ES2847124T3 - Anticuerpos humanos contra la proteína asociada a la resistencia sérica de Trypanosoma brucei rhodesiense - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal totalmente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína asociada a la resistencia sérica (SRA) de Trypanosoma spp, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de las SEQ ID NOs 66/74 y en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es una lgG1.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos humanos contra la proteína asociada a la resistencia sérica de Trypanosoma brucei rhodesiense

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos humanos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos humanos que se unen específicamente a la proteína asociada a la resistencia sérica (SRA) en Trypanosoma brucei rhodesiense y métodos terapéuticos para usar esos anticuerpos.

Exposición de la técnica relacionada

Trypanosoma brucei rhodesiense es el agente causante de la forma aguda de la tripanosomiasis africana humana, una enfermedad letal endémica del África subsahariana. La enfermedad, también conocida como enfermedad del sueño, se presenta de dos formas: una forma causada por T. brucei gambiense que se produce al oeste del Gran Valle del Rift; y una forma aguda causada por T. brucei rhodesiense que se produce al este del Gran Valle del Rift en África. La tripanosomiasis es una zoonosis transmitida por la mosca tsetsé (Glossina spp.) a los seres humanos y animales como el ganado y la caza silvestre. Los parásitos presentan varias estadios vitales en el hospedador mamífero y en el vector la mosca tsetsé.

T. brucei rhodesiense produce una proteína asociada a la resistencia sérica (SRA) que se une a la apolipoproteína L1 (apoL1) humana y neutraliza la actividad tripanolítica del suero humano. Los anticuerpos policlonales contra SRA han sido descritos por Milner et al 1999 en Mol. Biochem. Parasitol. 104: 271-283 y en la Patente de los Estados Unidos N.° 7585511. El documento WO2007039645 describe un factor tripanolítico conjugado con nanocuerpo para tratar la tripanosomiasis.

Pays et al. (Nature Reviews Microbiology 4.6(2006): 477-486) se refiere al factor tripanolítico del suero humano. Wang et al. (Molecular and biochemical parasitology 128.2 (2003): 135-145) se refiere a las características estructurales que afectan a la expresión de la glicoproteína de superficie variante en Trypanosoma brucei. Clarke et al. (Molecular immunology 24.7 (1987): 707-713) se refiere a las características estructurales de los determinantes antigénicos en glicoproteínas de superficie variantes de Trypanosoma brucei. Hall et al. (The Journal of Immunology 132.4 (1984): 2059-2063) se refiere a la cartografía topológica de epítopos protectores y no protectores en la glicoproteína de superficie variante del clon WRATat 1 de Trypanosoma brucei rhodesiense. Milner et al. (Molecular and biochemical parasitology 104.2 (1999): 271-283) se refiere a la expresión y localización de la proteína asociada a la resistencia sérica en Trypanosoma brucei rhodesiense. Vanhamme et al. (Nature 422.6927 (2003): 83-87) se refiere a la apolipoproteína LI como el factor lítico de tripanosomas del suero humano. El documento WO 2004/012757 se refiere a la apolipoproteína L-l y/o polipéptido derivado para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inducidas por Trypanosoma.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína asociada a la resistencia sérica (SRA) de Trypanosoma spp, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de las SEQ ID NOs 66/74 y en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es una lgG1.

En el presente documento se describen anticuerpos monoclonales (mAb) totalmente humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a la SRA tripanosomal. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para neutralizar la actividad de SRA y pueden actuar para disminuir la gravedad de una afección o enfermedad asociada a la enfermedad del sueño, o reducir el número, la duración o la gravedad de la recurrencia de la enfermedad, o mejorar al menos un síntoma asociado con la afección o enfermedad asociada a la enfermedad del sueño. Dichos anticuerpos pueden usarse solos o junto con un segundo agente útil para tratar una afección o enfermedad asociada a la enfermedad del sueño. En determinados aspectos, los anticuerpos pueden usarse profilácticamente como terapia independiente para proteger a los pacientes que están en riesgo de desarrollar una afección o enfermedad asociada con la enfermedad del sueño.

Los anticuerpos de la divulgación pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo lgG1 o lgG4) o pueden comprender únicamente una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv) y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, p. ej., para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., (2000), J. Immunol. 164:1925-1933).

En consecuencia, en el presente documento se describe un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la SRA tripanosomal. En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SRA.

En determinados aspectos, el anticuerpo se une a la SRA de longitud completa o un fragmento de la misma como se ilustra por las SEQ ID NOs: 289 y 290. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a la SRA recombinante o un fragmento de la misma como se ilustra por las SEQ ID NOs: 291,292, 293, 294, 295 o 296. En determinados aspectos, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno se une a SRA con una K^d igual a o inferior a 10-10 M, medida por resonancia de plasmón superficial. En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a SRA a 25 °C y un pH ácido con una semivida (t1^ ) disociativa de menos de aproximadamente 4 minutos, en donde el anticuerpo se une a SRA a 25 °C a pH neutro con una t1^ superior a aproximadamente 20 minutos, determinado mediante resonancia de plasmón superficial. En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a SRA a 25 °C y un pH ácido con una semivida (t1^ ) disociativa de menos de aproximadamente 100 minutos, en donde el anticuerpo se une a SRA a 25 °C a pH neutro con una t1^ superior a aproximadamente 150 minutos, determinado mediante resonancia de plasmón superficial. En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a SRA a pH ácido y a pH neutro, en donde la constante de velocidad de disociación (kd) para la unión del anticuerpo a SRA a 25 °C es inferior a aproximadamente 1,7 x 10-2, determinado mediante resonancia de plasmón superficial.

En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA bloquea la unión de SRA a la apolipoproteína humana (apoL1). En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA no bloquea la unión de SRA a apoL1.

En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a SRA a un pH que varía de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 4,5. En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a SRA a aproximadamente pH 7,4 y permanece unido a aproximadamente pH 4,5. En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA bloquea la unión de SRA a apoL1 a un pH que varía de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 4,5.

En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a SRA, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo en s Ra (SEQ ID NO: 290) que comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S-174, 1-175, V-176, K-177, K-178, P-179, K-180, G-181, A-182, P-183, D-184, K-185, T-186, A-187, A-188, D-189, E-190, L-191, V-192, T-193 y A-194.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA comprende las tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (CDR) (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas en una cualquiera de las secuencias de la región variable de la cadena pesada (HCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, y 274; y las tres CDR de la cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en una cualquiera de las secuencias de la región variable de la cadena ligera (LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, y 282. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR se conocen bien en la técnica y pueden usarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de la región o regiones variables de la cadena pesada (HCVR) y/o región o regiones variables de la cadena ligera (LCVR) específicas divulgadas en el presente documento. Las convenciones de ejemplo que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, p. ej., la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales, y la definición de AbM es un término medio entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véase, p. ej., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., (1997), J. Mol. Biol. 273:927-948; y Martin et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272. También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, y 274.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, y 282.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA comprende (a) una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, y 274; y (b) una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID n O: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, y 282.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SRA comprende:

(a) un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, y 276;

(b) un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, y 278;

(c) un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, y 280;

(d) un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, y 284;

(e) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, y 286; y

(f) un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, y 288.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, y 274/282.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, y 274, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, y 282, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, y 280, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, y 288, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, y 276, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, y 278, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, y 284, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, y 286, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y (v) se une a SRA con una Kd igual a o inferior a 10-10, medida por resonancia de plasmón superficial.

También se describe en el presente documento un anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1, en donde el anticuerpo comprende las tres CDR de la cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 66, 98, 130, 146, 162, 210, 226, 242, 258, y 274; y las tres CDR de la cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 74, 106, 138, 154, 170, 218, 234, 250, 266, y 282.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1 comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 66, 98, 130, 146, 162, 210, 226, 242, 258, y 274.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1 comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 74, 106, 138, 154, 170, 218, 234, 250, 266, y 282.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1 comprende (a) una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n Os: 66, 98, 130, 146, 162, 210, 226, 242, 258, y 274; y (b) una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID n O: 74, 106, 138, 154, 170, 218, 234, 250, 266, y 282.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1 comprende:

(a) un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 68, 100, 132, 148, 164, 212, 228, 244, 260, y 276;

(b) un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 70, 102, 134, 150, 166, 214, 230, 246, 262, y 278;

(c) un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 72, 104, 136, 152, 168, 216, 232, 248, 264, y 280;

(d) un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 76, 108, 140, 156, 172, 220, 236, 252, 268, y 284;

(e) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 78, 110, 142, 158, 174, 222, 238, 254, 270, y 286; y

(f) un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 80, 112, 144, 160, 176, 224, 240, 256, 272, y 288.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 66/74, 98/106, 130/138, 146/154, 162/170, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, y 274/282.

En un aspecto, se describe en el presente documento un anticuerpo monoclonal totalmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID n O: 66, 98, 130, 146, 162, 210, 226, 242, 258, y 274, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 74, 106, 138, 154, 170, 218, 234, 250, 266, y 282, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ iD NO: 72, 104, 136, 152, 168, 216, 232, 248, 264, y 280, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 80, 112, 144, 160, 176, 224, 240, 256, 272, y 288, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 68, 100, 132, 148, 164, 212, 228, 244, 260, y 276, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 70, 102, 134, 150, 166, 214, 230, 246, 262, y 278, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 76, 108, 140, 156, 172, 220, 236, 252, 268, y 284, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 78, 110, 142, 158, 174, 222, 238, 254, 270, y 286, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a SRA con una K^d igual a o inferior a 10-10 determinado mediante resonancia de plasmón superficial; y (vi) bloquea la unión de SRA a apoL1 a un pH que varía de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 4,5.

En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que neutraliza o bloquea la actividad de resistencia en el suero humano de la SRA que comprende las CDR de una HCVR, en donde cada HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 66, 98, 130, 146, 162, 210, 226, 242, 258, y 274; y las CDR de una LCVR, en donde la LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 74, 106, 138, 154, 170, 218, 234, 250, 266, y 282.

En determinados aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1 puede unirse al mismo epítopo en la SRA que la apoL1 o puede unirse a un epítopo diferente en la SRA que la apoL1.

En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1 se une a uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 174­ 194 de SRA (SEQ ID NO: 290). En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1 se une a uno o más aminoácidos de la SEQ ID NO: 301.

En un aspecto relacionado, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1 se une a un dominio de unión a apoL1 de SRA. En un aspecto, el dominio de unión a apoL1 de SRA comprende los aminoácidos 202-222 de la SRA de longitud completa.

