómago; gástrico; glioma; glioblastoma; endometrio; melanoma; de riñón; pelvis renal; vejiga; cuerpo uterino; cuello uterino; vagina; ovario; mieloma múltiple; de esófago; una leucemia; leucemia mielógena aguda; leucemia mielógena crónica; leucemia linfocítica; leucemia mieloide; de cerebro; una carcinoma del cerebro; la cavidad bucal y la faringe; laringe; intestino delgado; linfoma no hodgkiniano; melanoma; adenoma velloso de colon; una neoplasia; una neoplasia de carácter epitelial; linfomas; una carcinoma mamario; carcinoma basocelular; carcinoma escamocelular; queratosis actínica; enfermedades tumorales, incluyendo tumores sólidos; un tumor del cuello o la cabeza; policitemia vera; trombocitemia esencial; mielofibrosis con metaplasia mieloide; y enfermedad de Waldenstroem.

Los métodos de la divulgación no se limitan a cánceres y pueden incluir otras afecciones o trastornos (por ejemplo, mediados por PI3K) tales como policitemia vera, trombocitemia esencial, mielofibrosis con metaplasia mieloide, asma, COPD, ARDS, síndrome de Loffler, neumonía eosinófila, infestación de parásitos (en particular metazoos) (incluyendo eosinofilia tropical), aspergilosis broncopulmonar, poliarteritis nodosa (incluyendo síndrome de Churg-Strauss), granuloma eosinófilo, trastornos relacionados con eosinófilos que afectan a las vías respiratorias, ocasionados por reacción a fármacos, psoriasis, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, alopecia areata, eritema multiforme, dermatitis herpetiforme, esclerodermia, vitíligo, angiítis por hipersensibilidad, urticaria, penfigoide ampollar, lupus eritematoso, pénfigo, epidermólisis ampollar adquirida, trastornos hemáticos autoinmunitarios (por ejemplo, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia pura de glóbulos rojos y trombocitopenia idiopática), lupus eritematoso diseminado, policondritis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis activa crónica, miastenia grave, síndrome de Steven-Johnson, esprúe idiopático, enfermedad autoinmunitaria inflamatoria del intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), oftalmopatía endocrina, enfermedad de Grave, sarcoidosis, alveolitis, neumonitis por hipersensibilidad crónica, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, uveítis (anterior y posterior), fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriásica, glomerulonefritis, enfermedades cardiovasculares, ateroesclerosis, hipertensión, trombosis venosa profunda, apoplejía, infarto de miocardio, angina inestable, tromboembolia, embolia pulmonar, enfermedades trombolíticas, isquemia arterial aguda, oclusiones trombóticas periféricas, y arteriopatía coronaria, lesiones por reperfusión, retinopatía, tal como retinopatía diabética o retinopatía inducida por oxígeno hiperbárico, y afecciones caracterizadas por presión intraocular elevada o secreción de humor acuoso ocular, tal como glaucoma.

Detección

Los métodos de la divulgación incluyen detectar la presencia o ausencia de una mutación en la secuencia de ácido nucleico que codifica el aminoácido glutamina en la posición 859 de la subunidad p110a humana del gen de PI3K. En un ejemplo, este método incluye detectar un ácido nucleico que codifica un aminoácido mutado en la posición 859 para predecir la respuesta de un paciente a un tratamiento con fármaco contra PI3K. Como las mutaciones en la subunidad catalítica p110a de PI3K en general se producen a nivel de ADN, los métodos de la divulgación pueden basarse en la detección de mutaciones en ADN genómico, así como transcritos (ARNm, ADNc) y las propias proteínas.

Las mutaciones en la subunidad catalítica p110a de PI3K descritas en este documento puede detectarse por cualquier método conocido en la técnica. Al describir la mutación de la subunidad catalítica p110a de PI3K de la divulgación, la mutación incluye cualquier sustitución aminoacídica del aminoácido glutamina (Q) que existe en la secuencia de tipo silvestre en la posición 859, por ejemplo, la sustitución puede ser una glutamina (Q) por una alanina (A). Además la mutación de la subunidad catalítica p110a de PI3K mencionada en este documento es la hebra de sentido del gen por conveniencia. Como reconoce un experto en la materia, sin embargo, las moléculas de ácido nucleico que contienen el gen pueden ser moléculas bicatenarias complementarias y, por tanto, una referencia a un sitio particular en la hebra de sentido se refiere también al sitio correspondiente en la hebra de antisentido complementaria. Es decir, puede hacerse referencia al mismo sitio mutante en cualquier hebra y puede diseñarse un oligonucleótido para que hibride específicamente con cualquier hebra en una región diana que contiene el sitio polimórfico y/o mutante. Por tanto, la divulgación también incluye polinucleótidos monocatenarios y mutaciones que son complementarias a la hebra de sentido de las variantes genómicas descritas en este documento.

