ES2845656T3

ES2845656T3 - Kits y procedimientos para detectar anticuerpos anticélulas endoteliales en rechazo de aloinjertos

Info

Publication number: ES2845656T3
Application number: ES15842376T
Authority: ES
Inventors: Minnie Sarwal; Tara Sigdel; Annette Jackson
Original assignee: Johns Hopkins University; Immucor GTI Diagnostics Inc
Current assignee: Johns Hopkins University; Immucor GTI Diagnostics Inc
Priority date: 2014-09-18
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2035-09-18
Also published as: US20170276687A1; EP3194963A4; WO2016044714A1; EP3194963B1; EP3194963A1; US11029317B2

Abstract

Un procedimiento de diagnóstico de un rechazo de aloinjerto (AR) en un individuo que ha recibido o recibirá un trasplante de órgano, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) aislar un anticuerpo de una muestra biológica del individuo que forma una interacción de afinidad con al menos una porción o fragmento de péptido de CTLA4, y aislar opcionalmente al menos un anticuerpo adicional de la muestra biológica de un individuo que forma una interacción de afinidad con al menos una porción o fragmento de péptido al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en TRIM21, HSH2D, IFI6, APEX2, CLIP4, UBXD8, ZMYM5, EDIL3, UBE2V1, PHGDH, SCEL, ZCCHC8, C22orf33, CPSF3, C20orf96, ENG, DLG GAK, CDC42EP3, ARFGAP1, XIAP, C2orf47, QKI, ICAM4, FLT3LG, DRICH1, PDDC1, FOXP1, NUDT16L1, UBQLN2, TOX2, AFF4, CWF19L2, GCDH, FAM184A, SUMO1, CHGB, ZNF695, LMX1A, CPLX2, MYOT, SNX13, CSPP1, GYG2, ODF2, TADA3, AQP2, DMD, GOLGA2P10, MUTED, PRELP, HLA-DPA1 y TSSK2, b) medir el nivel de al menos un anticuerpo y, opcionalmente, el nivel de al menos un anticuerpo adicional, c) comparar el nivel de al menos un anticuerpo, y opcionalmente el nivel de al menos un anticuerpo adicional, del individuo con un estándar de referencia positivo y comparar el nivel de al menos un anticuerpo, y opcionalmente el nivel de al menos otro anticuerpo, a una referencia negativa; y en el que una similitud del nivel medido de al menos un anticuerpo, y opcionalmente el nivel medido de al menos un anticuerpo adicional, con el estándar de referencia positivo indica un mayor riesgo de desarrollar AR y una similitud del nivel medido de al menos un anticuerpo y, opcionalmente, el nivel medido de al menos un anticuerpo adicional con al patrón de referencia negativo indica un riesgo reducido de desarrollar AR.

Description

DESCRIPCIÓN

Kits y procedimientos para detectar anticuerpos anticélulas endoteliales en rechazo de aloinjertos

Campo de la invención

La divulgación se refiere a procedimientos y kits para la evaluación del rechazo de aloinjertos mediante la detección específica de anticuerpos anticélulas endoteliales.

Antecedentes de la invención

El trasplante de órganos de un donante a un receptor huésped es un componente de ciertos procedimientos médicos y regímenes de tratamiento. Después del trasplante, es necesario evitar el rechazo del injerto por parte del receptor. Con el fin de mantener la viabilidad del órgano del donante, se emplea típicamente terapia inmunosupresora. Sin embargo, aún puede ocurrir el rechazo de un trasplante de órganos.

El rechazo de trasplante de órganos se clasifica como hiperagudo, agudo, límite agudo, subclínico agudo o crónico. Para la mayoría de los órganos, incluidos los riñones, el rechazo de órganos se puede diagnosticar de manera inequívoca solo mediante la realización de una biopsia de ese órgano después de haber sido trasplantado. La detección de lesiones de manera oportuna es fundamental para garantizar la salud del aloinjerto y la supervivencia a largo plazo. Es particularmente importante poder evaluar si un trasplante de órgano sobrevivirá en un receptor del donante antes de que ocurra el trasplante. Esta evaluación previa al trasplante permitiría una mejor compatibilidad entre los donantes de órganos y los receptores de órganos, y aumentaría la capacidad de supervivencia de un número limitado de órganos disponibles para el trasplante.

Las mejoras en la capacidad para detectar aloanticuerpos en los sueros de los receptores de trasplantes antes y después del trasplante renal, junto con el desarrollo de procedimientos para identificar el daño mediado por anticuerpos, han puesto de relieve el papel de los anticuerpos en el rechazo agudo y crónico de aloinjertos (McKenna, RM et al., Transplantation 2000, 69, 319-326; Mengel, M. et al., Am J Transplant 2012, 12, 563-570; Sis, B. Et al., Am J. Transplant 2012, 12, 1168-1179; Loupy, A. et al., Nat Rev Nephrol 2012 8, 348-357). Sin embargo, la mayoría de estos estudios se han centrado en anticuerpos específicos de HLA y su potencial para activar el complemento. La relevancia clínica y los mecanismos de cómo los aloanticuerpos pueden contribuir al rechazo del aloinjerto en ausencia de activación del complemento, tal como en el caso de anticuerpos HLA de bajo nivel, se encuentran actualmente bajo investigación (Morrell, CN et al., Circ Res 2008, 102, 777- 785; Zhang, X. et al., Curr Opin Organ Transplant 2012 17, 446-451). Los informes de rechazo de aloinjertos en trasplantes entre hermanos con HLA idénticos sugieren un papel de para los anticuerpos no HLA en algunos rechazos (Opelz, G. Lancet 2005, 365, 1570-1576; Grafft, CA et al., Nephrol Dial Transplant 2010 25, 307-310). Los antígenos no HLA que se han asociado con el rechazo del aloinjerto renal incluyen: agrina, vimentina, perlecano, Ka-tubulina, proteína quinasa C zeta, la cadena A relacionada con el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MICA) y el receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R) (Sigdel, TK y Sarwal MM., Hum Immunol 201374, 1486-1490).

Los antígenos no HLA expresados en células endoteliales son de particular interés dado que el endotelio vascular sirve como punto de contacto entre el sistema inmunológico del receptor y el aloinjerto trasplantado. Por lo tanto, los anticuerpos anticélulas endoteliales (AECA) reactivos a estos antígenos no HLA pueden tener un papel patogénico importante en el rechazo de aloinjertos. El trasplante incompatible con HLA ha revelado que los pacientes trasplantados a través de las barreras de HLA y AECA tienen una mayor incidencia y gravedad de rechazo mediado por anticuerpos.

Esto ha llevado a la necesidad de nuevos procedimientos de detección de respuestas humorales de AECA no mediadas por HLA que contribuyan a una respuesta de rechazo de aloinjerto después del trasplante. Las nuevas pruebas de compatibilidad cruzada de células endoteliales específicas para donantes de órganos y receptores de órganos antes del trasplante proporcionarán un procedimiento necesario para identificar a los pacientes que de otro modo no se identificarían como de alto riesgo de sufrir un rechazo de aloinjerto. Los estudios que utilizaron sangre periférica, precursores de células endoteliales (ECP) como objetivos indicaron que los receptores no sensibilizados trasplantados a través de una prueba cruzada de células endoteliales con reacción positiva experimentaron un mayor rechazo y valores más altos de creatinina sérica temprano después del trasplante, lo que indica una respuesta temprana de rechazo agudo (Breimer, ME et al., Am J Transplant 2008). Estos procedimientos anteriores de compatibilidad cruzada de células endoteliales descritos adicionalmente por Sumatran et al., patente de los Estados Unidos No. 8.034.635, utilizan ECP de donantes que son reactivos con el suero del receptor para la detección de AECA que pueden ser responsables del rechazo de aloinjerto independiente del complemento. Aunque se ha demostrado que esta prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales es clínicamente útil, tiene muchos problemas técnicos. Por consiguiente, esta estrategia de prueba se basa en la detección de anticuerpos IgG e IgM del receptor como una lectura general de los AECA. Este enfoque es limitado porque los HLA se expresan en los ECP de los donantes, lo que limita la capacidad para detectar específicamente AECA en receptores incompatibles con HLA. Por los tanto, sin conocer los antígenos AECA específicos y conservados, se impide la identificación de los pacientes que proceden al trasplante a través de ambas barreras. Por lo tanto, la identificación de dianas antigénicas nuevas y específicas expresadas en los ECP proporcionaría una prueba de diagnóstico actualmente no disponible para AECA en inmunoensayos en fase sólida que, a su vez, puede ayudar en la evaluación del riesgo antes del trasplante y brindar una oportunidad para la intervención terapéutica. El documento US 2013/0004978 A1 divulga un procedimiento para el diagnóstico de rechazo agudo del injerto en un sujeto mediante la determinación del nivel de anticuerpos anti LG3 en una muestra biológica de dicho sujeto. El documento EP-1 844776 A1 divulga el diagnóstico de rechazo del injerto mediante la determinación del nivel de anticuerpos antirreceptor de endotelina en una muestra del paciente.

Por lo tanto, se describen en el presente documento dianas y procedimientos novedosos antigénicos de AECA, composiciones y kits para la identificación sensible y precisa de AECA que se correlacionan con un aumento de la lesión microvascular in vivo en pacientes que dan positivo para estos AECA.

Todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, documentos y artículos citados aquí se incorporan se incorporan el presente documento como referencia en su totalidad, a menos que se indique lo contrario.

Breve sumario de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento se divulgan composiciones y procedimientos para clasificar a un individuo como de alto riesgo de rechazo de aloinjerto (AR) y/o de bajo riesgo o sin riesgo de rechazo de aloinjerto (no AR) de trasplantes de órganos. Estas composiciones y procedimientos pueden usarse en tal clasificación tanto en pacientes pediátricos como adultos, que comprenden el nivel de un conjunto de anticuerpos anticélulas endoteliales.

En una realización se describe en el presente documento, un procedimiento para diagnosticar un AR en un individuo que ha recibido o recibirá un trasplante de órgano, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) aislar al menos un anticuerpo de una muestra biológica de un individuo que forma una interacción de afinidad con al menos una porción o fragmento de péptido de al menos una proteína seleccionada de la Tabla 2, b) medir un nivel de al menos un anticuerpo, c) comparar el nivel de al menos un anticuerpo de un individuo con un estándar de referencia y comparar el nivel de al menos un anticuerpo con una referencia negativa; y en el que una similitud del nivel medido de al menos un anticuerpo con el estándar de referencia positivo indica un mayor riesgo de desarrollar AR y una similitud del nivel medido de al menos un anticuerpo con el estándar de referencia negativo indica un riesgo reducido de desarrollar AR.

En una realización descrita en el presente documento, se trata de un procedimiento para tratar a un individuo que ha recibido un trasplante de órgano, comprendiendo el procedimiento solicitar una prueba clínica que comprende las etapas de: a) aislar al menos un anticuerpo de una muestra biológica de un individuo que forma una interacción de afinidad con al menos una porción o fragmento de péptido de al menos una proteína seleccionada de la Tabla 2, b) medir un nivel de al menos un anticuerpo, c) comparar el nivel de al menos un anticuerpo de un individuo con un estándar de referencia positivo y comparar el nivel de al menos un anticuerpo con una referencia negativa; y en el que una similitud del nivel medido de al menos un anticuerpo con el estándar de referencia positivo indica un mayor riesgo de desarrollar AR y una similitud del nivel medido de al menos un anticuerpo con el estándar de referencia negativo indica un riesgo reducido de desarrollar AR; y en el que una administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más agentes terapéuticos aumenta en un sujeto indicado por tener un AR, una administración de una cantidad estándar terapéuticamente eficaz de uno o más de un agente terapéutico se mantiene en un sujeto indicado que no tiene AR, o una administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de un agente terapéutico disminuye en un sujeto indicado que no tiene AR.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el procedimiento comprende un inmunoensayo en fase sólida. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el inmunoensayo en fase sólida comprende un ELISA. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, el individuo es un adulto de 23 años o más. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, el individuo es un niño o un adulto joven menor de 23 años. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la muestra comprende una muestra de suero del receptor. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, al menos un anticuerpo comprende un anticuerpo anticélulas endoteliales. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el anticuerpo anticélulas endoteliales puede formar una interacción de afinidad con al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en Endoglina, ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4). En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el aislamiento de al menos un anticuerpo comprende incubar una muestra que tiene el anticuerpo con un elemento de captura de anticuerpo. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, el elemento de captura de anticuerpo comprende un antígeno específico de anticuerpo, una perla de captura o un soporte sólido de captura. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, el elemento de captura de anticuerpos comprende un antígeno específico de anticuerpo. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el antígeno específico del anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante y un fragmento de polipéptido. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la proteína de longitud completa, fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante y un fragmento de polipéptido comprende al menos una porción o fragmento de péptido de al menos una o más de las proteínas en la Tabla 2. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la proteína de longitud completa, fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante y un fragmento de polipéptido comprende al menos una porción o fragmento de péptido de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Endoglina, ligando de tirosina quinasa-3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4). En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el antígeno específico del anticuerpo se marca con una etiqueta de aislamiento seleccionada del grupo que consiste en biotina, una etiqueta de GST, un grupo amida y una etiqueta de estreptavidina. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, la etiqueta de aislamiento comprende biotina. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el elemento de captura de anticuerpo se aísla con un elemento de captura secundario. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el elemento de captura secundario está inmovilizado sobre un soporte sólido que comprende una perla o una placa. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, el elemento de captura secundario comprende estreptavidina. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, el nivel del anticuerpo se mide mediante un elemento de detección. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, el elemento de detección comprende un anticuerpo secundario marcado. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el nivel de al menos un anticuerpo medido se compara con los estándares de referencia positivos y negativos mediante un programa informático, en el que después de la comparación, el programa informático genera una puntuación que indica la probabilidad de que un individuo tenga una respuesta de AR.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, los procedimientos descritos en el presente documento comprenden además la detección de un anticuerpo HLA específico del donante, en el que la presencia del anticuerpo HLA específico del donante indica un riesgo de desarrollar un AR. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la detección de un anticuerpo HLA específico de un donante comprende un ensayo basado en células o un inmunoensayo en fase sólida. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, el inmunoensayo en fase sólida comprende un ensayo ELISA o Luminex y el ensayo basado en células comprende un ensayo de compatibilidad cruzada.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el procedimiento para diagnosticar un AR en un individuo antes de recibir un trasplante de órgano sólido comprende además las etapas de realizar una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales entre un donante y un receptor de órganos. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, la prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales comprende las etapas de: a) aislar las células progenitoras de células endoteliales (ECP) del donante de una muestra de sangre del donante, b) obtener la muestra de suero del receptor, c) incubar los ECP aislados del donante con la muestra de suero del receptor; y d) aislar al menos un anticuerpo de los ECP que forma una interacción de afinidad con al menos una porción o fragmento de péptido de al menos una proteína seleccionada de la Tabla 2. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, al menos un anticuerpo es un anticuerpo anticélulas endoteliales. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el anticuerpo anticélulas endoteliales forma una interacción de afinidad con al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en Endoglina, ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4).

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el procedimiento de diagnóstico de un AR en un individuo que ha recibido o recibirá un trasplante de órgano comprende además un ensayo basado en células. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el ensayo basado en células comprende una prueba de compatibilidad cruzada de CDC o un ensayo de compatibilidad cruzada por citometría de flujo. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, el individuo puede ser positivo o negativo para anticuerpos específicos de HLA. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el individuo puede dar positivo o negativo en una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales. En algunas de las realizaciones descritas en este documento, el individuo puede dar positivo o negativo en una prueba de compatibilidad cruzada de CDC.

En una realización descrita en el presente documento, se encuentran kits para diagnosticar un AR en un individuo que ha recibido o recibirá un trasplante de órgano, comprendiendo el kit: a) un elemento de captura de anticuerpo para aislar al menos un anticuerpo de una muestra biológica de un individuo que forma una interacción de afinidad con al menos una porción o fragmento de péptido de al menos una proteína seleccionada de la Tabla 2, b) un elemento de detección para medir un nivel de al menos un anticuerpo, c) un estándar de referencia positivo y un estándar de referencia negativo para comparar el nivel de al menos un anticuerpo de un individuo con un estándar de referencia positivo y comparar el nivel de al menos un anticuerpo con una referencia negativa.

En un aspecto, el kit comprende un inmunoensayo en fase sólida. En otro aspecto, el kit comprende un inmunoensayo en fase sólida que comprende un ELISA. En otro aspecto, el kit comprende un elemento de captura de anticuerpo. En otro aspecto, el kit comprende un elemento de captura de anticuerpo que comprende un antígeno específico de anticuerpo, una perla de captura o un soporte sólido de captura. En otro aspecto, el kit comprende un elemento de captura de anticuerpo que comprende un antígeno específico de anticuerpo. En otro aspecto, el kit comprende un antígeno específico de anticuerpo que comprende una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante y un fragmento de polipéptido. En otro aspecto, el kit comprende un antígeno específico de anticuerpo que comprende una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido que comprende al menos una porción o un fragmento de péptido de una o más de las proteínas de la Tabla. 2. En otro aspecto, el kit comprende una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante y un fragmento de polipéptido que comprende al menos una porción o fragmento de péptido de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Endoglina, ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4). En otro aspecto, el kit comprende un antígeno específico de anticuerpo descrito en el presente documento marcado con una etiqueta de aislamiento seleccionada del grupo que consiste en biotina, una etiqueta GST, un grupo amida y una etiqueta de estreptavidina. En otro aspecto, el kit comprende un antígeno específico de anticuerpo descrito en el presente documento marcado con una etiqueta de aislamiento que comprende biotina. En otro aspecto, el kit comprende un elemento de captura secundario. En otro aspecto, el kit comprende un elemento de captura secundario inmovilizado sobre un soporte sólido que comprende una perla o una placa. En otro aspecto, el kit comprende un elemento de captura secundario que comprende estreptavidina. En otro aspecto, el kit comprende un elemento de detección. En otro aspecto, el kit comprende un elemento de detección que comprende un anticuerpo secundario marcado. En otro aspecto, el kit comprende un programa informático en el que el programa informático compara el nivel de al menos un anticuerpo medido con los estándares de referencia positivos y negativos, y en el que, después de la comparación, el programa informático genera una puntuación que indica la probabilidad de que un individuo tenga un AR. En otro aspecto, el kit comprende un elemento para detectar un anticuerpo HLA específico del donante, en el que la presencia del anticuerpo h La específico del donante puede indicar un mayor riesgo de desarrollar AR. En otro aspecto, el kit comprende el elemento de detección para detectar un anticuerpo HLA específico del donante que comprende un ensayo basado en células o un inmunoensayo en fase sólida que comprende además un ELISA o ensayo Luminex.

