ES2848066T3 - Vacuna contra Acinetobacter baumannii basada en componentes celulares deficientes en lipopolisacárido - Google Patents

Abstract

Composición de vacuna adecuada para el tratamiento profiláctico de una infección provocada por una cepa de Acinetobacter baumannii en un mamífero, que comprende: a. una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) caracterizada por la inactivación parcial o completa de una o diversas moléculas de ácido nucleico celulares que codifican para genes de biosíntesis de LPS endógeno; y/o b. una vesícula de la membrana externa (OMV) derivada de una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) tal como se definió en el párrafo a) anterior; en la que la cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) se caracteriza por la inactivación parcial o completa de los genes seleccionados de la lista que consiste en IpxA, IpxB, IpxC, IpxD, IpxK, IpxL y/o IpxM.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna contra Acinetobacter baumannii basada en componentes celulares deficientes en lipopolisacárido

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al campo de la farmacología e inmunología y, en particular, a una composición de vacuna adecuada para el tratamiento profiláctico de una infección provocada por una cepa de Acinetobacter baumannii en un mamífero.

Antecedentes de la invención

La creciente importancia clínica de las infecciones provocadas por A. baumannii resistente a múltiples fármacos garantiza el desarrollo de nuevos enfoques para la prevención y el tratamiento de infecciones provocadas por este patógeno. En este contexto, la inmunización de determinadas poblaciones de pacientes podría contribuir a la reducción de la morbimortalidad provocada por este patógeno. Las vacunas contra bacterias gramnegativas basadas en células bacterianas completas inactivadas son altamente inmunogénicas y se ha demostrado que producen inmunidad protectora contra varias especies bacterianas. Sin embargo, los altos niveles de endotoxina, debidos a la presencia de lipopolisacárido, en estas vacunas complican su uso en humanos.

Acinetobacter baumannii es un cocobacilo gramnegativo con importancia clínica en el ámbito hospitalario. Este organismo se distribuye altamente en el suelo y fuentes de agua medioambientales (Baumann, P. 1968. J. Bacteriol.

96, 39-42), y puede provocar diferentes tipos de infecciones como patógeno hospitalario, tales como neumonía, bacteriemia, meningitis e infección de piel y partes blandas, entre otras (García-Quintanilla et al., 2013. Curr. Pharm. Biotechnol. In press). Este patógeno infecta normalmente a pacientes que reciben respiración mecánica y a pacientes que padecen lesiones por quemaduras (Muñoz-Price y Weinstein. 2008. N. Engl. J. Med. 358, 1271-1281). Sin embargo, también se ha aislado en casos de neumonía extrahospitalaria (Ho et al., 2009. Chest. 136, 1119-1127; Ong et al.,2009. Respirology 14, 1200-1205) y en personal militar que padece traumatismos relacionados con la guerra en Vietnam, Iraq, Kuwait y Afganistán (Jones et al., 2006. Lancet Infect. Dis. 6, 317-318; Tong, 1972. JAMA 219, 1044­ 1047). Las tasas brutas de mortalidad asociadas con la infección por A. baumannii están entre el 35% y el 70% para infecciones hospitalarias (Vila y Pachón, 2008. Expert Opin. Pharmacother. 9, 587-599). Debido a la capacidad de A. baumannii de adquirir resistencia a los antibióticos, el número de cepas resistentes a múltiples fármacos ha aumentado drásticamente a lo largo de los últimos años (Tasbakan et al., 2009. Mikrobiyol Bul. 43, 61-70; Valencia et al., 2009. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 30: 257-263). La aparición de estas cepas altamente resistentes ha complicado la gestión clínica de infecciones provocadas por A. baumannii. En este contexto, el desarrollo de una vacuna contra A. baumannii podría reducir la morbimortalidad provocada por este patógeno (Pachón y McConnell, 2014. Vaccine, In press).

Las vacunas experimentales que se han descrito para A. baumannii pueden clasificarse en dos amplios grupos, las vacunas que consiste en un solo antígeno purificado y las vacunas de múltiples componentes. Dentro del primer grupo, la proteína de la membrana externa OmpA (Luo et al., 2012. PLoS One 7, e29446), la proteína asociada a la biopelícula Bap (Fattahian et al., 2011. Microb. Pathog. 51,402-406), el transportador de la membrana Ata (Bentancor et al., 2012. Infect. Immun. 80, 3381-3388) y el polisacárido de la superficie poli-N-acetil-p-(1-6)-glucosamina (Bentancor et al., 2012. Infect Immun 80, 651-656) se han descrito como buenos candidatos debido a su capacidad para provocar una respuesta inmunitaria específica. Sin embargo, los experimentos que someten a prueba la supervivencia después de la inmunización activa sólo han demostrado que OmpA proporciona una protección parcial y que la expresión de Bap no se ha demostrado con claridad en cepas que no forman biopelícula. Los enfoques que emplean vacunas de múltiples componentes incluyen complejos de la membrana externa (McConnell et al., 2011. Infect. Immun. 79, 518­ 526), vesículas de la membrana externa (outermembrane vesicles; McConnell et al., 2011. Vaccine 29,5705-5710) y células completas inactivadas (McConnell y Pachón, 2010. Vaccine 29: 1-5). Cada una de estas vacunas induce una respuesta inmunitaria fuerte y es capaz de provocar altos niveles de protección contra la infección en un modelo murino usando la cepa ATCC 19606 y aislados clínicos. Sin embargo, a pesar de estos resultados prometedores, el uso de estas vacunas en humanos es complicado en vista de los altos niveles de endotoxina en estas vacunas debidos a las altas cantidades de lipopolisacárido (LPS) presente en estas preparaciones.

El LPS se forma por el antígeno O, un polisacárido central y lípido A, que es responsable de la actividad de endotoxina del LPS. Los primeros estudios que emplearon Escherichia coli demostraron que la producción de LPS era esencial para la viabilidad bacteriana (Raetz, 1990. Annu. Rev Biochem. 59, 129-170). Sin embargo, trabajos posteriores demostraron que determinadas especies bacterianas, tales como Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis, eran viables después de la mutación de los genes que codifican para enzimas implicadas en la biosíntesis de LPS, dando como resultado cepas que carecen por completo de LPS (Peng et al., 2005. Infect. Immun. 73, 7569-7577; Steeghs et al., 1999. Infect. Immun. 67, 4988-4993). Un estudio reciente demostró que A. baumannii puede adquirir resistencia al antibiótico colistina a través de la mutación de los genes implicados en la biosíntesis de LPS IpxA, IpxC e IpxD (Moffatt et al., 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4971-4977), dando lugar a cepas completamente deficientes en LPS. Estos resultados indican que A. baumannii también es viable en ausencia de LPS, dando lugar a la posibilidad de desarrollar vacunas basadas en estas cepas.