En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1 se une fuera del dominio de unión a apoL1 de la SRA. En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo puede bloquear la unión de SRA a apoL1 debido al impedimento estérico.

También se describe en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que presenta unión a SRA en un amplio intervalo de pH. En determinados aspectos, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA a pH neutro y a pH ácido. En algunos aspectos, la divulgación incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA a pH neutro y que permanece unido a pH ácido. Por ejemplo, se describen en el presente documento anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a SRA a un pH que varía de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 4,5. En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a SRA a pH 7,4 y a pH 4,5. En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a SRA a pH 7,4 y permanece unido hasta pH 4,5. Por ejemplo, el anticuerpo mantiene su unión a SRA a pH 7,4, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0 y 4,5.

Las características de unión de un anticuerpo anti-SRA se pueden cuantificar in vitro, p. ej., por resonancia de plasmón superficial, que proporciona valores numéricos de las propiedades de unión (por ejemplo, ka, kd, K^d, t1^ , etc.) para la unión del anticuerpo a SRA a pH neutro y a pH ácido. La unión se puede estudiar a 25 °C.

En algunos aspectos, la divulgación incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a SRA a pH ácido con una t1^ de menos de aproximadamente 4 minutos, en donde el anticuerpo se une a SRA a pH neutro con una t1^ superior a aproximadamente 20 minutos. En un aspecto, la divulgación incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA a pH ácido con una t1^ inferior a aproximadamente 100 minutos, en donde el anticuerpo se une a SRA a pH neutro con una t1^ superior a aproximadamente 150 minutos.

En un aspecto, la divulgación incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA a pH neutro y pH ácido, en donde la kd para la unión del anticuerpo a SRA es inferior a aproximadamente 1,7 x 10-2, determinado mediante resonancia de plasmón superficial.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA a un pH neutro y a un pH ácido comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, y 274/282.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, y 274, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, y 282, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, y 280, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, y 288, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, y 276, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, y 278, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, y 284, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, y 286, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y (v) se une a SRA con una K^d igual a o inferior a 10-10 determinado mediante resonancia de plasmón superficial; y (vi) se une a SRA a un pH que varía de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 4,5.

En aspectos relacionados, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a SRA a pH ácido bloquean o impiden la unión de SRA a apoL1.

En determinados aspectos, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA a pH ácido y que bloquea la unión de SRA a apoL1 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 66/74, 98/106, 130/138, 146/154, 162/170, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, y 274/282.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA a pH ácido y que bloquea la unión de SRA a apoL1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ iD NO: 66, 98, 130, 146, 162, 210, 226, 242, 258, y 274, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 74, 106, 138, 154, 170, 218, 234, 250, 266, y 282, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la Se Q ID NO: 72, 104, 136, 152, 168, 216, 232, 248, 264, y 280, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 80, 112, 144, 160, 176, 224, 240, 256, 272, y 288, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 68, 100, 132, 148, 164, 212, 228, 244, 260, y 276, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 70, 102, 134, 150, 166, 214, 230, 246, 262, y 278, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 76, 108, 140, 156, 172, 220, 236, 252, 268, y 284, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 78, 110, 142, 158, 174, 222, 238, 254, 270, y 286, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a SRA con una K^d igual a o inferior a 10-10; (vi) se une a SRA a un pH que varía de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 4,5; y (vii) bloquea la unión de SRA a apoL1 a pH 4,5.

También se describe en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión específica a SRA con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las CDR de una HCVR, en donde cada HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, y 274; y las CDR de una LCVR, en donde la LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, y 282.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión específica a SRA con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las CDR de la cadena pesada y ligera contenidas en pares de secuencias de la cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 66/74, 98/106, 130/138, 146/154, 162/170, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, y 274/282.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en SRA que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las CDR de una HCVR, en donde cada HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 66, 98, 130, 146, 162, 210, 226, 242, 258, y 274; y las CDR de una LCVR, en donde la LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 74, 106, 138, 154, 170, 218, 234, 250, 266, y 282.

En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en SRA que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las CDR de la cadena pesada y ligera contenidas en pares de secuencias de la cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 66/74, 98/106, 130/138, 146/154, 162/170, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, y 274/282.

En determinados aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo en SRA que comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 202-222 de la SRA de longitud completa (SEQ ID NO: 289). En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo en SRA que comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 202-220 de la SRA de longitud completa (SEQ ID NO: 289). En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo en SRA que comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 174-194 de la SEQ ID NO: 290.

En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al dominio de unión a apoL1 de SRA. En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une fuera del dominio de unión a apoL1 de SRA.

La invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-SRA o fragmentos de los mismos de la invención. Los vectores de expresión recombinante que portan los ácidos nucleicos de la invención, y células hospedadoras en que se han introducido dichos vectores, también están abarcados por la invención, así como métodos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257 y 273, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.

En un aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265 y 281, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.

En un aspecto, la divulgación también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, y 279, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, y 287, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende además un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259 y 275, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos del grupo que consiste en la SEQ ID NO 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, y 277, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos del grupo que consiste en la SEQ ID NO 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, y 283, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, y 285, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención que se une específicamente a SRA y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo que comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 174-194 de SRA (SEQ ID NO: 290) y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un fragmento N-terminal de SRA y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende dos anticuerpos monoclonales totalmente humanos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a SRA, uno que bloquea la unión de SRA a apoL1 y uno que no bloquea la unión de SRA a apoL1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal totalmente humano de unión doble (un anticuerpo que se une al dominio de unión a apoL1 y fuera del dominio de unión a apoL1 de SRA) y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos monoclonales totalmente humanos de unión doble y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Debe entenderse que cualquier combinación de anticuerpos como se describe en el presente documento puede usarse en una composición farmacéutica para lograr los resultados deseados en la población de pacientes que necesita dicha terapia. Por ejemplo, en una composición se pueden usar dos anticuerpos que reconocen y/o se unen solo al dominio de unión a apoL1 de SRA. Como alternativa, en una composición se pueden usar dos anticuerpos que reconocen y/o se unen fuera del dominio de unión a apoL1 de SRA. En un aspecto, un anticuerpo que reconoce/se une solo al dominio de unión a apoL1 o a un dominio de unión no apoL1 de SAR se puede combinar con un anticuerpo de unión doble en una composición.

En el presente documento se describen composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos (como se divulga en otro lugar del presente documento) o combinaciones de anticuerpos individuales, dobles o multiespecíficos contra SRA.

En un aspecto, la composición comprende un anticuerpo que se une a SRA y que tiene un par de secuencias de aminoácidos de HCVr /lCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, y 274/282.

En un aspecto, la composición farmacéutica comprende un primer anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al dominio de unión a apoL1 de SRA, como se describe en el presente documento, y un segundo anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente fuera del dominio de unión a apoL1 de SRA, como se describe en el presente documento, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En una realización, la invención presenta una composición, que es una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, y un segundo agente terapéutico.

El segundo agente terapéutico puede ser un agente de molécula pequeña, una proteína/polipéptido, un anticuerpo, una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula antisentido, o un ARNip. El segundo agente terapéutico puede ser un agente de origen sintético o natural.

El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que se combine de forma ventajosa con el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, por ejemplo, un antibiótico, un fármaco antiinflamatorio, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un suplemento nutricional, o un segundo anticuerpo diferente contra SRA o cualquier otro antígeno de T. brucei rhodesiense, o cualquier otro agente anti-tripanosomal, tales como suramina, melarsoprol, eflornitina o nifurtimox.

En determinadas realizaciones, el segundo agente terapéutico puede ser un agente que ayude a contrarrestar o reducir cualquier posible efecto o efectos secundarios asociados con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, si ocurriera dicho efecto o efectos.

También se apreciará que los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden emplearse en terapias combinadas, es decir, los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables se pueden administrar simultáneamente con, antes que o después de, uno o más de los diferentes procedimientos terapéuticos o médicos deseados. La combinación particular de terapias (productos terapéuticos o procedimientos) para emplear en un régimen combinado tendrá en cuenta la compatibilidad de los productos terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se debe lograr. Se apreciará también que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un anticuerpo puede administrarse simultáneamente con otro agente usado para tratar el mismo trastorno) o pueden lograr efectos diferentes (p. ej., control de cualquier efecto adverso). Como se usan en la presente memoria, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad, o afección, en particular, son adecuados para la enfermedad, o afección, que se van a tratar. Cuando se administran de forma simultánea múltiples agentes terapéuticos, las dosis se pueden ajustar en consecuencia, como se reconoce en el campo pertinente.

La invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica de la invención para su uso en un método de tratamiento de un paciente que sufre la enfermedad del sueño, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociado con la enfermedad del sueño, o para tratar a un paciente. en riesgo de desarrollar enfermedad del sueño, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; o composición farmacéutica, de manera que la enfermedad del sueño se prevenga o disminuya en gravedad y/o duración, o se prevenga o mejore al menos un síntoma o complicación asociados con la enfermedad del sueño, o que la frecuencia y/o duración de, la gravedad de la enfermedad del sueño se reduzca. En una realización, el anticuerpo se administra terapéuticamente (administrado después de que se haya establecido la enfermedad del sueño y se haya administrado durante el transcurso de la enfermedad) a un paciente que padece la enfermedad del sueño o que padece al menos un síntoma o complicación asociado con la enfermedad del sueño. En una realización, el anticuerpo se administra profilácticamente (administrado antes del desarrollo de la afección) a un paciente con riesgo de desarrollar enfermedad del sueño. Por ejemplo, dichos "pacientes en riesgo de desarrollar la enfermedad del sueño" incluyen personas de regiones de gran incidencia de infestación por la mosca tsetsé, cazadores y otros visitantes de África, incluyendo visitantes de los parques de safaris, los niños nacidos de madres infectadas y las personas que han tenido contacto sexual con o transfusión de sangre de personas infectadas.

En una realización, la composición farmacéutica que comprende los anticuerpos de la invención se administra al paciente en combinación con un segundo agente terapéutico.

En otra realización, el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un fármaco antiinflamatorio, un AINE, y suplementos nutricionales tales como un antioxidante, otro anticuerpo frente a SRA o cualquier otro antígeno tripanosomal, o cualquier otro agente anti-tripanosomal, tales como suramina, melarsoprol, eflornitina o nifurtimox, variante de apoL1, y cualquier otra terapia útil para mejorar al menos un síntoma asociado con una afección o enfermedad asociada con la enfermedad del sueño.

