ES2846809T3

ES2846809T3 - Métodos y composiciones relacionadas con el uso de tensioactivos de bajo HLB en la producción de nanovehículos sintéticos que comprenden un rapalogo

Info

Publication number: ES2846809T3
Application number: ES15798601T
Authority: ES
Inventors: Conlin O'neil; Aaron Griset; David Altreuter
Original assignee: Selecta Biosciences Inc
Current assignee: Cartesian Therapeutics Inc
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2021-07-29
Anticipated expiration: 2035-11-05
Also published as: LT3215133T; IL280518B; IL283699A; JP2021143180A; DK3215192T3; EP3906918A1; EP4360633A2; MX2017005903A; WO2016073798A1; AU2021209204A1; EP3834823A1; EA201790977A1; IL295292B1; US20250152561A1; CN115212187A; JP2017533243A; CN107072964A; MX386982B; EP4356910A3; CN107072965A

Abstract

Una composición que comprende nanovehículos sintéticos que comprenden: un material vehículo hidrófobo, un rapalogo, y un tensioactivo no iónico con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10; en donde la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es >= 0,01 pero <= 20% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/peso de material vehículo hidrófobo, preferiblemente en donde la composición es esterilizable por filtración inicialmente a través de un filtro de 0,22 μm.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones relacionadas con el uso de tensioactivos de bajo HLB en la producción de nanovehículos sintéticos que comprenden un rapalogo

Campo de la invención

Esta invención se refiere a nanovehículos sintéticos y composiciones y métodos relacionados, que comprenden un material vehículo hidrófobo, un rapalogo y un tensioactivo no iónico con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10.

Resumen de la invención

Se proporcionan en el presente documento nanovehículos sintéticos que pueden inhibir o reducir la respuesta inmunitaria a un antígeno, tal como un antígeno coadministrado. Los nanovehículos sintéticos comprenden un material vehículo hidrófobo, un rapalogo y un tensioactivo no iónico con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10. Se ha descubierto sorprendentemente que el uso de dicho tensioactivo no iónico en la formulación durante la formación de nanovehículos sintéticos puede dar como resultado nanovehículos sintéticos con estabilidad y rendimiento mejorados.

En un aspecto, se proporciona una composición que comprende nanovehículos sintéticos que comprenden un material vehículo hidrófobo, un rapalogo y un tensioactivo no iónico con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10, en donde la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es > 0,01 pero < 20% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo.

En una realización de cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, los pesos son los pesos de receta de los materiales que se combinan durante la formulación de los nanovehículos sintéticos. En una realización de cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, los pesos son los pesos de los materiales en la composición de nanovehículos sintéticos resultante. En una realización de cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, los pesos son los pesos de receta de los materiales que se combinan durante la formulación de los nanovehículos sintéticos. En una realización de cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, los pesos son los pesos de los materiales en la composición de nanovehículos sintéticos resultante.

En otro aspecto, se proporciona un kit que comprende una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento. En una realización de uno cualquiera de los kits proporcionados, la composición es para usar en uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento. En una realización de uno cualquiera de los kits proporcionados, cuando la composición no comprende antígeno, el kit comprende además un antígeno. En una realización de uno cualquiera de los kits proporcionados, la composición y el antígeno están contenidos en recipientes separados. En una realización de uno cualquiera de los kits proporcionados, la composición y el antígeno están contenidos en el mismo recipiente. En una realización de uno cualquiera de los kits proporcionados, el kit comprende además instrucciones de uso. En una realización de uno cualquiera de los kits proporcionados, las instrucciones de uso incluyen una descripción de uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento.

En otro aspecto, se proporciona un método que comprende administrar una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento a un sujeto. En una realización de uno cualquiera de los métodos proporcionados, cuando la composición no comprende antígeno, el método comprende además administrar antígeno al sujeto. En una realización de uno cualquiera de los métodos proporcionados, el antígeno está comprendido en diferentes nanovehículos sintéticos. En una realización de uno cualquiera de los métodos proporcionados, el antígeno no se acopla a ningún nanovehículo sintético. En una realización de uno cualquiera de los métodos proporcionados, la administración es por administración intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

En otro aspecto, se proporciona un método para producir nanovehículos sintéticos que comprenden un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 y un rapalogo, que comprende obtener o proporcionar un material vehículo hidrófobo, obtener o proporcionar un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10, obtener o proporcionar un rapalogo, y combinar el material vehículo hidrófobo, el tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10 y el rapalogo para formar nanovehículos sintéticos, en donde la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos es > 0,01 pero < 20% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. En una realización de uno cualquiera de los métodos de producción proporcionados en el presente documento, el método comprende además disolver el material vehículo hidrófobo, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 y el rapalogo en un disolvente, obtener o proporcionar otro tensioactivo, que forma una primera y después una segunda emulsión de Ac/Ag con el material vehículo hidrófobo disuelto, tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 y rapalogo, y otro tensioactivo, mezclar la primera y segunda emulsiones de Ac/Ag y permitir que el disolvente se evapore. En una realización de uno cualquiera de los métodos de producción proporcionados en el presente documento, el disolvente es diclorometano, acetato de etilo, cloroformo o carbonato de propileno. En una realización de una cualquiera de los métodos de producción proporcionados en el presente documento, el método comprende además filtrar la composición resultante. En una realización de uno cualquiera de los métodos de producción proporcionados en el presente documento, la filtración comprende filtrar a través de un filtro de 0,22 pm.

En otro aspecto, se proporciona una composición producida por uno cualquiera de los métodos de producción proporcionados en el presente documento. El método de producción puede ser uno cualquiera de los métodos de producción proporcionados, tal como uno de los métodos ilustrados en los ejemplos.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la composición de nanovehículos sintéticos es inicialmente esterilizable por filtración a través de un filtro de 0,22 pm.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 10. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 9. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 8. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 7. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 6. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 5.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 comprende un éster de sorbitán, alcohol graso, éster de ácido graso, alcohol graso etoxilado, poloxámero, ácido graso, colesterol, derivado de colesterol o ácido biliar o sal. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 comprende SPAN 40, SPAN 20, alcohol oleílico, alcohol estearílico, palmitato de isopropilo, monoestearato de glicerol, BRIJ 52, BRIJ 93, Pluronic P-123, Pluronic L-31, ácido palmítico, ácido dodecanoico, tripalmitato de glicerilo o trilinoleato de glicerilo. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es SPAN 40.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 está encapsulado en los nanovehículos sintéticos, está presente en la superficie de los nanovehículos sintéticos, o ambos.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es > 0,1 pero < 15% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es > 1 pero < 13% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es > 1 pero < 9% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el material vehículo hidrófobo comprende uno o más polímeros o lípidos hidrófobos. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el material vehículo hidrófobo comprende uno o más polímeros hidrófobos, y en donde el uno o más polímeros hidrófobos comprenden un poliéster. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el poliéster comprende PLA, PLG, PLGA o policaprolactona. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el material vehículo hidrófobo comprende o comprende además PLA-PEG, PLGA-PEG o PCL-PEG.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de material vehículo hidrófobo en los nanovehículos sintéticos es 5-95% en peso de material vehículo hidrófobo/sólidos totales. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de material vehículo hidrófobo en los nanovehículos sintéticos es 60-95% en peso de material vehículo hidrófobo/sólidos totales.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de rapalogo es > 6 pero < 50% en peso de rapalogo/material vehículo hidrófobo. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de rapalogo es > 7 pero < 30% en peso de rapalogo/material vehículo hidrófobo. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de rapalogo es > 8 pero < 24% en peso de rapalogo/material vehículo hidrófobo.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el rapalogo está encapsulado en los nanovehículos sintéticos.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el rapalogo es rapamicina.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la composición comprende además un antígeno.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el antígeno se mezcla con los nanovehículos sintéticos en la composición.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la media de una distribución de tamaños de partículas obtenida usando dispersión dinámica de luz de los nanovehículos sintéticos es un diámetro mayor que 120 nm. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el diámetro es mayor que 150 nm. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el diámetro es mayor que 200 nm. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el diámetro es mayor que 250 nm. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el diámetro es menor que 300 nm. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el diámetro es menor que 250 nm. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el diámetro es menor que 200 nm.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados, donde el rapalogo es rapamicina, el material vehículo hidrófobo comprende PLA o PLGA y PLA-PEG, y el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es monopalmitato de sorbitán, el diámetro de los nanovehículos sintéticos es como se proporciona en una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tal como una cualquiera de las composiciones de los ejemplos. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados, donde el rapalogo es rapamicina, el material vehículo hidrófobo comprende PLA o PLGA y PLA-PEG, y el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es monopalmitato de sorbitán, el diámetro de los nanovehículos sintéticos y/o el % en peso de la rapamicina es como se proporciona en una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tal como una cualquiera de las composiciones de los ejemplos. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados, donde el rapalogo es rapamicina, el material vehículo hidrófobo comprende PLA o PLGA y PLA-PEG, y el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es monopalmitato de sorbitán, el diámetro de los nanovehículos sintéticos es como se proporciona en una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tal como una cualquiera de las composiciones de los ejemplos y/o el % en peso de la rapamicina es como se proporciona en una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tal como una cualquiera de las composiciones de los ejemplos y/o la cantidad del(de los) polímero(s) es como se proporciona en una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tal como una cualquiera de las composiciones de los ejemplos. En una realización de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados, donde el rapalogo es rapamicina, el material vehículo hidrófobo comprende PLA o PLGA y PLA-PEG, y el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es monopalmitato de sorbitán, el diámetro de los nanovehículos sintéticos es como se proporciona en una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tal como una cualquiera de las composiciones de los ejemplos y/o el % en peso de la rapamicina es como se proporciona en una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tal como una cualquiera de las composiciones de los ejemplos y/o la cantidad del(de los) polímero(s) es como se proporciona en una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tal como una cualquiera de las composiciones de los ejemplos y/o la cantidad de monopalmitato de sorbitán es como se proporciona en una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tal como una cualquiera de las composiciones de los ejemplos.

En otro aspecto, se proporciona una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tal como una cualquiera de las composiciones de los ejemplos.

En otro aspecto, se proporciona un método de fabricación de una cualquiera de las composiciones o kits proporcionados en el presente documento. En una realización, el método de fabricación comprende las etapas de uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, tales como las etapas de una cualquiera de los métodos proporcionados en los ejemplos.

En otro aspecto, se proporciona el uso de una cualquiera de las composiciones o kits proporcionados en el presente documento para la fabricación de un medicamento para promover la tolerancia inmunitaria en un sujeto. En otra realización de uno cualquiera de los usos proporcionados en el presente documento, el uso es para lograr uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento.

En otro aspecto, una cualquiera de las composiciones o kits proporcionados en el presente documento se puede usar en uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento.

En otro aspecto, se proporciona un método de fabricación de un medicamento previsto para promover la tolerancia inmunitaria. En una realización, el medicamento comprende una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra los resultados que demuestran la capacidad del nanovehículo y KLH (hemocianina de lapa californiana) coadministrados con rapamicina (RAPA) para inducir tolerancia. Se analizó en los sueros de los ratones los anticuerpos contra KLH después de cada exposición a KLH.

La Fig. 2 muestra resultados que demuestran la reducción duradera del título de anticuerpos con nanovehículos con tensioactivos de bajo HLB. El acrónimo "tSIP" se refiere a los nanovehículos como se describen.

La Fig. 3 muestra resultados que demuestran la eficacia del nanovehículo sintético+KLH en comparación con la rapamicina libre+KLH en ratones. Títulos de anticuerpos CE50 del anti-KLH el día 35 y 42 (después de 2 o 3 exposiciones a KLH sola) para ratones tratados o no con nanovehículo sintético+KLH (los símbolos representan la media geométrica ± IC del 95%). El acrónimo "NV" se refiere a nanovehículos como se describen.

La Fig. 4 muestra los protocolos de tratamiento para el ejemplo 7. El acrónimo "NC" se refiere a nanovehículos como se describen.

La Fig. 5 muestra la especificidad del antígeno de nanovehículo sintético+KLH en ratones. Títulos de anticuerpos CE50 anti-OVA el día 65 para ratones tratados o no con nanovehículo sintético+KLH (las barras representan la media geométrica ± IC del 95%). El acrónimo "NV" se refiere a nanovehículos como se describen.

Descripción detallada de la invención

Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a materiales o parámetros de procedimiento particularmente ilustrados, como tales, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el propósito únicamente de describir realizaciones particulares de la invención, y no pretende limitar el uso de terminología alternativa para describir la presente invención.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en el presente documento, ya sean antes o a continuación, se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad para todos los fines.

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye una mezcla de dos o más de dichas moléculas o una mezcla de diferentes pesos moleculares de una única especie de polímero, la referencia a "un nanovehículo sintético" incluye una mezcla de dos o más de dichos nanovehículos sintéticos o un una pluralidad de dichos nanovehículos sintéticos y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "comprenden" o variaciones del mismo tales como "comprende" o "que comprende" deben leerse para indicar la inclusión de cualquier número entero mencionado (p. ej., un aspecto, elemento, característica, propiedad, etapa o limitación del método/procedimiento) o grupo de números enteros (p. ej., aspectos, elementos, características, propiedades, etapas o limitaciones del método/procedimiento) pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, el término "que comprende" es inclusivo y no excluye números enteros o etapas del método/procedimiento adicionales no citados.

En realizaciones de una cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento, "que comprende" se puede reemplazar por "que consiste esencialmente en" o "que consiste en". La frase "que consiste esencialmente en" se usa en el presente documento para requerir el(los) número(s) entero(s) o etapas especificados, así como aquellos que no afectan materialmente al carácter o la función de la invención reivindicada. Como se usa en el presente documento, el término "que consiste" se usa para indicar solo la presencia del número entero (p. ej., una aspecto, elemento, característica, propiedad, etapa o limitación del método/procedimiento) o grupo de números enteros (p. ej., aspectos, elementos, características, propiedades, etapas o limitaciones del método/procedimiento) mencionados.

A. introducción

Se ha encontrado que los nanovehículos sintéticos que comprenden material vehículo hidrófobo en combinación con un rapalogo, tal como rapamicina, pueden ser inicialmente difíciles de esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,22 pm. El uso de dicho filtro en la producción de nanovehículos sintéticos es importante, ya que los filtros pueden eliminar bacterias a un nivel deseable y dar como resultado una composición que es más estéril, una característica beneficiosa para las composiciones usadas para la administración in vivo. Sorprendentemente, debido a la naturaleza de los dos componentes hidrófobos de dichos nanovehículos sintéticos, se ha descubierto que la incorporación de un tensioactivo no iónico, tal como el monopalmitato de sorbitán, en los nanovehículos sintéticos puede dar como resultado nanovehículos sintéticos con mejor filtrabilidad y, en algunas realizaciones, mejor carga de rapalogo y, por lo tanto, eficacia cuando se administra a un sujeto. Por consiguiente, se ha encontrado que el uso de tensioactivos no iónicos con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10 puede permitir una carga más eficaz de un rapalogo, preferiblemente uno hidrófobo, a la vez que también mejora la filtrabilidad esterilizante.