Las vesículas de la membrana externa (OMV) son vesículas derivadas de la membrana externa bacteriana que se secretan de numerosas bacterias gramnegativas (Kulp et al., 2010. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184). Las OMV son vesículas esféricas de aproximadamente 20-200 nm que se componen de proteínas de la membrana externa, proteínas periplásmicas y LPS (Kuehn et al., 2005. Genes Dev. 19, 2645-2655; Mashburn et al., 2005. Nature. 437, 422-425). Se ha demostrado que las OMV secretadas participan en la detección de percepción de quorum, el transporte de factores de virulencia y la transferencia de genes, lo que indica que desempeñan un papel en la patogénesis bacteriana. También se ha demostrado que las OMV pueden administrar proteínas al interior de células huésped a través de la fusión con balsas lipídicas, lo que sugiere que las OMV pueden usarse para transportar productos bacterianos a grandes distancias (Kesty et al., 2004. Embo J. 23, 4538-4549). Un estudio reciente por Kwon et al demostró que un aislado clínico de A. baumannii secretó OMV durante el crecimiento in vitro (Kwon et al., 2009. FEMS Microbiol. Lett. 297, 150-156). Un análisis proteómico de las OMV demostró que contienen múltiples factores de virulencia y proteínas inmunomoduladoras, lo que sugiere que las OMV desempeñan un papel importante en la patogénesis de A. baumannii.

Se han desarrollado vacunas basadas en OMV para diversas bacterias gramnegativas, incluyendo Neisseria meningitidis, Helicobacter pylori y Vibrio cholerae (Bjune et al., 1991. NIPH Ann. 14, 125-130; Keenan et al., 2003. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 36, 199-205; Bishop et al., 2012. J. Infect. Dis. 205, 412-21). Se ha demostrado que la inmunización con OMV induce anticuerpos contra múltiples antígenos bacterianos y la capacidad de proporcionar inmunidad protectora en modelos animales de infección. Además, las OMV aisladas del serogrupo B de N. meningitidis han demostrado ser seguras e inmunogénicas en humanos, y se han usado para controlar un brote de meningitis por meningococos en Nueva Zelanda (Nokleby et al., 2007. Vaccine. 25, 3080-84).

Las infecciones provocadas por A. baumannii se producen a menudo en brotes provocados por un solo clon. Por este motivo, una vacuna basada en OMV podría ser más eficaz si las OMV se aíslan del clon causante. La purificación de OMV de cultivos bacterianos es rápida y sencilla, requiriendo sólo la filtración del sobrenadante de cultivo y la concentración de las OMV.

Breve descripción de la invención

Aspecto A: este aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, preferiblemente una composición de vacuna, adecuada para el tratamiento profiláctico (antes de la infección) de una infección provocada por una cepa de Acinetobacter baumannii en un mamífero, que comprende:

a. una célula completa de cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) caracterizada por la inactivación parcial o completa de una o diversas moléculas de ácido nucleico celulares que codifican para LPS endógeno; y/o

b. una vesícula de la membrana externa (OMV) derivada de una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) tal como se definió en el párrafo a) anterior,

en la que la cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) se caracteriza por la inactivación parcial o completa de los genes seleccionados de la lista que consiste en IpxA, IpxB, IpxC, IpxD, IpxK, IpxL y/o IpxM.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) se caracteriza por la inactivación parcial o completa de los genes seleccionados de la lista que consiste en IpxA, IpxD y/o IpxC.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, la composición farmacéutica, preferiblemente la composición de vacuna, comprende además un polipéptido, preferiblemente recombinante, seleccionado de la lista que consiste en:

a. la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27 (supuesto receptor de sideróforo férrico (A. baumannii ATCC 17978; número de registro YP_001084684)) o un fragmento de la misma, en la que el término fragmento se entiende en el presente documento como fragmentos biológicamente activos seleccionados de la lista que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 o cualquier combinación de las mismas, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11; y/o

b. la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28 (supuesto receptor de sideróforo de hidroximato férrico (A. baumannii ATCC 17978; número de registro YP_001084696)) o un fragmento de la misma, en la que el término fragmento se entiende en el presente documento como fragmentos biológicamente activos seleccionados de la lista que consiste en SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23 o cualquier combinación de las mismas, o secuencias que tienen una identidad de al menos el 85% con los aminoácidos de SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, la composición farmacéutica, preferiblemente la composición de vacuna, comprende además una secuencia de proteína de la membrana externa purificada de A. baumannii seleccionada de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO 47; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO 51; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO 53; SEQ ID NO 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO 65; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO 68; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 71; SEQ ID NO 72; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO 75; SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO : 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 SEQ ID NO 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO : 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 o cualquier combinación de las mismas.

En aún otra realización preferida de este aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, la composición farmacéutica, preferiblemente la composición de vacuna, comprende además las secuencias de polipéptido recombinante de fusión SEQ ID NO: 24 y/o 25 y/o la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 26.

En aún otra realización preferida de este aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, la cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) comprende o se transforma, transduce o transfecta con una secuencia de nucleótidos capaz de codificar para cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal como se definió en cualquiera de los párrafos anteriores, de modo que tal cepa es capaz de producir la expresión exógena de cualquiera de estas secuencias de aminoácidos.

En aún otra realización preferida de este aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicha composición farmacéutica, preferiblemente la composición de vacuna, comprende además un vector, tal como un vector viral, un plásmido o un casete de expresión, que comprende una secuencia de nucleótidos capaz de codificar para cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal como se definió en cualquiera de los párrafos anteriores y expresar dichas secuencias de aminoácidos.

En aún otra realización preferida de este aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, la cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) se inactiva. Preferiblemente, dicha cepa o célula se deriva de la cepa ATCC 19606.

Aspecto B: este aspecto de la invención se refiere a la composición farmacéutica, preferiblemente la composición de vacuna, del aspecto A de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, para su uso en el tratamiento profiláctico o para la inmunización activa de una infección provocada por A. baumannii en un mamífero, preferiblemente en un humano.

Aspecto C: este aspecto de la invención se refiere a una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS), transformada, transducida o transfectada con una secuencia de nucleótidos capaz de codificar para cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal como se definió en el aspecto A de la invención, de modo que tal cepa es capaz de producir la expresión exógena de cualquiera de dichas secuencias de aminoácidos. Preferiblemente, dicha cepa deficiente de A. baumannii se usa como medicamento.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y a vacunas que consisten en células completas deficientes en LPS y/o vesículas de la membrana externa de Acinetobacter baumannii (A. baumannii) capaces de conferir protección contra una infección provocada por patógenos infecciosos.

Los autores de la presente invención demuestran que células inactivadas de A. baumannii deficientes en LPS y/o vesículas de la membrana externa de A. baumannii, tras inocularse, producen inmunización, que proporciona protección contra una posterior infección por dichas bacterias, lo que demuestra la utilidad de estas células o cepas como vacunas profilácticas contra infecciones provocadas por A. baumannii.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una célula o cepa de Acinetobacter que es deficiente en LPS, a continuación en el presente documento, célula o cepa de la invención.

La especie de Acinetobacter son bacilos no fermentadores y no móviles estrictamente aerobios que son negativos para oxidasa y aparecen en parejas al microscopio. Se distribuyen ampliamente en la naturaleza, y son importantes en el suelo y contribuyen a su mineralización.

Se entiende que “célula inactivada” en la presente invención es una célula que no tiene la capacidad de replicarse pero conserva su capacidad inmunogénica.

Las células de la presente invención se inactivan antes de su inoculación para prevenir su replicación en el huésped y, por tanto, previenen la invención producida por su administración. La inactivación de las células de la invención puede realizarse usando diversos métodos conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, aunque sin limitarse a, adsorción, calor, luz ultravioleta, radiación ionizante, ultrasonidos, fenol, formol, formaldehído, cristal violeta, gliceraldehído, óxido de etileno, propiolactona, etilenamina, bromoetilenamina o formalina. En una realización preferida, las células de la invención se inactivan con formalina. En otra realización preferida, las células de la invención son de la especie Acinetobacter baumannii y se inactivan con formalina.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la deficiencia en LPS puede lograrse mediante inactivación parcial o completa de una o diversas moléculas celulares de ácido nucleico que codifican para los genes endógenos para las subunidades de LPS, particularmente IpxA, IpxB y/o IpxC de LPS.

