ES2847947T3 - Conjugados de VMEn-antígeno nativas y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un conjugado inmunogénico que comprende una Vesícula de Membrana Externa nativa (VMEn) que tiene al menos una fracción de proteína de superficie conectada a al menos un antígeno mediante un enlazador divalente en el que dicho enlazador divalente es un enlazador homobifuncional.

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados de VMEn-antígeno nativas y uso de los mismos

Campo técnico

La presente invención se encuentra en el ámbito de la conjugación de vesículas de membrana externa nativas (VMEn) extraídas sin detergente a antígenos, a través de un enlace divalente, para formar conjugados de VMEn-antígeno. Los conjugados son útiles para la inmunización.

Antecedentes de la técnica

La conjugación de antígenos a portadores es un procedimiento establecido para mejorar la inmunogenicidad, en particular para polisacáridos. Por ejemplo, los polisacáridos capsulares bacterianos (PSC) son de forma natural antígenos independientes de linfocito-T que generan una respuesta inmune que carece de varias propiedades importantes. La conjugación a un portador convierte estos sacáridos en antígenos dependientes de linfocito T que pueden a continuación producir un efecto memoria inmunológico y también provocar respuestas inmunes protectoras en niños pequeños.

Un portador conocido en tales conjugados es el 'CPME' complejo de proteína de membrana externo, formado a partir de vesículas de N. meningitidis (por ejemplo, véaseEP-0467714), que se ha incluido como el portador en vacunas de conjugado de H. influenzae B. El CPME también se ha usado como el portador en conjugados de proteína. Por ejemplo, Wu y col. (PNAS EE.UU. 2006; 103(48): 18243-18248) informa que la conjugación de Pfs25H a CPME resultó en una vacuna de conjugado de Pfs25H-CPME que era >1.000 veces más potente en generar reactividad anti-Pfs25H ELISA en ratones que en una dosis similar de Pfs25H solo.

La conjugación de CPME a proteína Pfs25H puede lograrse mediante la reacción de Pfs25H activado con maleimida con proteínas de membrana externa dentro del CPME (véase, por ejemplo, el documento WO2006/124712), como se muestra en el Esquema 1Esquema 1.

Esquema 1

Tal como se muestra en el anterior esquema 1 y de acuerdo con los procedimientos de la técnica anterior, los procedimientos de conjugación y conjugados de los mismos contemplan el uso de un enlazador heterobifuncional divalente, es decir, una fracción enlazadora que tiene los extremos terminales que soportan distintos grupos funcionales. Esto es para evitar principalmente el reticulamiento del intermediario del enlazador de vesícula con otra partícula vesicular en lugar de con el antígeno seleccionado. En práctica, de acuerdo con la técnica anterior, los distintos extremos del enlazador se seleccionan dependiendo de los grupos reactivos sobre la vesícula y el antígeno seleccionado involucrado en el procedimiento, para tener una reacción selectiva con la parte que se tiene como objeto, a saber, la vesícula por un lado y el antígeno por el otro lado del extremo. Estos procedimientos, sin embargo, tienen algunos inconvenientes, principalmente relacionados con la selección y funcionalización de los enlazadores, planteando, de este modo, alguna limitación en la elección de la vesícula y el antígeno a acoplar juntos. El solicitante ha encontrado ahora que cuando se usan como vesículas de partida, vesículas de membrana externa nativas (VMEn) extraídas sin detergente, es posible usar un enlazador divalente adecuado para la conexión con una proteína de superficie de VMEn sobre un lado y con un antígeno seleccionado sobre el otro extremo, proporcionando, de este modo, un conjugado final que aún presenta la actividad inmunogénica tanto para la VME como el antígeno. De forma sorprendente, incluso cuando se usa el enlazador en la presente invención muestra grupos funcionales terminales idénticos, la conjugación de la VMEn con el antígeno seleccionado se logra sustancialmente sin la formación de agregados vesiculares o subproductos, perjudicial para la reacción de conjugación.

Sumario de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones. En un primer aspecto, la invención se refiere a un conjugado VMEn-enlazador-antígeno inmunogénico que comprende una Vesícula de Membrana Externa nativa (VMEn) obtenida mediante un procedimiento libre de detergente, que tiene al menos un resto de proteína de superficie conectado a al menos un antígeno extraño seleccionado por un enlazador homobifuncional divalente.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de dicho conjugado, que comprende las etapas de:

i) hacer reaccionar al menos un resto de proteína de superficie de VMEn con la primera parte terminal de un enlazador divalente para obtener un intermediario VMEn-enlazador, y

ii) hacer reaccionar dicho intermediario VMEn-enlazador con al menos un antígeno extraño seleccionado por medio de la segunda parte terminal del enlazador divalente, obteniendo, de este modo, el conjugado VMEn-enlazadorantígeno de la invención.

El enlazador es un enlazador homobifuncional divalente, es decir, que tiene las mismas funcionalidades terminales.

En un aspecto adicional, la invención se refiere al intermediario VMEn-enlazador obtenido (u obtenible) mediante la etapa anteriormente indicada i), y su uso para la preparación del conjugado VMEn-enlazador-antígeno de la invención.

En un aspecto adicional, la invención también se refiere al conjugado anterior VMEn-enlazador-antígeno para su uso como compuesto inmunogénico, en particular para la preparación de una composición inmunogénica o vacuna.

En un aspecto adicional, los conjugados inmunogénicos de acuerdo con la invención comprende una VMEn que tiene al menos una fracción de proteína de superficie conectada a un primer antígeno mediante un enlazador divalente, en el que dicho primer antígeno se conecta adicionalmente a un segundo antígeno distinto.

En otro aspecto adicional, los conjugados inmunogénicos de la invención comprenden una VMEn que tiene al menos una fracción de proteína de superficie conectada a un primer antígeno mediante un enlazador divalente y al menos otra fracción de proteína de superficie conectada a un segundo antígeno distintos mediante un enlazador divalente, en el que el enlazador divalente que conecta el primer antígeno y el enlazador divalente que conecta el segundo agente son independientemente los mismos o distintos entre sí.

En otro aspecto adicional, la invención se refiere a una composición inmunogénica o a una vacuna, que comprende el conjugado anteriormente indicado y al menos un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable; y a la composición para uso en un procedimiento para generar una respuesta inmune en un vertebrado, que comprende la administración de dicha composición o vacuna.

En un aspecto adicional, la invención también se refiere al uso de VMEn para la preparación de conjugados VMEnenlazador-antígeno polivalentes inmunogénicos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra títulos lgG anti-CSP (1A) y anti-OAg (1B) después de la inmunización con CSP o su fragmento (NANP)3 conjugado a VMEn de S. Typhimurium mediante química de SH-malemido, en comparación con CSP físicamente mezclada con dicha VMEn (formulada sin adyuvante). Ratones hembra CD1, de 5 semanas (8 por grupo) se inmunizaron subcutáneamente en los días 0 y 28 con 2 |jg de CSP/(NANP)3 por dosis. Los títulos se midieron en los días 0, 14, 28 y 42.

Figura 2: Respuesta de lgG anti-Pfs25 inducida en ratones (200 pl por dosis de SC inyectado en los días 0 y 28, sangrado en los días 0, 14, 27 y 42) por conjugados de VMEn de la invención producidos mediante la conjugación de VMEn de S. Typhimurium con antígeno Pfs25, por medio del enlazador BS3.

Figura 3: Respuesta de lgG anti-fHbp inducida en ratones (200 pl por dosis de SC inyectado en los días 0 y 28, sangrado en los días 0, 14, 27 y 42) por conjugados de VMEn de la invención producidos mediante la conjugación de VMEn de S. Typhimurium con antígeno fHbp, por medio del enlazador BS3.

Figura 4: Respuesta lgG antiMenA inducida en ratones por conjugados de VMEn de la invención producidos mediante la conjugación de VMEn de MenB con antígeno MenA, por medio del enlazador SIDEA, en comparación con el conjugado MenBGMMA bivalente MenA-MenC, GMMA, conjugado CRM y mezcla de MenA y GMMA (no conjugado).

Figura 5: Respuesta lgG anti-MenC inducida en ratones por conjugados de VMEn de la invención producidos mediante la conjugación de VMEn de MenD con antígeno MenC, por medio del enlazador SIDEA, en comparación con el conjugado MenBGMMA bivalente MenA-MenC, GMMA, conjugado de CRM y mezcla de MenC y g Mm A (no conjugado).

Descripción detallada de la invención

Para facilitar una comprensión de la presente invención, se definen a continuación un número de términos y expresiones.

Tal como se usa en la presente divulgación y reivindicaciones, las formas en singular "un", "una", y "el", "la" incluyen formas en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario; es decir, "un", "una" significa "uno o más" a menos que se indique lo contrario.

Los términos "sobre" o "aproximadamente" significan más o menos, alrededor de, o en las regiones de. Los términos "sobre" o "aproximadamente" significan adicionalmente dentro de un intervalo de error contextual aceptable para el valor particular como se determina por un experto habitual en la técnica, que dependerá en parte en cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición o el grado de precisión requerido para un fin particular, por ejemplo, la cantidad de un nutriente dentro de una formulación de alimentación. Cuando los términos "sobre" o "aproximadamente" se usan junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos descritos. Por ejemplo, "entre aproximadamente 0,2 y 5,0 mg/ml" significa que los límites del intervalo numérico se extienden por debajo de 0,2 y por encima de 5,0 de modo que el valor particular en cuestión consigue el mismo resultado funcional que dentro del intervalo. Por ejemplo, "sobre" y "aproximadamente" pueden significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar según la práctica en la técnica. Como alternativa, "sobre" y "aproximadamente" pueden significan un intervalo de hasta el 20 %, preferentemente hasta el 10 %, más preferentemente hasta el 5 % y más preferentemente hasta el 1 % de un valor dado.

El término "y/o" tal como se use en una expresión tal como "A y/o B" está concebida para incluir "A y B", "A o B", "A", y "B". Del mismo modo, el término "y/o" tal como se usa en una expresión como "A, B, y/o C" está concebida para abarcar cada una de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se indique lo contrario, todas las designaciones "A %-B %," "A-B %," "A % a B %," "A a B %," "A %-B," "A % a B" se proporciona su significado habitual y normal. En algunas realizaciones, estas designaciones son sinónimos.

Los términos "sustancialmente" o "sustancial" significan que la condición descrita o reivindicada funciona en todos los aspectos importantes como el estándar descrito. Por lo tanto, "sustancialmente libre" significa que abarca condiciones que funcionan en todos los aspectos importantes como condiciones libres, incluso si los valores numéricos indican la presencia de algunas impurezas o sustancias. "Sustancial" generalmente significa un valor superior al 90 %, preferentemente superior al 95 %, más preferentemente superior al 99 %. Cuando se usan valores particulares en la especificación y en las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, el término "sustancialmente" significa un intervalo de error aceptable para el valor particular.

Una "cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente para causar el efecto referido o el resultado. Una "cantidad eficaz" puede determinarse empíricamente de un modo rutinario usando técnicas conocidas en relación con el fin mencionado.

Tal como se usa en el presente documento, "heterólogo" significa que las dos o más moléculas referidas o estructuras están derivadas de un organismo distinto. Por ejemplo, para una VMEn, un antígeno heterólogo es uno que está derivado de un organismo distinto a la vesícula de VMEn a la cual está adjunta. "Homólogo" tal como se usa en el presente documento significa que las dos o más moléculas referidas están derivadas del mismo organismo.

Tal como se usa en el presente documento, "extraño" significa que las dos o más moléculas o estructuras referidas no están asociadas naturalmente entre sí. Por ejemplo, un antígeno seleccionado que está en el presente documento concebido para ser "extraño a" un sacárido de superficie de VMEn en el presente documento significa que el antígeno no está conjugado naturalmente o de forma innata al sacárido de superficie y no está, por tanto, naturalmente conjugado a la molécula de VMEn incluso si el antígeno y el sacárido (o la molécula de VMEn) pueda originarse del mismo organismo. De este modo, un antígeno extraño no es necesariamente un antígeno heterólogo sino un antígeno heterólogo es un antígeno extraño.

La "identidad de secuencia" puede determinarse mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se ha implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), utilizando una búsqueda de hueco afín con penalización por hueco abierto = 12 y penalización por extensión del hueco = 1, aunque se determina preferentemente mediante el algoritmo de alineamiento global Needleman-Wunsch (véase, por ejemplo, Rubin (2000) Pediatric. Clin.

North Am. 47:269-285), utilizando parámetros por defecto (por ejemplo, con penalización por hueco abierto = 10,0 y penalización por extensión del hueco = 0,5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa de manera conveniente en la herramienta aguja en el paquete EMBOSS. Cuando la aplicación se refiere a una identidad de secuencia a una SED ID particular, la identidad está concebida para ser calculada sobre la longitud completa de esa SEQ ID.

El término " % p/p" indica el porcentaje en peso de un compuesto dado, sobre un compuesto distinto o sobre el contenido total de una composición, como se indica.

De forma análoga, el término " % v/v" indica el porcentaje en volumen de un compuesto dado, sobre un compuesto distinto o sobre el contenido total de una composición, como se indica.