Como se muestra en los ejemplos, una serie de dichos tensioactivos aumentaban el rendimiento de las formulaciones de nanovehículos sintéticos cuando se pasaban inicialmente a través de un filtro de 0,22 pm. También se encontró que los nanovehículos sintéticos con dichos tensioactivos proporcionaban cargas más altas de rapalogo, tal como rapalogo hidrófobo, que podían proporcionar tolerancia específica de antígeno duradera en sujetos. Aunque el uso de tensioactivos de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) mayor es típico para la suspensión o disolución de agentes hidrófobos en disolventes, la introducción de dichos agentes en la fase soluble en aceite durante la formulación del nanovehículo puede no respaldar la fabricación optimizada de alta carga de rapalogo, tal como rapalogo hidrófobo, en nanovehículos. Más bien, los tensioactivos no iónicos con HLB < 10, tales como el monopalmitato de sorbitán (SPAN 40) (HLB 6,7), representan una clase de tensioactivos que ayudan a dicha optimización.

Por consiguiente, se proporcionan composiciones, y métodos relacionados con los mismos, de nanovehículos sintéticos que comprenden un material vehículo hidrófobo, un rapalogo, preferiblemente uno hidrófobo, y un tensioactivo no iónico con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10. Dichas composiciones pueden presentar una mejor filtrabilidad esterilizante inicial y, en algunas realizaciones, mejor rapalogo, tal como rapalogo hidrófobo, carga y rendimiento y se pueden usar en métodos para reducir la activación indeseada del sistema inmunitario específico de antígeno y/o promover la tolerancia específica de antígeno.

La invención se describirá ahora con más detalle a continuación.

B. Definiciones

"Administrar" o "administración" o "administra" significa proporcionar un material a un sujeto de una manera que sea farmacológicamente útil. Se pretende que el término incluya en algunas realizaciones hacer que se administre. "Hacer que se administre" significa hacer que, instar, alentar, ayudar, inducir o dirigir, directa o indirectamente, a otra parte para que administre el material.

"Mezclado" se refiere a mezclar un componente, tal como un antígeno, con otro, tal como nanovehículos sintéticos, en una composición. Los componentes que se mezclan se fabrican u obtienen por separado y se ponen juntos. Por consiguiente, los componentes no se acoplan entre sí salvo por posibles interacciones no covalentes que pueden ocurrir cuando se ponen juntos en una composición.

"Cantidad eficaz" en el contexto de una composición o dosis para la administración a un sujeto se refiere a una cantidad de la composición o dosis que produce una o más respuestas deseadas en el sujeto, por ejemplo, la generación de una respuesta inmunitaria tolerogénica específica de antígeno. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es una cantidad farmacodinámicamente eficaz. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una cantidad eficaz es cualquier cantidad de una composición o dosis proporcionada en el presente documento que produce uno o más de los efectos terapéuticos deseados y/o respuestas inmunitarias como se proporciona en el presente documento. Esta cantidad puede ser para propósitos in vitro o in vivo. Para propósitos in vivo, la cantidad puede ser una que un médico crea que puede tener un beneficio clínico para un sujeto que necesita tolerancia inmunitaria específica de antígeno. Una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento puede estar en una cantidad eficaz.

Las cantidades eficaces pueden implicar la reducción del nivel de una respuesta inmunitaria no deseada, aunque en algunas realizaciones, implica prevenir por completo una respuesta inmunitaria no deseada. Cantidades eficaces también pueden implicar retrasar la aparición de una respuesta inmunitaria no deseada. Una cantidad que es eficaz también puede ser una cantidad que produzca un criterio de valoración terapéutico deseado o un resultado terapéutico deseado. En otras realizaciones, las cantidades eficaces pueden implicar mejorar el nivel de una respuesta deseada, tal como un criterio de valoración o resultado terapéutico. Las cantidades eficaces, preferiblemente, dan como resultado una respuesta inmunitaria tolerogénica en un sujeto a un antígeno. El logro de cualquiera de los anteriores se puede controlar por métodos rutinarios.

Las cantidades eficaces dependerán, por supuesto, del sujeto particular que se esté tratando; la gravedad de una afección, enfermedad o trastorno; los parámetros individuales del paciente que incluyen la edad, condición física, tamaño y peso; la duración del tratamiento; la naturaleza de la terapia concurrente (si hubiera); la vía de administración específica y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario. Estos factores son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden abordar con sólo experimentación rutinaria. En general, se prefiere que se use una dosis máxima, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo con el buen criterio médico. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que un paciente puede insistir en una dosis más baja o una dosis tolerable por razones médicas, psicológicas o por prácticamente cualquier otra razón.

En general, las dosis de los componentes en las composiciones de la invención se refieren a la cantidad de los componentes. Alternativamente, la dosis se puede administrar basándose en el número de nanovehículos sintéticos que proporcionan la cantidad deseada.

"Antígeno" significa un antígeno de célula B o antígeno de célula T. "Tipo(s) de antígenos" significa moléculas que comparten las mismas, o sustancialmente las mismas, características antigénicas. En algunas realizaciones, los antígenos pueden ser proteínas, polipéptidos, péptidos, lipoproteínas, glicolípidos, polinucleótidos, polisacáridos o están contenidos o son expresados en células. En algunas realizaciones, tal como cuando los antígenos no están bien definidos o caracterizados, los antígenos pueden estar contenidos dentro de una preparación celular o tisular, restos celulares, exosomas celulares, medios acondicionados, etc.

"Específico de antígeno" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria que resulta de la presencia del antígeno, o parte del mismo, o que genera moléculas que reconocen o se unen específicamente al antígeno. Por ejemplo, cuando la respuesta inmunitaria es la producción de anticuerpos específicos de antígeno, se producen anticuerpos que se unen específicamente al antígeno. Como otro ejemplo, cuando la respuesta inmunitaria es la proliferación y/o actividad de células B o células T CD4+ específicas de antígeno, la proliferación y/o actividad resulta del reconocimiento del antígeno, o parte del mismo, solo o en complejo con moléculas MHC, células B, etc.

"Promedio", como se usa en el presente documento, se refiere a la media aritmética a menos que se indique lo contrario.

"Encapsular" significa encerrar al menos una porción de una sustancia dentro de un nanovehículo sintético. En algunas realizaciones, una sustancia está completamente encerrada dentro de un nanovehículo sintético. En otras realizaciones, la mayor parte o la totalidad de una sustancia que está encapsulada no está expuesta al entorno local externo al nanovehículo sintético. En otras realizaciones, no más de 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% (peso/peso) está expuesto al entorno local. La encapsulación es distinta de la absorción, la cual pone la mayor parte o la totalidad de una sustancia en una superficie de un nanovehículo sintético y deja la sustancia expuesta al entorno local externo al nanovehículo sintético. En realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el rapalogo y/o el tensioactivo no iónico con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10 se encapsulan dentro de los nanovehículos sintéticos.

"Material vehículo hidrófobo" se refiere a cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable que puede suministrar una o más moléculas (p. ej., un rapalogo y un tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10) y que tiene características hidrófobas. Dichos materiales incluyen materiales que pueden formar un nanovehículo sintético o una parte del mismo y que pueden incluir o estar cargados con una o más moléculas (p. ej., un rapalogo y un tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10). Generalmente, los materiales vehículos pueden permitir el suministro de una o más moléculas (p. ej., un rapalogo y un tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10) a un sitio objetivo o célula objetivo, la liberación controlada de uno o más moléculas y otras actividades deseadas. Los ejemplos de materiales vehículos hidrófobos incluyen, sin limitación, materiales que se pueden usar para formar nanovehículos sintéticos y que comprenden componentes hidrófobos, tales como polímeros hidrófobos, tales como poliésteres o lípidos. "Hidrófobo" se refiere a un material que no participa sustancialmente en la formación de enlace de hidrógeno con el agua. Dichos materiales son generalmente no polares, principalmente no polares o de carga neutra. Un material vehículo adecuado para las composiciones descritas en el presente documento se puede seleccionar basándose en que presente hidrofobicidad en algún nivel. Los materiales vehículos hidrófobos, por lo tanto, son aquellos que son hidrófobos en general y pueden estar compuestos completamente por componentes hidrófobos, tales como polímeros o lípidos hidrófobos. En algunas realizaciones, sin embargo, los materiales vehículos hidrófobos son hidrófobos en general y comprenden componentes hidrófobos, tales como polímeros o lípidos hidrófobos, en combinación con componentes no hidrófobos.

"Inicialmente esterilizable por filtración" se refiere a una composición de nanovehículos sintéticos que no se ha filtrado previamente pero que se puede filtrar a través de un filtro, tal como un filtro de 0,22 pm, con un rendimiento de al menos 50 gramos de nanovehículo/m2 de área superficial de la membrana del filtro. En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, el rendimiento se determina tomando un volumen de 9 ml de suspensión de nanovehículos sintéticos y poniéndolo en una jeringa de 10 ml con uno cualquiera de los filtros proporcionados en el presente documento. La suspensión de nanovehículos sintéticos se empuja entonces a través del filtro hasta que no pasan más materiales de suspensión a través del filtro. Después, el rendimiento se puede calcular en función del material que se empujó a través del filtro y el material de suspensión que queda en la jeringa. En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la composición inicialmente esterilizable por filtración no es estéril y/o no es adecuada para la administración in vivo (es decir, no es sustancialmente pura y comprende componentes solubles que son menos que deseables para la administración in vivo). En otras realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la composición inicialmente esterilizable por filtración comprende nanovehículos sintéticos que se han producido pero que no se han procesado adicionalmente para producir un material de calidad clínica. En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la composición inicialmente esterilizable por filtración no se ha filtrado previamente pero se puede filtrar a través de un filtro, tal como un filtro de 0,22 pm, con un rendimiento de al menos 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 140, 160, 200, 250, 300, 350, 500, 750, 1000 o 1500 gramos de nanovehículo/m2 de área superficial de una membrana de filtro. El filtro de 0,22 pm puede ser cualquier filtro con un tamaño de poros de 0,22 pm. Dichos filtros pueden estar hechos de una variedad de materiales, tales como polietilensulfona, poli(fluoruro de vinilideno), ésteres de celulosa mixtos, acetato de celulosa sin disolventes, celulosa regenerada, nailon, etc. Los ejemplos específicos de filtros incluyen Millipore SLGPM33R, Millipore SLGVM33RS, Millipore SLGSM33SS, Sartorius 16534, Sartorius 17764, Sartorius 17845, etc.

"Dimensión máxima de un nanovehículo sintético" significa la dimensión más grande de un nanovehículo medida a lo largo de cualquier eje del nanovehículo sintético. "Dimensión mínima de un nanovehículo sintético" significa la dimensión más pequeña de un nanovehículo sintético medida a lo largo de cualquier eje del nanovehículo sintético. Por ejemplo, para un nanovehículo sintético esferoidal, la dimensión máxima y mínima de un nanovehículo sintético sería sustancialmente idéntica y sería el tamaño de su diámetro. De manera similar, para un nanovehículo sintético cuboidal, la dimensión mínima de un nanovehículo sintético sería la más pequeña de su altura, anchura o longitud, mientras que la dimensión máxima de un nanovehículo sintético sería la mayor de su altura, anchura o longitud. En una realización, una dimensión mínima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los nanovehículos sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanovehículos sintéticos en la muestra, es igual a o mayor que 100 nm. En una realización, una dimensión máxima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los nanovehículos sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanovehículos sintéticos en la muestra, es igual a o menor que 5 pm. Preferiblemente, una dimensión mínima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los nanovehículos sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanovehículos sintéticos en la muestra, es mayor que 110 nm, más preferiblemente mayor que 120 nm, más preferiblemente mayor que 130 nm, y más preferiblemente aún mayor que 150 nm. La relación entre dimensiones de las dimensiones máxima y mínima de los nanovehículos sintéticos puede variar dependiendo de la realización. Por ejemplo, la relación entre dimensiones de las dimensiones máxima y mínima de los nanovehículos sintéticos puede variar de 1:1 a 1.000.000:1, preferiblemente de 1:1 a 100.000:1, más preferiblemente de 1:1 a 10.000:1, más preferiblemente de 1:1 a 1000:1, aún más preferiblemente de 1:1 a 100:1, y todavía más preferiblemente de 1:1 a 10:1.

Preferiblemente, una dimensión máxima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los nanovehículos sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanovehículos sintéticos en la muestra es igual o menor que 3 pm, más preferiblemente igual o menor que 2 pm, más preferiblemente igual o menor que 1 pm, más preferiblemente igual o menor que 800 nm, más preferiblemente igual o menor que 600 nm, y aún más preferiblemente igual o menor que 500 nm. En realizaciones preferidas, una dimensión mínima de al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% de los nanovehículos sintéticos en una muestra, basado en el número total de nanovehículos sintéticos en la muestra, es igual o mayor que 100 nm, más preferiblemente igual o mayor que 120 nm, más preferiblemente igual o mayor que 130 nm, más preferiblemente igual o mayor que 140 nm, y aún más preferiblemente igual o mayor que 150 nm. La medición de las dimensiones del nanovehículo sintético (p. ej., el diámetro efectivo) se puede obtener, en algunas realizaciones, suspendiendo los nanovehículos sintéticos en un medio líquido (normalmente acuoso) y usando dispersión dinámica de luz (DLS) (p. ej., usando un instrumento Brookhaven ZetaPALS). Por ejemplo, se puede diluir una suspensión de nanovehículos sintéticos de un tampón acuoso a agua purificada para lograr una concentración final de suspensión de nanovehículos sintéticos de aproximadamente 0,01 a 0,5 mg/ml. La suspensión diluida se puede preparar directamente en el interior o transferir a una cubeta adecuada para el análisis por DLS. La cubeta se puede poner en el DLS, dejar que se equilibre a la temperatura controlada y después escanear durante el tiempo suficiente para adquirir una distribución estable y reproducible basada en las entradas adecuadas para la viscosidad del medio y los índices de refracción de la muestra. Después se registra el diámetro efectivo, o la media de la distribución. La determinación de los tamaños efectivos de nanovehículos sintéticos de alta relación entre dimensiones o no esferoidales puede requerir técnicas aumentativas, tales como microscopía electrónica, para obtener medidas más precisas. "Dimensión" o "tamaño" o "diámetro" de nanovehículos sintéticos significa la media de una distribución de tamaño de partículas, por ejemplo, obtenida usando dispersión dinámica de luz.

"Tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10", o "tensioactivo de HLB bajo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula anfifílica no iónica que tiene una estructura que comprende al menos una cola hidrófoba y una cabeza hidrófila o que tiene grupos o regiones hidrófobos y grupos o regiones hidrófilas. La parte de cola de los tensioactivos generalmente consiste en una cadena de hidrocarburo. Los tensioactivos se pueden clasificar basándose en las características de carga de la parte o grupos o regiones de cabeza hidrófila. Como se usa en el presente documento, "HLB" se refiere al equilibrio hidrofílico-lipofílico o equilibrio hidrófilo-lipófilo de un tensioactivo y es una medida de la naturaleza hidrófila o lipófila de un tensioactivo.