Pueden usarse muchas técnicas diferentes para identificar si la secuencia de ácido nucleico codifica una mutación en la posición 859 en la subunidad catalítica p110a de PI3K, incluyendo análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria (SSCP), análisis de estructuras heterobicatenarias por cromatografía de líquidos de alto rendimiento desnaturalizante (DHPLC), secuenciación directa de ADN y métodos informáticos (Shi et al., Clin Chem A1U6AA12 (2001)). Los métodos más comunes actualmente incluyen hibridación, prolongación de cebador y métodos de escisión. Cada uno de estos métodos debe conectarse a un sistema de detección apropiado. Las tecnologías de detección incluyen polarización fluorescente (Chan et al., Genome Res. 9:492-499 (1999)), detección luminométrica de liberación de pirofosfato (pirosecuenciación) (Ahmadiian et al., Anal. Biochem. 280:103-10 (2000)), ensayos de escisión basados en transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), DHPLC y espectrometría de masas (Shi, Clin Chem 47:164-172 (2001); patente de Estados Unidos n.° 6300076 B1).

En una realización, se usa un analizador automatizado (por ejemplo, una máquina de PCR o una máquina de secuenciación automatizada) para determinar la presencia o ausencia de una mutación en la posición 2575 a 2577 (codón que codifica Gln en la posición 859) en la subunidad catalítica p110 alfa de PI3K. Todos estos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia.

En una realización particularmente preferida, las mutaciones pueden detectarse usando tecnología INVADER™ (disponible en Third Wave Technologies Inc. Madison, Wisconsin EE. UU.). En este ensayo, un oligonucleótido "invasor" en dirección 5' específico y una sonda en dirección 3' parcialmente solapante conjuntamente forman una estructura específica cuando se unen a molde de ADN complementario. Esta estructura se reconoce y se corta en un sitio específico por la enzima Cleavasa, que provoca la liberación de la solapa 5' del oligonucleótido sonda. Este fragmento entonces sirve como oligonucleótido "invasor" con respecto a dianas secundarias sintéticas y sondas de señal secundarias marcadas fluorescentemente contenidas en la mezcla de reacción. Esto provoca la escisión específica de las sondas de señal secundarias por la enzima Cleavasa. Se genera señal fluorescente cuando se escinde esta sonda secundaria (marcada con moléculas de tinte con capacidad de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia). Las Cleavasas tienen requisitos rigurosos con respecto a la estructura formada por las secuencias de ADN solapantes o solapas y, por lo tanto, pueden usarse para detectar específicamente emparejamientos incorrectos de un solo par de bases inmediatamente en dirección 5' del sitio de escisión en la hebra de A d N en dirección 3'. Ryan D et al., Molecular Diagnosis 4(2): 135-144 (1999) y Lyamichev V et al. Nature Biotechnology 17: 292-296 (1999), véanse también las patentes de Estados Unidos n.° 5846717 y 6001 567.

La divulgación incluye además composiciones que contienen sondas oligonucleotídicas y cebadores diseñados para que hibriden específicamente con la secuencia de ácido nucleico que codifica glutamina o un polipéptido variante en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a, o que están adyacentes a un sitio mutante. La región que contiene la mutación de interés puede amplificarse usando cualquier método de amplificación dirigida por oligonucleótido incluyendo, aunque sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR). (patente de Estados Unidos n.° 4 965 188), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193 (1991); solicitud de patente PCT publicada WO 90/01069), y ensayo de ligamiento de oligonucleótidos (OLA) (Landegren et al., Science 241: 1077-1080 (1988)). Los oligonucleótidos útiles como cebadores o sondas en dichos métodos deben hibridar específicamente con una región del ácido nucleico que contiene o está adyacente al sitio polimórfico/mutante. Típicamente, los oligonucleótidos son entre 10 y 35 nucleótidos de longitud y, preferiblemente, entre 15 y 30 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, los oligonucleótidos son de 20 a 25 nucleótidos de longitud. La longitud exacta del oligonucleótido dependerá de muchos factores que se consideran de forma rutinaria y se ponen en práctica por los expertos en la materia.

Pueden usarse otros procedimientos conocidos de amplificación de ácidos nucleicos para amplificar la región que contiene la mutación de la subunidad catalítica p110a en la posición 859, que incluyen sistemas de amplificación basados en transcripción (patente de Estados Unidos n.° 5130238; documento EP 329822; patente de Estados Unidos n.° 5169766, solicitud de patente PCT publicada WO 89/06700) y métodos isotérmicos. (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992)).