En otro aspecto, el kit comprende además un conjunto de reactivos para realizar una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales entre un donante de órganos y un receptor de órganos. En otro aspecto, el kit comprende una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales que comprende un conjunto de reactivos para: a) aislar las células progenitoras de células endoteliales del donante (ECP) de una muestra de sangre del donante, b) obtener la muestra de suero del receptor, c) incubar los ECP aislados del donante con la muestra de suero del receptor; y d) aislar al menos un anticuerpo de las células progenitoras de células endoteliales. En otro aspecto, el kit comprende además reactivos para realizar un ensayo basado en células que comprende un ensayo de compatibilidad cruzada CDC o un ensayo de compatibilidad cruzada de citometría por flujo.

Breve descripción de los dibujos

FIGURA 1. Puntuaciones de histopatología para los receptores de trasplantes de la cohorte de descubrimiento.

Se muestran las biopsias renales con puntuaciones histológicas positivas> 1 adquiridas durante los 1,5 años posteriores al trasplante de acuerdo con el protocolo o en el momento de la disfunción. La puntuación histológica (0-3) se realizó utilizando los criterios 26-29 actualizados de Banff '97. Se muestran los grados de glomerulitis (g), inflamación intersticial (i) y tubular (t), vasculitis (v), capilaritis peritubular (ptc). La tinción con C4d se realizó en tejido congelado mediante inmunofluorescencia indirecta. Glomerulopatía de trasplante (cg) definida por la duplicación de la membrana basal glomerular observada en microscopía electrónica y óptica. Se detectó un nivel bajo de HLA-DSA DR52 (MFI <1000) en un receptor en el momento de la biopsia.

FIGURA 2. Identificación de dianas antigénicas para AECA y el impacto del tratamiento de desensibilización.

Análisis del arreglo de proteína de 14 eluatos de AECA derivados de sueros positivos de compatibilidad cruzada con EC. Las unidades de fluorescencia relativa (RFU) para anticuerpos específicos para EDIL3, Endoglina (ENG), ICAM4 y ligando FLT3 (LG) fueron significativas en comparación con la intensidad de señal media de los anticuerpos de baja abundancia. Se definió un umbral positivo de 2000 RFU como límite de abundancia. Las barras de error representan el error estándar de la media. B. Impacto de la plasmaféresis/IVIg (PP) en los niveles de AECA. Los AECA específicos para Endoglina, FLT3 LG, EDIL3 e ICAM4 disminuyeron después de los tratamientos de PP y rebotaron en un suero después del trasplante que produjo una prueba de compatibilidad cruzada de EC positiva. Los datos mostrados son de un solo receptor renal, los valores se normalizaron a la inmunoglobulina IgG total.

FIGURA 3. Expresión de Endoglina y FLT3 en el endotelio renal.

La inmunohistoquímica realizada en biopsias tomadas en el momento del rechazo muestra la expresión de (A) Endoglina y (B) FLT3 en microvasculatura glomerular y peritubular y arterias. Los datos mostrados son representativos de las biopsias analizadas de nueve receptores de Cohorte de Descubrimiento.

FIGURA 4. Los cultivos de células endoteliales estimulados con eluatos de AECA sobrerregulan los marcadores de activación.

Se estimularon cultivos de células endoteliales primarias con sueros positivos para AECA, eluatos de AECA, TNFa (10 ng/pocillo) o un suero positivo para anticuerpo HLA. El análisis del fenotipo de la superficie celular se realizó 24 horas después de la estimulación usando citometría de flujo. Se realizaron comparaciones de los valores medios de fluorescencia entre las células estimuladas con eluatos de AECA concentrados y los sueros del receptor (se muestran los valores p). Datos acumulativos obtenidos de 7 experimentos independientes, probando eluatos de AECA de 5 receptores de Cohorte de Descubrimiento

FIGURA 5. Los cultivos de células endoteliales estimulados con eluatos de AECA tienen un impacto diferencial en la producción de citocinas y quimiocinas inflamatorias.

Los cultivos de células endoteliales primarias se estimularon con medio de cultivo solo, eluatos de AECA, un suero positivo para anticuerpo HLA o TNFa (10 ng/pocillo). El sobrenadante del cultivo se probó 72 horas después de la estimulación usando un inmunoensayo de 54 analitos humanos Procarta® adquirido en una plataforma multiplex Luminex® xMAP®. Se muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) para analitos expresados diferencialmente y estándares de control positivo. Los datos son representativos de 4 experimentos independientes, probando eluatos de AECA derivados de 5 receptores de Cohorte de Descubrimiento. La producción de citocinas inflamatorias PDGF, RANTES (también conocidas como CCL5) y RESISTIN aumentó después de la estimulación con eluatos de AECA en comparación con los controles negativos (p = 3,8 x 10-13, p = 2,1 x 10-14, p = 1,1 x 10-10 respectivamente) o células estimuladas con anticuerpos TNFa o h La (p = 1,8 x 10-13, p = 7,7 x 10-6 y p = 0,002, respectivamente). Por el contrario, las quimiocinas CCL3, CCL4, CXCL5 y CXCL aparecieron disminuidas en cultivos estimulados con los eluatos AECA en comparación con la estimulación con anticuerpos TNFa o HLA (p = 6,4 x 10-5, p = 0,05, p = 0,07 y p = 0,04, respectivamente).

FIGURA 6. Puntuaciones histológicas para los receptores fuertemente positivos (n = 28) y negativos (n = 24) de AECA por ELISA.

Biopsias renales con puntaje histológico positivo> 1 adquiridos durante el primer año después del trasplante tomadas de acuerdo con el protocolo o en el momento de la disfunción. Se muestran las puntuaciones de todas las biopsias o un subconjunto de biopsias cuando no se detectó HLA-DSA en el momento de la biopsia o se detectó a un nivel 20 de compatibilidad cruzada citométrica de flujo negativo. La puntuación histológica (0-3) se realizó utilizando los criterios 26-29 actualizados de Banff '97. Se muestran los grados de glomerulitis (g), inflamación intersticial (i) y tubular (t), vasculitis (v), capilaritis peritubular (ptc). La tinción con C4d se realizó en tejido congelado mediante inmunofluorescencia indirecta. Glomerulopatía de trasplante (cg) definida por la duplicación de la membrana basal glomerular observada en microscopía electrónica y óptica. Las estadísticas (comparaciones de la media y de la prueba T) se proporcionan en la Tabla 5.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se describe un grupo de anticuerpos anticélulas endoteliales (AECA), que pueden ayudar a determinar si un individuo que recibirá o ha recibido un trasplante de órgano está experimentando, o experimentará, un rechazo de aloinjerto (AR) del órgano trasplantado. La presencia de las AECA descritas en el presente documento es independiente de la edad del receptor, el centro de trasplante, la fuente de la muestra, el ensayo, la causa de la enfermedad en etapa terminal, las comorbilidades, el uso de inmunosupresión y similares. En el presente documento se describen además procedimientos para evaluar AR o no AR en un individuo que recibirá o que ha recibido un aloinjerto de órgano, así como procedimientos para identificar a un individuo para el tratamiento de AR en un trasplante de órgano. La invención proporciona además kits basados en estos procedimientos para evaluar el AR y la probabilidad de AR en un individuo que recibirá o ha recibido un aloinjerto de órgano.

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para controlar una variedad de diferentes tipos de aloinjertos de órganos. Los aloinjertos de órganos de interés incluyen, pero no se limitan a: corazón, riñón, pulmón, hígado, páncreas, islotes pancreáticos, tejido cerebral, estómago, intestino grueso, intestino delgado, córnea, piel, tráquea, hueso, médula ósea, músculo, vejiga o partes de los mismos trasplantados. Se puede recolectar una pluralidad de muestras biológicas en cualquier momento. Se puede tomar una muestra o muestras biológicas de un sujeto en cualquier momento, incluso antes del trasplante de aloinjerto, en el momento del trasplante o en cualquier momento después del trasplante.

Definiciones

Para los propósitos de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y cuando sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. En el caso de que alguna definición establecida a continuación entre en conflicto con cualquier documento incorporado en este documento como referencia, prevalecerá la definición establecida a continuación.

El "rechazo de aloinjerto" o "AR" es el rechazo por parte del sistema inmunológico de un receptor de trasplante de tejido/órgano cuando el tejido trasplantado es inmunológicamente extraño. "Rechazo de aloinjerto" o "AR", como se usa en este documento, abarca además los términos "rechazo agudo" o "rechazo crónico". El AR puede caracterizarse por la infiltración del tejido trasplantado por células inmunes del receptor, que llevan a cabo su función efectora y destruyen el tejido trasplantado. El AR también se puede caracterizar por el desarrollo de anticuerpos específicos del donante, un diagnóstico denominado como rechazo mediado por anticuerpos (AMR). El AR puede clasificarse además como AR hiperagudo, agudo, límite agudo o subclínico. El inicio del rechazo hiperagudo es en general rápido y generalmente ocurre en humanos en el lapso de minutos y horas después de la cirugía de trasplante. El inicio del a R generalmente ocurre en los seres humanos en el lapso de meses, a menudo aproximadamente de 6 a 12 meses después de la cirugía de trasplante. El AR de límite agudo y subclínico es el resultado de alorrespuestas inflamatorias de bajo grado. Generalmente, el AR puede tratarse, inhibirse o suprimirse con fármacos inmunosupresores tales como rapamicina, ciclosporina A, anticuerpos monoclonales anti-CD40L y similares.

"Sin rechazo de aloinjerto" o "sin AR" o "Estable" o "STA" se usan indistintamente en el presente documento. Sin AR/STA representa un paciente con bajo riesgo o sin riesgo de AR después de un trasplante. Sin AR se puede caracterizar por la supervivencia a largo plazo del injerto de tejido trasplantado que es inmunológicamente extraño para un receptor de trasplante de tejido.

El término "aloinjerto" se refiere a un trasplante de un individuo a otro y abarca cualquier órgano trasplantado.

Como se usa en este documento, "gen" se refiere a un ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido, que incluye secuencias de exón y (opcionalmente) intrón. El término "intrón" se refiere a una secuencia de ADN presente en un gen dado que no se traduce en proteína y generalmente se encuentra entre exones en una molécula de ADN. Además, un gen puede incluir opcionalmente su promotor natural (es decir, el promotor con el que el exón y los intrones del gen están enlazados operativamente en una célula no recombinante) y secuencias reguladoras asociadas, y puede incluir o no secuencias cadena arriba del sitio de inicio AUG, secuencias líder no traducidas, secuencias señal, secuencias no traducidas cadena abajo, secuencias de inicio y parada de la transcripción, señales de poliadenilación, secuencias de inicio y parada de traducción, sitios de unión a ribosomas y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "aislar" o "aislado" se refiere a la separación o inmovilización de un material biológico de una mezcla o muestra biológica compleja. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se pueden aislar uno o más anticuerpos de una muestra o mezcla biológica compleja. En algunos aspectos, uno o más anticuerpos aislados usando las metodologías descritas en este documento pueden comprender uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales.

El término "referencia" o "estándar de referencia" se refiere a un valor conocido o conjunto de valores conocidos con los que se puede comparar un valor observado. En una realización, el estándar de referencia es el valor (o nivel) de anticuerpos anticélulas endoteliales que presentan un fenotipo de supervivencia del injerto. En otra realización, el estándar de referencia es el valor (o nivel) de anticuerpos anticélulas endoteliales presentes en un fenotipo de pérdida de injerto.

Un "individuo" o "sujeto" puede ser un "paciente". Un "paciente" se refiere a un "individuo" que está bajo el cuidado de un médico tratante. El paciente puede ser hombre o mujer. En una realización, el paciente ha recibido un trasplante de órganos. En otra realización, el paciente ha recibido un trasplante de órgano y está experimentando AR.

Una "subpoblación de pacientes" y variaciones gramaticales de la misma, como se usa en este documento, se refiere a un subconjunto de pacientes caracterizado por tener una o más características distintivas medibles y/o identificables que distinguen al subconjunto de pacientes de otros en la categoría de enfermedad más amplia a la cual pertenece.

El término "muestra", como se usa en este documento, se refiere a una composición que se obtiene o se deriva de un individuo que contiene información genómica o proteómica. En una realización, la muestra es suero sanguíneo. En un aspecto, la muestra es suero sanguíneo de un donante. En otro aspecto, la muestra es suero sanguíneo de un receptor. En otra realización, la muestra es sangre completa. En otra realización, la muestra es sangre. En otra realización, la muestra son leucocitos de sangre periférica. En otra realización, la muestra son células mononucleares de sangre periférica. En otra realización, la muestra es una biopsia de tejido. En otra realización, la muestra es una biopsia de tejido de un órgano trasplantado. En otra realización, la muestra es una biopsia de tejido de un órgano antes del trasplante en un receptor.

Como se usa en este documento, "microarreglo" se refiere a una disposición de una colección de secuencias de nucleótidos en una ubicación centralizada. Los arreglos pueden estar sobre un sustrato sólido, tal como una superficie compuesta de vidrio, plástico o silicio. Las secuencias de nucleótidos pueden ser ADN, ARN o cualquier permutación de los mismos. Las secuencias de nucleótidos también pueden ser secuencias parciales de un gen, cebadores, secuencias de genes completas, secuencias no codificantes, secuencias codificantes, secuencias publicadas, secuencias conocidas o secuencias nuevas.

El término "anticuerpo anticélulas endoteliales" o "AECA" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo que tiene una interacción de afinidad con un antígeno expresado en cualquier tipo de célula endotelial. En algunos aspectos, el anticuerpo anticélulas endoteliales se genera a partir de un receptor de aloinjerto que es específico de un antígeno endotelial presentado en una célula endotelial de un aloinjerto de donante.

El término "célula endotelial", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier célula que comprende la vasculatura de cualquier órgano o sistema de órganos (por ejemplo, una célula endotelial que comprende un capilar, vénula, vena, arteriola o arteria). En algunos aspectos, la célula endotelial puede comprender la vasculatura de un órgano o aloinjerto trasplantado. En algunos aspectos, la célula endotelial comprende la vasculatura de un corazón, riñón, pulmón, hígado, páncreas, islotes pancreáticos, tejido cerebral, estómago, intestino grueso, intestino delgado, córnea, piel, tráquea, hueso, médula ósea, músculo, o vejiga trasplantado.

El término "progenitor de células endoteliales" o "ECP" como se usa en este documento se refiere a una población de células que circulan en la sangre y se diferencian fácilmente en una célula endotelial (Asahara, T. et al., Science 1997, 275, 964- 967). En algunos aspectos, los ECP pueden detectarse mediante la expresión de Tie-2. En algunos aspectos descritos en este documento, los ECP se aíslan de la sangre periférica del donante con un agente de unión específico para Tie-2. Las patentes estadounidenses números 8.173.372 y 8.034.635 se incorporan como referencia por sus enseñanzas específicas.

El término antígeno de células endoteliales como se usa en este documento se refiere a cualquier antígeno (por ejemplo, cualquier proteína, polisacárido o glicoproteína) expresado en una célula endotelial. En algunos aspectos se describen en el presente documento, antígenos específicos de células endoteliales que son un inmunógeno para un anticuerpo (por ejemplo, un antígeno específico de anticuerpo). En algunos aspectos se describen en el presente documento antígenos específicos de células endoteliales que son un inmunógeno para un anticuerpo anticélulas endoteliales (por ejemplo, un antígeno específico de anticuerpo anticélulas endoteliales).

"Predecir", "predicción" y "probabilidad", como se usa en el presente documento, no significa que el resultado se esté produciendo con un 100% de certeza. En cambio, tiene la intención de significar que el resultado es más probable que ocurra a que no ocurra. Los actos realizados para "predecir", "hacer una predicción" o "predecir la probabilidad de" pueden incluir la determinación de la probabilidad de que un resultado sea más probable que no ocurra. La evaluación de los múltiples factores descritos en este documento se puede utilizar para hacer tal determinación o predicción.

Por "comparar" o "comparación" se entiende correlacionar, de cualquier forma, los resultados de un primer análisis con los resultados de un segundo y/o tercer análisis. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis para clasificar el resultado como más similar a un segundo resultado que a un tercer resultado. Con respecto a la realización de una evaluación de AR de muestras biológicas de un individuo, se pueden usar los resultados para determinar si el individuo está experimentando una respuesta de AR. Con respecto a la realización de la evaluación sin AR de muestras biológicas de un individuo, se pueden usar los resultados para determinar si el individuo está experimentando una respuesta sin AR.

Los términos "evaluar" y "determinar" se usan indistintamente para referirse a cualquier forma de medición, e incluyen mediciones tanto cuantitativas como cualitativas. Por ejemplo, la "evaluación" puede ser relativa o absoluta.

El término "diagnóstico" se usa en este documento para hacer referencia a la identificación o clasificación de un estado, enfermedad o afección molecular o patológica. Por ejemplo, "diagnóstico" puede referirse a la identificación de un rechazo de órgano. "Diagnóstico" también puede referirse a la clasificación de un subtipo particular de rechazo de órganos, tal como la AR.

Como se usa en este documento, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo que está siendo tratado. Los efectos deseables del tratamiento incluyen reducir la aparición o recurrencia de una enfermedad o una afección o síntomas de la misma, aliviar una afección o síntoma de la enfermedad, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, disminuir la velocidad de progresión de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de la enfermedad y lograr un mejor pronóstico. En determinadas realizaciones, el tratamiento se refiere a disminuir la velocidad de progresión de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de la enfermedad y lograr un mejor pronóstico del AR en un individuo. En algunas realizaciones, el tratamiento se refiere a una intervención clínica que modifica o cambia la administración de un régimen de tratamiento de uno o más agentes terapéuticos en un sujeto.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro en sí mismo. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X". El término "aproximadamente" se utiliza para proporcionar flexibilidad a un punto final de intervalo numérico al proporcionar que un valor dado puede estar "un poco por encima" o "un poco por debajo" del punto final sin afectar el resultado deseado. Las concentraciones, cantidades y otros datos numéricos se pueden expresar o presentar en el presente documento en un formato de intervalo. Debe entenderse que dicho formato de intervalo se usa simplemente por conveniencia y brevedad y, por lo tanto, debe interpretarse de manera flexible para incluir no solo los valores numéricos mencionados explícitamente como los límites del intervalo, sino también para incluir todos los valores numéricos individuales o subintervalos incluidos dentro de ese intervalo como si cada valor numérico y subintervalo se mencionara explícitamente.