El HLB de uno cualquiera de los tensioactivos proporcionados en el presente documento se puede calcular usando el método de Griffin o el método de Davie. Por ejemplo, usando el método de Griffin, e1HLB de un tensioactivo es el producto de 20 multiplicado por la masa molecular de la parte hidrófila del tensioactivo dividida entre la masa molecular de todo el tensioactivo. El valor de HLB está en una escala de 0 a 20, donde 0 corresponde a una molécula completamente hidrófoba (lipófila) y 20 corresponde a una molécula completamente hidrófila (lipófoba). En algunas realizaciones, el HLB del tensioactivo de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (p. ej., determinado por el Método de Griffin o Davie). Los ejemplos de dichos tensioactivos para usar en una cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento incluyen, sin limitación, ésteres de sorbitán, tales como SPAN 40, SPAN 20; alcoholes grasos, tales como alcohol oleílico, alcohol estearílico; ésteres de ácidos grasos, tales como palmitato de isopropilo, monoestearato de glicerol; alcoholes grasos etoxilados, tales como BRIJ 52, BRIJ 93; poloxámeros, tales como Pluronic P-123, Pluronic L-31; ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido dodecanoico; triglicéridos, tales como tripalmitato de glicerilo, trilinoleato de glicerilo; colesterol; derivados del colesterol, tales como colesteril-sulfato de sodio, dodecanoato de colesterilo; y sales o ácidos biliares, tales como ácido litocólico, litocolato de sodio. Otros ejemplos de dichos tensioactivos incluyen monoestearato de sorbitán (SPAN 60), triestearato de sorbitán (SPAN 65), monooleato de sorbitán (SPAN 80), sesquioleato de sorbitán (SPAN 83), trioleato de sorbitán (SPAN 85), sesquioleato de sorbitán (Arlacel 83), dipalmitato de sorbitán, mono y diglicéridos de ácidos grasos, trioleato de sorbitán polioxietilénico (Tween 85), hexaoleato de sorbitán polioxietilénico (G 1086), monoisoestearato de sorbitán (Montane 70), alcoholes polioxietilénicos, polioxietilenglicol-alquiléteres, polioxietilenglicol (2)-oleiléter (BRIJ 93), cetiléter polioxietilénico (BRIJ 52), dodeciléter de polietilenglicol (BRIJ L4); 1-monotetradecanoil-rac-glicerol; monoestearato de glicerilo; monopalmitato de glicerol; etilendiamina tetradkis-tetrol (Tetronic 90R4, Tetronic 701), nonilfeniléter polioxietilénico (5) (IGEPAL CA-520), tensioactivo MERPOL A, tensioactivo MERPOL SE y hexaoleato de poli(etilenglicol)sorbitol. Otros ejemplos también serán evidentes para un experto en la técnica.

"Excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un material farmacológicamente inactivo usado junto con un material farmacológicamente activo para formular las composiciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden una variedad de materiales conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a sacáridos (tales como glucosa, lactosa y similares), conservantes tales como agentes antimicrobianos, auxiliares de reconstitución, colorantes, solución salina (tal como solución salina tamponada con fosfato) y tampones.

"Proporcionar" significa una acción o conjunto de acciones que realiza un individuo que proporciona un artículo o conjunto de artículos o métodos necesarios para la práctica de la presente invención. La acción o el conjunto de acciones pueden considerarse directamente por sí mismas o indirectamente.

"Rapalogo" se refiere a rapamicina y moléculas que están estructuralmente relacionadas con (un análogo de) la rapamicina (sirolimus), y son preferiblemente hidrófobas. Los ejemplos de rapalogos incluyen, sin limitación, temsirolimus (CCI-779), deforolimus, everolimus (RAD001), ridaforolimus (AP-23573), zotarolimus (ABT-578). Se pueden encontrar ejemplos adicionales de rapalogos, por ejemplo, en la publicación WO WO 1998/002441 y la patente de EE.UU. n° 8.455.510, cuya descripción de rapalogos se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

"Disolvente" se refiere a una sustancia que puede disolver un soluto, tal como uno cualquiera o más de los componentes de los nanovehículos sintéticos como se proporcionan en el presente documento. En algunas realizaciones, los disolventes son aquellos que son útiles en la formación de nanovehículos sintéticos, tal como en un procedimiento de emulsión (p. ej., un procedimiento de doble emulsión). Los ejemplos de dichos disolventes incluyen diclorometano, acetato de etilo, cloroformo y carbonato de propileno. Los ejemplos también incluyen mezclas de disolventes que son una combinación de un disolvente orgánico de baja solubilidad en agua y un disolvente miscible con agua, tal como acetona, etanol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, formamida, etc. Los expertos en la técnica conocerán más ejemplos.

"Sujeto" significa animales, que incluyen mamíferos de sangre caliente tales como seres humanos y primates; aves; animales domésticos o de granja tales como gatos, perros, ovejas, cabras, vacas, caballos y cerdos; animales de laboratorio tales como ratones, ratas y cobayas; peces; reptiles; animales de zoológico y salvajes; y similares.

"Tensioactivo" se refiere a un compuesto que puede reducir la tensión superficial entre dos líquidos o entre un líquido y un sólido. Los tensioactivos pueden actuar como detergentes, agentes humectantes, emulsionantes, agentes espumantes y dispersantes y se pueden usar en la formación de nanovehículos sintéticos como se proporciona en el presente documento. En algunas realizaciones, los tensioactivos son tensioactivos no iónicos con un valor de HLB menor o igual a 10.

"Nanovehículo(s) sintético(s)" significa un objeto discreto que no se encuentra en la naturaleza y que tiene al menos una dimensión que es menor o igual a 5 micrómetros de tamaño. Como se proporciona en el presente documento, los nanovehículos sintéticos comprenden un material vehículo hidrófobo. Por consiguiente, un nanovehículo sintético puede ser, pero no se limita a nanovehículos sintéticos que comprenden nanopartículas poliméricas hidrófobas así como nanopartículas basadas en lípidos. Los nanovehículos sintéticos pueden tener una variedad de formas diferentes, que incluyen, pero no se limitan a esferoidales, cuboidales, piramidales, oblongos, cilíndricos, toroidales y similares. Los nanovehículos sintéticos según la invención comprenden una o más superficies. En realizaciones, los nanovehículos sintéticos pueden tener una relación entre dimensiones mayor que 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 o mayor que 1:10.

Los nanovehículos sintéticos según la invención que tengan una dimensión mínima igual o menor que aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual o menor que 100 nm, no comprenden una superficie con grupos hidroxilo que activan el complemento o alternativamente comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no son grupos hidroxilo que activan el complemento. En una realización preferida, los nanovehículos sintéticos de acuerdo con la invención que tienen una dimensión mínima igual o menor que aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual o menor que 100 nm, no comprenden una superficie que activa sustancialmente el complemento o, alternativamente, comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no activan sustancialmente el complemento. En una realización más preferida, los nanovehículos sintéticos según la invención que tienen una dimensión mínima igual o menor que aproximadamente 100 nm, preferiblemente igual o menor que 100 nm, no comprenden una superficie que activa el complemento o alternativamente comprenden una superficie que consiste esencialmente en restos que no activan el complemento.

"Sólidos totales" se refiere al peso total de todos los componentes contenidos en una composición o suspensión de nanovehículos sintéticos. En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de sólidos totales se determina como la masa total del nanovehículo seco por ml de suspensión. Esto se puede determinar por un método gravimétrico.

"% En peso" se refiere a la relación de un peso a otro peso multiplicado por 100. Por ejemplo, el % en peso puede ser la relación del peso de un componente al otro multiplicado por 100 o la relación del peso de un componente a un peso total de más de un componente multiplicado por 100. Generalmente, el % en peso se mide como un promedio de una población de nanovehículos sintéticos o un promedio de los nanovehículos sintéticos en una composición o suspensión.

C. Composiciones y métodos relacionados

Se proporcionan en el presente documento composiciones de nanovehículos sintéticos con mejor filtrabilidad esterilizante inicial y, en algunas realizaciones, mejor carga de rapalogo y, por lo tanto, eficacia cuando se administran a un sujeto. Dichos nanovehículos sintéticos comprenden un material vehículo hidrófobo así como un rapalogo, que es preferiblemente hidrófobo. Sorprendentemente, se encontró que una cierta clase de tensioactivos, tensioactivos no iónicos con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10, eran capaces de permitir una mejor filtrabilidad esterilizante inicial y, en algunas realizaciones, cargas de rapalogos más eficaces en nanovehículos sintéticos. Como se muestra en los ejemplos, se encontró un mayor rendimiento de las composiciones de nanovehículos sintéticos, cuando se pasaron inicialmente a través de un filtro de 0,22 pm, cuando se incorporaron tensioactivos, como SPAN 40, en las composiciones de nanovehículos sintéticos. Como también se muestra en los ejemplos, una serie de dichos nanovehículos sintéticos formulados con un tensioactivo no iónico con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10 también pudieron proporcionar tolerancia duradera específica de antígeno en sujetos.

También se han descubierto cantidades optimizadas del tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos es > 0,01 pero < 20% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad del tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos es > 0,1 pero < 15, > 0,5 pero < 13, > 1 pero < 9 o 10% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. En otras realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad del tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos es > 0,01 pero < 17, > 0,01 pero < 15, > 0,01 pero < 13, > 0,01 pero < 12, > 0,01 pero < 11, > 0,01 pero < 10, > 0,01 pero < 9, > 0,01 pero < 8, > 0,01 pero < 7, > 0,01 pero < 6, > 0,01 pero < 5% en peso etc., de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. En otras realizaciones más de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad del tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos es > 0,1 pero < 15, > 0,1 pero < 14, > 0,1 pero < 13, > 0,1 pero < 12, > 0,1 pero < 11, > 0,1 pero < 10, > 0,1 pero < 9, > 0,1 pero < 8, > 0,1 pero < 7, > 0,1 pero < 6, > 0,1 pero < 5% en peso etc., de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. En otras realizaciones más de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad del tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos es > 0,5 pero < 15, > 0,5 pero < 14, > 0,5 pero < 13, > 0,5 pero < 12, > 0,5 pero < 11, > 0,5 pero < 10, > 0,5 pero < 9, > 0,5 pero < 8, > 0,5 pero < 7, > 0,5 pero < 6, > 0,5 pero < 5% en peso etc., de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. En otras realizaciones más de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad del tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos es > 1 pero < 9, > 1 pero < 8, > 1 pero < 7, > 1 pero < 6, > 1 pero < 5% en peso etc., de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. En otras realizaciones más de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad del tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos es > 5 pero < 15, > 5 pero < 14, > 5 pero < 13, > 5 pero < 12, > 5 pero < 11, > 5 pero < 10, > 5 pero < 9, > 5 pero < 8, > 5 pero < 7, > 5 pero < 6% en peso etc. de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad del tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/material vehículo hidrófobo. Cualquiera de los valores de HLB proporcionados en el presente documento se puede determinar usando el método de Griffin o Davie.

También se han determinado las cantidades optimizadas del material vehículo hidrófobo en las composiciones de nanovehículos sintéticos. Preferiblemente, en algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad del material vehículo hidrófobo en la composición de nanovehículos sintéticos es 5-95% en peso de material vehículo hidrófobo/sólidos totales. En otras realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad del material vehículo hidrófobo en los nanovehículos sintéticos es 10-95, 15-90, 20-90, 25-90, 30-80, 30-70, 30-60, 30-50% en peso etc. de material vehículo hidrófobo/sólidos totales. En otras realizaciones más de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, la cantidad de materiales vehículo hidrófobos en los nanovehículos sintéticos es 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95% en peso de material vehículo hidrófobo/sólidos totales.

Además, la cantidad de rapalogo, tal como rapamicina, en los nanovehículos sintéticos también se puede optimizar. Preferiblemente, dichas cantidades pueden producir resultados eficaces (p. ej., tolerancia específica de antígeno duradera) cuando se administran a un sujeto los nanovehículos sintéticos. En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, los nanovehículos sintéticos comprenden > 6 pero < 50% en peso de rapalogo/material vehículo hidrófobo. En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, los nanovehículos sintéticos comprenden > 6 pero < 45, > 6 pero < 40, > 6 pero < 35, > 6 pero < 30, > 6 pero < 25, > 6 pero < 20, > 6 pero < 15% en peso de rapalogo/material vehículo hidrófobo. En otras realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, los nanovehículos sintéticos comprenden > 7 pero < 45, > 7 pero < 40, > 7 pero < 35, > 7 pero < 30, > 7 pero < 25, > 7 pero < 20, > 7 pero < 15% en peso de rapalogo/material vehículo hidrófobo. En otras realizaciones más de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, los nanovehículos sintéticos comprenden > 8 pero < 24% en peso de rapalogo/material vehículo hidrófobo. En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, los nanovehículos sintéticos comprenden 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 35, 45% en peso o más de rapalogo/material vehículo hidrófobo.

Las cantidades de componentes o materiales como se citan en el presente documento para una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento se pueden determinar usando métodos conocidos por los expertos en la técnica o proporcionados de otro modo en el presente documento. Por ejemplo, las cantidades del tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10 se pueden medir por extracción seguida de cuantificación por un método de HPLC. Las cantidades de material vehículo hidrófobo se pueden determinar usando HPLC. La determinación de dicha cantidad, en algunas realizaciones, puede seguir el uso de RMN de protón u otros métodos ortogonales, tales como MALDI-MS, etc. para determinar la identidad de un material vehículo hidrófobo. Se pueden usar métodos similares para determinar las cantidades de rapalogo en una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones, la cantidad de rapalogo se determina usando HPLC. Otros ejemplos de métodos para determinar cantidades de componentes o materiales se proporcionan en otra parte de este documento, tal como en los ejemplos. Para una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, las cantidades de los componentes o materiales también se pueden determinar basándose en los pesos de la receta de una formulación de nanovehículo. Por consiguiente, en algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, las cantidades de uno cualquiera de los componentes proporcionados en el presente documento son las de los componentes en una fase acuosa durante la formulación de los nanovehículos sintéticos. En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento, las cantidades de uno cualquiera de los componentes son las de los componentes en una composición de nanovehículos sintéticos que se produce y el resultado de un procedimiento de formulación.

Los nanovehículos sintéticos como se proporcionan en el presente documento comprenden materiales vehículo hidrófobos, tales como polímeros hidrófobos o lípidos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los nanovehículos sintéticos proporcionados en el presente documento comprenden uno o más lípidos. En algunas realizaciones, un nanovehículo sintético puede comprender una bicapa lipídica. En algunas realizaciones, un nanovehículo sintético puede comprender una monocapa lipídica. En algunas realizaciones, un nanovehículo sintético puede comprender un núcleo que comprende una matriz polimérica rodeada por una capa lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.). Otros materiales vehículo hidrófobos incluyen lípidos (sintéticos y naturales), conjugados lípido-polímero, conjugados lípido-proteína y aceites reticulables, ceras, grasas, etc. Se pueden encontrar más ejemplos de materiales lipídicos para usar como materiales vehículo hidrófobos como se proporciona en el presente documento, por ejemplo, en la publicación PCT N° W02000/006120 y WO2013/056132, incorporándose las descripciones de dichos materiales en el presente documento por referencia en su totalidad.