Una mutación en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a puede ensayarse antes o después de amplificación usando uno de varios métodos basados en hibridación conocidos en la técnica. Típicamente, se utilizan oligonucleótidos específicos de alelo en la realización de dichos métodos. Los oligonucleótidos específicos de alelo pueden usarse como pares de sondas marcadas de forma diferente, mostrando un miembro del par un emparejamiento perfecto con una variante de una secuencia diana y mostrando el otro miembro un emparejamiento perfecto con una variante diferente. Preferiblemente, los miembros del conjunto tienen temperaturas de fusión en 5 grados Celsius y más preferiblemente en 2 grados Celsius, entre sí, cuando hibridan con cada sitio polimórfico o mutante que se está detectando. La hibridación de un oligonucleótido específico de alelo con un polinucleótido diana puede realizarse con ambas entidades en solución, o dicha hibridación puede realizarse cuando el oligonucleótido o el polinucleótido diana se fija covalente o no covalentemente a un soporte sólido. La fijación puede mediarse, por ejemplo, por interacciones de anticuerpo-antígeno, poli-L-Lys, estreptavidina o avidina-biotina, puentes salinos, interacciones hidrófobas, enlaces químicos, reticulación con UV, cocción, etc. El oligonucleótido específico de alelo puede sintetizarse directamente en el soporte sólido o fijarse al soporte sólido después de la síntesis. Los soporte sólidos adecuados para su uso en métodos de detección de la divulgación incluyen sustratos hechos de silicio, vidrio, plástico, papel y similares, que pueden formarse, por ejemplo, en pocillos (como en placas de 96 pocillos), portaobjetos, láminas, membranas, fibras, chips, placas y microesferas. El soporte sólido puede tratarse, recubrirse o derivatizarse para facilitar la inmovilización del oligonucleótido específico de alelo o ácido nucleico diana.

Los polipéptidos que tienen una glutamina en la posición 859 o que tienen una sustitución en la posición 859 de la subunidad catalítica p110 también pueden ensayarse usando métodos conocidos en la técnica, tales como radioinmunoensayos o inmunoensayos enzimáticos, inmunoensayos enzimáticos competitivos, espectrometría de masas, técnicas/plataformas del lugar de atención, transferencia puntual, transferencia de Western, cromatografía, preferiblemente cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) o similares. Pueden usarse anticuerpos marcados, partes de unión de los mismos, u otros compañeros de unión. Los anticuerpos pueden ser de origen monoclonal o policlonal, o pueden producirse biosintéticamente. Los compañeros de unión también pueden ser moléculas de origen natural o producirse sintéticamente. La cantidad de proteínas en complejo se determina usando metodologías convencionales de detección de proteínas descritas en la técnica. Puede encontrarse una revisión detallada del diseño, teoría y protocolos de ensayo inmunológico en numerosos textos de la técnica, incluyendo Practical Immunology, Butt, W. R., ed., Marcel Dekker, Nueva York, 1984.

Puede usarse una diversidad de diferentes marcadores en los ensayos de la divulgación incluyendo marcadores directos tales como marcas fluorescentes o luminiscentes, metales, tintes, radionúclidos y similares, fijados al anticuerpo. Los marcadores indirectos incluyen diversas enzimas bien conocidas en la técnica, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de hidrógeno y similares. En un ensayo de una etapa, la proteína diana (es decir, la subunidad catalítica p110 que tiene una glutamina en la posición 859) se inmoviliza y se incuba con un anticuerpo marcado. El anticuerpo marcado se une a la molécula diana inmovilizada. Después de lavar para retirar las moléculas no unidas, la muestra se ensaya para la presencia del marcador. Se incorporan numerosos métodos inmunohistoquímicos en formatos del punto de atención y dispositivos portátiles, que todos ellos pueden usarse para determinar la presencia de la proteína.

El uso de anticuerpos inmovilizados específicos para las proteínas o polipéptidos también se contempla por la presente divulgación. Los anticuerpos pueden inmovilizarse en una diversidad de soportes sólidos, tales como partículas de matriz magnética o cromatográfica, la superficie de una placa de ensayo (tal como pocillos de microvaloración), trozos de un material de sustrato sólido (tal como plástico, nailon, papel) y similares. Puede prepararse una tira de ensayo recubriendo con el anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos una matriz en un soporte sólido. Esta tira entonces puede sumergirse en la muestra de ensayo y procesarse a través de lavados y etapas de detección para generar una señal medible, por ejemplo, una mancha coloreada.

En un ensayo de dos etapas, puede incubarse una proteína diana inmovilizada (por ejemplo, la subunidad catalítica p110 que tiene una glutamina en la posición 859) con un anticuerpos sin marcar. El complejo de anticuerpo sin marcar, si está presente, se une entonces a un segundo anticuerpo marcado que es específico para el anticuerpo no marcado. La muestra se lava y se ensaya para la presencia del marcador. La elección de marcador usado para marcar los anticuerpos variará dependiendo de la aplicación. Sin embargo, la elección del marcador la puede determinar fácilmente un experto en la materia.

La transferencia puntual la practican de forma rutinaria los expertos en la materia para detectar una proteína deseada usando un anticuerpos como sonda (Promega Protocols and Applications Guide, segunda edición, 1991, página 263, Promega Corporation). Se aplican muestras a una membrana usando un aparato de transferencia puntual. Se incuba una sonda marcada con la membrana, y se detecta la presencia de la proteína.

El análisis de transferencia de Western es bien conocido por los expertos en la materia (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Vol. 3, capítulo 18, Cold Spring Harbor Laboratory). En transferencia de Western, la muestra se separa por SDS-PAGE. El gel se transfiere a una membrana. La membrana se incuba con anticuerpo marcado para la detección de la proteína deseada.

Administración y composiciones farmacéuticas

El compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede administrarse en cantidades terapéuticamente eficaces mediante cualquiera de los modos habituales y aceptables conocidos en la técnica, individualmente o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar ampliamente dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la edad y la salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto usado y otros factores. Para los usos anteriores, la dosis requerida variará obviamente dependiendo del modo de administración, la afección particular que se vaya a tratar y el efecto deseado.