Se entiende que los aspectos y realizaciones de la invención descritos en este documento incluyen "que comprende", "que consiste" y "que consiste esencialmente en" aspectos y realizaciones. Para todas las composiciones descritas en este documento, y todos los procedimientos que usan una composición descrita en este documento, las composiciones pueden comprender los componentes o etapas enumerados, o pueden "consistir esencialmente en" los componentes o etapas enumerados. Cuando una composición se describe como "que consiste esencialmente en" los componentes enumerados, la composición contiene los componentes enumerados y puede contener otros componentes que no afecten sustancialmente la afección que se está tratando, pero que no contienen ningún otro componente que afecte sustancialmente la afección que se está tratando aparte de los componentes enumerados expresamente; o, si la composición contiene componentes adicionales distintos de los enumerados que afectan sustancialmente a la afección que se está tratando, la composición no contiene una concentración o cantidad suficiente de los componentes adicionales para afectar sustancialmente a la afección que se está tratando. Cuando un procedimiento se describe como "que consiste esencialmente en" las etapas enumeradas, el procedimiento contiene las etapas enumeradas y puede contener otras etapas que no afectan sustancialmente la condición que se está tratando, pero el procedimiento no contiene ninguna otra etapa que afecte sustancialmente la afección que se está tratando de forma diferente a las etapas enumerados expresamente. Como ejemplo específico no limitante, cuando una composición se describe como "que consiste esencialmente en" un componente, la composición puede contener adicionalmente cualquier cantidad de portadores, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables y otros componentes que no afectan sustancialmente la afección que se está tratando.

Como se usa en la memoria descriptiva, la frase "cualquiera de las realizaciones" significa lo mismo que "algunas de las realizaciones". Los aspectos de los elementos incorporados del procedimiento no pretenden ser limitantes y pueden combinarse con todas y cada una de las diferentes realizaciones ejemplificadas en el presente documento.

Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Técnicas generales

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología de proteínas, química de proteínas, biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tales como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); " Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., eds., 1987, actualizaciones periódicas); " PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); y Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1994).

Receptores de aloinjertos

El receptor de un aloinjerto puede ser de cualquier edad. En algunas formas de realización, el individuo es un niño. En una realización, el niño es un bebé. En otra realización, el niño es un niño pequeño. En otras realizaciones, el individuo es un adulto joven menor de 23 años. En algunas realizaciones, el individuo tiene aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 años. En algunas realizaciones, el individuo es un adulto mayor de 23 años. En algunas realizaciones, el individuo tiene aproximadamente 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 67, 68, 69, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 años de edad. En una realización, el receptor del aloinjerto es una mujer. En otra realización, el receptor del aloinjerto es un hombre.

La operación/cirugía de trasplante puede tener lugar en una instalación de tratamiento especialmente designada o centro de trasplantes. El centro de trasplantes puede estar ubicado en cualquier parte del mundo. En una realización, el centro de trasplantes está en los Estados Unidos de América.

Recolección y procesamiento de muestras biológicas

Se recoge una muestra biológica de un individuo que ha recibido un trasplante de aloinjerto. En algunas realizaciones, el receptor del aloinjerto no presenta síntomas externos de AR. En otras realizaciones, el receptor del aloinjerto muestra síntomas de AR. Puede recolectarse cualquier tipo de muestra biológica, que incluye, pero no se limita a, sangre completa, sangre, suero, plasma, orina, moco, saliva, líquido cefalorraquídeo, tejidos, biopsias y combinaciones de los mismos. En una realización, la muestra biológica es sangre completa. En otra realización, la muestra biológica es sangre. En una realización, la muestra es suero sanguíneo. En un aspecto, la muestra es suero sanguíneo de un donante. En otro aspecto, la muestra es suero sanguíneo de un receptor. En algunas realizaciones, la muestra de sangre es sangre periférica. En otra realización, la muestra biológica son células mononucleares de sangre periférica.

En algunas realizaciones, la muestra biológica son linfocitos de sangre periférica. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una biopsia de tejido.

La recolección de una muestra biológica de un receptor de aloinjerto puede ocurrir en cualquier momento antes o después de recibir un trasplante de órgano. En algunas realizaciones, la muestra biológica se recoge durante el examen de vigilancia del protocolo de rutina. En otras realizaciones, la muestra biológica se recoge cuando un médico tratante tiene motivos para sospechar que el individuo está experimentando una respuesta de AR.

La muestra biológica que se recoge de un receptor de aloinjerto puede emparejarse con biopsias de aloinjerto contemporáneas del mismo paciente cuando se crea una referencia para muestras de AR o sin a R. Normalmente, la biopsia del aloinjerto se obtiene del receptor dentro de las 48 horas posteriores a la recolección de la muestra biológica.

En algunas realizaciones, la sangre se extrae de un donante de trasplante de órganos y de un receptor de trasplante de órganos. En algunas realizaciones, la sangre se extrae de un receptor de trasplante de órganos. En algunos aspectos, la sangre se recoge en un recipiente adecuado (por ejemplo, un Vacutainer o una jeringa) que contiene un anticoagulante (por ejemplo, citrato de sodio o EDTA). En algunas realizaciones, se recolecta de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 100 ml de sangre, incluidos todos los números enteros dentro del intervalo especificado. En algunos aspectos, se recolectan aproximadamente 5 ml, aproximadamente 10 ml, aproximadamente 15 ml, aproximadamente 20 ml, aproximadamente 25 ml, aproximadamente 30 ml, aproximadamente 35 ml, aproximadamente 40 ml, aproximadamente 45 ml, aproximadamente 50 ml, aproximadamente 55 ml, aproximadamente 60 ml, aproximadamente 65 ml, aproximadamente 70 ml, aproximadamente 75 ml, aproximadamente 80 ml, aproximadamente 85 ml, aproximadamente 90 ml, aproximadamente 95 ml o aproximadamente 100 ml de sangre.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) pueden aislarse de la sangre completa mediante procedimientos de centrifugación Ficoll conocidos en la técnica. En algunos aspectos, las PBMC se aíslan y las células endoteliales se cultivan a partir de células progenitoras endoteliales (EPC) como un cultivo endotelial primario estable como se conoce en la técnica; véase, por ejemplo, Asahara, T. et al., Science 1997, 275, 964-967 y la patente de los Estados Unidos No. 8.492.148, cada uno de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia por sus enseñanzas.

En algunos aspectos, también se recoge una biopsia de tejido en el momento del injerto. En otras realizaciones, la biopsia se recolecta hasta 24 meses después del trasplante. En una realización, la biopsia se puede recoger aproximadamente 3 meses después del trasplante; aproximadamente 6 meses después del trasplante; aproximadamente 12 meses después del trasplante; aproximadamente 18 meses después del trasplante; o aproximadamente 24 meses después del trasplante. Estos puntos de tiempo no deben verse como limitantes, ya que se puede recolectar una biopsia y/o muestra biológica en cualquier momento después del trasplante. Más bien, estos puntos temporales se proporcionan para demostrar los períodos posteriores al trasplante en los que es más probable que ocurra la vigilancia de rutina en la mayoría de los receptores de aloinjertos. Además, estos puntos temporales demuestran los períodos posteriores al trasplante en los que es más probable que ocurra una respuesta de a R.

En algunos aspectos, las biopsias de aloinjertos de riñón que se recogen pueden puntuarse de acuerdo con el sistema de clasificación de Banff (Solez, K. et al. Am. J. Transplant., 2008, 8, 753-760; Mengel, M. et al. Am. J. Transplant.

2012, 12, 563-570). Este sistema clasifica la patología observada de una muestra de biopsia de órgano renal como histología normal, rechazo hiperagudo, cambios límite, rechazo agudo, nefropatía crónica del aloinjerto y otros cambios. La clasificación de Banff establece estándares en patología del trasplante renal y se usa ampliamente en ensayos clínicos internacionales de nuevos agentes antirrechazo. Como se describe en el presente documento, "rechazo agudo" (AR) se define para muestras de biopsia con una puntuación de Tubulitis de Banff (t) menor o igual a 1 y una puntuación de infiltrado intersticial menor o igual a 0; "Estable" ("STA")/"sin AR" se define para muestras de biopsia que muestran una ausencia de AR (sin AR) o cualquier otra patología sustancial; y "Otro" se define para muestras que presentan una ausencia de AR de grado de Banff, pero cumplen los criterios de Banff para lesión crónica del aloinjerto, toxicidad crónica por inhibidor de calcineurina, infección viral BK u otra lesión del injerto.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las células endoteliales se utilizan para la identificación de anticuerpos anticélulas endoteliales. Las células endoteliales pueden aislarse de una pluralidad de células poniendo en contacto la mezcla de células con un reactivo de aislamiento de células endoteliales para formar un complejo de célula endotelial-reactivo de aislamiento, véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 8.034.635, que se incorpora en el presente documento como referencia por sus enseñanzas. El complejo se forma mediante una interacción de afinidad específica entre el reactivo de aislamiento y la célula. A continuación, el complejo puede separarse de la mezcla para aislar la célula endotelial. El complejo puede separarse de la mezcla usando técnicas conocidas en el arte, tales como, por ejemplo, citometría de flujo (FACS) o uso de un campo magnético. Alternativamente, el complejo puede separarse de la mezcla uniendo el reactivo de aislamiento de células endoteliales a un soporte sólido como se describe en este documento. Puede emplearse una etapa de lavado adicional resuspendiendo el complejo en una solución biológicamente compatible. El complejo se puede resuspender (por ejemplo, lavado tantas veces como sea necesario). Una solución biológicamente compatible comprende tampones biológicos conocidos en la técnica tales como solución salina tamponada con fosfato (PBS).

En algunas realizaciones, el reactivo de aislamiento de células endoteliales puede ser cualquier reactivo que identifique específicamente una célula endotelial y pueda aislarse adicionalmente usando procedimientos y técnicas conocidos en el arte y ejemplificados en el presente documento. Por ejemplo, el reactivo de aislamiento de células endoteliales puede comprender un ligando para un receptor de superficie de células endoteliales. Los receptores de superficie de células endoteliales no limitantes pueden incluir, por ejemplo, el receptor de tirosina quinasa específico de Ec Tie-2 o VEGFR y el ligando puede incluir angiopoyetina, VEGF o un anticuerpo específico para el receptor de superficie celular. El anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal. La referencia a anticuerpos abarca no solo un anticuerpo intacto sino también un fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo (por ejemplo, un fragmento Fab o (Fab)²; una molécula Fv monocatenaria modificada; o una molécula quimérica, por ejemplo, un anticuerpo que contiene la especificidad de unión de un anticuerpo, por ejemplo, de origen murino, y las porciones restantes de otro anticuerpo, por ejemplo, de origen humano. Por lo tanto, en algunos aspectos, el reactivo de aislamiento de células endoteliales puede comprender un anticuerpo monoclonal con especificidad para Tie-2 o VEGFR-1 .

En algunas realizaciones, el reactivo de aislamiento de células endoteliales puede unirse a un soporte sólido. Los ejemplos no limitantes de soportes sólidos pueden comprender una partícula, un polímero (por ejemplo, poliestireno, polietileno), un recipiente, una cámara, una varilla graduada, perlas, partículas, membranas (por ejemplo, de nailon, nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF)), o otras formas conocidas en la técnica. El soporte sólido puede llevar grupos funcionales tales como grupos hidroxilo, carboxilo, aldehído o amino. El soporte sólido puede estar cargado positivamente, cargado negativamente o ser hidrófobo. Los soportes revestidos funcionalizados se pueden preparar mediante la modificación del soporte. Por ejemplo, un soporte no recubierto se trata con un polímero que porta uno de tales grupos funcionales, tales como poliuretano junto con un poliglicol para proporcionar grupos hidroxilo, o un derivado de celulosa para proporcionar grupos hidroxilo, un polímero o copolímero de ácido acrílico o ácido metacrílico para proporcionan grupos carboxilo, o un polímero aminoalquilado para proporcionar grupos amino. La patente de los Estados Unidos No. 4.654.267 describe la introducción de muchos recubrimientos de superficie y se incorpora en el presente documento como referencia por sus enseñanzas.

Los ejemplos de partículas útiles pueden estar hechas de compuestos metálicos, sílice, látex, material polimérico o núcleos de sílice, látex o polímero recubiertos con un metal o compuesto metálico, tal como hierro, gadolinio, zinc, indio, oro, plata, cobalto, cobre o magnesio y pueden ser magnetizables o magnéticos. Por "magnetizable o magnética" se entiende que la partícula es capaz de tener un momento magnético afectado cuando se coloca en un campo magnético.

El reactivo de aislamiento de células endoteliales se puede marcar con un marcador detectable. Por ejemplo, el reactivo de aislamiento de células endoteliales puede marcarse con un isótopo radiactivo (por ejemplo, 125I y 131I), enzimas (por ejemplo, peroxidasa, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina) o sustancias fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC). Los marcadores del reactivo de detección se pueden cuantificar mediante procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica para cuantificar el complejo inmune formado (por ejemplo, un inmunoensayo ELISA u otro inmunoensayo en fase sólida). La mezcla de células puede comprender cualquier muestra conocida o sospechosa de contener una célula endotelial. Por ejemplo, la mezcla puede ser una muestra biológica tal como sangre completa, suero, leucaferisato, médula ósea, células mononucleares de sangre periférica o un homogeneizado de tejido.

En algunas realizaciones, la célula endotelial puede comprender cualquier célula derivada de cualquier parte de la vasculatura como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la célula endotelial puede originarse en venas grandes y pequeñas y arterias capilares, la vena umbilical de los recién nacidos, vasos sanguíneos en el cerebro o de tumores sólidos vascularizados. La célula endotelial puede comprender una célula madura o, alternativamente, una célula precursora endotelial. En algunos aspectos, la célula endotelial puede ser positiva para Tie-2.

Evaluación de la expresión genética en muestras biológicas

Se pueden usar muestras biológicas tomadas de un receptor de aloinjerto para evaluar el nivel de genes que se expresan diferencialmente en individuos que experimentan una respuesta de AR. Los expertos en la técnica conocen diversas técnicas de medición de la expresión génica. Un procedimiento no limitante es extraer ARN de la muestra biológica recolectada y sintetizar ADNc. El ADNc puede luego amplificarse usando cebadores o cebadores marcados específicos para los genes diana (es decir, genes que se expresan diferencialmente en individuos que experimentan una respuesta de AR) y posteriormente analizados usando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Se pueden utilizar plataformas de qPCR tales como BioMark (Fluidigm, South San Francisco, CA) o ABI viia7 (Life Technologies, Foster City, CA).

En algunas realizaciones, uno de los cebadores específicos del gen o los dNTP pueden marcarse de manera que los ADNc sintetizados estén marcados. Por etiquetadas se entiende que las entidades comprenden un miembro de un sistema de producción de señales y, por lo tanto, son detectables, ya sea directamente o mediante acción combinada con uno o más miembros adicionales de un sistema de producción de señales. Los ejemplos de marcadores directamente detectables incluyen fracciones isotópicas y fluorescentes incorporadas, normalmente unidas covalentemente a, una unidad monomérica de nucleótidos, por ejemplo, dNTP o unidad monomérica del cebador. Las fracciones isotópicas o marcadores de interés incluyen 32P, 33P, 35S, 125I y similares. Las fracciones fluorescentes o marcadores de interés incluyen cumarina y sus derivados, por ejemplo, 7-amino-4-metilcumarina, aminocumarina, colorantes Bodipy, tales como Bodipy FL, azul cascada, fluoresceína y sus derivados, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, verde de Oregón, colorantes de rodamina, por ejemplo, rojo Texas, tetrametilrodamina, eosinas y eritrosinas, colorantes de cianina, por ejemplo, Cy3 y Cy5, quelatos macrocíclicos de iones lantánidos, por ejemplo, Quantum DyeMR, colorantes de transferencia de energía fluorescente, tal como heterodímero de tiazol naranja-etidio, TOTAB, etc. Las etiquetas también pueden ser miembros de un sistema de producción de señales que actúan en concierto con uno o más miembros adicionales del mismo sistema para proporcionar una señal detectable. Ejemplos ilustrativos de dichos marcadores son miembros de un par de unión específico, tal como ligandos, por ejemplo, biotina, fluoresceína, digoxigenina, cationes polivalentes, grupos quelantes y similares, en los que los miembros se unen específicamente a miembros adicionales del sistema de producción de señales, en los que los miembros adicionales proporcionan una señal detectable ya sea directa o indirectamente, por ejemplo, anticuerpo conjugado con una fracción fluorescente o una fracción enzimática capaz de convertir un sustrato en un producto cromogénico, por ejemplo, anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina y similares. El ácido nucleico marcado también se puede producir mediante la realización de PCR en presencia de cebadores marcados. La patente de los Estados Unidos No. 5.994.076 se incorpora como referencia únicamente por sus enseñanzas de cebadores modificados y sus dNTP.

Otro procedimiento no limitante para medir la expresión génica es la transferencia Northern. El nivel de expresión génica de los genes que codifican proteínas también se puede determinar usando procedimientos de cuantificación de proteínas tales como transferencia Western. El uso de ensayos proteómicos para medir el nivel de genes expresados diferencialmente también se incluye en este documento. Un experto en la técnica sabría cómo usar ensayos proteómicos estándar para medir el nivel de expresión génica.

Procedimientos para detectar y aislar anticuerpos anticélulas endoteliales

En algunas realizaciones descritas en el presente documento se encuentran procedimientos para detectar y aislar anticuerpos anticélulas endoteliales. Se encontró que la presencia o ausencia de anticuerpos anticélulas endoteliales y, en algunos aspectos, un conjunto específico de anticuerpos anticélulas endoteliales es útil para el diagnóstico o la predicción de que un receptor de trasplante de órgano tiene un rechazo de aloinjerto.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anticélulas endoteliales se detectan después de un ensayo basado en células, tal como una prueba de compatibilidad cruzada. En algunos aspectos, la prueba de compatibilidad cruzada comprende mezclar una célula endotelial del donante y el suero del receptor. De esta manera, la compatibilidad cruzada detecta aquellas diferencias antigénicas a las que el receptor ya está sensibilizado. Por lo tanto, en algunos aspectos, se detecta la compatibilidad cruzada del donante con un receptor poniendo primero en contacto una muestra del donante con un reactivo de aislamiento de células endoteliales como se describe en este documento para aislar una célula endotelial y luego poniendo en contacto la muestra del receptor con la célula endotelial aislada. A continuación, se determina la reactividad de la muestra receptora con la célula endotelial aislada. Por reactividad se entiende que se forma un complejo mediante una interacción de afinidad específica entre un componente de la muestra receptora (por ejemplo, un anticuerpo) y la célula endotelial aislada del donante.

En algunos aspectos, la interacción de afinidad específica comprende un complejo de anticuerpo y antígeno. En algunos aspectos, el anticuerpo ya está presente en el suero del receptor y forma un complejo con un antígeno presente en la muestra del donante. En algunos aspectos, el antígeno está presente en una célula endotelial del donante presente dentro de la muestra; cuando el anticuerpo está presente en el suero del receptor, forma una interacción de afinidad específica con la célula endotelial del donante. Por lo tanto, la ausencia de reactividad de la muestra del receptor con la célula endotelial aislada indica compatibilidad entre la muestra del donante y el receptor. Por el contrario, la reactividad de la muestra del receptor con la célula endotelial aislada indica no compatibilidad entre la muestra del donante y la del receptor. La compatibilidad se mide por el rechazo hiperagudo o nulo del trasplante del donante por parte del receptor.

En algunas realizaciones, el donante y el receptor son, por ejemplo, cualquier mamífero; por ejemplo, un humano, un cerdo, una vaca, un perro, un felino o un caballo. En algunos aspectos, el donante y el receptor son la misma especie. Alternativamente, en otros aspectos, el donante y el receptor son de especies diferentes.