Por consiguiente, en algunas realizaciones los nanovehículos sintéticos proporcionados en el presente documento pueden ser liposomas. Los liposomas se pueden producir por métodos convencionales tales como los descritos por Kim et al. (1983, Biochim. Biophys. Acta 728, 339-348); Liu et al. (1992, Biochim. Biophys. Acta 1104, 95-101); Lee et al. (1992, Biochim. Biophys. Acta. 1103, 185-197), Brey et al. (publicación de solicitud de patente de EE.UU.

20020041861), Hass et al. (publicación de solicitud de patente de EE.UU. 20050232984), Kisak et al. (publicación de solicitud de patente de EE.UU. 20050260260) y Smyth-Templeton et al. (publicación de solicitud de patente de EE.UU.

20060204566), la descripción de dichos liposomas y los métodos para su producción se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad.

El material vehículo hidrófobo como se proporciona en el presente documento comprende uno o más polímeros hidrófobos o unidades de los mismos. Sin embargo, en algunas realizaciones, aunque el material vehículo hidrófobo es hidrófobo en general, el material vehículo hidrófobo también puede comprender polímeros o unidades de los mismos que no son hidrófobos.

Por consiguiente, el material vehículo hidrófobo como se proporciona en el presente documento puede comprender poliésteres, tales como poliésteres hidrófobos. Los poliésteres incluyen copolímeros que comprenden unidades de ácido láctico y ácido glicólico, tales como poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) y poli(lactida-co-glicólido), denominados colectivamente en el presente documento "PLGA"; y homopolímeros que comprenden unidades de ácido glicólico, denominados en el presente documento "PGA", y unidades de ácido láctico, tales como poli-ácido L-láctico, poli-ácido D-láctico, poli-ácido D,L-láctico, poli-L-láctida, poli-D-lactida y poli-D,L-lactida, denominadas colectivamente en el presente documento como "PLA". En algunas realizaciones, los poliésteres de ejemplo incluyen, por ejemplo, polihidroxiácidos; copolímeros de PEG y copolímeros de lactida y glicólido (p. ej., copolímeros de PLA-PEG, copolímeros de PGA-PEG, copolímeros de PLGA-PEG y derivados de los mismos. En algunas realizaciones, los poliésteres incluyen, por ejemplo, poli(caprolactona), copolímeros de poli(caprolactona)-PEG, poli(L-lactida-co-L-lisina), poli(éster de serina), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina), poli[ácido a-(4-aminobutil)-L-glicólico] y derivados de los mismos.

En algunas realizaciones, un polímero del material vehículo hidrófobo puede ser PLGA. El PLGA es un copolímero biocompatible y biodegradable de ácido láctico y ácido glicólico, y varias formas de PLGA se caracterizan por la relación de ácido láctico:ácido glicólico. El ácido láctico puede ser ácido L-láctico, ácido D-láctico o ácido D,L-láctico. La velocidad de degradación del PLGA se puede ajustar alterando la relación de ácido láctico:ácido glicólico. En algunas realizaciones, el PLGA que se usa de acuerdo con la presente invención se caracteriza por una relación de ácido láctico:ácido glicólico de aproximadamente 85:15, aproximadamente 75:25, aproximadamente 60:40, aproximadamente 50:50, aproximadamente 40:60, aproximadamente 25:75, o aproximadamente 15:85.

Los materiales vehículo hidrófobos como se proporcionan en el presente documento pueden comprender uno o más polímeros que son un polímero plurónico no terminado en metoxi, o una unidad del mismo. "Polímero no terminado en metoxi" significa un polímero que tiene al menos un extremo que termina con un resto distinto de metoxi. En algunas realizaciones, el polímero tiene al menos dos extremos que terminan con un resto distinto de metoxi. En otras realizaciones, el polímero no tiene extremos que terminen con metoxi. "Polímero plurónico no terminado en metoxi" significa un polímero distinto de un polímero plurónico lineal con metoxi en ambos extremos.

Los materiales vehículo hidrófobos pueden comprender, en algunas realizaciones, polihidroxialcanoatos, poliamidas, poliéteres, poliolefinas, poliacrilatos, policarbonatos, poliestireno, siliconas, fluoropolímeros o una unidad de los mismos. Otros ejemplos de polímeros que pueden estar comprendidos en los materiales vehículo hidrófobos proporcionados en el presente documento incluyen policarbonato, poliamida o poliéter, o una unidad de los mismos. En otras realizaciones, los polímeros del material vehículo hidrófobo pueden comprender poli(etilenglicol) (PEG), polipropilenglicol o una unidad de los mismos.

En algunas realizaciones, se prefiere que el material vehículo hidrófobo comprenda polímero que es biodegradable. Por lo tanto, en dichas realizaciones, los polímeros de los materiales vehículos hidrófobos pueden incluir un poliéter, tal como poli(etilenglicol) o polipropilenglicol o una unidad de los mismos. Además, el polímero puede comprender un copolímero de bloques de un poliéter y un polímero biodegradable de manera que el polímero sea biodegradable. En otras realizaciones, el polímero no comprende únicamente un poliéter o una unidad del mismo, tal como poli(etilenglicol) o polipropilenglicol o una unidad de los mismos.

Otros ejemplos de polímeros adecuados para usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a polietilenos, policarbonatos (p. ej., poli(1,3-dioxan-2-ona)), polianhídridos (p. ej., poli(anhídrido sebácico)), poli(fumeratos de propilo), poliamidas (p. ej., policaprolactama), poliacetales, poliéteres, poliésteres (p. ej., polilactida, poliglicólido, polilactida-co-glicólido, policaprolactona, polihidroxiácido (p. ej., poli(p-hidroxialcanoato))), poli(ortoésteres), policianoacrilatos, poli(alcoholes vinílicos), poliuretanos, polifosfazenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliureas, poliestirenos y poliaminas, polilisina, copolímeros de polilisina-PEG y poli(etilenimina), copolímeros de poli(etilenimina) -PEG.

Otros ejemplos más de polímeros que se pueden incluir en un material vehículo hidrófobo incluyen polímeros acrílicos, por ejemplo, copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de metacrilato de aminoalquilo, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), copolímero de alquilamida de ácido metacrílico, poli(metacrilato de metilo), poli(anhídrido de ácido metacrílico), metacrilato de metilo, polimetacrilato, copolímero de poli(metacrilato de metilo), poliacrilamida, copolímero de metacrilato de aminoalquilo, copolímeros de metacrilato de glicidilo, policianoacrilatos, y combinaciones que comprenden uno o más de los polímeros anteriores.

En algunas realizaciones, los polímeros del material vehículo hidrófobo se pueden asociar para formar una matriz polimérica. Se conocen convencionalmente una amplia variedad de polímeros y métodos para formar matrices poliméricas a partir de ellos. En algunas realizaciones, un nanovehículo sintético que comprende una matriz polimérica hidrófoba genera un entorno hidrófobo dentro del nanovehículo sintético.

En algunas realizaciones, los polímeros se pueden modificar con uno o más restos y/o grupos funcionales. Se puede usar una variedad de restos o grupos funcionales de acuerdo con la presente invención. En algunas realizaciones, los polímeros se pueden modificar con polietilenglicol (PEG), con un carbohidrato y/o con poliacetales acíclicos derivados de polisacáridos (Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786: 301). Se pueden hacer determinadas realizaciones usando las enseñanzas generales de la patente de EE.UU. n° 5543158 de Gref et al., o la publicación WO WO2009/051837 de Von Andrian et al.

En algunas realizaciones, los polímeros se pueden modificar con un grupo lípido o ácido graso. En algunas realizaciones, un grupo de ácido graso puede ser uno o más de ácido butírico, caproico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico, behénico o lignocérico. En algunas realizaciones, un grupo de ácido graso puede ser uno o más de ácido palmitoleico, oleico, vaccénico, linoleico, alfa-linoleico, gamma-linoleico, araquidónico, gadoleico, araquidónico, eicosapentaenoico, docosahexaenoico o erúcico.

En algunas realizaciones, se prefiere que el polímero sea biodegradable. En algunas realizaciones, los polímeros de acuerdo con la presente invención incluyen polímeros que han sido aprobados para su uso en seres humanos por la Administración de Medicamentos y Alimentos de EE.u U. (FDA) bajo 21 C.F.R. § 177.2600.

Los polímeros pueden ser polímeros naturales o no naturales (sintéticos). Los polímeros pueden ser homopolímeros o copolímeros que comprenden dos o más monómeros. En términos de secuencia, los copolímeros pueden ser aleatorios, de bloques o comprender una combinación de secuencias aleatorias y de bloques. Típicamente, los polímeros de acuerdo con la presente invención son polímeros orgánicos.

En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser polímeros lineales o ramificados. En algunas realizaciones, los polímeros pueden ser dendrímeros. En algunas realizaciones, los polímeros se pueden reticular sustancialmente entre sí. En algunas realizaciones, los polímeros pueden estar sustancialmente exentos de reticulaciones. En algunas realizaciones, se pueden usar polímeros de acuerdo con la presente invención sin someterse a una etapa de reticulación. Además, debe entenderse que los nanovehículos sintéticos pueden comprender copolímeros de bloque, copolímeros de injerto, combinaciones, mezclas y/o aductos de cualquiera de los polímeros anteriores y otros. Los expertos en la técnica reconocerán que los polímeros citados en el presente documento representan una lista ilustrativa, no completa, de polímeros que pueden ser útiles de acuerdo con la presente invención siempre que cumplan los criterios deseados.

Las propiedades de estos y otros polímeros y los métodos para prepararlos son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.123.727; 5.804.178; 5.770.417; 5.736.372; 5.716.404; 6.095.148; 5.837.752; 5.902.599; 5.696.175; 5.514.378; 5.512.600; 5.399.665; 5.019.379; 5.010.167; 4.806.621; 4.638.045; y 4.946.929; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; y Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181). Más generalmente, se describe una variedad de métodos para sintetizar ciertos polímeros adecuados en la Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. de Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization de Odian, John Wiley & Sons, Cuarta Edición, 2004; Contemporary Polymer Chemistry de Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; y en las patentes de EE.UU.

6.506.577, 6.632.922, 6.686.446 y 6.818.732.

Se puede usar una amplia variedad de nanovehículos sintéticos según la invención. En algunas realizaciones, los nanovehículos sintéticos son esferas o esferoides. En algunas realizaciones, los nanovehículos sintéticos son planos o en forma de placa. En algunas realizaciones, los nanovehículos sintéticos son cubos o cúbicos. En algunas realizaciones, los nanovehículos sintéticos son ovalados o elipses. En algunas realizaciones, los nanovehículos sintéticos son cilindros, conos o pirámides.

En algunas realizaciones, es deseable usar una población de nanovehículos sintéticos que sea relativamente uniforme en términos de tamaño o forma, de modo que cada nanovehículo sintético tenga propiedades similares. Por ejemplo, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de los nanovehículos sintéticos, basado en el número total de nanovehículos sintéticos, puede tener una dimensión mínima o dimensión máxima que se encuentra dentro del 5%, 10% o 20% del diámetro medio o dimensión media de los nanovehículos sintéticos.

Las composiciones de acuerdo con la invención pueden comprender elementos en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como conservantes, tampones, solución salina o solución salina tamponada con fosfato. Las composiciones se pueden preparar usando técnicas de fabricación y composición farmacéuticas convencionales para llegar a formas farmacéuticas útiles. En una realización, las composiciones, tales como las que comprenden los nanovehículos sintéticos, se suspenden en una solución salina estéril para inyección junto con un conservante.

En algunas realizaciones, se puede aislar cualquier componente de los nanovehículos sintéticos como se proporciona en el presente documento. Aislado se refiere a que el elemento se separa de su entorno nativo y está presente en cantidades suficientes para permitir su identificación o uso. Esto significa, por ejemplo, que el elemento se puede purificar por cromatografía o electroforesis. Los elementos aislados pueden ser sustancialmente puros, pero no es necesario que lo sean. Debido a que un elemento aislado se puede mezclar con un excipiente farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, el elemento puede comprender solo un pequeño porcentaje en peso de la preparación. No obstante, el elemento está aislado en cuanto que se ha separado de las sustancias con las que puede estar asociado en los sistemas vivos, es decir, aislado de otros lípidos o proteínas. Cualquiera de los elementos proporcionados en el presente documento se puede aislar e incluir en las composiciones o usar en los métodos en forma aislada.

D. Métodos de fabricación y uso de las composiciones y métodos relacionados

Los nanovehículos sintéticos se pueden preparar usando una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los nanovehículos sintéticos se pueden formar por métodos tales como nanoprecipitación, enfoque de flujo usando canales fluídicos, secado por atomización, evaporación de disolvente de emulsión simple y doble, extracción de disolvente, separación de fases, molienda (incluyendo criomolienda), procesamiento de fluido supercrítico (tal como dióxido de carbono supercrítico), procedimientos de microemulsión, microfabricación, nanofabricación, capas de sacrificio, coacervación simple y compleja y otros métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Alternativa o adicionalmente, se han descrito síntesis en disolventes acuosos y orgánicos para nanomateriales semiconductores monodispersos, conductores, magnéticos, orgánicos y otros (Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; y Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). Se han descrito métodos adicionales en la bibliografía (véase, p. ej., Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; y Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; patentes de EE.UU.

5578325 y 6007845; P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)).

Diversos materiales se pueden encapsular en nanovehículos sintéticos según sea conveniente usando una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a C. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pág. 247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8- 21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010). Se pueden usar otros métodos adecuados para encapsular materiales en nanovehículos sintéticos, incluyendo sin limitación métodos descritos en la patente de Estados Unidos 6.632.671 de Unger expedida el 14 de octubre, 2003.

En determinadas realizaciones, los nanovehículos sintéticos se preparan por un procedimiento de nanoprecipitación o secado por atomización. Las condiciones usadas en la preparación de nanovehículos sintéticos se pueden alterar para producir partículas de un tamaño o propiedad deseados (p. ej., hidrofobicidad, hidrofilicidad, morfología externa, "pegajosidad", forma, etc.). El método de preparación de los nanovehículos sintéticos y las condiciones (p. ej., disolvente, temperatura, concentración, caudal de aire, etc.) usadas pueden depender de los materiales que se van a incluir en los nanovehículos sintéticos y/o la composición de la matriz del vehículo.

Si los nanovehículos sintéticos preparados por cualquiera de los métodos anteriores tienen un intervalo de tamaños fuera del intervalo deseado, dichos nanovehículos sintéticos se pueden ajustar de tamaño, por ejemplo, usando un tamiz.

En realizaciones, los nanovehículos sintéticos se pueden combinar con un antígeno u otra composición mezclándolos en el mismo vehículo o sistema de suministro.

Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden comprender tampones inorgánicos u orgánicos (p. ej., sales de sodio o potasio de fosfato, carbonato, acetato o citrato) y agentes de ajuste de pH (p. ej., ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o potasio, sales de citrato o acetato, aminoácidos y sus sales) antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, alfa-tocoferol), tensioactivos (p. ej., polisorbato 20, polisorbato 80, polioxietilen9-10 nonilfenol, desoxicolato de sodio), estabilizantes en solución y/o crio/lioestabilizantes (p. ej., sacarosa, lactosa, manitol, trehalosa), agentes de ajuste osmótico (p. ej., sales o azúcares), agentes antibacterianos (p. ej., ácido benzoico, fenol, gentamicina), agentes antiespumantes (p. ej., polidimetilsilozona), conservantes (p. ej., timerosal, 2-fenoxietanol, EDTA), estabilizantes poliméricos y agentes de ajuste de la viscosidad (p. ej., polivinilpirrolidona, poloxámero 488, carboximetilcelulosa) y codisolventes (p. ej., glicerol, polietilenglicol, etanol).

Las composiciones según la invención pueden comprender excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones se pueden preparar usando técnicas de fabricación y composición farmacéuticas convencionales para llegar a formas farmacéuticas útiles. Las técnicas adecuadas para usar en la práctica de la presente invención se pueden encontrar en Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, editado por Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng y Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; y Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2a ed. Editado por M. E. Auten, 2001, Churchill Livingstone. En una realización, las composiciones se suspenden en una solución salina estéril para inyección junto con un conservante.

Debe entenderse que las composiciones de la invención se pueden preparar de cualquier manera adecuada, y la invención no se limita de ninguna manera a las composiciones que se pueden producir usando los métodos descritos en el presente documento. La selección de un método de fabricación adecuado puede requerir atención a las propiedades de los elementos particulares que se asocian.

En algunas realizaciones, las composiciones se fabrican en condiciones estériles o se esterilizan inicial o terminalmente. Esto puede garantizar que las composiciones resultantes son estériles y no infecciosas, mejorando así la seguridad en comparación con composiciones no estériles. Esto proporciona una medida de seguridad valiosa, especialmente cuando los sujetos que reciben las composiciones tienen defectos inmunitarios, padecen una infección y/o son susceptibles a la infección. En algunas realizaciones, las composiciones se pueden liofilizar y almacenar en suspensión o como polvo liofilizado dependiendo de la estrategia de formulación, durante períodos prolongados sin perder actividad.

La administración de acuerdo con la presente invención puede ser por una variedad de vías, que incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa e intraperitoneal. Las composiciones a las que se hace referencia en el presente documento se pueden fabricar y preparar para su administración usando métodos convencionales.

Las composiciones de la invención se pueden administrar en cantidades eficaces, tales como las cantidades eficaces descritas en otra parte del presente documento. Las dosis de formas farmacéuticas pueden contener cantidades variables de elementos según la invención. La cantidad de elementos presentes en las formas farmacéuticas de la invención se puede variar de acuerdo con su naturaleza, el beneficio terapéutico que se quiere conseguir y otros parámetros similares. En realizaciones, se pueden llevar a cabo estudios de intervalo de dosis para establecer cantidades terapéuticas óptimas que deben estar presentes en la forma farmacéutica. En realizaciones, los elementos están presentes en la forma farmacéutica en una cantidad eficaz para generar un efecto deseado y/o una respuesta inmunitaria reducida tras la administración a un sujeto. Puede ser posible determinar cantidades para lograr un resultado deseado usando estudios y técnicas convencionales de intervalos de dosis en sujetos. Las formas farmacéuticas de la invención se pueden administrar con una variedad de frecuencias. En una realización, al menos una administración de las composiciones proporcionadas en el presente documento es suficiente para generar una respuesta farmacológicamente relevante.

Otro aspecto de la descripción se refiere a los kits. En algunas realizaciones, el kit comprende una cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones de una cualquiera de los kits proporcionados, el kit comprende un rapalogo, un material vehículo hidrófobo y tensioactivo no iónico con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los kits proporcionados, las cantidades de rapalogo, material vehículo hidrófobo y tensioactivo no iónico con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10 están en cualquiera de las cantidades proporcionadas en el presente documento para ese componente, respectivamente. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los kits proporcionados, el kit comprende además un antígeno. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los kits proporcionados, las composiciones o elementos de las mismas pueden estar contenidos en recipientes separados o en el mismo recipiente en el kit. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los kits proporcionados, el recipiente es un vial o una ampolla. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los kits proporcionados, las composiciones o elementos de las mismas están contenidas en una solución separada del recipiente, de modo que las composiciones o elementos se pueden añadir al recipiente en un momento posterior. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los kits proporcionados, las composiciones o elementos de las mismas están en forma liofilizada, cada una en un recipiente separado o en el mismo recipiente, de modo que se puedan reconstituir en un momento posterior. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los kits proporcionados, el kit comprende además instrucciones para la reconstitución, mezcla, administración, etc. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los kits proporcionados, las instrucciones incluyen una descripción de los métodos descritos en el presente documento. Las instrucciones pueden estar en cualquier forma adecuada, p. ej., como un inserto impreso o una etiqueta. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los kits proporcionados en el presente documento, el kit comprende además una o más jeringas u otro(s) dispositivo(s) que pueden suministrar nanovehículos sintéticos in vivo a un sujeto.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Tensioactivo de bajo HLB, SM, aumenta la carga de RAPA y la filtrabilidad de nanovehículos sintéticos

Se sintetizaron composiciones de nanovehículos que contenían los polímeros PLA (viscosidad inherente 0,41 dl/g) y PLA-PEG (bloque de PEG de 5 kDa, viscosidad inherente 0,50 dl/g), así como el fármaco hidrófobo rapamicina (RAPA), con o sin la adición del tensioactivo de HLB bajo monopalmitato de sorbitán (SM), usando el método de evaporación de emulsión de aceite en agua. La fase orgánica se formó disolviendo los polímeros y RAPA en diclorometano. La emulsión se formó homogeneizando la fase orgánica en una fase acuosa que contenía el tensioactivo PVA usando un dispositivo de ultrasonidos de punta de sonda. Después, la emulsión se combinó con una mayor cantidad de tampón acuoso y se mezcló para permitir la disolución y evaporación del disolvente. Los nanovehículos resultantes se lavaron y filtraron a través de un filtro de 0,22 gm. Todas las composiciones contenían 100 mg de polímero. Se varió el contenido de RAPA en las diferentes composiciones.

Para las composiciones que no contienen el tensioactivo SM (muestras 1, 2 y 3), se observaron varias indicaciones de una capacidad limitante para incorporar completamente la RAPA en la composición de nanovehículos a medida que se añadían cantidades crecientes de RAPA. La diferencia creciente entre los tamaños de nanovehículos prefiltración y posfiltración en los niveles más altos de formulación de RAPA en ausencia de SM indicaba la presencia de partículas más grandes (partículas individuales o agregados) que se eliminaban durante los procedimientos de lavado y/o filtración. Esto también lo indicaba la menor capacidad de filtración antes de la obstrucción. Finalmente, la adición de cantidades crecientes de RAPA a las composiciones de nanovehículos sin SM no daba como resultado una mayor carga de RAPA (por ejemplo, muestra 1 en comparación con muestra 3), lo que indicaba que la RAPA adicional era separable de la masa de nanovehículos y era eliminada durante las etapas de lavado y/o filtración.

Por el contrario, las composiciones que contenían el tensioactivo SM incorporaban fácilmente mayores cantidades de RAPA. El tamaño del nanovehículo no se afectaba por la filtración, y el aumento de la cantidad de RAPA añadida a la composición daba como resultado mayor carga de RAPA de los nanovehículos. Se observó cierta reducción de la capacidad de filtración en el nivel de carga más alto (muestra 6), pero esto puede deberse al tamaño del nanovehículo inherentemente mayor. En resumen, la incorporación de SM ayudó a aumentar la carga de RAPA y la filtrabilidad de las composiciones de nanovehículos sintéticos.

Ejemplo 2 - Filtrabilidad y carga de RAPA mayor con SM y colesterol

Las composiciones de nanovehículos se produjeron usando los materiales y métodos descritos en el Ejemplo 1. Se produjeron nanovehículos que contenían polímero y RAPA con diferentes niveles de carga de RAPA. Además, también se produjeron nanovehículos altamente cargados con RAPA usando un excipiente, el tensioactivo SM o colesterol, en una relación en masa de excipiente:RAPA de 3,2:1.

Las muestras de nanovehículos producidas en ausencia de excipientes (muestras 7 y 8) demostraron que el aumento de carga de RAPA más allá de un punto de saturación aparente de nanovehículos tiende a conducir a una reducción de la capacidad de filtración. La adición de SM o colesterol daba como resultado una mayor carga de RAPA mientras se mantenía la estabilidad (muestras 9 y 10).

Para evaluar la capacidad de las composiciones para inducir inmunotolerancia, se inyectaron por vía intravenosa a ratones tres veces por semana nanovehículos coadministrados y KLH (hemocianina de lapa californiana) con la misma dosis de RAPA, y después se expusieron semanalmente solo a KLH. Después, se analizaron en los sueros de los ratones los anticuerpos contra KLH después de cada exposición a KLH (Fig. 1).

Aunque todos los ratones que recibieron el tratamiento con nanovehículos con RAPA recibieron las mismas dosis de RAPA, los diferentes grupos muestran diferentes grados de tolerancia a la KLH. Los 5 ratones que recibieron las composiciones de nanovehículos con la carga más baja (muestra 7) tenían títulos cuantificables de anticuerpos anti-KHL después de la tercera exposición a KLH (el día 40). Este grupo de ratones desarrolló títulos menores de anticuerpos anti-KLH en comparación con los ratones que recibieron solo PBS, pero presentaron la menor tolerancia en comparación con los otros grupos de nanovehículos. El aumento de la carga de RAPA de los nanovehículos en ausencia de un excipiente (SM o colesterol) (muestra 8) mejoró significativamente la tolerancia, con solo 2 de 5 ratones demostrando títulos cuantificables después de 3 exposiciones a KLH (el día 40). La composición que contenía colesterol como excipiente (muestra 10), a pesar de la alta carga de RAPA de los nanovehículos, daba como resultado que cuatro de cinco ratones demostraban títulos de anticuerpos anti-KLH significativos después de solo dos exposiciones (el día 33). La composición de nanovehículos que contenía SM (muestra 9) demostró tanto alta capacidad de la capacidad de filtración de 0,22 pm durante la producción como una tolerabilidad superior, y solo uno de cinco ratones desarrolló un título de anticuerpos anti-KLH cuantificable después de tres exposiciones a KLH (en el día 40). Los resultados de este estudio indican que ambos excipientes (SM y colesterol) permitían mayor carga de nanovehículos de acuerdo con el rendimiento de inducción de tolerancia y la favorabilidad de procesamiento, como lo indica la capacidad de filtración. El tensioactivo de HLB bajo SM proporcionaba las propiedades necesarias para aumentar la estabilidad de los nanovehículos y demostraba mayor rendimiento.

Ejemplo 3: Efectos del tensioactivo de HLB bajo en la carga de RAPA y la filtrabilidad

Materiales y métodos

El PLA con una viscosidad inherente de 0,41 dl/g se adquirió de Lakeshore Biomaterials (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211), código de producto 100 DL 4A. El copolímero de bloques de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en éter metílico de aproximadamente 5.000 Da y una viscosidad inherente global de 0,50 dl/g se adquirió de Lakeshore Biomaterials (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211), código de producto 100 DL mPEG 5000 5CE. La rapamicina se adquirió de Concord Biotech Limited (1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India), código de producto SIROLIMUS. El poli(alcohol vinílico) 4-88 EMPROVE®, USP (85-89% hidrolizado, viscosidad de 3,4-4,6 mPas) se adquirió de EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), código de producto 1.41350. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1X (DPBS) se adquirió de Lonza (Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Suiza), código de producto 17-512Q. El monopalmitato de sorbitán se adquirió de Croda International (300-A Columbus Circle, Edison, NJ 08837), código de producto SPAN 40. El polisorbato 80 se adquirió de NOF America Corporation (One North Broadway, Suite 912 White Plains, NY 10601), código de producto Polysorbate80 (HX2). El monolaurato de sorbitán (SPAN 20) se adquirió de Alfa Aesar (26 Parkridge Rd Ward Hill, MA 01835), código de producto L12099. El estearato de sorbitán (SPAN 60) se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), código de producto S7010. El monooleato de sorbitán (SPAN 80) se adquirió de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (9211 North Harborgate Street Portland, OR 97203), código de producto S0060. El octil-p-D-glucopiranósido se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, Mo 63103), código de producto 08001. El alcohol oleílico se adquirió de Alfa Aesar (26 Parkridge Rd Ward Hill, MA 01835), código de producto A18018. El palmitato de isopropilo se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), código de producto W515604. El polietilenglicol-hexadecil-éter (BRIJ 52) se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), código de producto 388831. El polietilenglicol-oleil-éter (BRIJ 93) se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), código de producto 388866. El poli(etilenglicol)-¿>/oguepoli(propilenglicol)-¿>/ogue-poli(etilenglicol) (Pluronic L-31) se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), código de producto 435406. El poli(etilenglicol)-¿>/ogue-poli(propilenglicol)-¿>/ogue-poli(etilenglicol) (Pluronic P-123) se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), código de producto 435465. El ácido palmítico se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), código de producto P0500. La DL-a-palmitina se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), código de producto M1640. El tripalmitato de glicerilo se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), código de producto T5888.

Para la muestra 11, las soluciones se prepararon como sigue:

Solución 1: Se preparó una mezcla de polímero y rapamicina disolviendo PLA a 75 mg/ml, PLA-PEG-Ome a 25 mg/ml y rapamicina a 16 mg/ml en diclorometano. Solución 2: Se preparó una mezcla de Polisorbato80 disolviendo Polisorbato80 a 80 mg/ml en diclorometano. Solución 3: Se preparó poli(alcohol vinílico) a 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.

Se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la Solución 1 (0,5 ml), la Solución 2 (0,1 ml), el diclorometano (0,4 ml) y la Solución 3 (3,0 ml) en un tubo de presión de vidrio pequeño, se mezcló con vórtice durante 10 segundos y después se sometió a ultrasonidos al 30% de amplitud durante 1 minuto con el tubo de presión sumergido en un baño de agua helada, usando un Branson Digital Sonifier 250. Después se añadió la emulsión a un vaso de precipitados de 50 ml que contenía DPBS (30 ml). Se preparó una segunda emulsión de Ac/Ag usando los mismos materiales y método que antes y después se añadió al mismo recipiente que contenía la primera emulsión y DPBS. A continuación, esto se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en DPBS que contenía PVA al 0,25% en p/v. Se repitió el procedimiento de lavado y después se resuspendió el sedimento en DPBS que contenía PVA al 0,25% en p/v para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg/ml sobre una base de polímero. La suspensión de nanovehículos después se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 gm (número de pieza de Millipore SLGP033RB). La suspensión de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

Para las muestras 12-25, las soluciones se prepararon como sigue:

Solución 1: Se preparó una mezcla de polímero y rapamicina disolviendo PLA a 75 mg/ml, PLA-PEG-Ome a 25 mg/ml y rapamicina a 16 mg/ml en diclorometano. Solución 2: La mezcla de HLB se preparó disolviendo el tensioactivo HLB a 5,0 mg/ml en diclorometano. Los tensioactivos HLB incluyen SPAN 20, s Pa N 40, SPAN 60, SPAN 80, octil-p-D-glucopiranósido, ácido oleílico, palmitato de isopropilo, BRIJ 52, BRIJ 93, Pluronic L-31, Pluronic P-123, ácido palmítico, DL-a-palmitina y tripalmitato de glicerilo. Solución 3: Se preparó poli(alcohol vinílico) a 62,5 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.