En general, se indica que para obtener resultados satisfactorios sistémicamente a dosis diarias de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 100,0 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 10,0 mg/kg de peso corporal del compuesto 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Una dosis diaria indicada en mamíferos más grandes, por ejemplo, seres humanos, está en el intervalo de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 3 g, por ejemplo, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 1,5 g del compuesto 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, administrada convenientemente, por ejemplo, en doses divididas hasta cuatro veces al día o en forma retardada. Las formas farmacéuticas unitarias adecuadas para administración oral comprenden de aprox. 0,1 a aproximadamente 500 mg, por ejemplo, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 500 mg del compuesto 1 -({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

El compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe en este documento puede administrarse como composiciones farmacéuticas por cualquier vía convencional, en particular por vía enteral, por ejemplo, por vía oral, por ejemplo, en forma de comprimidos o cápsulas, o por vía parenteral, por ejemplo, en forma de soluciones o suspensiones inyectables, por vía tópica, por ejemplo, en forma de lociones, geles, pomadas o cremas, o en una forma nasal o de supositorio. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K para el uso de la presente invención en forma libre o en una forma de sal farmacéuticamente aceptable en asociación con al menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable pueden fabricarse de manera convencional por métodos de mezclado, granulado o recubrimiento. Por ejemplo, las composiciones orales pueden ser comprimidos o cápsulas de gelatina que comprenden el ingrediente activo junto con a) diluyentes, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina; b) lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol; para comprimidos también c) aglutinantes, por ejemplo, silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona; si se desea d) disgregantes, por ejemplo, almidones, goma de agar, ácido algínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes; y/o e) absorbentes, colorantes, aromas y edulcorantes. Las composiciones inyectables pueden ser soluciones o suspensiones isotónicas acuosas, y los supositorios pueden prepararse a partir de emulsiones o suspensiones grasas.

El compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede esterilizarse y/o contener adyuvantes, tales como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulsionantes, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, también pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Las formulaciones adecuadas para aplicaciones transdérmicas incluyen una cantidad eficaz de un compuesto para el uso de la presente invención con un vehículo. Un vehículo puede incluir disolventes farmacológicamente aceptables absorbibles para ayudar al paso a través de la piel del hospedador. Por ejemplo, los dispositivos transdérmicos están en forma de un apósito que comprende un elemento protector, un depósito que contiene el compuesto opcionalmente con vehículos, opcionalmente una barrera que controla la velocidad para suministrar el compuesto a la piel del hospedador a una velocidad controlada y predeterminada durante un periodo de tiempo prolongado, y medios para sujetar el dispositivo sobre la piel. También pueden usarse formulaciones transdérmicas de matriz. Las formulaciones adecuadas para aplicación tópica, por ejemplo, a la piel y los ojos, son preferiblemente soluciones acuosas, pomadas, cremas o geles bien conocidos en la técnica. Estas pueden contener opcionalmente agentes solubilizantes, estabilizantes, potenciadores de la tonicidad, tampones y conservantes.

Datos

Al realizar cualquiera de los métodos descritos en este documento que requieren determinar la presencia o ausencia de una mutación de ácido nucleico en la posición 2575-2577 de la subunidad catalítica p110 de PI3K, se determinan, y se informa a los médicos o asesores genéticos o pacientes u otros investigadores del resultado. Específicamente el resultado puede plasmarse en forma transmisible de información que pueda comunicarse o transmitirse a otros investigadores o médicos o asesores genéticos o pacientes. Una forma de este tipo puede variar y puede ser tangible o intangible. El resultados puede plasmarse en declaraciones descriptivas, diagramas, fotografías, gráficos, imágenes o cualquier otra forma visual. Por ejemplo, se pueden usar imágenes de electroforesis en gel de productos de PCR en la explicación de los resultados. También son útiles diagramas que muestran una variante que está presente o ausente al indicar los resultados de ensayo. Estas declaraciones y formas visuales pueden grabarse en un medio tangible tal como papeles, medios legibles por ordenador tales como disquetes, discos compactos, etc., o en un medio intangible, por ejemplo, un medio electrónico en forma de correo electrónico en Internet o Intranet. Además, el resultado también puede grabarse en una forma auditiva y transmitirse a través de cualquier medio adecuado, por ejemplo, líneas de cable analógicas o digitales, cables de fibra óptica, etc., mediante teléfono, facsímil, teléfono móvil inalámbrico, llamada telefónica por Internet y similares. Todas estas formas (tangibles e intangibles) constituirían una "forma transmisible de información". Por tanto, la información y los datos sobre un resultado de ensayo se pueden producir en cualquier parte del mundo y transmitir a un lugar diferente. Por ejemplo, cuando se lleva a cabo un análisis genotípico en el extranjero, se pueden generar y emitir la información y los datos sobre un resultado de ensayo en una forma transmisible como las que se describen anteriormente. El resultado de ensayo en una forma transmisible, por tanto, puede importarse a los Estados Unidos. Por consiguiente, la presente divulgación también abarca un método para producir una forma transmisible de información que contiene datos sobre si existe una mutación en la posición 859 del dominio catalítico p110 en un individuo. Esta forma de información es útil para predecir la sensibilidad de un paciente a tratamiento con un inhibidor de PI3K, para seleccionar un ciclo de tratamiento basándose en esa información, y para tratar a un paciente basándose en esa información.