En algunas realizaciones, la muestra del donante comprende sangre completa, suero, leucaferisato, médula ósea, células mononucleares de sangre periférica o un homogeneizado de tejido. En algunos aspectos, la muestra del donante comprende una célula endotelial (por ejemplo, una célula progenitora endotelial) de sangre completa, sueros, leucaferisato, médula ósea, células mononucleares de sangre periférica o un homogeneizado de tejido. En algunas realizaciones, la muestra del receptor comprende sangre completa, suero, leucaferisato, médula ósea, células mononucleares de sangre periférica o un homogeneizado de tejido. En algunos aspectos, las muestras se someten a una etapa de purificación previa antes de la compatibilidad cruzada conocida en la técnica.

La reactividad se determina mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la reactividad se mide mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como un inmunoensayo en fase sólida (por ejemplo, un ensayo ELISA), citometría de flujo (por ejemplo, un ensayo de citometría de flujo de coincidencia cruzada) o una compatibilidad cruzada de linfotoxicidad dependiente del complemento (ensayo de compatibilidad cruzada de CDC).

En algunas realizaciones, los anticuerpos anticélulas endoteliales que se originan a partir del receptor o de las células inmunes del receptor se aíslan mediante procedimientos conocidos en la técnica. En algunos aspectos, se aísla al menos un anticuerpo anticélulas endoteliales después de una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales, como se describe en el presente documento. En un aspecto, al menos un anticuerpo anticélulas endoteliales se une a una célula endotelial derivada de un donante en la prueba de compatibilidad cruzada. En otro aspecto, al menos un anticuerpo anticélulas endoteliales se eluye con ácido y se neutraliza de la célula endotelial del donante mediante procedimientos conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Lucchiari, N. et al., Hum Immunol 2000, 61, 518-527, que se incorpora como referencia en el presente documento por sus enseñanzas. En otro aspecto, los anticuerpos de anticélulas endoteliales eluidos y neutralizados se almacenan para su identificación y pruebas adicionales.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se pueden identificar al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales o una mezcla de anticuerpos anticélulas endoteliales usando un arreglo de proteínas (por ejemplo, un arreglo de antígeno peptídico). En algunos aspectos, descritos en este documento, la mezcla de anticuerpos anticélulas endoteliales se puede obtener usando procedimientos de aislamiento de anticuerpos después de una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales como se describe en este documento. En algunos aspectos, el arreglo de proteínas tiene una pluralidad de proteínas o péptidos o una combinación de proteínas y péptidos unidos a un sustrato sólido descrito en este documento. En un aspecto, los péptidos humanos individuales son proteínas de fusión de GST del terminal N colocadas sobre portaobjetos de vidrio recubiertos de nitrocelulosa. Los péptidos inmovilizados son útiles para aislar específicamente una mezcla de anticuerpos anticélulas endoteliales de una muestra, en la que la mezcla de anticuerpos anticélulas endoteliales puede demostrar una afinidad por uno o más de los péptidos inmovilizados. De esta forma, se puede identificar la reactividad antigénica (o diana) de cada anticuerpo anticélulas endoteliales. Los péptidos pueden ser desde aproximadamente 1 péptido hasta aproximadamente 35.000 péptidos conocidos, dependiendo de la amplitud del cubrimiento antigénico diana deseado. En un aspecto, se prueban aproximadamente 9.500 péptidos usando los procedimientos descritos en el presente documento.

Como se describió anteriormente, los péptidos interactúan específicamente con un anticuerpo anticélulas endoteliales que tiene afinidad por uno o más péptidos que inmovilizan y unen el anticuerpo anticélulas endoteliales sobre el sustrato sólido. En algunos aspectos, la presencia de un anticuerpo anticélulas endoteliales unido a un péptido en el sustrato sólido se detecta con un anticuerpo secundario específico de clase (por ejemplo, un anticuerpo secundario específico de clase; IgG, IgM, IgA antihumano). En algunos aspectos, el anticuerpo secundario específico de clase se marca además con un marcador detectable. La cuantificación del marcador detectable se puede evaluar usando cualquier procedimiento de cuantificación y formación de imágenes conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de la solicitud de la patente de los Estados Unidos No. US2006/0281134, que se incorpora en el presente como referencia por sus enseñanzas específicas de arreglos de péptidos y la cuantificación posterior de las mismas.

En algunos aspectos, el anticuerpo anticélulas endoteliales se aísla mediante procedimientos de aislamiento de anticuerpos. Los ejemplos no limitantes de procedimientos de aislamiento de anticuerpos incluyen procedimientos de precipitación de anticuerpos (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, ácido octónico, polietilenglicol, etacridina); diálisis; cromatografía de exclusión por tamaño (por ejemplo, cromatografía de filtración en gel); cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de quelatos metálicos inmovilizados; adsorción tiofílica; cromatografía en gel de melón; procedimientos de aislamiento basados en epítopos (por ejemplo, proteína A, proteína G o proteína L inmovilizada en una resina o agarosa); aislamiento de anticuerpos IgM con proteína de unión a manano; aislamiento de anticuerpos IgA con lectina de jacalina; aislamiento utilizando perlas de captura de anticuerpos (por ejemplo, proteína A, proteína G, proteína L, MBP o lectina de jacalina inmovilizada en perlas magnéticas, resina de perlas, perlas de sefarosa o perlas de agarosa), una columna de afinidad (por ejemplo, proteína A, proteína G, proteína L, MBP o lectina de jacalina inmovilizadas en una columna de afinidad).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anticélulas endoteliales se captura con un elemento de captura. En algunos aspectos, el elemento de captura está unido selectivamente por el anticuerpo anticélulas endoteliales; por lo tanto, el elemento de captura puede ser cualquier elemento de unión al anticuerpo. En algunos aspectos, el elemento de captura es un antígeno para uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales. Los ejemplos no limitantes de elementos de captura incluyen una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un fragmento de polipéptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un dominio de unión de anticuerpo, un antígeno, un fragmento de antígeno, un determinante antigénico, un epítopo, un hapteno, un inmunógeno, un fragmento de inmunógeno, un ión metálico, una molécula recubierta de iones metálicos, biotina, avidina, estreptavidina, un inhibidor, un cofactor, un sustrato, una enzima, un receptor, un fragmento de receptor, una subunidad de receptor, un fragmento de subunidad de receptor, un ligando, un ligando de receptor, un agonista de receptor, un antagonista de receptor, una molécula de señalización, una proteína de señalización, un fragmento de proteína de señalización, un factor de crecimiento, un fragmento de factor de crecimiento, un factor de transcripción, un fragmento de factor de transcripción, un inhibidor, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, una glicoproteína, un lípido, una célula, una proteína de la superficie celular, un lípido de la superficie celular, un carbohidrato de la superficie celular, una glicoproteína de la superficie celular, un extracto celular, un virus, una proteína de la cubierta del virus, una hormona, una proteína del suero, una proteína de la leche, un oligonucleótido, una macromolécula o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el elemento de captura es una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido o un fragmento de polipéptido. En algunas realizaciones, el elemento de captura es un péptido. En algunos aspectos, cada péptido individual se sintetiza artificialmente y se optimiza para formar una interacción de afinidad con un anticuerpo anticélulas endoteliales descrito en el presente documento. En un aspecto, el fragmento de péptido o proteína se modifica con una etiqueta de aislamiento. En un aspecto, la etiqueta de aislamiento es cualquier modificación química o adición de una etiqueta de secuencia de aminoácidos que permite el aislamiento de un fragmento de proteína o péptido. En otro aspecto, la modificación del péptido incluye la adición de una etiqueta de aislamiento que incluye biotina, una etiqueta de GST, un grupo amida o una etiqueta de estreptavidina.

En algunas realizaciones, uno o más elementos de captura (por ejemplo, uno o más péptidos) se mezclan con una solución biológica compleja (por ejemplo, una muestra de un sujeto) que comprende potencialmente uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales para formar una reacción de afinidad. Como se describe en el presente documento, el elemento de captura puede comprender además una etiqueta de aislamiento (por ejemplo, una etiqueta de biotina o GST) para la purificación posterior del complejo anticuerpo/elemento de captura para detección y cuantificación adicionales como se describe en el presente documento.

En una realización, los sueros de los receptores de prueba se utilizan para probar el estado de activación de un cultivo preestablecido de células endoteliales de prueba. Por consiguiente, el suero de un receptor potencial que es reactivo con un órgano del donante que tiene anticuerpos anticélulas endoteliales activará un cultivo establecido de células endoteliales; mientras que un suero no reactivo que no tenga anticuerpos anticélulas endoteliales no activará un cultivo establecido de células endoteliales.

En otra realización, se pueden usar anticuerpos anticélulas endoteliales aislados de un suero del receptor para probar el estado de activación de un cultivo preestablecido de células endoteliales de prueba. En un aspecto, los anticuerpos anticélulas endoteliales aislados se aíslan después de una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales entre un donante y un receptor mediante los procedimientos descritos en el presente documento. En otro aspecto, los anticuerpos anticélulas endoteliales se aíslan mediante cualquier procedimiento de aislamiento de anticuerpos descrito en este documento. Por consiguiente, el eluato de anticuerpo anticélulas endoteliales aislado derivado de un receptor que es reactivo con un órgano del donante activará un cultivo establecido de células endoteliales; mientras que un suero no reactivo no activará un cultivo establecido de células endoteliales.

En algunas realizaciones, el estado de activación de una célula endotelial después de la estimulación con un anticuerpo anticélulas endoteliales se puede determinar midiendo un aumento o disminución en la expresión génica o el nivel de proteína de al menos uno o más marcadores de activación endotelial. En algunas realizaciones, la medición de un nivel aumentado, nivel disminuido o combinación de niveles aumentados o disminuidos de uno o más marcadores de activación endotelial después de la estimulación con un anticuerpo de células endoteliales define una firma de activación endotelial de anticuerpo anticélulas endoteliales. En un aspecto, los marcadores de activación endotelial aumentados incluyen una proteína de la superficie celular que comprende un gen de HLA clase I y moléculas de adhesión celular de selectina E, PECAM1 e ICAM1. En otro aspecto, el marcador de activación de células endoteliales incluye al menos una o más o una combinación de citocinas inflamatorias de la Tabla 4. Las citocinas inflamatorias que indican el estado de activación de una célula endotelial pueden ser al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos 37, al menos 38, al menos 39, al menos 40, al menos al menos 41, al menos 42, al menos 43, al menos 44, al menos 45, al menos 46, al menos 47, al menos 48, al menos 49, al menos 50, al menos 51, al menos 52, al menos 53, o al menos 54 de las citocinas inflamatorias enumeradas en la Tabla 4. En otro aspecto, la firma de activación de células endoteliales incluye niveles aumentados de PDGF, RANTES (es decir, CCL5) y RESISTIN. En otro aspecto, la firma de activación de células endoteliales incluye el nivel disminuido de CCL3, CCL4, CXCL5 y CXCL.

En algunos aspectos, uno o más de los marcadores de activación de células endoteliales descritos en el presente documento se miden mediante una medición cualitativa, procedimientos de medición semicuantitativos o altamente cuantitativos. Los ejemplos de procedimientos no limitantes incluyen inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, citometría de flujo, ELISA, transferencia Western, PCR, qRT-PCR y microarreglos.

El cultivo establecido de células endoteliales puede ser cualquier célula endotelial primaria enferma o normal. Por ejemplo, la célula endotelial puede ser una célula progenitora endotelial, cualquier cultivo de tejido completo ex vivo que comprenda células endoteliales, o cualquier célula endotelial inmortalizada, o una mezcla de células endoteliales de las mismas.

La célula endotelial de prueba puede ser de cualquier mamífero (por ejemplo, un ser humano, un ratón o una rata). Ejemplos no limitantes de cultivos endoteliales humanos comprenden células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), células endoteliales cardíacas humanas, células endoteliales de vejiga humana, células endoteliales de MV uterino humano, células endoteliales microvasculares dérmicas humanas, células endoteliales microvasculares de pulmón humano (HMVEC-L), células endoteliales aórticas humanas, células endoteliales microvasculares cardíacas humanas, células endoteliales de arterias coronarias humanas o células endoteliales de arterias pulmonares humanas. En algunos aspectos, la célula endotelial de prueba descrita en el presente documento puede derivarse de un donante receptor o de un órgano de un donante. En otros aspectos, la célula endotelial de prueba puede adquirirse de un proveedor comercial.

Detección de anticuerpos anticélulas endoteliales y anticuerpos HLA mediante inmunoensayos en fase sólida

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se pueden medir uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales en un inmunoensayo en fase sólida (por ejemplo, ELISA o resonancia de plasmón superficial). En algunos aspectos, el inmunoensayo en fase sólida comprende un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). En algunos aspectos, el inmunoensayo en fase sólida comprende aislar anticuerpos anticélulas endoteliales de una muestra de sangre o sueros del receptor con un elemento de captura de anticuerpos y medir el nivel de anticuerpos anticélulas endoteliales aislados.

En algunas realizaciones, el inmunoensayo en fase sólida comprende uno o más soportes sólidos. En algunos aspectos, la superficie de los soportes sólidos puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente. Los ejemplos no limitantes de soportes insolubles adecuados a los que se une la proteína, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido o un fragmento de polipéptido incluyen perlas, membranas, placas sólidas, placas de oro y placas de microtitulación. Por lo general, están hechos de metal, vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa. Las placas de microtitulación son especialmente convenientes porque se pueden realizar un gran número de ensayos simultáneamente, utilizando pequeñas cantidades de reactivos y muestras. En algunos aspectos, la placa de microtitulación comprende 96 pocillos individuales. En algunos aspectos, la placa de microtitulación comprende 384 pocillos individuales.

En algunos aspectos, el soporte sólido puede modificarse adicionalmente con recubrimientos específicos para unir la proteína, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido o un fragmento de polipéptido. Los ejemplos no limitantes de recubrimientos de soporte sólido incluyen biotina, avidina desglicosilada, avidina, estreptavidina, níquel, cobre, glutatión, anti-GST (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico para las etiquetas de GST), proteína A, proteína G, proteína L, anticuerpos secundarios específico de antígeno, anhídrido maleico o maleimida. La proteína, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido o fragmentos de polipéptido descritos en este documento se pueden unir al soporte sólido mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de procedimientos de enlace incluyen biotinilación, marcaje con GST, amidación o marcaje con estreptavidina.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se encuentran elementos de captura de anticuerpos que comprenden sustratos sólidos y una o más proteínas de longitud completa, fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante o fragmentos polipeptídicos. En algunos aspectos descritos adicionalmente en el presente documento, uno o más de proteína de longitud completa, fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante o fragmentos de polipéptido pueden enlazarse o unirse a los sustratos sólidos descritos en este documento. En algunos aspectos, uno o más de proteína de longitud completa, fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante o fragmentos polipéptido pueden usarse para capturar uno o más anticuerpos en una solución libre y luego el complejo puede unirse a un sustrato sólido como se describe en el presente documento.

En una realización, el elemento de captura de anticuerpo en el inmunoensayo en fase sólida comprende un sustrato sólido que comprende una perla de captura de anticuerpo. En un aspecto, la perla de captura de anticuerpo es una perla magnética, una perla de resina o una perla de sefarosa. En otro aspecto, la perla de captura de anticuerpo se une además a una proteína, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido o un fragmento de polipéptido. En algunos aspectos, una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido se une a una perla de captura. En algunos aspectos, más de una (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más) proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido se une a una perla de captura. La proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido pueden formar una interacción de afinidad específica con al menos un anticuerpo anticélulas endoteliales. De esta manera, la perla de captura de anticuerpo interactúa específicamente con un anticuerpo anticélulas endoteliales presente en una muestra y proporciona un procedimiento para aislar el anticuerpo anticélulas endoteliales de todos los demás anticuerpos (por ejemplo, incluidos los anticuerpos HLA) y otros materiales biológicos en una muestra. Los procedimientos para usar perlas de captura de anticuerpos son bien conocidos en la técnica y pueden comprender etapas adicionales de lavado, centrifugación y otras etapas de purificación. En algunos aspectos, la perla de captura de anticuerpos puede estar incrustada en una estructura de soporte sólida o puede flotar libremente.

En otra realización, el elemento de captura de anticuerpo en el inmunoensayo en fase sólida comprende una placa. En un aspecto, la placa es una placa de microtitulación. En otro aspecto, la placa de microtitulación se une además a una proteína, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido o un fragmento de polipéptido. En algunos aspectos, un tipo (por ejemplo, na pluralidad del mismo tipo) de proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido se une a un pocillo de la placa de microtitulación. En algunos aspectos, más de una (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más) proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido están unidos a pocillos adyacentes en una placa de microtitulación. La proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido pueden formar una interacción de afinidad específica con al menos un anticuerpo anticélulas endoteliales. De esta manera, la placa de microtitulación interactúa específicamente con un anticuerpo anticélulas endoteliales presente en una muestra y proporciona un procedimiento para aislar el anticuerpo anticélulas endoteliales de todos los demás anticuerpos (por ejemplo, incluidos los anticuerpos HLA) y otros materiales biológicos en una muestra. Los procedimientos para usar placas de microtitulación y unir proteínas o péptidos a placas de microtitulación son conocidos en la técnica y pueden comprender etapas adicionales de lavado, centrifugación y otras etapas de purificación.