En otra realización preferida de la invención, la célula o cepa de Acinetobacter deficiente en LPS se obtiene mediante deleciones y/o inserciones de uno o diversos nucleótidos en secuencias de ácido nucleico que codifican para el gen implicado en la biosíntesis de LPS y/o las secuencias que controlan su expresión. Las deleciones y/o inserciones pueden generarse mediante recombinación homóloga, inserción de transposones u otros métodos adecuados conocidos en el estado de la técnica.

En una realización preferida de la invención, la secuencia se inactiva, por ejemplo, mediante la construcción de un vector suicida que contiene el gen IpxA, IpxB, IpxC, IpxD, IpxK, IpxL y/o IpxM o cualquiera de sus combinaciones, o la interrupción con un gen marcador para la selección, la transformación de las células diana con el vector y el examen para determinar células positivas que son negativas para la expresión de LPS.

En otra realización preferida de la invención, la célula o cepa de la invención es preferiblemente una célula de A. baumannii, particularmente una célula de A. baumannii atenuada u otra de Acinetobacter; Acinetobacter baylyi, A. beijerinckii, A. bereziniae, A. boissieri, A. bouvetii, A. brisouii, A. calcoaceticus, A.gerneri, A. guillouiae, A. grimontii, A. gyllenbergii, A. haemolyticus, A. indicus, A. johnsonii, A. junii, A. Iwoffii, A. nectaris, A. nosocomialis, A. parvus, A. pittii, A. puyangensis, A. radioresistens, A. rudis, A. schindleri, A. soli, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. ursingii o A. venetianus.

En este informe, se entiende que Acinetobacter se refiere al reino Bacteria, al filo Proteobacteria, a la clase Gammaproteobacteria, al orden Pseudomonadales, a la familia Moraxellaceae.

Se entiende que “células o cepas de Acinetobacter baumannii" en la presente invención son aquellas células pertenecientes al dominio Bacteria, al filo Proteobacteria, a la clase Gammaproteobacteria, al orden Pseudomonadales, a la familia Moraxellaceae, al género Acinetobacter, a la especie Acinetobacter baumannii.

Se entiende que “lipopolisacárido (LPS) o lipooligosacárido” es un componente que se encuentra en la membrana externa de diversas bacterias gramnegativas. El término LPS se usa a menudo e indistintamente con “endotoxina”, debido a su historia de descubrimiento. El LPS consiste en una cadena de polisacárido y la parte restante es un lípido, conocido como lípido A, que es responsable de la actividad de endotoxina. La cadena de polisacárido es variable entre diferentes bacterias y determina el serotipo. La endotoxina tiene un tamaño de aproximadamente 10 kDa, pero puede formar grandes agregados de hasta 1000 kDa. Los humanos son capaces de producir anticuerpos contra LPS pero, en general, estos anticuerpos sólo pueden proteger contra bacterias de un serotipo específico. La endotoxina es responsable de muchas de las manifestaciones clínicas de infecciones provocadas por bacterias gramnegativas, tales como Neisseria meningitidis y Acinetobacter baumannii.

COMPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN

Un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición, a continuación en el presente documento, composición de la invención, que comprende:

a) una célula o cepa de la invención, y

b) opcionalmente una secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos o polipéptidos.

En una realización más preferida de este aspecto de la invención, el ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos o el polipéptido es recombinante.

En una realización todavía más preferida, el polipéptido se selecciona de

I) la secuencia de péptido SEQ ID NO: 27 (supuesto receptor de sideróforo férrico (A. baumannii ATCC 17978; número de registro YP_001084684)) o un fragmento de la misma, en la que los fragmentos son fragmentos biológicamente activos, preferiblemente seleccionados de la lista que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 o cualquiera de sus combinaciones, o secuencias que tienen una identidad de secuencia de al menos el 85% con las secuencias de péptido SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11, y/o

II) la secuencia de péptido SEQ ID NO: 28 (supuesto receptor de sideróforo de hidroximato férrico (A. baumannii ATCC 17978; número de registro YP_001084696)) o un fragmento de la misma, en la que los fragmentos son fragmentos biológicamente activos, preferiblemente seleccionados de la lista que consiste en SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23 o cualquiera de sus combinaciones, o secuencias que tienen una identidad de secuencia de al menos el 85% con las secuencias de péptido SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23.

En una realización todavía más preferida, la composición de la invención comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27.

En otra realización preferida, la composición de la invención comprende una proteína de fusión que consiste en al menos 2, preferiblemente 3, más preferiblemente 4, secuencias de aminoácidos de la siguiente lista que consiste en: SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 23 o una variante de estas secuencias que tiene una identidad de al menos el 85% con las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 23.

En otra realización preferida, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 o la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25.

En otra realización preferida, la composición de la invención comprende una secuencia de nucleótidos, a continuación en el presente documento, secuencia de nucleótidos de la invención, capaz de transcribir una secuencia de aminoácidos descrita en la invención. Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 26.

Los fragmentos descritos anteriormente difieren en la secuencia de aminoácidos en al menos un aminoácido. Las variaciones más preferidas son aquellas que tienen una identidad de secuencia de al menos el 85% o más, incluyendo el 90%, el 93% o más, y preferiblemente el 95% o más, el 96% o más, el 97% o más, el 98% o más, el 99% o más, con cualquiera de los polipéptidos mostrados en SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:25. Más preferiblemente, la invención se refiere a una variante de secuencia caracterizada por al menos una (al menos dos, al menos tres, al menos cuatro) mutación/mutaciones en relación con cualquiera de los polipéptidos SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:25. Según la invención tal como se describe en la sección de descripción, la mutación puede referirse a cualquier mutación seleccionada de inserción/inserciones, deleción/deleciones y sustitución/sustituciones. Preferiblemente, sustitución/sustituciones.

En otra realización preferida, la composición de la invención comprende un vector de expresión (a continuación en el presente documento, vector de expresión de la invención) que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención.

En otra realización preferida, la composición de la invención también comprende vesículas de la membrana externa, a continuación en el presente documento, vesículas de la membrana externa de la invención, deficientes en LPS.

En otra realización preferida, la composición de la invención también comprende al menos una de las proteínas purificadas de la membrana de A. baumannii con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 71; SEQ ID NO: 72; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89, o cualquiera de sus combinaciones.

Más preferiblemente, al menos una de las proteínas de la membrana externa de A. baumannii se obtiene mediante un procedimiento que comprende:

a. inocular un litro de caldo Mueller-Hinton con una colonia de A. baumannii ATCC 19606;

b. incubar el cultivo hasta una densidad óptica de 0,6 a 600 nm;

c. lavar las células bacterianas con 30 ml de tampón fosfato 10 mM pH 7,2;

d. centrifugar a 6000 x g durante 10 min;

e. resuspender el sedimento de células bacterianas con 10 ml de tampón fosfato 10 mM pH 7,2 y lisar mediante sonicación 5 veces durante 1 minuto;

f. eliminar las células sin lisar mediante centrifugación a 6000 x g durante 5 minutos;

g. centrifugar el sobrenadante a 4°C a 20000 x g durante una hora;

h. eliminar las proteínas de la membrana externa mediante solubilización con 5 ml de N-laurilsarcosinato al 2% en tampón fosfato 10 mM pH 7,2 durante 30 minutos a 37°C;

i. precipitar la fracción insoluble (que contiene las proteínas de la membrana externa) mediante centrifugación a 4°C a 20000 x g durante una hora;

j. lavar el sedimento de células una vez con 2 ml de Tris-HCI 62,5 mM pH 6,8 y centrifugar a 4°C durante una hora;

k. resuspender el sedimento de células en una disolución de SDS al 5% y precipitar con metanol/cloroformo; y

l. resuspender el sedimento de células en PBS estéril.