Kits

La divulgación proporciona además kits para determinar si existe una mutación en la posición 2575-2577 de una subunidad catalítica p110a humana del gen de PI3K. Los kits son útiles para seleccionar pacientes que se beneficiarán específicamente de tratamiento con el compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S/)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Un kit puede comprender cebadores y sondas útiles para detectar una mutación en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a humana del gen de PI3K. Un kit puede comprender además controles de ácido nucleico, tampones e instrucciones de uso.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y métodos para clonación y expresión de p110a catalítica de tipo silvestre y Q859A mutante con la ¡soforma 1 de p85

Manipulación de ADN y plásmidos: Se usan técnicas convencionales de biología molecular para construir los plásmidos descritos. Todas las enzimas se obtienen de Roche Diagnostics and New England BioLabs. Los fragmentos de ADN se purifican usando el kit GenElute PCR Clean-up (Sigma) o se aíslan de geles de agarosa preparativos con el Nucleospin Extract II (Macherey-Nagel). Los ligamientos de ADN se realizan durante 1 a 4 horas a temperatura ambiente con el kit Rapid DNA Ligation (Roche Diagnostics) y se transforman en E. coli DH5 alfa (Invitrogen). El ADN plasmídico se purifica con el kit QIAprep 8 Miniprep (QIAGEN) o el kit GenElute HP Plasmid Midiprep (Sigma). Todos los procedimientos se realizan como se describe en los manuales respectivos.

Se prepara el plásmido His-Nativ hPI3k-alfa/p85 pDUAL Consensus. Para esta construcción, se amplifica un fragmento de ADN bovino de 3243 pb que contiene el marco abierto de lectura completo de la isoforma p110a bovina de PI3-K (RefSeq NM_174574.1) por PCR a partir de un plásmido proporcionado por Mattias Wymann (Institute of Biochemistry, University of Freibourg) usando los cebadores compatibles GATEWAY mostrados en la tabla 1. En resumen, el cebador directo PI3Ka_FOR_GATE contenía un sitio de restricción a SamH I (subrayado simple), sitio de reconocimiento Kozak (subrayado doble) y la secuencia attB1 requerida para la clonación GATEWAY (cursiva), mientras que el cebador inverso PI3_Ka_REV_GATE contenía un sitio de restricción Hind III (subrayado simple) y la secuencia attB2 GATEWAY (cursiva). Las amplificaciones por PCR se realizaron usando la ADN polimerasa High Fidelity Platinum Pfx (Invitrogen) siguiendo los protocolos del fabricante.

Tabla 1: Cebadores usados para amplificación por PCR de PI3-Ka bovina

Nombre del cebador Secuencia del cebador

PI3_Ka_FOR_GATE GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA

GGC TGG GGATCC ACC ATG CCT CCA AGA

CCA TCA TCA GGT GAA CTG (SEQ ID NO:3)

PI3_Ka_REV_GATE GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG

GTG AAGCTT TCA GTT CAA AGC ATG CTG

CTT AAT (SEQ ID NO:4)

Después de PCR, los fragmentos se purifican usando PEG 8000 al 30 %; MgCl2 30 mM para retirar los dímeros de cebador attB, y se transponen en el vector GATEWAY de entrada pDONOR 201. En resumen, se mezclan 4 |jl de producto de p Cr (10 ng/jl) con 2 j l de mezcla de reacción, 1 j l de pDONOR 201 (150 ng/l), 2 j l de Clonasa BP y 1 j l de TE y se incuban a temperatura ambiente durante 60 minutos antes de la adición de 2 j l de Proteinasa K (2 jg / jl) . Entonces las muestras se incuban durante 60 minutos adicionales a 37 °C y después se usan para transformar células competentes DH5a. Posteriormente los plásmidos PI3-Ka pDONOR recombinantes positivos se identifican por análisis con enzimas de restricción y se verifica la secuencia (SOLVIAS). Entonces se mezclan 2 |jl de PI3-Ka pDONOR recién preparado con 2 j l de pDEST 20 (150 ng/jl), 2 j l de mezcla de reacción, 2 j l de Clonasa LR y 2 j l de TE. Las muestras se incuban a temperatura ambiente como se describe anteriormente antes de la transformación de células competentes DH5a para crear GST-PI3-Ka pDEST 20.

Entonces se amplifica un producto de PCR de 3933 pb que contiene el marco abierto de lectura completo de GST-PI3-Ka usando oligonucleótidos específicos de gen que contienen sitios flanqueantes de Spe I y Hind III (subrayados) (tabla 2) de GST-PI3-Ka pDEST 20 y se liga en p50 pFastBac DUAL como se describe anteriormente.