Tal como se usa en el presente documento, el término "fracción de sacárido (o azúcar)" comprende en su significado monosacáridos, así como unidades de polisacárido. Se entenderá que pueden existir fracciones de sacáridos en forma abierta y cerrada (anillo) y que, mientras que se muestran formas cerradas en las fórmulas estructurales en el presente documento, la invención también se abarca formas abiertas. De manera similar, se entenderá que pueden existir fracciones de sacáridos en formas de piranosa y furanosa y que, mientras que las formas se muestras en las fórmulas estructurales en el presente documento, las formas de furanosa también quedan englobadas. También se engloban formas anoméricas distintas de fracciones de sacáridos.

El término "oligosacárido" comprende en su significado sacáridos que tienen de 3 a 10 unidades de monosacáridos, como es sabido en general en la técnica (véase, por ejemplo, https://en.wikipedia.org/wiki/Oligosaccharide).

A menos que se proporcione lo contrario, el término "polipéptido" se refiere a polipéptidos de cualquier longitud capaces de actuar como un antígeno seleccionado. El polímero de aminoácido que forma el polipéptido de la invención, puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede ser interrumpido por ácidos no amino. El término también engloba un polímero de aminoácido que ha sido modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador. También se encuentran dentro de la definición incluidos, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluye, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden aparecer como cadenas individuales o cadenas asociadas.

"Peso molecular medio" está concebido para indicar el peso molecular medio obtenido por la media aritmética habitual o media de las masas moleculares del componente individual, por ejemplo, aminoácidos en el caso de conjugados de polipéptido.

El término “-OAg” (antígeno O) se usa dentro de la presente invención para indicar una funcionalidad de antígeno presente en los lipopolisacáridos (LPS) o lipooligosacáridos (LOS) sobre la superficie de la VMEn considerada. En más detalle, los lPs se forman generalmente mediante tres porciones distintas, conocidas como: lípido A (responsable de la toxicidad de los LPS), oligosacárido de núcleo y la cadena -OAg, un polímero de glicano repetitivo y contribuyente principal de la especificidad serológica de las bacterias.

El término "polisacáridos/sacáridos capsulares" (PSC) indica aquellos sacáridos que pueden encontrarse en la capa que se encuentra fuera de la envoltura celular de las bacterias, siendo, por lo tanto, parte de la envoltura externa de la célula bacteriana misma. Los PSC se expresan sobre la superficie más externa de una amplia gama de bacterias y en algunos casos incluso hongos.

El término "suspensión" comprende en su significado un medio líquido que presenta algunos precipitados o partículas o partículas floculantes, distintas de una solución en la que el medio está sustancialmente libre de cualquiera partícula sólida.

A menos que se proporcione lo contrario, el término "conjugación" indica la conexión o unión de las entidades sometidas, referida en particular a las VMEn y las fracciones de antígeno seleccionadas, por medio de un enlazador divalente.

Por "cantidad inmunológicamente eficaz", se refiere a que la administración de esa cantidad a un individuo, bien en una dosis única o bien como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento prevención. Esta cantidad puede variar dependiendo de la salud y condiciones físicas del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo en sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la fórmula de la vacuna, la evaluación del doctor de tratamiento de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad recaiga en una gama relativamente amplia que puede determinarse mediante ensayos rutinarios.

El término "VMEn" en el presente documento indica vesículas aisladas del medio y/o cortadas de células y que son vesículas de membrana intacta no expuestas a detergentes o agentes desnaturalizantes, es decir, extraídas sin detergente. Las VMEn de la invención presentan las proteínas de membrana externa (PME) y/o lipopolisacáridos (LPS) en su conformación nativa y orientación correcta en el entorno de membrana natural y carecen normalmente de los componentes citoplasmáticos.

Al contrario, el término "VME" o "VMEa" engloba varias vesículas proteoliposómicas obtenidas mediante la alteración de la membrana externa de una bacteria negativa Gram normalmente mediante un procedimiento de extracción con detergente para formar vesículas a partir de las mismas. Los complejos de proteína de membrana externa (por ejemplo, a partir de Neisseria meningitidis) pueden considerarse en tal definición, puesto que tienen una estructura tridimensional y una composición similar a las VMEa, y han sido aisladas por medio de procedimiento de extracción con detergente (véase, por ejemplo, los documentos EP0467714, US4271147, US4459286 y US4830852). El procedimiento de extracción de detergente retira LPS y fosfolípidos, junto con lipoproteínas inmunoprotectoras. Tal retiración cambia la estructura vesicular nativa y favorece la agregación. La agregación puede llevar a problemas consiguientes en términos de desarrollo de procedimiento (rendimiento, consistencia de producción y estabilidad). De modo distinto a las VMEn, caracterizadas por una distribución de tamaño homogéneo definida (normalmente en el intervalo de 20-250 nm, medida mediante la técnica de dispersión dinámica de luz DLS), las VMEn tienen una distribución de tamaño heterogénea no definida (normalmente en el intervalo de 550-5500 nm tal como se mide mediante la técnica de dispersión dinámica de luz DLS) causada por la agregación de vesículas inducidas por detergente (véase para una referencia general, Vacuna 28, 2010, 4810). El procedimiento de extracción con detergente también causa la contaminación de la VME que contiene la composición (por ejemplo, vacunas) con proteínas citoplásmicas como resultado de la lisis de células bacterianas.

De acuerdo con procedimientos de técnicas anteriores, las VMEa y VMEn pueden analizarse y describirse en términos de tamaño, forma y apariencia general de impurezas o materiales no VME contaminantes (como agregados vesiculares o restos de detergente en caso de VMEa) usando la microscopía electrónica de transmisión (MET). Para referencias detalladas según las diferencias entre VMEa y VMEn, véase, por ejemplo, van de Waterbeemd y col. J. Prot. Res. 12(4) (2013) 1898-1908 “Quantitative Proteomics Reveals Distinct Differences in the Protein Content of Outer Membrane Vesicle Vaccines”; y J. Klimentova y col. Microbiological Research 170 (2015) 1-9 “Methods of isolation and purification of the outer membrane vesicles from gram-negative bacteria”.

El término "enlazador homobifuncional divalente" o "enlazador homólogo" indica una unidad de enlace que presenta dos extremos terminales que soportan el mismo grupo funcional y son capaces de reaccionar con la proteína de VMEn por un lado y con el antígeno seleccionado por el otro lado, en el que la proteína de VMEn y el antígeno seleccionado como se describen en detalle a continuación en el presente documento.

De manera similar, el término "enlazador heterobifuncional divalente" o "enlazador heterólogo" indica una unidad de enlace que presenta dos extremos terminales que soportan grupos funcionales distintos y que es capaz de reaccionar específicamente con la proteína de VMEn por un lado y con antígeno seleccionado por el otro lado, en el que la proteína de VMEn y el antígeno seleccionado como se describen en detalle a continuación en el presente documento.

El término "grupo alquenilo o alquilo C1-C10 divalente" comprende en su significado un grupo alquilo o alquenilo saturado o insaturado divalente que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, tal como metileno, etileno, vinilo, alilo y similares.

Como se ha introducido anteriormente, la invención se refiere a conjugados VMEn-enlazador-antígeno obtenidos mediante la conexión de forma covalente de al menos una unidad de proteína sobre la superficie de la VMEn a uno o más antígeno(s) extraño(s) seleccionado(s), por medio de enlazador(es) divalente(s) adecuado(s). En otros términos, y según un aspecto, la invención se refiere a conjugados VMEn-enlazador-antígeno obtenidos (u obtenibles) mediante un procedimiento de la invención como se describe en el presente documento a continuación en más detalle.

Cabe señalar, que los presentes conjugados están provistos de una actividad inmunogénica notable, tal como se corrobora adicionalmente mediante la parte experimental en el presente documento. De hecho, aparte de ser capaces de inducir una respuesta inmune frente al antígeno conjugado, los conjugados de la invención también son capaces de inducir una respuesta inmune frente al componente de la VMEn, distinta de los conjugados VMEn-antígeno de la técnica en los que la actividad inmune recae principalmente sobre la parte de antígeno y no sobre la vesícula extraída con detergente. Al contrario, de acuerdo con la presente invención, la conjugación del antígeno seleccionado al componente de proteína de VMEn, no tiene un impacto significativo sobre la capacidad de la VMEn en inducir su propia respuesta inmune. Cabe señalar, que cuando la VMEn y el/los antígeno(s) seleccionado(s) son de fuentes distintas, los conjugados de la invención pueden ser útiles, por ejemplo, para la preparación de composiciones inmunogénicas polivalentes o vacunas basadas en tanto la actividad de la VMEn como del/los antígeno(s) conjugado(s).

Incluso además, la presente invención muestra de forma sorprendente que el enlazador homobifuncional puede usarse en la preparación de conjugados VMEn-enlazador-antígeno, sin incurrir en los problemas de la técnica anterior relacionados con, por ejemplo, la reacción cruzada o agregación vesicular. En práctica, la VMEn de partida se funcionaliza con el enlazador homobifuncional mediante la reacción de los grupos funcionales adecuados de al menos una proteína de superficie vesicular con un extremo del enlazador. Mediante esto, se forma de forma covalente un intermediario VMEn-enlazador, que tiene aún el otro extremo del enlazador disponible para la reacción posterior con el antígeno seleccionado. Por lo tanto, el segundo extremo del enlazador reaccionará con el antígeno seleccionado, de un modo específico y selectivo, conduciendo al conjugado final de VMEn-enlazador-antígeno, y evitando sustancialmente reacciones cruzadas o agregaciones intermediarias. Tal como se indica en el ejemplo 8a, la misma reacción cuando se lleva a cabo considerando una VMEa como vesícula de partida conduce a la formación de agregados vesícula-enlazador-vesícula, que no son adecuados para una reacción posterior con el antígeno seleccionado. De forma sorprendente ahora se ha encontrado que no solo el uso de VMEn como vesícula de partida puede superar los problemas de agregación de la técnica anterior, sino que también es posible usar varios enlazadores bifuncionales que conducen a la preparación de una serie de conjugados VMEn-enlazador-antígenos de acuerdo con la invención, que retienen el perfil inmunogénico de los componentes conjugados.

Los conjugados de la invención ofrecen varias ventajas en comparación con antígeno no conjugados, por ejemplo, la capacidad de actuar como un agente o vacuna inmunogénica bivalente o polivalente tal como se ha descrito anteriormente y una inmunogenicidad mejorada sobre antígeno no conjugados (véase ejemplos 5 y 7). Además, los conjugados de la invención tienen varias ventajas sobre los conjugados vesícula-proteína que se han usado hasta la fecha. En primer lugar, las VMEn pueden prepararse con pocas etapas en comparación con conjugados de VMEa en las que los antígenos se acoplaban a proteínas de VMEa, y en particular sin requerir la etapa costosa y lenta de derivatización de proteínas. En segundo lugar, la producción de VMEn puede ser más cómoda y segura que la preparación de VMEa mediante extracción con detergente. Incluso además, puede reciclarse el antígeno no reaccionado a partir de la mezcla de conjugación para su uso en una etapa de conjugación adicional, mejorando la eficacia de producción de los conjugados como se ilustra en el ejemplo 3.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un conjugado que comprende uno o más antígeno(s) extraño(s) seleccionado(s) distinto(s), cada uno conectado a un resto de proteína de una Vesícula de Membrana Externa nativa (VMEn) extraída sin detergente, mediante un enlazador homobifuncional divalente. Cabe señalar, que las VMEn pueden recogerse y aislarse sustancialmente sin el uso de detergentes, a diferencia, por ejemplo, de VMEa de la técnica anterior obtenidas por medio de una extracción con deoxicolato o usando detergentes zwitteriónicos como Empigen BB (véase, por ejemplo, el documento US4707543) o similar.

En más detalle, las VMEn son vesículas de membrana que aparecen de forma natural que se forman espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y se liberan dentro del medio de cultivo. Pueden obtenerse, por ejemplo, cultivando bacterias en medio de caldo de cultivo, separando células completas de las VMEn más pequeñas en el medio de caldo de cultivo (por ejemplo, mediante filtración o mediante centrifugado a baja velocidad para aglomerar solo las células y no las vesículas más pequeñas) y, a continuación, recoger las VMEs del medio empobrecido celular (por ejemplo, mediante filtración, mediante precipitación diferencial o agregación, mediante centrifugado a alta velocidad para aglomerar las vesículas). Las cepas para su uso en la producción de VMEn pueden seleccionarse de forma general en función de la cantidad de VMEn producidas en el cultivo. Como se ha indicado anteriormente, las VMEn presentes se caracterizan por el hecho de ser recogidas y aisladas siguiente un procedimiento libre de detergentes. Preferentemente, las VMEn se liberan dentro del caldo de fermentación y se purifican usando una etapa de centrifugado y posteriormente de filtración (para una referencia general véase, por ejemplo Clin. Vaccine Immunol. Abril de 2016; 23(4): 304-314). Aún más preferentemente, las VMEn se liberan dentro del calo de fermentación y se purifican usando las siguientes dos etapas consecutivas de filtración de flujo tangencial (TFF): (i) una microfiltración en la que el sobrenadante de cultivo que contiene la VMEn se separa de las bacterias y (ii) una ultrafiltración en la que las VMEn se separan de las proteínas solubles (para una referencia general véase, por ejemplo, PLoS One. 2015; 10(8): e0134478). La VMEn obtenida, por lo tanto, puede usarse directamente dentro de la presente invención sin llevar a cabo ninguna etapa de purificación/aislamiento adicional. Las VMEn que ahora se consideran tienen una distribución tamaño preferida comprendida de 20 a 250 nm, medida mediante la técnica de dispersión dinámica de luz.