En algunas realizaciones, el al menos un síntoma o complicación asociado con la enfermedad del sueño se selecciona del grupo que consiste en fiebre, dolores de cabeza, dolor articular, picor, inflamación grave de los ganglios linfáticos, anemia, trastorno endocrino, disfunción cardíaca o renal, confusión, coordinación reducida, interrupción del ciclo del sueño con episodios de fatiga interrumpidos por períodos maníacos que conducen al sueño diurno e insomnio nocturno, degradación rápida de la calidad de vida y muerte del paciente que padece la afección o enfermedad de la enfermedad del sueño.

En realizaciones de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo se administra por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, oral, intraperitoneal, intramuscular o intracraneal. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra en dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal, más específicamente de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal.

En aspectos relacionados, la divulgación incluye el uso de un anticuerpo anti-SRA aislado o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado o provocado por la actividad de SRA. En un aspecto, la divulgación incluye el uso de un anticuerpo anti-SRA de la divulgación en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o corre el riesgo de desarrollar la enfermedad del sueño.

También se describen en el presente documento métodos para diagnosticar la enfermedad del sueño en un paciente, comprendiendo el método hacer reaccionar una proteína SRA del paciente con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la divulgación, en donde la unión con SRA indica la presencia de la enfermedad del sueño.

En un aspecto, la divulgación presenta un método para predecir una mala supervivencia en un paciente que padece enfermedad del sueño, comprendiendo el método hacer reaccionar una proteína SRA del paciente con un anticuerpo aislado de la divulgación descrito en el presente documento, en donde la unión fuerte con SRA indica una mala supervivencia.

En un aspecto, la SRA de un paciente se obtiene de la sangre, suero, plasma, o biopsia de un tejido del paciente.

Otros aspectos resultarán evidentes tras la revisión de la descripción detallada adjunta.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática del protocolo utilizado para la cartografía del epítopo H/DX de SRA contra el péptido apoL1.

La Figura 2 muestra un gráfico de la respuesta de unión de Octet durante el ensayo de competición cruzada de SRA.

La Figura 3 muestra los resultados del ensayo de competición cruzada Octet 31X31.

Descripción detallada

Antes de describir los presentes métodos, se ha de entender que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales preferidos.

Definiciones

El término "SRA" se refiere a la proteína asociada a la resistencia sérica de Trypanosoma brucei rhodesiense. La secuencia de aminoácidos de SRA de longitud completa se proporciona en GenBank con número de registro CAA85518.2 y también se denomina en el presente documento como SEQ ID NO: 289. SRA también se encuentra en GenBank con número de registro AAC72381.1 y secuencias parciales de SRA con números de registro CAD90580.1 y CAC87890.1. El término "SRA" también incluye variantes de la proteína SRA que tienen la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 290, 291, 292, 293, 294, 295 o 296. El término "SRA" incluye SRA recombinante o un fragmento de la misma como se ilustra por la SEQ ID NO: 290. El término también abarca SRA o un fragmento de la misma acoplada a, por ejemplo, una etiqueta de histidina, Fc de ratón o humano, o una secuencia de señal tal como ROR1. Por ejemplo, el término incluye secuencias ilustradas por las SEQ ID NOs: 291, 292 o 293, que comprenden la secuencia de señal mROR1 (aa 1-29) en el extremo N-terminal, y una etiqueta de histidina o Fc de ratón (mlgG2a) o Fc humano (hlgG1) en el extremo C terminal, acoplado a los restos de aminoácidos 29-274 de SRA de longitud completa. Las variantes de proteína ilustradas por las SEQ ID NOs: 294, 295 y 296 comprenden la secuencia de señal mROR1 (aa 1-29) en el extremo N-terminal, y una etiqueta de histidina o Fc de ratón (mlgG2a) o Fc humano (hlgG1) en el extremo C terminal, acoplado a los restos de aminoácidos 29-388 de SRA de longitud completa.

SRA es un miembro de la familia de glicoproteínas de superficie variante (VSG) de tripanosomas. VSG cubre toda la membrana plasmática del parásito. SRA es una proteína de 410 aminoácidos con una horquilla N-terminal larga que contiene dos hélices alfa anfipáticas (Pays et al 2006, Nature Rev. Microbiol. 4: 477-486). El gen SRA solo se encuentra en T. brucei rhodesiense y la proteína SRA se expresa solo en las variantes de T. brucei rhodesiense que son resistentes al suero humano (o de primates). Las variantes de T.brucei rhodesiense que no expresan SRA son sensibles al factor tripanolítico o apolipoproteína L1 (apoL1) presente en el suero de humanos o primates.

El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro (es decir, "moléculas de anticuerpo completo"), así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM) o fragmentos de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada ("HCVR" o "V^h") y una región constante de la cadena pesada (comprendida por los dominios C^h1, C^h2 y C^h3). Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera ("LCVR o "V^l") y una región constante de la cadena ligera (C^l). Las regiones V^h y V^l pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada V^h y V^l está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las FR del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse natural o artificialmente. Una secuencia consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis paralelo de dos o más CDR.

También es posible la sustitución de uno o más restos de CDR o la omisión de una o más CDR. Se han descrito anticuerpos en la bibliografía científica en los que se puede prescindir de una o dos CDR para la unión. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) analizaron las regiones de contacto entre los anticuerpos y sus antígenos, basándose en estructuras cristalinas publicadas, y concluyeron que solo aproximadamente de un quinto a un tercio de los restos de CDR realmente entran en contacto con el antígeno. Padlan también descubrió muchos anticuerpos en los que una o dos CDR no tenían aminoácidos en contacto con un antígeno (véase también, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).

Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno se pueden identificar basándose en estudios anteriores (por ejemplo, los restos H60-H65 en CDRH2 a menudo no son necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de CDR de Chothia, por modelización molecular y/o empíricamente. Si se omite una CDR o uno o más restos de la misma, generalmente se sustituye con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de dichas secuencias. Las posiciones para la sustitución dentro de CDR y los aminoácidos a sustituir también pueden seleccionarse empíricamente. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservadoras o no conservadoras.

Los anticuerpos monoclonales anti-SRA totalmente humanos divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de la cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos que se divulgan en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. En este documento se describen anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se obtienen a partir de cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se divulgan en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservadora del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto habitual en la técnica, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera que se divulgan en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones de la línea germinal individuales o combinaciones de las mismas. En determinados aspectos, todos los restos de la región marco y/o CDR dentro de los dominios V^h y/o V^l mutan de vuelta a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros aspectos, únicamente determinados restos mutan de vuelta a la secuencia de la línea germinal original, p. ej., únicamente los restos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros aspectos, uno o más del resto o restos marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la cual se obtuvo originalmente el anticuerpo). Adicionalmente, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, p. ej., en donde ciertos restos individuales están mutados en el resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o están mutados en el resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden ensayarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), menor inmunogenicidad, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están incluidos en la presente divulgación.

También se describe en el presente documento anticuerpos monoclonales anti-SRA totalmente humanos que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-SRA que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservadoras de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los mAb humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria, no pretende incluir mAb en que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero (por ejemplo, ratón), se han injertado en secuencias FR humanas.

La expresión "se une específicamente", o "se une específicamente a", o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica puede caracterizarse por una constante de disociación en el equilibrio de al menos aproximadamente 1x10-9 M o menos (por ejemplo, una K^d menor indica una unión más estrecha). Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Como se describe en el presente documento, los anticuerpos se han identificado mediante resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE™, que se une específicamente a SRA. Por otra parte, los anticuerpos multiespecíficos, que se unen a un dominio en SRA y uno o más antígenos adicionales o uno biespecífico que se une a dos regiones diferentes de SRA se consideran, no obstante, anticuerpos que se "unen específicamente", como se usa en el presente documento.

La expresión anticuerpo "de alta afinidad" se refiere a aquellos mAb que tienen una afinidad de unión a SRA, expresada como K^d, de al menos 10-8 M; preferentemente 10-9 M; más preferentemente de 10-10 M, incluso más preferentemente de 10-11 M, incluso más preferentemente de 10-12 M, medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE™ o ELISA de afinidad en solución.

Por la expresión "disociación lenta", "Koff" o "kd" se entiende un anticuerpo que se disocia de SRA, con una constante de velocidad de 1 x 10-3 s-1 o menos, preferentemente 1 x 10-4 s-1 o menos, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE™.

Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en la presente memoria, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se usa en la presente memoria, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse a SRA.

En realizaciones específicas, un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden estar conjugados a una fracción tal como un ligando o una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como un antibiótico, un segundo anticuerpo anti-SRA, o un anticuerpo contra cualquier otro antígeno tripanosomal, o una inmunotoxina, o cualquier otra fracción terapéutica útil para tratar una enfermedad o afección incluida la enfermedad del sueño.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente memoria, pretende hacer referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos (Abs) que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a SRA o un fragmento del mismo, está sustancialmente exento de Abs que se unen específicamente a antígenos diferentes a SRA.

Un "anticuerpo de bloqueo" o un "anticuerpo neutralizante", como se usa en el presente documento (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de SRA"), pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión a SRA da como resultado la inhibición de al menos una actividad biológica de SRA. Por ejemplo, un anticuerpo de la divulgación puede prevenir la unión de SRA a apoL1, preferentemente a aproximadamente pH 4,5.

La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biomoleculares en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biodetectora, por ejemplo usando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor a B, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.).

El término "K^d", como se usa en la presente memoria, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción particular de anticuerpo-antígeno.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno o puede tener diferentes efectos biológicos. El término "epítopo"se refiere también a un lugar sobre un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. También se refiere a una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos de aminoácidos no lineales. En determinados aspectos, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales glucídicas, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinados aspectos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas.

La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 90 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o GAP, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en ciertos casos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar al polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 90 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos, que no son idénticas, difieren en sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje o grado de similitud puede ajustarse a la alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, p. ej., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalaninatirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 144345. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La similitud de secuencia para polipéptidos se mide normalmente usando un software de análisis de secuencia. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, p. ej., GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferente al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, p. ej., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y (1997) Nucleic Acids Res.

25:3389-3402.

En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo para usar en el método de la invención puede ser monoespecífico, biespecífico, o multiespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para epítopos de más de un polipéptido diana. Un formato de anticuerpo biespecífico de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio C^h3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio C^h3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio C^h3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio C^h3 de Ig está unido a la proteína A y el segundo dominio C^h3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A tal como una modificación en H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo C^h3 puede comprender además una modificación en Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C^h3 incluyen: D16E, L18M, N44S, k 52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de los mAb lgG1; N44S, K52N, y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de los mAb lgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de los mAb lgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo bi-específico descrito anteriormente.