Tabla 2: Cebadores usados para amplificación por PCR de GST-PI3-Ka

Nombre del cebador Secuencia del cebador

GST-FOR AGCA ACTAGT ACC ATG GCC CTT ATA CTA

GTT (SEQ ID NO:5)

PI3_Ka_REV_GATE GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG

GTG AAGCTT TCA GTT CAA AGC ATG CTG

CTT AAT (SEQ ID NO:6)

Entonces se confirman los plásmidos recombinantes positivos que contienen tanto GST-PI3-Ka como las proteínas adaptadoras p85 truncadas (bovGST-PI3-Ka/p85 pFastbac DUAL) por análisis de digestión de restricción y se verifica la secuencia (SOLVIAS).

Los números de acceso RefSeq para PIK3CA bovina (p110a) y PIK3R1 humana (isoforma 1 de p85a) son NM_174574.1 y NM_181523, respectivamente.

La secuencia primaria de todas las construcciones derivadas de PCR se confirman por secuenciación a través de Solvias AG, Basilea.

Amplificaciones por PCR: Las amplificaciones por PCR se realizan con un termociclador MJ-Research DNA Engine Pt C-200 en 100 j l de volumen total con Pwo Master (Roche).

La proteína adaptadora p85a de longitud completa (PIK3R1, 1-724 aa) se amplifica a partir de 1 ng de plásmido pCMV6_XL5::p85a isoforma 1 (n.° catálogo TC11320, Origene) con la concentración final de 500 nM de los cebadores, Master Mix 1x, DMSO al 5 % y los siguientes cebadores: p85upnew: 5'-CCGCGGATCCACCAT GAGT GCT GAGGGGT ACCAG-3' (SEQ ID NO:7) y p85do: 5'-GCCGGAATTCTCATCGCCTCTGCTGTGCATATAC-3' (SEQ ID NO:8). Los parámetros de ciclado son: 94 °C, 2 min; (94 °C, 15 s; 53 °C, 30 s; 72 °C, 60 s)¹⁰; (72 °C, 60 s 5 s/ciclo))¹⁹; 72 °C, 7 min.

Los cebadores p85upnew y p85do introducen los sitios de las enzimas de restricción BamHI y EcoRI en el extremo N y el extremo C, respectivamente.

Clonación:

Clonación de la isoforma 1 de p85 alfa (PI3KR1) en pFastBac1

El vector baculovírico pFastBac1 (Invitrogen) y el ADN amplificado de la isoforma 1 de p85a se cortan con BamHI y EcoRI y se purifican en gel. El ligamiento se realiza durante 1 hora a temperatura ambiente y se transforman células de E. coli DH5a competentes para obtener el plásmido pFastBac::p85a isoforma 1.

Clonación de p110 alfa catalítica (PIK3CA) en pFastBacI

El plásmido His-Nativ hPI3k-alfa p85 pDUAL se digiere con BamHI y HindIII. El fragmento obtenido se purifica de geles de agarosa y se liga durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente en pFastBac1 cortado con las mismas enzimas de restricción. La transformación en células de E. coli DH5a competentes produce el plásmido pFastBac::p110a.

Mutagénesis

La mutagénesis para generar PI3Ka (p110a) mutante Q859A se realiza con el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II (Stratagene (n.° cat. 200523) y los oligonucleótidos p110Q859Aup

(5'-GAAATTCTCACACTATAATGGCTATTCAGTGTAAAGGAGGCCTG-3') (SEQ ID NO:9) y p110Q859Ado

(5'-CAGGCCTCCTTTACACTGAATAGCCATTATAGTGTGAGAATTTC-3') (SEQ ID NO:10) siguiendo el protocolo del fabricante.

Expresión de proteínas:

(a) Generación de virus y expresión de proteínas

El ADN baculovírico recombinante se genera por transposición en E. coli DH10 Bac (Invitrogen). El ADN de bácmido se aísla de colonias individuales y después se transfiere a células Sf9. Las transfecciones, amplificaciones y ensayos de placa se realizan de acuerdo con el manual del sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) en medio TC-100 (Cambrex) complementado con FCS al 10 %. Las concentraciones de virus se determinan pos ensayos convencionales de placa. La expresión se hace en matraces de agitación partiendo de 1 x 106 células/ml en medio ExCell-420 (JRH Biosciences Ltd) complementado con solución 0,5x de penicilina/estreptomicina (Sigma).

Para reconstituir la holoenzima activa de la subunidad catalítica p110 y la proteína adaptadora p85 durante la expresión, se coinfectan células Sf9 con ambos virus simultáneamente. Las proteínas se expresan en 100 ml de medio de cultivo durante 72 h a 27 °C siguiendo el protocolo TIPS como se describe en otra parte (por ejemplo, Erdmann et al. (2010), J.Biomol.Tech.; 21 (1):9-17). La relación de coinfección relativa de p110 a p85 se varía y la relación de coinfección óptima es 1:1. La expresión de proteínas se visualiza examinando lisados de células completas por transferencia de Western. La solubilidad de la proteína PI3Ka^ es alta (85-90 % soluble).