De acuerdo con algunas realizaciones, las VMEn se preparan a partir de bacterias de tipo silvestre o a partir de bacterias que se han manipulado genéticamente generalmente para aumentar su inmunogenicidad (por ejemplo, para hiperexpresar inmunogenes), para reducir toxicidad, para inhibir la síntesis de polisacárido capsular, para inhibir la expresión de antígeno inmunodominante y similares. También pueden prepararse a partir de cepas de hiperampollas. Las VMEn de la invención también pueden expresar proteínas exógenas sobre su superficie y pueden estar empobrecidas de endotoxina.

Preferentemente, las VMEn a usar en la presente invención están producidas a partir de cepas bacterianas modificadas genéticamente que están mutadas para aumentar la producción de vesículas, y también opcionalmente para eliminar o modificar antígenos (por ejemplo, lípido A) y/o para sobreexpresar antígeno homólogos o antígenos de otros organismos. Dichas VMEn preferentes también son conocidas como Módulos Generalizados para Antígenos de Membrana (GMMA) como, por ejemplo, se ha descrito en PLoS One. 2015; 10(8): e0134478.

Puede lograrse la generación espontánea mejorada de vesículas, por ejemplo, mediante la deleción específica de proteínas involucradas en el mantenimiento de la integridad de la membrana. Se ha observado que la superficie externa de las VMEn se corresponde sustancialmente con la superficie externa de la bacteria de la cual derivan, preservando los antígenos de membrana (que incluye, por ejemplo, lipopolisacáridos, lipooligosacáridos y lipoproteínas) en el contexto de la membrana. De forma ventajosa, las VMEs usadas en la invención (menos VMEa extraídas con detergente) retienen estos componentes de membrana externa en su conformación nativa y orientación correcta, preservando de mejor modo la inmunogenicidad frente la cepa bacteriana de la cual derivan.

En general, las VMEn para su uso en la presente invención pueden prepararse a partir de cualquier bacteria adecuada, en la que las bacterias preferentes incluyen: Neisseria (por ejemplo, en particular, N. meningitidis de cualquier serogrupo que incluye A, B, C, Y, X o W135 o a partir de una Neisseria no patogénica), Shigella (such as S. sonnei, S. flexneri, dysenteriae o boydii), Salmonella enterica serovars (tal como Salmonella Paratyphi, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhi o Salmonella Typhimurium), Haemophilus influenzae (por ejemplo H. influenzae no tipable), Vibrio cholerae, Bordetella pertussis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis BCG, Escherichia coli, Bacteroides (incluyendo Porphyromonas), Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter pylori, Brucella melitensis Campylobacter jejuni, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Xenorhabdus nematophilus, Moraxella catarrhalis, o Borrelia burgdorferi.

Las bacterias particularmente preferentes se seleccionan a partir de al menos uno de: S. sonnei, S. flexneri, bacteria de la Salmonella, y meningococcus.

Las cepas de Shigella virulentas poseen un plásmido de 220kb que media las propiedades de virulencia. Este "plásmido de virulencia" ha mostrado codificar los genes para varios aspectos de la virulencia de Shigella, incluyendo adesinas para células epiteliales diana, la invasión de antígenos de plásmido, virF, virG y similares. Una Shigella usada con la invención puede o no puede poseer un plásmido de virulencia. La ausencia de plásmido puede estabilizar la cepa durante el cultivo industrial, atenuar la cepa retirando los factores de virulencia (aumentando de este modo la seguridad para su fabricación), evitar la presencia de enterotoxina ShET-2 (codificada mediante el gen ospD3 o sen en el plásmido) y evitar la presente de msbB2 que es una segunda copia del gen msbB responsable de la acilación de lípido A.

En lo que respecta a la bacteria de la Salmonella, una cepa particularmente preferente se selecciona a partir de: Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis y Salmonella Paratyphi A.

También son preferentes VMEn de bacteria de Meningococcus. Tales vesículas pueden prepararse a partir de cualquier cepa meningocócica. Las vesículas se preparar preferentemente a partir de una cepa de serogrupo B, pero también es preferente prepararlas a partir de serogrupos distintos de B, tales como: A, C, W135, Y o X. La cepa puede ser de cualquier serotipo (por ejemplo 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), cualquier serosubtipo (por ejemplo, P1.4) y cualquier inmunotipo (por ejemplo, L1; L2; L3; L3,7; L3,7,9; L10; etc.). Los meningococos pueden ser de cualquier linaje adecuado, incluyendo linajes hiperinvasivos e hipervirulentos, preferentemente cualquier de los siguientes siete linajes hipervirulentos: subgrupo I; subgrupo III; subgrupo IV-1; complejo ET-5; complejo ET-37; clúster A4; linaje 3. Más preferentemente, las VMEn se preparan a partir de la cepa NZ98/254 y otra cepa con el serosubtipo PorA P1.4.

En otra realización, las bacterias para la preparación de VMEn útiles para la invención pueden ser cepas mutantes que han sido manipuladas, por ejemplo, para aumentar la producción vesicular, para expresar uno o más antígeno(s) deseado(s) y/o para desactivar o modificar un gen no deseado (por ejemplo, que codifica una toxina o que codifica una enzima involucrada en la generación de un producto tóxico, tal como endotoxina).

En esta dirección, se producen otras VMEn preferentes para la invención mediante una bacteria de la Salmonella, en particular un S. Typhimurium (también conocido como Salmonella enterica serovar Typhimurium) que no expresa una proteína TolR funcional.

Cuando las vesículas se preparan a partir de E. coli, Shigella o Salmonella la bacteria puede expresar no más de 4 de proteínas TolA, TolB, TolQ, TolR y Pal. Por lo tanto, al menos una proteína del sistema Tol-Pal de cinco proteínas natural puede estar ausente, dando como resultado una bacteria que, durante su crecimiento en el medio de cultivo, libera cantidades mayores de vesículas de membrana externa dentro del medio que la misma bacteria expresando todas las 5 proteínas Tol-Pal. Preferentemente la TolR no se expresa, pero las otras cuatro proteínas pueden expresarse, es decir, una cepa ATolR).

En realizaciones preferentes, al menos una de las cinto proteínas Tol-Pal en E. coli, Shigella o Salmonella se retira, por ejemplo, mediante deleción o inactivación del gen que codifica la proteína. Por lo tanto, la bacteria puede expresar 0, 1, 2, 3 o 4 de TolA, proteínas TolB, TolQ, TolR y Pal. La retiración de una de las cinco proteínas puede ser suficiente, en cuyo caso la bacteria expresa solo 4 de estas proteínas. Preferentemente la proteína TolR se retira, por ejemplo, mediante inactivación de un gen tolR de cepa de partida. Por lo tanto, una bacteria preferente puede ser tolA+ tolB+ tolQ+ TolR- Pal+.

En algunas realizaciones, la bacteria expresa todas las cinco proteínas Tol-Pal, pero al menos una está mutada para causar hiperampollas. Por ejemplo, la proteína TolA, TolQ, TolR y/o Pal puede mutarse de tal modo que la proteína retenga su ubicación de membrana pero sus interacciones con otros miembros del sistema Tol-Pal se ven alterados. De este modo, la bacteria retendrá TolA, TolQ y TolR como proteínas transmembrana en la membrana interna y proteína Pal como lipoproteína orientada a periplasma en la membrana externa, pero al menos una de proteína TolA, TolQ, TolR y/o Pal se muta y no es completamente funcional.

Además, pueden haber otras mutaciones presentes, por ejemplo, para proporcionar cepas deficientes de OAg, tales como AgalU, AgalE o AwbaP en E. coli, cepas de Shigella o Salmonella.

En una realización preferente adicional, un meningococo no expresa una proteína MltA funcional. La desactivación de MltA (la transglicosilasa lítica unida a la membrana, también conocida como GNA33) en meningococo proporciona una bacteria que libera espontáneamente grandes cantidades de VMEn dentro del medio de cultivo, a partir del cual puede purificarse fácilmente. Por ejemplo, las vesículas pueden purificarse usando el procedimiento de filtración de tamaño de dos etapas, que comprende: (i) una primera etapa de filtración en el que las vesículas se separan de la bacteria basándose en sus distintos tamaños, con las vesículas pasando dentro del filtrado; y (ii) una segunda etapa de filtración en las que las vesículas se retienen en la fracción retenida.

En la presente invención, es preferente que el -OAg esté presente en las VMEn porque se ha observado (por ejemplo, VMEn de Salmonella y Shigella) que, la presencia de -OAg sobre la superficie de dichas VMEn es ventajoso para proporcionar una vacuna bivalente, ya que el -OAg puede actuar como un antígeno protector. Algunas cepas preferentes tienen LPS penta- o tetra-acilados menos tóxicos, que incluye -OAg unido, después de la mutación de msbB, htrB, ddg y/o PagP (véase, por ejemplo Rossi O y col., Clin Vaccine Immunol. 4 abril 2016;23(4):304-14 y Rossi O. y col., J. Biol. Chem. 5 sep 2014;289(36):24922-35).

En Neisseria, la cepa tiene preferentemente un gen fur modificado. De acuerdo con esta realización, se somete a estudio técnico Neisseria mutante para reducir o desactivar la expresión de al menos un gen involucrado en volver tóxico la parte de lípido A de los LPS, en particular del gen lpxl1. De este modo, las VMEn resultantes presentan una toxicidad reducida respecto a la cepa de tipo silvestre, desde la conversión del lípido A acilado en una forma menos acilada.

De manera similar, se somete a un estudio técnico Neisseria mutante preferente para la invención para reducir o desactivar la expresión de al menos un gen involucrado en la síntesis o exportación del sacárido capsular, en particular los genes synX y/o ctrA. De este modo, las VMEn resultantes pueden presentar una protección cruzada frente a distintos serotipos, apreciado en particular por el experto en la técnica.

En realizaciones preferentes, una cepa puede incluir uno o más de las mutaciones de desactivación y/o hiperexpresión desveladas, por ejemplo, en Fukusawa y col. (1999), Vaccine 17:2951-2958. Por ejemplo, siguiente las directrices y nomenclatura del presente documento, genes útiles para la inhibición y/o desactivación incluyen: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB; o (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, SynX y/o SynC.

Tal como se ha mencionado anteriormente, las VMEn están unidas de forma covalente al enlazador bivalente por medio de al menos un resto de proteína, generalmente ubicado sobre la superficie de la vesícula. En esta dirección, las proteínas reaccionarán preferentemente con un extremo terminal del enlazador por medio de una o más funcionalidades de aminoácido de amino, tiol o hidroxilo, siendo esta última un grupo hidroxilo alfa o parte de la funcionalidad de aminoácido carboxi. Preferentemente, el grupo funcional de proteína es un grupo amino, más preferentemente una amina primaria (-NH2). Estos grupos funcionales pueden estar naturalmente presente en las porciones de aminoácido de interés o incluso introducirse artificialmente para los fines de conjugación.

El enlazador seleccionado es un enlazador bivalente homobifuncional, por lo tanto, el grupo funcional de proteína y el grupo funcional de antígeno que reaccionarán respectivamente con las porciones terminales del enlazador serán preferentemente las mismas. A modo de ejemplo, un resto de aminoácido de lisina de una o más proteínas de VMEn se reaccionará con el enlazador (por ejemplo, BS3) por medio del grupo funcional -NH2 correspondiente. Del mismo modo, también se reaccionará un antígeno (por ejemplo, Pfs25) con la porción terminal libre del enlazador por medio de los grupos amino (-NH2) relevantes. Cabe señalar, y que también se explica en la presente descripción, que la reacción se produce sin reacción cruzada sustancial o formación de agregación, conduciendo de este modo al producto final, útil, por ejemplo, para la preparación de vacunas polivalentes, de un modo muy fiable y versátil, y de modo distinto al de usar VMEa, tal como se indica en el ejemplo comparativo 8 y 8a.

Entre los restos de aminoácidos preferentes se incluye: arginina, lisina, asparagina, glutamina, ácido aspártico o glutámico, cisteína e histidina. Preferentemente, las proteínas de VMEn son aquellas que tienen una o más fracción de aminoácido que muestra grupos amino libres, preferentemente grupos -NH2. Incluso más preferentemente dicha fracción de aminoácido es la arginina y/o lisina, mediante la cual distintos grupos -NH2 de distintas proteínas de arginina y/o lisina son capaces de reaccionar selectivamente con el enlazador de acuerdo con la presente invención.

En lo que se refiere al enlazador homobifuncional divalente, es normalmente una molécula de cierta longitud, con una solubilidad y polaridad de agua adecuada, capaz de unirse de forma covalente con las proteínas de VMEn y el antígeno mediante sus extremos terminales respectivamente. Para optimizar la solubilidad del enlazador elegido, podría ser conveniente introducir uno o más de grupo polar tal como sulfato, sulfito, fosfato y similares o incluso usado la sal correspondiente del mismo, por ejemplo, como alcalina o sal de metal alcalinotérrea, cuando sea posible. Debido a la versatilidad de la presente invención, es posible usar distintos enlazadores, en términos, por ejemplo, de longitudes, polaridad e impedimento estérico, proporcionando de este modo, un enlace covalente con tanto los restos de proteína de VMEn como el antígeno seleccionado. Mediante esto, la invención permite la preparación de una seria de conjugados VMEn-enlazador-antígeno finales provistos de un comportamiento específico notable, con especial consideración a su inmunogenicidad y actividad.