Por la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, y un experto en la materia podrá determinarla usando técnicas conocidas (véanse, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

La expresión "enfermedad del sueño", como se usa en la presente memoria, se refiere a la tripanosomiasis humana causada por dos subespecies del protozoo flagelado Trypanosoma brucei, concretamente T. brucei gambiense y T. brucei rhodesiense. T. brucei rhodesiense provoca la forma aguda y grave de la enfermedad del sueño, también denominada enfermedad del sueño de África Oriental. Es una infección letal transmitida por la mosca tsetsé en los seres humanos y en el ganado y otros animales domésticos y salvajes. La enfermedad del sueño se caracteriza por fiebre, cefalea, dolor articular y linfadenopatías, entre otros síntomas, en la fase inicial. La segunda fase de la enfermedad es neurológica en la que el parásito invade el sistema nervioso central cruzando la barrera hematoencefálica y provoca síntomas como confusión y alteración del comportamiento del sueño. El parásito tripanosomal produce triptofol, una sustancia química que induce el sueño en el hospedador; de ahí el nombre de la enfermedad. Sin tratamiento, la enfermedad es invariablemente fatal.

Descripción general

Los seres humanos son resistentes a los patógenos tripanosomales debido a un factor de inmunidad innato presente en el suero humano, el factor lítico tripanosómico (TLF) que lisa los patógenos tripanosomales (Rifkin 1978, PNAS 75: 3450-3454). El TLF es un subgrupo de la fracción de lipoproteínas de alta densidad (HDL) del suero humano. El componente tripanolítico clave del TLF es la apolipoproteína L1 (apoL1). Los otros componentes importantes del TLF son la apoA1 y la proteína relacionada con la haptoglobina (Hpr), que se une a la hemoglobina (Hb) sérica libre. La endocitosis de HDL que contiene apoL1 se produce a través de un receptor en la bolsa flagelar que reconoce el dímero Hpr-Hb. (Vanhamme et al 2003, Nature 422: 83-87; Vanhollebeke et al 2007, PNAS 104:4118-4123). El TLF que contiene apoL1 endocitosado se transfiere al lisosoma. La ApoL1 contiene un poro de membrana selectivo de aniones, similar al de las colicinas bacterianas. Cuando se inserta en la membrana lisosomal, este poro permite la entrada de iones cloruro en el lisosoma, lo que desencadena la entrada simultánea de agua y la hinchazón incontrolada de la vacuola hasta que el parásito muere (Pérez-Morga, et al 2005, Science 309: 469-472).

Sin embargo, T. brucei gambiense y T. brucei rhodesiense son resistentes al suero humano y, por tanto, provocan una enfermedad en el ser humano. En T. brucei gambiense, la resistencia se debe a la expresión reducida del receptor de haptoglobina en la célula tripanosomal (Kieft et al 2010, PNAS 107: 16137-16141). T. brucei rhodesiense produce la proteína asociada a la resistencia sérica (SRA) que evita la acción de apoL1 (Degreef & Hamers 1994, Mol. Biochem. Parasitol. 68: 277-284). La SRA es una variante de la glicoproteína de superficie variante (VSG) que forma la capa superficial de la célula tripanosomal. La SRA se ha localizado predominantemente en el endosoma; sin embargo, no se puede descartar la presencia de SRA en la superficie o en la bolsa flagelar (Vanhamme 2010, Infectious Disorders-Drug Targets 10: 266-282). La SRA se une a apoL1 en el endosoma y evita la acción de apoL1 en el lisosoma, protegiendo así al tripanosoma de la lisis.

No existe una vacuna disponible para la enfermedad del sueño debido a la capacidad de T. brucei rhodesiense para cambiar los antígenos de su capa superficial. Los fármacos que se utilizan actualmente, como la suramina y el melarsoprol, tienen efectos secundarios graves tales como neurotoxicidad, insuficiencia renal y encefalopatía reactiva. Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de desarrollar una nueva terapia eficaz con efectos secundarios menos graves para la enfermedad del sueño.

Los anticuerpos descritos en el presente documento se unen a SRA a pH neutro y pueden permanecer unidos y bloquear la interacción de SRA con apoL1 hasta pH 4,5. El bloqueo de la interacción de SRA hace que la apoL1 esté disponible para la interacción con el lisosoma donde causa inflamación osmótica y ruptura, destruyendo así al tripanosoma. Los anticuerpos descritos en el presente documento bloquean la unión de SRA a apoL1 a pH lisosómico (pH 4,5).

Los anticuerpos descritos en el presente documento demuestran una unión específica a SRA y pueden ser útiles para tratar a pacientes que padecen la enfermedad del sueño. Los anticuerpos cuando se administran a un sujeto que padece enfermedad del sueño pueden reducir la infección por T. brucei rhodesiense en el sujeto. Pueden usarse para inhibir el crecimiento o lisar T. brucei rhodesiense en un sujeto. Pueden usarse solos o como terapia complementaria con otras fracciones terapéuticas o modalidades conocidas en la técnica para tratar la enfermedad del sueño.

En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación se obtienen de ratones inmunizados con un inmunógeno primario, tal como una SRA de longitud completa [Véase el número de registro GenBank CAA85518.2 (SEQ ID NO: 289)] o con una forma recombinante de SRA (SEQ ID NO: 290) o fragmentos de SRA modificada (SEQ ID NOs: 291­ 296), seguido de inmunización con un inmunógeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de SRA.

El inmunógeno puede ser un fragmento biológicamente activo y/o inmunogénico de SRA o ADN que codifica el fragmento activo del mismo. El fragmento puede derivarse del dominio N-terminal o C-terminal de SRA. En determinados aspectos, el inmunógeno es un fragmento de SRA que varía entre los restos de aminoácidos 29-274 de la SEQ ID NO: 289.

La secuencia de aminoácidos de longitud completa de SRA de longitud completa se muestra como la SEQ ID NO: 289.

En determinados aspectos, los anticuerpos que se unen específicamente a SRA se pueden preparar usando fragmentos de las regiones antes mencionadas, o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas en aproximadamente 5 a aproximadamente 20 restos de aminoácidos de cualquiera, o ambos, el extremo N o C terminal de las regiones descritas en el presente documento. En determinados aspectos, se puede usar cualquier combinación de las regiones mencionadas anteriormente o fragmentos de las mismas en la preparación de anticuerpos específicos de SRA. En determinados aspectos, se puede usar una cualquiera o más de las regiones de SRA indicadas anteriormente, o fragmentos de las mismas, para preparar anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos.

Anticuerpos anti-SRA con un intervalo de pH amplio

Se describen en el presente documento anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que presentan unión a SRA en un amplio intervalo de pH. Los anticuerpos de la divulgación se unen a SRA a un pH que varía desde pH neutro hasta pH ácido.

Como se usan en la presente memoria, la expresión "pH ácido" significa un pH de 6,0 o inferior. La expresión "pH ácido" incluye valores de pH de aproximadamente 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5 o menos.

Como se usan en la presente memoria, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de aproximadamente 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 y 7,4.

Las propiedades de unión de un anticuerpo para un antígeno particular pueden expresarse en términos de la kd del anticuerpo. La kd de un anticuerpo se refiere a la constante de velocidad de disociación del anticuerpo con respecto a un antígeno particular y se expresa en términos de segundos recíprocos (es decir, seg-1). La presente divulgación incluye anticuerpos que se unen a SRA con un valor kd inferior a aproximadamente 1,7 x 10-2 tanto a pH ácido como neutro.

Las propiedades de unión de un anticuerpo para un antígeno particular también pueden expresarse en términos de la t1^ del anticuerpo. La t1^ de un anticuerpo se refiere a la semivida de la interacción anticuerpo-antígeno. En determinados aspectos, la divulgación incluye anticuerpos con una t1^ de más de aproximadamente 0,5 minutos a aproximadamente 290 minutos a pH ácido y neutro.

Los valores Kd, los valores kd, y los tiempos t1^ , como se expresan en el presente documento, pueden determinarse usando un biosensor basado en resonancia de plasmón superficial para caracterizar las interacciones anticuerpoantígeno. (Véase, el Ejemplo 5 del presente documento). Los valores K^d, los valores kd y los tiempos t1^ se pueden determinar a 25 °C o 37 °C.

Se ha descubierto que la unión de los anticuerpos a SRA a pH neutro y ácido puede impartir propiedades biológicas deseables/mejoradas a los anticuerpos en comparación con los anticuerpos que se unen a SRA solo a pH neutro. Los anticuerpos que se unen a SRA a pH ácido pueden dirigirse al lisosoma en el parásito tripanosomal y, por lo tanto, pueden evitar la unión de SRA a la proteína tripanolítica apoLI. En determinados aspectos, los anticuerpos que se unen a SRA a pH ácido bloquean o evitan la unión de SRA a apoLI a pH ácido.

Fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno

A menos que se indique específicamente de otra manera, el término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, debe entenderse que abarca moléculas de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina (es decir, "moléculas de anticuerpo completo") así como sus fragmentos de unión a antígeno. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en la presente memoria, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se usa en la presente memoria, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a SRA. Un fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento que contiene una CDR, o una CDR aislada. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, p. ej., a partir de moléculas de anticuerpo completo, usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables, y opcionalmente ) constantes, de anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente a partir de, p. ej., fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, p. ej., fagotecas de anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o suprimir aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR, que está adyacente o en marco con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio V^h asociado a un dominio V^l, los dominios V^h y V^l pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros V^h-V^h, V^h - V^l o V^l - V^l. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V^h o V^l monomérico.

En determinados aspectos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente con al menos un dominio constante. Configuraciones no limitantes, ilustrativas, de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación incluyen: (i) V^h -C^h1; (ii) V^h -C^h2; (iii) V^h -C^h3; (iv) V^h -C^h1-C^h2; (v) V^h -C^h1-C^h2-C^h3; (vi) V^h -C^h2-C^h3; (vii) V^h -C^l; (viii) V^l -C^h1; (ix) V^l -C^h2; (x) V^l-C^h3; (xi) V^l -C^h1-C^h2; (xii) V^l-C^h1-C^h2-C^h3; C^h3; y (xiv) V^l-C^l. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones de ejemplo enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Por otra parte, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un homo-dímero o hetero-dímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios V^h o

V^l monoméricos (p.ej., mediante enlace(s) disulfuro).

Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente sobre el mismo antígeno.

Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico de ejemplo que se divulgan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.

Preparación de anticuerpos humanos

Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos se conocen en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente divulgación para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a SRA.

Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ (véanse, por ejemplo, US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE® o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra SRA que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a loci endógenos de regiones constantes de ratón de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada y ligera humana. A continuación, el ADN puede expresarse en una célula capaz de expresar el anticuerpo totalmente humano.

En general, se estimula un ratón VELOCIMMUNE® con el antígeno de interés, y las células linfáticas (tal como los linfocitos B) se recuperan de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales y dichas líneas celulares de hibridoma se detectan de manera sistemática y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicha proteína de anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, El

ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.

Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra SRA que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo totalmente humano de la divulgación, por ejemplo, lgGI o lgG4 de tipo silvestre o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

En general, los anticuerpos de la presente divulgación poseen afinidades muy altas, poseyendo normalmente una K^d de aproximadamente l0 '12 a aproximadamente 10'10 M, cuando se miden mediante unión a antígeno inmovilizado sobre fase sólida o en fase en solución. Las regiones constantes de ratón se remplazan con regiones constantes humanas deseadas para generar los anticuerpos totalmente humanos de la invención. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

Bioequivalentes

Los anticuerpos anti-SRA y fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían respecto a las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unión a SRA. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. De manera análoga, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación.

Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, bien en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su velocidad de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la velocidad de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, p. ej., el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado.

En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza, o potencia.

En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.

En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.

La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo y/o in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, p. ej., (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en el que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos de la divulgación pueden construirse, por ejemplo, generando diversas sustituciones de restos o secuencias o suprimiendo restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden suprimirse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse con otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo que comprenden cambios de aminoácidos, los cuales modifican las características de glicosilación de los anticuerpos, p. ej., mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.

Anticuerpos anti-SRA que comprenden variantes de Fc

De acuerdo con ciertos aspectos descritos en el presente documento, se proporcionan anticuerpos anti-SRA que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que mejoran o reducen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, p. ej., a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-SRA que comprenden una mutación en la región C^h2 o C^h3 del dominio Fc, en los que la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma en el que el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administran a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, p. ej., una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T), y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, A, W, H, F o Y [N434A, N434W, N434H, N434F o N434Y]); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F), y 434. En un aspecto, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 259I (por ejemplo, V259I), y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (p. ej., H433K) y en 434 (p. ej., 434Y); una modificación en 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación en 250Q y 428L (por ejemplo,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P). En otro aspecto más, la modificación comprende una modificación en 265A (por ejemplo, D265A) y/o una modificación en 297A (por ejemplo, N297A).

Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-SRA que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); 257I y 3111 (por ejemplo, P257I y Q3111); 2571 y 434H (por ejemplo, P257I y N434H); 376V y 434H (por ejemplo, D376V y N434H); 307A, 380A y 434A (por ejemplo, T307A, E380A y N434A); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores, y otras mutaciones dentro de los dominios variables del anticuerpo divulgados en el presente documento, se contemplan.

La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-SRA que comprenden una región constante de la cadena pesada (C^h) quimérica, en donde la región C^h quimérica comprende segmentos derivados de las regiones C^h de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos de la divulgación pueden comprender una región C^h quimérica que comprende parte o todo el dominio C^h2 derivado de una molécula de lgG1 humana, lgG2 humana o lgG4 humana, en combinación con parte o la totalidad de un dominio C^h3 derivado de una molécula de lgG1 humana, lgG2 humana o lgG4 humana. Según ciertos aspectos, los anticuerpos de la divulgación comprenden una región C^h quimérica que tiene una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de aminoácidos de "bisagra superior" (restos de aminoácidos de las posiciones 216 a 227 de acuerdo con la numeración EU) derivada de una región bisagra de una lgG1 humana, lgG2 humana o lgG4 humana, en combinación con una secuencia "bisagra inferior" (restos de aminoácidos de las posiciones 228 a 236 de acuerdo con la numeración EU) derivada de una región bisagra de una lgG1 humana, lgG2 humana o lgG4 humana. Según ciertos aspectos, la región bisagra quimérica comprende restos de aminoácidos derivados de una bisagra superior de lgG1 humana o lgG4 humana y restos de aminoácidos derivados de una bisagra inferior de lgG2 humana. Un anticuerpo que comprende una región C^h quimérica como se describe en el presente documento puede, en determinados aspectos, exhibir funciones efectoras de Fc modificadas sin afectar negativamente a las propiedades terapéuticas o farmacocinéticas del anticuerpo. (Véase, p. ej., la Sol. Provisional de EE.UU. N.° 61/759.578, presentada el 1 de febrero de 2013).

Características biológicas de los anticuerpos

En general, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar uniéndose a SRA. En algunos aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse al dominio de unión a apoL1 o fuera del dominio de unión a apoL1 de SRA, o a un fragmento de cualquier dominio. En algunos aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse a más de un dominio (anticuerpos de reactividad cruzada).

En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse a un epítopo ubicado en el dominio de unión de apoL1 que comprende los restos de aminoácidos 202-222 de SRA (SEQ ID NO: 289). En un aspecto, los anticuerpos pueden unirse a un epítopo que comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 174-194 de la SEQ ID NO: 290.

En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar bloqueando o inhibiendo la actividad de unión de apoL1 asociada con SRA al unirse a cualquier otra región o fragmento de la proteína de longitud completa, cuya secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 289. En determinados aspectos, los anticuerpos pueden atenuar o modular la interacción entre SRA y apoL1.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden unirse a un epítopo en un dominio y también pueden unirse a un epítopo en un segundo dominio de SRA. En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden unirse a dos epítopos diferentes en el mismo dominio.

En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación se unen a SRA a un pH que varía desde pH neutro hasta pH ácido. En determinados aspectos, los anticuerpos se unen a SRA a un pH que varía desde aproximadamente 7,4 hasta aproximadamente 4,5. En algunos aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación permanecen unidos a SRA desde pH 7,4 hasta pH 4,5. Se cree que los anticuerpos capaces de unirse a SRA a pH ácido pueden dirigirse al lisosoma para su degradación y pueden bloquear la unión de SRA a la proteína tripanolítica apoL1 en la célula tripanosomal. Como se ilustra en los Ejemplos del presente documento, los anticuerpos que se unen a SRA a pH ácido bloquean o evitan la unión de s Ra a apoL1. En algunos aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación bloquean la unión de SRA a apoL1 a pH 4,5.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, y 274, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, y 282, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, y 280, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, y 288, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, y 276, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, y 278, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, y 284, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, y 286, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a SRA con una K^d igual a o inferior a 10-10; y (vi) se une a SRA a pH 7,4 y sigue unido a pH 4,5.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de SRA a apoL1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la Se Q ID No : 66, 98, 130, 146, 162, 210, 226, 242, 258, y 274, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la Se Q ID n O: 74, 106, 138, 154, 170, 218, 234, 250, 266, y 282, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 72, 104, 136, 152, 168, 216, 232, 248, 264, y 280, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 80, 112, 144, 160, 176, 224, 240, 256, 272, y 288, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 68, 100, 132, 148, 164, 212, 228, 244, 260, y 276, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 70, 102, 134, 150, 166, 214, 230, 246, 262, y 278, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 76, 108, 140, 156, 172, 220, 236, 252, 268, y 284, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 78, 110, 142, 158, 174, 222, 238, 254, 270, y 286, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) demuestra una K^d igual a o inferior a 10-10; (vi) se une a SRA a un pH que varía de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 4,5; y (vii) bloquea la unión de SRA a apoL1.

Ciertos anticuerpos anti-SRA de la presente divulgación pueden unirse y neutralizar la actividad de SRA, según lo determinado en ensayos in vitro o in vivo. La capacidad de los anticuerpos de la divulgación para unirse y neutralizar la actividad de SRA puede medirse usando cualquier método estándar conocido por los expertos en la materia, incluyendo ensayos de unión o ensayos de actividad, como se describe en el presente documento.

Configuraciones no limitantes, ilustrativas de ensayos in vitro para medir la actividad de unión se ilustran en los Ejemplos 5, 6 y 7, en el presente documento. En el Ejemplo 5, las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos anti-SRA humanos se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial y las mediciones se realizaron en un instrumento T200 Biacore. En el Ejemplo 6, se usaron ensayos de bloqueo para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-SRA para bloquear la capacidad de unión de s Ra a apoL1 in vitro. En el Ejemplo 7, se utilizaron ensayos de bloqueo para determinar la competencia cruzada entre anticuerpos anti-SRA.

En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden inhibir el crecimiento y la actividad de los parásitos tripanosomales in vitro y en un sujeto infectado con T. brucei rhodesiense. El Ejemplo 8 describe la actividad tripanolótica de los anticuerpos anti-SRA en un ensayo in vitro. El Ejemplo 9 describe la actividad de los anticuerpos anti-SRA en modelos de ratones en la protección contra la infección por T. brucei rhodesiense.

La presente divulgación incluye anticuerpos anti-SRA y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a al menos un fragmento biológicamente activo de cualquiera de las siguientes proteínas o péptidos: SRA de longitud completa (SEQ ID NO: 289) y diversas formas recombinantes de SRA ( SEQ ID NOs: 290-296). Cualquiera de los péptidos SRA descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos, se puede usar para generar anticuerpos anti-SRA.

Los péptidos pueden modificarse para incluir la adición o sustitución de ciertos restos para marcar o con fines de conjugación con moléculas vehículo, tales como, KLH. Por ejemplo, puede añadirse una cisteína en el extremo N terminal o C terminal de un péptido, o puede añadirse una secuencia enlazadora para preparar el péptido para conjugarlo con, por ejemplo, k Lh para inmunización. Otras secuencias incluyen IgG2a de ratón o IgG1 humana utilizadas para marcar el extremo C-terminal del péptido o la secuencia señal mROR1 para el marcado N-terminal.

Los anticuerpos específicos de SRA pueden no contener marcadores o fracciones adicionales, o pueden contener un marcador o fracción N-terminal o C-terminal. En una realización, el marcador o fracción es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de un marcador (si lo hay) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie sobre la que se une el péptido. Por ejemplo, si una superficie está recubierta con avidina, un péptido que contiene una biotina N-terminal se orientará de manera que la porción C-terminal del péptido estará distal a la superficie. En una realización, el marcador puede ser un radionúclido, un tinte fluorescente o un marcador detectable por RM. En determinadas realizaciones, dichos anticuerpos marcados pueden usarse en ensayos de diagnóstico que incluyen ensayos de formación de imágenes.