En otra realización preferida de la invención, la composición de la invención es una composición farmacéutica, más preferiblemente también comprende un vehículo farmacéutico aceptable y, todavía más preferiblemente, también comprende otro principio activo.

En otra realización preferida, la composición de la invención también comprende un adyuvante. En otra realización preferida, la composición de la invención es una vacuna.

En el contexto de la presente invención, el término “vacuna” se refiere a una preparación antigénica empleada para inducir una respuesta inmunitaria a una enfermedad. Se preparan a partir de antígenos que, una vez dentro del huésped, provocan una respuesta inmunitaria a través de la producción de anticuerpos y generan memoria inmunológica que produce inmunidad transitoria o permanente. Cabe destacar que, tal como se usa en el presente documento, el término “vacuna” también puede entenderse como una preparación a partir de anticuerpos o fragmentos de los mismos adecuada para el tratamiento terapéutico o para la inmunización pasiva de una infección provocada por una cepa de Acinetobacter, en particular de una cepa de A. baumannii.

SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS Y VECTOR DE EXPRESIÓN

Un tercer aspecto de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos, a continuación en el presente documento, segunda secuencia de nucleótidos de la invención, que codifica para cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 25, 27 ó 28, o cualquier combinación de las mismas. Dicha segunda secuencia de nucleótidos de la invención también incluye la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 26.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión, a continuación en el presente documento, vector de expresión de la invención, que comprende la segunda secuencia de nucleótidos de la invención.

En una realización preferida de este aspecto, la célula de la invención comprende el vector de expresión de la invención.

El ácido nucleico puede ubicarse en un vector recombinante. Preferiblemente, el vector recombinante es un vector procariota, que es un vector que contiene elementos para la replicación y/o integración en el genoma de células procariotas. Preferiblemente, el vector recombinante contiene la molécula de ácido nucleico de la presente invención unida operativamente a una secuencia de control de la expresión. La secuencia de control es preferiblemente una secuencia que controla la expresión activa en Acinetobacter, particularmente en A. baumannii. El vector puede ser un vector extracromosómico adecuado para la integración en el cromosoma. Los ejemplos de tales vectores se conocen por los expertos en el campo, por ejemplo, en Sambrook et al., citado anteriormente.

VESÍCULAS DE LA MEMBRANA EXTERNA DE LA INVENCIÓN

Un quinto aspecto de la invención se refiere a una vesícula de la membrana externa que es deficiente en LPS. En una realización preferida de este aspecto, la vesícula de la membrana externa se obtiene a partir de la célula o cepa de la invención.

USO DE LAS CÉLULAS, VESÍCULAS Y COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN

Un sexto aspecto se refiere a la composición de la invención para su uso como medicamento o, alternativamente, al uso de la composición de la invención para la fabricación de un medicamento.

El término “medicamento” o “composición farmacéutica”, tal como se usa en este informe, hace referencia a cualquier sustancia usada para la prevención, el alivio, el tratamiento o la cura de una enfermedad en humanos o animales. El contexto de la presente invención se refiere a una composición que comprende la composición de la invención. Esta composición de la invención comprende células inactivadas del género Acinetobacter y/o vesículas de la membrana externa del mismo en una cantidad terapéuticamente eficaz, que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en el organismo en el que se administran contra un organismo del género Acinetobacter. Por tanto, el término “medicamento” o “composición farmacéutica” se conoce como vacuna.

La dosificación para obtener la cantidad terapéuticamente eficaz depende de varios factores, tales como, por ejemplo, edad, peso, sexo, tolerancia... del mamífero. Tal como se usa en esta descripción, la “cantidad terapéutica eficaz” se refiere a la cantidad de células inactivas del género Acinetobacter y/o vesículas de la membrana externa que producen el efecto deseado y, en general, se determinan por el efecto terapéutico que se desea.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención para la prevención, la mejora o el tratamiento de una infección provocada por A. baumannii en un mamífero o, alternativamente, al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención, la mejora o tratamiento de una infección provocada por A. baumannii en un mamífero.

Por “enfermedad producida por organismos del género Acinetobacter” se entienden aquellas enfermedades en las que el agente causante de la patología es del género Acinetobacter o cualquiera de sus productos metabólicos. El género Acinetobacter produce diversas patologías, por ejemplo, pero sin limitarse a, bacteriemia, meningitis, infecciones de las vías urinarias, infecciones de la piel y partes blandas, infecciones en el sitio de cirugía y neumonía. Por estos motivos, una de las formas más preferidas, las enfermedades producidas por organismos del género Acinetobacter se seleccionan de la lista que consiste en bacteriemia, meningitis, infecciones de las vías urinarias, infecciones de la piel y partes blandas, infecciones en el sitio de cirugía y neumonía.

Los medicamentos y las composiciones de la invención pueden usarse solos o en combinación con otros medicamentos u otras composiciones para el tratamiento de enfermedades producidas por organismos del género Acinetobacter.

Tanto los medicamentos como las composiciones de la invención también pueden incluir vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Los medicamentos y las composiciones de la invención pueden usarse o bien solos o bien en combinación con otros medicamentos u otras composiciones para el tratamiento o la prevención de enfermedades provocadas por organismos del género Acinetobacter.

El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda en la absorción de los elementos de la composición de los medicamentos de la invención, la estabilización de dichos elementos, la activación o ayuda en la preparación del medicamento, de tal manera que proporciona consistencia o aromas que la hacen más sabrosa. Los excipientes pueden mantener juntos a los componentes como, por ejemplo, es el caso con almidones, azúcares, celulosa, edulcorantes, agentes colorantes, la función de protección del medicamento, por ejemplo, aislarlo del aire y/o la humedad, la función de llenado de la pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, por ejemplo, el caso de fosfato dibásico de calcio, la función para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otros tipos de excipientes descritos en este párrafo.

El vehículo, del mismo modo que el excipiente, es una sustancia que se usa en el medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la presente invención hasta un volumen o peso deseado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción similar a cualquiera de los elementos de la presente invención.

La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración y proporcionar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.

Los adyuvantes y el vehículo farmacéuticamente aceptable que pueden usarse en la composición de la invención son aquellos vehículos conocidos por los expertos en el campo.

En este informe, el término “adyuvante” se refiere a cualquier agente que no posee actividad antigénica en y por sí mismo, que puede usarse para estimular el sistema inmunitario para aumentar la respuesta a una vacuna. Existen muchos adyuvantes, por ejemplo, sin limitarse a, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, agonistas del receptor tipo Toll, citocinas, escualina, adyuvantes incompletos y completos de Freund. En una forma preferida de este aspecto de la invención, el adyuvante se selecciona de la lista que consiste en fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, agonistas del receptor tipo Toll, citocinas, escualina, adyuvantes incompletos y completos de Freund. En una forma todavía más preferida de este aspecto de la invención, el adyuvante es fosfato de aluminio.