En otro aspecto, la placa se recubre con un recubrimiento de unión a proteínas. La placa puede ser una placa sólida o una placa de microtitulación. En algunos aspectos, la placa se recubre con estreptavidina. Por lo tanto, la placa interactúa específicamente con cualquier elemento de unión a estreptavidina (por ejemplo, biotina). En algunos aspectos, se biotinila un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido. La proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido pueden formar una interacción de afinidad específica con al menos un anticuerpo anticélulas endoteliales. De esta manera, la placa de microtitulación interactúa específicamente con un fragmento de proteína biotinilada, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido que además forma una interacción de afinidad con un anticuerpo anticélulas endoteliales presente en una muestra y proporciona un procedimiento para aislar el anticuerpo anticélulas endoteliales de todos los demás anticuerpos (por ejemplo, incluidos los anticuerpos HLA) y otros materiales biológicos en una muestra. Los procedimientos para recubrir placas con estreptavidina son bien conocidos en la técnica y pueden comprender un lavado adicional, centrifugación y otras etapas de purificación.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el elemento de captura de anticuerpos en el inmunoensayo en fase sólida comprende una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido correspondiente al menos a una porción o fragmento de péptido de un producto génico (proteína) enumerado en la Tabla 2. En algunos aspectos, la proteína de longitud completa, el fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante o un fragmento de polipéptido comprende una porción o fragmento de péptido de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las proteínas enumeradas en la Tabla 2. En algunos aspectos, el tamaño del fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante o un fragmento de polipéptido correspondiente a cualquiera de las proteínas enumeradas en la Tabla 2 puede ser al menos de aproximadamente 1 a al menos aproximadamente 3.000 aminoácidos de longitud. El tamaño del fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante o un fragmento de polipéptido puede ser una porción o un fragmento de péptido de cualquiera de las proteínas correspondientes a cualquiera de las proteínas enumeradas en la Tabla 2 en la que la porción o fragmento de péptido puede ser al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos 37, al menos 38, al menos 39, al menos 40, al menos 41, al menos 42, al menos 43, al menos 44, al menos 45, al menos 46, al menos 47, al menos 48, al menos 49, al menos 50, al menos 51, al menos 52, al menos 53, al menos 54, al menos 55, al menos 56, al menos 57, al menos 58, al menos 59, al menos 60, al menos 61, al menos 62, al menos 63, al menos 64, al menos 65, al menos 66, al menos 67, al menos 68, al menos 69, al menos 70, al menos 71, al menos 72, al menos 73, al menos 74, al menos 75, al menos 76, al menos 77, al menos 78, al menos 79, al menos 80, al menos 81, al menos 82, al menos 83, al menos 84, al menos 85, al menos 86, al menos 87, al menos 88, al menos 89, al menos 90, al menos 91, al menos 92, al menos 93, al menos 94, al menos 95, al menos 96, al menos 97, al menos 98, al menos 99, al menos 100, al menos 101, al menos 102, al menos 103, al menos 104, al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109, al menos 110, al menos 111, al menos 112, al menos 113, al menos 114, al menos 115, al menos 116, al menos 117, al menos 118, al menos 119, al menos 120, al menos 121, al menos 122, al menos 123, al menos 124, al menos 125, al menos 126, al menos 127, al menos 128, al menos 129, al menos 130, al menos 131, al menos 132, al menos 133, al menos 134, al menos 135, al menos 136, al menos 137, al menos 138, al menos 139, al menos 140, al menos 141, al menos 142, al menos 143, al menos 144, al menos 145, al menos 146, al menos 147, al menos 148, al menos 149, al menos 150, al menos 151, al menos 152, al menos 153, al menos 154, al menos 155, al menos 156, al menos 157, al menos 158, al menos 159, al menos 160, al menos 161, al menos 162, al menos 163, al menos 164, al menos 165, al menos 166, al menos 167, al menos 168, al menos 169, al menos 170, al menos 171, al menos 172, al menos 173, al menos 174, al menos 175, al menos 176, al menos 177, al menos 178, al menos 179, al menos 180, al menos 181, al menos 182, al menos 183, al menos 184, al menos 185, al menos 186, al menos 187, al menos 188, al menos 189, al menos 190, al menos 191, al menos 192, al menos 193, al menos 194, al menos 195, al menos 196, al menos 197, al menos 198, al menos 199, al menos 200, al menos 201, al menos 202, al menos 203, al menos 204, al menos 205, al menos 206, al menos 207, al menos 208, al menos 209, al menos 210, al menos 211, al menos 212, al menos 213, al menos 214, al menos 215, al menos 216, al menos 217, al menos 218, al menos 219, al menos 220, al menos 221, al menos 222, al menos 223, al menos 224, al menos 225, al menos 226, al menos 227, al menos 228, al menos 229, al menos 230, al menos 231, al menos 232, al menos 233, al menos 234, al menos 235, al menos 236, al menos 237, al menos 238, al menos 239, al menos 240, al menos 241, al menos 242, al menos 243, al menos 244, al menos 245, al menos 246, al menos 247, al menos 248, al menos 249, al menos 250, al menos 251, al menos 252, al menos 253, al menos 254, al menos 255, al menos 256, al menos 257, al menos 258, al menos 259, al menos 260, al menos 261, al menos 262, al menos 263, al menos 264, al menos 265, al menos 266, al menos 267, al menos 268, al menos 269, al menos 270, al menos 271, al menos 272, al menos 273, al menos 274, al menos 275, al menos 276, al menos 277, al menos 278, al menos 279, al menos 280, al menos 281, al menos 282, al menos 283, al menos 284, al menos 285, al menos 286, al menos 287, al menos 288, al menos 289, al menos 290, al menos 291, al menos 292, al menos 293, al menos 294, al menos 295, al menos 296, al menos 297, al menos 298, al menos 299, al menos 300, al menos 301, al menos 302, al menos 303, al menos 304, al menos 305, al menos 306, al menos 307, al menos 308, al menos 309, al menos 310, al menos 311, al menos 312, al menos 313, al menos 314, al menos 315, al menos 316, al menos 317, al menos 318, al menos 319, al menos 320, al menos 321, al menos 322, al menos 323, al menos 324, al menos 325, al menos 326, al menos 327, al menos 328, al menos 329, al menos 330, al menos 331, al menos 332, al menos 333, al menos 334, al menos 335, al menos 336, al menos 337, al menos 338, al menos 339, al menos 340, al menos 341, al menos 342, al menos 343, al menos 344, al menos 345, al menos 346, al menos 347, al menos 348, al menos 349, al menos 350, al menos 351, al menos 352, al menos 353, al menos 354, al menos 355, al menos 356, al menos 357, al menos 358, al menos 359, al menos 360, al menos 361, al menos 362, al menos 363, al menos 364, al menos 365, al menos 366, al menos 367, al menos 368, al menos 369, al menos 370, al menos 371, al menos 372, al menos 373, al menos 374, al menos 375, al menos 376, al menos 377, al menos 378, al menos 379, al menos 380, al menos 381, al menos 382, al menos 383, al menos 384, al menos 385, al menos 386, al menos 387, al menos 388, al menos 389, al menos 390, al menos 391, al menos 392, al menos 393, al menos 394, al menos 395, al menos 396, al menos 397, al menos 398, al menos 399, al menos 400, al menos 401, al menos 402, al menos 403, al menos 404, al menos 405, al menos 406, al menos 407, al menos 408, al menos 409, al menos 410, al menos 411, al menos 412, al menos 413, al menos 414, al menos 415, al menos 416, al menos 417, al menos 418, al menos 419, al menos 420, al menos 421, al menos 422, al menos 423, al menos 424, al menos 425, al menos 426, al menos 427, al menos 428, al menos 429, al menos 430, al menos 431, al menos 432, al menos 433, al menos 434, al menos 435, al menos 436, al menos 437, al menos 438, al menos 439, al menos 440, al menos 441, al menos 442, al menos 443, al menos 444, al menos 445, al menos 446, al menos 447, al menos 448, al menos 449, al menos 450, al menos 451, al menos 452, al menos 453, al menos 454, al menos 455, al menos 456, al menos 457, al menos 458, al menos 459, al menos 460, al menos 461, al menos 462, al menos 463, al menos 464, al menos 465, al menos 466, al menos 467, al menos 468, al menos 469, al menos 470, al menos 471, al menos 472, al menos 473, al menos 474, al menos 475, al menos 476, al menos 477, al menos 478, al menos 479, al menos 480, al menos 481, al menos 482, al menos 483, al menos 484, al menos 485, al menos 486, al menos 487, al menos 488, al menos 489, al menos 490, al menos 491, al menos 492, al menos 493, al menos 494, al menos 495, al menos 496, al menos 497, al menos 498, al menos 499, al menos 500, al menos aproximadamente 525 , al menos aproximadamente 550, al menos aproximadamente 575, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 625, al menos aproximadamente 650, al menos aproximadamente ut 675, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 725, al menos aproximadamente 750, al menos aproximadamente 775, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 825, al menos aproximadamente 850, al menos aproximadamente 875, al menos aproximadamente 900, al menos aproximadamente 925, al menos aproximadamente 950, al menos aproximadamente 975, al menos aproximadamente 1000, al menos aproximadamente 1025, al menos aproximadamente 1050, al menos aproximadamente 1075, al menos aproximadamente 1100, al menos aproximadamente 1125, al menos aproximadamente 1150, al menos aproximadamente 1175, al menos aproximadamente 1200, al menos aproximadamente 1225, al menos aproximadamente 1250, al menos aproximadamente 1275, al menos aproximadamente 1300, al menos aproximadamente 1325, al menos aproximadamente 1350, al menos aproximadamente 1375, al menos aproximadamente 1400, al menos aproximadamente 1425, al menos aproximadamente 1450, al menos aproximadamente 1475, al menos aproximadamente 1500, al menos aproximadamente 1550, al menos aproximadamente 1600, al menos aproximadamente 1650, al menos aproximadamente 1700, al menos aproximadamente 1750, al menos aproximadamente 1800, al menos aproximadamente 1850, al menos aproximadamente 1900, al menos aproximadamente 1950, al menos aproximadamente 2000, al menos aproximadamente 2050, al menos aproximadamente 2100, al menos aproximadamente 2150, al menos aproximadamente 2200, al menos aproximadamente 2250, al menos aproximadamente 2300, al menos aproximadamente 2350, al menos aproximadamente 2400, al menos aproximadamente 2450, al menos aproximadamente 2500, al menos aproximadamente 2550, al menos aproximadamente 2600, al menos aproximadamente 2650, al menos aproximadamente 2700, al menos aproximadamente 2750, al menos aproximadamente 2800, al menos aproximadamente 2850, al menos aproximadamente 2900, al menos aproximadamente 2950 o al menos aproximadamente 3000 aminoácidos. En algunos aspectos, el fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante o un fragmento de polipéptido correspondiente a al menos una porción o fragmento de péptido de las proteínas enumeradas en la Tabla 2 puede modificarse adicionalmente para incluir una o más etiquetas que comprenden una etiqueta de biotina, una etiqueta de GST, un grupo amida o una etiqueta de estreptavidina o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la proteína de longitud completa, fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante o un fragmento de polipéptido corresponde a al menos una porción o fragmento de péptido de una proteína enumerada en la Tabla 2. En algunos aspectos, la proteína de longitud completa, fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante o un fragmento de polipéptido corresponde al menos a una porción o fragmento de péptido de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos 37, al menos 38, al menos 39, al menos 40, al menos 41, al menos 42, al menos t 43, al menos 44, al menos 45, al menos 46, al menos 47, al menos 48, al menos 49, al menos 50, al menos 51, al menos 52, al menos 53, al menos 54, o al menos 55 proteínas enumeradas en la Tabla 2. En algunos aspectos, la proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido corresponde a al menos una porción o fragmento de Endoglina, ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4).

En algunas realizaciones se describe en el presente documento un procedimiento para detectar anticuerpos anticélulas endoteliales en el rechazo de aloinjertos. En algunos aspectos se describe en el presente documento un inmunoensayo en fase sólida para detectar al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales. En algunos aspectos, las etapas de realizar el inmunoensayo en fase sólida comprenden: aislar al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con un elemento de captura de anticuerpos o procedimiento de aislamiento de anticuerpos descrito en el presente documento; medir el nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales; comparar el nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con un estándar de referencia positivo y un estándar de referencia negativo, en el que una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia positivo indica una mayor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto y una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia negativo indica una menor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto.

En algunas realizaciones se describe en el presente documento un inmunoensayo en fase sólida para detectar al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales. En algunos aspectos, las etapas para realizar el inmunoensayo en fase sólida comprenden: aislar al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con un elemento de captura o procedimiento de aislamiento de anticuerpos descrito en este documento y medir el nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales específicos para al menos una porción o fragmento de péptido de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 o 55 de las proteínas enumeradas en la Tabla 2. En algunos aspectos, los niveles de estos anticuerpos anticélulas endoteliales se comparan luego con un estándar de referencia positiva y estándar de referencia negativo, en el que una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia positivo indica una mayor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto y una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales para el estándar de referencia negativo indica una menor probabilidad de desarrollar un rechazo del aloinjerto.

En algunas realizaciones se describe en el presente documento un inmunoensayo en fase sólida para detectar un anticuerpo anticélulas endoteliales. En algunos aspectos, las etapas de realizar el inmunoensayo en fase sólida comprenden: aislar al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con un elemento de captura o procedimiento de aislamiento de anticuerpos descrito en el presente documento; medir el nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales específicos para al menos una porción o fragmento de péptido de Endoglina, ligando de tirosina quinasa-3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I ( EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4). En algunos aspectos, los niveles de ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4) se comparan con un estándar de referencia y un estándar de referencia negativo, en el que una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia positivo indica una mayor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto y una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales frente al patrón de referencia negativo indican una menor probabilidad de desarrollar un rechazo del aloinjerto anticélula.

En algunos aspectos, el antígeno diana del anticuerpo anticélulas endoteliales se expresa en la superficie celular de una célula endotelial. En algunos aspectos, los antígenos diana del anticuerpo anticélulas endoteliales no se expresan en la superficie celular de una célula endotelial. En algunos aspectos, el antígeno diana del anticuerpo anticélulas endoteliales se expresa en una célula endotelial en las etapas iniciales del rechazo del trasplante y disminuye en expresión durante el proceso de rechazo. En algunos aspectos, el antígeno diana del anticuerpo anticélulas endoteliales se expresa en una célula endotelial en las etapas iniciales del rechazo del trasplante y conserva su expresión durante todo el proceso de rechazo. En algunos aspectos, el antígeno del anticuerpo anticélulas endoteliales se tiñe mediante procedimientos inmunohistoquímicos conocidos en la técnica a partir de biopsias de tejido tomadas antes o después de un trasplante de órganos.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la presencia de uno o más anticuerpos HLA puede detectarse usando un inmunoensayo en fase sólida (por ejemplo, un ensayo de tipo ELISA tipo sándwich), véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.046.013, que se incorpora como referencia en el presente documento por sus enseñanzas. En algunas realizaciones, los ensayos descritos en el presente documento para detectar anticuerpos anticélulas endoteliales específicos se llevan a cabo al mismo tiempo que un ensayo para detectar la presencia de anticuerpos HLA. En algunas realizaciones, los dos ensayos se llevan a cabo en momentos diferentes para determinar si un receptor tiene tanto anticuerpos anticélulas endoteliales como anticuerpos HLA. En algunos aspectos, los receptores que tienen tanto anticuerpos anticélulas endoteliales como anticuerpos HLA tienen más probabilidades de tener un rechazo del aloinjerto.

En algunas realizaciones, se usa un ensayo ELISA tipo sándwich para la tipificación de HLA, similar a los inmunoensayos convencionales para pruebas de compatibilidad cruzada. Se realiza un ensayo en sándwich uniendo primero un agente de captura específico para HLA a un soporte sólido. El agente de captura puede unirse a la superficie por cualquier medio conveniente, dependiendo de la naturaleza de la superficie. Cuando el agente de captura es un anticuerpo, puede unirse a las placas de forma covalente o no covalente.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anticélulas endoteliales aislados se detectan mediante un reactivo de detección marcado específico y se mide la intensidad del marcador para determinar el rechazo del aloinjerto. En algunas realizaciones, los anticuerpos HLA aislados se detectan mediante un reactivo de detección marcado específico y se mide la intensidad del marcador. En algunas realizaciones, el reactivo marcado es un anticuerpo antihumano específico de clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, IgE, IgD), por ejemplo, antisueros. En algunas realizaciones, los anticuerpos antihumanos se marcan con una enzima unida covalentemente capaz de proporcionar una señal detectable después de la adición de un sustrato adecuado. Una enzima, la fosfatasa alcalina, reacciona con PNPP (fosfato de p-nitrofenilo), un sustrato que se utiliza con la fosfatasa alcalina para producir un color medible en las condiciones de reacción adecuadas. La intensidad del color, utilizando un tiempo de reacción constante, es proporcional a la cantidad de enzima adherida al pocillo, lo que es además indicativo de la cantidad de fondo capturado en cada pocillo. La absorbancia de luz entre aproximadamente 400 y 420 nm se mide con un espectrofotómetro. Se registra la medida de color que se desarrolla en cada pocillo con cada suero normal (no inmunizado) y se obtiene un promedio para los pocillos replicativos. Los ejemplos de otras enzimas adecuadas para su uso en conjugados incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, malato deshidrogenasa y similares. Otros ejemplos no limitantes de marcadores que permiten la medición directa de anticuerpos incluyen radiomarcadores, fluoróforos, colorantes, perlas, quimioluminiscentes, partículas coloidales y similares. Los expertos en la técnica conocen sustratos apropiados para otros conjugados enzimáticos y condiciones de reacción adecuadas.

En algunas realizaciones, un estándar de referencia positivo es cualquier suero o sueros positivos, que se ha demostrado previamente que tiene anticuerpos anticélulas endoteliales en una prueba de compatibilidad cruzada endotelial. En algunos aspectos, los sueros positivos son de una muestra o muestras de un paciente que también han mostrado haber tenido un rechazo de aloinjerto. En algunos aspectos, los sueros positivos provienen de una muestra 0 muestras de un paciente que fueron sensibilizadas o reactivas al HLA. En algunos aspectos, también se ha demostrado que el estándar de referencia positivo tiene anticuerpos anticélulas endoteliales contra al menos una porción o fragmento de péptido de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10., 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 o 55 de las proteínas enumeradas en la Tabla 2. En algunos aspectos, se ha demostrado que el estándar de referencia positivo tiene anticuerpos anticélulas endoteliales contra al menos una porción o fragmento de péptido de Endoglina, ligando de tirosina quinasa-3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina 1 (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4).

En algunas realizaciones, un estándar de referencia negativo es cualquier suero o sueros negativos, que se ha demostrado previamente que tienen anticuerpos anticélulas endoteliales en una prueba de compatibilidad cruzada endotelial. En algunos aspectos, los sueros negativos son de una muestra o muestras de un paciente que también han demostrado no haber tenido un rechazo de aloinjerto. En algunos aspectos, los sueros negativos provienen de una muestra o muestras de un paciente que no fueron sensibilizadas o reactivas a1HLA. En algunos aspectos, también se ha demostrado que el estándar de referencia negativo no tiene anticuerpos anticélulas endoteliales contra al menos una porción o fragmento de péptido de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10., 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 o 55 de las proteínas enumeradas en la Tabla 2. En algunos aspectos, se ha demostrado que el patrón de referencia negativo no tiene anticuerpos anticélulas endoteliales contra al menos una porción o fragmento de péptido de Endoglina, ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4).

En algunas realizaciones, el estándar de referencia positivo comprende además un suero o sueros positivos para anticuerpos HLA, que previamente se ha demostrado que tienen anticuerpos HLA (por ejemplo, mediante una prueba de compatibilidad cruzada). En algunas realizaciones, el estándar de referencia negativo comprende además un suero o sueros negativos para HLA, que previamente se ha demostrado que no tienen anticuerpos HLA (por ejemplo, mediante prueba de compatibilidad cruzada). En algunos aspectos, los sueros positivos y negativos para HLA son útiles para determinar si un sujeto tiene anticuerpos HLA además de anticuerpos anticélulas endoteliales.