Cartografiado de epítopos y tecnologías relacionadas

La presente divulgación incluye anticuerpos anti-SRA que interactúan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro de uno o más dominios de la molécula de SRA, incluidos, p. ej., el dominio de unión a apoL1 que comprende los restos de aminoácidos 202-222 de SRA. El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos localizados dentro de cualquiera de los dominios de la molécula de SRA anteriormente mencionados (por ejemplo, un epítopo lineal en un dominio). Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos (o secuencias de aminoácidos) no contiguos dentro de uno o ambos de los dominios anteriormente mencionados de la molécula de SRA (por ejemplo, un epítopo conformacional).

Pueden usarse diversas técnicas conocidas para los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas de ejemplo incluyen, por ejemplo, ensayos de retrobloqueo rutinario, tales como los descritos en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Ny ). Otros métodos incluyen análisis mutacionales de barrido de alanina, análisis de hibridación de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), análisis de escisión de péptidos, estudios cristalográficos y análisis por RMN. Adicionalmente, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo proteína/anticuerpo se transfiere al agua y los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que están protegidos por el complejo del anticuerpo experimentan un intercambio inverso de deuterio a hidrógeno a una velocidad más lenta que los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que no forman parte de la interfaz. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la interfaz proteína/anticuerpo pueden retener deuterio y, por lo tanto, presentan una masa relativamente mayor en comparación con los aminoácidos no incluidos en la interfaz. Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasa y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, p. ej., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem.

73: 256A-265A.

El término "epítopo"se refiere a un lugar sobre un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. Los epítopos de linfocitos B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se mantienen al tratarlos con disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

El perfilado asistido por modificación (MAP), también conocido como perfilado de anticuerpos basado en la estructura del antígeno (ASAP) es un método que categoriza grandes números de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies de antígenos modificadas química o enzimáticamente (Véase el documento US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo único diferente o parcialmente superpuesto con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización puede centrarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica al cribado de hibridomas, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridomas raros que producen mAb que tienen las características deseadas. MAP se puede usar para clasificar los anticuerpos de la divulgación en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.

En determinados aspectos, los anticuerpos anti-SRA o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen a un epítopo dentro de una o más de las regiones ilustradas en la SRA, ya sea en forma natural, como se ilustra en la SEQ ID NO: 289, o producida de forma recombinante, como se ilustra en las SEQ ID NOs: 290-296, o en un fragmento de la misma. En algunos aspectos, los anticuerpos de la divulgación se unen a una región epítopo de unión a apoL1 que comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 202-222 de la SRA.

En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación, como se muestra en la Tabla 1, interactúan con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 31 hasta aproximadamente la posición 174 de la SEQ ID NO: 289; restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 174 hasta aproximadamente la posición 194 de la SEQ ID NO: 289; o restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 194 hasta aproximadamente la posición 274 de la SEQ ID NO: 289. Estas regiones están parcialmente ilustradas en las SEQ ID No s : 290-296.

La presente divulgación incluye anticuerpos anti-SRA que se unen al mismo epítopo, o una porción del epítopo, como cualquiera de los anticuerpos de ejemplo específicos descritos en el presente documento en la Tabla 1, o un anticuerpo que tiene las secuencias CDR de cualquiera de los anticuerpos de ejemplo descritos en la Tabla 1. De manera análoga, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-SRA que compiten por unirse a SRA o un fragmento de SRA con cualquiera de los anticuerpos de ejemplo específicos descritos en el presente documento en la Tabla 1, o un anticuerpo que tiene las secuencias CDR de cualquiera de los anticuerpos de ejemplo descritos en la Tabla 1.

Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-SRA de referencia usando métodos de rutina conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-SRA de la divulgación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido SRA en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la molécula de SRA. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a SRA después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-SRA de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-SRA de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la proteína SRA después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-SRA de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo al que se une el anticuerpo anti-SRA de referencia de la divulgación.

Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-SRA de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína SRA en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de SRA. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula de SRA en condiciones de saturación seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de SRA. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la molécula de SRA, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión al SRA. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede que no se una necesariamente al epítopo idéntico al anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.

Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o epítopos solapantes si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso un 99 %, según se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, p. ej., Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

A continuación, puede realizarse experimentación de rutina adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, resonancia del plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica.

Inmunoconjugados

La invención abarca un anticuerpo monoclonal anti-SRA humano de la invención con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como un agente tripanocida o tripanostáti

usan en la presente memoria, el término "inmunoconjugado" se refiere a un anticuerpo que está unido química o biológicamente a una citotoxina, un agente radiactivo, una citocina, un interferón, una diana o fracción indicadora, una enzima, una toxina, un péptido o proteína o un agente terapéutico. El anticuerpo se puede unir a la citotoxina, agente radiactivo, citocina, interferón, diana o fracción indicadora, enzima, toxina, péptido o agente terapéutico en cualquier lugar a lo largo de la molécula siempre que sea capaz de unirse a su diana. Los ejemplos de inmunoconjugados incluyen conjugados anticuerpo-fármaco y proteínas de fusión anticuerpo-toxina. En una realización, el agente puede ser un segundo anticuerpo diferente contra SRA. En determinadas realizaciones, el anticuerpo puede conjugarse con apoL1 o un fragmento de la misma o con Hpr o un componente del TLF. El tipo de fracción terapéutica que se puede conjugar con el anticuerpo anti-SRA tendrá en cuenta la afección a tratar y el efecto terapéutico deseado a lograr. En la técnica se conocen ejemplos de agentes adecuados para formar inmunoconjugados; véase, por ejemplo, WO 05/103081.

Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, p. ej., Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos de la presente invención pueden unirse a o expresarse conjuntamente con otra molécula funcional, p. ej., otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en los que un brazo de una inmunoglobulina es específico para el dominio de unión a apoL1 de s Ra , o un fragmento de la misma, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para la unión fuera del dominio de unión a apoL1 de SRA, o una segunda diana terapéutica o está conjugado con una fracción terapéutica. En determinados aspectos, un brazo de una inmunoglobulina es específico para un epítopo que comprende los restos de aminoácidos 174-194 de SRA (SEQ ID NO: 290) o un fragmento de la misma, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para otro epítopo de SRA, o un fragmento de la misma.

Un formato de anticuerpo biespecífico de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio C^h3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio C^h3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio C^h3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio C^h3 de Ig está unido a la proteína A y el segundo dominio C^h3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A tal como una modificación en H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo C^h3 puede comprender además una modificación en Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C^h3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356e , L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG1; N44S, K52N, y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422i por EU) en el caso de anticuerpos lgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo bi-específico descrito anteriormente.

Otros formatos biespecíficos ilustrativos que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, p. ej., formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-lg, cuadroma, "botón en ojal", cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con "botón en ojal", etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, lgG1/lgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase,por ejemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4:6,1-11, y referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores). También se pueden construir anticuerpos biespecíficos usando conjugación de péptido/ácido nucleico, p. ej., en los que se usan aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal para generar conjugados de anticuerpo-oligonucleótido específicos de sitio que después se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. (Véase, p. ej., Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4 de diciembre de 2012]).

Administración terapéutica y formulaciones

La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-SRA o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se administrarán con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, administración, tolerancia, y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

La dosis de anticuerpo puede variar dependiendo de la edad y el tamaño de un sujeto a recibir la administración, enfermedad diana, afecciones, vía de administración, y similares. Cuando un anticuerpo de la presente invención se usa para tratar la enfermedad del sueño en un paciente adulto, o para prevenir la enfermedad del sueño, es ventajoso administrar el anticuerpo de la presente invención, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 60, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención puede administrarse como una dosis inicial de al menos aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 800 mg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 300 mg, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg, hasta aproximadamente 100 mg, o hasta aproximadamente 50 mg. En determinadas realizaciones, la dosis inicial puede ir seguida de la administración de una segunda o una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en una cantidad que puede ser aproximadamente la misma o menor que la de la dosis inicial, en la que las dosis posteriores están separadas por al menos 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, p. ej., Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, la vía intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. La composición farmacéutica también puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase, por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).

El uso de nanopartículas para administrar los anticuerpos de la presente invención también se contempla en el presente documento. Las nanopartículas conjugadas con anticuerpo pueden usarse tanto para aplicaciones terapéuticas como de diagnóstico. Las nanopartículas conjugadas con anticuerpo y los métodos de preparación y uso se describen en detalle por Arruebo, M., et al. 2009 ("Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" en J. Nanomat. Volumen 2009, Artículo ID 439389, 24 páginas), doi: 10.1155/2009/439389). Las nanopartículas se pueden desarrollar y conjugar con anticuerpos contenidos en composiciones farmacéuticas dirigidas contra los parásitos. También se han descrito nanopartículas para la administración de fármacos en, por ejemplo, los documentos EP 8257740 o EP 8246995.

En ciertas situaciones, la composición farmacéutica puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede usar una bomba. En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos. En otra realización más, puede ubicarse un sistema de liberación controlada en las proximidades de la diana de la composición, siendo necesaria, por lo tanto, solo una fracción de la dosis sistémica.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas, intracraneales, intraperitoneales e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, p. ej., disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros coadyuvantes, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, p. ej., aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de este modo se carga preferentemente en una ampolla apropiada.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Adicionalmente, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Tal dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable usa generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo completo se desecha.

Numerosos dispositivos de administración de pluma y autoinyector reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, aunque ciertamente sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), No VOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, aunque ciertamente sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), la FLEXp En ™ (Novo Nordisk) y la KWIKPe N™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, IL), por nombrar solo algunos.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.

Usos terapéuticos de los anticuerpos

En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos descritos en el presente documento son útiles para tratar sujetos que padecen la enfermedad del sueño africana. Los anticuerpos pueden usarse para tratar los síntomas de la enfermedad del sueño en etapa temprana o tardía. Los síntomas comunes de la etapa temprana de la enfermedad del sueño incluyen, pero no se limitan a, fiebre, dolores de cabeza, dolor articular, picor, inflamación grave de los ganglios linfáticos, anemia, pérdida de peso, fatiga, cuadros cardíacos como miocarditis, pericarditis e insuficiencia cardíaca congestiva, y disfunción endocrina o renal.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse para tratar a pacientes con enfermedad del sueño por sus síntomas y características neurológicas que se observan en una etapa posterior de la infección. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse a pacientes que padecen la última etapa de la enfermedad del sueño con síntomas tales como confusión, coordinación reducida e interrupción del ciclo del sueño con episodios de fatiga interrumpido por períodos maníacos que conducen al sueño diurno e insomnio nocturno, y un rápido deterioro mental que conduce al coma y la muerte. Se pueden administrar uno o más anticuerpos de la presente invención para aliviar o prevenir o disminuir la gravedad de uno o más de los síntomas o afecciones anteriores. En una realización, los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para facilitar la lisis de los tripanocitos infecciosos y así prevenir la parasitemia en un sujeto.