Se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la Solución 1 (0,5 ml), la Solución 2 (0,5 ml) y la Solución 3 (3,0 ml) en un tubo de presión de vidrio pequeño, se mezcló con vórtice durante 10 segundos y después se sometió a ultrasonidos al 30% de amplitud durante 1 minuto con el tubo de presión sumergido en un baño de agua helada usando un Branson Digital Sonifier 250. Después, se añadió la emulsión a un vaso de precipitados de 50 ml que contenía DPBS (30 ml). Se preparó una segunda emulsión de Ac/Ag usando los mismos materiales y método que antes y después se añadió al mismo vaso de precipitados que contenía la primera emulsión y DPBS. Esta después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en DPBS que contenía PVA al 0,25% en p/v. Se repitió el procedimiento de lavado y después se resuspendió el sedimento en DPBS que contenía PVA al 0,25% en p/v para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg/ml sobre una base de polímero. La suspensión de nanovehículos después se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 gm (número de pieza de Millipore SLGP033RB). La suspensión de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

El HLB para la mayoría de los tensioactivos de HLB bajo se determinó usando información disponible al público. Para la DL-a-palmitina, el HLB se calculó usando la siguiente fórmula: Mw = 330,5 g/mol, parte hidrófila = 119,0 g/mol; HLB = 119,0/330,5 * 100/5 = 7,2. Para el palmitato de glicerilo, el HLB se calculó usando la siguiente fórmula: Mw = 807,3 g/mol, parte hidrófila = 173,0 g/mol; HLB = 173,0/807,3 * 100/5 = 4,3. Para el palmitato de isopropilo, e1HLB se calculó usando la siguiente fórmula: Mw = 298,5 g/mol, parte hidrófila = 44,0 g/mol; HLB = 44,0/298,5 * 100/5 = 2,9. Para el alcohol oleílico, el HLB se calculó usando la siguiente fórmula: Mw = 268,5 g/mol, parte hidrófila = 17,0 g/mol; HLB = 17,0/268,5 * 100/5 = 1,3. Además, la carga de tensioactivo de HLB bajo se midió por extracción seguida de cuantificación por un método de HPLC.

Antes de la inyección en animales, la suspensión de nanovehículos en masa se descongeló en un baño de agua a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los nanovehículos se diluyeron con DPBS para alcanzar una concentración deseada de rapamicina de 278 pg/ml. Se trataron ratones hembra C57BL/6 de 6 semanas de edad por vía intravenosa los días 0, 7 y 14 con nanovehículos (1,17 ml) mezclados con 130 pl de 10x KLH (hemocianina de lapa californiana). Se dio a los ratones un refuerzo de 200 pg de KLH los días 21,28, 35 y 42. Los títulos de IgG anti-KLH (medidos por ELISA) se leyeron los días 40, 47 y 61. Los resultados demuestran que el tensioactivo de HLB bajo puede dar como resultado sustanciales cargas de rapamicina y filtrabilidad de nanovehículos sintéticos. Además, todos los nanovehículos con tensioactivos de HLB bajo como se muestra en la Fig. 2 dieron como resultado títulos de anticuerpos menores durante al menos 40 y 47 días.

Ejemplo 4 - Efecto del tensioactivo de HLB bajo en la filtrabilidad de nanovehículos sintéticos

Materiales y métodos

El copolímero de bloques de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en éter metílico de aproximadamente 5.000 Da y una viscosidad inherente total de 0,50 dl/g se adquirió de Evonik Industries (Rellinghauser Strape 1-11 45128 Essen, Alemania), código de producto 100 DL mPEG 50005CE. El PLA con una viscosidad inherente de 0,41 dl/g se adquirió de Evonik Industries (Rellinghauser Strape 1-11 45128 Essen Alemania), código de producto 100 DL 4A. La rapamicina se adquirió de Concord Biotech Limited, 1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India. Código de producto SIROLIMUS. Everolimus se adquirió de LC Laboratories (165 New Boston Street Woburn, MA 01801). Número de pieza E-4040, Temsirolimus se adquirió de LC Laboratories (165 New Boston Street Woburn, MA 01801). Número de pieza T-8040, El monopalmitato de sorbitán se adquirió de Croda (315 Cherry Lane New Castle Delaware 19720), código de producto SPAN 40. El diclorometano se adquirió de Spectrum (14422 S San Pedro Gardena CA, 90248-2027). Número de pieza M1266. El poli(alcohol vinílico) 4-88 EMPROVE®, USP (85-89% hidrolizado, viscosidad de 3,4-4,6 mPas) se adquirió de EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), código de producto 1.41350, la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1X, 0,0095 M (PO4), sin calcio ni magnesio, se adquirió de BioWhittaker (8316 West Route 24 Mapleton, IL 61547), número de pieza n° 12001, código de producto Lonza DPBS. La emulsión se llevó a cabo usando un dispositivo de ultrasonidos Branson Digital Sonifier 250 con una sonda de titanio de punta cónica de 3,17 mm (1/8 pulgada).

Las soluciones se prepararon como sigue:

Solución 1: Se preparó una mezcla de polímero disolviendo PLA-PEG-OMe (100 DL mPEG 50005CE) a 50 mg por 1 ml y PLA (100 DL 4A) a 150 mg por ml en diclorometano. Solución 2: se disolvió rapamicina a 160 mg por 1 ml en diclorometano. Solución 3: Se disolvió everolimus a 150 mg por ml en diclorometano. Solución 4: Se disolvió temsirolimus a 150 mg por ml en diclorometano. Solución 5: Se disolvió monopalmitato de sorbitán (SPAN 40) a 50 mg por 1 ml en diclorometano. Solución 6: El diclorometano se esterilizó por filtración usando un filtro de jeringa de membrana de PTFE de 0,2 gm (número de pieza VWR 28145-491). Solución 7: Se preparó una solución de poli(alcohol vinílico) disolviendo poli(alcohol vinílico) (poli(alcohol vinílico) 4-88 EMPROVE®) a 75 mg por 1 ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8. Solución 8: Se preparó una mezcla de poli(alcohol vinílico) y solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1X, 0,0095 M (PO4) disolviendo poli(alcohol vinílico) (poli(alcohol vinílico) 4-88 Em PrOVE®) a 2,5 mg por 1 ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1X, 0,0095 M (PO4) (Lonza DPBS).

Para la muestra 26, se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la Solución 1 (0,5 ml), la Solución 2 (0,1 ml), la Solución 5 (0,1 ml) y la Solución 6 (0,30 ml) en un tubo de presión de vidrio pequeño. La solución se mezcló pipeteando repetidamente. A continuación, se añadió la Solución 7 (3,0 ml) y la formulación se mezcló con vórtice durante diez segundos. Después la formulación se sometió a ultrasonidos con el tubo de presión sumergido en un baño de hielo durante 1 minuto al 30% de amplitud. Después, se añadió la emulsión a un vaso de precipitados de 50 ml abierto que contenía Lonza DPBS (30 ml). Esta después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en Solución 8. Se repitió el procedimiento de lavado y después el sedimento se resuspendió en Solución 8 para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg por ml sobre una base de polímero. La formulación de nanovehículos se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 gm (número de pieza de Millex SLGP033RS). Se midió la masa de la capacidad de filtración de solución de nanovehículos. La solución de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

Para la muestra 27, se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la Solución 1 (0,5 ml), la Solución 2 (0,1 ml) y la Solución 6 (0,40 ml) en un tubo de presión de vidrio pequeño. La solución se mezcló pipeteando repetidamente. A continuación, se añadió la Solución 7 (3,0 ml) y la formulación se mezcló con vórtice durante diez segundos. Después la formulación se sometió a ultrasonidos con el tubo de presión sumergido en un baño de hielo durante 1 minuto al 30% de amplitud. Después, se añadió la emulsión a un vaso de precipitados de 50 ml abierto que contenía Lonza DPBS (30 ml). Esta después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en Solución 8. Se repitió el procedimiento de lavado y después el sedimento se resuspendió en Solución 8 para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg por ml sobre una base de polímero. La formulación de nanovehículos se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 gm (número de pieza de Millex SLGP033RS). Se midió la masa de la capacidad de filtración de solución de nanovehículos. La solución de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

Para la muestra 28, se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la Solución 1 (0,5 ml), la Solución 3 (0,2 ml), la Solución 5 (0,1 ml) y la Solución 6 (0,20 ml) en un tubo de presión de vidrio pequeño. La solución se mezcló pipeteando repetidamente. A continuación, se añadió la Solución 7 (3,0 ml) y la formulación se mezcló con vórtice durante diez segundos. Después la formulación se sometió a ultrasonidos con el tubo de presión sumergido en un baño de hielo durante 1 minuto al 30% de amplitud. Después, la emulsión se añadió a un vaso de precipitados de 50 ml abierto que contenía Lonza DPBS (30 ml). Esta después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en Solución 8. Se repitió el procedimiento de lavado y después el sedimento se resuspendió en Solución 8 para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg por ml sobre una base de polímero. La formulación de nanovehículos se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 gm (número de pieza de Millex SLGP033RS). Se midió la masa de la capacidad de filtración de solución de nanovehículos. La solución de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

Para la muestra 29, se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la Solución 1 (0,5 ml), la Solución 3 (0,2 ml) y la Solución 6 (0,30 ml) en un tubo de presión de vidrio pequeño. La solución se mezcló pipeteando repetidamente. A continuación, se añadió la Solución 7 (3,0 ml) y la formulación se mezcló con vórtice durante diez segundos. La formulación después se sometió a ultrasonidos con el tubo de presión sumergido en un baño de hielo durante 1 minuto al 30% de amplitud. Después, la emulsión se añadió a un vaso de precipitados abierto de 50 ml que contenía Lonza DPBS (30 ml). Esta después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en la Solución 8. Se repitió el procedimiento de lavado y después se resuspendió el sedimento en la Solución 8 para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg por ml sobre un polímero base. La formulación de nanovehículos se filtró usando un filtro de jeringa de membrana PES de 0,22 gm (número de pieza Millex SLGP033RS). Se midió la masa de la capacidad de filtración de la solución de nanovehículos. La solución de nanovehículos filtrada después se almacenó a -202C.

Para la muestra 30, se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la Solución 1 (0,5 ml), la Solución 4 (0,2 ml), la Solución 5 (0,1 ml) y la Solución 6 (0,20 ml) en un tubo de presión de vidrio pequeño. La solución se mezcló pipeteando repetidamente. A continuación, se añadió la Solución 7 (3,0 ml) y la formulación se mezcló con vórtice durante diez segundos. Después, la formulación se sometió a ultrasonidos con el tubo de presión sumergido en un baño de hielo durante 1 minuto al 30% de amplitud. Después, la emulsión se añadió a un vaso de precipitados abierto de 50 ml que contenía Lonza DPBS (30 ml). Esta después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en la Solución 8. Se repitió el procedimiento de lavado y después se resuspendió el sedimento en Solución 8 para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg por ml sobre un polímero base. La formulación de nanovehículos se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 gm (número de pieza Millex SLGP033RS). Se midió la masa de la capacidad de filtración de la solución de nanovehículos. La solución de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

Para la muestra 31, se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la Solución 1 (0,5 ml), la Solución 4 (0,2 ml), la Solución 6 (0,30 ml) en un tubo de presión de vidrio pequeño. La solución se mezcló pipeteando repetidamente. A continuación, se añadió la Solución 7 (3,0 ml) y la formulación se mezcló con vórtice durante diez segundos. Después, la formulación se sometió a ultrasonidos con el tubo de presión sumergido en un baño de hielo durante 1 minuto al 30% de amplitud. Después, la emulsión se añadió a un vaso de precipitados abierto de 50 ml que contenía Lonza DPBS (30 ml). Esta después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en Solución 8. Se repitió el procedimiento de lavado y después se resuspendió el sedimento en Solución 8 para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg por ml sobre un polímero base. La formulación de nanovehículos se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 gm (número de pieza Millex SLGP033RS). Se midió la masa de la capacidad de filtración de la solución de nanovehículos. La solución de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

El tamaño de los nanovehículos se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de rapalogo en el nanovehículo se determinó por análisis de HPLC. La masa total de nanovehículo seco por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico. La filtrabilidad se evaluó por la cantidad de filtrado que pasaba a través del primer filtro.

Los datos muestran que para varios rapalogos, la incorporación de SPAN 40 en los nanovehículos sintéticos daba como resultado un aumento de la filtrabilidad de las composiciones de nanovehículos sintéticos.

Ejemplo 5 - Efectos de SPAN 40 en la filtrabilidad de nanovehículos sintéticos que comprenden polímeros no poliésteres

Materiales y métodos

La rapamicina se adquirió de Concord Biotech Limited (1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India). Código de producto SIROLIMUS. El poli(estireno)-¿>/ogue-poli(etilenglicol) (PS-PEG) con un bloque de PEG terminado en éter metílico de aproximadamente 700-1.100 Da se adquirió de Sigma Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103). Número de pieza 686476. El poli(estireno)-¿>/ogue-poli(metacrilato de metilo) (PS-PMMA) (Mw=30.000 Da) con una relación de metacrilato:estireno 1:1 se adquirió de Sigma Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103). Número de pieza 749184. La 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) se adquirió de Avanti Polar Lipids, Inc (Avanti Polar Lipids, Inc. 700 Industrial Park Drive Alabaster, Alabama 35007-9105). Número de pieza 850345P. El poli(etilenglicol)-¿>/ogue-poli(propilenglicol)-¿>/ogue-poli(etilenglicol) (P-123) con una relación PEG:PPG:PEG de 20:70:20 se adquirió de Sigma Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, Mo 63103). Código de producto Pluronic® P-123, Número de pieza 435465. El diclorometano se adquirió de Spectrum (14422 S San Pedro Gardena CA, 90248-2027). Número de pieza M1266. El monopalmitato de sorbitán se adquirió de Croda (315 Cherry Lane New Castle Delaware 19720). Código de producto SpAn 40, poli(alcohol vinílico) 4-88 (PVA)e Mp ROVE®, USP (85-89% hidrolizado, viscosidad de 3,4-4,6 mPas) se adquirió de EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027). Código de producto 1.41350, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), 1X, 0,0095 M (PO4), sin calcio ni magnesio, se adquirió de BioWhittaker (8316 West Route 24 Mapleton, IL 61547). Número de pieza 17-512Q. La emulsión se llevó a cabo usando un Branson Digital Sonifier 250 con una sonda de titanio de punta cónica de 3,17 mm (1/8 pulgada).