Tal como se usa en este caso, el término “principio activo”, “sustancia activa” o “sustancia farmacéuticamente activa” o “principio farmacéuticamente activo” se refiere a cualquier componente que proporciona potencialmente actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, la cura, el alivio, el tratamiento o la prevención de una enfermedad o que afecta a la estructura o función del cuerpo humano o animal. El término incluye aquellos componentes que fomentan un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo y una forma modificada que proporciona la actividad o el efecto específicos.

Un octavo aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención para conferir protección contra una infección provocada por A. baumannii en un mamífero o, alternativamente, al uso de la composición de la invención en la elaboración de un medicamento para conferir protección contra una infección provocada por A. baumannii en un mamífero.

Otro aspecto de la invención se refiere al péptido o la proteína de fusión de la invención o a la composición del primer o segundo aspecto de la invención o a la composición farmacéutica de la invención que puede administrarse una o diversas, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o más, veces. No existen limitaciones particulares relacionadas con la cantidad del principio activo por dosis.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición que consiste en un anticuerpo o fragmento del mismo que es capaz de unirse a SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28 o a una proteína de fusión tal como se definió en el segundo aspecto o a la proteína de fusión de la invención, en la que preferiblemente dicha composición es una composición farmacéutica, preferiblemente una vacuna, y en la que dicha composición farmacéutica se usa en el tratamiento o la prevención de una infección provocada por A. baumannii.

Un noveno aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo o fragmento activo del mismo que pueden obtenerse mediante la inmunización de un mamífero con la composición del primer o segundo aspecto de la invención o con la proteína de fusión de la invención, preferiblemente dicho anticuerpo o fragmento activo consiste en una composición en el que preferiblemente dicha composición es una composición farmacéutica y dicha composición farmacéutica se usa como terapia, particularmente para el tratamiento de infecciones provocadas por A. baumannii.

MÉTODO PARA PREPARAR UNA CÉLULA DE ACINETOBACTER SIGUIENDO LA INVENCIÓN

Un décimo aspecto de la invención se refiere a un método para preparar una célula de A. baumannii tal como se describió anteriormente.

Acinetobacter

Según este aspecto, este método consiste en las etapas (i) proporcionar una célula bacteriana deficiente en LPS, particularmente una célula de Acinetobacter, (ii) insertar una molécula de ácido nucleico recombinante en dicha célula bacteriana, codificando dicha molécula de ácido nucleico para un péptido de fusión que consiste en (a) al menos un dominio del polipéptido en el que dicho dominio es capaz de producir una respuesta inmunitaria en un mamífero y (b) un dominio de escape para el fagolisosoma, y (iii) cultivar la célula obtenida según la etapa (ii) en condiciones adecuadas. Preferiblemente, se obtiene una célula capaz de expresar dicho ácido nucleico. Más preferiblemente, la célula es una célula de A. baumannii.

Según el aspecto adicional, este método consiste en la etapa de (i) proporcionar una célula bacteriana deficiente en LPS, particularmente una célula de Acinetobacter, (ii) insertar una molécula de ácido nucleico recombinante en dicha bacteria, codificando dicha molécula de ácido nucleico para un péptido o polipéptido para el escape del fagolisosoma, y (iii) cultivar la célula obtenida según la etapa (ii) en condiciones adecuadas.

Si se desea, el método de la presente invención consiste en insertar al menos una molécula de ácido nucleico recombinante en la célula bacteriana, codificando dicha molécula para un péptido o polipéptido capaz de producir una respuesta inmunitaria en mamíferos.

Se entiende que “ infección” en la presente invención es aquella patología generada mediante la invasión o colonización de cualquier tejido huésped por cualquier organismo del género Acinetobacter, preferiblemente Acinetobacter baumannii.

Se entiende que “partes blandas” en la presente invención es cualquier tejido no óseo de un organismo.

El término “prevención”, tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de daño cuya causa es células del género Acinetobacter o cualquier derivado o producto metabólico de las mismas.

El término “antígeno” en el informe se refiere a una molécula (generalmente una proteína o un polisacárido) que puede inducir la formación de anticuerpos. Existen muchos tipos diferentes de moléculas que pueden actuar como antígenos, tales como proteínas, péptidos, polisacáridos y, con menor frecuencia, otras moléculas tales como ácidos nucleicos.

El término “resistencia” se refiere a cualquier mecanismo de defensa desarrollado por bacterias contra un fármaco. Los mecanismos de resistencia adquirida y transmitida por bacterias son los más importantes y consisten principalmente en: la producción de enzimas que inactivan antibióticos, la aparición de modificaciones que impiden la llegada del fármaco a su diana y/o la alteración de la propia diana. Una cepa bacteriana puede desarrollar diversos mecanismos de resistencia contra uno o muchos antibióticos y, del mismo modo, un antibiótico puede inactivarse por distintos mecanismos a partir de diversas especies bacterianas.

Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan indistintamente, haciendo referencia a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto de ADN y como de ARN.

Los términos “secuencia de aminoácidos”, “péptido”, “oligopéptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud que puede modificarse de manera química o bioquímica.

Durante la descripción de las reivindicaciones, la expresión “que comprende” y sus variantes no pretende excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Para los expertos en el estado de la técnica, se proporcionan otros objetos, ventajas y características de la invención en la sección de la descripción y práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan como ilustraciones y no pretenden limitar la presente invención.

Descripción de las figuras

Figura 1. Estabilidad y contenido de endotoxinas de IB010. (A) Se extrajo ADN genómico de tres cultivos independientes de ATCC 19606 e IB010 y se amplificó usando cebadores específicos para el gen IpxD. La banda correspondiente a aproximadamente 1000 Kb corresponde al gen IpxD intacto, mientras que la banda que migra más rápido corresponde al gen IpxD con una deleción de 462 nucleótidos. (B) Niveles de endotoxinas de ATCC 19606 e IB010 determinados mediante el ensayo de amebocitos de Limulus. Las barras representan la mediana de los valores de tres cultivos independientes y las barras de error representan el error estándar de la media. UE; unidades de endotoxinas.

Figura 2. Respuesta de anticuerpos a la inmunización con IB010.Se recogieron muestras de suero de ratones vacunados con ATCC 19606, vacunados con IB010 y de control antes de la vacunación (día 0) y en el día 7 y 21 después de la primera inmunización, y se midieron los niveles de IgG (A) e IgM (B) totales específicas de antígeno mediante ELISA (n = 8 ratones/grupo). Se midieron los niveles de IgG1 (C) e IgG2c (D) en suero de 21 días mediante ELISA en ratones vacunados con ATCC 19606, vacunados con IB010 y de control. En todos los paneles, los diagramas de cajas y bigotes representan los intervalos intercuartiles e intervalos, respectivamente, y las líneas horizontales representan las medianas de los valores. * p < 0,05 en comparación con los niveles en ratones de control en el mismo punto de tiempo, # p < 0,05 en comparación con muestras de 7 días del mismo grupo experimental, f p < 0,05 en comparación con muestras de 21 días en ratones vacunados con ATCC 19606.

Figura 3. Efecto de la vacunación sobre cargas bacterianas tisulares. Se infectaron ratones inmunizados y de control con 2,0 x 106 ufc (300 x DL⁵⁰) de la cepa ATCC 19606 y se determinaron las cargas bacterianas esplénicas 12 horas después de la infección (n = 8 ratones/grupo). Los puntos de datos representan las cargas bacterianas de ratones individuales y las líneas horizontales representan las medianas de los valores de grupos de ratones. * p < 0,05 en comparación con ratones de control.