También se contempla en el presente documento utilizar uno o más anticuerpos de la presente invención de forma profiláctica en pacientes con riesgo de desarrollar la enfermedad del sueño. Por ejemplo, los anticuerpos pueden administrarse a los visitantes de los parques de safaris en África o a los nativos que corren el riesgo de ser picados por la mosca tsetsé en áreas endémicas. En una realización, los anticuerpos pueden administrarse a un sujeto que es picado por moscas tsetsé para prevenir la infección por el parásito tripanosomal.

En una realización adicional de la invención, los presentes anticuerpos se utilizan para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de pacientes que padecen la enfermedad del sueño. En otra realización, los presentes anticuerpos se utilizan como terapia complementaria con cualquier otro agente útil para tratar la enfermedad del sueño o cualquier otra terapia conocida por los expertos en la materia.

Terapias de combinación

Las terapias de combinación pueden incluir un anticuerpo anti-SRA de la invención y cualquier agente terapéutico adicional que pueda combinarse ventajosamente con un anticuerpo de la invención, o con un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo de la invención.

Los anticuerpos de la presente invención pueden combinarse sinérgicamente con uno o más fármacos antitripanosomales usados para tratar la enfermedad del sueño. Ejemplos de fármacos anti-tripanosomales son melarsoprol, suramina, eflornitina y nifurtimox. En algunas realizaciones, se pueden usar uno o más anticuerpos de la presente invención en combinación con un AINE, otro anticuerpo contra SRA, un anticuerpo contra otra proteína tripanosomal tal como VSG, un agente terapéutico recombinante, un suplemento dietético o cualquier cuidado paliativo para tratar la enfermedad del sueño. En una realización, los anticuerpos de la presente invención pueden combinarse con un terapéutico recombinante tal como una forma recombinante de la proteína apoL1 (véase, por ejemplo, Baral et al 2006, Nature Med. 12: 580-584; o el documento US 7585511).

El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse antes de, simultáneamente con o después de la administración de un anticuerpo anti-SRA de la presente invención. Para los fines de la presente divulgación, dichos regímenes de administración se consideran la administración de un anticuerpo anti-SRA "en combinación con" un segundo componente terapéuticamente activo adicional.

Usos de diagnóstico de los anticuerpos

Los anticuerpos anti-SRA de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir SRA en una muestra, p. ej., con fines de diagnóstico. Algunos aspectos contemplan el uso de uno o más anticuerpos de la presente divulgación en ensayos para detectar la enfermedad del sueño. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar para detectar la enfermedad del sueño o la infección por T. brucei rhodesiense en un sujeto mordido por moscas tsetsé. Los ensayos diagnósticos de ejemplo para la SRA pueden comprender, p. ej., poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-SRA de la invención, en donde el anticuerpo anti-SRA está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora o se usa como un ligando de captura para aislar selectivamente la SRA de las muestras del paciente. Como alternativa, un anticuerpo anti-SRA sin marcar puede usarse en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de manera detectable. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, o 125l; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos de ejemplo específicos que pueden usarse para detectar o medir SRA en una muestra incluyen el ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Las muestras que pueden usarse en ensayos de diagnóstico de SRA de acuerdo con la presente divulgación incluyen cualquier muestra de tejido o fluido obtenible de un paciente, que contiene cantidades detectables de proteína SRA, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. En general, se medirán los niveles de SRA en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por la enfermedad del sueño) para establecer un nivel basal, o estándar, de SRA. Este nivel basal de SRA después puede compararse con los niveles de SRA medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen una afección relacionada con la enfermedad del sueño, o síntomas asociados con dicha afección.

Los anticuerpos específicos de SRA pueden no contener marcadores o fracciones adicionales, o pueden contener un marcador o fracción N-terminal o C-terminal. En un aspecto, el marcador o fracción es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de un marcador (si lo hay) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie sobre la que se une el péptido. Por ejemplo,

si una superficie está recubierta con avidina, un péptido que contiene una biotina N-terminal se orientará de manera que la porción C-terminal del péptido estará distal a la superficie.

Los aspectos de la divulgación se refieren al uso de los anticuerpos divulgados como marcadores para predecir el pronóstico de la enfermedad del sueño en pacientes. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en ensayos de diagnóstico para evaluar el pronóstico de la enfermedad del sueño en un paciente y predecir la supervivencia.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar los métodos y las composiciones descritos en la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra SRA

Puede usarse un inmunógeno que comprenda cualquiera de los siguientes para generar anticuerpos contra SRA. En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación se obtienen de ratones inmunizados con una SRA nativa, de longitud completa (véase el número de registro GenBank CAA85518.2) (SEQ ID NO: 289), o con un péptido SRA recombinante (SEQ ID NO: 290). Como alternativa, la SRA o un fragmento de la misma puede producirse usando técnicas bioquímicas estándar y modificarse (SEQ ID NOS: 291-296) y usarse como inmunógeno.

En determinados aspectos, el inmunógeno puede ser un péptido del extremo N terminal o C terminal de SRA. En determinados aspectos, el inmunógeno es un fragmento de SRA que varía desde aproximadamente los restos de aminoácidos 29-274 de la SEQ ID NO: 289.

En algunos aspectos, el inmunógeno puede ser un péptido SRA recombinante expresado en E. coli o en cualquier otra célula eucariota o de mamífero como las células de ovario de hámster chino (CHO).

En determinados aspectos, los anticuerpos que se unen específicamente a SRA se pueden preparar usando fragmentos de las regiones antes mencionadas, o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas en aproximadamente 5 a aproximadamente 20 restos de aminoácidos de cualquiera, o ambos, el extremo N o C terminal de las regiones descritas en el presente documento. En determinados aspectos, se puede usar cualquier combinación de las regiones mencionadas anteriormente o fragmentos de las mismas en la preparación de anticuerpos específicos de SRA. En determinados aspectos, se puede usar uno cualquiera o más de los dominios de SRA indicados anteriormente, o fragmentos de los mismos para preparar anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos, o multiespecíficos (véase el Ejemplo 10 siguiente para más detalles).

Las proteínas de longitud completa, o fragmentos de las mismas, que se usaron como inmunógenos, tal como se ha indicado anteriormente, se administraron directamente, con un adyuvante para estimular la repuesta inmunitaria, a un ratón VELOCIMMUNE® que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana. La respuesta inmunitaria de anticuerpos se controló mediante un inmunoensayo específico de SRA. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar estirpes celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar líneas celulares que producían anticuerpos específicos para SRA. Utilizando esta técnica y los diversos inmunógenos descritos anteriormente, se obtuvieron varios anti-SRA, así como anticuerpos con reactividad cruzada, quiméricos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); los anticuerpos de ejemplo generados de esta manera se designaron como H2aM10200N, H2aM10204N, H2bM10093N, H2aM10285N, H2aM10201N, H2aM10095N, H2aM10207N, H2aM10288N, H2aM10293N, H2aM10094N, H2aM10289N, H2aM10202N, H2aM10208N, H2bM10205N, H2bM10203N, H2bM10206N, H2aM10291N, H2aM10297N, H2aM10295N, H2aM10092N, H2aM10290N, H2aM10292N, H1M10096N, H2bM10097N, H2aM10294N y H2aM10296N.

También se aislaron anticuerpos anti-SRA directamente de linfocitos B positivos para antígeno sin fusión a células de mieloma, tal como se describe en el documento U.S. 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-SRA totalmente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos de ejemplo generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H1H10026P, H1H10027P, H1H10031P, H1H10040P, H1H10041P, H1H10045P, H1H10056P, H1H10058P, H1H10059P, H1H10061P, H1H10064P, H1H10067P y H1H10069P.

Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos de ejemplo generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo se describen en detalle en los Ejemplos que se exponen a continuación.

Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera

La Tabla 1 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-SRA seleccionados de la divulgación. Los identificadores de secuencia de ácidos nucleicos correspondientes se exponen en la Tabla 2.

Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo Fc (por ejemplo, "H4H", "H1M, "H2M"), seguido por un identificador numérico (por ejemplo, "10064" como se muestra en la Tabla 1), seguido por un sufijo "P" o "N". Por lo tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse como, por ejemplo, H1H10064. Los prefijos H4H, H1M y H2M en las denominaciones de anticuerpo usadas en el presente documento indican la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H2M" tiene una Fc de lgG2 de ratón, mientras que un anticuerpo "H4H" tiene una Fc de lgG4 humana. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo H1M o H2M puede convertirse en un anticuerpo H4H, y viceversa, pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), los cuales se indican por los identificadores numéricos mostrados en la Tabla 1, seguirán siendo los mismos. Anticuerpos que tienen la misma designación numérica de anticuerpo, pero que se diferencian por un sufijo de letra de N, B o P se refieren a anticuerpos que tienen cadenas pesadas y ligeras con secuencias CDR idénticas, pero con variaciones de secuencia en las regiones que están fuera de las secuencias CDR (es decir, en las regiones marco). Por lo tanto, las variantes N, B y P de un anticuerpo particular tienen secuencias CDR idénticas dentro de sus regiones variables de la cadena pesada y ligera, pero difieren entre sí dentro de sus regiones marco.

Tabla 1

Tabla 2

Ejemplo 3. Análisis de utilización de genes variables

Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos, los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables del anticuerpo se clonaron y secuenciaron. A partir de la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos predicha de los anticuerpos, se identificó el uso genes para cada región variable de cadena pesada (HCVR) y región variable de cadena ligera (LCVR). La Tabla 3 muestra el uso de genes para anticuerpos seleccionados de acuerdo con la divulgación.