Purificación de proteínas:

Las proteínas recombinantes se purifican de células de insecto Sf9 infectadas con baculovirus. Se resuspenden aproximadamente 1,5 x 108 células de una fermentación de 100 ml en 12 ml de tampón de lisis (Tris 50 mM pH = 7,2, NaCl 150 mM, MgCb 1 mM, CaCb 1 mM, Triton X-100 al 1 %, glicerol al 10 %, 6 |jl de Benzonasa (25 U/|jl), inhibidor de proteasa completo 1x (Roche), ortovanadato de sodio activado 1 mM) y se alteran por sonicación (Branson Digital sonifier W-450D durante un total de 3 minutos en baño de hielo/etanol (pulsos de 30 s, refrigeración de 1 min. entre pulsos). Los desechos celulares se retiran por centrifugación a 14000 x g (centrífuga Sorvall RC5-B, rotor SS-34, 11 000 rpm, 45 min. a 4 °C) y el sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo.

Para la purificación por marca de afinidad de histidina de p110a/p85a, se usan columnas de 1 ml de His-Trap HP Nisepharose (n.° cat. 17-5247-01, GE Healthcare) fijadas a un sistema de FPLC Ákta explorer. Las columnas se equilibran con Tris-HCl 25 mM pH 7,5, NaCl 0,5 M y los lisados aclarados se cargan con un superinóculo a un caudal de 0,5 ml/min. Después de lavar con 10 VC de Tris-HCl 25 mM pH=7,5, NaCl 0,5 M, imidazol 25 mM, la proteína unida se eluye con un gradiente por etapas de imidazol de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 250 y 500 mM de imidazol. La proteína eluida se concentra aproximadamente 10 veces mediante centrifugación con columnas de centrifugación Amicon Ultra-15 y, después de añadir glicerol a un 30 % (v/v) final, se divide en alícuotas y se congela instantáneamente en nitrógeno líquido.

La concentración de proteína se determina por duplicado con kit de ensayo de proteína BCA (n.° cat. 23227, Pierce) en placas de microvaloración siguiendo el protocolo proporcionado con el kit.

Materiales y métodos para ensayo enzimático HTRF®

El kit de ensayo de resolución temporal homogénea (HTRF®) de fosfoinosítido 3-cinasa (PI3-cinasa o PI3K) se adquiere de Upstate (ahora Millipore Corporation, Billerica, MA, EE. UU.). PIP2 y PiP3 se adquieren de Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, EE. UU.), microplacas de Greiner (Frickenhausen, Alemania; n.° catálogo 781207). Todos los demás reactivos se adquieren de Sigma (St Louis, MO, EE. UU.).

El ensayo de fluorescencia de resolución temporal homogénea (HTRF®) enzimático (de Upstate (ahora Millipore Corporation, Billerica, MA, EE. UU.) se realiza esencialmente como se describe por Sugita et al. (2008), Biochem. Biophys. Res. Commun. 377(3):941-5. PI3Ka (0,25-1,5 ng) se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente en 20 j l de tampón que contiene MgCb 10 mM, ATP 30 jM , 1,2-dioctanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositol-4',5'-bisfosfato) (sal de amonio) (PIP2) 20 jM , NaCl 150 mM, (dl-ditiotreitol) DTT 5 mM y Tris/HCl 25 mM (pH 7,5) en placas blancas de 384 pocillos. La reacción de cinasa se inicia añadiendo ATP (30 jM ) para estudios de inhibición y añadiendo PI3Ka para cinética de ATP (ATP 0-200 jM ).

El inhibidor de PI3K 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico (a partir de ahora en este documento "compuesto I") se diluye sucesivamente en dimetilsulfóxido (DMSO) y en tampón (concentración final: DMSO al 2,5 %). La reacción de cinasa se detiene por la adición de los reactivos de HTRF de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La placa se cierra herméticamente para evitar la evaporación y se mantiene en la oscuridad, a temperatura ambiente durante 16 horas. La placa se lee usando el lector de múltiples marcadores de Tecan GeniosPro® (de Tecan Group Ltd., Mannedorf, Suiza) en modo de fluorescencia de resolución temporal (filtro de excitación: 340 nm; filtro de emisión 1: 620 nm; filtro de emisión 2: 665 nm; espejo: dicroico 2; retardo: 150 js ; tiempo de integración: 500 js ; 10 destellos).

La señal de HTRF se determina de acuerdo con la fórmula:

señal de HTRF = 10000 * (emisión a 665 nm/emisión a 620 nm).

La señal de HTRF se disminuye gradualmente de una manera dependiente de PIP3 y se normaliza como el % de la disminución máxima obtenida con 1,2-dioctanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1-mio-inositol-3',4',5-trisfosfato) (sal de amonio) (PIP3) 30 |jM. Se prepara una curva patrón con PIP3 (CE⁵⁰= 200 nM) y se usa para calcular la cantidad de PIP3 producido por la reacción de cinasa de acuerdo con la fórmula:

[PIP3] = CE⁵⁰*(100-y)/y

donde y representa la señal de HTRF normalizada y CE⁵⁰la señal de la concentración de PIP3 al 50 % en la curva patrón. El consumo de ATP y PIP2 nunca excede el 5 %.