El enlazador es homobifuncional (es decir, que tiene funcionalidades terminales iguales). Incluso más preferentemente, en enlazado es simétrico con respecto a un eje vertical hipotético.

Por lo tanto, el enlazador divalente de acuerdo con la presente invención tiene la fórmula general (I):

X-L-X' (I)

en la que:

X and X' son los mismos, y son un grupo funcional capaz de reaccionar selectivamente con proteínas de VMEn por un lado y con el antígeno seleccionado por otro lado, preferentemente formando fracciones éster, amido o tioéster;

-L- es un grupo alquenilo o alquilo C1-C15 lineal o ramificado divalente sustituido opcionalmente e interrumpido opcionalmente por uno o más heteroátomo seleccionado a partir de: oxígeno (-O-), azufre (-S-), nitrógeno (-NH- o grupo -N- opcionalmente sustituido).

En una realización, -L- es preferentemente un grupo alquilo C3-C12 lineal divalente, sustituido opcionalmente o interrumpido por uno o más de heteroátomo de oxígeno (-O-). En otra realización aún más preferente, -L- es un grupo alquilo C3-C6 lineal divalente.

Según la fórmula (I), el enlazador se caracteriza adicionalmente por tener ambas porciones terminales que soportan dos funcionalidades X y X' que son las mismas proporcionando, de este modo, un enlazador homofuncional divalente. En una realización, los grupos X y/o X' pueden ser cualquiera que forme ésteres, tioéster o amida cuando se combina con una funcionalidad de hidroxilo, tiol o amino respectivamente.

Preferentemente, X y/o X' son conjugados de éster N-hidroxisuccinimida, más preferentemente seleccionados de al menos de uno de:

en el que el * representa el punto de contacto con el separador -L- en la fórmula (I), como se ha definido anteriormente. Por lo tanto, en una realización aún preferente, en enlazador se selecciona de al menos uno de: glutarato de disuccinimidilo (DSG), suberato de disuccinimidilo (DSS), hidroxisuccinimida, N oxisuccinimida and diéster de N-hidroxisuccinimida del ácido adípico (SIDEA), y suberato de Bis(sulfosuccinimidilo (BS3, n.° de CAS. 82436-77-9).

En una realización, enlazadores bifuncionales preferentes adicionales reactivos con aminas para su uso en la invención se seleccionan de al menos uno de: etilenglicol bis[succinimidil succinato], bis(sulfosuccinimidil)tri(etilenglicol) (BS(PEG)3), bis(sulfosuccinimidil)tetra(etilenglicol) (BS(PEG)4), bis(sulfosuccinimidil)penta(etilenglicol) (BS(PEG)5) y bis(sulfosuccinimidil)exa(etilenglicol) (BS(PEG)6), en el que bis(sulfosuccinimidil)penta(etilenglicol) (BS(PEG)5, n.° de CAS 756526-03-1) es particularmente preferente.

Enlazadores homobifuncionales preferentes capaces de reaccionar con grupos funcionales de tiol sobre proteína de VMEn y antígeno de acuerdo con la invención, son aquellos que tienen X y X' seleccionados de al menos uno de: resto de 2-piridilditío, maleimida o yodoacetilo.

Otro enlazador adecuado para la reacción con el grupo hidroxilo de proteína de VMEn como se ha definido anteriormente es dihidrazida de ácido adípico (ADH).

Enlazadores preferentes se seleccionan de al menos uno de: (BS(PEG)5), glutarato de disuccinimidilo (DSG) o una sal del mismo, SIDEA y BS3, en el que BS3 es incluso más preferente (para una referencia general de BS3 véase por ejemplo la patente de EE.UU.4.965.338). De acuerdo con una realización aún preferente, el DSG es particularmente útil cuando se maneja a un pH de aproximadamente 9. De forma sorprendente, la eficacia de la reacción de conjugación puede aumentarse de forma conveniente cuando se usa (BS(PEG)5) o BS3 como enlazador divalente, sustancialmente en la ausencia de formación de agregados vesiculares. A este respecto, cabe señalar que el uso de BS3 de acuerdo con la presente invención no proporciona reticulación sustancial de proteína de superficie de VMEn para formar agregados de elevado peso molecular, sino más bien, la reacción selectiva con una VMEn sobre un extremo terminal y con el antígeno seleccionado sobre el otro extremo. Este comportamiento se apoya adicionalmente por la parte experimental que se adjunta en el presente documento, en el que se describen el ejemplo 8 y el ejemplo 8a (comparativo, usando VMEa).

De forma ventajosa, cualquier antígeno adecuado puede conjugarse a las VMEn para obtener los conjugados VMEnenlazador-antígeno de la invención. En cualquier caso, la conexión de uno o más antígeno seleccionado produce un conjugado inmunogénico que puede generar una respuesta inmune que reconoce dicho antígeno y que también reconoce uno o más componentes en la VMEn, proporcionando, de este modo, convenientemente una vacuna polivalente. Los antígenos se incluirán en los presentes conjugados a una concentración es lo suficientemente alta para provocar, cuando se administra a un hospedador, una respuesta inmune que reconoce ese antígeno. Además, la respuesta inmune es preferentemente protectora frente el patógeno a partir del cual se ha derivado el antígeno, incluso más preferentemente frente uno de los patógenos enumerados a continuación.

En una realización de la invención, la VMEn está conjugada a al menos un antígeno homólogo, es decir, derivado del mismo organismo a partir del cual la VMEn está derivada. En una realización más preferente, el antígeno seleccionado es un antígeno heterólogo, es decir, derivado de un organismo distinto del organismo a partir del cual la VMEn está derivada.

En cualquier caso, los antígenos pueden seleccionarse generalmente a partir de cualquier polipéptido inmunogénico, es decir, polipéptidos capaces de provocar una respuesta inmune cuando se administran a un sujeto. Los polipéptidos usados con la invención incluirán un aminoácido que tiene un resto, o una cadena lateral, con un grupo funcional para la conjugación, preferentemente un grupo amino o tiol, incluso más preferentemente de fórmula general: -NH2 o -SH. Estos restos pueden estar naturalmente presentes en un antígeno o pueden introducirse artificialmente para los fines de conjugación. Entre los restos de aminoácidos preferentes se incluye, aunque no de forma limitativa: arginina, lisina, asparagina, glutamina, cisteína e histidina. El resto de aminoácido más preferente para la conjugación es lisina.

Los antígenos de polipéptido conjugados a VMEn se preparan preferentemente en forma sustancialmente pura o sustancialmente aislada (es decir, sustancialmente libres de otros polipéptidos). Pueden prepararse por medio de diversos medios, por ejemplo, mediante síntesis química (al menos en parte), mediante la digestión de polipéptidos más grandes usando proteasas, mediante la traducción a partir de ARN, mediante la purificación a partir del cultivo celular (por ejemplo, a partir de expresión recombinante o a partir de cultivo nativo) y similares. La expresión recombinante en un hospedador de E. coli es una ruta de expresión útil. Los antígenos de polipéptido pueden tomar diversas formas (por ejemplo, nativos, fusiones, glicosilados, no glicosilados, lipidados, puentes de disulfuro y similares).

Los antígenos de polipéptido usados con la invención tienen un peso molecular medio preferente de al menos 1 kDa, más preferentemente de al menos 3,5 kDa, incluso más preferentemente de 10 a 80 kDa. Aún más preferentemente, el peso molecular medio está comprendido de 15 a 75 kDa.

Antígenos de polipéptido más preferentes para la conjugación a VMEn de acuerdo con la presente invención comprenden un epítopo a partir de un polipéptido fúngico, bacteriano, protozoario o vírico. Polipéptidos protozoarios preferente son a partir de un Plasmodium (tal como P. falciparum, P. vivax, P. ovale). Polipéptidos bacterianos particularmente preferentes se seleccionan a partir de: E. coli, N. meningitidis y Streptococci (tal como S. agalactiae, S. pneumoniae, S. pyogenes).

Antígenos de polipéptido de E. coli preferentes incluyen CTF1232 (SEQ ID NO: 14), 3526 (SsIE, SEQ ID NO: 15) y 405 (FdeC, SEQ ID NO: 16). Como ejemplo preferente, Una VMEn a partir de Shigella o Salmonella puede conjugarse a CTF1232, 3526 o 405, de acuerdo con la presente invención, para generar una vacuna bivalente que cubra tanto la E. coli enterotoxigénica (ETEC) como la Shigella/Salmonella.

En una realización, los polipéptidos de N. meningitidis considerados son capaces de, cuando se administran a un mamífero, provocar una respuesta de anticuerpos que es bactericida frente a meningococcus. Polipéptidos de N. meningitidis preferentes para su uso con la invención se seleccionan de al menos uno de: NHBA, NadA, NsPA, NhhA, App y fHbp, tal como se detalla en el presente documento a continuación.

Antígeno NHBA.

El antígeno NHBA se incluyó en la secuencia de genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 como gen NMB2132 (número de referencia de GenBank GI:7227388; SEQ Id NO: 2 en el presente documento). Se han publicado desde entonces las secuencias de antígeno NHBA a partir de muchas cepas. También se ha informado de diversos fragmentos inmunogénicos del antígeno NHBA. Antígenos NHBA preferentes para su uso con la invención comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más, por ejemplo, 100 %) con respecto a SEQ ID NO: 2; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 2, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 2. Los antígenos NHBA más útiles de la invención pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2. Antígenos NHBA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de su administración a un sujeto.

Antígeno NadA.

En antígeno NadA se incluyó en la secuencia de genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 (véase, por ejemplo, Tettelin y col. (2000) Science 287:1809-1815) como gen NMB1994 (número de referencia de GenBank GI:7227256; SEQ ID NO: 3 en el presente documento). Se han publicado desde entonces las secuencias del antígeno NadA a partir de muchas cepas y se ha documentado bien la actividad de las proteínas como una adesina de Neisseria. También se ha informado de diversos fragmentos inmunogénicos de NadA. Antígenos NadA preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más, por ejemplo, 100 %) con respecto a SEQ ID NO: 3; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 3, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 3. Los antígenos NadA más preferentes de la invención pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3. Antígenos NadA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de su administración a un sujeto. SEQ ID NO: 7 es uno de tal fragmento.

Antígeno NspA.

Se incluyó el antígeno NspA en la secuencia de genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 (véase, por ejemplo, Tettelin y col. (2000) Science 287:1809-1815) como gen NMB0663 (número de referencia de GenBank GI:7225888; SEQ ID NO: 4 en el presente documento). Se han publicado desde entonces las secuencias de antígeno NspA a partir de muchas cepas. También se ha informado de diversos fragmentos inmunogénicos de NspA. Antígenos NspA preferentes para su uso con la invención comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más, por ejemplo, 100 %) con respecto a SEQ ID NO: 4; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 4, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 4. Los antígenos NspA más preferentes de la invención pueden provocar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4. Los antígenos NspA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la administración a un sujeto.

Antígeno NhhA.

El antígeno NhhA se incluyó en la secuencia del genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 (véase, por ejemplo, Tettelin y col. (2000) Science 287:1809-1815) como gen NMB0992 (número de referencia de GenBank GI: 7226232; SEQ ID NO: 5 en el presente documento). Desde entonces se han publicado las secuencias de antígeno NhhA de muchas cepas, por ejemplo, documento WO00/66741 y WO01/55182, y se ha informado sobre diversos fragmentos inmunogénicos de NhhA. Se conoce también como Hsf. Los antígenos NhhA preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más, por ejemplo, 100 %) con respecto a SEQ ID NO: 5; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 5, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 5. Los antígenos NhhA más preferentes de la invención pueden generar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5. Los antígenos NhhA ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la administración a un sujeto.

Antígeno App.

El antígeno App se incluyó en la secuencia del genoma publicado para la cepa meningocócica del serogrupo B MC58 (véase, por ejemplo, Tettelin y col. (2000) Science 287:1809-1815) como el gen NMB1985 (número de referencia de GenBank GI: 7227246; SEQ ID NO: 6 en el presente documento). Desde entonces se han publicado muchas secuencias de antígeno App. Se ha informado también sobre diversos fragmentos inmunogénicos de App. Los antígenos App preferentes para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más, por ejemplo, 100 %) con respecto a SEQ ID NO: 6; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 6, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 6. Los antígenos App más preferentes de la invención pueden generar anticuerpos que, después de su administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido meningocócico que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6. Los antígenos App ventajosos para su uso con la invención pueden generar anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos después de la administración a un sujeto.

Antígeno fHbp.

La proteína de unión a factor H existe como tres variantes (v1, v2 y v3) y la invención puede usar cualquiera de estas como realización preferente.

Una fHbp v i comprende preferentemente (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos k' % de identidad con la SEQ ID NO: 8, y/o (b) un fragmento de la SEQ ID NO: 8, k' se refiere al porcentaje de identidad y podría definirse como cualquier número de 1 a 100. Con referencia a las secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico, generalmente la identidad usada en la aplicación empieza por debajo del 40 % con referencias específicas a porcentajes más altos, por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más, por ejemplo, 100 %.

El fragmento incluirá preferentemente al menos un epítopo a partir de la SEQ ID NO: 8. Preferentemente, la fHbp v1 puede generar anticuerpos que son bactericidas frente a cepas v1, por ejemplo, frente la cepa MC58 (disponible de la ATCC como 'BAA-335').