Tabla 3

Ejemplo 4. Cartografía del epítopo H/DX de SRA frente al péptido apoLI

La cartografía del epítopo H/DX de SRA frente al péptido apoLI se llevó a cabo esencialmente según el protocolo mostrado en la Figura 1. Antes del experimento de intercambio H/D, los péptidos SRA (SEQ ID NO: 290) y apoL1 (SEQ ID NO: 297) se intercambiaron de tampón a solución de citrato (ácido cítrico 0,02 M/NaOH, pH 5,0, NaCl 0,15 M) con una concentración de 4,0 mg/ml y 1,5 mg/ml respectivamente. El intercambio H/D se inició mezclando 1 ml de SRA sola o 1 ml de complejo SRA-apoL1 (relación molar: 1:3) con 9 ml de tampón citrato pH 5,0 preparado en D2O. Los períodos de deuteración fueron 1 min, 5 min, y 10 min. El control o deuteración de 0 min fue SRA o complejo SRA-apoL1 diluido en citrato pH 5,0 preparado en H2O. Después, la reacción H/D se detuvo añadiendo 190 ml de tampón citrato enfriado con hielo (0,05 M, pH 2,4). Después de la digestión con pepsina inmovilizada (N.° de cat 20343) durante 4 min a 4 °C, los péptidos resultantes se desalaron utilizando puntas de pipeta cromatográficas ZipTip C18 y se analizaron inmediatamente mediante UltrafleXtreme Espectrometría de masas mediante desorción-ionización por láser, asistida por una matriz y analizador por tiempos de vuelo (MALDI-TOF)-TOF. Los valores centroides o la relación de masa a carga promedio (m/z) de todos los péptidos detectados se calcularon y compararon con el control para determinar la deuteración para los diferentes períodos de incubación.

La Tabla 4 es un resumen de la diferencia de deuteración entre SRA sola y SRA formando un complejo con apoL1 para todos los péptidos detectados en el experimento de intercambio H/D. Para 1 minuto de deuteración, tres péptidos que cubren los restos 174-194 de SRA (SEQ ID NO: 290) se deuteraron de manera menos prominente en presencia de apoL1 mientras que todos los demás péptidos tenían deuteración similar. Para 5 min y 10 min de deuteración, la región también se deuteró de manera constante menos en comparación con SRA sola. Por consiguiente, este segmento se define mediante el método de intercambio H/D como una probable región de unión/epítopo de SRA para apoL1.

Tabla 4

continuación

Es de destacar que la deuteración para muchas otras regiones diferentes también se redujo notablemente después de 5 min o 10 min de reacción en presencia de apoL1. Este efecto podría deberse al cambio conformacional o al efecto alostérico al unirse a apoL1.

Ejemplo 5. Unión del anticuerpo a SRA determinada mediante resonancia de plasmón superficial

Las constantes de velocidad de unión asociativa y disociativa (ka y kd, respectivamente) y las constantes de disociación en el equilibrio calculadas y las semividas disociativas (K^d y t1/2, respectivamente) para la unión del antígeno a los anticuerpos SRA purificados se determinaron usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (Biacore T200) a 25 °C.

Se determinaron los valores de las constantes de disociación en el equilibrio (K^d) para la unión de SRA a anticuerpos monoclonales anti-SRA purificados seleccionados usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real en un instrumento Biacore T200. La superficie del chip sensor Biacore CM4 se derivatizó con anticuerpo policlonal anti-ratón de conejo (N.° de catálogo GE BR-1008-38) o con anticuerpo policlonal anti-Fc humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc N.° de catálogo 109-005-098); para capturar alrededor de 100-350 RU de anticuerpos monoclonales anti-SRA que se expresaron con un Fc de ratón (AbPID prefijo H1M, H2aM) o con Fc de IgG1 humana (AbPID prefijo H1H) respectivamente. La cinética de la unión de SRA al anticuerpo monoclonal capturado se realizó a 25 °C en dos tampones de migración diferentes - tampón cítrico/fosfato de pH 7,4 (Na2HPO4 9,1 mM, ácido cítrico monohidratado 0,1 mM, KCI 2,5 mM, NaCI 137 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v) y tampón cítrico/fosfato pH 4,5 (Na2HPO4 4,7 mM, ácido cítrico monohidratado 5,3 mM, KCI 1,3 mM, NaCI 137 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v). Se prepararon diferentes concentraciones de muestras de SRA (SEQ ID NO: 290) en tampón de pH 7,4 y se inyectaron sobre la superficie capturada del anticuerpo monoclonal anti-SRA a un caudal de 50 ml/min. La unión de SRA a los anticuerpos monoclonales capturados se controló durante 4 min mientras que la disociación de SRA unida al mAb se controló durante 7 min. Se adoptaron dos formatos de ensayo diferentes para caracterizar la cinética de la unión de SRA: (i) cinética regular y (ii) caza a pH 4,5. Se realizaron experimentos cinéticos regulares usando tampón de pH 7,4 como tampón de migración y tanto la asociación como la disociación se realizaron a pH 7,4. Para el formato de caza, la asociación y disociación se realizaron en tampón de pH 7,4 y tampón de pH 4,5 respectivamente.

Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático de ajuste de la curva Scrubber 2.0c. Solo se calculó la tasa de disociación (kd) para el experimento de caza a pH 4,5. Las constantes de disociación de la unión en el equilibrio (K^d) y las semividas disociativas (t1^ ) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como:

Los parámetros de la cinética de unión para diferentes anticuerpos monoclonales anti-SRA que se unen a diferentes reactivos SRA a 25 °C se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5

continuación

La mayoría de los anticuerpos anti-SRA presentaban valores K^d que varían desde 27 pM hasta 94 nM para la unión a SRA a pH 7,4. La mayoría de los anticuerpos se unían fuertemente a pH 4,5.

Ejemplo 6. Bloqueo de unión de SRA al péptido apoLI

El bloqueo de la unión de SRA al péptido Apo-L1 mediante anticuerpos monoclonales anti-SRA purificados seleccionados se determinó usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real en un instrumento Biacore T200. La superficie del chip sensor Biacore CM4 se derivatizó con anticuerpo policlonal antiratón de conejo (N.° de catálogo GE BR-1008-38) o con anticuerpo policlonal anti-Fc humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc N.° de catálogo 109-005-098); con el fin de, capturar alrededor de 100-350 RU de anticuerpos monoclonales anti-SRA que se expresaron con un Fc de ratón (AbPID prefijo H1M, H2aM) o con Fc de IgG1 humana (AbPID prefijo H1H) respectivamente. El experimento se realizó a 25 °C y se usó tampón cítrico-fosfato pH 4,5 (Na2HPO4 4,7 mM, ácido cítrico 5,3 mM monohidratado, KCI 1,3 mM, NaCI 137 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v) como tampón de migración. Se mezcló 50 nM de proteína SRA (SEQ ID NO: 290) con 5 mM de biotinapéptido apoL1 (SEQ iD NO: 298) o con 5 mM de biotina-péptido apoL1 mutante (SEQ ID NO: 300). Todas las muestras se prepararon en tampón de migración. Se capturaron alrededor de 450-850 RU de anticuerpos monoclonales anti-SRA en la superficie del chip seguido de la inyección de la muestra de SRA en presencia y ausencia de péptido apoL1 durante 4 min a 20 ml/min. Se midió la cantidad de SRA unida al anticuerpo capturado en presencia y ausencia de péptido apoL1 y se calculó el porcentaje de bloqueo de unión del anticuerpo por apoL1. La Tabla 6 muestra los anticuerpos que bloqueaban la unión SRA-péptido apoL1 a pH 4,5.

Tabla 6

La mayoría de los anticuerpos se unieron fuertemente a SRA; sin embargo 10 anticuerpos bloquearon la unión de apoLI a SRA a pH 4,5.

Ejemplo 7. Ensayo de competición cruzada Octet 31X31

La competición cruzada entre anticuerpos monoclonales anti-SRA se realizó en el biosensor Octet QK384 (Fortebio Inc.). Todo el experimento se realizó a 25 °C con el caudal de 1000 rpm en el tampón Octet HBST (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, 0,1 mg/ml de BSA). Para evaluar si 2 anticuerpos eran capaces de competir entre sí para unirse a sus respectivos epítopos en SRA.mmh (SEQ ID NO: 291), primero se capturaron alrededor de ~0,7 nm de SRA.mmh en las puntas del sensor Octet recubierto con anticuerpo anti-Penta-His (N.° de catálogo 18-5079) sumergiendo las puntas durante 5 min en una solución de 20 mg/ml de SRA.mmh. Las puntas del sensor capturadas con SRA.mmh se sumergieron a continuación en pocillos que contenían 50 mg/ml de solución de anticuerpos monoclonales anti-SRA individuales (posteriormente denominados mAb-1) durante 5 min para saturar la superficie de SRA.mmh. A continuación, las puntas de los sensores se sumergieron finalmente en pocillos

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal totalmente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína asociada a la resistencia sérica (SRA) de Trypanosoma spp, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de las SEQ ID NOs 66/74 y en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es una lgG1.

2. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

3. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1.

4. Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.

5. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 4.

6. Un método para producir un anticuerpo anti-SRA o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, comprendiendo el método cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 5 en condiciones que permiten la producción del anticuerpo o fragmento, y recuperar el anticuerpo o fragmento así producido.

7. El método de la reivindicación 6, que además comprende formular el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como una composición farmacéutica que comprende un vehículo aceptable.

8. Una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, o una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a SRA de acuerdo con la reivindicación 2, para su uso en un método para tratar un paciente que sufre la enfermedad del sueño, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociado con la enfermedad del sueño, o para tratar a un paciente en riesgo de desarrollar la enfermedad del sueño, comprendiendo el método administrar al paciente el anticuerpo, fragmento o composición de manera que la enfermedad del sueño se prevenga o disminuya en gravedad y/o duración, o se prevenga o mejore al menos un síntoma o complicación asociado con la enfermedad del sueño, o que la frecuencia y/o duración de, o la gravedad de la enfermedad del sueño se reduzca.

9. El anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición para su uso en el método de la reivindicación 8, en donde el anticuerpo se administra terapéuticamente a un paciente que padece enfermedad del sueño, o al menos un síntoma o complicación asociado con la enfermedad del sueño, o en donde el anticuerpo se administra profilácticamente a un paciente en riesgo de desarrollar la enfermedad del sueño, o al menos un síntoma o complicación asociado con la enfermedad del sueño.

10. El anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o composición para su uso en el método de la reivindicación 8 o 9, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, se administra al paciente en combinación con un segundo agente terapéutico.

11. El anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición para su uso en el método de la reivindicación 10, en donde el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un AINE, un corticoesteroide, un fármaco anti-tripanosomal, tal como suramina, melarsoprol, eflornitina o nifurtimox, otro anticuerpo diferente frente a SRA u otro antígeno tripanosomal, un suplemento dietético tal como un antioxidante, una variante de apolipoproteína L1, y cualquier otra terapia anti-tripanosomal útil para mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad del sueño o afección o enfermedad asociada a la enfermedad del sueño.

12. El anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se administra por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, oral, intramuscular o intracraneal.

13. El anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se administra en dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal del paciente.