Las soluciones se prepararon como sigue:

Solución 1: Se preparó una solución de polímero y rapamicina disolviendo PS-PEG a 50 mg por ml y rapamicina a 8 mg por ml en diclorometano. Solución 2: Se preparó una solución de polímero y rapamicina disolviendo PS-PMMA (Mw = 30.000 Da) a 50 mg por ml y rapamicina a 8 mg por ml en diclorometano. Solución 3: Se preparó una solución de lípido y rapamicina disolviendo DMPC a 50 mg por ml y rapamicina a 8 mg por ml en diclorometano. Solución 4: Se preparó una solución de polímero y rapamicina disolviendo (P-123) a 50 mg por ml y rapamicina a 8 mg por ml en diclorometano. Solución 5: El diclorometano se esterilizó por filtración usando un filtro de jeringa de membrana de PTFE de 0,2 pm (número de pieza VWR 28145-491). Solución 6: Se disolvió SPAN 40 a 50 mg por ml en diclorometano. Solución 7: Se disolvió PVA a 62,5 mg por ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.

Para la muestra 28, se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la Solución 1 (1,0 ml) y la Solución 5 (0,05 ml) en un tubo de presión de vidrio pequeño preenfriado >4 minutos en un baño de agua helada. A continuación, se añadió la Solución 7 (3,0 ml) y el tubo de presión se mezcló con vórtice durante diez segundos. Después, la emulsión se sometió a ultrasonidos con el tubo de presión sumergido en un baño de hielo durante 1 minuto al 30% de amplitud. La nanoemulsión resultante se añadió después a un vaso de precipitados abierto de 50 ml que contenía DPBS (15 ml), y se colocó un trozo de papel de aluminio sobre el vaso de precipitados abierto. Se preparó una segunda emulsión usando el mismo procedimiento y se añadió a la primera emulsión en el mismo vaso de precipitados de 50 ml con una parte alícuota nueva de DPBS (15 ml). El vaso de precipitados se dejó sin tapar y se descartó el papel de aluminio. Después, este se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en DPBS. Se repitió el procedimiento de lavado y después se resuspendió el sedimento en DPBS para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg por ml sobre un polímero base. La formulación de nanovehículos se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 pm (número de pieza Millex SLGP033RS). Se midió la masa de la capacidad de filtración de la solución de nanovehículos. La solución de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

La muestra 29 se preparó igual que la muestra 28, usando la Solución 6 en lugar de la Solución 5. La muestra 30 se preparó igual que la muestra 28, usando la Solución 2 en lugar de la Solución 1. La muestra 31 se preparó igual que la muestra 30, usando la Solución 6 en lugar de la Solución 5. La muestra 32 se preparó igual que la muestra 28, usando la Solución 3 en lugar de la Solución 1. La muestra 33 se preparó igual que la muestra 32, usando la Solución 6 en lugar de la Solución 5. La muestra 34 se preparó igual que la muestra 28, usando la Solución 4 en lugar de la Solución 1. La muestra 35 se preparó igual que la muestra 34, usando la Solución 6 en lugar de la Solución 5.

El tamaño del nanovehículo se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de rapamicina en el nanovehículo se determinó por análisis de HPLC. La masa total de nanovehículo seco por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico. La filtrabilidad se evaluó por la masa de nanovehículo filtrado a través del primer filtro de jeringa de 0,22 pm de membrana de PES de 33 mm.

A continuación, los resultados muestran que, aunque no está optimizado, la inclusión de SPAN 40 en nanovehículos sintéticos con polímeros no poliésteres puede aumentar la filtrabilidad de los nanovehículos sintéticos en algunas realizaciones.

Ejemplo 6: SPAN 40 aumenta considerablemente la filtrabilidad de nanovehículos sintéticos que comprenden polímeros de poliéster

Materiales y métodos

El PLA (100 DL 4A), con una viscosidad inherente de 0,41 dl/g se adquirió de Evonik Industries AG (Rellinghauser StraBe 1-11, Essen Alemania), código de producto 100 DL 4A. El copolímero de bloques de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en éter metílico de aproximadamente 5.000 Da y una viscosidad inherente total de 0,50 dl/g se adquirió de Evonik Industries AG (Rellinghauser Strape 1-11, Essen Alemania), código de producto 100 DL mPEG 5000 5CE. La rapamicina se adquirió de Concord Biotech Limited (1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India), código de producto SIROLIMUS. El poli(alcohol vinílico) 4-88 (PVA) EMPROVE®, USP (85-89% hidrolizado, viscosidad de 3,4-4,6 mPas) se adquirió de EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), código de producto 1.41350. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1X (DPBS) se adquirió de Lonza (Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Suiza), código de producto 17-512Q. El monopalmitato de sorbitán (SPAN 40), se adquirió de Croda International (300-A Columbus Circle, Edison, NJ 08837), código de producto Span 40. El PLGA (5050 DLG 2.5A), con aproximadamente 54% en peso de lactida y 46% en peso de glicólido, y una viscosidad inherente de 0,24 dl/g se adquirió de Evonik Industries AG (Rellinghauser StraBe 1-11, Essen Alemania), código de producto 5050 DLG 2.5A. El PlGA (7525 DLG 4A), con aproximadamente 73% en peso de lactida y 27% en peso de glicólido, y una viscosidad inherente de 0,39 dl/g se adquirió de Evonik Industries AG (Rellinghauser StraBe 1-11, Essen Alemania), código de producto 7525 DLG 4A. La policaprolactona (PCL), Mw medio de 14.000 Da y Mn de 10.000 Da, se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), código de producto 440752.

Para las muestras 1,3, 5 y 7, las soluciones se prepararon como sigue:

Solución 1: PLA-PEG-Ome a 50 mg por ml, Span 40 a 10 mg por ml y rapamicina a 32 mg por ml se disolvieron en diclorometano. Solución 2: Se disolvieron 100 DL 4A en diclorometano a 150 mg por ml. Solución 3: Se disolvió 5050 DLG 2.5A en diclorometano a 150 mg por ml. Solución 4: Se disolvió 7525 DLG 4A en diclorometano a 150 mg por ml. Solución 5: Se disolvió PCL en diclorometano a 150 mg por ml. Solución 6: Se preparó PVA a 75 mg por ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.

Se preparó una emulsión de Ac/Ag transfiriendo la Solución 1 (0,5 ml) a un tubo de presión de vidrio de pared gruesa.

A esto, al lote 1 se añadió la Solución 2 (0,5 ml), al lote 3 se añadió la Solución 3 (0,5 ml), al lote 5 se añadió 4 (0,5 ml) y al lote 7 se añadió la Solución 5 (0,5 ml). Después, las dos soluciones se mezclaron pipeteando repetidamente. A continuación, se añadió la Solución 6 (3,0 ml), el tubo se mezcló con vórtice durante 10 segundos y después se emulsionó por ultrasonidos a una amplitud del 30% durante 1 minuto con el tubo de presión sumergido en un baño de agua helada usando un Branson Digital Sonifier 250. La emulsión después se añadió a un vaso de precipitados de 50 ml que contenía DPBS (30 ml). Esta después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en DPBS. Se repitió el procedimiento de lavado y después se resuspendió el sedimento en DPBS para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg/ml sobre un polímero base. La suspensión de nanovehículos después se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 gm (número de pieza de Millipore SLGP033RB) y, si es necesario: filtro de jeringa de membrana de PES de 0,45 gm (número de pieza de PALL 4614) y/o un filtro de jeringa de membrana de PES de 1,2 gm (número de pieza PALL 4656). La suspensión de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

El tamaño del nanovehículo se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de rapamicina en el nanovehículo se determinó por análisis de HPLC. La filtrabilidad se determinó comparando el peso del flujo a través del primer filtro estéril de 0,22 pm con el rendimiento para determinar la masa real de nanovehículos que pasaban antes de bloquear el filtro, o el total a través del primer y único filtro. La masa total de nanovehículo seco por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.

Para las muestras 2, 4, 6 y 8, se prepararon soluciones como sigue:

Solución 1: Se preparó una mezcla de polímero y rapamicina disolviendo PLA-PEG-Ome a 50 mg por ml y rapamicina a 32 mg por ml en diclorometano. Solución 2: Se disolvieron 100 DL 4A en diclorometano a 150 mg por ml. Solución 3: Se disolvió 5050 DLG 2.5A en diclorometano a 150 mg por ml. Solución 4: Se disolvió 7525 DLG 4A en diclorometano a 150 mg por ml. Solución 5: Se disolvió PCL en diclorometano a 150 mg por ml. Solución 6: Se preparó poli(alcohol vinílico) a 75 mg por ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.

Se preparó una emulsión de Ac/Ag transfiriendo la Solución 1 (0,5 ml) a un tubo de presión de vidrio de pared gruesa. A esto, al lote 2 se añadió la Solución 2 (0,5 ml), al lote 4 se añadió la Solución 3 (0,5 ml), al lote 6 se añadió 4 (0,5 ml) y al lote 8 se añadió la Solución 5 (0,5 ml). Después, las dos soluciones se mezclaron pipeteando repetidamente. La adición de la solución de PVA, el lavado, filtración y almacenamiento son iguales que los anteriores.

El tamaño del nanovehículo se evaluó igual que antes.

Los resultados muestran un aumento significativo en la filtrabilidad de los nanovehículos sintéticos que comprenden polímeros de poliéster con la inclusión de SPAN 40 en los nanovehículos sintéticos.

Ejemplo 7: Nanovehículos sintéticos con tensioactivo de HLB bajo y carga de RAPA significativa dan como resultado tolerancia específica de antígeno duradera

Materiales y métodos

El PLA con una viscosidad inherente de 0,41 dl/g se adquirió de Lakeshore Biomaterials (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211), código de producto 100 DL 4A. El copolímero de bloques de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en éter metílico de aproximadamente 5.000 Da y una viscosidad inherente total de 0,50 dl/g se adquirió de Lakeshore Biomaterials (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211), código de producto 100 DL mPEG 5000 5CE. La rapamicina se adquirió de Concord Biotech Limited (1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India), código de producto SIROLIMUS. El monopalmitato de sorbitán se adquirió de Sigma-Aldrich (3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103), código de producto 388920. El poli(alcohol vinílico) 4-88 EMPROVE® (PVA), USP (85-89% hidrolizado, viscosidad de 3,4-4,6 mPas) se adquirió de e Md Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), código de producto 1.41350. La solución salina tamponada con fosfato 1X de Dulbecco (DPBS) se adquirió de Lonza (Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Suiza), código de producto 17-512Q.

Las soluciones se prepararon como sigue:

Solución 1: Se preparó una mezcla de polímero, rapamicina y monopalmitato de sorbitán disolviendo PLA a 37,5 mg/ml, PLA-PEG-Ome a 12,5 mg/ml, rapamicina a 8 mg/ml y monopalmitato de sorbitán a 2,5 en diclorometano. Solución 2: Se preparó poli(alcohol vinílico) a 50 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.

Se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la Solución 1 (1,0 ml) y la Solución 2 (3 ml) en un tubo de presión de vidrio pequeño, mezclado con vórtice durante 10 segundos. Después la formulación se homogeneizó mediante ultrasonidos a una amplitud del 30% durante 1 minuto. Después, la emulsión se añadió a un vaso de precipitados abierto que contenía DPBS (30 ml). Se preparó una segunda emulsión de Ac/Ag usando los mismos materiales y método que antes y después se añadió al mismo vaso de precipitados que contenía la primera emulsión y DPBS. Después, la emulsión combinada se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en DPBS que contenía PVA al 0,25% en p/v. Se repitió el procedimiento de lavado y después el sedimento se resuspendió en DPBS que contenía PVA al 0,25% en p/v para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg/ml sobre un polímero base. La suspensión de nanovehículos después se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 pm (número de pieza de Millipore SLGP033RB). La suspensión de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

El tamaño del nanovehículo se determinó por dispersión dinámica de la luz. La cantidad de rapamicina en el nanovehículo se determinó por análisis de HPLC. La masa total del nanovehículo seco por ml de suspensión se determinó por un método gravimétrico.

Se evaluó la capacidad de los nanovehículos sintéticos, frente a la rapamicina libre, para inducir inmunotolerancia duradera frente al antígeno modelo KLH. A grupos de ratones C57BL/6 sin tratamiento previo (n = 10 por grupo) se les administró por vía intravenosa los días 0, 7 y 14 PBS (grupo 1), 50 pg (~2 mg/kg) de rapamicina libre sola o mezclada con KLH (grupos 2 y 3, respectivamente), o 50 pg de rapamicina encapsulada en nanovehículos sintéticos sola (grupo 6) o mezclada con KLH (grupos 7 y 8) (Fig. 3). Para determinar los efectos de la administración crónica de rapamicina, el grupo 4 recibió rapamicina libre sola cinco veces por semana (50 pg/día) desde el día 0 al día 20 o en combinación con KLH administrada una vez por semana (grupo 5). Posteriormente, todos los grupos se expusieron a 200 pg de KLH los días 21, 28 y 35. Se recogieron los sueros y se midieron las respuestas de anticuerpos anti-KLH los días 35 y 42 (después de 2 y 3 inyecciones, respectivamente). La eficacia se evaluó como la CE50 para el título de anticuerpos anti-KLH determinado por ELISA. La figura 4 ilustra el protocolo.

Los ratones de control tratados con PBS desarrollaron niveles elevados de anticuerpos anti-KLH los días 35 y 42, después de 2 y 3 inyecciones de exposición de KLH, respectivamente. Los ratones tratados con rapamicina libre (semanal o diaria) en ausencia de KLH desarrollaron niveles similares de anticuerpos anti-KLH como el grupo tratado con PBS. Los ratones tratados con nanovehículos sintéticos solos o con rapamicina libre diaria y KLH mostraron una respuesta retardada en comparación con el grupo de control de PBS, pero los títulos se reforzaron con cada exposición con KLH. Estos resultados indican que el tratamiento con nanovehículos sintéticos solos no induce inmunosupresión crónica, y que la KLH administrada con rapamicina libre diaria, incluso en 5 veces la dosis semanal total de rapamicina administrada en nanovehículos sintéticos, no induce tolerancia inmunológica duradera.

Por el contrario, los ratones tratados con nanovehículos sintéticos+KLH (grupos 7 y 8), que comprendían una cantidad significativa de rapamicina, desarrollaron pocos anticuerpos anti-KLH o no detectables, incluso después de recibir tres exposiciones de KLH postratamiento semanales (para un total de 6 inyecciones de KLH), lo que indica una inmunotolerancia duradera. Ambos lotes de nanovehículos sintéticos fueron igualmente efectivos. Todos los grupos, excepto los tratados con nanovehículo sintético+KLH, desarrollaron reacciones anafilácticas el día 42. Estos resultados indican que la tolerancia a la KLH inducida por el tratamiento con nanovehículos sintéticos que comprenden una cantidad significativa de rapamicina y KLH prevenían el desarrollo de reacciones de hipersensibilidad.