En algunas realizaciones, los estándares de referencia positivos y negativos descritos en este documento se utilizan para proporcionar un umbral o valor de corte para la presencia de un anticuerpo anticélulas endoteliales que establece si un individuo tiene un AR o predice si un individuo incurrirá en un AR. El nivel exacto del umbral es irrelevante porque los valores de expresión determinados son relativos para un estándar de referencia o negativo y dependen del instrumento de detección que se utilice, la concentración de reactivo, el operador y las cualidades de la muestra.

En algunas realizaciones, se puede usar una curva estándar de referencia para cuantificar los niveles o la concentración de un anticuerpo anticélulas endoteliales. La curva estándar de referencia puede usarse para determinar una unidad de detección relativa, por ejemplo, una unidad de fluorescencia relativa (RFU) usada en inmunoensayos en fase sólida. Como se describe en el presente documento, se puede generar una curva estándar de referencia para uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales tomando una cantidad conocida de un anticuerpo anticélulas endoteliales y cuantificando la unidad de detección relativa por microgramo de proteína en un intervalo de concentraciones del anticuerpo anticélulas endoteliales que está siendo medido. En un aspecto descrito en este documento, se puede utilizar una curva estándar de referencia para determinar una cantidad de un anticuerpo anticélulas endoteliales en un estándar de referencia positivo. En otro aspecto descrito en el presente documento, se puede utilizar una curva estándar de referencia para determinar una cantidad de un anticuerpo anticélulas endoteliales en un estándar de referencia negativo. En otro aspecto descrito en el presente documento, se puede utilizar una curva estándar de referencia para determinar una cantidad de un anticuerpo anticélulas endoteliales en una muestra desconocida o de prueba (por ejemplo, una muestra obtenida de un sujeto para determinar que el sujeto está experimentando un rechazo de aloinjerto).

Procedimientos para diagnosticar o predecir el rechazo de un aloinierto con anticuerpos anticélulas endoteliales

En una realización se describe en el presente documento, un procedimiento para predecir la probabilidad de un rechazo de aloinjerto. En un aspecto, el procedimiento comprende detectar al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con un elemento de captura o procedimiento de aislamiento de anticuerpos descrito en el presente documento; medir el nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales específico para al menos una porción o fragmento de péptido de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 o 55 proteínas enumeradas en la Tabla 2. En algunos aspectos, los niveles de estos anticuerpos anticélulas endoteliales se comparan luego con un estándar de referencia positivo y un estándar de referencia negativo, en los que una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia positivo indica una mayor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto y una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia negativo indica una menor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto.

En una realización se describe en el presente documento, un procedimiento para predecir la probabilidad de un rechazo de aloinjerto. En un aspecto, el procedimiento comprende detectar al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con un elemento de captura o procedimiento de aislamiento de anticuerpos descrito en el presente documento; medir el nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales específicos para al menos una porción o fragmento de péptido de Endoglina, ligando de tirosina quinasa-3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4). En algunos aspectos, los niveles de los anticuerpos anticélulas endoteliales contra el ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y los dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y la molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4) se comparan entonces con un estándar de referencia positivo y un estándar de referencia negativo, en los que una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia positivo indica una mayor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto y una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia negativo indica una menor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto.

En algunas realizaciones se describe en el presente documento, un procedimiento para predecir la probabilidad de un rechazo de aloinjerto. En un aspecto, el procedimiento comprende medir el nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales específicos para al menos una porción o fragmento de péptido de Endoglina, ligando de tirosina quinasa-3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo a discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4). En otro aspecto, el procedimiento comprende además medir el nivel de al menos uno o más anticuerpos HLA de clase I y clase II. En algunos aspectos, los niveles de ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3), molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4) y anticuerpos HLA clase I y h LA clase II se comparan luego con un estándar de referencia positivo y un estándar de referencia negativo, en los que una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia positivo indica una mayor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto y una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el patrón de referencia negativo indica una menor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto.

En algunas realizaciones se describe en el presente documento, el procedimiento para predecir la probabilidad de que un rechazo de aloinjerto pueda comprender además probar el estado de activación de un cultivo preestablecido de células endoteliales como se describe en este documento poniendo en contacto las células endoteliales con una muestra de un sujeto. En algunos aspectos, la muestra es una elución o aislamiento de anticuerpos después de una prueba de compatibilidad cruzada como se describe en este documento. En algunos aspectos, se pueden medir uno o más marcadores seleccionados de la Tabla 4 para determinar una firma de activación de célula endotelial, lo que indica una mayor probabilidad de un evento de rechazo de aloinjerto. En otro aspecto, la firma de activación endotelial puede comprender la mayor o menor expresión de uno o más de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos 37, al menos 38, al menos 39, al menos 40, al menos 41, al menos 42, al menos 43, al menos 44, al menos 45, al menos 46, al menos 47, al menos 48, al menos 49, al menos 50, al menos 51, al menos 52, al menos 53 o al menos 54 de las citocinas inflamatorias enumeradas en la Tabla 4. En otro aspecto, la firma de activación endotelial puede comprender la mayor o menor expresión de uno o más genes HLA de clase I, selectina E, PECAM1 o ICAM1. En otro aspecto, la firma de activación de células endoteliales incluye mayores niveles de los PDGF, RANTES (es decir, CCL5) y RESISTIN. En otro aspecto, la firma de activación de células endoteliales incluye el menor nivel de CCL3, CCL4, CXCL5 y CXCL.

En una realización se describe en el presente documento, un procedimiento para tratar a un paciente que se sospecha que tiene un rechazo de aloinjerto. En un aspecto, el procedimiento comprende ordenar una prueba clínica que comprende detectar al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con un elemento de captura o procedimiento de aislamiento de anticuerpos descrito en el presente documento; medir el nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales específicos para al menos una porción o fragmento de péptido que comprende Endoglina, ligando de tirosina quinasa-3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4). En algunos aspectos, se comparan los niveles de anticuerpos anticélulas endoteliales para el ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y la molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4) se comparan luego con un estándar de referencia positivo y un estándar de referencia negativo, en los que una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia positivo indica una mayor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto y una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos de anticélulas endoteliales contra el patrón de referencia negativo indica una menor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto. En algunos aspectos, el régimen terapéutico aumenta si se indica que el paciente tiene una mayor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto o se reduce si se indica que el paciente tiene una menor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto.

En una realización se describe en el presente documento, un procedimiento para tratar a un paciente que se sospecha que tiene un rechazo agudo. En un aspecto, el procedimiento comprende ordenar una prueba clínica que comprende medir el nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales específicos para al menos una porción o fragmento de péptido de Endoglina, ligando de tirosina quinasa-3 de tipo Fms (FLT3), Repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4). En otro aspecto, el procedimiento comprende además medir el nivel de al menos uno o más anticuerpos HLA de clase I y clase II. En algunos aspectos, los niveles de anticuerpos anticélulas endoteliales para el ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 similares a discoidina I (EDIL3), molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4) y anticuerpos HLA de clase I y HLA de clase II se comparan luego con un estándar de referencia positivo y un estándar de referencia negativo, en los que una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos anticélulas endoteliales con el estándar de referencia positivo indica una mayor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto y una similitud estadística del nivel de al menos uno o más anticuerpos de anticélulas endoteliales con el estándar de referencia negativo indica una menor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto. En algunos aspectos, el régimen terapéutico aumenta si se indica que el paciente tiene una mayor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto o se reduce si se indica que el paciente tiene una menor probabilidad de desarrollar un rechazo de aloinjerto.

La detección de la presencia o ausencia de anticuerpos anticélulas endoteliales además de la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos HLA también puede usarse para identificar un individuo para el tratamiento de AR. En algunas realizaciones, este individuo es monitoreado por la progresión o regresión de los síntomas de AR. En algunas realizaciones, este individuo es tratado por AR antes o al inicio de los síntomas de AR. En algunas realizaciones, el tratamiento es una terapia con corticosteroides. En otras realizaciones, el tratamiento es la administración de un anticuerpo anticélulas T, tal como muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3). En realizaciones adicionales, el tratamiento es una combinación de plasmaféresis y administración de anticuerpos anti-CD20. En algunos casos, el seguimiento se realiza para determinar si el tratamiento debe continuarse o para ver si el tratamiento es eficaz.

En algunas realizaciones de los procedimientos descritos en el presente documento, los procedimientos tienen uso para predecir la respuesta de AR. En estos procedimientos, primero se hace un seguimiento a un sujeto para detectar AR de acuerdo con los procedimientos objetivo, y luego se trata usando un protocolo determinado, al menos en parte, sobre los resultados del seguimiento. En una realización, se hace un seguimiento al sujeto para detectar la presencia o ausencia de rechazo agudo de acuerdo con uno de los procedimientos descritos en este documento. A continuación, el sujeto puede tratarse utilizando un protocolo cuya idoneidad se determina utilizando los resultados de la etapa de seguimiento. Por ejemplo, cuando se predice que el sujeto tendrá una respuesta de rechazo agudo dentro de los próximos 1 a 6 meses, la terapia inmunosupresora se puede modular, por ejemplo, aumentar o cambiar los fármacos, como se conoce en la técnica para el tratamiento/prevención del rechazo agudo. Asimismo, cuando se predice que el sujeto está libre de rechazo agudo actual y a corto plazo, la terapia inmunosupresora puede reducirse para reducir el potencial de toxicidad del fármaco. En algunas realizaciones de los procedimientos descritos en este documento, se hace seguimiento a un sujeto para detectar un rechazo agudo después de recibir un injerto o trasplante. El sujeto puede ser examinado una vez o en serie después de recibir el trasplante, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, bimestralmente, semestralmente, anualmente, etc. En algunas realizaciones, al sujeto se le hace seguimiento antes de que ocurra un episodio de rechazo agudo. En otras realizaciones, se hace seguimiento al sujeto tras la aparición de un episodio de rechazo agudo.

En algunas realizaciones de los procedimientos descritos en el presente documento, los procedimientos tienen uso para alterar o cambiar un paradigma de tratamiento o un régimen terapéutico de un sujeto que necesita tratamiento de AR. Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos o terapéuticos inmunosupresores útiles para el tratamiento de un sujeto que los necesita comprenden esteroides (por ejemplo, prednisona (Deltasone), prednisolona, metilprednisolona (Medrol, Solumedrol)), anticuerpos (por ejemplo, muromonab-CD3 (Orthoclone-OKT3), inmunoglobulina antitimocítica (ATGAM, Timoglobulina), daclizumab (Zenapax), basiliximab (Simulect), Rituximab, inmunoglobulina contra citomegalovirus (Cytogam), inmunoglobulina (Polygam)), inhibidores de la calcineurina (por ejemplo, Ciclosporina (Sandimmune) tacrolimus (Prograf)), antiproliferativos (por ejemplo, micofenolato de mofetilo (CellCept), azatioprina (Imuran)), inhibidores de TOR (por ejemplo, rapamicina (Rapamune, sirolimus), everolimus (Certican)), plasmaféresis terapéutica o una terapia combinada de los mismos.

En algunas realizaciones, en las que se identifica que un sujeto no tiene AR usando los procedimientos descritos en el presente documento, el sujeto puede permanecer en un estándar inmunosupresor de terapia de mantenimiento de la atención que comprende la administración de un agente antiproliferativo (por ejemplo, micofenolato de mofetilo y/o azatioprina), un inhibidor de calcineurina (por ejemplo, ciclosporina y/o tacrolimus), esteroides (por ejemplo, prednisona, prednisolona y/o metil prednisolona) o una combinación de los mismos. Por ejemplo, un sujeto identificado por no tener un AR usando los procedimientos descritos en este documento puede recibir una terapia de mantenimiento que comprende la administración de una dosis baja de prednisona (por ejemplo, aproximadamente 0,1 m gkg '1 d'1 hasta aproximadamente 1 m gkg '1 d'1), una dosis baja de ciclosporina (por ejemplo, aproximadamente 4 m gkg '1 d'1 hasta aproximadamente 8 m gkg '1 d'1) y una dosis baja de micofenolato (por ejemplo, Aproximadamente 1-1,5 g dos veces al día). En otro ejemplo, un sujeto identificado por no tener un AR usando los procedimientos descritos en este documento puede ser retirado de la terapia con esteroides y colocado en una terapia de mantenimiento que comprende la administración de una dosis baja de ciclosporina (por ejemplo, aproximadamente 4 m gkg '1 d'1 hasta aproximadamente 8 m gkg '1 d'1) y una dosis baja de micofenolato (por ejemplo, aproximadamente 1-1,5 g dos veces al día). En otro ejemplo, un sujeto identificado por no tener un AR usando los procedimientos descritos en este documento se le pueden eliminar todos los agentes terapéuticos inmunosupresores descritos en este documento.

En algunas realizaciones, en las que se identifica que un sujeto tiene un AR usando los procedimientos descritos en este documento, el sujeto puede recibir una terapia de rescate o un aumento de agentes inmunosupresores que comprenden la administración de una dosis alta de un esteroide (por ejemplo, prednisona, prednisolona y/o metil prednisolona), una dosis alta de un anticuerpo policlonal o monoclonal (por ejemplo, muromonab-CD3 (OKT3), inmunoglobulina antitimocítica, daclizumab, Rituximab, basiliximab, inmunoglobulina contra citomegalovirus y/o inmunoglobulina), una dosis alta de un agente antiproliferativo (por ejemplo, micofenolato de mofetilo y/o azatioprina), o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el curso de la terapia en el que se identifica que un sujeto no tiene AR o se identifica que tiene AR usando los procedimientos descritos en este documento depende del tiempo después del trasplante y de la gravedad del rechazo, el médico tratante y el centro de trasplantes.

Por lo tanto, detectar la presencia o ausencia de anticuerpos anticélulas endoteliales además de detectar la presencia o ausencia de anticuerpos HLA usando la metodología descrita en este documento permite el diagnóstico de AR en un receptor de aloinjerto, el diagnóstico de no AR en un receptor de aloinjerto, ayuda en el diagnóstico de AR, ayuda en el diagnóstico del riesgo de AR, monitorea la progresión de AR, monitorea la regresión de AR, identifica a una persona que debe ser tratada por AR o continúa el tratamiento para AR, evalúa la eficacia del tratamiento para AR y/o identifica a los individuos que deben ser controlados para detectar los síntomas de AR.

En algunas realizaciones, la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos anticélulas endoteliales además de la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos HLA mediante la metodología descrita en este documento puede usarse para la estratificación o identificación de AR mediado por anticuerpos. En algunas realizaciones, la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos anticélulas endoteliales además de la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos HLA mediante la metodología descrita en el presente documento puede usarse para la estratificación o identificación de AR mediado por células T. La detección de la presencia o ausencia de anticuerpos anticélulas endoteliales además de la detección de la presencia o ausencia de anticuerpos HLA mediante la metodología descrita en este documento es útil para la identificación de AR mediada por células B o T en algunos aspectos porque se expresan en células B o se expresan en células T o son marcadores conocidos de células T activadas.

Kits para el diagnóstico, detección o predicción de AR

En algunas realizaciones descritas en el presente documento se encuentran kits de ensayo para el diagnóstico, detección y predicción de AR. En algunas realizaciones, el kit comprende un inmunoensayo en fase sólida (por ejemplo, un ELISA) para capturar y medir anticuerpos anticélulas endoteliales en una muestra biológica. En algunos aspectos, el kit incluye además patrones de referencia positivos y negativos para determinar si una muestra biológica tiene anticuerpos anticélulas endoteliales. En algunos aspectos, el kit es útil para diagnosticar o predecir la probabilidad de que una persona tenga o tendrá un AR.

En algunas realizaciones, el kit comprende un elemento de detección de anticuerpos para medir el nivel de un anticuerpo anticélulas endoteliales presente en una muestra biológica de un individuo que ha recibido o recibirá un trasplante de órgano. En algunas realizaciones, el kit comprende un elemento de captura de anticuerpos que comprende una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido correspondiente a al menos una porción o fragmento de péptido de al menos una proteína enumerada en la Tabla 2. En algunas realizaciones, el kit comprende un elemento de captura de anticuerpos que comprende una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido correspondiente a al menos una porción o fragmento de péptido de Endoglina, ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms(FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4). En algunas realizaciones, el kit comprende un sustrato sólido que comprende una perla, una placa o una placa de microtitulación. En algunos aspectos, el kit comprende una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina. En algunos aspectos, el kit comprende un reactivo de detección. En algunos aspectos, el reactivo de detección es un anticuerpo secundario antihumano marcado específico de clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, IgE, IgD).

En algunas realizaciones, el kit comprende además un sustrato sólido que comprende una perla, placa o placa de microtitulación, en la que una proteína de longitud completa, fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante o un fragmento de polipéptido correspondiente a al menos una porción o fragmento de péptido de al menos una proteína enumerada en la Tabla 2 está enlazada. En algunos aspectos, el kit comprende además un sustrato sólido que comprende una perla, placa o placa de microtitulación, en la que una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante o un fragmento de polipéptido correspondiente a al menos una porción o fragmento de péptido de Endoglina, se enlaza un ligando de tirosina quinasa 3 de tipo Fms (FLT3), repeticiones de tipo EGF y dominios 3 de tipo discoidina I (EDIL3) y molécula de adhesión intercelular 4 (ICAM4).

En algunas realizaciones, el kit comprende además un estándar de referencia positivo y un estándar de referencia negativo para comparar los resultados del ensayo y determinar si un individuo tiene un Ar o tendrá un AR como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, el estándar de referencia positivo es un suero o sueros positivos, que previamente se ha demostrado que tienen anticuerpos anticélulas endoteliales en una prueba de compatibilidad cruzada endotelial. En algunos aspectos, el estándar de referencia positivo es un suero o sueros positivos, que previamente se ha demostrado que tiene anticuerpos anticélulas endoteliales específicos para al menos una porción o fragmento de péptido de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6., 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 o 55 proteínas enumerados en la Tabla 2. En algunos aspectos, el estándar de referencia negativo es un suero o sueros negativos, que previamente se ha demostrado que no tienen anticuerpos anticélulas endoteliales en una prueba de compatibilidad cruzada endotelial. En algunos aspectos, el estándar de referencia negativo es un suero o sueros negativos, que previamente se ha demostrado que no tienen anticuerpos anticélulas endoteliales específicos para al menos una porción o fragmento de péptido de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 o 55 proteínas enumeradas en la Tabla 2.

En algunas realizaciones, la comparación se realiza mediante un programa informático. En algunas realizaciones, la comparación la realiza un individuo. En algunas realizaciones, la comparación la realiza un médico. En algunas realizaciones, la comparación es útil para diagnosticar que un individuo tiene un AR o tiene una mayor probabilidad de sufrir un AR.

En algunas realizaciones, los kits comprenden un programa informático. En algunas realizaciones, un programa informático está configurado para enviar a un usuario una puntuación que representa una mayor o menor probabilidad de al menos uno de: una predicción de la aparición de una respuesta de AR, un diagnóstico de una respuesta de AR y una caracterización de una respuesta de AR en el sujeto, en la que el resultado se determina comparando niveles de anticuerpos anticélulas endoteliales en una muestra de prueba (por ejemplo, de un receptor de aloinjerto) con un estándar de referencia negativo y un estándar de referencia positivo descrito en el presente documento.