Figura 4. Efecto de la vacunación sobre los niveles de citocinas proinflamatorias después de la infección. Se infectaron ratones inmunizados y de control con 2,0 x 106 ufc (300 x DL⁵⁰) de la cepa ATCC 19606 y se determinaron los niveles en suero de IL-1p, TNF-a e IL-6 (n = 8 ratones/grupo). Los puntos de datos representan los niveles de citocinas de ratones individuales y las líneas horizontales representan las medianas de los valores de grupos de ratones. * p < 0,05 en comparación con ratones de control, # p < 0,05 en comparación con ratones vacunados con ATCC 19606.

Figura 5. Efecto de la vacunación sobre la supervivencia en un modelo de ratón de infección por A. baumannii diseminada. Se infectaron ratones vacunados y de control con 2,25 x 106 ufc (340,9 x DL⁵⁰) de la cepa ATCC 19606 (A) o 1,05 x 106 ufc (2,18 x DL⁵⁰) del aislado clínico de A. baumannii Ab-154 (B), y se monitorizó la supervivencia a lo largo de los siguientes 7 días (n = 8 ratones/grupo). * p < 0,05 en comparación con ratones de control.

Figura 6. Perfil de proteínas de OMV de A. baumannii sin LPS. Las cepas ATCC 19606 e IB010 para la producción de OMV después de 24, 48 y 72 horas de cultivo. Después de la purificación de las OMV, se cuantificó la cantidad de proteína usando el método de Bradford y se visualizaron 10 mcg de la proteína en un gel de poliacrilamida al 10% con tinción de Coomassie.

Figura 7. Efecto de 2,2-bipiridilo, quelante de hierro, sobre el perfil de proteínas de OMV. Se usaron las cepas ATCC 19606 e IB010 para analizar el efecto de 2,2 bipiridilo (BIP) sobre el perfil de proteínas de las OMV después del cultivo durante 24 horas. En el caso de la cepa ATCC 19606, se usó una concentración de 200 mcM, mientras que en el caso de IB010, se usaron 100 y 150 mcM. Después de la purificación de las OMV, se cuantificó la cantidad de proteína usando el método de Bradford y se visualizaron 10 mcg de la proteína en un gel de poliacrilamida al 10% con tinción de Coomassie.

Figura 8. Efecto de 2,2-bipiridilo, quelante de hierro, sobre la producción de OMV. Se usaron las cepas ATCC 19606 e IB010 para analizar el efecto de 2,2-bipiridilo (BIP) sobre la producción de las OMV después del cultivo durante 24 horas. En la figura, se muestra el contenido de proteína total de las OMV después del tratamiento con Bip y la medición de la concentración con Bradford.

Figura 9. Visualización de OMV. Se fijaron OMV purificadas de ATCC 19606 usando glutaraldehído al 1,6% y se tiñeron con tetróxido de osmio y plomo y uranio, y se visualizaron mediante microscopía electrónica.

Figura 10. Visualización de OMV purificadas. Se fijaron OMV purificadas de IB010 usando glutaraldehído al 1,6% y se tiñeron con tetróxido de osmio y plomo y uranio, y se visualizaron mediante microscopía electrónica.

Figura 11. Perfil de proteínas de OMV sin LPS. Se usaron las cepas IB010 y 167R para producirOMV y se cuantificó la cantidad de proteína de cada muestra. Se visualizaron diez mcg de la proteína en un gel de poliacrilamida al 10% con tinción de Coomassie.

Ejemplos de la invención

Ejemplo 1

Declaración de ética

Todos los experimentos que implican el uso de animales fueron aprobados por el comité de ética y experimentación del Hospital Universitario Virgen del Rocío (código de evaluación: 2013PI/296). En todos los experimentos, se realizaron esfuerzos por minimizar el padecimiento, y cualquier animal que pareciera moribundo durante el transcurso de la experimentación se sacrificó inmediatamente usando tiopental.

Cepas bacterianas. A. baumannii ATCC 19606 es una cepa de referencia susceptible a antibióticos. Se obtuvo un derivado deficiente en LPS de ATCC 19606 sembrando en placa un cultivo durante la noche de ATCC 19606 sobre agar de Mueller-Hinton que contenía 10mg/l de colistina, tal como se describió previamente (Clinical Laboratory Standards Institute 2013). Se identificaron las cepas con mutaciones en los genes implicados en la biosíntesis de LPS secuenciando los genes IpxA, IpxC e IpxD de los mutantes resistentes a colistina que estaban presentes después del crecimiento durante la noche a 37°C. Se identificó una cepa con una deleción grande en el gen IpxD y se denominó IB010. Se confirmó la resistencia a colistina mediante microdilución en caldo según las directrices del Clinical Laboratory Standard Institute [23]. Se confirmó la ausencia de LPS midiendo los niveles de endotoxinas de tres cultivos independientes de cada cepa usando el ensayo de amebocitos de Limulus QCL-1000 (Lonza) según las instrucciones del fabricante. La cepa Ab-154 es un aislado clínico de A. baumannii caracterizado previamente (Gautom, 1997. J. Clin. Microbiol. 35, 2977-2980).

Preparación de vacunas e inmunización de ratones. Se prepararon las vacunas IWC (que contenían LPS y deficientes en LPS) tal como se describe basándose en un método descrito previamente (Moffatt et al., 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4971-4977). En resumen, se hicieron crecer las cepas ATCC 19606 e IB010 en caldo Mueller-Hinton hasta una DO⁶⁰⁰ de 0,8. En el caso de IB010, se añadieron 10 |ig/ml de colistina al cultivo. Con el fin de confirmar que no se produjo ninguna reversión al tipo natural durante el crecimiento de IB010, se hicieron crecer tres cultivos independientes de ATCC 19606 e IB010, y se aisló ADN genómico de cada cultivo usando el minikit de ADN QIAmp (Qiagen). Se usaron los cebadores específicos de IpxD 5' GCTAATTGGTGAAGGTAGTC 3' y 5' GACGAATCGTTTGAATCTGC 3' para amplificar el ADN genómico de los cultivos con el fin de confirmar que estaba presente la deleción en IpxD de IB010 después del crecimiento.

Para la preparación de vacunas, se lavaron a fondo las bacterias en solución salina tamponada con fosfato antes de la inactivación en formalina 0,5 M durante 18 h con agitación a temperatura ambiente. Se confirmó la inactivación completa de las bacterias sembrando en placa en agar con sangre. Se ajustó la concentración de células inactivadas a 1x1010 células/ml y se combinaron 1:1 (v/v) con el adyuvante a base de aluminio, Alhydrogel al 2% (p/v) (InvivoGen). Se llevó a cabo la vacunación en ratones C57BL/6 hembra de 6 a 8 semanas de edad mediante inyección intramuscular de 100 |il de la vacuna en cada músculo cuádriceps los días 0 y 14. Se inyectaron de manera similar ratones de control con una mezcla de solución salina tamponada con fosfato y adyuvante.