La cinética de ATP se ajusta mediante regresión no lineal con la ecuación de Michaelis-Menten y las curvas de inhibición por compuesto I se ajustan con la ecuación lógica de 4-parámetros. La función de ajuste global de Xlfit^®(ID Business Solutions, Guildford, R.U.) se usa para ajustar globalmente todos los experimentos replicados.

Resultados

Usando los materiales y métodos anteriores, los experimentos demuestran la cinética de activación de ATP de PI3Ka como se expone en la figura 1 y la inhibición de PI3Ka de tipo silvestre (wt) y con mutación Q859A por el compuesto I como se expone en la figura 2.

La figura 1 proporciona los valores medios ± error típico (E.T.) de 14 experimentos para PI3K de tipo silvestre (wt) (constante de Michaelis (Km) = 60 ± 6 j M) y 5 experimentos para PI3Ka mutante Q859A (Km = 72 ± 8 j M). Como se resume en la figura 1 hasta ahora la Pl3K de tipo silvestre (wt) y la PI3Ka mutante Q859A demuestran cinética de activación de ATP similar de PI3Ka.

La figura 2 proporciona los valores medios ± error típico (E.T.) de 10 experimentos para PI3K de tipo silvestre (wt) y 7 experimentos para PI3Ka mutante Q859A. Como se resume en la figura 2 hasta ahora, la mutación Q859A en PI3Ka aumenta significativamente la CI⁵⁰hasta 122 ± 28 nM en comparación con el tipo silvestre (CI⁵⁰= 8,4 ± 1,0 nM). Este aumento de 14,5 veces en la CI⁵⁰hasta 122 ± 28 nM demuestra claramente que la mutación Q859 en PI3Ka es un residuo clave para evaluar la potencia del compuesto I tras la administración.

Claims

REIVINDICACIONES

1. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, en el que el sujeto tiene una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K, o

en el que el sujeto tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K.

2. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el método comprende:

b) administrar selectivamente 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto basándose en que la muestra tiene una glutamina en la posición 859.

3. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

4. Un compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K que es 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el método comprende:

a) determinar la presencia o ausencia de glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K en una muestra biológica del sujeto, en el que la presencia de glutamina en la posición 859 indica que hay una probabilidad aumentada de que el sujeto responda al tratamiento con dicho inhibidor de la subunidad alfa de Pl3K; y

b) después de ello seleccionar al sujeto para tratamiento con dicho compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K basándose en que la muestra del sujeto tiene glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K.

5. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el método comprende:

a) ensayar una muestra biológica del sujeto para la presencia o ausencia de mutación en la secuencia de ácido nucleico en la subunidad catalítica p110a de PI3K, en el que la mutación provoca una sustitución del aminoácido glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K; y

b) administrar 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto basándose en que la muestra de la secuencia de ácido nucleico no tiene mutación y codifica una glutamina en la posición 859.

6. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el método comprende:

b) después de ello seleccionar al sujeto para tratamiento con 1 -({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1, 1 -dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S/)-pirrol¡d¡n-1,2-dicarboxíl¡co, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, basándose en que la muestra del sujeto carece de la mutación y codifica glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K; y

c) después de ello administrar 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('S)-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto que carece de la mutación.

7. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (S)-pirrolidin-l ,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el método comprende:

a) ensayar una muestra biológica del sujeto para la presencia o ausencia de mutación en la secuencia de ácido nucleico en la subunidad catalítica p110a de PI3K, en el que la mutación provoca una sustitución aminoacídica de glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K, en el que la ausencia de una mutación en la secuencia de ácido nucleico indica que hay una probabilidad aumentada de que el sujeto responda a tratamiento con dicho compuesto inhibidor de la subunidad alfa de PI3K, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

8. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido (SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC), cáncer de endometrio, cáncer de próstata, cáncer de colon y mieloma.

9. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en el que la muestra es una muestra tumoral.

10. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la muestra tumoral es una muestra congelada fresca o una muestra tejido incluida en parafina.

11. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la detección de la presencia o ausencia de glutamina en la posición 859 de la subunidad catalítica p110a de PI3K se realiza por inmunoensayos, inmunohistoquímica, ELISA, citometría de flujo, transferencia de Western, HPLC y espectrometría de masas.

12. 1-({4-Metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) de 2-amida del ácido ('SJ-pirrolidin-1,2-dicarboxílico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5-7, en el que la presencia o ausencia de una mutación en una molécula de ácido nucleico que codifica la subunidad catalítica p110a de PI3K se detecta mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste en análisis de transferencia de Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (RT-PCR), ensayos basados en TaqMan, secuenciación directa, hibridación dinámica específica de alelo, matrices de SNP de oligonucleótidos de alta densidad, ensayos de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), ensayos de prolongación de cebador, ensayos de ligasa de oligonucleótidos, análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria, electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE), cromatografía de líquidos de alto rendimiento desnaturalizante, análisis de fusión de alta resolución, ensayos de proteínas de unión a desemparejamientos de ADN, SNPLex®, electroforesis capilar o transferencia de Southern.