Para evaluar la especificidad antigénica de la tolerancia a la KLH, todos los animales se expusieron a OVA+CpG s.c. (35 pg+20 pg) en la extremidad trasera los días 49 y 56. La Fig. 5 muestra que todos los animales desarrollaron niveles similares de títulos contra la OVA, lo que demuestra que la administración concomitante del antígeno con nanovehículo sintético puede producir tolerancia inmunológica y que el tratamiento con nanovehículo sintético no induce inmunosupresión crónica. Estos resultados demuestran que la rapamicina encapsulada en nanovehículos, en lugar de rapamicina libre, (cuando está presente en una cantidad significativa, induce inmunotolerancia duradera y específica de antígeno cuando se administra de forma concomitante con un antígeno diana.

Ejemplo 8: SPAN 40 aumenta la filtrabilidad de rapalogos, rapamicina y everolimus

Materiales y métodos

El PLA con una viscosidad inherente de 0,41 dl/g se adquirió de Evonik Industries AG (Rellinghauser StraBe 1-11, Essen, Alemania), código de producto 100 DL 4A. El copolímero de bloques de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en éter metílico de aproximadamente 5.000 Da y una viscosidad inherente total de 0,50 dl/g se adquirió de Evonik Industries AG (Rellinghauser Strape 1-11, Essen, Alemania), código de producto 100 DL mPEG 5000 5CE. La rapamicina se adquirió de Concord Biotech Limited (1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India), código de producto SIROLIMUS. Everolimus se adquirió de LC Laboratories (165 New Boston St # T, Woburn, MA 01801). Código de producto E-4040. El temsirolimus se adquirió de LC Laboratories (165 New Boston Street Woburn, MA 01801). Número de pieza T-8040. El deforolimus se adquirió en MedChem Express (11 Deer Park Drive, Suite 102D Monmouth Junction, NJ 08852). Código de producto hY-50908. El poli(alcohol vinílico) 4-88 EMPROVE®, USP (85-89% hidrolizado, viscosidad de 3,4-4,6 mPa s) se adquirió de EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), código de producto 1.41350. La solución salina tamponada con fosfato 1X de Dulbecco (DPBS) se adquirió de Lonza (Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Suiza), código de producto 17-512Q. El monopalmitato de sorbitán se adquirió de Croda International (300-A Columbus Circle, Edison, NJ 08837), código de producto SPAN 40.

Las soluciones se prepararon como sigue. Solución 1: Se preparó una mezcla de polímero y rapamicina disolviendo PLA a 150 mg/ml y PLA-PEG-Ome a 50 mg/ml. Solución 2: Se preparó una solución de rapamicina a 100 mg/ml en diclorometano. Solución 3: Se preparó una solución de everolimus a 100 mg/ml en diclorometano. Solución 4: Se preparó una solución de temsirolimus a 100 mg/ml en diclorometano. Solución 5: Se preparó una solución de deforolimus a 100 mg/ml en diclorometano. Solución 6: Se preparó una solución de monopalmitato de sorbitán disolviendo SPAN 40 a 50 mg/ml en diclorometano. Solución 7: Se preparó poli(alcohol vinílico) a 75 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8.

Se prepararon emulsiones de Ac/Ag añadiendo la Solución 1 (0,5 ml) a un tubo de presión de pared gruesa. Para los lotes 1,3, 5 y 7, esta se combinó con la Solución 6 (0,1 ml) y diclorometano (0,28 ml). Después, el lote 1 combinó esta con la solución 2 (0,12 ml), el lote 3 con la solución 3 (0,12 ml), el lote 5 con la solución 4 (0,12 ml) y el lote 7 con la solución 4 (0,12 ml). De manera similar, los lotes 2, 4, 6 y 8 se combinaron con diclorometano (0,38 ml) y después el lote 2 se combinó con la solución 2 (0,12 ml), el lote 4 con la solución 3 (0,12 ml), el lote 6 con la solución 4 (0,12 ml) y el lote 8 con la solución 5 (0,12 ml). Por lo tanto, para cada lote individual, el volumen total de la fase orgánica era de 1 ml. Las soluciones de fase orgánica combinadas se mezclaron pipeteando repetidamente. A continuación, se añadió la Solución 7 (3,0 ml), el tubo de presión se mezcló con vórtice durante 10 segundos y después se sometió a ultrasonidos a una amplitud del 30% durante 1 minuto con el tubo de presión sumergido en un baño de agua helada usando un Branson Digital Sonifier 250. La emulsión después se añadió a un vaso de precipitados de 50 ml que contenía DPBS (30 ml). Después esta se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara rápidamente para que se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en DPBS que contenía PVA al 0,25% en p/v. Se repitió el procedimiento de lavado y después se resuspendió el sedimento en DPBS que contenía PVA al 0,25% en p/v para lograr una suspensión de nanovehículos que tenía una concentración nominal de 10 mg/ml sobre un polímero base. Después, la suspensión de nanovehículos se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 gm (número de pieza de Millipore SLGP033RB). La suspensión de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

Los resultados muestran que la incorporación de SPAN 40 en nanovehículos sintéticos aumentó la filtrabilidad de los rapalogos, rapamicina y everolimus.

Ejemplo 9: Muestra los efectos de las cantidades de los componentes en la carga de rapamicina y la filtrabilidad del nanovehículo sintético

Materiales y métodos

El copolímero de bloques de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en éter metílico de aproximadamente 5.000 Da y una viscosidad inherente total de 0,50 dl/g se adquirió de Evonik Industries (Rellinghauser Strape 1-11 45128 Essen, Alemania), código de producto 100 DL mPEG 50005CE. El PLA con una viscosidad inherente de 0,41 dl/g se adquirió de Evonik Industries (Rellinghauser StraBe 1 -11 45128 Essen, Alemania), código de producto 100 DL 4A. La rapamicina se adquirió en Concord Biotech Limited, 1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India. Código de producto SIROLIMUS. El monopalmitato de sorbitán se adquirió de Croda (315 Cherry Lane New Castle Delaware 19720), código de producto SPAN 40.

El diclorometano se adquirió de Spectrum (14422 S San Pedro Gardena CA, 90248-2027). Número de pieza M1266. El poli(alcohol vinílico) 4-88 EMp Ro VE®, (PVA), USP (85-89% hidrolizado, viscosidad de 3,4-4,6 mPas) se adquirió de EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), código de producto 1.41350. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), 1X, 0,0095 M (PO4), sin calcio ni magnesio, se adquirió de BioWhittaker (8316 West Route 24 Mapleton, IL 61547), número de pieza 12001, código de producto Lonza DPBS. La emulsión se llevó a cabo usando un Branson Digital Sonifier 250 con una sonda de titanio de punta cónica de 3,17 mm (1/8 pulgadas).

Las soluciones se prepararon de la siguiente manera:

Solución de polímero: Se preparó una mezcla de polímero disolviendo PLA-PEG-OMe (100 DL mPEG 5000 5CE) y PLA (100 DL 4A) en los mg indicados por ml en diclorometano en una proporción 1:3 de PLA-PEG a PLA. Solución de rapamicina: se disolvió rapamicina a los mg indicados por 1 ml en diclorometano. Solución de SPAN 40: se disolvió monopalmitato de sorbitán (SPAN 40) a los mg indicados por ml en diclorometano. Solución de CH2Cl2: El diclorometano (CH2Cl2) se esterilizó por filtración usando un filtro de jeringa de membrana de PTFE de 0,2 gm (número de pieza VWR 28145-491). Solución de PVA: Se preparó una solución de poli(alcohol vinílico) disolviendo poli(alcohol vinílico) (poli(alcohol vinílico) 4-88 EMPROVE®) a los mg indicados por 1 ml en tampón de fosfato 100 mM a pH 8. Solución de DPBS PVA: Se preparó una mezcla de poli(alcohol vinílico) y solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1X, 0,0095 M (PO4) disolviendo poli(alcohol vinílico) (poli(alcohol vinílico) 4-88 EMPROVE®) a 2,5 mg por 1 ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1X, 0,0095 M (PO4) (Lonza DPBS).

Se preparó una emulsión de Ac/Ag combinando la solución de polímero, solución de rapamicina, solución de SPAN 40 y/o solución de CH2Cl2 (volumen total 1-2 ml) en un tubo de presión de vidrio de pared gruesa. La solución se mezcló pipeteando repetidamente. A continuación, se añadió solución de PVA (3 a 6 ml) (éter como una única emulsión con 1 ml de fase orgánica y 3 ml de solución acuosa de PVA, o como dos emulsiones individuales preparadas una tras otra). La formulación se mezcló con vórtice durante diez segundos y después se sometió a ultrasonidos con el tubo de presión sumergido en un baño de hielo durante 1 minuto al 30% de amplitud. La emulsión después se añadió a un vaso de precipitados abierto de 50 ml que contenía Lonza DPBS (30 ml). Esta después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que se evaporara el diclorometano y se formaran los nanovehículos. Una porción de los nanovehículos se lavó transfiriendo la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga y centrifugando a 75.600xg y 4°C durante 50 minutos, eliminando el líquido sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en solución de DPBS PVA. Se repitió el procedimiento de lavado y después se resuspendió el sedimento en solución de DPBS PVA para lograr una suspensión de nanovehículos con una concentración nominal de 10 mg por ml sobre un polímero base. La formulación de nanovehículos se filtró usando un filtro de jeringa de membrana de PES de 0,22 gm (número de pieza Millex SLGP033RS). Se midió la masa de la capacidad de filtración de la solución de nanovehículos. La solución de nanovehículos filtrada después se almacenó a -20°C.

La filtrabilidad se da como g/m2 de área superficial de la membrana de filtración, del nanovehículo medido que pasa a través de un filtro de jeringa de 0,22 gm de membrana de PES de 33 mm de Millipore, número de pieza SLGP033RB.

Los resultados muestran la cantidad de varios componentes en una serie de nanovehículos sintéticos que pueden dar como resultado nanovehículos sintéticos esterilizables por filtración inicial con una cantidad de rapamicina que se espera que sea eficaz in vivo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende nanovehículos sintéticos que comprenden:

un material vehículo hidrófobo,

un rapalogo, y

un tensioactivo no iónico con un valor de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) menor o igual a 10;

en donde la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es > 0,01 pero < 20% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/peso de material vehículo hidrófobo, preferiblemente en donde la composición es esterilizable por filtración inicialmente a través de un filtro de 0,22 pm.

2. Un método para producir nanovehículos sintéticos que comprenden un tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10 y un rapalogo, que comprende:

obtener o proporcionar un material vehículo hidrófobo,

obtener o proporcionar un tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10,

obtener o proporcionar un rapalogo, y

combinar el material vehículo hidrófobo, el tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10 y el rapalogo para formar nanovehículos sintéticos,

en donde la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 en los nanovehículos sintéticos es > 0,01 pero < 20% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/peso de material vehículo hidrófobo.

3. El método de la reivindicación 2, que además comprende:

disolver el material vehículo hidrófobo, tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 y rapalogo en un disolvente;

obtener o proporcionar otro tensioactivo;

formar una primera y después una segunda emulsión de Ac/Ag con el material vehículo hidrófobo disuelto, tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 y rapalogo, y otro tensioactivo;

mezclar la primera y segunda emulsiones de Ac/Ag; y

dejar que el disolvente se evapore, preferiblemente en donde el disolvente es diclorometano, acetato de etilo, cloroformo o carbonato de propileno.

4. La composición de la reivindicación 1 o el método de las reivindicaciones 2 o 3, en donde:

(i) el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 10;

(ii) el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 9;

(iii) el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 8;

(iv) el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 7;

(v) el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 6; o

(vi) el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es un tensioactivo no iónico con valor de HLB menor que 5.

5. La composición de las reivindicaciones 1 o 4, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde: (i) el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 comprende un éster de sorbitán, alcohol graso, éster de ácido graso, alcohol graso etoxilado, poloxámero o un ácido graso;

(ii) el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 comprende un éster de sorbitán, alcohol graso, éster de ácido graso, alcohol graso etoxilado, poloxámero o un ácido graso, y

en donde el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 comprende SPAN 40, SPAN 20, alcohol oleílico, alcohol estearílico, palmitato de isopropilo, monoestearato de glicerol, BRIJ 52, BRIJ 93, Pluronic P-123, Pluronic L-31, ácido palmítico, ácido dodecanoico, tripalmitato de glicerilo o trilinoleato de glicerilo ; o

(iii) el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es SPAN 40.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 ,4 o 5, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde el tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 está encapsulo en los nanovehículos sintéticos, presente en la superficie de los nanovehículos sintéticos, o ambos.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 6, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde:

(i) la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es > 0,1 pero < 15% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/peso de material vehículo hidrófobo;

(ii) la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es > 1 pero < 13% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/peso de material vehículo hidrófobo; o

(iii) la cantidad de tensioactivo no iónico con valor de HLB menor o igual a 10 es > 1 pero < 9% en peso de tensioactivo no iónico con un valor de HLB menor o igual a 10/peso de material vehículo hidrófobo.

8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 7, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde:

(i) el material vehículo hidrófobo comprende uno o más polímeros hidrófobos o lípidos;

(ii) el material vehículo hidrófobo comprende uno o más polímeros hidrófobos, y

en donde el uno o más polímeros hidrófobos comprenden un poliéster, preferiblemente en donde el poliéster comprende PLA, PLG, PLGA o policaprolactona;

(iii) el material vehículo hidrófobo comprende uno o más polímeros hidrófobos, y

en donde el uno o más polímeros hidrófobos comprenden un poliéster, preferiblemente en donde el poliéster comprende PLA, PLG, PLGA o policaprolactona, y en donde el material vehículo hidrófobo comprende o comprende además PLA-PEG, PLGA-PEG o PCL-PEG.

9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 8, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en donde:

(i) la cantidad de material vehículo hidrófobo en los nanovehículos sintéticos es 5-95% en peso de material vehículo hidrófobo/sólidos totales; o

(ii) la cantidad de material vehículo hidrófobo en los nanovehículos sintéticos es 60-95% en peso de material vehículo hidrófobo/sólidos totales.

10. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 9, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en donde:

(i) la cantidad de rapalogo es > 6 pero < 50% en peso de rapalogo/peso de material vehículo hidrófobo;

(ii) la cantidad de rapalogo es > 7 pero < 30% en peso de rapalogo/peso de material vehículo hidrófobo; o

(iii) la cantidad de rapalogo es > 8 pero < 24% en peso de rapalogo/peso de material vehículo hidrófobo.

11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 10, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde el rapalogo está encapsulado en los nanovehículos sintéticos y/o en donde el rapalogo es rapamicina.

12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 11, en donde:

(i) la composición comprende además un antígeno; o

(ii) la composición comprende además un antígeno, en donde el antígeno se mezcla con los nanovehículos sintéticos en la composición.

13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 12, en donde la media de una distribución de tamaño de partículas obtenida usando la dispersión dinámica de luz de los nanovehículos sintéticos es un diámetro mayor que 120 nm, preferiblemente en donde el diámetro es mayor que 150 nm.

14. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 13, en donde la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Un kit que comprende: la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 14.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en donde:

(i) el método comprende además filtrar la composición resultante; o

(ii) el método comprende además filtrar la composición resultante,

en donde la filtración comprende filtrar a través de un filtro de 0,22 pm.

17. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 14 para usar en la modulación de una respuesta inmunitaria.