Una fHbp v2 comprende preferentemente (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos k' % de identidad con la SEQ ID NO: 1, y/o (b) un fragmento de la SEQ ID NO: 1. Se proporciona información sobre 'k' y fragmentos anteriormente. El fragmento incluirá preferentemente al menos un epítopo a partir de la SEQ ID NO: 1. Preferentemente, la fHbp v2 puede generar anticuerpos que son bactericidas frente a cepas v2, por ejemplo, frente a la cepa M2091 (ATCC 13091).

Una fHbp v3 comprende preferentemente (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos k' % de identidad con la SEQ ID NO: 9, y/o (b) un fragmento de la SEQ ID NO: 9. Se proporciona información sobre 'k' y fragmentos anteriormente. El fragmento incluirá preferentemente al menos un epítopo a partir de la SEQ ID NO: 9. Preferentemente, la fHbp v3 puede generar anticuerpos que son bactericidas frente a cepas v3, por ejemplo, frente a la cepa M01-240355.

También son preferentes por igual antígenos del Grupo A Streptococcus (GAS), Grupo B Streptococcus (GBS) y Pneumococcus. Como ejemplos no limitativos, pueden incorporarse antígenos GAS25 (Slo), GAS40 (SpyAD) y GAS57 (SpyCEP) en conjugados de acuerdo con algunas realizaciones de la invención.

Son más preferentes antígenos de plasmodio. Estos pueden ser de cualquier especie adecuada, en las que las especies preferentes se seleccionan a partir de: P. falciparum, P. vivax y P. ovale.

Otro antígeno aún preferente es Pfs25 (SEX ID NO: 10), que es un antígeno de etapa sexual de P. falciparum expresado sobre la superficie de formas de zigoto y ooquineto del parásito. Otro antígeno preferente es Pfs48/45, que es un candidato de vacuna bloqueadora de la transmisión. Recientemente, el fragmento de cisteína 10 de C-terminal (10C) de Pfs48/45, que contenía tres epítopos conocidos para anticuerpos de bloqueo de la transmisión, se ha producido como una quimera con la parte N-terminal de GLURP (RO), la proteína rica en glutamato de antígeno de etapa sanguínea asexual. La proteína de fusión resultante (RO10C) generó altos niveles de anticuerpos bloqueadores de la transmisión en roedores (véase Theisen y col. (2014) Vaccine 32:2623-2630). Shing y col. (2015) Vaccine 33:1981-1986 describe una quimera que contiene fragmentos 6C truncados, que aumenta el rendimiento del conformador correctamente doblado. La construcción de RO6C fue capaz de generar anticuerpos de bloqueo de la transmisión de titulación elevada en ratas. RO6C (SEQ ID NO: 11) es un antígeno preferente que puede conjugarse de acuerdo con la presente invención.

Otro antígeno preferente es la proteína circumsporozoite (CSP; SEQ ID NO: 12).

También pueden conjugarse péptidos más cortos de CSP de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el péptido de aminoácido 12 (NANP)3 (SEQ ID NO: 13) derivado de CSP puede usarse de acuerdo con realizaciones preferentes.

En otra realización aún preferente los antígenos son especies de sacáridos. La invención es, de hecho, adecuada para conjugar uno o más antígenos de sacáridos seleccionados a VMEn, mediante los cuales pueden usarse sacáridos en su forma natural de longitud completa. Como alternativa, también puede seleccionarse de forma ventajosa una fracción de tamaño particular. Por lo tanto, los sacáridos pueden fragmentarse desde su longitud natural y puede usarse opcionalmente una fracción de tamaño de estos fragmentos. Incluso además, los sacáridos no están limitados a sacáridos purificados a partir de fuentes naturales y pueden, en cambio, usarse sacáridos sintéticos o semisintéticos. El antígeno de polisacárido a usar de acuerdo con la invención está generalmente funcionalizado para permitir la reacción con el enlazador divalente. Por lo tanto, en una realización, cuando el antígeno es un polisacárido, la invención comprende la oxidación del grupo hidroxilo anomérico de dicho antígeno a aldehído, seguido por la conversión de aminación reductora a grupo amino, por ejemplo, usando NaIO4 y NaBH4, de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. De este modo, el antígeno de polisacárido presentará un grupo -NH2adecuado para la reacción con la parte terminal del enlazador, ya conectado a la VMEn para proporcionar el conjugado VMEn-enlazador-antígeno.

Antígenos de sacáridos preferentes son sacáridos capsulares bacterianos (PSC). Estos incluyen, aunque no de forma limitativa, sacáridos capsulares seleccionados de al menos uno de: Haemophilus influenzae tipo B; Neisseria meningitidis serogrupos A, C, W135, X e Y, en los que los serogrupos A y C son particularmente preferentes; Streptococcus pneumoniae serotipos 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F; Salmonella incluyendo Salmonella enterica serovar Typhi Vi, bien en su longitud completa o fragmentada (indicada como fVi); Streptococcus agalactiae serotipos Ia, Ib y III; Streptococcus pyogenes, Shigella sp.

En una realización preferente, la VMEn es un GMMA de bacterias de Meningococcus, preferentemente preparado a partir de una cepa del serogrupo B y el antígeno seleccionado es un sacárido capsular de Neisseria meningitidis de los serogrupos A o C, incluso más preferentemente conjugado a el GMMA a través del enlazador SIDEA.

En cualquier caso, tal como se ha mencionado anteriormente, los antígenos seleccionados podrían conjugarse VMEn derivados a partir de la mismo o incluso de una cepa bacteriana distinta, proporcionando, de este modo, una vacuna polivalente. A este respecto, en una realización más preferente de la invención, la VMEn y el antígeno de sacáridos están derivados de cepas bacterianas distintas.

Otros antígenos de sacáridos preferentes son p-glucanos, particularmente útiles para la protección frente a C. albicans (para una referencia general véase Sandlin y col. (1995) Infect. Immun., 63:229-37).

Otros antígenos de sacáridos preferentes son oligosacáridos de poliramnosa para la protección frente al Grupo A de Streptococcus (GAS). El sacárido de GAS nativo tiene una cadena principal sustituida con NAcGlcN. Oligosacáridos de poliramnosa sintéticos u oligómeros con la estructura de un sacárido de GAS nativo, pueden conjugarse a VMEn de acuerdo con la invención.

Los conjugados de la invención son inmunogénicos, tal como se ha demostrado por los estudios en ratones y apoyado por la parte experimental en el presente documento.

Como se ha indicado anteriormente, en un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de conjugados de VMEn-enlazador-antígeno, que comprende la reacción de al menos un resto de proteína de VMEn con una primera parte terminal de un enlazador divalente, seguido por la reacción de la segunda parte terminal de tal enlazador con un antígeno extraño seleccionado, tal como se describe en el presente documento a continuación en más detalle.

Por lo tanto, de acuerdo con una realización, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de conjugados VMEn-enlazador-antígeno, que comprende la etapa de:

(i) hacer reaccionar al menos una proteína sobre la superficie de la VMEn con un enlazador divalente para formar un intermediario de VMEn-enlazador; y

(ii) hacer reaccionar el, por lo tanto, obtenido intermediario VMEn-enlazador con al menos un antígeno extraño para formar los conjugados VMEn-enlazador-antígeno de la invención.

De acuerdo con una realización, las VMEn se suspenden inicialmente en un tampón apropiado, tal como un tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico), tampón de borato o PBS (tampón de fosfato salino), para seleccionar un pH comprendido de 5 a 9, preferentemente de 5 a 7 o de 7 a 9, dependiendo, por ejemplo, del enlazador seleccionado o las condiciones de conjugación. También se usan los mismos intervalos de pH para la etapa ii) para la reacción entre el extremo terminal libre del enlazador y el antígeno seleccionado como se describe a continuación en el presente documento en detalle.

Después de la etapa i) el porcentaje de funcionalización de VMEn está comprendido del 15 % al 60 %, dependiendo principalmente del tipo de enlazador divalente usado. A este respecto, el % de grupos funcionales en el extremo terminal libre del enlazador es del 15 % al 40 %, preferentemente del 30 % al 35 %, dependiendo del tipo y estabilidad de dichos grupos funcionales reactivos. De hecho, se observa que tales intervalos permiten una eficacia mejorada del procedimiento, resultando, de este modo, en una cantidad superior de conjugado de antígeno final de la invención.

La suspensión tamponada obtenida de este modo tiene una concentración de VMEn comprendida de 2 a 10 mg/ml, preferentemente de 3 a 6 mg/ml. En enlazador escogido, se añade generalmente en cantidades dependiendo en, por ejemplo, los grupos -NH2 sobre la VMEn, preferentemente en exceso, incluso más preferentemente comprendidas de 10 a 20 equivalentes por mol de -NH2.

Dependiendo del enlazador, podría ser conveniente disolverlo de forma preventiva en un disolvente polar seco, tal como DMSO o similar, para facilitar la manipulación y eficacia, obteniendo de este modo resultados mejorados en términos de rendimiento total y reproducibilidad.

La mezcla se incuba a continuación a temperatura ambiente (por ejemplo de aproximadamente 15 a 40 °C) durante un período de tiempo generalmente de 30 minutos a 4 horas. Posteriormente, el intermediario VMEn-enlazador obtenido de este modo se purifica, por ejemplo, mediante ultracentrifugado y a continuación se hace reaccionar con el antígeno seleccionado de acuerdo con la etapa ii). El antígeno se disuelve generalmente en una solución de tampón adecuada, tal como tampón fosfato salino. El antígeno se añade preferentemente en una cantidad que varía de 2:1 a 1:2 p/p de relación sobre el intermediario de VMEn-enlazador o más preferentemente en una relación de 1:1. La reacción puede controlarse, por ejemplo, mediante HPLC/SEC y la formación de producto final puede confirmarse mediante análisis por transferencia Western/ SDS page.

Como en una realización alternativa, la reacción de conjugación comprende las etapas de: (i) reaccionar el antígeno con un enlazador para formar un intermediario antígeno-enlazador; y (ii) reaccionar al menos una proteína sobre la VMEn con el intermediario antígeno-enlazador formado de este modo para formar un conjugado VMEn-enlazadorantígeno.

Como otra alternativa, la reacción de conjugación comprende las etapas de: (i) reaccionar el antígeno con un primer enlazador para formar un intermediario antígeno-enlazador; (ii) reaccionar al menos una proteína sobre la VMEn son un segundo enlazador para forma run intermediario VMEn-enlazador; y (iii) reaccionar el antígeno-enlazador con el VMEn-enlazador para formar un conjugado VMEn-enlazador-antígeno.

El experto en la técnica entenderá que cuando se usa un enlazador homobifuncional, los grupos funcionales de la proteína y el antígeno involucrados en la reacción serán la misma entidad química, tal como se explica anteriormente en detalle.

Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferente, el procedimiento de la presente invención comprende las etapas de:

(i) reacción de un grupo -NH2 de al menos una proteína de VMEn con un enlazador homobifuncional divalente para formar un intermediario VMEn-enlazador; y

(ii) reacción de dicho intermediario con un grupo -NH2 sobre un antígeno extraño seleccionado para formar el conjugado VMEn-enlazador-antígeno de la invención.

Este tipo de reacción de conjugación se ilustra en el Esquema 2 a continuación, usando, a modo de ejemplo, un GMMA como vesícula nativa y BS3 como el enlazador.

Cuando las reacciones del enlazador con la proteína sobre la superficie de la VMEn y el antígeno involucran grupos funcionales distintos (tales como una amina sobre la proteína en la vesícula y un tiol sobre el antígeno o viceversa) es preferente usar un enlazador heterobifuncional de la fórmula general anterior (I) X-L-X', en el que X y X' son distintos entre sí, tal como se ha definido anteriormente y L es una fracción como se ha definido anteriormente. El grupo X puede reaccionar con un grupo funcional, por ejemplo, una amina sobre la proteína de VMEn; mientras que el grupo X' puede reaccionar con un grupo funcional distinto, por ejemplo, un tio sobre el antígeno seleccionado. Preferentemente, el grupo X es N-hidroxisuccinimida o N-oxisuccinimida, mientras que el grupo X' se selecciona de al menos uno de: grupo de 2-piridilditío, maleimida o yodoacetilo.

Un procedimiento de conjugación alternativo de la invención incluye reacción el antígeno con un primer enlazador y una proteína sobre la vesícula con un segundo enlazador, a continuación, reaccionar el primer y segundo enlazador juntos para formar el conjugado.

A modo de ejemplo, bien el antígeno o la proteína sobre la VMEn puede reaccionarse con un enlazador que termina en un grupo maleimida, por ejemplo, reaccionando una amina primara o bien el antígeno o la proteína sobre la VMEn con 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) o éster de N-Y-maleimidobutiriloxisuccinimida (GMBS). Un tiol o bien sobre el antígeno o la proteína sobre la VMEn puede a continuación reaccionarse con maleimida. El tiol puede ser nativo con respecto la proteína sobre la VMEn o antígeno o el tiol puede ser el resultado de reaccionar la proteína sobre la VMEn o el antígeno con un enlazador separado. Este tipo de reacción de conjugación se ejemplifica en el Esquema 3 a continuación, usando, a modo de ejemplo, GMMA y fHbp como el antígeno:

Esquema 3

De forma ventajosa, debido a su versatilidad, la invención puede usarse para la preparación de varios conjugados, particularmente apreciados por los expertos en la materia cuando se enfrentan con el problema de encontrar procedimiento convenientes y fiables para obtener conjugados inmunogénicos.