El kit también comprende instrucciones para el uso del ensayo.

Ejemplos

Ejemplo 1. Identificación de nuevas dianas de células endoteliales antigénicas mediante arreglos de proteínas

Se aislaron AECA de una cohorte de descubrimiento de diez receptores de trasplante renal cuyos datos demográficos se proporcionan en la Tabla 1. La mayoría (9 de 10) fueron sensibilizados a HLA y todos dieron positivo para AECA en pruebas de compatibilidad cruzada de células endoteliales previas al trasplante. Nueve experimentaron disfunción del aloinjerto y rechazo comprobado por biopsia con glomerulitis y capilaritis peritubular notorias (Figura 1). Solo un receptor tenía anticuerpos contra HLA del donante (DR52) en el momento del rechazo. Para centrar estos análisis en los antígenos diana de AECA, se generaron eluatos de anticuerpos utilizando ECP derivados de la sangre. En resumen, cada suero se incubó con ECP y, tras las etapas de lavado, los anticuerpos unidos se eluyeron con ácido y se neutralizaron. Utilizando una plataforma de proteínas de alta densidad, se perfilaron los eluatos de AECA de los diez receptores de la Cohorte de Descubrimiento frente a aproximadamente 9500 proteínas humanas. Se identificaron cuatro proteínas, expresadas en el endotelio vascular, Endoglina, EDIL3, ICAM4 y ligando FLT3, en todos los eluatos. Las intensidades de señal para estos cuatro anticuerpos fueron significativas (Endoglina, EDIL3 y FLT3 p <0,001; ICAM4 p <0,03) en comparación con anticuerpos de baja abundancia con señales <2000 RFU Figura 2A y Tabla 2. También se realizaron análisis de eluatos de AECA derivados de dos receptores que se sometieron a plasmaféresis terapéutica por rechazo. Estos eluatos de AECA se derivaron de sueros positivos con compatibilidad cruzada de células endoteliales extraídos antes del trasplante, sueros negativos de compatibilidad cruzada obtenidos al final del tratamiento y sueros extraídos más tarde después del tratamiento (3 y 9 meses) que nuevamente dieron positivo en una prueba cruzada de células endoteliales. Los datos del arreglo de proteínas, normalizados a la inmunoglobulina IgG total, mostraron que los AECA para las cuatro dianas de proteína (Endoglina, ligando de FLT3, EDIL3 e ICAM4) disminuyeron después de la plasmaféresis y rebotaron nuevamente en sueros que tenían AECA detectables en pruebas de compatibilidad cruzada Figura 2B.

Ejemplo 2. Nuevas dianas antigénicas de anticuerpos anticélulas endoteliales

Los antígenos diana de anticuerpos anticélulas endoteliales identificados a partir de eluatos de anticuerpos de los ECP en arreglos de proteínas humanas se enumeran en la Tabla 2 a continuación. Cada anticuerpo anticélulas endoteliales formó un complejo anticuerpo/antígeno y se identificó en un umbral de corte de RFU> 2000.

continuación

Ejemplo 3. Expresión de antígenos diana en células endoteliales

El análisis del fenotipo celular usando citometría de flujo confirmó la expresión superficial de Endoglina, EDIL3, ICAM4 y FLT3 (receptor para el ligando de FLT3) en los e Cp derivados de sangre en comparación con un anticuerpo de control de isotipo (datos no mostrados). El análisis de dos líneas de EC, derivadas de la arteria ilíaca y la vena umbilical humana, produjo una tinción positiva para Endoglina, pero tinción negativa para EDIL3, ICAM4 y FLT3, incluso después de la estimulación con TNFa. Para investigar la expresión de estas dianas antigénicas en el tejido renal, se realizó inmunohistoquímica en biopsias de rechazo obtenidas de los diez receptores de la Cohorte de Descubrimiento. La Figura 3 ilustra la tinción representativa para Endoglina y FLT3, que se expresaron en el endotelio arterial y los capilares glomerulares y peritubulares. La tinción concomitante del tejido de la biopsia para FLT3LG, EDIL3 e ICAM4 dio resultados negativos.

Ejemplo 4. Incidencia de AECA utilizando ELISA específicos de antígeno.

Los sueros de 150 receptores de trasplante renal secuencial, para los que había sueros adecuados antes y después del trasplante (< 3 meses), se analizaron usando ELISA MSD específicos para Endoglina, EDIL3, ICAM4 y FLT3. Esta cohorte de estudio retrospectivo fue similar a la Cohorte de Descubrimiento en que se enriqueció para los receptores sensibilizados a HLA, con un 91% (137 de 150) dando positivo para anticuerpos específicos de HLA de clase I y/o clase II. Tabla 1.

Se analizaron los sueros que reaccionaban más fuertemente en cada ELISA, en los que la intensidad de la señal era igual o mayor que la media recortada. Cincuenta y seis sueros (37%) reaccionaron positivamente con una o más dianas antigénicas. Dentro de este grupo, 36 sueros (24%) mostraron una fuerte reactividad con los cuatro antígenos diana. Tabla 3. Las comparaciones por pares realizadas utilizando los 36 sueros que reaccionaron con mayor frecuencia arrojaron correlaciones altamente significativas (P <0,0005) en la producción de anticuerpos para estos cuatro antígenos: Endoglina y EDIL3 (R2 = 0,91, r = 0,954), Endoglina e ICAM4 (R2 = 0,89, r = 0,94), y EDIL3 e ICAM4 (R2 = 0,87, r = 0,93), FLT3 y Endoglina (R2 = 0,74, r = 0,86), FLT3 e ICAM4 (R2 = 0,76, r = 0,87) y FLT3 y EDIL3 (R2 = 0,72, r = 0,85). Los niveles de AECA específicos para estos cuatro objetivos disminuyeron en los sueros después del trasplante (< 3 meses) en casi todos los casos (93%, 140 de 150 pacientes).

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Ejemplo 5. Activación con AECA de cultivos de células endoteliales

Se establecieron cultivos de células endoteliales primarias y se estimularon con suero de control negativo, sueros positivos para AECA, eluatos de AECA, TNFa o un suero que contiene anticuerpos HLA. Se utilizaron como estimulantes los eluatos de AECA de cinco de los diez receptores originales de la Cohorte de Descubrimiento. Los eluatos contenían una concentración de AECA comparable a la del suero original.

Se estimularon las células endoteliales cultivadas durante 24 horas, después de lo cual se realizó el análisis del fenotipo de superficie usando citometría de flujo para evaluar la activación de las células endoteliales. Se observó un aumento significativo en la expresión de HLA clase I (p = 0,04) y moléculas de adhesión: selectina E (p = 0,02) e ICAM1 (p = 0,005) tras la estimulación con eluatos de AECA en comparación con el suero de control negativo (datos no mostrados) o los sueros positivos para AECA originales de los que se derivaron los eluatos (Figura 4). El aumento de la molécula 1 de adhesión de plaquetas/células endoteliales (PECAM1) después de la estimulación con eluato de AECA no fue estadísticamente diferente de los controles negativos (p = 0,12). La estimulación de cultivos de células endoteliales usando TNFa o suero que contiene anticuerpos HLA aumentó la expresión de todos los marcadores (HLA clase I, PECAM1, selectina E e ICAM1) en comparación con los controles negativos.

Se evaluó la producción de citocinas y quimiocinas inflamatorias después de la estimulación del eluato de AECA usando un inmunoensayo multiplexado realizado en una plataforma Luminex®. Las proteínas y citocinas ensayadas para indicaciones de activación de células endoteliales se muestran en la Tabla 4. Los cultivos de células endoteliales primarias se estimularon con medio de cultivo solo, suero de control negativo, eluatos de AECA, TNFa o suero que contenía anticuerpos HLA específicos para el donante de ECP. Después de 72 horas, se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se analizaron en un inmunoensayo humano Affymetrix Procarta®. Cuarenta y cuatro de los 54 analitos fueron negativos en todos los sobrenadantes analizados. Se detectaron interleucina (IL) 8, antagonista del receptor de IL1 (IL-1RA) y Serpina E1 en todos los cultivos de prueba, incluidos aquellos sin estimulación (medio de cultivo solo). Las citocinas inflamatorias PDGF, RANTES (también conocida como CCL5) y RESISTIN aumentaron en cultivos estimulados con eluatos de AECA en comparación con controles negativos o cultivos estimulados con anticuerpos TNFa o HLA (Figura 5). Por el contrario, las quimiocinas CCL3, CCL4, CXCL5 y CXCL parecieron disminuidas en cultivos estimulados con eluatos de AECA en comparación con otros estimulantes.

continuación

Ejemplo 6. Resultados clínicos para los receptores que dieron positivo en AECA

Se realizó un análisis preliminar de los resultados clínicos para 40 receptores con los sueros de menor reacción en los ELISA, un grupo intermedio de 20 receptores que probaron por encima de la media recortada para anticuerpos específicos para uno a tres antígenos diana, y 36 receptores que dieron un resultado muy positivo para los anticuerpos contra los cuatro objetivos: Endoglina, EDIL3, ICAM4 y FLT3 (Tabla 2). Los sueros de los receptores restantes analizados por debajo de la media recortada en ELISA para los cuatro antígenos diana. Los datos demográficos de estas cohortes fueron similares para todas las características previas al trasplante. Es importante destacar que la concentración de HLA-DSA en el momento del trasplante fue similar entre las tres cohortes de ELISA.

El veintiocho por ciento del grupo positivo para ELISA y el 25% del grupo intermedio experimentaron un retraso en la función del injerto, requiriendo diálisis posterior al trasplante, en comparación con el 15% en la cohorte negativa para ELISA (Tabla 5). La incidencia de rechazo celular no fue significativamente diferente entre los tres grupos de ELISA; sin embargo, el rechazo mediado por anticuerpos fue significativamente mayor en los receptores que dieron positivo para AECA (Intermedio: 15%, p = 0,04 y fuertemente positivo: 19%, p = 0,007) en comparación con el 4% en los receptores que dieron negativo en la prueba de ELISA. El análisis de ochenta y seis biopsias de 36 receptores con los sueros de reacción más fuerte (68 biopsias de indicación y 18 de protocolo) reveló significativamente más glomerulitis, capilaritis peritubular, positividad para C4d y glomerulopatía de trasplante que las biopsias de los 40 receptores negativos para ELISA (36 biopsias de indicación y 34 de protocolo) (Tabla 5 y Figura 6). El grupo intermedio (31 biopsias de indicación y 36 de protocolo) mostró menos glomerulitis, pero más capilaritis peritubular, positividad para C4d y cambios vasculares crónicos que el grupo negativo. La incidencia de HLA-DSA en el momento de la biopsia fue alta, lo que refleja el alto grado de sensibilización a HLA y la inclusión de trasplantes incompatibles en estas cohortes de pacientes (Tabla 5). Se detectó HLA-DSA en el momento de la biopsia en el 76% de las biopsias de los receptores positivos para ELISA, el 45% de las biopsias de los receptores intermedios positivos y el 47% de las biopsias de los receptores negativos para ELISA. Los receptores que resultaron muy positivos para AECA tenían un mayor número de DSA en el momento de la biopsia y una mayor incidencia de anticuerpos contra los antígenos HLA de clase I y II. Se eliminaron de un análisis posterior, las biopsias con alto nivel de HLA-DSA suficientes para producir una citometría de flujo positiva o una prueba de citotoxicidad cruzada de linfocitos para examinar el impacto de HLA-DSA y AECA de bajo nivel. Entre las biopsias restantes con niveles bajos o nulos de HLA-DSA, detectados solo mediante ensayos de perlas, todavía se observó más daño microvascular en los receptores fuertemente positivos frente a los receptores negativos para AECA (Tabla 5 y Figura 6). Las puntuaciones de histopatología para la lesión microvascular no aumentaron significativamente en las biopsias de receptores con niveles intermedios de AECA sin HLA-DSA o con niveles bajos.

Los niveles de creatinina en suero en el período inmediatamente posterior al trasplante (7 días) fueron significativamente más altos en el grupo positivo por ELISA (p = 0,002), lo que corresponde a la alta incidencia de función retardada del injerto. La creatinina media en suero a 1 mes fue mayor en el grupo positivo por ELISA (1,80 ± 1,07) en comparación con el grupo negativo por ELISA (1,38 ± 1,02) pero la diferencia no fue significativa (p = 0,09). Los niveles medios de creatinina en suero a los 3 meses, 1 año y > 1,5 años también fueron más altos que los de la cohorte positiva por ELISA, pero no significativamente diferentes. La tasa de filtración glomerular estimada no fue significativamente diferente en ningún momento después del trasplante (datos no mostrados).

continuación

Ejemplo 7. Pacientes

Se estudiaron los datos clínicos y los sueros almacenados de 160 receptores de trasplante renal, trasplantados entre 2009-2011, retrospectivamente después de la aprobación del IRB. Los sueros de un grupo de descubrimiento de diez receptores, que dieron positivo en las pruebas de compatibilidad cruzada de células endoteliales y experimentaron rechazo del aloinjerto en los primeros 3 meses después del trasplante, en ausencia del anticuerpo específico de HLA del donante, se probaron en una plataforma de arreglos de proteínas. Se realizaron pruebas ELISA en 150 receptores de trasplante renal secuencial para los que había sueros adecuados antes y después del trasplante (< 3 meses). Los datos demográficos de los pacientes se proporcionan en la Tabla 1.

Ejemplo 8. Tratamientos inmunosupresores de pacientes

La inmunosupresión de mantenimiento incluyó micofenolato de mofetilo (2 g/día), tacrolimus (nivel en suero de 8-10 ng/ml) y prednisona (30 mg/día). La prednisona se redujo a 20 mg/día cuando el tacrolimus alcanzó el intervalo terapéutico (8-12 ng/dl) y luego se redujo a 5 o 10 mg/día. La terapia de inducción intraoperatoria consistió en anticuerpo antirreceptor de IL2 (anti-CD25, daclizumab 2 mg/kg) o timoglobulina (1,5 mg/kg por día durante 5 días). En este estudio se incluyeron pares incompatibles HLA y ABO. La desensibilización incluyó plasmaféresis en días alternos seguida inmediatamente por una dosis baja (100 mg/kg) de inmunoglobulina intravenosa (IglV) (Cytogam-CSL Behring, King of Prussia, PA). Se iniciaron micofenolato de mofetilo (2 g/día) y tacrolimus (nivel en suero de 8-10 ng/ml) con el inicio de los tratamientos de plasmaféresis. El número de tratamientos dependía de ABO o del título de anticuerpos específicos de HLA del donante (HLA-DSA). El rechazo agudo mediado por anticuerpo confirmado por biopsia (AMR) se trató con plasmaféresis y/o rituximab y/o IglV y pulsos de Solumedrol.

Ejemplo 9. Detección de anticuerpos HLA y pruebas de compatibilidad cruzada

Se evaluaron anticuerpos específicos de HLA antes del trasplante y en el momento de la biopsia usando inmunoensayos en fase sólida (paneles de identificación de clase I y II de Lifecodes, Immucor-Lifecodes, Stamford, CT y Single Antigen Beads, One Lambda, Canoga Park, CA) realizados en una plataforma Luminex®. Las pruebas de compatibilidad cruzada con células T y B del donante se realizaron utilizando protocolos estándar de citotoxicidad y/o citometría de flujo (FCXM). Se determinó el anticuerpo reactivo del panel calculado para anticuerpos suficientes para producir una citotoxicidad positiva o FCXM utilizando procedimientos virtuales de compatibilidad cruzada y la calculadora en línea UNOS cPRA20. Los AECA se detectaron usando un FCXM realizado usando ECP de sangre periférica positivos para el receptor de angiopoyetina (Tie-2) (XM-ONE®).

Ejemplo 10. Derivación de eluatos de anticuerpos anticélulas endoteliales no HLA

Los eluatos de AECA se derivaron de la absorción de anticuerpos de sueros positivos de compatibilidad cruzada de células endoteliales en ECP Tie2+ aislados de donantes sustitutos para quienes no había HLA-DSA. La proporción de suero a células, incubación y etapas de lavado fueron consistentes con el procedimiento de compatibilidad cruzada de células endoteliales. El anticuerpo se eluyó con ácido en 1/10 del volumen de suero original como se describió anteriormente y se dializó 18 horas contra solución salina tamponada con fosfato. Los eluatos de AECA se volvieron a analizar en pruebas de compatibilidad cruzada de células endoteliales para garantizar la integridad y especificidad del anticuerpo. El absorbedor AB, (Estocolmo, Suecia) se adquirió a través de BD FACSAriaMR usando FACSDiva (versión 6.1.1, BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey).

Ejemplo 11. Análisis de microarreglos de proteínas

Se usaron microarreglos de proteínas humanas ProtoArray® v5,0 (Life Technologies, Foster City, CA) para perfilar anticuerpos presentes en 14 eluatos de AECA de diez receptores positivos de compatibilidad cruzada de células endoteliales. Para dos receptores, el análisis se realizó en eluatos de AECA derivados de sueros obtenidos antes y después de los tratamientos de desensibilización. Los arreglos de proteínas contenían aproximadamente 9500 proteínas humanas recombinantes expresadas como proteínas de fusión de GST del terminal N y se transfirieron al portaobjetos de vidrio recubierto de nitrocelulosa. Se siguieron los protocolos establecidos (http://www.invitrogen.com) 23, 24 para la preparación de muestras, bloqueo, sondeo, secado por centrifugación, escaneo y adquisición de datos. Los portaobjetos se escanearon utilizando un escáner Axon GenePix 4000B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y el software GenePix pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Usando el software de análisis de datos ProtoArray® Prospector 5.2 para analizar cualquier anticuerpo IgG unido detectado por el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor® 647. A continuación, se cuantificó la unión del anticuerpo secundario en el microarreglo midiendo la intensidad de fluorescencia de cada característica en el portaobjetos. La generación y normalización de datos involucró el cálculo de los valores apropiados de la señal fluorescente teniendo en cuenta las correcciones para el fondo y las características de control negativo impresas en el microarreglo. Se calcularon los factores Z para todas las intensidades corregidas de las características de la proteína humana y las características que tenían intensidades de señal superiores al valor de corte de 2000 se consideraron como señal abundante. El análisis de la ruta se realizó utilizando el análisis de la ruta Ingenuity (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) y la herramienta de análisis de ruta GO-Elite (http://www.genmapp.org/go_elite/go_elite.html).