Modelo de ratón de infección por A. baumannii. Se usó un modelo de ratón de septicemia, desarrollado previamente por el presente grupo y usado para la evaluación de vacunas contra A. baumannii, para caracterizar la eficacia de la (Batson et al., 1950. J. Exp. Med. 91, 219-229; Rodriguez-Hernandez et al., 2000. J. Antimicrob. Chemother. 45, 493­ 501). Este modelo produce una infección diseminada después de la instilación intraperitoneal del inóculo, que da como resultado normalmente la muerte en el plazo de 24 a 48 horas. Para la preparación de los inóculos, se hicieron crecer cepas de A. baumannii durante 18 h a 37°C en cultivos de caldo Mueller-Hinton y se ajustaron a la concentración apropiada en solución salina fisiológica tal como se describió previamente (Moffatt et al., 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4971-4977; Martin et al., 1998. J. Immunol. Methods 212, 187-192). Se determinaron las concentraciones bacterianas de los inóculos sembrando en placa en agar con sangre. Se infectaron los ratones el día 21 (una semana después de la segunda inmunización) mediante inyección intraperitoneal con 0,5 ml de la suspensión bacteriana y se monitorizó la supervivencia durante 7 días.

Cargas bacterianas esplénicas y niveles en suero de citocinas. Se determinaron las cargas bacterianas después de la infección en ratones vacunados y de control 12 h después de la infección. Se sacrificaron los ratones con una sobredosis de tiopental y, después de la extracción de muestras de sangre del seno retroorbital, se extirparon asépticamente los bazos, se pesaron y se homogeneizaron en 2 ml de solución salina fisiológica. Se sembraron en placa diluciones logarítmicas en serie en placas de agar con sangre para la cuantificación bacteriana. Se determinaron los niveles en suero de interleucina-1p (IL-1P), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) e interleucina-6 (IL-6) en ratones 12 h después de la infección usando kits BD OptEIA mouse (BD Biosciences).

Ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). Para los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) indirectos, se recubrieron placas de 96 pocillos con 5 x 107 células bacterianas/pocillo en solución salina tamponada con fosfato incubando a 4°C durante la noche. Se realizaron los ELISA usando sueros recogidos los días 0, 7 y 21 tal como se describió previamente [28]. Se midieron los títulos de anticuerpo contra la cepa que se usó para inmunizar el ratón, y se definieron como la dilución en la que las lecturas espectrofotométricas estaban al menos 0,1 unidades por encima de los pocillos en el nivel inicial (pocillos que no contenían suero).

Análisis estadístico. Se compararon los títulos de anticuerpo, las cargas bacterianas y los niveles de citocinas usando la prueba de la H de Kruskal-Wallis y la prueba de la U de Mann-Whitney para muestras independientes y las pruebas de Friedmann y Wilcoxon para muestras dependientes. Se aplicó la corrección de Bonferroni según fuese apropiado. Se compararon los datos de supervivencia usando la prueba de rangos logarítmicos. Todas las estadísticas se realizaron usando el software SPSS versión 15.0 (SPSS Inc.) y se consideró significativo un valor de p < 0,05.

Resultados

Selección de una cepa deficiente en LPS para el desarrollo de vacunas. El crecimiento de ATCC 19606 en presencia de colistina 10 |ig/ml dio como resultado numerosos derivados resistentes a colistina con mutaciones en los genes IpxA, IpxC e IpxD (datos no mostrados). Una de estas cepas, IB010, contenía una deleción grande de 462 nucleótidos en el gen IpxD (nucleótidos 104-565) y se eligió para su uso adicional en estudios de vacunas. Se razonó que, basándose en que la cepa contenía una deleción grande, sería menos probable que esta cepa revirtiera al tipo natural durante el crecimiento que cepas que contienen cambios de nucleótidos individuales o pequeñas deleciones en los genes de biosíntesis de LPS. Los experimentos de microdilución en caldo demostraron que la concentración mínima inhibidora de la cepa ATCC 19606 fue < 0,25 |ig/ml y > 128 |ig/ml para IB010, lo que demuestra que, de manera similar a los resultados descritos previamente, las mutaciones en IpxD pueden dar como resultado resistencia a colistina (Moffatt et al., 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4971-4977). Con el fin de garantizar que IB010 era genéticamente estable durante el crecimiento, se amplificó ADN genómico de tres cultivos independientes de ATCC 19606 e IB010 con cebadores específicos de IpxD para confirmar que la deleción estaba presente. Tal como se muestra en la figura 1A, estaba presente una banda correspondiente al gen IpxD mutado de IB010 que contenía una deleción de 462 nucleótidos después de la amplificación de todos los cultivos de IB010, lo que indica que no había ocurrido ninguna reversión. Se caracterizaron la pérdida fenotípica de LPS y la reducción en los niveles de endotoxinas mediante el ensayo de amebocitos de Limulus para ATCC 19606 e IB010, y demostraron que la mutación en el gen IpxD dio como resultado una reducción drástica en los niveles de endotoxinas hasta > 1 Ue por 106 células (figura 1B).

Respuesta de anticuerpos a la vacuna IWC deficiente en LPS. El tratamiento con formalina de ATCC 19606 e IB010 dio como resultado bacterias no viables, lo que indica una inactivación bacteriana completa. Con el fin de cuantificar la respuesta de anticuerpos producida mediante la inmunización con IB010 inactivada, se realizaron ELISA indirectos usando sueros recogidos de ratones de control negativo (inmunizados con PBS y adyuvante) y ratones vacunados con 1 x 109 células de IB010 inactivadas. Como control positivo, se inmunizó un grupo de ratones con 1 x 109 células de ATCC 19606 inactivadas basándose en que se había demostrado previamente que la inmunización con estas células induce una respuesta inmunitaria robusta y produce inmunidad protectora contra una infección experimental (McConnell y Pachón, 2010. Vaccine 29, 1-5). Tal como se muestra en la figura 2A, la inmunización con IB010 inactivada provocó niveles detectables de IgG total específica de antígeno en todos los ratones siete días después de una única administración intramuscular, y estos niveles de anticuerpo aumentaron significativamente tras la potenciación con una segunda administración de la vacuna (p = 0,03, prueba de Wilcoxon). Los títulos de IgG total en ratones que recibieron dos administraciones de vacuna de IB010 inactivada fueron similares a los títulos en ratones que recibieron la vacuna que contenía células de tipo natural inactivadas (p = 0,726, prueba de la U de Mann Whitney). Los ratones de control no tuvieron IgG específica de antígeno detectable en ningún punto. En cambio, los niveles de IgM fueron similares entre ratones inmunizados con la vacuna de IB010 inactivada y ratones que recibieron células de tipo natural inactivadas siete días después de una única administración (p = 0,186, prueba de la U de Mann Whitney), sin embargo, siete días después de una segunda inmunización, no hubo IgM específica de antígeno detectable en ratones vacunados con IB010, mientras que todos los ratones inmunizados con células de tipo natural inactivadas tuvieron niveles detectables de IgM (figura 2B).

Se determinaron los niveles de los subtipos de IgG IgG1 e IgG2c, el homólogo de IgG2a en C57BL/6 (Martin et al., 1998. J. Immunol. Methods 212: 187-192), en suero de 21 días (figura 2C y D). Ambos grupos de ratones que recibieron las vacunas inactivadas tuvieron niveles significativos de IgG1 e IgG2c en comparación con ratones de control (p < 0,001; prueba de la U de Mann-Whitney). De manera interesante, los títulos de IgG1 fueron significativamente mayores en ratones vacunados con IB010 en comparación con ratones vacunados con ATCC 19606 (p = 0,003; prueba de la U de Mann-Whitney), mientras que los títulos de IgG2c fueron similares entre estos grupos. Estos resultados indican que se provocan respuestas tanto Th1 como Th2 por la vacuna de IB010 inactivada de manera similar a lo que se demostró previamente para la vacuna de ATCC 19606 inactivada (McConnell y Pachón, 2010. Vaccine 29, 1-5).