Como alternativa adicional, puede enlazarse una proteína sobre la vesícula al antígeno mediante (i) la modificación de la proteína de la vesícula para incluir un alquino; (ii) la modificación del antígeno para incluir un azida, a continuación (iii) la reacción del alquino y azida, conocido como "química click", tal como se ilustra en el ejemplo 6. Como alternativa, el antígeno puede modificarse para incluir un alquino y la vesícula puede modificarse para incluir un azida. Esto tipo de reacción de conjugación se ilustra en el Esquema 4 a continuación, usando, a modo de ejemplo, GMME como la vesícula y fHbp como el antígeno y usando químico click libre de cobre. Solo los enlazadores homobifuncionales de acuerdo con las reivindicaciones son parte de la invención.

Esquema 4

La presente invención también es útil para la preparación de VMEn funcionalizadas de diferentes formas, permitiendo la presentación polivalente de distintos antígenos sobre la superficie de la vesícula seleccionada.

Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferente, la invención se refiere a un conjugado inmunogénico que comprende una VMEn como se ha descrito anteriormente, que tiene al menos una fracción de proteína conectada a un primer antígeno por medio de un enlazador divalente, en el que dicho antígeno está conectado a un segundo antígeno distinto. En esta dirección, los dos antígenos seleccionados (aquí indicados como Ag1 y Ag2) pueden ser antígenos. En esta dirección, los dos antígenos seleccionados (en el presente documento indicados como Ag1 y Ag2) pueden acoplarse juntos para proporcionar un derivado de Antígeno1 - Antígeno2 (Ag1-Ag2), que puede estar conectado posteriormente a la fracción de proteína de superficie de la VMEn seleccionada mediante un enlazador divalente adecuado como se ha descrito anteriormente, para proporcionar un conjugado indicado por la fórmula general (I):

VMEn -enlazador-Ag1-Ag2 (I)

Como alternativa, el resto de proteína de VMEn puede conectarse en primer lugar al Ag1 seleccionado por medio de un enlazador como se ha descrito anteriormente y posteriormente se conecta adicionalmente un segundo Ag2 a dicho resto de Ag1, para proporcionar los conjugados de la fórmula general anterior (I).

En cualquier caso, las VMEn preferentes son vesículas GMMA. El Ag1 y Ag2 en la fórmula (I) puede seleccionarse entre los antígenos preferentes tal como se ha descrito anteriormente, bien sea fracciones de proteína o polisacárido. Preferentemente, los antígenos usados para la multifuncionalización tal como se contempla en el presente documento son ambas proteínas o ambos polisacáridos.

De acuerdo con una realización adicional, la presente invención se refiere a un conjugado inmunogénico que comprende una VMEn, que tiene al menos una fracción de proteína de superficie conectada a un primer antígeno (Ag1) mediante un enlazador divalente y al menos otra fracción de proteína de superficie conectada a un segundo antígeno distinto (Ag2) mediante un enlazador divalente, para proporcionar un conjugado indicado por la fórmula general (II):

Ag1-enlazador-VMEn-enlazador-Ag2 (II)

Tal como se indica en la fórmula (II) Ag1 y Ag2 están cada uno individualmente conectados a la VMEn por medio de un enlazador adecuado. En esta dirección, el enlazador para la conexión de la proteína de la VMEn al Ag1 o Ag2 puede ser independientemente el mismo o diferir entre sí.

Los conjugados de fórmula (II) pueden proporcionar de forma ventajosa la multifuncionalización selectiva de VMEn, preferentemente GMMA, mediante el uso de un patrón de funcionalización específico. El Ag1 y Ag2 en la fórmula (II) puede seleccionarse entre los antígenos preferentes tal como se ha descrito anteriormente, bien sea fracciones de proteína o polisacárido. Preferentemente, los antígenos usados para la multifuncionalización tal como se contempla en el presente documento son ambas proteínas o ambos polisacáridos.

Por lo tanto, de acuerdo con una realización más preferente, la invención se refiere a un conjugado de fórmula (II) en el que Agí comprende el sacárido capsular de la Nesseria mengitidis del serogrupo A (MenA) y el Ag2 comprende el sacárido capsular de la Nesseria mengitidis del serogrupo C (MenC), incluso más preferentemente que tiene la VMEn que es una vesícula GMMA, más preferentemente obtenida a partir de Nesseria mengitidis del serogrupo B, incluso más preferentemente que expresa fHbp v2 y v3.

Incluso más preferentemente, los dos enlazadores, cada uno conectado Ag1 y Ag2, preferentemente MenA y MenC respectivamente, son los mismos, más preferentemente SIDEA. A este respecto, el GMMA multifuncionalizado obtenido puede usarse como agente inmunogénico frente a las bacterias de Neisseria de MenB, MenA o MenC, tal como se sostiene por los datos SBA recogidos en la presente parte experimental.

En una realización, dichos conjugados se preparan mediante un procedimiento que comprende la adición de una mezcla de polisacáridos MenA y MenC activados a GMMA, de acuerdo con el presente procedimiento como se ha descrito anteriormente. Los polisacáridos MenA y MenC se activan preferentemente mediante reacción con SIDEA, proporcionando, de este modo, derivados SIDEA-MenA y SIDEA-MenC adecuados, capaces de reaccionar con los grupos -NH2 de la proteína de la VMEn a través de la parte terminal de la fracción SIDEA, conduciendo, de este modo, a los conjugados de la fórmula general anterior (II).

El análisis HPAEC-PAD y de transferencia Western confirma la formación de los conjugados cuando los sacáridos MenA y MenC se conectan de forma aleatoria a las proteínas de superficie GMMA por medio del enlazador y no se detecta agregación de VMEn por dls.

El experto en la materia reconocerá que a la luz de la versatilidad de la tecnología propuesta, la presente invención puede usarse de forma adecuada para la multifuncionalización de VMEn, preferentemente GMMA, incluso con más de 2 antígenos distintos. Además de la posibilidad de seleccionar distintos antígenos tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención también permite la introducción de distintas cantidades de antígenos, modulando, de este modo la relación antígeno-VMEn de acuerdo con, por ejemplo, el antígeno seleccionado o VMEn usada.

Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones adicionales, la invención se refiere a conjugado de fórmula general (II) en el que el Agí comprende Hib y Ag2 comprende Hia, en el que dicho Agí y Ag2 están individualmente conjugados a un GMMA, preferentemente un GMMA pertussis, incluso más preferentemente por enlazadores BS3. En realizaciones aún adicionales, la invención se refiere a conjugados de fórmula general (II) en el que el Agí comprende ETEC 405 (FdeC, SEQ ID NO:16) y el Ag2 comprende ETEC3526 (SsIE, SEQ ID n O:15), en el que dicho Agí y Ag2 están independientemente conjugados a un GMMA, preferentemente un GMMA de Shigella Sonnei, incluso más preferentemente por un enlazador BS3.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención se refiere a los conjugados de la invención para su uso como un medicamento, particularmente como agente inmunogénico, incluso más preferentemente para un o más de los patógenos tal como se indica en el presente documento. En otras palabras, la invención se refiere al uso de los presentes conjugados para la fabricación de una composición inmunogénica.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición inmunogénica, preferentemente una vacuna, que comprende un conjugado de la invención y al menos un portador, excipiente o adyuvante adicional farmacéuticamente aceptable. En general, un portador, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable, puede ser cualquier sustancia que no induce ella misma a la producción de anticuerpos dañinos para el paciente que recibe la composición y que puede administrarse. Portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables son aquellos usados en la técnica y pueden incluir líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Sustancias auxiliares, tales como agentes emulsionantes o humectantes, sustancias tamponadoras del pH y similares, también pueden estar presentes en tales vehículos, de acuerdo con la técnica anterior.

La invención también proporciona un conjugado de la invención para su uso en un procedimiento para generar una respuesta inmune en un vertebrado, preferentemente un mamífero, que comprende administrar un conjugado de la invención al mamífero o vertebrado. La respuesta inmune es preferentemente protectora e involucra preferentemente anticuerpos. El procedimiento puede generar una respuesta de refuerzo.

El mamífero es preferentemente un humano. El sujeto en el que se previene la enfermedad puede que no sea el mismo que el sujeto que recibe el conjugado de la invención. Por ejemplo, puede administrarse un conjugado a una hembra (antes o durante el embarazo) para proteger el descendiente (denominado 'inmunización materna'). Los conjugados de la invención también pueden usarse para inmunizar otros mamíferos, por ejemplo, vacas, ovejas y cerdos (especialmente frente a Salmonella sp.), y otros vertebrados no mamíferos entre los que se incluye peces y aves.

La invención proporciona conjugados de la invención para su uso en la terapia (por ejemplo, como composiciones inmunogénicas o como vacunas). La invención también proporciona un conjugado de la invención para su uso en un procedimiento para generar una respuesta inmune en un vertebrado, preferentemente un mamífero. La invención también proporciona el uso de un conjugado de la invención en la fabricación de un medicamento para la generación de una respuesta inmune en un vertebrado, preferentemente un mamífero. Los usos y procedimientos son particularmente útiles para prevenir/tratar varias enfermedades, dependiendo de los antígenos y VMEn dentro de los conjugados como se ha descrito anteriormente. Los conjugados preferentes de la invención pueden conferir un título de anticuerpos en un paciente que es superior al criterio para la seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Antígenos con un título de anticuerpos asociados por encima de cual un hospedador es considerado estar seroconvertido frente al antígeno son bien conocido, y tales títulos se publican por organizaciones tales como la OMS. Preferentemente más del 80 % de una muestra estadísticamente significante de sujetos se seroconvierte, más preferentemente más del 90 %, aún más preferentemente más del 93 % y lo más preferentemente del 96-100 %.

Las composiciones inmunogénicas de la invención se administrarán generalmente de forma directa al paciente. El suministro directo puede conseguirse mediante inyección parenteral (por ejemplo, subcutáneamente, intraperitoneal, por vía intravenosa, intramuscularmente o al especio intersticial de un tejido) o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra administración de mucosa. Es preferente la administración intramuscular, por ejemplo, al muslo o parte superior del brazo. La inyección puede ser a través de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero puede usarse de forma alternativa la inyección sin aguja. La invención puede usarse para provocar la inmunidad sistémica y/o de la mucosa. El tratamiento de dosis puede ser un programa de una única dosis o un programa de múltiple dosis. Pueden usarse múltiples dosis en un programa de inmunización primario y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Un programa de dosis primario puede estar seguir por un programa de dosis de refuerzo. El momento adecuado entre dosis de sensibilización (por ejemplo, 4-16 semanas), y entre sensibilización y refuerzo, puede determinarse de forma rutinaria.

Las infecciones afectas diversas áreas del cuerpo y de este modo las composiciones de la invención pueden prepararse de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, bien como soluciones líquidas o bien como suspensiones. Pueden prepararse las formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La composición puede prepararse para administración tópica, por ejemplo, como un ungüento, crema o polvo. La composición puede prepararse para la administración oral, por ejemplo, como un comprimido o como un jarabe (opcionalmente con sabor). La composición puede prepararse para la administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizador. La composición puede prepararse como un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para la administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, como gotas. Las composiciones adecuadas para la inyección parenteral son las más preferentes. La composición es preferentemente estéril. Está preferentemente libre de pirógenos. Está preferentemente tamponada, por ejemplo, a entre pH 6 y pH 8, generalmente sobre pH 7. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los humanos. Las composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de un conjugado de la invención, así como cualquier otro de otros componentes especificados, según se necesite. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple (por ejemplo, que incluye dosis de refuerzo). La composición puede administrarse en conjunción con otros agentes inmunorreguladores.

Los adyuvantes que pueden usarse opcionalmente en las composiciones de la invención incluyen, pero sin limitarse a sales de metal insolubles, emulsiones aceite en agua (por ejemplo MF59 o AS03, ambos conteniendo escualeno), saponinas, conjugados no tóxicos de LPS (tal como monofosforil lípido A o MPL 3-O-deacilado), oligonucleótidos inmunoestimulantes, toxinas bacterianas ADP-ribosilantes destoxificadas, micropartículas, liposomas, imidazoquinolonas o mezclas de los mismos. Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se desvelan, por ejemplo, en Watson, Pediatr. Infect. Dis. J. (2000) 19:331-332. Es particularmente preferente el uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o de fosfato de aluminio. Estas sales incluyen oxihidróxidos y hidroxifosfatos. Las sales pueden tomar cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalino, amorfo, etc.).

Los conjugados de la invención que incluyen VMEn a partir de un patógeno y un antígeno seleccionado a partir de un segundo patógeno pueden ser útiles como compuestos inmunogénicos para la preparación de vacunas polivalentes.

Los conjugados preferentes de VMEn-enlazador-antígeno de la invención se indican en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1: conjugados preferentes de la invención

(continuación)

Por lo tanto, los presentes conjugados son particularmente útiles como agentes inmunogénicos frente a los patógenos enumerados en la Tabla 1. En particular, los datos confirmaron que GMMA de MenB conjugado a sacáridos capsulares de MenA y/o MenC mostraron resultados r/hSBA comparables o incluso mejores a aquellos obtenidos usando CRM197 como proteína transportadora. Los datos de SBA confirman de hecho la respuesta inmunogénica frente a MenA y MenC así como frente a MenB (véase en particular ejemplos 12, 13 y 14).