Ejemplo 12. ELISA específicos de antígeno de células endoteliales

Se validaron dianas de antígeno específico de EC identificadas por arreglos de proteínas usando la plataforma de ELISA de MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Las proteínas/antígenos recombinantes obtenidos de Abcam (Cambridge, MA) incluían: EDIL3 (Cat. No. ab94549), FLT3 (Cat. No. 83996), Endoglina (Cat No. ab95043) e ICAM4 recombinante (Cat. No. H00003386-P) se adquirieron a través de Abnova (Walnut, CA). Para aumentar la especificidad y la sensibilidad de detección, cada antígeno se conjugó con biotina y se incubó con suero diluido antes de recubrir el complejo antígeno-anticuerpo sobre la placa de ELISA recubierta con avidina. La marcación con biotina de cada antígeno (5 |jg) se realizó utilizando EZ-Link Sulfo-NHS-LC_Biotin (Cat. No. PI21335, Rockford, IL), kit de cuantificación de biotina (Cat. No. PI28005, Rockford, IL) y columnas de desalinización de centrifugación Zeba* (MWCO 7K, 5 ml, Cat. No. PI89892, Rockford, IL) siguiendo el protocolo del fabricante. El suero se diluyó 1:75 con Bloqueador A al 2% (Cat. No. R93AA-1, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) en TPBS, después de que los estudios de titulación mostraran que esta era la dilución óptima. Se agregaron partes iguales de suero diluido (50 jl) y antígeno marcado con biotina (5 ng) o Bloqueador A al 2% en TPBS a una placa de oro con estreptavidina (Cat. No. L15SA-1, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) y se incubó durante 90 min a temperatura ambiente con agitación (300 rpm). La placa se bloqueó con Bloqueador A al 5% (150 j l) durante 90 minutos a temperatura ambiente con agitación, se lavó una vez con 300 j l de TPBS y se añadieron 100 j l de anticuerpo de detección SULFO-TAG antihumano de cabra diluido (1:1000) y se incubó en la oscuridad durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación. Después de tres lavados con 300 j l de TPBS, se añadieron 150 j l de tampón de lectura a cada pocillo y la placa se leyó inmediatamente con un SECTOR® Imager 2400 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). La reactividad por encima de la media recortada se consideró positiva y los cambios entre los niveles de anticuerpos antes y después del trasplante se determinaron mediante aumentos o disminuciones que excedían un intervalo de confianza del 95% para cada ELISA.

Ejemplo 13. Cultivo de células endoteliales

Se establecieron cultivos de células endoteliales primarias usando ECP Tie2+ aislados de donantes que produjeron una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales positiva con sueros de la Cohorte de Descubrimiento como se describió previamente 25. En resumen, los ECP se aislaron usando perlas magnéticas Tie2 (Absorbedor AB XM-ONE®, Estocolmo, Suecia), sembrados en placas a una densidad de 1000 células/mm2 en pocillos recubiertos con fibronectina (1 jg/pocillo) y se cultivaron durante 2-3 semanas en medios de soporte (Kit e GM-2 Bullet, Lonza, Walkersville, MD) para permitir para la maduración. Las líneas EC (CRL-2606TM, a Tc C y HuVEC, obsequio del Dr. Mark K Halushka) se cultivaron como anteriormente; los cultivos se pasaron cuando el 70-80% eran confluentes y se analizaron dentro de los primeros 5 pases.

Ejemplo 14. Análisis después de la estimulación del cultivo de células endoteliales

Los cultivos de células endoteliales primarias se lavaron dos veces con tampón de lavado (PBS 1x con suero de ternera fetal al 5% inactivado por calor). Las células se estimularon usando 100 j l de suero AB de control negativo, sueros positivos de compatibilidad cruzada de células endoteliales, eluatos de AECA, TNFa (10 ng/pocillo, Abcam, Cambridge, MA) o un suero que contenía anticuerpos específicos para antígenos HLA del donante de ECP. Las células se incubaron durante 1 hora, después de lo cual se añadió a cada pocillo 1 ml de medio de soporte. El análisis del fenotipo de la superficie celular se realizó 24 horas después de la estimulación. Las células se eliminaron con tripsina al 0,25%, se lavaron y se tiñeron de acuerdo con los protocolos estándar. Los anticuerpos monoclonales incluían CD54 conjugado con complejo proteico de clorofila y peridinina (clon HA58), CD62E conjugado con ficoeritrina (clon 68-5H11), HLA clase I conjugado con isotiocianato de fluoresceína (clon G46-2,6) y CD3 (clon SK7), CD31 conjugado con Alexa Fluor 647 (clonWM59) (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey). Los anticuerpos policlonales antihumanos de conejo incluían CD105 (Endoglina, ab21224), CD242 (ICAM4, ab112554), EDIL3 (ab74775) y CD135 (FLT3, ab37847), (Abcam, Cambridge, MA). Se adquirió IgG anti-conejo de cabra conjugada con aloficocianina de R&D Systems (Minneapolis, MN). Las células se adquirieron (2000 eventos cerrados) y se analizaron utilizando un BD FACSAriaMR y FACSDiva (versión 6,1,1, BD Biosciences) y/o De Novo SoftwareMR (Los Ángeles, CA). Después de 72 horas de estimulación, los sobrenadantes del cultivo se probaron usando el inmunoensayo de 54 analitos humanos Procarta® (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se adquirieron en una plataforma multiplex Luminex® xMAP®. Cada ensayo incluyó un estándar de control positivo para cada proteína diana. Todas las biopsias de histopatología realizadas durante el primer ano después del trasplante se incluyeron en el análisis. Las biopsias se realizaron al momento de la disfunción del injerto y para los receptores incompatibles con HLA, de acuerdo con el protocolo a 1, 3, 6 y 12 meses después del trasplante. Los receptores pueden ser excluidos de las biopsias de protocolo debido a la terapia anticoagulante o si no pueden tomarse biopsias con seguridad del trasplante intraabdominal. Las biopsias se puntuaron utilizando los criterios 26-29 actualizados de Banff '97. Los criterios para el diagnóstico de rechazo mediado por anticuerpos incluyeron la detección de C4d mediante inmunofluorescencia indirecta. La tinción con C4d se consideró positiva si estaba presente en > 50% de los capilares peritubulares con intensidad >1+ (C4d2-3). Se realizó una tinción adicional del tejido de la biopsia utilizando anticuerpos policlonales antihumanos de conejo reactivos con CD105 (RB9291P1, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), CD242 (ICAM4, ab112554), EDIL3 (ab74775) y CD135 (FLT3, ab37847) (Abcam, Cambridge, MA). La detección se realizó usando un anticuerpo secundario conjugado con polímero de peroxidasa de rábano picante (Kit de detección de polímeros SuperPictureMR, Life Technologies, Grand Island, NY).

Ejemplo 15. Métodos estadísticos

Los datos del arreglo de proteínas fueron analizados por analizador Prospector (Life Technologies, Foster City, CA) usando normalización de modelo lineal robusto 30. Se requirió una unidad fluorescente relativa mínima (RFU) > 500 y un factor Z de 0,4 para la detección positiva. El resumen estadístico que incluye la media, la media recortada, la mediana, la distribución de la norma de confianza, el coeficiente de correlación, el coeficiente de diferencia y la desviación estándar se calcularon utilizando Microsoft Excel. La significancia estadística se determinó usando Chi cuadrado y pruebas t de Student (dos colas) y los valores p <0,05 se consideraron significativos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de diagnóstico de un rechazo de aloinjerto (AR) en un individuo que ha recibido o recibirá un trasplante de órgano, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) aislar un anticuerpo de una muestra biológica del individuo que forma una interacción de afinidad con al menos una porción o fragmento de péptido de CTLA4, y aislar opcionalmente al menos un anticuerpo adicional de la muestra biológica de un individuo que forma una interacción de afinidad con al menos una porción o fragmento de péptido al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en TRIM21, HSH2D, IFI6, APEX2, CLIP4, UBXD8, ZMYM5, EDIL3, UBE2V1, PHGDH, SCEL, ZCCHC8, C22orf33, CPSF3, C20orf96, ENG, DLG GAK, CDC42EP3, ARFGAP1, XIAP, C2orf47, QKI, ICAM4, FLT3LG, DRICH1, PDDC1, FOXP1, NUDT16L1, UBQLN2, TOX2, AFF4, CWF19L2, GCDH, FAM184A, SUMO1, CHGB, ZNF695, LMX1A, CPLX2, MYOT, SNX13, CSPP1, GYG2, ODF2, TADA3, AQP2, DMD, GOLGA2P10, MUTED, PRELP, HLA-DPA1 y TSSK2,

b) medir el nivel de al menos un anticuerpo y, opcionalmente, el nivel de al menos un anticuerpo adicional,

c) comparar el nivel de al menos un anticuerpo, y opcionalmente el nivel de al menos un anticuerpo adicional, del individuo con un estándar de referencia positivo y comparar el nivel de al menos un anticuerpo, y opcionalmente el nivel de al menos otro anticuerpo, a una referencia negativa; y

en el que una similitud del nivel medido de al menos un anticuerpo, y opcionalmente el nivel medido de al menos un anticuerpo adicional, con el estándar de referencia positivo indica un mayor riesgo de desarrollar AR y una similitud del nivel medido de al menos un anticuerpo y, opcionalmente, el nivel medido de al menos un anticuerpo adicional con al patrón de referencia negativo indica un riesgo reducido de desarrollar AR.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende un inmunoensayo en fase sólida, en el que opcionalmente el inmunoensayo en fase sólida comprende un ELISA.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el individuo es un adulto de 23 años o más.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el individuo es un niño o un adulto joven menor de 23 años.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende una muestra de suero del receptor.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el aislamiento de al menos un anticuerpo, y opcionalmente el aislamiento de al menos un anticuerpo adicional, comprende incubar la muestra que tiene al menos un anticuerpo, y opcionalmente el aislamiento de al menos un anticuerpo adicional con uno o más elementos de captura de anticuerpos, opcionalmente en el que uno o más elementos de captura de anticuerpos comprenden un antígeno específico de anticuerpo, una perla de captura o un soporte sólido de captura,

opcionalmente, en el que el antígeno específico del anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante y un fragmento de polipéptido,

opcionalmente en el que la proteína de longitud completa, fragmento de proteína, péptido, polipéptido, péptido recombinante, proteína recombinante y un fragmento de polipéptido comprende al menos una porción o fragmento de péptido de CTLA4 y opcionalmente comprende una porción o fragmento de péptido de al menos una proteína adicional seleccionada del grupo que consiste en TRIM21, HSH2D, IFI6, APEX2, CLIP4, UBXD8, ZMYM5, EDIL3, UBE2V1, PHGDH, SCEL, ZCCHC8, C22orf33, CPSF3, C20orf96, ENG, DLG3, GAK, CDC42EP3, ARFGAP1, XIAP, C2orf47, QKI, ICAM4, FLT3LG, DRICH1, PDDC1, FOXP1, NUDT16L1, UBQLN2, TOX2, AFF4, CWF19L2, GCDH, FAM184A, SUMO1, CHGB, ZNF695, LMX1A, CPLX2, MYOT, SNX13, CSPP1, GYG2, ODF2, TADA3, AQP2, DMD, GOLGA2P10, MUTED, PRELP, HLA-DPA1 y TSSK2; o

opcionalmente en el que el antígeno específico del anticuerpo está marcado con una etiqueta de aislamiento seleccionada del grupo que consiste en biotina, una etiqueta GST, un grupo amida y una etiqueta de estreptavidina, opcionalmente en el que la etiqueta de aislamiento comprende biotina.

7. El procedimiento de las reivindicaciones 1-6, en el que uno o más elementos de captura de anticuerpos se aíslan con un elemento de captura secundario, opcionalmente, en el que el elemento de captura secundario está inmovilizado sobre un soporte sólido que comprende una perla o una placa, opcionalmente en el que el elemento de captura secundario comprende estreptavidina.

8. El procedimiento de las reivindicaciones 1-7, en el que el nivel del anticuerpo se mide mediante un elemento de detección, en el que opcionalmente el elemento de detección comprende un anticuerpo secundario marcado.

9. El procedimiento de las reivindicaciones 1-8, en el que el nivel de al menos un anticuerpo medido se compara con los estándares de referencia positivo y negativo mediante un programa informático, en el que después de la comparación, el programa informático genera una puntuación que indica la probabilidad de que un individuo tenga una respuesta de AR.

10. El procedimiento de las reivindicaciones 1-9 que comprende además la detección de un anticuerpo HLA específico del donante, en el que la presencia del anticuerpo HLA específico del donante indica un riesgo de desarrollar un AR, opcionalmente en el que la detección de un anticuerpo HLA específico del donante comprende un ensayo basado en células o un inmunoensayo en fase sólida,

opcionalmente en el que el inmunoensayo en fase sólida comprende un ensayo ELISA o Luminex y el ensayo basado en células comprende un ensayo de compatibilidad cruzada.

11. El procedimiento de las reivindicaciones 1-10, en el que el procedimiento para diagnosticar un AR en un individuo antes de recibir un trasplante de órgano sólido comprende además las etapas de realizar una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales entre un donante y un receptor de órganos, opcionalmente en el que la prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales comprende las etapas de:

a) aislar las células progenitoras de células endoteliales (ECP) del donante de una muestra de sangre del donante, b) obtención de la muestra de suero del receptor,

c) incubar los ECP aislados del donante con la muestra de suero del receptor; y

d) aislar al menos un anticuerpo de los ECP, en el que al menos un anticuerpo que se aísla de los ECP es un anticuerpo anticélulas endoteliales.

12. El procedimiento de las reivindicaciones 1-11, en el que el procedimiento para diagnosticar un AR en un individuo que ha recibido o recibirá un trasplante de órgano comprende además un ensayo basado en células, en el que el ensayo basado en células comprende una prueba de compatibilidad cruzada de CDC o un ensayo de compatibilidad cruzada por citometría de flujo.

13. El procedimiento de las reivindicaciones 1-12, en el que el individuo:

a) es positivo o negativo para anticuerpos específicos de HLA; y/o

b) da positivo o negativo en una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales; y/o

c) da positivo o negativo en una prueba de compatibilidad cruzada de los CDC.

14. Un procedimiento de determinación de un protocolo de tratamiento adecuado para un sujeto que ha recibido un trasplante de órgano, en el que se diagnostica que el sujeto tiene un AR o no tiene Ar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13,

en el que una administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de un agente terapéutico aumenta en un sujeto indicado por tener un AR, una administración de una cantidad estándar terapéuticamente eficaz de uno o más de un agente terapéutico se mantiene en un sujeto indicado por no tener AR, o la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de un agente terapéutico disminuye en un sujeto indicado por no tener un AR.

15. Un procedimiento de cribado para el desarrollo de un AR que comprende diagnosticar la presencia o ausencia de un AR en un sujeto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 después de recibir un injerto o trasplante, en el que el diagnóstico se repite, opcionalmente se repite semanalmente, mensualmente, cada dos meses, cada seis meses o anualmente.

16. Un kit de diagnóstico de un rechazo de aloinjertos (AR) en un individuo que ha recibido o recibirá un trasplante de órgano, comprendiendo el kit:

a) un elemento de captura de anticuerpos para aislar al menos un anticuerpo de una muestra biológica del individuo que forma una interacción de afinidad con al menos una porción o fragmento de péptido de CTLA4, y al menos un elemento de captura de anticuerpos adicional para aislar al menos un anticuerpo adicional de la muestra biológica del individuo que forma una interacción de afinidad con al menos una porción o fragmento de péptido de al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en TRIM21, HSH2D, IFI6, APEX2, CLIP4, UBXD8, ZMYM5, EDIL3, UBE2V1, PHGDH, SCEL, ZCCHC8, C22orf33, CPSF3, C20orf96, ENG, DLG3, GAK, CDC42EP3, ARFGAP1, XIAP, C2orf47, QKI, ICAM4, FLT3LG, DRICH1, PDDC1, FOXP1, NUDT16FL1, UBQLN2, TOX2, AFF4, CWF19L2, GCDH, FAM184A, SUMO1, CHGB, ZNF695, LMX1A, CPLX2, MYOT, SNX13, CSPP1, GYG2, ODF2, TADA3, AQP2, DMD, GOLGA2P10, MUTED, PRELP, HLA-DPA1 y TSSK2,

b) un elemento de detección para medir el nivel de al menos un anticuerpo, y al menos un elemento de detección adicional para medir el nivel de al menos un anticuerpo adicional,

c) un estándar de referencia positivo y un patrón de referencia negativo para comparar el nivel de al menos un anticuerpo, y el nivel de al menos un anticuerpo adicional, del individuo con un estándar de referencia positivo y comparar el nivel de al menos uno anticuerpo, y el nivel de al menos un anticuerpo adicional, con un estándar de referencia negativo.

17. El kit de la reivindicación 16, que además comprende uno o más de:

a) un elemento de captura secundario, en el que opcionalmente el elemento de captura secundario está inmovilizado sobre un soporte sólido que comprende una perla o una placa, en el que opcionalmente el elemento de captura secundario comprende estreptavidina;

b) un programa informático en el que el programa informático compara el nivel de al menos un anticuerpo, y el nivel de al menos un anticuerpo adicional, con los estándares de referencia positivos y negativos, y en el que, después de la comparación, el programa informático genera una puntuación indicando la probabilidad de que un individuo tenga un AR;

c) un elemento para detectar un anticuerpo HLA específico del donante, en el que la presencia del anticuerpo HLA específico del donante indica un riesgo de desarrollar un AR, opcionalmente en el que el elemento para detectar un anticuerpo HLA específico del donante comprende un ensayo basado en células o un inmunoensayo en fase sólida, en el que opcionalmente el inmunoensayo en fase sólida comprende un ensayo ELISA o Luminex; d) reactivos para realizar una prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales entre un donante y un receptor de órganos, en los que opcionalmente la prueba de compatibilidad cruzada de células endoteliales comprende un conjunto de reactivos para:

i) aislar las células progenitoras de células endoteliales (ECP) del donante a partir de una muestra de sangre del donante,

ii) obtener la muestra de suero del receptor,

iii) incubar los ECP aislados del donante con la muestra de suero del receptor; y

iv) aislar al menos un anticuerpo de los ECP,

e) reactivos para realizar un ensayo basado en células, opcionalmente en el que el ensayo basado en células comprende un ensayo de compatibilidad cruzada con CDC o un ensayo de compatibilidad cruzada con citometría de flujo.

18. El kit de la reivindicación 16 o 17, en el que el elemento de captura de anticuerpo, y al menos un elemento de captura de anticuerpo adicional, comprende un antígeno específico de anticuerpo, una perla de captura o un soporte sólido de captura;

opcionalmente, en el que el antígeno específico de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

una proteína de longitud completa, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un péptido recombinante, una proteína recombinante y un fragmento de polipéptido;

opcionalmente, en el que el antígeno específico del anticuerpo está marcado con una etiqueta de aislamiento seleccionada del grupo que consiste en biotina, una etiqueta de GST, un grupo amida y una etiqueta de estreptavidina,

opcionalmente en el que la etiqueta de aislamiento comprende biotina.

19. El kit de las reivindicaciones 17-18, en el que el elemento de detección comprende un anticuerpo secundario, opcionalmente un anticuerpo secundario marcado.

20. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 16-19, en el que el kit es un inmunoensayo en fase sólida, en el que opcionalmente el inmunoensayo en fase sólida es un ELISA.