Efecto de la vacunación sobre las cargas bacterianas después de la infección. Con el fin de caracterizar el efecto de la vacunación sobre las cargas bacterianas tisulares después de la infección, se empleó un modelo de ratón desarrollado previamente por el presente grupo, para la caracterización de una vacuna que previene la infección por A. baumannii (McConnell et al., 2011. Infect. Immun. 79, 518-526; McConnell et al., 2011. Vaccine 29: 5705-5710; McConnell y Pachón , 2010. Vaccine 29, 1-5). Este modelo produce rápidamente una infección diseminada en la que se detectan bacterias en órganos distales tan pronto como una hora después de la infección [16]. Se infectaron ratones vacunados y de control con 2,0 x106 ufc (300 x DL⁵⁰) de la cepa ATCC 19606 y se determinaron las cargas bacterianas esplénicas 12 horas después de la infección (figura 3). La vacunación con IB010 redujo el número de bacterias en los bazos en aproximadamente 1000 veces en comparación con ratones de control (p < 0,05; prueba de la U de Mann-Whitney). Las cargas bacterianas esplénicas en ratones vacunados con IB010 no fueron significativamente diferentes de los ratones inmunizados con células de ATCC 19606 inactivadas.

Efecto de la vacunación sobre los niveles en suero de citocinas y la supervivencia después de la infección. Con el fin de caracterizar el efecto de la inmunización con la vacuna deficiente en LPS inactivada sobre los niveles de citocinas, se recogieron sueros de ratones vacunados y de control 12 h después de la infección y se determinaron los niveles de IL-1P, IL-6 y TNF -a (figura 4). Los niveles de las tres citocinas fueron significativamente menores en ambos grupos de ratones vacunados que en ratones de control (p = 0,003 para IL-1p, IL-6 y TNF-a; prueba de la U de Mann-Whitney), lo que sugiere que los ratones vacunados no experimentaron la liberación de citocinas proinflamatorias asociada con el desarrollo de choque séptico.

Se sometió a prueba la eficacia de la vacuna infectando ratones inmunizados y de control con 2,25 x 106 ufc (340,9 x DL⁵⁰) de la cepa ATCC 19606 siete días después de la segunda inmunización y se monitorizó la supervivencia a lo largo de siete días (figura 5). Todos los ratones vacunados con la vacuna de IB010 se protegieron de la exposición, mientras que todos los ratones de control murieron en el plazo de 48 horas (P<0,001; prueba de los rangos logarítmicos). Tal como se esperaba, todos los ratones inmunizados con la cepa ATCC 19606 sobrevivieron a la exposición, de manera similar a los resultados que se notificaron previamente (McConnell et al., 2011. Infect. Immun.

79, 518-526; McConnell et al., 2011. Vaccine 29: 5705-5710; McConnell y Pachón , 2010. Vaccine 29, 1-5). Con el fin de determinar si la vacunación con IB010 podía proteger contra la exposición heteróloga con una cepa no relacionada, se infectaron ratones inmunizados y de control con 1,05 x 106 ufc (2,18 x DL⁵⁰) del aislado clínico de A. baumannii Ab-154 previamente caracterizado [29]. De nuevo, todos los ratones inmunizados sobrevivieron a la exposición, mientras que ratones los de control sucumbieron a la infección en el plazo de 48 horas (p < 0,001; prueba de los rangos logarítmicos), lo que indica que la inmunización con IB010 puede proporcionar una protección cruzada contra la exposición con una cepa heteróloga.

En conclusión, estos resultados proporciona información importante con respecto al desarrollo de una vacuna para la prevención de infecciones provocadas por A. baumannii basándose en células bacterianas completas que carecen de LPS. Estos resultados también pueden proporcionar una percepción de la posibilidad de desarrollar vacunas para otras especies bacterianas basándose en cepas que carecen de LPS.

Ejemplo 2

Este ejemplo se refiere al desarrollo de una vacuna contra A. baumannii basándose en OMV purificadas de dicho cultivos de mutantes sin LPS.

Para llevar a cabo este objetivo, se generaron en el laboratorio las cepas ATCC 19606T y su mutante sin LPS, IB010, a partir de la cepa ATCC 19606T y que contiene una deleción de 462 nucleótidos entre las posiciones 103 y 565 del gen IpxD.

Tras la realización de la purificación de las OMV de dichas cepas, se usó el siguiente protocolo:

- Se renuevan las cepas en placas de agar con sangre o MHBII con colistina a 10 mcg/ml y se hacen crecer durante la noche a 37°C.

- Se uso un cultivo líquido para el crecimiento de ATCC 19606 o IB010. Se cultivan con aireación a 180 rpm a 37°C durante la noche.

-A l siguiente día, se realizan cultivos de 50 o 100 ml o 1 l en MHB y se incuban durante la noche a 37°C con aireación (180 rpm).

- Después de la incubación, se centrifugan las células a 4000 rpm durante 30 min a 4°C.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Composición de vacuna adecuada para el tratamiento profiláctico de una infección provocada por una cepa de Acinetobacter baumannii en un mamífero, que comprende:

a. una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) caracterizada por la inactivación parcial o completa de una o diversas moléculas de ácido nucleico celulares que codifican para genes de biosíntesis de LPS endógeno; y/o

b. una vesícula de la membrana externa (OMV) derivada de una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) tal como se definió en el párrafo a) anterior;

en la que la cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) se caracteriza por la inactivación parcial o completa de los genes seleccionados de la lista que consiste en IpxA, IpxB, IpxC, IpxD, IpxK, IpxL y/o IpxM.

2. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que la cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) se caracteriza por la inactivación parcial o completa de los genes seleccionados de la lista que consiste en IpxA, IpxC e IpxD.

3. Composición de vacuna según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dicha vacuna comprende además un polipéptido recombinante seleccionado de la lista que consiste en:

a. un polipéptido de SEQ ID NO: 27 (supuesto receptor de sideróforo férrico (A. baumannii ATCC 17978; número de registro YP_001084684)) o un fragmento biológicamente activo del mismo, en la que el fragmento se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 o cualquier combinación de las mismas, o en la que el fragmento es un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85% con cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID NO: 1-11; y/o

b. un polipéptido de SEQ ID NO: 28 (supuesto receptor de sideróforo de hidroximato férrico (A. baumannii ATCC 17978; número de registro YP_001084696)) o un fragmento biológicamente activo del mismo, en la que el fragmento se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23 o cualquier combinación de las mismas, o en la que el fragmento es un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85% con los polipéptidos de SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 23.

4. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una proteína de la membrana externa purificada de A. baumannii seleccionada de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 71; SEQ ID NO: 72; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 o cualquier combinación de las mismas.

5. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha vacuna comprende además el polipéptido recombinante de fusión de SEQ ID NO: 24 ó 25 o el polipéptido recombinante de fusión codificado por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 26.

6. Composición de vacuna caracterizada por una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) comprende o se transforma, transduce o transfecta con una molécula de ácido nucleico capaz de codificar para cualquiera de los polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, de modo que tal cepa es capaz de producir la expresión exógena de cualquiera de dichos polipéptidos.

7. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) se inactiva.

8. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) se deriva de la cepa ATCC 19606.

9. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento profiláctico de una infección provocada por A. baumannii en un mamífero, preferiblemente un humano.

10. Cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en lipopolisacárido (LPS) según la reivindicación 1 ó 2, para su uso como medicamento.