Esto significa que los presentes conjugados pueden ser usados de forma adecuada para la preparación de una composición inmunogénica polivalente o una vacuna, por ejemplo, pero no solo, frente a MenB y MenC y/o MenA, tal como se describe y apoya con detalles en el presente documento.

La invención se describirá ahora mediante la siguiente parte experimental, sin suponer ninguna limitación a su ámbito.

Parte experimental

EJEMPLO 1: Producción de VMEn

Las VMEn tal como se usan en los ejemplos son vesículas GMMA, preparadas a partir de cepas de S. Typhimurium o N. meninigitidis B, como se desvela, por ejemplo, en Clin Vaccine Immunol. Abril de 2016; 23(4): 304-314. Las características de dichas VMEn eran tal como se indican en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2: características de VMEn purificadas preparadas a partir de cepas de S. Typhimurium o N. meninigitidis.

(continuación)

EJEMPLO 2: Conjugación de VMEn por medio de enlazador BS3 (conjugación de VMEn de Pfs25-S. Typhimurium)

Se conjugó antígeno de malaria Pfs25 a las vesículas de VMEn de S. Typhimurium siguiendo el procedimiento que se describe a continuación. Se añadieron VMEn, a una concentración de proteína de 4 mg/ml en 100 mM de tampón de borato de pH 9, de enlazador BS3 (48 mg/ml en la mezcla de reacción). La mezcla se incubó a la temperatura controlada de 25 °C durante 30 minutos. Después de este tiempo, las VMEn activadas se purificaron mediante ultracentrifugado (110000 rpm, 16 min, 4 °C) y se añadió inmediatamente antígeno Pfs25. En la etapa de conjugación, se usó una relación 1:1 de VMEn:Pfs25, a una concentración de Pfs25 de 2,7 mg/ml en PBS con incubación durante la noche a temperatura ambiente. El conjugado se purificó mediante ultracentrifugado (110000 rpm, 16 min, 4 °C) y se volvió a suspender en PBS. La caracterización mediante análisis por trasferencia Western/SDS page confirmó la formación de conjugado. El análisis mediante ELISA competitivo mostró un 19,2 % de Pfs25 con respecto a la relación p/o de proteína total en el conjugado final. Las VMEn activadas intermediarias se caracterizaron por un 62 % de grupos NH2 derivados con el enlazador y un 32 % de grupos éster activos introducidos en grupos NH2 sobre VMEn. No se verificó reticulamiento en ambas etapas de la activación de VMEn con BS3 y siguiente conjugación, como se verificó mediante dls

EJEMPLO 3: fHbp v2 enlazado a VMEn de S. Typhimurium mediante química de BS3 (reciclaje de fHbp)

Se conjugó antígeno fHbp v2 a VMEn de S. Typhimurium nOMV mediante química de BS3. La reacción se llevó a cabo trabajando con fHbp a una relación de p/p de VMEn-BS3 de 1, una concentración de fHbp v2 de 0,92 mg/ml en PBS. Se produjo un conjugado adicional reciclando fHbp v2 no reaccionado del primer lote de conjugación y volviéndolo a usar para la conjugación con un lote reciente de VMEn.BS3, usando la misma condición de conjugación. El análisis por transferencia Western SDS PAGE confirmó la formación de conjugado también con el fHbp v2 reciclado.

EJEMPLO 4: CSP y (NANP)3-SH enlazados a VMEn de S. Typhimurium mediante química SH-malemido de acuerdo con la invención

Ejemplo 4,1: Derivatización de CSP con enlazador de éster de N-£-malemidocaproil-oxisuccinimda (EMCS).

Se añadió CSP a la concentración de 270 pg/ml en PBS de enlazador EMCS (como una solución de 10 mg/ml en DMSO) para tener una relación molar de 1:1 de enlazador a restos de lisina de la proteína. La solución se mezcló a TA durante 4 horas y a continuación la proteína derivatizada se purificó mediante columna PD10 frente a MES de 10 mM de pH 6. El producto resultante se caracterizó por micro BCA (64 % de recuperación).

Ejemplo 4.2: Derivatización de VMEn de S. Typhimurium con enlazador de SH.

Se volvieron a suspendes VMEn en 100 mM de tampón de borato con pH 8 y se añadió del tampón de activación que contenía 2,6 mg/ml de DTT, 13,16 mg/ml de EDTA y 7,04 mg/ml de enlazador de N-acetil-DL-homocisteína tiolactona en 100 mM de tampón de borato de pH 11. Las VMEn estaban a 2,3 mg/ml con una relación molar de enlazador con respecto a grupos NH2 sobre GMMA igual a 7. Se purificaron VMEn-SH mediante ultracentrifugado (110000 rpm, 4 °C, 1 hora) y se recuperó en un tampón de MES de 100 mM de pH 6. Las VMEn-SH se caracterizaron mediante micro BCA (80 % de recuperación de proteínas) y se activaron los t Nb S que mostraban un 54 % de grupos NH2.

Ejemplo 4.3: Derivatización de VMEn de S. Typhimurium con enlazador EMCS.

Se volvieron a suspender VMEn en 100 mM de NaPi de pH 7,2 y se añadieron de enlazador EMCS (como una solución de 20 mg/ml en DMSO) para tener una relación molar de 0,6:1 de enlazador a restos de lisina de la proteína y con una concentración de VMEn de 3,94 mg/ml. La reacción se dejó mezclar a TA durante 4 horas y las VMEn-EMCS se purificaron mediante ultracentrifugado (110000 rpm, 4 °C, 1 hora). VMEn derivatizados se recuperaron en un tampón de MES de 100 mM de pH 6. Las VMEn-EMCS se caracterizaron mediante micro BCA (87 % de recuperación de proteínas) y procedimientos colorimétricos de TNBS y Ellman para evaluar el % de grupos NH2 activados (30 %).

Ejemplo 4.4: Conjugación de VMEn-SH con CSP-EMCS.

Se conjugó proteína de CSP, previamente derivatizada con enlazador de EMCS, a VMEn-SH. La conjugación se realizó con una relación de p/p de VMEn con respecto a CSP de 1:1 a una concentración de CSP de 96,7 |jg/ml en 100 mM de MES a pH 6. La reacción se dejó mezclar a TA durante 4 horas y el conjugado se purificó mediante ultracentrifugado (110000 rpm, 4 °C, 1 hora) y se recuperó en PBS. La cantidad de CSP conjugado con respecto al contenido de proteína total fue de 0,33 (p/p) según se evaluó por el análisis HPLC-SEC de la mezcla de conjugación. El análisis por transferencia Western/SDS PAGE confirmó la formación de conjugado.

Ejemplo 4.5: Conjugación de VMEn-EMCS con (NANP) ³ -SH.

Proteína (NANP)3-SH, que tenía un resto terminal de cisteína, se añadió a VMEn-EMCS en Mes de 100 mM a pH 6 a una concentración de 8,7 mg/ml y con una relación de p/p de 1 respecto a la VMEn. La reacción se dejó mezclar a TA durante 4 horas y el conjugado se purificó mediante ultracentrifugado (110000 rpm, 4 °C, 1 hora) y se recuperó en PBS. La cantidad de (NANP)3 conjugado con respecto al contenido de proteína total fue de 0,31 (p/p) según se calculó mediante análisis Ellman y HPAEC-PAD sobre el conjugado. El análisis por transferencia Western/SDS PAGE confirmó la formación de conjugado.

EJEMPLO 5: inmunogenicidad de conjugados del Ejemplo 4 en ratones

Se inmunizaron ratones subcutáneamente en los días 0 y 28 con conjugados de VMEn-CSP y VMEn-(NANP)3 preparados de acuerdo con el Ejemplo 4. Comparado con la mezcla física de VMEn CSP, a 2 |jg de CSP o (NANP)3 por dosis. Se midieron títulos lgG anti-CSP en los días 0, 14, 28 y 42, ay los resultados se muestran en la Figura 1A.

Ambos conjugados de VMEn indujeron una respuesta específica anti-CSP más elevada que CSP físicamente mezclado con VMEn (prueba de Kruskal-Wallis con análisis post hoc de Dunn, p = 0,002 para VMEn-CSP y p = 0,001 para VMEn-(NANP)3 respectivamente el día 42).

Ambos conjugados mostraron la capacidad de reforzar la respuesta (día 14-día 42).

También se evaluaron los títulos lgG frente al -OAg. La presencia de CSP o (NANP)3 sobre la superficie de la VMEn no tuvo un impacto sobre la capacidad de VMEn en inducir una respuesta lgD anti-OAg específica (Figura 1B).

EJEMPLO 6: fHbp v1.1 enlazado a VMEn de S. Typhimurium mediante química SH-malemido o click

Ejemplo 6.1: Derivatización de VMEn de S. Typhimurium con enlazador de SH.

Las VMEn se suspendieron en 100 mM de tampón de burato de pH 8 y se añadieron del tampón de activación que contenía 2,6 mg/ml de DTT, 13,16 mg/ml de EDTA y 7,04 mg/ml de enlazador de N-acetil-DL-homocisteína tiolactona en 100 mM de tampón de borato de pH 11. Las VMEn estaban a 3,0 mg/ml con una relación molar de enlazador con respecto a grupos NH2 sobre una VMEn igual a 6,63. Esta reacción se dejó mezclar a TA durante 4 horas y las VMEn-SH se purificaron a continuación mediante diálisis frente a 50 mM de MES de 0,5 mM de tampón de DTT de pH 6. Las VMEn-SH se caracterizaron mediante Lowry (75 % de recuperación de proteínas) y el TNBS mostró que un 41 % de los grupos NH2 se activaron.

Ejemplo 6.2: Derivatización de fHbp v1.1 con enlazador de éster de N-£-malemidocaproil-oxisuccinimda (EMCS).

Al fHbp a la concentración de 1,25 mg/ml en PBS se añadió enlazador EMCS (como una solución de 10 mg/ml en DMSO) para tener una relación molar de 0,2:1 de enlazador a restos de lisina de la proteína. La solución se mezcló a TA durante 4,5 horas y a continuación la proteína derivatizada se purificó mediante columna PD10 frente a MES de 10 mM de pH 6. El producto resultante se caracterizó mediante micro BCA (95 % de recuperación), mostrando el HPLC-SEC y SDS-PAGE ninguna agregación de proteína con respecto proteína no derivatizada y el MADI-MS indicando un promedio de tres enlazadores introducidos por molécula de proteína.

Ejemplo 6.3: Conjugación de VMEn-SH con fHbp-EMCS.

fHbp-EMCS se conjugó a VMEn-SH. La conjugación se realizó con 2:1 p/p con respecto a relación de fHbp a una concentración de fHbp de 2 mg/ml. La reacción se dejó mezclar a TA durante 5 horas y el conjugado se purificó mediante Vivaspin 100k frente a PBS. La formación de conjugado se confirmó mediante análisis por transferencia Western/SDS page.

Ejemplo 6.4: Derivatización de VMEn de S. Typhimurium con enlazador de alquino.

Se suspendieron VMEn en 100 mM de Napi de pH 7,2 y se añadió 25 mg/ml de enlazador de éster I de N-hidroxisuccinimido BCN click-easy (Berry Associates) en DMSO. Las VMEn estaban a 8,9 mg/ml con una relación molar de enlazador a grupos NH2 sobre GMMA igual a 0,6. La reacción se dejó mezclar a TA durante 4 horas y a continuación las VMEn-alquino se purificaron mediante diálisis frente a 100 mM de Napi de pH 7,2. Las VMEn-alquino se caracterizaron mediante Lowry (72 % de recuperación de proteínas) y el TNBS mostró que un 40 % de grupos de NH2 se activaron.

Ejemplo 6.5: Derivatización de fHbp v1.1 con enlazador NHS-PEG ⁴ -N ^3.

Al fHbp a la concentración de 1,25 mg/ml en PBS se añadió enlazador -N3 (como una solución de 25 mg/ml en DMSO) para tener una relación molar de 0,2:1 de enlazado con respecto a restos de lisina de la proteína. La solución se mezcló a TA durante 6 horas y a continuación la proteína derivatizada se purificó mediante columna PD10 frente a 10 mM de NaPi de pH 7,2. El producto resultante se caracterizó mediante micro BCA (87 % de recuperación), HPLC-SEC y SDS-PAGE, mostrando ninguna agregación de proteína con respecto a la proteína derivatizada y el MALDI-MS, indicando un promedio de dos enlazadores introducidos por molécula de proteína.

Ejemplo 6.6: Conjugación de VMEn-alquino con fHbp-N ³ .

Se conjugó fHbp-N3 a VMEn-alquino. La conjugación se realizó con 2:1 p/p con respecto a relación de fHbp a una concentración de fHbp de 1,67 mg/ml. La reacción se dejó mezclar a TA durante 5 horas y el conjugado se purificó mediante Vivaspin 100k frente a PBS. La formación de conjugado se verificó mediante análisis por transferencia Western/ SDS page.

EJEMPLO 7: inmunogenicidad de conjugados obtenida en el Ejemplo 6 en ratones

Se inmunizaron ratones subcutáneamente en los días 0 y 28 con los conjugados sintetizados en comparación con fHbp solo, VMEn sola y fHbp mezclado físicamente con VMEn. Se usaron 2,5 |jg de proteína total (1,75 |jg de VMEn y 0,75 jg de fHbp, asumiendo un fHbp con respecto a la relación p/p de proteína total en los conjugados de 0,3) por dosis. Todos los antígenos se formularon con Alhidrogel de 0,7 mg/ml Al3+ y 10 mM de Histidina.

Los anticuerpos inducidos por los conjugados mostraron una mayor protección frente a distintas cepas meningocócicas, con una actividad bactericida superior en comparación con fHbp recombinante solo o físicamente mezclado con VMEn (Tabla 3). El suero de los conjugados también resultó bactericida frente al aislado clínico de Malaui invasivo D23580 S. Cepa de Typhimurium y no inferior a VMEn sola en términos de respuesta inducida de lgG de anti-OAg (Tabla 3).

Tabla 3. Títulos de SBA frente a distintas cepas meningocócicas de suero agrupado recolectado después de la inmunización con construcciones de fHbp. Se inmunizaron ratones el día 0 y 28 con 2,5 de proteína total (1,75 de VMEn y 0,75 mg de fHbp, asumiendo un fHbp con respecto a relación p/p de proteína total en los conjugados de 0,3) formulada con Alhidrogel.

EJEMPLO 8: VMEn de MenB conjugadas a proteína fHbp-SH v3 mediante química BS3 (sin formación de agregados después de la conjugación)

Se añadieron VMEn de MEnB, a una concentración de proteínas de 2,8 mg/ml en 100 mM de tampón MES de pH 6, de enlazador BS3 (50 mg/ml en la mezcla de reacción). La mezcla se incubó a la temperatura controlada de 25 °C durante 30 minutos. Después de este tiempo, las VMEn activadas se purificaron mediante ultracentrifugado (110000 rpm, 16 min, 4 °C) y se añadió inmediatamente fHbp-SH v3. En la etapa de conjugación, se usó una relación p/p de 1:1 de VMEn con respecto a fHbp-SH, con una concentración de VMEn de 1,7 mg/ml en PBS. Después de mezclar durante la noche a t A, el conjugado se purificó mediante ultracentrifugado (110000 rpm, 16 min, 4 °C) y se recuperó en PBS. La caracterización mediante transferencia Western/SDS page confirmó la formación de conjugado. El VMEn-BS3 y el conjugado final se compararon con VMEn mediante HPLC-SEC/MALS mostrando ninguna formación de agregados (Tabla a continuación).

EJEMPLO 8a (comparativo): Conjugación de VMEa por medio de enlazador BS3

Se ha evaluado VMEa (a partir de MenB) como material de partida para la reacción con enlazador BS3, con las siguientes condiciones:

- pH: 6,5;

- concentración de BS3: 50 mg/ml;

- concentración de VMEa: 1,011 mg/ml;

- 30 min de tiempo de reacción a 25 °C;

- Purificación mediante UC (110Krpm, 16 min, 4 °C).

La reacción proporciona agregados de VMEa y subproductos como mayores resultados. Se ha verificado la agregación/reticulamiento mediante análisis dls y SEC/MALS.

EJEMPLO 9: VMEn de S. Typhimurium conjugada a GAS-PS

GAS PS se derivatizó terminalmente con enlazador de ADH antes de la conjugación a VMEn. El PS se solubilizó en 20 mM de AcONa a pH 4,5 a 30 mg/ml y se añadió ADH y NaBHaCN ambos con una relación de p/p de 1:1 con respecto al PS. La solución se mezcló a 30 °C durante 5 días. Después de este tiempo el producto se purificó mediante columna 2 PD10 frente a NaCl 3 M y agua, respectivamente. PS-Ad H se caracterizó mediante HPAEC-PAD (78 % de recuperación) y TNBS, encontrando que todas las cadenas de PS se activaron con enlazador de ADH.

VMEn, a una concentración de proteínas de 4,4 mg/ml en 100 mM de tampón MES de pH 6, se añadieron a enlazador de BS3 a 50 mg/ml en la mezcla de reacción. La mezcla se incubó a la temperatura controlada de 25 °C durante 30 minutos. Después de este tiempo, las VMEn activadas se purificaron mediante ultracentrifugado (110000 rpm, 16 min, 4 °C) y se añadió inmediatamente GAS PS-ADH. En la etapa de conjugación, se usó una relación de 1:3 de VMEn con respecto a GAS PS-ADH, con una concentración de g As PS-ADH de 10 mg/ml en PBS. Durante la incubación durante la noche a TA, el conjugado se purificó mediante ultracentrifugado (110000 rpm, 16 min, 4 °C) y se recuperó en PBS. La caracterización mediante micro BCA, HPAEC-PAD y NTA permitió estimar un promedio de 107 cadenas PS por partícula de VMEn.

Se aplicó el mismo protocolo de conjugación para conjugar oligosacáridos sintéticos de fórmula (Rha)4-(CH2)3-NH2 y (Rha)6-(CH2)3-NH2 a VMEn. Los conjugados resultantes tenían un número promedio de 876 y 640 cadenas de oligosacáridos por partícula de VMEn.

EJEMPLO 10: Datos in vivo de los conjugados de la invención obtenidos mediante conjugación de una partícula de VMEn S. Typhimurium a antígenos Pfs25 o fHbp v2 mediante química de BS3.

Se inmunizaron ratones hembra CD1 subcutáneamente los días 0 y 28 con 2,5 |jg de proteína total de partículas de VMEn de S. Typhimurium conjugadas a antígenos Pfs25 o fHbp mediante química de BS3. Todos los antígenos se adsorbieron sobre Alhidrogel (0,7 mg/ml de Al3+). Se midieron títulos de lgG de anti-Pfs25 (Figura 2) y anti-fHbp v2 (Figure 3) en los días 0, 14, 27 y 42.

Tal como se ha demostrado, los conjugados de VMEn-BS3 fueron capaces de inducir una alta respuesta de lgG específica de antiantígeno.

EJEMPLO 11: preparación de conjugados MenA-GMMA-MenC por medio de enlazadores de SIDEA.

GMMA meningocócicos B sobreexpresando fHbp, a una concentración de proteínas de 10 mg/ml en un tampón de NaH2PO4 de 50 mM de pH 7,2, se añadieron simultáneamente a sacáridos de MenA y MenC (avDP 15), previamente derivatizados terminalmente con enlazador de SIDEA (Vaccine 1992 10(10):691-698), con una relación de p/p de MenA/MenC con respecto a VMEn de 10:1, de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Después de este tiempo, el conjugado resultante se purificó mediante ultracentrifugado (2x, 110000 rpm, 1h, 4 °C) y se suspendió en PBS. El análisis por transferencia Western SDS page confirmó la formación de conjugados, con ambos sacáridos enlazados a VMEn. El conjugado se caracterizó mediante una relación de p/P de MenA con respecto a proteína y de MenC con respecto a proteína de 0,10 y 0,12 respectivamente, tal como se determinó mediante análisis HPAEC-PAD y micro BCA, con 19,3 % de MenA y 4,3 % de MenC libres de sacáridos respectivamente (mediante análisis HPAEC-PAD después del tratamiento C4 SPE de los conjugados).

EJEMPLO 12: preparación de conjugados MenA-GMMA por medio de enlazador de SIDEA

GMMA meningocócicos B sobreexpresando fHbp, a una concentración de proteínas de 10 mg/ml en un tampón de NaH2PO4 de 50 mM de pH 7,2, se añadieron a polisacáridos de Men (avDP 15), derivatizado previamente terminalmente con enlazador de SIDEA (Vaccine 1992 10(10):691-698), con una relación de p/p de MenA con respecto a VMEn de 10:1, de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Después de este tiempo, el conjugado resultante se purificó mediante ultracentrifugado (2x, 110000 rpm, 1h, 4 °C) y se suspendió en PBS. El análisis por transferencia Western SDS PAGE confirmó la formación de conjugado. El conjugado se caracterizó mediante una relación de p/p de MenA con respecto a proteína de 0,054, tal como se determinó mediante análisis HPAEC-PAD y micro BCA, sin detectar MenA libre mediante análisis HPAEC-PAD después del tratamiento C4 SPE del conjugado.

EJEMPLO 13: preparación de conjugados MenC-GMMA por medio de enlazados de SIDEA

Se siguió el mismo procedimiento que se usó en el Ejemplo 12 para la preparación del conjugado titulado, usando un antígeno a partir de MenC en lugar de MenA. La caracterización del conjugado se presenta en la tabla a continuación.

EJEMPLO 14: Estudio de inmunogenicidad en ratones

Se inmunizaron ratones hembra CD1 de 5-6 semanas de edad (8 por grupo) intramuscularmente en los días 0 y 28 con 1 |jg de MenA o MenC por dosis. los conjugados de GMMA se compararon con los conjugados MenA-CRMw o MenC-CRM197 y con GMMA físicamente mezclado a polisacáridos de MenA o MenC.

Todos los antígenos se adsorbieron sobre Alhidrogel (0,7 mg/ml de Al3+). Se midieron los títulos lgG anti-MenA y MenC en los días -1, 27 y 42 (Figura 2) y los títulos de SBA de suero agregado a partir de cada grupo se midieron el día 42 frente a un panel de cepas de MenA, MenC y MenB.

EJEMPLO 14a: lgG anti-MenA/SBA

Respuesta lgG

Tal como se muestra en la Figura 4, el estudio de inmunogenicidad en ratones mostró que:

- Una respuesta lgG de anti-MenA superior es inducida mediante el conjugado MenA-GMMA en comparación con MenA-CRMw.

- La conjugación de MenA a GMMA mejora la respuesta inmune humoral frente al polisacárido.

- El conjugado bivalente induce una respuesta lgG de anti-MenA comparable al conjugado de MenA-GMMA, sin interferencia debido a la presencia de MenC sobre las mismas partículas de GMMA.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado inmunogénico que comprende una Vesícula de Membrana Externa nativa (VMEn) que tiene al menos una fracción de proteína de superficie conectada a al menos un antígeno mediante un enlazador divalente en el que dicho enlazador divalente es un enlazador homobifuncional.

2. El conjugado inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una VMEn que tiene al menos una fracción de proteína de superficie conectada a un primer antígeno mediante un enlazador divalente, en donde dicho primer antígeno está conectado adicionalmente a un segundo antígeno distinto.

3. El conjugado inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una VMEn que tiene al menos una fracción de proteína de superficie conectada a un primer antígeno por medio de un enlazador divalente y al menos otra fracción de proteína de superficie conectada a un segundo antígeno distinto mediante un enlazador divalente.

4. El conjugado inmunogénico de acuerdo con las anteriores reivindicaciones, en el que dicho enlazador divalente tiene la fórmula general (I):

X-L-X' (I)

en la que:

X y X' son iguales y son un grupo funcional capaz de reaccionar selectivamente con el residuo de proteína de VMEn por un lado y con el antígeno por otro lado;

-L- es un grupo alquenilo o alquilo C1-C15 lineales o ramificados divalentes sustituidos opcionalmente e interrumpidos opcionalmente por uno o más heteroátomos seleccionados a partir de: oxígeno (-O-), azufre (-S-), nitrógeno (-NH- o grupo -N- opcionalmente sustituido).

5. El conjugado inmunogénico de acuerdo con una cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que dicho enlazador divalente se selecciona de al menos uno de: glutarato de disuccinimidilo (DSG), suberato de disuccinimidilo (DSS), N-hidroxisuccinimida, N oxisuccinimida y diéster de N-hidroxisuccinimida de ácido adípico (SIDEA) y suberato de Bis(sulfosuccinimidilo (BS3), etilenglicol bis[succinimidil succinato], bis(sulfosuccinimidil)tri(etilenglicol) (BS(Pe G)3), bis(sulfosuccinimidil)tetra(etilenglicol) (BS(PEG)4), bis(sulfosuccinimidil)penta(etilenglicol) (BS(PEG)5) y bis(sulfosuccinimidil)exa(etilenglicol) (BS(PEG)6), dihidrazida de ácido adípico (ADH).

6. El conjugado inmunogénico de acuerdo con las anteriores reivindicaciones, en el que dicha VMEn se obtiene mediante un procedimiento sin detergentes, siendo liberada dentro del caldo de fermentación y purificada usando un centrifugado y una posterior filtración; o siendo liberada dentro del caldo de fermentación y purificada usando dos etapas consecutivas de filtración de flujo tangencial (TFF).

7. El conjugado inmunogénico de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, , en el que dicha VMEn es una vesícula de GMMA.

8. Un procedimiento para la preparación del conjugado inmunogénico de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, que comprende las etapas de:

i) hacer reaccionar al menos un residuo de proteína de superficie de VMEn con la primera porción terminal de un enlazador divalente para obtener un intermediario VMEn-enlazador; y

ii) hacer reaccionar dicho intermediario VMEn-enlazador con al menos un antígeno por medio de la segunda porción terminal del enlazador divalente, obteniendo de este modo el conjugado VMEn-enlazador-antígeno.

9. El intermediario enlazador VMEn obtenido (u obtenible) mediante la etapa i) de la reivindicación 8.

10. Uso del intermedio enlazador VMEn de la reivindicación 9 para la preparación de VMEn-enlazador-antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1-7.

11. Una composición inmunogénica que comprende un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y al menos un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables.

12. El conjugado o la composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 u 11, para su uso como medicamento.

13. El conjugado o la composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 para inducir una respuesta inmune en un vertebrado.

14. Una vacuna que comprende los conjugados inmunogénicos definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 7 o la composición inmunogénica definida en la reivindicación 11.